KR20000022350A - 세린 프로티아제 억제제 - Google Patents

세린 프로티아제 억제제

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KR20000022350A
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마이클 핀바르 스쿨리
크리스토퍼 앤드류 구드윈
비제이 비르 카카르
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카카 산자이 케이
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Abstract

본 발명은 이작용성 세린 프로티아제 억제제 및 붕소 함유 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 세린 프로티아제 억제제는 세린 프로티아제의 활성부위에 결합하여 이를 억제하는 촉매 부위 지향성 잔기, 및 연결 잔기에 의해 연결되는 외부부위 결합 잔기를 포함한다. 촉매 부위 지향성 잔기 및 외부부위 결합 잔기는 동시에 세린 프로티아제의 분자에 결합할 수 있다.

Description

세린 프로티아제 억제제
세린 프로티아제 억제제의 조절 또는 억제는 특히 혈전증의 예방에 유용하다.
세린 프로티아제 효소 부류는 효소의 활성 부위에 Asp-His-Ser 잔사의 촉매적 3개의 아미노산 잔기를 포함하는 작용기작에 의해 펩티드 결합을 절단한다. 세린 프로티아제 억제제는 이 3개의 아미노산 잔기와 상호작용하여 효소 기질의 활성화를 방지하는 작용기를 이용하도록 고안되어왔다. 오직 1개의 목적 프로티아제에만 선택적인 억제제를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 펩티드 억제제에 대한 종래 분야의 설명은 본원과 같은날 출원된 발명의 명칭이 "Thrombin Inhibitors"인 영국 특허원 및 제 PCT/GB96/00352 호의 명세서에서 발견할 수 있다. 발명의 명칭이 "Thrombin Inhibitors"인 특허원의 명세서의 사본이 함께 출원되어 있다. 이 특허원의 내용은 발명의 명칭이 "Thrombin Inhibitors"인 특허원의 대상을 포함하지않으며, 이 특허를 숙련된 이들은 본원에 참고된 다양한 종래 문헌과 함께 참고할 수 있다. "Thrombin Inhibitors" 명세서는 본원의 공개된 명세서의 일부를 형성하지않는다.
일부 세린 프로티아제는 기질의 음이온 부분에 결합하기위한 제 2 부위 또는 "외부부위"를 갖는 것으로 공지되어있다. 이 외부부위는 종종 음이온 결합 외부부위("ABE")로서 언급된다.
세린 프로티아제 기질의 끊어지기 쉬운 결합의 카보닐 기를 제공하는 아미노산 잔기는 "P1"으로 명명된다. 잔기 P1의 N-말단 잔기쪽의 후속 아미노산 잔기는 P2, P3, P4 … 식으로 언급되고, 잔기 P1의 C-말단쪽의 아미노산 잔기는 "P1', P2', P3' …으로 명명된다. 피브리노겐에서는, P1'이 글리신이고 P2'이 프롤린이다. 프로티아제는 P1 아미노산의 측쇄를 인식하는 "특이성 공간"을 갖는다. 트립신형 프로티아제는 일반적으로 아르기닌형 또는 세린형 측쇄를 갖는 P1 잔사를 인식한다.
본 발명은 세린 프로티아제(protease) 억제제 및 기질, 및 이런 화합물의 합성법 및 붕소 함유 화합물의 합성에 대한 신규한 방법 및 물질에 관한 것이다.
도 1은 메리필드(Merrifield) 수지의 푸리에 전환 적외선(F.t-I.R.) 스펙트럼이다.
도 2는 나트륨 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올레이트와의 반응후의 동일한 수지의 F.t-I.R. 스펙트럼이다.
도 3은 HCl로 처리하여 디옥솔란의 하이드록실기를 탈보호시킨 후의 반응된 수지의 F.t-I.R. 스펙트럼이다.
도 4는 페닐보론산과의 반응후의 탈보호된 수지의 F.t-I.R. 스펙트럼이다.
본 발명은 (a) 세린 프로티아제의 활성 부위에 결합하여 이를 억제하는 촉매 부위-지향적 잔기(CSDM), (b) 외부부위 결합 잔기(EAM), 및 선택적으로 (c) EAM과 CSDM사이에 결합된 연결 잔기를 포함하는 신규한 이작용성 세린 프로티아제 억제제를 제공하며, 이때 CSDM과 EAM은 세린 프로티아제 분자에 동시에 결합할 수 있다.
억제제의 한 군에서, 세린 프로티아제는 트롬빈이 아니다. 세린 프로티아제는 바람직하게는 트립신형 프로티아제이다. 임의의 경우에, 억제제는 연결 잔기가 그의 C-말단 확장으로써 CSDM에 결합된 트롬빈 억제제를 포함하지않고, 즉, 미국 특허 제 5196404 호 및 상응하는 국제 특허 제 WO 91/02750 호에 개시된 화합물이 아니다.
다른 양태에서, 본 발명은 붕소 함유 펩티드를 제조하는 신규한 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 "천연" 아미노산은 단백질에서 발편되는 20개의 통상적이거나 "표준" α-아미노산중 하나로부터 선택되는 L-아미노산(또는 그의 잔사)을 의미한다.
"비천연" 아미노산은 20개의 "표준" 아미노산이 아닌 임의의 α-아미노산(또는 이의 잔사)를 의미한다. 따라서 비천연 아미노산은 천연 L-아미노산의 D-이성질체 및 측쇄 보호기를 갖는 아미노산을 포함한다.
접두사 "D" 및 "L"은 일반적으로 각각 D- 또는 L- 배위의 아미노산을 나타낸다. "D, L-" 접두사는 라세미 혼합물을 나타내고, 접두사가 없는 것은 아미노산이 D- 또는 L- 배위중 어느 하나일 수 있음을 의미하고, 단 달리 언급되지않는한 실시예에서 잔사는 L-배위이다. 본문에서 배위가 규정되지않은 기들의 경우 D- 또는 L- 배위가 가능하고, L-배위가 바람직하다.
접두사 "보로"가 붙는 약자 및 용어는 말단 카복실 기 -CO2H가 붕소 작용기로 치환된 아미노산을 나타낸다.
이제, 본 발명의 화합물 및 방법을 보다 자세히 설명하겠다.
촉매 부위-지향적 잔기(CSDM)
촉매 부위-지향적 잔기(CSDM)는 세린 프로티아제 효소의 활성 부위에 결합하여 불활성화시킨다. CSDM의 구조는 본 발명에 결정적이지않다. 세린 프로티아제 촉매 부위의 임의의 공지된 억제제의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면 CSDM의 한 군은 하기 화학식 I을 포함한다:
X-(aa4)m-(aa3)n-(aa2)-(aa1)-Z
상기 식에서,
aa1, aa2및 aa3은 천연 또는 비천연 산 잔사를 나타내고,
(aa4)m의 하나이상의 선택적 아미노산 잔사는 aa3의 아미노산에 결합된다. 다르게는, 임의의 하나이상의 aa기는 α-수소가 치환체에 의해 치환된 아미노산 잔기의 동족체일 수 있다. 아미노산 및/또는 아미노산 동족체의 서열은 세린 프로티아제 활성 부위에 결합한다. 적합한 서열은 명세서의 후반에 개시되고,
X는 H 또는 N-말단 아미노기상의 치환체이고,
Z는 -COOH 또는 당분야에 공지된 C-말단 연장기(카복실 치환기)이고, 바람직한 화합물에서 Z는 이종 원자 산 기, 예를 들면 -B(OH)2, -P(OH)2, PO(OH)2, 또는 이의 유도체이고, 예를 들면 카복실산 에스테르, 디옥소-보로네이트 [-B(O치환체)2] 또는 포스페이트 [-PO(O치환체)2] 또는 BF2이고, 바람직한 이종 원자 동족체 기는 -B(OH)2및 -P(O)(OH)2이고, 덜 바람직한 이종원자 동족체 기는 S(O)2OH이고, 다른 바람직한 Z 기 중에서는 -CN, -COCH2Cl 및 -COCH2F가 언급될 수 있다. 바람직한 양태에서는, m은 0 내지 7이고, 보다 바람직하게는 0 내지 5, 예를 들면 0, 1 또는 2이고, 특히 0이고, 일반적으로 n은 1이다.
화합물의 한 군에서, (aa2)-(aa1) 천연 펩티드 결합은 다른 결합(ψ)에 의해 치환된다. 추가로 또는 다르게는 다른 천연 펩티드 결합은 다른 결합에 의해 치환될 수 있다.
세린 프로티아제의 촉매 부위 억제제는 당분야에 잘 공지되어있다. 세린 프로티아제 억제제, 즉 세린 프로티아제 촉매 부위의 억제제의 짧은 개론은 제 EP-B-145441 호에서 발견되고, 이 특허는 C-말단 붕소 기를 갖는 세린 프로티아제 군을 개시한다. 세린 프로티아제 억제제를 개시하는 다른 특허 명세서는 제 EP 293881 호, 제 EP 471651 호(미국 특허 제 5288707 호에 상응함), 제 EP 235692 호 제 US 4963655 호 및 제 WO 89/09612 호(특히 [TF:VII/VIIa] 착체에서의 인자 VII/VIIa의 억제제에 대해)를 포함한다.
트립신형 효소의 억제제의 경우, CSDM의 P1 잔사의 바람직한 군은 (i) Arg, Lys 및 이들의 동족체, 및 (ii) 소수성 잔기이고, 또한 다른 트립신형 효소에 대한 트롬빈에 대한 바람직한 P1 기의 개시는 발명의 명칭이 "Thrombin Inhibitors"인 전술된 명세서 및 제 PCT/GB96/00352 호에서 발견될 수 있다. 키모트립신형 세린 프로티아제는 P1 잔사에 페닐알라닌형 및 알라닌형 측쇄를 갖는 CDSM에 우선적으로 결합한다. 하기 표 1은 8개의 특정한 세린 프로티아제에 대한 가장 바람직한 (P4)P3P2 잔사를 나타낸다.
효소 잔사 서열
트롬빈 D-Phe-/치환된 D-Phe-/D-Dpa-/Dba-/Pms-/α-Nal-/β-Nal-/TMSal-/Chg-/Phg-/D-Tiq-/D-Try의 파라에테르/NaSO2-Pro
인자 Xa IleuGlyGly, PyroGluGly, ArgGly, ChaGly, LeuArg
인자 VIIa L-PhePhe, NalPhe, D-TiqPhe, NalThr, NalPhg
인자 IXa ValVal
인자 XIa γ-BzlGluGly, Glu(OBzl)Ala, GlyArg, GlyLys
인자 XIIa GlnGly
유로키나제 PhePro, GluGly
단백질 Ca LeuSerThr
각각의 경우, 바람직한 아미노산은 그의 동족체로 치환될 수 있다.
외부부위 결합 잔기(EAM)
외부부위 결합 잔기(EAM)는 세린 프로티아제의 외부부위(ABE)에 결합하는 잔기이다. 트롬빈은 트롬빈 분해 부위에 결합하는 피브리노겐 아미노산 서열 C-말단에 추가하여 히루딘과 같은 트롬빈의 비-기질 리간드에 결합하는 잘 정의된 외부부위를 갖는다. Hir53-64와 같은 히루딘 서열은 "히룰로그(hirulogs)"로 명명된 이작용성 펩티드에서 사용되어왔다. 이 히룰로그는 제 US5196404 호에 개시되어있고 트롬빈 EAM의 또다른 개시는 발명의 명칭이 "Thrombin Inhibitors"인 전술된 영국 특허원에서 발견될 수 있다. 트롬빈에 대한 EAM은 종종 "음이온 결합 외부부위 결합 잔기(ABEAM)"로 언급된다.
FXa의 결정 구조에 대한 결과(파드마나브한(Padmanabhan K) 등의 문헌["Structure of Human Des(1-45) Factor Xa at 2.2Å Resolution", J. Mol. Biol., 1993, 232, 947-966])는 8개의 산성 잔기를 함유한 서열 35 내지 41 및 70 내지 81가 양이온 결합 외부부위를 구성함을 나타낸다. 천연 폴리펩티드 억제제 안티스타신(antistasin) 및 길란텐(ghilanten)은 각각 전자양성 양이온 외부부위 결합 서열108CRPKRKLIPR117및108CKPKRKLVPR117을 함유한다.
P' 부위(분해부에 대해 C-말단)에서의 세린 프로티아제 상호작용이 P 부위에서의 것들과 같이 특이성에 중요할 수 있고(예를 들면 딩(Ding, L.), 쿰브스(Coombs, G.S.), 스트란드버그(Strandberg, L.), 나브르(Navre, M.), 코레유(Coreyu, D.R.) 및 매디슨(Madison, E.L.)의 문헌[Origins of the Specificity of Tissue-type Plasminogen Activator, Proc. Natl. Acad. Sci., 1995, 92, 7627-7631]을 참조할 수 있다), 라이브러리 스크리닝으로부터 쉽게 수득되는 바와 같이 더 많은 리간드가 양 부위에 걸쳐 비교하기 위해 필요하다. 최근에(로손(Lawson), 1992), 상당한 P' 및 P 결합 단위를 함유하는 펩티드 서열의 스크리닝이 존재하는 기질이 너무 민감하지않았던 곳에서의 FVIIa/TF 활성의 검출을 가능하게 함을 나타낸다. 펩티드 라이브러리는 다양한 특허원(예를 들면 에이클러(Eichler), 1994)에서의 생물학적 활성에 대한 스크리닝에 대한 높은 효율을 나타내고 본 발명에 유용하다.
본 발명은 하기와 같은 EAM을 형성하는 다른 세린 프로테이나제(proteinase) 기질의 분해점의 C-말단 서열을 고려한다.
효소 천연 기질 분해 부위(-)
인자 Xa 프로트롬빈 YIDGR-JVEGSDAEIGMSPWQ
인자 Xa 프로트롬빈 AIEGR-TATSEYQTFFNPRTFGS
인자 Xa 인자 VII SKPQGR-IVGGKVC
인자 VIIa 인자 X NLTRR-IVGGQECKDGEC
인자 IXa 인자 X NLTRR-IVGGQECKDGEC
인자 XIa 인자 IX SKLTR-AEAVFPDVDYVN
인자 XIa 인자 IX FNDFTR-VVGGEDAKPGQF
인자 XIIa 인자 XI KIKPR-IVGGTASVRGE
인자 XIIa 혈장 칼리크레인 KTSTR-IVGGTNSSWGE
단백질 Ca 인자 VIII ELR-MKNNEEAEDYDDDLTDSEMD
t-PA/UK 플라스미노겐 PKKCPGR-VVGGCVAHPHSWPWQVSLRT
연결 잔기
본 발명의 화합물은 CSDM과 EAM을 연결하는 연결 잔기를 함유할 수 있고, 연결 잔기는 CSDM 및 EAM이 개별적인 세린 프로테이나제 억제제의 분자에 동시에 결합할 수 있게한다. 트롬빈의 경우, 연결 잔기는 N-말단 연장으로서 또는 그의 측쇄를 통해 CSDM에 결합된다.
연결 잔기는 C-말단 연장, 또는 다르게는 N-말단 연장 또는 측쇄를 통해서 CSDM에 결합될 수 있다. 그러나, 화합물이 트롬빈 억제제이면, 연결 잔기는 CSDM의 C-말단 연장부가 아닐 수 있다.
특히, 연결 잔기가 CSDM의 N-말단 연장부이거나, 또는 그의 측쇄에 포함되는 경우, 예를 들면 N-말단에 2개이상의 인접한 Gly 잔기를 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 화합물의 한 군에서, 연결자는 바람직하게는 펩티드 "이격자" 및 비-펩티드 "링커(linker)"를 포함한다. 대표적인 연결 구조는 하기 화학식 II를 갖는다:
-λ-σ-
상기 식에서,
λ는 비-펩티드 링커를 나타내고,
σ는 아미노산의 서열을 포함하는 이격자이고,
λ 및 σ은 적합하게는 펩티드 결합에 의해 연결된다.
비록 σ가 CSDM에 연결되고, λ가 EAM에 연결되는 덜 바람직한 양태를 형성하는 화합물이 본 발명에 포함되기는 하지만, 이격자 σ는 바람직하게는 EAM에 연결되고, 링커 λ는 CSDM에 연결된다.
링커는 전형적으로 이격자의 N-말단 아미노 기 및 CSDM의 작용기, 예를 들면 N-말단 기와 반응하는 작용기를 갖는 화합물의 잔기이다. 따라서 바람직한 링커는 2개의 카복실레이트 기를 가지며, 예를 들면 CSDM 및 이격자의 N-말단 아미노기와 아미드 결합을 형성할 수 있는 디카복실산이다. 특히 바람직한 링커는 글루타르산 (HO2C(CH2)3CO2H)의 잔사 및 화학식 (HO2C(CH2)hCO2H)(이때, h는 2 또는 4 내지 6의 정수이다)의 동족체이다. 알킬렌 잔사 [-(CH2)2-6-]은 링커를 공간적으로 방해하지않는 하나이상의 치환체에 의해 치환될 수 있고, 이에 의해 링커의 바람직한 가요성이 유지된다.
덜 바람직하게는, 링커는 예를 들면 탄소 원자가 2 내지 6개의 원자에 의해 분리된 2개의 카복실 기를 갖는 다른 화합물의 잔기를 포함할 수 있다.
이격자의 아미노산 서열은 본 발명에 결정적이지않지만, 바람직하게는 2개이상의 인접한 Gly 잔기를 통상적으로 그의 N-말단에 포함한다. 이격자의 길이는 특히 링커가 결합되는 CSDM상에서의 위치에 의존한다.
펩티드 트롬빈 억제제에 적합한 연결 잔기의 또다른 개시는 전술된 본원과 같은 날 출원된 발명의 명칭이 "Thrombin Inhibitors"인 영국 특허원에서 발견할 수 있다.
연결 잔기는 다른 연결에 의해 치환된 하나이상의 천연 아미드 결합을 가질 수 있다.
합성
본 발명의 화합물은 예를 들면 일반적으로 공지된 펩티드 합성 방법 및 커플링 펩티드에 의해 제조될 수 있다. 예시적인 방법에서, 신규한 화합물은 고상 합성 기술에 의해 제조된다.
고상 합성은 펩티드 화학자들에게 익숙한 기술이고 따라서 상세한 설명은 본원에 필요하지않다. 기술에 대한 설명은 문헌["The Chemical Synthesis of Peptides", John Jones, Clarendon Press, Oxford, England, 1991]에서 발견될 수 있다. 종래의 고상 합성의 원칙은 고상에 커플링되는 아미노산 또는 펩티드가 반응 자체에 대해서 보호되고, 고상에 링크된 아미노산과의 커플링된후, 반응 자체에 대해서는 보호된 또다른 아미노산과의 반응을 위해 탈보호되는 것이다. 이들 단계는 필요한 만큼 반복된다.
하나의 고상 합성 기술은 Fmoc기술(Fmoc는 플루오레닐메틸카보닐이다)이다. Fmoc화학에서(또한 일반적으로 '세파드(Sheppard) 접근'), 펩티드(또는 아미노산)의 카복시 말단은 반응 작용에 의해 종결되는 링커에 의해 수지 비드에 커플링된다. 비록 용매중에서 적합한 팽윤 특성을 갖는 다른 고형물을 사용할 수 있지만 수지 비드 자체는 전형적으로 폴리스티렌(PS)이고, 이는 펩티드 쇄가 비드의 내부상의 공극에서 성장하는 것이 이제 공지되어있기 때문이다. 다른 고형물의 예는 키에슬거(Kiesulguhr)로 언급되는 폴리아미드이다.
링커는 여러 가지일 수있지만, 본 출원인은 알콜 작용기를 갖는 PEG(즉, 폴리에틸렌 글리콜 링커)를 이용하는 것을 선호한다.
전형적으로 "핸들(handle)"로 언급되는 링커의 말단은 바람직한 생성물에 의존하지만 Fmoc화학의 경우 최종적으로 산에 의해 분해될 수 있는 잔기일 것이다. 가장 통상적인 말단(본출원인이 사용한)은 HMBA 또는 파라-하이드록시메틸벤조산 링커이다. HMBA는 PEG상에 에스테르화된 후, 펩티드 또는 아미노산(N-말단상에 Fmoc가 있는)이 반응하여 또한 HMBA에 에스테르 링커를 생성한다. 그런다음, 에스테르 링커는 산에 의해 분해된다. Fmoc보호기는 염기에 약하고 전형적으로 2차 염기(예를 들면 피페리딘)에 의해 제거되고, 생성된 유리 아미노기는 선택된 Fmoc-보호된 아미노산과 반응하고, 아미노산 서열은 이들 단계의 반복에 의해 연장된다.
다른 고상 합성 접근은 Boc 기술(Boc는 3차부틸옥시카보닐이다)이다. Boc 화학에 사용되는 수지(또한 보다 일반적으로는 메리필드 방법으로 공지되어있다)는 종종 디비닐벤질계이고, 예를 들면 '왕(Wang)' 수지는 2% 디비닐벤젠에 공중합되는 클로로메틸 벤젠을 갖는다. 클로로메틸 벤젠 기는 아미노산이 Boc로 보호된 아미노산 또는 펩티드와 반응하여 수지에 연결된다. 수지에 대한 링크는 전형적으로 무수 액상 HF에 의해 분해된다(매우 조심해야한다). 이는 '격렬한' 산분해로 개시된다. Boc 보호기는 산에 분해되기쉽고 전형적으로 생성된 유리 아미노기와 선택된 Boc-보호된 아미노산과의 반응 전에 TFA에 의해 분해되고; Fmoc화학에서와 같이 아미노산 서열은 이들 단계의 반복에 의해 연장된다.
따라서 2개의 전형적인 고상 펩티드 합성 방법(세파드 및 메리필드)은 카복시-말단 또는 이들의 유도체를 통한 고형 수지 입자에의 아미노산의 커플링 후, 생성된 N-말단에 새로운 아미노산(활성화된 카복시 말단을 통해)을 커플링시킴을 포함한다.
다르게는 최근 연구는 N-말단을 통해 수지에 커플링시킴, 예를 들면 산 분해성 벤질옥시카보닐 링크후, 카복시 말단을 유리시키고, 이들을 활성화시키고 N-말단을 통해 아미노산을 커플링시키고, 아미노산의 카복시 말단을 일시적으로 보호함을 나타낸다(샤마(Sharma, R.P.), 존스(Jones, D.A.), 브로드브릿지(Broadbridge, R.J.), 코리나(Corina, D.L.) 및 아크타(Akhtar, M.A.)의 문헌[Novel Method of Solid Phase Synthesis Of Peptide Analogues, in Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis, ed., R. Epton, 1994, Mayflower Worldwide Limited, Birmingham, page 353-356] 및 레티싱거(Letsinger, R.L.) 및 코르네트(Kornet, M.J.)의 문헌[J. Amer. Chem. Soc., 1963, 85, 3045]).
이런 N-말단 커플링 방법은 발명의 생성물을 제조하는데 이용될 수 있다. 한 양태에서는, 임의의 직접 결합된 아미노산(들)을 포함하는 CSDM은 N-말단 커플링에 의해 합성된다. 이 기술은 특히 CSDM이 C-말단 이종 원자 기를 갖는 경우 유용하며, 이 방법에서 N-말단 커플링을 통해 제조된 수지에 결합된 펩티드 쇄는 그의 카복시 말단을 활성화시키도록 유도화된 후, 유리 α-아미노보로네이트 에스테르 또는 산을 수지 결합된 서열에 커플링시킨다. 최종적으로 펩티드 보로네이트(CSDM을 포함하는)는 최종 생성물의 나머지에 연결되기 전에 강산(예를 들면 HF 또는 THF)에 의해 수지로부터 분해된다.
그의 CSDM이 P1-P2 비-천연 아미드 결합을 함유하는 화합물을 합성하는 경우, 결합 아부위(subsite) 친화성 잔기[화학식 1의 X-(aa4)m-(aa3)n-(aa2)] 및 그의 결합된 C-말단 기를 갖는 특이성 포켓 친화성 잔기[화학식 1의 (aa1)-Z]를 중간체로서 미리 제조하는 것이 편리하다. 2개의 중간체는 서로 반응하여 목적 비-천연 아미드 결합[ψ]을 형성하기에 적합한 작용기를 함유하고 서로 반응하여 화합물(또는 하나이상의 작용기 전환을 추가로 수행하기위한 이의 전구체)을 형성하게된다.
비-아미드 결합 ψ을 함유하는 펩티드를 제조하기에 적합한 합성 기술은 제 PCT/GB96/00352 호에 개시되어있다.
본출원인은 예상치못하게 고상 화학을 이용하여 펩티드 보로네이트 에스테르를 성공적으로 합성하였다. 예를 들면 연결 잔기 및 그에 결합된 EAM이 CSDM의 N-말단 연장을 형성하는 세린 프로테이나제 억제제의 합성을 위한 예시적인 방법에서, EAM은 Fmoc 고상 펩티드 화학에 의해 제조되고, 예를 들면 Fmoc-폴리아미드 연속 유동 방법을 이용하여 제조된다. 이 목적을 위한 적합한 고상은 미리 유도화된 고상 지지체 Fmoc-Leu-PEG-PS이다. 펩티드-공액 수지는 후속적으로 예를 들면 그의 하나의 카복실 기가 EAM의 N-말단 아미노 기와 반응하는 글루타르산 무수물로 처리된다. 예비 합성된 펩티드 보로네이트 CSDM은 수지/펩티드/글루타르산 공액물과 반응하여 최종 화합물을 형성하고, 이는 예를 들면 100% TFA로 처리되어 수지로부터 분해된다.
고상 화학에서 펩티드 보로네이트 에스테르를 이용하는 다른 방법은 보론산[-B(OH)2]이 수지에 커플링된 디올상에 직접 에스테르화되는 완전히 신규한 방법이다. 쇄 연장은 예를 들면 표준 Fmoc 방법에 의해 아미노산의 아미노 기로부터 연장된다. 보론산 에스테르는 산(예를 들면 TFA)에 의해 수지로부터 분해되어 펩티드 보로네이트[펩티드-B(OH)2]를 생성하거나, 예를 들면 피난디올과 같은 장애 디올의 농축 용액에 의한 트랜스에스테르화에 의해 수지로부터 분해된다.
따라서 본 발명은 목표 아미노산 서열을 제조하기위해 하기 단계 (i) 내지 (iv)를 수행함을 포함하는 본 발명의 화합물을 제조하는 방법을 포함한다:
(i) 아미노 기 또는 바람직하게는 카복실 기 또는 이의 반응성 유도체와 반응할 수 있는 작용기가 커플링되어있는 고상을 제공하는 단계;
(ii) 본 발명의 화합물의 아미노산 서열의 말단 아미노산의 아미노 또는 카복실 기(이는 이의 반응성 유도체의 형태일 수 있다)를 상기 작용기와 선택적으로 반응시키는 단계;
(iii) 목표 서열에서 상기 고상에 커플링된 선행 아미노산의 바로 다음 아미노산을 상기 선행 아미노산에 커플링시키는 단계; 및
(iv) 단계 (iii)을 필요한 만큼 반복하는 단계.
단계 (i)에서, 고상에 커플링된 작용기는 최종 생성 화합물에 혼입된 잔기상의 하나일 수 있고, 예를 들면 고상에 직접 또는 간접적으로 커플링된 아미노산의 아미노기(유도화될 수 있음)일 수 있다.
하나이상의 추가의 단계가, 종종, 본 발명의 화합물을 수득하기위한 방법에 포함될 수 있다. 따라서, 바람직한 방법은 경우에 따라, 아미노기와 반응할 수 있는 2개의 작용기를 갖는 화합물을 통해 단계 (iii)의 바로 다음 아미노산을 상기 단계의 선행 화합물과 커플링시켜 작용기중 하나가 상기 선행 아미노산의 아미노기에 결합되고 다른 것은 상기 바로 다음 아미노산의 아미노기에 결합시키는 단계 (v)를 포함할 수 있다.
단계 (iii)의 바로 다음 아미노산은 더 큰 잔기, 예를 들면 천연 펩티드 결합에 대한 치환체를 선택적으로 함유하는 아미노산 서열의 일부일 수 있다.
이 방법에서, 아미노기와 반응하는 임의의 하나이상의 카복실레이트 기는 이의 반응성 카보닐 함유 유도체, 예를 들면 활성화된 카복실 기, 예를 들면 산 무수물의 형태일 수 있다.
사용하기전에 고상 합성의 최종 생성물은 당분야에 공지된 방법 등에 의해 고상으로부터 분해된다. 분해된 화합물은 하나이상의 추가 화학 반응을 거쳐 최종 생성 화합물이 수득된다.
바람직한 양태에서는, 고상에 결합된 작용기와 반응하는 말단 아미노산은 EAM의 C-말단 아미노산이고, 단계 (iii)은 EAM 서열의 연속적인 아미노산 및 임의의 인접한 연결 펩티드의 연속적인 아미노산과 계속 커플링하여 방해받지않는 아미노산 서열을 형성한다.
고상과 커플링하는 방해받지않는 아미노산 서열의 최종 아미노산은 2개의 카복실레이트 기 또는 그의 반응성 유도체를 갖는 화합물, 예를 들면 디카복실산의 무수물과 반응하여 2개의 카복실레이트중 하나를 최종 아미노산의 아미노기에 결합시킬 수 있다.비반응된 카복실레이트 또는 카복실레이트 유도체는 전형적으로 아미노산의 아미노 기와 반응되고, 이는 일반적으로 CSDM의 N-말단 아미노산이다. 후자의 경우, 아미노산은 이미 CSDM의 나머지에 결합할 수 있고, 즉 CSDM은 비반응된 카복실레이트(유도체)에 결합되기위해 전체로서(또는 부분으로) 각각 제조될 수 있다. 2개의 카복실레이트 기를 갖는 화합물은 상기 개시된 바와 같은 바람직하게는 링커이다.
일부 바람직한 방법에서는, C-말단 카복시 기 대신에 이종 원자 기를 갖는 예비형성된 CSDM을 이용한다. 이종원자 기는 바람직하게는 상기 개시된 보로네이트 또는 보로네이트 유도체이다.
고상 물질(고상 및 임의의 결합된 분자)과 반응하는 아미노산 또는 임의의 잔기는 바람직하게는 고상 물질과 반응하는 기가 아닌 합성에 방해될 수 있는 그의 모든 반응성 기가 보호되어있다. 후속적으로 그자체가 반응되는 반응된 아미노산 또는 잔기의 임의의 보호된 작용기는 후속 반응전에 탈보호화된다.
따라서, 제 1의 바람직한 방법은
(i) 카복실 기 또는 이의 반응성 유도체와 반응할 수 있는 작용기가 커플링되어있는 고상을 제공하는 단계;
(ii) EAM의 C-말단 아미노산(이때, 아미노산은 보호된 아미노기 및 선택적으로 유도화된 카복실기를 갖고있어, 아미노산 분자의 카복실 기가 고상의 작용기와 반응할 수 있다)과 고상을 접촉시키는 단계;
(iii) 반응된 아미노산의 아미노 기를 탈보호시켜 고상이 유리 아미노 기를 갖게하는 단계;
(iv) EAM 및 선택적으로 인접한 이격자 펩티드의 후속적인 아미노산으로 단계 (ii) 및 (iii)을 반복하여 고상에 서열의 유리 말단에서의 EAM의 C-말단으로부터 이격자의 N-말단까지의 아미노산 서열을 제공하는 단계;
(v) 고상을 2개의 카복실 기 또는 이의 반응성 잔기를 갖는 링커 화합물과 접촉시키고, 링커 카복시 기 또는 반응성 카복시 잔기를 이격자 서열의 N-말단 아미노산과 반응시키는 단계;
(vi) 커플링된 링커 화합물을 갖는 고상을 CSDM 서열의 N-말단 아미노산(이때 CSDM 서열의 N-말단 아미노산은 선택적으로 완전한 CSDM의 일부이다)과 접촉시키고 아미노산 분자의 아미노기를 링커 화합물의 카복시 기 또는 반응성 카복시 잔기와 반응시키는 단계;
(vii) 필요에 따라, CSDM의 후속적인 아미노산으로 단계 (ii) 및 (iii)을 반복하여 CSDM 서열을 완성시키는 단계; 및
(viii) 생성된 화합물을 고상의 작용기로부터 분해시키는 단계를 포함한다.
제 2의 바람직한 방법은
(i) 카복실 기 또는 이의 반응성 유도체와 반응할 수 있는 작용기가 커플링되어있는 고상을 제공하는 단계;
(ii) 고상을 EAM의 C-말단 아미노산(이때, 아미노산은 보호된 아미노기 및 선택적으로 유도화된 카복시 기를 가져서 아미노산 분자의 카복시 기가 고상의 작용기와 반응할 수 있다)과 접촉시키는 단계;
(iii) 반응된 아미노산의 아미노기를 탈보호시켜 고상이 유리 아미노 기를 갖도록 하는 단계;
(iv) EAM의 후속적인 아미노산으로 단계 (ii) 및 (iii)을 반복하여 고상에 서열의 유리 말단에서 EAM의 C-말단으로부터 EAM의 N-말단까지의 아미노산 서열을 형성시키는 단계;
(v) 고상을 2개의 카복실 기 또는 이의 작용성 잔사를 갖는 링커 화합물과 접촉시켜 링커 카복시 잔사가 EAM의 N-말단 아미노기와 반응시키는 단계;
(vi) 선택적으로 펩티드 이격자 서열의 N-말단 아미노산과 링커 화합물이 커플링된 고상을 접촉시켜 아미노산 분자의 아미노기를 링커 화합물의 카복실 기 또는 반응성 카복시 잔기와 반응시키는 단계;
(vii) 선택적으로 이격자의 후속적인 아미노산으로 단계 (ii) 및 (iii)을 반복한 후 CSDM 서열의 N-말단 아미노산(이때, CSDM 서열의 N-말단 아미노산은 선택적으로 완전한 CSDM의 일부이다)으로 단계 (ii)를 반복하는 단계;
(viii) 경우에 따라 CSDM의 후속적인 아미노산으로 단계 (ii) 및 (iii)을 반복하여 CSDM 서열을 완성시키는 단계; 및
(ix) 생성된 화합물을 고상의 작용기로부터 분해시키는 단계를 포함한다.
이들 방법중 어느 것에서도, 합성된 화합물은 바람직하게는 산에 의해 고상으로부터 분해된다.
전술된 방법은 바람직하게는 C-말단 붕소 기를 갖는 CSDM 아미노산 또는 아미노산 서열(예를 들면 완전한 CSDM)의 이용을 포함한다.
제 1 및 제 2 바람직한 방법에서 고상에 커플링되는 작용기는 최종 생성 화합물에 혼입되는 잔사의 일부일 수 있고, 예를 들면 고상에 직접 또는 간접적으로 커플링된 아미노산의 아미노기(유도될 수 있다)일 수 있다.
본 발명의 방법의 한 군에서는, 고상에 커플링되는 작용기는 최종 생성 화합물에 혼입되는 아미노산 보로네이트의 일부이고, 즉 고상에는 아미노산 보로네이트가 결합되는 디올이 커플링되어있다.
방법의 다른 군에서는, 측쇄가 아미노 또는 카복시 기인 아미노산이 측쇄의 카복실 기 또는 아미노 기에 의해 고상에 커플링될 수 있다. 쇄 연장은 아미노산의 작용기중 하나, 예를 들면 아미노 기로부터의 Fmoc 합성으로부터 수행될 수 있다. 그런 다음 다른 작용기는 최종 생성물의 일부 다른 구성 성분, 예를 들면 (CSDM의 P1 잔기를 형성하기위해) 아미노산 보로네이트와 반응될 수 있다. 그러나, 붕소함유 펩티드의 고상 합성은 임의의 이런 펩티드에 적용될 수 있고 본 발명의 세린 프로티아제 억제제에만 한정되는 것이 아니다.
붕소 함유 화합물의 고상 합성
펩티드 보로네이트는 액상 화학에 의해 이제까지 제조된 잘 확립된 군의 화합물이다. 따라서, 펩티드 세린 프로티아제 억제제는 C-말단 카복시 기가 보론산 기 또는 이의 유도체에 의해 치환된 것으로 공지되어있다. 대표적인 화합물은 하기 화학식 III을 갖는다:
(aa)k-B(R2)(R3)
상기 식에서,
(aa)k는 아미노산의 서열(예를 들면 화학식 1에서와 같이)을 나타내고,
R2및 R3은 각각 독립적으로 할로겐, -OH, -OR4및 -NR4R5로부터 선택되고, 이때, R4및 R5는 각각 독립적으로 일반식 R6(CO)u-(이때, u는 0 또는 1이고, R6은 H 또는 선택적으로 (10-u)의 탄소수를 갖는 할로겐화된 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 기이다)의 기이고, 선택적으로 -OH, R7(CO)vO- 및 R7(CO)v-(이때, v는 0 또는 1이고, R7은 C1-C6-v알킬, 또는 (10-v)의 탄소수를 갖는 아릴, 알킬아릴, 아릴알킬 또는 알킬아릴알킬 기이다)로 구성된 군에서 선택된 하나이상의 기로 치환되거나, 또는 R2및 R3은 함께 디올 또는 디티올의 잔사를 나타낸다.
이런 펩티드 보로네이트는 본원에 참고로 혼입된 예를 들면 제 WO 92/07869 호(제 USSN 08/317,387 호에 상응함), 제 EP 0471651 호(이는 제 US 5288707 호에 상응함) 및 제 USSN 08/240,606 호에 개시되어있다.
이미 개시된 바와 같이 본 출원인은 붕소-함유 펩티드가 심각한 분해없이 고상 화학에 의해 합성될 수 있음을 발견하였다. 따라서 본 발명의 한 양태는, 고상 화학, 특히 Fmoc 화학(또한 "세파드 방법"으로 공지되어있음)을 이용한 펩티드 합성에서 붕소-함유 아미노산 동족체의 이용이다.
다른 양태에서는, 목표 아미노산 서열을 제조하기위해 하기 단계를 수행함을 포함하고, 보론산 기[-B(OH)2] 또는 이의 유도체, 특히 에스테르를 포함하는 화합물이 고상으로부터 분해되기전에 고상에 링크된 화합물에 혼입됨을 특징으로하는 펩티드 또는 펩티드 함유 화합물의 제조 방법이 제공된다:
(i) 작용기가 커플링되어있는 고상을 제공하는 단계;
(ii) 아미노 기 또는 카복실 기 또는 그의 반응성 유도체와 반응할 수 있는 작용기를 갖는 화합물을 고상의 작용기와 선택적으로 반응시키는 단계;
(iii) 목표 아미노산 서열의 말단 아미노산의 아미노 또는 카복실 기(이는 그의 반응성 유도체의 형태일 수 있다)를 반응된 화합물의 상기 작용기와 선택적으로 반응시키는 단계;
(iv) 목표 서열에서 상기 고상에 커플링된 선행 아미노산의 바로 다음 아미노산을 상기 선행 아미노산에 커플링시키는 단계;
(v) 단계 (iv)을 필요한 만큼 반복하는 단계; 및
(vi) 산 또는 염기의 작용에 의해 고상으로부터 단계 (i) 내지 (iv)를 이용하여 제조된 고상에 링크된 화합물을 분해시키는 단계.
펩티드 또는 펩티드-함유 화합물을 제조하는 본 발명의 방법이 공정의 이전 단계, 선택적으로 공정의 단계 (iv)(즉, 다음 아미노산이 펩티드의 일부인 공정의 단계 (iv))에서 제조된 고상에 링크된 화합물에 펩티드를 커플링시키는 단계를 포함할 수 있다.
펩티드 또는 펩티드 함유 화합물을 제조하기위한 본 발명의 방법은 공정의 이전 단계에서 제조된 고상에 링크된 화합물에 아미노산 또는 펩티드가 아닌 화합물, 예를 들면 고상에 링크된 펩티드의 아미노 기를 액상에서 펩티드, 펩티드 동족체 또는 아미노산과 링크시키는데 사용되는 2개의 카복실 기를 갖는 화합물을 커플링시키는 단계를 포함할 수 있다. 물론, 아미노기 또는 경우에 따라 카복실 기와 반응할 수 있는 임의의 다른 액상 화합물을 고상에 링크된 펩티드에 링크시킬 수 있다. 디아민은 카복실 기를 갖는 잔기들(예를 들면 그의 반응성 유도체의 형태)을 서로 연결시키는데 유용한다. 디카복실산, 특히 글루타르산에 의한 고상에 링크된 펩티드의 연장은 펩티드 이격자 부분 및 디카복실산 잔기 링커 부분을 포함하는 연결자 잔기에 의해 EAM으로 전형적으로 N-말단에 의해 연결된 CSDM을 갖는 이작용성 세린 프로티아제 억제제의 제조에 유용하다.
유리 말단이 디카복실산 잔사로 종결되는 고상에 링크된 화합물은 또한 유리 카복실산(선택적으로 그의 유도체의 형태)과 아미노산의 아미노기와의 반응에 의해 더욱 연장될 수 있고, 예를 들면 고상에 링크된 EAM-이격자 잔기에 커플링된 디카복실산 잔기는 CSDM의 아미노산, 예를 들면 CSDM의 N-말단 아미노산과 반응할 수 있다.
방법의 단계 (ii)는 아미노산의 아미노 기 또는 선택적으로 유도체화된 카복시 기를 고상에 직접 또는 간접적으로 커플링된 작용기와 반응시키는 것을 예를 들면 종래의 고상 펩티드 합성의 일부로서 포함할 수 있다. 고상에 커플링되는 아미노 또는 카복시 기는 종종 말단 아미노 또는 카복시 기이지만, 일부 양태에서는 측쇄의 작용기, 예를 들면 글루타르산의 측쇄 카복실 기이고, 예를 들면 측쇄를 통해 고상에 결합된 아미노산의 C-말단 카복실기는 보론산 잔기 [-B(OH)2] 또는 그의 에스테르로 치환될 수 있다.
방법은 SPPS에서의 N-말단 커플링을 포함할 수 있고, 이때 수지에 결합된 펩티드의 카복시 말단은 생성된 생성물이 수지로부터 산 분해되기전에 유리 α-아미노보로네이트 산 또는 에스테르에 커플링된다.
다른 양태에서는, 단계 (ii)는 아미노산 또는 하기 화학식 IIIa의 펩티드 보론산 또는 하기 화학식 IIIb의 에스테르를 고상에 커플링된 디올과 반응시킴을 포함한다:
상기 식에서,
E1및 E2는 보론산 에스테르 형성 잔사일 수 있거나 또는 함께 단일 잔사를 형성할 수 있다.
붕소 원자(예를 들면 아미노산 또는 펩티드 보론산 또는 에스테르의 일부로서)을 고상에 (직접 또는 간접적으로) 커플링된 하이드록시 기를 통해 링크시키는 기술은 신규하고 본 발명의 한 양태를 형성한다.
보론산 또는 에스테르가 선행 양태중 어느 하나의 단계 (ii)에서 사용되는 아미노산 보로네이트인 화합물을 포함하는 경우, 고상 합성 방법은 세린 프로티아제 촉매 부위의 펩티드 보로네이트 억제제를 제조하는데, 선택적으로 이작용성 세린 프로티아제 억제제의 합성에 이용될 수 있다.
따라서 보론산은 디올-함유 수지상에 직접 에스테르화된 후, 쇄 연장을 표준 Fmoc 화학에 의해 N-말단부로부터 계속할 수 있다. 이어서, 보론산 에스테르를 무기산에 의해 분해시켜 유리 보론산 [펩티드-B(OH2)]을 생성하거나, 또는 예를 들면 디올, 특히 피난디올과 같은 장애 디올의 농축 용액에 의한 트랜스에스테르화에 의해 분해시킬 수 있다.
문헌은 디올-함유 고상 수지를 제조하는 방법들을 개시하고 있고, 이는 알데하이드에 의해 유도체화될 수 있고 또한 보론산/에스테르에 의해 유도체화될 수 있다(예를 들면, 주(Xu, Z.H.), 맥아더(McArthur, C.R.) 및 레즈노프(Leznoff. C.C.)의 문헌['The monoblocking of symmetrical Diketones on Insoluble Polymer Supports', Can. J. Chem., 1993, 61, 1405-1409] 및 레즈노프 및 시와닉(Sywanyk, W.)의 문헌['Use of Polymer Supports in Organic Synthesis 9, Synthesis of Unsymmetrical Caretenoids on Solid Phase', J. Org. Chem., 1997, 42, 3203-3205]를 참조할 수 있다).
일반적인 방법은 하기와 같다:
디올은 2개이상의 알콜성 하이드록시 기를 갖는 화합물이다.
X 및 Y는 보호기이다.
R은 아미노산 보로네이트/보론산의 측쇄이다.
전형적으로 수지는 각 단계후에 세척된다. 적합한 양태에서 디올은 수지와 반응하기전에는 보호되지않는다.
보다 구체적인 방법은 하기에 개시된다:
따라서 본발명은 고상 화학에 의해 펩티드 보로네이트를 제조하는 방법, 예를 들면 조합 방법에 의해 펩티드 보로네이트의 라이브러리를 제조하는 방법을 개발하였다.
본 발명은
(i) 알콜성 하이드록시기가 커플링된 고상을 제공하는 단계;
(ii) 아미노산 보론산 또는 펩티드 보론산을 하이드록시기와 반응시켜 보론산 잔사를 고상에 에스테르화시키는 단계;
(iii) 최종 생성물에서 펩티드 보론산 또는 보로네이트 에스테르의 바로 다음 아미노산의 카복실 기를 고상에 커플링되어있는 선행 아미노산의 아미노 기와 반응시키는 단계;
(iv) 필요한 만큼 단계 (iii)을 반복하는 단계;
(v) 생성된 펩티드 보로네이트를 수지로부터 분해시키는 단계를 포함하며, 선택적으로 상기 화합물을 제조하기위한 하나이상의 추가 단계를 포함하는, 펩티드 보론산 또는 펩티드 보로네이트 에스테르를 포함하는 화합물의 제조 방법을 포함한다.
고상에 커플링된 알콜성 하이드록시 기는 바람직하게는 한쌍의 기가 붕소 원자에 결합된, 즉 붕소 원자가 이들에 의해 디에스테르화될 수 있다:
일부 양태에서는 하이드록시 기는 1,2-배열(즉, 인접한 탄소이다)이고, 다른 양태에서는 이들은 쇄상에서 분리되어있다(예를 들면 NH(CH2CH2OH)2의 잔사).
바람직하게는 고상에 커플링된 각각의 아미노산은 보호된 아미노 기를 갖고 단계 (iii)은 선행 아미노산의 아미노기를 탈보호시킴을 포함한다. 바람직하게는 단계 (v)의 분해는 산을 이용하거나 트랜스에스테르화에 의해 수행된다.
보다 일반적으로, 하이드록시 기 잔사를 통해 고상에 결합된 보론산 잔사의 고상 합성에서의 용도가 제공된다.
또한 붕소 원자를 포함하는 화합물의 제조 방법이 제공되고, 이 방법은
(i) 알콜성 하이드록시 기가 커플링되어있는 고상을 제공하는 단계;
(ii) 보론산 또는 보로네이트 에스테르를 하이드록시기와 반응시켜 보론산 잔사를 고상에 에스테르화시키는 단계;
(iii) 하나이상의 추가 단계를 수행하여 상기 화합물을 제조하는 단계를 포함한다.
알콜성 하이드록시 기는 바람직하게는 상기 개시된 바와 같이 배열된다.
다른 양태에서는, 하이드록시 기를 통해 보론산 잔사가 결합된 고상 물질, 및 하기 화학식 IV의 잔사가 커플링된 고상 물질이 제공된다:
상기 식에서,
R은 붕소 원자가 결합된 잔사이고, 일반적으로는 유기 잔기이고, 잔기 R은 알콜성 하이드록시 기와 반응하는 작용기가 없는 물질의 한 군이다(그러나, 물질은 예를 들면 탈보호되기전에 보호된 형태로 이런 작용기를 함유할 수 있다). 물질의 다른 군에서는, 이런 작용기는 비보호되고, 보호기는 이미 제거된다. R은 전형적으로 R이 화학 반응할 수 있게하는 하나이상의 작용기를 갖는 유기 잔기이고, 임의의 보호된 작용기는 보호될 수 있다.
물질의 한 군에서, 고상에는 하기 화학식 V의 물질이 커플링되어있다:
-CH2- 기의 수소 원자중 하나 또는 둘 모두는 물질의 용도와 상용성이 있는 다른 기, 예를 들면 알킬 기(예를 들면 메틸 또는 부틸)로 치환될 수 있다.
물질의 또다른 군에서는, 화학식 IV의 좌측 산소는 에스테르의 일부이다.
고상 합성 방법의 제 1 군은 보론산 기 [-B(OH)2] 또는 그의 유도체, 특히 에스테르를 포함하는 화합물을 산 분해성 결합의 분해전에 고상에 링크된 화합물에 혼입함을 특징으로하는 하기 단계를 수행하여 목표 아미노산 서열을 제조하는 것을 포함한다:
(i) 카복실 기와 반응할 수 있는 작용기가 커플링되어있는 고상을 제공하는 단계;
(ii) 작용기와 반응성이고 염기-분해성 보호 기에 의해 보호된 아미노산을 포함하는 화합물을 작용기와 반응시켜 산 분해성 결합을 형성시키는 단계;
(iii) 아미노기를 염기로 탈보호시키는 단계;
(iv) 아미노기가 염기-분해성 보호기로 보호된 아미노산의 카복실 기를 단계 (iii)에서 생성된 탈보호된 아미노 기와 반응시키는 단계;
(v) 보호된 아미노산을 염기로 탈보호시키는 단계;
(vi) 목표서열에서 고상에 커플링된 선행 아미노산의 바로 다음 아미노산(이때 바로 다음 아미노산은 염기-분해성 보호기로 보호된 아미노 기를 갖는다)을 선행 아미노산의 탈보호된 아미노기와 반응시키는 단계;
(vii) 염기를 이용하여 보호된 아미노산 기를 탈보호시키는 단계;
(viii) 단계 (vi)와 (viii)를 필요한 만큼 반복하는 단계; 및
(ix) 산 분해성 결합을 산을 이용하거나 또는 트랜스에스테르화에 의해 분해시키는 단계.
펩티드 또는 펩티드 함유 화합물을 제조하는 상기 방법에 개시된 바와 같이, 방법의 단계 (ii)는 예를 들면 고상 화학 분야에서 공지된 방법에 의해 아미노산의 선택적으로 유도화된 카복시 기를 고상에 직접 또는 간접적으로 커플링된 작용기와 반응시킨다. 아미노산은 보론산 또는 에스테르 기를 함유하는 화합물, 즉, 아미노산 보론산 또는 에스테르일 수 있다. 다르게는 단계 (ii)는 아미노산 또는 펩티드 보론산 또는 에스테르의 형태인 보론산 또는 에스테르 기를 포함하는 화합물을 고상에 커플링된 디올과 반응시킴을 포함할 수 있다. 아미노산(또는 펩티드) 보론산 또는 에스테르가 사용되는 어느 경우든, 방법은 세린 프로티아제 촉매 부위의 펩티드 보로네이트 억제제를 제조하기에, 선택적으로 이작용성 세린 프로티아제 억제제의 합성에 적합하다.
펩티드 또는 펩티드 함유 화합물의 제조 방법의 상기 개시된 다른 변형은 고상 합성 방법의 상기 제 1 군에 적용가능하다.
고상 합성 방법의 제 2 군은 보론산 기 [-B(OH)2] 또는 그의 유도체, 특히 에스테르를 포함하는 화합물을 산 분해성 결합의 분해전에 고상에 링크된 화합물에 혼입함을 특징으로하는 하기 단계를 수행하여 목표 아미노산 서열을 제조함을 포함한다:
(i) 카복실 기와 반응할 수 있는 작용기가 커플링되어있는 고상을 제공하는 단계;
(ii) 작용기와 반응성이고 산분해성 보호기에 의해 보호된 아미노산을 포함하는 화합물을 작용기와 반응시켜 염기 분해성 결합을 형성시키는 단계;
(iii) 아미노기를 산으로 탈보호시키는 단계;
(iv) 아미노기가 산분해성 보호기에 의해 보호된 아미노산의 카복실 기를 단계 (iii)에서 생성된 탈보호된 아미노 기와 반응시키는 단계;
(v) 보호된 아미노산을 산으로 탈보호시키는 단계;
(vi) 목표 서열에서 고상에 커플링된 선행 아미노산의 바로 다음 아미노산(이때 바로 다음 아미노산은 산-분해성 보호기에 의해 보호된 아미노 기를 갖는다)을 선행 아미노산의 탈보호된 아미노기와 반응시키는 단계;
(vii) 보호된 아미노 산 기를 산을 이용하여 탈보호시키는 단계;
(viii) 필요한만큼 단계 (vi)와 (viii)를 반복하는 단계; 및
(ix) 염기 분해성 결합을 염기를 이용하거나 트랜스에스테르화에 의해 분해시키는 단계.
상기 개시된 고상 합성 방법의 제 1 군의 변형은 또한 제 2 군에도 적용가능하다.
펩티드 또는 펩티드 함유 화합물을 제조하는 방법에 관해 상기 개시된 바와 같이, 고상 합성 방법의 제 1 및 제 2 군의 방법은 아미노산 또는 펩티드가 아닌 화합물을 방법의 이전 단계에 의해 제조된 고상에 링크된 화합물에 커플링시키는 단계를 포함할 수 있다.
일반적인 합성
본 발명의 화합물은 붕소를 함유하지않고, 함유할 수도 있다. 붕소를 함유하지않은 화합물은 고상 합성에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 일부 화합물은 다른 링크기에 의해 치환되는 천연 펩티드 결합을 갖는다. 본 발명의 모든 화합물의 합성에 적합한 방법에 대한 또다른 정보는 같은날 출원되고 발명의 명칭이 "Thrombin Inhibitors"인 전술된 특허원에서 발견될 수 있다.
용도
본 발명에 따른 신규한 화합물은 세린 프로티아제, 예를 들면 트롬빈의 억제제 또는 기질로서 유용하고, 이런 효소의 진단학적 및 역학 연구를 위해 생체외 또는 생체내에서 사용될 수 있다. 보다 일반적으로 신규한 펩티드는 연구 또는 합성 목적으로 이용될 수 있다. 또한, 이들의 억제 활성 때문에 억제제는 조절 시스템, 특히 포유동물 시스템, 예를 들면 인간 또는 동물 신체에서 과다한 트롬빈 또는 다른 세린 프로티아제에 의한 질병의 예방 또는 치료, 예를 들면 응고 시스템의 조절에 유용하다. 약학적으로 유용한 화합물은 임의의 N-말단 치환체(X)로서 약학적으로 허용가능한 기를 갖는다.
항혈전제가 필요한 경우 본발명의 항혈전 화합물이 사용될 수 있다. 일반적으로 이들 화합물은 효과양으로 경구 또는 비경구적으로 숙주에 투여되어 항혈전 효과를 수득할 수 있다. 인간과 같은 더 큰 포유동물의 경우, 화합물은 단독으로, 또는 하나이상의 약학적 담체 또는 희석제와 함께 체중 ㎏당 0.02 내지 10㎎, 바람지갛게는 1 내지 100㎎의 투여량으로 투여되어 항혈전 효과를 수득할 수 있고, 단일 투여 또는 분할 투여되거나 서방형 이형 제제로서 투여될 수 있다. 환자의 체외 혈관 루프가 확립된 경우, 0.1 내지 10㎎/㎏이 정맥내 투여될 수 있다. 전체 혈액과 함께 사용되는 경우 ℓ당 1 내지 100㎎이 응고를 예방하기위해 제공될 수 있다.
인간 또는 동물용 용도에 대한 약학적 희석제 또는 담체는 잘 공지되어있고, 당, 전분 및 물을 포함하고, 필요한 약학적으로 적절하거나 효과량 또는 농도의 하나이상의 목표 펩티드를 함유하는 약학 조성물(인간 또는 동물)의 허용가능한 제제를 제조하기위해 이용될 수 있다. 약학 제제는 단위 투여 형태일 수 있다. 화합물의 제형은 정제, 캡슐, 주사 용액 등을 포함한다.
본 발명의 항응고 화합물은 또한 혈액과 접촉하는 혈액 수집 또는 분배 용기, 튜브 또는 이식 기구에서 혈액의 응고를 예방할 목적으로 혈액에 첨가될 수 있다.
본 발명의 화합물에 의한 장점은 경구 활성, 신속한 활성의 개시 및 낮은 독성을 포함한다. 또한, 이들 화합물은 헤파린 또는 트롬빈 또는 다른 세린 프로티아제의 다른 공지된 억제제에 매우 민감한 개인의 치료에 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 방법은 세린 프로티아제 억제제 및 다른 화합물의 합성에 유용하다. 이들은 조합 화학에서 유용하다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 개시되고 예시될 것이다.
실시예에서, 아미노산 잔기는 달리 언급되지않으면 L-배위이다.
1. [-D-Phe-Pro-BoroBpgOPin]CO(CH2)3COGly2Gln(Tyr63)Hir51-64
a. GlyGlyGln(Tyr63)Hir51-64
H-Gly-Gly-Gln-His-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Tyr-Leu-OH의 아미노산 일반식을 갖는 GlyGlyGln(Tyr63)Hir51-64은 밀리겐(Millgen) 9050 펩신테사이저(PepSynthesizer)상에서 Fomc-폴리아미드 연속 유동 방법 및 프로프리에타리(proprietary) 9050 플러스 온 칼럼 모니터링 소프트웨어를 이용하여 고상 펩티드 화학에 의해 제조되었다. 미리 유도체화된 고형 지지체, Fmoc-Leu-PEG-PS(1.6g, 0.22meq/g)을 내내 이용하였다. Fmoc-Leu-PEG-PS는 HMBA 링커를 이용하여 폴리에틸렌 글리콜 유도화된 폴리스티렌을 포함한다. Fmoc 기는 DMF중의 20% 피페리딘을 이용하여 제거하였다. 적절한 곳에서 측쇄가 보호된 펜타플루오로페닐 에스테르로서 Fmoc-아미노산(4당량), 예를 들면 Fmoc-L-Tyr(tBu)OPfp, Fmoc-L-Glu(tBu)OPfp, Fmoc-L-Asp(tBu)OPfp, Fmoc-L-Asn(Trt)OPfp 및 Fmoc-His(boc)OPfp가 순차적으로 커플링된다. 일단 필요한 펩티드 서열이 완성되면 N-말단 Fmoc 기는 DMF중의 20% 피페리딘을 이용하여 제거되었다. 양성 닌하이드린 시험은 Fmoc 기가 제거되었음을 나타낸다. 이어서 펩티드-공액 수지는 필터상에서 경사분리되고 디클로로메탄, 메탄올 및 디클로로메탄으로 "오프 라인" 세척하고, 몇시간동안 진공에서 건조시켰다.
b. HO2C(CH2)3COGlyGlyGln(Tyr63)Hir51-64
실시예 1a에서 수득된 펩티드를 환저 플라스크(25㎖)에서 DMF(5㎖)중에서 현탁시키고 글루타르산 무수물(300㎎) 및 4-메틸-모르폴린(200㎎)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 하룻밤동안 와동시켰다. 수지를 DMF, DCM 및 MeOH로 세척한 후 진공에서 하룻밤동안 건조시켜 목표 화합물을 수득하였다.
c. H-D-Phe-ProBoroBpgOPin
H-D-Phe-ProBoroBpgOPin은 격벽으로 부합되고 질소로 플러싱된 환저 플라스크(100㎖)에서 아세트산(20㎖)중의 40% HBr 용액을 Cbz-D-Phe-Pro-BoroBpgOPin(2g)에 첨가하여 제조되었다. 플라스크를 보호된 트리펩티드가 완전히 용해되도록 와동시켰다. 약 30분후에 기체 발생이 중단되었을 때 무수 에테르(200㎖)를 첨가하고 반응 혼합물을 냉장고에 4시간동안 두었다. 반응 혼합물을 여과시키고, 잔사를 EtOH(1㎖)에 용해시키고 무수 에테르를 첨가하여 생성물(800㎎)을 백색 고형물로서 침전시켰다. (M-H), 516; TLC(C/M/A, 95/5/3), Rf = 0.05.
d. [-D-Phe-Pro-BoroBpgOPin]CO(CH2)3COGly2Gln(Tyr63)Hir51-64
[-D-Phe-Pro-BoroBpgOPin]CO(CH2)3COGly2Gln(Tyr63)Hir51-64를 합성하기위해 건조 수지 HOCO(CH2)3COGly2Gln(Tyr63)Hir51-64를 DMF(10㎖)에 현탁시킨 후 TBTU(129㎎, 0.4mmol) 및 H-D-Phe-ProBoroBpgOPin(230㎎, 0.4mmol)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 5분동안 교반한후, 트리에틸아민(40㎎, 0.04mmol)을 첨가하고 플라스크를 하룻밤동안 교반하였다.
완전히 보호된 펩티드 수지를 디클로로메탄, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척한 후 진공하에서 건조시켰다. 측쇄 보호기의 동시 탈보호와 함께 수지로부터의 분해는 수지를 2시간동안 100% TFA를 이용하여 처리함으로써 수득되었다. TFA를 제거하고 C-말단 카복실산을 갖는 유리 펩티드를 찬 무수 에테르를 이용하여 침전시킴으로써 생성시켰다. 조질 펩티드를 여과에 의해 수집하고 에테르의 또다른 분획으로 세척하였다.
조질 펩티드의 정제는 비닥(Vydac)TMC-18 제조용 칼럼(TP 실리카, 10㎛, 25mmx300mm)을 이용한 역상 HPLC에 의해 수행되었다. 칼럼을 용매 A(물중의 0.1% TFA) 및 용매 B(아세토니트릴중의 0.1% TFA)의 30 내지 90% 선형 구배를 이용하여 용출시켰다. 칼럼 용출물을 230nM에서 모니터링하였고, 적절히 분획을 수집하였다. 생성물의 순도는 분석용 RP-HPLC 및 질량 분광계를 이용하여 결정하였다.
2. Cbz-D-Phe-Pro-ψ(CO2)-Boro에틸글리신피난디올
a. Cbz-D-Phe-Pro-ψ(CO2)-BoroEtg피난디올
1-클로로에탄-피난디올 보로네이트 에스테르(0.321g, 1.25x10-3몰)를 Cbz-D-Phe-Pro-OH(0.6g, 1.52x10-3몰)에 첨가하였다. 첨가가 종료되면, CH2Cl2중의 DBU(0.23g, 1.52mmol)를 혼합물에 첨가하고 실온에서 교반시킨후 4℃에서 더 오래동안 교반시킨후 후처리하였다. 탁한 액체를 HCl(0.1M, 2x50㎖), NaHCO3(1%, 50㎖)를 이용하여 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO4상에서 격렬히 교반함으로써 건조시키고 여과하여 건조제를 제거하였다. 여액을 회전식 증발기중에서 감압하에서 농축하여 걸쭉한 점성이 있는 잔사를 제공하였다.1H NMR에 의한 예비 조사는 필요한 조질 생성물을 나타낸다. 조질 시료는 소량의 MeOH에 용해되어 세파덱스(Sephadex) LH20 칼럼에 부하된후 동일한 용매를 이용하는 펌프를 이용하여 용출시킨다. 용출 프로필을 UV 램프(226nM) 및 기록기를 이용하여 추적하였다. 공극 부피, 분획 1 내지 6 및 또다른 큰 부피를 수집하였다. 크로마토그램의 형태로부터, 분획 1 내지 6이 트리펩티드가 발견될 수 있는 가장 가능성있는 분획인 것으로 생각된다. 분획을 개별적으로 농축하여 투명한 약간 색을 띤 점성이 있는 잔사를 수득하였다. 고진공하에 두었을 때 부피가 큰 물질을 함유하는 한 분획은 나중에 약학 결정성인 생성물을 제공하였다(35% 수율인 0.269). NMR, FABMS(빠른 원자 충돌 질량 분광계) 및 C, H, N은 화합물이 형성됨을 나타내는 매우 강한(우수한) 지시자이다.
b. H-Phe-Pro-ψ(CO2)-BoroEtg피난디올
Cbz-D-Phe-Pro-ψ(CO2)-BoroEtg피난디올(실시예 2a에서의)을 MeOH(30㎖)에 용해시키고 10% Pd/C로 처리하고 교반하면서 아르곤으로 퍼징하고, 플라스크를 비우고 5시간동안 교반하면서 H2로 펌핑하였다. 닌하이드린 염색은 TLC상에서 탈보호된 생성물을 나타내었다. 용액을 아르곤으로 10분간 퍼징하고 여과하고 감압하에서 농축하여 걸쭉한 흑색 오일을 수득하였고 이를 CHCl3에 용해시키고 여과하고 농축시켰다. 조질 생성물의1H NMR은 보호된 생성물이 없음을 나타낸다. 상기로부터의 잔사를 세파덱스 LH20 크로마토그래피 칼럼상에서 크로마토그래피하였다.1H (60MHz) NMR은 단리된 화합물이 유사 구조를 기준으로 예상되는 특징중 대부분을 나타냄을 보여준다. 122㎎의 유리 아미노 보로네이트 에스테르를 단리하였다.
3. H-Phe-L-Glu-BoroBpgOPin
a. Fmoc-L-Glu(PEG-PS)OH
테트라키스트리페닐포스핀 팔라듐(0) [PdP(Ph3)4](1g)을 Ar하에서 5% 아세트산 및 2.5% N-메틸모르폴린(30㎖)을 함유하는 CH3Cl의 용액에 용해시켰다. 이 혼합물을 Ar 하에서 Fmoc-L-Glu(PEG-PS)OAl(1.6g)을 함유하는 플라스크로 이동시켰다. 수지를 2시간동안 종종 부드럽게 진탕하면서 정치시켰다. 수지를 하소된 유리 깔대기상에서 여과시키고 0.5% 디이소푸로필에틸아민 및 DMF(300㎖)중의 나트륨 디에틸디티오카바메이트(0.5%w/w)로 세척하여 촉매를 제거하였다.
b. Fmoc-L-Glu(PEG-PS)NHBoroBpgOPin
무수 수지 Fmoc-L-Glu(PEG-PS)OH(1.5g)을 Ar하에서 DMF(10㎖)에 현탁시켰다. TBTU(129㎎, 0.4mmol) 및 NH2BoroBpgOPin(165㎎, 0.5mmol)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 5분동안 교반한 후, 트리에틸아민(40㎎, 0.4mmol)을 첨가하고 플라스크를 하룻밤동안 교반하였다. 수지를 디클로로메탄, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척한 후 진공하에서 건조시켰다.
c. H-Phe-L-Glu(PEG-PS)NHBoroOPin
H-Phe-L-Glu(PEG-PS)NHBoroBpgOPin을 밀리겐 9050 펩티드 합성기상에서 고상 화학에 의해 제조하였다. Fmoc 기를 DMF중의 20% 피페리딘을 이용하여 고형 지지체 Fmoc-L-Glu(PEG-PS)NHBoroBpgOPin으로부터 제거하였다. Fmoc-Phe-OPfp를 유리 N-말단에 커플링시켰다.
보호된 펩티드 수지를 디클로로메탄, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척한 후 진공하에서 건조시켰다.
d. H-Phe-L-Glu-BoroBpgOPin
수지로부터 펩티드의 분해는 수지를 2시간동안 100% TFA로 처리함으로써 수행되었다. TFA를 제거하고 유리 펩티드 H-Phe-Glu-NH-BoroBpgOPin이 찬 무수 에테르로 침전시킴으로써 생성되었다. 조질 펩티드를 여과에 의해 수집하고 에테르의 또다른 분획으로 세척하였다.
조질 펩티드의 정제는 비닥 C-18 제조용 칼럼(TP 실리카:입자 크기 10㎜; 25㎜x300㎜)를 이용한 역상 HPLC에 의해 수행하였다. 칼럼을 용매 A(물중의 0.1% TFA) 및 용매 B(아세토니트릴중의 0.1% TFA)의 30 내지 90% 선형 구배를 이용하여 용출시켰다. 칼럼 용출액을 230nM에서 모니터링하고 분획을 적절하게 수집하였다. 생성물의 순도를 분석용 RP-HPLC 및 질량 분광계에 의해 결정하였다. 생성물 H-Phe-Glu-NH-BoroBpgOPin을 17% 수율, 34㎎으로 수득하였다. ES-MS: 626[M+Na]; 잔류 시간 분석용 HPLC(4x250㎜, 비닥, C-18 테크스피어(Techsphere))을 물중의 0.1% TFFA가 있는 MeCN과 0.1% TFA와의 10 내지 60%로 25분동안 용출시켜 Rt 23.1분의 잔류 시간을 수득하였다.
4. 메리필드 수지에의 보론산의 결합
a. 보호된 디올(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올)을 이용한 수지의 유도체화
Na(고형물, 8g)을 아르곤 기체하에서 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올(240㎖)에 첨가하고 혼합물을 투명한 용액이 될 때까지 교반하였다. 메리필드 수지(시그마, 1.1MeQ, g당 Cl, 20g)을 첨가하고 혼합물을 하룻밤동안 교반한후 80℃에서 24시간동안 가열하였다.
유도화된 수지를 여과에 의해 수집하고 1,4-디옥산(1ℓ), 물(3x500㎖) 및 MeOH:물(1:1, 3x500㎖), MeOH(3x500㎖) 및 무수 에테르(3x500㎖)로 세척하였다. KBr(무수, 300㎎)과 함께 1.5 내지 2㎎의 수지를 분말화시키고 디스크로 압축시킨후 퍼킨(등록상표, Perkin) 1600 푸리에 전환 IR상에서 스캐닝하여 적외선 스펙트럼을 수득하였다. 메리필드 수지(도 1)와 비교된 유도화된 수지(도 2)는 5원 고리의 에테르 신축 진동수 특성에 대한 명확한 신축 신호 1050 대 1150㎝-1(s)를 나타내고, 알킬-알킬 신축에 대한 1060 대 1150㎝-1(s)에서의 디알킬 에테르 신축을 나타낸다.
b. 탈보호
유도화된 수지를 HCl(1.5M, 250㎖) 및 1,4-디옥산(250㎖)과 혼합하고 현탁액을 교반하고 80℃에서 가열시켰다. 72시간후에, 수지를 물(500㎖), MeOH(500㎖), DCM(500㎖) 및 Et2O(500㎖)로 세척한 후 공기중에서 건조시켰다. 수지의 F.t-IR 스펙트럼은 3400 내지 3550㎝-1(s)에서의 명확한 O-H 신축 진동수 및 3413.6에서의 주 피크를 나타내고(도 3), 이 피크는 실질적으로 2917.6㎝-1에서의 신호보다 더 크다. 비교에서 에테르(도 2) 및 메리필드 수지는 오직 배경 습기에 대한 약한 3400㎝-1만을 나타낸다.
c. 유도화된 수지와 보론산과의 반응
디올 수지(5g, 디올 5.5mmol)를 THF(무수, 500㎖) 및 페닐보론산(3.35g, 27.5mmol, 5당량)에 현탁시키고 4Å체(150℃에서 건조시킴)를 통과시켰다.
아르곤하에서 하룻밤동안 교반한 후, 수지를 폐쇄 시스템에서 아르곤하에서 여과하고 THF(500㎖)로 세척하고 진공하에서 건조시켰다. Ft-IR(도 4)는 페닐 고리에 대한 1026㎝-1(아릴-알킬 신축 진동수)에서의 강한 신호 및 3417㎝-1에서의 약한 신호(출발 디올에 대해 도 3과 비교할 수 있다)를 나타낸다.
레즈노프(Leznoff, C.C.) 및 웅(Wong, J.Y.)의 문헌[The use of Polymer Supports in Organic Synthesis, III, Selective Chemical Reactions on One Aldehyde Group of Symmetrical Dialdehydes, Can. J. Chem., 1973, 51, 3756-3764]를 참조할 수 있다.
분석 및 활성 자료
하기 표 1은 본 발명에 관한 활성 자료를 포함한다. 표에서, "Z"는 벤조일옥시카보닐을 의미하고 "NHir"은 일반적인 히루딘을 의미한다. "NHir49-64(des-S)는 천연 Tyr(OSO3H)53이 Tyr으로 치환된 일반적인 히루딘의 아미노산 49에서부터 아미노산 64의 아미노산 서열을 의미한다.
표 1에 열거된 화합물은 상기 제조 실시예 1 및 2의 화합물과 동일하거나 유사한 방법으로 제조되거나, 중간체의 경우 공급원으로부터 수득되었다.
활성 측정을 위해서 하기 기술을 사용하였다.
혈장 트롬빈 시간(TT)
시트레이트 처리된 일반 인간의 혈장 150㎕ 및 완충액 또는 시료 20㎕를 37℃에서 1분간 가온시켰다. 응집은 150℃의 막 제조된 소의 트롬빈(5NIHu/염수㎖)을 첨가함으로써 시작되고 응집 시간은 응집계상에서 기록하였다.
0.1% 소의 혈청 알부민 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유한 포스페이트 완충 용액, pH 7.8를 사용하였다. 시료를 DMSO에 용해시키고 완충용액으로 희석시켰다. 억제제를 사용하지않을 때에는 DMSO를 시료에 사용된 것과 동일한 농도로 완충용액에 첨가하였다. 억제제 농도를 세미로그 그래프에서 트롬빈 시간에 대해 플롯팅하였고, 이루보터 트롬빈 시간의 2배(40초)가 되는 억제제 농도가 결정되었다.
Ki의 결정
인간 α-트롬빈의 억제는 3개의 상이한 농도의 발색원성 기질 S-2238의 효소 촉매화된 가수분해의 억제에 의해 결정되었다.
200㎕의 시료 또는 완충용액 및 50㎕의 S-2238을 37℃에서 1분동안 항온처리하고 50㎕의 인간 α-트롬빈(0.25NIHμ/㎖)를 첨가하였다. 억제 및 비억제 반응의 초기 속도를 4.5분에 기록하였다. 광학 밀도의 증가는 라인위버(Lineweaver)와 버크(Burke)의 방법에 따라 플롯팅하였다. Km및 겉보기 Km을 결정하였고 하기 수학식 1을 이용하여 Ki를 계산하였다:
사용되는 완충용액은 0.1M 나트륨 포스페이트, 0.2M NaCl, 0.5% PEG 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유하고 오르토인산을 이용하여 pH 7.5로 조절하였다.
시료는 DMSO중의 개시된 화합물로 구성된다.
Ki 측정의 더욱 자세한 설명은 본원에 참고로 혼입된 딕슨(Dixon, M) 및 웹(Webb, E.C.)의 문헌[Enzymes, 3판, 1979, Academic Press]를 참조할 수 있다.

Claims (21)

  1. 목표 아미노산 서열을 제조하기위해
    (i) 작용기가 커플링되어있는 고상을 제공하는 단계;
    (ii) 아미노 기 또는 카복실 기 또는 그의 반응성 유도체와 반응할 수 있는 작용기를 갖는 화합물을 고상의 작용기와 선택적으로 반응시키는 단계;
    (iii) 목표 아미노산 서열의 말단 아미노산의 아미노 또는 카복실 기(이는 그의 반응성 유도체의 형태일 수 있다)를 반응된 화합물의 상기 작용기와 선택적으로 반응시키는 단계;
    (iv) 목표 서열에서 상기 고상에 커플링된 선행 아미노산의 바로 다음 아미노산을 상기 선행 아미노산에 커플링시키는 단계;
    (v) 단계 (iv)을 필요한 만큼 반복하는 단계; 및
    (vi) 산 또는 염기의 작용에 의해 고상으로부터 단계 (i) 내지 (iv)를 이용하여 제조된 고상에 링크된 화합물을 분해시키는 단계
    를 수행함을 포함하고, 보론산 기[-B(OH)2] 또는 에스테르 또는 이의 다른 유도체를 포함하는 화합물이 고상으로부터 분해되기전에 고상에 링크된 화합물에 혼입됨을 특징으로하는 펩티드 또는 펩티드 함유 화합물의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    단계 (ii)가 종래 고상 펩티드 합성의 일부로서 아미노산의 아미노 기 또는 선택적으로 유도화된 카복시 기를 고상에 직접 또는 간접 커플링된 작용기와 반응시킴을 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    보론산 기를 함유하는 화합물이 아미노산 보론산, 펩티드 보론 에스테르 또는 이중 하나의 보로네이트 에스테르이고, 단계 (ii)가 아미노산 또는 펩티드 보론산 또는 에스테르를 고상에 커플링된 디올과 반응시켜, 예를 들면 하기 화학식 VI의 잔사가 링커를 통해 커플링된 고상을 형성함을 포함하는 방법:
    상기 식에서,
    R'은 천연 또는 비천연 아미노산의 잔사 또는 이의 동족체이고, 동족체는 선택적으로 천연 펩티드 결합이 아닌 다른 결합을 형성할 수 있는 다른 작용기에 의해 치환되는 아미노 기 및/또는 치환된 수소 원자를 갖는다.
  4. (i) 알콜성 하이드록시 기가 커플링되어있는 고상을 제공하는 단계;
    (ii) 아미노산 보론산 또는 펩티드 보론산을 하이드록시 기와 반응시켜 보론산 잔기가 고상에 에스테르화되게하는 단계;
    (iii) 선행 아미노산이 고상에 커플링되어있는 경우, 목적 생성물에서 펩티드 보론산 또는 보로네이트 에스테르 바로 다음의 아미노산의 카복실 기를 아미노기와 선택적으로 반응시키는 단계;
    (iv) 필요한만큼 단계 (iii)을 반복하는 단계;
    (v) 생성된 펩티드 보로네이트를 수지로부터 분해시키는 단계
    를 포함하며, 선택적으로 하나이상의 추가 단계를 포함할 수 있는 펩티드 보론산 또는 펩티드 보로네이트 에스테르를 포함하는 화합물의 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    고상에 커플링된 각각의 아미노산이 보호된 아미노 기를 갖고, 단계 (iii)이 선행 아미노산의 아미노기를 탈보호시킴을 포함하고/하거나, 단계 (v)의 분해가 산을 이용하거나 트랜스에스테르화에 의해 수행되는 방법.
  6. 펩티드-함유 화합물의 고상 합성에서의 아미노산 또는 펩티드 보론산 또는 보로네이트 에스테르의 용도.
  7. 하이드록시 잔기를 이용하여 고상에 결합되는 보론산 잔기의 고상 합성에서의 용도.
  8. (i) 알콜성 하이드록시기가 커플링되어있는 고상을 제공하는 단계;
    (ii) 보론산 또는 보로네이트 에스테르를 하이드록시 기와 반응시켜 보론산 잔사를 고상에 에스테르화시키는 단계; 및
    (iii) 하나이상의 추가 단계를 수행하여 상기 화합물을 제조하는 단계
    를 포함하는 붕소 원자를 포함하는 화합물의 제조 방법.
  9. 하이드록시 기를 통해 보론산 잔기가 커플링되어있는 고상 물질.
  10. 하기 화학식 IV의 잔사가 커플링되어있는 고상 물질:
    화학식 IV
    상기 식에서,
    R은 붕소 원자 및 산소가 결합되어있는 잔사이고, 이를 통해 고상에 결합된 잔사가 선택적으로 불활성 치환될 수 있는 알킬렌 잔기 또는 카보닐 기에 직접 결합된다.
  11. (a) 세린 프로티아제의 활성 부위에 결합하여 억제하는 촉매 부위-지향적 잔기(CSDM);
    (b) 외부부위 결합 잔기(EAM); 및 선택적으로
    (c) EAM과 CSDM사이에 결합된 연결 잔기를 포함하며, 이때 CSDM과 EAM은 세린 프로티아제의 분자에 동시에 결합할 수 있고 단 억제제는 트롬빈 억제제가 아닌, 이작용성 세린 프로티아제 억제제.
  12. 제 11 항에 있어서,
    CSDM이 Arg, Lys 또는 이의 동족체이거나 소수성인 P1 잔기, 및 D-Phe-/치환된 D-Phe-/D-Dpa-/Dba-/Pms-/α-Nal-/β-Nal-/TMSal-/Chg-/Phg-/D-Tiq-/D-Tyr-의 파라에테르/NaSO2-Pro, IleGluGly, PyroGluGly, ArgGly, ChaGly, LeuArg, L-PhePhe, NalPhe, D-TiqPhe, NalThr, NalPhg, ValVal, γ-BzlGluGly, Glu(OBzl)Ala, GlyArg, GlyLys, GlnGly, PhePro, GluGly, LeuSerThr에서 선택되는 (P4)P3P2 잔사를 갖는 억제제.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    EAM이 YIDGR-IVEGSDAEIGMSPWQ, AIEGR-TATSEYQTFFNPRTFGS, SKPQGR-IVGGKVC, NLTRR-IVGGQECKDGEC, LNTRR-IVGGQECKDGEC, SKLTR-AEAVFPDVDYVN, FNDFTR-VVGGEDAKPGQF, KIKPR-IVGGTASVRGE, KTSTR-IVGGTNSSWGE, ELR-MKNNEEAEDYDDDLTDSEMD, PKKCPGR-VVGGCVAHPHSWPWQVSLRT에서 선택되는 아미노산인 억제제.
  14. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,
    연결 잔기가 하기 화학식 II인 억제제:
    화학식 II
    -λ-σ-
    상기 식에서,
    λ는 일반식 HO2C(CH2)hCO2H(이때, h는 2 내지 6이다)의 비-펩티드 링커를 나타내고,
    σ는 2개이상의 인접한 Gly 잔기를 포함하는 이격자이다.
  15. 제 11 항 내지 제 14 항중 어느 한 항에 있어서,
    목표 아미노산 서열을 제조하기위해
    (i) 아미노기 또는 바람직하게는 카복실 기 또는 이의 반응성 유도체와 반응할 수 있는 작용기가 커플링되어있는 고상을 제공하는 단계;
    (ii) 목표 아미노산 서열의 말단 아미노산의 아미노, 또는 선택적으로 이의 반응성 유도체의 형태일 수 있는 카복실 기를 작용기와 선택적으로 반응시키는 단계;
    (iii) 목표 서열에서 고상에 커플링된 선행 아미노산의 바로 다음의 아미노산을 선행 아미노산에 커플링시키는 단계; 및
    (iv) 단계 (iii)을 필요한 만큼 반복하는 단계를 포함하는 억제제의 제조 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    아미노기와 반응할 수 있는 2개의 작용기를 갖는 화합물을 통해 단계의 선행 아미노산에 단계 (iii)의 바로 다음 아미노산을 커플링시킴으로써, 작용기중 하나가 선행 아미노산의 아미노 기에 결합되고 다른 것이 바로 다음의 아미노산의 아미노 기에 결합하는 단계 (v)를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    고상에 결합된 작용기와 반응하는 말단 아미노산이 EAM의 C-말단 아미노산이고, 단계 (iii)를 반복하여 EAM 서열의 후속적인 아미노산 및 임의의 인접한 연결자 펩티드의 후속적인 아미노산을 커플링시키는 방법.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항중 어느 한 항에 있어서,
    고상에 커플링된 중단되지않은 아미노산 서열의 최종 아미노산을 2개의 카복실레이트 기 또는 이의 반응성 유도체를 갖는 화합물과 반응시키고, 비반응한 카복실레이트 또는 카복실레이트 유도체를 전형적으로 CSDM의 N-말단 아미노산인 아미노산의 아미노기와 반응시키는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    N-말단 아미노산이 이미 CSDM의 나머지에 결합되어있고 CSDM이 C-말단 카복시 기 대신에 이종 원자 기를 갖는 방법.
  20. 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 선택적으로 포함하며, 인간 또는 동물 약제로서 사용하기위해 배합되는 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한항의 억제제를 포함하는 약학 제제.
  21. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한항의 억제제의 치료학적 또는 예방학적 효과량을 인간 또는 동물 환자에게 경구 또는 비경구 투여함을 포함하는 세린 프로티아제의 억제에 의해 치료될 수 있는 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 치료 방법.
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