DE4214328A1 - Neue peptidderivate die als inhibitoren von bakteriellen kollagenasen verwendet werden koennen - Google Patents

Neue peptidderivate die als inhibitoren von bakteriellen kollagenasen verwendet werden koennen

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DE4214328A1
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Description

Die vorliegende Erfindung hat neue Peptidderivate zum Gegenstand, die als Inhibitoren von bakteriellen Kollagenasen verwendet werden können, welche zur Klasse der Zink enthaltenden metallhaltigen Proteasen gehören.
Genauer gesagt betrifft sie Derivate von Polypeptiden, die eine chelatbildendende Phosphinatgruppe PO2-CH2 enthalten, welche eine starke Wechselwirkung mit dem Zinkatom des aktiven Zentrums dieser Kollagenasen eingehen kann.
Das Kollagen ist ein überwiegender Bestandteil der extrazellulären Matrix von mehrzelligen eukaryontischen Organismen. So ist es der Hauptbestandteil der Haut, der Sehnen, der Knochen, der Knorpel und der Gewebe, und macht etwa 40% der gesamten Proteine des menschlichen Körpers aus.
Obwohl das Kollagenmolekül sehr beständig gegen die Wirkung der meisten Proteasen ist, kann es dennoch durch spezifische Proteasen, nämlich die Kollagenasen, abgebaut werden.
Bis jetzt sind zwei deutlich unterscheidbare Klassen von Kollagenasen identifiziert und aufgrund der Spezifizität der Schnitte, die sie im Kollagenmolekül verursachen, charakterisiert worden. Die erste Klasse von Kollagenasen besteht aus den Kollagenasen von höheren Organismen, die die Peptidbindungen, welche das Paar Gly-Ile oder Gly-Leu enthalten, hydrolysieren, während die zweite Klasse aus bakteriellen Kollagenasen besteht, die systematisch alle Peptidbindungen, welche die Sequenz X-Gly enthalten, hydrolysieren und im allgemeinen das gesamte Kollagenmolekül abbauen.
Die bakteriellen Kollagenasen gehören zu der Klasse der Zink enthaltenden metallhaltigen Proteasen und das Vorhandensein eines Zinkatoms in ihrem katalytischen Zentrum, welches direkt an der Hydrolysereaktion der Peptidbindung des Substrats beteiligt ist, macht die Entwicklung von kompetitiven Inhibitoren dieser Enzyme möglich. Diese Inhibitoren, die Peptidderivate sein können, enthalten einen Peptidteil, dessen Funktion es ist, spezifische Wechselwirkungen mit den Bindungsstellen des Enzyms einzugehen, und eine chelatbildende Gruppierung, die eine starke Wechselwirkung mit dem Zinkatom des aktiven Zentrums eingehen kann.
Dieses Modell der Enzym-Substrat-Wechselwirkung, das für die Familie der Zink enthaltenden Proteasen gilt, hat in letzter Zeit die Entwicklung von wirksamen Inhibitoren ermöglicht, die interessante pharmakologische Eigenschaften aufweisen. Darunter sind die Inhibitoren der Konvertase (enzyme de conversion) und die Inhibitoren der Enzephalinasen. Diese Verbindungen sind jedoch nicht fähig, die bakteriellen Kollagenasen zu inhibieren. Dies erklärt sich dadurch, daß jede dieser drei Zink enthaltenden Proteasen (Enzephalinase, Konvertase, bakterielle Kollagenase) eine verschiedene Spezifizität besitzt.
Im Fall der bakteriellen Kollagenasen haben neuere Arbeiten gezeigt, daß es möglich war, gemäß den oben dargelegten Hypothesen, auch für diese Klasse von Proteasen pseudopeptidische Inhibitoren zu erzeugen, die eine chelatbildende Thiol-, Keton- oder Phosphoramidgruppierung enthalten.
So haben Yotakis et al. in Eur. J. Biochem, Band 160, S. 413-418 (1986) und in Eur. J. Biochem., Band 172, S. 761-766, (1988), gezeigt, daß die Verbindungen HS-CH2-CH2-CO- Pro-Arg und HS-CH2-CH2-CO-Pro-Har die von Achromobacter iophagus und von Clostridium histolyticum produzierten Kollagenasen inhibierten, wobei die erhaltenen Inhibitionskonstanten Ki 400 * 10-9M und 210 * 10-9M betrugen.
Galardy et al. in Biochemistry, Band 22, Nr. 19, S. 4556- 4561 (1983) und in US-A-45 58 034 haben gezeigt, daß Di- und Tripeptide, die eine Phosphonylgruppierung enthalten, die Kollagenase von Clostridium histolyticum inhibierten. In diesem Fall ist die Inhibitionskonstante Ki 20 * 10-6M für die beste Verbindung Isoamyl-PO₂Gly-Pro-Ala.
Mookhtiar et al. in Biochemistry, Band 27, S. 4299-4304 (1988) haben gezeigt, daß Peptidderivate, die eine Ketonfunktion tragen, die Kollagenasen von Clostridium histolyticum inhibieren konnten. In diesem Fall ist die Inhibitionskonstante Ki 1 * 10-6M für die beste Verbindung (Cinnamoyl-Leuk-Gly-Pro-Arg).
So führt keiner der bekannten Inhibitoren zu Inhibitionskonstanten mit einer Größenordnung im Nanomolbereich.
Es sind auch Forschungsarbeiten unternommen worden, um andere, wirksamere Inhibitoren zu finden.
Die vorliegende Erfindung hat genau solche neuen Peptidderivate zum Gegenstand, die stärkere und selektivere Inhibitoren von bakteriellen Kollagenasen sind.
Gemäß der Erfindung entsprechen diese Peptidderivate der Formel:
in welcher
R1 für ein Wasserstoffatom, eine Gruppe, die als Schutzgruppe für das Aminoende einer alpha-Aminosäure wirken kann, oder ein Radikal steht, das von einer alpha- Aminosäure oder einem Peptid abgeleitet ist, das an NH über sein CO-Ende gebunden ist und an seinem Aminoende ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe, die als Schutzgruppe für das Aminoende einer alpha-Aminosäure wirken kann, trägt,
R² die Seitenkette einer alpha-Aminosäure ist,
R³ ein Wasserstoffatom, ein Metallatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine Benzylgruppe ist,
R⁴ ein bivalentes Radikal ist, das von einer alpha- Amonisäure abgeleitet ist, die aus Prolin, Hydroxyprolin, Thiazolidin und Dehydroprolin mit den Formeln:
ausgewählt wird, und das an CO über sein Stickstoffatom gebunden ist,
R⁵ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist,
R⁶ eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder die Seitenkette einer alpha-Aminosäure ist, und
R⁷ für OR⁸ steht, wobei R⁸ für ein Wasserstoffatom, ein Metallatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine Benzylgruppe steht,
oder in welcher entweder R1 und R7, oder R1 und R6 zusammen ein bivalentes Radikal bilden, das von einer alpha-Aminosäure oder einem Peptid abgeleitet ist, welches 2 bis 3 Aminosäurereste enthält.
In diesem Peptidderivaten wird als chemische Gruppierung, die mit dem Zinkatom des aktiven Zentrums der Kollagenasen wechselwirken kann, die Phosphinatgruppe PO₂--CH₂ verwendet, die ein großes Inhibitionsvermögen aufweist und gleichzeitig dem Derivat eine gute chemische Stabilität verleiht.
Tatsächlich stabilisiert die Verwendung dieser Phosphinatbindung die neuen Derivate, besonders in saurer Umgebung. Zudem sind diese Derivate besonders interessant, da sie, neben einer ausgezeichneten Affinität zu den bakteriellen Kollagenasen, außerdem eine bessere Selektivität als die bekannten Inhibitoren besitzen.
Zudem besitzen die erfindungsgemäßen Peptidderivate, die der Formel (I) entsprechen, in welcher R1 und R7 zusammen ein bivalentes Radikal bilden, das von einer alpha- Aminosäure oder einem Peptid abgeleitet ist, eine verbesserte Stabilität gegen den möglichen Abbau durch Proteasen.
In der Tat betrifft eines der Probleme, mit denen man bei der Verwendung von Peptiden in physiologischer Umgebung konfrontiert wird, die Tatsache, daß diese Moleküle im allgemeinen sehr schnell durch Proteasen inaktiviert werden, die in der Lage sind, eine in diesen Molekülen vorhandene Peptidbindung zu trennen.
Bei der Definition der erfindungsgemäßen Peptide bezieht sich der Ausdruck "alpha-Aminosäure" auf die zwanzig alpha-Aminosäuren, die gewöhnlich in den Proteinen gefunden werden, die auch unter dem Namen Standardaminosäuren bekannt sind, und auf ihre Analogen. Die Seitenketten dieser Aminosäuren umfassen geradkettige und verzweigte Alkylgruppen, Hydroxyalkylgruppen, Carboxyalkylgruppen, Aralkylgruppen, Aminoalkylgruppen, Carboxamidalkylgruppen, Mercaptoalkylgruppen, Phenylalkylgruppen, Hydroxyphenylalkylgruppen, Guanidinoalkylgruppen, Imidazolylalkylgruppen, Indolylalkylgruppen und Pyrrolidinylgruppen.
Als Beispiele für Aminosäuren, die verwendet werden können, können Alanin, Arginin, Asparagin, Asparginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Norleucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Hydroxyprolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, Nitrophenylalanin, Komoarginin, Thiazolidin und Dehydroprolin genannt werden.
Die Ausdrücke "Gruppe, die als Schutzgruppe für das Aminoende einer alpha-Aminosäure wirken kann" und "Schutzgruppe" schließen alle Schutzgruppen ein, die zum Schutz der Aminofunktion von Aminosäuren und Peptiden verwendet werden können, zum Beispiel die t-Butoxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl, Cinnamoyl-, Pivaloyl- und N-(9-Fluorenyl-methoxycarbonyl)-gruppen.
Die Metalle, die für R3 und R8 verwendet werden können, sind insbesondere pharmazeutisch akzeptable Metalle, zum Beispiel Alkalimetalle wie Natrium und Lithium.
In einer ersten Ausführungsform der Erfindung steht R1 für ein Wasserstoffatom, eine Gruppe, die als Schutzgruppe für das Aminoende einer alpha-Aminosäure wirken kann, oder für ein Radikal, das von einer alpha­ Aminosäure oder einem Peptid abgeleitet ist, das eventuell durch eine Schutzgruppe geschützt wird, und R7 steht für OR8, wobei R8 für ein Wasserstoffatom, ein Metallatom, eine Alkylgruppe oder eine Benzylgruppe steht.
In diesen Derivaten ist R2 die Seitenkette einer alpha- Aminosäure, die zum Beispiel Phenylalanin sein kann, und R4 ist von einer Aminosäure abgeleitet, die aus Prolin, Hydroxyprolin, Thiazolidin und Dehydroprolin ausgewählt wird.
Vorzugsweise wird für R4 das Prolinderivat der Formel:
verwendet.
In diesen Derivaten kann das
Ende verschiedenen Aminosäuren entsprechen.
Zum Beispiel könnte es sich um Norleucin handeln, und in diesem Fall ist R5 ein Wasserstoffatom und R6 ist die n-Butyl-Gruppe.
In dieser ersten Ausführungsform der Erfindung, kann R1 für eine Schutzgruppe stehen, zum Beispiel für die Benzyloxycarbonyl-Gruppe, oder einem geschützten Aminosäurerest, zum Beispiel einem durch eine Schutzgruppe geschützten Glycin, oder einem geschützten Peptidrest entsprechen, zum Beispiel durch eine Schutzgruppe geschütztem -Pro-Gly. Die Schutzgruppe kann ebenfalls die Benzyloxycarbonyl-Gruppe sein.
Sofern die erfindungsgemäßen Peptidderivate als Inhibitoren von bakteriellen Kollagenasen verwendet werden sollen, ist R3 vorzugsweise ein Metall wie Natrium und in R7, d. h. OR8, ist R8 ebenfalls vorzugsweise ein Metall, zum Beispiel Natrium.
Nach einer zweiten Ausführungsform der Erfindung ist das Peptidderivat ein Cyclopeptid entsprechend, zum Beispiel, der Formel:
in welcher R10 für ein bivalentes Radikal steht, das von einem Peptid oder einer alpha-Aminosäure abgeleitet ist.
Allgemein ist R10 von einem Peptid abgeleitet und umfaßt zum Beispiel zwei Aminosäurereste. Mit einem solchen R10 erhält man ein zyklisches Derivat, das beständiger gegen einen Abbau durch Proteasen ist, als die nicht-zyklischen Derivate der Formel (I), welches im übrigen seine inhibitorischen Eigenschaften bezüglich der bakteriellen Kollagenasen intakt beibehält.
In dieser zweiten Ausführungsform der Erfindung stehen R2, R3, R4, R5 und R6 vorteilhafterweise für die gleichen Gruppen wie in der ersten Ausführungsform der Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Peptidderivate können nach klassischen Verfahren hergestellt werden.
So können die der ersten Ausführungsform der Erfindung entsprechenden Derivate, in denen R1 eine Schutzgruppe ist, R2, R3, R4, R5 und R6 die oben angegebene Bedeutung haben, und R7 für OR8 steht, wobei R8 identisch mit R3 ist, nach einem Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte umfaßt:
  • a) Umsetzen eines Aldehyds der Formel R2-CHO, in dem R2 die oben angegebene Bedeutung hat, mit Diphenylaminohypophosphit, um eine Diphenylmethylaminoalkylphosphinsäure der Formel: zu erhalten.
  • b) Umsetzen der Diphenylmethylaminoalkylphosphinsäure der Formel (II) mit einer Halogenwasserstoffsäure der Formel HX, in welcher X ein Halogenatom ist, um eine Aminoalkylphosphinsäure der Formel: zu erhalten.
  • c) Schützen des Aminoendes der Aminoalkylphosphinsäure der Formel (III) durch die Schutzgruppe R¹, um die Aminoalkylphosphinsäure der Formel: zu erhalten,
  • d) Umsetzen der Säure der Formel (IV) mit einem Alkylacrylat der Formel: CH₂ = CH - COOR⁹in welcher R⁹ ein Alkylradikal ist, um die Verbindung der Formel: zu erhalten,
  • e) Verseifen der Verbindung der Formel (V), um die Säure der Formel (VI) zu erhalten,
  • f) Umsetzen der Säure der Formel (VI) mit einem Peptid der Formel in welchem R⁹ ein Alkylradikal ist, um ein Peptid der Formel (VII) zu erhalten.
  • g) Umsetzen des Peptids der Formel (VII) mit einem Halogenid der Formel R3X, in welchem R3 die oben angegebene Bedeutung hat und X ein Halogenatom ist, um das Peptid der Formel (I) zu erhalten.
Die der ersten Ausführungsform der Erfindung entsprechenden Peptidderivate, d. h. die der Formel (I) entsprechenden, in der R1 ein Radikal ist, das von einer Aminosäure oder einem Peptid abgeleitet ist, dessen Aminoende durch eine Schutzgruppe geschützt ist, R2, R3, R4, R5 und R6 die oben angegebene Bedeutung haben, und R7 für OR8 steht, wobei R8 identisch mit R3 ist, können durch ein Verfahren hergestellt werden, das die nachstehenden aufeinanderfolgenden Schritte umfaßt:
  • a′) Herstellen eines Peptids der Formel (VII) durch Ausführen der Schritte a) bis f) des oben beschriebenen Verfahrens,
  • b′) Entfernen der Schutzgruppe R¹ desPeptids der Formel (VII), um das Peptid der Formel: zu erhalten,
  • c′) Umsetzen des Peptids der Formel (VIII) mit einer Aminosäure oder einemn Peptid, dessen Aminoende durch eine Schutzgruppe geschützt ist und dessen Carboxylende durch eine Nitrophenylgruppe aktiviert ist, und
  • d′) Umsetzen des in Schritt c′) erhaltenen Peptids mit einem Halogenid der Formel R³X, in dem X ein Halogenatom ist.
Die der zweiten Ausführungsform der Erfindung entsprechenden Cyclopeptidderivate, die der Formel:
entsprechen, in welcher R10 für ein bivalentes Radikal steht, das von einem Peptid oder einer Aminosäure abgeleitet ist, und in der R2, R3, R4, R5 und R6 die oben angegebene Bedeutung haben, können nach einem Verfahren hergestellt werden, das die nachstehenden aufeinanderfolgenden Schritte umfaßt:
  • a′′) Herstellen eines Peptids der Formel (VII) durch Ausführen der Schritte a) bis f) des oben beschriebenen Verfahrens,
  • b′′) Entfernen der Schutzgruppe R¹ des Peptids der Formel (VII), um das Peptid der Formel: zu erhalten,
  • c′′) Umsetzen des Peptids der Formel (VIII) mit einem Peptid der Formel R¹-R¹⁰-OR¹¹, in welcher R¹ eine Schutzgruppe für das Aminoende des Peptids und R¹¹ eine Nitrophenylgruppe ist, um ein Peptid der Formel: zu erhalten,
  • d′′) Umsetzen des Peptids der Formel (IX) mit Hydrazin, um das Hydrazid der Formel: zu erhalten,
  • e′′) Entfernen der Schutzgruppe des Hydrazids der Formel (X), um ein Hydrazid der Formel: zu erhalten,
  • f′′) Cyclisieren des Hydrazids der Formel (XI), um das Cyclopeptid der Formel (Ia): zu erhalten.
In den oben beschriebenen Verfahren werden die verschiedenen Schritte nach klassischen Methoden und unter Verwendung von Reagenzien und Lösungsmitteln durchgeführt, die allgemein in der Peptidchemie eingesetzt werden, um diese Art von Reaktionen auszuführen.
Die erfindungsgemäßen Peptidderivate können zahlreiche Anwendungen finden aufgrund ihrer inhibitorischen Fähigkeit gegenüber bakteriellen Kollagenasen.
Sie können insbesondere in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die zur Behandlung gewisser Infektionen bestimmt sind, welche auf die Anwesenheit von Bakterien zurückzuführen sind, die Kollagenase ausscheiden können.
In der Tat kann die Anwesenheit dieser Bakterien eine bedeutende Zerstörung des Kollagens nach sich ziehen und somit die Unversehrtheit des Bindegewebes des infizierten Organismus beeinträchtigen. Dies ist besonders bei Erkrankungen durch Clostridium histolyticum oder durch Pseudomonas aeruginosa der Fall. Man kann sie besonders zur Behandlung von Zahnfleischerkrankungen verwenden, die mit kollagenolytischen Mikroorganismen in Zusammenhang stehen, welche für die Zerstörung des Kollagens verantwortlich sind, die zum Beispiel in der Zusammensetzung des Zahnfleisches eintritt. Obwohl die erfindungsgemäßen Peptidderivate keine direkte Wirkung auf die kollagenolytischen Mikroorganismen haben, stellen sie in der Tat ein interessantes therapeutisches Mittel bei einigen pathologischen Zuständen (zum Beispiel Gangrän, Zahninfektionen) dar, da sie starke und spezifische Inhibitoren der bakteriellen Kollagenasen sind. Bei diesen pharmazeutischen Anwendungen können die erfindungsgemäßen Peptidderivate auch dazu verwendet werden, andere metallhaltige Proteasen zu inhibieren, die ähnliche Spezifitäten wie die bakteriellen Kollagenasen aufweisen, und die am Stoffwechsel des Kollagens beteiligt sind.
Ein Gegenstand der Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine pharmazeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Peptidderivats umfaßt, welches der oben angegebenen Formel (I) entspricht, in der R3 ein Wasserstoffatom oder Metallatom ist.
Diese Zusammensetzung kann in der Form eines physiologisch akzeptablen Salzes des Peptidderivats, in einem Transportmittel oder einem geeigneten physiologisch akzeptablen Träger vorliegen. Sie kann zum Beispiel in der Form von Lösungen oder Suspensionen durch Injektion verabreicht werden.
Die bevorzugt verabreichte Dosis liegt im Bereich von 1 mg/Kg/Tag bis ungefähr 5 mg/Kg/Tag.
Die Zusammensetzungen können auch in der Form von Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung, wie etwa Tabletten oder Kapseln, vorliegen, die zum Beispiel durch das Kombinieren der erfindungsgemäßen Peptidderivate mit Trägern, Arzneimittelgrundlagen und klassischen Zusätzen wie zum Beispiel Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Talk, Zucker, Laktose, Pektin, Dextrin, Stärke, Gelatine, Tragant, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose oder Kakaobutter erhalten werden. Zum Beispiel können Verdünnungsmittel, Geschmacksstoffe, Lösungsvermittler, Gleitmittel, Suspendierhilfen, Bindemittel oder Lockerungsmittel den Zusammensetzungen hinzugefügt werden. Die aktiven Inhaltsstoffe können auch mit anderen Trägern etc. verkapselt werden.
Die erfindungsgemäßen Peptidderivate können auch auf anderen Gebieten Verwendung finden, zum Beispiel zum Schutz von Häuten im Bereich der Lederherstellung oder zum Schutz der Gelatine bei verschiedenen Tätigkeiten, die Gelatine verwenden.
Wenn auch das natürliche Substrat für bakterielle Kollagenasen offensichtlich in erster Linie das native Kollagen ist, ist doch bekannt, daß diese Protease als Substrat Kollagen in denaturierter Form, d. h. Gelatine, verwenden kann. Gelatine wird zur Zeit in verschiedenen Zusammenhängen verwendet und es besteht ein Interesse, die vollkommene Unversehrtheit der Gelatine für diese Anwendungen aufrecht zu erhalten. Dies kann nun durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptidderivate als kompetitive Inhibitoren der bakteriellen Kollagenasen, welche die Gelatine zerstören können, erreicht werden.
Man kann weiter die erfindungsgemäßen Peptidderivate verwenden, um neue, Zink enthaltende Proteasen, die eine ähnliche Spezifizität wie die der bakteriellen Kollagenasen aufweisen, zu isolieren, besonders in höheren Organismen. In diesem Fall kann man die erfindungsgemäßen Peptidderivate als Ligand zur Herstellung von Affinitätssäulen mit dem Ziel der Abtrennung anderer Zink enthaltender Proteasen verwenden.
Man kann die erfindungsgemäßen Peptidderivate auch als Mittel zur Kontrolle der Aktivität der bakteriellen Kollagenase verwenden, zum Beispiel in biotechnologischen Verfahren, die auf die Verwendung von kollagenolytischen Bakterien gegründet sind, zum Beispiel für das Zartmachen von Rindfleisch oder den Abbau der Sedimente in Absetzbecken.
Weitere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden durch die folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 Herstellunng von Z-D, LPhe*-PO₂CH₂-CH₂-CO-Pro-Nle°,2Na⁺ (Verbindung A) (Z = C₆H₅-CH₂-OCO, Phe* = -NH-CH(CH₂C₆H₅) und Nle° = -NH-CH(CH₂C₆H₅)-COO a) Synthese der D,L-1-Diphenylmethylamino-2-phenyl- ethylphosphinsäure (1) (Verbindung Nr. 1):
Eine Dioxanlösung (12 ml), die Phenylacetaldehyd (12 g, 0,1 mol) enthält, wird vorsichtig zu einer Dioxanlösung (300 ml) gegeben, in der Diphenylaminohypophosphit (24,9 g, 0,1 mol) suspendiert ist. Die Zugabe des Phenylacetaldehyds erfolgt bei 100°C in Stickstoffatmosphäre in dem Maß, daß die Temperatur 100°C nicht überschreitet. Diese Zugabe erfolgt während 3 Stunden. Das im Verlauf der Reaktion gebildete Wasser wird durch azeotrope Destillation entfernt. Nachdem der gesamte Aldehyd zugegeben worden ist, wird die Reaktion 15 min unter Rückfluß fortgesetzt. Das Gemisch wird abgekühlt, dann mit 100 ml Ethanol verdünnt. Das auskristallierte Produkt wird filtriert, erst mit Ethanol, dann mit Ether gewaschen und getrocknet. Man erhält so 12 g der Verbindung Nr. 1 (34%); (Schmelzpunkt: 210°C, Rf(1) = 0,81)
b) Synthese der D,L-1-Amino-2-phenyl-ethylphosphinsäure (2) der Formel:
Die Verbindung Nr. 1 (3,51 g, 10 mmol) wird während 1 Stunde in einem 48% HBr/H2O-Gemisch (12 ml) auf 100°C erhitzt. Das Gemisch wird im Hochvakuum zur Trockne eingedampft, danach wird das Produkt in Wasser aufgenommen. Das Diphenylmethylbromid wird aus dieser Lösung durch Behandeln mit Ether extrahiert. Nach dem Eindampfen wird das Produkt in 30 ml Ethanol aufgenommen. Dieses Gemisch, dem 1 ml Propylenoxid zugegeben wird, wird auf 4°C abgekühlt, bis zur vollständigen Ausfällung des Produkts. Das filtrierte Produkt wird erst mit Ethanol, dann mit Ether gewaschen und getrocknet. Die erwartete Verbindung Nr. 2 (2) wird mit einer Ausbeute von 76% (1,42 g) erhalten. Rf(1) = 0,37, Rf(2) = 0,7, Schmelzpunkt: 226°C.
c) Synthese der D,L-1-Benzyloxycarbonylamino-2-phenyl­ ethyl-phosphinsäure (3) der Formel:
Die Verbindung Nr. 2 (1,1 g, 6 mmol) wird in 10 ml Wasser gelöst, anschließend wird der pH der Lösung mit einer 4N Sodalösung (solution de soude) auf 9,5 eingestellt. Zu diesem in einem Eisbad gekühlten Gemisch wird vorsichtig Chlorameisensäurebenzylester (1,2 ml, 7,5 mmol) zugegeben, wobei der pH durch wiederholte Zugabe von Soda stets bei 9,5 gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird unter Rühren 30 min bei 0°C, danach eine Stunde bei Raumtemperatur gehalten. Nach Behandeln mit Diethylether wird das Gemisch abgekühlt und danach durch Zugabe von Salzsäure angesäuert. Das ausfallende Produkt wird filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und getrocknet. Die erwartete Verbindung Nr. 3 wird mit einer Ausbeute von 76% (1,5 g) erhalten. Rf(1) = 0,57, Rf(2) = 0,76, Schmelzpunkt: 110°C.
d) Synthese des D,L-Ethyl-3-(1′-Benzyloxycarbonylamino- 2′-phenyl-ethylhydroxyphosphinyl)-propionats (4) der Formel:
Eine Suspension der Verbindung Nr. 3 (1,27 g, 4 mmol) in Hexamethyldisilazan (0,968 g, 6 mmol) wird unter Rühren während 40 min auf 110°C in einer Argonatmosphäre erhitzt. Nachdem man das Gemisch auf 90°C abgekühlt hat, wird Ethylacrylat (0,48 g, 4,8 mmol) zugetropft. Diese Reaktion wird anschließend unter Rühren 15 min bei 90°C gehalten. Wenn die Temperatur des Gemisches 70°C erreicht hat, gibt man 12 ml absoluten Ethanol zu und dampft zur Trockne ein, sobald es wieder die Raumtemperatur erlangt hat. Der Rückstand wird in 10 ml 10%iger NaHCO3 gelöst und dann mit Diethylether gewaschen. Die wäßrige Lösung wird abgekühlt und bis pH 1,5 mit 1N HCl angesäuert. Der Niederschlag wird filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und getrocknet. Die erwartete Verbindung Nr. 4 wird mit einer Ausbeute von 84% (1,4 g) erhalten. Rf(1) = 0,52, Rf(3) = 0,8.
e) Synthese der 3-(1′-Benzyloxycarbonylamino-2′-phenyl- ethyl-hydroxyphosphinyl)-propionsäure der Formel:
Die Verbindung Nr. 4 (1,26 g, 3 mmol) wird in 6,5 ml 1N KOH gelöst und unter Rühren 45 min bei Raumtemperatur gelassen. Dieses Gemisch wird anschließend mit 1N HCl bis zum pH 1,5 angesäuert. Der Niederschlag wird mit Ethylacetat extrahiert, anschließend wird diese Phase mit einer wäßrigen, mit NaCl gesättigten Lösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und auf ein geringes Volumen eingeengt. Nach einer Nacht bei 4°C wird der Niederschlag filtriert, mit ein wenig Ethylacetat gewaschen und getrocknet. Die erwartete Verbindung Nr. 5 wird mit einer Ausbeute von 88% (1 g) erhalten. Rf(1) = 0,51, Rf(2) = 0,93, Rf(3) = 0,55, Rf(5) = 0,41.
f) Synthese des Peptids der Formel:
Zu einer 4°C kalten Lösung der Verbindung Nr. 5 Tetrahydrofuran (12 ml) gibt man 1,1-Carbonyldiimidazol (1,78 g, 11 mmol). Nach 45 min Rühren bei Raumtemperatur gibt man zu diesem Gemisch das Peptid Pro-Nle-OCH3 (5,5 mmol), das mit Tetrahydrofuran (5 ml) verdünnt wurde. Das Gemisch wird nach 24 h Rühren zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 20 ml 0,27N KOH (5,5 mmol) gelöst und diese Phase wird sofort mit Diethylether gewaschen, und mit 1N HCl bis zum pH 1,5 angesäuert. Das ausfallende Produkt wird in Ethylacetat aufgenommen und diese Phase wird mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge Chloroform gelöst, und dann durch Zugabe von Petrolether ausgefällt. Das Endprodukt Verbindung Nr. 6 wird nach der Filtration, Waschen und Trocknen mit einer Ausbeute von 89% (3 g) erhalten. Rf(5) = 0,6, Rf(6) = 0,33.
g) Synthese des Peptids der Formel: Z-D,LPhe*PO₂CH₂-CH₂-CO-Pro-Nle°, 2Na⁺ (Verbindung A)
Die Verbindung Nr. 6 (0,15 g, 0, 19 mmol) wird in 10%igem Ethanol (15 ml) gelöst, dann gibt man 2N KOH (0,475 ml) zu, unter Rühren 3 h bei Raumtemperatur. Die wäßrige Phase wird mit 1N HCl bis zum pH 1,5 angesäuert. Der Niederschlag wird in Ethylacetat aufgenommen und die organische Phase wird mit einer wäßrigen Lösung, die mit NaCl gesättigt ist, gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in einer wäßrigen Lösung verdünnt, die NaHCO3(0,38 mmol) enthält, und anschließend lyophilisiert. Das erwartete Produkt wird mit einer Ausbeute von 93% erhalten.
Rf(1) = 0,27, Rf(2) = 0,85, Rf(8) = 0,57.
¹H NMR (H₂O): CHε Nle 0,94; CHγ,δ Nle 1,37 (m, 4) CHβNle 1,84 (m, 1); CHβ Nle 1,73 (m, 1); CHαNle 4,18 (m, 1); NHNle 8,08 (d,1); CHγPro 2,02 (m, 2); CHβPro 2,02 (m, 1); CHβPro 2,228 (m, 1); CHδPro 3,63 (m, 1); CHδPro 3,48 (m, 1); CHαPro 4,41 (q, 1);P-CH₂- CH₂ 2,57 (m, 2) P-CH₂-CH₂ 1,88 (m, 2); CHβ Phe 2,73 (m, 1); CHβ Phe 3,26 (m, 1); CHαPhe 3,96 (m, 1); NHPhe 7,26; (d, 1); Z-CH₂- 5 (m, 2); Ar 7,35 (m, 10).
³¹P NMR (H₂O): 43,83
Beispiel 2 Herstellung des Peptids Z-Pro-Phe*-PO(OH)-CH₂-CH₂-CO-Pro-Nle°, 2Na⁺ (Verbindung B) (Z = C₆H₅OCO, Phe* = NH-CH(CH₂C₆H₅)-)
Die Schutzgruppe Z der Verbindung Nr. 6 wird durch klassische katalytische Hydrogenolyse entfernt. Das erhaltene Produkt wird an kommerziell erhältliches Z-Pro­ ONph (Nitrophenylester) in Dimethylformamid angekoppelt. Das Produkt wird verseift und dann unter den gleichen Bedingungen weiterbehandelt, wie bei der Gewinnung von Verbindung A beschrieben.
¹H NMR (H₂O): CHε Nle 0,89; CHδ,γ Nle 1,35 (m, 4) CHβNle 1,84 (m, 1); CHβ Nle 1,73 (m, 1); CHαNle 4,12 (m, 1); NHNle 7,96 (d,1); CHγPro 2,02 (m, 2); CHβPro 1,98 (m, 1); CHβPro 2,25 (m, 1); CHδPro 3,63 (m, 1); CHδPro 3,52 (m, 1); CHαPro 4,28 (q, 1);P-CH₂- CH₂ 2,63 (m, 2) P-CH₂-CH₂ 1,70 (m, 2); CHβ Phe 2,73 (m, 1); CHβ Phe 3,31 (m, 1); CHαPhe 4,42 (m, 1); NHPhe 8,16; (d, 1); CHγPro 1,55 (m, 2); CHβPro 1,72 (m, 1); CHβPro 2,15 (m, 1); CHδPro 3,42 (m, 1); ChαPro 4,32 (q, 1); Z-CH₂- 5 (m, 2); Ar 7,35-7,45 (m, 10).
³¹P NMR (H₂O): 43,2
Beispiel 3 Herstellung des Peptids Z-Gly-Pro-Phe*-PO(OH)-CH₂-CH₂-CO-Pro-Nle°, 2Na⁺ (Verbindung C) (Z = C₆H₅OCO, Phe* = -NH-CH(CH₂C₆H₅)-)
Die Synthese dieses Peptids wird durch Ankoppeln von Z- Gly-Pro-ONph an die Verbindung Nr. 6, welche zuvor einer klassischen katalytischen Hydrogenolyse unterzogen wurde, ausgeführt und anschließend unter den gleichen Bedingungen weiterbehandelt, wie bei der Gewinnung der oben erwähnten Verbindung A beschrieben.
¹H NMR (H₂O): CHε Nle 0,89; CHw,γ Nle 1,35 (m, 4) CHβNle 1,84 (m, 1); CHβ Nle 1,73 (m, 1); CHαNle 4,12 (m, 1); NHNle 7,96 (d,1); CHγPro 2,02 (m, 2); CHβPro 1,98 (m, 1); CHβPro 2,25 (m, 1); CHδPro 3,63 (m, 1); CHδPro 3,52 (m, 1); CHαPro 4,28 (q, 1);P-CH₂- CH₂ 2,63 (m, 2) P-CH₂-CH₂ 1,70 (m, 2); CHa Gly 3,65 (d, 1); CHα Gly 3,45 (d, 1); CHβ Phe 2,73 (m, 1); CHβ Phe 3,31 (m, 1); CHαPhe 4,37 (m, 1); NHPhe 8,2 (d, 1); CHγPro 1,55 (m, 2); CHβPro 1,70 (m, 1); CHβPro 2,15 (m, 1); CHδPro 3,40 (m, 1); CHαPro 4,29 (q, 1); Z-CH₂- 5 (m, 2); Ar 7,35-7,45 (m, 10).
³¹P NMR (H₂O): 43,35
Beispiel 4 Herstellung des Cyclopeptids
Die Synthese dieses Produkts wird ausgeführt ausgehend von der Verbindung Z-Gly-Pro-Phe*-PO(OH)-CH₂-CH₂-CO-Pro- Nle°-OCH₃, die in Beispiel 3 im Verlauf der Synthese der Verbidnung C erhalten wurde. Man stellt durch Behandeln mit Hydrazin in Methanol das Hydrazid dieser Verbindung her, danach wird die Schutzgruppe Z durch klassische katalytische Hydrierung entfernt. Anschließend wird die Cyclisierung nach dem Verfahren von Bodanzsky M. und Henes G.B. (1975) Bioorg. Chem. Band 4, S. 212-218 durchgeführt.
¹H NMR (H₂O): CHε Nle 0,92; CHδ Nle 1,28 (m, 2) CHγNle 1,28 (m, 2); CHβ Nle 1,95 (m, 1); CHβNle 1,67 (m, 1); CHαNle 4,5 (m, 1); NHNle 8,31 (d,1); CHγPro 2,11 (m, 2); CHβPro 2,02 (m, 1); CHβPro 2,38 (m, 1); CHδPro 3,63 (m, 1); CHδPro 3,82 (m, 1); CHαPro 4,38 (q, 1) ;P- CH₂-CH₂ 2,68 (m, 2) P-CH₂-CH₂ 1,62 (m, 1); P-CH₂-CH₂ 2,29 (m, 1); CHβ Phe 2,78 (m, 1); CHβ Phe 3,25 (m, 1); CHαPhe 4,27 (m, 1); NHPhe 8,33 (d, 1); CHγPro 1,88 (m, 2); CHβPro 1,18 (m, 1) CHβPro 2,06 (m, 1); CHδPro 3,58 (m, 1); CHδ Pro 3,41 (m, 1) CHαPro 4,28 (q, 1); Ar 7,35- 7,45 (m, 10).
³¹P NmR (H₂O): 43,83
Beispiel 5 Bestimmung der Inhibitoraktivitäten
Die Aktivitäten der verschiedenen Verbindungen A, B, C und D sind zum einen bestimmt worden durch Messen der Geschwindigkeitskonstante der Bindung der Inhibitoren an Kollagenase nach dem Verfahren von Morrison, J. und Walsh, C.T. (1987), Adv. Enzymol. Relat. Aeras Mol. Biol., was im Fall von Inhibitoren des slow binding-Typs angewandt wurde; zum anderen durch Messen der Geschwindigkeitskonstanten der Dissoziation der Inhibitoren vom Enzym-Inhibitor-Komplex. In diesem Fall wird, nachdem die Kollagenase in Gegenwart eines Überschusses des Inhibitors vorinhubiert worden ist, der so gebildete Enzym-Inhibitor-Komplex durch Gelfiltration gereinigt. Anschließend wird die den gereinigten Komplex enthaltende Lösung um einen Faktor 10 000 in einer Referenz-Pufferlösung verdünnt und man mißt anschließend als Funktion der Zeit die Rückkehr der Aktivität der Kollagenase, die der Dissoziation des Inhibitors vom Enzym-Inhibitor-Komplex entspricht.
Die in der folgenden Tabelle angegebenen Inhibitionskonstanten entsprechen dem Zusammenhang mit den so bestimmten Geschwindigkeitskonstanten der Dissoziation Koff und der Assoziation Kon. Bei allen Experimenten zur Messung der Aktivität haben wir als synthetisches Substrat das Fa-Leu-Gly-Pro-Ala in einem Tricine ph7 Puffer verwendet. Die Quelle der verwendeten bakteriellen Kollagenase ist der Stamm Empedobaterium collagenolyticum.
Zum Vergleich wurden auf die gleiche Weise die Aktivität der folgenden Verbindungen bestimmt:
welche in der gleichen Weise wie die Verbindung A hergestellt wurden, jedoch unter Verwendung von dem Peptid Ala-Nle-OCH3 anstelle des Peptids Pro-Nle-OCH3 für die Verbindung E im Schritt f) Ethylmethacrylat anstelle von Ethylacrylat für die Verbindung F im Schritt d).
In Anbetracht der Ergebnisse der Tabelle im Anhang stellt man fest, daß das Ersetzen des Pro in der Verbindung A durch eine Aminosäure, die nicht zu der Gruppe des Hydroxyprolins, des Thiazolidins und des Dehydroprolins gehört, die Aktivität der Verbindung gegenüber bakteriellen Kollagenasen stark herabsetzt.
Ebenso führt das Ersetzen des Glycins durch Alanin zu schlechten Ergebnissen.
Tabelle

Claims (15)

1. Peptidderivat entsprechend der Formel in welcher
R1 für ein Wasserstoffatom, eine Gruppe, die als Schutzgruppe für das Aminoende einer alpha-Aminosäure wirken kann, oder ein Radikal steht, das von einer alpha- Aminosäure oder einem Peptid abgeleitet ist, das an NH über sein CO-Ende gebunden ist und an seinem Aminoende ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe, die als Schutzgruppe für das Aminoende einer alpha-Aminosäure wirken kann, enthält,
R2 die Seitenkette einer alpha-Aminosäure ist,
R3 ein Wasserstoffatom, ein Metallatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine Benzylgruppe ist,
R4 ein bivalentes Radikal ist, das von einer alpha- Aminosäure abgeleitet ist, die aus Prolin, Hydroxyprolin, Thiazolidin und Dehydroprolin mit den Formeln: ausgewählt wird, und das an CO über sein Stickstoffatom gebunden ist,
R5 ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist,
R⁶ eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder die Seitenkette einer alpha-Aminosäure ist, und
R⁷ für OR⁸ steht, wobei R⁸ für ein Wasserstoffatom, ein Metallatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine Benzylgruppe steht,
oder in welcher entweder R¹ und R⁷, oder R¹ und R⁶ zusammen ein bivalentes Radikal bilden, das von einer alpha-Aminosäure oder einem Peptid abgeleitet ist, welches 2 bis 3 Aminosärereste enthält.
2. Peptidderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R⁴ für das Radikal der Formel: steht.
3. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß R5 ein Wasserstoffatom und R6 die n-Butylgruppe ist.
4. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß R2 für das Phenylmethylradikal steht.
5. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß R1 für eine Gruppe steht, die als Schutzgruppe für das Aminoende einer alpha-Aminosäure wirken kann.
6. Derivat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß R1 die Benzyloxycarbonylgruppe ist.
7. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß R1 für ein Radikal steht, das von Prolin abgeleitet ist, welches eine Gruppe enthält, die als Schutzgruppe für sein Aminoende wirken kann.
8. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß R1 für das vom Peptid Pro-Gly abgeleitete Radikal steht, welches am Aminoende von Gly durch eine Schutzgruppe geschützt ist.
9. Peptidderivat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzgruppe die Benzyloxycarbonyl-Gruppe ist.
10. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß R7 für OR8 steht, wobei R8 für ein Natriumatom steht und R3 für ein Natriumatom steht.
11. Peptidderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß R1 und R7 zusammen das bivalente Radikal Pro-gly bilden.
12. Verfahren zum Herstellen eines Peptidderivats entsprechend der Formel: in welcher R1 eine Gruppe ist, die als Schutzgruppe für das Aminoende einer alpha-Aminosäure wirken kann, R2, R3, R4, R5 und R6 die in Anspruch l angegebene Bedeutung haben, und R7 für OR8 steht, wobei R8 identisch mit R3 ist, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:
  • a) Umsetzen eines Aldehyds der Formel R2-CHO, in welchem R2 die oben angegebene Bedeutung hat, mit Diphenylaminohypophosphit, um eine Diphenylmethylaminoalkylphosphinsäure der Formel: zu erhalten,
  • b) Umsetzen der Diphenylmethylaminoalkylphosphinsäure der Formel (II) mit einer Halogenwasserstoffsäure der Formel HX, in welcher X ein Halogenatom ist, um eine Aminoalkylphosphinsäure der Formel: zu erhalten,
  • c) Schützen des Aminoendes der Aminoalkylphosphinsäure der Formel (III) durch die Schutzgruppe R1, um die Aminoalkylphosphinsäure der Formel: zu erhalten,
  • d) Umsetzen der Säure der Formel (IV) mit einem Alkylacrylat der Formel: CH2 = CH - COOR⁹in welcher R9 ein Alkylradikal ist, um eine Verbindung der Formel: zu erhalten,
  • e) Verseifen der Verbindung der Formel (V), um die Säure der Formel (VI) zu erhalten,
  • f) Umsetzen der Säure der Formel (VI) mit einem Peptid der Formel in welchem R9 ein Alkylradikal ist, um ein Peptid der Formel (VII) zu erhalten,
  • g) Umsetzen des Peptids der Formel (VII) mit einem Halogenid der Formel R3X, in welchem R3 die oben angegebene Bedeutung hat und X ein Halogenatom ist, um das Peptid der Formel (I) zu erhalten.
13. Verfahren zum Herstellen eines Peptidderivats entsprechend der Formel: in welcher R1 ein Radikal ist, das von einer Aminosäure oder einem Peptid abgeleitet ist, dessen Aminoende durch eine Schutzgruppe geschützt ist, R2, R3, R4, R5 und R6 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, und R7 für OR8 steht, wobei R8 identisch mit R3 ist, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:
  • a′) Herstellen eines Peptids der Formel (VII) durch Ausführen der Schritte a) bis f) des Verfahrens von Anspruch 12.
  • b′) Entfernen der Schutzgruppe R¹ des Peptids der Formel (VII), um das Peptid der Formel: zu erhalten,
  • c′) Umsetzen des Peptids der Formel (VIII) mit einer Aminosäure oder einem Peptid, dessen Aminoende durch eine Schutzgruppe geschützt ist und dessen Carboxylende durch eine Nitrophenylgruppe aktiviert ist,
  • d′) Umsetzen des in Schritt c′) erhaltenen Peptids mit einem Halogenid der Formel R³X, in dem X ein Halogenatom ist.
14. Verfahren zum Herstellen eines Cyclopeptidderivats entsprechend der Formel: in welchem R10 für ein bivalentes Radikal steht, das von einer Aminosäure oder einem Peptid abgeleitet ist, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:
  • a′′) Herstellen eines Peptids der Formel (VII) durch Ausführen der Schritte a) bis f) des Verfahrens von Anspruch 12,
  • b′′) Entfernen der Schutzgruppe R¹ des Peptids der Formel (VII), um das Peptid der Formel: zu erhalten,
  • c′′) Umsetzen des Peptids der Formel (VIII) mit einem Peptid der Formel R¹-R¹⁰-OR¹¹, in welchem R¹ eine Schutzgruppe für das Aminoende des Peptids und R¹¹ eine Nitrophenylgruppe ist, um ein Peptid der Formel: zu erhalten,
  • d′′) Umsetzen des Peptids der Formel (IX) mit Hydrazin, um das Hydrazid der Formel: zu erhalten.
  • e′′) Entfernen der Schutzgruppe des Hydrazids der Formel (X), um ein Hydrazid der Formel: zu erhalten,
  • f′′) Cyclisieren des Hydrazids der Formel (XI), um das Cyclopeptid der Formel: zu erhalten.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Peptidderivats nach einem der Ansprüche 1 bis 11 umfaßt, wobei R3 für ein Wasserstoffatom oder Metallatom steht.
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