TW201706403A - 用於連續減少微生物產生及／或處理產物的模組化系統與方法 - Google Patents

用於連續減少微生物產生及／或處理產物的模組化系統與方法 Download PDF

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Abstract

本發明係提供用於連續減少微生物產生及/或處理來自非均勻細胞培養液混合物之生物醫藥、生物大分子產物的方法，其包括下列步驟：(a)提供一來自含有產物之非均勻細胞培養液混合物的無顆粒液體，(b)至少一次過濾，提供一濾液，(c)至少二次層析步驟供純化產物，(d)至少一次病毒耗竭，(e)至少一次超過濾及/或至少一次步驟(b)、(c)及/或(d)產物流之滲濾，其特徵在於至少二次(c)之層析步驟係包括在各情況下經由至少二個層析管柱及/或膜吸附器之純化，及該方法係以封閉和模組方式來進行。本發明進一步係提供用於進行該方法之對應的模組系統。

Description

用於連續減少微生物產生及/或處理產物的模組化系統與方法
本發明係關於用於連續減少微生物產生及/或處理來自非均勻細胞培養液混合物之產物的模組化系統與方法。
在生物技術生產中，蛋白通常係分批純化。此項係表示以逐批的方式不連續處理個別的生產循環，其中係在生產循環完成後，移出整個產物。然後必須開始一分開的新生產循環/批次，以便再次生產。
在最近幾年，已逐漸驗證在生物技術生產上亦可進行連續製程，其中此方法係在無中斷下運作，與分批處理相反。
高管制醫藥生產就時間、技術和人力而言需要很大努力以提供清潔和無菌的生物反應器及確保無菌產品。為了確實避免萬一多用途系統中產品轉換或二批產物之間的交叉污染，除了清潔之外所需要的是非常複雜的清潔確認，其，若適用，必須重複製程調適。
此項適用於上游處理(USP)，亦即發酵槽中的生物產物的製造，以及下游處理(DSP)，亦即發酵產物的純化。
特言之，在發酵的情況下，無菌環境為成功培養所必須。就批式發酵槽或分批給料發酵槽之殺菌，一般係使用SIP技術(SIP=原位殺菌)。
因必須的清潔和殺菌程序所導致的反應器停工可能佔用了反應器可利用性之主要分配，特別是在短期使用和頻繁產品更換的情況。此項影響，例如生物技術生產USP中培養劑製備和發酵之處理步驟，以及DSP中溶解、冷凍、解凍、pH調整、生產分離，例如經由層析、沉澱或結晶、調整緩衝劑和病毒失活。
在下游處理中，管制要求為降低微生物處理的管理。因此，就分批操 作的情況並不需要殺菌處理。然而，連續製程中，蛋白的純化係在一段相當長的時間內進行，若可能，並無清潔步驟。此項較佳地係於純化期間在無殺菌步驟下進行。即使微生物污染的風險高於簡單分批操作情況許多倍，但情況即是如此。
WO2012/078677描述了藉由層析和生產系統中之整合，更特言之於可拋棄系統中，用於連續處理生物醫藥產物之方法和系統。雖然WO2012/078677提供了連續製造生物醫藥和生物產物之方法，但所揭示的解決方法並不足以用於施行。WO2012/078677同時並未揭示使用無菌層析管柱。
US 2014/0255994 A1揭示了用於製造治療蛋白之整合的連續方法。然而，US 2014/0255994 A1並未揭示無菌層析管柱可用此一方法中之特點。
EP 2 182 990 A1揭示了藉由使用熱水蒸氣用於將層析管柱殺菌之方法。
首先，某些術語將更詳細定義。
在本發明內文中，連續方法係指任何進行至少二個連續處理步驟之方法，上游步驟之輸出流運送到該方法中的下游步驟。在上游步驟完成前，下游步驟即開始處理產物流。典型地，以一連續方法，部份的產物流通常係在生產系統中運送且係稱為「連續產物流」。因此，產物流從上游單位連續運送或轉移到下游單位係指在上游單位停止作業之前下游單位已開始操作，亦即二個連續相連接的單位同時處理流經其中的產物流。
在本發明內文中，術語「降低微生物」係指降低每單位面積或單位體積之微生物數至幾乎為零的狀態，其係藉由適合的降低微生物方法來進行，可能的係由γ照射、β照射、高壓蒸氣滅菌、環氧乙烷(ETO)處理和「原位蒸氣」(SIP)處理中選出該降低微生物的方法。
在本發明內文中，術語「可拋棄物件」係指與產品接觸的該所指物件，更特言之裝置、桶槽、過濾器和連接元件，適合一次性使用及隨後丟棄，可能的該桶槽係由塑膠或金屬所製成。在本發明內文中，此術語亦涵蓋可再使用的物件，例如在本發明方法中僅使用一次及然後於該方法中不再使用。在本發明內文中，該可再使用物件，例如有不鏽鋼所製，則亦係指「用 作可拋棄物件之物體」。在本發明方法中，此所用的可拋棄物件亦分別可指作為「可拋棄」或「單次使用」物件(“SU technology”)。這些又進一步增進本發明方法和模組系統之降低微生物狀態。
在本發明內文中，術語「產物流」係指來自含有產物之非均勻細胞培養/液體混合物之無顆粒流體，以及本發明方法之各自的其他處理步驟之成果，亦即過濾後、層析後、病毒耗竭後、超過濾後、滲濾後或本發明方法之另外的步驟後之產物流，然後，該產物流可能的係具有不同的濃度和純化程度。
在本發明內文中，術語「病毒耗竭(virus depletion)」係指降低所處理之液體的每單位體積之活性病毒濃度，直到存在所處理流體中的病毒完全失活及/或移除。
在本發明內文中，術語「殺微生物劑」係指可緩慢或完全抑制微生物生長之物質，該殺微生物劑可能係以含殺微生物劑之緩衝液的形式來使用，特別是在本發明方法內文中之超過濾期間。
在本發明內文中，術語「除泡器」係指在所指之流體於脫氣的同時，用於收集氣泡之裝置，其中當此項進行時所指之流體則進行脫氣。
在本發明內文中，術語「模組」係指本發明方法之個別的步驟可在彼此相連接之分開的模組中進行，此等模組係預先設定及降低微生物且可能的係以密閉的方式及不同的組合相互連接。
在本發明內文中，術語「模組系統」係指一系列的模組(「單元」)其中可運送流體(「產物流」)且其係彼此相連接供進行至少二個下游及/或上游步驟。根據本發明，此等單元係適用於連續進行一步驟並且可以連續液流(「產物流」)作業。在此連接中，「模組系統」之個別的模組可以任何組合彼此相互連接。在本發明內文中模組之實例為過濾模組2，層析模組3，超過濾模組6，滲濾模組7及透析模組8。
在本發明內文中，術語「密閉」係指本發明方法及本發明模組系統之操作模式，其係在操作下使得藉由該方法和該模組系統所生產及/或所處理的產物不會暴露在室內環境。物質、物件、緩衝液等等可從外面加到密閉的本發明製程及本發明對應的密閉模組系統中，然而，此添加係以避免所生產及/或所處理的產物暴露於室內環境之方式來進行。
先其技術已知的方法具有一系列缺點，其將於下文處理。
用於製造生物醫藥和生物產品之已知方法典型地係包括下列彼此相連接的生產步驟：
1.灌注培養
2.細胞駐留系統，亦可使用分批給料培養作為步驟1和2之替代步驟，
3.移出細胞
4.緩衝液或培養液交換，較佳地以濃度
5.降低生物負荷，較佳地以無菌過濾
6.捕獲層析。
典型地，進行另外的步驟供進一步純化產物流，更特言之：
7.病毒失活
8.中和，及
9.視需要進一步深層過濾，降低生物負荷(無菌過濾)。
有鑑於生物醫藥製造之高品質標準，典型地係另外進行下列步驟：
10.層析中間物及高品質純化
11.降低微生物負荷，例如無菌過濾
12.病毒過濾
13.緩衝液交換及較佳地濃度，及
14.無菌過濾。
在上述的生產中，含有營養溶液之發酵槽中的細胞產生了生物產物，例如蛋白，例如治療蛋白。此營養溶液亦為微生物，例如細菌和孢子之理想的生長培養基。因為此等微生物生長並非所希望的，因此從這些狀況產生了問題。該不欲的微生物生長特別是在長時間運作的情況下變成了問題，因為當處理的運作時間增加時營養溶液污染逐漸增加，直到微生物的指數生長且因此完全失去所製造的該批生物產物。
為了達到快速和可變通的製造系統再裝填同時維持最大的清潔和無菌之要求，就連續生產之概念，較佳地使用可拋棄技術，吸引持續增加的市場利益。
對於長時間運作的此一方法，範圍從2小時或以上至數天到數週內，然而習用的衛生清潔方法為不足的，例如習用的「原位清潔」(CIP)方法， 例如藉由如1M NaOH之衛生清潔。在運作時間為2小時或以上的情況下，此等習用方法和系統因此具有高度易遭受可能污染及/或可能的微生物生長之缺點。
因此，需要一種供來自非均勻細胞培養液混合物之產物連續純化的方法，由於其微生物減低的狀況而得以讓連續作業模式進行數週。
因此本發明之一目標係開發一種方法和對應系統，藉此產物，例如蛋白可於數小時至數週的期間內連續純化。
本發明藉由提供一用於連續、降低微生物之生產及/或處理來自非均勻細胞培養液混合物之生物醫藥、生物大分子產品的方法，來達到此目標，該方法係包括下列步驟：(a)以產物流之形式，提供一含有產物之來自非均勻細胞培養液混合物的無顆粒流體，(b)至少一次過濾，提供一濾液，(c)至少二個層析步驟供純化產物，(d)至少一次病毒耗竭，(e)至少一次超過濾及/或至少一次步驟(b)、(c)及/或(d)產物流之滲濾，其特徵在於至少二次(c)之層析步驟係包括在各情況下經由至少二個層析管柱及/或膜吸附器之純化，及該方法係以密閉和模組方式來進行。
本發明方法之基礎為其四個核心原則及因此核心特質為：
1.連續
2.降低微生物
3.密閉，及
4.模組製造生物醫藥、生物大分子產物。
這四種特質共同大大地降低常發生的不欲微生物生長的問題，讓本發明方法之運作時間以持續的作業模式高達8週。
在步驟a)中所提供的來自非均勻細胞培養液混合物之無顆粒流體較佳的可源自連續灌注和發酵製程，例如細胞培養或組織培養，或灌注反應器。甚至一個以上的灌注反應器，例如二個灌注反應器平行作業為可能的。
此流體首先可經由適合的細胞駐留系統連續釋出，例如傾斜的盤分離器(沉澱器)，藉此可保留大部份的細胞。存在流體中的顆粒然後可藉由後續 過濾及/或離心步驟或其他適合的分離法從流體中移除，得到含有生物醫藥、生物大分子產物之無顆粒流體。
過濾步驟(b)可，例如為在步驟(a)後所得到的無顆粒流體之過濾，得到一濾液。然而，本發明之方法亦可在此製程中適合的點包括另外的過濾步驟。
過濾步驟b)可藉由適合的過濾器方法來進行，例如0.2μm過濾器，或二或多個過濾器平行操作。適用於過濾步驟的過濾器為，例如Sartoguard NF 0.2μm過濾器，二或多個此過濾器可平行操作。
在本發明方法之另一實施例中，過濾步驟(b)係包括一帶有另外耗竭污染物，例如DNA、蛋白A、HCP可能性之深層過濾器。這些可為具有足夠的界達電位(zeta potentia)之深層過濾器(Zetapor 3M,Posidyne,Pall)或具有活性碳之深層過濾器(Millistak Merck Millipore)。
步驟c)之用於純化產品的至少二個層析步驟係包括在各情況下經由至少二個層析管柱及/或膜吸附器之純化。就此，層析管柱及/或膜吸附器可具有任何適合的結合原理，例如產物對配體的親和力、離子相互作用、金屬螯合結合、疏水性相互作用或凡德瓦力(van der Waals force)。例如，至少二個層析步驟中的第一層析步驟可為親和層析(例如對產物具有親和力之配體，例如蛋白A、蛋白G、蛋白L、IgM、IgG以及不同於蛋白A、蛋白G、蛋白L、IgM、IgG的重組蛋白且其對產物具有親和力)。然後將其接著一另外的(第二)層析步驟，例如經由離子相互作用之層析。
在步驟c)中，本發明之方法為可變通的，其中，依照所欲達到的產物純度之程度和產物濃度，其可包括任何順序之任何適合的層析原理。
根據步驟c)使用經由至少二個層析管柱及/或膜吸附器之至少二個層析步驟之技術效應為一個別的層析步驟一般不能確保充份移除污染物，例如宿主細胞雜質、聚集物、DNA、蛋白A等。
此外，此舉得以用一層析步驟連續製造，因為至少一個層析管柱及/或膜吸附器可裝載未純化產物，而至少另一個層析管柱及/或膜吸附器可再重建或溶離，可使此製程達到一連續和有效的作業模式。
在本發明方法之另一實施例中，一或多個用於調整pH及/或調整導電率及/或過濾步驟及/或濃縮步驟及/或緩衝液交換之另外的步驟，可在步驟(c) 中至少二個層析步驟之間及/或步驟(d)之病毒失活之後進行。此舉讓用於此方法之作業模式得以適應條件調整。
步驟d)之至少一病毒耗竭特別可藉由調整無顆粒流體之pH來進行，較佳地調整至4.0之pH。無顆粒流體之pH調整至4.0失活性，可例如藉由加入HCl溶液來進行。此添加典型地係在病毒耗竭裝置之前進行。典型地，pH係使用鹼，例如氫氧化鈉(NaOH)調整至>4，以終止病毒耗竭。
然而，步驟d)之至少一病毒耗竭亦可藉由溶劑/清潔劑步驟來進行，其中病毒耗竭係藉由溶劑/清潔劑來完成。
在另一實施例中，病毒耗竭亦可藉由UV處理及/或藉由熱處理來完成。
步驟d)之至少一病毒耗竭特別是可在駐留部分進行，一分段產物流可導入其中。
在本發明方法之另一實施例中，所有與產物接觸之步驟(a)至(e)中所用的元件藉由適合的減少微生物方法來進行微生物減低。
較佳地，減少微生物方法可由下列組成之群中選出：γ照射、β照射、高壓蒸氣滅菌、環氧乙烷(ETO)處理、臭氧(O3)處理、過氧化氫(H2O2)處理和原位蒸氣(SIP)處理。
因此，與產物流接觸之用於本發明方法中的模組之物件和元件較佳地可進行減少微生物及/或可殺菌，較佳地可以高壓蒸氣滅菌，可以γ照射、可通入環氧乙烷(ETO)處理，可以臭氧(O3)處理、可以過氧化氫(H2O2)處理或可以原位蒸氣(SIP)處理，使得微生物減少或甚至無菌操作本發明之製程。
在本發明方法之另一實施例中，所有從步驟(b)起與產物接觸的所用元件為可拋棄物件或可用作為可拋棄物件。在本發明製程中，此可拋棄物件則亦可稱為「單次使用」物件(“SU technology”)。此舉增進了該製程之微生物減少狀態。
在本發明方法之另一實施例中，所有的進入液體係經由減少微生物過濾器來過濾，例如Sartorius之Sartoguard NF過濾器。
就此而言，所有的出口較佳地可藉由微生物屏障來保護，防止微生物回長。例如，本處亦可能使用Sartorius之Sartoguard NF過濾器作為微生物 屏障。可藉由過濾器及/或廢料線之轉換開關來達到微生物屏障11之另外的可靠性。另一種確保減少微生物狀況之措施可藉由廢料線之定期衛生清潔，較佳地在過濾後，例如以NaOH溶液來進行。另外可能的方法為UV照射和熱處理。
在另一實施例中，本發明方法之模組處理步驟較佳地係在彼此相互連接之模組中進行。
較佳地，此模組係藉由熔接或藉由無菌連接器相互連接。就熔接模組，例如可使用Sartorius之「TC熔接器」儀器。
在本發明方法之另一實施例中，全部所用的液體、氣體和固體係在步驟(a)至(e)中進行微生物減少。就此，微生物減少較佳藉通過具有較佳0.45μm孔徑大小之過濾器的過濾方式來進行。在此情況下，製程中殺菌(in-process sterilization)較佳地係不在製程期間進行。在其他的實施例中，亦可能藉由過濾經由具有較佳地0.20μm之孔徑大小的過濾器來進行。
在本發明方法之另一較佳的實施例中，所有來到至少二個層析管柱上之流體的脫氣係在層析步驟(c)之前進行，脫氣較佳地係藉由至少一除泡器，及/或藉由至少一疏水性微過濾膜經由真空，及/或藉由以超音波處理，及/或藉由噴灑難溶的氣體例如氦氣來進行。
就此，在本發明方法和本發明系統之持續導入中使用疏水性微過濾膜經由真空對於維持無菌性為較佳的，因為已發現相較於除泡器此舉特別有利。所用的疏水性微過濾膜可為，特言，來自Membrana之MicroModule。
在本發明方法之一特佳的實施例中，來自步驟a)之無顆粒流體係以含殺微生物劑之緩衝液進行至少一次超過濾。超過濾的結果，存在流體中的營養素被含殺微生物劑之緩衝液取代而剝奪了流體中供微生物生長之調件。此舉額外地增強此製程的微生物減低。
就此所使用的殺微生物劑，或一過多種殺微生物劑，較佳地可由下列組成之群中選出：咪唑、苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸酯、亞硫酸鹽、二亞硫酸鹽、疊氮化物、鄰苯基酚、乳酸鏈球菌素(nisin)、鏈黴菌素(natamycin)、六亞甲基四胺、二碳酸二甲酯、亞硝酸鹽、硝酸鹽、乙酸、抗壞血酸、異抗壞血酸、L-乳酸、丙酸、硼酸和溶菌酶(lysozyme)。
存在含殺微生物劑之緩衝液中的殺微生物劑再者可為一或多種來自下 列組成之群之殺微生物劑：E210至E213：苯甲酸及其鹽類，0.05-0.1%在酸性環境溶於溶劑中，2-3g/kg溶於溶劑中；E200至E203：山梨酸及其鹽類，300-2000mg/kg；E214至E219：PHB酯(對羥基苯甲酸酯，paraben)，對羥基苯甲酸丁酯和對羥基苯甲酸丙酯；E220至E228：亞硫酸鹽和二亞硫酸鹽；E231和E232：鄰苯基酚，12mg/kg；E234：乳酸鏈球菌素；E235：鏈黴菌素；E239：六亞甲基四胺，25mg/kg；E242：二碳酸二甲酯；E249-E252：亞硝酸鹽和硝酸鹽，300mg/kg；E260：乙酸，0.5-3%；E300-E302：抗壞血酸，300mg/kg；E315-E316：異抗壞血酸，1500mg/kg；E261-E263：乙酸鹽；E270：L-乳酸；E280 to E283：丙酸及其鹽類，1-3g/kg；E284 and E285：硼酸，最大4g/kg；E1105：溶菌酶；及疊氮化物。
在本發明方法之一較佳的實施例中，此生物醫藥、生物大分子產物為一由下列組成之群中選出的蛋白或多肽：單株抗體、多株抗體、重組蛋白和疫苗，較佳地DNA和RNA疫苗。
用於步驟c)之層析管柱及/或膜吸附器可具有任何適合的結合原理，例如產物對配體的親和力、離子相互作用、金屬螯合結合、疏水性相互作用或純凡德瓦力。例如，至少二個層析步驟中的第一層析步驟可為親和層析(例如對產物具有親和力之配體，例如蛋白A、蛋白G、蛋白L、IgM、IgG以及不同於蛋白A、蛋白G、蛋白L、IgM、IgG的重組蛋白且其對產物具有 親和力)。然後將其接著一另外的(第二)層析步驟，例如經由離子相互作用之層析。
在此階段本發明之方法為可變通的。在步驟c)中，依照所欲達到的產物純度之程度和產物濃度，其可包括任何順序之任何適合的層析原理。
在本發明方法之一特佳的實施例中，步驟c)之至少二個層析管柱及/或膜吸附器係包括一配體，較佳地係由下列組成之群中選出：蛋白A、蛋白G、蛋白L、IgM、IgG以及不同於蛋白A、蛋白G、蛋白L、IgM、IgG的重組蛋白且其對產物具有親和力。
在本發明方法之一較佳的實施例中，步驟(a)至(e)的製程中具有至少4小時的運作時間，較佳地至少8小時，較佳地至少12小時，較佳地至少24小時，更佳地至少48小時，更佳地至少7天，更佳地至少4週，及特佳地至少8週。此二週或以上的長時間連續作業僅在密閉、模組及特言之減少微生物模式的製程操作下才可行。
在本發明方法之一較佳的實施例中，包括至少一過濾器之至少一過濾步驟係在步驟a)至e)之間及/或其後所進行。
在本發明方法之一特佳的實施例中，此過濾器係在減少微生物的條件下自動更換，自動過濾氣更換較佳地係包括下列步驟：
(i)在非濾液側於壓力感應器超過閥值之情況下以封閉流量通道，將流量通道至切換新的過濾器，用過的過濾器中之產物較佳地係藉由氣體或液體推入濾液側，或在超過流量通道中用過的過濾器之最長時間的情況下，或在超過流經用過的過濾器之濾液最大體積的情況下。
(ii)經由在新過濾器之排出閥，具有較佳地<=0.25μm孔徑大小之空氣過濾器，進行新過濾器排出，藉由給料幫浦將產物運送入新過濾器，或送入以減少微生物方式連接的密閉袋中，
(iii)藉由壓力感應器或填充量感應器或天平或液體偵測器，偵測在非濾液側的新過濾器排出是否完全，
(iv)藉由閥門打開濾液出口並關閉排出閥和空氣過濾器之間的流量通道，及
(v)將用過的過濾器換成新過濾器。
同時或下游的產物輸送到新過濾器可，例如藉由供料幫浦來進行。
在本發明方法之另一實施例中，此項係指，過濾器交換(從一用過的過濾器元件切換到新的過濾器)可自動進行。本處所發現的問題為過濾器排出，然而其為必須的且其在目前可取得的過濾器之情況下必須手動進行。首先，將過濾器進行減少微生物法，藉由，適當的，例如ETO、高壓蒸氣滅菌或γ照射及然後加入到製程。之後，此過濾器可在非濾液側填充，同時排出閥為打開的。在成功排出後此閥必須關閉，以便進行實際的過濾。在一分批處理中，非濾液側之嚴格的減少微生物處理並非必需的。這是因為分批處理僅需短時間運作。因此，盡可能得到減少微生物之濾液為重要的。在連續處理中，然而，亦要求非濾液側之嚴格的無微生物作業以防止製程的微生物污染。在先前技術中，在過濾器藉由旋轉移動填充後，排出閥必須手動關閉，以便可進行實際的過濾。該旋轉移動難以自動化因為其亦需要一旋轉體的軸移動。旋轉體軸移動與其上應用密閉共同的結果，使界限變動。若在該手動關閉排出閥之前進行微生物減少，同時排出閥為關閉的，則在排出閥打開後生物界限變動。此舉將含微生物區域導入到減少微生物區域且因此使減少微生物失效。並不推薦以打開過濾器閥減少微生物，因為開關位置並不具有固定位置，且可能容易發生閥門的損傷。此外，開關位置通常為搖晃的，且因此可能經由一般的過濾器處理而發生微生物界限變動。
在自動過濾器排出之情況下，在起初作業期間避免排出閥旋轉移動為有利的，使得排出可僅藉由簡單的措施來進行。然後排出閥可修改使得即使在關閉的狀態下仍為可滲透的，但持續可靠地與環境隔絕。因此，在安全的狀態下此閥為「關閉的」，且其特徵為密合的。「打開的」狀態通常並未明確定義，因為閥體在作業期間搖晃很大並讓界限變動。一段末端為疏水性<=0.2μm空氣過濾器之管道係與旋轉體之噴嘴相連接。此配置較佳地則是藉由ETO、γ照射、高壓蒸氣滅菌或臭氧(O3)處理或藉由過氧化氫(H2O2)處理來進行微生物減少。因此，整個非濾液側上至排出閥上的空氣過濾器為微生物減少的或低微生物。在排出閥和空氣過濾之間，一段管道係插入至能牢靠鉗制該段管道之管道鉗制閥中。以此方式，能以全自動和低微生物方式進行排出。藉由排出閥和該段管道填充過濾器直到液體進入空氣過 濾器為止。疏水排出過濾器阻斷此液體。同時，此處理系統藉由濾液側上的閥阻斷生產流，所以在過濾器前有一壓力上升。該壓力上升係藉由適合的感應器偵測。若超過特定的閥值壓力，則排出管道的鉗制閥為關閉的，而濾液側上的閥為打開的。經由此過程，使用修改的排出閥，在無手動介入下可能自動修正過濾器。
此自動過濾器更換係例如圖2所示，其係以流程圖說明將所用的製程及系統之過濾步驟的操作原理，其中係將熔接的新過濾器16與過濾器17交換。
在製程終了時，來自非均勻細胞培養液混合物之最終的純化生物醫藥、生物大分子產物可藉由最後過濾，較佳地經由具有0.2μm孔徑的過濾器最後一次過濾。最後過濾可，例如藉由通過γ照射Sartopore 2囊袋(Midicap size 7,0.05m2)至γ照射5公升GE ReadCircuit袋來進行。當最後袋內的填充量為可接受的時，該袋則可脫除並可將一新袋熔接至此製程。
本發明可藉由提供用於連續、減少微生物產生及/或處理來自非均勻細胞培養液混合物之生物醫藥、生物大分子產物之模組系統來達成該目標，其係包括下列模組：(a)至少一過濾模組，(b)至少一層析模組，其係包括至少二個層析管柱及/或膜吸附器，(c)至少一超過濾模組及/或至少一滲濾模組及/或至少一透析模組，及(d)至少一用於連續病毒耗竭之模組，其特徵為該模組系統為密閉及微生物減少的。
然而，至少一層析模組亦可包括二個以上的層析管柱及/或膜吸附器，例如三個或四個層析管柱及/或膜吸附器。
在本發明模組系統之另一實施例中，所有與產物接觸及步驟(a)至(e)中所用的元件藉由減少微生物方法來進行微生物減低，此減少微生物方法較佳地係由下列組成之群中選出：γ照射、β照射、高壓蒸氣滅菌、環氧乙烷(ETO)處理、臭氧(O3)處理、過氧化氫(H2O2)處理和原位蒸氣(SIP)處理。
較佳地，模組系統本身，以及與產物流接觸之模組的元件可進行減少微生物及/或可殺菌，較佳地可以高壓蒸氣滅菌，可以γ照射、可通入環氧乙烷(ETO)，可以臭氧(O3)處理、可以過氧化氫(H2O2)處理或可以原位蒸氣 (SIP)處理，得到低微生物或甚至無菌操作之本發明製程。
在本發明模組系統之另一實施例中，所有用於模組(a)至(d)之與產物接觸的物件為可拋棄物件或可用作為可拋棄物件。就此，模組較佳地係藉由熔接或藉由無菌連接器彼此相連接。例如，GE之無菌「ReadyMate」連接器較佳地為用於本發明模組系統之無菌連接器。
較佳地，係使用立即可用之可拋棄物件作為γ照射元件。
在本發明模組系統之一較佳的實施例中，所有的進液係通過減少微生物過濾器，而所有出口較佳地係受到微生物屏障保護，防止微生物回長。
在模組系統末端，來自非均勻細胞培養液混合物之最終的純化生物醫藥、生物大分子產物可藉由最後過濾，較佳地經由具有0.2μm孔徑的過濾器最後一次過濾。最後過濾可，例如藉由通過γ照射Sartopore 2囊袋(Midicap size 7,0.05m2)至γ照射5公升GE ReadCircuit袋來進行。當最後袋內的填充量為可接受的時，該袋則可脫除並可將一新袋熔接至此製程。
包括較佳實施例之本發明在不受其限制下將以下列圖式和實例更詳細說明。若文中並未明確顯示為不利的，則此等實施例可隨意彼此組合。
1‧‧‧模組系統
2‧‧‧過濾模組
3‧‧‧層析模組
4‧‧‧層析管柱
5‧‧‧膜吸附器
6‧‧‧超過濾模組
7‧‧‧滲濾模組
8‧‧‧透析模組
9‧‧‧病毒耗竭
10‧‧‧減少微生物過濾器
11‧‧‧微生物屏障
12‧‧‧無菌連接器
13‧‧‧過濾器
14‧‧‧除泡器
15‧‧‧疏水微過濾膜
16‧‧‧新過濾器
17‧‧‧用過的過濾器
18‧‧‧壓力感應器
19‧‧‧空氣過濾器
20‧‧‧新過濾器之排出閥
21‧‧‧給料幫浦
22‧‧‧填充量感應器
23‧‧‧天平
24‧‧‧閥
25‧‧‧廢料流
26‧‧‧產物流
27‧‧‧緩衝液
28‧‧‧液體偵測器
29‧‧‧袋子
下列係顯示：圖1係以流程圖顯示本發明製程之一實施例的處理圖。括弧間的數字係指質量平衡，如實例1和表1中所列。
圖2係以流程圖顯示本發明製程和系統之過濾步驟的操作原理，其中係以熔接的新過濾器16置換使用過的過濾器17。
圖3係以例示顯示病毒失活和中和的二個處理步驟-以模組方式設定的二個單元，其中pH探針pH0501和pH0502係以高壓蒸氣滅菌而其餘的係經γ照射。然後將pH探針pH0501和pH0502熔接至裝置中。袋子係經由無菌GE ReadyMate®連接器相連接。與Prot-A和與過濾單元之連接係先封住及然後連接不同單元。
圖4係以例示顯示系統之模組結構，其中所有的進料流和出口流係經由微生物屏障10、13與環境相連。例示的模組系統1係由三個過濾模組2(其各自具有二個過濾器13，可交替操作)、二個層析模組3(具有二個層析管柱4或二個膜吸附器5)、一病毒耗竭步驟(例如病毒失活9)、一超過濾模組6和一 滲濾模組7所組成。氣泡係經由疏水過濾器15或除泡器14從緩衝液中移除。
實例1
為了以連續和減少微生物方式從非均勻細胞培養/液混合物純化蛋白，係設置具有下列模組之小型設備和有關的處理步驟：除非另有說明，否則在製程中係使用具有一EasyLoad II泵揚程的MasterFlex蠕動幫浦。所用的管道為Masterflex LS16或Cflex或Sanipure。全部與產物接觸之所用的組件係進行25kGy γ照射。在其中因為材料而γ照射不可行之例外狀況中，組件係以121℃高壓蒸氣滅菌20min，例如具有pH探針或病毒過濾器之次組件。若可能，使用立即可用的可拋棄物件作為γ照射模組。無例外地，對所有的袋件皆是如此。該袋件一般係使用General Electric(GE)之ReadyMate®連接器與模組相連接。各模組之間，係放置單次使用的γ照射袋件(ReadyCircuit 1公升，GE)作為模組n-1之出料流和模組n之進料流之間的補償桶槽。一般而言，此時在各模組中有一出料流和一進料流。當產物液體排出為有利時，桶槽則經由一疏水0.2μm過濾器與環境分隔。
A.上游 i)灌注反應器
就IgG單株抗體之連續製造，係使用一10公升灌注反應器。在穩定狀態下活細胞的密度為6-7千萬個細胞/ml。效價為~115mg/l。生產係使用二個平行的灌注反應器進行28天。
ii)細胞駐留系統
產物係經由傾斜的盤分離器(沉澱器)連續釋出，藉此保留大部份的細胞。
B.下游DSP-1 i)細胞澄清
使用平行操作的Sartoguard NF 0.2μm過濾器(T-型，MaxiCap,0.65m2)進行澄清作用。圖2係顯示本處如何施行密閉低微生物處理。將過濾器和管道組件二者以γ照射。將進料和出料線經由無菌連接器與經γ照射的袋件(GE ReadyCircuit 1公升)相連接，其係用作為流速變動之補償體積。就排出 的目的，係將過濾器與疏水0.2μm空氣過濾器連結，且因而此模組在本發明意義中為密閉的(圖2)。空氣過濾器為Pall公司之Emflon II或Sartorius Stedim之Midisart 2000。排出閥係經修改使得其即使在密閉的狀態仍為可滲透的，但仍牢靠地與環境分隔開。就此，排出閥的內部密封環移至Sartoguard NF上且此閥在γ照射之前為關閉的。該閥另外有防開保護。因此，此閥在安全狀況下為「關閉的」，且其特徵為密合的。排出閥係經由一段管道與空氣過濾器相連。在排出閥和空氣過濾器之間，一段管道插入至管道鉗制閥中。藉由排出閥和此管道注入過濾器直到液體進入空氣過濾器。然後此疏水排出過濾器阻斷液體。同時，處理系統藉由濾液側上的閥阻斷生產流，且因此在過濾器前有壓力上升。該壓力上升係藉由Pendotech壓力感應器來偵測。若超過0.5bar的閥值，則此段排出管道的鉗制閥會關閉，並打開濾液側上的閥。
ii)濃縮及再緩衝
將來自i)細胞澄清之濾液使用超過濾中空纖維膜(GE Healthcare ReadytoProcess,0.2m2，經γ照射)連續濃縮為十分之一。所使用的循環幫浦為可拋棄QuattroFlow 1200 SU幫浦，其泵揚程係在γ照射之前整合至管道組件。
然後通過Gambro Revaclear 300透析膜以50mM咪唑/NaCl緩衝液交換濃縮產物之媒劑組成份。此模組係由製造商以無菌包裝來提供並與生物安全櫃中之經γ照射的管道組件相連接。來自濃縮液的滲透物和含媒劑的廢料流係導入經γ照射的200公升Sartorius Flexboy。此Flexboy係使用Sartorius熔接器藉由熔接交換。
0.2μm過濾
在填充之前，係使用交替操作之經γ照射的Sartoguard NF過濾器(MaxiCap size 8)連續將產物過濾到200公升Flexboy。設定和操作係類似「B.下游DSP-1-i)細胞澄清」。
C.下游DSP-II 0.2μm過濾
儲存後，將來自DSP-I之產物再次過濾以避免下游層析管柱有顆粒。
1.捕獲層析
使用Mabselect Sure(GE)作為Prot-A樹脂來分離IgG。將IgG濃縮至十分之一並移除大部份的污染物。使用一帶有12支管柱(ID 16mm,L 80mm)之Tarpon Biosystems公司的連續BioSMB系統，其中8支管柱係在裝載區(2支管柱串聯及四支並聯)。整個包括此等管柱的流徑係藉由衛生清潔或γ照射以微生物減少來提供。每個循環的載量為每管柱32個管柱體積。所用的緩衝液為具有不同莫耳濃度、pH和導電率之乙酸鹽緩衝液。所有的緩衝液係使用γ照射或高壓蒸氣滅菌0.2μm過濾器過濾至經γ照射的袋件中。緩衝液袋之出口管道係熔接至BioSMB系統的進料口。該系統在其各自的進料口具有一經γ照射的除氣器膜(Liquicell Micro模組，Membrana)。同樣地，產物線係經由此一除氣器熔接至BioSMB系統。然後藉由真空幫浦於50mbar將所有的進料流脫氣。
1.病毒失活及中和
病毒失活及中和係由三個模組所組成且係位於捕獲層析和0.2μm過濾之間：(a)帶有蠕動幫浦M0502之均質化環；(b)停留時間環流程圖顯示為撓曲管道；(c)中和袋，其中pH可調整至7.5。模組為個別預製並在圖3中熔接點線上以γ照射，其中在各其情況下末端係經封住。
帶有pH探針之線段，就pH0501和pH0502之情況，係經高壓蒸氣滅菌。然後pH探針部份熔接至組件。如所示，袋件係經由無菌GE ReadyMate®連接器相連接。與Prot-A容離液線和過濾模組之連接係先封住及然後熔接不同模組。
0.2μm過濾
因為在pH改變後蛋白可能沉澱，所以將沉澱的蛋白濾出。
層析(中度(intermediate)和精緻(polish)純化)
上述0.2μm過濾的產物係經由二個層析步驟藉由四個按順序(4-PCC)操作的2.5ml Capto Adhere(2.5ml GE)及然後二個交替操作的20ml陰離子交換器(Pall Hypercel StarAX)來純化。在此純化中，係將Prot-A leachable、DNA、HCP和聚集物移除。二個層析步驟係經由γ照射過的袋件(GE ReadyCircuit® 1公升)彼此相連，其中導電率係下陰離子交換器需求下藉由線上供應水，調整至7.5mS/cm。
整個包括管柱的流道係經衛生清潔或γ照射。每個循環的載量為每個 管柱50各管柱體積。所用的緩衝液為具有不同莫耳濃度、pH和導電率之乙酸鹽緩衝液。所有的緩衝液係使用經γ照射或高壓蒸氣滅菌的0.2μm過濾器過濾到經γ照射的袋件中。緩衝液袋的出口管道係熔接至BioSMB系統的進料口。該系統在其各自的進料口具有一經γ照射的除氣器膜(Liquicell Micro模組，Membrana)。同樣地，上述0.2μm過濾的產物線係經由此一除氣器熔接至BioSMB系統的進料口。然後藉由真空幫浦於50mbar將所有的進料流脫氣。廢料流係導入經γ照射的200公升Sartorius Flexboy。此Flexboy係使用Sartorius熔接器藉由熔接交換。
產物流再次收集至經γ照射的產物袋中(GE ReadyCircuit 1公升)。
預過濾
從精緻層析之產物袋，先使用0.1μm囊件(Sartopore2,MidiCap size 9,0.2m2)將產物溶液預過濾。製程和設定係類似「B.下游DSP-1-i)細胞澄清」。.
病毒過濾
來自預過濾出口管線直接藉由熔接經由一蠕動幫浦與來自「C.下游DSP-II」之病毒過濾的進料口相連接。另外，來自「C.下游DSP-II」之病毒過濾的設定和操作係類似「C.下游DSP-II-0.2μm過濾」。然而，所使用的病毒過濾器為Virosart CPV過濾器(MidiCap size 9,0.2m2)，其係根據製造商的說明沖洗及高壓蒸氣滅菌。再次，將過濾器熔接至組件。產物流再次以幫浦送入經γ照射的產物袋(GE ReadyCircuit 1公升)。
最終的濃縮和再緩衝
最終的濃縮和再緩衝係類似上述「B.DSP-I-ii)濃縮和再緩衝」而唯一差異係在於高壓蒸氣滅菌的UV槽係整合至濃縮環供監測產物濃度。再緩衝係類似上述「B.DSP-I-ii)濃縮和再緩衝」來進行，其中在此情況中係使用50mM磷酸緩衝液pH 7.5。產物流再次以幫浦送入經γ照射的產物袋(GE ReadyCircuit 1公升)。
0.2μm過濾
最終的過濾係如上文「DSP-1 i)」中所述來進行穿過γ照射的Sartopore 2囊件(Midicap size 7,0.05m2)進入經γ照射的5公升GE ReadCircuit袋。當最後袋內的填充量為可接受的時，該袋則可脫除並可將一新袋熔接至此製程。
本發明製程之規律進行的運作時間，如實例1中所述，為3天而無微生物生長，其中層析管柱係以40%異丙醇+0.5M NaOH消毒清潔。就本發明製程在運作時間超過3天的情況下，層析管柱係以γ照射。
圖1中所示位置之平均流速和抗體濃度係彙整於表1。
本申請案之研究係依據“Bio.NRW：MoBiDiK-Modulare Bioproduktion-Disposable und Kontinuierlich”[Bio.NRW：MoBiDiK-modular bioproduction-disposable and continuous]所資助為歐洲區域發展基金(ERDF)之一部份贈款協定。

Claims (18)

  1. 一種用於連續、減少微生物產生及/或處理來自非均勻細胞培養液混合物之生物醫藥、生物大分子產物的方法，其包括下列步驟：(a)以產物流(26)之形式，提供來自含有產物之非均勻細胞培養液混合物的無顆粒流體，(b)至少一次過濾，提供濾液，(c)至少二個層析步驟以純化產物，(d)至少一次病毒耗竭，(e)至少一次超過濾及/或至少一次步驟(b)、(c)及/或(d)之產物流(26)的滲濾，其特徵在於該至少二次自(c)之層析步驟係包括經由至少二個層析管柱(4)及/或膜吸附器(5)之純化，及該方法係以密閉和模組方式來進行。
  2. 根據請求項1之方法，其特徵在於一或多個用於調整pH及/或導電率及/或過濾步驟及/或濃縮步驟及/或緩衝液交換之另外的步驟，係在步驟(c)中至少二個層析步驟之間及/或在步驟(d)之病毒失活之後進行。
  3. 根據請求項1或2之方法，其特徵在於所有與產物接觸之步驟(a)至(e)中所用的元件係經由適合的減少微生物方法來進行微生物減低，該減少微生物方法較佳地係由下列組成之群中選出：γ照射、β照射、高壓蒸氣滅菌、環氧乙烷(ETO)處理、臭氧(O3)處理、過氧化氫(H2O2)處理和原位蒸氣(SIP)處理。
  4. 根據請求項1至3之方法，其特徵在於所有從步驟(b)起及與產物接觸的所用元件為可拋棄物件或可用作為可拋棄物件。
  5. 根據請求項1至4之方法，其特徵在於所有的進料流係經由一減少微生物過濾器(10)來過濾及所有的出口較佳地係藉由微生物屏障(11)來保護，防止微生物回長。
  6. 根據請求項1至5之方法，其特徵在於該模組處理步驟係於模組中進行，該等模組係彼此相連接，該等模組較佳係藉由熔接或藉由無菌連接器(12)彼此相連接。
  7. 根據請求項1至6之方法，其特徵在於全部步驟(a)至(e)中所用的液體、氣體和固體係進行微生物減少，而該微生物減少較佳藉通過具有較佳 0.45μm孔徑之過濾器(13)的過濾方式來達成，且該製程中殺菌(in-process sterilization)較佳地係不在製程期間進行。
  8. 根據請求項1至7之方法，其特徵在於所有來到至少二個層析管柱(4)上之流體的脫氣係在步驟(c)之前進行，該脫氣較佳地係藉由至少一除泡器(14)及/或藉由至少一疏水性微過濾膜(15)經由真空，及/或藉由以超音波處理，及/或藉由噴灑氦氣來完成。
  9. 根據請求項1至8之方法，其特徵在於來自步驟a)之無顆粒流體係以含殺微生物劑之緩衝液進行至少一次超過濾，而殺微生物劑較佳地係由下列組成之群中選出：咪唑、苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸酯、亞硫酸鹽、二亞硫酸鹽、疊氮化物、鄰苯基酚、乳酸鏈球菌素(nisin)、鏈黴菌素(natamycin)、六亞甲基四胺、二碳酸二甲酯、亞硝酸鹽、硝酸鹽、乙酸、抗壞血酸、異抗壞血酸、L-乳酸、丙酸、硼酸和溶菌酶(lysozyme)。
  10. 根據請求項1至9中任一項之方法，其特徵在於該生物醫藥、生物大分子產物為蛋白、胜肽或包括DNA或RNA，該蛋白或胜肽係由下列組成之群中選出的：單株抗體、多株抗體、重組蛋白和蛋白疫苗，以及該DNA和RNA為DNA及/或RNA疫苗的部份。
  11. 根據請求項1至10中任一項之方法，其特徵在於步驟c)之至少二個層析管柱(4)及/或膜吸附器(5)係依照親和力原理，經由離子相互作用、經由金屬螯合結合、經由疏水性相互作用或經由凡德瓦力(van der Waals force)與產物結合，該至少二個層析管柱(4)及/或膜吸附器(5)就依照親和力原理結合之情況係包括配體，較佳地係由下列組成之群中選出：蛋白A、蛋白G、蛋白L、IgM、IgG，以及不同於蛋白A、蛋白G、蛋白L、IgM、IgG的重組蛋白且其對產物具有親和力。
  12. 根據請求項1至11中任一項之方法，其特徵在於步驟(a)至(e)的方法中具有至少4小時的運作時間，較佳地至少8小時，較佳地至少12小時，較佳地至少24小時，更佳地至少48小時，更佳地至少7天，更佳地至少4週，及特佳地至少8週。
  13. 根據請求項1至12中任一項之方法，其特徵在於包括至少一過濾器(13)之至少一過濾步驟係在步驟a)至e)之間及/或其後所進行。
  14. 根據請求項13之方法，其特徵在於該過濾器(13)係在減少微生物的條件下自動更換，該自動過濾器更換較佳地係包括下列步驟：(i)在非濾液側於壓力感應器(18)超過閥值之情況下以關閉流量通道，將流量通道切換至新的過濾器(16)，在用過的過濾器(17)中的產物較佳地係藉由氣體或液體推入濾液側，或在流量通道中超過該用過的過濾器(17)之最大時間的情況下，或在超過流經用過的過濾器(17)之濾液最大體積的情況下。(ii)經由在新過濾器(16)之排出閥(20)，具有較佳<=0.25μm孔徑大小之空氣過濾器(19)，進行新過濾器(16)排出，較佳地藉由給料幫浦(21)將產物運送入新過濾器(16)，或送入以減少微生物方式連接的密閉袋(29)中，(iii)藉由壓力感應器(18)或填充量感應器(22)或天平(23)或液體偵測器(28)，偵測在非濾液側的新過濾器(16)排出是否完全，(iv)藉由閥門(24)打開濾液出口並關閉排出閥(20)和空氣過濾器(19)之間的流量通道，及(v)將用過的過濾器(17)換成新過濾器(16)。
  15. 一種用於連續、減少微生物產生及/或處理來自非均勻細胞培養液混合物之生物醫藥、生物大分子產物之模組系統(1)，其係包括下列模組：(a)至少一過濾模組(2)，(b)至少一層析模組(3)，其係包括至少二個層析管柱(4)及/或膜吸附器(5)，(c)至少一超過濾模組(6)及/或至少一滲濾模組(7)及/或至少一透析模組(8)，及(d)至少一用於連續病毒耗竭之模組(9)，其特徵為該模組系統(1)為密閉及微生物減少的。
  16. 根據請求項15之模組系統(1)，其特徵在於所有與產物接觸之模組(a)至(d)中所用的元件係藉由減少微生物方法來進行微生物減低，該減少微生物方法較佳地係由下列組成之群中選出：γ照射、β照射、高壓蒸氣滅菌、環氧乙烷(ETO)處理、臭氧(O3)處理、過氧化氫(H2O2)處理和原位蒸氣(SIP)處理。
  17. 根據請求項15或16之模組系統，其特徵在於所有與產物接觸之模組(a)至(d)中所用的元件為可拋棄物件或可用作為可拋棄物件，且該模組較佳地係藉由熔接或藉由無菌連接器彼此相連接。
  18. 根據請求項15至17之模組系統，其特徵在於所有的進液係通過減少微生物過濾器(10)，且所有出口較佳地係受到微生物屏障(11)保護來防止微生物回長。
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