CN101688188B - 纯化病毒悬浮液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明目的为从液体病毒悬浮液获得病毒的方法，根据该方法：使病毒悬浮液经受基于密度梯度的超速离心，超速离心是以连续方式进行的，以及密度梯度是包含至少两个平台的不连续梯度。

Description

纯化病毒悬浮液的方法

本发明涉及病毒纯化领域，特别地涉及用于从液体病毒悬浮液获得病毒的方法。

用于纯化病毒悬浮液的方法在制药领域特别是在疫苗领域中是已知的。

因此，特别是专利FR2201079描述了一种用于从病毒悬浮液纯化病毒的方法，其中在区域离心机停止时，将所述病毒悬浮液加入到分带离心机的转子中；在转子开始缓慢(2000～5000rpm)旋转后，在转子的外周加入至少两个不同密度的液体缓冲层(coussins de liquide)；接着，一旦转子被填充了待处理的液体，则将所述转子加速至足以从杂质分离病毒的速度；以及最后，在转子速度返回到2000～5000rpm之间的速度后，在周边加入密度等于或大于转子内含物的液体，以通过其中央通道(conduitcentral)清空转子；随后收集除去杂质的含有病毒的级分。

在旋转过程中，不同密度的缓冲层(cousins)通过扩散被转化成非线性梯度。

在所述专利中描述的方法是不连续的方法，但是其具有仅可能处理恒定和有限体积的病毒悬浮液的缺陷，因此必须对待纯化的病毒悬浮液进行预先浓缩和/或重复该相同操作多次以便处理大体积的液体。

使用这类方法还使具有一种完全在无菌条件下进行的方法尝试变得复杂。

本发明的目的是一种用于从液体病毒悬浮液获得病毒的方法，根据该方法，将所述病毒悬浮液进行基于密度梯度超速离心(ultracentrifugation sur gradient)，特征在于，

-所述超速离心是连续进行的，

-所述密度梯度是包含至少两个平台(palier)的不连续梯度。

因此，可以将该纯化步骤整合到在线制造工艺中，其能够降低污染的风险，并且能够实现从工业的观点来看是有利的自动化。

根据本发明方法的特定特征，在超速离心机的入口施加给病毒悬浮液的离心力为36000～60000g，而在外周的出口处离心力以90000～120000g存在。

因此，最佳的是病毒能够渗入密度梯度层中，而病毒悬浮液中不期望的成分则直接穿过超速离心机并被除去，而不渗入该梯度中或者即使渗入梯度中但迁移非常小。

根据本发明方法另一特定特征，所述密度梯度是平台形式的蔗糖梯度，这是通过叠置至少两个不同密度的蔗糖层以及缓冲液溶液层而获得的。

由此获得至少两个很好区别的对应密度的“跳跃”的平台，这能够很好地分离病毒悬浮液的成分。

通过参考附图阅读后面详细描述的说明书之后，本发明的许多优点将显现，其中所述附图示意表示可以实施本发明的装置。

图1用示意图描述了用于实施本发明的在停止状态时的装置。

图2用示意图描述了用于实施本发明的在运行状态时的装置。

特别适合实施本发明的超速离心装置的例子是例如描述于专利申请US 2005/0215410中的装置。

正如在附图中所描绘的，这类装置主要由转子构成，所述转子包含构成了具有中央核心2的罐的圆柱外壳1。该罐在其下部具有待处理液体的入口3，在其上部具有出口4。为了简化，没有描绘该装置不同部分的的驱动手段和固定手段。

在外壳1和核心2之间可以利用的容积被密度梯度所占据，其中根据本发明，所述密度梯度由至少两个不同密度的层5和6，以及缓冲溶液层7构成。如图1所示，在停止时，这些密度梯度的层水平叠置，密度最高的层处于下面，缓冲液层则位于上面。如图2所示，当该装置被使用时，不同密度的层围绕核心同心地配置，其中密度最高的层在距离核心最远的位置，而从入口3进入的待处理病毒悬浮液则在通过出口4被排出之前在接近核心的区域内流通。

根据本发明，所处理的病毒悬浮液是液体悬浮液，其含有可以是活着或非活着的病毒。它们可以是在制备疫苗中所使用的病毒，特别是流感、麻疹、腮腺炎、疱疹、黄热病、狂犬病或脊髓灰质炎病毒或所有具有使其可以用于预防疾病的特征的其他病毒。这些病毒可以通过在细胞、或器官或者(对于流感病毒的情况)在鸡蛋上进行培养而制备。对于在细胞上制备病毒的情况，待除去的主要成分是蛋白质和细胞DNA。对于在鸡蛋上制备病毒的情况，适合除去的成分之一是卵清蛋白。事实上，欧洲卫生局(autoritiés de santéen Europe)建立的标准设定了每剂量的给药疫苗1μg卵清蛋白的限制阙值。当然，工业公司尽力充分降低到所批准的阙值之下；因此重要的是能够提供简单并且有效的方法，其能够最大地减少产生自病毒生产的杂质。

本发明的方法是非常有利的，并且显示出，在待处理的病毒悬浮液是由包含流感病毒的尿囊液构成时，高度有效性，其中其适合分离产生自用于病毒传代的鸡蛋的卵清蛋白。

本发明的方法是在单一的区域超速离心步骤中进行的。为此目的，所使用的超速离心机的罐是圆柱罐，其壁优选是由钛制成的；在其中心，其具有圆柱核心，该圆柱核心具有允许流体流动的凹槽；该核心有利地由Noryl^TM制成。根据本发明，在核心和外壁之间可以利用的容积足以引入能够产生具有至少二个平台的密度梯度的产品。因此，已经注意到，通过使用具有K10核心的KII型超速离心系统，获得完全适合本发明的8升的容积。

为了确保通过密度梯度的纯化，将至少3个不同密度的层在停止时装载到超速离心机的罐中。可以通过使用各种产品获得该密度梯度，例如蔗糖、氯化铯、酒石酸钾或溴化钾；利用蔗糖已经获得了特别好的结果。因此，可以获得3个层，其中2层由不同浓度蔗糖构成，所述层之一由缓冲溶液构成。根据待纯化的病毒悬浮液的性质，可以考虑更多的层，这将能够获得更多不同密度的平台。

装载是通过首先加入缓冲液体，接着以提高密度的顺序引入所述缓冲层；这种装载是在停止时进行的。

当所有都已装载时，将转子加速到最高速度，即35000～40500rpm。在加速过程中，通过入口3加入待处理的病毒悬浮液。如图2所示，这时待处理液体沿着核心2流动；在此位置，其受到36000～60000g的离心力，而在靠近外壁的加速度为90000～120000g；尽管待处理液体在其进入超速离心机处受到了相对低的离心力，但病毒可以渗入梯度内部，并且没有观察到所担心的病毒的过多损失。一些不期望的蛋白质或颗粒也能够渗入该梯度中；然而，不同的密度平台将构成对于在开始时病毒悬浮液中存在的某些成分无法通过的屏障。由于病毒是重颗粒，因此他们自身能够迁移到接近梯度端点的等密度点。根据本发明，获得了非常好的病毒/卵清蛋白的分离。借助于单个超速离心步骤，由此获得99％的卵清蛋白的去除。

在全部体积的病毒悬浮液都被处理之后，通过不同密度级分回收密度梯度的液体，并进行处理以从密度最大的级分中分离病毒。

接着可以利用常规方法对病毒进行灭活或处理。

令人吃惊地，无论高加速以及该加速的持续时间，本发明能够保持这些密度梯度平台。事实上，本发明人曾经担心足够大的8L容积会导致梯度的不稳定性，并且还担心由于与现有技术中通常使用的装置相比该装置入口的旋转速度被降低导致会有显著的病毒损失。

实施例：从鸡蛋尿囊液纯化流感病毒

提供KII型超速离心系统，在其中心具有Alfa Wasserman提供的K10核心。

在停止时，将下列连续加入到转子中：

-稍微超过8L的125mM柠檬酸盐缓冲液，

-3.4L 34％蔗糖溶液，其置换了部分柠檬酸盐缓冲液，

-1.6L 55％蔗糖溶液，其同样置换了部分柠檬酸盐缓冲液。

接着，将转子加速最高达到35000rpm的速度，并将待处理的尿囊液即60升以10升/小时的速度加入。该尿囊液已经被预先澄清并浓缩，以除去一部分污染物；其含有期望分离以将其引入疫苗中的流感病毒。

进行超速离心6小时，接着通过用125mM柠檬酸替换尿囊液进行冲洗1小时。该冲洗阶段不仅能够除去梯度入口处的杂质，而且并尤其为病毒提供了更多的时间以迁移至它的等密度区。

在所有待处理液体都已经被超离心之后，停止旋转并分32个250ml的级分收集梯度。

接着在折射率、光学密度和特别是清蛋白定量方面对这些级分进行分析。观察到获得了非常好的病毒/清蛋白分离。保存含有47～35％蔗糖的级分，其为含有最大量的病毒和最小量的卵清蛋白的级分。

接着将这些级分合并，并在分级之前，通过稀释标准化至恒定的光学密度值(这是病毒蛋白质含量的指标)，接着灭活和过滤以获得分离的灭活病毒颗粒的悬浮液。

观察到，根据本发明方法纯化的病毒在片段化之前是完整的病毒，在所收获的级分中卵清蛋白的浓度对于这些病毒后面用于疫苗制剂而言是足够低的，符合欧洲药典(Pharmacopée Européene)关于要求卵清蛋白低于1μg/剂量的量的规定。

Claims (6)

1.用于从液体病毒悬浮液获得病毒的方法，根据该方法，使病毒悬浮液经受基于密度梯度的超速离心，其特征在于：

-所述超速离心是连续进行的，

-所述密度梯度是包含至少两个平台的不连续梯度，

-在超速离心机的入口施加给液体病毒悬浮液的离心力为36 000～60 000g的值，

-在密度梯度的末端施加给病毒悬浮液的离心力为90 000～120 000g的值，

-在超速离心机内可用于所述液体流通和密度梯度的容积是大约8升。

2.前述权利要求1所述的方法，其特征在于所述密度梯度是通过叠置至少两个不同密度的蔗糖层，和缓冲溶液层而获得的蔗糖梯度。

3.前述权利要求1或2所述的方法，其特征在于在所述超速离心机中病毒悬浮液的流速是大约10升/小时。

4.前述权利要求1或2所述的方法，其特征在于待处理的液体病毒悬浮液包含悬浮在浓缩尿囊液中的流感病毒和卵清蛋白。

5.前述权利要求1或2所述的方法，根据该方法：

-在全部病毒悬浮液都已被处理之后，通过增大或降低的梯度的级分回收超速离心机中存在的蔗糖，

-保存含有所述病毒的密度最高的级分。

6.装置在实施前述权利要求任一项所述方法中的用途，所述装置至少包含：

-能够达到至少35 000rpm的旋转速度的转子，其包含具有钛壁的圆柱形罐以及由Noryl^TM制成的带横肋的内部核心，

-待处理病毒悬浮液的入口，

-经过处理的液体的出口，

其特征在于

-所述密度梯度由至少两个不同密度的蔗糖层和由缓冲溶液构成的层构成，

-还在于可以用于密度梯度和待处理流体流通的容积是大约8升。

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