NL192116C

NL192116C - Beta-urogastron-genen, overeenkomstige recombinant plasmiden, overeen- komstige transformanten en de bereiding ervan en van beta-urogastron.

Info

Publication number: NL192116C
Application number: NL8501880A
Authority: NL
Original assignee: Earth Chemical Co
Priority date: 1984-07-02
Filing date: 1985-06-28
Publication date: 1997-02-04
Also published as: GB8516591D0; SE8503228L; FR2566799A1; DK291885A; NL192116B; JPS6115691A; NL8501880A; CH670654A5; CA1304023C; IT1210142B; KR920009543B1; DK291885D0; SE8503228D0; JP2554459B2; DE3523634C2; AU4411185A; KR860001186A; FR2566799B1; DE3523634A1; GB2162851B

Description

1 192116 β-urogastron-genen, overeenkomstige recombinant-plasmiden, overeenkomstige transformanten en de bereiding ervan en van β-urogastron

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe β-urogastron-genen, overeenkomstige recombinant-5 plasmiden, overeenkomstige transformanten en de bereiding ervan en van β-urogastron.

β-urogastron is een polypeptide-hormoon, dat gesynthetiseerd wordt in de speekselklieren van mensen, enz. (zie bijvoorbeeld Heitz et al., Gut, 19,408-413 (1978)), en dat een primaire structuur met 53 aminozuren in de volgende volgorde bezit (zie H. Gregory et al., Int. J. Peptide Protein Res., 9, 107-118 (1977)).

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp 10 Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr lie Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr He Gly Glu Arg Cys Gin Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg.

In de beschrijving worden aminozuren weergegeven door de volgende symbolen.

15 Asn: asparagine Ser: serine

Asp: asparaginezuur Glu: glutaminezuur

Leu: leucine His: histidine

Gly: glycine Tyr: tyrosine

Val: valine Met: methionine 20 lie: isoleucine Ala: alanine

Lys: lysine Gin: glutamine

Arg: arginine Trp: tryptofaan

Phe: fenylalanine Cys: cysteine

Pro: proline 25 β-urogastron bezit fysiologische activiteiten zoals het onderdrukken van de afscheiding van maagzuur en het bevorderen van celgroei (zie Elder et al., Gut, 16, 887-893 (1975)) en is derhalve nuttig voor het behandelen van zweren en wonden.

Aangezien β-urogastron in kleine hoeveelheden uitgescheiden wordt in menselijke urine, werd de verbinding vroeger door extractie, scheiding en zuivering uit urine bereid. Deze methode heeft echter het 30 bezwaar, dat niet gemakkelijk grote hoeveelheden van de verbinding verkregen kunnen worden, omdat de verbinding een gering bestanddeel van menselijke urine is.

De Europese octrooiaanvrage nr. 0.046.039 beschrijft de bereiding van β-urogastron onder toepassing van een synthetisch β-urogastron-gen met een specifieke nudeotide-volgonde, doch openbaart niet of er andere genen zijn, die in staat zijn om β-urogastron tot expressie te brengen. De in deze publicatie 35 beschreven nucleotide-volgorde verschilt ter plaatse van 30 triplet-codons van de nucleotide-volgonde van het nieuwe synthetische β-urogastron-gen volgens de uitvinding.

WO-A-8.304.030 beschrijft twee nucleotide-volgorden van een synthetisch urogastron-gen, waarvan de eerste ter plaatse van 20 triplet-codons en de tweede ter plaatse van 28 triplet-codons van de nucleotide-volgorde volgens de onderhavige uitvinding verschilt.

40 Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, vol. 80, no. 24, december 1983, blz.

7461-7465 beschrijft een synthetisch urogastron-gen met een nucleotide-volgorde, die ter plaatse van 25 triplet-codons van de nucleotide-volgorde volgens de uitvinding verschilt.

Een groot aantal nucleotide-volgorden kan coderen voor de aminozuurvolgorde van β-urogastron. Niettemin is het moeilijk te voorspellen welke van dergelijke nucleotide-volgorden in staat is om β-urogastron 45 tot expressie te brengen door middel van genmanipulatie, of welk gen het meest geschikt is voor de toepassing van genmanipulatietechnieken. Dientengevolge zijn vele proeven en inventieve inspanningen vereist om de meest geschikte nucleotide-volgorde te bepalen.

Een oogmerk van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een nieuw β-urogastron-gen, dat totaal verschillend is van de in de bovengenoemde publicaties beschreven genen met betrekking tot de 50 nucleotide-volgorde en in staat is om β-urogastron tot expressie te brengen door middel van genmanipulatie.

Een ander oogmerk van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van nieuwe recombinant-plasmiden en transformanten overeenkomende met het nieuwe β-urogastron-gen.

Nog een ander oogmerk van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een werkwijze, die de productie van β-urogastron in grote hoeveelheden met een hoge zuiverheid mogelijk maakt met behulp van 55 het nieuwe gen door middel van genmanipulatie.

Deze en andere oogmerken van de onderhavige uitvinding zullen toegelicht worden in de volgende beschrijving.

192116 2

Door aanvraagster zijn vele proeven uitgevoerd en is gevonden, dat een gen I met de volgende nucleotide-volgorde het mogelijk maakt om de oogmerken van de uitvinding te bereiken:

Gen I:

5' AAT AGC GAT TCT GAG TGC CCA CTG

5 3' TT A TCG CTA AGA CTC ACG GGT GAC

TCT CAC GAT GGC TAT TGT CTG CAC

AGA GTG CTA CCG ATA ACA GAC GTG

10 GAC GGT GTT TGC ATG TAC ATC GAA

CTG CCA CAA ACG TAC ATG TAG CTT

GCT TTG GAT A A A TAC GCG TGT AAC

CGA AAC CTA TT T ATG CGC ACA TTG

15

TGT GTA GTG GGT TAT ATC GGT GAA

ACA CAT CAC CCA ATA TAG CCA CTT

CGC TGT CAA TAC CGT GAT CTG A A A

20 GCG ACA GTT ATG GCA CTA GAC TTT

TGG TGG GAA TTG CGT 3' ACC ACC CTT AAC GCA 5'

De letters geven de purine- of pyrimidine-basen aan, die de nucleotide-volgorde vormen. De hierin voor 25 de basen toegepaste symbolen zijn als volgt: A voor adenine, G voor guanine, C voor cytosine en T voor thymine.

Het gen I is volledig nieuw en ligt als zodanig niet voor de hand en wordt verkregen door bepaling van de specifieke nucleotide-volgorde uit een zeer groot aantal mogelijke nucleotide-volgorden. Aan de voor-en/of achterzijde van deze sequentie kunnen nog andere sequenties aanwezig zijn.

30 Het gen I heeft de volgende eigenschappen: 1. β-urogastron kan zeer volledig tot expressie gebracht worden door genmanipulatietechnieken.

2. De trinucleotide-codons, die het gen I vormen, zijn alle aanvaardbaar voor de gastheercellen, in het bijzonder Escherichia coli (E.coli), dat gemakkelijk met zekerheid verkrijgbaar is, waardoor een hoge mate van expressie gewaarborgd wordt.

35 3. Specifieke herkenningsplaatsen van het restrictie-enzym zijn in het gen aanwezig en kunnen aan beide uiteinden ervan gevormd worden en naar wens gemanipuleerd worden ter vergemakkelijking van de koppeling met een ander gen en de opname in de plasmidevector.

4. Voor de bereiding van het gen I kunnen de samenstellende oligonucleotiden gekoppeld worden tot blokken en kunnen de blokken gemakkelijk naar wens tot ondereenheden gekoppeld worden, die in 40 hoofdzaak vrij zijn van ongewenste koppeling.

5. Bij het tot expressie brengen van β-urogastron als een gefuseerd eiwit zijn middelen beschikbaar, waardoor een niet noodzakelijk gedeelte gemakkelijk verwijderd kan worden ter verkrijging van het gewenste β-urogastron.

Wanneer β-urogastron feitelijk met behulp van het gen I tot expressie gebracht moet worden, kunnen 45 herkenningsplaatsen van het restrictie-enzym aangebracht worden aan de voorzijde en/of de achterzijde van het gen met het oog op de koppeling met de promotor, Shine-Dalgamo-volgorde (hierna aangeduid als SD-volgorde), vector, enz. die nodig zijn voor de expressie. Voorts kan, indien noodzakelijk, een start-codon en/of een stop-codon respectievelijk aan de voorzijde en achterzijde van het gen aangebracht worden. De herkenningsplaatsen, het start-codon en het stop-codon zijn niet bijzonder beperkt, doch kunnen naar wens 50 gekozen worden.

Hierna wordt een voorbeeld van een gen met een uitgebreide volgorde (hierna aangeduid als gen II) gegeven, dat een aan de voorzijde van het gen I aangebrachte restrictie-enzym-herkenningsplaats en een start-codon en een aan de achterzijde van het gen I aangebrachte stop-codon en restrictie-enzym-herkenningsplaats bevat, waarbij de plaatsen en codons in de vermelde volgorde zijn aangebracht, en het 55 gen II voorts andere restrictie-enzym-herkenningsplaatsen bevat.

Gen II: 3 192116

Start codon -15 -1, 1_

5- Iaat t I c g a a 1g a t c tgc atgJaat agc 5 3- G cl T TC T A g| ACG T A [c TTA TCG

E Ta Bg(S) Mb 10 20 30

10 G I A T T C T GAG TGC CCA CTG TCT CAC

C T A A~|g A CTC ACG GGT GAC AGA GTG

Hf 15 40 50

GAT GGC TAT TGT CTG CAC GAC GGT

CTA CCG ATA ACA GAC GTG CTG CCA

60 70 80

20 GTT TGC ATG TAC AT |_C_G A Ia G C T T T G

CAA ACG TAC ATG TA G cl TT CGA AAC

Ta Hd 25 90 100

GAT AAA TA l C G C G TGT AAC TGT GTA

CTA TTT ATG CGC ACA TTG ACA CAT

30 (Th) 110 120

GTG GGT TAT ATC GGT GAA CGC TGT

CAC CCA ATA TAG CCA CTT GCG ACA

35 130 140 150

CAA TAC CGT I G A T C T G AAA TGG TGG

GTT ATG GCA CTA G~j A C TTT ACC ACC

40 S

Stop codon 160 _ _ 170

gIa A T T G CGT TAA TAG TGA aIg A T C T

45 C T T A Ale GCA ATT ATC ACT TCT A G Ia E Bg(S) G |_ 3' 50 C C T A G 5'

Ba 55 192116 4

De symbolen, die de restrictie-enzymen in de bovenstaande volgorde vertegenwoordigen, hebben de volgende betekenissen: E: EcoRI, Ta: Taql

Bg: Bglll, S: Sau3AI

5 Mb-.Mboll, Hf: HinFI

Ba: BamHI, Hd: Hindlll

Ml: Mlul, Th: Thai

Meer in het bijzonder ter illustratie kan de eerste ondereenheid een ondereenheid A met de voorste helft van het gen II en een restrictie-enzym (BamHI) herkenningsplaats aan de achterzijde ervan en de 10 laatstgenoemde ondereenheid een ondereenheid B met de achterste helft van het gen II met een restrictie-enzym (Hindlll) herkenningsplaats aan de voorzijde ervan zijn. Deze ondereenheden zijn hierna weergegeven.

Ondereenheid A:

5' AAT TCG AAG ATC TGC AT G AAT AGC

15 3' GC TT C TAG ACG TAC TT A TCG

GAT TCT GAG TGC CCA CTG TCT CAC

CTA AGA CTC ACG GGT GAC AGA GTG

20 GAT GGC TAT TGT CTG CAC GAC GGT

CTA CCG ATA ACA GAC GTG CTG CCA

GTT TGC ATG TAC ATC GAA GCT TCG

CAA ACG TAC ATG TAG CTT CGA AGC

25 3' CTA G 5'

Ondereenheid B:

5' AGCT TTG GAT A A A TAC GCG TGT

30 3' AAC CTA TTT ATG CGC ACA

AAC TGT GTA GTG GGT TAT ATC GGT

TTG ACA CAT CAC CCA ATA TAG CCA

35 GAA CGC TGT CAA TAC CGT GAT CTG

CTT GCG ACA GTT ATG GCA CTA GAC

A A A TGG TGG GAA TTG CGT TAA TAG

TTT ACC ACC CTT AAC GCA ATT ATC

40 TGA AGA TCT G 3' ACT TCT AGA CCT AG 5'

De ondereenheden A en B worden bijvoorbeeld op de volgende wijze bereid. Oligonucleotiden met 11, 13 of 15 basen worden bereid (A-1 tot A-16 en B-1 tot B-16, d.w.z. 32 oligonucleotiden). Vervolgens worden 45 4 tot 6 van deze oligonucleotiden samengevoegd en tot blokken gekoppeld (blok 1 tot blok 7, d.w.z. 7 blokken). Deze oligonucleotiden en blokken zijn hierna weergegeven.

Blok 1: (A-1) (A-2) (A-3) 5' AATTCGAAGAT CTGCATGAATAGC GATTCT G AGTG 3' 50 3' GCTTCTAGACGTA CTTATCGCTAA GACTCACGGGTGA 5' (A-16) (A-15) (A-14)

Blok 2: (A-4) (A-5) (A-6) 55 5' CCCACTGTCTCAC GATGGCTATTG TCTGCACGACGGT 3' 3' CAGAGTGCTAC CGATAACAGACGT GCTGCCACAAA 5' (A-13) (A-12) (A-11) 5 192116

Blok 3: (A-7) (A-8) 5' GTTTGCATGTA CATCGAAGCTTCG 3' 5 3' CGTACATGTAGCT TCGAAGCCTAG 5' (A-10) (A-9)

Blok 4: m (B-1) (B-2) 5' AGCTTTGGATA AATACGCGTGTAACT 3' 3' AACCTATTTATGC GCACATTGACACA 5' (B-16) (B-15)

Blok5: (B-3) (B-4) 5' GTGTAGTGGGT TATATCGGTGAACGC 3' 3' TCACCAATATAG CCACTTGCGACAG 5' (B-14) (B-13)

Blok 6: (B-5) (B-6) 5' TGTCAATACCG TGATCTGAAATGGTG 3' 3' TTATGGCACTAGA CTTTACCACCCTT 5' (B-12) (B-11)

Blok?: (B-7) (B-8) 5' GGAATTGCGTT AATAGTGAAGATCTG 3' 3' AACGCAATTAT CA CTTCTAGACCTAG 5' (B-10) (B-9) 30 Vervolgens worden de blokken 1 t/m 3 samengekoppeld tot de ondereenheid A en worden de blokken 4 t/m 7 samengekoppeld tot de ondereenheid B.

De onderhavige uitvinding zal nader beschreven worden aan de hand van de tekeningen en foto’s.

Figuur 1 toont schematisch de synthese van een oligonucleotide volgens de vaste fase-methode; 35 figuur 2 toont een werkwijze voor het koppelen van oligonucleotiden A-1 t/m A-16 tot een ondereenheid A en het opnemen van de ondereenheid in een plasmide pBR322 afkomstig van E.coli ter verkrijging van een recombinant-plasmide pUG1; figuur 3 toont een soortgelijke werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide pl)G2 door opnemen van een ondereenheid B in een plasmide pBP322; 40 figuur 4 toont een werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide pUG3 uit pUG1 en pUG2; figuur 5 toont het resultaat verkregen door analyseren van de nucleotidevolgorde van oligonucleotide A-3 door tweedimensionale fractionering door elektroforese en homochromatografie; figuur 6 toont een werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide pGH37; figuur 7 toont een werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide pGH35; 45 figuur 3 toont een werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide pEK28; figuur 9 toont werkwijzen voor het bereiden van recombinant-plasmiden pUG102 tot pUG122 en recombinantplasmiden pUG103-E en pUG117-E; figuur 10 toont werkwijzen voor het bereiden van recombinant-plasmiden pBRH02 en pBRH03; figuur 11 toont een Mboll restrictie-schema van pUG3 met een H-fragment (179 b.p.), dat het onderha-50 vige β-urogastron-gen bevat; figuur 12 toont een werkwijze voor het bereiden van recombinant-plasmiden pUG2301 t/m pUH2303; figuur 13 toont een werkwijze voor het bereiden van recombinant-plasmiden pUG2101 t/m pUG2105; figuur 14 toont een werkwijze voor het bereiden van recombinant-plasmiden pUG2701 t/m pUG2703; figuur 15 toont een werkwijze voor het bereiden van recombinant-plasmiden pUG1102 en pUG1105; 55 figuur 16 toont een werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide pUG1004; figuur 17 toont een werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide pUGl201; figuur 18 toont een werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide pUG1301; en 192116 6 de foto’s 1 t/m 5 tonen respectievelijk analytische resultaten van nucleotide-volgorden van recombinant-plasmiden, die bijvoorbeeld verkregen zijn volgens de Maxam-Gilbert-methode.

Oe procedures voor het opbouwen van het gen II van de onderhavige uitvinding zijn als zodanig bekend. De 5 oligonucleotiden voor het opbouwen van het gen II kunnen volgens bekende methoden bereid worden, bijvoorbeeld door de vaste fase-methode, die hierna in het kort beschreven zal worden (zie bijvoorbeeld H. Ito et al., Nucleic Acids Research, 10,1755-1769 (1982)).

Wanneer gebruik gemaakt wordt van de vaste fase-methode, wordt het oligonucleotide zoals weergegeven in figuur 1 bereid door achtereenvolgens koppelen van mononucleotiden of dinudeotiden met een op 10 polystyreenhars gedragen nucleoside ter verkrijging van een vooraf bepaalde volgorde van nucleotiden.

Het hars voor het ondersteunen van het nucleoside kan bijvoorbeeld bereid worden met behulp van een gedeeltelijk verknoopt polystyreenhars door N-(chloormethyl)-ftaalimide met het hars te laten reageren, hydrazine met het product te laten reageren ter verkrijging van aminomethylgroepen bevattend polystyreenhars en aan de aminogroep ervan een nucleoside met de 5'-hydroxylgroep in vrije vorm en de aminogroep 15 beschermd te binden onder toepassing van bamsteenzuur als afstandhouder.

Anderzijds zijn verschillende werkwijzen voor de bereiding van mononucleotiden of dinudeotiden bekend (zie bijvoorbeeld C. Broka et al., Nucleic Adds Research, 8, 5461-5471 (1980)). Bijvoorbeeld kan een mononucleotide bereid worden door laten reageren van o-chloorfenylfosfordichloridaat, triazool en een nucleoside, waarvan de 5'-hydroxylgroep beschermd is met een dimethoxytritylgroep (DMTr) in aanwezig-20 heid van triethylamine, waarna men het verkregen monotriazolide laat reageren met β-cyaanethanol in aanwezigheid van 1 -methylimidazool als katalysator en het reactieproduct elueert met chloroform-methanol door kolomchromatografie op silicagel. Deze werkwijze levert een volledig beschermd mononucleotide.

Een dinucleotide kan bereid worden door het hieiboven verkregen volledig beschermde mononucleotide te behandelen met benzeensulfonzuur of een soortgelijk zuur ter verkrijging van het mononucleotide met 25 een vrije 5'-hydroxylgroep, dat men laat reageren met het eerder verkregen monotriazolide, en het reactieproduct te elueren met chloroform-methanol door kolomchromatografie op silicagel. Deze werkwijze levert een volledig beschermd dinucleotide.

De synthese van oligonucleotiden in vaste fase wordt met voordeel uitgevoerd onder toepassing van een DNA-synthesemiddel, dat bijvoorbeeld als DNA-synthesemiddel verkrijgbaar is bij Bachem Inc., U.S.A. Het 30 hierboven verkregen nudeoside-ondersteunende hars wordt in een reactievat gebracht en met dichloormethaan-isopropanol gewassen, en een oplossing van zinkbromide in dichloormethaan-isopropanol wordt toegevoegd aan het hars om de dimethoxytritylgroep op de 5'-plaats te verwijderen. Deze procedure wordt verscheidene malen herhaald tot de kleur van de oplossing verdwijnt. Het hars wordt gewassen met dichloormethaan-isopropanol en vervolgens met een oplossing van triethylammoniumacetaat in dimethylfor-35 mamide ter verwijdering van het resterende Zn2*, en daarna gewassen met tetrahydnofuran en gedurende verscheidene minuten blootgesteld aan een stroom stikstofgas om het te drogen. Afzonderlijk wordt het volledig beschermde dinucleotide of mononucleotide opgelost in pyridine gevolgd door toevoeging van triethylamine en wordt de verkregen oplossing geschud, waarna men hem gedurende verscheidene uren bij kamertemperatuur laat staan en vervolgens onder verminderde druk indampt. Het verkregen triethyl-40 ammoniumzout wordt opgelost in pyridine en verscheidene malen met behulp van pyridine azeotropisch ingedampt om het te drogen. Het nucleotidezout wordt opgelost in een oplossing van mesityleensulfonyl-5-nitrotriazool (MSNT, condensatiemiddel) in pyridine. Men voegt de verkregen oplossing toe aan het gedroogde hars en laat bij kamertemperatuur staan. Men verwijdert het vloeibare gedeelte van het reactiemengsel en wast het harsgedeelte met pyridine en laat het vervolgens reageren met azijnzuuranhy-45 dride onder toepassing van methylaminopyridine als katalysator in tetrahydrofuran-pyridine om de niet omgezette hydroxylgroep te maskeren. Tenslotte wordt het hars met pyridine gewassen om één cyclus van de vaste fase-synthese te voltooien. Door één cyclus wordt de nucleotidevolgorde met een of twee ketenlengten verlengd. De bovenstaande procedure wordt herhaald om achtereenvolgens mononucleotiden of dinudeotiden met het hars te koppelen tot de gewenste lengte, waardoor een op het hars gedragen 50 volledig beschermd oligonucleotide verkregen kan worden.

Aan het verkregen hars wordt een oplossing van tetramethylguanidine-2-pyridinealdoximaat in pyridine-water toegevoegd en men laat het mengsel onder verwarming staan. Vervolgens wordt het hars afgefiltreerd en afwisselend met pyridine en ethanol gewassen. De wasvloeistoffen en het filtraat worden samengevoegd en onder verminderde druk geconcentreerd. Het concentraat wordt opgelost in een waterige oplossing van 55 triethylammoniumbicarbonaat (TEAB) gevolgd door wassen met ether. De waterige oplossing wordt onderworpen aan Sephadex G-50-kolomchromatografie onder toepassing van een TEAB-oplossing ais elutiemiddel. De fracties worden verzameld en de optische dichtheid van elke fractie wordt bij 260 nm 7 192116 bepaald. Een fractie met eerste elutiepiek wordt geconcentreerd. Het concentraat wordt gezuiverd, bijvoorbeeld door snelle vloeistofchromatografie, tot een enkele piek wordt verkregen. Het aldus verkregen oligonucleotide is op de 5'-plaats nog steeds beschermd door eéri dimethoxytritylgroep, zodat het product behandeld wordt met een waterige oplossing van azijnzuur ter verwijdering van de beschermende groep, 5 opnieuw gevolgd door snelle vloeistofchromatografie of dergelijke voor de zuivering tot een enkele piek wordt verkregen.

De gewenste oligonucleotiden worden volgens de bovenbeschreven werkwijze bereid en vervolgens afzonderlijk onderzocht met betrekking tot de nucleotidevolgorde door middel van een tweedimensionale fractioneringsmethode onder toepassing van elektroforese en homochromatografie en (of) de Maxarrt-10 Gilbert-methode en daarna toegepast voor de bereiding van de blokken en ondereenheden.

De tweedimensionale fractioneringsmethode voor het bepalen van nucleotidevolgorde kan uitgevoerd worden volgens de methode van Wu et al. (E. Jay, R.A. Bambara, R. Padmanabhan en R. Wu, Nucleic Acids Res., 1, 331 (1974)).

Voor de uitvoering van deze methode wordt het oligonucleotide in gevriesdroogde toestand opgelost in 15 gedestilleerd water tot een concentratie van ongeveer 0.1 pg/μΙ. Een gedeelte van deze oplossing wordt behandeld met γ-32Ρ-ΑΤΡ en T4 polynucleotidekinase om het 5'-uiteinde te merken met 32P en vervolgens gedeeltelijk gedigereerd met slangengif-fosfordiesterase. Het product wordt op een cellulose-acetaatfilm gedruppeld en onderworpen aan elektroforese voor de eerste dimensionale ontwikkeling ter scheiding van het product aan de hand van het verschil in de basen. De ontwikkelde producten worden dan overgebracht 20 op een diethylaminoethylcellulose (DEAE cellulose) plaat en onderworpen aan de tweede dimensionale ontwikkeling onder toepassing van een oplossing van gedeeltelijk gehydrolyseerd RNA, homomengsel genaamd. (Deze procedure wordt homochromatografie genoemd.) Aldus wordt het oligonucleotide overeenkomstig de ketenlengte gescheiden. Vervolgens wordt de nucleotidevolgorde van het oligonucleotide vanaf het 5'-einde autoradiografisch bepaald.

25 Wanneer het moeilijk is om de volgorde door deze methode te bepalen, wordt indien noodzakelijk gebruik gemaakt van de Maxam-Gilbert-methode. (A.M. Maxam and W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Set., USA, 74, 560 (1977), A.M. Maxam en W. Gilbert, Methods in Enzymol., Vol 65, blz. 499, Academie Press 1980.

Deze methode, die eveneens een chemische ontledingsmethode wordt genoemd, maakt gebruik van een door een bepaalde base specifieke reactie om het oligonucleotide te splitsen op de plaats van de base, en 30 de door elektroforese getoonde banden dienen om de volgorde vanaf het 5'- of 3'-einde te bepalen. De voor de base specifieke reacties zijn als volgt. Guanine wordt specifiek cemethyleerd door dimethylsulfaat. Guanine en adenine ondergaan een depurineringsreactie in de aanwezigheid van een zuur. Thymine en cytosine reageren beide met hydrazine in een lage zoutconcentratie, doch cytosine reageert alleen met hydrazine in een hoge zoutconcentratie. Na de voltooiing van de reacties voor de vier basen laat men elk 35 reactiemengsel reageren met piperidine om de base, waar de ring geopend is, te vervangen, en de β-eliminatie van beide fosfaten uit de suiker te katalyseren, en ten slotte wordt de DNA-streng bij deze base gesplitst. De verkregen reactiemengsels worden respectievelijk onderworpen aan elektroforese met polyacrylamidegel om de nucleotidevolgorde vast te stellen afhankelijk van welke van de reacties elke band produceerde.

40 Vervolgens worden de oligonucleotiden gekoppeld met behulp van een T4 DNA ligase zoals weergegeven in figuur 2. Voor de juiste koppeling worden de 16 oligonucleotiden A-1 t/m A-16 overeenkomende met de ondereenheid A verdeeld in drie stellen, d.w.z. het blok 1 met A-1, A-2, A-3, A-14, A-15 en A-16, het blok 2 met A-4, A-5, A-6, A-11, A-12 en A-13, en het blok 3 met A-7, A-8, A-9 en A-10 zoals weergegeven in figuur 2 gekoppeld. Door elektroforese worden de blokken 1 t/m 3 met de juiste volgorden verkregen en 45 voorts gekoppeld tot de ondereenheid A.

Meer in het bijzonder worden sommige van de 5'-einden van de 16 oligonucleotiden A-1 t/m A-16 gemerkt met 32P met behulp van γ-32Ρ-ΑΤΡ en T4 polynucleotidekinase en worden de hydroxylgroepen van de resterende 5'-einden gefosforyleerd met ATP. Ter vorming van elk van de drie blokken worden de oligonucleotiden verenigd en gekoppeld met behulp van T4 DNA ligase, en het product wordt onderworpen 50 aan elektroforese op polyacrylamidegel om het gewenste blok te isoleren. De aldus verkregen drie btokken worden gekoppeld met behulp van T4 DNA ligase ter vorming van de ondereenheid A. Hoewel een dimeerstructuur gevormd kan worden bij de koppelingsreactie, wordt deze gemakkelijk gesplitst met de restrictie-enzymen EcoRI en BamHI ter verkrijging van de ondereenheid A. Vervolgens wordt, zoals weergegeven in figuur 2, een bekende plasmidevector, pBR322, die afkomstig is van E.coli en gemakkelijk 55 verkrijgbaar is, gesplitst met EcoRI en BamHI en wordt de ondereenheid A opgenomen in de vector ter verkrijging van een recombinant-plasmide pUG1.

Dezelfde procedure als hieivoor wordt eveneens toegepast voor de ondereenheid B. Evenals in tiet geval 192116 8 van de ondereenheid A worden de 16 oligonucleotiden B-1 t/m B-16 verdeeld in vier stellen zoals weergegeven in figuur 3 gekoppeld en worden de blokken samengekoppeld ter vorming van ondereenheid B. Het dimeer, indien gevormd, wordt gesplitst met de restrictie-enzymen Hindlll en BamHI ter verkrijging van de ondereenheid B. Een plasmidevector, pBR322, wordt gesplitst met Hindlll en BamHI en de ondereenheid B 5 wordt in de vector opgenomen ter verkrijging van een recombinant-plasmide pUG2 zoals weergegeven in figuur 3.

Voorts wordt, zoals weergegeven in figuur 4, pUG1 gesplitst met restrictie-enzymen Hindlll en Sail en wordt een met behulp van dezelfde restrictie-enzymen uit pUG2 verwijderd fragment opgenomen in pUG1 ter vorming van een recombinant-plasmide pUG3 met een β-urogastron-stmctureel gen (gen II).

10 pUG1, pUG2 en pUG3 zijn recombinant-plasmiden, die elk pBR322 en de ondereenheid A, die de voorste helft van het β-urogastron-structurele gen is, de ondereenheid B, die de achterste helft van het gen is, of het gehele structurele gen bevatten. Deze recombinant-plasmiden kunnen in grote hoeveelheden vermenigvuldigd worden door ze in een gastheer op te nemen zoals de stam HB101 van E.coli, die bekend en gemakkelijk verkrijgbaar is volgens de calciummethode als transformatiemethode (E. Lederberg and S.

15 Cohen, J. Bacteriol., 119, 1072 (1974)).

Of pUG1, pUG2 en pUG3 aanwezig zijn in de gastheer, zoals de stam HB101 van E.coli, kan door de volgende methoden nagegaan worden. Nadat de plasmiden verzameld zijn door de alkalische extractiemethode, worden pUG1 en pUG2 gecontroleerd op de aanwezigheid van de Bglll herkenningsplaats, die niet aanwezig is in de vector pBR322. Op soortgelijke wijze worden pUG2 en pUG3 erop gecontroleerd, of 20 ze afgesplitst kunnen worden met Mlul, dat niet aanwezig is in pBR322.

Volgens de alkalische extractiemethode wordt E.coli, waarin het plasmide is gehuisvest, geïncubeerd, waarna de cellen verzameld worden en men er lysozym op laat inwerken om de celwand op te lossen. Een mengsel van natriumhydroxide en natriumlaurylsulfaat wordt toegepast om de cel te verbreken en het DNA vervolgens te denatureren, dat dan geneutraliseerd wordt met natriumacetaatbuffer. Hierbij blijft het 25 chromosoom-DNA gedenatureerd, doch hij krijgt het plasmide, dat een niet uit chromosomen afkomstig DNA is, de oorspronkelijke dubbele streng-vorm. Plasmiden worden verzameld door gebruikte maken van deze eigenschappen. De plasmiden worden voorts onderworpen aan ultracentrifugeren met een dichtheids-gradiënt met cesiumchloride en ethidiumbromide ter zuivering en vervolgens door een biogel A 50m kolom geleid om RNA te verwijderen. Zo kunnen plasmiden met een hoge zuiverheid in een grote hoeveelheid 30 verkregen worden. Op deze wijze kan het β-urogastron-gen van de uitvinding (gen II) verkregen worden.

Vervolgens zal de methode voor het opnemen van het β-urogastron-gen in gastheercellen beschreven worden.

De bij de onderhavige uitvinding toe te passen gastheercellen zijn niet bijzonder beperkt en elk van de bekende cellen is bruikbaar, bijvoorbeeld die van E.coli, Bacillus, Pseudomonas, gisten, enz., waarvan de 35 voorkeur wordt gegeven aan E.coli-cellen.

De wijzen voor het tot expressie brengen van het β-urogastron-gen met behulp van E.coli omvat een systeem voor het direct exprimeren van β-urogastron, en een systeem, waarin het geëxprimeerd wordt als een gefuseerd eiwit met β-lactamase of een ander eiwit.

Voor de directe expressie van β-urogastron-gen is het nodig om bovenstrooms van het β-urogastron-gen 40 een promotor en een SD-volgorde in het recombinant-plasmide op te nemen. Omdat de promotor niet bijzonder beperkt is, zijn gewenste promotoren degene, die een hoge mate van expressie waarborgen, zoals XPL, dat de linkse promotor van γ-bacteriofaag is, lac UV5, dat bovenstrooms van β-galactosidase-gen van E.coli aanwezig is, enz. Wanneer XPL toegepast wordt als promotor, is de SD-volgorde niet bijzonder beperkt, doch het is gewenst om de vier-basen-volgorde van AGGA toe te passen. Voorts is het bij 45 toepassing van LAC UV5 als promotor gewenst om de SD-volgorde toe te passen, die bovenstrooms van de LAC UV5 promotor optreedt, of degene, die chemisch gesynthetiseerd is.

Het systeem voor directe expressie van het β-urogastron-gen zal beschreven worden aan de hand van het geval, waarin XPL-SD volgorde^-urogastron-gen wordt toegepast. Hoewel λΡ,. een krachtige promotor is (J. Hedgpeth et al., Molecular and General Genetics, 163,197-203 (1978)) veroorzaakt de volledig 50 geactiveerde λΡ^ρΓοπιοίοΓ iethale uitwerkingen op de E.coli gastheercel, zodat het noodzakelijk is om de cel onder een van elke Iethale werking vrije omstandigheid te vermenigvuldigen en daarna de XPL te laten werken. Anderzijds is CI857, dat een gen in λ bacteriofaag is, een van de gemuteerde genen van Cl repressor, die inwerkt op de operator voor λΡί. Bij lage temperaturen (tot ongeveer 30°C) bindt de CI857 repressor zich aan de operator, waardoor de activiteit van λΡί als promotor volledig geremd wordt, en 55 dientengevolge de vermenigvuldiging van E.coli mogelijk gemaakt wordt. Dientengevolge laat men de gastheercellen zich in deze toestand vermenigvuldigen en brengt ze daarna op een hoge temperatuur (niet lager dan 37°C), waardoor het XPL in staat gesteld wordt om te werken. Voorts zijn de plasmidevectoren, θ 192116 zoals pSC101, dat bekend en gemakkelijk verkrijgbaar is, met een streng neplicatiemechanisme, en degene zoals pBR322 met een gematigd replicatiemechanisme, niet onverenigbaar met elkaar, doch kunnen ze tezamen in dezelfde E.coli-cel bestaan.

Dientengevolge is het geschikt om een recombinant-plasmide pGH37 op te bouwen, waarin een 5 CI857-gen opgenomen is in een tetracycline-resistente plasmidevector pSC101 (met lac UV5-promotor bovenstrooms ervan aangebracht voor de efficiënte expressie van CI857) zoals weergegeven in figuur 6, en het recombinant-plasmide op te nemen in E.coli (stam HB101) ter verkrijging van een transformant (stam ECI-2) ter toepassing als gastheer voor de vector voor de expressie van β-urogastron onder leiding van de λΡ|_ promotor.

10 Volgens de onderhavige uitvinding wordt het \PL-SD-volgorde-p-urogastron-gen bijvoorbeeld opgenomen in pBR322 ter verkrijging van een β-urogastron exprimerende vector, die toegepast wondt voor de transformatie van de stam ECI-2, waardoor een zogenaamd twee-plasmidesysteem wordt verkregen, waarin twee bruikbare plasmiden coëxisteren in een E.coli-cel.

Met dit systeem bindt de door pGH37 gecodeerde CI857 repressor zich aan de operator voor de 15 XPL-promotor op het tweede plasmide, wanneer de cel bijvoorbeeld bij 30°C wordt gekweekt, waardoor de vermenigvuldiging van de cel wordt mogelijk gemaakt. Nadat de cel in deze toestand volledig vermenigvuldigd is, wordt de temperatuur bijvoorbeeld tot 40°C verhoogd, waarop de CI857 repressor van de operator gescheiden wordt, waardoor de activiteit van de XPL-promotor voor de expressie van β-urogastron wordt mogelijk gemaakt.

20 Hoewel een soortgelijk ontwerp toegepast werd voor de expressie van fibroblast-interferon, SV-40 Small t-antigeen, enz. wordt in deze gevallen een λ-lysogeen toegepast als gastheer, waarin het DNA van λ-bacteriofaag met een CI857 gen opgenomen wordt in het gastheer-chromosoom (R. Derynck et af,

Nature, 287, 193-197 (1980), C. Derom et al, Gene, _17, 45-54 (1982), K. Küpper et al, Nature, 289, 555-559 (1981)).

25 Met het systeem van de onderhavige uitvinding wordt het CI857 gen echter opgenomen in een verschillend plasmide, dat resistent is voor tetracycline. Dientengevolge heeft het onderhavige systeem de voordelen, dat het niet waarschijnlijk is dat het in het gastheer-chromosoom opgenomen λ-bacteriofaag tot vermenigvuldiging zal worden gebracht en de stam gemakkelijk gecontroleerd kan worden. Vanzelfsprekend wordt het tweeplasmidesysteem voor de eerste maal toegepast voor systemen voor de expressie van 30 β-urogastron.

Volgens een ander systeem wordt een gedeelte van een ander eiwit-gen zoals β-lactamase-gen gekoppeld aan het β-urogastron-gen om het β-urogastron-gen als een gefuseerd eiwit te exprimeren. Deze methode heeft het voordeel, dat het gefuseerde eiwit minder ontvankelijk is voor ontleding door het protease in het E.coli en dientengevolge bescherming voor het β-urogastron levert. Een ander voordeel is, dat het 35 gefuseerde eiwit migreert naar en zich ophoopt in het periplasma in de cel van E.coli (S.J. Chan et al, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 78, 5401-5405 (1981)), plaatselijk aanwezig is, en dientengevolge gemakkelijk af te scheiden en te zuiveren is.

Meer in het bijzonder wordt een gen-codering voor twee basische aminozuren, die een splitsingsplaats kunnen leveren voor de verwijdering van β-urogastron uit het gefuseerde eiwit door splitsing met een 40 enzym, opgenomen in het β-lactamase-gen op een geschikte restrictie-enzym-splitsingsplaats, en wordt een β-urogastron-gen gekoppeld aan het β-lactamase-gen.

Bij voorkeur is de volgorde van de twee basische aminozuren -Lys-Arg- of Arg-Lys-. Voorbeelden van enzymen voor het herkennen van de aminozuurvolgorde ter afsplitsing van β-urogastron uit het gefuseerde eiwit zijn kallikreïne, trypsine, enz. Voorbeelden van restrictie-enzymen voor het afsplitsen van het 45 β-lactamase-gen zijn Xmnl, Hindi, Seal, Pvul, Pstl, Bgll, Banl, enz.

Het aldus bereide β-Ιθοίθπιββθ-β-υΗ^ββίΓοη recombinant-plasmide kan een gefuseerd eiwit exprimeren in E.coli voor de productie. Het verkregen gefuseerde eiwit wordt behandeld met kallikreïne of dergelijke, waardoor β-urogastron verkregen kan worden.

Het expressiesysteem kan gecontroleerd worden door directe analyse van de nucleotidevolgorde van het 50 gen volgens de Maxam-Gilbert-methode, door vaststellen van de opname van het gen en de richting ervan door de mini-bereidings- of ontwerpmethode (H.C. Bimboim et al., Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979)), of door radio-immunologische bepaling van β-urogastron.

De aldus verkregen transformant van de onderhavige uitvinding wordt volgens de gebruikelijke methode gekweekt, waardoor β-urogastron met een hoge zuiverheid in een grote hoeveelheid verkregen kan worden. 55 De onderhavige uitvinding zal nu nader beschreven worden aan de hand van het volgende voorbeeld, waartoe de uitvinding op generlei wijze beperkt is.

192116 10

Voorbeeld 1. Bereiding van het nucleoside-dragende hars.

Verschillende nucleoside-dragende harsen werdén bereid volgens de volgende methode.

Een hoeveelheid van 1 gew.% verknoopt polystyreenhars ”S-XI” (product van BIO.RAD Laboratories, 5 U.S.A., 200 tot 400 mesh) werd gemengd met 2,41 g N-(chloormethyl)-ftaalimide, 0,22 ml trifluorme-thaansulfonzuur en 50 ml dichloormethaan door 2 uur roeren bij kamertemperatuur. Na voltooiing van de reactie werd het hars afgefiltreerd, achtereenvolgens met dichloormethaan, ethanol en methanol gewassen, onder verminderde druk gedroogd en vervolgens gedurende 1 nacht door verwarming onder terugvloei-koeling gekookt met 50 ml van een 5 gew.%’s hydrazine-oplossing in ethanol. Het hars werd afgefiltreerd, 10 achtereenvolgens met ethanol, dichloormethaan en methanol gewassen en vervolgens onder verminderde druk gedroogd. Men liet het mengsel van aldus verkregen aminomethylgroepen bevattend polystyreenhars (2,5 g), 0,75 mmol monobamsteenzure ester van 5'-o-dimethoxytritylnucleoside, 1,23 mmol dicyclohexylcar-bodiimide en 1 mmol dimethylaminopyridine 1 nacht bij kamertemperatuur staan onder toevoeging van 30 ml dichlooimethaan. Het hars werd afgefiltreerd, achtereenvolgens met dichloormethaan, methanol en 15 pyridine gewassen en vervolgens ondergedompeld in pyridine-azijnzuuranhydride (volumeverhouding 90:10), waarna men het 30 minuten bij kamertemperatuur liet staan. Het verkregen nucleoside-dragende hars werd afgefiltreerd, gewassen met pyridine en dichloormethaan en onder verminderde druk gedroogd ter toepassing bij de synthesereactie in vaste fase.

2. Synthese van dinucleotide.

20 Bij wijze van voorbeeld zal de synthese van een volledig beschermd dinucleotide met de basevolgorde van TA beschreven worden. Adenosine (13,14 g) met de 5'-hydroxylgroep beschermd met een dimethoxytri-tyl (DMTr) groep en de aminogroep beschermd met een benzoylgroep, en 6,34 g triazool werden opgelost in watervrije dioxan. Onder koelen met ijs werd 8,35 ml triethylamine aan de oplossing toegevoegd, waarna gedurende 10 minuten druppelsgewijs 6,86 g o-chloorfenylfosfordichloridaat aan het mengsel werd 25 toegevoegd, en het verkregen mengsel werd 2,5 uur bij kamertemperatuur geroerd.

Het gevormde triethylamine-hydrochloride werd af gefiltreerd, het filtraat werd geconcentreerd tot ongeveer 2/3 van het volume en 3,6 g β-cyaanethanol en 4,8 g 1-methylimidazol werden met het concentraat gemengd door 3 uur roeren bij kamertemperatuur. Het reactiemengsel werd onder verminderde druk geconcentreerd. Het residu werd opgelost in ethylacetaat, driemaal gewassen met een 0,1 M waterige 30 oplossing van dibasisch natriumfosfaat en tweemaal met water en vervolgens onder verminderde druk geconcentreerd, waardoor 19,96 g ruw product werd verkregen. Het product werd gezuiverd door chromato-grafie op een silicagelkolom onder toepassing van chloroform-methanol (volumeverhouding 98:2) als elutiemiddel. De zuivering werd herhaald ter verkrijging van 15,12 g volledig beschermd adenosine-mononucleotide.

35 Het aldus verkregen adenosine-mononucleotide (7,81 g) werd toegevoegd aan een 2 gew.%’s oplossing van benzeensulfonzuur in chloroform-methanol (volumeverhouding 70:30) en het mengsel werd 20 minuten onder koelen met ijs geroerd en vervolgens geneutraliseerd met een waterige oplossing van natriumwaterstof-carbonaat. De afgescheiden chloroformlaag werd met water gewassen en onder verminderde druk geconcentreerd, waardoor 7,11 g ruw product werd verkregen. Het product werd onderworpen 40 aan kolomchromatografie op silicagel en geëlueerd met chloroform-methanol (volumeverhouding 97:3) ter verkrijging van 4,31 g adenosine-mononucleotide met een vrije 5'-hydroxylgroep.

Thymidine (1,64 g) met de 5'-hydroxylgroep beschermd met een dimethoxytritylgroep en 0,95 g triazool werden opgelost in 21 ml watervrije dioxan, aan de oplossing werd 1,25 ml triethylamine toegevoegd en aan het mengsel werd gedurende 5 minuten onder roeren en koelen met ijs druppelsgewijs 0,69 ml 45 o-chloorfenylfosfordichloridaat toegevoegd. Het mengsel werd daarna 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het bij de reactie verkregen triethylaminehydrochloride werd afgefiltreerd en het filtraat werd 10 minuten geroerd met 1,1 ml van een waterige pyridine-oplossing (1 M). Aan de oplossing werd een dioxanoplossing (10 ml) van 1,17 g van het op de bovenbeschreven wijze bereide adenosine-mononucleotide met de vrije 5'-hydroxylgroep en 0,72 ml 1-methylimidazool toegevoegd, en het mengsel werd 3 uur bij kamertempera-50 tuur geroerd. Het verkregen reactiemengsel werd onder verminderde druk geconcentreerd, het residu werd opgelost in ethylacetaat en de oplossing werd gewassen met een waterige oplossing van dibasisch natriumfosfaat (0,1 M) en vervolgens met water en onder verminderde druk geconcentreerd, waardoor 2,39 g ruw product werd verkregen. Het product werd onderworpen aan kolomchromatografie op silicagel en geëlueerd met chloroform-methanol (volumeverhouding 98:2) ter verkrijging van 2,39 g volledig beschermd 55 dinucleotide TA.

Op dezelfde wijze werden verschillende nucleotriden bereid.

3. Synthese van oligonucleotide.

11 192116

De synthese in vaste fase van het oligonucleotide A-1, d.w.z. undecanucleotide AATTCGAAGAT zal beschreven worden.

Een hars (40 mg) met het daarop aangebrachte en volgens de bovenstaande methode 1. bereide nucleoside T werd in een reactievat gebracht, driemaal met dichloormethaan-isopropanol (volumeverhouding 5 85:15) gewassen en vervolgens behandeld met een oplossing van zinkbromide (1M) in dichloormethaan-isopropanol om de dimethoxytritylgroep op de 5'-plaats te verwijderen. Deze procedure werd verscheidene malen herhaald tot de kleur van de oplossing verdwenen was. Het hars werd gewassen met dichloorme-thaan, vervolgens gewassen met een oplossing van triethylammoniumacetaat (0,5M) in dimethylformamide ter verwijdering van de resterende Zn2+, voorts gewassen met tetrahydrofuran en gedroogd door verschei-10 dene minuten stikstofgas door het reactievat te leiden.

Het volledig beschermde en op de eerder beschreven wijze 2. bereide dinucleotide GA (50 mg) werd opgelost in 1 ml pyridine, geschud met 1 ml triethylamine en gedurende verscheidene uren bij kamertemperatuur met rust gelaten. De oplossing werd vervolgens onder verminderde druk ingedampt. Het residu werd verscheidene malen azeotropisch ingedampt met pyridine om het nucleotide om te zetten in een triethyl-15 ammoniumzout. Het zout werd opgelost in 0,3 ml van een 0,3 M oplossing van mesityleensulfonyl-5- nitrotriazool in pyridine. De oplossing werd toegevoegd aan het gedroogde hars, waarna men 60 minuten bij kamertemperatuur liet reageren. Het vloeibare gedeelte werd uit het reactiemengsel afgefiltreerd en het vaste gedeelte werd met pyridine gewassen, waarna men het 5 minuten liet staan in het mengsel van 0,2 ml azijnzuuranhydride en 0,8 ml van een 0,1 M oplossing van dimethylaminopyridine in tetrahydrofuranpyri-20 dine om de niet omgezette hydroxylgroep te maskeren. Tenslotte werd het hars gewassen met pyridine, waardoor een cyclus van de vaste fase-synthese voltooid werd. Eén cyclus verlengt de nucleotideketen met twee basen. Dezelfde procedure werd herhaald om achtereenvolgens de dinucleotiden AA, CG, TT en AA door condensatie met het verkregen nucleotide te koppelen, waardoor het volledig beschermde undecanucleotide AATTCGAAGAT gedragen door het hars werd bereid.

25 Men liet het verkregen hars (20 mg) 1 uur bij 40°C staan met 0,6 ml van een 0,5 M oplossing van tetramethylguanidine-2-pyridinealdoximaat in pyridine-water (volumeverhouding 90:10). Het hars werd vervolgens door een met katoen gevulde pasteurpipet geleid en daardoor afgefiltreerd. Het hars werd afwisselend met pyridine en ethanol gewassen. De wasvloeistoffen en het filtraat werden bijeengevoegd en onder verminderde druk bij 40°C geconcentreerd. Het residu werd opgelost in 2 ml van een waterige 30 oplossing van triethylammoniumbicarbonaat (TEAB, 10 mmol). De oplossing werd driemaal met ether gewassen. De waterige fase werd overgebracht naar een Sephadex G-50 kolom (2 x 100 cm) en geëlueerd met 10 mM TEAB-oplossing. De fracties werden gecontroleerd op de absorptie bij 260 nm. De fractie met de eerste eluaatpiek werd geconcentreerd. Het residu werd onderworpen aan snelle vloeistofchromatografie (pomp: model 6000A, detector: model 440, producten van Waters Associates, U.S.A.) ter verkrijging van 35 een gezuiverde fractie met een enkele |»ek. De voor de snelle vloeistofchromatografie toegepaste kolom was μ-Bondapak C18 (product van Waters Associates, U.S.A.), en een 0,1 M oplossing van triethylammoniumacetaat in waterige acetonitril werd toegepast als elutiemiddel voor gradiënt-elutie (5 -» 40 vol.%). Het aldus gezuiverde undecanucleotide was nog steeds op de 5'-plaats beschermd met de dimethoxytritylgroep, zodat de verbinding gedurende 15 minuten behandeld werd met een 80 vol.%’s 40 waterige azijnzuuroplossing om de dimethoxytritylgroep te verwijderen en vervolgens opnieuw door snelle vloeistofchromatografie werd gezuiverd tot een enkele piek werd verkregen. Hiertoe werd gebruik gemaakt van dezelfde kolom als in het voorafgaande, en werd een 0,1 M oplossing van triethylammoniumacetaat in waterige acetonitril toegepast voor de gradiënt-elutie (5 -> 25 vol.%).

Op dezelfde wijze als in het voorafgaande werden oligonucleotiden A-2 t/m A-16 en B-1 t/m B-16 45 gesynthetiseerd.

Tabel 1 toont de opbrengst van elk oligonucleotide bepaald met behulp van 20 mg van het van de vaste fase-synthese verkregen hars, door het oligonucleotide van het hars te scheiden, gevolgd door verwijdering van de beschermende groep en zuivering.

De opbrengst werd berekend uit de bepaling van de absorptie van het uiteindelijke gezuiverde product bij 50 260 nm en de som van de absorptiewaarden voor de nucleotide-basen.

TABEL 1 A-1 80 pg A-2 120 pg A-3 90 pg A-4 50 pg 55 A-5 140 pg A-6 70 pg A-7 80 pg A-8 90 pg A-9 100 pg A-10 90 pg A-11 110 pg A-12 40 pg 192116 12 TABEL 1 (vervolg) A-13 50 pg A-14 40 pg A-15 60 pg A-16 150 pg B-1 60 pg B-2 100 pg B-3 50 pg B-4 90 pg 5 B-5 100 pg B-6 90 pg B-7 130 pg B-8 100 pg B-9 110 pg B-10 100 pg B-11 110 pg B-12 110 pg B-13 130 pg B-14 60 pg B-15 70 pg B-16 50 pg 10 4. Controle van de volgorde van de oligonucleotidebasen.

De volgorde werd gecontroleerd volgens de eerder genoemde tweedimensionale fractionering door elektroforese en homochromatografie van Wu et al.

Gevonden werd, dat elk van de oligonucleotiden A-1 t/m A-16 en B-1 t/m B-16 de gewenste nucleotide-volgorde bezaten. Figuur 5 toont het door analyse van het oligonucleotide A-3 verkregen resultaat, waarbij 15 gevonden werd, dat A-3 gezien vanaf het 5'-einde de volgorde GATTCTGAGTG bezat.

De nucleotidevolgorde van elk oligonucleotide werd eveneens gecontroleerd volgens de eerder genoemde Maxam-Gilbert-methode.

Vastgesteld werd, dat de oligonucleotiden A-1 t/m A-16 en B-1 t/m B-16 elk de gewenste nucieotide-volgorde bezaten.

20 5. Opbouw van oligonudeotideblokken en ondereenheden.

De blokken en ondereenheden werden op de in figuur 2 toegelichte en hierna nader beschreven wijze bereid.

Eerst werd ongeveer 5 pg van elk van de oligonucleotiden A-1, A-2, A-3, A-14, A-15 en A-16 opgelost in gedestilleerd water (50 pl) ter verkrijging van een oplossing met een concentratie van ongeveer 0,1 pg/pl.

25 De zes soorten van waterige oplossingen werden elk in een hoeveelheid van 10 pl (1 pg berekend als DNA) afzonderlijk in zes Eppendorf-buizen gebracht. Een gemengde oplossing (6 pl) met 250 mM tris-HCI (pH 7,6), 50 mM magnesiumchloride, 10 mM spermine en 50 mM DTT werd in elke buis gebracht, gevolgd door toevoeging van 0,5 pl waterige y-32p-ATP-oplossing (product van Amersham International Ltd., Engeland), 0,5 pl T4 polynucleotidekinase (product van Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) en 13 pl gedestilleerd water, ter 30 verkrijging van 30 pl mengsel. Men liet het mengsel 30 minuten bij 37°C reageren en vervolgens nog 30 minuten verder reageren onder toevoeging van 1 pl waterige 30 mM ATP oplossing. De reactie werd beëindigd door 2 minuten op 100°C te verhitten. Het reactiemengsel werd snel met ijs gekoeld. De oligonucleotiden A-1, A-2, A-3, A-14, A-15 en A-16 met hun aldus gefosforileerde 5'-plaatsen werden elk in een hoeveelheid van 10 pl in één enkele Eppendorf-buis van 1,5 ml gebracht. In de buis werd 40 pl van een 35 waterige 250 mM tris-HCI oplossing (pH 7,6), 40 pl 50 mM magnesiumchloride en 35 pl gedestilleerd water gebracht ter verkrijging van een totale hoeveelheid van 175 pl. Het mengsel werd 2 minuten op 90°C verhit en vervolgens geleidelijk tot kamertemperatuur afgekoeld. Onder toevoeging van 10 pl waterige 200 mM DTT-oplossing, 10 pl waterige 20 mM ATP oplossing en 5 pl (100 eenheden) T4 DNA ligase (product van Nippon GEne Co., Ltd., Japan) liet men het mengsel 1 nacht bij 4°C reageren, waardoor het blok 1 van 40 gekoppelde oligonucleotiden A-1, A-2, A-3, A-14, A-15 en A-16 werd bereid.

De blokken 2 en 3 werden op soortgelijke wijze gevormd door koppeling van A-4, A-5, A-6, A-11, A-12 en A-13 en door koppeling van A-7, A-8, A-9 en A-10.

Ethanol werd in een tweemaal zo grote volumehoeveelheid toegevoegd aan het reactiemengsel van de aldus bereide blokken en men liet het mengsel 30 minuten bij -80°C staan om DNA neer te slaan, gevolgd 45 door elektroforese op een 12,5 gew.%’s polyacrylamidegel en autoradiografie. Dit leidde tot banden op de plaatsen van 72 b.p. (basenpaar) en 36 b.p. voor het blok 1, een band op de plaats van 36 b.p. voor het blok 2 en banden op de plaatsen van 48 b.p. en 24 b.p. voor het blok 3. Vervolgens werd elke band uitgesneden en werd een mengsel van 10 mM tris-HCI (pH 7,6) en 10 mM EDTA in waterige oplossing (tris-EDTA) eraan toegevoegd. Men liet het mengsel vervolgens 1 nacht bij kamertemperatuur staan ter 50 extractie. Het verkregen mengsel werd gecentrifugeerd, de bovenstaande vloeistof werd afgescheiden en de bovenstaande vloeistof werd grondig geschud met met tris-EDTA verzadigde fenol en vervolgens gecentrifugeerd om de onderste laag te verwijderen. Dezelfde procedure werd tweemaal herhaald met met tris-EDTA verzadigde fenol. Ten slotte werd de bovenste laag door een met Sephadex G-50 gepakte kolom met een diameter van 1 cm en een lengte van 20 cm geleid om de fenol en acrylamide te verwijderen. Het eluaat 55 werd vervolgens geconcentreerd tot 200 pl, waarna men het 30 minuten bij -80<’C liet staan met een tweemaal zo grote volumehoeveelheid ethanol om DNA neer te slaan.

De drie verkregen blokken werden gecombineerd. Aan het mengsel werd 50 mM tris-HCI (pH 7,6) 10 mM

13 192116 magnesiumchloride, 20 mM DTT, 1 mM ATP en 5 μΙ (100 eenheden) T4 DNA ligase toegevoegd. Men liet het verkregen mengsel 1 nacht bij 4°C staan voor de koppeling. Aan het mengsel werd tweemaal het volume aan ethanol toegevoegd en men liet het mengsel 30 minuten bij -80eC staan om DNA neer te slaan, gevolgd door elektroforese op 8 gew.%’s polyacrylamidegel en autoradiografie, waardoor banden bjj 5 96 b.p. en 192 b.p. werden getoond. Elke band werd uitgesneden en tris-EDTA werd eraan toegevoegd, en men liet het mengsel 1 nacht bij kamertemperatuur staan ter extractie. Het mengsel werd gecentrifugeerd om de bovenstaande vloeistof af te scheiden, de bovenstaande vloeistof werd grondig geschud met met tris-EDTA verzadigde fenol, en de onderste laag werd weggegooid. Deze procedure werd tweemaal herhaald met verdere toevoeging van met tris-EDTA verzadigde fenol. De bovenste laag werd door een 10 Sephadex G-50 kolom geleid, het eluaat werd geconcentreerd en aan het concentraat werd tweemaal het volume aan ethanol toegevoegd, gevolgd door 30 minuten laten staan bij -80°C om DNA neer te slaan. Het verkregen product werd gesplitst met EcoRI en BamHI ter verkrijging van de ondereenheid A.

Dezelfde procedure ais in het voorafgaande werd herhaald zoals getoond in figuur 3 om oligonudeotiden B-1, B-2, B-15 en B-16 te koppelen tot het blok 4, oligonudeotiden B-3, B-4, B-13 en B-15 te koppelen tot 15 het blok 5, oligonudeotiden B-5, B-6, B-11 en B-12 te koppelen tot het blok 6 en oligonudeotiden B-7, B-8, B-9 en B-10 te koppelen tot het blok 7. De blokken overeenkomende met 26 b.p. en 52 b.p. werden verzameld en op soortgelijke wijze gekoppeld ter vorming van producten met 104 b.p. en 208 b.p., die gesplitst werden met Hindlll en BamHI. Aldus werd de ondereenheid B verkregen.

6. Cloneren van ondereenheden en analyse van recombinantplasmiden.

20 Onder verwijzing naar figuur 2 werd pBR322 gesplitst met EcoRI en BamHI en werden fosfaatgroepen met alkalisch fosfatase (product van Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) verwijderd van de 5'-einden, om de oorspronkelijke toestand niet te herstellen. Vervolgens liet men het aldus gesplitste en gedefosforyleerde pBR322 en de ondereenheid A 1 nacht bij 4°C in een mengsel van 50 mM tris-HCI (pH 7,6), 10 mM magnesiumchloride, 20 mM DTT en 1 mM ATP met toevoeging van 5 μΙ T4 DNA ligase staan, waardoor ze 25 gekoppeld werden. Aan het reactiemengsel werd tweemaal het volume aan ethanol toegevoegd en men Bet het mengsel 30 minuten bij -80°C staan ter precipitatie. Het mengsel werd vervolgens gecentrifugeerd, het neerslag werd gedroogd en opgelost in 100 μΙ gedestilleerd water, waardoor een plasmide pUG1 werd verkregen, waarin de ondereenheid A opgenomen was in pBR322.

De E.coli stam HB101 werd getransformeerd met het plasmide pUG1 volgens de calcium-methode.

30 De als gastheer dienende stam HB101 werd bij 37°C gekweekt in 50 ml LB kweekmedium (1 gew.% bactotrypton, 0,5 gew.% gistextract en 0,5 gew.% natriumchloride). Wanneer de absorptie bij 610 nm 0,25 bereikte, werd een hoeveelheid van 40 ml van de kweekvloeistof overgebracht in een centrifugebuis en 10 minuten bij 4°C met 6000 rpm gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd weggeworpen, het neerslag werd gesuspendeerd in 20 ml met ijs gekoelde 0,1 M magnesiumchlorideoplossing, de suspensie werd 35 opnieuw onder dezelfde omstandigheden gecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistof werd weggeworpen.

Het neerslag werd gesuspendeerd in 20 ml van een met ijs gekoelde oplossing van 0,1 M calciumchloride en 0,05M magnesiumchloride en 1 uur met ijs gekoeld. De suspensie werd gecentrifugeerd, de bovenstaande vloeistof werd verwijderd en het neerslag werd gesuspendeerd in 2 ml van een met ijs gekoelde oplossing van 0,1 M calciumchloride en 0,05M magnesiumchloride. Aan een hoeveelheid van 200 μΙ van de 40 suspensie werd 10 μΙ waterige oplossing van pUG1 toegevoegd en het mengsel werd 1 uur met ijs gekoeld en vervolgens 30 seconden in een waterbad op 43,5°C verwarmd. Vervolgens werd 2,8 ml LB kweekmedium aan het mengsel toegevoegd, gevolgd door 1 uur incubatie bij 37°C. De kweek werd vervolgens uitgespreid over een LB plaat met 50 pg/ml ampicilline in een hoeveelheid van 200 μΙ/schaal en 1 nacht b$ 37°C geïncubeerd. De groeiende kolonies werden gecontroleerd door verdere transplantatie op een LB plaat 45 met 50 pg/ml ampicilline en eveneens op een LB plaat met 20 pg/ml tetracycline en werden 1 nacht bij 37°C geïncubeerd. Alleen de ampicilline-resistente kolonies werden afgescheiden ter verkrijging van een getransformeerde cel.

Plasmiden werden uit de cel verzameld op kleine schaal door middel van de alkalische extractiemethode en gecontroleerd op de aanwezigheid van een BGIII splitsingsplaats. Een van de cellen met het plasmide 50 met een Bglll splitsingsplaats werd op grote schaal gekweekt om op soortgelijke wijze gezuiverd plasmide pUG1 met behulp van de alkalische extractiemethode te verkrijgen.

De nucleotidevolgorde van de in het verkregen pUG1 opgenomen ondereenheid A werd aan beide strengen geanalyseerd met behulp van de eerder genoemde Maxam-Gilbert-methode.

De foto’s 1 en 2 tonen de resultaten van de analyse. De banen 1 t/m 4 zijn het resultaat van de 55 elektroforese voor het EcoRI-Sall fragment en de banen 5 t/m 8 voor het BamHI-Pstl fragment. De banen 1 en 5 tonen de reactieproducten voor guanine, de banen 2 en 6 de reactieproducten voor guanine + adenine, de banen 3 en 7 tonen de reactieproducten voor thymine + cytosine en de banen 4 en 8 tonen de 192116 14 reactieproducten voor cytosine. Foto 2 toont de met behulp van dezelfde monsters verkregen resultaten, waarin een gebied van het gedeelte met een hoger moleculegewicht (overeenkomende met het bovenste gedeelte van foto 1) is vergroot. Aldus werd de nucleotidevolgorde van de ondereenheid A vastgesteld.

Onder verwijzing naar figuur 3 werd het plasmide pBR322 gesplitst met Hindlll en BamHI en werd het 5 grotere fragment met behulp van elektroforese geïsoleerd en aan de ondereenheid B gekoppeld. Aldus werd een plasmide p(JG2 verkregen, waarin ondereenheid B op soortgelijke wijze als in het geval van pUG1 opgenomen was in pBR322. Onder toepassing van het verkregen plasmide p(JG2 werd de stam HB101 getransformeerd en werden uitsluitend de ampicilline-resistente kolonies geselecteerd. Plasmiden werden uit de kolonies verzameld en vervolgens gecontroleerd op de aanwezigheid van een Bglll splitsingsplaats en 10 een Mlul splitsingsplaats. De cellen met het plasmide met beide plaatsen werden geselecteerd. Eén van de geselecteerde cellen werd op grote schaal gekweekt ter verkrijging van gezuiverd plasmide pUG2. De nucleotidevolgorde van de ondereenheid B in pUG2 werd aan beide strengen geanalyseerd met behulp van de Maxam-Gilbert-methode.

Foto 3 toont de resultaten van de analyse. De banen 1 t/m 4 tonen het door het Hindlll-Sall fragment 15 verkregen resultaat. De banen 5 t/m 8 tonen het met hetzelfde monster verkregen resultaat, waarin een gebied van het gedeelte met hoger moleculegewicht (overeenkomende met het bovenste gedeelte van banen 1 t/m 4) op vergrote schaal is getoond. Elke baan toont hetzelfde overeenkomende reactieproduct als op foto 1. Aldus werd de nucleotidevolgorde van de ondereenheid B vastgesteld.

Vervolgens werd onder verwijzing naar figuur 4 pUG1 gesplitst met Hindlll en Sail en werd een groter 20 fragment afgescheiden met behulp van een biogelkolom van 1,5 m. pUG2 werd gesplitst met Hindlll en Sail, gevolgd door elektroforese ter verkrijging van een kleiner fragment. De twee fragmenten werden gecombineerd en behandeld met T4 DNA ligase voor de koppeling, waardoor het plasmide pUG3 werd verkregen, waarin de ondereenheden A plus B, d.w.z. β-urogastron-gen, opgenomen was in pBR322. De E.ooli stam HB101 werd met behulp van het plasmide pUG3 getransformeerd. De transformant is gedeponeerd volgens 25 het verdrag van Budapest met betrekking tot internationale erkenning van depots onder het nummer FERM BP 543 bij het Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan.

In het bovenstaande geval werden eveneens de cellen, die uitsluitend ampicilline-resistentplasmide pUG3 . met een Mlul splitsingsplaats huisvesten, geselecteerd. Eén van de geselecteerde cellen werden op grote 30 schaal gekweekt ter verkrijging van gezuiverd plasmide pUG3. De nucleotidevolgorde van het β-urogastron-gen in pUG3 werd aan beide strengen geanalyseerd met behulp van de Maxam-Gilbert-methode.

Foto 4 toont de resultaten van de analyse. De banen 1 t/m 4 tonen het met het BamHI-Pstl fragment veikregen resultaat. De banen 5 t/m 8 tonen het met hetzelfde monster verkregen resultaat, waarin een gebied van het gedeelte met hoger moleculegewicht (overeenkomende met het bovengedeelte van de 35 banen 1 t/m 4) op grote schaal getoond is. De reactieproducten van de banen zijn dezelfde als de overeenkomstige producten op foto 1. De analyse bevestigde de nucleotidevolgorde van het β-urogastron-gen.

7. Expressievector met XPL-promotor.

De XPL-promotor, de linkse promotor van λ-bacteriofaag, werd toegepast voor het exprimeren van 40 β-urogastron, zoals hierna nader beschreven zal worden.

Eerst zal de bereiding van een stam ECI-2 afgeleid van E.coli-stam HB101 beschreven worden. ECI-2 diende als gastheer voor λ-PL expressieplasmiden. Vervolgens zal het doneren van een DNA fragment met XPL promotor vanuit het DNA van λ-0Ι85737, dat een mutant van λ-bacteriofaag is, en de opbouw van expressieplasmiden uit het gedoneerde DNA beschreven worden. Voorts zal de expressie van 45 β-urogastron-gen in de ECI-2 gastheerstam door de λΡί-ρπ>ιηοΙοΓ beschreven worden.

7-1. Opbouw van de stam ECI-2.

De stam ECI-2 is E.coli HB101, dat een plasmide pGH37 voor de expressie van CI857-gen huisvest. pGH37 werd volgens de in figuur 6 getoonde werkwijze bereid. Eerst werd DNA van λΟΙ85737 gesplitst met Bglll. Vervolgens werden de samenhangende uiteinden op de splitsingsplaats gedigereerd met behulp van 50 S1 nudease. Men liet 1 pg met Bglll gesplitst DNA van XCI857S7 30 minuten bij 20°C reageren met 200 eenheden S1 nuclease in 100 pl van een waterige oplossing (pH 4,5) die 200 mM natriumchloride, 30 mM natriumacetaat en 5 mM zinksulfaat bevatte. De aldus verkregen DNA fragmenten met stompe uiteinden werden onderworpen aan een elektroforese met 1,0 gew.% agarosegel om daaruit een fragment met 2385 b.p. met het gehele CI857 structurele gen te isoleren. Het fragment werd opgenomen op de Pvull splitsings-55 plaats van plasmiden pGL101 ter vorming van een plasmide pGH36, dat het CI857-gen exprimeert onder leiding van een promotor, lac UV5. Vervolgens wordt pGH36 gesplitst met twee restrictie-enzymen, EcoRI en Pstl, ter verkrijging van een fragment met 1193 b.p., dat opgenomen werd in een plasmide pSC101 15 192116 tussen de EcoRI en Pstl splitsingsplaatsen ter voiming van een plasmide pGH37.

Vervolgens werd de stam HB101 van E.coli getransformeerd met pGH37 volgens de eerder genoemde calcium-methode. Een van de verkregen stammen werd ECI-2 genoemd. De stam ECI-2 is volgens het verdrag van Budapest met betrekking tot internationale erkenning van depots onder nummer FERM BP 542 5 gedeponeerd bij het Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan. Deze stam is resistent voor tetracycline, exprimeert het CI857 gen en maakt een gelijktijdige aanwezigheid, door transformatie, van andere plasmiden mogelijk, die bijvoorbeeld afgeleid zijn uit pBR322. Dientengevolge werd de stam ECI-2 vervolgens als gastheer voor XPL-expressieplasmiden toegepast.

10 7-2. Cloneren van λΡ^ρΓοπκΛοΓ en bereiding van expiessieplasmiden.

Zoals toegelicht in figuur 7 werd eerst pGH35 gevormd. DNA van CI857S7 werd gesplitst met EcoRI en Sail ter verkrijging van een fragment met 5925 b.p., dat de XPL-promotor en het CI857 gen alsmede \PR-promotor bevat. Het fragment werd opgenomen in het plasmide pBR322 tussen de EcoRI en Sail splitsingsplaatsen ter vorming van een plasmide pGH25.

15 Vervolgens werd pGH25 gesplitst met BamHI en gekoppeld aan op soortgelijke wijze met BamHI gesplitst pBR322 ter verkrijging van pGH34.

Vervolgens werd pGH34 gesplitst met Aval en BGIII en daarna behandeld met S1 nuclease ter vorming van een fragment met een stomp uiteinde van ongeveer 4500 b.p. Het fragment werd tot een ring gevormd met T4 DNA ligase ter vorming van een plasmide pGH35.

20 Vervolgens werd zoals weergegeven in figuur 8 pEK28 opgebouwd. Synthetische oligonucleotiden C-1-1 en C-1-2 als adaptor, die een SD-volgorde en de hierna vermelde nucleotidevolgorde bevatten, werden gekoppeld aan het fragment, dat verkregen was door splitsing van pGH35 en Hpal. De combinatie werd voorts gekoppeld aan het met BamHI gesplitste plasmide pMC1403 ter verkrijging van plasmide pEG2. Het pEG2 bezit twee ampicilline-resistente genen en exprimeert van pMC1403 afgeleid β-galactosidase-gen 25 onder leiding van XPL-promotor onder toepassing van een startcodon alsmede de SD-volgorde in de adaptor.

De fragmenten C-1-1 en C-1-2 bezitten de volgende nucleotide-volgorde.

SD-volgorde Start-codon.

30 C-1-1: 5' A G G A A C A I G A T C T A T G 3' C-1-2: 3'TCCTTGTCTAGATACCTAG 5'

Bglll 35 De methode van Miller werd toegepast om de expressie van β-galactosidase in de gastheer ECI-2 van het plasmide pEG2 vast te stellen (Miller, J. (1972) ’’Experiments in Molecular Genetics” New York, Cold Spring Harbor Laboratory pp352-355). Deze methode is gebaseerd op de reactie van β-galactosidase met een synthetisch substraat ONPG (o-nitrofenylgalactoside) om een gele verbinding o-nitrofenol vrij te maken. De methode van Miller zal nader beschreven worden. Een hoeveelheid van 0,1 ml van een kweek van een 40 bacteriesoort, waarvan de absorptie gemeten is bij 610 nm, wordt gemengd met 1,9 ml van een proefbuffer (0,1 M natriumfosfaat, pH 7,0,1 mM magnesiumsulfaat en 0,1 M β-mercapto-ethanol) en 15 seconden krachtig geschud met 0,1 ml tolueen om de permeabiliteit van de bacteriesoort te verhogen. De tolueen wordt daarna afgedampt door middel van een aanzuiger. Met toevoeging van 0,2 ml ONPG oplossing (oplossing van 400 mg ONPG in 100 ml proefbuffer) wordt het mengsel bij 30°C geincubeerd tot zich een 45 gele kleur ontwikkelt, waarna 0,5 ml 1 M natriumcaibonaat toegevoegd wordt om de enzymreactie te stoppen. De absorptie van het reactiemengsel wordt bij 420 nm en 550 nm gemeten.

De activiteit van β-galactosidase wordt gedefinieerd door de eenheden in 1 ml van de kweekvloeistof volgens de onderstaande vergelijking, waarbij de absorptie bij 610 nm berekend is als 1,0.

Activiteit van β-galactosidase 35 (eenheden) = Q.l^Pf20 ~~ x 9^55° x 1000 50 txvxOD610 t: incubatietijd (minuten) v: aan het reactiesysteem toegevoegde hoeveelheden monster (0,1 ml) OD610: absorptie bij 610 nm van het monster.

Bij uitvoering van de bovenstaande methode werd het volgende resultaat verkregen. Wanneer de pEG2 55 herbergende stam ECI-2 bij 30°C werd geincubeerd, bedroeg de β-galactosidase-activiteit 98 eenheden. Wanneer de kweek echter verder gedurende 1 uur bij 42°C werd geincubeerd, werd de XPL-promotor geactiveerd met als resultaat een β-galactosidase-activiteit van 9637 eenheden. Dit bevestigt, dat de 19211$ 16 volgorde van de λΡ,,-promotor tot β-galactosidase de gewenste volgorde is.

Hoewel pEG2 twee Bglll splitsingsplaatsen bezit, is slechts de onmiddellijk na de SD-volgorde van β-galactosidase aanwezige Bglll plaats noodzakelijk, terwijl de andere plaats ongewenst is. Dientengevolge werd het plasmide met BamHI gesplitst en opnieuw gekoppeld ter verwijdering van een fragment met 5 ongeveer 770 b.p. Aldus werd de opbouw van pEK28, dat een expressieplasmide met toepassing van XPL-promotor is, voltooid.

7-3. Expressie van gefuseerd gen van de voorste helft van β-urogastron en β-galactosidase.

Figuur 9 toont schematisch de reeks van de hierna beschreven procedures.

Een plasmide pUG101 werd op de volgende wijze opgebouwd. Dit plasmide is een gefuseerd gen van de 10 voorste helft van β-urogastron en een β-galactosidase. Meer in het bijzonder werd pUG1, dat de voorste helft van β-urogastron-gen bevat, en pMC1403 met een β-galactosidase-gen gesplitst met BamHI en vervolgens gekoppeld ter vorming van pUG101. Met dit plasmide zijn de voorste helft van het β-urogastron-gen en het β-galactosidase-gen in hetzelfde frame gekoppeld. Dientengevolge exprimeert het plasmide de aminozuurvolgorde van de twee als een gefuseerd eiwit.

15 Voor de expressie met dit plasmide onder leiding van de λΡι/ριοιηοΙοΓ, werden pUG101 en pEK28 elk gesplitst met Bglll.

De splitsing met Bglll levert een DNA-fragment met uitstekende 5'-einden in de vorm van ( jcTAg)-Wanneer men het DNA-fragment echter laat reageren met een groot fragment van E.coli DNA polymerase I (Klenow fragment) in aanwezigheid van de vier soorten deoxribonucleotide-trifosfaten dGTP, dATP, dTTP en dCTP, wordt een stomp uiteinde verkregen door opvullen met de overeenkomstige nucleotiden, die het uiteinde (" jctag) νοΓΤΤ1θη· Wanneer alleen dGTP wordt toegevoegd als nucleotidebestanddeel, wordt het uiteinde ( "jctag) ver^re9®n tengevolge van de beëindiging van de reactie. Vervolgens, wanneer 2^ S1 -nuclease wordt toegepast voor het digereren van de resterende enkele streng, wordt een stomp uiteinde in de vorm van (" jq) verkregen. Op soortgelijke wijze wordt, wanneer dGTP en dATP toegevoegd worden bij de Klenow-reactie, gevolgd door digereren met S1-nuclease, (” jqj) verkregen. Wanneer de Klenow-reactie uitgevoerd wordt door toevoeging van dGTP, dATP en dTTP, gevolgd door digereren met (AGAT\ TCTA/ veri<r®9en· Voorts wordt, wanneer alleen het digereren met S1-nuclease

wordt uitgevoerd zonder uitvoering van de Klenow-reactie, ("’j) verkregen. Wanneer derhalve het DNA

fragment met het uiteinde ( "jctag) ond®rworpen wordt aan de Klenow-reactie met gebruik van verschillende nucleotiden en/of aan de S1-nuclease-reactie, worden vijf soorten stompe uiteinden verkregen, die 35 van elkaar verschillen door de lengte van een basenpaar.

De Klenow-reactie en S1-nuclease-reactie werden onder de volgende omstandigheden uitgevoerd. xKlenow-reactie:

Men liet 1 pg DNA als substraat reageren met 1 mM van elk desoxyribonucleotidetrifosfaat gedurende 30 minuten bij 12°C in aanwezigheid van 1 eenheid van het enzym (Klenow-fragment) en 1 mM ATP in 50 40 pi van een reactiemedium, dat 40 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7,4), 1 mM β-mercapto-ethanol en 10 mM magnesiumchloride bevat.

XS1 -nuclease-reactie:

Men liet 1 pg DNA als substraat en 200 eenheden van het enzym gedurende 30 minuten bij 20°C reageren in 100 pl van een reactiemedium, dat 200 mM natriumchloride, 30 mM natriumacetaat en 5 mM 45 zinksulfaat bevat (pH 4,5).

pEK28 en pUG101 werden elk gesplitst met Bglll en vervolgens onderworpen aan verschillende combinaties van de Klenow-reactie en de S1-nuclease-reactie, waardoor fragmenten met vijf soorten stompe uiteinden verkregen werden. Bij combinatie van de twee typen van deze fragmenten werden 21 combinaties verkregen, die van elkaar verschilde in het aantal en de volgorde van de nucleotiden tussen de 50 SD-volgorde en het startcodon van het gefuseerde eiwit, zoals vermeld in tabel 2.

In de praktijk werden de aldus verkregen DNA-fragmenten gesplitst met Sail ter isolatie van fragmenten, die het gen bevatten, dat codeert voor gefuseerd eiwit van de voorste β-urogastronhelft en β-galactosidase uit pUG101, en fragmenten met λ-Ρ^-promotor uit pEK28. Deze fragmenten werden gekoppeld door T4 DNA ligase in de in tabel 2 vermelde combinaties.

55 Dientengevolge werden de recombinant-plasmiden in tabel 3 verkregen. De β-galactosidase-activiteit van de geëxprimeerde gefuseerde eiwitten werd gemeten volgens methode van Miller. Tabel 3 toont, dat alle geëxprimeerde plasmiden een betrekkelijk hoog niveau van β-galactosidase-activiteit bezitten. In het 17 192116 bijzonder pUG103, pUG104 en pUG117 bereikten opmerkelijke resultaten.

TABEL 2 5 Nucleotide-volgorde bovenstrooms van het start-codon (ATG)

ATCTGC- GATCTGC

Nucleotide- -ACA -ACAATCTGC- -ACAGATCTGC- volgorde (pUG105) (pUG106) 10 benedenstrooms -ACAG - -ACAGGATCTGC- van SD-volgorde (pUG110) (AGGA) -ACAGA -ACAGAATCTGC- -ACAGAGATCTGC- (pUG113) (pUG114) -ACAGAT -ACAG ATATCTGC- -ACAGATGATCTGC- 15 (pUG117) (pUG118) -ACAGATC -ACAGATCATCTGC- -ACAGATCGATCTGC- (pUG121) (pUG122)

Nucleotide-volgorde bovenstrooms van het start-oodon (ATG) 20 - TGC- CTGC- TCTGC-

Nucleotide- -ACA -ACATGC- -ACACTGC- -ACATCTGC- volgorde (pUG102) (pUG103) (pUG104) benedenstrooms -ACAG -ACAGTGC- -ACAGCTGC- -ACAGTCTGC- 25 van de SD-volgorde <PUG107> <PUG108> (PUG109> (AGGA) -ACAGA -ACAGATGC- -ACAGACT GC- (pUG111) (pUG112) -ACAGAT -ACAGATTGC- - -ACAGATTCTGC- 30 (pUG115) (pUG116) -ACAGATC - -ACAGATCCTGC- -ACAGATCTCTGC- (pUG119) (pUG120) 35 TABEL 3

Aantal nucleotiden tussen de SD-volgorde en het Recombinantplasmide β-Galactosidase startcodon (eenheden) 40 6 pUG102 1674 7 pUG103 2533 7 pUG107 2260 8 pUG104 2802 8 pUG108 1835 45 9 pUG105 1018 9 pUG109 1942 10 pUG106 973 11 pUG110 1764 11 pUG113 1950 50 11 pUG119 1862 12 pUG114 946 12 pUG117 2332 12 pUG120 1374 13 pUG118 2041 55 13 pUG121 1678 14 pUG122 1814 192116 18

Vervolgens werd een vector voor de expressie van β-urogastron bereid uit pUG103 of pUG117. Het plasmide (pUG103 of pUG117) werd gesplitst met Hindlll en Pvull ter verkrijging van een fragment van 1,2 kb, dat het gebied van XPL-promotor tot de voorste helft van β-urogastron-gen bevatte. Voorts werd pUG2 gesplitst met EcoRI, aangevuld met een Klenow-fragment en gesplitst met Hindlll ter verkrijging van een 5 fragment van 4,1 kb. De twee fragmenten werden gekoppeld met T4 DNA ligase, en de stam ECI-2 van E.coli werd getransformeerd volgens de eerder genoemde calcium-methode ter verkrijging van een recombinant, die het plasmide pUG103-E of pUG117-E bevat voor de expressie van de combinatie van de voorste helft en de achterste helft van het β-urogastron-gen, d.w.z. het gehele β-urogastron-gen, onder leiding van APL-promotor.

10 8. Vector voor de expressie van gefuseerd eiwit.

Een β-lactamase-gen op het plasmide pBR322 en een β-urogastron-gen werden gekoppeld voor het exprimeren van β-urogastron als gefuseerd eiwit, zoals hierna beschreven zal worden.

8-1. Donor van β-lactamase-gen.

pBRH02 wordt verkregen door splitsen van pBR322 met Aval en Pvull, gevolgd door de Klenow-reactie 15 en koppeling door T4 DNA ligase. Dit plasmide bezit genen voor ampicilline-resistentie (ApR) en tetracycline-resistentie (TcR) als markeringen. pBRH03 wordt verkregen door splitsen van pBR325 met Aval en Hindlll, gevolgd door de Klenow-reactie en koppeling en bevat ApR en chloorampfenicol-resistentie (CmR) als markeringen. Figuur 10 toont deze plasmiden.

8-2. Donor van β-urogastron-gen.

20 Op de reeds beschreven wijze bereid pUG3 werd gesplitst met Mboll ter verkrijging van 13 soorten DNA-fragmenten, die A t/m M genoemd werden in de volgorde van afmeting zoals weergegeven in figuur 11. Van deze DNA-fragmenten werd gevonden, dat het H-fragment bestond uit 179 b.p. beginnend met een voor asparaginecoderend nucleotide aan het N-uiteinde van β-urogastron en eindigend met 16 basen benedenstrooms van het stopcodon, waarbij het fragment het gehele structurele gen van β-urogastron 25 bevat. Om het H-fragment te isoleren werden de fragmenten onderworpen aan elektroforese met 6 gew.%’s polyacrylamidegel en werd het fragment gezuiverd.

8-3. Adaptor.

Als adapteren werden de in tabel 4 vermelde oligonucleotiden op de reeds eerder beschreven wijze bereid. Deze adaptoren werden zo ontworpen, dat ze coderen voor het basische aminozuurpaar van 30 Lys-Arg of Arg-Lys voor het enzymatisch afsplitsen van β-urogastron uit het geèxprimeerde gefuseerde eiwit.

TABEL 4 35 Adaptor 5'-einde — 3'-einde

D-1-3 CCGTAAG

D-1-4 TTACGG

D-2-1 CGTAAG

40 D-2-2 TTACG

D-3-2 TTACGGAT

D-4-2 TTACGTGCA

E-1 CGCTAAACGG

E-2 CGTTTAGCG

45 E-3 GACAAACGG

E-4 CGTTTGTC

E-5 CGTTTAGCGAT

E-6 CGTTTGTCTGCA

E-7 CGGCTAAACGG

50 E-8 CGTTTAGCCG

E-9 CAAACGG

E-10 CGTTTG

55 8-4. Systeem voor de expressie van gefuseerd eiwit van β-lactamase en β-urogastron verbonden door Lys-Arg.

Een vector voor de expressie van β-Ιβοίθητοβθ-β-υιχχϊθείΐΌη^θίυβθθκΙ eiwit werd zodanig bereid, dat 19 192116 een herkenningsvolgorde voor restrictie-enzym gevormd zou worden in het gebied, dat een adaptor bevat.

8-4-a. Opbouw van pUG2301 t/m pUG2303.

De in figuur 12 weergegeven werkwijze werd uitgevoerd.

Het plasmide pBRH02 werd gedurende 3 uur bij 37°C volledig gesplitst met Xmnl. Vervolgens werden 3 5 pg van de vector, ongeveer 0,1 pg β-urogastronfragment van 179 b.p. en ongeveer 1 pg van zowel E-1 als E-2 (met niet-gefosforyleerd 5'-uiteinde) als adaptor in een enkele trap gedurende 15 uur bij 12°C gekoppeld ter verkrijging van plasmiden als expressievector. De stam HB101 werd getransformeerd met behulp van de plasmiden volgens de calcium-methode.

Van de verkregen 499 TcR kolonies waren 168 kolonies (33,7%) Aps. Deze kolonies werden door 10 mini-bereiding gecontroleerd op de afmeting van het plasmide DNA. Dertien plasmiden waren ongeveer 200 b.p. groter dan de vector en werden verondersteld een daarin opgenomen β-urogastron-gen te bevatten.

Alle plasmiden met een Mlul-plaats werden gesplitst met Hinfl en gecontroleerd op de oriëntatie van de opname van het β-urogastron-gen door middel van elektroforese met 1,5 gew.% agarose-gel. Drie van de gecontroleerde plasmiden gaven fragmenten van ongeveer 1050 b.p. en ongeveer 800 b.p. Dit toonde, dat 15 het β-urogastron-gen opgenomen was met dezelfde oriëntatie als β-lactamase. Deze drie plasmiden werden pUG2301 t/m pUG2303 genoemd.

8-4-b. Opbouw van pUG2101 t/m pUG2105.

De in figuur 13 weergegeven werkwijze werd uitgevoerd.

Het plasmide pBR322 werd toegepast als plasmidevector met een enkele Pvul plaats in het β-lactamase-20 gen. Volgens de in 8-4-a beschreven werkwijze werd een expressievector gevormd onder toepassing van E-1 en E-5 als adaptor.

Wanneer de verkregen 1626 TcR-kolonies gecontroleerd werden op Ap-gevoeligheid, waren 31 kolonies (1,9%) Aps. Een minibereiding werd uitgevoerd voor de 22 TcR en Aps kolonies en de plasmiden werden gecontroleerd op de opname van β-urogastron-gen door splitsing van Mlul. Gevonden werd, dat twintig 25 plasmiden een Mlul plaats bezaten. De oriëntatie werd gecontroleerd door splitsen met Hinfl of BamHI. Gevonden werd, dat de plasmiden pUG2101 t/m pUG2105 een daarin opgenomen β-urogastron-gen met dezelfde oriëntatie als het β-lactamase-gen bevatten.

8-4-c. Opbouw van pUG2701 t/m pUG2703.

Expressieplasmiden werden gevormd volgens dezelfde methode als 8-4-a onder toepassing van 30 pBR322 als vector en E-7 en E-8 als adaptor, zoals weergegeven in figuur 14.

Van de verkregen 217 TcR kolonies waren 106 kolonies (48,8%) Aps. Een minibereiding werd urtgevoerd voor 25 van deze kolonies. Acht van de plasmiden waren ongeveer 200 b.p. groter dan de vector en bleken een daarin opgenomen β-urogastron-gen te bevatten, zodat deze acht plasmiden gesplitst werden met BamHI en gecontroleerd werden op de oriëntatie van het gen. Gevonden werd, dat drie plasmiden het 35 β-urogastron-gen met dezelfde oriëntatie als β-lactamase bevatten en deze werden pUG2701 t/m 2703 genoemd.

Het volgens de bovenstaande methode 8-4-a verkregen plasmide pUG2301 levert een gefuseerd «wit van een gedeelte van β-lactamase en β-urogastron. De voorspelde aminozuurvolgorde en de overeenkomstige nucleotide-volgorde zijn hierna vermeld.

40 Met Ser He Gin His Phe Arg Val

ATG AGT ATT CAA CAT TTC CGT GTC

Ala Leu lie Pro Phe Phe Ala Ala

GCC CTT ATT CCC TTT TTT GCG GCA

45

Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His

TTT TGC CTT CCT GTT TTT GCT CAC

Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys

50 CCA GAA ACG CTG GTG AAA GTA AAA

Asp Ala Glu Asp Gin Leu Gly Ala

GAT GCT GAA GAT CAG TTG GGT GCA

55 Arg Val Gly Tyr He Glu Leu Asp

CGA GTG GGT TAC ATC GAA CTG GAT

192116 20

Leu Asn Ser Gly Lys lie Leu Glu

CTC AAC AGC GGT AAG ATC CTT GAG

Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Ala

5 AGT TTT CGC CCC GAA GAA CGC GCT

Lys Arg Asn Ser Asp Ser Glu Cys

AAA_ CGG AAT AGC GAT TCT GAG TGC

10 Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys

CCA CTG TCT CAC GAT GGC TAT TGT

Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr

CTG CAC GAC GGT GTT TGC ATG TAC

15

He Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala

ATC GAA GCT TTG GAT AAA TAC GCG

Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr lie

20 TGT AAC TGT GTA GTG GGT TAT ATC

Gyl Glu Arg Cys Gin Tyr Arg Asp

GGT GAA CGC TGT CAA TAC CGT GAT

25 Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg (stop)

CTG AAA TGG TGG GAA TTG CGT TAA

TAGTGAAGATCTGGATCCGTTTAGCGTTTTCCA

ATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGC

30 GCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAG

CAACTCGGTCGCCG CATAC

Op soortgelijke wijze vormt het volgens de methode 8-4-b verkregen plasmide pUG2101 een gefuseerd 35 eiwit met de volgende primaire structuur.

Met Ser lie Gin His Phe Arg Val

ATG AGT ATT CAA CAT TTC CGT GTC

40 Ala Leu lie Pro Phe Phe Ala Ala

GCC CTT ATT CCC TTT TTT GCG GCA

Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His

TTT TGC CTT CCT GTT TTT GCT CAC

45

Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys

CCA GAA ACG CTG GTG AAA GTA AAA

Asp Ala Glu Asp Gin Leu Gly Ala

50 GAT GCT GAA GAT CAG TTG GGT GCA

Arg Val Gly Tyr He Glu Leu Asp

CGA GTG GGT TAC ATC GAA CTG GAT

55 Leu Asn Ser Gly Lys He Leu Glu

CTC AAC AGC GGT AAG ATC CTT GAG

21 192116

Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe

AGT TTT CGC CCC GAA GAA CGT TTT

Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Vai

5 CCA ATG ATG AGC ACT TTT AAA GTT

Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser

CTG CTA TGT GGC GCG GTA TTA TCC

10 Arg Val Asp Ala Gly Gin Glu Gin

CGT GTT GAC GCC GGG CAA GAG CAA

Leu Gly Arg Arg He His Tyr Ser

CTC GGT CGC CGC ATA CAC TAT TCT

15

Gin Asn Asp lie Val Glu Tyr Ser

CAG AAT GAC TTG GTT GAG TAC TCA

Pro Val Thr Glu Lys His Leu Thr

20 CCA GTC ACA GAA AAG CAT CTT ACG

Asp Gly Met Thr Val Arg Glu Leu

GAT GGC ATG ACA GTA AGA GAA TTA

25 Cys Ser Ala Ala lie Thr Met Ser

TGC AGT GCT GCC ATA ACC ATG AGT

Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu

GAT AAC ACT GCG GCC AAC TTA CTT

30

Leu Thr Thr lie Ala Lys Arg Asn

CTG ACA ACG ATC_GCT_AAA_CGG AAT

Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser

35 AGC GAT TCT GAG TGC CCA CTG TCT

His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp

CAC GAT GGC TAT TGT CTG CAC GAC

40 Gly Val Cys Met Tyr lie Glu Ala

GGT GTT TGC ATG TAC ATC GAA GCT

Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys

TTG GAT AAA TAC GCG TGT AAC TGT

45

Val Val Gly Tyr lie Gly Glu Arg

GTA GTG GGT TAT ATC GGT GAA CGC

Cys Gin Tyr Arg Asp Leu Lys Trp

50 TGT CAA TAC CGT GAT CTG AAA TGG

Trp Glu Leu Arg (stop)

TGG GAA TTG CGT TAA TAGTGAAG AT C

192116 22

TGGATCCGTTTAGCGATCGGAGGACCGAAGG

AGCTAACCGCTTTTTTGCACA

Op soortgelijke wijze vormt het volgens de methode 8-4-c verkregen plasmide pUG2701 een gefuseerd eiwit met de volgende primaire structuur.

5

Met Ser lie Gin His Phe Arg Val

ATG AGT ATT CAA CAT TTC CGT GTC

Ala Leu lie Pro Phe Phe Ala Ala

10 GCC CTT ATT CCC TTT TTT GCG GCA

Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His

TTT TGC CTT CCT GTT TTT GCT CAC

15 Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys

CCA GAA ACG CTG GTG AAA GTA AAA

Asp Ala Glu Asp Gin Leu Gly Ala

GAT GCT GAA GAT CAG TTG GGT GCA

20

Arg Val Gly Tyr lie Glu Leu Asp

CGA GTG GGT TAC ATC GAA CTG GAT

Leu Asn Ser Gly Lys He Leu Glu

25 CTC AAC AGC GGT AAG ATC CTT GAG

Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe

AGT TTT CGC CCC GAA GAA CGT TTT

30 Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Val

CCA ATG ATG AGC ACT TTT AAA GTT

Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser

CTG CTA TGT GGC GCG GTA TTA TCC

35

Arg Val Asp Ala Gly Gin Glu Gin

CGT GTT GAC GCC GGG CAA GAG CAA

Leu Gly Arg Arg He His Tyr Ser

40 CTC GGT CGC CGC ATA CAC TAT TCT

Gin Asn Asp He Val Glu Ser Ala

CAG AAT GAC TTG GTT GAG TCG_GCT

45 Lys Arg Asn Ser Asp Ser Glu Cys

AAA_CGG AAT AGC GAT TCT GAG TGC

Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys

CCA CTG TCT CAC GAT GGC TAT TGT

50

Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr

CTG CAC GAC GGT GTT TGC ATG TAC

He Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala

55 ATC GAA GCT TTG GAT AAA TAC GCG

23 192116

Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr lie

TGT AAC TGT GTA GTG GGT TAT ATC

Gly Glu Arg Cys Gin Tyr Arg Asp

5 GGT GAA CGC TGT CAA TAC CGT GAT

Leu Lys Tip Tip Glu Leu Arg (stop)

CTG AAA TGG TGG GAA TTG CGT TAA

10 TAGTGAAGATCTGGATCCGTTTAGCCGACTCAC

CAGT CAC AGAAAAGCATCTTACGGAT

De voor de gefuseerde eiwitten coderende nucleotide-volgorden in de plasmiden pUG2101, pUG2301 en pUG2701 werden geanalyseerd volgens de Maxam-Gilbert-methode.

15 Foto 5 toont de resultaten van de analyse. In foto 5 tonen de banen 1 t/m 4 het met het Mlul-Pstl-fragment (224 b.p.) van pUG2101 verkregen resultaat, tonen de banen 5 t/m 8 het met het Mlul-EcoRI-fragment (721 b.p.) van pUG2101 verkregen resultaat, tonen de banen 9 t/m 12 het met het Mlul-BamHI-fragment (452 b.p.) van p(JG2301 verkregen resultaat, de banen 13 t/m 16 het met het Mlul-Pstl-fragment (335 b.p.) van pUG2701 verkregen resultaat en de banen 17 t/m 20 het met het Mlul-EcoRI-fragment (610 20 b.p.) van pUG2701 verkregen resultaat. De banen 1,5,9,13 en 17 tonen de reactieproducten voor guanide, de banen 2, 6, 10, 14 en 18 de reactieproducten voor guanine plus adenine, de banen 3, 7, 11,15 en 19 de reactieproducten voor thymine plus cytosine en de banen 4, 8,12, 16 en 20 de reactieproducten voor cytosine. Het met} gemarkeerde gedeelte is een adaptor.

8-5. Systeem voor de expressie van gefuseerd eiwit van β-lactamase en β-urogastron verbonden door 25 Arg-Lys.

8- 5-a. Bereiding van pUG1102 en pUG1105.

β-urogastron-gen werd opgenomen in het β-lactamase-gen van pBR322 op de enige Pvul-restrictie-plaats ter verkrijging van vectoren voor de expressie van gefuseerd eiwit van β-lactamase en β-urogastron, zoals weergegeven in figuur 15.

30 Het plasmide pBR322 werd gedurende 3 uur bij 37°C gesplitst met Pvul. Sommige van de plasmiden werden gecontroleerd door elektroforese met 1 gew.% agarosegel om te bevestigen, dat ze volledig gesplitst zijn. De adaptoren D-1-3 en D-3-2 werden gedurende 15 uur bij 12°C aan het fragment gekoppeld en het gekoppelde product werd vervolgens onderworpen aan elektroforese met 1 gew.%’s agarose-gel om een DNA-fragment te isoleren. Vervolgens werden het β-urogastronfragment en de vector gemengd met een 35 molaire verhouding van ongeveer 5:1 en gedurende 15 uur bij 12°C gekoppeld. Na de koppeling werd de stam HB101 met het verkregen plasmide getransformeerd en werden de kolonies gekozen met betrekking tot TcR.

Een en zeventig TcR getransformeerde kolonies werden verkregen en vervolgens gecontroleerd op hun Ap-gevoeligheid. Plasmide DNA werd bereid uit 20 APs-kolonies (28,2%) en vervolgens gecontroleerd op de 40 aanwezigheid van Mlul-restrictieplaats ter bevestiging van de opname van β-urogastron-gen. Gevonden werd, dat vijf van de 20 plasmiden de Mlul-plaats van β-urogastron-gen bevatten. Het DNA werd gesplitst met Hinfl en vervolgens onderworpen aan elektroforese met 1,5 gew.%’s agarosegel om de oriëntatie van de opname te controleren. Gevonden werd, dat twee van de plasmiden, n.l. pUG1102 en pUG1105 het gen in de juiste oriëntatie bevatten.

45 8-5-b. Bereiding van pUG1004, pUG 1201 en pUG1301.

De procedure 8-5-a werd herhaald onder toepassing van Pstl, Hindi en Xmnl in plaats van Puvl ter verkrijging van respectievelijk pUG1004, pUG1201 en pUG1301 zoals weergegeven in de figuren 16,17 en 18.

9. Bevestiging van de expressie van β-urogastron.

50 De aldus opgebouwde expressieplasmiden werden toegepast voor het transformeren van E.coli, HB101 of ECI-2, en de cellen werden gekweekt volgens de onderstaande methode, gevolgd door extradie en radio-immunologisch onderzoek ter bevestiging van de expressie.

9- 1. Kweek van recombinant-micro-organismen met β-urogastron-gen en extradie van eiwitten.

9-1-a. Expressiesysteem onder toepassing van PL-promotor.

55 De stam ECI-2 met het expressieplasmide pUG103-E en dezelfde stam met het expressieplasmide

pUG117-E werden elk bij 25°C gekweekt in twee kolven, die elk 1 liter LB kweekmedium bevatten. Wanneer de kweek in een van de kolven een absorptie van 0,3 bij 660 nm vertoonde, werd de kweek 1 uur bij 42°C

192116 24 onderworpen aan warmte-inductie. De kweek in de andere kolf werd voortdurend bij 25°C geïncubeerd tot de absorptie 0,4 bedroeg. De cellen in elke kolf werden verzameld, gewassen met PBS-buffer (137 mM natriumchloride, 2,7 mM kaliumchloride, 8,1 mMdibasisch natriumfosfaat en 1,5 mM monobasisch natriumfosfaat (pH 7,0», vervolgens opnieuw gesuspendeerd in PBS-buffer in 3 vol% van de hoeveelheid 5 van de oorspronkelijke kweek en vernietigd (gedurende 30 seconden bij 100 W, driemaal) door een sonicator (model 5202, product van Ohtake Works Co., Ltd., Japan) onder koelen met ijs. De door ultracentrifugeren (1 uur bij 40.000 g) van de celresten gescheiden bovenstaande vloeistof werd gediali-seerd tegen 0,01 N waterige azijnzuuroplossing en het dialysaat werd gevriesdroogd en vervolgens onderworpen aan radio-immunologisch onderzoek (hierna aangeduid als RIA).

10 9-1 -b. Systeem voorde expressie van gefuseerd eiwit.

De E.coli-stam HB101 met plasmiden pUG1004,1301,2101, 2303 of 2703 werd vooraf geïncubeerd bij 37°C in een kweekmedium, dat 50 pg/ml tetracycline bevat, vervolgens verdund tot een volumeverhouding van 1:100 met hetzelfde medium en gekweekt tot de absorptie bij 660 nm 0,4 bedroeg. De cellen werden verzameld, gewassen met PBS-buffer, vervolgens opnieuw gesuspendeerd in PBS-buffer in 3 vol% van de 15 hoeveelheid van de oorspronkelijke kweek en onderworpen aan sonische trillingen (bij 100 W gedurende 30 seconden, driemaal) met behulp van dezelfde sonicator als eerder vermeld onder koelen met ijs. De door ultracentrifugeren (1 uur bij 40.000 g) van de celresten gescheiden bovenstaande vloeistof werd gediali· seerd tegen 0,01 N waterige azijnzuuroplossing, gevriesdroogd en vervolgens onderworpen aan RIA.

Ter bevestiging van de ophoping van gefuseerd eiwit in het periplasma werd de periplasma-fractie bereid 20 volgens S.J. Chan et al. (Chan, S.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 78, 5401-5405 (1981)). Een gedeelte van de kweek werd verdund tot een volumeverhouding van 1:100 met vers E kweekmedium (1 liter waterige oplossing van 10 g dibasisch kaliumfosfaat, 3,5 g natriumammoniumwaterstoffosfaat, 0,2 g magnesiumsulfaatheptahydraat, 2 g citroenzuur, 2 g glucose, 0,23 g L-proline, 39,5 mg L-leucine, 16,85 mg thiamine en 20 mg tetracyclinehydrochloride) en vervolgens bij 37°C gekweekt tot de absorptie bij 660 nm 25 0,4 bedroeg. De cellen werden verzameld (6000 r.p.m., 10 min.) en tweemaal gewassen met een mengsel van 10 mM tris-HCI (pH 8,0) en 30 mM natriumchloride. De cellen (1 g) werden opnieuw gesuspendeerd in 80 ml 20 gew.%’s saccharose-30 mM tris-HSI (pH 8,0), waarna EDTA aan de suspensie werd toegevoegd in een concentratie van 1 mM. Het mengsel werd 10 minuten bij 180 r.p.m. (24°C) geschud met een roterend schudapparaat en vervolgens gecentrifugeerd (13.000 g, 10 minuten) om de cellen te verzamelen, 30 die opnieuw gesuspendeerd werden in 80 ml gedestilleerd water. De suspensie werd onder af en toe roeren gedurende 10 minuten in ijs gehouden en vervolgens gecentrifugeerd (13.000 g, 10 minuten). De bovenstaande vloeistof werd verzameld als periplasma-fractie (0-Sup). Het bezinksel werd gesuspendeerd in een mengsel van 10 mM tris-HCI (pH 8,0) en 30 mM natriumchloride en behandeld met dezelfde sonicator als in het voorafgaande ter verkrijging van een cytoplasma-fractie (0-Ppt). Deze monsters werden onderworpen 35 aan RIA.

9-2. Radio-immunologische proef.

9-2-a. Tot stand brengen van het RIA-systeem.

Konijnen werden geïmmuniseerd met gezuiverd menselijk β-urogastron als antigeen ter verkrijging van antiserum. Het β-urogastron (300 pg) werd opgelost in 0,2 ml gedestilleerd water, aan de oplossing werd 40 1,5 ml 50%’s polyvinylpyrrolidonoplossing toegevoegd en het mengsel werd 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Volledig Freund’s adjuvans (2,0 ml) werd aan het mengsel toegevoegd ter verkrijging van een emulsie, die subcutaan geïnjecteerd werd in het borstgedeelte van drie konijnen. Na viermaal elke 2 weken herhalen van de immunisatie werd voorts 50 pg van het antigeen intraveneus geïnjecteerd, het gehele bloed 3 dagen daarna verzameld en het serum afgescheiden.

45 Vervolgens werden de volgende RIA omstandigheden bepaald met het oog op de titratiekromme voor de bepaling van de verdunningsgraad van het antiserum voor de proef, de incubatietijd voor het optimaliseren van de proefomstandigheden, de methode voor het scheiden van het gebonden radio-actief gemerkte antigeen (gebonden) van het vrije radio-actief gemerkte antigeen (vrij), enz.

De toegepaste verdunningsoplossing was een fosfaatbuffer (10 mM, pH 7,4) die 0,5 gew.% runderserum-50 albumine (BSA), 140 mM natriumchloride en 25 mM dinatrium-EDTA bevatte. De verdunningsoplossing (400 μΙ), 100 μΙ van het monster of standaard menselijk β-urogastron en 100 μΙ antimenselijk β-urogastron-serum werden gemengd. Nadat het mengsel 24 uur bij 4°C was geïncubeerd werd 100 μΙ van een 125,-gemerkt menselijk β-urogastron-oplossing (ongeveer 5000 cpm) aan het mengsel toegevoegd. Nadat het mengsel verder 48 uur bij 4°C was geïncubeerd, werden 100 μΙ van een tweede antilichaam (anti-55 konijnen γ-globuline geitenserum) (20-voudige verdunning met PBS-buffer), 100 μΙ normaal konijnenserum (200-voudige verdunning met PBS-buffer) en 900 μ110 mM PBS-buffer met 5 gew.% polyethyleenglycol aan het verkregen mengsel toegevoegd, waarna het nog 3 uur bij 4°C werd geïncubeerd. De kweek werd 30 25 192116 minuten bij 3000 r.p.m. gecentrifugeerd, de bovenstaande vloeistof werd afgescheiden en het neerslag werd geteld. Het gehalte aan immunoreactieve stof als menselijk β-urogastron in het monster werd bepaald uit de met behulp van standaard menselijk β-urogastron verkregen standaardkromme.

9-2-b. Bevestiging van β-urogastron-productiviteit van het recombinant-micro-organisme.

5 Tabel 5 toont het resultaat van RIA voor het expressiesysteem met toepassing van XPL-promotor.

TABEL 5

Expressieplasmide Warmte-inductie Geproduceerde hoeveelheid 10 β-urogastron (n g/l van de kweek) pUG103-E ja 450,2 pUG103-E nee 3,2 pUG117-E ja 388,4 15 pUG117-E nee 3,2

Controle (pBR322) nee niet waarneembaar

Tabel 6 toont het resultaat van RIA voor gefuseerde eiwit-expressiesystemen.

20 TABEL 6

Expressieplasmide Geproduceerde hoeveelheid β-urogastron (pg/l van de kweek) 25 - pUG1004 729,6 pUG1301 650,7 pUG2101 31,3 PUG2301 125,2 30 pUG2701 119,2

Tabel 7 toont de lokalisatie van het geëxprimeerde gefuseerde eiwit.

35 TABEL 7

Expressieplasmide Geproduceerde hoeveelheid β-urogastron (pg/l van de kweek) 40 Periplasma-fractie Cytoplasma-fractie (0-Sup) (0-Ppt) PÜG1004 326,0 4,0 pUG1301 347,4 2,8 45 pUR2101 79,9 10,2 pUG2301 118,8 4,1 pUG2701 65,7 3,6 50 De tabellen 5 en 6 tonen, dat het X-PL-promotorsysteem voor directe expressie van β-urogastron en het systeem voor expressie van de verbinding als een gefuseerd eiwit beiden β-urogastron-immunoreactiviteit in E.coli exprimeerden. Tabel 7 toont, dat in het geval van gefuseerd eiwit, de geëxprimeerde β-urogastron-immunoreactiviteit vrijwel gelokaliseerd is in het periplasma.

Claims

192116 26 1. β-urogastron-genen met de volgende nucleotide-volgorde: 5' AAT AGC GAT TCT GAG T G C CCA CTG 5 3' T T A TCG CTA AGA CTC ACG GGT GAC TCT CAC GAT GGC TAT TGT CTG CAC AGA GTG CTA CCG ATA ACA GAC GTG

2. Een gen volgens conclusie 1, dat een herkenningsplaats voor restrictie-enzym bevestigd aan de voorzijde en/of achterzijde van het gen bevat.

3. Een gen volgens conclusie 2, dat een herkenningsplaats voor restrictie-enzym en een startcodon aan de voorzijde van het gen en/of een stopcodon en een herkenningsplaats voor restrictie-enzym aan de achterzijde van het gen bevat, waarbij de codons en de herkenningsplaatsen in de aangegeven volgorde 30 zijn opgesteld.

4. Een gen volgens conclusie 3, dat de volgende nucleotide-volgorde bezit: -15 -1, 1 5' AAT TCG AAG ATC TGC ATG AAT AGC 3' GC TTC TAG ACG TAC TTA TCG 35 10 20 30 GAT TCT GAG TGC CCA CTG TCT CAC CTA AGA CTC ACG GGT GAC AGA GTG 40 40 50 GAT GGC TAT TGT CTG CAC GAC GGT CTA CCG ATA ACA GAC GTG CTG CCA 60 70 80

45 GTT TGC ATG TAC ATC GAA GCT TTG CAA ACG TAC ATG TAG CTT CGA AAC 90 100 GAT A A A TAC GCG TGT AAC TGT GTA

50 CTA TTT ATG CGC ACA TTG ACA CAT 110 120 GTG GGT TAT ATC GGT GAA CGC TGT CAC CCA ATA TAG CCA CTT GCG ACA 55 27 192116 130 140 150 CAA TAC CGT GAT CTG AAA TGG TGG GTT ATG GCA C T A GAC TTT ACC ACC 5 160 170 G A A TTG CGT T A A TAG T G A AGA TCT CTT AAC GCA ATT ATC ACT TCT AGA G 3'

5. Een recombinant-plasmide met het in conclusie 4 gedefinieerde gen.

6. Werkwijze voor de bereiding van het recombinant-plasmide volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men de ondereenheid met de nudeotidevolgorde: 15 5' AAT TCG AAG ATC TGC ATG AAT AGC 3' GC TT C TAG ACG TAC TT A TCG GAT TCT GAG TGC CCA CTG TCT CAC CTA AGA CTC ACG GGT GAC AGA GTG 20 GAT GGC TAT TGT CTG CAC GAC GGT CTA CCG ATA ACA GAC GTG CTG CCA GTT TGC ATG TAC ATC GAA GCT TCG

25 CAA ACG TAC ATG TAG CTT CGA AGC 3' CTA G 5' 30 en de ondereenheid met de nudeotidevolgorde: 5' A GCT TTG GAT A A A TAC GCG TGT AAC CTA TTT ATG CGC ACA AAC TGT GTA GTG GGT TAT ATC GGT

35 TTG ACA CAT CAC CCA ATA TAG CCA GAA CGC TGT CAA TAC CGT GAT CTG CTT GCG ACA GTT ATG GCA CTA GAC

40. A A TGG TGG GAA TTG CGT TAA TAG TTT ACC ACC CTT AAC GCA ATT ATC TGA AGA TCT G 3' ACT TCT AGA CCT AG 5' 45 opneemt op een geschikte opnameplaats van een geschikte plasmidevector.

7. Een recombinant-plasmide, dat een plasmidevector met daarin opgenomen het in conclusie 4 gedefinieerde p-urogastron-gen bevat, waarbij in de plasmidevector voorts aan de voorzijde van het p-urogastron-gen een promotor voor de regeling van de expressie van het gen en een met de promotor verbonden

50 SD-volgorde zijn opgenomen.

8. Een recombinant-plasmide, dat een plasmidevector met de volgorde van de vierde en volgende basenparen van het in conclusie 4 gedefinieerde p-urogastron-gen bevat, waarbij in de plasmidevector de combinatie van een promotor, een SD-volgorde en een ander gen aan de voorzijde van het p-urogastron-gen is opgenomen.

9. Een recombinant-plasmide zoals gedefinieerd in conclusie 8, waarin het andere gen een p-lactamase-gen is.

10. Een recombinant-plasmide zoals gedefinieerd in conclusie 7 of 8, waarin de promotor λΡι. of lac UV5 is. 192116 28

10 CCT AG 5'

10 GAC GGT G TT TGC ATG TAC ATC GAA CTG CCA CAA ACG TAC ATG TAG CTT GCT TTG GAT A A A TAC GCG TGT AAC CGA AAC CTA TTT ATG CGC ACA TTG 15 TGT GTA GTG GGT TAT ATC GGT GAA ACA CAT CAC CCA ATA TAG CCA CTT CGC TGT CAA TAC CGT GAT CTG A A A

20 GCG ACA G TT ATG GCA CTA GAC TTT TGG TGG GAA TTG CGT 3' ACC ACC CTT AAC GCA 5', waarbij aan de voor- en/of achterzijde van deze sequentie nog andere sequenties aanwezig kunnen zijn.

11. Een recombinant-plasmide zoals gedefinieerd in conclusie 7 of 8, waarin de plasmidevector pBR322 is.

12. Een transformant, die een gastheercel met een recombinant-plasmide bevat, dat in staat is om het in conclusie 1 gedefinieerde β-urogastron-gen tot expressie te brengen.

13. Een transformant zoals gedefinieerd in conclusie 12, waarin het recombinant-plasmide het in conclusie 5 7 gedefinieerde recombinant-plasmide is.

14. Een transformant zoals gedefinieerd in conclusie 12, waarin het recombinant-plasmide het in conclusie 8 gedefinieerde recombinant-plasmide is.

15. Een transformant zoals gedefinieerd in conclusie 12, waarin de gastheercel E.coli is.

16. Een transformant zoals gedefinieerd in conclusie 12, waarin de gastheercel getransformeerd is met een 10 recombinant-plasmide met een TcR-gen en een CI857-gen.

17. Werkwijze voor de vorming van een transformant, met het kenmerk, dat men een gastheercel transformeert met een recombinant-plasmide, dat in staat is om het in conclusie 1 gedefinieerde β-urogastron-gen tot expressie te brengen.

18. Werkwijze voor de vorming van β-urogastron, met het kenmerk, dat men de in conclusie 12 gedefini-15 eerde transformant kweekt en het tot expressie gebrachte β-urogastron verzamelt. Hierbij 23 bladen tekening