CN116200346B - 一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法及系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法及系统，所述方法是将病毒溶液全部输入超滤器进液端，由超滤器对全部的病毒溶液进行单方向超滤浓缩，将经超滤浓缩后病毒溶液再次全部输入超滤器进液端，由超滤器对全部的经超滤浓缩后病毒溶液再次进行单方向超滤浓缩，控制经超滤浓缩后病毒溶液输入超滤器进液端的次数，直至病毒溶液超滤浓缩至设定的浓度。本发明采用病毒单次过膜超滤浓缩方式，以狂犬病病毒为例，该超滤方式能够保证在超滤浓缩过程中所有病毒颗粒进入超滤膜包的次数一致，避免了部分病毒颗粒因为反复进入膜包而被剪切力破环其G蛋白结构甚至病毒完整性的问题，能最大程度保持病毒颗粒的完整性，提高后续病毒层析纯化质量及疫苗质量。

Description

一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法及系统

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法及系统。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒（Rabiesvirus，RABV）引起的，只要发病就能够100%致死的人畜共患病。到目前为止，无任何特效药物能够治疗被狂犬病病毒感染后的个体，所以防控狂犬病唯一有效的手段是接种疫苗，这便要求狂犬病疫苗要有高的有效性和安全性。狂犬病疫苗的安全性取决于疫苗的纯度，有效性取决于病毒的免疫原性。

RABV的病毒粒子呈子弹状，平均直径约70 nm，长度100~300 nm。RABV共表达5种结构蛋白（N、P、L、M、G），G蛋白是唯一存在于RABV病毒包膜表面的三聚体跨膜糖蛋白，能够与细胞受体结合，在狂犬病病毒致病性和免疫原性中起着关键作用。RABV的免疫原性具有结构依赖性，取决于病毒颗粒的完整性和G蛋白的三聚体结构，即疫苗中完整病毒颗粒含量越高，诱导机体产生中和抗体水平越高，疫苗的有效性越高。

当前国内外上市的人用狂犬病疫苗主要是狂犬病灭活疫苗，灭活疫苗病毒原液生产过程通常分为：病毒培养收获、病毒液澄清、浓缩、灭活、层析/超速离心。澄清步骤为疫苗生产过程第一步分离纯化，能去除病毒收获液中的大量的大小在500~1000nm的细胞碎片和细胞器，起到初步纯化的目的。超滤浓缩为第二步分离纯化，通常使用膜截留分子量为100~300KD的超滤膜，将病毒澄清液浓缩一定倍数，在去除小分子量杂质（宿主细胞蛋白质、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、抗生素、胰酶等）的同时，对病毒起到富集作用，以便下一步的精细纯化(层析或者超速离心)。超速离心或者层析技术由于高分辨率，为疫苗原液生产的最后一步精细纯化过程，使病毒颗粒和少量干扰杂质尽可能分开，达到所需的质量标准。

现有狂犬病病毒超滤浓缩工艺如下：

采用切向流超滤膜包或者切向流中空纤维柱进行病毒超滤浓缩，超滤浓缩工艺一般为：将狂犬病病毒澄清液从病毒澄清液罐泵入切向流超滤膜包内，由于病毒分子量较大（300000~600000KD），能够被超滤膜截留而从超滤器回流端进入浓缩罐中，小分子物质（杂质和水）透过超滤膜，从滤出端流出，进入废液桶。病毒液在单个浓缩罐和超滤膜包之间反复循环最终体积缩小，达到目标浓缩体积，然后将浓缩液收集，实现狂犬病病毒超滤浓缩。

此方法存在以下缺点：

1、待浓缩病毒液在超滤膜包和浓缩罐之间反复循环，病毒颗粒进出超滤器的次数不均一，狂犬病病毒作为对剪切力较敏感的包膜病毒，进出超滤器次数多的病毒颗粒很容易被超滤过程形成的剪切力剪切，G蛋白从病毒表面脱落，不利于抗原完整性。

2、采用反复循环的方式，不能控制病毒液经过超滤器的次数，无法评估浓缩后抗原收率与膜处理量（即每平方米超滤膜处理的病毒澄清液量）之间的线性关系，从而无法对工艺进行优化。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有狂犬病病毒超滤浓缩工艺存在病毒颗粒进出超滤器的次数不均一，而导致G蛋白从病毒表面脱落的缺陷，从而提供一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法及系统，以在狂犬病病毒超滤浓缩过程中，优化浓缩工艺，在尽可能温和的条件下控制病毒进入超滤器的次数以达到浓缩倍数，更利于保持浓缩液病毒粒子完整性，从而提高后续病毒纯化质量及疫苗免疫原性。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，所述方法是将病毒溶液全部输入超滤器进液端，由超滤器对全部的病毒溶液进行单方向超滤浓缩，将经超滤浓缩后病毒溶液再次全部输入超滤器进液端，由超滤器对全部的经超滤浓缩后病毒溶液再次进行单方向超滤浓缩，控制经超滤浓缩后病毒溶液输入超滤器进液端的次数，直至病毒溶液超滤浓缩至设定的浓度。

进一步优化技术方案，包括以下步骤：

S1.将病毒收获液罐中的病毒收获液泵入已经启动的连续流离心机中，连续流离心机将病毒收获液分离出病毒上清液；

S2.病毒上清液泵入超滤器进液端，病毒在超滤器内单次过膜超滤浓缩；透过超滤膜的物质从超滤器废液端流出；不能透过超滤膜的物质经过超滤器回流端进入浓缩缓冲单元，并由浓缩缓冲单元再次泵入超滤器进液端；

S3.通过控制待浓缩病毒液全部单次过膜的方式，使得待浓缩病毒在超滤器内进行多轮超滤浓缩；

S4.将浓缩液泵入定容瓶中，冲洗超滤器及管道，将超滤器内残留的浓缩液冲洗至定容瓶内。

进一步优化技术方案，在进行步骤S1前，还包括对连续流离心机和/或超滤器进行灭菌的步骤。

进一步优化技术方案，对连续流离心机进行灭菌的步骤为：

将β-丙内酯溶液泵入连续流离心机中，对连续流离心机进行灭菌；

灭菌完成后，对连续流离心机进行清洗。

进一步优化技术方案，对超滤器进行灭菌的步骤为：

将氢氧化钠溶液泵入超滤器中，对超滤器进行灭菌；

灭菌完成后，对超滤器进行清洗。

进一步优化技术方案，所述步骤S2中，不能透过超滤膜的物质经过超滤器回流端进入浓缩缓冲罐A中，浓缩缓冲罐A中的物质再次泵入超滤器进液端并通过超滤器对病毒进行单次过膜超滤浓缩，不能透过超滤膜的物质经过超滤器回流端进入浓缩缓冲罐B中；

所述步骤S3中，在浓缩缓冲罐A和浓缩缓冲罐B之间切换，使得待浓缩病毒在超滤器内进行多轮超滤浓缩。

一种病毒单次过膜超滤浓缩的系统，包括：

病毒收获液罐，用于对病毒收获液进行存储；

连续流离心机，具有进液口和出液口，所述进液口与所述病毒收获液罐相连通，所述连续流离心机用于将病毒收获液分离出病毒上清液；

超滤器，内部设置有超滤膜，具有超滤器进液端、超滤器回流端和超滤器废液端，所述超滤器进液端与所述连续流离心机的出液口相连通，所述超滤器用于对病毒上清液进行单次过膜超滤浓缩；

浓缩缓冲单元，一端与所述超滤器回流端相连通，另一端与所述超滤器进液端相连通；所述浓缩缓冲单元用于对经超滤浓缩后病毒溶液进行暂存，且能够将暂存的经超滤浓缩后病毒溶液传输至超滤器进液端并由超滤器对病毒溶液再次浓缩；

定容瓶，与所述超滤器回流端相连通，所述定容瓶用于对经所述超滤器最终处理后的浓缩病毒进行存储；

输送泵组件，用于对病毒收获液或病毒上清液或经超滤浓缩后病毒溶液进行泵送。

进一步优化技术方案，还包括：

病毒澄清液罐，设置在所述连续流离心机的出液口与所述超滤器进液端之间，所述病毒澄清液罐用于存储经所述连续流离心机分离后的病毒上清液。

进一步优化技术方案，还包括：

灭菌单元，与连续流离心机和/或超滤器相连通，所述灭菌单元用于对连续流离心机和/或超滤器进行灭菌；

清洗单元，与连续流离心机和/或超滤器相连通，所述清洗单元用于对灭菌后的连续流离心机和/或超滤器进行清洗。

进一步优化技术方案，还包括：

废液罐，所述连续流离心机、超滤器废液端、浓缩缓冲单元、定容瓶分别与所述废液罐相连通。

进一步优化技术方案，还包括以下内容的至少一项：

所述超滤器进液端和超滤器回流端均设置压力检测表，所述压力检测表用于实时监测超滤器内部压力状况；

所述灭菌单元包括用于存储β-丙内酯溶液的β-丙内酯溶液罐和/或用于存储氢氧化钠溶液的氢氧化钠溶液罐，β-丙内酯溶液罐能够切换至与连续流离心机的进液口相连通的状态，氢氧化钠溶液罐能够切换至与超滤器进液端相连通的状态；

所述清洗单元包括盛装有PBS溶液的PBS罐，PBS罐能够切换至与连续流离心机的进液口或超滤器进液端相连通的状态；

所述连续流离心机用20~30L PBS溶液进行清洗，所述超滤器用PBS溶液进行清洗，清洗至超滤器废液端pH值7.2~7.4；

所述病毒收获液罐、β-丙内酯溶液罐、病毒澄清液罐、PBS罐、定容瓶、氢氧化钠溶液罐、浓缩缓冲单元和废液罐的罐体上部均有空气过滤器。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，采用病毒单次过膜超滤浓缩方式，以狂犬病病毒为例，该超滤方式能够保证在超滤浓缩过程中所有病毒颗粒进入超滤膜包的次数一致，避免了部分病毒颗粒因为反复进入膜包而被剪切力破环其G蛋白结构甚至病毒完整性的问题，从而能最大程度保持病毒颗粒的完整性，进而提高后续病毒层析纯化质量以及疫苗质量。

2.本发明提供的一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，与常规循环过膜超滤浓缩方式相比存在以下优点：

单次过膜超滤浓缩的狂犬病病毒抗原回收率高，病毒颗粒较完整，纯化后抗原质量较高。

3.本发明提供的一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，在对病毒进行超滤浓缩前，对连续流离心机和/或超滤器进行灭菌处理，降低了浓缩后病毒污染的可能性。

4.本发明提供的一种病毒单次过膜超滤浓缩的系统，能够将灭菌、离心澄清及超滤浓缩工序串联，从而增加生产操作简便性，避免中间产物的保存与转移。

5.本发明提供的一种病毒单次过膜超滤浓缩的系统，该系统能够实现工序全部闭环化操作，降低病毒液污染风险。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种病毒单次过膜超滤浓缩的系统的结构示意图。

图2为狂犬病病毒澄清液经不同过膜方式超滤浓缩后浓缩效果对比图。

图3为单次过膜和循环过膜两种方式超滤浓缩的狂犬病病毒浓缩液分子筛层析UV280图谱。

图4为单次过膜和循环过膜两种方式超滤浓缩的狂犬病病毒浓缩液分子筛层析液中狂犬病病毒抗原分布图（其中，A：循环过膜；B：单次过膜）。

图5为狂犬病病毒分子筛层析液SDS-PAGE及Western Blot结果对比图（其中，A：循环过膜；B：单次过膜）。

附图标记：

1、病毒收获液罐，2、β-丙内酯溶液罐，3、蠕动泵，4、连续流离心机，401、进液口，402、出液口，5、病毒澄清液罐，6、PBS罐,7、超滤器，71、超滤器进液端，72、超滤器回流端，73、超滤器废液端，8、隔膜泵，9、定容瓶，10、氢氧化钠溶液罐，11、浓缩缓冲罐A，12、浓缩缓冲罐B，13、废液罐，14、病毒输送管，15、分离液输送管，16、废液输送总管，17、病毒澄清液输送管，18、β-丙内酯溶液输送管，19、PBS溶液输送管，20、氢氧化钠溶液输送管，21、超滤器进液输送管，22、超滤器回流液输送管，23、超滤器废液输送管，24、浓缩缓冲罐A进液管，25、浓缩缓冲罐A排液管，26、浓缩缓冲罐B进液管，27、浓缩缓冲罐B排液管，28、第一阀门，29、第二阀门，30、第三阀门，31、第四阀门，32、第五阀门，33、第六阀门，34、第七阀门，35、第八阀门，36、第九阀门，37、第十阀门，38、第十一阀门，39、第十二阀门，40、第十三阀门，41、第十四阀门，42、第十五阀门，43、第十六阀门，44、第十七阀门，45、第十八阀门，46、第十九阀门，47、第二十阀门，48、第二十一阀门，49、第二十二阀门，50、第二十三阀门，51、第二十四阀门,52、浓缩缓冲罐循环管。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

如图1所示，本实施例公开了一种病毒单次过膜超滤浓缩的系统，该系统为适用于中试、规模化生产的狂犬病病毒收获液澄清、超滤浓缩系统，该系统包括：病毒收获液罐1、输送泵组件、连续流离心机4、超滤器7、浓缩缓冲单元和定容瓶9。

病毒收获液罐1用于对病毒收获液进行存储。

输送泵组件用于对病毒收获液或病毒上清液或经超滤浓缩后病毒溶液进行泵送。

连续流离心机4具有进液口401和出液口402，进液口与病毒收获液罐1相连通，连续流离心机4用于将病毒收获液分离出病毒上清液。连续流离心机4购自日本日立公司，型号为CR22N。

超滤器7为切向流超滤器，内部设置有超滤膜，购自Millipore公司，型号JMCDSPCONS，膜包孔径截留分子量100~300 KD。超滤器7共3个端口，分别为超滤器进液端71、超滤器回流端72和超滤器废液端73。超滤器进液端与连续流离心机的出液口相连通，超滤器用于对病毒上清液进行单次过膜超滤浓缩。

浓缩缓冲单元的一端与超滤器回流端相连通，另一端与超滤器进液端相连通。浓缩缓冲单元用于对经超滤浓缩后病毒溶液进行暂存，且能够将暂存的经超滤浓缩后病毒溶液传输至超滤器进液端并由超滤器对病毒溶液再次浓缩。

定容瓶9与超滤器回流端相连通，定容瓶9用于对经超滤器7最终处理后的浓缩病毒进行存储。

上述一种病毒单次过膜超滤浓缩的系统，超滤器7在对病毒进行超滤浓缩后，经浓缩后的病毒进入至浓缩缓冲单元，再由浓缩缓冲单元重新将全部病毒一次性输入至超滤器进液端，再次对病毒进行整体单次过膜超滤浓缩，经浓缩后的病毒再次回流至浓缩缓冲单元，以此对病毒进行多次超滤浓缩。本发明提供了一种狂犬病病毒单次过膜超滤浓缩方式，该超滤方式能够保证在超滤浓缩过程中所有病毒颗粒进入超滤膜包的次数一致，避免了部分病毒颗粒因为反复进入膜包而被剪切力破环其G蛋白结构甚至病毒完整性的问题，从而能最大程度保持病毒颗粒的完整性，进而提高后续病毒层析纯化质量以及疫苗质量。

输送泵组件包括蠕动泵3和隔膜泵8。蠕动泵3设置在病毒收获液罐1与连续流离心机4的进液口之间，蠕动泵3购自Longerpump公司，型号BT600-1J。隔膜泵8位于超滤器进液端处。

作为一种进一步改进的实施方式，本实施例还包括病毒澄清液罐5，病毒澄清液罐5设置在连续流离心机4的出液口与超滤器进液端之间，病毒澄清液罐5用于存储经连续流离心机4分离后的病毒上清液，即连续流离心机4对病毒溶液进行分离后的病毒上清液会进入至病毒澄清液罐5。

超滤器进液端连通有超滤器进液输送管21，超滤器回流端连通有超滤器回流液输送管22，超滤器废液端连通有超滤器废液输送管23。病毒收获液罐1通过病毒输送管14与连续流离心机4的进液口相连通，连续流离心机4的出液口通过分离液输送管15与病毒澄清液罐5相连通，病毒澄清液罐5通过病毒澄清液输送管17与超滤器进液输送管21相连通。病毒澄清液输送管17上设置有第七阀门34，分离液输送管15直接连接至病毒澄清液罐5的进液端，分离液输送管15上设置有第八阀门35。

作为一种进一步改进的实施方式，本实施例还包括灭菌单元和清洗单元。灭菌单元与连续流离心机4和/或超滤器7相连通，灭菌单元用于对连续流离心机4和/或超滤器7进行灭菌。清洗单元与连续流离心机4和/或超滤器7相连通，清洗单元用于对灭菌后的连续流离心机4和/或超滤器7进行清洗。本实施例在工序进行前对连续流离心机4和/或超滤器7主要部件进行在线灭菌，降低了浓缩后病毒污染的可能性。

灭菌单元包括β-丙内酯溶液罐2和/或氢氧化钠溶液罐10。

β-丙内酯溶液罐2用于存储β-丙内酯溶液。β-丙内酯溶液罐2通过β-丙内酯溶液输送管18与病毒输送管14相连通，β-丙内酯溶液输送管18上设置有第一阀门28，与β-丙内酯溶液输送管18相交处的病毒输送管14两侧分别设置有第二阀门29和第三阀门30。当需要通过β-丙内酯溶液对连续流离心机4进行灭菌时，关闭第二阀门29，打开第一阀门28和第三阀门30，β-丙内酯溶液输送管18与连续流离心机4的进液口相连通，通过β-丙内酯溶液对连续流离心机4进行灭菌。

氢氧化钠溶液罐10用于存储氢氧化钠溶液。氢氧化钠溶液罐10通过氢氧化钠溶液输送管20与超滤器进液输送管21相连通，氢氧化钠溶液输送管20上设置有第四阀门31，超滤器进液输送管21上设置有第五阀门32。病毒澄清液输送管17与氢氧化钠溶液输送管20及超滤器进液输送管21相交汇，病毒澄清液输送管17上设置有第六阀门33。当需要通过氢氧化钠溶液对超滤器7进行清洗时，关闭第六阀门33，打开第四阀门31和第五阀门32，使得氢氧化钠溶液输送管20与超滤器进液输送管21相连通，通过氢氧化钠溶液对超滤器7进行灭菌。

清洗单元包括盛装有PBS溶液的PBS罐6，连续流离心机4用20~30L PBS溶液进行清洗，超滤器7用PBS溶液进行清洗，超滤器清洗至超滤器废液端pH值7.2~7.4。PBS罐6通过PBS溶液输送管19连通至病毒输送管14的侧部，并且PBS溶液输送管19与病毒澄清液输送管17相交汇。与病毒澄清液输送管17交汇处的PBS溶液输送管19两侧设置有第九阀门36和第十阀门37，与PBS溶液输送管19交汇处的病毒澄清液输送管17两侧设置有第七阀门34和第十一阀门38。当需要对连续流离心机4进行清洗时，关闭第七阀门34和第十一阀门38，打开第九阀门36和第十阀门37，PBS溶液输送管19与病毒输送管14相连通，PBS罐6中的PBS溶液通入到连续流离心机4对连续流离心机4进行清洗。

作为一种进一步改进的实施方式，本实施例还包括废液罐13，连续流离心机4、超滤器废液端、浓缩缓冲单元、定容瓶9分别与废液罐13相连通。更为具体地，废液罐13的进液端连通有废液输送总管16，分离液输送管15通过分支管路与废液输送总管16相连通。β-丙内酯溶液罐2通过β-丙内酯溶液罐废液管与废液输送总管16相连通，β-丙内酯溶液罐废液管上设置有第十二阀门39，废液输送总管16上设置有第十三阀门40，第十三阀门40用于控制从β-丙内酯溶液罐2和连续流离心机4排出的废液是否通入到废液输送总管16。

超滤器废液输送管23与废液输送总管16相连通，超滤器废液输送管23上设置有第十四阀门41。

定容瓶9通过定容瓶输送管与超滤器回流液输送管22相连通，定容瓶输送管上设置有第十五阀门42。

氢氧化钠溶液罐10与超滤器7之间形成氢氧化钠溶液循环冲洗系统，即氢氧化钠溶液罐10通过循环管路与超滤器回流液输送管22相连通，循环管路上设置有第十六阀门43。当对超滤器7进行清洗时，可通过隔膜泵8将氢氧化钠溶液罐10中的氢氧化钠溶液泵送至超滤器7。当需要对氢氧化钠溶液进行循环时，可关闭超滤器废液输送管23上的第十四阀门41，打开循环管路上的第十六阀门43，其余阀门关闭，对超滤器7进行清洗后的氢氧化钠溶液重新回流至氢氧化钠溶液罐10中。

本实施例中的浓缩缓冲单元包括浓缩缓冲罐A11和浓缩缓冲罐B12。

浓缩缓冲罐A11上设置有浓缩缓冲罐A进液管24和浓缩缓冲罐A排液管25，浓缩缓冲罐A进液管24与超滤器回流液输送管22相连通，浓缩缓冲罐A进液管24上设置有第十七阀门44，浓缩缓冲罐A排液管25通过浓缩缓冲罐循环管52与超滤器进液输送管21相连通，浓缩缓冲罐A排液管25上设置有第十八阀门45。

浓缩缓冲罐B12上设置有浓缩缓冲罐B进液管26和浓缩缓冲罐B排液管27，浓缩缓冲罐B进液管26与超滤器回流液输送管22相连通，浓缩缓冲罐B进液管26上设置有第十九阀门46，浓缩缓冲罐B排液管27通过浓缩缓冲罐循环管52与超滤器进液输送管21相连通，浓缩缓冲罐B排液管27上设置有第二十阀门47。

浓缩缓冲罐循环管52上设置有第二十一阀门48。浓缩缓冲罐A11与浓缩缓冲罐B12之间的超滤器回流液输送管22上设置有第二十二阀门49，浓缩缓冲罐B12与废液输送总管16之间的超滤器回流液输送管22上设置有第二十三阀门50。

位于废液罐13进口端的废液输送总管16上设置有第二十四阀门51。

病毒收获液罐1与连续流离心机4、病毒澄清液罐5、定容瓶9、浓缩缓冲液罐A11、浓缩缓冲液罐B12、废液罐13依次相连。

β-丙内酯溶液罐2、PBS罐6、病毒收获液罐1分别与连续流离心机4的进液口连接，之间设置蠕动泵3；β-丙内酯溶液罐2、病毒澄清液罐5、PBS罐6、废液罐13分别与连续流离心机4的出液口连接，用于对连续流离心机进行在线灭菌和清洗及病毒收获液离心澄清。

病毒澄清液罐5、PBS罐6，氢氧化钠溶液罐10、浓缩缓冲罐A11、浓缩缓冲罐B12分别与超滤器进液端相连，之间设置隔膜泵8；氢氧化钠溶液罐10、定容瓶9、浓缩缓冲罐A11、浓缩缓冲罐B12、废液罐13与超滤器回流端相连；超滤器废液端与废液罐13相连；用于对超滤器进行在线灭菌清洗及病毒澄清液超滤浓缩。

作为一种进一步改进的实施方式，病毒收获液罐1、β-丙内酯溶液罐2、病毒澄清液罐5、PBS罐6、定容瓶9、氢氧化钠溶液罐10、浓缩缓冲罐A11、浓缩缓冲罐B12、废液罐13罐体上部均有空气过滤器。

作为一种进一步改进的实施方式，超滤器进液端和超滤器回流端均设置压力检测表，压力检测表用于实时监测超滤器内部压力状况。

实施例2

在实施例1的基础上，本实施例公开了一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，包括以下步骤：

步骤S1：组装实施例1中的一种病毒单次过膜超滤浓缩的系统。

组装管路，采用高温高压（121℃）对管路、罐体进行灭菌。

在A级环境下，将管路、罐体、连续流离心机、超滤器组装。

步骤S2：启动连续流离心机，设置参数（温度2~8℃，转速 3000~8000g），设定连续流离心机转速至目标转速。

步骤S3：连续流离心机的进液口和出液口均切换到β-丙内酯溶液罐，待连续流离心机达到设定转速后，将β-丙内酯溶液（浓度1：1000~1：4000（V:V））通过蠕动泵泵入连续流离心机中，对连续流离心机进行循环灭菌（循环40~80分钟）。灭菌完毕后，连续流离心机进液口切换到PBS溶液罐，连续流离心机的出液口切换到废液罐，通过PBS溶液（0.01 mol/L，pH 7.2~7.4）对连续流离心机进行清洗。

步骤S4：超滤器进液端和超滤器回流端切换至氢氧化钠溶液罐，超滤器废液端切换至废液罐，开启隔膜泵，将氢氧化钠溶液（0.2~0.8mol/L）泵入超滤器中，对超滤器进行灭菌（循环60~240分钟）。灭菌完毕后，超滤器进液端切换到PBS罐，超滤器回流端和超滤器废液端切换到废液罐，用PBS溶液（0.01 mol/L，pH 7.2~7.4）对超滤器进行清洗。

步骤S3和步骤S4中，连续流离心机需要用20~30L PBS清洗，切向流超滤器需要用PBS溶液清洗至超滤器废液端pH值7.2~7.4。

步骤S5：将连续流离心机进液口切换至病毒收获液罐1，连续流离心机出液口切换至病毒澄清液罐5，将狂犬病病毒收获液通过蠕动泵3泵入连续流离心机中进行离心澄清，细胞碎片及细胞器等大分子杂质沉淀到离心机腔壁上，病毒随病毒上清液流出收集到澄清液罐中，从而对狂犬病病毒收获液进行初步纯化。病毒上清液从连续流离心机出口流出后，进入病毒澄清液罐5中。

步骤S6：将超滤器进液端切换至病毒澄清液罐5，超滤器回流端切换至浓缩缓冲罐A，超滤器废液端切换至废液罐，开启隔膜泵8，将病毒澄清液罐5中的病毒澄清液泵入超滤器7中。病毒颗粒等大分子物质不能透过超滤膜，经过超滤器回流端进入缓冲罐A中；水分子和小分子杂质透过超滤膜，从超滤器废液端流出，进入废液罐13。直至病毒澄清液罐5全部病毒澄清液进入超滤器，完成第一轮超滤浓缩。

步骤S7：将超滤器进液端切换至浓缩缓冲罐A，超滤器回流端切换至浓缩缓冲罐B，超滤器废液端切换至废液罐。开启隔膜泵8，将浓缩缓冲罐A中的病毒液泵入切向流超滤器中。病毒颗粒等大分子物质不能透过超滤膜，经过超滤器回流端进入浓缩缓冲罐B中；水分子和小分子杂质透过超滤膜，超滤膜透过液经过超滤器废液端进入废液罐13中。直至浓缩缓冲罐A中病毒液全部进入超滤器中，完成第二轮超滤。

步骤S8：通过控制待浓缩病毒液全部单次过膜的方式，在浓缩缓冲罐A和浓缩缓冲罐B之间切换，直至浓缩缓冲罐A和浓缩缓冲罐B中的溶液体积小于目标定容体积。将超滤器回流端切换为定容瓶9，废液端止液阀关闭，将浓缩液泵入定容瓶9中。超滤器进液端切换至PBS罐6，用PBS溶液冲洗超滤器及管道，将超滤器内残留的浓缩液冲洗至定容瓶9内，直至定容瓶内液体体积达到目标定容体积。

上述一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，是将狂犬病病毒澄清液从病毒澄清液罐5泵入切向流超滤膜包内，由于病毒分子量较大（300000~600000KD），能够被超滤膜截留而从超滤器回流端进入浓缩缓冲罐中，小分子物质（杂质和水）透过超滤膜，从超滤器废液端流出，进入废液罐13。病毒液在单个浓缩缓冲罐和超滤膜包之间反复循环最终体积缩小，达到目标浓缩体积，然后将浓缩液收集，实现狂犬病病毒超滤浓缩。

实施例3

本实施例是将单次过膜超滤浓缩与常规循环过膜超滤浓缩效果进行对比的实施例。

将本发明中单次过膜超滤浓缩的狂犬病病毒浓缩液，采用常规循环过膜超滤浓缩的狂犬病病毒浓缩液，以及浓缩前的病毒澄清液，分别进行狂犬病抗原含量检测（采用酶联免疫吸附法（ELISA法），《中华人民共和国药典》2020年版 三部通则3429，ELISA试剂盒为上海青赛生物科技股份有限公司自制）、牛血清白蛋白残留量检测（《中华人民共和国药典》2020年版 三部通则3411，试剂盒购自无锡博生医用生物技术开发有限公司）、蛋白质含量检测(采用lowry法（《中华人民共和国药典》2020年版 三部 通则0731）)，评估两种浓缩方式的抗原回收率及杂质去除率。

结果如图2所示，本发明中所阐述的单次过膜超滤浓缩与常规循环过膜超滤浓缩方式，杂质去除率无显著差异，单次过膜超滤浓缩的狂犬病病毒抗原回收率高于常规循环过膜超滤浓缩方式。可能原因在于，循环过膜超滤浓缩时，完整病毒颗粒遭受破环或者病毒表面G蛋白脱落，导致无法被超滤膜拦截而透过膜进入废液里，部分病毒不能被回收而进入废液中，从而导致抗原回收率降低。

实施例4

本实施例是将单次过膜超滤浓缩与循环过膜超滤浓缩后样品分子筛层析纯化的实施例。

将本发明中单次过膜超滤浓缩的狂犬病病毒浓缩液及采用常规循环过膜超滤浓缩的狂犬病病毒浓缩液，进行分子筛层析纯化，根据UV280nm峰型图、纯化后样品抗原分布、纯化后样品SDS-PAGE、Western Blot评估超滤浓缩方式对病毒纯化质量的影响。

实验过程包括：

步骤1：纯化柱准备，采用Sepharose 4FF填料（购自GE公司）进行装柱，层析柱（购自GE公司，型号XK16/100），柱高90cm，柱体积180ml。

步骤2：用PBS（0.01 mol/L，pH 7.2~7.4）进行平衡1.5~2个柱体积。

步骤3：将两种方式超滤浓缩的狂犬病病毒浓缩液，按照5~7%柱体积分别进行上样，用PBS（0.01 mol/L，pH 7.2~7.4）进行洗脱（1.5~2柱体积）。

步骤4：根据UV280nm OD值收集样品，按照1ml/管分管收集。

对分管收集的样品进行狂犬病抗原含量检测（采用酶联免疫吸附法（ELISA法），《中华人民共和国药典》2020年版 三部通则3429，ELISA试剂盒为上海青赛生物科技股份有限公司自制），确定病毒分布范围。

根据图3结果，循环过膜超滤浓缩后样品分子筛层析后共出现4个峰，第一峰与第二峰分辨率较低；单次过膜超滤浓缩后样品经分子筛层析共出现3个峰，第一峰与第二峰分辨率较高。

对分管收集样品进行狂犬病病毒抗原检测以确定病毒分布，结果如图4(A、B)所示：循环过膜超滤浓缩后样品分子筛层析，病毒主要分布在第一峰，第二峰含有部分病毒，第三峰与第四峰均不含狂犬病病毒；单次过膜超滤浓缩后样品分子筛层析，病毒主要分布在第一峰，第二峰及第三峰均不含狂犬病病毒。

原因为循环过膜超滤浓缩会导致部分病毒颗粒崩解，所以在分子筛层析时，崩解的狂犬病病毒颗粒分子量远远小于完整病毒颗粒分子量，所以会随着第二峰流穿出来。而单次过膜超滤浓缩，病毒颗粒较完整，所以在分子筛层析时不会紧接着第一峰（纯病毒峰）出现含有部分崩解病毒颗粒的第二峰。

实施例5

本实施例是不同过膜方式超滤浓缩样品分子筛层析后SDS-PAGE及Western Blot结果对比的实施例。

狂犬病病毒浓缩液经分子筛层析后，病毒主要分布在第1峰、第2峰，第3峰和第4峰中未检测到狂犬病病毒，所以将纯化后的层析液峰1、峰2进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹（Western Blot）确定病毒，具体步骤如下：

步骤1：峰1、峰2层析液与5×Loading Buffer（购自Elabscience，E-BC-R288）按照1：4（V:V）混匀，100℃变性5min。

步骤2：上样，12%聚丙烯酰胺凝胶（购自invitrogen，1mm×15well，21050670），每孔上样12µl，加入SDS Running Buffer（购自novex，批号2166662），电压100V跑胶100min。

步骤3：SDS-PAGE所用胶进行考马斯亮蓝染色。

步骤4：蛋白质免疫印迹（Western Blot）所用胶转PVDF膜（购自BIO-RAD，1620177），120V转膜30min。

步骤5：用0.5%脱脂奶粉进行封闭（30min），1：2000（V:V）N蛋白抗体作为一抗（兔抗RABV N蛋白，上海青赛生物科技股份有限公司自制）孵育1小时，1：2500（V:V）HRP-羊抗兔IgG（购自BOSTER，批号BST16C17B16D54）孵育1小时，显色后使用成像仪（购自GE，amershamimager 680）进行显色。

结果如图5（A）所示，循环过膜超滤浓缩后病毒液分子筛层析样品，SDS-PAGE及Western Blot结果显示峰1中为纯病毒，峰2中含有部分病毒及杂蛋白；单次过膜超滤浓缩后病毒液分子筛层析样品，SDS-PAGE及Western Blot结果显示峰1中为纯病毒，峰2中全部为杂蛋白。

进一步说明了，循环过膜超滤浓缩，由于部分病毒颗粒反复进出超滤膜包所受剪切力影响较大，会使部分病毒颗粒崩解成不完整病毒结构。在浓缩时，部分不完整结构病毒会穿过超滤膜流入废液，降低抗原回收率；在后续分子筛纯化时，不完整结构病毒由于分子量小于完整结构病毒颗粒，病毒碎片会在病毒主分布峰（峰1）后形成含有部分病毒碎片的次病毒峰（峰2），由于峰2还含有部分杂蛋白，收集峰2会影响纯化后抗原质量。

单次过膜超滤浓缩，浓缩阶段抗原回收率较高，且分子筛纯化只出现1个病毒峰，纯化后抗原质量较高。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，其特征在于，所述方法基于一种病毒单次过膜超滤浓缩的系统进行；

所述系统用于对狂犬病病毒进行超滤浓缩，包括：

病毒收获液罐（1），用于对病毒收获液进行存储；

连续流离心机（4），具有进液口和出液口，所述进液口与所述病毒收获液罐（1）相连通，所述连续流离心机（4）用于将病毒收获液分离出病毒上清液；

超滤器（7），内部设置有超滤膜，具有超滤器进液端、超滤器回流端和超滤器废液端，所述超滤器进液端与所述连续流离心机的出液口相连通，所述超滤器用于对病毒上清液进行单次过膜超滤浓缩；

浓缩缓冲单元，一端与所述超滤器回流端相连通，另一端与所述超滤器进液端相连通；所述浓缩缓冲单元用于对经超滤浓缩后病毒溶液进行暂存，且能够将暂存的经超滤浓缩后病毒溶液传输至超滤器进液端并由超滤器对病毒溶液再次浓缩；

定容瓶（9），与所述超滤器回流端相连通，所述定容瓶（9）用于对经所述超滤器（7）最终处理后的浓缩病毒进行存储；

输送泵组件，用于对病毒收获液或病毒上清液或经超滤浓缩后病毒溶液进行泵送；所述输送泵组件包括蠕动泵（3）和隔膜泵（8），蠕动泵（3）设置在病毒收获液罐（1）与连续流离心机（4）的进液口之间，隔膜泵（8）位于超滤器进液端处；

病毒澄清液罐（5），设置在所述连续流离心机（4）的出液口与所述超滤器进液端之间，所述病毒澄清液罐（5）用于存储经所述连续流离心机（4）分离后的病毒上清液；

灭菌单元，与连续流离心机（4）和/或超滤器（7）相连通，所述灭菌单元用于对连续流离心机（4）和/或超滤器（7）进行灭菌；所述灭菌单元包括用于存储β-丙内酯溶液的β-丙内酯溶液罐（2）和/或用于存储氢氧化钠溶液的氢氧化钠溶液罐（10），β-丙内酯溶液罐（2）能够切换至与连续流离心机（4）的进液口相连通的状态，氢氧化钠溶液罐（10）能够切换至与超滤器进液端相连通的状态；

清洗单元，与连续流离心机（4）和/或超滤器（7）相连通，所述清洗单元用于对灭菌后的连续流离心机（4）和/或超滤器（7）进行清洗；

所述方法用于对狂犬病病毒进行超滤浓缩，所述方法是将病毒溶液全部采用隔膜泵泵入超滤器进液端，由超滤器（7）对全部的病毒溶液进行单方向超滤浓缩，将经超滤浓缩后病毒溶液再次全部采用隔膜泵泵入超滤器进液端，由超滤器（7）对全部的经超滤浓缩后病毒溶液再次进行单方向超滤浓缩，控制经超滤浓缩后病毒溶液采用隔膜泵泵入超滤器进液端的次数，直至病毒溶液超滤浓缩至设定的浓度；

将单次过膜超滤浓缩的狂犬病病毒浓缩液及采用循环过膜超滤浓缩的狂犬病病毒浓缩液，进行分子筛层析纯化，根据UV280nm峰型图、纯化后样品抗原分布、纯化后样品SDS-PAGE、Western Blot评估超滤浓缩方式对病毒纯化质量的影响，实验过程包括：

纯化柱准备，采用填料进行装柱，层析柱的柱高90cm，层析柱的柱体积180ml；

用PBS进行平衡1.5~2个柱体积；

将两种方式超滤浓缩的狂犬病病毒浓缩液，按照5~7%柱体积分别进行上样，用PBS进行洗脱；

据UV280nm OD值收集样品，按照1ml/管分管收集；

采用酶联免疫吸附法对分管收集的样品进行狂犬病抗原含量检测，确定病毒分布范围；

狂犬病病毒浓缩液经分子筛层析后，病毒主要分布在第1峰、第2峰，第3峰和第4峰中未检测到狂犬病病毒，所以将纯化后的层析液峰1、峰2进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹确定病毒。

2.根据权利要求1所述的一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将病毒收获液罐（1）中的病毒收获液泵入已经启动的连续流离心机（4）中，连续流离心机（4）将病毒收获液分离出病毒上清液；

S2.病毒上清液泵入超滤器进液端，病毒上清液在超滤器（7）内单次过膜超滤浓缩；透过超滤膜的物质从超滤器废液端流出；不能透过超滤膜的物质经过超滤器回流端进入浓缩缓冲单元，并由浓缩缓冲单元再次泵入超滤器进液端；

S3.通过控制待浓缩病毒液全部单次过膜的方式，使得待浓缩病毒在超滤器（7）内进行多轮超滤浓缩；

S4.将浓缩液泵入定容瓶（9）中，冲洗超滤器（7）及管道，将超滤器（7）内残留的浓缩液冲洗至定容瓶（9）内。

3.根据权利要求2所述的一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，其特征在于，在进行步骤S1前，还包括对连续流离心机（4）和/或超滤器（7）进行灭菌的步骤。

4.根据权利要求3所述的一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，其特征在于，对连续流离心机（4）进行灭菌的步骤为：

将β-丙内酯溶液泵入连续流离心机（4）中，对连续流离心机（4）进行灭菌；

灭菌完成后，对连续流离心机（4）进行清洗。

5.根据权利要求3所述的一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，其特征在于，对超滤器（7）进行灭菌的步骤为：

将氢氧化钠溶液泵入超滤器（7）中，对超滤器（7）进行灭菌；

灭菌完成后，对超滤器（7）进行清洗。

6.根据权利要求2所述的一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，其特征在于，所述步骤S2中，不能透过超滤膜的物质经过超滤器回流端进入浓缩缓冲罐A（11）中，浓缩缓冲罐A（11）中的物质再次泵入超滤器进液端并通过超滤器（7）对病毒进行单次过膜超滤浓缩，不能透过超滤膜的物质经过超滤器回流端进入浓缩缓冲罐B（12）中；

所述步骤S3中，在浓缩缓冲罐A和浓缩缓冲罐B之间切换，使得待浓缩病毒在超滤器（7）内进行多轮超滤浓缩。

7.根据权利要求1所述的一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，其特征在于，还包括：

废液罐（13），所述连续流离心机（4）、超滤器废液端、浓缩缓冲单元、定容瓶（9）分别与所述废液罐（13）相连通。

8.根据权利要求1所述的一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法，其特征在于，还包括以下内容的至少一项：

所述超滤器进液端和超滤器回流端均设置压力检测表，所述压力检测表用于实时监测超滤器内部压力状况；

所述清洗单元包括盛装有PBS溶液的PBS罐（6），PBS罐（6）能够切换至与连续流离心机（4）的进液口或超滤器进液端相连通的状态；

所述连续流离心机（4）用20~30L PBS溶液进行清洗，所述超滤器（7）用PBS溶液进行清洗，清洗至超滤器废液端pH值7.2~7.4；

所述病毒收获液罐（1）、β-丙内酯溶液罐（2）、病毒澄清液罐（5）、PBS罐（6）、定容瓶（9）、氢氧化钠溶液罐（10）、浓缩缓冲单元和废液罐（13）的罐体上部均有空气过滤器。