CH640268A5 - Process for the preparation of filamentous hybrid phages, novel hybrid phages and their use - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von filamentösen Hybridphagen, die neuen filamentösen Hybridphagen selbst und ihre Verwendung. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von neuen filamentösen Hybridphagen, die als Vektor für die Herstellung synthetischer Rekombinanten mit bestimmten gewünschten neuen Stoffwechseleigenschaften geeignet sind.

Es ist bekannt, dass die biologische Synthese gewünschter Stoffwechselprodukte durch die in der DNA enthaltene genetische Information kontrolliert wird. Weiter ist bekannt, dass man durch Züchtung von Mikroorganismen bestimmte, von diesen Mikroorganismen erzeugte Stoffwechselprodukte, wie z.B. Antibiotika. Arzneimittel, Antigene und Enzyme, in technisch vorteilhafter Weise gewinnen kann. Diese Gewinnungsverfahren können jedoch nur dort angewendet werden, wo ein Mikroorganismus, welcher das gewünschte Stoffwechselprodukt herstellt, gefunden wird. Viele wertvolle Stoffwechselprodukte lassen sich daher auf diese Weise nicht gewinnen, da man keine geeigneten Mikroorganismen kennt. Hinzu kommt, dass häufig zwar Mikroorganismen bekannt sind, welche das gewünschte Stoffwechselprodukt bilden, der Mikroorganismus selbst jedoch für die Züchtung höchst ungünstige Eigenschaften aufweist. Daher ist man bestrebt, Methoden zu entwickeln, um die genetische Information für die

Bildung bestimmter gewünschter Stoffwechselprodukte in Mikroorganismen, welche diese Information noch nicht enthalten, derart einzuführen, dass neue synthetische Rekombinanten gebildet werden, welche nun die gewünschte Stoffwechseleigenschaft aufweisen und das gesuchte Stoffwechselprodukt bilden, welches dann daraus gewonnen werden kann. Dieses Verfahren, welches als «genetic engineering» bezeichnet wird, ermöglicht es im Prinzip, jede gewünschte Stoffwechseleigenschaft in einen für die Züchtimg und die Aufarbeitung besonders geeigneten Mikroorganismus einzuführen und dadurch die Möglichkeiten der Biosynthese entscheidend zu erweitern. Das Prinzip dieser Methoden besteht darin, dass man Mikroorganismenwirtszellen mit sogenannten Vektoren, d.h. mit Phagen, Phagen-DNA oder Plasmid-DNA infiziert, in welche die genetische Information für das gewünschte Stoffwechselprodukt biochemisch eingebracht worden ist. Das Verfahren der Einbringung und der Vermehrung der neu eingebrachten genetischen Information in den Wirtszellen wird als Klonierung bezeichnet. Die durch den Vektor nebst eingebauter genetischer Information infizierte Wirtszelle kann die eingeführte neue genetische Information ablesen und1 das entsprechende Stoff-wechselprodukt bilden.

In der Praxis hat sich jedoch die Realisierung derartiger Verfahren als sehr schwierig erwiesen. Insbesondere erwies es sich als sehr schwierig, geeignete lebensfähige Vektoren zu erzielen und geeignete Vektoren von ungeeigneten Vektoren zu unterscheiden.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Hybridphagen zu schaffen, welches die oben genannten Nachteile nicht oder nur in erheblich verringertem Masse aufweist.

Gelöst wird' diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein Verfahren zur Herstellung von filamentösen Hybridphagen, die als Vektor für die Herstellung synthetischer Rekombinanten mit bestimmten gewünschten neuen Stoffwechseleigenschaften geeignet sind, welches dadurch gekeimzeichnet ist, dass man die DNA filamentöser Phagen [D. A. Marvin et al., Bacteriol. Rev. 33 (1969) 172-209] mit einem Enzym statistisch spaltet, die gespaltene DNA mit einer ersten zusätzlichen DNA, welche die genetische Information für die gewünschte neue Stoffwechseleigenschaft enthält, in vitro enzymatisch verknüpft, mit der verknüpften DNA Wirtszellen infiziert und die von den Wirtszellen gebildeten Hy-bridphagen gewinnt. Das Verfahren kann unter Einbau einer zweiten zusätzlichen, von der ersten verschiedenen DNA wiederholt werden. Als Enzym für die Spaltung eignen sich besonders Restriktionsendonucleasen.

Die Erfindung baut auf der Erkenntnis auf, dass filamentose Phagen unter bestimmten Bedingungen besonders dazu geeignet sind, in Vektoren umgewandelt zu werden, wenn man ihre DNA in geeigneter Weise spaltet, eine zusätzliche DNA damit verknüpft, welche eine genetische Information trägt, die zu einem leicht nachweisbaren Stoffwechselprodukt führt und dann damit Wirtszellen infiziert. Voraussetzung für den erfolgreichen Einbau einer genetischen Information, welche zum Auftreten der neuen leicht nachweisbaren Stoffwechseleigenschaft führt, ist nun eine Spaltung der Phagen DNA an einer für die Lebensfähigkeit des Phagens nicht essentiellen Stelle. Da die Spaltung statistisch erfolgt und damit sowohl an essentiellen wie an nichtessentiellen Stellen auftritt, erfolgt beim Verfahren der Erfindung eine natürliche Selektion solcher DNA, die an einer nicht für die Lebensfähigkeit essentiellen Stelle gespalten wurde, da die leicht nachweisbare neue Stoffwechseleigenschaft nur bei solchen Wirtszellen auftritt, die mit einem replikationsfähigen Vektor infiziert wurden, d.h. bei dem die zusätzliche DNA in eine nichtessentielle Spaltstelle der DNA eingebaut wurde.

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Es sind bisher im wesentlichen zwei Vektor-Systeme bekanntgeworden, mit denen prokaryotische und eukaryotische DNA's in E. coli kloniert werden können, und zwar Plasmide der Col E 1-Familie oder pSC 101 und das Bakteriophagen--X-genom [vgl. M. So, R. Gill und S. Falkow (1975) Mol. Gen. Genet. 142, 239-249],

Nach D. A. Marvin et al. [Bacteriol. Rev. 33, 172-239 (1969)] wird bei filamentösen Phagen die einzelsträngige Phagen-DNA nach Infektion der Wirtszelle durch den Phagen in eine doppelsträngige vertwistete Form (RFI) umgewandelt und bis zu 300 Kopien/pro Zelle vermehrt. Die Phagen produzierenden Zellen werden durch die Infektion nicht abgetötet und können sich weiterhin vermehren. Das Wachstum einer durch, einen filamentösen Phagen infizierten Bakterienzelle wird geringfügig verzögert, diese Verzögerung führt zur Bildung von «trüben plaques», womit infizierte Bakterien schnell und ohne Selektionsdruck erkannt werden können.

Obwohl einige Verfahren zur Klonierung von DNA [vgl. M. So, R. Gill und S. Falkow (1975) Mol. Gen. Genet. 142, 239-249] bekannt sind, ist es bisher nicht gelungen, DNA auch in filamentösen Phagen zu klonieren. Dass eine DNA-Klonierung in filamentösen Phagen mit den Mitteln des augenblicklichen Standes der Technik nicht möglich ist, geht aus dem nachstehend beschriebenen Versuch hervor. Wenn man z.B. eine doppelsträngige ringförmige DNA des filamentösen Phagen M13 wie bei den Plasmiden mit dem Restriktionsenzym Hind II einmal schneidet, die einzige Hind II-Erkennungsstelle als Rezeptor für ein DNA-Fragment, das die Information für die Inaktivierung des Antibiotikums Kanamycin enthält, verwendet und Escherichia coli nach bekannten Verfahren [vgl. M. So, R. Gill und S. Falkow (1975) Mol. Gen. Genet. 142, 239-249] mit diesem in-vitro-Produkt transformiert, so isoliert man zwar Kanamycin-resistente Phagen, die jedoch instabil sind und nur in Gegenwart eines Helfer-Phagen vermehrt werden können. Sie gehen deshalb nach kurzer Zeit verloren.

Es war deshalb nicht zu erwarten, dass filamentose Phagen als Vektoren zur Klonierung von DNA verwendet werden können. Durch Anwendung des neuen Verfahrens der Erfindung wird eine Stelle im Phagen-genom gefunden, die für die in-vitro-Rekombination oder Klonierung von DNA geeignet ist und zu stabilen Hybridphagen führt. Diese Hybridphagen bewirken die Expression von zusätzlichen Genen bzw. Synthese von zusätzlichen Stoffwechselprodukten, welche der Ausgangsphage nicht zu bilden vermag.

Beim erfindungsgemässen Verfahren erfolgt die enzyma-tische Spaltung vorzugsweise mit dem Restriktionsenzym Bsu I. Zur Klonierung (enzymatische Verknüpfung) verwendet man vorzugsweise T4-DNA-ligase.

Als erste zusätzliche DNA kann prinzipiell jedes DNA-Fragment verwendet werden, welches die vollständige Information für die Ausbildung der gewünschten neuen Stoffwechseleigenschaft trägt. Vorzugsweise verwendet man ein solches DNA-Fragment, dessen genetische Information zur Ausbildung einer leicht nachweisbaren, beispielsweise durch eine Farbreaktion nachweisbaren, Stoffwechselprodukts führt. Dies hat zur Folge, dass bei Verwendung der mit diesem DNA-Fragment klonierten filamentösen Phagen DNA als Vektor die mit lebensfähigem Hybridphagen DNA infizierten Wirtszellen durch das Vorhandensein des neuen Stoffwechselprodukts leicht erkannt werden können, beispielsweise also durch Ausbildung einer Färbung.

Gemäss einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird als zusätzliche DNA das Lac Hind II-Fragment verwendet, welches die Information für die Synthese des a-Fragments der ß-Galactosidase enthält. Verwendet man eine Wirtszelle, der dieses a-Fragment fehlt, so wird bei Infektion mit einem solchen erfindungsgemäss hergestellten Hybridphagen DNA ß-Galactosidase gebildet, die sich durch eine bekannte Farbreaktion leicht nachweisen lässt.

Verwendet man im Rahmen dieser speziellen Ausführungsform der Erfindung als Wirtszelle den Stamm E. coli 17-18 (ATCC 31274) welchem eben dieses a-Fragment der ß-Galactosidase fehlt, so lassen sich die mit lebensfähigen Hybridphagen infizierten Wirtszellen leicht anhand der Farbreaktion nachweisen, isolieren und mit Hilfe dieser Wirtszellen wiederum können die neuen Hybridphagen gewonnen werden.

Verwendet man in der oben beschriebenen bevorzugten Weise das Lac Hind II-Fragment zum Klonieren von filamentöser Phagen-DNA unter Verwendung von Bsu I als Restriktionsenzym und T4-DNA-ligase zur Klonierung, so wird durch geeignete Wirtszellen, wie die weiter unten beschriebene, der neue Hybridphage M13 mpl (ATCC 31274-B) gebildet.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch den neuen Hybridphagen M13 mpl (ATCC 31274-B), der in der beigefügten Zeichnung mit seinen physikalischen und genetischen Merkmalen charakterisiert wird. Bei den Enzymen Bsu I und Hind II handelt es sich um Restriktions-endonucleasen, die eingehend beschrieben werden in Bron, S., Murray, K. & Trautner, T.A. (1975) Mol. Gen. Genet. 143, 13-23; und Phillipsen, P., Streeck, R. E. & Zachau, H. G. (1974) Eur. J. Biochem. 45, 479-488.

Die physikalische Ordnung der Bsu I Fragmente wird ausserhalb des Kreises angegeben. Auf die einzelnen Fragmente wird durch grosse Buchstaben hingewiesen und die Hind II-Spaltstelle wird als Nullpunkt der Karte gewählt. Innerhalb des Kreises wird die Genordnung durch römische Zahlen angegeben. «X» stellt das «X-Protein» in dem Gen II und I.R. die intergenetische Region mit der Startstelle für die Replikation dar. Die Positionen der fünf G und der drei A Promotoren werden durch lange Striche wiedergegeben. Eine Karteneinheit entspricht der Länge von 6400 Basenpaaren. Die Karteneinheiten werden wiedergegeben als Abstand von der Hind II-Spaltstelle per Länge des M13 Wildtyp RF. Die Richtung der Transkription verläuft auf der genetischen Karte entgegen dem Uhrzeigersinn [vgl. L. Edens et al. (1976) Eur. J. Biochem. 70, 577-587]. Das eingesetzte Lac-Fragment wird auf einem Aussenkreissegment mit derselben Skaleneinteilung wie der Innenkreis dargestellt. Seine Orientierung wurde durch das Spaltmuster vom M13 mpl und M13 Wildtyp RF mit Bsu I bzw. Hpa II geklärt:

I' Teil des lac-Repressorgens p lac-promotor o lac Operator

Z' (a) a-Region des ß-Galactosidase.

Der neue Hybridphage M13 mpl wurde am 17. März 1977 bei der American Type Culture Collection in 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md/USA unter der ATCC-Nr. 31274-B hinterlegt. Der Escherichia-Stamm 71-18 wurde ebenfalls am 17. März 1977 unter der ATCC-Nr. 31274 dort hinterlegt.

Wie erwähnt, macht es das Verfahren der Erfindung möglich, auf der DNA des filamentösen Phagen (Phagen-genom) eine Spaltstelle zu finden, die nicht eine für die Lebensfähigkeit (Replikationsfähigkeit) des Phagen essentielle Basenfolge unterbricht. Durch die erfindungsgemässe Verwendung des Restriktionsenzyms Bsu I ist es gelungen, die RF-DNA des filamentösen Phagen M13 statistisch zu spalten und dabei unter vielen im obigen Sinne essentiellen Spaltstellen auch eine nicht essentielle Spaltstelle (G. 0,08, vgl. die Genkarte auf der Zeichnung) zu finden. Die Spaltungsreaktion wird in an sich bekannter Weise gestoppt, z.B.

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durch Zugabe eines Denaturierungsmittels, wie Harnstoff oder Natriumdodecylsulfat (SDS), vorzugsweise mit 1 % SDS. Die Reaktionsprodukte werden gereinigt, z.B. durch Gel-elektrophorese, vorzugsweise mit Agarosegelen. Die verwendete Menge an Restriktionsenzym kann dabei so dosiert werden, dass auf den Agarosegelen z.B. hauptsächlich das linearisierte vollständige RF-Molekül, d.h. das nur einmal gespaltene DNA-Molekül, wiedergefunden wird. Diese Klasse von Molekülen wird zweckmässig zur Gewinnung mit dem Gel herausgeschnitten und dadurch von kleineren Fragmenten oder Partialverdauungsprodukten abgetrennt. Zur Abtrennung von der Agarose wird z.B. die DNA einer Gleichgewichtszentrifugation, z.B. in Kaliumjodid (Dichte 1,4 bis 1,6 g/ml), unterworfen, das Salz herausdialysiert und die DNA mit Alkohol gefällt. Die auf diese Weise erhaltene lineare DNA-Sequenz des Phagen stellt das Ausgangsmaterial für den Einbau der Fremd-DNA mit der regulatorischen Region dar.

Die Verknüpfung der einmal in der oben beschriebenen Weise mit Bsu I linearisierten (gespaltenen) RF DNA mit dem nach dem Verfahren von A. Landy et al [(1974) Molec. gen. Genet. 133, 273-281] aus X-plac DNA durch Verdauung mit Hind II Endonuclease gewonnenen Lac Hind II Fragment erreicht man mit T4 DNA-ligase. Die Reaktion wird z.B. in einem Ligasepuffer (40 bis 60 mM NaCl, 8 bis 12 mM MgCl2, 10 mM DTT oder ß-Mercaptoäthanol, 0,3 bis 2 mM ATP, 20 bis 80 mM Tris-HCl, pH 7,2 bis 7,8) bei 4 bis 15°C über eine Zeit von 7 bis 48 Stunden durchgeführt.

Durch Heteroduplex-kartierung und durch Restriktionsenzymanalyse kann gezeigt werden, dass die in-vitro-Einfüh-rung der Fremd-DNA an einer Stelle des Phagen-genoms erfolgt, die weder die Sequenz eines Struktur-gens unterbricht, noch Startstellen der Transkription für die Phagen-spezifischen Proteine beeinträchtigt.

Der erfindungsgemäss erhaltene Phage M13 mpl weist nun gegenüber den bereits bekannten filamentösen Phagen folgende Vorteile auf:

Dem Bakterienchromosom des E. coli Stammes 71-18 (ATCC 31274) z.B. fehlt die Information für den Lactose-stoffwechsel. Statt dessen befindet sich auf einem Episom — also einem besonderen genetischen Element in der Zelle —, welches für die Infektion von filamentösen Phagen notwendig ist, das Lactose-operon mit folgenden Modifikationen: Das erste Strukturgen des Lactose-operons, das die Information für die ß-Galactosidase trägt, besitzt eine Deletion. Die Bakterienzelle produziert zwar ein stabiles Rumpfprotein, dem jedoch die Aminosäuren 11-41 fehlen, so dass es keine Enzymaktivität mehr besitzt. Ferner führt eine Mutation zur Überproduktion von lac-Repressor, der die Expression der Strukturgene reprimiert.

Wird E. coli 71-18 mit einem normalen filamentösen Phagen infiziert, so bleibt die Produktion der Rumpf-ß-ga-lactosidase nach Derepression durch Zusatz von IPTG (Iso-propylthiogalactosid), welches ein allosterischer Effektor des lac-Repressors ist, erhalten, aber ß-Galactosidaseaktivität wird nach wie vor nicht nachgewiesen. Erfolgt jedoch Infektion mit M13 mpl so wird von der in vitro eingebauten DNA nach Derepression mit IPTG die Synthese eines Proteinfragments der ß-Galactosidase induziert (gesteuert), das die oben beschriebene Rumpf-ß-galactosidase intrazistronisch komplementieren kann. Enzymaktivität der ß-Galactosidase wird durch Hydrolyse von Xgal (5-Brom-4-chlor-indolyl-ß--D-galactosid), einer farblosen Verbindimg zu 5-Brom-4--chlor-indigo, einen tiefblauen Farbstoff, angezeigt. Während nach Infektion von E. coli 71-18 mit filamentösen Phagen Kolonien nach dem Aussäen auf Indikatorplatten (mit Zusatz von Xgal und IPTG) farblos bleiben, färben sich M13

mpl infizierte Kolonien tiefblau. Ohne den Zusatz von IPTG bleiben M13 mpl infizierte Kolonien ebenfalls farblos, d.h. Transkription der eingebauten DNA vom lac-Promotor wird spezifisch abgeschaltet.

Diese Ergebnisse zeigen, dass filamentose Phagen durch das beschriebene Verfahren in vitro zusätzliche DNA aufnehmen können und dass von der eingebauten DNA unter der Kontrolle der regulatorischen Region des Lactose-operons ein Peptid produziert wird, das die Wirtszellen nicht besitzen.

Diese Eigenschaften des erfindungsgemäss erhaltenen Hybridphagen M13 mpl lassen sich in besonders vorteilhafter Weise dadurch ausnützen, dass man das Phagengenom, also seine DNA einem weiteren Zyklus des erfindungsgemässen Verfahrens unterwirft und dabei ein zweites DNA-Fragment einbaut, welches von dem beim ersten Verfahrenszyklus unter Bildung dieses Phagen eingebauten Lac-Hind II-frag-ments verschieden ist. Die Spaltung mit einem geeigneten Enzym, z.B. einem anderen Restriktionsenzym, erfolgt dann wiederum so, dass keine essentielle Basensequenz unterbrochen wird. Das zweite DNA-Fragment, welches beispielsweise die Information für die Bildung eines gewünschten Arzneimittels, Hormons usw. trägt, wird in analoger Weise eingebaut. Dazu gibt es zwei prinzipiell verschiedene Möglichkeiten. Man lagert die DNA additiv an, so dass neben der ersten eine zweite Stoffwechseleigenschaft zur Ausbildung kommen kann oder man baut das zweite Stück DNA innerhalb des ersten eingelagerten DNA-Stücks ein. Dabei wird in der Regel die Stoffwechseleigenschaft, die vom ersten Stück abhängt, zerstört. Dies hat im Fall des Hybridphagen mpl Vorteile, denn er ergibt nun keine Blaufärbung mehr, so dass der Einbau des zweiten Stücks leicht erkennbar ist. Bei der Infektion von Wirtszellen mit dem so erhaltenen Vektor, in dem die neue DNA kloniert wurde, erhält man Wirtszellen, die sich einerseits sehr leicht durch die oben beschriebene Farbreaktion auffinden lassen und die andererseits auch das durch das neu eingebaute zweite DNA-Fragment gesteuerte gewünschte Stoffwechselprodukt herstellen.

Die erfindungsgemäss möglich gewordene Verwendung von filamentösen Phagen für die Herstellung von Vektoren ist gegenüber den bisher vewendeten sphärischen Phagen aus mehreren Gründen von Vorteil. Z.B. kann beim sphärischen Phagen bei dem vorgegebenen Rauminhalt des Partikels nur eine bestimmte DNA-Menge eingebaut werden. Bei den filamentösen Phagen gibt es diese enge Begrenzung nicht. Sie werden vielmehr bei Einbau neuer DNA länger, so dass wahrscheinlich ein Mehrfaches des Molekulargewichts ihrer DNA in dieselbe eingefügt werden kann.

Unter Wirtzellen versteht man im Rahmen der Erfindung alle in der Publikation von D.A. Marvin et al. [Bac-teriol. Rev. 33, 172-209 (1969)] beschriebenen Stämme, wie z.B. E. Colibacterien, Pseudomonen, Salmonellen u.a.

Beispiel 1

A. Das Ausgangs-lac Hind II-Fragment wird nach der Vorschrift aus A. Landy, E. Olchowski und W. Ross (1974) Molec. gen. Genet. 133, 273-281 hergestellt.

Folgende Materialien werden hierfür und in den Ausführungsbeispielen benötigt:

DNA des lac-operons (z.B. X-plac DNA), M13 RF DNA, die Restriktionsenzyme Hind II und Bsu I, T4 DNA-ligase, der E. coli K12 Stamm 71-18 (A[Iac, pro], F' lac Iq ZAM15 pro+), Isopropylthiogalactosid (IPTG), 5-Brom-4-chlor-indo-lyl-ß-D-galactosid (Xgal), lac Repressor.

Ca. 200 (ig X-plac DNA werden mit Hind II Endonuclease verdaut und die Reaktion durch einen Hitzeschritt (10 Minuten 60°C) beendet. Dem Reaktionsgemisch werden 20 [ig lac Repressor zugesetzt, und die Lösung langsam

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durch Nitrozellulosefilter (Porengrösse 0,45 (i) filtriert. Filtergebundene DNA wird durch eine IPTG-haltige Lösung (1 mM) eluiert, phenolisiert, mit Alkohol gefällt und das Präzipitat in 50 |il TES Puffer (20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0) aufgenommen.

B. Hybridphage M13 mpl (ATCC 31274-B)

Die Ml3 RF DNA (20 (ig) wird hergestellt wie beschrieben [Marvin: Bacteriol. Rev. 33, (1969) 172-209], bei Raumtemperatur mit Bsu I behandelt und die Reaktion wird durch Zugabe von 1 % SDS gestoppt. Die Reaktionsprodukte werden durch Agarosegel elektrophoretisiert. Die Menge des Enzyms wird darauf abgestimmt, dass auf den Agarosegelen hauptsächlich das linearisierte vollständige RF-Molekül wiedergefunden wird. Diese Klasse von Molekülen wird mit dem Gel herausgeschnitten und von kleineren Fragmenten oder Partialverdauprodukten abgetrennt. Die DNA wird von der Agarose durch Gleichgewichtszentrifugation in Kaliumjodid (Dichte 1,5 g/m) getrennt, das Salz her-ausdialysiert und die DNA mit Alkohol gefällt. Nach Re-suspension in 50 [il TES Puffer werden 2 [ig mit Bsu I linearisierte RF DNA und 0,5 (ig des lac Hind II Fragments

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im Ligasepuffer (66 mM NaCl, 10 mM MgCIa, 10 mM DTT (Dithiothreitol), 0,5 mM ATP, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) auf ein Volumen von 100 [xl verdünnt und T4DNA Ligase (1 (il, 8 nM Endkonzentration) dem Gemisch zuge-5 geben. Die Ligasereaktion wird bei 12,5°C für 16 Stunden durchgeführt.

Beispiel 2

Verifizierung des Hybridphagen in der Bakterienzelle io (Identifizierung des Hybridphagen durch Expression des a-Fragments der ß-Galactosidase).

Das Reaktionsgemisch mit dem Hybridphagen M13 mpl (ATCC 31274-B) wird auf 30 mM CaCl2 gebracht und mit CaCl2 (30 mM) gewaschene exponentiell wachsende E. coli 15 71-18 (ATCC 31274)'bei Eistemperatur gemischt. Nach einer Stunde werden die Zellen für 2 Minuten bei 42°C behandelt. Die Zellen werden im Anschluss mit IPTG (1 mM), Xgal (40 (ig/ml) und 5 ml Topagar versetzt und auf Standardnährmedium plattiert. Die Agarplatte wird für 24 Stunden 20 bei 37°C bebrütet. Blaue Kolonien oder blaue trübe Plaques werden aus dem Agar steril entnommen und auf Einzelkolonien ausgesät.

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1 Blatt Zeichnungen

Claims (12)

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1. Verfahren zur Herstellung von filamentösen Hybrid-phagen, die als Vektor für die Herstellung synthetischer Re-kombinanten mit bestimmten gewünschten neuen Stoffwechseleigenschaften geeignet sind, dadurch gekennzeichnet, dass man die DNA filamentöser Phagen mit einem Enzym statistisch spaltet, die gespaltene DNA mit einer ersten zusätzlichen DNA, welche die genetische Information für die gewünschte neue Stoffwechseleigenschaft enthält, in vitro enzy-matisch verknüpft, mit der verknüpften DNA Wirtszellen infiziert und die von den Wirtszellen gebildeten Hybrid-phagen gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Restriktionsenzym Bsu I verwendet.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man zur enzymatischen Verknüpfung T4 DNA-ligase verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als erste zusätzliche DNA das Lac Hind II Fragment verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Wirtszelle E. coli 71-18 (ATCC 31274) verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man besagtes Verfahren unter Einbau einer zweiten zusätzlichen, von der ersten verschiedenen DNA wiederholt.

7. Verwendung von nach Anspruch 1 erhaltenen Hybrid-phagen zur Synthese von Stoffwechselprodukten, durch Infektion von Wirtszellen.

8. Verwendung nach Anspruch 7 zur Synthese von Arzneimitteln von Protein- oder Peptidcharakter.

9. Verwendung nach Anspruch 7 zur Synthese von Insulin und Insulinderivaten.

10. Verwendung nach Anspruch 7 zur Synthese von Antigenen oder Antikörpern.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man den Hybridphagen M13 mpl bzw. ATCC 31274-B verwendet.

12. Hybridphagen M13 mpl bzw. ATCC 31274-B erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.