CN1374318A - 天然离解素γ基因以及抗肿瘤活性多肽离解素γ - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活性多肽离解素γ,它包含具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列及其序列片断或同源序列,富含半胱氨酸,含有融合素特异性识别保守序列Arg－Gly－Asp(RGD),呈现特异性三维空间结构,能作为融合素的强效拮抗剂,强力抑制肿瘤新生血管生成、肿瘤转移及实体瘤的生长。本发明还涉及离解素γ的基因序列,以及含有离解素γ的生物医药制品。
Description
技术领域
本发明涉及从中国五步蛇(尖吻腹)毒液中分离、纯化得到的一种新的离解素-离解素γ，并克隆得到了其编码基因。离解素γ作为一种活性多肽，在肿瘤治疗的应用上具有广阔前景。本发明属于基因工程领域。
发明背景
目前，肿瘤患者死亡率仍居高不下。除极少部分肿瘤患者能在早期采用手术联合放疗或化疗的治疗效果尚可外，绝大部分肿瘤患者治疗效果不佳，而且放疗和化疗都严重损害患者的身体健康。
恶性肿瘤细胞通过粘附血管和淋巴管周围的胞外基质，侵蚀进入血液系统和淋巴系统，从而造成肿瘤细胞的转移。而肿瘤细胞在体内的转移是目前恶性肿瘤致死的主要原因。
大量研究表明，肿瘤细胞表面的融合素(Integrin)是肿瘤转移发生的关键所在。融合素是由非共价连接的α和β亚基组成的异二聚体，连接了周围的胞外基质蛋白与胞内细胞骨架蛋白actin等[Schoenwaelder SM等，Curr Opin Cell Biol，1999；11：274-286]。融合素不仅能与内皮细胞、成纤维细胞等基质细胞的胞外蛋白结合，导致细胞的粘附；同时，融合素，特别是αVβ3亚家族，与基质蛋白的结合能够激活并诱导肿瘤细胞表面特异性基质蛋白酶(如MMPS、ADAMs等)的表达[Iba K等，Am J Pathol1999；154：1489-1501，McDonnell S等，Clin Exp Metastasis 1999；17：341-349]，而这些特异性基质蛋白酶具有水解基质蛋白的作用，促使肿瘤细胞侵蚀进入血液系统和淋巴系统，导致肿瘤细胞的转移；融合素还能与许多可溶性生长因子、分化因子结合，参与细胞内信号传导，与Ras-、Rho-等GTPase家族直接相关，调节细胞凋亡、肿瘤新生血管生成[Kjoller L，Exp Cell Res 1999；253：166-179，Giancotti FG等，Science1999；285：1028-1032]。
离解素(Disintegrin)是一种可溶性短链多肽，富含半胱氨酸，含有融合素特异性识别保守序列Arg-Gly-Asp(RGD)，或Lys-Gly-Asp(KGD)，呈现特异性三维空间结构，能与融合素αVβ3亚家族和αVβ5亚家族高亲和力结合[Dennis MS等，Proc Natl Acad Sci1990；87：2471-2475]，具有融合素拮抗剂作用，能减少细胞表面粘附分子的表达，并调节细胞内信号传导，在肿瘤治疗的应用上具有广阔前景。
发明内容
本发明应用生物医学工程的方法，为肿瘤，特别是实体瘤的治疗提供了一种新的抗肿瘤药。
本发明人从中国五步蛇(尖吻腹)毒液中分离、纯化得到了一种新的离解素-离解素γ，并克隆得到了其编码基因。离解素γ是一种活性多肽，包含具有SEQ IDNO：1所示氨基酸序列或及其序列片断或同源序列。离解素γ分子量为7.5KD，富含半胱氨酸，含有融合素特异性识别保守序列Arg-Gly-Asp(RGD)，呈现特异性三维空间结构，具有强力抑制血小板凝集的作用。
实验结果表明，离解素γ不仅能抑制新生血管的形成，还明显抑制实验性肿瘤的转移。
本发明技术方案描述如下：
一、天然离解素γ的分离与纯化
本发明首先将五步蛇毒液用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释20倍，装入用相同缓冲液平衡过的Superdex G75 2mm直径层析柱，以5ml/min的流速，用含乙腈的0.1％(W/V)的三氟乙酸梯度洗脱，得到五步蛇(尖吻腹)蛇毒蛋白小分子量多肽组份，再将洗脱下来的蛋白组份用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)稀释10倍后，经DEAE-Sepharose阴离子交换层析柱，以1ml/min流速，用5M NaCl溶液梯度洗脱得到离解素γ。
二、离解素γ编码基因的克隆
本发明使用Trozil试剂(Gibco公司生产)与五步蛇毒腺组织混合(每克组织加1毫升Trozil)，匀浆后提取总RNA，以多聚寡核苷酸d(T)作为反义链引物(TTT，TTT，TTT，TTT，TTT，TTT，TTT)，逆转录得到五步蛇毒腺cDNA文库，根据蛇毒ADAMs前体中离解素结构域与金属蛋白酶结构域之间的高度保守核苷酸序列(SEQID NO：2)作为正义链引物，经PCR克隆得到离解素γ编码基因cDNA(SEQ IDNO：3)。
基因克隆的过程为：
将五步蛇断头处死后，迅速分离毒腺组织，经DEPC处理过的PBS冲洗一次，与Trozil试剂(Gibco公司生产)混合(每克组织加1毫升Trozil)装入玻璃匀浆器中(玻璃匀浆器预先经200℃烧烤4小时)，组织研磨均匀后移入1.5毫升Eppendof管中，加入氯仿(200微升每毫升Trozil)并剧烈振摇混匀，静止5分钟后，13,000rpm离心15分钟，取上清，加入等体积异丙醇，13,000rpm10分钟离心沉淀得到总RNA。以多聚寡核苷酸d(T)(TTT，TTT，TTT，TTT，TTT，TTT，TTT)作为反义链引物，逆转录得到五步蛇腺体组织cDNA文库。根据蛇毒ADAMs前体中离解素结构域与金属蛋白酶结构域之间的高度保守核苷酸序列(SEQ ID NO：2)作为正义链引物，经PCR克隆，80℃完全变性2分钟，95℃ 15秒，55℃ 15秒，68℃ 30秒，循环35次，最后68℃延伸5分钟，得到离解素γ编码基因cDNA(SEQ ID NO：3)，离解素γ PCR产物琼脂糖凝胶电泳见图1。在克隆的离解素γ编码基因的5’端和3’端分别引入Xho、XbaI酶切位点，经电泳后，回收相应片段，经酶切、连接亚克隆到pBluescript载体(Stratagen公司)上相应的多克隆位点上，选取重组质粒进行测序分析，并由所得到的DNA序列推测基因所编码的氨基酸，结果与分离得到的离解素γ序列一致。
三、重组离解素γ的表达以及与天然离解素γ的比较分析
本发明将离解素γ编码基因亚克隆入酵母表达载体pPICZαA后，大量表达了重组离解素γ。
将离解素γ基因片段以限制性内切酶XhoI和XbaI从pBluescript质粒中切下，并亚克隆至酵母表达载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)相应的多克隆位点(见图6)，得到离解素γ的酵母表达载体。在pPICZαA表达载体中，5’AOX1为目的蛋白起动子，α因子为分泌信号肽，能在甲醇的诱导下高效将重组蛋白以可溶形式转运至酵母培养液中，C末端的myc和6×His标签蛋白，以便于目的蛋白的分离和纯化，因此整个载体具有大量表达重组蛋白，并易于纯化的优点。重组表达质粒经Sac I酶线性化后，转化至酵母菌株GS115(购自Invitrogen公司)中，并在含有Zeocin(100ug/ml)上的平板上筛选生长。取一转化克隆在10ml条件培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、100ug/ml Zeocin)中28℃生长至OD595为12，然后离心收集酵母，并重悬于10ml甲醇培养基中(1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM PH6.0磷酸钾缓冲液、0.5％甲醇、0.00001％生物素、1.3％酵母基本氮原)，并于28℃生长2天。酵母最后于1600g离心20分钟，分离酵母菌和培养液，目的蛋白主要以可溶形式存在于培养液，取上清迅速贮存于-80℃，酵母沉淀重悬于新鲜培养基中备用。取20ul培养上清行15％ SDS-PAGE电泳，见图2。经SDS-PAGE电泳分析，重组离解素γ与蛇毒中分离得到的离解素γ分子量大小一致；培养上清分别与6×His和myc两种亲和树脂(购自QIAgen公司)在4℃结合6～8小时后，装载于层析柱中，经50mMTris.HCl缓冲液(PH7.5)洗去杂蛋白，最后用含0.1％TFA的50mMTris.HCl缓冲液(PH3.0)洗脱，得到具有生物活性的纯化离解素γ。分析克隆得到的cDNA序列，推断该DNA所编码的氨基酸序列与分离得到的离解素γ序列一致；经血小板凝集试验，重组离解素γ与分离得到的离解素γ生物活性一致。上述研究表明，重组离解素γ与天然离解素γ不仅氨基酸序列一致，而且具有完全相同的生物学活性。因此上述实验结果充分证明，通过基因工程的方法大量制备重组离解素γ替代直接从蛇毒中分离解素γ是完全可行的。
四、离解素γ对肿瘤治疗的作用
本研究通过离解素γ对黑色瘤B6F10生长的抑制实验、对鸡胚尿囊绒毛膜(CAM)新生血管以及肿瘤组织新生血管的抑制实验，对肿瘤转移抑制实验说明离解素γ不仅能明显抑制肿瘤组织新生血管形成、抑制肿瘤生长，而且强力阻断了恶性肿瘤细胞的转移。而离解素γ对体外肿瘤细胞的生长并无任何影响，说明离解素γ本身并无细胞毒性作用，其对肿瘤生长及转移的抑制是通过与肿瘤细胞表面融合素结合而实现的。
本发明离解素γ对肿瘤治疗的作用可以通过下述实验例进一步说明。
实验例1 离解素γ抑制实体瘤生长的实验研究
本实验的目的是研究离解素γ对实体瘤生长的抑制作用。
将肿瘤细胞株-黑色素瘤B6F10细胞在37℃，5％CO2，60％培养箱中培养，当细胞数量足够时，用胰酶消化成单个细胞，并计数，用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释成细胞悬浮液(1×106个/毫升)备用。选取雄性裸鼠25只(60克±5克)，每只于背部中线皮下注射制备的细胞悬液1ml。两周后，将肿瘤阳性小鼠随机分为两组，每组各10只，一组在腹腔注射1ml PBS，另一组在同一位置注射1ml离解素γ的PBS溶液(浓度为2mg/ml)，每天注射一次。每天同一时间用游标卡尺测量肿块的最长径与最短径，并按照公式：
肿瘤体积＝4/3 JI(长径/2)(短径/2)(长径+短径)/4
计算肿瘤体积大小，当注射PBS组小鼠出现死亡时终止实验。结果发现，离解素γ能强烈抑制黑色素瘤在裸鼠中的生长(见下表1及图3)。
表1 各组小鼠的平均肿瘤体积(均数±标准差)
实验例2 离解素γ抑制新生血管生成的实验研究A.离解素γ对鸡胚尿囊绒毛膜(CAM)新生血管形成的影响
| 肿瘤体积(CM3) | 第一周 | 第二周 | 第三周 | 第四周 | 第五周 | 第六周 | 第七周 |
| 离解素γ组 | 0.0097±0.0012 | 0.0223±0.0054 | 0.1434±0.0134 | 0.3915±0.0752 | 0.8172±0.0932 | 1.2745±0.3127 | 1.8772±0.8432 |
| PBS组 | 0.0097±0.0015 | 0.3542±0.0073 | 0.7832±0.0241 | 1.5638±0.1326 | 3.0758±0.5634 | 4.6384±0.8542 | 5.3248±1.0463 |
本实验目的是研究离解素γ对体外新生血管形成的影响。将20个1天龄受精鸡胚蛋随机分成两组，置入37℃，60％湿度培养箱中培养。次日用碘酒及酒精消毒受精鸡胚蛋，在超净工作台中用眼科尖嘴镊小心敲开蛋壳，用1ml一次性注射器将预先制备的重组离解素γ的PBS溶液(浓度为2mg/ml)或PBS各0.1ml分别注入壳膜下胚盘细胞周围的尿囊绒毛膜中，但不要损伤胚盘细胞，然后用干净的保鲜膜覆盖蛋壳缺口，避免蛋清直接与空气接触，置入37℃，60％湿度培养箱中继续培养4天，每4-6小时翻动一次。第五天打开保鲜膜，扩大蛋壳缺口，在显微手术镜下观察鸡胚绒毛膜上新生血管生成情况，并用近焦镜头保存图像(见图4)。结果发现经离解素γ处理的鸡胚绒毛膜上的血管明显稀疏，血管生成受抑制。
B.离解素γ抑制肿瘤组织中新生血管的生成
本实验目的是研究离解素γ对肿瘤组织内新生血管形成的影响。将肿瘤细胞培养足够数量后，用胰酶消化成单个细胞，并计数，用PBS稀释成细胞悬浮液(1×106个/毫升)备用。选取雄性裸鼠25只(60克±5克)，每只于背部中线皮下注射制备的细胞悬液1ml。两周后，将肿瘤阳性小鼠随机分为两组，每组各10只，一组在腹腔注射1ml PBS，另一组在同一位置注射1ml离解素γ的PBS溶液(浓度为2mg/ml)，每天注射一次。二周后，取各组小鼠肿瘤组织块(OCT包埋)进行冰冻切片，并置于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，冰冻切片在室温中风干后，经丙酮室温固定20min，再用含0.05％H2O2的纯甲醇室温浸泡30min；用1∶10 0.01M PBS稀释的山羊血清封闭20min后，加入1∶200稀释的CD31抗体，用SABC法DAB显色分析肿瘤组织中CD31的表达情况。结果发明离解素γ可以强烈抑制肿瘤组织中新生血管的形成(见图5)。
实验例3 离解素γ抑制肿瘤转移的实验研究
本实验的目的是研究离解素γ对肿瘤转移的抑制作用。将高转移肿瘤细胞株-黑色素瘤B6F12细胞在37℃，5％CO2，60％培养箱中培养，当细胞数量足够时，用胰酶消化成单个细胞，并计数，用PBS稀释成细胞悬浮液(1×106个/毫升)备用。选取雄性裸鼠25只(60克±5克)，每只于右前肢腋内皮下注射制备的细胞悬液1毫升。一周后，将肿瘤阳性小鼠随机分为两组，每组各10只，一组在腹腔注射1ml PBS，另一组在同一位置注射1ml离解素γ(冻干备用的离解素γ最后溶解于PBS中，浓度为2mg/ml)，每天注射一次。当注射PBS组小鼠开始出现死亡时终止实验，颈椎脱臼处死所有小鼠，并检查每只小鼠的肺、肝及皮下，若有肿块出现者为阳性。结果发现，离解素γ能强烈抑制黑色素瘤在裸鼠中的转移，见下表2。
表2 各组小鼠肿瘤转移阳性率
| 组别 | 动物数 | 肿瘤转移阳性率 | P值 |
| 离解素γ处理组 | 10 | 10％(1/10) | ＜0.001 |
| PBS处理组 | 10 | 80％(8/10) |
实验例4 离解素γ的急性毒性实验
本实验的目的是研究离解素γ的急性毒性实验，将预先制备的重组离解素γ溶解于PBS溶液中，终浓度为50mg/ml。健康Balb/C小鼠，随机分组，每组各10只，离解素γ组腹腔注射大剂量离解素γ(有效剂量的100倍，为2g/Kg)，对照组腹腔注射PBS溶液，观察1周，统计各组小鼠死亡数。结果发现离解素γ组并没出现大量小鼠死亡(结果见下表3)，说明离解素γ在有效剂量范围内是足够安全的。表3 大剂量离解素γ对小鼠死亡率的影响
附图说明
| 组别 | 动物数 | 死亡数 | 死亡百分率 |
| 离解素γ组 | 10只 | 2只 | 20％ |
| PBS组 | 10只 | 0 | 0％ |
图1是离解素γPCR产物1.5％琼脂糖电泳图片，1为PCR产物，2为DNA分子量标准；
图2是离解素γ的SDS-PAGE照片，其中M为蛋白质分子量标准，1为重组离解素γ，2为天然离解素γ。
图3为离解素γ对肿瘤生长的影响示意图。其中■代表离解素γ处理组，□代表PBS处理组。
图4为离解素γ对鸡胚尿囊绒毛膜新生血管生成抑制实验照片，其中图4A为离解素γ处理的鸡胚CAM新生血管形成情况；图4B为PBS处理的鸡胚CAM新生血管形成情况。
图5为离解素γ对肿瘤组织新生血管的抑制作用示意图，其中图5A是离解素γ处理组小鼠肿瘤组织CD31免疫组化照片；图5B为PBS处理组小鼠肿瘤组织CD31免疫组化照片。
图6为离解素γ表达载体质粒示意图。
具体实施方式
实施例1 天然离解素γ的分离与纯化
为了从中国五步蛇的毒液中分离纯化离解素γ，将1ml五步蛇毒液用50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释到20ml，装入用60ml体积的相同缓冲液[50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)]平衡过的Superdex G75装填层析柱(10mm×300mm)，以5ml/min的流速运行，样品装填后，用20ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)清洗，最后用40ml体积的含乙腈的0.1％(W/V)的三氟乙酸梯度洗脱，收集洗脱组份，得到含五步蛇(尖吻腹)蛇毒蛋白小分子量多肽。再将洗脱下来的蛋白组份真空抽干，浓缩为1～2ml左右，并用稀释为10ml，进一步经DEAE-Sepharose阴离子交换层析柱[40ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)预先平衡]纯化，以1ml/min流速运行，样品后用10ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗柱，最后用5M NaCl溶液梯度洗脱样品，得到不同洗脱组份，分别对各组份进行SDS-PAGE电泳，分子量为7.5KD条带即为离解素γ。
实施例2 离解素γ编码基因的克隆
本实验目的是从五步蛇毒腺中克隆得到离解素γ编码基因。将五步蛇断头处死后，迅速分离毒腺组织，经RNA酶灭活剂焦碳酸二乙酯(DEPC，Gibco公司生产)处理过的PBS冲洗一次，与RNA分离试剂Trozil(PBSRNATrozilGibco，Gibco公司生产)混合(每克组织加1毫升Trozil)装入玻璃匀浆器中(玻璃匀浆器预先经200℃烧烤4小时)，组织研磨均匀后移入1.5毫升Eppendof管中，加入氯仿(200微升每毫升Trozil)并剧烈振摇混匀，静止5分钟后，13,000rpm离心15分钟，取上清，加入等体积异丙醇，13,000rpm10分钟离心沉淀得到总RNA。以多聚寡核苷酸d(T)(如下)作为反义链引物，逆转录得到五步蛇腺体组织cDNA文库。根据蛇毒ADAMs前体中离解素结构域与金属蛋白酶结构域之间的高度保守核苷酸序列(SEQ ID NO：2)作为正义链引物，经PCR克隆，80℃完全变性2分钟，95℃ 15秒，55℃ 15秒，68℃ 30秒，循环35次，最后68℃延伸5分钟，得到离解素γ编码基因cDNA(SEQ ID NO：3)，离解素γ PCR产物琼脂糖凝胶电泳见图1。在克隆的离解素γ编码基因的5’端和3’端分别引入Xho、XbaI酶切位点，经电泳后，回收相应片段，经酶切、连接亚克隆到pBluescript载体(Stratagen公司)上相应的多克隆位点上，选取重组质粒进行测序分析，并由所得到的DNA序列推测基因所编码的氨基酸，结果与分离得到的离解素γ序列一致。
实施例3 重组离解素γ的制备
本实验目的是在体外大量制备重组离解素γ。
将离解素γ基因片段以限制性内切酶XhoI和XbaI从从实施例2制备的pBluescript质粒中切下，并亚克隆至酵母表达载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)相应的多克隆位点(见图6)，得到离解素γ的酵母表达载体。在pPICZαA表达载体中，5’AOX1为目的蛋白起动子，α因子为分泌信号肽，能在甲醇的诱导下高效将重组蛋白以可溶形式转运至酵母培养液中，C末端的myc和6×His标签蛋白，以便于目的蛋白的分离和纯化，因此整个载体具有大量表达重组蛋白，并易于纯化的优点。重组表达质粒经Sac I酶线性化后，转化至酵母菌株GS115(购自Invitrogen公司)中，并在含有Zeocin(100ug/ml)上的平板上筛选生长。取一转化克隆在10ml条件培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、100ug/ml Zeocin)中28℃生长至OD595为12，然后离心收集酵母，并重悬于10ml甲醇培养基中(1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM PH6.0磷酸钾缓冲液、0.5％甲醇、0.00001％生物素、1.3％酵母基本氮原)，并于28℃生长2天。酵母最后于1600g离心20分钟，分离酵母菌和培养液，目的蛋白主要以可溶形式存在于培养液，取上清迅速贮存于-80℃，酵母沉淀重悬于新鲜培养基中备用。取20ul培养上清行15％ SDS-PAGE电泳，见图2。经SDS-PAGE电泳分析，重组离解素γ与蛇毒中分离得到的离解素γ分子量大小一致；培养上清分别与6×His和myc两种亲和树脂(购自QIAgen公司)在4℃结合6～8小时后，装载于层析柱中，经50mMTris.HCl缓冲液(PH7.5)洗去杂蛋白，最后用含0.1％TFA的50mMTris.HCl缓冲液(PH3.0)洗脱，得到具有生物活性的纯化离解素γ。
序列表SEQ ID NO：1氨基酸数 73分子类型 氨基酸来源 五步蛇SEQ ID NO：l的序列描述Glu Ala Gly Lys Asp Tyr Asp Arg Asp Ser Ser Ala Asn Pro Cys Tyr Asp Ala Ala Thr Cys
5 10 15 20Lys Leu Asn Gln Gly Ala Gln Cys Thr Ala Gly Pro Cys Cys Asp Gln Gly Arg Phe Lys Gln
25 30 35 40Gln Gly Thr Ile Cys Arg Arg Ala Arg Gly Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser
45 50 55 60Ala Asp Cys Pro Arg Asn Pro Tyr His Ala
65 70SEQ ID NO：2核苷酸数 24分子类型 DNA来源 五步蛇(尖吻蝮)SEO ID NO：2的序列描述5’CCAGTTTCTGGAAATGAACTTTTG 3’SEQ ID NO：3核苷酸数 222分子类型 DNA来源 五步蛇(尖吻蝮)SEQ ID NO：3的序列描述
Claims (4)
1.一种离解素γ基因，其特征在于它具有SEQ ID NO：3所代表的cDNA序列。
2.一种活性多肽离解素γ，其特征在于它具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或其序列片断或同源序列。
3.权利要求2所述的活性多肽，其特征在于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列由SEQ ID NO：3所代表的cDNA序列推断出来。
4.一种抗肿瘤的生物医药制品，其特征在于它包含有权利要求2或3的离解素γ。
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