JPS61282095A - 蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、蛋白質、とくにメタロプロテアーゼインヒビ
ターの、組換えＤＮＡ操作による製造方法に関する。本
発明はまた、特異的蛋白質、遺伝子、ベクター、宿主生
物および医薬組成物に関する。

細胞外有機間質の酵素的吸収による結合組織の加速的、
無制御の崩壊は、多くの病理学的状態の特徴である〔ウ
ーレー（Ｄ、Ｅ、　Ｗｏｏｌｌｅｙ）、１９８４、マン
マリアン・コラーゲネーシズ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃ
ｏ１１ａａｅｎａｓｅｓ）　、１１９〜１５７頁、　　
　　□エキストラセルラー・マトリックス・バイオケミ
ストリー（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、ビーズはか（Ｋ、　Ａ
、　Ｐｉｅｚ　＆　Ａ。

Ｈ，Ｒｅｄｄｉ）編、エルセピア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）
　、ニュー・ヨーク〕。

酵素的吸収は正常状態でも病的状態でも起こり、一部は
数種のメタロプロテアーゼの活性によるものである。そ
のうち最も重要なものはコラ−ゲナーゼであると考えら
れている（セラーズはか（Ｓｅｌｌｅｒｓ　＆　Ｈｕｒ
ｐｈｙ）　、１９８１　、インターナショナル・レビュ
ー・オブ・コネクテイブ・ティシュ−・リサーチ（Ｉｎ
ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｃ０ｎｎｅＣｔｉＶｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ
Ｒｅｓ、）　、９．１５１〜１９０〕。正常時にはこれ
らの分解酵素の活性は、分娩後の子宮におけるコラーゲ
ン崩壊の制御の例のように〔ウオースナー（Ｗｏｅｓｓ
ｎｅｒ）　、１９７１　、バイオケミカル・ジャーナル
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）　、１８０．９５〜１０
２　；ウオースナ−（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ）　、１９８０
　、コラーゲン分解・イン・ノーマル・アンド・パソロ
ジカル・コネクテイブ・テイシューズ（Ｃｏｌｌａｇｅ
ｎａｓｅ　１ｎＮＯｒｌｌｌａｌ　　ａｎｄ　　Ｐａｔ
ｈｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　　Ｔｉ
５ｓｕｅｓ）　　、ウーレーはか（Ｄ、　Ｅ、’　Ｗｏ
ｏｌｅｙ　＆　Ｊ、　Ｈ，Ｅｖａｎｓｏｎ）編、２２３
〜２３９頁、ウイレー（Ｗｉｌｅｙ　）　、ニュー・ヨ
ーク〕、また前頁構成におけるコラーゲンの分解と合成
の密接な連関のように〔レイズ（Ｒａｉｓｚ　）ほか、
１９７８、メカニズム・オブ・ロー力うイズド・ボーン
ぐロス（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｒＬｏｃａｌｉｚｅｄ
　Ｂｏｎｅ　Ｌｏｓｓ　）　、ホートンほか（Ｊ、　Ｅ
。

Ｈｏｒｔｏｎ、　Ｔ、　Ｈ，Ｔａｐｌｅｙ　＆　　Ｗ、
　Ｆ、Ｄａｖｉｓ　）編、３９〜４５頁、インホーメー
ション・リトリーバル・インコーポレーション（Ｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎＲｅｔｒｉｅｖａｉ　Ｉｎｃ、）　、
’）シ）トンーロンドン〕厳密に調節されている。しか
しながら、たとえば慢性関節リウマチや骨関節炎では、
無制御なコラーゲン分解により、結合組織の不可逆的な
機械的不全を生じる〔ケンブソン（にｅｍｐｓｏｎ　）
ほか、１９７６、ビオシミーク・工・ビオフイジーク・
アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔ
ａ）　、４２８．７４１〜７６０）。

コラ−ゲナーゼ活性のこの厳密な制御は強力なインヒビ
ターによってもたらされることが示唆されてきた（レイ
ノルド（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）ほか、１９７７、ザ・ラン
セット（Ｌａｎｃｅｔ）　、２．３３３〜３３５〕。コ
ラ−ゲナーゼのインヒビターは結合組織の培養液中に検
出されている（マーフィー（＋ｕｒｐｈｙ）ほか、１９
７７、ごオシミーク・工・ビオフイジーク・アクタ（Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　）　、４８３．４９３〜
４９８；ジンカイ（Ｓｈｉｎｋａｉ　）ほか、ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー・トーキヨー（Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｉ、　。

Ｔｏｋｙｏ　）　、比ユ、２６１〜２６３；ベイター（
Ｖａｔｅｒ　）ほか、１９７９、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカ／ｌｚ−ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、　　）、２５４．３０４６〜３０５３；ノーラン
（Ｎｏｌａｎ　）ほか、１９８０、アセロスフレローシ
ス（Ａｔｈｅｒｏ−ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　）　、　３５
．９３〜１０２；ヤスイ（Ｙａｓｕｉ　）ほか、１９８
１．コラーゲン・リサーチ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｒｅｓ
、　）　、　１．５９〜７２；ディージはかＣＤｅａｎ
　＆　Ｗｏｅｓｓｎｅｒ　）　、１９８４、バイオ）７
ミｈ）レージｒｙ−すＪＬ／　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ
、　　）　、２１８．２７７〜２８０〕。さらに、細胞
中〔ノーラン（Ｎｏｌａｎ　）ほか、１９７８、バイオ
ケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　Ｒｅｓ、Ｃｏ＋＋＋ｎ＋ｕｎ、　）、８３．１１８３
〜１１９０：ウェルガス（１４ｅ１ｇｕｓ）ほか、１９
７９、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・’ｙミス’
ｒ”Ｊ　−（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　、２５
４．１９３８〜１９４３　：カーラオー（にｅｒｗａｒ
）ほか、１９８０、ビオシミーク・工・ビオフイジーク
・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔ
ａ）、６３２゜１８３〜１９１；ベテイグリュー（Ｐｅ
ｔｔｔｏｒｅｗ　）ほか、１９８０．アーカイブズ・オ
ブ・オーラル・バイオロジー（Ａｒｃｈ、　０ｒａｌ　
Ｂｉｏｌ、）　、２５　。

２６９〜２７４　；サボルスキー（５ａｐｏ　ｌ　ｓｋ
ｙ　）ほか、１９８１、ビオシミーク・工・ビオフイジ
ーク・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　
Ａｃｔａ）　、６５８．１３８〜１４７；マ゛ンカート
ニーはか（Ｈａｃａｒｔｎｅｙ　＆　Ｔｓｈｅｓｈｅ　
）　、１９８３、ニアロビーアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、）　、１３　Ｑ、７９〜８３；ストリックリンはか（
Ｓｔｒｉｃｋｌｉｎ　＆　ｌ＋ｌｅ１ｇｕｓ）、１９８
３、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　、　２５８．１２
２５２〜１２２５８　；マツクギアーゴールデイング（
ＨｃＧｕｉｒ−Ｇｏｌｄｉｎａ　）ほか、１９８３、ビ
オシミーク・工・ビオフイジーク・アクタ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）　、７６３．１
２９〜２３９　）　、血清中（ウ−Ｌ／　−（１４ｏｏ
１１ｅｙ　）ほか、１９７６、ネイチｔ　−（Ｎａｔｕ
ｒｅ）　、２６２．３５３〜３２７；ウーレー（１４ｏ
ｏ１１ｅｙ　）ほか、１９７８、ごオシミーク・工・ビ
オフイジーク・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、　Ａｃｔａ　）　、　５２２．２０５〜２１７）、
また他の体液中（パニング（Ｂｕｎｎｉｎｇ　）ほか、
１９８４、ニアロビーアン・ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー（Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　）　、１３９．７５〜８０
〕にも検出されている。ざらに、培養ウサギ骨からのコ
ラ−ゲナーゼインヒビターが、ゼラチンおよびプロテロ オグリカンを分解する２種の他の中性メナラロテアーゼ
を阻害することも明らかにされた〔セラーズ（Ｓｅｌｌ
ｅｒｓ　）ほか、１９７９、バイオケミカル・アンド・
バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　）　、８ユ、５８１〜５８７〕。この
インヒビター、すなわちメタロプロテアーゼの組織イン
ヒビター（以下、ＴＩＭＰと略す）およびヒト羊水から
単離された他のインヒビターが精製され、分子量約２８
，０００のきわめて類似した蛋白質であることが示され
た〔カラストン（Ｃａｗｓｔｏｎ　）ほか、１９８１、
バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、
　）　、１９５．１６７〜１７０〕。

現在では、上述のインヒビターはすべてＴＩＭＰに関連
があると考えられる（ヘンブリー（ｔ（ｅｍｂｒｙ）ほ
か、１９８５、ジャーナル・オブ・セル・サイｘ’、ｙ
ス（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、）　、　７３．１０５〜
１１９〕　。

大部分の培養組織および細胞におけるＴＩＭＰの普遍的
存在〔レイノルズ（Ｒｅｖｎｏｌｄｓ）ほか、１９８１
、リサーチ・モノグラフス・イン・セル・アンド・ティ
シュ−・フイジオロジー：セルラー・インターラクショ
ンズ（ＲｅｓｅａｒｃｈＨｏｎｏｇｒａｐｈｓ　ｉｎ　
Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇ
ｙ：Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　）
　、６巻、ディンゲルほか（Ｊ、　Ｔ、　Ｄｉｎｇｌｅ
　＆　Ｊ、　ｔ、　Ｇｏｒｄｏｎ　）編、２０５〜２１
５頁、エルセピア／ノース・ホランド・バイオケミカル
・プレス（ＥＩＳＱＶｉｅｒ／ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎ
ｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ　）　、アム
ステルダム〕および活性コラゲナーゼまたは活性プロテ
オグリカナーゼのいずれかと強固なコンプレックスを形
成するその能力（カラストン（Ｃａｗｓｔｏｎ　）ほか
、　　　　□１９８３、バイオケミカル・ジャーナル（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）、２１１．３１３〜３１８
）は、　　　□すべての結合組織が各種異化酵素の局所
活性を制御するための安全誤作！１ｌＩａ構としてＴＩ
ＭＰを合　　　□成することを示している〔レイノルズ
（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）ほか、１９７７、ザ・ランセット
（Ｌａｎｃｅｔ）　、２゜３３３〜３３５；マーフィー
ほか（Ｈｕｒｐｈｙ　＆５ｅｌｌｅｒｓ　）　、１９８
０、コラ−ゲナーゼ・イン・ノーマル・アンド・バソロ
ジカル・コネクテイブ・テイシューズ（Ｃｏｌｌａｇｅ
ｎａｓｅ　ｉｎ　Ｎｏｒ＋＋ａｌ　ａｎｄＰａｔｈｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　Ｔｉ５ｓｕｅｓ
　）　、ウーレーはか（Ｄ、　Ｅ、　Ｗｏｏｌｅｙ　＆
　Ｊ、　Ｈ，Ｅｖａｎｓｏｎ）編、６５〜８１頁、ジョ
ン・ウィリー（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ）　、ロンドン；
セラーズはかＣ３ｅｌｌｅｒｓ　＆　）４ｕｒｐｈｙ）
、１９８１、インターナショナル・レビュー・オブ・コ
ネクテイブ・ティシュ−・リサーチ（Ｉｎｔ。

Ｒｅｖ、　　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　　Ｔｉ５ｓｕｅ　
　Ｒｅｓ　　　）　　、　９　、１５１〜１９０、ホー
ルはか（Ｄ、　Ａ、　Ｈａｌｌ　＆　Ｄ、　Ｅ。

Ｊａｃｋｓｏｎ　）編、アカデミツク・プレス・インコ
ーポレーション（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎ
ｃ、　）　、ニューヨーク〕。たとえば、正常者および
関節炎患者からのヒト関節組織での研究結果は、局所的
メタロプロテアーゼの生産増加に拮抗するＴＩＭＰが不
十分なことが吸収と密接に関係するとの仮説を支持する
ウサギモデルでの実験結果と類似する〔マツクギ７　（
ＨｃＧｕｉｒｅ　）ほか、１９８１、クリニカル・サイ
エンス（ＣＩｉｎ、　Ｓｃｉ、）　、　６ユ、７０３〜
７１０：ｖ−フィー（Ｈｕｒｐｈｙ）ほか、１９８１、
クリニカル・サイエンス（ＣＩｉｎ、　ｓｃｉ、）　、
５　ｉ、７１１〜７１６；カンブレー（ｃａｍｂｒａｙ
　）ほか、１９８１、リューマトロジー・インターナシ
ョナル（Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、　Ｉｎｔ、　）　、１．
１１〜１６：マーフィー（Ｈｕｒｌ）ｈ’Ｖ）ほか、１
９８１、リューマトロジー・インターナショナル（Ｒｈ
ｅｕｍａｔｏｌ、　Ｉｎｔ、　）、１．１７〜２０〕。

さらに、腫瘍の浸蝕と周辺間質におけるＴ　ＩＭＰレベ
ルとは逆相関するとの証拠がアル〔マラカ（Ｈａｌａｋ
ａ）ほか、１９８３、ジャーナル・オブ・ニューロサー
ジエリ−（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｑ、）　、５９．４６
１〜４６６Ｓヒツクス（Ｈｉｃｋｓ　）ほか、１９８４
、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー
（Ｉｎｔ、　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ）　、３３９．８３５〜８４４〕。最後に
、実験的腫瘍浸蝕モデル〔トルガイアスン （Ｔｈｏｒｇｅ　＋　ｒｓｓｏｎ　）ほか、１９８２、
ジエー・シー・エヌ・アイ（Ｊ、Ｃ，Ｎ、１．）　、６
９．１０４９〜１０５４）において、精製メタロプロテ
アーゼインヒビターが腫瘍浸蝕の防止に有効な唯一のイ
ンヒビターであることが明らかにされた。

ＴＩＭＰは細胞外有機間質の崩壊促進が認められる疾患
過程の遮断に有効と考えられる。しかしながら、ＴＩＭ
Ｐの治療的有用性やその治療剤としての経済的価値をさ
らに評価することは、天然源からの原料を欠くことによ
り困難である。たとえば、ヒト皮膚線雑芽細胞上清７０
１かられずかに１６．４ｆＩｒｇの蛋白質が精製されて
いるにすぎない〔ストリツクンはか（Ｓｔｒｉｃｋｌｉ
ｎ　＆　Ｗｅｌｇｕｓ）、１９８３、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミスト＋）　−（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、）　、２５８　、・１２２５２〜１２２
５８）。

本発明は、メタロプロテアーゼインヒビターをコードす
る遺伝子を含むベクターで形質転換した宿主細胞を培養
することを特徴とするメタロプロテアーゼインヒビター
の製造方法を提供するものである。

本発明の方法によれば、メタロプロテアーゼインヒビタ
ーの比較的大量の生産が可能であり、またこの蛋白質の
構造や薬理作用の特徴を完全に解明することが可能にな
った。

メタロプロテアーゼインヒビターは、１種または２種以
上のメタロプロテアーゼの活性を低下させることができ
る蛋白質である。しかしながら、インヒビターは、細胞
外間質の吸収時に活性を示すメタロプロテアーゼ、たと
えばコラ−ゲナーゼの活性を低下できるインヒビターが
好ましい。もつとも好ましいインヒビターはメタロプロ
テアーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）である。数種
のＴＩ　Ｍ　Ｐ様蛋白質が文献に報告されているが、こ
れらの類似性はこれらの蛋白質がＴＩＭＰとは同一では
ないにしても密接な関係をもつことを示唆している。す
なわち、第３図に示すアミノ酸１〜１８４の配列と９０
％以上のホモロジー（共通アミノＩＩ／総アミノＩりを
もつアミノ酸配列を有するメタロプロテアーゼの組織イ
ンヒビターが好ましい。さらに好ましいメタロプロテア
ーゼインヒビターは第３図のアミノ酸配列と９８％以上
のホモロジーを有する蛋白質であり、もつとも好ましい
メタロプロテアーゼインヒビターは第３図のアミノ酸配
列を有する蛋白質である。

完全なメタロプロテアーゼインヒビター蛋白質のほかに
、このような蛋白質の比較的小さなペプチドフラグメン
ト、たとえばＴＩＭＰのペプチドフラグメントがメタロ
プロテアーゼインヒビターとして有用であることも考え
られる。したがって、本発明の第一の態様における特定
の実施態様および以下の態様における適当な実施態様に
おいては、メタロプロテアーゼインヒビターの語は、メ
タロプロテアーゼインヒビター蛋白質のメタロプロテア
ーゼ阻害ペプチドフラグメントを包含する。

メタロプロテアーゼインヒビターはメチオニン−メタロ
プロテアーゼインヒビターであることが適当である。遺
伝子の発現にはその遺伝子が５′ＡＴＧコドンをもたね
ばならないこと、したがって相当するペプチドはＮ末端
メチオニンアミノ酸をもつことが最近間らかにされてい
る。本明細書において用いられるメチオニン−メタロプ
ロテアーゼインヒビターの語は、Ｎ末端メチオニン残基
を有する真正哺乳類メタロプロテアーゼインヒビター（
または機能的に均等な蛋白質を与える真正哺乳類メタロ
プロテアーゼインヒビターの＊ｉまたは置換体）を意味
する。メチオニン残基はメタロプロテアーゼインヒビタ
ーのＮ末端アミノ酸に隣接することが好ましいが、その
蛋白質がメタロプロテアーゼインヒビター機能活性を有
する限り、１個または２個以上のアミノ酸を匍にはさん
でいてもよい。

本発明はさらに別の態様として、メタロプロテアーゼイ
ンヒビタープレカーサーをツー下する遺伝子を含むベク
ターで形質転換された宿主細胞を培養してメタロプロテ
アーゼインヒビターのプレカーサーを製造し、このプレ
カーサーを切断してメタロプロテアーゼインヒビターを
生成させることを特徴とするメタロプロテアーゼインヒ
ビターの製造方法を提供する。

プレカーサー蛋白質はメチオニン−メタロプロテアーゼ
インヒビターでもよい。

プレカーサー蛋白質はアミン末端シグナル配列を有する
メタロプロテアーゼインヒビターでもよい。シグナル配
列は、遺伝子が発現した宿主細胞からの発現生成物の輸
送を促進する作用をもつ配列である。たとえば、本発明
の場合、第３図のアミノ酸−１〜−２３で示されるよう
な２３個のアミノ酸のシグナル配列がメタロプロテアー
ゼインヒビターのアミノ末端に結合してプレメタロプロ
テアーゼインヒビターを形成する。このシグナル配列は
真核宿主細胞からの生成物の輸送を助け、シグナル配列
自体は細胞壁の通過時に生成物から切断される。

プレカーサー蛋白質は異種蛋白質とメタロプロテアーゼ
インヒビター蛋白質からなる融合蛋白質であってもよい
。異種蛋白質は宿主生成物中で、好ましくは高レベルに
産生可能な蛋白質のすべてまたは一部でもよい。このよ
うな２種の蛋白質としてβ−ガラクトシダーゼおよび１
遺伝子の生成物がある。融合蛋白質は、メタロプロテア
ーゼインヒビター蛋白質と異種蛋白質の間に化学的また
は酵素的選択切断されやすい部位を含むことが好ましい
。異種蛋白質は酵母シグナル配列で、宿主生物は酵素で
あってもよい。この好ましい実施態様においては、酵母
宿主が融合蛋白質を切断し、成熟メタロプロテアーゼイ
ンヒビターを産生する利点がある。

本発明はさらに別の態様として、第一の態様の方法によ
って生成されたメタロプロテアーゼイン　　　　；ヒビ
ターまたは中間体化合物として産生されるメタロプロテ
アーゼインヒビタープレカーサーを提供する。

本発明はさらに別の態様として、異種蛋白質とメタロプ
ロテアーゼインヒビターからなる融合蛋白質を提供する
。

本発明はさらに別の態様として、メタロプロテアーゼイ
ンヒビターまたはそのプレカーサーの７ミノ酸配列をコ
ードする遺伝子を提供する。好ましい遺伝子は第３図の
６４〜６８４のヌクレオチド配列を有する遺伝子、およ
び第３図の１３３〜６８４のヌクレオチド配列を含む遺
伝子を有する。

本発明はさらに別の態様として、上述の遺伝子を含有す
るベクターを提供する。与えられた宿主細胞について適
当な選択マーカー、プロモーターおよびその他の調節領
域が準備されれば使用できる。

本発明はさらに別の態様として、本発明のベクターで形
質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、メタロ
プロテアーゼインヒビターまたはそのプレカーサーをコ
ードする遺伝子を含有するベクターによって形質転換さ
れ、その遺伝子を発現される任意の宿主生物でよい。適
当な宿主細胞としては、酵母（たとえばサツカロミセス
・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）　）および組織培養哺乳類細胞（たとえ
ばハムスター卵巣およびマウス乳房腫瘍細胞）を挙げる
ことができる。

宿主細胞が細菌または酵母である場合、ベクターはメチ
オニン−メタロプロテアーゼインヒビターをコードする
かあるいはメタロプロテアーゼインヒビターを含む融合
蛋白質をコードする遺伝子を包含するベクターであるこ
とが好ましく、宿主細胞が組織培養した哺乳類動物の細
胞である場合、ベクターはプレメタロプロテアーゼイン
ヒビターをコードする遺伝子を包含するベクターである
ことが好ましい。

本発明はさらに別の態様として、メタロプロテアーゼイ
ンヒビターと医薬的に許容される賦形剤からなる医薬組
成物を提供する。医薬組成物はたとえば注射用溶液の剤
型とすることができる。

本発明はさらに別の態様として、メタロプロテアーゼイ
ンヒビターを医薬的に許容される担体と配合することか
らなる医薬組成物の製造方法を提供する。

本発明によって製造されるメタロプロテアーゼインヒビ
ターは、免疫系に対して重大な抗原反応を示すことなく
有用な薬理作用を発揮するものであることが好ましい。

と（に、本発明の化合物は、腫瘍細胞の浸蝕または腫瘍
の血管新生の防止により癌の治療に使用できる。また本
発明の化合物は、各種形態の表皮水痘症のような皮膚疾
患、歯根膜疾患、電皮症および皮膚新形成における軟組
織の崩壊の治療に使用できる可能性がある。

さらに、角膜の潰瘍形成のような各種形態の関節炎を伴
う結合組織の崩壊、慢性関節リウマチにおける関節組織
の崩壊も本発明の化合物で治療できる可能性がある。さ
らに、構造がＴＡＭＰと同一の蛋白質が赤血球強化活性
を有するとの報告があり（トチエルティー（ｔ＋ｏｃｈ
ｅｒｔｙ）ほか、１９８５、ネイチャーＧＮａｔｕｒｅ
）　、３１８．６６〜６９〕、したがって造血系の疾患
の処置に治療的に使用できる可能性が考えられる。

本発明の各種態様を図面によって例示する。

第１図は、ヒト胎児肺線維芽細胞およびヒト羊水ＴＩＭ
Ｐ（２）、ヒト皮膚線維芽細胞コラーゲナーゼインヒビ
ター（ハ）のＮ末端アミノ酸配列、ならびに６９塩基の
オリゴヌクレオチドプローブ（へ）、および１８塩基対
の相補的配列りを示す。

第２図は、はぼ完全な長さのｃＤＮＡと１個の付加的重
複ＣＤＮＡの５′末端（破線）から編集したヒトＴＩＭ
Ｐ　　ｃＤＮＡの制限酵素地図である。

第３図は、ヒトＴＩＭＰ　　ｃＤＮＡのヌクレオチド配
列および予測されるアミノ酸配列である。

第４図は、大腸菌発現ベクターｐＭＧ４５４の制限酵素
地図である（黒色の切仕は６１　ｂｐリンカ−を示す）
。

第５図は、哺乳類動物＠胞の発現ベクターＤＴＩＭＰ−
１の制限酵素地図である。

第６図は、ｐＭＧ４５４で形質転換された大腸菌Ｅ１０
３Ｓ中に作られた蛋白質を１２％ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に付し、クーマシーブルー染色した図
である（レーン１：マーカー蛋白質、レーン２：ＴＩＭ
Ｐ　　ｃＤＮＡインサートをもたない発現ベクターを含
む非誘導対照細胞、レーン３：誘導対照細胞、レーン４
　：　ｐＭＧ４５４を含む非誘導Ｅ１０３Ｓ細胞、レー
ン５：レーン４と同じ誘導細胞、レーン６：精製大腸菌
β−ラクタマーゼ）。

第７図は、ウェスタンブロッティング後に得られたオー
トラジオグラフィーを示す（レーン１および２：第６図
におけるレーン４および５に同じ、レーン３：精製ヒト
羊水ＴＩＭＰ、レーン４：ｐＴＩＭＰ−１でトランスフ
ェクションを行ったＣ１２７１１１胞系からの培養上清
蛋白質）。

第８図は、ウサギ腫瘍細胞によって生じるコラーゲンフ
ィルムの分解に対する組換えＴＩＭＰの阻害を示す棒グ
ラフである。

方法 決定 １３継代で購入した〔フロー・ラボラトリーズ（Ｈｏｗ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　）ヒト胎仔肺二倍体
細胞（ＡＴＣＣＣＬＬ１５３）を、４ｍＨグルタミン、
１５％熱不活性化ウシつ仔血清（ＦＣ８）および１００
Ｉｕ／Ｉｄペニシリンと１００μｇ／Ｉｄストレプトマ
イシンを補充したダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ　Ｓギブコ、ヨーロッパ（Ｇｉｂｃｏ　。

Ｅｕｒｏｐｅ）社〕に維持させた。細胞を２個の４９０
Ｃｍ２プラスチックローラーボトルに広げ、生育培地中
で接触阻止に達するまで生育させ、血清を含まないＤＭ
ＥＭで洗浄し、ついで血清を含まない培地中に６日間維
持した。培養上清のＴＩＭＰを、コラーゲン細線維法〔
マーフィーほか（Ｈｕｒｐｈｙ。

Ｃａｗｓｔｏｎ　＆　Ｒｅｙｎｏｌｃｌｓ）　、１９８
１　、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　’）１．１」Ｌ互、１６７〜１７０
〕を用いウサギ皮膚コラ−ゲナーゼの阻害によって測定
した。１単位のＴＩＭＰは２単位のコラ−ゲナーゼ（１
分間に２μ９のコラーゲンを分解）を５０％阻害した。

ＴＩＭＰレベルは０．２Ｕ以下〜５Ｕ／１０”細ＩＩ／
４８時間と変動し、低産生細胞は血清を含まない培地に
５ｎ９／ｄの４β−フォルボール−１２β−ミリステー
ト１３α−アセテート（ＰＭＡ）を加えて刺激した〔マ
ーフィーほか（１４ａｒｐｈｙ、　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ　
＆　Ｈｅｒｂ　）　、１９８５、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｗ、）　、２６０．３０７９〜３０８３）。６日後に
培養上清と細胞を収穫し、前者はダイアフロー（Ｄｉａ
ｆｌｏ）の凹状線維カートリッジ（Ｍｒｌｏ、０００カ
ツトオフ）を用いアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）コンセント
レータ−により４０倍に濃縮した。

ＴＩＭＰは濃縮上清からマーフィーら（ｆ４ｕｒｐｈｙ
。

Ｃａｗｓｔｏｎ　＆　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、　１９８１　
、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　）、１９５．１６７〜１７０〕の記載に
従って精製し、標準操作によって還元し、カルボキシメ
チル化した。ヒト羊水からのＴＩＭＰも同様に、精製、
還元、カルボキシメチル化した。Ｎ末端配列は、アプラ
イド・バイオシステムズ（ＡｐＨｌｉｅｄＢｉＯｓｙ３
ｔｅｍＳ）のアミノ酸配列分析装置を用い、自動的に、
エドマン分解によって決定した。これらのＮ末端配列と
、ヒト皮膚線維芽＠胞によるＴＩＭＰと類似の性質を有
する（ウェルガスはか（ｌＪｅｌｇｕｓ　＆　５ｔｒｉ
ｃｋｌｉｎ）　、　１９８３、ジャーナル・オプ・バイ
オロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂ１０１、ＣｈｅＩＩ
ｌ、）　、２５８．１２２５９〜１２２６４）既報のコ
ラ−ゲナーゼインヒビターの配列〔ストリックリンはか
（Ｓｔｒｉｃｋｌｉｎ　＆Ｗｅｌａｕｓ）　、１９８３
、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、　Ｂ１１１．　ｃｈｅｍ、）、Ｌ旦１．１２２５２
〜１２２５８）との比較は第１図（２）に示す。ヒト羊
水およびヒト胎仔肺ＴＩＭＰは同定した２８個のすべて
のＮ末端アミノ酸について同一である。ヒト皮膚線維芽
輻胞インヒビターも２２番目のリジンがロイシンである
ほかは２３個のＮ末端残基について同一である〔第１図
（ハ）〕。

この情報に基づいて、ＴＩＭＰの２３個のＮ末端アミノ
酸をコードできる単一の６９塩基オリゴヌクレオチドプ
ローブを設計した〔レーザ（Ｌａｔｈｅ）　、１９８５
、ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロジー（Ｊ
、　Ｈｏｌ’、　Ｂｉｏｌ、　）、１８３．１〜１２）
　（第１図Ｃ）。コドンはヒト遺伝子にもつとも頻繁に
現れると報告されているものとしたが３個所例外がある
。その場所には稀に認められるジヌクレオチドＣｐＧを
挿入する方が好都合であった（グランサム（Ｇｒａｎｔ
ｈａｌ）ほか、１９８１、ヌクレチツク・アシツズ・リ
サーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、）　、９、
ｒ４３〜４７：ヌセノフ（Ｎｕｓｓｅｎｏｖ）　、１９
８１　、ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオ０ジ
ー（Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｒｉｏｔ、　）　、１４９．１２５〜１３１〕。さらに
、長いプローブのヌクレオチド２５〜４２に相補的な１
８塩基対の配列も構築した〔第１図に）〕。

Ｃ６塩基のオリゴヌクレオチドプローブはアプライド・
バイオシステムズ（ＡＩ）ｐｌｉｅｄ　ｅ＋ｏｓｙｓｔ
ｅｉ＋ｓ）の３８０Ａ型合成装置を用い、固体担体への
活性化ホスホアミダイトのモノマー添加により合成した
。脱保護プローブをＨＰＬＣで精製した。鎖長１８個の
オリゴマーは自動化同相リン酸トリエステル法によって
合成し〔パテル（Ｐａｔｅｌ　）ほか；ヌクレイツク・
アシズ・リサーチ（Ｍｕｃｌ、Ａｃ１ｄ。

Ｒｅｓ、）　、１０．５６０５〜５６１９（１９８２）
）、同じ＜ＨＰＬＣで精製した。プローブ配列上の数字
は、第３図のｃＤＮＡのヌクレオチド配列における番号
を示す。プローブ配列上の文字はｃＤＮＡ中でそのヌク
レオチドが異なることを示している。

１．２．ＴＩＭＰに対する抗体の調 ヒツジ抗ヒト羊水ＴＩＭＰ血清は、ヘンブリー氏（Ｒ，
ｏｅｍｂｒｙ　、ストレンジウェイ・リサーチ・ラボラ
トリーズ（Ｓｔｒａｎｇｅｗａｙｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
　ＬａｂＯ−ｒａｔｏｒｉｅｓ）　、ケンブリッジ（Ｃ
ａｍｂｒｉｄｇｅ　）　ＣＢ　１４ＲＮ、英国）より恵
与された。そのｌｌｌ製法は報告されている〔ヘンブリ
ー（Ｈｅｍｂｒｙ）ほか、１９８５、ジャーナルφオブ
・セルやサイエンス（Ｊ、　　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、）　
、Ｌ旦、１０５〜１１９）。

一部の実験では、免疫グロブリン（Ｉ　ＱＧ＞をヒツジ
抗血清から固体硫酸ナトリウム（１８％Ｗ／Ｖ）で沈殿
させ、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）に再溶解し、同一１
１１１液で大容饅透析して使用した。得られたＩＱＧプ
レバレージョンを１０ＩＮトリス−塩酸（１）８７．６
）、１６０１８　　ＮａＣｊ！、０．５％Ｗ／Ｖカゼイ
ンおよび０．０５％Ｖ／Ｖツイーン２０中に１００倍に
希釈した。ついで、ドチャーテイー（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ
）ら〔ヌクレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　
Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、）　、皿、１８９１〜１９０３）
の報告のように、ニトロセルロースフィルター〔シュラ
イベル・ラント・ジュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ｕ
ｎｄ　５ｃｈｕｌｌ　）　）上で大腸菌コロニーの密集
的細胞単層を尿素により溶菌させたのち、上記ＩｇＧと
インキュベートして、大腸菌ＤＨ１抗原に吸着させた。

−夜４℃でインキュベートしたのち、ＩＯ’Ｇブレバレ
ージョンを遠心分離して澄明とし、使用まで一２０℃に
保存した。

１．３．ｍＲＮＡの講　とｉｎ　ＶｉｔｒＯ訳ヒト胎仔
二倍体肺細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１５３）を蛋白質の精製
の項に述べたと同様にして生育させた。６日間血清を含
まない培地中に置いたのち、マニアテイス（Ｈａｎｉａ
ｔｉｓ）らの記載（モルキュラー・クローニングニア・
ラボラトリー−？二１アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１
ｏｎｉｎｏ　：　Ａｔａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ
ｌ　）　、１９１頁、コールド・スプリング・ハーバ−
・う゛ボラトリー（Ｃｏｌｄｓｐｒａｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、二１−３−り）に従っ
てローラー・ボトルから収穫した。

ＤＮＡは細胞からグアニジニウム・イソチオシアネート
・フェノール法〔マニアテイス（Ｈａｎｉａｔｉｓ）ほ
か、１９８２、モルキュラー・クローニング；アーラボ
ラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ
ｉｎｏ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ
　）、１９４〜１９５頁、コールド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　５ｔ）ｒｉｎ（ｌ　ｔ
ｔａｒｂｏｒＬａｂＯｒａｔＯｒｌ／）　、ニューヨー
ク〕を用いて抽出した。

ポリアデニル化ｍＲＮＡを全ＲＮＡから、オリゴｄＴ−
セルロース〔コラボレイテイブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａ
ｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　）カラムクＯ
Ｖトゲラフイー（アビプはか（Ａｖｉｖ　＆　Ｌｅｄｅ
ｒ）、１９７２、プロシーデイングズ・オブ・ザ　ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステイソ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、
　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ
）　、６９．１４０８〜１４１２）によって単離し、つ
いでその完全性をアガロースゲル電気泳動および３５Ｓ
−メチオニンの存在下ウサギ網状赤血球溶解物中１ｎＶ
ｉｔｒＯ翻訳によってチェックした（ベルハムばか（Ｐ
ｅｌｈａｍ　＆　Ｊａｃｋｓｏｎ）　、１９７６、ユア
ロビアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅ
ｕｒ。

Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　、６７．２４７〜２５６
）、次に、複合体を沈殿させるため、ヒトＴＩＭＰおよ
びプロティンＡセファロースに対するヒツジ抗血清を用
いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳生成物の免疫沈降を行った
〔ハリス（ｔｌａｒｒｉｓ）ほか、１９８１、パイロロ
ジー（ＶｉｒｏｌｏｇＶ）　、１１２．９１〜９８）。

１０％ポリアクリルアミドゲル上ペプチドを解析したと
ころ〔レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ　）　、１９７０、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２２７．６８０〜６８５〕
、分子量約２３．０００の単一ペプチドがＴＩＭＰ抗体
とともに免疫沈降したことが明らかにされた。これはＣ
ＣＬ１５３細胞系から単離されたｍＲＮＡ中にＴＩＭＰ
　　ＲｍＮＡが存在するこ・とを示している。ｍＲＮＡ
翻訳後の狡二２３．’ＯＯＯポリペプチドの収率は各種
組織培養実験で変動したが、全ｍＲＮＡプレバレージョ
ンを集め、以後のｃＤＮＡ合成に使用した。

１．４．０ＤＮＡ合成 ｍＲＮＡを用い、はぼレツツエル（Ｒｅｔｚｅｌ　）ら
の記載〔バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、１９８０、エユ、５１３〜５１８〕に従って逆転
写酵素（アングリアン・バイオテクノロジー（Ａｎｇｌ
ｉａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）社〕により一
重鎖ＣＤＮＡを合成した。ついでこれを、大腸菌ＤＮア
ーゼ−Ｈ〔エンゾ・バイオケム（Ｅｎｚ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　）　、Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ（ベー
リンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎａｅｒ）　）およびＤＮＡリ
ガーゼ〔ペーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　）を
用いて二重鎖ｃＤＮＡへ変換した〔ガブラーほか（Ｇｕ
ｂｌｅｒ　＆　Ｈｏｆｆｎ＋ａｎ）、１９８３、ム、２
６３〜２６９参照〕。次にターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフエラーゼ〔マイルズ（旧１ｅｓ　）　
）を用い、はぼミケルソンら（Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ　＆
　０ｒｋｉｎ　１１９８２、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
　）　、２５７．１４７７３〜１４７８２）の推薦に従
ってｃＤＮＡの３′ＯＨ末端へのｄＣＴＴの段階的付加
を触媒させた。次に、種々の量のｄＣＴＰ尾部をもつＤ
ＮＡをｄＧＴＰ尾部をもつｐＢＲ３２２プラスミドＤＮ
Ａ　（ＢＲＬ、ロット番号２１１１２）（ガプラーはか
（Ｇｕｂｌｅｒ　＆　Ｈｏｆｆｍａｎ）　、１９８３　
、ｚ５．２６３〜２６９〕で７ニーリングしたのら、大
腸菌ＤＨ１（ｖナハン（Ｈａｎａｈａｎ　）　、１９８
３、ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロジー（
Ｊ、　Ｈｏｔ、　Ｂｉｏｌ、　）　、１６６．５５７〜
５８０〕をテトラサイクリン抵抗性に形質転換するのに
用いた。この方法で、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　１　ｎｏあたり
５０〜１００個のテトラサイクリン抵抗性形質転換体を
生じさせる条件が確立された。

１．５．０ＤＮＡライブラリーのスクリーニン上述のア
ニーリングしたＤＮＡによるＤＨｌの形質転換体カラ約
１５．０００〜２０．０００１７）コロニーのＣＤＮＡ
ライブラリーが得られた。

３７℃で２０時間生育させたのち、コロニーのレプリカ
をニトロセルロースフィルター（シュライベル・ラント
・ジュール（Ｓｃｈｒｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｌｌ
））に移し、ＬＢ−寒天板上クロラムフェニコール１０
０μｇ／ｌｄの存在下、フィルターをさらに１６時間イ
ンキュベートしてプラスミド含量を増幅させた。コロニ
ーからのＤＮＡのニトロセルロースへのその場での固定
は、はぼマニアテイス（Ｈａｎｉａｔｉｓ）らの記載（
モルキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニ
ュアル （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：＾Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｈａｎｎｕａｌ）、３１５頁、コールド
・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
、ニューヨーク〕に従って実施した。

ついでニトロセルロースフィルターを、０．９Ｍトリス
−塩酸（ｐＨ７，４）　、Ｏ，ＯＯ０５ＭＥＤＴＡ１０
．５ｖ／ｖ％ＮＰ４０，０．２ｗ／ｖ％、ＳＤＳ、１０
０μ９７ｔｌｌのせん断変性すケ精子ＤＮＡ、２ｘデン
ハルト溶液〔アンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）　、１９
６６、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、　
ＢｉｏｐｈｙＳ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｏｎ、）、２３
．６４１〜６４６〕からなる緩衝液中、６５℃で４時間
、プレハイブリダイズさせた。

１３．５ｚ径のフィルター１枚に緩衝液２ｄを使用した
。プレハイブリダイゼーション後、標識した６９塩基の
プローブＤＮＡを濃度が約２５　ｎｏ／−になるように
加えた。プローブはあらかじめ、はぼマニアナイス（Ｈ
ａｎｉａｔｉｓ）らの記載〔モルキュラー・クローニン
グニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＨａ
ｎｎｕａ、ｌ　）　、１２２頁、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、ニューＢ−り
〕に従ッテ標識シタが、導入されなかった３”Ｐ−ＡＴ
Ｐは２Ｍ酢酸アンモニウムによる反復沈殿で除去した（
ガブラーほか（Ｇｕｂｌｅｒ　＆　ｌｌｏＨｍａｎ）　
、１９８３、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、２５．２６３〜２
６９）、標識プローブの比活性は２．５Ｘ１０５チ工レ
ンコフＣＩａｍ　／ｐｍｏ　Ｉで、ハイブリダイゼーシ
ョン時の標識の濃度・　は１．１　Ｘ　１０６チ工レン
コフｃｐｍ／Ｉ１１であった。

プローブをフィルターに添加したのち、ハイブリダイゼ
ーション温度を３時間で４２℃に下げ、この温度でハイ
ブリダイゼーションを１２時間続けた。

ついで、ニトロセルロースフィルターを、０．５ＸＳＳ
Ｃ（クエン酸ナトリウム食塩溶液、１　Ｘ５ＳＣは０．
１５Ｍ　　ＮａＣｊ！、１５ｍＨクエン酸三ナトリウム
、ｐＨ７，０＞中、４３℃で４５分、４５℃で３０分、
５０℃で１５分順次洗浄した。最後に、フィルターを０
．５ＸＳＳＣ中’１１でリンスしたのち、強化スクリー
ンを用い、−８０℃で２０時間オートラジオグライーに
かけた。オートラジオグラフィーで記録されたシグナル
と一致するポジティブと推定されるコロニーを原プレー
ト上に同定した。これらを単一コロニーごとに画線培養
し、上述したと全く同様にして第２回目のオリゴヌクレ
オチドスクリーニングに付した。画線培養で単離された
６個のコロニーが再びポジティブシグナルを示した。こ
れらの画線培養で得られたクローン的に純粋なコロニー
についてさらに次のように特性を調べた。

１．６．ポジティブクローンの解析 ６個のポジティブクローンからのプラスミドＤＮＡをア
ルカリ溶菌法、ついで塩化セシウム−エチジウムプロミ
ド中遠心分離によって精製した〔マニアナイス（Ｈａｎ
ｉａｔｉｓ）ほか、１９８２、モルキュラー・クローニ
ングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎａ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ
ｎｕａｌ）　、９０〜９４頁、コールド・スプリング−
Ａ−バー・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、ニュー　と１−
り〕。ついで、それらのＣＤＮＡインサートの関連性を
非切断プラスミドの直接配列決定により、はぼビエイラ
ら（Ｖｉｅｉｒａ　＆　Ｍｅｓｓｉｎｇ）の記載（ジー
ン（Ｇｅｎｅ）、１９８２．１旦、２５９〜２６８〕に
従って調べた。ジデオキシ法を用い〔サンガー（５ａｎ
（ｌｅｒ）ほか、１９７７、プロシーデイングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・スティソ・オブ・アメリカ（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩ
ＳＡ）　、７４．５４６３〜５４６７）　、最初のスク
リーニングで使用した６９塩基のヌクレオチドの２５〜
４２に相補的なブライマー（５− ＣＴＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＴＧＴＣＴＧ−３’　）を自
動化固相リン酸トリエステル法〔バテル（Ｐａｔｅｌ　
）ほか、１９８２、ヌクレイツク・アシズ・リサーチ（
ＮｕＣｌ　、八ｃｉｄ、　Ｒｅｓ、　）　、１没、５６
０５〜５６１９）によって合成して実施した。

したがって、このブライマーは成熟ＴＩＭＰの残基９〜
１３をコードするセンス鎖に相補的である（第１図参照
）。６個のクローンのうち５個が少なくとも７０個のヌ
クレオチド上に同一のＤＮＡ配列をもつこと、そしてク
ローン３がもつとも長いことが明らかにされた。さらに
、１８マーをクローン３ＤＮＡの配列決定ブライマーと
して使用する前に末端標識すると〔マニアナイス（Ｈａ
ｎｉａｔｉＳ）ほか、１９８２、モルキュラー・クロー
ニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｍａｎｕａｌ　）、１２０頁、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）、ニューヨ
ーク〕、このＤＮＡは線維芽細胞インとビターの最初の
８個のアミノ酸をコードする能力をもつことが明らかに
された。これは、単離されたクローンがヒトＴＩＭＰの
ｃＤＮＡクローンであることを強力に支持するものと考
えられた。

次に、プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼをそ
れらの推薦条件下〔アマ−ジャム・インターナショナル
（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）　
）で使用して、制限解析を行った。得られたデータから
、ｐＢＲ３２２配列と第２図に示す制限地図の太線部分
の表示が可能となった。この地図はクローン２とクロー
ン３の５′末＠（破線）から集積したもので、白抜きの
矩形部分はＧＣ尾部の位置を示す。矢印はジデオキシ配
列決定の方向を示している。略号の意味は次のとおりで
ある：ｐ＝ｐｓＢ、Ｎ＝ＮｃｏＩ、Ｔ＝Ｔｔｈｌ［Ｉ−
１、Ｂ＝ＢｓｔＸ［ＳＭ＝Ｍｓｔｌｒ、Ａ＝ＡＶａＩ。

Ｖ＝Ｐｖｕ　Ｉ、Ｈ＝Ｈａｅｎ、Ｉ＝ＨｉｎｆＩ０クロ
ーン２およびクロー３から推定された全プクレオチド配
列は、制限フラグメントをＭ１３ｔｑ１３またはｔｇ１
３１〔アマ−ジャム（Ａｌｅｒｓｈａｍ　）　）にサブ
クローニングし、ＪＭｌｏｌに形質転換したのち〔メツ
シングはか（Ｈｅｓｓｉｎｏ　＆　Ｖｉｅｉｒａ）　、
１９８２、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、上皇、２６９〜２７
６）、ジブオキ法（ナンガー（Ｓａｎｇｅｒ　）ほか、
１９７７、プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイ
テッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ）　　、　−ヱニュ
４−１５４６３〜５４６７）によって得られた。ヒトＴ
ＩＭＰの全配列および予測されるアミノ酸配列を第３図
に示す。配列の下の数字はｍＲＮＡの配列によるもので
ある。

２７および７０６位のヌクレオチドは同定されなかった
。配列の上の数字はアミノ酸配列の番号であり、負の数
字はシグナル配列と推定される部分である。グリコジル
化サイトの可能性がある部分にはアンダーラインを付し
た。

ｃＤＮＡは鎖長７９３個のヌクレオチドからなり、６２
１個のヌクレオチドの読み取り枠を含む（第３図のヌク
レオチド６４〜６８４）。

ＴＩＭＰ　　ｍＲＮＡの３′末端は、ポリアデニル化シ
グナルＡＡＴＡＡが先行するポリ△配列をもつことから
表示した配列と考えられる〔ブラウトフットはか（Ｐｒ
ｏｕｄｆｏｏｔ　＆　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）　、１９８１
、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２５２．３５９〜３
６２）。６４〜６６番目のヌクレオチドが翻訳開始部位
と考えられる。それは、ヌクレオチド１３３〜１２６で
コードされるＴＩＭＰのＮ末端アミノ酸に先行する読み
取り枠中、メチオニン（Ｍ）をコードする唯一の枠だか
らである。したがって、この配列はアミノ酸２０７個の
ポリペプチドに翻訳され、停止コドンＴＧＡ　（ヌクレ
オチド６８５〜６８７）で終了する。ヌクレオチド１９
６〜１９８はストリフリンはか（５ｔｒｉｃｋｌ　ｉｎ
＆　Ｗｅｌｇｕｓ）によって報告されているジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｗ、　）　、１’９８３．２５８．１２２５
２〜１２２５８）ロイシン（し）よりもリジンであろう
と思われる。しかも、ヒト羊水Ｔ　Ｉ　ＰＭおよびＣＣ
Ｌ１５３培養上清から精製されたＴＩＭＰはこの位置に
リジンをもっている（第１図参照）。

これは、このＤＮＡ配列が正確であることを示唆し、こ
のＣＤＮＡがヒト１−ＩＭＰをコードすることを裏書き
する。ＣＣＬ１５３ヒ１へ二倍肺細胞系、′コト羊水お
よびヒト皮膚線維芽細胞から単離されたＴＩＭＰの密接
な類似性も明らかである。

ヌクレオチド６４〜６６でコードされるＮ末端メチオニ
ンに続いて２２個のアミノ酸がある。その多くは疎水性
で、Ｎ末端システィン（Ｃ）に先行し、ヒト羊水ＴＩＭ
Ｐにも線維芽細砲コラーゲナーゼインヒビターにも認め
られる。これは、これらのアミノ酸がシグナル配列の疎
水性核であり、分泌時に切断されて成熟蛋白質を遊離す
ると考えれば矛盾がない。したがって、成熟Ｔ　、Ｉ　
Ｍ　Ｐは鎖長１８４個のアミノ酸からなり、分子量は２
０．６８５と推定される。ＤＮＡ配列から予想される成
熟ＴＩＭＰの全アミノ酸組成を第１表に示す。興味のあ
ることに、成熟ｒ１ＭＰ中には１２個のシスティン（Ｃ
）残塁が存在し、これはストリフリンはか（Ｓｔｒｉｃ
ｋｌｉｎ　＆　Ｗｅｌｇｕｓ）が線維芽細胞インヒビタ
ー中に存在すると推定した数〔ジＡ７−ナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミスト１、Ｊ　−（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、）　、１９８３．２５８．１２２５９〜１
２２６４）の半分である。しかしながら、ウシメタロプ
ロテナーゼインヒビターについて報告されたシスティン
、含量（キシはか（Ｋｉｓｈｉ　＆　Ｈａｙａｋａｗａ
）　、ジャーナル・オブ・バイオケミストＩＪ　−（Ｊ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　）　、１９８４．９６．３９
５〜４０４〕とは一致する。

最後に、このＤＮＡ配列から、成熟蛋白質にはＮ−グリ
コジル化サイ１−の可能性が考えられる２部位が存在す
る。これらは、第３図中にアンダーラインを付して示す
。

付加的ＮＨ２末端メチオニン残基をもつＴ　ＩＭＰ　（
ｍｅｔ−Ｔ　ＩＭＰ）の大腸菌内テノ発現は、上記２の
項に記載し、第３図に示した成熟ＴＩＭＰをコードする
配列に、オリゴヌクレオチドを用いて、プロモーター、
シャインーダガルノ配列および開始ＡＴＧコドンを結合
することによって達成される。この例では、大腸菌ｔｒ
ｐｌ：プロモーターとシャインーダガルノ配列を用いた
。

これらの配列はたとえばプラスミドｐＣＴ５４上に存在
し、問題の蛋白質をコードするＤＮＡ配列はＣｊ！ａ１
サイトに挿入できる〔エムタージ（Ｅｉｔａｇｅ　）ほ
か、１９８３、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニ
ナイテツド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υＳ八）、８０．３
６７１〜３６７５）。しかしながら、これらまたは他の
プロモーターとシャインーダガルノ配列を含む他のプラ
スミドも、増幅可能で、その発現を厳密に調節できれば
、使用可能である（たとえばヨーロッパ特許出願ＥＰ−
Ａ２−０１２１３８６号参照）。本例では、シグナル暗
号配列はもたず付加的Ｎ末端メチオニンコドンを伴うＴ
ＩＭＰコード配列を大腸菌発現ベタターｐＭＧ　１９６
に挿入し、ｐＭＧ４５４を産生さじだ（第４図）。これ
には標準組換えＤＮＡ技術を用いた〔マテアテイス（Ｈ
ａｎｉａｔｉｓ）ほか：モルキュシー・クローニングニ
ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　ＬａｂｏｔａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ）　、３９０〜４３３負）、ｐＭＧ４５４は、選
択がなければ大腸菌内に低コピー数で安定に存在するが
、誘導時にはコピー数は染色体あたり１００〜２００に
増加する。

発現ベクターへの挿入には、ＴＩＭＰ停止コドン（第３
図）に隣接するＨｉｎｆｌサイト（ヌクレオチド６８６
〜６９０）をリンカ−で８８ｍＨＩサイトに変換した。

ついでＣＤＮＡの５′末端をヌクレオチド１７８〜１８
６（第３図）にあるＴｔｈｌｌ［−１サイトから６１　
ｂｐクリンカを用いて再構築し、上流ＣＪａ１サイトお
よびそれに続き、成熟ＴｒＭＰのＮ末端におけるシステ
ィンコドンに先行するＡＴＧ開始コドンを設けた。

このリンカ−の配列は次のとおりである。

平　−云１ それは椋準方法によって以下のオリゴヌクレオチドから
構築された。

ＣＧＡＴ八ＡＣへ八ＡＴへＴＧＴ八ＣＣへＧＣＧＴ丁Ｃ
ＣＡＣＣＴＣＡ丁ＣＣＴＣ八＾ＡへＴＧＣＴＴＴＣＴＧ
ＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＴＴＡＧＴＴＡＴ ＴＧＡＧＧＴＧＧＡＡＣＧＣＡＧＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧ
ＴＴＴＧＡＧＧＡ ＾ＧＧＴＣＡＧＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡ 各オリゴヌクレオチドは自動化固相リン酸トリエステル
法〔パテル（Ｐａｔｅｌ　）ほか、１９８２、ヌクレテ
イツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、）　、１０．５６０５〜５６１９
〕によって合成された。

このリンカ−を用い、ＴＩＭＰ遺伝子の５′末端をＴＩ
ＭＰコード配列内に存在するＴｔｈＩ［［１サイトを介
して、アラスミ６０ＭＧ１９６中に存在するｔｒｐＥシ
ャイン−ダルガノ配列から下流に位置するＣｊ！ａ１サ
イトと結合させた。得られたプラスミドｐＭＧ４５４は
、大腸菌Ｅ１０３Ｓ（プロテアーゼ欠損大腸菌に１２Ｍ
導体）への形質転換によって確立された。結果は、シャ
イン−ダルガノ配列と、成熟ＴＩＭＰのＮ末端システィ
ン（Ｃ）に直接隣接する開始ＡＴＧとの間の１３個のヌ
クレオチド配列である。

このプラスミドを含むＥ１０３Ｓの培養はＬ−ブイヨン
中３０℃でＯＤ　　　が０．４になるまで行い、６５℃
で振盪して４２℃にシフトした。

４２℃に達したのち、３７℃の水浴に移し、さらに５時
間生育させた。この間に適当はのサンプルをとり、ＳＤ
Ｓゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングによっ
て解析した。第６図に示すように、誘導後Ｍｒ２０．０
００の蛋白質が認められ、これはグリコジル化されてい
ないＴＩＭＰの期待される大きさであった。β−ラクタ
マーゼ（これもｐＭＧ４５４によってコードされている
）も特異的に誘導されることに留意すべきである。

ウェスタンブロッティングにより、１ｙｌｒ２０．００
０蛋白質は、ヒト羊水から精製されたＴＩＭＰに対する
ポリクロナール抗体と特異的に反応する（第７図、トラ
ック７）。大腸菌内で発現される他の組変え蛋白質と同
様、丁ＩＭＰは大部分、封入体内に不溶の形で存在する
ことが明らかにされた。

ｐＭＧ４５４内のＭｅｔ−ＴＩＭＰのＮ末端アミノ酸を
コードするＤＮＡ配列を変えることによって、ＴＩＭＰ
の収率を改善することができた。

新しいプラスミドは、６１　ｂｐリンカ−からなるオリ
ゴヌクレオチドの一部が異なる配列を有するほかは、ｐ
ＭＧ４５４の構築の場合の記載とほぼ同様にして生成さ
せた。これらの変化の一部は新しいＮ末端アミノ酸の結
果である。得られたプラスミドならびにＴＩＭＰ５’お
よびＮ末端配列は次のとおりである。

ＣＴ ｐＭＧ４５４　　　　ＡＴＧＴＧＴＡＣＣＣＩ ｐＭＧ４５６　　　　ＡＴＧＴＧＴＡＴＣＦＴ １）ＭＧ４５７　　　　△ＴＧＴＴＴＡＣＣＣＴ ｐＭＧ４６８　　　　ＡＴＧＴＧＴＡＣＴさらに、アラ
スミ１０ＭＧ４５４中のシャイン−ダルガノ配列とＡＴ
Ｇ開始コドンの間のヌクレオチド数を変えることによっ
てＴＩＭＰの収率が改善された。これは、ｐＭＧ４５４
をＣｊ！ａ１サイトで線状化し、Ｓ１ヌクレアーゼで処
理し、ついでエムタージ（Ｅｍｔａａｅ）はか〔プロシ
ーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・スティソ
・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　　＞　　、　ｓｏ、　　３６１　〜３７５　　
（１９８３）　　）（７）記載にほぼ従ってリゲートす
るにとにより行った。

この方法でプラ及ミドｐＭＧ４６１を生成した。

最後に、Ｔ７転写ターミネータ−〔ダンほか（Ｄｕｎｎ
　＆　５ｔｕｄｉｅｒ）　、１９８０、ヌクレイツク・
アシズ、　ＩＪサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅ
ｓ、）　、旦、２１９〜２１３２）を、最善の産生プラ
スミド中のＴ　ＩＭＰコード配列の３′末末端位に置い
た。

この配列は［３ａｍＨＩサイトでプラスミドにリゲート
した。

３．２．−陽画細胞からのＴＩＭＰの　製上述のように
して構築したプラスミドを含む大腸菌細胞を、発現至適
条件下に生育させると総細胞蛋白質の１０％までのレベ
ルでｍｅｔ−ＴＩＭＰを産生する。

大腸菌の粗抽出液の可溶性蛋白質分画におけるＴＩＭＰ
活性をならし培地についての記載〔ヒツクス（Ｈｉｃｋ
ｓ　）ほか、１９８４、インターナショナル・ジャーナ
ル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ）　、３３．８３５〜８４４〕にほぼ従っ
て測定した。大腸菌内に発現したｎｅｔ−ＴＩＭＰの一
部または全体は不溶型であるので、上記測定では検出さ
れない。したがって、測定および精製に先立って、可溶
化し活性化する。この方法の一例はメチオニンープロ力
イモシンの生成に関連して、本出願人による係属中の国
際特許出願Ｐ　Ｃ１”／ＧＢ８３１００１５２　（ＷＯ
８３１０４４１８として公開）および英国特許出願ＧＢ ２１００７３７Ａに記載されている。可溶性の、活性、
部分精製ＴＩＭＰが得られたのち、さらに免疫親和性ク
ロマトグラフィーによって精製する（たとえば、エベラ
イはか（Ｅｖｅｌｅｉｇｈ　＆　Ｌｅｖｙ　）、１９７
７、ジャーナル・オブ・ソリッド・フェース・バイオケ
ミストリー（Ｊ、　５ｏｌｉｄ　ＰｈａｓｅＢｉｏｃｈ
ｅｍ、）　、２．４５参照〕。この場合、上述のヒツジ
ポリクロナール抗体またはＣＣＬ１５３細胞上清から精
製したＴＩＭＰ標品によって生じるモノクロナール抗体
を用いることができる。また、たとえば既報の〔マーフ
ィー（Ｈｕｒｐｈｙ）ほか、ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー（Ｊ。

８ｉｏｃｈｅｍ、　）　、１９５．１６７〜１７０（１
９８１）；マーサー（Ｍｅｒｃｅｒ）ほか、バイオケミ
カル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）　、２
３１．５０５〜５１０　（１９８５））標準的蛋白質精
製技術によってさらに精製することもできる。

３．３．酵母中での発現 大腸菌内での発現を達成するために用いたと類似の標準
的組換えＤＮＡ技術を使用して、酵母中でのＴＩＭＰの
発現に適したプラスミドベクターを構築する。この場合
も第２項に述べ第３図に示したオリゴヌクレオチドリン
カーおよびＴＩＭＰコードＣＤＮＡを用いる。構築はた
とえば係属中の公開されたヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ
２−００７３６３５号に記載のベクターに基づいて行わ
れる。それらにはＴＩＭＰコード配列が、Ｍ母ホスホグ
レセシートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータとＰＧＫ遺伝
子３′非翻訳領域に囲まれて包含される。ＰＧＫプロモ
ーターに関してのＴＩＭＰＣＤＮＡの方向性は、大腸菌
における発現で上述したように、成熟ＴＩＭＰと付加的
Ｎ１−１２末端メチオニン残基の発現を保証するように
定められる。

また、プレーＴＩＭＰは、ＴＩＭＰコード配列をＴＩＭ
Ｐシグナル配列を残すようにベクターに結合させても発
現させることができる。この目的にはヌクレオチド３２
〜３７（第３図）におけるＮｃｏ１サイを使用できる。

酵母シグナル配列〔たとえば、酵母α因子シグナル配列
：カージャンはか（Ｋｕｒｊａｎ　＆　Ｈｅｒｓｋｏｗ
ｉｔｚ　）　、１９８２、セル（Ｃｅｌｌ）　、３０．
９３３〜９４８〕と成熟ＴＩＭＰの融合蛋白質の発現は
適当なリンカ−を用いて実施できる。これらのプラスミ
ドＤＮＡは、たとえばベグズ（Ｂｅｇａｓ　）の方法〔
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、１９７８．２７５．１
０４〜１０９〕によって、酵母細胞中に導入される。

３．４．酵母細胞からのＴＩＭＰの精製これらのプラス
ミドを含有する酵母細胞を、ＴＩＭＰの発現に至適な条
件下に生育させると、ＴＩＭＰとして総細胞蛋白質の５
％までを産生する。上述の変化に応じて、Ｔ　Ｉ　Ｍ　
Ｐは酵母細胞から分泌されることもあるし、また分泌さ
れないこともある。細胞間に産生された場合は発現ＴＩ
ＭＰはほぼ前述のようにして定量、評価、精製できる。

分泌された場合は、細胞上清から、前述のようにしてま
たは標準的蛋白質精製技術（マーフィー（Ｈｕｒｐｈｙ
）ほか、ジャーナル・オブ・バイｔ’ｒミスト’Ｊ　−
（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　）　、１９５．１６７〜
１７０　（１９８１）　；マーサー（Ｍｅｒｃｅｒ）ほ
か、バイオケミカル・ジャーナル（ＢｉｏｃｈｅｎＪ、
）　、２３１．５０５〜５１０（１９８５）によって精
製される。

３．５．　　　動物細胞　におけるＴ　ＩＭＰの動物細
胞におけるプレーＴＩＭＰの発現は、ハウツー（ｈｏｗ
ｌｅｙ）ら（米国特許 第４，４１９．４４６号、１９８３）によって記載され
ているようなベクターまたは他の非ウィルス性ベクター
を用いて行われた。必要なりＮＡの増殖は標準方法〔マ
ーニアテイス（Ｈａｎｉａｔｉｓ）ほか、１９８２、コ
ールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒｔａｂｏｒａｔｏｒｙ
）　、ニューヨーク〕を用いて達成された。ブレーＴＩ
ＭＰをコードするＤＮＡ配列は第２項に述べ第３図に示
したＤＮＡから切取り、ＴＩＭＰ停止コドンに隣接する
３’ｌ−１ｉｎｆｌサイト（ヌクレオチド６８６〜６９
０）をリンカ−で３ａｍＨＩサイトに変換した。同様に
、ＡＴＧ開始コドンに隣接する５’ＮＣ０Ｉサイト（ヌ
クレオチド６２〜６７）を（内部にＮｃｏ　Ｉサイトが
あるので部分ＮＣＯＩ消化後）リンカ−でＨｉｎｄｌ［
Ｉサイトに変換した。ついで全プレーＴＩＭＰコード配
列を、第５図に示すようなウシ乳頭腫ウィルスに基づく
ベクター中、ネズミメタロチオネイン（ＭＭＴ）プロモ
ーターとＳＶ４０初期転写ポリアデニル化シグナルの間
にインサートした。このプラスミドはｐＴＩＭＰ−１と
命名された。

ｐＴＩＭＰをＣ１２７細胞〔ロウイ（ｔ’ｏｗｙ＞ほか
、ジャーナル・オブ・パイロロジ−（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　）　、　２６．２９１〜２９８　（１９
７８）　）にリン酸カルシウム共沈殿（グラハムはか（
Ｇｒａｈａｒａ　＆　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　）　、バ
イ００ジー（ＶｉｒｏｌｏｇＶ）　、５２　、４５１〜
４６１（１９８３））によってトランスフェクションし
たのち、ｃｄＣ１２（２０μＭ）およびＺｎＣｊ！２　
　（２０μＭ）抵抗性フォーカスを選択した。血清を含
まない培地中で１６時間生育させたのち、ＴＩＭＰを分
泌する能力をＴＩＭＰに対する固定化特異的抗体に基づ
く競合的ＲＩＡ（ヘンブリーホか（Ｈｅｍｂｒｙ、　Ｈ
ｕｒｐｈｙ　＆　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ　）、ジャーナル・
オブ・セル・サイエンス（Ｊ、　Ｃｅ１ｌＳｃｉ、）　
、７３．１０５〜１１９　（１９８５））、ウェスタン
・プロッティングおよびＣＣＬ１５３細胞上清について
前述したコラーゲン細線維アッセーによって測定した。

精製ヒト羊水ＴＩＭＰに反応し、ウシまたはネズミＴＩ
ＭＰとは交差反応しないことが知られているＲＩＡ利用
ポリクロナール抗体〔ヘンブリーはか（Ｈｅｍｂｒｙ、
　Ｈｕｒｐｈｙ　＆Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）　、ジャーナル
・オブ・セル・サイエンス（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｓｃｉ
、　）　、７３．１０５〜１１９（１９８５））が、Ｐ
ＴＭＰ−１１−ランスヘエクション細胞系の一部におい
て、ＣＤＮＡをインサーとしていないプラスミドでトラ
ンスフェクションを行った対照細胞に比べて２００倍に
増加していることが検出された。１．５〜２．０μｇ／
〆までの最高収率が達成される。

さらに、ウェスタンプロティングの結果は、トランフエ
クションを行ったＣ１２７細胞から分泌されたＴＩＭＰ
がヒト羊水から精製した標品ＴＩＭＰと同一のＭｒを有
することを示しており、これは、これらの細胞中で、組
換えＴＩＭＰが正しく処理され、グリコジル化されてい
ることを示唆する（第７図、トラック４）。Ｃ１２７細
胞中で生成した免疫反応性ＴＩＭＰが生物学的活性か否
かを調べるために、コラーゲン細線線アツセー〔マーフ
ィー（Ｈｕｒｐｈｙ）ほか、ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　）　、１９
５．１６７〜１７０　（１９８１））を用いてウサギ皮
膚コラーゼナーゼの阻止能力を試験した。ＲＩＡにおい
て検知できる皇のＴＩＭＰの産生を示さなかった細胞の
上清からは活性は検出できなかった。

しかしながら、ＲＩＡにおいて５００ｎ（Ｊ／ＩＩＩ以
上のＴＩＭＰの産生を示した細胞の上清からは２〜５Ｕ
／ｄが検出され、これはＣ１２７細胞中でｐＴＩＭＰ−
１は活性ＴＩＭＰの合成を行っていることを示している
。ρＴＩＭＰを含有する細胞系をさらに改良することに
より、活性ＴＩＭＰの収率は５μｇ／−以上に達した。

３．６．動物細胞からのＴＩＭＰの精製上に述べたよう
にして動物細胞に発現したブレーＴＩＭＰは細胞膜を通
して分泌され、ここでシグナルペプチドが切断されて成
熟ＴＩＭＰが遊離する。これは上述の３．２．において
述べたようにして組織培養培地から測定され、精製でき
る。

ヘパリンセファロースおよびゲル濾過クロマトグラフィ
ーにより（マーフィー（Ｎｕｒｐｈｙ、Ｇ）はが、１９
８１、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｊ、　　）　、１９５．１６７〜１７０）、ヒト線維
芽細胞ＴＩＭＰを精製し、哺乳類動物細胞内に発現した
組換えヒトＴＩＭＰを部分精製した。組換え生成物は生
化学的アツセーおよびＥＬＩＳＡにおいて天然ヒトＴＩ
ＭＰに匹敵した。

生物学的活性を試験するため、−次ＶＸ２ウサギ腫瘍細
胞を１４ｃ−標識タイブＩコラーゲン股上で継代培養し
た。

材料：ヒトプラスミノーゲン（２０力ゼイン単位／ｍ）
はカビ社（にａｂｉ　Ｄｉａｏｎｏｓｔｉｃａ。

Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、　Ｓｗｅｄｅｎ　）から購入した
。その他のすべての材料はすでに報告されている〔マー
フィーはか（Ｇ、　Ｈｕｒｐｔ＋ｙ、　Ｔ、　Ｅ、　Ｃ
ａｗｓｔｏｎ　＆　Ｊ、　Ｊ。

Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）　、１９８１　、バイオケミカル・
ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　　）　、１９５
．１６７〜１７０：ヘンブリーほか（Ｈｅｍｂｒｙ、　
Ｒ，Ｈ，、Ｈｕｒｐｈｙ、　Ｇ、。

Ｃａｗｓｔｏｎ、　Ｔ、　Ｅ、、Ｄｉｎｏｌｅ、Ｊ、　
Ｔ、　＆　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、Ｊ、Ｊ、）、１９８５、
ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ
　Ｓｃｉ、）　、投稿中；ヘンブリーほか（Ｈｅｍｂｒ
ｙ、　Ｒ，Ｈ，、Ｈｕｒｐｈｙ、Ｇ、　＆　Ｒｅｙｎｏ
ｌｄｓ。

Ｊ、Ｊ、）、１９８５、ジャーナル・オブ・セル・サイ
エンス（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ　、　）　、７３．１
０５〜１１９；セラーズほか（Ｓｅｌｌｅｒｓ、　Ａ、
　＆Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、Ｊ、Ｊ、　　）　、１９７７、
バイオケミカル・ジャーナル（８ｉｏｃｈｅｓ、　Ｊ、
　）　、１６７．３５３〜３６０　；　トレクセルほか
（Ｔｒｅｃｈｓｅｌ、υ、　、　Ｄｅｖ。

Ｇ、、Ｈｕｒｐｈｙ、Ｇ　　、＆　　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ
、Ｊ、Ｊ、　　）　　、　１　９８２、ビオシミ力・工
・ビオフイジ力・アクタ（８ｉｏｃハｉｍ、　　８ｉｏ
ｐｈｙｓ、　　Ａｃｔａ）　　、　７　２０．　３　６
４〜３７０〕。

ＶＸ２腫１細胞：ウサギＶＸ２癌腫は、最初キッドほか
（にｉｄｄ、　Ｊ、Ｇ、　＆　Ｒｏｕｓ、Ｐ、）　ニよ
ッテショーブ乳頭腫ウィルスで誘発された〔ジャーナル
・オブ・エスクベリメンタル・メデイシン（Ｊ、　　Ｅ
ｘｐ、　Ｒｅｄ、）　、７ユ、８１３〜８３７（１９４
０））が、現在はウィルスとは関係がない。実験に用い
た原腫瘍はガラスコ（Ｃ，Ｓ、　Ｂ。

Ｇａ１ａｓｋｏ　）教授および共同研究者〔デパートメ
ント・オブ・オルソペデイツク・サージエリ−、ユニバ
ージティー・オブ・マンチェスター（Ｄｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔ　ｏｆ　０ｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ
。

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｈａｎｃｈｅｓｔｅｒ）
　、ホープ・ホスピタル（Ｈｏｐｅ　１ｌｏｓｐｉｔａ
ｌ　）　、Ｅｃｃｌｅｓ　Ｏｌｄ　Ｒｏａｄ　。

５ａｌｆｏｒｄ、　Ｕに〕から恵与され、ニューシーラ
ント白色ウサギの大腿筋に連続移植して維持した。これ
は常に肺に転移した。移植後２〜３″ｉＡで動物を層殺
し、腫瘍を摘出した。−次腫瘍細胞は腫瘍から細胞をほ
ぐし、１０％ウシ胎仔血清（Ｆｅ２）を補充したダルベ
ツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中０．２Ｘ１０　　
細胞／ｃＩ１２になるように平板上に置いた。７〜１０
日後に一次腫瘍２＋ 細胞をコラーゲン膜上、Ｃａ　７Ｍｇ２＋を含まないリ
ン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ−Ａ）中で０．０２％ＥＤＴＡ
を用いて継代された。−次継代腫瘍細胞（０，５ｘｌＯ
６）を・クサギ大腿筋に注射すると４週後に触知できる
！！瘍が形成された。

コラーゲン膜：ジョンソンーウィンドの方法（ジョンソ
ン−ウィンド（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｈｉｎｔ、　Ｂ、　）
、１９８０、アナリテイカル・バイオケミストリー（Ａ
ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、）　、１０４．１７５〜
１８１）を改良して、放射標識コラーゲン膜を１１製し
た。

１４Ｃ−標識タイブ■コラーゲン（ラット皮膚、１５０
μ９）を、ｌＱｍＨリン酸塩、３００　ｍ８食塩、０．
０２％アジド中にとり、その一部（３００μ、ｉりを２
　ｃｔｘ径のリンプロウェル中に広げた。このプレート
を３７宅で乾燥させ、２回滅菌蒸留水で洗浄し、１回血
清を含まない培地で洗浄した。

細胞を１０％ＦＯ８含有ＤＭＥＭ中、洗浄膜上に各ウェ
ル１０５個になるように置いた。２４時間後に細胞層を
静かに血清を含まない培地で洗浄し、２％ウサギ血清〔
プロテアーゼインヒビターが無視できるレベルのものを
選択；トレクセル（Ｔｒｅｃｈｓｅｌ　）ほか、１９８
２）含有ＤＭＥＭを各ウェルに加えた。２日後に各ウェ
ルの培地を集め、未消化コラーゲンを除くために遠心分
離し、膜から放出された放射能を液体シンチレーション
カウンターで測定した。ウェル内に残った分解されてい
ないコラーゲンを細菌コラ−ゲナーゼ５０μ３で一夜分
解し、放射能を測定した。これらのデータから、各フィ
ルムからの放射能の放出％を計算した。コラーゲン膜の
非特異的分解の可能性はコラーゲン膜をトリプシン１０
μｇ／ウェルとインキュベートして評価した。放射能の
放出は１５〜２０％で、慣用の細線維アツセーで実施し
た類似のトリプシンブランクの場合に匹敵するものであ
った。一部のウェルは、精製ウサギ骨コラーゲナーゼに
対してヒツジに生じさせた特異的ポリクロナール抗体〔
ヘンブリー（ｌｌｅｍｂｒｙ）ほか、前出）または正常
ヒツジ血清Ｉ９Ｇで処理した。

コラ−ゲナーゼ活性およびＴＴＭＰのアツセー：コラー
ゲナーゼおよびＴＩＭＰのアツセーは既報の方法〔セラ
ーズばか（Ｓｅｌｌｅｒｓ　＆　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）、
１９７７、前出〕に従って実施した。１単位のコラ−ゲ
ナーゼは３５℃で１分間に１μＪのコラーゲンを分解す
る。ＴＩＭＰは活性化ウサギコラ−ゲナーゼの阻害によ
って評価した。１単位は２単位のコラ−ゲナーゼを５０
％阻害するＴＩＭＰｆｆｌと定義した。

２日後に、培地をメタロプロテアーゼに対する阻害活性
が低い血清を含む培地に交換した。ついで対照緩衝液ま
たは純粋なヒト線雑芽細胞ＴＩＭＰ（２単位／ウェル）
もしくは部分精製組換えＴＩＭＰ（２単位／ウェル）を
培地に加え、さらに２日間培養を続けた。ならし培地の
一部をとり、シンチレーションカウンターでカウント数
を測定してゲル分解を評価し、阻害を第２表および第８
図に示すように計算した。第２表に示した２つの実験例
は、天然および組換えＴＩＭＰ活性　４・が類似するこ
とを例示するものであり、第８図は組換えＴＩＭＰ単独
での他の実験を例示するものである。第８図には３回の
実験の平均値を示した。

第２表 実験１ 対照緩衝液　　　　３５５ｏ±２８０ 純粋ヒトＴＩＭＰ　　　７０９＋７６　　　８０実ｗＡ
２ 対照緩衝液　　　　８４５６±１０３５組換えＴＩＭＰ
　　　　７６４±２９　　９１本発明を以上、実施例に
より説明したが、これは単に本発明を例示するもので、
細部Ω改変は本発明の範囲内に包含されるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒト胎仔肺線維芽ａｒｍおよびヒト羊水ＴＩ
ＭＰ（ａ）、ヒト皮膚線維芽細胞コラーゲナーゼインヒ
ビター（ｂ）のＮ末端アミノ酸配列、ならびに６９塩基
からなるオリゴヌクレオチドプローブの配列（Ｃ）、１
８塩基の相補的配列（ｄ）である。 第２図は、はぼ完全な鎖長のＣＤＮＡと１個の付加的重
複ｃＤＮＡの５′末端（破線）から編集したヒトＴＩＭ
Ｐ　　ｃＤＮＡの制限酵素地図である。 第３図は、ヒトＴＩＭＰ　　ｃＤＮＡのヌクレオチド配
列および予測されるアミノ酸配列である。 第４図は、大腸菌発現ベクターｐＭＧ４５４の制限酵素
地図である（黒くつぶした部分は６１　ｂｐのリンカ−
を示す）。 第５図は、哺乳類動物細胞の発現ベクター１）Ｔ　ＩＭ
Ｐ−１の制限酵素地図である。 第６図は、ｐＭＧ４５４で形質転換された大腸菌Ｅ１０
３Ｓ中に作られた蛋白質を１２％ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に付し、クーマー・シーブルー染色し
た結果を示す（レーン１：マーカー蛋白質、レーン２：
ＴＩＭＰ　　ｃＤＮＡインサートをもたない発現ベクタ
ーを含む非誘導対照細胞、レーン３：誘導対照細胞、レ
ーン４：１）ＭＧ４５４を含む非誘導Ｅ１３０Ｓ細胞、
レーン５：レーン４と同じ誘導細胞、レーン６：精製大
腸菌β−ラクタマーゼ）。 第７図は、・クエスタンプロツテイング後に得られたオ
ートラジオグラフィーを示す（レーン１および２：第６
図におけるレーン４および５に同じ、レーン３：精製ヒ
ト羊水ＴＩＭＰ、レーン４：ｐＴＩＭＰ−１でトランス
フェクションを行ったＣ１２７細胞系の培養上清からの
蛋白質）。 第８図は、ウサギ腫瘍細胞によって生じるコラーゲンフ
ィルムの分解に対する組換えＴＩＭＰの阻害を示す棒グ
ラフである。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）メタロプロテアーゼインヒビターをコードする遺
   伝子を含むベクターで形質転換した宿主細胞を培養する
   ことを特徴とするメタロプロテアーゼインヒビターの製
   造方法
2. （２）メタロプロテアーゼインヒビターはメチオニン−
   メタロプロテアーゼインヒビターである特許請求の範囲
   第１項記載の製造方法
3. （３）メタロプロテアーゼインヒビタープレカーサーを
   コードする遺伝子を含むベクターで形質転換した宿主細
   胞を培養してメタロプロテアーゼインヒビターのプレカ
   ーサーを製造し、このプレカーサーを切断してメタロプ
   ロテアーゼインヒビターを生成させることを特徴とする
   メタロプロテアーゼインヒビターの製造方法
4. （４）メタロプロテアーゼインヒビタープレカーサーは
   プレメタロプロテアーゼインヒビターであり、宿主細胞
   はプレメタロプロテアーゼインヒビターを切断してメタ
   ロプロテアーゼインヒビターを産生できる宿主細胞であ
   る特許請求の範囲第３項記載の製造方法
5. （５）メタロプロテアーゼインヒビタープレカーサーは
   、異種蛋白質とメタロプロテアーゼインヒビター蛋白質
   からなる融合蛋白質である特許請求の範囲第３項記載の
   製造方法
6. （６）メチオニン−メタロプロテアーゼインヒビター
7. （７）プレメタロプロテアーゼインヒビター
8. （８）異種蛋白質とメタロプロテアーゼインヒビターか
   らなる融合蛋白質
9. （９）メタロプロテアーゼインヒビター、メチオニン−
   メタロプロテアーゼインヒビター、プレメタロプロテア
   ーゼインヒビターまたは異種蛋白質とメタロプロテアー
   ゼインヒビターからなる融合蛋白質のアミノ酸配列をコ
   ードする遺伝子
10. （１０）第３図に示した６４から６８４までのヌクレオ
    チド配列を実質的に有する特許請求の範囲第９項記載の
    遺伝子
11. （１１）第３図に示した１３３から６８４までのヌクレ
    オチド配列を実質的に有する特許請求の範囲第９項記載
    の遺伝子
12. （１２）特許請求の範囲第９項から第１１項までのいず
    れかに記載の遺伝子を含有するベクター
13. （１３）特許請求の範囲第１２項記載のベクターで形質
    転換された宿主細胞
14. （１４）メタロプロテアーゼインヒビターおよび医薬的
    に許容される賦形剤からなる医薬組成物
15. （１５）プラスミドｐＭＧ４５４、ｐＭＧ４５６、ｐＭ
    Ｇ４５７、ｐＭＧ４６８またはｐＭＧ４６１およびそれ
    らの誘導体
16. （１６）プラスミドｐＴＩＭＰ−１およびそれらの誘導
    体