JP2002500042A - 非同一遺伝子ならびに改良された分子アジュバントにおけるそれらの適用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はコドンの遺伝コードの第三の塩基の重複性のために、各々が少なくともアミノ酸３０個の同じポリペプチドをコードする、少なくとも２つの非同一ＤＮＡ配列の線状コンカテマーであって、該コンカテマーが、連続したリーディングフレーム中に該ポリペプチドのオリゴマーをコードする塩基配列を含む、または、からなる線状コンカテマーを提供する。単一の不変システインコドンが１つのＤＮＡ配列に付加され、ユニークな、対になっていないシステインを有するポリペプチド誘導体をコードしてもよい。コンカテマーが１つ以上の抗原をコードする１つ以上の配列と融合していてもよい。コンカテマーのＤＮＡ配列が補体Ｃ３フラグメントＣ３ｄまたはそのアナログをコードしてもよい。本発明はまた、コンカテマー核酸配列およびそれによってコードされるオリゴマーペプチドの発現用の調節配列または他の配列を含む発現ベクターならびに該発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、コンカテマーを投与するか、またはベクターを投与することでヒトまたは動物において抗原に対する免疫応答を誘発させる方法を提供することもできる。すなわち、本発明はＤＮＡワクチンの形態の医薬組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、拡張された反復配列を含有する多ドメイン蛋白、特に、分子アジュ
バントおよび免疫原の創製に有用な蛋白の発現または合成を可能にする新規遺伝
学的構築物に関する。

【０００２】 補体系は、外来抗原に対する免疫系の応答において重要な血清蛋白のセットか
らなっている。補体の主成分が開裂され、その生成物が単独または他の蛋白とと
もにさらなる補体蛋白を活性化して蛋白分解カスケードを生じさせる場合に補体
系が活性される。補体系の活性化は、血管透過性の増大、食細胞の化学走性、炎
症細胞の活性化、外来性粒子のオプソニン化、細胞の直接的殺傷ならびに組織の
ダメージを包含する種々の応答を引き起こす。補体系の活性化は、抗原−抗体複
合体により引き金が引かれることがあり（古典的経路）、あるいは細菌およびウ
イルスのごとき侵襲性生物の細胞壁の存在下で通常の遅い活性化が増幅されるこ
ともある（別経路）。補体系は、古典的経路および別経路のいずれにおいても中
心的蛋白であるＣ３を含む特殊な経路により細胞性免疫系と相互作用する。Ｃ３
の蛋白分解的活性化は、大きなフラグメント（Ｃ３ｂ）を生じさせ、化学的に反
応性のあるチオールエステル結合を露出させ、チオールエステルは、侵襲性生物
または外来性細胞の細胞表面蛋白のごとき外部求核体と反応して共有結合しうる
。結果として、潜在的な抗原はＣ３ｂでタグが付されるが、当該蛋白に結合した
ままであり、それはさらに蛋白分解を受けてｉＣ３ｂおよびＣ３Ｄ，ｇとなる。
後者のフラグメントは、それぞれ、補体受容体ＣＲ３およびＣＲ２のリガンドで
ある。かくして、Ｃ３ｂによる抗原の標識によって、これらの受容体を産生する
免疫系の細胞に対する標的機構が生じる。

【０００３】 かかる標的化が免疫応答の増大にとり重要であるということは、マウスの循環
Ｃ３を枯渇させ、ついで、抗原（ヒツジ・赤血球）で攻撃した実験により最初に
示されている。Ｃ３の除去は、この抗原に応答する抗体を減少させた（M. B. Pe
pys, J. Exp. Med, 140, 126-145, 1974）。Ｃ３を欠損させるかあるいはＣ３ｂ
を生じさせる補体カスケードの上流成分、すなわちＣ２およびＣ４を遺伝学的に
欠損させた動物における研究により、Ｃ３の役割が確認された（J. M. Ahearn &
D. T. Fearon, Adv. Immunol. 46, 183-219, 1989）。より最近になって、マウ
スにおいて、未修飾抗原対照と比較した場合、モデル抗原と２コピーよりも多い
ネズミＣ３ｄフラグメント配列とを直鎖状抱合体化させることにより抗体応答が
非常に増大する（１０００〜１００００倍）ことが示されている（P. W. Dempse
y et al, Science, 271: 348-350, 1996; WO96/17625, PCT/GB95/02851）。その
増大は、フロイントの完全アジュバントのごとき慣用的なアジュバントを用いず
に達成することができた。この著しい効果の機構は、Ｂ細胞上のＣＲ２への多価
Ｃ３ｄ構築物の高アフィニティー結合、その後の、ＣＲ２と、別のＢ細胞膜蛋白
であるＣＤ１９と、膜結合免疫グロブリンとの同時結合によるＢ細胞核へのシグ
ナル発生であることが示された。

【０００４】 これらの実験において、適当なコーディングプラスミドをＬ細胞中にトランス
フェクションし、ついで、高発現クローンを選択することにより、未修飾抗原対
照および１個または２個のＣ３ｄドメインを有する直鎖状融合物が調製された。
３個のＣ３ｄユニットを有する最も免疫原性のある構築物をＣＯＳ細胞中で一時
的に発現させなければならず、この手順は融合蛋白の収率が非常に低かった。一
部には、その低収率は、抗原を含有するが低分子量であり、３個のＣ３ｄユニッ
トよりも小さい種の生成によるものと考えられた。後者の分子が３個のＣ３ｄ構
築物の蛋白分解により生じたものであるか、あるいはそれらがインビボにおける
組み換えによるものであるかは、Dempseyらの公表された研究からは不明であっ た。

【０００５】 Dempseyらのものとは異なる発現系およびDempseyらのものと同じＣ３ｄ構築物
を用いて、我々は、３個のＣ３ｄリピートをコードするＤＮＡからの３個のＣ３
ｄユニットよりも小さい分子の生成が、相同組み換えによる１個またはそれ以上
のＣ３ｄユニットの消失によるものであり、翻訳後プロセッシングによるもので
はないという証拠を、今回得た（下記参照）。また、この観察結果により、Ｃ３
ｄモノマーの発現のための有効な発現系が確認された。

【０００６】 反復ＤＮＡ配列が複製中に転移する傾向にあるために、複数の反復配列を含む
高分子ポリペプチドの産生が困難であるということが、一般的に知られている。
プラスミド内部での反復性に対するいくつかの制限がGupta（Bio/Technology 1,
602-609, 1983）により議論された。Ferrariら（米国特許第５６４１６４８号 ）は、連結により濃縮されたモノマーユニットから構築された合成遺伝子を用い
て反復配列を発現させる方法を記載している。同じ反復アミノ酸配列をコードし
ているがモノマー中またはモノマー間でヌクレオチド配列が異なるＤＮＡ配列が
、遺伝学的コードの縮重を用いて構築された。ヌクレオチドレベルでの正確な反
復性の欠如が生じ、反復オリゴペプチド配列が発現されうるポイントに対する相
同組み換えが減少した。Ferrariらの研究は、多数反復される（典型的には〜３ ０回）４ないし３０コドン（アミノ酸）の比較的短い反復ユニットに限られてい
た。

【０００７】 本発明は、同一またはほとんど同一のアミノ酸配列をコードする異なるＤＮＡ
ユニットが濃縮され、発現されてドメインオリゴマーを生じるように、遺伝子全
体または遺伝子のフラグメント中に、特に、自律的にフォールディングする蛋白
ドメインまたは３０個よりも多いアミノ酸からなるモチーフをコードする遺伝子
全体または遺伝子フラグメント中に変化を導入するための一般的方法を記載する
。

【０００８】 本発明は以下の要素を含む： １．自律的にフォールディングするポリペプチドドメインをコードする新規合
成ＤＮＡ配列の構築、ならびに連続したリーディングフレームおよびアミノ酸配
列の保持に適合した遺伝学的コードにより可能となる各コドン中の第３塩基の最
大の縮重をこれらのＤＮＡ配列中において使用すること。これらのＤＮＡ分子の
混合物を「ファジーな遺伝子」という。 ２．これらのライブラリーを用いて、ＤＮＡリピートが互いに第３塩基位置に
おいて異なるコンカテマーを単離または設計すること。他の蛋白のイン−フレー
ムコーディング領域を伴ったあるいは伴わないこれらのコンカテマーを作成して
もよい。 ３．混合集団として、あるいは単一の特徴付けられたコンカテマーとして、こ
れらの配列を適当な発現ベクター中に入れて、組み換え宿主細胞中で集団を発現
させること。 ４．反復ドメイン発現蛋白生成物の存在を検出できるアッセイの使用。宿主細
胞クローンは、有用なレベルの機能的に活性のあるポリペプチドコンカテマー／
融合蛋白を産生しうるクローンについてスクリーニングされる。 ５．必要な場合には、これらのクローンに由来し、発現生成物をコードしてい
る１またはそれ以上のユニークなＤＮＡ配列を特徴付けること。 ６．発現生成物中の単一のシステイン残基のユニークな化学反応性を用いて、
ＤＮＡレベルでのコンカテマー化と組み合わされた翻訳後の化学修飾によって複
数コピーのドメインを有する蛋白誘導体を集めること。

【０００９】 本発明の特定の具体例において、自律的にフォールディングする反復蛋白ドメ
インは、免疫系の調節に関与している１またはそれ以上の細胞表面受容体のリガ
ンドである。そのような例はヒトまたはネズミのＣ３ｄまたはＣ３ｄ，ｇポリペ
プチド配列あるいはＣＲ２（ＣＤ２１）またはＣＤ１９の別のペプチドリガンド
である。

【００１０】 第２の具体例において、さらなるドメインが免疫原、特に、抗原性蛋白または
蛋白の領域であってもよい。ポリペプチド免疫原の例は、Ｂ型肝炎表面抗原、メ
ニンゴコッカス表面蛋白、マラリア寄生体の生活環の種々の段階で発現される蛋
白、ストレプトコッカスのグルコシルトランスフェラーゼのグルカン結合領域、
インフルエンザウイルス株の赤血球凝集素（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）
蛋白ならびにスタフィロコッカスのフィブロネクチン結合蛋白のＤ−リピート領
域を包含するが、これらに限らない。 所望により、抗原オリゴマーをＣ３ｄオリゴマーに融合させ、一方または両方
の成分をファジーな遺伝子または部分的にファージな遺伝子から発現させてもよ
い。

【００１１】 第３の態様において、発現されたオリゴマー蛋白を誘導体化して、抗原または
他の蛋白への翻訳後の連結を容易ならしめてもよい。好ましくは、オリゴマー中
のユニークな部位、好ましくはＣまたはＮ末端において遊離システインまたはチ
オエステル基のごとき反応性残基を処理することによりかかる誘導体化を行う。

【００１２】 さらなる態様において、本発明は、ほとんど同一のアミノ酸配列をコードする
ファジーなＤＮＡ配列の連結により密接に関連したポリペプチドを単一の直鎖状
分子として発現させることを提供する。この意味において、ほとんど同一とは、
アミノ酸の全数のうち少なくとも１個であるが１０％を超えないアミノ酸が異な
ることにより異なっている配列を意味する。かかる構築物の例は、蛋白または抗
原の数種の変異体をコードする遺伝子、ならびに類似の全体構造を有するが相補
性決定領域において小規模な変化を有していて異なった抗原を認識する濃縮され
た免疫グロブリン１本鎖Ｆｖフラグメントをコードする遺伝子を包含するが、こ
れらに限らない。

【００１３】 本発明のもう１の具体例は、上記選択方法により同定された新規ＤＮＡ配列を
、遺伝学的（ＤＮＡ）免疫化のための発現ベクターの成分として使用するもので
ある。この適用において、一定の細胞タイプ（ヒト細胞系のごとき）における発
現に好ましいＤＮＡ配列を、ファジーなＤＮＡまたは部分的にファジーなＤＮＡ
のプール（適当なベクター中に入れてある）でトランスフェクションされたタイ
プの細胞を所望構築物の発現に関してスクリーニングすることにより同定する。
発現され、誘導体化されたＣ３ｄ（または他の蛋白）のオリゴマーをカチオン性
脂質、リポペプチドまたはリポソームのごときＤＮＡ結合分子に化学的に連結し
て、ＤＮＡ免疫化のためのベクターは特定の細胞タイプに標的化されうるように
することにより、この適用をさらに拡張してもよい。かくして、例えば、（Ｃ３
ｄ）₃−抗原融合物をコードするＤＮＡを含有するリポソームに連結されたＣ３ ｄトリマーを樹状細胞に対して標的化することができる。ついで、樹状細胞によ
る構築物の発現により、さらにＢ系細胞を限定的に標的とする抗原が提示され、
このようにして二重のレベルの選択性が達成されうる。 上記工程は下記の一般的方法を包含する。

【００１４】 本発明は、本発明のオリゴマーポリペプチドを製造する方法を提供し、該方法
は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み換え宿主細胞中で発現させ、つい
で、生成物を回収することを含む。当該方法は以下の工程を含んでいてもよい： （ｉ）宿主細胞中で、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤ
ＮＡポリマーを発現しうる可変できる複製可能な発現ベクターを調製し； （ｉｉ）該ベクターで宿主を形質転換し； （ｉｉｉ）該ＤＮＡポリマーの発現を可能にする条件下で該形質転換宿主を培
養して該ポリペプチドを産生させ；ついで （ｉｖ）活性形態の該ポリペプチドを回収する。

【００１５】 該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する変異体ＤＮＡポリマ
ーもまた、本発明の一部を形成する。 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual 2nd Edition. C
old Spring Harbor Press (1989)ならびにDNA Cloning vols I, IIおよびIII（D
. M. Glover ed., IRL Press Ltd.）に記載されたような慣用的な組換え法を用 いて本発明方法をを行ってもよい。 本発明は、適切なモノ−、ジ−またはオリゴマーヌクレオチド単位の縮合によ
ってＤＮＡポリマーを調製する方法も提供する。 調製を、インビトロまたはインビボにて、適当に、化学的に、酵素的に、また
は２つの方法を組み合わせて、行うことができる。それゆえ、ＤＮＡポリマーを
、D. M. Roberts et al., Biochemistry 1985, 24, 5090-5098に記載されるよう
な慣用の方法により、適当なＤＮＡフラグメントの酵素的ライゲーションにより
調製できる。

【００１６】 ＤＮＡフラグメントを、適当な制限酵素で必要なヌクレオチドの配列を含むＤ
ＮＡを消化することにより、化学的合成により、酵素的ポリマー化により、また
はこれらの方法の組み合わせにより、得ることができる。 制限酵素での消化を、適当な緩衝液中、２０〜７０℃の温度にて、一般に５０
μｌ以下の容量中、０．１〜１０μｇのＤＮＡで、行ってもよい。ＤＮＡの酵素
的ポリマー化を、インビトロで、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント
）などのＤＮＡポリメラーゼを用い、必要に応じて、ヌクレオシド三リン酸、ｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む適当な緩衝液中、１０〜３７
℃の温度にて、一般に５０μｌ以下の容積で、行ってもよい。ＤＮＡフラグメン
トの酵素的ライゲーションをＴ４ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼを用い、
適当な緩衝液中、４℃〜３７℃の温度にて、一般に５０μｌ以下の容積で、行っ
てもよい。

【００１７】 ＤＮＡポリマーまたはフラグメントの化学的合成を、慣用のリン酸トリエステ
ル、ホスファイトまたはホスホラミダイト化学反応により、‘Chemical and Enz
ymatic Synthesis of Gene Fragments-A Laboratory Manual'(ed. H. G. Gassen
and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim(1982)または他の科学的刊行物、例え
ば、M. J. Gait. H. W. D. Matthes M. Singh, B. S. Sproat and R. C. Titmas
, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B. S. Sproat and W. Bannwarth,
Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M. D. Matteucci and M. H. Caruther
s, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M. D. Matteucci and M. H. Caruthe
r, Journal of the American Chemical Society 1981, 103, 3185; S. P. Admas
et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N. D.
Sinha, J. Biernat, J. McMannus and H. Koester, Nucleic Acids Rearch, 19
84, 12, 4539; およびH. W. D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801 などに記載されるような固相技術を用い、行ってもよい。好ましくは、自動化Ｄ
ＮＡ合成機（例えば、Applied Biosystems 381A Synthesiser)を用いる。

【００１８】 好ましくは、ＤＮＡポリマーをポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を共に含
む２以上のＤＮＡ分子をライゲートして調製する。ＤＮＡ分子を、必要なコーデ
ィング配列を有するベクターの適当な制限酵素による消化により得ることができ
る。 ＤＮＡ分子の正確な構造およびそれらを得る方法は、所望の生成物の構造によ
る。ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの化学
的合成、酵素的ポリマー化、制限酵素消化およびライゲーションを含むさまざま
な方法を用いて構築することができる。ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の
構築の適当な手法の設計は、当業者の慣用の方法である。 第３塩基使用の系統的な多様性を、以下にさらに詳細に記載し（例３、表１）
、また特定の宿主細胞の稀に使用されるコドンに対してさらなる考察を行うこと
ができる。

【００１９】 組換え宿主細胞においてポリペプチドをコードするＤＮＡポリマーの発現を、
宿主中にてＤＮＡポリマーを発現可能な、複製可能な発現ベクター手段により、
行ってもよい。発現ベクターは新規であり、また本発明の部分を形成する。 複製可能な発現ベクターを、本発明にしたがって、宿主細胞に適するベクター
を開裂して、完全なレプリコンを有する線状ＤＮＡセグメントを得て、該線状フ
ラグメントを、該線状セグメントとともにポリペプチドをコードする一以上のＤ
ＮＡ分子と、ライゲーション条件下で結合させることにより、調製してもよい。 線状セグメントと１以上のＤＮＡ分子とのライゲーションを、所望により、同
時にまたは連続的に行ってもよい。それゆえ、所望により、ＤＮＡポリマーを事
前に形成するか、またはベクターの構築中に形成してもよい。ベクターの選択は
、イー・コリなどの原核細胞、またはマウスＣ１２７、マウスミエローマ、チャ
イニーズハムスター卵巣もしくはその他の真核細胞（真菌、例えば繊維状真菌も
しくは単細胞酵母、またはドロソフィラ（Drosophila）もしくはスポドプテラ（
Spodoptera）などの昆虫細胞）であってもよい宿主細胞によりある程度決定され
る。宿主細胞は、トランスジェニック動物中にあってもよい。適当なベクターに
は、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、および例えばバキュロウイル
スもしくはワクシニア由来の組換えウイルスが包含される。

【００２０】 ＤＮＡポリマーを、フラグメントを発現する安定な形質転換哺乳動物細胞系の
単離用に設計されたベクター、例えば、マウスＣ１２７細胞におけるウシ乳頭腫
ウイルス、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞における増幅ベクター中に組
み込んでもよい（DNA Cloning Vol. II D. M. Glover ed. IRL Press 1985; Kau
fman, R. J. et al., Molecular and Cellular Biology 5, 1750-1759, 1985; P
avlakis G. N. and Hamer, D. H. Proceedings of the National Academy of Sc
iences(USA) 80, 397-401, 1983; Goeddel, D. V. et al., European Patent Ap
plication No. 0093619, 1983)。

【００２１】 複製可能な発現ベクターの調製を、例えばSambrook et al.(前掲）に記載され
る手法により、ＤＮＡの制限、ポリマー化およびライゲーション用の適当な酵素
を用いて、慣用的に行ってもよい。ポリマー化およびライゲーションをＤＮＡポ
リマーの調製について上記したように行ってもよい。制限酵素での消化を、適当
な緩衝液中、２０〜７０℃の温度にて、一般に５０μｌ以下の容量で、０．１〜
１０μｇのＤＮＡで行ってもよい。 組換え宿主細胞を、本発明にしたがって、形質転換条件下に、本発明の複製可
能な発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより調製する。適当な形質転
換条件は、慣用であり、例えば、Sambrook et al.（前掲)、または "DNA Clonin
g" Vol. II. D. M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985に記載されている。

【００２２】 形質転換条件の選択は宿主細胞により決定される。それゆえ、イー・コリなど
の細菌宿主を、ＣａＣｌ₂の溶液(Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973,
69, 2110）またはＲｂＣｌ、ＭｎＣｌ₂、酢酸カリウムおよびグリセロールの混
合物を含む溶液で処理し、ついで３−[Ｎ−モルホリノ]−プロパン−スルホン酸
、ＲｂＣｌおよびグリセロールで処理するか、または、例えば、Bio-Rad Labora
tories, Richmond, California, USA, manufacturers of an electroporator に
記載のエレクトロポレーションにより処理してもよい。培養中の真核細胞を、当
該細胞へのベクターＤＮＡのカルシウム共沈により、またはカチオン性リポソー
ムを用いることにより、形質転換させてもよい。 本発明はまた、本発明の様々な複製可能な発現ベクターで形質転換した宿主細
胞にもわたる。 ＤＮＡポリマーの発現が可能な条件下での形質転換宿主細胞の培養を、例えば
、Sambrook et al.および "DNA Cloning"（前掲)に記載されるように慣用的に行
う。それゆえ、好ましくは、細胞に栄養分を供給し、４５℃以下の温度にて培養
する。

【００２３】 タンパク質産物を、宿主細胞に応じて慣用の方法により回収する。それゆえ、
宿主細胞がイー・コリなどの細菌細胞であり、タンパク質が細胞内に発現される
場合、物理的、化学的または酵素的に細胞を溶解させ、その結果得られる溶解物
からタンパク質産物を単離してもよい。宿主細胞が真核細胞である場合、通常、
産物を栄養培地から単離する。 宿主細胞がイー・コリなどの細菌細胞である場合、培養から得られる産物を最
適機能活性のために折りたたむことが必要であり得る。タンパク質が封入体とし
て発現されるとき、もっともこの可能性がある。重要であると考えられる単離お
よび折りたたみ方法の多数の態様がある。特に、混入タンパク質との凝集形成を
最小とし、ポリペプチドの間違った折りたたみを最小とするために、好ましくは
ポリペプチドを、折りたたみの前に部分的に精製する。それゆえ、特異的に封入
体を単離することにより、混入しているイー・コリのタンパク質を除去し、続け
て折りたたみの前にさらに精製することは、当該方法の重要な態様である。

【００２４】 折りたたみ操作をポリペプチドの中間−折りたたみ状態の凝集を最小とするよ
うに行う。それゆえ、なかでも、塩型および濃度、温度、タンパク質濃度、酸化
還元緩衝液の濃度および折りたたみ時間を注意深く考慮する必要がある。あらゆ
る所定のポリペプチドについての正確な条件は、一般に予測不可能であり、実験
により決定しなければならない。 封入体からのタンパク質の折りたたみに利用可能な多数の方法があり、これら
はこの分野における当業者に知られている。一般に、該方法は、８Ｍ 尿素また は６Ｍ 塩酸グアニジンなどの高濃度の変性剤の存在下で、例えば５０ｍＭ ２−
メルカプトエタノールを用いて封入体中のすべてのジスルフィド結合を壊すこと
を包含する。次の工程では、これらの薬剤を除去し、タンパク質の折りたたみが
起こるようにする。ジスルフィド架橋の形成は酸化環境を必要とし、これを、例
えば空気により、または適当な酸化還元系、例えば還元および酸化グルタチオン
の混合物などの組み込みにより、提供してもよい。

【００２５】 好ましくは、封入体をメルカプトエタノールの存在下、８Ｍ 尿素を用いて可 溶化し、はじめに冷緩衝液の添加により混入タンパク質を除去した後に、タンパ
ク質を折りたたむ。好ましい緩衝液は、１ｍＭ 還元グルタチオンおよび０．５ ｍＭ 酸化グルタチオンを含有する６０ｍＭ エタノールアミンである。理想的に
は、機能的に活性なタンパク質産物を得るために、緩衝液の性質を実験的に決定
する。折りたたみを、好ましくは、１〜５℃の範囲の温度にて、１〜４日間にわ
たって行う。 冷緩衝液の添加にかえて、完全に還元されたタンパク質を、室温でセファデッ
クスＧ２５媒質（Sephadex G25 Medium）を用いて、例えば０．３Ｍエタノール アミン／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１ｍＭシステインＵＳＰ／２ｍＭ Ｌ−シスチン ２ ＨＣｌ（ｐＨ調整不要）へ、緩衝液交換する。当該溶液は、不純物のレベルに依
存して、清澄またはわずかに濁っており、これを約２〜３℃で１〜４日間静置す
る。上記のように、正確な緩衝液条件および温度は、各タンパク質について実験
的に決定すべきであり、上記のものに限らない。

【００２６】 何らかの沈澱または凝集が観察される場合、多くの方法、例えば、遠心分離、
または硫酸アンモニウムなどの沈澱剤での処理により、凝集タンパク質を除去で
きる。 本発明の誘導体のポリペプチド部分にＣ−末端システインを含有させ、翻訳後
修飾を容易にしてもよい。中程度の大きさ(〜７０ｋＤａまで）で、＜〜８ジス ルフィド架橋を有するいくつかのタンパク質については、細菌系における発現が
好ましい。遊離の末端Ｃｙｓが折りたたみまたは安定性の問題を引き起こす、よ
り複雑なタンパク質には、真核細胞系における発現が必要であり得る。 ポリペプチド部分をコードする組換えバキュロウイルスで感染した昆虫細胞の
使用もまた、より複雑なタンパク質の調製、時に本発明のＣ３ｄオリゴマーにと
って、好ましい一般的な方法である。 システインで誘導されるタンパク質の取り扱いの好ましい方法は、以下に一般
的に記載されるようなメルカプトエタノールもしくはグルタチオンと混合したジ
スルフィド、または、２−ニトロ，５−カルボキシフェニルチオ−誘導体のよう
なものである。

【００２７】 本発明のオリゴマーポリペプチド誘導体が単独のシステインを含む場合、独特
のシステインを含む第２のポリペプチドへの化学的結合を利用できる。架橋を、
慣用のジスルフィド交換化学反応により、一方のポリペプチドのチオールの活性
化および当該活性化チオールと他方のポリペプチドの遊離チオールとの反応によ
って、生じさせる。かかる活性化方法は、Ｓ−Ｓ架橋の開裂時に安定なチオレー
トアニオンを形成するジスルフィドを使用し、チオールとさらに反応できる中間
体混合ジスルフィドを形成して安定なジスルフィド架橋を与える２，２’−ジチ
オピリジンおよび５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）
などの試薬を包含する。本方法において活性化された一方のポリペプチドは、つ
いで、遊離チオールを含む第２のポリペプチドと反応する。ｐＨ、温度、緩衝液
および反応時間の正確な条件は、使用する試薬と修飾されるポリペプチドの性質
に依存する。ポリペプチド結合反応を、およそ等モル比の中性緩衝液中での修飾
ポリペプチドの混合によって行うことが好ましい。好ましくは、窒素雰囲気下で
当該反応を行わせるべきである。好ましくは、カップリングをモニターできるＵ
Ｖ−活性産物を生産する（例えば、２−ピリジル ジチオ誘導体からのピリジン
２−チオンの脱離に由来）。

【００２８】 結合反応の後、ポリペプチド結合体を、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィーまたは疎水相互作用クロマトグラフィ
ーのような多くのクロマトグラフの方法によって単離できる。これらの方法を低
圧または高処理の変形のいずれかで行うことができる。 結合体を、低圧力もしくは高処理ゲル濾過、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動または等電点電気泳動を含む多くの技術により性質決定してもよい。 したがって、さらなる態様においては、本発明は、本発明に従い誘導体を調製
する方法を提供し、本方法は、組換え宿主細胞における当該誘導体のオリゴマー
ポリペプチド部分をコードするＤＮＡの発現を含み、生産物の回収およびその後
のポリペプチドの誘導抗原またはその他のポリペプチドへのポリペプチドの翻訳
後結合を含む。

【００２９】 実施例において使用する一般的方法 （ｉ）ＤＮＡの切断 制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断を、供給される緩衝液を使用して
製造者の説明書に従って実施した（New England Biolabs (U.K.) Ltd., Hertsま
たはPromega Ltd., Hants, UK）。緩衝液条件が両方の酵素に適切である場合は 、二重消化を同時に実施した。そうでなければ二重消化を連続的に行い、その場
合、最低塩条件を必要とする酵素を最初に消化物に加えた。消化が完了すると、
塩濃度を変化させ、第２の酵素を加えた。

【００３０】 （ｉｉ）ＤＮＡの連結 PromegaまたはNew England Biolabsから購入したＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用 して、Sambrook et al, (1989) Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd
Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Pressに記載されるように連結を実 施した。

【００３１】 （iii）プラスミドの単離 プラスミドを、Wizard^TM Plus Minipreps（Promega）、またはQiex miniもし くはmidiキットおよびQiagen Plasmid Maxiキット（QIAGEN, Surrey）を使用し て、製造者の説明書に従って単離した。 Ｃ３ｄモノマーをコードするプラスミドｐＳＧ．Ｃ３ｄ₁．ＹＬおよびＣ３ｄ トリマーをコードするプラスミドｐＳＧ．（Ｃ３ｄ）₃．ＹＬを、University of
CambridgeのD.T. Fearon教授から得た。

【００３２】 （ｉｖ）ＤＮＡフラグメントの単離 アガロースゲルからＤＮＡフラグメントを切り出し、QIAEXゲル抽出キットも しくはQiaquick（QIAGEN, Surrey, UK）またはGeneClean、GeneClean Spin Kit 、MERmaid KitもしくはMERmaid Spin Kit（Bio 101 Inc, CA, USA）ゲル抽出キ ットを製造者の説明書に従って使用してＤＮＡを抽出した。

【００３３】 （ｖ）ＤＮＡのイー・コリへの導入 プラスミドを、コンピテントなイー・コリ（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）ま たはＸＬ−１−ｂｌｕｅ株（Studier and Moffat, (1986), J. Mol. Biol. 189:
113）中に形質転換した。イー．コリ株はStraragene（Cambridge, UL）から凍 結コンピテント培養物として購入した。

【００３４】 （ｖｉ）ＤＮＡ配列決定 配列を、Perkin Elmer ABI Prism 373 DNAシークエンサーにより分析した。こ
れは、３６ｃｍ×０．２ｍｍ ４％アクリルアミドゲルを使用する電気泳動技術
であり、蛍光標識したＤＮＡフラグメントを、製造者の説明書に従って、チャー
ジ結合装置カメラ（charge coupled device camera）により検出した。

【００３５】 （ｖｉｉ）オリゴヌクレオチドの製造 Cruachem, Glasgow, UKよりオリゴヌクレオチドを購入した。

【００３６】 （ｖｉｉｉ）バキュロウイルスベクターの生成 名称のはじめにｐＢＰを有する本発明において記載するプラスミド（例えば、
下記のｐＢＰ６８−０１）を、下記の方法（節（ｖｉｉｉ）〜（ｘ））によるバ
キュロウイルスベクターの生成およびコードされる組換えポリペプチドの発現の
ために使用する。精製プラスミドＤＮＡを、キット「The BacPak Baculovirus E
xpression System」を製造者のプロトコル（Clontech, CA, USA）に従って使用 する組換えバキュロウイルスの生成に使用した。昆虫細胞株Ｓｆ９（ＡＴＣＣ）
を、製造者の推奨に従って酵母エキス、脂質およびプロニックＦ６８（全てSigm
a）ならびに１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Gibco, Paisley, UK）を補充したＩ ＰＬ−４１培地（Sigma, Dorset, UK）（これを増殖培地と称する）中で増殖さ せた。細胞を線状化したバキュロウイルスＤＮＡ（キット中に供給される）およ
び精製プラスミドを用いてトランスフェクトした。プラークアッセイ（下記方法
を参照のこと）を培養上清およびその１０倍段階希釈物に対して実施して、単一
プラークの単離を可能にした。ガラスパスツールピペットを使用してプラークを
拾い、０．５ｍｌアリコートの増殖培地中に移した。これが１次種ストックであ
る。

【００３７】 （ｉｘ）バキュロウイルスのプラークアッセイ １×１０⁶個のＳｆ９細胞を単層培養物として３０ｍｍプレート中に播種し、 少なくとも３０分間付着させた。培地を流し出し、１００μｌの増殖培地中のウ
イルス接種物を単層の表面に滴下した。プレートを、単層の乾燥を防止するため
に時々傾けながら、３０分間室温でインキュベートした。単層に、３７℃に温め
た１ｍｌの増殖培地および３％（ｗ／ｖ）の「Seaplaque」アガロース（FMC, ME
）の混合物を重層し、穏やかに撹拌して接種物中に混合した。固定後、１ｍｌの
増殖培地の液体重層をのせた。プレートを湿潤雰囲気下で３〜５日間インキュベ
ートした。 １％（ｗ／ｖ）のストック溶液（Sigma, Dorset, UK）からのニュートラルレ ッド溶液を０．１％（ｗ／ｖ）含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍ
ｌの液体重層を添加することによって、プラークを可視化した。プラークは直径
３ｍｍまでの染色なしの円形領域として見える。

【００３８】 （ｘ）バキュロウイルスベクターのスケールアップおよびタンパク質の発現 ２００μｌの１次種ストックを使用して、３０ｍｍプレート中の１×１０⁶個 のＳｆ９単層細胞培養物を感染させた。種ストックを単層に滴下し、２０分間室
温でインキュベートし、次いで１ｍｌの増殖培地とともに重層した。プレートを
２７℃で湿潤雰囲気下で３〜５日間インキュベートした。これらの培養物由来の
上清は継代１ウイルスストックである。ウイルス力価をプラークアッセイによっ
て測定し、感染多重度（ｍｏｉ）０．１で単層培養物または浮遊培養物に感染さ
せることによって、さらにスケールアップした。欠損ウイルスの出現を最小にす
るために、ウイルスストックを最大６回まで継代した。 ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するかまたは含有しない増殖培地中での単層培
養物または浮遊培養物の感染によって、組換えタンパク質を発現させた。ＦＣＳ
を含まない場合、ＦＣＳ非存在下での増殖に馴化した細胞を使用した。継代１〜
６のウイルスストックを使用して、細胞当りｍｏｉ＞５で培養物を感染させた。
代表的には、感染した培養物を感染後７２時間目に回収し、組換えタンパク質を
上清または細胞のいずれかから単離した。

【００３９】 （ｘｉ）バキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞中で発現させた（Ｃ３ｄ
）３の安定改変体の選択 １個以上のファジーＣ３ｄドメインを含む未特徴付けＣ３ｄコンカテマーをコ
ードするバキュロウイルス移入ベクタープラスミドを、コンピテントなイー・コ
リＸＬ１−ｂｌｕｅ株中に方法（ｖ）に従って形質転換する。得られたコロニー
は各々単一の単離物を含有し、これは１個以上のファジーＣ３ｄドメインを含有
してもよく、またｐＳＧ．Ｃ３ｄ．ＹＬ由来のもとのＤＮＡ配列を有する１コピ
ーのＣ３ｄを含有してもよい。個々のコロニーをスケールアップし、ＤＮＡを方
法（ｉｉｉ）（ミニプレップ法）に従って抽出する。ＤＮＡのアリコートを製造
者のプロトコルの以下の改変を使用してＢａｃＰａｋ６線状ＤＮＡとともに昆虫
細胞中に同時トランスフェクトする：２×１０⁵個のＳｆ９細胞を平底マイクロ タイタープレート中に播種し、３０分間無血清培地中で付着させる。細胞を血清
含有培地中で増殖させる場合は、単層を無血清培地で３回洗浄する。各ウェル中
の培地の容量を標準容量に調整する（代表的には５０〜１５０μｌ）。 ミニプレッププラスミドＤＮＡの各プラスミド単離物０．５μｌを取り（０．
５〜５μｇ／ｕｌの範囲の濃度）、０．１μｌ〜２μｌのＢａｃＰａｋ６ ＤＮ
Ａ（Clontech）（供給された濃度）および５〜２５μｌの５０μｇ／ｍｌのLipo
fectin試薬（Life Technologies Inc.）と混合し、室温で１５分間インキュベー
トして、Lipofectin／ＤＮＡ複合体を形成させる。この混合物を単一のマイクロ
タイターウェル中の培地の表面に滴下し、穏やかにピペットチップを用いて撹拌
する。単一マイクロタイターディッシュに９６個までのプラスミド単離物のトラ
ンスフェクションを含めてもよい。トランスフェクションを湿潤雰囲気下２７℃
で５時間インキュベートする。 次いで、Lipofectin／ＤＮＡを含有する培地を単層から除去し、１００μｌの
培地に交換する。この培地は、後のアッセイに干渉しそうであると考えられなけ
れば１％ＦＣＳを含有してもよい。プレートを湿潤雰囲気下２７℃で３〜５日間
インキュベートする。３日後、プレートをバキュロウイルス感染の証拠について
目視検査する。有意な数のウェルが感染の徴候を示す場合（遅延した細胞増殖お
よび大型化したかまたはダンベル型になった細胞）、培養上清のアリコートを各
ウェルから回収し、後の拡大用に滅菌条件下で貯蔵する。培養上清または細胞の
さらなるアリコートを生化学的アッセイまたは生物学的アッセイに供して、Ｃ３
ｄモノマーおよびオリゴマーの有無を決定する。例えば、上清の２０μｌアリコ
ートをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはウエスタンブロッティング（方法節（ｘ
ｉｉ）および（ｘｉｖ）を参照のこと）に供してもよい。 （Ｃ３ｄ）３の有意な収量を示す選択したクローンを方法（ｘ）に従って貯蔵
した上清からスケールアップする。選択したクローンに対応するプラスミドをま
た、方法（ｉｉｉ）に従って大規模プラスミドＤＮＡ抽出のためにスケールアッ
プし、方法（ｖｉ）に従って配列決定する。

【００４０】 （ｘｉｉ）ｐＢＲＯＣ４１３ プラスミドｐＴ７−７［Tabor,S. (1990), Current Protocols in Molecular
Biology, F. A. Ausubel, Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidma
n, J. A. Smith, and K. Struhl, (eds). pp. 16.2.1-16.2.11, Greene Publish
ing and Wiley-Interscience, New York］は、ｐＢＲ３２２のヌクレオチド２０
６５〜４３６２に対応するＤＮＡを含有し、ｐＢＲ３２２同様、第３のプラスミ
ドＣｏＩＫの存在下で接合性プラスミドにより移動させることができる。ＣｏＩ
Ｋによりコードされる移動タンパク質はｐＢＲ３２２のヌクレオチド２２５４の
ｎｉｃ部位に作用し、この点から移動を開始させる。ｐＴ７−７をＬｓｐＩおよ
びＢｇｌＩＩで消化し、突出５’末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラ
グメントで埋めた。プラスミドＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動に
より精製し、平滑末端を一緒に連結し、製造者の推奨する条件に従ってBio-Rad
Gene Pulserを使用したエレクトロポレーションによりイー・コリＤＨ１に形質 転換した。得られたプラスミドｐＢＲＯＣ４１３をプラスミドＤＮＡの制限酵素
分析により同定した。 ｐＢＲＯＣ４１３におけるｆ１０プロモーターのすぐ上流のＬｓｐＩ部位から
ｐＴ７−７のヌクレオチド４３４のＢｇｌＩＩ部位までの欠失は、ｐＢＲ３２２
のヌクレオチド２０６５〜２２９７に対応するＤＮＡを欠失させる。それゆえ、
ｎｉｃ部位および隣接する配列は欠失され、ｐＢＲＯＣ４１３は非移動性となっ
ている。

【００４１】 （ｘｉｉｉ）ｐＤＢ１０１３ ｐＢＲＯＣ４１３の誘導体であるこのプラスミドの構築は、Dodd et al (1995
) Protein Expression and Purification 6: 727-736に十分に記載されている。

【００４２】 （ｘｉｖ）タンパク質の精製 例えば、標的タンパク質の精製のために適切な緩衝系および勾配を利用したイ
オン交換および疎水性相互作用マトリックスクロマトグラフィーのような多数の
標準的なクロマトグラフィー技術を使用して、Ｃ３ｄ含有タンパク質を単離する
ことができる。Ｃ３ｄ含有融合ポリペプチドの特性は融合タンパク質の性質に依
存して変動する。 Ｃ末端親和性タグＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅを含有するように構築したＣ３ｄ分
子は、Dempsy et al（WO 061725；PCT/GB95/02851）に記載のように、Sepharose
4Bに結合したＹＬ１／２抗体を使用するアフィニティクロマトグラフィーによ って精製することができる。

【００４３】 （ｘｖ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ） ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、一般に、製造者の説明書に従ってNovexシステム（Novex
GmbH, Heidleburg）を使用して実施した。予め充填されたゲル（４〜２０％の アクリルアミド勾配、トリス−グリシン緩衝液を含有する）を通常使用した。通
常、タンパク質分子量標準品（例えば、LMW Kit, Pharmacia, SwedenまたはNove
x Mark 12, Novex, Germany）を含む電気泳動用サンプルを、１％（ｗ／ｖ）Ｓ ＤＳ含有緩衝液（５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールを含むかまたは含ま
ない）で希釈し、ゲルにかける前に室温で約５〜３０分間放置した。

【００４４】 （ｘｖｉ）イムノブロッティング （ａ）ドットブロット Immobilon膜（Millipore, Middlesex, UK）を、メタノール中に２０秒間浸漬 し、次いでＰＢＳ中で５分間洗浄することによって活性化した。膜を真空多岐管
Dot Blotter（Bio-Rad Laboratories, Watford, UK）中に入れた。細胞由来の粗
抽出物または培養上清を、減圧をかけることによって膜に移し、ＰＢＳで洗浄し
た。膜を乾燥させないで、Dot Blotterを分解し、膜を取り出した。

【００４５】 （ｂ）ウエスタンブロッティング 細胞抽出物および精製タンパク質のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで節（ｘｖ）
に記載のように分離した。Immobilon膜を、上記（ａ）におけるように使用する ために調製した。ゲルおよび膜をSemi-Dry Transfer Cell（Trans-Blot SD, Bio
-Rad Laboratories）中に、Immobilon膜をアノードに向け、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルをカソード側にして組み立てた。カソードとゲルの間に、１０％（ｖ／ｖ）メ
タノールを含有する１９２ｍＭ ６−アミノ−ｎ−カプロン酸、２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ｐＨ９．４の溶液に事前に浸漬したゲルの大きさに切断したWhatman 3M濾
紙３枚を置いた。アノードと膜の間に、１０％（ｖ／ｖ）メタノールを含有する
０．３Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ１０．４に浸漬したゲルの大きさに切断したWhatman
3M濾紙２枚をアノードに隣接して置き、その上に１０％（ｖ／ｖ）メタノールを
含有する２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ１０．４に事前に浸漬したWhatman 3M濾紙を
さらに置いた。 エアポケットの排出を確実にするように完全に組み立てたゲルアセンブリを構
築した。アセンブリに２００ｍＡの電流を３０秒間流すことによって、タンパク
質をＳＤＳ−ＰＡＧＥからImmobilon膜に移した。

【００４６】 （ｃ）ドットブロットおよびウエスタン膜のイムノプロービング 膜を１時間室温で１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌｌ
４００、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドンおよび０．１％（ｗ／ｖ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４ ５
０ｍｌ中でインキュベートすることによって、膜をブロッキングした。適切な１
次抗体を抗体希釈液（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−８
０および１．０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７
．４）中でその作業濃度に希釈した。膜を２時間室温で５０ｍｌのこの溶液中で
インキュベートし、次いで３回、２分間、洗浄緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌおよ
び０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−８０含有２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．
４）中で洗浄した。次いで、膜を、選択した発色過程に適切な標識（例えば、ビ
オチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））で標識された種特異的抗体の
適切な希釈物を含有する抗体希釈緩衝液５０ｍｌに移し、２時間室温でインキュ
ベートした。次いで、膜を上記のように洗浄緩衝液中で洗浄した。最後に、ブロ
ットを製造者の説明書に従って発色させた。 １次抗体および２次抗体の両方についての抗体の適切な希釈とは、選択した発
色系を使用しての選択した抗原の検出に影響を及ぼすことなく、所望されないバ
ックグラウンドノイズを最小にする希釈をいう。この希釈は各抗体について経験
的に決定する。

【００４７】 （ｘｖｉｉ）生物学的活性の測定 バキュロウイルスにおいて生産されたＣ３ｄ単量体の生物学的機能は、そのレ
セプター、補体レセプター−２（ＣＲ２）に結合できる能力について試験するこ
とができる。Ｃ３ｄは補体活性化およびその後の血清プロテアーゼ因子Ｉによる
Ｃ３ｂの分解の過程の生産物なので、古典的経路の溶血アッセイを用いる補体活
性化に対する可能な効果についてＣ３ｄを試験することもまた有益であった。

【００４８】 （ａ）Ｃ３ｄのラジ（Raji）細胞に対する競合結合アッセイ 該アッセイにおいて、少なくとも１単位のＣ３ｄを発現する新規な構築物のラ
ジ細胞、Ｂリンパ芽球状細胞系統の表面におけるＣＲ２結合部位について対照^{12 5} Ｉ−ＨＥＬ−Ｃ３ｄと競合する能力を評価する。ラジ細胞、５ｘ１０⁷〜７ｘ１
０⁷細胞／ｍｌを４℃で１時間、１ｎＭ ¹²⁵Ｉ−ＨＥＬ−Ｃ３ｄおよび増加濃度 の関連のＣ３ｄ含有分子と一緒にインキュベートする。次いで、細胞をジブチル
−ジイソ−オクチル−フタレートクッションによって遠心分離し、ペレットに付
随する放射能の量を測定する。該データから、１ｎＭ ¹²⁵Ｉ−ＨＥＬ−Ｃ３ｄに
おける５０％減少を生じるのに必要な試験下でのＣ３ｄ−含有タンパク質の量を
決定できる。

【００４９】 （ｂ）ＣＲ２に結合するＣ３ｄを示す競合ＥＬＩＳＡ Ｃ３ｄを使用して、９６ウェルマイクロタイタープレートを０．１Ｍ ＮａＨ ＣＯ₃中の５μｇ／ｍｌで４℃で一晩インキュベートすることによって被覆する 。次いで、プレートをＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で室
温で１時間ブロックし、その後、それらを２５μｌ／ウェルのＣ３ｄまたはＣ３
ｄ含有分子のいずれかと一緒に、用量応答方法における試験下でインキュベート
する。ウェルに２５μｌ／ウェルの亜飽和濃度のコライゲートしたＣＲ２．Ｉｇ
Ｇ１を１２５ｐＭで加え、室温で１時間インキュベートする。次いで、プレート
を０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３回洗浄する。固
定化したＣ３ｄに結合したＣＲ２の量を０．１％（ｖ／ｖ）を含有するＰＢＳ中
のＨＲＰ標識化ヤギ抗−マウスＩｇＧ１抗体の１：３０００希釈液を用いて検出
し、室温で１時間インキュベートし、次いでウェルを上記のように洗浄した。Ｈ
ＲＰ−抗体の存在をＴＭＢペルオキシダーゼＥＩＡ基質キットを製造者の説明書
（BioRad，UK）にしたがって使用して検出する。

【００５０】 （ｃ）ヒツジ赤血球の溶血によって測定される抗−補体活性 ウサギ抗体（Diamedix Corporation, FL, USA）で感作されたヒツジ赤血球の 補体媒介溶解の阻害を測定することは、補体インヒビターの機能的活性を評価す
ることである。０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．１％ゼラチン
ｐＨ７．４中１：１２５または１：１００に希釈されたヒト血清を補体の供給源
として使用した。血清は、J.V. DacieおよびS.M. Lewis, Practical Haematolog
y, Churchill Livingstone, Edinburgh, 1975に記載のように本質的にボランテ ィアの血液寄付から集められた。簡単に言うと、血液（１０−２０ｍｌ）を３７
℃に５分間加温し、血餅を除去し、遠心分離によって残りの血清から不純物を除
去した。血清フラクションを小さなアリコートに分け、−１９６℃で保管した。
必要時にアリコートを解凍し、使用直前にＨｅｐｅｓバッファー中に希釈した。

【００５１】 感作されたヒツジ赤血球の補体媒介溶解の阻害は、以下のように、ｖ底マイク
ロタイタープレート形式を使用する標準的溶血アッセイを用いて測定する。 Ｈｅｐｅｓバッファー中で希釈した一連の濃度のインヒビター（典型的には、
０．１−１００ｎＭの領域）５０μｌを５０μｌの希釈血清および１００μｌの
感作ヒツジ赤血球と混合し、次いで、３７℃で１時間インキュベートする。試料
を１６００ｒｐｍで周囲の温度で３分間遠心した後、１５０μｌの上清を平底マ
イクロタイタープレートに移し、４１０ｎｍで吸収を測定する。血清をいずれか
のインヒビターの不在下で赤血球と一緒にインキュベートすることによって、最
大溶解（Ａｍａｘ）を決定する。いずれかの血清またはインヒビターの不在下で
赤血球をインキュベートしてインヒビター自体が溶解に対していずれかの効果を
有するかどうかをチェックすることによって、バックグラウンド溶解（Ａｏ）を
決定する。赤血球を単独のインヒビターとインキュベートし；赤血球の溶解に対
していずれかの直接的効果を有する化合物はなかった。全細胞溶解のフラクショ
ンとして阻害を示し、ＩＨ５０は、溶解の５０％阻害を与えるために必要なイン
ヒビターの濃度を示す。 ＩＨ＝Ａ−Ａｏ／Ａｍａｘ−Ａｏ ここに、０は補体阻害に等しく、１は阻害がないことに等しい。

【００５２】 （ｘｖｉｉｉ）タンパク質中のジスルフィドの還元およびチオールの修飾 標題の目的を達成するために使用される多くの方法が存在する。ジスルフィド
の選択的還元を行うことが必要な理由は、複数のチオールを含むタンパク質の単
離および精製の間、特に、完全に変性した複数のチオールを含むタンパク質のリ
ホールディングの間、不適当なジスルフィド対合が起こりうることである。さら
に、たとえ正しいジスルフィド対合が起こっても、タンパク質中の遊離のシステ
インが例えばグルタチオンで遮断されるようになる可能性がある。これらの誘導
体は、一般に非常に安定である。例えば、その後の別の官能基への結合のために
それらをより反応性にするために、それらを例えば、ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）で選
択的に還元し、次いで、所望により適度に不安定な官能基で修飾する必要がある
。後者の例は、混合ジスルフィドを与えるエルマン試薬（ＤＴＮＢ）である。Ｄ
ＴＮＢでの処理が省略される場合、遊離のチオール含有タンパク質の二量体化が
最小になることを保証するために、実験計画を注意深く留意する必要がある。上
記の「選択的に還元する」なる語は、タンパク質の天然構造内のジスルフィド架
橋が還元されないように、反応条件、例えば、期間、温度、反応物のモル比を注
意深く調節しなければならないことをいう。全ての試薬は、例えば、Sigma（Poo
le, Dorset）またはPierce & Warriner（Chester, Cheshire）より商業的に入手
可能である。

【００５３】 以下の一般的な実施例は、使用される遊離のチオールの発生に有用な条件の型
およびそれらの任意の修飾を説明する。最適なチオール還元および／または修飾
を達成するための特定の反応条件は、各タンパク質バッチについて原則的に決定
される。

【００５４】 ＴＣＥＰは、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（約ｐＨ４．５）中の２０ｍＭ溶液として 調製され、−４０℃で保管される。ＤＴＴは、リン酸ナトリウムｐＨ７．０中１
０ｍＭで調製され、−４０℃で保管される。ＤＴＮＢは、リン酸ナトリウムｐＨ
７．０中１０ｍＭで調製され、−４０℃で保管される。上記の試薬の全ては、典
型的に等量のモルまたは過剰のモルで使用され、正確な濃度は原則的に実験的に
同定される。反応期間および温度は、同様に実験的に決定される。一般に、期間
は１〜２４時間の範囲であり、温度は２〜３０℃の範囲である。過剰な試薬は、
例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５を用いるバッファー交換によって都合よく除去
される。適当なバッファーは、０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．０である。

【００５５】 実施例 実施例１． エシェリキア・コリ（Escherichia coli）における単量体ネズミ
Ｃ３ｄ［（Ｃ３ｄ）１］（配列番号２６）および三量体Ｃ３ｄ［（Ｃ３ｄ）３］
（配列番号２７）の発現および単離−細菌宿主における三量体構築物の不安定性
に対する証拠 （ａ）（Ｃ３ｄ）１をコードするプラスミドｐＤＢ１０３３の構築 ｐＤＢ１０１３をＳｐｅＩ／ＮｄｅＩで消化し、ベクターフラグメントを１．
１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルから単離し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用い
て精製した。 ＷＯ９６／１７６２５号に記載のｐＳＧ．Ｃ３ｄ₁．ＹＬと呼ばれるベクター は、犬プレ−プロ−インスリン由来のシグナルペプチドの後に１コピーのＣ３ｄ
コーディング配列をコードし、商業的に入手可能なＹＬ１／２抗体（Serotec, O
xon）によって認識されるトリペプチドエピトープ（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ） によってＣ末端にタグ付加される。ベクターをＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで切断
し、消化物を１．１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上に流し、１０００塩基対Ｂｇ
ｌＩＩ／ＸｂａＩフラグメントを単離した。 これら２つのフラグメントをＢｇｌＩＩ／ＮｄｅＩリンカー（配列番号２８お
よび２９）でライゲートし、標準条件下でコンピテントイー・コリ（E. coli） ＪＭ１０９細胞中に形質転換し、クローンを単離した。

【００５６】 （ｂ）ｐＤＢ１０３３からの（Ｃ３ｄ）１の発現 ｐＤＢ１０３３を塩化カルシウムコンピテントイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）
中に形質転換し、得られたコロニーを単離し、プラスミド含量をチェックした。
イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）においてｐＤＢ１０３３由来のタンパク質を発現
するために、単一コロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma）を含有する １０ｍＬ ＬＢ培地（２０ｇ／ｌトリプトン、１５ｇ／ｌ酵母抽出物、０．８ｇ ／ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．１ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄）中に 接種した。培養体を３７℃、２６０ｒｐｍで６時間生育させた後、５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含有する１００ｍｌの同じ培地に接種するために使用した。同
一条件下で一晩生育させた。次いで、２５ｍｌの各培養体をエルレンマイヤーフ
ラスコ中５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する３ｘ５００ｍｌの同一培地中に
接種するために使用した。細胞をＡ₆₀₀ｎｍでＯＤ約１．２まで生育させた。Ｉ ＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄガラクトピラノシド）を最終濃度１ｍＭまで加え、
細胞をさらに３．５時間インキュベートした後、８０００ｇ／１０分の遠心分離
によって収集した。培養体１．５ｌ由来の細胞ペレットをすぐに処理した。

【００５７】 （ｃ）（Ｃ３ｄ）１の単離 記載の方法は、本質的に、Doddら(1995) Protein Expression and Purificati
on 6: 727-736における補体レセプター１のＳＣＲ１−３の単離について詳述さ れたものにいくつかの修飾を用いたものである。

【００５８】 （ｉ）可溶化封入体の単離 イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＤＢ１０３３）の細胞ペレットを５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ／５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０（約１５０ｍｌ）
中に再懸濁した。懸濁液を氷で取り囲んだガラスビーカーに移し、３分間超音波
処理し（Heat Systems-Ultrasonics W380; ５０ｘ５０％パルス、パルス時間＝ ５秒）、次いで、１５０００ｇで１０分間遠心した。上清をデカントし、捨てた
。封入体ペレットを−４０℃で７日間保管した。次いで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ ８Ｍ尿素／１ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ２−メルカプトエタノールｐＨ８．５（ １２０ｍｌ）中に、室温で勢いよく攪拌しながら再懸濁し、次いで、室温で２時
間、時々攪拌しながら放置した。

【００５９】 （ｉｉ）Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑを用いる最初の精製 粘性溶液に水洗し、真空乾燥させたＭａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ（Bio-Ra
d: ２４ｇ含水重量）を加えた。混合物を勢いよく攪拌し、室温で１−２時間静 置させた。上清をデカントし、試料を取り、捨てた。残りのスラリーを均質の懸
濁液に再懸濁し、ガラスジャケット中に注ぎ入れ、充填床中に固定させた。カラ
ムを室温で０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ／８Ｍ尿素／０．０５Ｍ２−メルカプトエタノ ール／０．００１Ｍ ＥＤＴＡｐＨ８．５で平衡化した。溶出液のＡ₂₈₀がベース
ラインで安定化したとき、バッファーを付加的に１Ｍ ＮａＣｌを含有する平衡 化バッファーに交換した。単一のＡ₂₈₀ピークを１Ｍ ＮａＣｌ−含有バッファー
によって溶出し；容量は約８０ｍｌであった。還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥは
、生産物が分子量約３５０００を有する１つの主要な種を含有したことを示した
。溶液を−４０℃で保管した。

【００６０】 （ｄ）（Ｃ３ｄ）３をコードするプラスミドｐＤＢ１０３２の構築 ｐＤＢ１０１３をＳｐｅＩ／ＮｄｅＩで消化し、ベクターフラグメントを１．
１％（ｖ／ｗ）アガロースゲルから単離し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用い
て精製した。 ＷＯ９６／１７６２５号に記載のｐＳＧ．（Ｃ３ｄ）３．ＹＬと呼ばれるベク
ターは、犬プレ−プロ−インスリン由来のシグナルペプチドの後にＣ３ｄコーデ
ィング配列の３つの別個のコピーをコードする。Ｃ３ｄドメインは、リンカー（
Ｇｌｙ₄−Ｓｅｒ）₂によって分離し、トリペプチドエピトープ（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
−Ｐｈｅ）が最終的なＣ３ｄドメインのＣ末端に存在し、それは商業的に入手可
能なＹＬ１／２抗体（Serotec, Oxon）によって認識される。ベクターをＢｇｌ ＩＩおよびＸｂａＩで切断し；消化物を１．１％（ｖ／ｗ）アガロースゲル上に
流し、３０００塩基対のＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩフラグメントを単離した。これら
２つのフラグメントをＢｇｌＩＩ／ＮｄｅＩリンカー（配列番号２８および２９
）でライゲートし、コンピテントイー・コリＪＭ１０９細胞中に標準条件下で形
質転換し、ｐＤＢ１０３２を含有するクローンを単離した。Ｃ３ｄ３をコードす
るアミノ酸配列を配列番号２７に記載する。

【００６１】 （ｂ）ｐＤＢ１０３２からの（Ｃ３ｄ）３の発現 ｐＤＢ１０３２を塩化カルシウムコンピテントイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）
中に形質転換し、得られたコロニーを単離し、プラスミド含量についてチェック
した。イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）においてｐＤＢ１０３２由来のタンパク質
を発現するために、単一コロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する１０
ｍｌ ＬＢ−リン酸（２０ｇ／ｌトリプトン、１５ｇ／ｌ酵母抽出物、０．８ｇ ／ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．１ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄）中に 接種した。培養体を３７℃、２３０ｒｐｍで一晩生育させた後、５０μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含有する同一培地５０ｍｌに接種するために使用した。同一条件
下で一晩、生育させた。次いで、１５ｍｌの各培養体をアーレンマイヤーフラス
コ中５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する同一培地３ｘ６００ｍｌに接種する
ために使用した。細胞をＡ₆₀₀ｎｍでＯＤ約１．１まで生育させた。ＩＰＴＧを 最終濃度１ｍＭまで加え、細胞をさらに３．５時間生育させ続けた後、８０００
ｇ／１０分の遠心分離により収集した。培養体１．５ｌ由来のペレットをすぐに
処理した。

【００６２】 （ｃ）（Ｃ３ｄ）３の単離 記載の方法は、本質的に、Doddら(1995) Protein Expression and Purificati
on 6: 727-736における補体レセプター１のＳＣＲ１−３の単離について詳述さ れたものにいくつかの修飾を用いたものである。

【００６３】 （ｉ）可溶化封入体の単離 イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＤＢ１０３２）の細胞ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０／０．１ｍＭ Ｐ ＭＳＦ（約１００ｍｌ）中に再懸濁した。懸濁液を氷で取り囲んだガラスビーカ
ーに移し、３分間超音波処理し（Heat Systems-Ultrasonics W380; ５０ｘ５０ ％パルス、パルス時間＝５秒）、次いで、１５０００ｇで１０分間遠心した。上
清をデカントし、捨てた。封入体ペレットを−４０℃で３日間保管した。次いで
、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／８Ｍ尿素／１ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ２−メルカプトエ
タノールｐＨ８．５（１２０ｍｌ）中に、室温で勢いよく攪拌しながら再懸濁し
、次いで、室温で２時間、時々攪拌しながら放置した。

【００６４】 （ｉｉ）Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑを用いる最初の精製 粘性溶液に水洗し、真空乾燥させたＭａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ（Bio-Ra
d: ２４ｇ含水重量）を加えた。混合物を勢いよく攪拌し、室温で１−２時間静 置させた。上清をデカントし、試料を取り、捨てた。残りのスラリーを均質の懸
濁液に再懸濁し、ガラスジャケット中に注ぎ入れ、充填床中に固定させた。カラ
ムを室温で０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ／８Ｍ尿素／０．０５Ｍ２−メルカプトエタノ ール／０．００１Ｍ ＥＤＴＡｐＨ８．５で平衡化した。溶出液のＡ₂₈₀がベース
ラインで安定化したとき、バッファーを付加的に１Ｍ ＮａＣｌを含有する平衡 化バッファーに交換した。単一のＡ₂₈₀ピークを１Ｍ ＮａＣｌ−含有バッファー
によって溶出し；容量は約８０ｍｌであった。還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥは
、生産物が分子量約３５０００を有する１つの主要な種および標的分子量約１０
５０００に近く、標的種であると考えられる分子量を有する付加的な種を含有し
たことを示した。溶液を−４０℃で保管した。 これらの結果は、単量体または三量体Ｃ３ｄ遺伝子の細菌宿主における発現が
実質的に同一の生産物−単量体タンパク質を生じることを示す。この不安定性の
原因は、該実施例において決定されなかった。

【００６５】 実施例２ バキュロウイルスベクターを用いる昆虫細胞において発現されるＣ３
ｄオリゴマーの発現および単離：低率のトリマーおよび高率のモノマーＣ３ｄ形
態の起源としての相同的組換えの証拠 （ａ）（Ｃ３ｄ）₃−ＥＥＦをコードするプラスミドｐＢＰ６８−０１の構築 特許ＷＯ９６／１７６２５号に記載されるｐＳＧ（Ｃ３ｄ）₃と称されるベク ターは、イヌプレ−プロ−インシュリン由来のシグナルペプチドに続くＣ３ｄコ
ーディング配列の３つの同一のコピーをコードする。Ｃ３ｄドメインは、リンカ
ー（Ｇｌｙ₄−Ｓｅｒ）₂により分離され、市販のＹＬ１／２抗体（Serotec., Ox
on）により認識される最終Ｃ３ｄドメインのＣ−末端にトリペプチドエピトープ
（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）がある。 ＰＳＧ（Ｃ３ｄ）₃ＹＬを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ で消化し、製造者の指示にしたがって GeneClean 抽出キットを用いて１％（ｗ ／ｖ）アガロースゲルから３０７５塩基対バンドを単離した。バキュロウイルス
発現ベクターｐＢａｃＰａｋ８（Clontech）を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ
ＩおよびＸｂａＩで消化し、０．７％（ｗ／ｖ）アガロースゲルから５．６ｋ塩
基対バンドを単離した。 ２つのフラグメントをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結し、ｐＢＰ６８−０１を得 た。連結したプラスミドを Stratagene より購入したコンピテントイー．コリＸ
Ｌ−１−ｂｌｕｅ中に形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を５０μｇ／
ｍｌアンピシリンを含むＬＢ−寒天プレート上で選択した。得られたコロニーを
制限エンドヌクレアーゼ消化により解析した。プラスミドＤＮＡを、製造者のプ
ロトコールにしたがって Qiaex mini または midi prep キットを用いてｐＢＰ ６８−０１を含むイー．コリから抽出した。

【００６６】 （ｂ）Ｃ３ｄオリゴマーの発現用バキュロウイルスｐＢＰ６８−０１の作成 精製したｐＢＰ６８−０１プラスミドＤＮＡを用い、一般法セクション（ｖｉ
ｉｉ）に記載するように（Ｃ３ｄ）３−ＹＬ用の組換えバキュロウイルス発現ベ
クターを作成した。得られたプラークをとり、一次種ストックを作成するのに用
いた。Ｃ３ｄオリゴマーを発現する組換えバキュロウイルスを、２０００中１の
希釈で Dako (Ely, Cambs) から得たヒトＣ３ｄに対する抗体でプロービングす る、パッセージ１ウィルスストックの培養上澄のイムノ−ドットブロットにより
同定した。ブロットは、ＥＣＬキット (Amersham, Middelsex) を用いて行った 。ドットブロット上で正のシグナルを示したものをさらに増加させ、１ｍｌあた
り１０⁷および１０⁹プラーク形成単位（ｐｆｕ）の間のウイルス力価を有するパ
ッセージ３または４作業ストックを作成するのに用いた。

【００６７】 （ｃ）昆虫細胞におけるＣ３ｄオリゴマーの発現 血清なしでの生育に適したＳｆ９細胞を、２０ｒｐｍにて振盪させた２００ｍ
ｌのエルレンマイヤーフラスコ中、４×５０ｍｌの培地中で、１．５×１０⁶細 胞／ｍｌの細胞濃度にまで懸濁培養物中で生育させた。ついでこれらの細胞を１
×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌのパッセージ３作業ストックを加えて最終濃度５ｐｆｕ／ 細胞とすることにより感染させた。感染後７２時間の上澄は、３種のＣ３ｄオリ
ゴマー：オリジナルベクター中にコードされるものとして少量の（Ｃ３ｄ）３、
少量の（Ｃ３ｄ）２および比較的大量（５〜１０ｍｇ／ｌ）のＣ３ｄモノマーを
含むことが示された。２１０ｍｌの回収した培地をさらに処理するまで−４０℃
にて保存した。

【００６８】 （ｄ）Ｓｆ９バキュロウイルス回収培地からのＣ３ｄの精製 回収した上澄の約半分、１１３ｍｌを１０Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．４に調製し 、溶液の伝導率を測定した。通常塩濃度は０．１Ｍ以下であった。この濃度より
も高い場合、溶液を適量の５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４で希釈し、塩濃度を
８０ｍＭにした。 回収した上澄を、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４中で予め平衡化したベッド
容量；２５ｍｌのＭａｃｒｏｐｒｅｐ−ｈｉｇｈ−Ｑカラム上にロードし、つい
でベースラインが安定するまで５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４で洗浄した。ロ
ーディングおよびカラムの洗浄の直線状流速は、８９ｃｍ／ｈであり、溶出の間
に６０ｃｍ／ｈに減少した。結合したタンパク質を１０カラム容積以上の直線状
０−１Ｍ ＮａＣｌで溶出させ、５ｍｌのフラクションを集めた。カラム材料は 培地成分で多量に汚染され、一回の使用後に廃棄した。 還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより明らかにされたように、０．１５Ｍおよび０．３
Ｍ ＮａＣｌの間でＣ３ｄが溶出した。０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．２Ｍ Ｎ ａＣｌ間に溶出するフラクションは５０％純粋であり、（Ｃ３ｄ）２および（Ｃ
３ｄ）３はＣ３ｄ１の後で溶出した。プールしたＣ３ｄ１フラクション４０ｍｌ
をＹＭ１０膜を含む４０ｍｌのウルトラフィルトレーション攪拌セル（Amicon,
Glos.)を用いて２ｍｌにまで濃縮した。以下のセクション（ｄ）および（ｅ）の
生成物の解析の前にさらなる精製は行わなかった。

【００６９】 （ｅ）モノマー種の生理化学的解析 （ｉ）Ｎ−末端配列 モノマーＣ３ｄを含むサンプルを還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。タンパ
ク質を一般法（セクション（ｘｖｉ）（ｂ））において記載するようにプロブロ
ット（Applied Biosystems)に電気−移動した。電気移動後、膜を１００％メタ ノール中で１０秒間リンスし、ついで０．１％（ｗ／ｖ）アミドブラック（Sigm
a）、４０％メタノール、１％酢酸を含む溶液で３０秒間染色し、続けて５０％ メタノール溶液で脱染色した。Ｃ３ｄモノマーに対応するバンドを摘出した。タ
ンパク質のＮ−末端配列を Beckman Automatic Amino Acid Analyser (Beckman)
を用いてエドマン分解により解析した。単一のＮ−末端配列が得られ、この配 列はバキュロウイルス／Ｓｆ９細胞において発現されたＣ３ｄ１配列の２５〜４
４に対応し（配列番号３７）、予想されたように分泌されたモノマーはそのシグ
ナル配列が除去されていることが示された。

【００７０】 （ｉｉ）質量分析法 精製したＣ３ｄを含む溶液でエレクトロスプレー質量分析法により、Ｃ３ｄの
質量を調べた。３４２７９Ｄａの質量を有する単一のピークが見られた。これは
、上記のセクション（ｄ）（ｉ）において記載したようなＮ−末端配列にて開始
する配列に対応するが、Ｃ−末端抗体アフィニティタグ（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈ
ｅ）を含む。この配列を以下に示す（配列番号３７）。

【００７１】 （ｉｉｉ）ウェスタンブロッティング 精製したＣ３ｄをセクション（ｘｖｉ）（ｂ）に記載する方法にしたがってウ
ェスタンブロットに付し、ついで還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ブロットを
Ｃ３ｄに対する一次抗体およびアフィニティタグＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅでブロ
ットした。

【００７２】 （１）Ｃ３ｄ抗体 ヒトＣ３ｄに対する一次ウサギポリクローナル抗体（Dako, Cambs. UK）およ び二次抗体ビオチン−標識化ポリクローナルヤギ抗−ウサギＩｇＧ抗体 (Amersh
am, Bucks. ) を、ストックの１：５００希釈にて用いた。ブロットを製造者の 指示にしたがって Immunogold Silver Staining Kit (Amersham) を用いて行っ た。ブロットはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＣ３ｄモノマーの正しい位置に対応する単
一の免疫反応性バンドを示した。

【００７３】 （２）アフィニティＴａｇに対する抗体 Ｃ−末端タグＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅを認識するクローンＹＬ１／２（Serote
c) 由来のモノクローナルラット抗体を１：５００希釈で用い、イムノブロット をプローブした。二次抗体ビオチン−標識化ポリクローナルヤギ抗−ラット抗体
を１：１０００の希釈で用いた。ブロットを製造者の指示にしたがって Immunog
old Silver Staining Kit (Amersham) を用いて行った。ブロットはＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ上のＣ３ｄモノマーの正しい位置に対応する単一の免疫反応性バンドを示
した。この結果は、大部分のＣ３ｄモノマーにエピトープタグが存在することを
示した。 これらのセクション（ｉ〜ｉｉｉ）は回収した上澄において発現されたＣ３ｄ
が、プラスミドｐＢＰ６８−０１においてコードされたシグナルペプチドを含む
第一のＣ３ｄユニットのＮ−末端およびプラスミド中のアフィニティタグを含む
Ｃ３ｄの第３のユニットによりコードされる情報の分子のＣ−末端を含むことを
示す。この組み合わせのアミの酸配列を配列番号３７に記載する。

【００７４】 （ｆ）Ｃ３ｄモノマーの生物学的アッセイ バキュロウイルス中に産生されたＣ３ｄモノマーの生物学的機能をそのレセプ
ター、補体レセプター−２（ＣＲ２）に結合するその能力により試験した。

【００７５】 （ｉ）Ｃ３ｄのＲａｊｉ細胞への競合的結合アッセイ 結合を一般法セクション（ｘｖｉｉ）（ａ）に記載したように行った。細胞ペ
レットに結合した放射活性の量を用い、Ｒａｊｉ細胞に結合した¹²⁵Ｉ−ＨＥＬ −Ｃ３ｄの結合曲線を構築し、これは標識の結合における５０％減少が２．５μ
Ｍの結合濃度のバキュロウイルス／Ｓｆ９ Ｃ３ｄまたはＣＯＳ細胞中に発現し たＣ３ｄのいずれかを用いることで達成されることを示した。

【００７６】 （ｉｉ）ＣＲ２へのＣ３ｄ結合を示すＥＬＩＳＡ 一般法セクション（ｘｖｉｉ）（ｂ）に記載したようにＥＬＩＳＡを行った。
モノマーはバキュロウイルス／Ｓｆ９材料について２μＭのＩ₅₀を示した。同様
な値がＣＯＳ細胞産生Ｃ３ｄについて得られた。

【００７７】 （ｉｉｉ）Ｃ３ｄの抗溶血活性 一般法セクション（ｘｖｉｉ）（ｃ）に記載したように抗溶血アッセイをＣ３
ｄ１の精製したサンプルで行った。Ｃ３ｄ１タンパク質生成物は、約７００ｎＭ
のＩＨ５０で感作されたヒツジ赤血球細胞の補体−媒介溶血を阻害した。このア
ッセイにおけるＣ３ｄ活性は、おそらくＣ３補体パスウェイの競合的阻害剤とし
てである。 このセクション中に記載したデータは、バキュロウイルス／Ｓｆ９発現系にお
いて産生されたＣ３ｄはＣＯＳ細胞において産生されたものと活性において等価
である証拠を提供する。しかしながら、この系は、有意な発酵セーブを提供する
ＣＯＳ系よりも、１リットルあたり少なくとも５０倍よりも多くのＣ３ｄを産生
する。

【００７８】 （ｇ）ｐＢＰ６８−０１から産生されたバキュロウイルスベクターの解析 モノマータンパク質の解析により、バキュロウイルスベクター中の繰り返され
たＣ３ｄコーディング配列内で相同的組換えが起こり、Ｃ３ｄの２つのコピーが
欠失したという仮説が導かれた。ＰＣＲ解析を用い、モノマー種を産生する培養
物中に存在するウイルスを解析した。 ２回の別々の産生作業で、５０ｍｌサンプルからの細胞ペレットからＤＮＡを
抽出した。細胞を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ
プロテイナーゼＫ、ｐＨ７．６を含む溶液５ｍｌ中に懸濁した。再懸濁後、ＳＤ
Ｓを０．５％（ｗ／ｖ）まで添加し、ＤＮＡの剪断を防止するように穏やかに混
合し、３７℃にて６０分間インキュベートした。等量のフェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール、１：２４：１（Sigma）を加え、反転により５分間 混合し、ついで、１２０００ｇにて５分間遠心分離した。上部の水相をきれいな
チューブに移し、０．６容積のイソプロパノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた
。ＤＮＡのクロットが生成され、これを５ｍｌの８０％（ｖ／ｖ）エタノール中
に１分間移した。ペレットのＤＮＡクロットが完全に乾かすことなく、エタノー
ルを注ぎ出し、排出した。ＤＮＡクロットを５０ユニットのＲＮａｓｅＡ（Sigm
a）を含む脱イオン化した水１ｍｌ中に溶解した。 ＰＣＲ反応を行い、Ｃ３ｄをコードするＤＮＡの長さを調べた。ＰＣＲに用い
たプライマーは、コーディング領域の側に位置し、クローニングに用いたＥｃｏ
ＲＩおよびＸｂａＩ制限部位の位置に対応する配列に相同性であった。フォワー
ドプライマー＃３９１７１は、ＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＣＴＴＧＣＴＴＧ（配列番
号３０）であり、リバースプライマー＃３９１７２は、ＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡ
ＣＣＡＧＡＣ（配列番号３１）であった。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：
１μｌ ＤＮＡ溶液（細胞ペレットから）、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ、各５０ ｐＭｏｌのフォワードおよびリバースプライマー（配列番号３０および３１）、
５μｌ×１０ Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（Promega)、３μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣ ｌ₂、４９μｌまでの脱イオン水および１μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５ユニット
）（Promega)。ＰＣＲをサーマルサイクラー中で以下のサイクルで行った：ステ
ップ１：９５℃、１分間、ステップ２：９５℃、３０秒間、ステップ３：５５℃
、３０秒間、ステップ４：７２℃１分間、ステップ５：７２℃５分間。ステップ
２〜４をステップ５の前に３０回繰り返した。１０番目の産物を１％（ｗ／ｖ）
アガロースゲル上に流した。（Ｃ３ｄ）３について予想される大きさは３０８８
塩基対であり、Ｃ３ｄモノマーについては１２１７塩基対であった。反応のＰＣ
Ｒ産物は、あきらかに１２１７塩基対のバンドであり、３０８８塩基対バンドの
証拠はなかった。 これらのデータおよびタンパク質解析データは、相同的組換えが起こり、その
結果、３つのＣ３ｄ遺伝子の二つが欠失し、シグナルペプチド、第一のドメイン
のアミノ末端部分、カルボキシ末端部分、第３のドメインのＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｈｅタグが除去されることを強く示す。交差のポイントは、Ｃ３ｄの３つのコピ
ー内のコーディング配列が同一であるため、決定することは不可能である。 プラーククローニングによる３つのＣ３ｄドメインを含む安定なウイルスを単
離するその後の試みは成功しなかった。回収されたすべてのウイルスは、上記し
たようにＰＣＲ解析により決定した単一のＣ３ｄドメインのみを含んでいた。

【００７９】 実施例３ Ｃ３ｄ単量体をコードするファジー遺伝子の設計および構築 （ａ）合成遺伝子設計 ホモロジー領域間でのＤＮＡ鎖交換の結果として相同的組換え体が生じる。本
発明において、一連の合成Ｃ３ｄドメインは、Ｃ３ｄドメインのコード配列を変
更せずに、配列を連結した場合に相同ＤＮＡの存在を最小量に減少させるような
方法で構築される。本発明の基本原理は、第３塩基「ゆらぎ」現象を利用して、
該ドメイン全体にサイレント変化を誘導することである。これにより起こり得る
変種の数は非常に多く、個々に特徴付けることができない。第３塩基「ゆらぎ」
が導入された場合には、表１に示される変種が包含される。ある種の第３塩基「
ゆらぎ」オプションは、コドンが哺乳動物、昆虫または細菌ゲノムにおいて微量
であることが見出された場合には特別に回避される。可変性の第３塩基部分を有
するコドンを、本明細書において、以下、「ファジー」コドンと記載する。

【００８０】

【表１】

【００８１】

【表２】

【００８２】 Ｃ３ｄ配列の上方または下方の鎖をコードする、長さが７６ないし１０６塩基
の範囲である１２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドＦ
ｕｚ１（配列番号１）は、ＢｇｌＩＩ部位（ｐＢＰ６８−０１におけるＢｇｌＩ
Ｉ部位とインフレーム）およびＮｄｅＩ部位（ｐＤＢ１０３２およびｐＤＢ１０
３３におけるＮｄｅＩ部位とインフレーム）を含む２１塩基を前に置いたＣ３ｄ
配列の最初の７９塩基（フォワード鎖）をコードした。Ｆｕｚ１に存在する２６
個のＣ３ｄアミノ酸コドンのうち最初の２０個は、（不変メチオニンコドンＡＴ
Ｇを除いて）ファジーコドンによりコードされる。Ｆｕｚ１の１４個のカルボキ
シ末端残基は不変であり、これらの相補的配列のアニーリングを増強するために
ＧＣリッチである可能性がある選択されたコドンを有する。この領域は、Ｆｕｚ
２（配列番号２）との重複領域を表す。オリゴヌクレオチドＦｕｚ２は、Ｃ３ｄ
のアミノ酸２３ないし５４（リバース鎖）をコードし、この場合、３'末端のア ミノ酸２３−２６についてのリバースコドンは不変であり、Ｆｕｚ１と重複する
。アミノ酸２７ないし４９は、（不変トリプトファンリバースコドンＣＣＡを除
いて）リバースファジーコドンによりコードされる。５'末端で、Ｆｕｚ２の１ ４個の末端残基は不変であり、ＧＣリッチである可能性がある選択されたリバー
スコドンを有する。この領域は、Ｆｕｚ３との重複領域を表す。

【００８３】 同様の方法に従って、ファジーコドンの中心領域およびフランキングオリゴヌ
クレオチドと１３−１７個の塩基が重複している不変のＧＣリッチ末端を有する
Ｆｕｚ３からＦｕｚ１１まで（配列番号３ないし１１）を設計した。 Ｆｕｚ１２（配列番号１２）は、３'末端で１４個の塩基がＦｕｚ１１と重複 しており、Ｃ３ｄをコードするファジーコドンの中心領域を有するが、該遺伝子
のカルボキシ末端を表すオリゴヌクレオチドの５'末端は、リンカー領域（Ｇｌ ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ファジーコドンにおける））、ＢａｍＨ
Ｉ部位、終止コドンおよびＥａｇＩ部位を含む。ＢａｍＨＩ部位は、次に、複数
のドメインの連結のために別のＣ３ｄドメインのアミノ末端ＢｇｌＩＩ部位と融
合する。終止コドンは、カルボキシ末端Ｃ３ｄドメインにおいてのみ保持され、
ＥａｇＩ部位は、次に、バキュロウイルスベクターｐＢａｃＰａｋ８にクローニ
ングされる。

【００８４】 （ｂ）遺伝子アッセンブリー ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いてアニーリングおよび増幅のサイク
ルを含む段階でファジーＣ３ｄ遺伝子を構築した。次いで、これらの増幅セグメ
ントを一緒にライゲートする。 第１段階において、ファジーオリゴヌクレオチドを、以下の組合せでそれらの
ＧＣリッチ不変重複領域を介して２つ１組にしてアニール化した；Ｆｕｚ１＋Ｆ
ｕｚ２、Ｆｕｚ３＋Ｆｕｚ４、Ｆｕｚ５＋Ｆｕｚ６、Ｆｕｚ７＋Ｆｕｚ８、Ｆｕ
ｚ９＋Ｆｕｚ１０、Ｆｕｚ１１＋Ｆｕｚ１２。ファジーオリゴヌクレオチド対を
増幅させるために、ＰＣＲプライマーを設計した。各鎖は、奇数番号のオリゴヌ
クレオチドの５'末端の重複不変ＧＣリッチ領域および偶数番号のオリゴヌクレ オチドの３'末端を有する。これらのＰＣＲプライマーは、ファジーオリゴヌク レオチドの重複している対の各末端で新たな制限部位を作製する塩基変化を取り
込んだ。この特性により、特異的なエンドヌクレアーゼにより増幅ＤＮＡ配列が
トリミングされて、それらの正しい配向で増幅ファジーオリゴヌクレオチドをア
ニール化する付着末端が提供される。Ｆｕｚ２５（配列番号２５）と称されるＦ
ｕｚ１２に対する別のＰＣＲプライマーは、Ｃ末端システイン残基を取り込むた
めにその５'末端で終止コドンの前にさらなるコドンを付加した以外は、Ｆｕｚ １２と同一であった。その結果、発現された蛋白質におけるこのＣ末端システイ
ンを用いてＣ３ｄに対する抗原を結合することができる。 該ＰＣＲプライマーを下記表２に挙げ、設計されたプライマーにより増幅され
るファジーオリゴヌクレオチドおよびそれらの固有制限部位と共に示す。

【００８５】

【表３】

【００８６】 ＰＣＲ反応は、全て、一対の重複ファジーオリゴヌクレオチドを含む、各反応
について同一の条件下で行った。ＰＣＲ反応は、上記表２に記載した組合せで最
終濃度１Ｍのファジーオリゴヌクレオチドおよび２μＭのＰＣＲオリゴヌクレオ
チドを含む０.６ｍｌの全反応容量中で行い、これに、２.５ｍＭ ｄＮＴＰ ４８
μｌ、ｘ１０ Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（プロメガ（Promega））６０μｌ、２
５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ４８μｌ、脱イオン水４９μｌまで、およびＴａｑポリメラ ーゼ（３０単位）（プロメガ）６μｌを添加し、無菌脱イオン水を添加して最終
容量０.６ｍｌを得た。温度サイクルは、全ての反応について同一であった：９ ４℃で５分間、次いで、５０℃／２分、７２℃／３分、９４℃／１分のサイクル
を３５回；これに次いで、７２℃で７分間インキュベートした。

【００８７】 ＰＣＲ産生物を１.３％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分離し、正しい大きさ の増幅産生物を該ゲルから切り出し、ＭＥＲｍａｉｄ ＫｉｔまたはＭＥＲｍａ ｉｄ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔのいずれかを用いて無菌脱イオン水６０μｌ中に精製した
。

【００８８】 ＰＣＲ反応からの精製産生物は、ライゲーションのための付着末端を提供する
ために上記表２に示される適当な酵素で制限エンドヌクレアーゼ消化された。制
限酵素消化後、ＭＥＲｍａｉｄ ＫｉｔまたはＭＥＲｍａｉｄ ｓｐｉｎ Ｋｉｔ のいずれかを用いて溶液から該ＤＮＡを精製して該ＤＮＡを無菌脱イオン水３０
μｌ中に緩衝液交換した。

【００８９】 制限部位が適当に切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（ストラー
タジーン（Stratagene））と適合するＰＣＲ産生物をライゲートした。ライゲー
トしたＤＮＡを、ストラータジーンから購入したコンピテントイー・コリ（E. c
oli）ＸＬ１−ブルー中に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ Ｂ−寒天プレート上でアンピシリン耐性形質転換体を選択した。得られたコロニ
ーから抽出したプラスミドＤＮＡを、最初に、制限酵素消化により同定して、Ｐ
ＣＲ産生物の挿入を確認し、次いで、ファジー変種の配列をＤＮＡ配列決定によ
り決定した。

【００９０】 別法として、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ポリメラーゼ（ストラータジーン）を用いて
変更した反応において上記したファジーオリゴヌクレオチド対およびＰＣＲプラ
イマーを用いてファジーＣ３ｄフラグメントを得た。ＰＣＲ反応は、上記表２に
記載した組合せで最終濃度１ｎＭのファジーオリゴヌクレオチドおよび２μＭの
ＰＣＲオリゴヌクレオチドを含む１００μｌの全反応容量中で行い、これに、５
ｍＭ ｄＮＴＰ ４μｌ、ｘ１０ Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液（ストラータジーン ）１０μｌ、脱イオン水９９μｌまで、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ポリメラーゼ（２０
単位）（ストラータジーン）２μｌを添加した。温度サイクルは、全ての反応に
ついて同一であった：９５℃で５分間、次いで、５０℃／１分、６８℃／１分、
９５℃／１分のサイクルを３０回；これに次いで、６８℃で７分間インキュベー
トした。典型的には長さ１８０−２００塩基対の得られた産生物を、製造業者の
取扱説明書に従って、Ｇｅｎｅ−Ｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ カラム（バイオ１０１（
Bio101））を用いて１.５％アガロースゲルから精製した。

【００９１】 精製フラグメントを用いてベクターｐＢＰ６６−０１を突然変異誘発し、それ
により、製造業者のプロトコールを変更したプロトコールを用いてＱｕｉｃｋＣ
ｈａｎｇｅ突然変異誘発（ストラータジーン）を用いてファジー配列のパッチを
野生型配列に導入した。突然変異誘発反応は、典型的には、ファジーＤＮＡフラ
グメント０.５μｇ、ｐＢＰ６６−０１ ０.５μｇ、５ｍＭ ｄＮＴＰ ２μｌ、 キット中に供給される緩衝液５μｌ、脱イオン水４９μｌまで、およびＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ポリメラーゼ（１０単位）（ストラータジーン）１μｌを含んだ。 サイクリング条件および次の段階は、多重突然変異についての製造業者のプロト
コールに記載されているとおりであった。該反応物を、ストラータジーンから購
入したコンピテントイー・コリＸＬ１−ブルー中に形質転換した。５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含むＬＢ−寒天プレート上でアンピシリン耐性形質転換体を選
択した。得られたコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡを、最初に、制限酵素
消化により同定し、ＤＮＡ配列決定により確認する。種々のファジーフラグメン
トを用いて突然変異誘発を数回繰り返し、次いで、標準的な製造業者プロトコー
ルを用いてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発を用いて誤差補正する。突然変
異誘発および配列決定を数回繰り返した後、完全なファジーＣ３ｄ遺伝子のライ
ブラリーを得、該ライブラリーから、野生型Ｃ３ｄ配列からの正しい配列および
最大変異を有するものを選択する。

【００９２】 実施例４． Ｃ３ｄ配列の変異体を用いた、(Ｃ３ｄ)３をコードするファジー遺
伝子の構築および発現 (ａ)ｐＢＰ６８-３０シリーズの構築：相同的組換えに耐性がある(Ｃ３ｄ)３の ためのバキュロウイルスベクター ｐＢＰ６８-３０〜ｐＢＰ６８-３９は、反復継代により昆虫細胞で相同的組換
えに耐性があると証明されている(一般法(ix)を参照されたい)、第一および第二
のＣ３ｄ領域で第三塩基の「ゆらぎ」部位に配列変異を誘導した配列変異による
、Ｃ３ｄ配列の３つの異なる変異体を含む。プラスミドのｐＢＰ６８-３０シリ ーズは、２つのステップで構築した。1番目のステップでは、ｐＢＰ６８-０１を
、各Ｃ３ｄ領域内で１回切断する制限酵素ＳａｃＩで切断した。６７２５塩基対
ベクター断片を精製し、自己連結させてｐＢＰ６６-０１を作成した。ｐＢＰ６ ６-０１は、アミノ末端にシグナルペプチドを、カルボキシ末端にGlu-Glu-Pheタ
グを含む単一Ｃ３ｄ領域を含む。ｐＢＰ６６-０１をＸＬ-１blue-イー．コリに 形質転換し、生じたコロニーからＤＮＡを抽出し、制限酵素切断により分析した
。

【００９３】 ２番目のステップでは、ｐＢＰ６６-０１を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断した。 ファジーＣ３ｄ領域または断片を、実施例３(ｂ)に記載のように集めた。ＰＣＲ
断片または完全長の産物または、該産物をサブクローニングしたプラスミドベク
ターをＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで切断し、単一のファジーＣ３ｄ領域をコードし
ている９３６塩基対のＤＮＡ断片を精製し、この断片とつないだ。ファジーＣ３
ｄの小さい方の断片も、実施例３(ｂ)で作成することができ、これらは適当な制
限酵素で切断し、相溶性の凝集性末端を作成し、完全長のファジーＣ３ｄ領域を
再構築した。 ファジーＣ３ｄ領域の個々の変異体の配列は、ｐＢＣ００-０２のようなホー ルディングベクター(以下を参照されたい)にサブクローニングした後、このライ
ゲーションの前に決定してもよく、またはライゲーションは、実施例３(ｂ)で生
じた未特定および異性分から成る可能性のあるＰＣＲ産物を用いて行ってもよい
。 生じたプラスミドは、単一のファジーＣ３ｄ領域がｐＢＣ００-０２へクロー ニングされたｐＢＣ６６-１０〜１９、ベクターが１つのファジーＣ３ｄ領域お よび１つの変異Ｃ３ｄ領域を含むｐＢＰ６７-２０〜ｐＢＰ６７-２９、または、
ベクターが２つの異なるファジーＣ３ｄ領域と１つの変異Ｃ３ｄ領域を含むｐＢ
Ｐ６８-３０〜ｐＢＰ６８-３９と指定する。

【００９４】 これとは別の方法として、プラスミドｐＢＰ６６-０１を位置指定突然変異誘 発に供し、ＰＣＲプライマー対Ｆｕｚ１３およびＦｕｚ１４(配列特定番号１３ ／１４)を用いて配列特定番号３２に従い番号をつけたｐＢＣ６６-０１の１７１
３部位に新規なＸｈｏＩ部位を作成し、；ＰＣＲプライマー対Ｆｕｚ１５／Ｆｕ
ｚ１６(配列特定番号１５／１６)を用いてｐＢＣ６６-０１の１８６６部位に新 規なＸｍａＩ部位を作成し、；ＰＣＲプライマー対Ｆｕｚ１７／Ｆｕｚ１８(配 列特定番号１７／１８)を用いてｐＢＣ６６-０１中の２０６０部位に新規なＢｃ
ｌＩ部位を作成し、；ＰＣＲプライマー対Ｆｕｚ２１／Ｆｕｚ２２(配列特定番 号２１／２２)を用いてｐＢＣ６６-０１中の２２２２部位に新規なＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位を作成するように、表２に記載される、ファジーＣ３ｄのサブ領域を表す
ＰＣＲ産物の末端に設計される制限酵素部位に対応するユニークな制限酵素部位
を導入する。これらの制限部位および変異配列中３９３部位に存在するユニーク
なＰｖｕＩＩ部位を用いて、変異Ｃ３ｄ配列の特異断片を切除する。これらを、
相溶性の凝集性末端を有する、実施例３(ｂ)で作成した対応するファジーＣ３ｄ
断片、同一のアミノ酸をコードしている配列だが、実施例３(ａ)に記載のような
第３塩基の「ゆらぎ」部位でのファジーＤＮＡ配列と置きかえる。 結果的に生じた、制限部位に変異Ｃ３ｄ配列を導入したプラスミドは、ｐＢＰ
６６-０２(ＸｈｏＩ部位)、ｐＢＰ６６-０３(ＸｍａＩ部位)、ｐＢＰ６６-０４(
ＢｃｌＩ部位)、ｐＢＰ６６-０５(ＨｉｎｄＩＩＩ部位)と指定する。

【００９５】 (ｂ)バキュロウイルス／Ｓｆ９系統でのＣ３ｄ配列のファジー遺伝子変異体を
用いた(Ｃ３ｄ)３の発現 組換えバキュロウイルスをこの実施例のセクション(ａ)に記載のように構築し
たプラスミドから作成し、「実施例に用いられる一般法」セクション(viii)から
(x)に記載の方法に従い、コードされたポリペプチドを発現するのに用いる。

【００９６】 (ｃ) ファジー変異体から発現される(Ｃ３ｄ)３の精製と性質決定 (Ｃ３ｄ)３タンパクを、一般法(General Methods)のセクション(ｘｉｖ)に記 載のように精製する。精製されたタンパク質を、セクション(ｘｖｉｉ)に記載の
方法により生物学的に性質決定し、セクション(ｘｖ)および(ｘｖｉ)(ｂ-ｃ)に 記載のように物理的に性質決定し、その正確な質量を質量分析により決定する。
Ｎ末端配列も決定する。

【００９７】 (ｄ)ｐＢＣ６６-１０、ｐＢＣ６７-１０、ｐＢＣ６８-１０の構築：相同的組 換えに耐性のある(Ｃ３ｄ)３のためのイー．コリベクター ｐＢｒｏｃ４１３を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＰｓｔＩを用いて
切断し、ベクター断片を０．９％(ｗ/ｖ)寒天ゲルから単離する。ｐＢａｋＰａ ｋ８ベクターと細菌発現ベクター間のＣ３ｄ変異体の交換に適した新規なマルチ
クローニング部位を作るために、配列特定番号３８と３９に記載される新規なポ
リリンカー部位をベクター断片に連結する。この新規なベクターはｐＢＣ００- ０２と指定する。

【００９８】 ｐＢＰ６８-１０〜１９と指定したプラスミドは、１つのファジーＣ３ｄ領域 をコードする。シリーズｐＢＰ６７-２０〜２９は、１つのファジーＣ３ｄ変異 体と未変性のＣ３ｄ配列をコードし、ｐＢＰ６８-３０〜３９は２つのファジー Ｃ３ｄ変異体と未変性のＣ３ｄ配列を含む。これらのプラスミドを制限エンドヌ
クレアーゼＢｇｌＩＩとＥａｇＩで切断し、断片をコードしているＣ３ｄを１％
(ｗ／ｖ)寒天ゲルから精製する。ＰＢＣ００-０２を同様にＢｇｌＩＩとEａｇＩ
で切断し、大きい方の断片(ベクター断片)を０．９％(ｗ／ｖ)寒天ロースゲルか
ら精製する。 ベクター断片とＣ３ｄをコードしている断片を連結し、イー．コリ XI-1 blu
eに通常の条件下で形質転換し、クローンを単離し、制限マッピング(restrictio
n mapping)によりスクリーニングした。新規プラスミドは、：１つのファジーＣ
３ｄ領域をコードしているｐＢＣ６８-１０〜１９、１つのファジーＣ３ｄ変異 体と未変性のＣ３ｄ配列をコードしているｐＢＣ６８-２０〜２９および、２つ のファジーＣ３ｄ変異体と未変性のＣ３ｄ配列を含むｐＢＣ６８ ３０-３９と 指定する。

【００９９】 実施例５ バキュロウイルスベクターの構築とシステイン末端を有するＣ３ｄモ
ノマーの昆虫細胞における発現 (ａ)ｐＢＰ６６-０６の構築 Ｃ末端システインをプラスミドｐＢＰ６６-０１の位置指定突然変異誘発によ り導入し、ｐＢＰ６６-０６を作製した。このプラスミドは、次の配列を有する オリゴヌクレオチドを用いて位置指定突然変異誘導に供した。 ＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＡＧＡＧＴＴＣＴＧＡＧＧ(配列特定番 号３３)およびＣＣＴＣＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＧ Ｇ(配列特定番号３４)。位置指定突然変異誘発は、ストラタジーン(Stratagene)
(Cambridge UK.)から入手した「クイックチェンジ(Quick Change)」キットを用 いて製造者のプロトコルに従い行った。生じたプラスミドｐＢＰ６６-０６をス トラタジーンから購入したコンピテントイーコリXL1-blueに形質転換した。アン
ピシリン耐性形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むLB-寒天プレー ト上で選抜した。生じたコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡを、最初に制限
酵素切断により同定し、ＤＮＡのシークエンスにより確認した。

【０１００】 (ｂ)バキュロウイルス／Ｓｆ９系統におけるシステイン末端を有するＣ３ｄ配列
の発現 組換えバキュロウイルスをこの実施例のセクション(ａ)に記載されるように構
築したプラスミドから作成し、「実施例で用いられる一般法」セクション(ｖｉ ｉｉ)〜(ｘ)に記載される方法に従ってコードされたポリペプチドを発現させる ために用いた。

【０１０１】 (ｃ)Ｓｆ９／バキュロウイルス系統におけるシステイン末端を有するＣ３ｄの精
製と性質決定 (Ｃ３ｄ)-ｃｙｓ末端タンパク質を一般法のセクション(xiv)に記載のように精
製し、セクション(xvii)に記載の方法により生物学的に性質決定し、(XV)と(xvi
)(ｂ-ｃ)に記載されるように物理的に性質決定する。

【０１０２】 (ｄ)Ｃ３ｄ-ｃｙｓまたは(Ｃ３ｄ)３-ｃｙｓの抗原との結合 精製したＣ３ｄ_n-ｃｙｓをトリス(２-カルボキシメチル)ホスフィン．ＨＣｌ(
ＴＣＥＰ)で処理し、Ｃ末端システイン上のいずれのブロッキング部位(blocking
moiety)も除去する。ついでＣ３ｄ_n(１０μＭ；１ｍｌ)をＴＣＥＰ(５０ｍＭヘ
ペスｐＨ４．５中５ｍＭ；０．００８ｍｌ)と混合し、２０から２５℃で約１８ 時間インキュベートし、溶液Ａを得る。抗原は、一般的には、適当な結合基の化
学的吸着により抗原へと調製し、その後、(Ｃ３ｄ)３分子上の遊離システインへ
結合する。抗原(０．１ＭトリエンｐＨ８．０中２０μＭ；１．０ｍｌ)を、２- イミノチオラン(０．１ＭトリエンｐＨ８．０中１０ｍＭ；０．０１ｍｌ)と混合
し、２０から２５℃で１時間インキュベートする。ＤＴＮＢ(０．１Ｍトリエン ｐＨ８．０中１００ｍＭ；０．０１ｍｌ)を添加し、混合物をさらに１時間置い た。混合物を次いでセファデックスＧ２５(ＰＤ１０；ファルマシア)を用いて０
．１ＭトリエンｐＨ８．０(２．０ｍｌ)にバッファー交換し、溶液Ｂを得る。溶
液Ｂ(１．０ｍｌ)を溶液Ａ(１．０ｍｌ)と混合し、任意に限外濾過により濃縮し
ながら２０℃から２５℃で１８時間インキュベートし、溶液Ｃを得る。溶液Ｃを
任意に濾過し、未反応の物質を例えばサイズイクスクルージョンクロマトグラフ
ィーにより除去し、最終生成物へと調製する。この調製は、後に滅菌濾過、等分
および凍結を続ける、例えばリン酸緩衝塩水のような物理的に許容されるバッフ
ァーへのバッファー交換を含んでもよく、または、凍結乾燥に適したバッファー
へのバッファー交換を含んでもよい。

【０１０３】 実施例６ バキュロウイルスベクターの構築および昆虫細胞におけるシステイン
末端を有するＣ３ｄ３の発現 ａ)ｐＢＰ６６-０８の構築 ｐＢＰ６６-０８を、Ｃ３ｄ-Ｃｙｓの単一コピーを含むバキュロウイルス転移
ベクターであるｐＢＰ６６-０６(実施例５を参照されたい)から誘導した。ユニ ークなＫｐｎＩ制限部位を、ベクター内のシグナルペプチドとＣ３ｄコード配列
との間に設計し、Ｃ３ｄ配列の追加のコピーを挿入できるようにした。ここで、
Ｃ３ｄの追加のコピーはもとのＣ３ｄ配列と異なり、また、互いに１０％以上相
違するが、Ｔｈ₁とＰｒｏ₂₉₅との間で同一であるポリペプチドをコードし、ポリ
ペプチド配列Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-
Serのような、実施例３に記載の方法を用いて得られるファジーＣ３ｄモノマー 遺伝子のようなリンカーまたはスペーサー配列をコードしてよい。 ＫｐｎＩ部位を導入するために、ｐＢＰ６６-０６に、以下の配列： ＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＡ(配列特定番号４１)および
ＧＧＴＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧ(配列特定番号４２)を
有するオリゴヌクレオチドを用いる位置指定突然変異誘発を適用した。位置指定
突然変異誘発は、ストラタジーン(Stratagene)(Cambridge UK)から入手した「ク
イックチェンジ(Quick Change)」キットを用い、製造者のプロトコールに従って
行った。その結果得られたプラスミド、ｐＢＰ６６-０８をストラタジーン(Stra
tagene)から購入したコンピテントイー・コリXL1-blueに形質転換した。アンピ シリン耐性形質転換体を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ-寒天プ レート上で選択した。その結果得られたコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡ
を、まず制限酵素切断によって同定し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。

【０１０４】 ｐＢＰ６７-０８およびｐＢＰ６８-０８の構築 ｐＢＰ６７-０８は、ｐＢＰ６６-０８のＫｐｎＩ部位に挿入された変異配列を
有するＣ３ｄの追加のコピーを含有する。ｐＢＰ６８-０８は、ｐＢＰ６６-０８
のＫｐｎＩ部位に挿入された変異配列を有する２つのＣ３ｄの追加のコピーを含
有する。Ｃ３ｄの追加のコピーの配列は、もとのＣ３ｄ配列と異なり、また、互
いに１０％以上相違するが、Ｔｈ₁とＰｒｏ₂₉₅との間で同一であるポリペプチド
をコードし、ポリペプチド配列Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-
Gly-Gly-Ser-Gly-Serのような、リンカーまたはスペーサー配列をコードしてよ い。実施例３に記載の方法を用いて得られるＣ３ｄモノマーを操作し、以下のプ
ライマー対：ＣＧＡＧＣＣＡＴＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＣＣＡＧＣ(配列特定 番号４３)およびＧＧＴＴＡＧＣＡＧＧＴＡＣＣＧＧＡＡＣＣ(配列特定番号４４
)を用いるＰＣＲによってＫｐｎＩ部位に挿入し、ついで、ＰＣＲ産物を制限酵 素ＫｐｎＩで切断する。

【０１０５】 ベクターｐＢＰ６６-０８をＫｐｎＩで切断してベクターのセルフライゲーシ ョンを防ぎ、ついで、製造者の使用説明書に従い、エビアルカリホスファターゼ
(Amersham Life Sciences Inc)とともにインキュベートする。その結果得られた
断片を、Ｃ３ｄの単一の変異配列またはＣ３ｄの１以上の変異配列の混合物をコ
ードしている可能性のあるＫｐｎＩ切断ＰＣＲ産物と連結した。当該連結ＤＮＡ
をストラタジーン(Stratagene)から購入したコンピテントイー・コリXL1-blueに
形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを
含有するＬＢ-寒天プレート上で選択した。その結果得られたコロニーから抽出 したプラスミドＤＮＡを、まず制限酵素切断によって同定し、Ｃ３ｄの１または
２の変種コピーの正しい方向で挿入されたこと確認し、ＤＮＡ配列決定により確
認した。

【０１０６】 (ｂ)バキュロウイルス／Ｓｆ９系統におけるシステイン末端を有するＣ３ｄ₂ま たはシステイン末端を有するＣ３ｄ₃配列の発現 本実施例のセクション(ａ)に記載のように構築したプラスミドから、組換えバ
キュロウイルスを生成し、これを用いて「実施例で用いられる一般法(General M
ethodology used in example)」セクション(viii)〜(x)に記載の方法に従って、
コードされているポリペプチドを発現させた。

【０１０７】 (ｃ)バキュロウイルス／Ｓｆ９系統におけるシステイン末端を有するＣ３ｄ₂ま たはシステイン末端を有するＣ３ｄ₃の精製および性質決定 Ｃ３ｄ_n-ｃｙｓ末端を有するタンパク質を一般法のセクション(xiv)に記載の ように精製し、セクション(xvii)に記載の方法により生物学的に性質決定し、お
よび(xv)および(xvi)(b-c)に記載のように物理的に性質決定した。

【０１０８】 実施例７ 細菌ベクターの構築およびエシェリキア・コリにおけるシステイン−テイルのＣ
３ｄモノマーの発現 （ａ）ｐＢＣ６６−０６の構築 プラスミドｐＤＢ１０３３を部位特異変異導入することでＣ−末端システイン
を導入してｐＢＣ６６−０６を形成させた。このプラスミドを以下の配列を有す
るオリゴヌクレオチドを用いて部位特定変異導入に供した： ＧＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＡＧＣ
（配列番号４５）および ＧＣＴＴＴＡＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＡＴＣＣ
（配列番号４６）。部位特異変異導入は、Stratagene（英国、ケンブリッジ）よ
り入手した「クイック・チェンジ」キットを用い、製造業者の指示書に従って行
った。得られたプラスミド、ｐＢＣ６６−０６を、Stratageneより購入したコン
ピテントエシェリキア・コリＸＬ１−ブルー中に形質転換した。アンピシリン耐
性形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ−寒天プレートよ
り選択した。まず、制限酵素消化により得られたコロニーから抽出したプラスミ
ドＤＮＡを同定し、それをＤＮＡ配列決定により確認した。Ｃ３ｄ１−ｃｙｓの
アミノ酸配列を配列番号２６に示す。

【０１０９】 （ｂ）Ｃ３ｄ１−ｃｙｓのｐＢＣ６６−０６からの発現 ｐＢＣ６６−０６を塩化カルシウムコンピテントエシェリキア・コリＢＬ２１
（ＤＥ３）中に形質転換させ、得られたコロニーを単離し、プラスミド含量につ
いて調べた。エシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中で蛋白をｐＢＣ６６−０
６より発現させるために、シングルコロニーを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
（シグマ）含有の１０ｍｌのＬＢ培地（２０ｇ／ｌのトリプトン、１５ｇ／ｌの
酵母エキス、０.８ｇ／ｌのＮａＣｌ、０.２ｇ／ｌのＮａ₂ＨＰＯ₄、０.１ｇ／ ｌのＫＨ₂ＰＯ₄）に植菌した。使用する前に、培養体を３７℃、２６０ｒｐｍで
６時間増殖させ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２５０ｍｌの同じ培
地に植菌し、増殖を同じ条件で一夜行った。ついで、２０ｍｌの一夜培養体を用
いて、５Ｌのエルレンマイヤーフラスコ中、各１０００ｍｌの５個のＬＢを５０
μｇ／ｍｌで植菌した。細胞をＡ₅₅₀ｎｍ、３７℃、２００ｒｐｍで約０.６のＯ
Ｄにまで増殖させた。蛋白の発現を誘発するのに、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−
Ｄガラクトピラノシド）を１ｍＭの最終濃度にまで添加し、細胞を２０℃、２０
０ｒｐｍで約１６時間インキュベートし、３０００ｇ／２５分間で遠心分離に付
すことで細胞を収穫した。５Ｌの培養体からの細胞ペレットを即座に処理した。

【０１１０】 （ｃ）（Ｃ３ｄ）１−ｃｙｓの精製 （ｉ）可溶性Ｃ３ｄ１−ｃｙｓの単離 エシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＢＣ６６−０６）の細胞ペレット
を、０.１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μＭ ３,４-ジクロロイソコウ
マリンおよび１０μＭ Ｌ−トランスエポキシスクシニル−ロイシルアミド−（ ４−グアニジノ）−ブタン、Ｎ-［Ｎ-（Ｌ−３−トランスカルボキシラン−２−
カルボニル）−Ｌ−ロイシル］アグマチンを含有する、約１００ｍｌの５０ｍＭ
トリス（ｐＨ８.０）に懸濁させた。その懸濁液を高圧ホモジネーター（エマル
シフレックスＣ５）に移し、４℃に冷却し、その懸濁液を１２０００ｐｓｉのホ
モジネーターに２回通すことで細胞を破壊した。そのホモジネートを９０００ｇ
で２０分間回スピン処理に付した。上澄みをデカントし、−４０℃で貯蔵し、ペ
レットを捨てた。

【０１１１】 （ｉｉ）可溶性Ｃ３ｄ１−ｃｙｓの精製 可溶性ホモジネートフラクションを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７.５）を用い
て１；１に希釈し、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７.５）で前平衡にしたＭａｃｒ
ｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ−Ｑカラム（バイオラッド、約１０００ｍｌのベッド容量 ）に加えた。そのカラムを５００ｍｌ以上の０ないし０.３５Ｍの線形ＮａＣｌ グラジエントのＮａＣｌを用いて溶出した。Ｃ３ｄ１−ｃｙｓを含有するフラク
ションを、一般的方法のセクション（ｘｖ）および（ｘｖｉｂ）に記載のＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより評価し、さらに精製するため
にプールし、−４０℃で貯蔵した。

【０１１２】 Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ−Ｑ精製からのＣ３ｄ１−ｃｙｓを含有するフ ラクションを、４Ｍ 硫酸アンモニウム、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.５）に
て１：１に希釈した。この溶液を２Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ （ｐＨ７.５）で前平衡にしたエーテル−トーヨーパール（ｅｔｈｅｒ−Ｔｏｙ ｏｐｅａｒｌ）カラム（ベッド容量２５ｍｌ、トーヨーハス（ＴｏｙｏＨａａｓ
））に加え、０Ｍの硫酸マグネシウムまでの線形グラジエントで溶出した。フラ
クションを一般的方法のセクション（ｘｖ）および（ｘｖｉｂ）に記載されるよ
うにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより純度について評価
した。Ｃ３ｄ−ｃｙｓを含有するフラクションをプールし、−４０℃で貯蔵した
。

【０１１３】 最終カラムに加える前に、エーテル−トーヨーパールカラムからのプールした
Ｃ３ｄ−ｃｙｓを含有するフラクションを緩衝化し、１ｍＭ塩化マグネシウムを
含有する５００倍過剰容量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）に対する透析 により交換を行った。その透析物を、１ｍＭ塩化マグネシウム含有の１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６.８）で予め平衡にした２０ｍｌのベッド容量の８０μＭ マ
クロプロプ・セラミック−ヒドロキシアパタイト（Ｉ型、バイオラッド）に加え
た。典型的には非結合フラクションに、および５ｍＭ塩化マグネシウムにあるＣ
３ｄ−ｃｙｓを溶出し、カラムに結合した他のすべての不純物を０.３Ｍリン酸 塩（ｐＨ６.８）に溶出させた。フラクションを、一般的方法のセクション（ｘ ｖ）および（ｘｖｉｂ）に記載されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン
ブロッティングにより純度について評価した。９０％より大きな純度のＣ３ｄ−
ｃｙｓ含有フラクションをプールし、−４０℃で貯蔵した。

【０１１４】 実施例８：Ｃｄ３ｃｙｓおよび（Ｃ３ｄ）ｎ−ｃｙｓを抗原にカップリングさせ
るための三機能性リンカー試薬 Ｎ−アセチル−Ｌｙｓ−（Ｎ−ε−ＰＤＰ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ＰＤＰ
）−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ＰＤＰ）−ＯＨ（ＰＤＰ＝３−（２−ピリジル「
ジチオ）プロペオニル、すべてＬ−体） ペプチド：Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（配列番号：４
０）を、シェパードおよびアサートン（SheppardおよびAtherton）（E.Atherton
およびR.C.Sheppard、固相合成、ＩＲＬプレス、オックスフォード、１９８９）
により開発された総合的Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法を介する固相合成を用いて調製した
。固体支持体としてキーゼルガー支持のポリジメチルアクリルアミド樹脂（マク
ロソルブ（Ｍａｃｒｏｓｏｒｂ１００））を用い、それをエチレンジアミンで誘
導した。Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール（４倍モル過剰量）で予め活性化したＮ−α−Ｆｍｏｃ保護試薬を用いて
ブロモフェノールブルーをモニターしながらカップリング反応を行った。Ｆｍｏ
ｃの切断にはＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いた。ペプチド鎖を組み立てる反応
はカップリングと脱保護のサイクルを繰返すことで行った。リジンはｔ−Ｂｏｃ
基を用いて保護した。

【０１１５】 ペプチドの組み立てを終え、ペプチドをまだ樹脂に結合させたまま、無水酢酸
で処理することで、アセチル基をＮ−末端グリシンのアミノ基に結合させる。つ
いでこの修飾ペプチドを樹脂より切断し、それと同時に２.５％水および２.５％
トリイソプロピルシラン含有のトリフルオロ酢酸で処理することにより側鎖保護
基を除去した。保護基を中和し、乾燥させ、３.３当量過剰量の３−（２−ピリ ジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−オキシスクシンイミドエステルと反応させ、つい
でアセトニトリル中０.１％トリフルオロ酢酸を含む水中０.１％トリフルオロ酢
酸のグラジエントを用いる逆相高性能液体クロマトグラフィーにより精製した。
生成物は純度が約９２％であった。高速原子衝撃質量分析により、１１７８.４ ダルトンの分子イオンを得た（計算値：１１７７.２）および１２００.４ダルト
ンの一ナトリウム化イオンを得た。

【０１１６】 このペプチドを以下のように蛋白誘導化のために活性なエステル形態に変換し
た。ペプチド（２０ｍｇ）を室温の乾燥Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（０.５ｍ
ｌ）に溶かし、Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（４.５ｍｇ）を加え た。溶液を室温で１５分間反応させて沈殿物を濾過により取り除いた。Ｎ−ヒド
ロキシスルホンスクシンイミド（４.５ｍｇ、１当量）を加え、その溶液を室温 で一夜反応させた。溶媒を真空蒸発により除去して白色固体を得、それを−４０
℃のデシゲーターの中で貯蔵した。

【０１１７】 実施例９：結合チオール化反応を用いるＣ３ｄｃｙｓとＣ３ｄ_nｃｙｓの抗原と の化学カップリング反応 抗原は、都合よくは、過剰量の反応性ジスルフィド、例えば、上記したような
２,２'−ジチオビス（５−ニトロ安息香酸）［ＤＴＮＢ］の存在下で２−イミノ
チオランと反応させることにより遊離システインを含有するペプチドと反応する
ように、さらに誘導化することができる。

【０１１８】 メロゾイト表面蛋白−１（ＭＳＰ−１／１９）の組換え１９ｋＤａフラグメン
ト（０.０５Ｍリン酸ナトリウム、０.１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７.４、ＰＢＳ 中、４.３２ｍｇ／ｍｌのフラグメント２００μｌ）を０.１Ｍトリエタノールア
ミン塩酸塩（ｐＨ８.０、０.５ｍｌ）と混合し、つづいて５０μｌのジメチルス
ルホキシド中１００ｍＭ ＤＴＮＢと２０μｌの水中新たに調製した１００ｍＭ ２−イミノチオランと混合した。その混合物を２５℃で９０分間インキュベート
した。生成物を使捨てセファデックスＧ−２５カラムを用いて４℃のＰＢＳ（２
.０ｍｌ）中にゲル濾過した。この物質のアリコートを２ｍＭ Ｌ−システインを
用いて還元し、４１２ｎｍでの光学密度の変化、活性化ジスルフィドのよる置換
度より、蛋白１モル当たりＤＴＮＢ／３−チオプロパミジンジスルフィドの混合
物が約２.３モルであると評価した。

【０１１９】 この物質を約３倍モル過剰量のＣ３ｄ−ｃｙｓと混合し、約１０ｋＤａまでの
分子量をカットするセントリコン（Centricon）−１０遠心分離濃縮器を用いて 元の体積の約２０％に濃縮した。ついで、生成物をセファデックスＧ−１００ゲ
ル浸透クロマトグラフィーカラムに加え、排除体積付近で溶出する生成物を集め
た。約５０ｋＤａより小さい分子量の物質は修飾されていない出発物質またはＣ
３ｄ−ｃｙｓとの一接合体であり、それらを捨てた。

【０１２０】 実施例１０：三機能性カップリング試薬を用いるＣ３ｃｙｓおよびＣ３ｄ_nｃｙ ｓの抗原との化学カップリング 実施例８のペプチドの活性エステル誘導体を乾燥ジメチルスルホキシド中約２
ｍＭの濃度にまで溶かし、０.２ｍＭの最終濃度にまでＭＳＰ−１／１９の溶液 （ＰＢＳ中約０.２ｍＭ）に加えた。生成物を２５℃で１時間インキュベートし 、ついで実施例９に記載したように、小さなゲル濾過カラム上のクロマトグラフ
ィーに付した。ついで、この生成物を上記したようにＣ３ｃｙｓと混合し、濃縮
し、セファデックスＧ−１００上の分画化により精製した。

【０１２１】 実施例１１：Ｃ３ｄに融合したマラリア抗原の発現用ベクターの構築 プラスモジウム（Plasmodium）種のマラリア寄生虫のメロゾイト表面蛋白（Ｍ
ＳＰ−１）のＣ末端より由来の１９ｋＤａ蛋白はマラリア感染に対する免疫原と
して用いることができる。プラスモジウム・ヨエリ（Plasmodium yoelii）（マ ウスマラリア）をヒト疾患のモデルとして用いる。プラスモジウム・ヨエリのＭ
ＳＰ−１の１９ｋＤａのカルボキシ末端フラグメント（ＭＳＰ１₁₉）（プラスモ
ジウム・ヨエリのアミノ酸Ｈｉｓ₁₆₁₉ないしＳｅｒ₁₇₅₄）をコードする遺伝子に
融合したＣ３ｄのコピーを３個有するプラスミドを構築する。ＭＳＰ１１９をコ
ードするＤＮＡをプラスミドｂＧＳＴ−ＭＳＰ１（１９）より得る（Tianら、１
９９６、J.Immunology １５７、１１７６−１１８３）。適当なフランキング制 限部位を有するＭＳＰ１１９遺伝子を増殖し、ＭＳＰ１₁₉のＣ３ｄの第１のコピ
ーのアミノ末端またはＣ３ｄの第３のコピーのカルボキシ末端のいずれかにイン
フレーム融合させるように、ＰＣＲプライマーを設計する。

【０１２２】 実施例１５：インテイン融合蛋白としてのＣ３ｄオリゴマーの発現および精製 （ａ）ｐＢＰ８１−０１およびｐＢＰ８３−０１の構築 この実施例においては、選択された抗原に直接共有結合するように、カルボキ
シ末端反応性チオエーテルを有する、形態のＣ３ｄまたはＣ３ｄオリゴマーを発
現させる。天然のＣ３ｄ配列は、通常、最初のＣ３を埋め、Ｃ３ｂおよびそのフ
ラグメントにおける抗原に結合する部位である、チオールエステルを有している
ことに留意すべきである。プラスミドｐＳＧ．Ｃ３ｄ₁ＹＬおよびそのフラグメ ントにおいて、天然のチオエステルの生合成前駆体であるシステイン残基は変異
して、組換えＣ３ｄ蛋白のジスルフィド結合形成における干渉を防止する（Demp
seyら、Science ２７１、３４８−３５０，１９９６）。この構築物において、 チオエステルはＣ３ｄドメインのＣ−末端まで効果的に動いている。

【０１２３】 ベクターｐＢＰ６６−０１あるいはｐＢＰ６８−２０ないしｐＢＰ６８−２９
のシリーズのいずれかのＣ３ｄのカルボキシ末端を部位特異変異導入により修飾
し、オリゴヌクレオチド番号５０３９１（配列番号３５） （ＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣ）およ
び番号５０３９２（配列番号３６） （ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＣＣＡＣＴＧＣＴＧＣ） を用いて新規な制限部位ＳｐａＩおよびＰｓｔＩを導入する。部位特異変異導入
をStratageneより購入した「クイック・チェンジ」キットを用い、製造業者の使
用説明書に従って行う。得られたプラスミド、ｐＢＰ６６−０７およびｐＢＰ６
８−５０ないしｐＢＰ６８−５９をStratageneより購入したコンピテントエシェ
リキア・コリＸＬ１−ブルーに形質転換する。アンピシリン耐性形質転換体を５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ−寒天プレート上で選択する。得ら
れたコロニーより抽出したプラスミドＤＮＡをまず制限酵素消化により同定し、
ＤＮＡ配列決定により確認した。

【０１２４】 ｂ）ｐＢＰ６６−０７およびｐＢＰ６８−６０ないしｐＢＰ６８−６９の構築 ｐＢＰ８１−０１およびｐＢＰ８３−５０ないしｐＢＰ８３−５９は、インテ
インおよびキチン結合ドメインに関する遺伝子を野生型のＣ３ｄの下流あるいは
１またはそれ以上のドメインがファジーであり、均一な組換えを妨げる（Ｃ３ｄ
）３の下流にて、インフレームでクローンされる。そのインテインおよびキチン
結合ドメイン配列は、商業上入手可能なプラスミドｐＣＹＢ１（ニュージランド
・バイオラブス）を酵素ＳａｐＩおよびＰｓｔＩで消化し、以下、「フラグメン
ト１と称する」１５６０塩基対のフラグメントを精製することで得られる。ｐＢ
Ｐ６６−０７およびｐＢＰ６８−５０ないしｐＢＰ６８−６９をＳａｐＩおよび
ＰｓｔＩで消化し、６７１８塩基対のフラグメントをｐＢＰ６６−０７（フラグ
メント２）より精製し、８５９０塩基対のフラグメントをｐＢＰ６８−５０ない
しｐＢＰ６８−５９（フラグメント３ａ−３ｊ）より精製する。

【０１２５】 フラグメント１および２をＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートし、ｐＢ Ｐ８１−０１を得る。フラグメント３ａないし３ｊを、各々、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いてフラグメント１にライゲートし、ｐＢＰ８３−５０ないしｐＢＰ８３
−５９を得る。ライゲートしたプラスミドをStratageneより購入したコンピテン
トエシェリキア・コリＸＬ１−ブルーに形質転換した。アンピシリン耐性形質転
換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ−寒天プレート上で選択す
る。得られたコロニーより抽出したプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
消化により分析し、ＤＮＡ配列決定により確認した。

【０１２６】 （ｃ）インテインおよびキチン結合蛋白に融合したＣ３ｄオリゴマーの発現 組換えバキュロウイルスをこの実施例のセクションｂ）に記載するように構築
したプラスミドより形成し、それを用いて「実施例にて用いる一般的方法」セク
ション（ｖｉｉｉ）ないし（ｘ）に記載の方法に従ってコードされたポリペプチ
ドを発現する。

【０１２７】 （ｄ）カルボキシ末端反応性チオールエステルを形成するためのＣ３ｄ_n−イン テイン融合蛋白の精製および切断 Ｃ３ｄ_n−インテイン−キチン結合ドメイン融合蛋白をＳｆ９感染バキュロウ イルス細胞によって培地中に発現された物質から精製する。キチンビーズアフィ
ニティーカラム（ニューイングランド・バイオラブス、ハート）に加える前に、
その培地のｐＨを１０ＭＮａＯＨを添加することで８に修正する。培地の塩の濃
度を導電率で測定する。通常、約０.０８Ｍであり、ＮａＣｌ固体を培地に加え 、最終濃度０.５ＭのＮａＣｌを得る。

【０１２８】 Ｃ３ｄｎ−インテイン−キチン結合ドメイン融合蛋白を含有する上澄みをキチ
ンビーズアフィニティーマトリックスカラムに加え、「インパクトＩ（ＩＭＰＡ
ＣＴ Ｉ）」キット（ニューイングランド・バイオラブス、ハート、イングラン ド）の指示書に従って分離を行う。カラム上の切断はインテインとして知られて
いる蛋白スプライシング機構を利用しており、還元剤、例えば、ＤＴＴの存在下
でＣ３ｄ_nのＣ−末端とインテインのＮ−末端の間で自己切断反応される。この 反応の結果、溶出したＣ３ｄ_nはそのＣ−末端に反応性チオールエステルを有す る。アフィニティー精製して得られた蛋白は少なくとも９０％の純度を有してい
なければならず、抗原にカップリングする前に９０％よりも純度が低い場合には
、一般的方法のセクション（ｘｉｖ）に記載される方法を用いてさらに精製しな
ければならない。

【０１２９】 （ｅ）Ｃ３ｄ（ｎ）−チオエステルと抗原との反応 インテイン機構（上記したセクションｄ）によりＣ３ｄ_nのＣ−末端で切断す ることで産生した活性化チオールエステルを用いて抗原をその分子にカップリン
グさせることができる。チオールエステルを抗原の表面にある遊離求核物質、例
えば、アミノ酸リジンと反応させ、あるいはある環境下で、セリンおよびチロシ
ンなどのアミノ酸に含まれる、またはグリコシル化蛋白の糖基に含まれる、ヒド
ロキシル基と反応させる。抗原はチオールエステルの量に比べて少なくとも１０
倍モル過剰量で存在しなければならず、カラムより溶出した後の精製（Ｃ３ｄ）
ｎに加え、プロセッシングの間に、ＤＴＴ（競合求核物質として作用する）を除
去し、蛋白を一緒に濃縮することが好ましい。抗原−Ｃ３ｄの形成は質量分析お
よび／またはゲル電気泳動によりモニターし、その個体群中にある種をすべて検
出することができる。少なくとも１個のＣ３ｄの単位と１個の抗原の単位を含む
複合体は、例えば、ゲル濾過により分離することができ、あるいは多量体と単量
体を分離することのできるサイズ排除膜を介して分離することができる。

【０１３０】 実施例１３：（Ｃ３ｄ）３の種変異体をコードするファジー遺伝子の構築 上記した実施例で利用した配列はすべてネズミＣ３ｄ配列である。実施例３に
記載の方法を用いて、ヒト、ネコ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ウマおよびヤギを含
むが、これらに限定されるものではない、どのような種のためにもファジーＣ３
ｄ配列を創作し、１個のＣ３ｄドメイン、あるいはＣ３ｄの２個の独立したファ
ジー変異体ドメインおよび非変異体ＤＮＡ配列の１個のドメインを有する一連の
変異体を生成することができる。後の実施例すべてに記載されるその後の修飾を
同じように行うことができる。

【０１３１】 その配列が公知、例えば、ヒトの場合（de Bruin and Fey （１９８５）ＰＮ ＡＳ（ＵＳＡ）８２：７０８−７１２）、ファジーオリゴヌクレオチドは直接生
成することができ；配列が不明である場合には、ヒトまたはマウスのいずれかか
ら由来のＣ３ｄハイブリダイゼーションプローブを用いて同定することができ、
選択された種ライブラリーからのＣ３ｄをクローンし、配列決定することができ
る。

【０１３２】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 リチャード・アンソニー・ゴッドウィン・ スミス イギリス、エスジー８・５ディワイ、ハー トフォードシャー、ロイストン、グリー ン・ドリフト、ザ・マルティングズ、ユニ ッツ７アンド８、セカンド・フロアー、ア ドプロテック・リミテッド (72)発明者 パメラ・ジェーン・エリザベス・ローリン グ イギリス、エスジー８・５ディワイ、ハー トフォードシャー、ロイストン、グリー ン・ドリフト、ザ・マルティングズ、ユニ ッツ７アンド８、セカンド・フロアー、ア ドプロテック・リミテッド Ｆターム(参考） 4B024 DA02 DA06 EA02 GA11 GA18 GA19 HA12 HA15 4B064 AG01 AG31 CA02 CA10 CA19 CC24 CE10 CE14 DA01 4B065 AA26X AA90X AA91Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA45 4C084 AA02 AA06 AA07 BA02 BA19 BA20 BA21 BA22 BA23 CA53 DA01 NA14 ZB071 ZB072 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA86 EA31 FA74 GA21 GA26 GA30

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コドンの遺伝コードの第三の塩基の重複性のために、各々が
   少なくともアミノ酸３０個の同じポリペプチドをコードする、少なくとも２つの
   非同一ＤＮＡ配列の線状コンカテマーであって、該コンカテマーが、連続したリ
   ーディングフレーム中に該ポリペプチドのオリゴマーをコードする塩基配列を含
   む、または、からなる線状コンカテマー。
2. 【請求項２】 単一の不変システインコドンが１つのＤＮＡ配列に付加され
   、ユニークな、対になっていないシステインを有するポリペプチド誘導体をコー
   ドする請求項１記載のコンカテマー。
3. 【請求項３】 付加されたシステインコドンが配列の３’末端に位置し、対
   応するポリペプチドのＣ−末端でシステインをコードする請求項２記載のコンカ
   テマー。
4. 【請求項４】 コンカテマーが、１つ以上の抗原をコードする１つ以上の配
   列と融合している請求項１〜３いずれか１項に記載のコンカテマー。
5. 【請求項５】 コンカテマーが、１つ以上の抗原をコードする１つ以上の配
   列と融合し、単一のシステインコドンが、ただ１つの抗原コード配列に付加また
   は、そのフレーム内に挿入されている請求項１記載のコンカテマー。
6. 【請求項６】 １つの抗原をコードする１つの配列と融合している請求項４
   または５記載のコンカテマー。
7. 【請求項７】 コンカテマーの各ＤＮＡ配列が補体Ｃ３フラグメントＣ３ｄ
   またはそのアナログをコードする請求項１〜６いずれか１項記載のコンカテマー
   。
8. 【請求項８】 請求項１〜７いずれか１項記載の塩基配列および、それによ
   ってコードされるオリゴマーペプチドの発現用の調節配列または他の配列を含む
   発現ベクター。
9. 【請求項９】 請求項８記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の宿主細胞から請求項１〜７いずれか１項記
    載のコンカテマーを発現させ、発現した生成物を単離することを特徴とするコン
    カテマー化ポリペプチドの製造法。
11. 【請求項１１】 請求項２〜６いずれか１項記載のコンカテマーを発現させ
    、ユニークな、対をなしていないシステインと、少なくとも１つの抗原とを有す
    る発現したポリペプチドを単離し、分子間ジスルフィド結合の形成により単離し
    たポリペプチドをホモ−またはヘテロ−ダイマー化することを特徴とするコンカ
    テマー化ポリペプチドの製造法。
12. 【請求項１２】 請求項２〜６いずれか１項記載のコンカテマーを発現させ
    、ユニークな、対をなしていないシステインと、少なくとも１つの抗原とを有す
    る発現したポリペプチドを単離し、単離したポリペプチド中のユニークシステイ
    ン残基を、少なくとも２つのチオール反応性官能基を含む化学的リンカー基と複
    合（conjugate）させ、該複合ポリペプチドを単離することを特徴とするコンカ テマー化ポリペプチドの製造法。
13. 【請求項１３】 請求項１記載のコンカテマーを、フレーム内で、まず、自
    己スプライシング・インテイン（intein）・ポリペプチドをコードするＤＮＡ配
    列と、ついで、アフィニティークロマトグラフィーに有用なリガンド特異性を有
    するタンパク質ドメインをコードするＤＮＡ配列と融合させることによりＤＮＡ
    構築物を形成し、ＤＮＡ構築物を発現させ、該タンパク質ドメインに特異的な固
    定化リガンド上でのクロマトグラフィーにより発現された融合ポリペプチドを単
    離することを特徴とする化学的反応性コンカテマー化ポリペプチドの製造法。
14. 【請求項１４】 コンカテマーが、Ｃ３ｄまたはＣＲ２（ＣＤ２１）のもう
    １つ別のリガンドである繰り返しポリペプチド単位をコードし、かつコンカテマ
    ーが、細菌性インテイン配列と融合し、かつキチン結合ドメインとも融合し、発
    現された融合ポリペプチドが固定化されたキチン上でアフィニティークロマトグ
    ラフィーにより単離される、請求項１３記載の製造法による化学的反応性アジュ
    バントコンカテマー化ポリペプチドの製造法。
15. 【請求項１５】 請求項１３または１４の方法で製造した、単離したポリペ
    プチドチオールエステルを１つ以上の抗原タンパク質と結合させることを特徴と
    するコンカテマー化ポリペプチドの製造法。
16. 【請求項１６】 該ポリペプチドを１つの抗原タンパク質と結合させる請求
    項１５記載の製造法。
17. 【請求項１７】 請求項２または３記載のコンカテマーを発現させ、ユニー
    クシステイン残基を有する発現ポリペプチドを単離し、単離したポリペプチド中
    のユニークシステイン残基を、化学結合を介して１つ以上のチオール反応性官能
    基を含む抗原分子と結合させることを特徴とするコンカテマー化ポリペプチドの
    製造法。
18. 【請求項１８】 請求項４記載のコンカテマーと、生理的に許容される賦形
    剤または担体とを含む、または、からなる医薬組成物。
19. 【請求項１９】 請求項４記載のコンカテマーを含む請求項８記載のベクタ
    ーと、生理的に許容される賦形剤または担体とを含む、または、からなる医薬組
    成物。
20. 【請求項２０】 請求項４記載のコンカテマー、または請求項４記載のコン
    カテマーを含む請求項８記載のベクターを投与することを特徴とするヒトまたは
    動物において抗原に対する免疫応答を誘発させる方法。
21. 【請求項２１】 請求項１８または１９記載の医薬組成物を投与することを
    含む請求項２０記載の方法。