JPH04504418A - マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤ペプチド - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤ペプチド発明の分野 本発明はマトリックスメタロプロテイナーゼの阻害のために育用な単離されたタ ンパク質またはペプチドに関する。より詳細には、本発明は高い親和性でマトリ ックスメタロプロテイナーゼ酵素およびその類似体に結合する培養ヒト腫瘍細胞 の調整培地から単離された新規タンパク質に関する。天然のタンパク質は特定部 位のシスティン残基を含む新規アミノ酸配列により規定される。本発明はさらに 、メタロプロテイナーゼアフイニテイークロマトグラフィーを用いてマトリック スメタロプロテイナーゼ阻害剤を精製する新規手段に関する。

発明の背景 酵素のコラ−ゲナーゼファミリーは、マトリックスメタロプロテイナーゼとして も知られる中性メタロプロテイナーゼの一群であり、酵素前駆体の形態で分泌さ れ、そして細胞外マトリックスのコラーゲン成分および非コラーゲン成分の両方 を分解する。全てが金属イオン（カルシウムおよび／または亜鉛）を加水分解活 性のために必要とし、そして全てが潜在的プレ酵素の形態で分泌される。このコ ラ−ゲナーゼ遺伝子ファミリーのメンノく−は：コラーゲンＩ型、■型および■ 型を分解し、そして基質特異性および活性化のための必要条件に関して特徴づけ られてきた間質コラ−ゲナーゼ（Ｓｔｒｉｃｋｌｉｎ、　Ｇ、Ｐ、。

Ｊｅｆｆｒｅｙ、　Ｊ、Ｊ、、　Ｒｏｓｅｗｊｔ、　Ｗ、Ｔ、およびＥｉｓｅｎ 、　Ａ、Ｚ、、　１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２．６１−６８；　 Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、Ｇ、１．、Ｗｉｌｈｅｌｍ、　Ｓ、、　Ｋｒｏｎｂｅｒｇｅ ｒ、　Ａ、、　Ｂａｕｅｒ　Ｅ、へ、、　Ｇｒａｎｔ、　Ｇ、Ａ、　およびεｊ ｓｅｎ、　Ａ、Ｚｌ、　１９８６．　Ｊ、　ＢｉｏＬ、　Ｃｈｅｍ、　２６１． ６６００−６６０５；　Ｈａｓｔｅ、　Ｋ、Ａ−、ＪｅｆｆｒｅＹ、　Ｊ、Ｊ、 、　Ｈｉｂｂｓ、　Ｍ−Ｓ、＋およびＷｅｌｇｕｓ、）１．Ｇ、、１９８７．　 Ｊ、ＢｉｏＬ、Ｃｈｅｒｒｒ、２６２　、　１０４８−１０５２；　Ｆｉｅｌｄ ｓ、　Ｇ、Ｂ、、　Ｖａｎ　Ｗａｒｔ、　Ｈ，Ｅ、およびＢｉｒｋｅｄａｌ−Ｈ ａｎｓｅｎ、Ｈ，、１９８７，Ｊ、ＢｉｏＬ、Ｃｈｅｗｒ、２６２．６２２１− ６２２６；　Ｇｒａｎｔ。

Ｇ、Ａ、、　Ｅｉｓｅｎ、　Ａ、Ｚ、、　Ｍａｒｍｅｒ、　Ｂ、Ｌ、、　Ｒｏｓ ｗｅｉｔ、　ｗ４’、およびＧｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｇ、１．、　１９８７．　Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、、Ｃｈｅｒｔｒ、’　２６２．５８８６−５８８９）；プロテオ グリカン、糖タンパク質およびコラーゲン分子の非ヘリックス部分を分解するス トロメリシン（Ｗ目ｈｅ１ｍ、Ｓ、Ｍ、、　ＣＣｏ１１ｉｅｒ、１．Ｅ、、Ｋｒ ｏｎｂｅｒｇｅｒ、　Ａ、、Ｅｉｓｅｎ、　Ａ、Ｚ、、　Ｍａｒｍｅｒ、　Ｂ、 Ｌ、、　Ｇｒａｎｔ、　Ｇ、Ａ３．　Ｂａｕｅｒ、　Ｅ、Ａ。

およびＧｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｇ、１．、１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｌ１．　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ｕ、Ｓ、Ａ、　８４．６７２５−６７２９；　Ｗｈｉｔｍａｎ、　Ｓ、Ｅ、、　 Ｍｕｒｐｈｙ、　Ｇ、。

、Ａｎｇｅｌ、　Ｐ、、　Ｒａｈｍｓｆｏｒｆ、　Ｈ，−Ｊ、、　Ｓｍ１ｔｈ、 　Ｂ１．、　Ｌｙｏｎｓ、　Ａ、。

）１ａｒｒｉｓ、　Ｔ１．Ｔ、、　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、　Ｊ、Ｊ、、　Ｈｅｒｒ ｌｉｅｈ、　Ｐ、およびＤｏｃｈｅｒｔｙ、　Ａｉ、Ｐ、、　１９８６．８ｉｏ ｃｈｅｍ、　Ｊ、　２４０．９１３−９１６）；およびベプンン耐性三重らせん ■型コラーゲンおよび間質コラーゲン（ゼラチン）を分解する■型コラーゲナー ゼを包含する。■型コラーゲナーゼはヒト腫瘍細胞（ｌｊｏｔｔａ、　Ｌ、Ａ、 、　Ｋｌｅｉｎｅｒｍａｎ、　Ｊ、、　Ｃａｔａｎｚａｒｏ、　Ｐ、およびＲｙ ｎｂｒａｎｄｔ、Ｄ、、１９７７、Ｊ、Ｎａｔｅ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、５ ８　、　１４２７−１４３９：　Ｔｕｒｐｅｅｎｎｉｅｍｉ−Ｈｕｊａｎｅｎ、 　Ｔ、およびＴｒｙｇｇｖａｓｏｎ。

Ｋ、、１９８２．　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　３Ｏ，６６９−６７３；　Ｌｉ ｏｔｔａ、Ｌ、Ａ、。

へｂｅ、　Ｓ、、　Ｇｅｈｒｏｎ−Ｒｏｂｅｙ、　Ｐ、およびＭａｒｔｉｎ、　 Ｇ、Ｒ，、１９７９゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｅ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｉｊ、Ｓ、Ａ、 ７６、　２２６８−２２７２；　１ｊｏｔｔａ、Ｌ、Ａ、、Ｔｒｙｇｇｖａｓｏ ｎ、Ｋ、、Ｇａｒｂｊｓａ、Ｓ、、Ｈａｒｔ、１．、Ｐａ１ｔｚ、　Ｃ，Ｍ、お よび５ｈａｆｉｅ、　Ｓ、　１９８０．’Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２ １１４．６７−６８；　Ｃｏ１１ｉｅｒ、１．Ｅ！、、Ｗｉｌｈｅｌｍ、Ｓ、Ｍ 、、Ｅｉｓｅｎ、Ａ。

Ｚ、、Ｍａｒ＋ｏｅｒ、Ｂ、Ｌ、、Ｇｒａｎｔ、Ｇ、Ａ、、５ｅｌｔｚｅｒ、Ｊ 、Ｌ、、Ｋｒｏｎｂｅｒｇｅｒ、　Ａ、、　Ｈｅ、、　Ｃ，、Ｂａｕｅｒ　Ｅ、 Ａ、およびＧｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｇ。

［、、１９８８，Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗｌ、　２６３　、６５７９−６５ ８７）　、内皮細胞（Ｋａｌｅｂｉｃ、　Ｔ、、　Ｂａｒｂｉｓａ、　Ｓ、、　 Ｇｌａｓｅｒ、　Ｂ、およびＬｉｏｔｔａ、　Ｌ、Ａ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２ ２１　、２８１２８３　）　、骨（Ｍｕｒｐｈｙ、　Ｇ、　。

ＭｃＡｌｐｉｎｅ、　Ｃ，Ｇ、、　Ｐｏ１１．　Ｃ，Ｔ、およびＲｅｙｎｏｌｄ ｓ、　Ｊ、Ｊ、　１９８５、　Ｂｉｏｃｈｅｒｔｒ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃ ｔａ、　８３１．４９−５８　）　、繊維芽細胞（Ｃｏｌ目ｅｒ、　ＩＪ、、　 ｌｌｌｉｌｈｅｌｍ、　Ｓ、Ｍ、、　Ｅｉｓｅｎ、　Ａ、Ｚ、、　Ｍａｒｍｅｒ 、Ｂ、Ｌ、、Ｇｒａｎｔ、Ｇ、Ａ＋、５ｅｌｔｚｅｒ、Ｊ、Ｌ、、にｒｏｎｂｅ ｒｇｅｒ。

Ａ、、　Ｈｅ、、　Ｃ，、Ｂａｕｅｒ　Ｅ、Ａ、およびＧｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｇ 、１．、１９８８゜Ｊ、　ＢｉｏＬ、　ＣｈｅＩＩ＋、　２６３　、６５７９− ６５８７）　、多形核白血球（Ｕｉｔｔｏ、　Ｖｌ、、　ｓｃｈｗａｒｔｚ　Ｄ 、およびＶｅｉｓ、　Ａ、、　１９８０．　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｒｒｒ、　１０５　、４０９−４１７）およびマクロファージ（Ｇ ａｒｂ’１ｄｓａ、　Ｓ、、　Ｂａｔ口ｎ、　Ｍ、　Ｄａｇａ−Ｇｉｏｒｄｉｎ ｉ、　Ｄ、、　Ｆａｓｔｅｌｌｉ。

Ｇ、、　Ｎａｔｕｒａｌｅ、　Ｍ、、　Ｎｅｇｒｏ、　Ａ、、　Ｓｅｍｅｎｚａ ｔｏ、　Ｇ、およびＬｉｏｔｔａ、Ｌ、Ａ、、１９８６．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、２６１　、　２３６９−２３７５）において同定された。この酵素は酵素 前駆体の形態で分泌される６８ないし７２キロダルトンの中性メタロプロテイナ ーゼである（Ｉｊｏｔｔａ、　Ｌ、Ａ、、　Ａｂｅ、　Ｓ、、　Ｇｅｈｒｏｎ− Ｒ。

ｂｅｙ、　Ｐ、およびＭａｒｔｉｎ、　Ｇ、Ｒ，、１９７９，Ｐｒｏｃ、　Ｎａ １１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃ１．　ＩＪ、Ｓ、Ａ−７６，２２６８−２２７２；Ｌｉｏｔｔａ、Ｌ、Ａ、 、Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ。

ｔｌ、　Ｇａｒｂｉｓａ、　Ｓ、、　Ｇｅｈｒｏｎ−Ｒｏｂｅｙ、　Ｐ、および Ａｂｅ、　Ｓ、、　１９８１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２θ、１００−１０ ４；　５ａｌｏ、Ｔ、、Ｌｉｏｔｔａ、Ｌ。

Ａ、およびＴｒｙｇｇｖａｓｏｎ、　Ｋ、、　１９８３．　Ｊ、　ＢｉｏＬ、　 Ｃｈｅｗｒ、　２５８゜３０５８−３０６３　）。さらに、このコラ−ゲナーゼ 遺伝子ファミリーの種々のその他のメンバーとしては、最近、ストロメリシンの １２の型（ストロメリシン−２）、Ｌ盟コラ−ゲナーゼの９２キロダルトン体お よびブユータティブ・ユーテリン・メタロブロティナーゼ（ＰＬＩＭＰ）−１、 低分子量ユーテリンコラーゲナーゼ（Ｗｉｌｈｅｌｍ、　Ｓ、４．。

Ｃｏ１１ｉｅｒ、　１．［：、、　Ｍａｒｍｅｒ、　Ｂ、Ｌ、、　Ｅｉｓｅｎ、 　Ａ、Ｚｌ、　Ｇｒａｎｔ。

Ｇ、、Ａ、およびＧｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｇ、１．、１９８９．　Ｊ、　ＢｉｏＬ 、　Ｃｈｅｒｎ、　２６４゜１７２１３−１７２２１；　Ｗｏｅｓｓｎｅｒ、　 Ｊ、Ｐ、およびＴａ１ｐｉｎ、　Ｃ１，、１９８８、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｒｒｔ、　２６３．１６９１８−１６９２５　）等が記載されている。

マトリックスメタロプロテイナーゼは細胞外マトリックスの不適当な破壊により 特徴づけられる疾病過程において重要な役割を果たしていると考えられている。

疾病は炎症の過程例えばリュウマチ性関節炎およびその他の自己免疫異常、腫瘍 細胞侵入および転移形成、心筋無酸素症の局部後遺症および角膜潰瘍を包含する （　０ｋａｄａ等。

１９８６、Ｊ、ＢｌｏＬ、Ｃｈｅｒｔｒ、２６１　、　１４２４５−１４２５５ ：　Ｈａｒｒｉｓ等。

１９８４、　ＣｏｌＣｏ１１ａ　ＲｅＬａｔ、　４　、４９３−５１２：　Ｗｅ ｒｂ等、　１９７７゜、〜ｅｒｎ　ＥｎｇＬ、　Ｊ、　ｌｅｄ、　２９６　、１ ０１７−１０２３；　Ｌｉｏｔｔａ等、　１９８０゜、ｖａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎ ｄｏｎ）　２１１４　、　６７−６８；　Ｋａｌｅｂｉｃ等、１９８３．５ｔｉ ｒｎｃｅ　２２７　、２８１−２８８　）。多くの組織はマトリックスメタロプ ロテイナーゼの中性阻害剤を含む。いくつかの場合、この阻害活性は血漿中のア ンチプロテアーゼ、特にα。

−マクログロブリンおよびβ、−アンチコラ−ゲナーゼから誘導される。α、− マクログロブリンは血清中に存在する高分子量（７２５０００Ｄａ）阻害剤であ る。血清中に存在するコラーゲン分解阻害活性の９５％を説明すると考えられる 。その巨大な大きさのために、血管の透過障壁を通過することは通常不可能であ る。高められた毛細管透過性が存在する極端な炎症の状態において、Ｃ２−マク ログロブリンは組織区画に入り、そしてマトリックスメタロプロテイナーゼの調 節において役割を果たす。α、−マ、クログロブリンによるマトリックスメタロ プロテイナーゼの阻害の機構は直接研究されていない。

しかしながら、Ｃ２−マクログロブリンがその他のプロテアーゼの阻害を引き起 こす機構に類似であると考えられる。従って、この機構はマトリックスメタロプ ロテイナーゼに特有であると考えられない。

β１−アンチコラ−ゲナーゼは約４００００ダルトンの大きさである。それは血 清のメタロプロテイナーゼ阻害活性の約５％を説明する。この阻害剤は血管の透 過障壁を通過し、そして組織区画中に広（分配されると考えられる。β１−アン チコラ−ゲナーゼは、Ｔ　ＩＭＰ、すなわちメタロプロテイナーゼの組織阻害剤 と呼ばれるメタロブロティナーゼの天然阻害剤のもう１つの群と関係づけられ得 る。メタロプロテイナーゼコラーゲン分解およびタンパク質分解の負の調節はＴ ＩＭＰを介して生じ得る。

原型ＴＩＭＰであるＴ　ＩＭＰ−１は活性化された間質コラ−ゲナーゼ、ストロ メリシンおよび９２ｋＤａの■型コラーゲナーゼと１＝１化学量論の複合体を形 成する明確な分子の大きさ２＆５ｋＤａを育する糖タンパク質である（Ｗｅｌｇ ｕｓおよび５ｔｒｉｃｋｌｉｎ、　１９８３．）、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｒｔ。

２５３　、１２２５９−１２２６４：　Ｗｅｌｇｕｓ等、　１９８５ａ、　Ｃｏ ｌＣｏ１１ａ　Ｒｅｄ。

Ｒｅｓ、５　、　１６７−１７９；　Ｗｉｌｈｅｌｍ等、１９８９．　Ｊ、Ｅｉ ｏｌ、Ｃｈｅｙｘ。

２６４、１７２１３−１７２２１．欧州特許１８９７８４号）。ＴＩＭＰ−１を コードする遺伝子はクローン化され、配列決定され、モしてＸ染色体に対して地 図作成された（　Ｃａｒｍｉｃｈａｅ１等２１９８６、　Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔｅ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、　８３．２４０７−２４１１゜Ｄｏｃｈ ｅｒｔｙ等、　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、　３７θ、　６ ６−６９；　Ｍｕｌｌｉｎｓ等、１９８８．　Ｇｅｎｏ＊ｔｃｓ　３．　１８７ −１９４；　Ｍａｈｔａｎｉ等、１９８８、　Ｇｅｎｏｒａｉｃｓ　２．２９４ −３０１　）　ｏ分泌されたタンパク質は１８４個のアミノ酸を有し、そして６ 個の分子内ジスルフィド結合を有する。ＴＩＭＰ−１の還元およびアルキル化は 全阻害活性を消失させる。間質コラ−ゲナーゼを産生ずる同様の細胞はＴ　ＩＭ Ｐ−１を合成し、そして分泌することができる（Ｗｅｌｇｕｓ等、　１９８５ｂ 、　Ｊ、　ＣＬｉｎ、　１ｎｖｅｓｔ、７６　、２１９−２２４；　Ｈｅｒｒｏ ｎ等、１９８６．　Ｊ、ＢｉｏＬ、Ｃｈｅｗｒ、　２６１、２８１４−２８１８ 　”）。従って、これらの細胞型に対する真のコラーゲン分解活性は活性化され た酵素量とＴＩＭＰ−１量との均衡の結果である。研究により、ＴＩＭＰ−１量 とネズミとヒトの腫瘍細胞の侵入能力との間の逆の相関関係が示された。Ｔ　Ｉ ＭＰ−１アンチセンスＲＮＡの使用によるＴＩＭＰ−１ｍＲＮＡ量の負の制御に より、元々非腫瘍形成性で非侵入性のスイス３Ｔ３細胞が試験管内での侵入特性 および生体内での転移能力を有する腫瘍形成性細胞に変換した（　Ｋｈｏｋｈａ 等、　１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４３　、９４７−９５０　）。

生物学的に活性なコラ−ゲナーゼ阻害剤のもう１つの類は軟骨、大動脈および歯 から単離された低分子量（）ｔｏｏｏｏダルトン）陽イオン性タンパク質からな るが、しかし十分に特徴づけられていない。

最近、様々な基質特異性を有するマトリックスメタロプロテイナーゼファミリー の種々の新しいメンバーが同定されている。これらはストロメリシン（ラットト ランシンの相同体）、■型コラーゲナーゼ（７０ｋＤａゼラチナーゼ）および９ ２ｋＤａゼラチナーゼを包含する。

通常の細胞型中において同定されているが、これらの酵素の過発現は多くの系に おいて悪性転換および転移表現型に関係づけられている。従って、これらのメタ ロプロテイナーゼの調節の分子的基礎を理解すること、および診断や治療目的に 利用され得る阻害剤を見つけることに対する要求がある。

発明の要約 メタロプロテイナーゼの天然阻害剤を精製する手段を提供することが本発明の目 的である。

マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤およびその誘導体を提供することが本 発明の別の目的である。該阻害剤は天然の供給源から得ることができ、また、合 成手段例えばメリフィールドペプチド合成法または遺伝子操作音機体もしくは細 胞系により製造することができる。

本発明の上記阻害剤はマトリックスメタロブロチイナー。

ゼの活性から生じる疾病状態を処置するために使用され得る。さらに、メタロプ ロテイナーゼ活性は接合体の着床に必須であるから、これらの阻害剤は避妊薬と して有用である。

本発明は上記従来の阻害剤と異なる新規メタロプロテイナーゼ阻害剤に関する。

今ではＴＩＭＰ−２と表記される（そのアミノ末端アミノ酸配列およびゲル電気 泳動に基づく明確な分子量に対して命名され、最初はＣ３Ｃ−２１にと呼ばれる ）新規タンパク質の単離および配列決定が本明細書に記載されている。Ｃ５Ｃ− ２１Ｋは■型プロコラーゲナーゼと■型コラーゲナーゼとの１：１複合体を形成 し、そして活性化された■型コラーゲナーゼを阻害する。活性化された■型コラ ーゲナーゼへのＣ３Ｃ−２１にの結合はそのコラーゲン分解活性の阻害を生じる 。この阻害剤は固相に付着した精製マトリックスメタロブロチイナーゼ上でのア フィニティークロマトグラフィーを用いて単離され得る。Ｃ３Ｃ−２１にのアミ ノ酸配列分析は、Ｃ３Ｃ−２１ＫがＴＩＭＰ様タンパク質ファミリーの最初の新 規な別のメンバーであることを示すＴＩＭＰ−１との顕著な相同性を明らかにす る。

従って、好ましい実施態様はマトリックスメタロブロチイナーゼに結合し、モし て固相の精製メタロプロテイカーゼ上のアフィニティークロマトグラフィーを用 いて単離され得る約２１６００ダルトンのタンパク質である。

この単離されたタンパク質のアミノ酸配列は、該タンパク質がこれまで発見され ていない新しい遺伝子産物であり、そしてメタロプロテイナーゼの公知天然組織 阻害剤（ＴＩＭＰ−１）との配列相同性の領域を有することを示す。この阻害剤 の好ましい実施態様のタンパク質は下の図５に示されるアミノ酸配列により特徴 づけられる。

図面の簡単な説明 図１　ヒト黒色膳細［１ａ（Ａ２０５Ｂ）ＩＩ整培地から単離され、そしてゼラ チンアフィニティークロマトグラフィーから溶離させた阻害剤と■型コラーゲナ ーゼとの複合体の陰イオン交換クロマトグラフィー。ゼラチンアフィニティー精 製材料１５μｇを陰イオン交換樹脂に注入した。カラムをＮａＣ１の直線勾配（ −）で溶離させた。０．１８Ｍ　ＮａＣ１で溶離する単一主要ピークからの物質 は逆相カラム上で再びクロマトグラフィーを行った（図中に挿入して示す）。ビ ークＡおよびＢからの物質を直接配列決定した（図２Ｂ参照）。

コラ−ゲナーゼ複合体の１５％ポリアクリルアミド−３ＤＳゲル電気泳動。列Ａ ・逆相ＨＰＬＣ精製に続くＣ３Ｃ−２１に２μｇ（ピークＡ）。列Ｂ：セラチン ーセファロースアフィニティークロマトグラフィーにより単離されたＣ５Ｃ−２ １ＫＩＶ型コラ−ゲナーゼ複合体２μｇ０ゲルはラエムリ試料緩衝液系およびβ −メルカプトエタノール含有試料緩衝液を用いて２５ミリアンペアの一定電流で 操作された。電気泳動前に試料を９５℃で２分間加熱した。Ｂ、逆相ＨＰＬＣピ ークのアミノ末端アミノ酸配列。ゼラチン−アフィニティーおよび陰イオン交換 クロマトグラフィーにより得られた複合体をさらに逆相ＨＰＬＣにより各成分に 精製した。ビークＡおよびＢ（図１中に挿入）中に得られた物質を直接配列決定 した。

図３　活性化■型コラーゲナーゼ／ゼラチナーゼ活性のＣ５Ｃ−２１に阻害。Ａ 、精製されたｐＡＰＭＡ活性化■型コラ−ゲナーゼの精製Ｃ５Ｃ−２１阻害の投 与量関係（上側の曲線・還元およびアルキル化あり、下側の曲線、還元およびア ルキル化なし）。Ｃ５Ｃ−２１にはＴＩＭＰ−２と命名され、モしてモル１モル に基づいて示される。基質は天然■型コラーゲンである。Ｂ、精製されたｐＡＰ ＭＡ活性化■型コラ−ゲナーゼの精製Ｃ３Ｃ−２１Ｋ　（ＴＩＭＰ−２と命名） 阻害の投与量関係。

基質はゼラチンである。

図４　アミン末端から、およびエンドプロテイナーゼＬｙ　ｓ−Ｃ，Ａｒ　ｇ− ＣおよびＡｓｐ−Ｎでの消化に統いて得られたＣ３Ｃ−２１にタンパク質配列デ ータ。消化に続いて得られたペプチド配列は示されるように重複（下線領域）に より並べられている。Ｃ５Ｃ−２１にの全配列はこれらの重複するペプチドによ り網羅されている。各ペプチドの起源は図面の下半分に示されている。

図５　直接アミノ酸配列決定から誘導されるＣ５Ｃ−２１Ｋ　（Ｔ　ＩＭＰ−２ ）の完全配列およびヒトＴＩＭＰ−１に対する相同性。バイオネット（ＢＩＯＮ ＥＴ）システムを用いる電算処理された相同性検索がエンドプロテイナーゼＬｙ ｓ−Ｃ，Ａｒｇ−ＣおよびＡｓｐ−Ｎでの消化に続いて得られた配列に対して行 われた。これらの相同性検索の結果が示されている。

図６　Ｃ５Ｃ−２１にの一部をコード化するクローンｐｓｓ　１５およびｐｓｓ 　１８のｃＤＮＡ配列および予測タンパク質配列。

図７　完全ヒトＴＩＭＰ−２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および予想アミノ酸配 列。クローンｐｓｓ３８のＣＤＮＡ挿入物がジデオキシ方法論を用いて両方向に 配列決定された。予測アミノ酸配列はＤＮＡ配列の下に示さ′れている。予想ポ リアデニル化シグナルには下線を付しにタンパク質の直接アミノ酸配列決定（上 記図５参照）の比較。Ｃ５Ｃ−２１に一次構造はボートン・インストルメンツ２ ０２０気相タンパク質シーケネーターおよび０、４６　Ｘ　２５■ベツクマンＯ ＤＳカラムを備えたベックマン・システム・ゴールドＨＰＬＣユニット上でのフ ェニルヒダントイン誘導体の同定を用いて直接決定された。

比較はこれらの配列の９６％同一性を示す。星印は完全ＴＩＭＰ−２ｃＤＮＡの ＤＮＡ配列決定により同定された配列における変化を示す。

Ｋ１　ＴＩＭＰ−２とＴＩＭＰ−１とのアミノ酸レベル（Ａ）およびヌクレオチ ドレベル（Ｂ）での相同性比較。Ａ、ＴＩＭＰ−２およびＴ　ＩＭＰ−１の推定 アミノ酸配列はブステル・スコアリング・マトリックスを用いて比較された。分 析は６６％相同性のカットオフ値および８アミノ酸重複を用いて行われた。線は 、相同性がこれらの２種のタンパク質の間で６６％相同性の平均値を越える領域 を示す。Ｂ、ＴＩＭＰ−２とＴＩＭＰ−１とのヌクレオチド配列の比較。分析は ブステル・スコアリング・マトリックスを用い、４のハツシュ値および３０のウ ィンドーで行われた。線は同一の領域を示す。ＴＩＭＰ−１対ＴＩＭＰ−１また はＴＩＭＰ−２対ＴＩＭＰ＝２が行われる場合、分析は対角線の実線が得られ、 それは完全な同一を示す。これは、ＴＩＭＰ−２がＴＩＭＰ−１と異なる特有の 遺伝子産物であることを示す。

図１０　培養細胞系におけるＴ　ＩＭＰ−２ｍＲＮＡ発現のノーザンプロット分 析。テキストの記載と同様に細胞から単離されたような全体の細胞質ＲＮＡおよ びオリゴ−ｄＴ選択されたＲＮＡ、ナイトランフイルターへの移送の後にＲＮＡ をＴＩＭＰ−２に特異的なＩ！ｐ標識プローブとハイブリッド形成させた。得ら れるオートラジオグラフが示されている。Ａ）Ａ２０５８ヒト黒色腫細胞からの オリゴ−ｄＴ選択されたＲＮＡ（１μｇ）。Ｂ）Ｗｌ−３８ヒト胚誘導繊維芽細 １！ｌｉ（列１）およびＨＴ−１０８０ヒト繊維肉腫細胞（列２）からの全体の 細胞質ＲＮＡ　（５μｇ）。

図１１１２−テトラデカノイルホルボル１３−アセテート（１０ｍｇ／ｍ１．列 Ｂ）または形賀転換性成長因子β１（５μｇ／ｍｌ、列Ｃ）での４８時間処理に 続いてＡ２０５８ヒト黒色腫細胞から単離された全体の細胞質ＲＮＡのノーザン プロット分析。これらは未処理Ａ２０５８細胞（何人）における基本的レベルと 比較される。等量のＲＮＡ　（５μｇ）が注入され、そして臭化エチジウム染色 ゲルが対照として示されている（図中の挿ザンプロット分析。各試料のＲＮＡ　 （５μｇ）をテキストに記載のとおりに電気泳動し、そして移送した。列Ｔ１、 Ｔ、およびＴ、は侵入性肛門腫瘍からのＲＮＡを含有する。列Ｎ、　、Ｎ２およ びＮ、は相当する隣接正常粘膜からのＲＮＡを含有する。

発明の詳細な説明 本発明は、完全−次構造の決定によりこのタンパク質がＴＩＭＰファミリーの第 ２のメンバー、最近報告されたような（５ｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等 、　１９８９．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ履、　２６４　、１７３７４−１７ ’３７８）　Ｔ　Ｉ　Ｍ　Ｐ　−２であることが示されるマトリックスメタロプ ロテイナーゼの阻害剤に関する。Ｔ　ＩＭＰ−２は７２ｋＤａＩＶ型コラ−ゲナ ーゼの潜在的プロ酵素体と選択的に複合体を形成する２１ｋＤａタンパク質であ る（　５ｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等、　１９８９．　Ｊ、　Ｂｉｏｎ 、Ｃｈｅｙａ、２６４　、　１７３７４−１７３７８；　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ等、 １９８９．　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、θ ６．８２（１７−８２１１＞　、分泌されたタンパク質は１９２個のアミノ酸残 基を有し、そしてグリコジル化されていない。ＴＩＭＰ−２はアミノ酸配列レベ ルでＴＩＭＰ−１に対して全体で７１％の相同性を示す。１２個のシスティン残 基の位置がＴＩＭＰ−１に存在する位置に関して保存されており、４個のトリプ トファン残基のうち３個が保存されている。ＴＩＭＰ−２は７２ｋＤａの酵素と 結合して■型コラーゲン分解活性およびゼラチン活性を阻害する。阻害研究は完 全な酵素阻害がＴＩＭＰ−２：活性化７２ｋＤａＩＶ型コラ−ゲナーゼ酵素の１ ：１モル比で生じることを示した（　５ｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ　等 、　１９８９．　Ｊ、Ｂｉａｓ、　Ｃｈｅｒｒｒ、２６４　。

１７３７４−１７３７８）。従って、ＴＩＭＰ−１’と異なりＴＩＭＰ＝２は■ 型コラーゲナーゼの潜在的形態および活性化形態の両方に結合し得る。種々のコ ラ−ゲナーゼファミリー酵素を産生ずる細胞系、ならびにＴＩＭＰ−１およびＴ ＩＭＰ−２の両方を用いた細胞培養研究はＴＩＭＰ−２が７２ｋＤａＩＶ型コラ −ゲナーゼと優先的に相互作用することを示唆する（　５ｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅ ｖｅｎｓｏｎ等、　１９８９゜）、ＢｉｏＬ、Ｃｈｅｍ、２６４　、　１７３７ ４−１７３７８：　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ等、１９８９゜Ｐｒｏｃ、Ｈａｔｅ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８６．　８２０７−８２１１　）　、従って、活性 化酵素とＴＩＭＰ−１との均衡である間質コラ−ゲナーゼ活性と同様に、真の７ ２ｋＤａＩＶ型コラ−ゲナーゼ活性は活性化酵素とＴＩＭＰ−２の量の間の均衡 に依存し得る。

本発明の天然阻害剤の類似体は、該天然阻害剤中のシスティンと同様の間隔でシ スティンを有するペプチドおよびタンパク質を製造することにより作成し得る。

その他のアミノ酸は、上記システィンが適当な間隔で位置する限り天然阻害剤の パターンと変化していてもよい。少な（とも２個の適当に配置されたシスティン が、ジスルフィド架橋形成による阻害活性を確実にするために、ペプチド中に存 在しなければならない。

好ましいタンパク質は図５の配列を含むけれども、少なくとも５０％の配列位置 において図５の配列と同一なアミノ酸を有するペプチドは、所望の相対位置にシ スティンが保持されていれば、メタロプロテイナーゼ活性の有用な阻害性を有す る本発明の範囲内である。

天然Ｃ５Ｃ−２１分子から誘導されたペプチド断片は免疫原として使用された。

Ｃ３Ｃ−２１Ｋに特異的な抗体のための免疫原または抗原として使用されるべき タンパク質の合成ペプチド断片の場合において、当業者は、抗体結合部位による 認識に関するユニークアミノ酸配列が抗体が使用されるべき環境（例えばヒト生 物学的標本）において別のタンパク質中に存在することが知られていない４ない し６個のアミノ酸の配列からなるということを理解する。さらに、本明細書にお いてユニークヌクレオチド配列は上で定義されたようなユニークアミノ酸配列を コード化するヌクレオチド配列を意味し、そしてそれ故に４ないし６個のアミノ 酸をコード化するのに必要な４ないし６コドン（１２ないし１８ヌクレオチド） か、らなる。そのようなユニークタンパク質断片に対する抗体は天然阻害剤を血 清、組織およびその他の天然供給源中に検出するために使用され得る。

特に好ましいペプチドは少な（とも２個のシスティンを有するものである。上記 分子のアミノ末端から誘導されル配列Ｃ３Ｃ３ＰＶＨＰＱＱＡＦＣＮＡを含むｙ ミ／酸配列およびアミノ酸配列５ＬＮＨＲＹＱＱＧＣＥＣＫＩＴＲＣＰおよびＭ ＩＰＣＹＩＳＳＰＤＥＣＬＷＴＤを含む断片が特に活性であると考えられる。Ｃ ３Ｃ−２１Ｋから誘導されるペプチドの免疫庫的および機能的応用はこれらのペ プチドに限定されず、天然または合成で誘導された全体のタンパク質を包含し得 る。

実　施　例　Ｉ Ｃ５Ｃ−２１Ｋ　（ＴＩＭＰ−２）の精製ヒトＡ２０５８黒色腫細胞を１０％ウ シ胎児血清含有のダルベツコ変形イーグル培地中に８０％集密まで増殖させた。

培地を次に無血清ダルベツコ変形イーグル培地に置き換え、そして培養をさらに ２４時間継続した。ヒト黒色腫細胞（Ａ２０５８）無血清調整培地的６Ｃ１をア ミコンＹＭ３０限外ろ過膜により３００ｍ１まで濃縮した。この濃縮調整培地を 、０．０５　Ｍ　トリスＨＣＩ、０゜５Ｍ　ＮａＣ１，０，００Ｅ＋Ｍ　ＣａＣ １，，０，０２％Ｂｒ１ｊ３５、ｐ　Ｈ７，６緩衝液で平衡化させた連続した２ 本の１．０　Ｘ　１０■ゼラチン−セファロース（シグマ・ケミカル社）アフィ ニティーカラムに注入した。カラムを次に平衡化緩衝液中の１０．Ｏ％ＤＭＳＯ で溶離する前に平衡化緩衝液で洗浄する。アミコンＹＭ３０膜を用いて溶離液を 濃縮し、そして０．０５　Ｍ　）リスＨＣＩ、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，００ ５Ｍ　ＣａＣｌｘ　、０．０２％Ｂｒ１ｊ３５、ｐ　Ｈ７，６に交換する。試料 を一８０℃で貯蔵する。陰イオン交換クロマトグラフィー用の試料を２０％エチ レングリコール含有の０．０１　Ｍ　）リスＭＣＩ、ｐＨ７，５中で透析した。

試料１５μｇを０．４　Ｘ　５．０　ａｎデイオネックス・プロバック陰イオン 交換カラムを備えたディオネックスＡ　Ｉ　４００ＨＰＬＣシステム中に注入し た。

このカラムをゼロから０．４Ｍ　ＮａＣ１の線状勾配で溶離した。単一の主要ピ ークの物質を集め、そして一部を０．４６Ｘ１０ａｎＰＲ３００カラム（ピアー ス・ケミカル社）に注入した。二〇カラムを以前記載されたように溶離した（　 Ｌｉｏｔｔａ等により１９８９年３月１日出願された米国特許出願第０７／３１ ７４０７号）。また、ゼラチン−セファロースクロマトグラフィーから得られ、 そして−８０℃で貯蔵した複合体もＰＲ３００カラムシステムに直接注入し得る 。

Ｃ３Ｃ−２１Ｋがヒト黒色鳳細１！！（Ａ２０５Ｂ）調整培地のゼラチンアフィ ニティークロマトグラフィーによりヒト■型コラーゲナーゼとの複合体として単 離された。

ゼラチンアフィニティークロマトグラフィーから得られた材料の陰イオン交換ク ロマトグラフィーは約０．１８　ＭＮａＣｌで溶離する単一種を生じた（図１） 。このイオン交換クロマトグラフィーから溶離した材料の逆相ＨＰＬＣ分析は、 この材料が２成分を含有することを示した（図１．挿入部）。従って、ゼラチン アフィニティークロマトグラフィ一段階から得られた材料は陰イオン交換クロマ トグラフィーで見られるように分子間複合体であり、そしてゼラチンアフィニテ ィークロマトグラフィーでの２種の単純な共精製物ではない。ゼラチンアフィニ ティークロマトグラフィーから得られた複合体のＮａＤ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏａ　− Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅはまた２成分を示した（図２Ａ）。

より大きい分子量の物質はＭ、７００００を有する。それはイムノブロッティン グおよびアミノ末端配列決定（下記参照）により■型プロコラーゲナーゼと同定 された。より小さい分子量の物質は、還元でＭ、２１０００に高められるみかけ のＭ、１８０００を有する。ゼラチンアフィニティークロマトグラフィーから得 られた複合体の直接逆相ＨＰＬＣ分析はＩＩＩに挿入したチャートと同一の２つ のピークの分離を生じた。これらのピーク（ビークＡ：より短い保持時間の物質 、ビークＢ：より長い保持時間の物質）の各々から得られた物質をアミノ酸分析 および直接アミノ酸配列決定に供した。ピークへの物質は図２Ｂに示されるよう なユニークアミノ末端アミノ酸配列を与えた。ビークＢの物質は潜在的■型コラ ーゲナーゼ（すなわち■型プロコラーゲナーゼ）と同一なアミノ末端アミノ酸配 列を与えた（図２Ｂ）。

実施例２ 酵素消化、アミノ酸配列決定およびアミノ醗組成分析ＨＰＬＣ精製Ｃ５Ｃ−２１ Ｋを上記のようにして還元し、そしてアルキル化した。ｊ１元およびアルキル化 Ｃ３Ｃ−２１に１５ｇｇをエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ５μｇ５エンドプロ テイナーゼＡｒｇ−Ｃ５μｇまたはエンドプロテイナーゼへ５ｐ−Ｎ２μｇと（ ＬＩＭ　ＮＨ、Ｈｃｏｓ緩衝液中８７℃で一晩保温する。次に、消化物のＰＲ３ ００カラム上での逆相ＨＰＬＣにより、各々が集められて個々に配列決定される 各成分ビークに分離した。アミノ酸配列分析は、ＨＰＬＣ精ＩＩ精分１ｗ分、ポ ートン・インストルメンツ２０２０気相タンパク質シ′−ケネーターにより標準 プログラム３９を用いて行われた。ＰＴＨアミノ酸同定は０．４６Ｘ２５ｃｘへ ツクマンＯＤＳカラムを備え、そして酢酸ナトリウム／ＴＨＦ／アセトニトリル 変形分離法を用いて溶離されるベックマン・システム・ゴールドＨＰＬＣユニッ ト上で行われた。

アミノ酸組成分析は６Ｎ　ＨＣＩ、ＣＬ１％フェノールを用いる１２０℃で１８ 時間蒸気相加水分解に続いて行われた。加水分解物はＰ　ＩＴＣ法（ピコタグ・ システム。

ウォーターズ）を用いて誘導され、そしてトリエチルアミン／酢酸アンモニウム アセトニトリル変形溶離法を用いて上記のように同様の）４ＰＬＯユニツト中で 分析された。

ゼラチンアフィニティークロマトグラフィーから溶離された複合体およびＣ３Ｃ −２１にのアミノ酸組成分析は表１において比較されている。Ｃ３Ｃ−２１にの アミノ酸組成はその他のコラ−ゲナーゼ阻害剤と著しく異なり、そして異常なＬ ｅｕ／Ｉｌｅ比により区別される。

この特徴はゼラチンアフィニティークロマトグラフィーにより単離された際の複 合体の化学量論を評価するために使用された。Ｃ３Ｃ−２１（７Ｌｅｕ、１８１ １ｅ；表１２図４の重複ペプチドからの直接アミノ酸配列と一致する）の実験的 に決定されたモルアミノ酸組成および■型プロコラーゲナーゼの予測組成（’１ ９Ｌｅｕ／２５１１ｅ）に基づいて、Ｉ；Ｉモル複合体の理論的Ｌｅｕ／１１ｅ 比が４’６Ｌｅｕ／４２１１　ｅまたは１．ｌＯであろうと計算された。このこ とは、Ｃ３Ｃ−２１に−ＩＶ型プロコラーゲナーゼ複合体のアミノ酸組成分析か ら決定された１、０３の比率とよく一致する。このように、種々のメタロプロテ イナーゼを分泌することが知られているヒト黒色腫細胞はまた、■型コラーゲナ ーゼの潜在型に特異的に結合しそして１：ｌのモル化学量論で複合体を形成する タンパク質Ｃ３Ｃ−２１Ｋを分泌する。

Ｃ５Ｃ−２１・に　Ｃ５Ｃ−２１Ｋ　複合体アミノ酸　残　基 残基　ピコモロ１１）　モ＊ｌ！）　ピコモに′１）ＡＳＰ／ＡＳＮ　１４１　 １８　１４９ＧＬＵ／ＧＬＮ　１６６　２２　１２７ＳＥＩＲ１０７１４７８ ＨＩＳ　３２　４　２５ ＧＬＹ　２２２　２９　１２３ ＡＲＧ　５６　７　６１ ＴＨＲ５９８８６ ＡＬ＾　１０８　１４　９２ ＰＲＯ９３１２９２ ＴＹＲ６０８６４ ＶＡＬ　８６　１１　６７ ＭＥＴ　１１　１　２８ ＣＹＳ　３３　４　１２ ＩＬＥ　１３７　１８　８３ ＬＥＵ　５７　７　８１ ＰＨＥ　５０　７　８６ しＹＳ　１２７　１７　１０７ 合計　１５４５　２０１　１３６１ ＬＥＵ／ＩＬＥ　Ｉｔ　Ｏ，４２０，３９１，０２成。

エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ，エンドブロティナーゼＡｒ　ｇ−Ｃおよびエ ンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ消化により得られた重複ペプチドの配列分析によ り決定されたヒトＣ３Ｃ−２１にの完全−次構造は図４に示されている。この配 列データから決定されたＣ３Ｃ”−２１にのアミノ酸組成は精製Ｃ５Ｃ−２１に の直接分析により得られたもの（表１）と一致す葛。−次配列から計算されるＣ ３Ｃ−２１にの分子量は２１６００ダルトンであり、ゲル電気泳動データとよく 一致する。相同性に対するコンピューター検索はバイオネットタンパク質データ ベース（ＮＢＲＦ−ＦＩＲおよび５ＷＩＳＳ−ＰＴＯＴタンパク質配列データバ ンクをアクセスする）で行われた。電算処理された相同性検索は全体のペプチド 配列に対して行われた。これにより、Ｃ５Ｃ−２１に構造とヒトＴ　ＩＭＰとの 並列（図５）に対する基礎が得られた。

１９’１個のアミノ酸重複中に４１．０％のアミノ酸同一性および２９％の保存 置換がある。１２個のシスティン残基の位置が保存され、そして４個のトリプト ファン残基のうち３個の位置もまた保存されている。これらの残基の相対位置の 保存は両方のタンパク質における機能的または構造的役割を支持する。

実施例３ コラーゲン分解およびゼラチン分解阻害■型コラーゲナーゼアッセイは以前記載 されたように行われた（Ｌｉｏｔｔａ等により１９８９年３月ＩＢ出願された米 国特許出願第０７／３１７４０７号）。ゼラチナーゼアッセイは熱変性ラット皮 膚フラーゲン（ＮＥＮ／デュポン）を利用して上記方法の適用により行われた。

Ｃ３Ｃ−２１−ＩＶ型コラ−ゲナーゼプロ酵素複合体は１ｍＭｐ−アミノフェニ ル水銀アセテート（ｐ−ＡＰＭＡ）と１時間の予備保温により活性化された。続 いて、■型フラーゲナーゼ活性のアッセイの前に精製Ｃ３Ｃ−２１Ｋを添加した 。

ゼラチン＝アフィニティークロマトグラフイーにより単離されたとき、Ｃ３Ｃ− ２１にと■型プロコラーゲナーゼとの間の複合体にはコラーゲン分解活性がなか った。

育種水銀化合物ｐ−アミノフェニル水銀アセテート（ｐ−ＡＰＭＡ）での活性化 に続いて、得られた達成可能な最大■型コラーゲン分解活性は分解■型コラーゲ ン７．１２μｇ／時間／酵素複合体μｇだった。有機水銀活性化に続いて、得ら れた最大ゼラチン分解活性は２６．４μｇ／時間／酵素複合体μｇだった。ジス ルフィド結合の還元はＴＩＭＰと間質コラ−ゲナーゼとの間に形成された複合体 を破壊し、モしてＣ３Ｃ−２１にと■型プロコラーゲナーゼとの間の複合体を破 壊する（図３Ａ）。精製された天然Ｃ５Ｃ−２１にであって、還元およびアルキ ル化されていないＣ３Ｃ−２１にのこのｐ−ＡＰＭＡ活性化複合体への添加はコ ラーゲン分解活性およびゼラチン分解活性の両方の部分的阻害を生じた（図３Ａ およびＢ）。このデータから推論すると、Ｃ３Ｃ−２１にの活性化酵素への結合 がゼラチン−セファロースクロマトグラフィーにより単離された複合体に対して 決定された１・１モル比に一致する化学量論的様式で起こることが示された。こ れらの結果は、有機水銀化合物に晒されなかったＣ３Ｃ−２１Ｋが活性化■型コ ラーゲナーゼに結合し、そして阻害し得るが、しかし■型コラーゲナーゼのｐ− ＡＰＭＡ活性化がＣ３Ｃ−２１Ｋの育種水銀介在不活性化に伴って起こることを 示唆する。

これらのデータは、Ｃ５Ｃ−２１ＫがＴＩＭＰ−１゜特にシスティン残基の保存 部位に関して分散された相同性を共有するけれども、Ｃ３Ｃ−２１にペプチドの 全てが公知のＴ　ＩＭＰ−１の配列と明らかに異なることを示す。従って、本発 明のペプチドはＴＩＭＰをコード化するものとは異なる遺伝子によりコード化さ れる。このことはＣ５Ｃ−２１Ｋが別の遺伝子産物であることを示す。

合成ペプチドはＣ３Ｃ−２１に分子のアミノ末端部分からの配列を用いて製造さ れた。これらは、標準法により抗ペプチド抗体生成において使用するためにウシ 血清アルブミンに結合された。抗体は以前記載されたように固相ペプチドアフィ ニティークロマトグラフィーを用いてアフィニティー精製された（　５ｔｅｔ　 １ｅｒ−３ｔｅｖｅｎｓｏｎ等。

１９８９、　Ｊ、　ＢｉｏＬ、　Ｃｈｅｙｍ、　２６４　、１３５３−１３５６ ）　、これらの抗体は標準的なウェスタンおよびイムノプロット上で反応性であ る。

単離精製されたＣ３Ｃ−２１に、組換えＣ３Ｃ−２１におよび類似体はマトリッ クスメタロプロテイナーゼの非調節活性を特徴とする疾病の治療に使用され得る 。そのような疾病には関節炎、糖尿病、ガン、粘膜および上皮組織の潰瘍、自己 免疫仲介炎症、肺障害、肉芽腫症が含まれる。特に音用な適用は、心筋基底膜の 破壊等のマトリックスタンパク質分解は苦痛における有害な過程であるから心筋 梗塞の治療においてであろう。その他の治療効果はまた、基底膜破壊を伴う疾病 例えば狼癒、自己免疫神経系異常、筋肉異常例えば筋ジストロフィー、心筋梗塞 および糸球体症において得られる。ｅｓｃ−２ｔＫはまた、胚の胎盤付着または 着床を妨げることにより出産調節剤として使用され得る。

実施例４ ヒトＣ３Ｃ−２１にのクローニング ヒトＡ２０５８黒色腫細胞を集密まで増殖させ、オリゴｄＴカラムに流し、メツ センジャーＲＮＡ種を選択的に単離した。このｍＲＮＡ調製物は次にＬａｍｂｄ ａＧｅｍ−４ベクターおよび標準的方法論を用いてｃ　ＤＮＡライブラリーを調 製するために使用された。精製ｍＲＮＡ１μｇが市販のＣＤＮＡ合成キット（ア マルシャム）を用いて二本ＭＣＤＮＡを調製するために使用された。

このｃＤＮＡはＥｃｏ　Ｒ１メチラーゼ（プロメガ）を用いてメチル化され、ｉ ｃｏ　Ｒ１リンカ−（プロメガ）に連結され、Ｅｃｏ’　Ｒ１で制限され、そし てＥｃｏ　Ｒ１消化ＬａｍｂｄａＧｅｍ−４ベクター（プロメガ）に連結された 。結合物を包装しくギガバック・ゴールド、ストラタジーン）、そして最適反応 物を１．５　Ｘ　１０　＠組換え体を得るように貯蔵した。７．５　Ｘ　１０　 ｈ組換え体がオリゴヌクレオチド２７−４０を用いてスクリーニングされた。オ リゴヌクレオチド２７−４０は４５ｍｅｒで配列＋　５　’　−ＧＡＧＡＡＧＧ ＡＧＧＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＣＡＡＴＧＡＣＡＴＣＴＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡ ＴＣ−３’を有し、既に配列決定されたＴＩＭＰ−２タンパク質の残基２７ない し４０の逆翻訳に相当する。オリゴヌクレオチド２７−４０はパイオサ−千８７ ００ＤＮＡシンセサイザーでβ−シアノエチルホスホルアミジフト化学により合 成され、モしてγ−（”Ｐ）−ＡＴＰ　（アマルシャム）およびＴ４キナーゼ（ ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）を用いて標識された。スクリーニングさ れた全体で７５００００種のプラークから、２８９種の陽性のものが同定された 。これらの陽性物の中で、最初に８種のクローンが、親のＬａｍｂｄａＧｅｍ− ４クローンの５ｐｅｌ消化、５ｐｅｌ消化物の結合および形質転換体のアンピシ リン耐性選択に続いて、さらに特徴づけられた。これらの８種のクローンが、Ｃ ３Ｃ−２１に４：対するタンパク質配列データに基ついた４種の付加的な合成オ リゴヌクレオチドとのサザンブロットハイブリダイゼーションに続いて交差スク リーニングされた。２種のクローンだけが４種全ての付加的合成オリゴヌクレオ チドプローブと陽性に反応した。これらのクローンはｐｓｓ１５およびｐｓｓｔ ｓと表記される。これらの２種のクローンのより大きいものが２．１ｋｂ挿入物 含有ｐＧＥＭ−１ベクターであるｐｓｓ１５である。このクローンはその５′末 端からおよそ１．２　ｋ　ｂに位置する内部ｊｌｉｎｄＴ１制限部位を含む。こ の挿入物はＥｃｏ　Ｒ１およびｌｂａ　ｌでの二重エンドヌクレアーゼ制限によ りｐＯＥＭ−１ベクターから遊離され得る。

ｐｓｓ１５およびｐｓｓｔｓの両方のクローンをＭ２Ｓ中にサブクローン化し、 モしてジデオキシ法を用いて配列決定した。ｐｓｓ　ｌ　５クローンを２つの１ ｉｎｄＴ１断片を用いてサブクローン化した。得られた部分的ｃ　ＤＮＡ配列お よび予測されたアミノ酸配列は図６に示されている。得られたアミノ酸配列は、 図５に示されたＣ５Ｃ−２１にの部分に対して得られたものと実験誤差の範囲内 で同一である。これらの結果は、ｐＳＳ１５およびｐＳＳ１８と表記されるこれ らのクローンがタンノ（り質Ｃ３Ｃ−２１Ｋをコード化することを示す。種間の コドン優位性における相違により、その他の種からのクローンが機能的Ｃ５Ｃ− ２１にタンパク質をコード化するが、しかし異なるヌクレオチド配列を育するこ とは明瞭である。

従って、Ｃ３Ｃ−２１ＫｃＤＮＡのコドンあたり１個の塩基変化は全体のヌクレ オチド配列において３３％の変化を生じ、機能的Ｃ３Ｃ−２１にタンパク質をコ ード化するであろうｃＤＮＡを依然として生じ得る。従って、ヒトＣ５Ｃ−２１ Ｋに対するこのクローンの存在により、その他の種からこのタンパク質をコード 化するｃ　ＤＮＡを単離する操作を省略できる。

Ｃ３Ｃ−２１ＫｃＤＮＡ　（ｐＳＳ　１５）の寄託は、アメリカ合衆国、２０８ ５２メリーランド、ロックヴイレ。

バークロラン・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク シ３ン（ＡＴＣＣ）に１９８９年８月１１日に行い、寄託番号は４０６４４であ る。寄託物は寄託口から３０年間または寄託試料の最後の請求日から５年のより 長い方の間生存したまま保管され、もし生存していない場合は再寄託するであろ う。そして法律に特に制限のない場合一般に分譲される。特許および商標子の長 官は請求に応じて寄託物を利用するであろう。

次の実験において、２つの付加的クローンが単離され、そして最長のクローンｐ ＳＳ３８におけるｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列が図７に示されている。こ の挿入物は７３　ｏｂｐからなり、ポリ（ＡＴ）尾部がな（、そして１９４個の アミノ酸の成熟ＴＩＭＰ−２タンパク質をフード化する。１３０ヌクレオチド長 の３′非翻訳領域はＲＮＡの３Ｙ末端から下流に推定上のポリアデニル化シグナ ル３０塩基を含む。

ｃＤＮＡクローンから予測されたＴＩＭＰ−２のアミノ酸配列と重複性エンドプ ロテイナーゼ誘導化ペプチド断片の直接アミノ酸配列決定により決定されたアミ ノ酸配列との比較は優れた一致を示す。元の配列は１９２個だけのアミノ酸を含 有していた。これまで同定されていない残基は９２位のグリシル残基およびカル ボキシル末端のプロリル残基に相当する。その他の変化は図８に記載されている 。ＴＩＭＰ−２とＴＩＭＰ−２との予測されたアミノ酸配列レベルでの相同性は ３７．６％の同一性であり、そして６５．６％の全体の相同性である。６６％相 同性のカットオフ値および８アミノ酸重複を用いたこれらの２つの予測されたタ ンパク質配列間の相同性分配のブステル・マトリックス分析は、相同性がこの平 均値より下回る２つの領域があることを示す。ＴＩＭＰ−２はその他の潜在的な メタロプロテイナーゼおよびＴＩＭＰ−１の両方の存在下で７２ｋＤａＩＶ型コ ラ−ゲナーゼの潜在型に結合する明らかな傾向を示す（Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅ ｖｅｎｓｏｎ等、　１９８９．　Ｊ、　ＦｊｉｏＬ、　Ｃｈｅｒｔ、　２６４　 、１７３７４−１７３７８；ＧＯｌｄｂｅｒｇ等、１９８９．　Ｐｒｏｃ、　Ｍ ａｔｅ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　υ、　Ｓ、　Ａ、　８６゜８２０７−８２１ １　）。しかしながら、ＴＩＭＰの両形態は活性化■型コラーゲナーゼを阻害す るであろう。従つて、これらのタンパク質の間に高度に保存されているアミノ酸 の領域、例えば６６％の全体の相同性値を越える領域はこれらのタンパク質の公 知の共有機能、すなわち個々のＴＩＭＰ分子に特有の活性化コラ−ゲナーゼファ ミリー酵素の阻害に関連するであろう。従って、残基２０ないし４５の間の低い 相同性の領域およびＴＩＭＰ−２のカルボキシル末端は７２ｋＤａＩＶ型コラ− ゲナーゼの潜在型へのＴＩＭＰ−２の結合に関連するであろう。

実　施　例　５ 、ＴＩＭＰ−２ｃＤＮＡの適用 ヒトＴＩＭＰ−２とヒトＴＩＭＰ−１とのｃＤＮＡ配列の比較は、アミノ酸レベ ルで見られたものに匹敵する相同性を（孟とんど示さない（図９ｂ）。この結果 は、これらの遺伝子がこの遺伝子ファミリーの進化において初期に分化したこと を意味する。ｃＤＮＡレベルでの相同性の欠如はまた、ＴＩＭＰ−２ｍＲＮＡ転 写物がＴＩＭＰ−１プローブを用いたノーザンプロット分析で検出されなかった こと、およびＴＩＭＰ−１プローブでのｃＤＮＡライブラリィのスクリーニング によりＴＩＭＰ−２クローンが得られなかったことを説明する。

種々の細胞から単離されたオリゴｄＴ遺択ｍＲＮＡのノーザンプロット分析はＴ ＩＭＰ−２ｃＤＮＡを用いて行われた。ＨＴ−１０８０ヒト繊維肉腫細胞、Ｗｌ −３８ヒト胚誘導師繊維芽細胞、およびＡ２０５８ヒト黒色腫細胞をダルベツコ 変形イーグル培地（ＤＭＥＭ、ギブコ）中８０％集密まで増殖させた。培地を次 に０．５％ＩＴＳ’″　（フラボラティブ・リサーチ社）および２５μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン補足ＤＭＥＭに置き換えた。培地を４時間後に換え、そしてｌＯ ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＡ（シグマ・ケミカル社）まｔ二は５ｎｇ／ｍｌ　ＴＧＦ−β １（アール・アンド・ディ・システムズ）の添加前に２０時間培養を続けた。

全体の細胞質ＲＮＡを記載のように細胞系から単離した（Ｇｏｕｇｈ、　１９８ ８．　ＡｎａＬ、　Ｂｉｏｃｈｅｒｘ、　１７３　、９３−９５　）　ｅ　ｍＲ ＮＡはＦＡＳＴ−ＴＲＡＣＫ　ｍＲＮＡ単離キット（インビトロゲン）を用いて 単離された。組織ｍＲＮＡは凍結組織断片から単離された。組織断片はワシント ンにあるワシントン・ホスピタル・センターのＢａｒｒｙ　Ｓｃｈｍｕｃｋｌｅ ｒ博士からの手術の際の８種の部分的結腸切除標本から得られた。３種全例の病 理学的診断は侵入性アデノカルシノーマだった。組織試料はまた隣接する正常粘 膜からも得られた。凍結組織を液体窒素中乳鉢と乳棒で粉々にした。次いで組織 粉末を４Ｍグアニジンイソチオシアネート、３Ｍ酢酸ナトリウム、Ｑ、８４％β −メルカプトエタノール、ｐ　Ｈ６，０に溶解させた。全体の細胞質ＲＮＡを５ ．７Ｍ塩化セシウム、８Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６、０を介してペレット化する ことにより単離した。ＲＮＡの一部をホルムアルデヒド／１％Ｗ　／　Ｖアガロ ースゲルに注入し、そして電気泳動しナイトランフイルター（シュライヒャー・ アンド・シューエル）に移した。ＲＮＡをフィルターに紫外線架橋させ、そして クローンｐＳＳ３８からの挿入物にハイブリッド形成させた。ｐＳＳ３８ｃＤＮ Ａプローブをα−（”Ｐ）−（ＩＣＴＰでランダムブライマーラベリングキット （ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）により標識した。

Ａ２０５８ヒト黒色腫細胞系のノーザンプロット分析は３．５および０．　’ａ 　ｋ　ｂのおおよその大きさを育する２種の特異的ｍＲＮＡ種を表した（図１０ ８）。これらのｍＲＮＡ種はまた、ヒトＷｌ−３８繊維芽細胞から単離されたＲ ＮＡ中に、ＨＴ−１０８０繊維肉腫細胞からの等量のＲＮＡ中に検出可能な０． ９　ｋ　ｂ種の非常に低いレベルで検出された（図１０ｂ）。これらの２種の特 異的転写物の起源は決定されないままであるが、しかし、大きさの相違はあまり にも太き（，３′ポリアデニル化における相違によっては容易に説明できない。

インシュリン様成長因子ｌｌｍＲＮＡに対して説明されたように、別の５１非翻 訳領域が異なる転写物の大きさを説明することは可能である。

Ａ２０５８細胞の１２−〇−テトラデカノイルホルボル１３−アセテート（ＴＰ Ａ）（１０ｎｇ／ｍｌ）での処理はＴＩＭＰ−２転写レベルを著しく変えなかっ た（図１１）。これは、ＴＰＡに応答して負の制御された７２ｋＤａＩＶ型コラ −ゲナーゼに対するｍＲＮＡとは対照的である。間質コラ−ゲナーゼｍＲＮＡは Ａ２０５８黒色腫細胞および繊維芽細胞系のＴＰＡ処理に続いて急速に誘導され る（Ｃｈｉｎ等、　１９８５．　Ｊ、　ＢｉｏＬ、　ＣｈｅＮ、　２６０　。

１２３６７−１２３７６；　Ｗｅｒｂ等、１９８６．　Ｊ、ＣｅＬＬ　ＢｉｏＬ 、１０２　、　６９７−７０２；　Ｆｒ１ｓｃｈ等、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、 　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ。

Ａ、　８４　、２６００−２６０４　”）　、これはＴＩＭＰ−１の場合と同様 である（　Ｅｄｗａｒｄｓ等、　１９８５．　ＭｏＬ、　ＣｅＬＬ、　ＢｉｏＬ 、　５．３２８０−３２８８；　Ｍｕｒｐｔ＋ｙ等、　１９８５．　Ｊ、　Ｅｉ ｏＬ、　Ｃｈｅｗ、　２６０．３０７９−３０８３；　Ｗｅｌｇｕｓ等、　１９ ８５ｂ、　Ｊ、　ＣＬｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７６、２１９−２２４）。Ａ２ ０５８黒色腫細胞の形質転換性成長因子−ベータ１　（ＴＧＦ−βｌ）との４８ 時間の処理はＴＩＭＰ−２ｍＲＮＡレベルにおける明らかに検出可能な低下を生 じた（図１１）。＆５および０．９　ｋ　ｂ転写物は安定状態レベルでの同様の 低下を示し、そして異なる発現の指示はなかった。ＴＧＦ−β１はヒト歯肉繊維 芽細胞におけるＴ　ＩＭＰ−１ｍＲＮＡレベルの増加を示した（Ｏｖｅｒａｌｌ 等、　１９８９．　Ｊ、　ＢｉｏＬ、　Ｃｈｅｒｒｔ、　２６４．１８６０−１ ８６９　）。

ＴＧＦ−β１が７２ｋＤａ■型コラ−ゲナーゼｍＲＮＡおよびタンパク質レベル 、ならびに酵素活性を誘導することは以前示された。その他の成長因子の存在下 、ＴＧＦ−β１はまた、間質コラ−ゲナーゼおよびＴＩＭＰ−１発現に選択的な 逆の作用を有する（　Ｅｄｗａｒｄｓ等、　１９８７゜ＥＭＢＯＪ、　６．１８ ９９−１９０４　）。ＴＧＦ−β１は同質フラーゲナーゼの誘導を選択的に抑制 するが、ＴＩＭＰ−１を超誘導するように相乗的に相互作用する。これらのデー タは、ＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−２がＴＰＡ処理に異なって応答し、そしてＴＧ Ｆ−βｌ処理に逆に応答することを示す。さらに、ＴＧＦ−β１はヒト黒色腫細 胞において、ＴＩＭＰ−２および７ＺｋＤａｌＶ型コラ−ゲナーゼ転写レベルへ の逆の作用を有する。従って、ＴＩＭＰ＝２の転写調節がＴＩＭＰ−１と無関係 であることが明らかである。

最後に、３種の原発性のヒト肛門腫瘍および隣接した正常粘膜からの組織のノー ザンプロット分析はｐｓｓ　３８ＴＩＭＰ−２プローブを用いて行われ、そして 図１２に示されている。組合せた試料は、結腸腫瘍試料と隣接した通常の粘膜と の間のＴ　ＩＭＰ−２ｍＲＮＡ転写レベルに検出可能な変化が見られなかった。

従来の研究は、実際のヒト結腸腫瘍組織が高められた■型コラーゲナーゼｍＲＮ Ａ転写物を含有することを示した。これらのデータは、原発性腫瘍細胞数におけ るＴＩＭＰ−２と７２ｋＤａＩＶ型コラ−ゲナーゼの比率が異なる転写による酵 素種のために変更されることを示唆する。しかしながら、原発性腫傷細胞異形お よび侵入性腫瘍試料中の正常細胞の可能な混入のために、侵入性転移細胞数を正 確に反映しないかもしれない。転移領域の試験は腫瘍細胞侵入においてこれらの タンパク質の役割のよりよい理解を可能にする。

Ｃ３Ｃ−２１ＫｃＤＮＡクローンｄ）利用メタロプロテイナーゼ阻害剤タンパク 質ＴＩＭＰ−２をコード化する単離されたヒトＣＤＮＡクローンは治療において 広い用途を有する。腫瘍、炎症性疾病、心臓血管病、中枢神経系失調症、糖尿病 ならびに成長および発育の異常症を包含する疾病状態は、本発明の対象であるメ タロプロテイナーゼ阻害剤タンパク質の異常レベルに随伴するか、またはそれが 原因となっている。これらの疾病の経過の全てが細胞外マトリックスタンパク質 の異常な蓄積または欠如を包含し得る。特に、これらの疾病状態の多くは異常な 基底膜を提示する。基底膜破壊の調節はメタロプロテイナーゼ作用の阻害により 制御され得るから、本発明の対象である阻害剤タンパク質は基底族の安定状態レ ベルを決定する重要な役割を演じ得る。阻害剤タンパク質Ｃ３Ｃ−２１Ｋをコー ド化する本発明のＣＤＮＡクローンは、実施例５（上記）に記載されたように、 組織試料または培養細胞から単離されたＲＮＡ試料中の阻害剤のｍＲＮＡレベル を測定するためのノーガンブロッティング分析に使用され得る。いくつかの場合 において、この方式で検出された高められたＣ３Ｃ−２１ＫｍＲＮＡレベルは高 められた基底膜蓄積を導く疾病状態、例えば真性糖尿病を反映し得る。その他の の場合において、例えば腫瘍および神経を取り囲む基底族を含む中枢神経系失調 症において、阻害剤タンパク質の欠如が重要であり得る。単離されたＣＤＮＡク ローン（全体または一部）と単離されたＲＮＡまたはＤＮＡのハイブリダイゼー シーンの他に、組織または細胞試料を用いるその場での（ｉｎ　５ｉｔｕ　）ハ イブリダイゼーシヨンがこの分野で十分に公知の方法を用いて容易に操作され得 る。

この目的およびその他の目的のために、クローンは検出のために放射性マーカー で適当な酵素および放射性前駆体を用いて標識され得る。

阻害剤タンパク質Ｃ５Ｃ−２１には腫瘍侵入の抑制剤であり、そしてそのような ものとして腫瘍抑制遺伝子である。それ故に、ホモ接合の損失、対立遺伝子の損 失または遺伝子調節領域の突然変異不活性化は阻害剤の発現を抑制し、ガンの進 展を助長する。これらの遺伝子欠陥の全てが、この分野で十分に公知の方法およ び適当な制限酵素を用い、所望により予め試料ＤＮＡ配列のポリメラーゼ錫反応 増幅を行い、標準サザンブロッティング分析において、単離されたＣＤＮＡクロ ーンにより検出され得る。ＤＮへの抽出およびそのような遺伝子欠陥の測定はガ ンの診断およびガンを進展しやすくする遺伝欠陥を有する個人の検出において有 用であろう。

単離されたＣＤＮＡクローンは遺伝子治療に有用であろう。本発明の阻害剤タン パク質の発現の損失または負の制御に関連した疾病は、Ｃ５Ｃ−２１にタンパク 質の増大した合成を可能にする、適当な発現ベクター中のＣＤＮＡクローンで処 置され得るであろう。適当なプロモーターを有する発現ベクターにおけるＣ３Ｃ −２１にのためのＣＤＮＡクローンをＣ３Ｃ−２１に産生を欠く細胞中にトラン スフェクションすると、Ｃ３Ｃ−２１にの高められた産生および異常表現型の訂 正を生じる。また、同様の発現ベクターを用いるが、しかし逆配向のＣ３Ｃ−２ １ＫｃＤＮＡ挿入物を含むアンチセンス構集物はメタロプロテイナーゼ阻害剤タ ンパク質の通産生を抑制するために使用され得る。これは異常調節の障害やＣ３ Ｃ−２１に阻害剤タンパク質の不適当に高い産生において有用であり得る。その ような遺伝子試薬の系および調製方法はこの分野で公知であるが、しかし本発明 の特定の単離されたヌクレオチド配列を必要とする。本発明のＣＤＮＡクローン があらゆるその他のタンパク質をコード化する遺伝子の隣にスプライシングされ 、そしてハイブリッドタンパク質を生しる。この方法論は高められた阻害活性ま たは腫瘍探索作用を有するハイブリッドタンパク質を産生ずるために使用され得 る。

ＴＩＭＰ−２タンパク質のアミノ酸配列をコード化する本発明のＣＤＮＡクロー ンまたはあらゆるその他のＤＮＡ断片（普遍的遺伝コードに準拠）は阻害剤タン パク質Ｃ３Ｃ−２１Ｋ　（ＴＩＭＰ−２）の組換え産主に必要であり、そして非 常に有用である。組換えＣ５Ｃ−２１にはあらゆる適当な発現系において原核細 胞または真核細胞のいずれかにおいて作成され得る。本発明の製造における顕著 な利点は、タンパク質がグリコリル化されておらず、そして機能的活性のために 翻訳後の修飾を必要としないことである。従って、バクテリア発現系において作 成された組換えタンパク質は培養培地から得られた際にそのまま機能的に活性で あり得る。組換え阻害剤タンパク質は適当な担体タンパク質、マーカータンパク 質またはその活性を安定化するかまたは高めるその他の化合物に連結されてもよ い。全体または部分的な組換えタンパク質はメタロプロテイナーゼ活性を阻害す るための抗原または処置剤として使用され得る。

本発明のＣＤＮＡクローンは新規なメタロプロテイナーゼ阻害剤Ｃ３Ｃ−２１Ｋ をコード化する。遺伝子それ自体は新規であり、そして新規なメタロプロテイナ ーゼ阻害剤Ｃ３Ｃ−２１Ｋをコード化することが明確である。

遺伝子それ自体は新規であり、そしてプロテイナーゼ阻害剤をコード化するＣＤ ＮＡクローンを帽告する全ての従来技術とは異なる。実際、従来技術として存在 するプロテイナーゼ阻害剤のためのｃＤＮＡクローンのいずれかの、または全て のハイブリダイゼーションは、緊縮条件または減じられた緊縮性の条件のいずれ かの下で、本発明の遺伝子の検出が全体的か、または部分的にできない。そのた めに、本発明の遺伝子はけっしてこれまで検出されなかった。本発明の遺伝子の 単離を導く本発明のタンパク質のアフィニティー精製、および本発明の新規アミ ノ酸配列の同定は全体的に独創的なアプローチであり、従来の文献には記載され ていなかった。

あるタンパク質の機能的特性がそのタンパク質を構成するアミノ酸残基の１００ ％の同一性に依存するものではないことはタンパク質化学の分野ではよ（知られ ている。同一の電荷または疎水性を有し、そして同一の機能を達成する個々のア ミノ酸残基が置換され得る。さらに、タンパク質の構造を決定するように特異的 に作用するタンパク質分子内のその他のアミノ酸は、親タンパク質分子の全体の 生物学的活性が消失しなければ、電荷または疎水性の異なる残基で置換されても よい、さらに一般的には、構造的および機能的に関連する２つのポリペプチドの アミノ酸配列の進化的類似度がピアソンおよびリップマンにより記載された配列 並列および比較アルゴリズムにより規定された定量分析方法により決定される（ Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｗ、Ｒ，＆　Ｌｉｐｍａｎ、　Ｄ、　Ｊ、、　１９８８．　 Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪ、Ｓ、Ａ、　８５　、２ ４４４−４８　）　、　：（１）定量比較により、アミノ酸配列の正確な相同性 だけでなく、保存機能を共有する進化的に関連するタンパク質のファミリー内に 頻繁に起こることが知られている１残基の別の残基への置換を推察される。従っ て、この場合、本発明はまた、マトリックスメタロブロティナーゼを阻害し、そ して図７に示された配列と少なくとも１つの部位が興なるアミノ酸配列を育し、 そして［７のアミノ酸配列またはそのユニーク部分に対して、あらゆるその他の ポリペプチドのアミノ酸配列に対するより、より高い類似性を依然として有する 単離されたポリペプチドに関する。

本発明のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤が不適当な血管形成、関節炎 、腫瘍増殖、侵入および転移、および肉芽腫性炎症状態例えばサルコイド−シス およびその他の疾病状態の処置に使用される場合、産生された酵素の量および９ ０％以上の活性酵素を阻害することが要求されるペプチド阻害剤の量を評価する ことが可能である。あらゆる疾病状態の処置に使用するために、阻害剤ペプチド の治療的投与量はｘ−２５ｏｍｇ／ｋｇ／ｄの許容できる薬学的範囲であり、よ り好ましくは２５−１ａ　Ｏｍｇ／ｋｇ／ｄのａｍである。投薬される患者の投 与量は該患者において産生される酵素の量、該患者の状態および体格に依存する であろう。阻害剤は注射として、または血流中に速やかに移行するあらゆる手段 により投与され得る。凍結乾燥粉末は「飲み込まれ」てもよい。経頬または舌下 投与のための調剤も与えられ得る。

呼吸器に欠陥を有する患者のために、ペプチドは吸入により投与され得る。エア ロゾルがこの目的のために特に有用である。目の異常に対して、ペプチドは点眼 薬として投与されてもよい。

単離されたＣ３Ｃ−２１タンパク質、天然もしくは組換え、またはそれから誘導 された活性ペプチドは静脈注射で、経口で、経子宮で、吸入または局部適用によ り投与され得る。例えば、局部適用は基底細胞ガンもしくは皮膚の黒色腫、また は角膜潰瘍の処置のための適当な担体を用いて製造され得る。

完全Ｃ３Ｃ−２１タンパク質またはＣ３Ｃ−２１ペプチドは天然のものからの精 製、合成ペプチド化学方法または組換えＤＮＡ法により製造され得る。後者の場 合において、適当な発現ベクター内のＣ５Ｃ−２１のための適当なｃＤＮ八クコ クローン５Ｃ−２１活性を有するペプチドを製造するために使用され得る。

Ｃ５Ｃ−２１ペプチドおよびＣ３Ｃ−２１に対する抗体はまた、マトリックスメ タロプロティナーゼと結合阻害剤の異常な均衡によ６特像づけられる疾病のＢｌ ｒに有用である。精製Ｃ５Ｃ−２１は、メタロプロテイナーゼを結合する性質に より、あらゆる天然の供給源からメタロプロテイナーゼを′ｆｌｔＷおよび／ま たは検出する手段として使用され得る。Ｃ５Ｃ−２１のための適当なイムノアッ セイは抗Ｃ５Ｃ−２１抗体、参照Ｃ３Ｃ−２１抗原および固相または液相反応体 を包含し得る。精製Ｃ３Ｃ＝２１またはＣ５Ｃ−２１のペプチドドメインは適当 な酵素、蛍光または放射性ラベルで当分野でよく知られた方法により印を付して もよい。

システィンを欠くか、またはシスティンを１個だけ有するペプチドはメタロブロ ティナーゼを検出するためのアッセイにおいて、およびメタロブロティナーゼを 精製する手段として有用であることが見出され、そしてこれは本発明の一部でも ある。３種のそのような構造は以下のアミノ酸配列： ＤＩＹＧＮＰＩＫＲＩＱＹＥＩＫＱＩＫＫＦＫＧＩＥＫＤＩＥＦＩＹＴＡＰＳＳ ＡＶＣＣ；ＶＥＬＤＶＧＧＫ。

ＤＶＧＧＫＫＥＹＬ　ＩＡＧＫＡＥＤＧＫＲＨＩＴＬおよび ＲＨＪＴＬＣＤＦ　ＩＶＰＷＤＴＬＳＴＴＱＫＫＳＬＮを存するペプチドだった 。

本発明のペプチドは動物もしくはヒト組織またはメタロプロテイナーゼに対する 抗体を有するかもしれない体液中のメタロプロテイナーゼを検定する試験に使用 されでもよい。ペプチドはまた、メタロプロテイナーゼの検出に使用するための 抗体を誘導するために使用され得る。

本明細書にお′いてアミノ酸は以下のように認められる通常の１文字表示で示さ れる： Ａ＝アラニン　Ｃ＝システィン Ｄ＝アスパラギン酸　Ｅ＝グルタミン酸Ｆ＝フェニルアラニン　Ｈ＝ヒスチジン ■冨イソロイシン　Ｋ＝リジン Ｌ＝ロイシン　Ｍ＝メチオニン Ｎ＝アスパラギン　Ｐ＝プロリン Ｑ＝グルタミン　Ｒ＝アルギニン Ｓ＝セリン　Ｔ＝トレオニン ■＝バリン　Ｗ＝トリプトファン Ｘ＝千コロジン　Ｙ＝ピログルタミン酸本　本　本 背景の記載および発明の開示を完全にするために、本明細書にこれまで示された 刊行物、特許および特許出願は本明細書内への参照により本明細書に編入される 。

［ＮａＣｌ３（ｍｏｌｅｓ／Ｌ） Ｆｉｇｕｒｅ　２゜ ＠＠−４−６８Ｋ ｓＷＩ禰−２９に □− ＄＋１ａ、ａに ＢＣ ％遇ｔシｉｆｚ ％　Ａｔミｔｆｚ ０　３　８　８　呂　８ ａｔ　＋：Ｉ！ｉ　＊’＃基偽に １１３　唾出びＩＮＧＨＱ＾にＦＦＡＣＩＫＢ！　１６１　Ｎ−１鵠γす４Ｆ ２．５，６，７，９，１３　Ａｓｐ−Ｎ　Ｌｍイｃ　／Ｘ”７°？ド′３．１１ ，１５　Ａｒｇ−Ｃｒ、＊（ｃ　ｑ７°チド４．８，１０，１２，１４，１６　 Ｌｙｓ−Ｃミ電（（へ’７’（−４ごＦＩＧ、４ ＣＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣ ＣＴＴＧＣＣＣＧＴＣＴＣＧＣ５０ｃ’ＤＡ／Ａ　７０　′’＋　ｒ　５５１５ 　（Ａ、）ｉルー　ｒ　５５　ｊｇ（８，Ｉ　Ｍ　品２７シＦＩＧ、６Ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　７゜ Ｆｉｇｕｒｅ　８゜ Ｃ５（：ＳＰＶ？ＩＰＱＱ　ＪｌｌｊｒＩＪ！ＭＩＷＴＲＮＧｖＳＥ’ＫＸ’Ｖ Ｄ　５ＧＮＤ！ＹＧＮＰＩＦＪｔ！Ｑ！！：！ＫＱ工　Ｃ３b２ＨＣ Ｃ３ＣＳＰＶＲＰＱＱ　ＡＦＣＮＪＩＪ）ＷＩＲＡＸＡＶＳＫＫｔＶＤ　ＳＧＭ ２Ｘ’ｔＧＭＰＸ　ＫＲＸＱ’ｔＥＸＫＱｔ　↑Ｉ膚２ＷＴＭＮＸＮＧＨＱＡＫ ＦＦ入Ｃ工ＫＲ５ＤＧＳＣＡＷＹＲＧ　ＡＡＰＰＫＱ）：ｒＬＤ　！！Ｄ　Ｃ５ Ｃ２１１ＷＶＴＥＦＯｉＩＮＧ１１　ＱＡＸＩＦＴＡＣ！ＫＲ５ＤＧＳ０すαヌ Ｇ　ＡＡＰＰＸＱＥｒＬＤ　Ｉ）：ＤＰ　ＴＸＭｉ’　２Ｆｉｇｕｒｅ　９゜ Ｆｉｇｕｒｅ　１０・ Ｆ’ｉｇｕｒｅ　１１゜ ＢＣ 請求の範囲の補正 （１）　出願用紙第３０頁ないし第３３頁（請求の範囲）を添付の請求の範囲と 差し替える〔特許法第１８４条の５第１項の規定による書面に添付した請求の範 囲の翻訳文を別紙のとおり補正する。〕。

請求の範囲 １、　マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害し、モして■型コラーゲナーゼ と■型プロコラーゲナーゼの両方に１：１の化学量論比で結合する約２１キロダ ルトンの単離されたポリペプチド。

２　図７に示されたアミノ酸配列またはそのユニーク部分を有する請求項１記載 のポリペプチド。

＆　マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害する単離されたポリペプチドであ って、該ポリペプチドは図７に示された配列と少なくとも１つの部位が異なるユ ニークアミノ酸配列を有し、そして該ユニークアミノ酸配列は図７のアミノ酸配 列またはその部分に対して、あらゆるその他のポリペプチドのアミノ酸配列に対 するより、より高い類似性を有する、上記単離されたポリペプチド。

４、　ゼラチン分解活性またはコラーゲン分解活性を育するメタロプロテイナー ゼのタンパク質阻害剤を精製する方法でありで、 （１）上記メタロプロテイナーゼの基質を固相に付着させ、（２）上記阻害剤お よび上記メタロプロテイナーゼを含むタンパク質混合物を上記固定化基質に、上 記阻害剤および上記メタロプロテイナーゼの複合体が上記基質に結合するような 条件下で暴露し、そして （３）　請求項１記載のポリペプチドを単離するための適当な手段で上記複合体 を溶離する、 段階からなる上記方法。

５、　ゼラチン分解活性またはコラーゲン分解活性を有するメタロプロテイナー ゼのタンパク質阻害剤を精製する方法であって、 （１）上記メタロプロテイナーゼを固相に付着させ、（２）上記阻害剤を含むタ ンパク質混合物を上記固定化メタロプロテイナーゼに、上記阻害剤が上記メタロ プロテイナーゼと複合体を形成するような条件下で暴露し、そして （３）請求項１記載のポリペプチドを単離するための適当な手段で上記阻害剤を 溶離する、 段階からなる上記方法。

６、　マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するのに十分な量の請求項１ま たは３記載の上記ペプチドを薬学的に許容性の担体中に含有する物質組成物。

７、　吸入のために製剤化される請求項６記載の組成物。

＆　凍結乾燥粉末である請求項６記載の組成物。

９、　経頬または舌下投与に適合した封入複合体である請求項６記載の組成物。

１０、図７に示されたアミノ酸配列を育する単離されたペプチドまたはそのユニ ーク部分。

１１、以下の群： Ｃ３ＣＳＰＶＨＰＱＱＡＦＣＮＡ。

ＳＬＮＨＲＹＱＭＧＣＥＣＫＩＴＲＣＰ。

ＭＩＰＣＹ　ＩＳＳＰＤＥＣＬＷＭＤ。

ＤＩＹＧＮＰＩＫＲＩＱＹＥＩＫＱＩＫＭＦＫＧＰＥＫＤ　Ｉ　ＥＦ　ＩＹＴＡ ＰＳＳＡＶＣＧＶＳＬＤＶＧＧＫ。

ＤＶＧＧＫＫＥＹＬ　Ｉ　ＡＧＫＡＥＧＤＫＭＨＩＴＬおよび ＭＨＩＴＬＣＤＦＩＶＰＷＤＴＬＳＴＴＱＫＫＳＬＮから選択されるアミノ酸配 列を有する請求項１０記載のペプチド。

ＩＺ　請求項ｌＯ記載のペプチドを免疫応答を誘導するのに十分な量で、薬学的 に許容性の担体と共に含む物質組成物。

１＆　上記ペプチドが免疫原性担体タンパク質に共有結合で結合されている請求 項１２記載の組成物。

１４、請求項１０記載のペプチドの投与に応答して誘導された抗体。

１５、固体支持体に付着した請求項１４記載の少な（とも１種の抗体である物質 組成物。

１６、請求項１４記載の抗体および適当な直接または間接検出手段からなるヒト 組織または体液中の請求項１記載のポリペプチドを検定するためのキット。

１７、　請求項１記載のポリペプチドまたは請求項３記載のペプチドを、マトリ ックスメタロプロテイナーゼと上記ポリペプチドまたは上記ペプチドとの間の結 合親和性によりマトリックスメタロプロテイナーゼを捕獲または検出する手段と して含有する、動物もしくはヒト組織または体液中のマトリックスメタロプロテ イナーゼを検定するためのキット。

１＆　ゼラチン分解活性またはコラーゲン分解活性を有するメタロプロテイナー ゼのプロ酵素のタンパク質阻害剤を精製する方法であって、 （１）上記メタロプロテイナーゼのプロ酵素の基質を固相に付着させ、 （２）上記阻害剤および上記メタロプロテイナーゼのプロ酵素体を含むタンパク 質混合物を上記固定化基質に、上記阻害剤および上記プロ酵素の複合体が上記基 質に結合するような条件下で暴露し、そして （３）適当な手段で上記複合体を溶離する、段階からなる上記方法。

１９、固体支持体に付着した請求項１記載のポリペプチドまたは請求項３記載の ペプチドを含有する物質組成物。

２０、請求項１記載のポリペプチドまたは請求項３記載のペプチドをコード化す るＤＮＡ断片。

２１、図７−に示されるヌクレオチド配列またはそのユニーク部分を有する請求 項２０記載のＤＮＡ断片。

２ｚ　請求項２０記載のＤＮＡ断片およびベクターからなる組換えＤＮＡ分子。

２＆　請求項２２記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された細胞の培養体。

２４、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害量の請求項６記載の組成物を投与 することからなる哺乳動物においてマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害す る方法。

２５、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害量の請求項６記載の組成物を投与 することからなるマトリックスメタロプロテイナーゼの活性から生じる変質過程 のために哺乳動物を処理する方法。

２６、マトリックスメタロブロティカーゼ阻害性組成物が舌下にまたは経頬で投 与される請求項２５記載の方法。

２７、変質過程が呼吸器系に生じ、そしてマトリックスメタロブロティカーゼ阻 害性組成物が吸入により投与される請求項２５記載の方法。

２＆　マトリックスメタロブロティカーゼ阻害性組成物が静脈注射として投与さ れる請求項２６記載の方法。

２９、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害量の請求項１記載のポリペプチド または請求項３記載のペプチドを投与することからなり、該ポリペプチドまたは ペプチドは請求項２２記載の組換えＤＮＡ分子を投与することにより投与され、 それによりＤＮＡ分子が発現されて上記ペプチドを産生ずる、哺乳動物において マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害する方法。

３０、組換えＤＮＡ分子が哺乳動物の細胞内にトランスフェクションされ、次に トランスフェクションされた細胞を患者に投与する、請求項２９記載の方法。

３１、以下の段階： １）細胞または組織からＲＮＡまたはＤＮＡを遊離させ、２）段階１の調製物中 のＲＮＡまたはＤＮＡを請求項２１記載のＤＮＡ断片に、該ＤＮＡ断片が上記細 胞または組織からのＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリッド二本鎖を形成するような 条件下で暴露し、そして３）段階２から生じたハイブリッド二本鎖の量を測定す る、 からなるマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤活性を測定する方法。

３Ｚ　ＤＮＡ断片が標識され、それにより該ＤＮＡの検出が促進される請求項３ １記載の方法。

３３、ＲＮＡまたはＤＮＡの暴露が組織の調製物上で直接行われる請求項３１記 載の方法。

３４、マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害の処置のための哺乳動物に投与 されるべき薬剤を調製するために請求項６記載の組成物を使用する方法。

３５、マトリックスメタロプロテイナーゼの活性から生じる変質過程の処置のた めの哺乳動物に投与されるべき薬剤を調製するために請求項６記載の組成物を使 用する方法。

３６、マトリックスメタロブロティカーゼ阻害性組成物が舌下にまたは経頬で投 与される請求項２５記載の使用方法。

３７、変質過程が呼吸器系に生じ、そしてマトリックスメタロブロティカーゼ阻 害性組成物が吸入により投与される請求項２５記載の使用方法。

３＆　マトリックスメタロブロティカーゼ阻害性組成物が静脈注射として投与さ れる請求項２６記載の使用方法。

３９、請求項１記載のポリペプチドまたは請求項３記載のペプチドが請求項２２ 記載の組換えＤＮＡ分子を投与することにより投与され、それにより該ＤＮＡ分 子が発現されて上記ペプチドを産生ずる、マトリックスメタロプロテイナーゼの 阻害の処置のための哺乳動物に投与されるべき薬剤を調製するために請求項１記 載のポリペプチドまたは請求項３記載のペプチドを使用する方法。

４０、組換えＤＮＡ分子が哺乳動物の細胞内にトランスフェクションされ、次に トランスフェクションされた細胞を患者に投与する、請求項２９記載の使用方法 。

４１、上記ペプチドが組織阻害剤メタロプロテイナーゼ１よりも７２ｋＤａｌＶ 型コラ−ゲナーゼと優先的に相互作用する請求項１記載の単離されたペプチド。

４２、上記ペプチドが形質転換性成長因子−ベータ１（ＴＧＦ−β１）の存在下 で減少する請求項１記載の単離されたペプチド。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．マトリックスメタロプロティナーゼを阻害し、そしてＩＶ型コラーゲナーゼ とＩＶ型プロコラーゲナーゼの両方に１：１の化学量論比で結合する約２１キロ ダルトンの単離されたポリペプチド。 ２．図７に示されたアミノ酸配列またはそのユニーク部分を有する請求項１記載 のポリペプチド。 ３．マトリックスメタロプロティナーゼを阻害する単離されたポリペプチドであ って、該ポリペプチドは図７に示された配列と少なくとも１つの部位が異なるユ ニークアミノ酸配列を有し、そして該ユニークアミノ酸配列は図７のアミノ酸配 列またはその部分に対して、あらゆるその他のポリペプチドのアミノ酸配列に対 するより、より高い類似性を有する、上記単離されたポリペプチド。 ４．ゼラチン分解活性またはコラーゲン分解活性を有するメタロプロティナーゼ のタンパク質阻害剤を精製する方法であって、 （１）上記メタロプロティナーゼの基質を固相に付着させ、（２）上記阻害剤お よび上記メタロプロティナーゼまたはそのプロ酵素体を含むタンパク質混合物を 上記固定化基質に、上記阻害剤および上記メタロプロティナーゼまたはそのプロ 酵素の複合体が上記基質に結合するような条件下で暴露し、そして （３）適当な手段で上記複合体を溶離する、段階からなる上記方法。 ５．ゼラチン分解活性またはコラーゲン分解活性を有するメタロプロティナーゼ のタンパク質阻害剤を精製する方法であって、 （１）上記メタロプロティナーゼを固相に付着させ、（２）上記阻害剤を含むタ ンパク貧混合物を上記固定化メタロプロティナーゼに、上記阻害剤が上記メタロ プロティナーゼと複合体を形成するような条件下で暴露し、そして （３）適当な手段で上記阻害剤を溶離する、段階からなる上記方法。 ６．マトリックスメタロプロティナーゼを阻害するのに十分な量の請求項１また は３記載の上記ペプチドを薬学的に許容性の担体中に含有する物質組成物。 ７．吸入のために製剤化される請求項６記載の組成物。 ８．凍結乾燥粉末である請求項６記載の組成物。 ９．経頬または舌下投与に適合した封入複合体である請求項６記載の組成物。 １０．図７に示されたアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのユニーク部分。 １１．以下の群： 【配列があります】【配列があります】および【配列があります】 から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１０記載のペプチド。 １２．請求項１０記載のペプチドを免疫応答を誘導するのに十分な量で、薬学的 に許容性の担体と共に含む物質組成物。 １３．上記ペプチドが免疫原性担体タンパク質に共有結合で結合されている請求 項１０記載の組成物。 １４．請求項１０記載のペプチドの投与に応答して誘導された抗体。 １５．固体支持体に付着した請求項１４記載の少をくとも１種の抗体である物質 組成物。 １６．請求項１４記載の抗体および適当な直接または間接検出手段からなるヒト 組織または体液中の請求項１記載のポリペプチドを検定するためのキット。 １７．請求項１記載のポリペプチドまたは請求項３記載のペプチドを、マトリッ クスメタロプロティナーゼと上記ポリペプチドまたは上記ペプチドとの間の結合 親和性によりマトリックスメタロプロティナーゼを捕獲または検出する手段とし て含有する、動物もしくはヒト組織または体液中のマトリックスメタロプロティ ナーゼを検定するためのキット。 １８．請求項１記載のポリペプチドまたは請求項３記載のペプチドを含有する物 質組成物。 １９．固体支持体に付着した請求項１記載のポリペプチドまたは請求項３記載の ペプチドを含有する物質組成物。 ２０．請求項１記載のポリペプチドまたは請求項３記載のペプチドをコード化す るＤＮＡ断片。 ２１．図７に示されるヌクレオチド配列またはそのユニーク部分を有する請求項 ２０記載のＤＮＡ断片。 ２２．請求項２０記載のＤＮＡ断片およびベクターからなる組換えＤＮＡ分子。 ２３．請求項２２記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された細胞の培養体。 ２４．マトリックスメタロプロティナーゼ阻害量の請求項６記載の組成物を投与 することからなる哺乳動物においてマトリックスメタロプロティナーゼを阻害す る方法。 ２５．マトリックスメタロプロティナーゼ阻害量の請求項６記載の組成物を投与 することからなるマトリックスメタロプロティナーゼの活性から生じる変質過程 のために哺乳動物を処理する方法。 ２６．マトリックスメタロプロティナーゼ阻害性組成物が舌下にまたは経類で投 与される請求項２５記載の方法。 ２７．変質過程が呼吸器系に生じ、そしてマトリックスメタロプロティナーゼ阻 害性組成物が吸入により投与される請求項２５記載の方法。 ２８．マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害性組成物が静脈注射として投与さ れる請求項２６記載の方法。 ２９．マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害量の請求項１記載のポリペプチド または請求項３記載のペプチドを投与することからなり、該ポリペプチドまたは ペプチドは請求項２２記載の組換えＤＮＡ分子を投与することにより投与され、 それによりＤＮＡ分子が発現されて上記ペプチドを産生する、哺乳動物において マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害する方法。 ３０．組換えＤＮＡ分子が哺乳動物の細胞内にトランス，フェクションされ、次 にトランスフェクションされた細胞を患音に投与する、請求項２９記載の方法。 ３１．以下の段階： １）細胞または組織からＲＮＡまたはＤＮＡを遊離させ、２）段階１の調製物中 のＲＮＡまたはＤＮＡを請求項２１記載のＤＮＡ断片に、該ＤＮＡ断片が上記細 胞または組織からのＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリッド二本鎖を形成するような 条件下で暴露し、そして３）段階２から生じたハイブリッド二本鎖の量を測定す る、 からなるマトリックスメタロプロティナーゼ随害剤活性を測定する方法。 ３２．ＤＮＡ断片が標識され、それにより該ＤＮＡの検出が促進される請求項３ １記載の方法。 ３３．ＲＮＡまたはＤＮＡの暴露が組織の調製物上で直接行われる請求項３１記 載の方法。