JPH02195895A - Ｂｃｇ菌由来免疫タンパクｍｐｂ７０ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はミコバクテリウム・ボビス（■三−ｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ（以下、ＢＣＧ菌と称す
る。）由来の免疫タンパクＭＰＢ７０　、該ＭＰ［１７
Ｇをコードする遺伝子、該遺伝子を組み込んだ組み換え
ベクター、該ベクターで形質転換した形質転換体、該形
質転換体を培養してヒトインターロイキン２（以下、ヒ
トＩＬ−２と称する。）の部分フラグメントが結合した
ＢＣＧ菌由来免疫タンパクＭＰＢ７０を製造する方法、
該免疫タンパクＭＰＢ７Ｇのシグナルペプチド、該シグ
ナルペプチドをコードする遺伝子およびＢＣＧ菌のプロ
モーターに関する。

［従来の技術、発明が解決しようとする課題］ＢＣＧ菌
はマクロファージ内でも増殖可能な結核菌のうちウシ型
結核菌を２０年以上人工培地上で継代培養して得られた
弱毒株であり、次に示す特徴を有している。

（１）細菌ワクチンの中では現在唯一の生菌ワクチンと
して用いられている。

（２）毒性が極めて弱い。

（３）結核感染のみならず一般に強い非特異的細膓性免
疫増強作用がある。

−Ｂ　ＣＧ菌東京株が分泌する抗原タンパクＭＰＢ７０
の分湯量は全分泌タンパクの１０％以上になる（１ｎｆ
ｏｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、、３１．１１５２（１９８１）］
　、免疫タンパクＭＰＢ７０の高分泌にはプロモーター
、　ＳＤ配列、シグナルペプチド等が重要な役割を果し
ていると考えられ、将来その利用が期待されている。

ところで、ウシ型結核菌に感染した牛は市販されている
ツベルクリンタンパクでは鑑別することが難しく、また
市販の生化学的同定法によるキットも培養に時間がかか
り（約３週間）、技術的にも困難が伴なう。

このＭＰＢ７０タンパクはＢＣＧ菌および強電クシ型結
核菌に特異的に存在し、免疫反応（抗原抗体反応、遅延
型皮膚反応など）でその特異性が認められる［Ｉｎｆｅ
ｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、、３１．１１５２（１９８１）］　
。

牛はウシ型結核に罹患すると、他の牛や人への伝染を防
ぐために屠殺される。また、ツベルクリン陽性の乳牛も
不適格となる。それ故、牛の結核菌感染と他の抗酸菌の
感染を区別することが畜産上重要であるが、現在のとこ
ろ、その鑑別は極めて難しい、　ＭＰＢ７０タンパクは
その特異性により牛の結核診断に応用できる［Ｉｎｆａ
ｃｔ、Ｌｓｍｕｎ、、５６，９２１（１９８Ｂ））ので
、産業上特に重要である。

今回、発明者によりクローニングに成功したタンパクＭ
ＰＢ７０の遺伝子を大腸菌で発現させ、そのリコンビナ
ントタンパクをＥＬＩＳＡ法で感度の高い診断薬に利用
することが可能である。

タンパクＭＰＢ７０のアミノ酸配列についてはＭ、Ｅ。

Ｐａｔａｒｒｏｙｏらの報告［Ｌｅｐｒ、Ｒｅｖ、、５
７，５ｕｐｐｌｅ　２゜１６３、１９８６１があるが、
化学的手段により決められたアミノ酸配列は本発明者の
得た知見とかなり異なっている。また、Ｒａｄｆｏｒｄ
らはタンパクＭＰＢ７０の遺伝子をクローニングしてア
ミノ酸配列を決めている［Ｉｎｆｏｃｔ、　ｌｍ５ｕｎ
、　、５６　、９２１　（１９８８）　］けれども、彼
らの配列にはＮ末端部分とＣ末端部分が含まれておらず
Ｐｒｏ　（Ｎｏ、１６）からＴｙｒ（ＮＯ，１００）ま
での８４個のアミノ酸配列とそれをコードするヌクレオ
チド配列のみが報告されており、しかも今回、本発明者
が決定したアミノ酸配列のうちＧｌｙ（Ｎｏ、１８）を
欠いている。

［課題を解決するための手段］ ＭＰＢ７０の成熟タンパクのＮ末端３０個のアミノ酸の
組成は既に決定されている［Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ
、　、５２゜２９３（１９８Ｂ）］ので、それに従って
予想されるヌクレオチド配列を化学合成オリゴヌクレオ
チドプローブで探索し、ＢＣＧ菌からタンパクＭＰＢ７
Ｇの遺伝子を阜離し、遺伝子の塩基配列を決定した。さ
らに、発明者は該タンパクＭＰＢ７０の遺伝子のヒトＩ
Ｌ−２Ｎ末端フラグメントとの融合タンパクとしての発
現に成功した。

本発明は下記のアミノ酸配列を有するＢＣＧ菌由来免疫
タンパクＭＰＢ７０に関する。

Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇ
ｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ＾１ａ　Ａｌａ
　Ａｌａ　　Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　
　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　Ｓｅｔ　　ＶａｌＧｌｎ　Ｇｌ
ｙ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ
　Ａｌａ　Ｖａｌ　ＡｌａＡｌａ　Ｓｅｒ＾ｓｎ　Ａｓ
ｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ
　Ｔｈｒ＾１ａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇ
ｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ＶａｌＡｓｎ
　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ＾ｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｓ
ａｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　ＴｙｒＴｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ
　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ＾ｓｎ　Ａｌａ　Ａｆａ　Ｐ
ｈｅ　５ｅｒＬｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｓｅｒ　
Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＴｈ
ｒ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅ
ｕ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　ｌｉｅ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈ
ｒ丁ｙｒ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｖａｔ　　Ａｌａ　
　Ｇｌｙ　　Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ｓｉｒ　　Ｐｒｏ　
　Ａｌａ＾ｓｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａ
ｒｇ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ＾１ａ
　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　５ｅｒＬｅｕ　　Ｌｙｓ　　
Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　
Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｃｙｔ、　　ＧｌｙＧｌｙ　Ｖａ
ｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ＾ｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　
Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＭｅｔＩＸｅ＾ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｖａｔ
　Ｌｅｕ　Ｍａｔ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ＾ｌａまた、本発明
は上記タンパクＭＰＢ７０をコードする遺伝子、プラス
ミドｐＴ１３ｓ　（Ｎｃｏ）を制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　
ＩＩＩおよびＫｌｅｎｏｗ断片で処理した後に上記遺伝
子を組み込んだ組み換えベクター、該ベクターで形質転
換した形質転換体、該形質転換体を培養してヒトＩＬ−
２Ｎ末端付近のフラグメントが結合したＢＣＧ菌由来免
疫タンパクＭＰＢ７０を生産せしめることを特徴とする
ヒトＩＬ−２Ｎ末端付近のフラグメントが結合したＢＣ
Ｇ菌由来免疫タンパクＭＰＢ７０の製造法に関する。

さらに、本発明は上記タンパクＭＰＢ７Ｇのシグナルペ
プチド、下記のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
。

Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｉ
ｌｅ　ＡｌａＡｌａ　Ｔｈｒ　５ｅｒＰｈｅ　Ａｌａ　
Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌ
ｅｕ　Ａｌａ　ＶａｔＡｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ
　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａこれらシグナルペプ
チドをコードする遺伝子およびミコバクテリウム・ボビ
スＢＣＧ　（ＢＣＧ菌）のプロモーターに関する。

以下に本発明について詳しく説明する。

（１）　ＢＣＧ菌染色体ＯＮ＾の調製 染色体ＤＮＡは鈴木らの方法［Ｊ　、Ｂａｃｔａｒｉｏ
ｌ、　、　１８９　。

８３９　（１９８７）　］により塩化セシウム・臭化エ
チジウム密度勾配遠心分離法により調製することができ
る。

（２）タンパクＭＰＢ７０遺伝子のクローニング上記方
法により得た染色体ＤＮＡの種々の制限酵素による消化
物を、アガロースゲル電気泳動とサザンの方法［Ｊ　、
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　、９８，５０３　（１９７５）］
によりＤＮＡ断片を結合したフィルターを調節すること
ができる。

このフィルターに対して５′リン酸基をｓ２Ｐで標識し
た合成オリゴヌクレオチドプローブをパイプリダイゼイ
ション（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
８８，４１９（１９７９）］　させることにより、タン
パクＭＰＢ７Ｇの遺伝子を含むＤＮＡ断片を検出するこ
とができる。このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動
により分画し、５０％グリセロールで回収し、エタノー
ル沈澱により分離、濃縮することができる。

このＤＮＡ断片をｐＨｃ１９プラスミドに導入し、ハナ
へンの方法［Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ、、１６８．５５７
　（１９８３）］　に準じて宿主細胞（例えば大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株）に導入して形質転換させ、選択（大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株の場合はアンピシリン耐性、β−ガラクトシ
ヂース活性陰性株）することによりＤＮＡライブラリー
を作製できる。

このＤＮＡライブラリーについてＳ２Ｐ標識オリゴヌク
レオチドプローブを用いたコロニーパイプリダイゼイシ
３ン［Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６
８，３７９（１９７９）］　を行い、目的とするクロー
ンをスクリーニングする。

（３）タンパクＭＰＢ７０遺伝子の塩基配列決定かくし
て得られたクローンよりクローン化ＤＮＡ断片を調製し
、メッシングらの方法［Ｇｅｎｅ、３３，１０３（１９
８５）］　によって塩基配列を解析し、タンパク關Ｐ８
７０の全遺伝子を決定することができた。

（４）タンパクＭＰＢ７０遺伝子のヒトＩＬ−２Ｎ末端
フラグメントとの融合タンパクとしての発現得られた８
ＣＧ菌のタンパクＭＰＢ７０遺伝子を用いて発現させる
手段として、他のタンパクとの融合タンパクを作製する
方法がある。ここではＩＬ−２を発現させるプラスミド
であるｐＴ１３ｓ　（Ｎｃｏ）　［Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１Ｇ４，３０（１９８８）］の制限
酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉ１１部位にＭＰＢ７０遺伝子を挿
入してＩＬ−２Ｎ末端とタンパクＭＰＢ７０との融合タ
ンパクのＤＮＡを作製し、次にこれを大腸菌に導入して
好気性培地中で培養することにより融合タンパクを含む
培養物を得ることができた。なお、培養に際して用いた
プロモーターに応じて適当な誘導剤（例えばｔｒｐプロ
モーターの゛９合、３−インドールアクリリックアシド
）を用いて発現の効率を高めることができる。

なお、　ＢＣＧ菌のプロモーター活性を示すＤＮＡ配列
を次に示す。

ＣＧＣＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＣＧＴＣＣＧ＾　＾＾ＣＡ
ＣＴＴＧＡＧ　　ＧＴＧＣＧＧＣＣ［；Ａ６Ｇ＾八ＧＧ
ＧＧＣＴ　　ＡＣＡＧＧＴＴＴＴＴ　　ＴＣＣＴＴＣＡ
ＣＣＴ　　ＡＣＧＧＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＡＴＣＣ＾＾
　ＧＡＣＣ［：ＧＧＡＣＧ　　ＧＣＴＣＣＧＡＡＧＡ　
　＾＾ＴＣＡＴＧＴＣＧＧＧＧＧＴＡＧＣＧＡ　　ＧＡ
ＣＧＧＣＡＣＡＡ　　ＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴ　　Ｃ（：
ＧＧＣＡＧＣＧ＾八ＧＧＡＧＴＧ＾＾ＣＧＧＣ 上記ＤＮＡ配列中ＴＴＧＡＧＧ　（２６〜３１）とＴＡ
ＣＡＧＧ　（５０〜５５）がプロモーターと思われる。

［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

なお、実施例においては以下の略号を使用する。

Ａ：アデニン　　　　　Ｃ：シトシン Ｇニゲアニン　　　　　Ｔ：チミン にｂ：キロ塩基　　　　　にｂｐ：キロ塩基対ＤＮＡ　
：デオキシリボ核酸 へＴＰ：アデノシン三リン酸 ｄＣＴＰ　：デオキシシチジン三すン酸ＥＤＴ＾：エチ
レンジアミン四酢酸 ＤＥＡＥ　ニジエチルアミノエチル ＳＯＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム ＳＳＣ：　０．１５Ｍ塩化ナトリウム ０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）　Ｍｉ
街液＾ｌａ：アラニン　　　　　Ｌｅｕ　：ロイシン＾
ｒｇ：アルギニン　　　　Ｌｙｓ　：リジンＡｓｎ　：
アスパラギン　　Ｍｅｔ　：メチオニン＾Ｓｐ；アスパ
ラギン酸　Ｐｈｅ　：フェニルアラニンＣｙｓ　　ニジ
スティン　　　　Ｐ「０ニブロリンＧｉｎ　：グルタミ
ン　　　　Ｓｅｒ　：セリンＧｌｕ　：グルタミン酸　
　Ｔｈｒ　：スレオニンＧｌｙ　ニゲリシン　　　　　
Ｔｒｐ：）リプトファン旧Ｓ　：ヒスチジン　　　Ｔｙ
ｒ　：チロシン１１ｅ　　：イソロイシン　　　Ｖａｌ
　：バリンＩＰＴＧ　：イソブロピルーβ−Ｄ−チオガ
ラクトシドＸ−ｇａｌ：５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド ＴＡＡ：３−インドールアクリリックアシド実施例１ （１）　ＢＣＧ菌染色体ＤＮＡの調製 ミコバクテリウム・ボビスＢＣＧ東京株をツートン培地
（組成：アスパラギン０．４％、クエン酸０．２％、ク
エン酸ナトリウム０．２８％、リン酸カリウム０．０５
％、硫酸マグネシウムＯ，ＯＳ％、クエン酸第１鉄アン
モニウムｏ、ｏｏｓ％、グリセリン６％）１ｐ中にて３
７℃で培養し、対数増殖期に達した時点で培養を終了し
て遠心分離によって集菌した。

得られた菌体を１０ａ＋Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ８，０）
　。

１働Ｍ　　ＥＤＴＡバッファー（以下、ＴＥと略記する
。）５１に懸濁し、リゾチーム５Ｂを加えて３７℃で１
５分間インキエベートした。次いで、これに１０％ＳＤ
Ｓ水溶液０．５ｍｊを加えたのちフェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１の混合液
６＋ｓｊで３回抽出し、得られた水層にエタノールｔｏ
ｓａを加え、沈澱するＤＮＡをガラス棒に＠き取った。

このｔｌＮ＾をＴ　Ｅ　６．６ｍｊに溶解し、塩化セシ
ウム７ｇ、エチヂウムブロミド（５１ｇ／ａｊ）水溶液
０，７朧ｔを加えて溶解させた。

該溶液を遠心チューブ（米国ベックマン社製、５Ｗ４０
Ｔｉローター用）中に入れ、６０，０００ｒｐｍにて６
時間遠心して染色体ＤＮＡのバンドを遠心チューブの上
方より採取した。このＯＮ＾溶液をＴＥに対して透析、
脱塩して精製ＢＣＧ染色体ＤＮＡを得た。

（２）合成オリゴヌクレオチドプローブの調製プロー１
６丁ＣＧＡＧ　ＧＧＣＡＴＧ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＧＡＣ
ＣＣＧ　ＧＴの合成　（２Ｂｍａｒ、　Ｖａｔ２２−Ｖ
ａｌ”に相当）自動ＤＮＡ合成装置（米国アプライド　
バイオシステムズ社製、３８０＾型）を用いて合成した
のち、ジメトキシトリチル基以外の保護基を除去し、逆
相中圧カラムクロマトグラフィーで精製した（条件；Ｃ
１８−シリカゲルカラムを用い、移動相として１００１
１１Ｍ　トリエチルアミンアセテートバッファー（ｐＨ
７，０）中アセトニトリルからなる濃度勾配液を使用）
。

次に、８０％酢酸を用いてジメトキシトリチル基を除去
して逆相高圧液体クロマトグラフィーで精製しく条件：
　ＹＭＣＰＡＣＫ　ＡＭ−３１４０ＤＳカラムを用い、
移動相として１１００Ｉ　ｌ’リエチルアミンアセテー
トバッファ−（ｐＨ７，０）中アセトニトリルからなる
濃度勾配液を使用）、凍結乾燥した。

かくして得られたオリゴヌクレオチドプローブを２０ｐ
ｍｏｉ）／μｌの濃度になるようにＴＥに溶解した。こ
の溶液５μｌとキナーゼ反応バッファー［５０１Ｍ）−
リスー塩酸バッフｙ　−（ｐＨ７，５）　、　１０ｍＭ
塩化マグネシウム、　１０ｍＭジチオスレイトール。

０．６８μＭ　ＡＴＰ、　ｔｏｏμＣＩ　Ｍ　−”Ｐ　
−ＡＴＰ　（比活性６０００Ｃｉ／ｓｍｏｊ）　、　Ｌ
５Ｊ１位ポリヌクレオチドキナーゼ２５μｊ］を３７℃
で１時間反応させた。

反応終了後、フェノールで１回抽出したのち水層を集め
た。これに修生胸腺ＤＮ＾（ｌ■ｇ／ｍｊ）　３０μ！
。

３Ｍ酢酸ナトリウム１０μｆを加え、さらにエタノール
を加えて生じた沈澱を集め、減圧乾燥してＴＥ５００μ
オに溶かし、３２ｐ５識オリゴヌクレオチドプローブと
して用いる。

（３）サザンハイプリダイゼイシコンテスト前記（１）
で得た染色体ＤＮＡ　３μｇを制限酵素Ｓａｔ　Ｉで完
全消化して０．８％アガロースゲル電気泳動にて分画し
た後、このアガロースゲルを１．５Ｍ塩化ナトリウムお
よび０．５Ｍ水酸化ナトリウム液中で４０分分間上うし
た。次に、このゲルを３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．５
　Ｍ　トリス−塩酸バッファー（ｐＨ７，０）中で１時
間振とうした。最後に、２００倍濃のＳＳＣ（３Ｍ塩化
ナトリウムおよび０゜３Ｍクエン酸ナトリウムバッファ
ー（ｐＨ７，０）中で３０分分間上うさせた。このゲル
に２００倍濃のＳＳＣに浸したナイロンメンブランフィ
ルタ−（米国ＮＥＮ社製、　Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　
ｐｌｕｓ）を乗せ、ＤＮＡを吸着させた。このフィルタ
ーを洗浄後、１時間室温で静置した後、３７℃で１６時
間乾燥させた。このフィルターをパイプリダイゼーショ
ン溶液（５倍濃度のＤｅｎｈａｒｄｔ（０，１％〕４コ
ール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血
清アルブミン）。

５倍濃度のＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ溶液および修生胸腺
ＤＮＡ　１０μｓ／腸ｌ）中に６５℃で６時間静置した
０次に、上記パイプリダイゼーション溶液１０−１に（
２）で得られた＄２ｐ標識プローブ３０μ！を加え、５
５℃で１６時間静置した。このフィルターを２倍濃度の
５ＳＣ−０，１％ＳＤＳ溶液中で５５℃で１５分間の振
どう洗浄を４回繰り返した後、室温で乾燥させオートラ
ジオグラフィーを行なった。

（４）　ＤＮＡライブラリーの作成 ■Ｓａｌ　ｌ　ＤＮＡ断片の調製 前項によって検出した３、８Ｋｂｐと１．０Ｋｂｐの制
限酵素５ａｌＩ消化ＯＮ＾断片をクローン化するため、
ＢＣＧ染色体ＤＮ＾４５μｇをＳａｌ　ｌで完全に消化
した後、０．８％アガロースゲル電気泳動により分画し
た。それぞれの大きさのＤＮＡ断片の部位に対してゲル
に溝を掘って、５０％グリセロールに溶出させエタノー
ル沈澱を行った後、フェノール処理２回、クロロホルム
処理１回で抽出し、２．５倍のエタノールを加えてＤＮ
Ａを沈澱させた。この沈澱を減圧乾燥後、ＴＥＩＯμオ
に溶かしてＳａｔ　Ｉ　　ＤＮＡ断片とした。

■クローニングベクターｐＨｃ１９の処理ｐＵｃ１９１
０ａｇを２０車位Ｓａｌ　Ｉを用いて３７℃で２時間処
理した後、フェノールおよびクロロホルムでそれぞれ１
回づつ抽出し、エタノール沈澱した。

減圧乾燥した後、５ｈｌｌリス塩酸バツフアー（ｐＨ８
，４）　　１９４μｌに溶解し、１．５単位アルカリフ
ォスファターゼ（Ｅ、Ｃｏ１１　Ｃ７５，宝酒造製）を
加えて６５℃で１時間反応させた。さらに、１．５単位
のアルカリフォスファターゼを加えて６５℃で１時間反
応させた後、フェノールおよびクロロホルムでそれぞれ
２回づつ抽出し、水層にエタノールを加えてＤＮＡを沈
澱させた。沈澱をＴＥに溶解して０．０５μｇ／μｌの
ベクターＤＮＡを調製した。

■組み換えＤＮＡおよびライブラリーの作成前記（４）
−■で調製したＳａｌ　Ｉ断片溶液２μＰと（４）−■
で調製したベクターＤＮＡ溶液４μｆに対して、ＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造製）のＡ液２８μ！とＢ
液６μオの混合物を１８℃で３０分間反応させた後、反
応混合物２０μ！を大腸菌ＪＭ　１０９株コンピテント
セル（宝酒造製）１００μ！に加えた。次に、これを水
中で３０分間静置し、４２℃で４５秒間、次いで水中で
２分間静置した。この混合物に２ＹＴ培地８８０μｌを
加えて３７℃で３０分間放置した。この培養液の一部を
とり、アンピシリン５０μｇ／ｙａｌ。

０．１！ＩＭ　ＩＰＴＧ、　０．００４％Ｘｇａｌを含
むＹＴ−１，５％寒天培地に塗布し、３７℃で一夜静置
し、白色コロニのクローンを得てＤＮＡライブラリー作
成に用いた。

（５）　ＭＰＢ７０遺伝子を有するクローンの選択（コ
ロニーパイプリダイゼーシａンテスト） 前記のＤＮＡライブラリーについてＭＰＢ７０遺伝子を
含む株を選択するために、前記（２）で調製した３２ｐ
ｐ識オリゴヌクレオチドプローブを用いたコロニーハイ
ブリダイゼーシ日ンテストを行った。

ニトロセルロースフィルター（Ｍｌｌｌｌｐｏｒｅ社製
。

ＨＡ）上で（４）−〇で調製したＤＮＡライブラリーの
形質転換菌を培養し、常法に従ってフィルターをアルカ
リ処理、１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７，５）によ
る中和、（１Ｍトリス−塩酸バッフ１−（ｐＨ７，５）
および１．５Ｍ塩化ナトリウム）による処理をし、２倍
濃度のＳＳＣに浸した後、風乾し、８０℃で３時間静置
した。これによりＤＮＡ結合フィルターを調製した。

次いで、このフィルターを前記（３）　で行りたサザン
ハイプリダイゼーションと同様の操作を行い、プローブ
に強く結合する塩基配列を含む組み換えＤＮＡ分子を有
する形質転換株を選別することにより、３．６Ｋｂｐの
Ｓａｌ　Ｉ断片からは２００個のコロニーより１個のコ
ロニーを得た。　１．０ＫｂｐのＳａｌ　Ｉ断片からは
、プローブに結合する塩基配列を含むコロニーを得られ
なかった。

（６）タンパクＭＰＢ７Ｇ遺伝子の塩基配列決定前記（
５）で得た３、６にｂｐｓａｌＩ断片からのプローブと
反応するコロニーから、５１１ＩｌＬＩで開裂させて生
じる　ＳｍａｌＤＮ＾断片３本　（０，６にｂｐ、　０
．８Ｋｂｐ。

４．８にｂｐ、　４．８にｂｐはｐＬＩｃ１９２．６に
ｂｐに　ＢＣＧ−５ａｌ　Ｉ断片の２．２にｂｐが結合
したもの）をそれぞれＳａｌ　Ｉ断片と同様に分離精製
した。このうち、０．８Ｋｂｐ断片の一部と０．６にｂ
ｐ断片の全部についてｐ［Ｉｃ１９．　ｐｕｃｔａと宿
主ＪＭ１０９を用いたメッシングの方法（Ｇｅｎｅ、３
３゜１０３　（１９８５）］、旧３■９１１１．１９を
用いた方法、ジデオキシ法による塩基配列決定法［Ｐｒ
ｏ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、７４゜５４６３　（１９７７）　］
により塩基配列を決定した。なお、ａ、ａにｂｐと０．
６にｂｐの境界領域もＴａｑ　Ｉで切断し、ｐｔｌｃ１
８を八ｃｃｌで切断したプラスミドと反応させて連続性
を確認した。塩基配列は第１表に示す通りである。この
うち、ＴＴＧＡＧＧ　（２６〜３１）と、ＴＡＣＡＧＧ
　（５０〜５５）はプロモーターと思われる。

＾＾ＧＧＡＧ　（１８０〜１６５）は、リポソームＲＮ
Ａと結合するＳ、Ｏ，配列と考えられる。また、（１７
４〜２６３）は３０個のアミノ酸よりなるシグナルペプ
チドをコードしていると考えられる。　（２６４〜７５
２）の領域は成熟タンパクの遺伝子で、このうち（３１
０〜５６３）の領域は４個の塩基を除いてラドフォード
らの報告した塩基配列［Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉａ＋ｓｕｎ
、、５６．９２１１９８８）］　と一致した。成熟タン
パクのＮ末ｆ４３０個のアミノ酸は既に調べられたアミ
ノ酸配列［１ｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、、５２，２９
３（１９８８）］　と３個のアミノ酸を除いて合致した
。成熟タンパクは１６３個のアミノ酸からなり、分子量
は１６３０５と計算された。

第１表 ＣＧＣＧＡＴ（：ＧＧＣ ＴＧＧＣＧＴＣＣＧ＾ ＡＡＣＡＣＴＴＧＡＧ ＧＴＧＣＧＧＣＣＣ＾ ＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴ ＾ＣＡＧＧＴＴ丁ＴＴ ＴＣＩＩ：ＴＴ（：ＡＣＣＴ ＡＣＧＧＡＴＧＡＡＴ Ｏ ＾ＴＣＣＡＴＣＣ＾＾ ＧＡＣＣＣＧＧＡＣＧ １１（Ｉ ＧＣＴＣＣＧＡＡＧ＾ ＡＡＴＣＡＴＧＴ（：Ｇ ＧＧＧＧＴＡＧＣＧＡ ＧＡ（：ＧＧＣＡＣ＾＾ ＧＣＣＧＣ（：ＧＴＣＴ ＣＣＧＧＣＡＧＣＧＡ ＡＧＧＡＧＴＧＡＡＣ ＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧ Ｔ＾＾＾ＧＡＡＣＡＣ ＾ＡＴＴＧＣＧＧＣ＾ 八ＣＣＡＧＴＴＴ（：Ｇ ＣＧＧＣＧＧＣＩＩ：ＧＧ ＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴ ４Ｑ ＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧ ＣＴＧＴＣＴＣＡＣＣ ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣ ＧＣＡＧＧＣＧＡＴＣ ＴＧＧＴＧＧＧＣＣＣ ＧＧＧＣＴＧＣＧＣＧ Ｇへ＾ＴＡＣＧＣＧＧ ＣＡＧＣＣＡＡＴＣＣ ＣＡＣＴＧＧＧＣＣＧ Ｇ［：ＣＴＣＧＧＴＧＣ ＾ＧＧＧＡＡＴＧＴＣ ＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧ ＧＴＣＧＣＧＧＴＧＧ ＣＧＧ［：ＣＴＣＧＡＡ ＣＡＡＴＣＣＧＧＡＧ ＴＴＧＡＣ＾＾ＣＧＣ ＴＧＡＣＧＧＣ丁ＧＣ ＡＣＴＧＴＣＧＧＧＣ ＣＡＧＣＴＣＡＡＴＣ ＣＧＣＡＡＧＴ＾＾＾ ＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣ ＡＣＣＣＴＣＡＡＣ＾ ＧＣＧＧＴＣＡＧＴＡ ＣＡＣＧＧＴＧＴＴＣ ＧＣＡＣＣＧＡＣＣＡ ＾ＣＧＣＧＧＣＡＴＴ Ｔ＾６Ｃ＾＾ＧＣＴＧ ＣＣＧＧＣＡＴＣＣＡ ＣＧＡＴＣＧＡにＧ＾ ＧＣＴＣ＾＾ＧＡＣＣ ＾ＡＴＴＣＧＴＣＡＣ ＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧ ＣＡＴｔｌ：ＣＴＧＡＣＣ ＴＡＣＣＡＣＧＴＡＧ ＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡ ＡＡＣＣＡＧＣＣＣＧ ８［１０ ０ＣＣ＾＾（：ＧＴＣＧ ＧＡＣＣＧＧＴＣＡＧ　　ＧＧＴ＾＾ＣＡＧＣＣＴＣ＾
＾ＧＧＴＣＧＧ　　ＴＡＡＣＧＣＣＧＡ（：＾ＣＡＴＧ
ＡＴＴＧＡ　　ＣＡＧＣＧＴＧＣＴ＾　＾ＴＧＣＣＴＣ
ＣＧＧ　　ＣＧＴＡＡＴＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＧＧＣＴ
　　ＣＧＣＡＡＣＡＴＧＡ　　ＧＴＣ（、ＡＣ（７）　
タンパクＭＰＢ７０のヒトＩＬ−２Ｎ末端フラグメント
との融合タンパクの発現 ■成熟タンパクＭＰＢ７Ｇをコードする遺伝子の単離タ
ンパクＭＰＢ７０をコードする遺伝子のうち１８番目の
ｂａｓｅ以降（第１表では２８１番目以降）は前記（６
）の０．６にｂｐ断片に含まれているので、Ｎ末端をコ
ードする遺伝子として下記の２種のＤＮＡを前記（２）
と同様にして合成し、精製した。

オリゴマー１　２１ａｅｒ ５’ＣＡＴＧ　ＧＧＣＧＡＴ　ＣＴＧ　　ＧＴＧ　　Ｇ
ＧＣＣＣ３’オリゴマー２　：　１７ａｅｒ ５’ＧＧ　ＧＣＣＣＡＣＣＡＧ　ＡＴＣＧＣＣ３上記の
オリゴマーをそれぞれ１００２６゜の濃度に調節し、オ
リゴマー１は２１μオ、オリゴマー２は１７μｊとり、
Ｔｒｉｓ−ＨＣ１’（ｐＨ８，０）　　５０ｍＭ、　Ｍ
ｇＣｊｚ　　１ｈＭ。

ジチオスレイトール５ｍＭおよびＡＴＰ　２００μＭ　
（いずれも最終濃度を示す、）中でクローン化ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造製）１μＰを加え、最終容量
を５０μ！として３７℃で３０分間、次に６５℃で１０
分間、さらに室温で３０分間それぞれ静置した。その後
、フェノールで１回、クロロホルムで１回抽出したのち
乾燥後、Ｔ　Ｅ　１５０μｋに溶解した。この溶液を（
７）−■−Ａ液とする。

一方、市販されているプラスミドｐにに２３３−２（フ
ァルマシア製）２μｇを制限酵素Ｎｃａｌ　（宝酒造製
）で切断したのち、フェノールで２回、クロロホルムで
１回抽出し、エタノール沈澱の後、乾燥させた０次いで
、前記（４）の■と同様にしてアルカリフォスファター
ゼ処理を行い、乾燥後ＴＥ４０μ！に溶解した。この溶
液を（７）−■−Ｂ液とする。

ライゲーションキットＡ液８μオ、Ｂ液２μ！。

（７）−■−Ａ液１μ２および（７）−〇−Ｂ液１μｌ
を混合し、前記（４）−■と同様の方法で形質転換菌を
作り、アンピシリン５０μｇ／履ｌを含むＹＴ−１，５
％寒天培地に塗布し、３７℃で１夜静置してコロニーを
得た。

得られたコロニーのうち数個をアンピシリン５０μｇ／
ｍｊを含む２ＹＴ培地１ｈｊに植菌し、３７℃で１夜振
盪培養した。得られた菌液よりプラスミドを調製し、こ
れを５ｒａａ　Ｉで切断し、０．８％アガロースゲルを
用いて全量の電気泳動を実施した。切断されたことが確
認されたプラスミドのうち１コロニー由来のものを前記
（４）−〇の方法と同様にして回収、精製した。その後
、（４）−〇と同様にしてアルカリフォスファターゼ処
理を行ったのち０．１μｇ／１１１となるようにＴＨに
溶かした。この溶液１μ！および前記（６）で得たＳｍ
ａ　Ｉ断片０．８Ｋｂｐを０．０２μｇ／μｉの濃度と
なるように調製したもの３μ！、ライゲーションキット
Ａ液１２μｐ、Ｂ液４μｉを混合し、前記（４）−■と
同様の方法で形質転換菌を作り、アンピシリン５０μｇ
／ｍｌを含むＹＴ−１，５％寒天培地に塗布し、３７℃
で１夜静置してコロニーを得た。このコロニーを用いて
上記と同様にして菌液を得、数コロニーよりプラスミド
を調製した。

上記方法により得られたプラスミドはすべて制限酵素Ｎ
ｃｏ　１で切断し、全量を０．８％アガロースゲルを用
いて電気泳動を実施し、約０．６Ｋｂｐの大きさのバン
ドが確認できたｌコロニー由来のプラスミド（以下、ｐ
にに−７０と称する。）由来のフラグメントのうち０．
６にｂｐのものを前記（４）−■と同様に回収し、精製
した（第１図参照）。

０発現用ベクターの調製 ＩＬ−２をコードする遺伝子を含有する発現用ベクター
ｐＴ１３５Ｎｃｏ　（第２図参照）２μｇを制限酵素Ｈ
ｔ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで処理した０次に、フェノールで２
回、クロロホルムで１回抽出し、エチルアルコール沈澱
を行った後、乾燥させた。これをＭ１３−シークエンス
キット（宝酒造製）のＣｈａｓｅ液４０ｇｊに溶かして
同キットの１０倍希釈バッファー５μ２を加え、さらに
Ｌａｒｇｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｐｏｌｌ　、宝酒造製
）を５μ２加えて１５℃で４時間インキュベートして切
断末端を平滑化した後、フェノールで３回、クロロホル
ムで２回抽出し、エタノール沈澱の後、乾燥した０次に
、ＴＥ３０μｉに溶かしてＢａａ＋ＨＩで処理し、前記
（４）−〇と同様にして０．８％アガロースゲル電気泳
動を用いて２．６ＫｂＰのバンドを精製した後、前記（
４）−■と同様の方法でアルカリフォスフ１ターゼ処理
を行った。沈澱はｏ、ｏｏｏｓμｇ／μｐとなる様にＴ
Ｈに溶解した。

■ＭＰＢ７０遺伝子を含んだインサートの調製ｐ■−７
０より分１１精製したタンパクＭＰＢ７０をコードする
遺伝子を含んだインサートは、まず前記（７）−■のｐ
Ｔ１３ｓＮｃｏと同様に切断末端を平滑化した０次に、
このインサートはＭＰＢ７０のｇｅｎｅの終止コドンよ
りも下流にｐＵｃプラスミド由来のＢａｍＨｌ５ｉｔｅ
を含むのでＢａｍＨ１で切断し、前記（４）−のと同様
にして０４８％アガロースゲル電気泳動を用いて精製し
た。沈澱は０．０３μｓ／μオとなる様にＴＥ＆：溶解
した。

■発現ベクターによる宿主の形質転換 前記（７）−■で調製したｐＴ１３５Ｎｃｏ　１μ！と
（７）−〇で調製したタンパクＭＰＢ７０の遺伝子を含
んだインサート１μｋをＤＮＡライゲ〒ジョンキットの
Ａ液８μ！およびＢ液２ｕＩ！と混合し、大腸菌８８１
０１株コンピテントセル（宝酒造製）を用いて前記（４
）−〇と同様の方法でライゲーションと形質転換を行っ
た。この反応液全部をアンピシリン５０μｇ／ｍＲを含
むＹＴ−１，５％寒天培地に塗布し、３７℃で一夜静置
してコロニーを得た。

得られたコロニーのうち、アンピシリン５０μｇ／ｌｉ
ｊを含んだ２ＹＴ液体培地で３７℃で一夜振とう培養し
、プラスミドをＢｇｌｌｌとＢａｍＨＩで切断して０．
８％アガロースゲルで観察したところ、約０．７にｂｐ
のＤＮＡが存在し、約１．３にｂｐのＤＮＡが存在しな
いことによりインサートが唯１個存在すると推定される
ものが認められたので、訪導１発現を実施した（第１図
参照）。

■形質転換体によるＭＰＢ７０−ＩＬ−２Ｎ末端フラグ
メント融合タンパクの産生 前記（７）−■で得られた融合タンパクの遺伝子を含ん
だ大腸菌８８１０１株（セ→→ＨＢＩＯＩ−ＭＰＢ７０
゜５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有２ＹＴ培地で３７℃
で一晩振どう培養し、この培養液２ｍｌを５０μｇ／■
ｌアンピシリンを加えたＳ型用Ｍ９−カザミノ酸培地（
カザミノ酸１　ｇ／ｄｐ、塩化アンモニウム０．５ｇ／
ｄｊ、硫酸マグネシウム０．０５ｇ／ｄ！、塩化カルシ
ウム５　ｍｇ／ｄｐ。

Ｌ−Ｌｅｕ　４０Ｂ／ｄｆｆｉ、　Ｌ−Ｐｒｏ　４０ｍ
ｇ／ｄｊおよびチアミン塩酸塩０．４ｍｇ／ｄｊの液８
０ｍ１）に２０ｇ／ｄｊのブドウ糖液１（ｌｉ＋ｊと１
　ｇ／ｄｊのリン酸２水素カリウム（に８２ＰＯＪ）の
１０ｍｊを混合したもの）　１００ｍｊに加え、２８℃
で３時聞損どう培養した。これにＩ＾＾を最終濃度５０
μｇ／Ｉｌｊになるように加えて２３℃で１４時時間上
う培養した。

その後、菌液Ｌ（１ｍｊを遠心して菌の沈澱を集め、ト
リス−塩酸バッファー（ｐＨ８，０）２７．５鳳Ｍおよ
びεＤＴＡ１１ｓＭの９００μ！に懸濁した。ここに１
０％ＳＯ５１００μｌを加えて混合し、室温で１時間放
置した後に１５．０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清
１００μｊを採取した。

これらの菌体抽出液をレムリの方法［Ｎａｔｕｒｅ２２
７．６８０　（１９〕０）］に従って、５ｌｌＩＳ−ポ
リアクリルアミド電気泳動法とウェスタンプロット法に
より解析した。抗ＭＰＢ７０抗体を用いたウェスタンプ
ロット法によって、大腸菌８８１０１−９丁１３ではバ
ンドが認められないが、ＨＢＩＯＩ−ＭＰＢ７０（ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−１０４４６）のレーンではＭｗ約２５にのと
ころに抗体と反応するバンドを認めた。また、ＢＣＧ菌
由来のＭＰＢ７０のレーンでは１ｗ２ＯＫ付近にバンド
を認めた“（′ｓ４図参照）。

以上のことより、　ｐＴ１３５Ｎｃｏベクターを用いた
ＭＰＢ７０−ヒトＩＬ−２Ｎ末端フラグメントの融合タ
ンバりは発現していることがわかった０ＭＰＢ７０−ヒ
トＩＬ−２Ｎ末端フラグメントのアミノ酸配列は第３図
に示した。

［発明の効果］ 本発明により提供されるＢＣＧ菌由来のＭＰＢ７０とヒ
トＩＬ−２Ｎ末端フラグメントの配合タンパクは、牛の
結核菌感染と他の抗酸菌の感染を区別するための抗原抗
体反応による診断薬として使用できるものと考えられる
。また、本発明により提供されるＢＣＧ菌のＭＰＢ７０
タンパク遺伝子およびそれを用いた遺伝子工学的手法に
よるＭＰＢ７０−ヒトＩＬ−２Ｎ末端フラグメント融合
タンパク製造法は、上記診断に有用な同タンパクを大量
に提供するために重要である。

【図面の簡単な説明】

第１図はＭＰＢ７０−ｒＬ−２Ｎ末端フラグメント融合
タンパクの発現ベクターの作製を示す。 第２図はプラスミドｐＴ１３ｓＮｃｏにおけるＩＬ−２
をコードする遺伝子を示す。 第３図はＭＰＢ７０−ヒトＩＬ−２Ｎ末端フラグメント
の融合タンパクのアミノ酸配列を示す。 第４図は菌体抽出液のウエスタンブロツを示す。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記のアミノ酸配列を有するＢＣＧ菌由来免疫タ
   ンパクＭＰＢ７０。 【遺伝子配列があります】
2. （２）請求項１記載のＢＣＧ菌由来免疫タンパクＭＰＢ
   ７０をコードする遺伝子。
3. （３）プラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）を制限酵素Ｈｉ
   ｎｄIIIおよびＫｌｅｎｏｗ断片で処理した後に請求項
   ２記載の遺伝子を組み込んだ組み換えベクター。
4. （４）請求項３記載のベクターで形質転換した形質転換
   体。
5. （５）請求項４記載の形質転換体を培養してヒトインタ
   ーロイキン２Ｎ末端付近のフラグメントが結合したＢＣ
   Ｇ菌由来免疫タンパクＭＰＢ７０を生産せしめることを
   特徴とするヒトインターロイキン２Ｎ末端付近のフラグ
   メントが結合したＢＣＧ菌由来免疫タンパクＭＰＢ７０
   の製造法。
6. （６）請求項１記載のＢＣＧ菌由来免疫タンパクＭＰＢ
   ７０のシグナルペプチド。
7. （７）下記のアミノ酸配列を有する請求項６記載のシグ
   ナルペプチド。 【遺伝子配列があります】
8. （８）請求項６または７記載のシグナルペプチドをコー
   ドする遺伝子。
9. （９）ミコバクテリウム・ボビスＢＣＧ（ＢＣＧ菌）の
   プロモーター。