CN102212542A

CN102212542A - 重组马gmcsf的制备方法及相关马gmcsf核苷酸序列

Info

Publication number: CN102212542A
Application number: CN 201110090267
Authority: CN
Inventors: 王静; 范志和; 杨涛; 孙九如
Original assignee: SAILUN BIOLOGICAL TECH Co Ltd SHANGHAI
Current assignee: Shanghai Sailun biotechnology Limited by Share Ltd
Priority date: 2011-04-11
Filing date: 2011-04-11
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2031-04-11
Also published as: CN102212542B

Abstract

本发明涉及一种重组马GMCSF的制备方法，将经过密码子优化的编码马GMCSF的核苷酸序列构建入原核细胞诱导表达载体中，然后转入原核细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得重组马GMCSF，较佳地，原核细胞诱导表达载体是非分泌表达载体，在诱导表达后，裂解培养得到的原核细胞，断裂DNA和分离包涵体，包涵体中含有重组马GMCSF，将包涵体溶于变性缓冲液得到变性溶液，然后使变性溶液中的蛋白复性得到复性溶液，再进行纯化，重组马GMCSF最好带有标签，采用相关亲和层析柱层析纯化，本发明设计巧妙，从而可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马GMCSF，进而可以作为免疫马匹时的佐剂，以增强动物的免疫反应，提高抗体的滴度，适于大规模推广应用。

Description

重组马GMCSF的制备方法及相关马GMCSF核苷酸序列

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及GMCSF制备技术领域，具体是指一种重组马GMCSF的制备方法及相关GMCSF核苷酸序列。

背景技术

细胞因子(cytokine)是一类机体在免疫反应时产生的免疫调节物质。机体的免疫系统在受到抗原和各种免疫佐剂的刺激后，产生的应答性物质，这类物质统称为细胞因子。天然的细胞因子为哺乳动物产生的蛋白质，多数为分子量较小的单体(1x10⁴-2.5x10⁴)，也有天然状态为二体或三体的。免疫反应通常是由多种细胞因子参与调节的。细胞因子对抗原递呈细胞(APC)的作用有增加APC的数量和活化APC的功能两个方面。

GMCSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)是一种强烈刺激巨噬细胞和DC等抗原呈递细胞的增殖、分化、活化、成熟及趋化的细胞因子，能促进单核吞噬细胞和颗粒细胞的分化；激活APC的抗原处理和递呈功能；促使B细胞成熟和分泌抗体。GMCSF可以明显提高机体的体液免疫机能。

在被动免疫治疗和预防中，马抗体发挥了无可替代的作用。马抗蛇毒抗体是治疗蛇伤的最快速、最有效的药物；在预防狂犬病中，马抗狂犬病抗体的使用是不可或缺的。因此免疫获得高滴度抗体用以制备高效价的马抗蛇毒、抗狂犬病等抗体具有重要意义。在免疫马匹时佐剂的使用可以大幅提高抗体的滴度，马GMCSF是一种细胞因子，在免疫动物的同时添加马GMCSF可以明显提高抗体的滴度。

因此，需要提供一种重组马GMCSF的制备方法，其可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马GMCSF。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组马GMCSF的制备方法及相关马GMCSF核苷酸序列，该重组马GMCSF的制备方法设计巧妙，从而可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马GMCSF，进而可以作为免疫马匹时的佐剂，以增强动物的免疫反应，提高抗体的滴度，适于大规模推广应用。

为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种重组马GMCSF的制备方法，其特点是，将经过密码子优化的编码马GMCSF的核苷酸序列构建入原核细胞诱导表达载体中，然后转入原核细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得所述重组马GMCSF。

其中，培养转化的原核细胞所用的材料不含任何动物或人来源的物质，而且能在发酵过程中获得高细胞密度。培养转化的原核细胞进行在含一种或多种可供选择的材料，如酵母提取物，甘油和含氮盐类的培养基中实施

较佳地，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO：1所示的序列。编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

较佳地，所述培养包括预接种的预备步骤。

所述原核细胞可以是任何合适的原核细胞。较佳地，所述原核细胞是细菌细胞。

更佳地，所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。

更进一步地，所述大肠杆菌细胞是大肠杆菌BL21(DE3)细胞。

较佳地，所述诱导表达在培养液的OD₆₀₀达到1-20时启动。

更佳地，所述OD₆₀₀为5-15。

更进一步地，所述OD₆₀₀为8-12。

所述原核细胞诱导表达载体可以是分泌表达载体，也可以是非分泌表达载体。较佳地，所述原核细胞诱导表达载体是非分泌表达载体，在所述诱导表达后，裂解培养得到的原核细胞，断裂DNA和分离包涵体，所述包涵体中含有所述重组马GMCSF，将所述包涵体溶于变性缓冲液得到变性溶液，然后使所述变性溶液中的蛋白复性得到复性溶液，再进行所述纯化。

更佳地，所述非分泌表达载体是T7表达载体。

更进一步地，所述诱导表达通过乳糖、IPTG或功能相同的类似物进行。

更佳地，所述裂解采用冻融法或高压细胞破碎仪进行。还可采用本领域技术人员熟知的其他等同技术实施细胞裂解。

更佳地，所述断裂DNA采用生化或物理方法如加入重组来源的DNase或通过化学-机械作用来使DNA断裂。重组来源的DNase优选benzonase。常规通过混和器来使DNA断裂。

更佳地，所述分离包涵体通过至少两个循环的离心和洗涤，洗涤缓冲液内含1M尿素，0.5-1.0M氯化钠，pH在7.0-8.0之间。

更佳地，所述变性缓冲液是含尿素、异硫氰酸胍或盐酸胍的变性缓冲液。还可以是含其它变性剂的变性缓冲液。

更佳地，所述变性缓冲液加入所述包涵体中并采用匀浆或超声处理从而将所述包涵体溶于所述变性缓冲液。

更佳地，所述复性通过在所述变性溶液中添加氧化/还原剂并在温度10-30℃搅拌10-30小时实现。

更进一步地，所述温度为20℃，所述搅拌进行20-23小时。

更进一步地，在加入所述氧化/还原剂之前，先稀释所述变性溶液至OD₂₈₀达到0.01-2，所述氧化/还原剂是氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽，所述氧化型谷胱甘肽的浓度在0.1mM和2.5mM之间，所述还原型谷胱甘肽的浓度在0.25mM和6.25mM之间。

尤其更佳地，所述OD₂₈₀达到0.5。

较佳地，所述纯化采用亲和层析将所述重组马GMCSF以单体形式分离。

更佳地，所述重组马GMCSF带有6x His标签，所述亲和层析采用Ni-亲和层析柱层析，样品上柱体积/柱体积的比率为10∶1至300∶1。

更进一步地，所述比率为40∶1。

更进一步地，采用咪唑-NaCl缓冲液作为洗脱液，所述重组马GMCSF主要在100-250mM咪唑浓度的洗脱组分中。

重组GMSCSF纯化后可以进一步超滤浓缩然后添加保护剂和/或冷冻干燥保存。

在本发明的第二方面，提供了一种密码子优化的编码GMCSF的核苷酸序列，其特点是，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO：1所示的序列，适于上述的重组马GMCSF的制备方法。

本发明的有益效果在于：本发明的重组马GMCSF的制备方法是将经过密码子优化的编码马GMCSF的核苷酸序列构建入原核细胞诱导表达载体中，然后转入原核细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得所述重组马GMCSF，表达量可达约200mg/l；纯度高，经检测，不含可以用SDS-PAGE或HPLC检测到的细菌菌体蛋白或其它细菌残留物，通过实验表明获得的重组马GMCSF具有生物学活性，因此本发明的重组马GMCSF的制备方法设计巧妙，从而可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马GMCSF，进而可以作为免疫马匹时的佐剂，以增强动物的免疫反应，提高抗体的滴度，适于大规模推广应用。

附图说明

图1是表达马GMCSF的重组大肠杆菌在诱导前和诱导后在还原条件下SDS-PAGE结果，其中1为蛋白分子量标准，2和5为诱导前样品，3和6为诱导后样品。

图2为包涵体变复性前后和Ni-Sepharose High Performance金属离子螯合层析纯化后获得的高纯度马GMCSF蛋白SDS-PAGE结果，其中1为蛋白分子量标准；2为包涵体洗涤后加变性缓冲液BD后获得的蛋白溶液；3为变性蛋白溶液复性后的样品；4为复性样品过Ni-Sepharose High Performance金属离子螯合层析并用250mM咪唑溶液洗脱获得的纯化重组马GMCSF。

图3是将带有6x His标签的密码子优化的马GMCSF的核苷酸序列通过NdeI和XhoI酶切位点构建入pET30a(+)获得的重组质粒图谱示意图。

具体实施方式

为了达到使马GMCSF在原核细胞内高表达这个目的，通过查文献得到该完整基因的氨基酸序列(即SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列)。根据这个氨基酸序列，设计了最佳的核苷酸序列(即SEQ ID NO：1所示的序列)，将该核苷酸序列插入表达载体，然后转化原核细胞。然后使用相应的诱导物进行诱导表达。可以使用多种原核诱导表达系统。市场上可获得的原核诱导表达系统主要有下列几种：

1)pBAD表达系统(Invitrogen)，其中蛋白合成置于araBAD启动子控制下，可以用阿拉伯糖在大肠杆菌菌株中诱导。

2)T7表达系统(Invitrogen或Promega)，其蛋白合成受T7噬菌体的RNA聚合酶启动子控制，可以用乳糖或乳糖类似物(IPTG)诱导。需要使用大肠杆菌衍生物DE3(BL21(DE3)或JM109(DE3))型，即含有乳糖诱导型启动子控制下的T7噬菌体的RNA聚合酶的基因拷贝。

3)Trc表达系统(Invitrogen)，其中蛋白合成置于Trc杂合启动子控制下。这种启动子可以通过解链trp启动子和lac启动子而获得，并可以依靠乳糖或其类似物(IPTG)在不同的大肠杆菌菌株中诱导。

4)Tac表达系统(Amersham Biosciences)，其蛋白合成置于tac启动子控制下。在这个系统中，依靠如乳糖类似物(IPTG)在大肠杆菌菌株lacIq(JM105型)中诱导蛋白合成。

5)P_L表达系统，其中蛋白合成置于P_L启动子控制下，可以通过添加色氨酸诱导。在这种情况下，需要使用含色氨酸又导型启动子控制下噬菌体cI抑制剂的编码基因拷贝的大肠杆菌衍生物(G1724)。

步骤I：发酵和诱导

在优选实施方案中，含密码子优化的马GMCSF的核苷酸序列(即SEQ ID NO：1所示的序列)在5’端加上Nde I位点和6个组氨酸密码子序列，在3’端加入XhoI位点。选用pET30a质粒，用NdeI和XhoI双酶切使之线性化。将具有NdeI和XhoI酶切获得的马GMCSF DNA与NdeI和XhoI线性化的pET30a(+)质粒(Invitrogen)连接(见图3)，然后转化大肠杆菌菌株Bl21(DE3)(Invitrogen)获得，名称定为BL21(DE3)GMCSF。可理解，本发明不限于马GMCSF因子，也涉及其它动物来源的(狗、羊、兔等)的GMCSF。

本发明方法中作为接种菌的菌株BL21(DE3)GMCSF以冷冻干燥形式保存以维持其表达能力。使用时，通过适当的缓冲液，将冷冻干燥的细菌再悬浮到溶液中。为了避免污染风险，优选不含任何动物和人来源物质的培养基中实施根据本发明的发酵(培养)步骤。在优选实施方案中，使用通过在无菌条件下含酵母提取物、甘油和硫酸铵的第一溶液(A)与含磷酸盐缓冲液的第二溶液(B)混合而获得的培养基。接着该混合物添加卡那霉素。适当的抗生素浓度为20-300微克/ML卡那霉素，优选50微克/ML。

发酵步骤前可以进行预接种步骤，其中冷冻干燥的微生物悬浮于培养基中并进行连续培养和稀释步骤，旨在使培养体系中具有最佳数量的微生物细胞。优选地，在37度过夜培养该微生物，接着再稀释和培养几个小时。随后离心所选预接种体积，再次悬浮于富含卡那霉素的培养基中并在发酵容器中孵育进行发酵步骤。

在添加卡那霉素的上述培养基中，于适合该细菌的温度下，通常在大约37度，在溶解O₂百分比为20-40％，优选30％(相对于空气饱和度)条件下实施发酵。发酵期间，pH保持在中性或弱酸性值(6.4-7.0)。此外，在发酵过程，可优选使用防泡剂。发酵过程中，培养基的光密度逐渐增加。光密度是本发明利用的参数，以监测发酵进展程度。600nm的光密度读数最适合。

本发明的主要特征是表达诱导时细菌能达到的高密度。由于本发明培养基的原因，培养物在600nm的光密度可以达到1-50。优选高于10的密度以获得高表达量。特别优选12-15之间的密度开始诱导，以得到最佳结果。

使用了用含T7噬菌体启动子的表达载体修饰的细菌菌株BL21(DE3)时用适当浓度的乳糖或其衍生物(即大于0.5mM)，如IPTG诱导表达。根据需要诱导持续时间可以变化。优选诱导时间为3-4个小时；在最佳方法中，通过使用大约等于10％的溶解O₂百分比，诱导3小时。诱导前后取细胞样品进行分析，如用SDS-PAGE电泳，来确定诱导结果。当蛋白表达达到预期水平时，离心培养物，取出细胞进行下列步骤。

步骤II：包涵体提取和纯化

细菌菌株中表达的重组蛋白是以包涵体形式存在于细胞中。本发明提供了细胞裂解、核酸(DNA)的破裂和包涵体回收和洗涤的方法。

洗涤细胞并悬浮于含去垢剂的溶液，优选含0.5％-1％Triton X100(V/V)的缓冲液进行细菌细胞的悬浮。接着进行细胞的裂解，细胞裂解可以用冻/融、高压破菌仪、超声处理或其它类似已知技术实施。对于本发明所用的细菌菌株BL21(DE3)的优选方法是冻/融方法，在最优选实施方案中，该冻/融方法重复至少两个循环。裂解后，裂解混合溶液需在室温下，持续搅拌2-10分钟，优先选择搅拌5分钟。

裂解细菌细胞中包涵体的释放伴随着微生物其它成分如细胞蛋白、类脂和核酸物质的释放。这些物质可干扰重组蛋白纯化。因此，必须采用化学或物理方法来尽可能地除这些杂质。如用DNAse(天然或重组酶如Benzonase)、脱氧胆酸、或物理-机械试剂，如超声处理或依靠叶片进行高能量搅拌处理。重悬于含螯合剂和洗涤剂(例如EDTA和Triton X100)的包涵体进行反复洗涤，优选3次，离心、弃去上清，以除去包涵体中的杂质。

步骤III蛋白的变性和复性

将含GMCSF的包涵体沉淀溶于含变性剂如尿素、异硫氰酸胍、盐酸胍的溶液中。优选变性溶液为8M的尿素溶液或6M盐酸胍溶液。为了加速溶解过程，该包涵体沉淀可以匀浆或超声处理。包涵体溶解后，用变性缓冲液稀释到OD280nm大约0.5的光密度。并适当加入稀释缓冲液。

GMCSF蛋白在稀释缓冲液中复性时，须在溶液添加适当浓度的氧化/还原剂，随后在搅拌下于10-30度(优选20度)孵育10至30小时，优选20-23小时完成。氧化/还原剂的实例是：胱氨酸/半胱氨酸，胱胺/半胱胺，2-羟基乙基二硫化物/2-巯基-乙醇。氧化/还原剂的优选实例是氧化和还原型的谷胱甘肽，分别为0.1mM和2.5mM(优选0.5mM)之间和0.25mM和6.25mM(优选1.25mM)之间的浓度。

步骤IV Ni-Sepharose High Performance金属离子螯合层析纯化

由于在重组马GMCSF的构建中加入了6x His标签，使得重组马GMCSF可以与Ni离子鳌合，通过Ni-Sepharose High Performance金属离子螯合层析，只需用一步层析方法就可以将目的蛋白与其它分子分离。复性处理后的含重组马GMCSF的细菌包涵体溶液离心除去不溶性颗粒物质后可以直接过Ni-Sepharose High Performance金属离子螯合层析柱，样品过完后先后用洗涤液和含10mM咪唑的洗涤液充分洗涤Ni-Sepharose High Performance金属离子螯合层析柱，接着用含50-500mM咪唑，较优的为含100-350mM咪唑最优为含250mM咪唑的洗脱液洗脱重组马GMCSF。收集洗脱获得的蛋白峰，这个蛋白峰即为高纯度重组马GMCSF。

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特列举以下具体实施例详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：发酵

材料：

SBM液：

溶液A(1升)

酵母提取物 34g

硫酸铵 2.5g

甘油 100ml

水加至 1000ml

溶液B(10x)

KH₂PO₄ 1.7g

K₂HPO₄-3H₂O 20g

H₂O加至 100ml

溶液A和B分别高压消毒后在无菌条件下混和。

IPTG溶液：IPT5g溶于100ml蒸馏水，用0.22n.m过滤器过滤该溶液，制备成200mMIPTG(200X)，-20℃保存。防泡剂是Antifoam O-30(Sigma Cat A-8082)，使用的工程菌菌株是BL21(DE3)GMCSF。取一管冻干BL21(DE3)GMCSF工程菌菌种悬浮于30ml的SBM(含50μg/ml卡那霉素)中。在37℃摇床中培养过夜，摇床转速为180转/分。第二天，稀释于800ml的SBM(含50μg/ml卡那霉素)中，分到4个1升三角烧瓶，每瓶200ml，37℃培养6小时。混和4瓶培养物。加入发酵罐中，加入的比例为每升发酵培养液加20毫升上述细菌培养物。

在下列实验条件下实施发酵：

培养基：SBM(含50μg/ml卡那霉素)

温度：37℃

溶解氧：30％(相对于空气饱和度)

pH：6.4-7.4

防泡剂(1∶10稀释于水中)；以每750ml培养基加140μl稀释的防泡剂的比例进行添加。

诱导：

诱导起始的OD₆₀₀：16-20；诱导剂：IPTG，终浓度1mM；溶解氧：10％(相对于空气饱和度)；诱导时间：3小时30分钟。诱导结束后收集培养液，于4℃，7500g离心10分钟，弃去上清，保留沉淀的细菌体。

结果：SDS-PAGE电泳检查诱导结果，如图1所示。其中2和5的诱导前样品制备如下：取600nm下吸光度为0.1单位的未诱导培养液。取20微升这种物质添加20微升还原缓冲液并煮沸3分钟，取20微升加样到SDS-PAGE基质上。3和6为诱导后样品，诱导结束后收集的培养液，用生理盐水稀释培养液至600nm下吸光度为0.1单位浓度，取20微升添加20微升还原缓冲液并煮沸3分钟，取20微升加样到SDS-PAGE基质上。发现在诱导后样品中(3和6)，相当于分子量指示14.3kD的附近出现小一个明显的蛋白条带(箭头所示)，未诱导样品(2和5)无此条带，该条带相应于表达和存在于包涵体中的GMCSF蛋白，表达量为200毫克/升。

实施例2：包涵体的提取和纯化：

下列步骤涉及GMCSF的包涵体的制备和重折叠。通过重折叠，GMCSF蛋白被部分复性。

材料：

裂解溶液：1mM Mg₂SO₄+20mM Tris-HO pH8+1％Triton X100。

洗涤溶液：0.5％Triton X100+10mM EDTApH 8。

BD(变性缓冲液)：8M尿素，50mM Tris pH 8，NaCl 20mM溶液。

氧化型谷胱甘肽200x：100mM水溶液。

还原型谷胱甘肽200x：：250mM水溶液。

稀释缓冲液：600μM PEG 4000(2.4g/l)，50mM Tris-HCl pH 8，20mM NaCl。

防泡剂：Antifoam O-30(非硅；Sigma)。

GMCSF包涵体的制备：

以每毫升OD₆₀₀450单位的细菌体添加1ml裂解浓液的比例添加裂解溶液，混匀细菌。以-80℃冰冻/37℃融合的方式，实施3次冻/融循环，使细菌沉淀溶解。接着在RT搅拌(250rpm)孵育30分钟后以每毫升OD₆₀₀450单位细菌体加3ml洗涤溶液的比例，添加洗涤溶液，同时添加未稀释防泡剂，比例为每毫升样品添加0.4μl未稀释防泡剂。搅拌30分钟后13000g离心30分钟，废弃上清，沉淀按每毫升450OD₆₀₀细菌添加6.5ml洗涤溶液的比例添加洗涤溶液，室温下搅拌45分钟。如此获得的悬液在25℃以13000g速度离心30分钟，弃去上清，沉淀以每毫升OD₆₀₀450的细菌体添4ml洗涤溶液的比例进行重悬，接着在上述条件下离心并除去上清。此步骤重复两次，以除去可溶性细菌蛋白。

实施例3：GMCSF蛋白变性和复性：

变性缓冲液BD(含8M尿素)加至上述洗涤后沉淀中，使沉淀溶解，并进一步加BD直到OD₂₈₀为0.8。为了使尿素终浓度达到5M，添加0.6体积的稀释缓冲液，并添加200x还原型谷胱甘肽，使终浓度为1.25mM；添加200x氧化型谷胱甘肽，使终浓度为0.5mM。上述蛋白溶液在20℃温度下搅拌18-20小时。搅拌结束后，缓慢滴加稀释缓冲液使尿素的浓度降到4M，继续在室温条件下搅拌1小时。紧接着，继续滴加稀释缓冲液，使尿素浓度降到3M后在室温下搅拌1小时，然后再加稀释缓冲液，使得尿素浓度为2M，样品溶液在室温下搅拌1小时，此时蛋白复性基本完成。复性后的样品20℃，13000g离心10分钟，弃沉淀，保留上清。

结果：SDS-PAGE电泳分析折叠前和重折叠后的蛋白溶液(图2)。结果表明纯化后的重组马GMCSF(箭头所示)纯度高，不含可以用SDS-PAGE或HPLC检测到的细菌菌体蛋白或其它细菌残留物。SDS-PAGE凝胶薄层扫描显示马GMCSF主条带占95％以上，最终得率为47％。

实施例4：Ni-Sepharose High Performance金属离子螯合层析

材料：Ni-Sepharose High Performance

透析缓冲液：20mM Tris，150mM NaCl，pH7.4.

上述经复性处理后的样品可以直接用Ni-Sepharose High Performance金属离子螯合层析方法来纯化。用重力方法组装Ni-Sepharose High Peformance层析柱，柱高控制在5-10cm，层析柱的直径根据上样蛋白量来决定。样品过层析柱的体积和凝胶的体积比例控制在每2-400ml上述实施例3的蛋白样品用1毫升Ni-Sepharose High Peformance凝胶的量，较佳地比例为10-300毫升蛋白样品用1毫升凝胶的量，最佳的比例为40-60毫升蛋白样品用1毫升Ni-Sepharose High Peformance凝胶。层析柱用PBS洗涤，接着用3柱体积的5M尿素，50mMTris，20mMNaCl pH8.0的缓冲液洗涤。上述步骤完成后，实施例3的蛋白样品以30cm(柱长)/小时的线速度过凝胶柱，上样完成后层析柱先后用5体积的2M尿素、50mM Tris、20mMNaCl pH8.0的洗涤液和5体积的2M尿素、50mM Tris、500mM NaCl pH8.0的洗涤液洗涤，以除去杂蛋白。紧接着用250mM咪唑、2M尿素、150mM NaCl pH8.0的洗脱液洗脱马GMCSF。收集洗脱的蛋白峰，该峰即含有高纯度的马GMCSF蛋白。得到的蛋白溶液可以对透析缓冲液透析除去尿素和咪唑。除去尿素和咪唑的马GMCSF蛋白溶液需分装后-20℃保存，以保持生物学活性。

实施例5.马GMCSF生物学活性测定

BALB/c小鼠骨髓细胞作为检测细胞。处死小鼠，立即分离股骨和胫骨，用RPMI1640细胞培养基冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，用无血清RPMI1640洗涤细胞3次，然后用含10％小牛血清的RPMI1640稀释细胞，以每孔10⁵个细胞接种于96孔板中，待测样品与标准品分别用含10％小牛血清的RPMI1640倍比稀释后加到各孔，使每孔的总体积为200微升，37℃5％CO₂培养箱培养96小时后加入5g//L噻唑蓝(MTT)染料20微升、孔，继续培养4小时后吸出培养上清，每孔加100微升DMSO，震摇10分钟后测定OD₅₇₀。用本方法测定的马GMCSF的活性为5x10⁶U/mg。

从上可以看出，本发明的提取和纯化用诱导型原核表达系统表达的重组马GMCSF的方法包括下列步骤：I)细菌细胞的发酵，II)包涵体的提取和纯化，III)表达蛋白的变性和复性，IV)亲和层析纯化，和任选V)超滤浓缩添加保护剂和/或冷冻干燥保存。根据这种方法，实施发酵(步骤I)直到获得培养基中高细菌密度，高细菌密度是由培养物的高光学密度得到体现。步骤(II)包括细菌裂解、DNA破裂和包涵体分离。通过包涵体溶解于变性缓冲液并稀释，同时添加氧化还原剂和长时间搅拌来获得表达蛋白的复性(步骤III)。在步骤(IV)中，表达的GMCSF蛋白与其它杂蛋白分离，随后超滤浓缩，添加保护剂并冷冻干燥。结果表明，采用本发明的方法可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马GMCSF。

综上，本发明的重组马GMCSF的制备方法设计巧妙，从而可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马GMCSF，进而可以作为免疫马匹时的佐剂，以增强动物的免疫反应，提高抗体的滴度，适于大规模推广应用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims

1.一种重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，将经过密码子优化的编码马GMCSF的核苷酸序列构建入原核细胞诱导表达载体中，然后转入原核细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得所述重组马GMCSF。

2.根据权利要求1所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO：1所示的序列。

3.根据权利要求1所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述培养包括预接种的预备步骤。

4.根据权利要求1所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述原核细胞是细菌细胞。

5.根据权利要求4所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。

6.根据权利要求5所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌细胞是大肠杆菌BL21(DE3)细胞。

7.根据权利要求1所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述原核细胞诱导表达载体是非分泌表达载体，在所述诱导表达后，裂解培养得到的原核细胞，断裂DNA和分离包涵体，所述包涵体中含有所述重组马GMCSF，将所述包涵体溶于变性缓冲液得到变性溶液，然后使所述变性溶液中的蛋白复性得到复性溶液，再进行所述纯化。

8.根据权利要求7所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述非分泌表达载体是T7表达载体。

9.根据权利要求8所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述诱导表达通过乳糖、IPTG或功能相同的类似物进行。

10.根据权利要求7所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述裂解采用冻融法或高压细胞破碎仪进行。

11.根据权利要求7所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述断裂DNA采用生化或物理方法使DNA断裂。

12.根据权利要求7所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述分离包涵体通过至少两个循环的离心和洗涤，洗涤缓冲液内含1M尿素，0.5-1.0M氯化钠，pH在7.0-8.0之间。

13.根据权利要求7所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述变性缓冲液是含尿素、异硫氰酸胍或盐酸胍的变性缓冲液。

14.根据权利要求7所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述变性缓冲液加入所述包涵体中并采用匀浆或超声处理从而将所述包涵体溶于所述变性缓冲液。

15.根据权利要求7所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述复性通过在所述变性溶液中添加氧化/还原剂并在温度10-30℃搅拌10-30小时实现。

16.根据权利要求15所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，在加入所述氧化/还原剂之前，先稀释所述变性溶液至OD₂₈₀达到0.01-2，所述氧化/还原剂是氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽，所述氧化型谷胱甘肽的浓度在0.1mM和2.5mM之间，所述还原型谷胱甘肽的浓度在0.25mM和6.25mM之间。

17.根据权利要求1所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述重组马GMCSF带有6x His标签，所述纯化采用亲和层析将所述重组马GMCSF以单体形式分离。

18.根据权利要求17所述的重组马GMCSF的制备方法，其特征在于，所述亲和层析采用Ni-亲和层柝柱层柝。

19.一种密码子优化的编码马GMCSF的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO：1所示的序列，适于根据权利要求1-18任一所述的重组马GMCSF的制备方法。