CN110426522B

CN110426522B - 一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法及其应用

Info

Publication number: CN110426522B
Application number: CN201910743592.9A
Authority: CN
Inventors: 陈则; 杨智; 王德慧; 罗敏; 李鑫; 卞聪华; 范铁炯
Original assignee: Shanghai Serum Bio-Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Serum Bio-Technology Co ltd
Priority date: 2019-08-13
Filing date: 2019-08-13
Publication date: 2021-01-12
Anticipated expiration: 2039-08-13
Also published as: CN110426522A

Abstract

本发明公开了一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法，包括如下步骤：（1）将圆斑蝰蛇毒素冻干粉溶解后配制成蛋白质溶液；（2）进行SDS‑PAGE电泳分析；（3）进行液质联用LC‑MS/MS质谱鉴定。此外，本发明还公开了所述的一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法在制备治疗蝰蛇毒中毒的抗蝰蛇毒血清中的应用。本发明可对蝰蛇毒进行实验室鉴定，更准确地对蝰蛇毒进行质控，一方面能够保证治疗蝰蛇毒中毒的特效抗蝰蛇毒血清安全有效、质量可控，对毒蛇种类鉴别、蛇伤诊断治疗及其他蛇毒应用等方面具有十分重要的意义。本发明方法检测灵敏度高、正确检出率较高、不存在交叉反应，操作过程简单。

Description

一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法及其应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法，特别涉及一种用蛇毒蛋白分析技术鉴定蛇毒的种类的方法；此外，本发明还涉及该鉴定方法的应用，在抗蛇毒血清的生产、毒蛇种类鉴别、蛇伤诊断治疗及其他蛇毒应用等方面具有十分重要的意义。

背景技术

毒蛇咬伤常见于亚热带和热带地区。在亚洲、非洲、拉丁美洲和大洋洲的农村地区，毒蛇咬伤是特别突出的公共卫生问题，我国的蛇伤发病呈现出逐年增多的趋势。

蛇毒液多为淡黄色或乳白色半透明黏稠状液体，成分达100多种。每种蛇毒含有多种不同的毒性成分，各种毒性组分在不同蛇毒中含量有较大差异，同种毒蛇的毒性组分可因地域分布、季节性、蛇龄等不同而异。蛇毒组分由酶、多肽、糖蛋白和金属离子等组成，其中毒性蛋白质达数十种，蛋白类占蛇毒总量的90%～95%以上。蛇毒可对机体神经系统、血液系统、肌肉组织、循环系统、泌尿系统、内分泌系统、消化系统等产生损害作用。

本研究的对象为圆斑蝰蛇蛇毒，其成分复杂，含有多种蛋白，主要包括丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、磷脂酶A2、L-氨基酸氧化酶、C-类凝集素蛋白等。蝰蛇毒的组成成分与蝰蛇毒咬伤后的临床症状有直接关系，包括促凝血、水肿、组织损伤等。

世界卫生组织(WHO)强调抗蛇毒血清是蛇伤的唯一有效的解毒药（WHO:Guidelines for the management of snakebites）。抗蛇毒血清是治疗毒蛇咬伤的高效、特效药物，一般认为在被毒蛇咬伤后应立即注射同种蛇毒抗血清以达到最佳中和治疗效果。在明确毒蛇种类后，采取相应的救治措施，迅速使用抗蛇毒血清中和体内蛇毒，防治可能发生的并发症。由于毒蛇咬伤如不及时有效救治常致人死亡，针对本文所述蝰蛇毒，应用抗蝰蛇毒血清进行治疗。

抗蝰蛇毒血清是利用脱毒的圆斑蝰蛇毒素免疫马匹，所得血浆经胃蛋白酶消化、硫酸铵沉淀、明矾沉淀、超滤等纯化步骤得到的马抗蝰蛇毒免疫球蛋白。为了生产出治疗蝰蛇毒中毒的特效药抗蝰蛇毒血清，需要对蝰蛇毒进行实验鉴定，以便更好的对蝰蛇毒进行质控。

目前研究蛇毒鉴定的技术包括凝集测试法、酶联免疫吸附法、适配子技术、聚合酶链反应等。凝集试验属于免疫学检测方法，需要将抗原与抗血清混合，使二者发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物。但是，凝集测试法存在检测灵敏度不高、正确检出率偏低和交叉反应明显的问题。有学者揭示了酶联免疫法鉴定蛇毒蛋白蛇毒时存在严重的交叉反应，对于蛇毒的鉴定却非常不利。适配子技术存在操作过程十分复杂繁琐的缺点，如《一种利用适配子技术检测鉴定蛇毒种类的方法》（中国发明专利申请CN102323400A）。聚合酶链反应是从DNA的角度去鉴定，但是相关研究报道较少。

因此，本领域亟需研发一种新的鉴定方法来克服上述传统方法的缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法，该方法结合蛋白电泳和液质联用，即LC-MS/MS的方法，从蛋白角度对蝰蛇毒进行鉴定，明确蛇毒的各种主要蛋白成分，针对性强，准确性好，较其他鉴定方法优势明显。

本发明要解决的技术问题之二在于提供该圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法在制备治疗蝰蛇毒中毒的抗蝰蛇毒血清中的应用。本发明可对蝰蛇毒进行实验室鉴定，更准确地对蝰蛇毒进行质控，进而生产出治疗蝰蛇毒中毒的特效药抗蝰蛇毒血清，对保证抗蝰蛇毒血清产品安全有效、质量可控，具有十分重要的意义。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法，包括如下步骤：

（1）将圆斑蝰蛇毒素冻干粉溶解后配制成蛋白质溶液；

（2）进行SDS-PAGE电泳分析；

（3）进行液质联用LC-MS/MS质谱鉴定。

作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述溶解后配制成蛋白质溶液具体为：用溶液A溶解后配制成蛋白浓度30-60mg/mL的蛋白质溶液（优选为蛋白浓度40mg/mL的蛋白质溶液）；其中，溶液A的配方为：3.2-3.6 mg/mL氯化钠，4.2-4.5 mg/mL硼酸，0.41-0.46mg/mL四硼酸钠，水；溶液A的pH值为 6.0-8.0。溶液A的配方优选为：3.5mg/mL氯化钠，4.2mg/mL硼酸，0.45mg/mL四硼酸钠，水；溶液A的pH值为 6.8。

作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述进行SDS-PAGE电泳分析，蛋白胶浓度为10-17.5%，蛋白胶浓度优选为15%。所述蛋白胶为分离胶，由如下表1组分组成：水、溶液B、溶液C、溶液D、溶液E、溶液F。

作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述进行SDS-PAGE电泳分析，蛋白胶浓度为4.5%，所述蛋白胶为浓缩胶，浓度为由如下表1组分组成：水、溶液B、溶液G、溶液D、溶液E、溶液F。

表1 SDS-PAGE蛋白分离胶和浓缩胶配方

表1中溶液的配制方法：

溶液B的配方：280-300mg/mL Acrylamide（丙烯酰胺），9-11mg/mL Bis-acrylamid（甲叉双丙烯酰胺），水。

溶液C的配方：181-182 mg/mL Tris（三羟甲基氨基甲烷），水；溶液C的pH值为7.5-9.5。

溶液D的配方：90-110mg/mL SDS（十二烷基硫酸钠），水。

溶液E的配方：90-110 mg/mL APS（过硫酸铵），水。

溶液F的配方：80-100%（质量百分百）TEMED（四甲基乙二胺）溶液。

溶液G的配方： 110-130 mg/mL Tris（三羟甲基氨基甲烷），水；溶液G的pH值为6.0-8.0。

作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述进行SDS-PAGE电泳分析后，进行考马斯亮蓝染色，切取相应的蛋白质条带，加少量溶液H覆盖住蛋白条带，所述溶液H的配方为： 94 mg/mL甘氨酸，15.1 mg/mL Tris（三羟甲基氨基甲烷），5 mg/mL SDS（十二烷基硫酸钠），水。

作为本发明优选的技术方案，步骤（3）中，所述进行液质联用LC-MS/MS质谱鉴定，检测到的蝰蛇蛇毒蛋白主要有磷脂酶A2PLA2 、金属蛋白酶SVMP、丝氨酸蛋白酶SVSP、C-类凝集素蛋白CLPS、L-氨基酸氧化酶LAAO、K-丝氨酸蛋白酶抑制剂KSPI、5'-核苷酸酶5' NUC。

此外，本发明还提供所述的一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法在制备治疗蝰蛇毒中毒的抗蝰蛇毒血清中的应用。

LC-MS/MS结合了液相色谱仪有效分离热不稳性及高沸点化合物的分离能力与质谱仪很强的组分鉴定能力，是一种分离分析复杂有机混合物的有效手段。串联质谱由两个质谱串联而成，其中第一个质量分析器将离子预分离或加能量修饰，由第二级质量分析器分析结果。分子离子经由第二级质谱通过与反应器的碰撞产生断裂，因此能提供更多的结构信息，所以二级质谱特别适合于复杂组分体系且干扰严重的样品中低含量组分分析测定。

液质联用鉴定蛋白质的方法虽然起步较晚，但是一次可以鉴定多个蛋白质，可以用蛋白质电泳分离和质谱技术相结合，对蛇毒做出鉴定。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明明确鉴定蝰蛇蛇毒，为蝰蛇蛇毒免疫马，并经生产得到的抗蝰蛇血清，提供重要的质量保证。本发明可对蝰蛇毒进行实验室鉴定，更准确地对蝰蛇毒进行质控，进而生产出治疗蝰蛇毒中毒的特效药抗蝰蛇毒血清，对保证抗蝰蛇毒血清产品安全有效、质量可控，具有十分重要的意义。本发明结合蛋白电泳和液质联用，即LC-MS/MS的方法，从蛋白角度对蝰蛇毒进行鉴定，明确蛇毒的各种主要蛋白成分，针对性强，准确性好，较其他鉴定方法优势明显。通过检测生物样品中的蛇毒蛋白质鉴定蛇毒种类，这是非常可靠的一种方法。

本发明相比于传统的凝集测试法、酶联免疫法等，创新点在于：

（1）首次系统地从蛋白角度鉴定了圆斑蝰蛇蛇毒的组成成分。

（2）SDS-PAGE电泳实验中，蛇毒蛋白浓度和蛋白胶浓度十分关键，决定能否有效分离蛋白质，以对蛋白进行鉴定。本发明确定了可分离蛋白的最佳上样浓度和胶浓度条件：蛇毒蛋白上样浓度可为30-60mg/mL，40mg/ml最佳；SDS-PAGE电泳蛋白胶胶浓度可为10-17.5%，15%蛋白胶浓度最佳，可分辨出13条蛋白条带。

（3）首次将基于液相色谱质谱联用技术的蛋白质组学研究方法运用于产地为中国的蝰蛇蛇毒的鉴定研究，为抗蝰蛇血清生产的原料蝰蛇蛇毒的鉴定和质控提供了新方法和新思路。

（4）解决了传统的凝集测试法存在检测灵敏度不高、正确检出率偏低和交叉反应明显的问题，克服了适配子技术存在操作过程十分复杂繁琐的缺点。本发明方法检测灵敏度高、正确检出率较高、不存在交叉反应，操作过程简单。

附图说明

图1为本发明实施例1中SDS-PAGE电泳图，其中，1-13代表13条蛋白条带。

图2为本发明实施例2中从供应商（义乌市春风蛇业有限公司）新购入的蝰蛇蛇毒的SDS-PAGE电泳图，其中，1-13代表13条蛋白条带。

具体实施方式

本发明通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。

实施例1 一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法

步骤如下：

（1）选择一个批次的圆斑蝰蛇毒素，用溶液A溶解后配制成40mg/mL；

（2）进行SDS-PAGE电泳，蛋白分离胶浓度15%，配方如下表2：

表2 SDS-PAGE蛋白分离胶和浓缩胶配方

（3）进行考马斯亮蓝染色；SDS-PAGE电泳图见图1，可分辨出13条蛋白条带（见图1中1-13）；

（4）切取相应的蛋白质条带，加少量溶液H覆盖住蛋白条带；

（5）进行LC-MS/MS质谱鉴定：样品在液相质谱中和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图，通过搜索软件，在蛋白质数据库比对所鉴别的蛋白序列，以鉴定蛋白种类；

（6）本发明方法检测到的蝰蛇蛇毒蛋白主要有PLA2 、SVMP、SVSP、CLPS、LAAO、KSPI、5' NUC等，英文简写对应中文名如下表3。本实施例验证了本发明方法检测灵敏度高（蛋白电泳胶中10ng蛋白即可通过质谱检出）、正确检出率较高（正确检出率达100%）、不存在交叉反应，操作过程简单。

表3 英文简写和中文名对照表

以上述及溶液的配制方法：

溶液A配方：3.5g 氯化钠，4.2g硼酸，四硼酸钠0.45g ，加水定容至1L，pH 6.8。

溶液B的配方：290g Acrylamide（丙烯酰胺），10g Bis-acrylamide（甲叉双丙烯酰胺），加水定容至1L。

溶液C的配方：181.7g Tris（三羟甲基氨基甲烷），HCl（盐酸）调pH至8.2，加水定容至1L。

溶液D的配方：100g SDS（十二烷基硫酸钠），加水定容至1L。

溶液E的配方：100g APS（过硫酸铵），加水定容至1L。

溶液F的配方：TEMED（四甲基乙二胺）溶液。

溶液G的配方：121g Tris（三羟甲基氨基甲烷），HCl（盐酸）调pH至6.0-8.0，加水定容至1L。

溶液H的配方：94g甘氨酸，15.1g Tris（三羟甲基氨基甲烷），5g SDS（十二烷基硫酸钠），加水定容至1L。

实施例2 一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法在制备治疗蝰蛇毒中毒的抗蝰蛇毒血清中的应用

步骤如下：

（1）从义乌市春风蛇业有限公司购入的蝰蛇蛇毒，溶液A溶解后，进行SDS-PAGE电泳；

（2）将SDS-PAGE电泳结果（见图2）与已有的电泳图谱（图1）比对，确认蛋白为13个主要条带，即为对应蝰蛇蛇毒蛋白；

（3）将已经鉴定的蝰蛇蛇毒甲醛脱毒后，免疫马匹；

（4）免疫蝰蛇蛇毒的马匹，经单采血浆机采血后，转移至生产部进行抗蝰蛇蛇毒血清的生产，得到抗蝰蛇蛇毒血清原液和产品；

以上抗蝰蛇毒血清的生产流程，从源头上进行蛇毒种类的鉴别，控制蝰蛇蛇毒的质量和种属，为生产合格的抗蝰蛇毒血清提供有力的保证。

Claims

1.一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将圆斑蝰蛇毒素冻干粉溶解后配制成蛋白质溶液；步骤（1）中，所述溶解后配制成蛋白质溶液具体为：用溶液A溶解后配制成蛋白浓度30-60mg/mL的蛋白质溶液；其中，溶液A的配方为：3.2-3.6 mg/mL氯化钠，4.2-4.5 mg/mL硼酸，0.41-0.46 mg/mL四硼酸钠，水；溶液A的pH值为 6.8；

（2）进行SDS-PAGE电泳分析；所述进行SDS-PAGE电泳分析，蛋白胶浓度为15%；所述进行SDS-PAGE电泳分析后，进行考马斯亮蓝染色，分辨出13条蛋白条带，切取相应的蛋白质条带，加少量溶液H覆盖住蛋白条带，所述溶液H的配方为：94 mg/mL甘氨酸，15.1 mg/mLTris，5 mg/mL SDS，水；

（3）进行液质联用LC-MS/MS质谱鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法，其特征在于，所述溶液A的配方为：3.5mg/mL氯化钠，4.2mg/mL硼酸，0.45mg/mL四硼酸钠，水。

3.根据权利要求1所述的一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法，其特征在于，所述用溶液A溶解后配制成蛋白浓度40mg/mL的蛋白质溶液。

4.根据权利要求1所述的一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述蛋白胶为分离胶，由如下组分组成：水、溶液B、溶液C、溶液D、溶液E、溶液F；所述溶液B的配方为：280-300mg/mL Acrylamide，9-11mg/mL Bis-acrylamid，水；所述溶液C的配方为：181-182 mg/mL Tris，水；溶液C的pH值为7.5-9.5水；所述溶液D的配方为：90-110mg/mLSDS，水；所述溶液E的配方为：90-110 mg/mL APS，水；所述溶液F的配方为：80-100%TEMED溶液。

5.根据权利要求1所述的一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述进行SDS-PAGE电泳分析，蛋白胶浓度为4.5%，所述蛋白胶为浓缩胶，浓度为由如下组分组成：水、溶液B、溶液G、溶液D、溶液E、溶液F；所述溶液B的配方为：280-300 mg/mLAcrylamide，9-11 mg/mL Bis-acrylamide，水；所述溶液G的配方为：110-130 mg/mL Tris，水；溶液G的pH值为6.0-8.0；所述溶液D的配方为：90-110mg/mL SDS，水；所述溶液E的配方为：90-110mg/mL APS，水；所述溶液F的配方为：80-100%TEMED溶液。

6.根据权利要求1所述的一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法，其特征在于，步骤（3）中，所述进行液质联用LC-MS/MS质谱鉴定，检测到的蝰蛇蛇毒蛋白主要有磷脂酶A₂PLA₂ 、金属蛋白酶SVMP、丝氨酸蛋白酶SVSP、C-类凝集素蛋白CLPS、L-氨基酸氧化酶LAAO、K-丝氨酸蛋白酶抑制剂KSPI、5'-核苷酸酶5' NUC。

7.如权利要求1-6任一项所述的一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法在制备治疗蝰蛇毒中毒的抗蝰蛇毒血清中的应用。