KR20180002783A - 생성물의 연속적, 세균-감소된 생산 및/또는 가공을 위한 모듈형 시스템 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 불균질 세포 배양물-유체 혼합물로부터의 생물제약적, 생물학적 거대분자 생성물의 연속적, 세균-감소된 생산 및/또는 가공을 위한 방법이며, (a) 생성물 스트림의 형태로, 생성물을 함유하는 불균질 세포 배양물-유체 혼합물로부터 무입자 유체를 제공하는 단계, (b) 여과물을 제공하는, 적어도 1회의 여과, (c) 생성물을 정제하기 위한 적어도 2회의 크로마토그래피 단계, (d) 적어도 1회의 바이러스 고갈, (e) 단계 (b), (c) 및/또는 (d)의 생성물 스트림의 적어도 1회의 한외여과 및/또는 적어도 1회의 투석여과를 포함하며, (c)로부터의 적어도 2회의 크로마토그래피 단계는 각각의 경우에 적어도 2개의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 막 흡착기를 통한 정제를 포함하고, 방법은 폐쇄되고 모듈형인 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 방법을 수행하기 위한 상응하는 모듈형 시스템을 추가로 제공한다.
Description
본 발명은 불균질 세포 배양물-유체 혼합물로부터의 생성물의 연속적, 세균-감소된 생산 및/또는 가공을 위한 모듈형 시스템 및 방법에 관한 것이다.
생물공학 생산에서, 일반적으로 단백질은 뱃치로 정제된다. 이는 개별적인 생산 사이클이 뱃치형 방식으로 불연속적으로 취급되면서, 생산 사이클의 완료 후 전체 생성물이 제거된다는 것을 의미한다. 다시 생산하기 위해, 그 후 별도의 새로운 생성물 사이클/뱃치를 시작하는 것이 필요하다.
최근, 뱃치 공정에 대조적으로 공정이 중단 없이 실행되는 연속적 절차가 생물공학 생산에서 또한 수행될 수 있다는 것이 점차적으로 증명되었다.
고도로 조절되는 제약 생산은 세정되고 멸균된 생물반응기를 제공하고 멸균 생성물을 보장하기 위해 시간, 기술 및 인력 면에서 많은 노력을 필요로 한다. 다목적 시스템에서 또는 2개의 생성물 뱃치 사이에서 생성물 전환의 경우에 교차 오염을 신뢰할 수 있게 방지하기 위해, 세정 이외에 매우 복잡한 세정 검증이 요구되고, 적용가능하다면, 이는 공정 개조의 경우에 반복되어야 한다.
이는 상류 가공 (USP), 즉 발효기에서의 생물학적 생성물의 생산, 및 하류 가공 (DSP), 즉 발효 생성물의 정제 둘 다에 적용된다.
특히 발효의 경우에, 멸균 환경이 성공적인 배양에 필수적이다. 뱃치 발효기 또는 페드-뱃치 발효기를 멸균하기 위해, SIP 기술 (SIP = 정치 멸균(sterilization-in-place))이 일반적으로 사용된다.
특히 짧은 사용 기간 및 빈번한 생성물 교체의 경우에, 필요한 세정 및 멸균 절차로부터 초래되는 반응기의 휴지 시간은 반응기 가용성의 상당 부분을 차지할 수 있다. 예를 들어, 이는 생물공학 생산의 USP에서의 배지 제조 및 발효, 및 DSP에서의 가용화, 동결, 해동, pH 조정, 예를 들어 크로마토그래피, 침전 또는 결정화를 통한 생성물 분리, 완충제 조정, 및 바이러스 불활성화의 공정 단계에 영향을 미친다.
하류 공정에서, 조절 요건은 세균-감소된 공정 관리이다. 따라서, 뱃치 공정의 경우에는 멸균 공정이 필요하지 않다. 그러나, 연속적 공정에서는, 가능하다면 세정 단계 없이 비교적 긴 기간에 걸쳐 단백질 정제가 수행된다. 이는 바람직하게는 정제 동안 멸균 단계 없이 일어난다. 그러나, 단순한 뱃치 공정의 경우보다 세균 오염의 위험이 몇배 더 높다.
WO2012/078677은 크로마토그래피 및 이를 생산 시스템, 보다 특히 일회용 시스템 내에 통합하는 것에 의한 생물제약적 생성물의 연속적 가공을 위한 공정 및 시스템을 기술한다. WO2012/078677이 생물제약적 및 생물학적 생성물의 연속적 생산을 위한 접근법을 제공하지만, 개시된 해법은 실제로는 충분하지 않다. 또한 WO2012/078677에는 멸균된 크로마토그래피 칼럼의 사용이 개시되어 있지 않다.
US 2014/0255994 A1에는 치료용 단백질을 생산하기 위한 통합된 연속적 공정이 개시되어 있다. 그러나, US 2014/0255994 A1에는 멸균된 크로마토그래피 칼럼이 이러한 공정에서 사용될 수 있다는 특색이 개시되어 있지 않다.
EP 2 182 990 A1에는 고온 수증기를 사용함으로써 크로마토그래피 칼럼을 멸균하는 공정이 개시되어 있다.
먼저, 일부 용어가 더욱 상세하게 정의될 것이다.
본 발명의 맥락에서, 연속적 공정은 적어도 2개의 공정 단계를 연속하여 수행하기 위한 임의의 공정을 의미하며, 상기 공정에서 상류 단계의 유출물 스트림은 하류 단계로 운반된다. 하류 단계는 상류 단계가 완료되기 전에 생성물 스트림의 가공을 시작한다. 전형적으로, 연속적 공정에서, 생성물 스트림의 일부분이 항상 생산 시스템에서 운반 중이고, "연속적 생성물 스트림"으로 지칭된다. 따라서, 상류 유닛에서 하류 유닛으로의 생성물 스트림의 연속적 운반 또는 전달은 상류 유닛이 작동을 멈추기 전에 하류 유닛이 이미 작동 중이라는 것, 즉 2개의 연속적으로 연결된 유닛이 이들을 통과하여 유동하는 생성물 스트림을 동시에 가공한다는 것을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "세균-감소된"은 세균 카운트가 감소된 상태, 즉 단위 면적 또는 단위 부피당 미생물 카운트가 실질적으로 0인 상태를 의미하며, 이는 적합한 세균-감소 방법에 의해 달성될 수 있으며, 상기 세균-감소 방법을 감마 조사, 베타 조사, 오토클레이빙, 에틸렌 옥시드 (ETO) 처리 및 "정치 증기(steam-in-place)" (SIP) 처리로부터 선택할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "일회용 물품"은 생성물과 접촉하는 당해 물품, 보다 특히 기구, 탱크, 필터 및 연결 요소가 1회 사용 후 폐기하는데 적합하다는 것을 의미하며, 상기 탱크는 플라스틱 및 금속 둘 다로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 이러한 용어는 본 발명에 따른 공정에서 1회만 사용된 후 공정에서 더 이상 사용되지 않는 재사용가능 물품, 예를 들어 강철로 제조된 것을 또한 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 상기 재사용가능 물품, 예를 들어 강철로 제조된 것은 "일회용 물품으로서 사용되는 물체"로서 지칭될 수 있다. 이러한 사용된 일회용 물품은 본 발명에 따른 공정에서 각각 "일회용" 또는 "1회용" 물품 ("SU 기술")으로서 지칭될 수도 있다. 따라서, 이들은 본 발명에 따른 공정 및 모듈형 시스템의 세균-감소된 상태를 추가로 개선한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "생성물 스트림"은 생성물을 함유하는 불균질 세포 배양물/유체 혼합물로부터의 무입자 유체, 및 본 발명에 따른 공정의 다른 공정 단계 각각의 결과, 즉 여과 후, 크로마토그래피 후, 바이러스 고갈 후, 한외여과 후, 투석여과 후, 또는 본 발명에 따른 공정의 추가 단계 후의 생성물 스트림을 의미하며, 상기 생성물 스트림은 상이한 농도 및 순도를 가질 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "바이러스 고갈"은 처리될 유체 내에 존재하는 바이러스의 완전한 불활성화 및/또는 제거까지 처리될 유체의 단위 부피당 활성 바이러스 농도가 감소되는 것을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "살균제"는 미생물 성장을 느리게 하거나 또는 완전히 억제할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 살균제는, 특히 본 발명에 따른 공정의 맥락에서 한외여과 동안, 살균제-함유 완충제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "버블 트랩"은 당해 유체가 탈기되는 동안 동시에 기체 버블을 수집하기 위한 장치를 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "모듈형"은 본 발명에 따른 공정의 개별적인 단계가 서로 연결된 별개의 모듈에서 수행될 수 있다는 것을 의미하며, 이러한 모듈들은 미리 설정되어 있고 세균-감소된 상태이며, 이들을 폐쇄된 방식 및 상이한 조합으로 서로 연결할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "모듈형 시스템"은 유체 ("생성물 스트림")가 운반될 수 있고 적어도 2개의 하류 및/또는 상류 단계를 수행하기 위해 서로 연결된 일련의 모듈 ("유닛")을 의미한다. 본 발명에 따르면, 이러한 유닛들은 단계를 연속적으로 수행하는데 적합하고, 연속적 유체 스트림 ("생성물 스트림")으로 작동될 수 있다. 이와 관련하여, "모듈형 시스템"의 개별적인 모듈들은 임의의 조합으로 서로 연결될 수 있다. 본 발명의 맥락에서의 모듈의 예는 여과 모듈(2), 크로마토그래피 모듈(3), 한외여과 모듈(6), 투석여과 모듈(7) 및 투석 모듈(8)이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "폐쇄된"은 본 발명에 따른 공정 및 본 발명에 따른 모듈형 시스템에 의해 생산 및/또는 가공된 생성물이 실내 환경에 노출되지 않도록 작동되는 상기 공정 및 상기 모듈형 시스템의 작동 방식을 의미한다. 본 발명에 따른 폐쇄된 공정 및 상응하는 본 발명에 따른 폐쇄된 모듈형 시스템의 외부로부터 물질, 물체, 완충제 등이 첨가될 수 있지만, 이러한 첨가는 생산 및/또는 가공된 생성물이 실내 환경에 노출되는 것을 피하는 방식으로 일어난다.
종래 기술로부터 공지된 공정들은 하기에서 다루어질 다양한 단점이 있다.
생물제약적 및 생물학적 생성물을 생산하기 위한 공지된 공정은 서로 연결된 하기 생산 단계를 전형적으로 포함한다:
1. 관류 배양
2. 세포 유지 시스템,
단계 1 및 2에 대한 대안으로서, 페드-뱃치 배양을 또한 사용할 수 있음,
3. 세포 제거
4. 완충제 또는 배지 교환, 바람직하게는 농축하면서
5. 바이오버든 감소, 바람직하게는 멸균 여과에 의한 감소
6. 포획 크로마토그래피.
전형적으로, 생성물 스트림의 추가 정제를 위해 추가 단계가 수행되고, 보다 특히 하기 단계가 수행된다:
7. 바이러스 불활성화
8. 중화, 및
9. 임의적으로, 추가적인 심층 여과, 바이오버든 감소 (멸균 여과).
생물제약 생산에서의 높은 품질 기준의 관점에서, 전형적으로 하기 단계가 추가적으로 수행된다:
10. 크로마토그래피에 의한 중간체 및 고품질 정제
11. 바이오버든 감소, 예를 들어 멸균 여과
12. 바이러스 여과
13. 완충제 교환 및 바람직하게는 농축, 및
14. 멸균 여과.
상기 기술된 생산에서, 영양 용액을 함유하는 발효기 내의 세포가 생물학적 생성물, 예를 들어 단백질, 예를 들어 치료용 단백질을 생산한다. 영양 용액은 또한 미생물, 예컨대 박테리아 및 포자에 대한 이상적인 성장 배지이다. 이러한 미생물의 성장을 원치 않기 때문에, 이러한 상황으로부터 문제가 발생한다. 상기의 원치 않는 미생물 성장은 비교적 긴 실행 시간의 경우에 특히 문제가 되는데, 기하급수적인 미생물 성장, 그리고 따라서 생산되는 생물학적 생성물의 뱃치의 전체적인 손실까지 공정의 실행 시간이 증가함에 따라 영양 용액이 점점 더 오염되기 때문이다.
최대의 청결 및 멸균성을 유지하면서 생산 시스템의 신속하고 유연성이 있는 재로딩에 대한 요구에 대처하기 위해, 연속적 생산, 바람직하게는 일회용 기술을 사용하는 생산에 대한 개념이 시장에서 지속적으로 성장하는 관심을 끌고 있다.
그러나, 2시간 이상에서 수일 내지 수주까지의 범위에 이르는 이러한 공정의 비교적 긴 실행 시간에 대해, 통상의 소독 수단, 예를 들어 통상의 "정치 세정(clean-in-place)" (CIP) 수단, 예컨대 1 M NaOH에 의한 소독은 불충분하다. 따라서, 2시간 이상을 초과하는 실행 시간의 경우에, 이러한 통상의 공정 및 시스템은 가능한 오염 및/또는 가능한 세균 성장에 대해 고도로 감수성이라는 단점이 있다.
따라서, 세균-감소된 상태로 인해 연속적 작동 방식을 수주 동안 허용하는, 불균질 세포 배양물-유체 혼합물로부터의 생성물의 연속적 정제를 위한 공정이 요구된다.
따라서 본 발명의 목적은 생성물, 예를 들어 단백질이 수시간 내지 수주까지의 기간에 걸쳐 연속적으로 정제될 수 있는 공정 및 상응하는 시스템을 개발하는 것이다.
본 발명은 불균질 세포 배양물-유체 혼합물로부터의 생물제약적, 생물학적 거대분자 생성물의 연속적, 세균-감소된 생산 및/또는 가공을 위한 방법 (공정)이며, 하기 단계:
(a) 생성물 스트림의 형태로, 생성물을 함유하는 불균질 세포 배양물-유체 혼합물로부터 무입자 유체를 제공하는 단계,
(b) 여과물을 제공하는, 적어도 1회의 여과,
(c) 생성물을 정제하기 위한 적어도 2회의 크로마토그래피 단계,
(d) 적어도 1회의 바이러스 고갈,
(e) 단계 (b), (c) 및/또는 (d)의 생성물 스트림의 적어도 1회의 한외여과 및/또는 적어도 1회의 투석여과
를 포함하며,
(c)로부터의 적어도 2회의 크로마토그래피 단계는 각각의 경우에 적어도 2개의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 막 흡착기를 통한 정제를 포함하고, 방법은 폐쇄되고 모듈형인 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는
방법 (공정)을 제공함으로써 이러한 목적을 달성한다.
본 발명에 따른 방법의 기초는 그의 4개의 핵심 원리 및 그에 의한 핵심 특색이다:
1. 연속적
2. 세균-감소됨
3. 폐쇄됨, 및
4. 생물제약적, 생물학적 거대분자 생성물의 모듈형 생산.
일반적으로 발생하는 원치 않는 미생물 성장의 문제를 이러한 4개의 특색들이 함께 급격하게 감소시켜, 본 발명에 따른 공정의 실행 시간을 연속적 작동 방식으로 8주까지 허용한다.
단계 a)에서 불균질 세포 배양물-유체 혼합물로부터 제공되는 무입자 유체는 바람직하게는 연속적 관류 및 발효 공정, 예를 들어 세포 배양물 또는 조직 배양물, 또는 관류 반응기로부터 유래될 수 있다. 1개 초과의 관류 반응기, 예를 들어 2개의 관류 반응기가 병렬 작동되는 것도 가능하다.
먼저 유체를 적합한 세포 유지 시스템, 예를 들어 경사진 플레이트 분리기 (침강기)를 통해 연속적으로 방출시킬 수 있고, 이에 의해 대다수의 세포가 유지될 수 있다. 그 후, 유체 내에 존재하는 입자를 후속 여과 및/또는 원심분리 단계 또는 다른 적합한 분리 방법에 의해 유체로부터 제거하여, 생물제약적, 생물학적 거대분자 생성물을 함유하는 무입자 유체를 산출할 수 있다.
여과 단계 (b)는, 예를 들어, 단계 (a) 후에 수득된 무입자 유체를 여과하여 여과물을 산출하는 것일 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 공정은 공정 내의 적합한 지점에서 추가적인 여과 단계를 또한 포함할 수 있다.
여과 단계 b)는 적합한 필터 방법, 예를 들어 0.2 μm 필터, 또는 병렬 작동되는 2개 이상의 필터에 의해 달성될 수 있다. 여과 단계를 위한 적합한 필터는, 예를 들어, 사르토가드(Sartoguard) NF 0.2 μm 필터이고, 2개 이상의 이러한 필터가 병렬 작동될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서, 여과 단계 (b)는 오염물 예컨대 DNA, 단백질 A, HCP를 고갈시킬 가능성을 추가로 지니는 심층 필터를 포함한다. 이는 충분한 제타 전위를 갖는 심층 필터 (제타포(Zetapor) 3M, 포시다인(Posidyne), 폴(Pall)) 또는 활성탄이 있는 심층 필터 (밀리스택(Millistak), 머크 밀리포어(Merck Millipore))일 수 있다.
단계 c)의 생성물을 정제하기 위한 적어도 2회의 크로마토그래피 단계는 각각의 경우에 적어도 2개의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 막 흡착기를 통한 정제를 포함한다. 이와 관련하여, 크로마토그래피 칼럼 및/또는 막 흡착기는 임의의 적합한 결합 원리, 예를 들어 리간드에 대한 생성물의 친화성, 이온성 상호작용, 금속 킬레이트 결합, 소수성 상호작용 또는 반 데르 발스 힘을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 적어도 2회의 크로마토그래피 단계의 제1 크로마토그래피 단계는 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 생성물에 대한 친화성을 갖는 리간드, 예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, IgM, IgG, 및 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, IgM, IgG와 상이하고 생성물에 대한 친화성을 갖는 재조합 단백질)일 수 있다. 그 후, 이에 추가 (제2) 크로마토그래피 단계, 예를 들어 이온성 상호작용을 통한 크로마토그래피가 이어진다.
단계 c)에서, 본 발명에 따른 방법은 달성하려는 생성물 순도 및 농도의 정도에 따라 임의의 적합한 크로마토그래피 원리를 임의의 순서로 포함할 수 있다는 점에서 유연성이 있다.
단계 c)에 따라 적어도 2개의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 막 흡착기를 통해 적어도 2회의 크로마토그래피 단계를 사용하는 것의 기술적인 효과는 일반적으로 개별적인 크로마토그래피 단계는 오염물, 예를 들어, 숙주 세포 불순물, 응집물, DNA, 단백질 A 등의 충분한 제거를 보장할 수 없다는 것이다.
추가적으로, 이는 하나의 크로마토그래피 단계에서의 연속적 생산을 허용하는데, 적어도 1개의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 막 흡착기에 미정제 생성물이 로딩될 수 있는 한편, 적어도 1개의 다른 크로마토그래피 칼럼 및/또는 막 흡착기가 재생 또는 용출될 수 있어, 공정에 대한 연속적이고 효과적인 작동 방식을 달성할 수 있게 하기 때문이다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서, pH를 조정하고/하거나 전도도를 조정하기 위한 하나 이상의 추가 단계 및/또는 여과 단계 및/또는 농축 단계 및/또는 완충제 교환이 (c)에서의 적어도 2회의 크로마토그래피 단계 사이에 및/또는 단계 (d)에서의 바이러스 불활성화 후에 수행된다. 이는 조건에 맞게 개조될 수 있는 공정에 대한 작동 방식을 허용한다.
단계 d)의 적어도 1회의 바이러스 고갈은 특히 무입자 유체의 pH를 바람직하게는 ≤ 4.0의 pH로 조정함으로써 수행될 수 있다. 불활성화될 무입자 유체의 pH를 ≤ 4.0으로 조정하는 것은, 예를 들어, HCl 용액을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 이러한 첨가는 전형적으로 바이러스 고갈용 장치에 앞서 행해진다. 전형적으로, 바이러스 고갈을 종료하기 위해, 염기, 예를 들어 수산화나트륨 용액 (NaOH)을 사용하여 pH를 > 4로 조정한다.
그러나, 단계 d)의 적어도 1회의 바이러스 고갈은 용매/세제에 의해 바이러스 고갈이 달성되는 용매/세제 단계에 의해서 수행될 수도 있다.
추가 실시양태에서, 바이러스 고갈은 또한 UV 처리 및/또는 열 처리에 의해 달성될 수 있다.
특히 단계 d)의 적어도 1회의 바이러스 고갈은 분할된 생성물 스트림이 도입될 수 있는 잔류 섹션에서 일어날 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서, 생성물과 접촉하는 단계 (a) 내지 (e)에서 사용된 모든 요소가 적합한 세균-감소 방법에 의해 세균 감소에 적용된다.
바람직하게는, 세균-감소 방법은 감마 조사, 베타 조사, 오토클레이빙, 에틸렌 옥시드 (ETO) 처리, 오존 처리 (O3), 과산화수소 처리 (H2O2) 및 정치 증기 (SIP) 처리로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
따라서, 생성물 스트림과 접촉하는 본 발명에 따른 공정에서 사용된 모듈의 물체 및 요소는 바람직하게는 세균 감소에 적용될 수 있고/있거나 멸균될 수 있고, 바람직하게는 오토클레이빙될 수 있거나, 감마-조사될 수 있거나, 에틸렌 옥시드 (ETO)가 플러싱될 수 있거나, 오존 (O3)으로 처리될 수 있거나, 과산화수소 (H2O2)로 처리될 수 있거나, 또는 정치 증기 (SIP) 처리로 처리될 수 있어, 본 발명에 따른 공정의 세균-감소된 또는 심지어 무균성인 조작을 허용한다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서, 생성물과 접촉하는 여과 단계 (b)부터 계속 사용된 모든 요소는 일회용 물품이거나 또는 일회용 물품으로서 사용된다. 이러한 일회용 물품은 본 발명에 따른 공정에서 "1회용" 물품 ("SU 기술")으로서 지칭될 수도 있다. 이는 공정의 세균-감소된 상태를 개선한다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서, 모든 유입물 유체는 세균-감소 필터, 예를 들어, 사르토리우스(Sartorius)로부터의 사르토가드 NF 필터를 통해 여과된다.
이와 관련하여, 모든 유출물은 바람직하게는 미생물의 재성장을 방지하는 세균 장벽에 의해 보호된다. 예를 들어, 여기에서 사르토리우스로부터의 사르토가드 NF 필터를 세균 장벽으로서 사용하는 것이 또한 가능하다. 세균 장벽(11)의 추가적인 신뢰성이 필터 및/또는 폐기물 라인의 전환에 의해 달성될 수 있다. 세균-감소된 조건을 보장하는 추가 수단이, 바람직하게는 여과 후에, 예를 들어 NaOH 용액으로, 폐기물 라인을 주기적으로 소독함으로써 달성될 수 있다. 추가적인 가능한 방법은 UV 조사 및 열 처리이다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법의 모듈형 공정 단계는 바람직하게는 모듈에서 수행되며, 이러한 모듈들은 서로 연결된다.
바람직하게는, 모듈들은 용접에 의해 또는 무균성 연결기에 의해 서로 연결된다. 모듈들을 용접시키기 위해, 예를 들어, 사르토리우스로부터의 "TC 용접기" 기기를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서, 단계 (a) 내지 (e)에서 모든 사용된 액체, 기체 및 고체가 세균 감소에 적용된다. 이와 관련하여, 세균 감소는 바람직하게는 세공 크기가 바람직하게는 ≤ 0.45 μm인 필터를 통한 여과에 의해 달성된다. 이러한 경우에, 공정 중 멸균은 바람직하게는 공정 동안 수행되지 않는다. 다른 실시양태에서, 세공 크기가 바람직하게는 ≤ 0.20 μm인 필터를 통한 여과에 의해 세균 감소를 수행하는 것이 또한 가능하다.
본 발명에 따른 방법의 추가로 바람직한 실시양태에서, 적어도 2개의 크로마토그래피 칼럼에 도달하는 모든 유체의 탈기가 크로마토그래피 단계 (c) 전에 수행되며, 탈기는 바람직하게는 적어도 1개의 버블 트랩에 의해 및/또는 진공을 통해 적어도 1개의 소수성 미세여과 막에 의해 및/또는 초음파로의 처리에 의해 및/또는 예를 들어 헬륨과 같은 난용성 기체로의 스파징에 의해 달성된다.
이와 관련하여, 본 발명에 따른 공정 및 본 발명에 따른 시스템의 연속적 수행에서 멸균성을 유지하기 위해 진공을 통한 소수성 미세여과 막을 사용하는 것이 바람직한데, 이것이 버블 트랩에 비교하여 특히 유리한 것으로 발견되었기 때문이다. 사용된 소수성 미세여과 막은 특히 멤브라나(Membrana)로부터의 마이크로모듈(MicroModule)일 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 실시양태에서, 단계 a)로부터의 무입자 유체가 살균제-함유 완충제에 대한 적어도 1회의 한외여과에 적용된다. 한외여과의 결과로서, 미생물/세균으로부터 유체 내에서 성장할 조건을 박탈하기 위해 유체 내에 존재하는 영양소가 살균제-함유 완충제로 대체된다. 이는 추가적으로 공정의 세균 감소를 개선한다.
이와 관련하여 사용된 살균제, 또는 하나 이상의 살균제는 바람직하게는 이미다졸, 벤조산, 소르브산, 파라-히드록시벤조산 에스테르, 술파이트, 디술파이트, 아지드, 오르토-페닐페놀, 니신, 나타마이신, 헥사메틸렌테트라민, 디메틸 디카르보네이트, 니트라이트, 니트레이트, 아세트산, 아스코르브산, 이소아스코르브산, L-락트산, 프로피온산, 붕산 및 리소자임으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
살균제-함유 완충제 내에 존재하는 살균제는 또한 하기로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 살균제일 수 있다:
E210 내지 E213: 벤조산 및 그의 염, 산성 환경에서 용매 내 0.05-0.1%, 용매 내 2-3 g/kg;
E200 내지 E203: 소르브산 및 그의 염, 300-2000 mg/kg;
E214 내지 E219: PHB 에스테르 (파라-히드록시벤조산 에스테르, 파라벤), 부틸파라벤 및 프로필파라벤;
E220 내지 E228: 술파이트 및 디술파이트;
E231 및 E232: 오르토-페닐페놀, 12 mg/kg;
E234: 니신;
E235: 나타마이신;
E239: 헥사메틸렌테트라민, 25 mg/kg;
E242: 디메틸 디카르보네이트;
E249-E252: 니트라이트 및 니트레이트, 300 mg/kg;
E260: 아세트산, 0.5-3%;
E300-E302: 아스코르브산, 300 mg/kg;
E315-E316: 이소아스코르브산, 1500 mg/kg;
E261-E263: 아세테이트;
E270: L-락트산;
E280 내지 E283: 프로피온산 및 그의 염, 1-3 g/kg;
E284 및 E285: 붕산, 최대 4 g/kg;
E1105: 리소자임; 및
아지드.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 생물제약적, 생물학적 거대분자 생성물은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 단백질 및 백신으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 펩티드, 바람직하게는 DNA 및 RNA 백신이다.
단계 c)에서 사용된 크로마토그래피 칼럼 및/또는 막 흡착기는 임의의 적합한 결합 원리, 예를 들어 리간드에 대한 생성물의 친화성, 이온성 상호작용, 금속 킬레이트 결합, 소수성 상호작용 또는 순수한 반 데르 발스 힘을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 적어도 2회의 크로마토그래피 단계의 제1 크로마토그래피 단계는 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 생성물에 대한 친화성을 갖는 리간드, 예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, IgM, IgG, 및 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, IgM, IgG와 상이하고 생성물에 대한 친화성을 갖는 재조합 단백질)일 수 있다. 그 후, 이에 추가 (제2) 크로마토그래피 단계, 예를 들어 이온성 상호작용을 통한 크로마토그래피가 이어진다.
이러한 단계에서, 본 발명에 따른 방법은 유연성이 있다. 이는 단계 c)에서, 달성하려는 생성물 순도 및 생성물 농도의 정도에 따라 임의의 적합한 크로마토그래피 원리를 임의의 순서로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)의 적어도 2개의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 막 흡착기는 바람직하게는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, IgM, IgG, 및 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, IgM 및 IgG와 상이하고 생성물에 대한 친화성을 갖는 재조합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 리간드를 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 단계 (a) 내지 (e)의 공정은 적어도 4시간, 바람직하게는 적어도 8시간, 바람직하게는 적어도 12시간, 바람직하게는 적어도 24시간, 보다 바람직하게는 적어도 48시간, 보다 바람직하게는 적어도 7일, 보다 바람직하게는 적어도 4주, 특히 바람직하게는 적어도 8주의 실행 시간을 갖는다. 2주 이상의 연속적 작동의 이러한 긴 실행 시간은 공정의 폐쇄되고, 모듈형이며, 특히 세균-감소된 작동 방식으로만 실현가능하다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 적어도 1개의 필터를 포함하는 적어도 1회의 여과 단계가 단계 a) 내지 e) 사이에 및/또는 그 후에 수행된다.
본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 실시양태에서, 필터가 세균-감소된 조건 하에 자동으로 교체되고, 자동 필터 교체는 바람직하게는 하기 단계를 포함한다:
(i) 비-여과물 측 상의 압력 센서에서 역치를 초과하는 경우에, 유동 경로를 폐쇄하면서, 사용된 필터 내의 생성물을 바람직하게는 기체 또는 액체에 의해 여과물 측으로 밀어 넣으며,
또는 유동 경로 내의 사용된 필터의 최대 시간을 초과하는 경우에, 또는 사용된 필터를 통과하는 여과물의 최대 부피를 초과하는 경우에,
유동 경로를 새로운 필터로 전환하는 단계,
(ii) 새로운 필터의 벤팅 밸브에서 세공 크기가 바람직하게는 <= 0.25 μm인 공기 필터를 통해 새로운 필터를 벤팅하며, 바람직하게는 생성물을 공급 펌프에 의해 새로운 필터 내로, 또는 세균-감소된 방식으로 연결된 폐쇄된 백 내로 운반하는 단계,
(iii) 압력 센서 또는 충전-수준 센서 또는 저울 또는 액체 검출기에 의해 비-여과물 측 상에서 새로운 필터의 벤팅이 완료된 것을 검출하는 단계,
(iv) 밸브에 의해 여과물 유출구를 개방하고 벤팅 밸브와 공기 필터 사이의 유동 경로를 폐쇄하는 단계, 및
(v) 이전 필터를 새로운 필터로 교환하는 단계.
생성물의 새로운 필터로의 동시 또는 하류 수송은, 예를 들어, 공급 펌프에 의해 달성될 수 있다.
이는 본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서 필터 교체 (사용된 필터 요소를 새로운 것으로 전환하는 것)이 자동으로 행해질 수 있다는 것을 의미한다. 여기에서 필터 벤팅이 문제인 것으로 발견되었지만, 이는 필수적이고 현재 이용가능한 필터의 경우에는 수동으로 수행되어야 한다. 먼저, 필터가 적절하게는 예를 들어 ETO, 오토클레이빙 또는 감마 조사에 의한 세균-감소 방법에 적용된 후, 공정에 연결된다. 그 후, 벤팅 밸브를 개방하면서 비-여과물 측 상에서 필터를 채울 수 있다. 실제 여과가 수행될 수 있도록 성공적인 벤팅 후 이러한 밸브를 폐쇄하여야 한다. 뱃치 공정에서는, 비-여과물 측에서의 엄격한 세균-감소된 취급이 필수적이지 않다. 이는 뱃치 공정은 짧은 기간 동안만 실행되기 때문에 그러하다. 따라서, 가능한 한 세균-감소된 여과물을 수득하는 것이 중요할 뿐이다. 그러나, 연속적 공정에서는, 공정의 세균 오염을 방지하기 위해 비-여과물 측의 엄격한 무세균 조작이 또한 요구된다. 종래 기술에서는, 실제 여과가 수행될 수 있도록 회전식 이동에 의해 필터를 채운 후 벤팅 밸브가 수동으로 폐쇄되어야 한다. 회전체의 축방향 이동을 또한 필요로 하기 때문에 상기 회전식 이동은 자동화하기가 어렵다. 회전체가 이에 장착된 밀봉재와 함께 축방향으로 이동한 결과로서, 경계가 시프팅된다. 벤팅 밸브의 상기 수동 폐쇄 전에 벤팅 밸브가 폐쇄되어 있으면서 세균 감소가 수행되었으면, 벤팅 밸브를 개방할 때 세균 경계가 시프팅된다. 이는 세균을 함유하는 영역을 세균-감소된 영역 내로 도입하고, 따라서 세균 감소를 무효로 만든다. 필터 밸브가 개방된 상태의 세균 감소는 권장되지 않는데, 개방된 위치는 고정된 위치가 없고, 밸브 손상이 쉽게 발생할 수 있기 때문이다. 추가적으로, 개방된 위치는 일반적으로 흔들거리고, 따라서 정상적인 필터 취급을 통해 세균 경계의 시프팅이 발생할 수 있다.
자동 필터 벤팅의 경우에, 간단한 수단만으로 벤팅이 수행될 수 있도록 초기 작동 동안 벤팅 밸브의 회전식 이동을 피하는 것이 유리하다. 그 후, 폐쇄된 상태에서도 투과가 가능하지만 계속 신뢰할 수 있게 환경을 봉쇄하도록 벤팅 밸브를 변형시킬 수 있다. 그 결과, 밸브가 안전한 상태로 "폐쇄"되고, 이는 밀착 끼워맞춤을 특징으로 한다. "개방"된 상태는 일반적으로 명확하게 정의되지 않는데, 밸브 본체가 작동 동안 매우 흔들리고 경계 시프팅을 허용하기 때문이다. 소수성 <= 0.2 μm 공기 필터에서 종결되는 소정의 길이의 튜빙이 회전체의 노즐에 부착된다. 그 후 이러한 배열은 바람직하게는 ETO, 감마 조사, 오토클레이빙, 또는 오존 (O3) 처리 또는 과산화수소 (H2O2) 처리에 의한 세균 감소에 적용된다. 따라서, 벤팅 밸브 상의 공기 필터까지의 전체적인 비-여과물 측이 세균-감소된 또는 저-세균 상태이다. 벤팅 밸브와 공기 필터 사이에서, 소정의 길이의 튜빙이 신뢰할 수 있게 소정의 길이의 튜빙을 핀칭할 수 있는 튜빙 핀치 밸브 내로 삽입된다. 이러한 방식으로, 완전히 자동이고 저-세균인 방식으로 벤팅이 달성될 수 있다. 벤팅 밸브 및 소정의 길이의 튜빙에 의해 액체가 공기 필터에 진입할 때까지 필터를 채운다. 소수성 벤팅 필터가 액체를 차단한다. 동시에, 공정 시스템이 여과물 측 상의 밸브에 의해 생산 스트림을 차단하고, 따라서 필터 앞에서 압력이 상승한다. 적합한 센서에 의해 상기 압력 상승이 검출된다. 특정 역치 압력을 초과하면, 벤팅 튜빙의 핀치 밸브가 폐쇄되고, 여과물 측 상의 밸브가 개방된다. 이러한 절차를 통해, 변형된 벤팅 밸브를 사용하여 수동 개입 없이 필터를 자동으로 변형시킬 수 있다.
이러한 자동 필터 교체가 예를 들어 도 2에서 제시되고, 이는 사용된 필터(17)가 새로운 필터(16)의 용접에 의해 대체된 공정 및 시스템의 여과 단계의 작동 원리를 개략적으로 도해한다.
공정 끝에서, 불균질 세포 배양물-유체 혼합물로부터의 최종적인 정제된 생물제약적, 생물학적 거대분자 생성물이, 바람직하게는 세공 크기가 0.2 μm인 필터를 통해, 최종 여과에 의해 마지막으로 1회 여과될 수 있다. 최종 여과는, 예를 들어, 감마-조사 사르토포어(Sartopore) 2 캡슐 (미디캡(Midicap) 사이즈 7, 0.05 ㎡)을 가로질러 감마-조사 5 리터 GE 레디서킷(ReadyCircuit) 백 내로 달성될 수 있다. 최종 백의 충전 수준이 허용가능할 때, 그 후 상기 백을 탈용접시킬 수 있고, 새로운 백을 공정에 용접시킬 수 있다.
본 발명은 불균질 세포 배양물-유체 혼합물로부터의 생물제약적, 생물학적 거대분자 생성물의 연속적, 세균-감소된 생산 및/또는 가공을 위한 모듈형 시스템이며,
(a) 적어도 1개의 여과 모듈,
(b) 적어도 2개의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 막 흡착기를 포함하는, 적어도 1개의 크로마토그래피 모듈,
(c) 적어도 1개의 한외여과 모듈 및/또는 적어도 1개의 투석여과 모듈 및/또는 적어도 1개의 투석 모듈, 및
(d) 연속적 바이러스 고갈을 위한 적어도 1개의 모듈
을 포함하며,
폐쇄되고 세균-감소된 것을 특징으로 하는 모듈형 시스템을 제공함으로써 상기 목적을 추가로 달성한다.
그러나, 적어도 1개의 크로마토그래피 모듈이 2개 초과의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 막 흡착기, 예를 들어 3개 또는 4개의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 막 흡착기를 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 모듈형 시스템의 추가 실시양태에서, 생성물과 접촉하고 모듈 (a) 내지 (d)에서 사용된 모든 요소가 세균-감소 방법에 의해 세균 감소에 적용되며, 세균-감소 방법은 바람직하게는 감마 조사, 베타 조사, 오토클레이빙, 에틸렌 옥시드 (ETO) 처리, 오존 처리 (O3), 과산화수소 처리 (H2O2) 및 정치 증기 (SIP) 처리로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 모듈형 시스템 자체, 그리고 또한 생성물 스트림과 접촉하는 모듈의 요소들이 세균 감소에 적용될 수 있고/있거나 멸균될 수 있고, 바람직하게는 오토클레이빙될 수 있거나, 감마-조사될 수 있거나, 에틸렌 옥시드 (ETO)가 플러싱될 수 있거나, 오존 (O3)으로 처리될 수 있거나, 과산화수소 (H2O2)로 처리될 수 있거나, 또는 정치 증기 (SIP) 처리로 처리될 수 있어, 본 발명에 따른 모듈형 시스템의 저-세균 또는 심지어 무균성 조작을 허용한다.
본 발명에 따른 모듈형 시스템의 추가 실시양태에서, 생성물과 접촉하는 모듈 (a) 내지 (d)에서 사용된 모든 물체는 일회용 물품이거나 또는 일회용 물품으로서 사용된다. 이와 관련하여, 모듈들은 바람직하게는 용접에 의해 또는 무균성 연결기에 의해 서로 연결된다. 예를 들어, GE의 무균성 "레디메이트(ReadyMate)" 연결기는 본 발명에 따른 모듈형 시스템에서 바람직하게 사용되는 무균성 연결기이다.
바람직하게는, 바로 사용할 수 있는 일회용 물품이 감마-조사 요소로서 사용된다.
본 발명에 따른 모듈형 시스템의 바람직한 실시양태에서, 모든 유입물 유체는 세균-감소 필터를 통과하며, 모든 유출물은 바람직하게는 재성장을 방지하는 세균 장벽에 의해 보호된다.
모듈형 시스템의 끝에서, 불균질 세포 배양물-유체 혼합물로부터의 최종적인 정제된 생물제약적, 생물학적 거대분자 생성물은, 바람직하게는 세공 크기가 0.2 μm인 필터를 통해, 최종 여과에 의해 마지막으로 1회 여과될 수 있다. 최종 여과는, 예를 들어, 감마-조사 사르토포어 2 캡슐 (미디캡 사이즈 7, 0.05 ㎡)을 가로질러 감마-조사 5 리터 GE 레디서킷 백 내로 달성될 수 있다. 최종 백의 충전 수준이 허용가능할 때, 그 후 상기 백을 탈용접시킬 수 있고, 새로운 백을 공정에 용접시킬 수 있다.
바람직한 실시양태를 포함하는 본 발명이 하기 도면 및 실시예에서 이에 제한되지 않으면서 더욱 상세하게 설명될 것이다. 맥락 상 명확하게 반대되지 않는다면, 원하는 대로 실시양태들을 서로 조합할 수 있다.
하기가 제시된다:
도 1은 본 발명에 따른 공정의 한 실시양태의 공정 설계도를 개략적으로 제시한다. 괄호 사이의 숫자는 실시예 1 및 표 1에 열거된 바와 같은 물질 수지에 대한 언급이다.
도 2는 사용된 필터(17)가 새로운 필터(16)의 용접에 의해 대체된 공정 및 시스템의 여과 단계의 작동 원리를 개략적으로 제시한다.
도 3은 바이러스 불활성화 및 중화의 2개의 공정 단계를 예시적으로제시한다 - pH 프로브 pH0501 및 pH0502가 있는, 모듈형 방식으로 구성된 2개의 유닛은 오토클레이빙되고, 나머지는 감마-조사된다. 그 후, pH 프로브 pH0501 및 pH0502이 조립체 내로 용접된다. 백들이 무균성 GE 레디메이트® 연결기를 통해 연결된다. 먼저 Prot-A 및 여과 유닛으로의 연결이 용접되어 닫힌 후, 다양한 유닛으로 용접된다.
도 4는 모든 유입물 스트림 및 유출물 스트림이 세균 장벽(10, 13)을 통해 환경에 연결되어 있는, 시스템의 모듈형 구조를 예시적으로 제시한다. 예시적인 모듈형 시스템(1)은 택일적으로 작동되는 2개의 필터(13)를 각각 갖는 3개의 여과 모듈(2), 2개의 크로마토그래피 칼럼(4) 또는 2개의 막 흡착기(5)를 갖는 2개의 크로마토그래피 모듈(3), 바이러스 고갈 단계, 예를 들어 바이러스 불활성화(9), 한외여과 모듈(6), 및 투석여과 모듈(7)로 이루어진다. 기체 버블은 소수성 필터(15) 또는 버블 트랩(14)을 통해 완충제로부터 제거된다.
도 1은 본 발명에 따른 공정의 한 실시양태의 공정 설계도를 개략적으로 제시한다. 괄호 사이의 숫자는 실시예 1 및 표 1에 열거된 바와 같은 물질 수지에 대한 언급이다.
도 2는 사용된 필터(17)가 새로운 필터(16)의 용접에 의해 대체된 공정 및 시스템의 여과 단계의 작동 원리를 개략적으로 제시한다.
도 3은 바이러스 불활성화 및 중화의 2개의 공정 단계를 예시적으로제시한다 - pH 프로브 pH0501 및 pH0502가 있는, 모듈형 방식으로 구성된 2개의 유닛은 오토클레이빙되고, 나머지는 감마-조사된다. 그 후, pH 프로브 pH0501 및 pH0502이 조립체 내로 용접된다. 백들이 무균성 GE 레디메이트® 연결기를 통해 연결된다. 먼저 Prot-A 및 여과 유닛으로의 연결이 용접되어 닫힌 후, 다양한 유닛으로 용접된다.
도 4는 모든 유입물 스트림 및 유출물 스트림이 세균 장벽(10, 13)을 통해 환경에 연결되어 있는, 시스템의 모듈형 구조를 예시적으로 제시한다. 예시적인 모듈형 시스템(1)은 택일적으로 작동되는 2개의 필터(13)를 각각 갖는 3개의 여과 모듈(2), 2개의 크로마토그래피 칼럼(4) 또는 2개의 막 흡착기(5)를 갖는 2개의 크로마토그래피 모듈(3), 바이러스 고갈 단계, 예를 들어 바이러스 불활성화(9), 한외여과 모듈(6), 및 투석여과 모듈(7)로 이루어진다. 기체 버블은 소수성 필터(15) 또는 버블 트랩(14)을 통해 완충제로부터 제거된다.
표 1은 도 1에 제시된 위치의 평균 유량 및 항체 농도를 제시한다.
사용된 참조 번호는 하기와 같다:
1 = 모듈형 시스템
2 = 여과 모듈
3 = 크로마토그래피 모듈
4 = 크로마토그래피 칼럼
5 = 막 흡착기
6 = 한외여과 모듈
7 = 투석여과 모듈
8 = 투석 모듈
9 = 바이러스 고갈
10 = 세균-감소 필터
11 = 세균 장벽
12 = 무균성 연결기
13 = 세공 크기가 바람직하게는 ≤ 0.45 μm인 필터
14 = 버블 트랩
15 = 소수성 미세여과 막
16 = 새로운 필터
17 = 사용된 필터
18 = 압력 센서
19 = 세공 크기가 바람직하게는 <= 0.25 μm인 공기 필터
20 = 새로운 필터 16의 벤팅 밸브
21 = 공급 펌프
22 = 충전 수준 센서
23 = 저울
24 = 밸브
25 = 폐기물 스트림
26 = 생성물 스트림
27 = 완충제
28 = 액체 검출기
29 = 백
실시예
1
불균질 세포 배양물/유체 혼합물로부터 연속적 및 세균-감소된 방식으로 단백질을 정제하기 위해, 하기 모듈 및 조합된 공정 단계를 갖는 미니플랜트를 구성하였다:
달리 언급되지 않는 한, 이지로드(EasyLoad) II 펌프 헤드가 있는 마스터플렉스(MasterFlex) 연동 펌프를 공정에서 사용하였다. 사용된 튜빙은 마스터플렉스 LS16 또는 씨플렉스(Cflex) 또는 사니퓨어(Sanipure)였다. 생성물과 접촉하는 모든 사용된 성분을 25 kGy 감마 조사에 적용하였다. 물질, 예를 들어 pH 프로브가 있는 하위조립체 또는 바이러스 필터로 인해 감마 조사가 실현가능하지 않은 예외적인 경우에, 성분들을 121℃에서 20분 동안 오토클레이빙하였다. 가능한 경우에, 바로 사용할 수 있는 일회용 물품을 감마-조사 모듈로서 사용하였다. 예외 없이, 모든 백에 대해 그러하였다. 일반적으로 상기 백을 제네럴 일렉트릭(General Electric) (GE)으로부터의 레디메이트® 연결기를 사용하여 모듈에 연결시켰다. 각각의 모듈 사이에, 1회용 감마-조사 백 (레디서킷 1 리터, GE)을 모듈 n-1의 유출물 스트림과 모듈 n의 유입물 스트림 사이에 보상 탱크로서 놓았다. 일반적으로, 각각의 모듈에서 이러한 시점에 유입물 스트림 및 유출물 스트림이 있었다. 생성물 액체의 벤팅이 유리한 경우에, 소수성 0.2 μm 필터를 통해 환경으로부터 탱크를 봉쇄하였다.
A. 상류
i) 관류 반응기
IgG 모노클로날 항체의 연속적 생산을 위해, 10 리터 관류 반응기를 사용하였다. 정상 상태에서 생육성 세포 밀도는 60-70백만개의 세포/ml이었다. 역가는 ~115 mg/l였다. 2개의 병렬 관류 반응기를 사용하여 28일 동안 생산을 수행하였다.
ii) 세포 유지 시스템
생성물을 경사진 플레이트 분리기 (침강기)를 가로질러 연속적으로 방출시켰고, 이에 의해 대다수의 세포가 유지되었다.
B. 하류 DSP-1
i) 세포 정화
병렬로 작동되는 사르토가드 NF 0.2 μm 필터 (T-스타일, 맥시캡(MaxiCap), 0.65 ㎡)를 사용하여 정화를 수행하였다. 도 2는 어떻게 폐쇄된 저-세균 공정이 본원에서 실현되었는지를 제시한다. 필터 및 튜빙 조립체 둘 다를 감마-조사하였다. 무균성 연결기를 통해 유입물 및 유출물 라인을 변동하는 유량에 대한 보상 부피로서 사용된 감마-조사 백 (GE 레디서킷 1 리터)에 연결하였다. 벤팅 목적을 위해, 필터를 소수성 0.2 μm 공기 필터에 커플링시켰고, 그 결과, 본 발명의 맥락에서 모듈이 폐쇄되었다 (도 2). 공기 필터는 폴 코포레이션(Pall Corp.)으로부터의 엠플론(Emflon) II 또는 사르토리우스 스테딤(Sartorius Stedim)으로부터의 미디사트(Midisart) 2000이었다. 폐쇄된 상태에서도 투과가 가능하지만 여전히 신뢰할 수 있게 환경을 봉쇄하도록 벤팅 밸브를 변형시켰다. 이를 위해, 사르토가드 NF 상에서 벤팅 밸브의 내부 밀폐 고리를 제거하고, 감마 조사 전에 밸브를 폐쇄하였다. 상기 밸브를 개방되지 않도록 추가적으로 고정하였다. 그 결과, 밸브가 안전한 상태로 "폐쇄"되었고, 이는 밀착 끼워맞춤을 특징으로 하였다. 벤팅 밸브를 소정의 길이의 튜빙을 통해 공기 필터에 연결하였다. 벤팅 밸브와 공기 필터 사이에서, 소정의 길이의 튜빙을 튜빙 핀치 밸브 내로 삽입하였다. 벤팅 밸브 및 튜빙에 의해 액체가 공기 필터에 진입했을 때까지 필터를 채웠다. 그 후, 소수성 벤팅 필터가 액체를 차단하였다. 동시에, 공정 시스템이 여과물 측 상의 밸브에 의해 생산 스트림을 차단하였고, 따라서 필터 앞에서 압력이 상승하였다. 펜도테크(Pendotech) 압력 센서에 의해 상기 압력 상승이 검출되었다. 0.5 bar의 역치를 초과하였으면, 소정의 길이의 벤팅 튜빙의 핀치 밸브가 폐쇄되었고, 여과물 측 상의 밸브가 개방되었다.
ii) 농축 및 재완충
i) 세포 정화로부터의 여과물을 먼저 한외여과 중공-섬유 막 (GE 헬스케어(GE Healthcare)의 레디투프로세스(ReadytoProcess), 0.2 ㎡, 감마-조사됨)을 사용하여 10배 농축하였다. 사용된 순환 펌프는 일회용 쿼트로플로우(QuattroFlow) 1200 SU 펌프였고, 그의 펌프 헤드를 감마 조사 전에 튜빙 조립체 내로 통합하였다.
그 후, 농축된 생성물의 배지 성분을 갬브로(Gambro)의 레바클리어(Revaclear) 300 투석 막을 가로질러 50 mM 이미다졸/NaCl 완충제로 교환하였다. 제조사가 멸균-포장하여 모듈을 제공하고, 이를 생물 안전 캐비닛에서 감마-조사 튜빙 조립체에 연결하였다. 농축으로부터의 투과물 및 배지-함유 폐기물 스트림을 감마-조사 200 리터 사르토리우스 플렉스보이 내로 보냈다. 사르토리우스 용접기를 사용하여 재용접시킴으로써 플렉스보이를 교환하였다.
0.2 μm 여과
충전 전에, 택일적으로 작동되는 감마-조사 사르토가드 NF 필터 (맥시캡 사이즈 8)를 사용하여 200 리터 플렉스보이(Flexboy) 내로 생성물을 연속적으로 여과하였다. 구성 및 조작이 "B. 하류 DSP-1 - i) 세포 정화"와 유사하였다.
C. 하류 DSP-II
0.2 μm 여과
보관 후, 하류 크로마토그래피 칼럼을 입자로부터 보호하기 위해 DSP-I로부터의 생성물을 다시 여과하였다.
1. 포획 크로마토그래피
맙셀렉트 슈어(Mabselect Sure) (GE)를 Prot-A 수지로 사용하여 IgG를 단리하였다. IgG를 10배까지 농축하였고, 대부분의 오염물을 제거하였다. 타폰 바이오시스템즈, 인크(Tarpon Biosystems, Inc.)로부터의 연속적 바이오SMB(BioSMB) 시스템을 12개의 칼럼 (ID 16 mm, L 80 mm)과 함께 사용하였고, 여기서 8개의 칼럼이 로딩 구역에 있었다 (일련의 2개의 칼럼 및 4개의 병렬 시리즈). 이러한 칼럼들을 포함하는 전체 유동 경로에서 소독 또는 감마 조사에 의해 세균을 감소시켰다. 사이클당 로드는 칼럼당 32 칼럼 부피였다. 사용된 완충제는 몰 농도, pH 및 전도도가 상이한 아세테이트 완충제였다. 모든 완충제를 감마-조사되거나 오토클레이빙된 0.2 μm 필터를 사용하여 감마-조사 백 내로 여과하였다. 완충제 백의 유출구 튜빙을 바이오SMB 시스템의 유입구에 용접시켰다. 상기 시스템은 각각의 그의 유입구에 감마-조사 탈기기 막 (리퀴셀 마이크로 모듈(Liquicell Micro Module), 멤브라나)이 있었다. 유사하게, 생성물 라인을 이러한 탈기기를 통해 바이오SMB 시스템의 유입구에 용접시켰다. 그 후, 모든 유입물 스트림을 50 mbar로 진공 펌프에 의해 탈기시켰다.
1. 바이러스 불활성화 및 중화
바이러스 불활성화 및 중화는 3개의 모듈로 이루어졌고, 포획 크로마토그래피와 0.2 μm 여과 사이에 위치하였다: (a) 연동 펌프 M0502가 있는 균질화 루프; (b) 개략적으로 코일형 튜빙으로 제시된 체류-시간 루프; (c) pH가 7.5로 조정될 수 있는 중화 백. 이러한 모듈들은 도 3에서의 용접점에 따라 개별적으로 사전 제작 및 감마-조사되었고, 각각의 경우에 끝부분들이 용접되어 폐쇄되었다.
pH 프로브, 이러한 경우에는 pH0501 및 pH0502가 있는 라인 부분을 오토클레이빙하였다. 그 후, pH 프로브 부분을 조립체 내로 용접시켰다. 제시된 바와 같이, 백들이 무균성 GE 레디메이트® 연결기를 통해 연결되었다. Prot-A 용출물 라인 및 여과 모듈로의 연결을 먼저 용접시켜 닫은 후, 다양한 모듈로 용접시켰다.
0.2 μm 여과
pH 시프트 후 단백질이 침전될 수 있기 때문에, 침전된 단백질을 여과해냈다.
크로마토그래피 (중간체 및 정련)
상기 0.2 μm 여과의 생성물을 4개의 순차적으로 (4-PCC) 작동되는 2.5 ml 캅토 어드히어(Capto Adhere) (2.5 ml GE) 및 그 후의 2개의 교대로 작동되는 20 ml 음이온 교환기 (폴의 하이퍼셀 스타에이엑스(Hypercel StarAX))에 의해 2회의 크로마토그래피 단계를 통해 정제하였다. 이러한 정제에서, Prot-A 여과가능물, DNA, HCP 및 응집물이 제거되었다. 음이온 교환기의 요건에 따라 물 공급에 의해 전도도가 7.5 mS/cm로 조정된 감마-조사 백 (GE 레디서킷® 1 리터)을 통해 2회의 크로마토그래피 단계가 서로 연결되었다.
칼럼들을 포함하는 전체 유동 경로를 소독하거나 감마-조사하였다. 사이클당 로드는 칼럼당 50 칼럼 부피였다. 사용된 완충제는 몰 농도, pH 및 전도도가 상이한 아세테이트 완충제였다. 모든 완충제를 감마-조사되거나 오토클레이빙된 0.2 μm 필터를 사용하여 감마-조사 백 내로 여과하였다. 완충제 백의 유출구 튜빙을 바이오SMB 시스템의 유입구에 용접시켰다. 상기 시스템은 각각의 그의 유입구에 감마-조사 탈기 막 (리퀴셀 마이크로 모듈, 멤브라나)이 있었다. 유사하게, 상기 0.2 μm 여과의 생성물 라인을 이러한 탈기기를 통해 바이오SMB 시스템의 유입구에 용접시켰다. 그 후, 모든 유입물 스트림을 50 mbar로 진공 펌프에 의해 탈기시켰다. 폐기물 스트림을 감마-조사 200 리터 사르토리우스 플렉스보이 내로 보냈다. 사르토리우스 용접기를 사용하여 재용접시킴으로써 플렉스보이를 교환하였다.
생성물 스트림을 감마-조사 생성물 백 (GE 레디서킷 1 리터) 내에 다시 수집하였다.
예비여과
정련 크로마토그래피의 생성물 백으로부터, 먼저 생성물 용액을 0.1 μm 캡슐 (사르토포어 2, 미디캡 사이즈 9, 0.2 ㎡)을 사용하여 예비여과하였다. 절차 및 구성이 "B. 하류 DSP-1 - i) 세포 정화"와 유사하였다.
바이러스 여과
예비여과로부터의 유출물 라인이 "C. 하류 DSP-II"로부터의 바이러스 여과의 유입구에 연동 펌프를 통한 용접에 의해 직접적으로 연결되었다. 다른 면에서는, "C. 하류 DSP-II"로부터의 바이러스 여과의 설정 및 조작이 "C. 하류 DSP-II - 0.2 μm 여과"와 유사하였다. 그러나, 사용된 바이러스 필터는 바이로사트(Virosart) CPV 필터 (미디캡 사이즈 9, 0.2 ㎡)였고, 이를 제조사의 설명서에 따라 헹구고 오토클레이빙하였다. 또 다시, 필터를 조립체 내로 용접시켰다. 생성물 스트림을 다시 감마-조사 생성물 백 (GE 레디서킷 1 리터) 내로 펌핑하였다.
최종 농축 및 재완충
최종 농축 및 재완충은 상기 "B. DSP-I - ii) 농축 및 재완충"과 유사하게 설정되었고, 오토클레이빙된 UV 세포가 생성물 농도의 모니터링을 위해 농축 루프 내로 통합되었다는 점에서만 상이하였다. 상기 "B. DSP-I - ii) 농축 및 재완충"과 유사하게 재완충을 수행하였고, 이러한 경우에는 50 mM 포스페이트 완충제, pH 7.5을 사용하였다. 생성물 스트림을 다시 감마-조사 생성물 백 (GE 레디서킷 1 리터) 내로 펌핑하였다.
0.2 μm 여과
감마-조사 사르토포어 2 캡슐 (미디캡 사이즈 7, 0.05 ㎡)을 가로질러 감마-조사 5 리터 GE 레디서킷 백 내로 상기에서 "B. DSP-1 i)"에서 기술된 바와 같이 최종 여과를 수행하였다. 최종 백의 충전 수준이 허용가능했을 때, 상기 백을 탈용접시키고, 새로운 백을 공정에 용접시켰다.
실시예 1에 기술된 바와 같은, 본 발명에 따른 공정의 정기적으로 수행된 실행 시간은 세균 성장이 없으면서 3일이었고, 여기서 크로마토그래피 칼럼을 40% 이소프로판올 + 0.5 M NaOH에 의해 소독하였다. 본 발명에 따른 공정에 대해 실행 시간이 3일을 초과하는 경우에, 크로마토그래피 칼럼을 감마-조사하였다.
도 1에 제시된 위치의 평균 유량 및 항체 농도가 표 1에서 요약된다.
표 1
본 출원에 이르는 연구는 유럽 지역 개발 기금(European Regional Development Fund) (
ERDF
)의 일환으로서 "Bio.
NRW
:
MoBiDiK
-
Modulare
Bioproduktion - Disposable
und
Kontinuierlich
" [Bio.
NRW
:
MoBiDiK
- 모듈형 생물생산 - 일회용 및 연속적] 보조금 협정에 따라 기금을 지원받았다.
Claims (18)
- 불균질 세포 배양물-유체 혼합물로부터의 생물제약적, 생물학적 거대분자 생성물의 연속적, 세균-감소된 생산 및/또는 가공을 위한 방법이며, 하기 단계:
(a) 생성물 스트림(26)의 형태로, 생성물을 함유하는 불균질 세포 배양물-유체 혼합물로부터 무입자 유체를 제공하는 단계,
(b) 여과물을 제공하는, 적어도 1회의 여과,
(c) 생성물을 정제하기 위한 적어도 2회의 크로마토그래피 단계,
(d) 적어도 1회의 바이러스 고갈,
(e) 단계 (b), (c) 및/또는 (d)의 생성물 스트림(26)의 적어도 1회의 한외여과 및/또는 적어도 1회의 투석여과
를 포함하며,
(c)로부터의 적어도 2회의 크로마토그래피 단계는 적어도 2개의 크로마토그래피 칼럼(4) 및/또는 막 흡착기(5)를 통한 정제를 포함하고, 방법은 폐쇄되고 모듈형인 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는
방법. - 제1항에 있어서, pH 및/또는 전도도를 조정하기 위한 하나 이상의 추가 단계 및/또는 여과 단계 및/또는 농축 단계 및/또는 완충제 교환이 (c)에서의 적어도 2회의 크로마토그래피 단계 사이에 및/또는 단계 (d)에서의 바이러스 불활성화 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 생성물과 접촉하는 단계 (a) 내지 (e)에서 사용된 모든 요소가 적합한 세균-감소 방법을 통해 세균 감소에 적용되며, 세균-감소 방법은 바람직하게는 감마 조사, 베타 조사, 오토클레이빙, 에틸렌 옥시드 (ETO) 처리, 오존 처리 (O3), 과산화수소 처리 (H2O2) 및 정치 증기(steam-in-place) (SIP) 처리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)부터 계속 사용되고 생성물과 접촉하는 모든 요소가 일회용 물품이거나 또는 일회용 물품으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 유입물 유체가 세균-감소 필터(10)를 통해 여과되고, 모든 유출물은 바람직하게는 재성장을 방지하는 세균 장벽(11)에 의해 보호되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 모듈형 공정 단계가 모듈에서 수행되며, 모듈들은 서로 연결되고, 모듈들은 바람직하게는 용접에 의해 또는 무균성 연결기(12)에 의해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 내지 (e)에서 사용된 모든 액체, 기체 및 고체가 세균 감소에 적용되며, 세균 감소는 바람직하게는 세공 크기가 바람직하게는 ≤ 0.45 μm인 필터(13)를 통한 여과에 의해 달성되고, 공정 중 멸균이 바람직하게는 공정 동안 수행되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 크로마토그래피 칼럼(4)에 도달하는 모든 유체의 탈기가 단계 (c) 전에 수행되며, 탈기는 바람직하게는 적어도 1개의 버블 트랩(14)에 의해 및/또는 진공을 통해 적어도 1개의 소수성 미세여과 막(15)에 의해 및/또는 초음파로의 처리에 의해 및/또는 헬륨으로의 스파징에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)로부터의 무입자 유체가 살균제-함유 완충제에 대한 적어도 1회의 한외여과에 적용되며, 살균제는 바람직하게는 이미다졸, 벤조산, 소르브산, 파라-히드록시벤조산 에스테르, 술파이트, 디술파이트, 아지드, 오르토-페닐페놀, 니신, 나타마이신, 헥사메틸렌테트라민, 디메틸 디카르보네이트, 니트라이트, 니트레이트, 아세트산, 아스코르브산, 이소아스코르브산, L-락트산, 프로피온산, 붕산 및 리소자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 생물제약적, 생물학적 거대분자 생성물이 단백질 또는 펩티드이거나 또는 DNA 또는 RNA를 포함하며, 단백질 또는 펩티드는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 단백질 및 단백질 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되고, DNA 또는 RNA는 DNA 및/또는 RNA 백신의 일부분인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 적어도 2개의 크로마토그래피 칼럼(4) 및/또는 막 흡착기(5)가 친화성 원리에 따라, 이온성 상호작용을 통해, 금속 킬레이트 결합을 통해, 소수성 상호작용을 통해 또는 반 데르 발스 힘을 통해 생성물에 결합하며, 친화성 원리에 따라 결합하는 경우에 적어도 2개의 크로마토그래피 칼럼(4) 및/또는 막 흡착기(5)는 바람직하게는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, IgM, IgG, 및 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, IgM 및 IgG와 상이하고 생성물에 대한 친화성을 갖는 재조합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 내지 (e)의 방법이 적어도 4시간, 바람직하게는 적어도 8시간, 바람직하게는 적어도 12시간, 바람직하게는 적어도 24시간, 보다 바람직하게는 적어도 48시간, 보다 바람직하게는 적어도 7일, 보다 바람직하게는 적어도 4주, 특히 바람직하게는 적어도 8주의 실행 시간을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 필터(13)를 포함하는 적어도 1회의 여과 단계가 단계 a) 내지 e) 사이에 및/또는 그 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제13항에 있어서, 필터(13)가 세균-감소된 조건 하에 자동으로 교체되며, 자동 필터 교체는 바람직하게는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(i) 비-여과물 측 상의 압력 센서(18)에서 역치를 초과하는 경우에, 유동 경로를 폐쇄하면서, 사용된 필터(17) 내의 생성물을 바람직하게는 기체 또는 액체에 의해 여과물 측으로 밀어 넣으며, 또는 유동 경로 내의 사용된 필터(17)의 최대 시간을 초과하는 경우에, 또는 사용된 필터(17)를 통과하는 여과물의 최대 부피를 초과하는 경우에, 유동 경로를 새로운 필터(16)로 전환하는 단계,
(ii) 새로운 필터(16)의 벤팅 밸브(20)에서 세공 크기가 바람직하게는 <= 0.25 μm인 공기 필터(19)를 통해 새로운 필터(16)를 벤팅하며, 바람직하게는 생성물을 공급 펌프(21)에 의해 새로운 필터(16) 내로, 또는 세균-감소된 방식으로 연결된 폐쇄된 백(29) 내로 운반하는 단계,
(iii) 압력 센서(18) 또는 충전-수준 센서(22) 또는 저울(23) 또는 액체 검출기(28)에 의해 비-여과물 측 상에서 새로운 필터(16)의 벤팅이 완료된 것을 검출하는 단계,
(iv) 밸브(24)에 의해 여과물 유출구를 개방하고 벤팅 밸브(20)와 공기 필터(19) 사이의 유동 경로를 폐쇄하는 단계, 및
(v) 사용된 필터(17)를 새로운 필터(16)로 교환하는 단계. - 불균질 세포 배양물-유체 혼합물로부터의 생물제약적, 생물학적 거대분자 생성물의 연속적, 세균-감소된 생산 및/또는 가공을 위한 모듈형 시스템(1)이며,
(a) 적어도 1개의 여과 모듈(2),
(b) 적어도 2개의 크로마토그래피 칼럼(4) 및/또는 막 흡착기(5)를 포함하는, 적어도 1개의 크로마토그래피 모듈(3),
(c) 적어도 1개의 한외여과 모듈(6) 및/또는 적어도 1개의 투석여과 모듈(7) 및/또는 적어도 1개의 투석 모듈(8), 및
(d) 연속적 바이러스 고갈을 위한 적어도 1개의 모듈(9)
을 포함하며,
폐쇄되고 세균-감소된 것을 특징으로 하는 모듈형 시스템(1). - 제15항에 있어서, 생성물과 접촉하는 모듈 (a) 내지 (d)에서 사용된 모든 요소가 세균-감소 방법에 의해 세균 감소에 적용되며, 세균-감소 방법은 바람직하게는 감마 조사, 베타 조사, 오토클레이빙, 에틸렌 옥시드 (ETO) 처리, 오존 처리 (O3), 과산화수소 처리 (H2O2) 및 정치 증기 (SIP) 처리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 모듈형 시스템(1).
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 생성물과 접촉하는 모듈 (a) 내지 (d)에서 사용된 모든 요소가 일회용 물품이거나 또는 일회용 물품으로서 사용되고, 모듈들이 바람직하게는 용접에 의해 또는 무균성 연결기에 의해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는 모듈형 시스템.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 유입물 유체가 세균-감소 필터(10)를 통과하고, 모든 유출물이 바람직하게는 미생물의 재성장을 방지하는 세균 장벽(11)에 의해 보호되는 것을 특징으로 하는 모듈형 시스템.
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