DE60005788T2

DE60005788T2 - Phosphinic pseudopeptide als matrix metalloprotease-inhibitoren

Info

Publication number: DE60005788T2
Application number: DE60005788T
Authority: DE
Inventors: Paul Di Basset; Vincent Dive; Philippe Cuniasse; Marie-Christine Rio; Athanasios Yotakis; Fabrice Beau; Stamania Vassiliou
Original assignee: BASSET GENEVIEVE LF; Basset Genevieve Lf; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique CEA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1999-01-19
Filing date: 2000-01-18
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2020-01-19
Also published as: US6630501B1; WO2000043404A1; CA2360787A1; FR2788525A1; DE60005788D1; EP1144421B1; DK1144421T3; EP1144421A1; ATE251630T1; FR2788525B1; ES2208260T3; JP2003517450A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Phosphinsäurepseudopeptide, die insbesondere als sehr starke und spezifische Inhibitoren für Matrix-Zink-Metallproteasen (MMP), insbesondere für MMP-11, MMP-2, MMP-9 und MMP-8, verwendbar sind. Diese Pseudopeptide sind dagegen sehr wenig aktiv gegenüber MMP-1 und MMP-7. Auch bieten diese Inhibitoren die Möglichkeit, in vivo nur eine MMP-Unterfamilie zu blockieren und sie könnten sich diesbezüglich als weniger toxisch erweisen als MMP-Inhibitoren mit einem sehr breiten Aktivitätsspektrum.
Diese Pseudopeptide können verwendet werden für die Behandlung von Erkrankungen, die durch eine Überexpression der Matrix-Proteasen charakterisiert sind, wie z. B. der Degenerierung von Bindegeweben und Gelenkgeweben, bei rheumatoiden Arthritiden, Osteoarthritiden, dem Aortenaneurisma und Krebs.
Auf der Basis von Untersuchungen, die in vivo bei Tieren durchgeführt wurden, scheinen diese Phosphinsäure-Inhibitoren verwendbar zu sein in pharmazeutischen Zusammensetzungen zum Blockieren des Wachstums von primären oder sekundären Tumoren.
Stand der Technik
Die Matrix-Zink-Metallproteasen (MMP) stellen eine Familie von Enzymen dar, die allgemein die Gesamtheit der Proteine der extrazellulären Matrix spalten können. Wegen ihres Einflusses auf die Proteine der extrazellulären Matrix spielen diese Enzyme eine sehr wichtige Rolle bei der Entwicklung und dem Verlauf der verschiede- nen Prozesse der Gewebsverformung, wie z. B. der Involution der Brustdrüse, der Vernarbung und der Extravasion von spezialisierten Zellen der Immunantwort.
Beim Menschen sind heute etwa 15 Enzyme bekannt, die zur Familie der MMP gehören:
Die Kollagenasen scheinen die einzigen MMP zu sein, die in der Lage sind, das Kollagen in Form von Fibrillen zu spalten. Die Gelatinasen A und B sind charakterisiert durch ihre Fähigkeit, Kollagen vom Typ IV, das in großer Menge im Bereich der Basalmembranen vorkommt, und Kollagen in denaturierter Form zu spalten. Die Stromelysine 1 und 2 sind verantwortlich für den Abbau von anderen Proteinen der extrazellulären Matrix wie des Fibronectins und verschiedener Proteoglycane. Die MT-MMP sind vor allem beteiligt an der Aktivierung der Gelatinase A und aufgrund ihrer Anordnung auf der Membran spielen diese Matrixine die Rolle von Membran-Rezeptoren für Gelatinase A. Es sei darauf hingewiesen, dass das physikalische Substrat von Stromelysin-3 nicht immer bekannt ist. Dennoch zeigen mehrere Arbeiten über diese Protease, die ursprünglich in Brusttumoren charakterisiert worden sind, dass das Stromelysin-3 ein wichtiger Faktor für die Entwicklung und das Überleben von Tumoren ist.
Die MMP scheinen bei verschiedenen Pathologien beim Menschen, insbesondere beim Krebs, überexprimiert zu werden. Bei dieser Pathologie wurde die Rolle der MMP lange Zeit in Verbindung gebracht mit der Invasion der Tumorzellen und ihrer Fähigkeit, verschiedene Sperren (Sperrschichten) zu überwinden, um Sekundärtumoren zu bilden. Verschiedene neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass diese Proteasen sicherlich eine fundamentalere Rolle bei der Cancerogenese spielen, insbesondere beim Wachstum der primären Tumoren. Unter den verschiedenen Hypothesen zur Erklärung dieser Funktion der MMP betreffen die am besten untersuchten ihre Rolle bei:

– ihrer Fähigkeit, durch Proteolyse von Proteinen der extrazellulären Matrix aus dieser Matrix Wachstumsfaktoren freizusetzen, die unerlässlich sind für die Entwicklung und das Überleben der Tumoren, und
– der Angiogenese, die erforderlich ist für das Wachstum der Tumoren.

Die offensichtliche Beteiligung der MMP am Wachstum der Tumoren hat zahlreiche Forschergruppen auf der Welt dazu veranlasst, sich für die Rolle von Verbindungen zu interessieren, welche diese Enzyme inhibieren (hemmen) können.
Seit vielen Jahren wurden Programme zur Synthese von MMP-Inhibitoren entwickelt. In jener Zeit lagen die Anwendungen der MMP-Inhibitoren vor allem auf dem Gebiet der Entzündungserkrankungen von Bindegeweben. Erst vor kurzem wurden mehrere Programme zur Anwendung der MMP-Inhibitoren in der Cancerologie entwickelt, wie von Brown in "Medical Oncology", 1997, 14, Seiten 1–10 [1], beschrieben. Wie oben angegeben, sind nämlich die Arbeiten, die zeigen, dass die MMP als bevorzugte Ziele für die Entwicklung von neuen Antikrebsmitteln angesehen werden müssen, erst jüngsten Datums. Diesbezüglich sei darauf hingewiesen, dass in dem Jahr 1997 weltweit 67 Patente, welche die Synthese von MMP-Inhibitoren betreffen, eingereicht worden sind, deren überwiegender Anteil Anwendungen in der Cancerologie betrifft, wie es von Beckett et al. in "Exp. Opin. Ther. Patents", 8, Seiten 259–289, 1998 [2], beschrieben worden ist. Bei der Mehrzahl dieser Patente gehören die synthetisierten Verbindungen zur Familie der Pseudopeptid-Derivate, die eine Hydroxamat-Funktion aufweisen. Einige Patente betreffen Pseudopeptid-Verbindungen, die Carboxylalkyl- oder Thiol-Funktionen aufweisen. In diesen Verbindungen treten die Hydroxamat-, Thiol- oder Carboxylalkyl-Funktionen mit dem Zinkatom in Wechselwirkung, das an der aktiven Stelle der MMP vorhanden ist. Die wegen ihrer Antikrebs-Aktivität am weitesten entwickelten Verbindungen wurden von der Firma British Biotechnology entwickelt. Zwei Verbindungen, das Batismatat BB94 und das Marimastat, waren Gegenstand von klinischen Untersuchungen der Phasen II und III beim Menschen. Seither scheint es, dass weitere Firmen (Roche, Bayer, Agouron, Novartis) klinische Untersuchungen der Phasen I und II mit MMP-Inhibitoren in der Cancerologie durchgeführt haben.
Keine der Verbindungen, welche die aus den Dokumentenen [1] und [2] bekannten MMP inhibieren können, besteht aus einem Phosphinsäure-Pseudopeptid.
In dem Dokument: Goulet et al, "Bioorg. Med. Chem. Lett." 4,1994, Seiten 1221–1224 [3], sind jedoch Phosphinsäure-Pseudopeptide beschrieben, die als selektiver Inhibitor für das Stromelysin-1 (MMP-3) verwendbar sind, welche die Endsequenz aufweisen:
Caldwell et al beschreiben in "Bioorg. Med. Chem. Letter", 6, 1996, Seiten 323 –328 [4], ebenfalls ein Phosphinsäure-Pseudopeptid, bei dem es sich um einen seletiven Inhibitor für das Stromelysin-1 (MMP-3) handelt, das die gleiche Endsequenz wie das Pseudopeptid des Dokuments [3] aufweist.
In diesen Dokumenten [3] und [4] wurde die Aktivität gegenüber MMP-3 erforscht, während erfindungsgemäß eine selektive Aktivität gegenüber MMP-11, MMP-2, MMP-9 und MMP-8 erforscht wird. Andererseits ist festzustellen, dass in der vorliegenden Erfindung R³ nicht nur ein Phenylethyl-Rest ist. Noch wichtiger ist jedoch, dass die Erfindung zeigt, dass andere Substituenten in dieser Position Verbindungen mit einer höheren Inhibitor-Aktivität ergeben.
Die Dokumente FR-A-2 676 059 [5], FR-A-2 689 764 [6] und EP-A-0 725 075 [7] erläutern Phosphinsäure-Pseudopeptide, die eine Inhibitor-Aktivität gegenüber bakteriellen Kollagenasen und Endopeptidasen mit Zink 24.15 und 24.16 aufweisen.
Das Dokument WO 98/03516 beschreibt Inhibitoren für Matrix-Metallproteasen auf Basis eines Phosphinats der Formel:
in der R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R¹⁶ sehr zahlreiche Gruppen darstellen können.
Das Dokument WO 93/14112 beschreibt Phosphinsäure-Peptidderivate der Formel
in der X, Y, R₁, R₂, R₃ und R₄ sehr zahlreiche Bedeutungen haben können, die verwendbar sind für die Behandlung von Erkrankungen, die durch Matrix-Metallendoproteinasen verursacht werden.
Ziel der vorliegenden Erfindung sind insbesondere neue Phosphinsäure-Pseudopeptide, die eine starke und spezifische Inhibitor-Aktivität gegenüber den Matrix-Zink-Metallproteasen MMP-11, MMP-2, MMP-9 und MMP-8 aufweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Erfindungsgemäß entspricht das Phosphinsäure-Pseudopeptid der Formel:
in der bedeuten:

– R¹ eine Gruppe, die eine Amin-Funktion blockiert, oder einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest mit einer terminalen blockierten Amino-Funktion, wie im Anspruch 1 definiert,
– R² die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure, wie im Anspruch 1 definiert,
– R³
1) die Seitenkette einer natürlichen Aminosäure, ausgenommen Gly und Ala, die unsubstituiert oder durch eine Arylgruppe substituiert ist,
2) eine Aralkylgruppe, oder
3) eine Alkylgruppe mit mindestens 3 Kohlenstoffatomen und
– R⁴ eine Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure, wie im Anspruch 1 definiert, oder eine Dinitrobenzylgruppe.

Dieses Pseudopeptid der Formel (I) ist ein Pseudotripeptid, das eine chemische Gruppe vom Phosphinsäure-Typ aufweist, welche die Funktion hat, das Zinkatom der MMP in Form eines Chelats zu binden. In diesem Pseudotripeptid ist es durch geeignete Wahl der Gruppen R², R³ und R⁴ möglich, die Wechselwirkung des Tripeptids jeweils mit den Unterzentren S1, S1' und S2' der MMP zu gewährleisten. Die Gruppe R¹ tritt, wie angenommen wird, mit der Verbindungsstelle zwischen den Unterzentren S3/S2 in Wechselwirkung.
In der vorstehend angegebenen Definition der erfindungsgemäßen Pseudopeptide beziehen sich die für R¹, R², R³ und R⁴ in [5] verwendeten Ausdrücke "Aminosäure" auf 20 α-Aminosäuren, die gemeinsam in den Proteinen anzutreffen sind, die auch unter der Bezeichnung "Standard-Aminosäuren" bekannt sind, und auf ihre Analogen. Die Seitenketten dieser Aminosäuren enthalten lineare und verzweigte Alkylgruppen, Hydroxyalkyl-, Carboxyalkyl-, Aralkyl-, Aminoalkyl-, Carboxamidalkyl-, Mercaptoalkyl-, Phenylalkyl-, Hydroxyphenylalkyl-, Guanidinoalkyl-, Imidazoylalkyl-, Indolylalkyl- und Pyrrolidinyl-Gruppen.
Als Beispiele für verwendbare Aminosäuren können genannt werden Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Norleucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Hydroxyprolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, Nitrophenylalanin, Homoarginin, Thiazolidin und Dehydroprolin. Im Falle von R³ kann jedoch die Aminsäure nicht Gly oder Ala sein, weil diese keine ausreichende Wechselwirkung mit dem Unterzentrum S1' der MMP aufweist.
Vorzugsweise wird die für R³ verwendete Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Phe, Leu oder auch aus den Resten Ser, Cys, deren Seitenkette durch eine Arylalkylgruppe substituiert ist.
Die verwendbaren Arylgruppen sind diejenigen Derivate eines monocyclischen oder polycyclischen Kerns, die gegebenenfalls durch Alkyl- oder Alkoxygruppen substituiert sind. Als Beispiele für verwendbare Arylgruppen können genannt werden die Phenyl-, Naphthyl-, Benzyl- und Alkoxybenzyl-Gruppen, wie z. B. die p-Methoxybenzylgruppe.
R³ kann außerdem eine Aralkylgruppe darstellen. Die Arylgruppe in dieser Aralkylgruppe kann eine der oben genannten Gruppen sein. Der Alkylanteil der Aralkylgruppe kann eine lineare oder verzweigte Kette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sein.
Als Beispiele für verwendbare Aralkylgruppen können die Gruppen der Formeln genannt werden:
worin n für eine ganze Zahl von 1 bis 4 steht, und
worin p für die Zahl 1 oder 2 steht.
Die für R³ verwendbaren Alkylgruppen weisen mindestens 3 Kohlenstoffatome auf. Sie können linear oder verzweigt sein, und sie weisen vorzugsweise höchstens 7 Kohlenstoftatome auf. Als Beispiele für verwendbare Alkylgruppen können genannt werden die Gruppen CH₃-(CH₂)₆- und (CH₃)₂-CH-CH₂-.
Vorzugsweise steht R³ für eine Gruppe, die einer der folgenden Formeln entspricht:
Erfindungsgemäß wird R² so ausgewählt, dass es mit dem Unterzentrum S1 der MMP in Wechselwirkung tritt. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn R² für die Methyl- oder Benzyl-Gruppe steht; vorzugsweise steht R² für die Benzylgruppe, die der Seitenkette von Phe entspricht.
Erfindungsgemäß wird R⁴ so ausgewählt, dass es mit dem Unterzentrum S2' der MMP in Wechselwirkung tritt. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn R⁴ die Seitenkette Trp oder eine Dinitrobenzylgruppe (Dpa) darstellt.
In dem erfindungsgemäßen Pseudopeptid können die Seitenketten R², R³ und R⁴ der Aminosäuren in der L- oder in der D-Form vorliegen. Außerdem kann das Pseudopeptid aus einem einzigen Isomeren oder aus einer Mischung von 4-Diasteroisomeren aufgebaut sein, die aufgrund der Anwesenheit von zwei asymmetrischen Zentren im Bereich der α-Kohlenstoffatome, welche die Reste R² und R³ tragen, vorliegen können. Obgleich jede Konfiguration der Aminosäuren geeignet ist, ist es bevorzugt, dass das asymmetrische Kohlenstoffatom der Aminosäure
in er L-Form vorliegt.
Dagegen weisen drei von vier Diasteroisomeren, die den verschiedenen Konfigurationen von R² und R³ entsprechen, Aktivitäten auf, die praktisch äquivalent sind als Inhibitoren der MMP.
In den erfindungsgemäßen Pseudopeptiden kann R¹ verschiedene Gruppen darstellen, deren Natur die Affinität des Pseudopeptids gegenüber verschiedenen MMP beeinflusst.
R¹ steht für "eine Gruppe, die eine Aminfunktion blockiert". Dieser Ausdruck umfasst die Gruppen t-Butoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Cinnamoyl, Pivaloyl und N-(I-Fluorenyl-methoxycarbonyl) Fmoc.
R¹ steht für blockierende Gruppen, die ausgewählt sind unter den Acetyl-, Benzyloxyacetyl-, Phenylaminoacetyl-, (m-Chlorophenyl)aminoacetyl-, (2-Hydroxy-5-chlorophenyl)-aminoacetyl-, Indolyl-2-carbonyl-, 4,6-Dichloroindolyl-2-carbonyl-, Chinolyl-2-carbonyl- und 1-Oxa-2,4-dichloro-7-naphthalincarbonyl-Gruppen, oder auch für einen Aminosäure- oder Peptid-Rest, dessen terminale Amin-Funktion durch eine geeignete Gruppe blockiert ist. Als Beispiele für derartige Reste können genannt werden die Gruppen Z-Ala und Z-Leu, in denen Z für die Benzyloxycarbonyl-Gruppe steht.
Die erfindungsgemäßen Pseudopeptide können nach klassischen Verfahren hergestellt werden, wobei man von Phosphinsäureblöcken der Formel:
in der Z steht für die Benzyloxycarbonylgruppe und Ad steht für die Adamantylgruppe,
und der R⁴ entsprechenden Aminosäure ausgeht, durch chemische Synthese in fester Phase nach den Verfahren, wie sie von Yotakis et al in "J. Org. Chem.", 1996, 61, Seiten 6601–6605 [8], und von Jiracek et al in "J. Biol. Chem.", 1995, 270, Seiten 21701–21706 [9] und in "J. Biol. Chem.", 1996, 271, Seiten 19606–19611 [10], beschrieben sind.
Die als Ausgangsmaterial verwendeten Phosphinsäure-Blöcke können erhalten werden durch Michael-Addition einer Phosphinsäure, welche die Gruppe R² trägt
an ein Acrylat, das die Gruppe R³ liefert
worin Et die Ethylgruppe darstellt.
Die Acrylate, welche die Gruppe R³ liefern, können auf verschiedenen Wegen synthetisiert werden, wie nachstehend beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Pseudopeptide können verwendet werden für die Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine Überexpression der Matrix-Zink-Metallproteasen eine Rolle spielt.
Außerdem betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens eine Matrix-Zink-Metallprotease hemmt (inhibiert), die mindestens ein Pseudopeptid der Formel (I), wie weiter oben definiert, umfasst.
Vorzugsweise hemmt diese Zusammensetzung eine Matrix-Zink-Metallprotease, ausgewählt unter MMP-2, MMP-8, MMP-9 und MMP-11.
Diese Zusammensetzung ist bestimmt für die Behandlung einer Krankheit, die durch die Überexpression von Matrix-Proteasen charakterisiert ist, wie z. B. Krebs.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines Phosphinsäure-Pseudopeptids der Formel (I), wie weiter oben definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels, das mindestens eine Matrix-Zink-Metallprotease, insbesondere MMP-2, MMP-8, MMP-9 und MMP-11, hemmt (inhibiert).
Weitere Charakteristika und Vorteile der Erfindung gehen aus der Lektüre der nachfolgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen besser hervor.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 zeigt ein Schema zur Synthese von erfindungsgemäßen Pseudopeptiden.
Die 2 stellt ein Diagramm dar, das die antitumorale Wirksamkeit einer erfindungsgemäßen Verbindung erläutert, in dem das mittlere Volumen des Tumors (in mm³) als Funktion der Zeit (in Tagen) nach der Injektion von Krebszellen bei Vergleichsmäusen und bei Mäusen, die mit dem erfindungsgemäßen Pseudopeptid behandelt worden sind, darstellt.
Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Die folgenden Beispiele 1 bis 27 erläutern die Herstellung von erfindungsgemäßen Pseudopeptiden.
In der 1 ist ein Schema zur Synthese der erfindungsgemäßen Pseudopeptide dargestellt, bei dem eine erste Reaktion zur Herstellung von Phosphinsäure- Blöcken 3 aus einer Phosphinsäure 1, welche die Gruppe R² trägt, und einem Acrylat 2, welches die Gruppe R³ liefert, durch Michael-Addition dargestellt ist.
Nach der Bildung des Phosphinsäure-Blockes 3 führt man eine Adamantylgruppe in die Hydroxyphosphinyl-Funktion des Blockes 4 ein, dann eliminiert man die C-terminale Ester-Funktion 5 und führt eine Synthese in fester Phase des Pseudopeptids durch Addition der gewünschten Aminosäure 6 an die C-terminale Säurefuntion durch.
In dieser Figur steht Z für die Benzyloxycarbonylgruppe.
Beispiele 1 bis 5
Diese Beispiele erläutern die Herstellung von Acrylaten 2, die eine Gruppe R³ mit terminalem CH₂ aufweisen, nach dem folgenden Verfahren:
Weg A:
Diese Synthese entspricht dem von Eistetter et al in "J. Med. Chem.", 25, Seiten 109–113, 1982 [11], beschriebenen Verfahren.
Nachstehend wird diese Synthese für den Fall beschrieben, dass R³ für die in der Tabelle 1 erläuterten Gruppen steht.
Zu einer Natriumethoxid-Lösung (10 mmol Natrium in 11 ml absolutem Ethanol) gibt man über einen Zeitraum von 10 min 10 mmol Diethylmalonat zu. Man rührt die Lösung 1 h lang bei 50°C, dann tropft man dieser 10 mmol des erforderlichen Bromids zu. Man rührt die Mischung 6 h lang bei 50°C, dann eliminiert man das Et hanol unter Vakuum und gibt Diethylether zu. Man wäscht diese Lösung mit Wasser, mit einer Kochsalzlösung und trocknet über Na₂SO₄, dann engt man ein, wobei man einen ölige Rückstand erhält, der nach der Destillation den Diester der Formel:
in Ausbeuten von 40 bis 65% ergibt.
Zu einer Lösung von 10 mmol Diester in 8 ml Ethanol gibt man eine Lösung von KOH (10 mmol) in 8 ml Ethanol zu, man rührt die Mischung 16 h lang. Nach dem Verdampfen des organischen Lösungsmittels behandelt man den Rückstand mit Wasser und extrahiert mit Diethylether.
Man säuert die wässrige Phase mit 6N HCl an und extrahiert zweimal mit Diethylether. Man trocknet die organischen Phasen über Na₂SO₄ und dampft sie ein, wobei man die Monoester der Formel:
in Ausbeuten von 65 bis 90% erhält.
Zu einer Lösung des Monoesters in 0,8 ml Pyridin und 0,05 ml Piperidin gibt man 6 mmol Paraformaldehyd zu, dann rührt man die Mischung unter Erwärmen auf 50 bis 55°C 3 h lang. Nach der Zugabe von Diethylether wäscht man die organische Phase mit Wasser und 3N HCl, dann trocknet man über Na₂SO₄ und engt ein, wobei man die Verbindungen 2a bis 2c mit den in der Tabelle angegebenen Ausbeuten erhält.
Die Schmelzpunkte der erhaltenen Acrylate 2a bis 2e sind ebenfalls in der Tabelle 1 angegeben.
Beispiel 6
In diesem Beispiel, in dem R³ für CH₂R'³ steht, führt man die Acrylat-Synthese unter Anwendung des folgenden Syntheseweges durch:
Weg B
In diesem Beispiel wendet man diesen Syntheseweg an, um das Acrylat 2 herzustellen, in dem R³ für die Gruppe CH₃(CH₂)₆ steht, entsprechend R'³ = CH₃-(CH₂)₅. Unter einer Argonatmosphäre tropft man eine Lösung von Hexylbromid CH₃(CH₂)₅Br (1,65 g, 10 mmol) in 15 ml absolutem Diethylether über einen Zeitraum von 90 min in einen Kolben, der 0,22 g (11 mmol) Magnesium und Iod I₂ (katalytisch) enthält. Man bringt die Reaktionsmischung 1 h lang zum Rückfluss. Nach der Zugabe von 0,18 mmol CuI lässt man die Temperatur der Mischung auf –78 C sinken.
Dann gibt man langsam eine Lösung von 1,15 g (6,7 mmol) der Verbindung
in 10 ml Et₂O: THF zu. Man rührt die Mischung 30 min lang bei Umgebungstemperatur. Nach der Behandlung der Mischung mit 0,5 N HCl, 5%igem NaHCO₃ und Wasser trocknet man die organische Schicht über Na₂SO₄. Man eliminiert das Lösungsmittel unter Vakuum und reinigt den erhaltenen Rückstand durch Chromatographie an einer Kolonne unter Verwendung einer Mischung aus Petrolether von 40 bis 60°C/Ether (13 : 1) als Eluierungsmittel. Man erhält so die Verbindung 2f mit einer Ausbeute von 40%. Die Charakteristika der Verbindung 2f sind in der Tabelle 1 angegeben.
Beispiel 7
In diesem Beispiel stellt man ein Acrylat 2 mit R₃=R'³-CH₂- her unter Anwendung des Verfahrens, wie es von Baldwin et al in "J. Chem. Soc. Chem. Comm." 1986, Seite 1339–1340 [12], beschrieben ist.
Dieses entspricht dem folgenden Reaktionsschema:
Weg C:
Dieses Verfahren wird angewendet, um das Acrylat 2 g herzustellen, in dem R³ steht für die Gruppe der Formel:
Man bringt eine Mischung von 1,9 g (10 mmol) Ethylbrommethylacrylat und 3,3 g (20 mmol) des Natriumsalzes der Benzolsulfinsäure in 40 ml Methanol 12 h lang zum Rückfluss. Man eliminiert das Lösungsmittel und gibt Diethylether zu. Man wäscht die Lösung mit Wasser, mit Salzlösung, trocknet über Na₂SO₄ und engt ein, wobei man 2 g Sulfinsäureacrylat
in Form eines Öls mit einer Ausbeute von 80% erhält.
Zu einer Mischung von 2 g (8 mmol) Sulfinsäureacrylat in 40 ml trockenem Benzol gibt man 4,7 g (16,4 mmol) tri-n-Butylzinnhydrid und 0,15 g (0,96 mmol) 2,2'- Azobisisobutyronitril (AlBN) zu. Man bringt die Mischung 1,5 h lang zum Rückfluss, dann gibt man Wasser zu und trocknet die extrahierte organische Schicht über Na₂SO₄ und engt sie ein. Man reinigt das Rohprodukt durch Chromatographie an einer Kolonne, wobei man als Eluierungsmittel Petrolether (40 bis 60°C)/Ether (9 : 1) verwendet. Man erhält 2,9 g Alkylstannan
mit einer Ausbeute von 90%.
Man löst in 10 ml trockenem Benzol 1,47 g (3,6 mmol) Alkylstannan und 0,39 g (1,8 mmol) 2-Bromethylnaphthalin. Nach der Zugabe von 0,064 g (0,39 mmol) AlBN bringt man die Reaktionsmischung 2 h lang zum Rückfluss. Nach der Zugabe von Wasser trennt man die organische Phase ab, wäscht sie mit Wasser, trocknet sie über Na₂SO₄ und engt sie zur Trockne ein. Man erhält so 0,06 g des in der Tabelle 1 angegebenen Acrylats 2g mit einer Ausbeute von 13% nach der Reinigung des Rückstands an einer Chromatographiekolonne unter Verwendung von Petrolether (40 bis 60°C)/Ether (9 : 1) als Eluierungsmittel.
Beispiele 8 und 9
In diesen Beispielen stellt man ein Acrylat 2 her, in dem R³ ein Schwefelatom oder ein Sauerstoffatom trägt, wobei man nach dem folgenden Syntheseschema verfährt:
Weg D
In diesem Schema entspricht R³ RX-CH₂ mit X = S oder 0.
Man wendet dieses Verfahren an zur Herstellung der Acrylate 2h und 2i, in denen R³ für die p-Methoxybenzylthiomethyl-Gruppe bzw. die Benzylthiomethyl-Gruppe steht.
Zu einer in einem Eisbad gekühlten gerührten Lösung von 9 mmol Natrium in 20 ml Methanol tropft man über einen Zeitraum von 30 min eine Lösung von 10 mmol des geeigneten Thiols R-SH in 15 ml Methanol zu. Nach der Zugabe des Thiols engt man die Mischung zur Trockne ein und gibt Diethylether zu. Man kühlt das ausfallende Salz in einem Eisbad ab. Man filtriert das Produkt ab, wäscht es mit kaltem Et₂O und trocknet es über P₂O₅, wobei man das Natriumsalz mit einer Ausbeute von 85 bis 95% erhält. Zu einer Mischung von 10 mmol des Natriumsalzes, suspendiert in 40 ml trockenem Et₂O, die in einem Eisbad gekühlt wird, tropft man über einen Zeitraum von 45 min eine Lösung von Etyhlbrommethacrylat (9 mmol) in 20 ml Diethylether zu. Man rührt die Lösung 30 min lang bei 0°C und 1 bis 2 h lang bei Umgebungstemperatur. Man verdünnt die Reaktionsmischung mit 20 ml Wasser und wäscht die organische Schicht mit Wasser, dann trocknet man sie über Na₂SO₄ und dampft ein. Man reinigt die so erhaltenen Verbindungen 2h und 2i durch Chromatographie an einer Kolonne unter Verwendung von Petrolether (40–60°C)/Et₂O (8 : 2) als Eluierungsmittel.
Die Ausbeuten sind in der Tabelle 2 angegeben.
Beispiel 10
In diesem Beispiel stellt man das Acrylat 2j her, in dem R³ ROCH₂ entspricht und die Gruppe der Formel C₆H₄-CH₂-O-CH₂ darstellt, wobei man das vorstehend erläuterte Reaktionsschema anwendet mit R = OH.
Zu einem gut getrockneten Kolben gibt man kleine Stücke Natrium (10 mmol) mit 20 ml trockenem Diethylether zu. Zu dieser Reaktionsmischung gibt man eine Lösung von 10 mmol Benzylalkohol in 10 ml Diethylether über einen Zeitraum von 2 h unter mäßigem Rückfluss zu. Man bringt die Reaktionsmischung weitere 6 h lang zum Rückfluss. Man kühlt den erhaltenen weißen Niederschlag in einem Eisbad ab, filtriert ihn dann ab, wäscht ihn mit trockenem und kaltem Diethylether und trocknet über P₂O₅, wobei man das Natriumsalz mit einer Ausbeute von 85 bis 95% erhält.
Die Reaktion dieses Salzes mit Ethylbrommethacrylat und die Reinigung der erhaltenen Verbindung werden wie im Beispiel 8 beschrieben durchgeführt.
Das erhaltene Acrylate 2j ist in der Tabelle 2 angegeben.
Beispiele 11 bis 21
In diesen Beispielen stellt man Phosphinisäure-Blöcke 3 mit den in der Tabelle 3 angegebenen Resten R² und R³ her unter Anwendung des Verfahrens, wie es von Yiotakis et al. in "J. Org. Chem." 61, 1996, 6601–6605 [8], beschrieben ist.
Dieses Verfahren umfasst in einer ersten Stufe die in der 1 beschriebene Michael-Reaktion. Die als Ausgangsmaterial verwendete Phosphinsäure 1 (1) wurde nach dem von Baylis et al. in "J. Chem. Soc. Perkin Trans I", 1984, Seiten 2845–2853 [13], beschriebenen Verfahren hergestellt.
Die Acrylate 2 wurden in den Beispielen 1 bis 10 hergestellt. Zur Herstellung der Phosphinsäure-Blöcke arbeitet man auf die folgende Weise:
Man erwärmt eine Suspension von 1 mmol N-Benzoyloxycarbonylphosphinsäure 1 und 5 mmol Hexamethyldisilazan 1 h lang unter einer Stickstoffatmosphäre auf 110°C.
Anschließend tropft man 1,3 mmol des geeigneten Acrylats 2 innerhalb eines Zeitraums von 15 min zu. Man rührt die Reaktionsmischung weitere 3 h lang bei 110 °C. Man lässt die Mischung auf 70°C abkühlen und tropft 3 ml Ethanol zu. Nach dem Abkühlen auf Umgebungstemperatur engt man die Reaktionsmischung ein. Man reinigt den Rückstand durch Chromatographie an einer Kolonne unter Verwendung einer Mischung von Chloroform/Methanol/Essigsäure (7/0,5/0,5) als Eluierungsmittel. Man erhält so die Phosphinsäure-Blöcke 3a bis 3k mit den in der Tabelle 3 angegebenen Ausbeuten.
In dieser Tabelle ist in der Spalte R³ angegeben, welches Acrylat 2 für die Synthese des Phosphinsäure-Blockes verwendet wurde. In der Tabelle 3 sind auch die Rf-Werte der erhaltenen Blöcke angegeben.
Beispiele 22 und 23
In diesen Beispielen synthetisiert man die Phosphinsäure-Blöcke 3l und 3m, die den in der Tabelle 3 angegebenen Formeln entsprechen, auf die nachstehend angegebene Weise.
Man gibt 2,1 mmol Diisopropylamin und 2,1 mmol Trimethylsilylchlorid zu einer mit Eis gekühlten Lösung von 1 mmol Phosphinsäure 1 in 2 ml Chloroform zu.
Man rührt die Mischung 3 h lang bei Umgebungstemperatur. Nach dem Abkühlen auf 0°C gibt man 1,4 mmol des geeigneten Ethylacrylats 2 (2e oder 2g) zu, dann rührt man die Reaktionsmischung 16 h lang bei Umgebungstemperatur. Nach dem Zutropfen von Ethylalkohol eliminiert man die Lösungsmittel unter Vakuum. Man erhält die Verbindungen 3l oder 3m der Tabelle 3 nach einer Chromatographie an einer Kolonne wie im Falle der Beispiele 11 bis 21.
Die Ausbeuten und die Rf-Werte der erhaltenen Blöcke sind in der Tabelle 3 angegeben.
Die Blöcke 3b, 3d und 3e bis 3k wurden durch Protonen-NMR, durch C¹³-NMR und Phosphor-NMR charakterisiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Anlage darstellt.
Beispiel 24
In diesem Beispiel stellt man die Verbindungen 4a bis 4m der 1 her aus den Verbindung 3a bis 3m unter Anwendung der nachstehend beschriebenen Arbeitsweise.
In 10 ml Chloroform löst man 1 mmol der Verbindung 3a bis 3m und 1,2 mmol 1-Adamantylbromid. Man bringt die Reaktionsmischung zum Rückfluss. Anschließend gibt man 2 mmol Silberoxid in fünf gleichen Portionen über einen Zeitraum von 50 min zu. Man bringt die Lösung weitere 30 min lang zum Rückfluss. Nach dem Eliminieren der Lösungsmittel behandelt man den Rückstand mit Diethylether und filtriert über Celite. Man engt die Filtrate ein. Man reinigt den Rückstand durch Kolonnenchromatographie unter Verwendung einer Mischung von Chloroform/Isopropanol (9,8/0,2) als Eluierungsmittel. Auf diese Weise erhält man die Verbindung 4a bis 4m mit den in der Tabelle 4 angegebenen Ausbeuten, wobei die Rf-Werte dieser Verbindungen ebenfalls in der Tabelle 4 angegeben sind.
Beispiel 25
In diesem Beispiel folgt man der in der 1 darstellten Arbeitsweise zur Umwandlung der Verbindungen 4a bis 4m in die Verbindungen 5a bis 5m. Zu diesem Zweck arbeitet man wie folgt:
Zu einer gerührten Lösung von 1 mmol der Verbindung 4a bis 4m in 5,5 ml Methanol tropft man 1 ml 4 N NaOH zu. Man rührt die Reaktionsmischung 18 h lang. Dann eliminiert man das Lösungsmittel. Man verdünnt den Rückstand mit Wasser, dann rührt man mit 0,5 N HCl in einem Eisbad an, trocknet über Na₂SO₄ und engt ein, wobei man die Verbindungen 5a bis 5m in Form eines weißen Feststoffes mit den in der Tabelle 5 angegebenen Ausbeuten erhält. Die Rf-Werte dieser Verbindungen sind ebenfalls in der Tabelle 5 angegeben.
Beispiel 26
In diesem Beispiel stellt man Phosphinsäure-Pseudopeptide her, deren Formeln in den Tabellen 5 bis 7 angegeben sind, aus den Phosphinsäure-Blöcken der Tabelle 4 unter Anwendung einer Synthese in fester Phase mit der Chemikalie Fmoc (Fluorenylmethoxycarbonyl) nach dem von Yotakis et al. in "J. Org. Chem." 61, Seiten 6601 bis 6605, 1996 [8], und dem von Jiracek et al in "J. Biol. Chem.", 1995, 270, Seiten 21701–21706 [9], und in "J. Biol. Chem.", 1996, 271, Seiten 19606–19611 [10], beschriebenen Verfahren.
Die Verbindung 12 der Tabelle 6 ist nicht Teil der Erfindung.
Man führt die Kupplungen durch unter Anwendung der in situ-Strategie unter Verwendung von 2-(1H-Benzotriazol-1-yl-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorophosphat (HBTU)/Diisopropylethylamin. Die Kupplungs-Bedingungen sind die folgenden: 3 Äquivalente des Derivats der Aminosäure Fmoc und 4 Äquivalente Diisopropylethylamin in Dimethylformamid werden zu dem Harz zugegeben und man lässt 30 min lang damit reagieren. Für die Kupplung der Phosphinsäure-Blöcke:
verwendet man 1,5 Äquivalente des Blocks.
Die Bedingungen für die Abspaltung der Gruppe Fmoc sind 50% Piperidin in Dimethylformamid innerhalb von 30 min. Die Gruppe Fmoc ist die (Fluorenylmethoxy)carbonyl-Gruppe.
Beispiel 27
In diesem Beispiel führt man die Synthese der in der Tabelle 8 angegebenen Pseudopeptide durch, die Reste R¹ unterschiedlicher Natur aufweisen. Die Bedin gungen zur Einführung der Gruppe R¹ sind nachstehend entsprechend der Natur dieser Gruppe angegeben.
Für den Fall, dass R¹ eine Säure darstellt, die eine Indol- oder Chinolingruppe aufweist (Verbindungen 30, 31, 32, 33 der Tabelle 8), wurde die Kupplung von R¹ an das Peptid der allgemeinen Formel
das noch an das Harz gekuppelt war, unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 3 Äquivalente der verdünnten Säure in einem geringen Volumen N-Methylpyrolidon, 3 Äquivalente HBTU (0,4 M), 10 Äquivalente Diisopropylethylamin (1,2 M) bei einer Kupplungszeit von 45 min. Die Einarbeitung der Gruppe R¹ wird mit einem Kaiser-Test verfolgt. Erforderlichenfalls wird dieser Arbeitsgang mehrmals wiederholt, bis eine vollständige Substitution der Amin-Funktion vorliegt.
Die Einarbeitung der Gruppe R¹ = Ph-CH₂-O-CH₂-CO- (Verbindung 26) wurde durchgeführt unter Verwendung des entsprechenden chlorierten Derivats als Ausgangsverbindung unter den folgenden Bedingungen: das chlorierte Derivat (25 Äquivalente, 0,5 M/Dichlormethan) und das Diisopropylethylamin (25 Äquivalente, 0,5 M/Dichlormethan) werden zu dem Harz zugegeben. Die Acylierungsreaktion erfordert 1/2 h.
Für die Synthese der Verbindungen 27, 28 und 29 wurde das Peptid
das noch an das Harz gekuppelt war, zunächst mit dem Derivat Br-CH₂-CO-Br unter den folgenden Bedingungen aktiviert: das bromierte Derivat (25 Äquivalente, 0,5 M/Dichlormethan) und das Diisopropylethylamin (25 Äquivalente, 0,5 M/Dichlormethan) werden zu dem Harz zugegeben für eine Reaktionszeit von 1/2 h. Die zweite Stufe entspricht der Alkylierung der entsprechenden Anilin-Derivate. Zu diesem Zweck wird das Anilin-Derivat (50 Äquivalente/DMSO) zu dem Harz zugegeben für eine Kupplungsdauer von 2,5 h.
Die Abspaltung der Peptide von dem Harz sowie die Hydrolyse der Schutzgruppe wurde durchgeführt mit Hilfe einer Trifluoressigsäure-Lösung, die 2,5% Wasser, 2,5% Thioanisol, 1,25% Thiophenol, 1,25% Ethandithiol und 1,25% Triisopropylsilan enthielt.
Alle in den Beispielen 26 und 27 synthetisierten Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt mit Hilfe von Gradienten, die mit Lösungen von Wasser, Acetonitril, enthaltend 0,01% Trifluoressigsäure, hergestellt wurden. In der Mehrzahl der Fälle stellt man in den Chromatogrammen 4 Peaks fest, die den vier Formen der Diastereoisomeren entsprechen, die bei dem Syntheseprotokoll dieser Phosphinsäure-Verbindungen entstehen. Alle auf diese Weise gereinigten Phosphinsäure-Peptide wurden durch Massenspektroskopie kontrolliert.
Beispiel 28
In diesem Beispiel überprüft man die Affinitätskonstanten Ki der Pseudopeptide der Tabellen 5 bis 8 gegenüber verschiedenen Matrix-Metallproteasen MMP.
Die verwendeten MMP wurden in rekombinanter Form hergestellt in einem Expressionssystem von E. coli, dann durch Chromatographien verschiedener Typen gereinigt. Abgesehen von Tromelysin-3 (MMP-11), entsprechen die gebildeten MMP den Human-Sequenzen. Das in dieser Untersuchung verwendete Stromelysin-3 entspricht der Murin-Form.
Die Aktivität jedes MMP wurde bestimmt unter Verwendung von zwei fluorogenen synthetischen Substraten. Das Abschneiden dieser Substrate, das ein Fluoreszenz-Signal proportional zur Menge des abgespalteten Substrats ergibt, erlaubt eine genaue Bestimmung der kinetischen Parameter. Die Werte der Konstanten Km der Substrate, die berücksichtigt wurden bei der Bestimmung des Wertes der Ki, sind in der folgenden Tabelle angegeben. Die Affinitätskonstanten Ki wurden errechnet aus der Gleichung von Horowitz et al. in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 1987, 84, Sei ten 6654–6658 [14], wobei die Abhängigkeit des experimentell gemessenen Inhibierungsprozentsatzes entsprechend der Inhibitor-Konzentration von der Enzym-Konzentration und der Substrat-Konzentration berücksichtigt wurden.
Die Versuche wurden in einem Tris/HCl-Puffer 50 mM, pH 6,8, 10 mM CaCl₂, 25°C, durchgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 5 bis 8 angegeben.
Die allgemeine Formel für die hier synthetisierten Inhibitoren zeigt, dass es sich um Phosphinsäure-Pseudotripeptide handelt. Entsprechend der Art der Bindung, die für diese Verbindungen mit dem aktiven Zentrum (Stelle) der MMP angenommen wird, müssen diese Inhibitoren jeweils mit den Unterzentren S1, S1' und S2' dieser Enzyme in Wechselwirkung treten. Die Gruppe R1, die in der Mehrzahl der Inhibitoren vorhanden ist, tritt, wie angenommen wird, in Wechselwirkung mit der Verbindungsstelle zwischen den Unterzentren S3/S2.
In der Tabelle 5 wurde der Einfluss der Art des Restes R³ auf die Wirksamkeit des Pseudopeptids als MMP-Inhibitor untersucht.
Die Wechselwirkung der Inhibitoren mit dem Unterzentrum S1' unter Berücksichtigung der Gruppe R³ der Verbindungen war Gegenstand einer Untersuchung, da dieses Unterzentrum, wie angenommen wird, großtenteils die Selektivität der Enzym-Inhibitoren-Wechselwirkungen steuert.
Die Analyse der Tabelle 5 zeigt, dass die Größe und Art des Restes R³ eine kritische Rolle spielt für die Affinität der Verbindungen: so scheint die Aktivität der Inhibitoren im Falle von MMP-8 mit einem Faktor 30 multipliziert zu werden, wenn die Gruppe R³ von einem Benzyl-Rest in einen Phenylpropyl-Rest übergeht (Verbindungen 7 und 9). Man stellt fest, dass der Affinitätszugewinn, der dieser Substitution entspricht, nicht konstant ist für die verschiedenen MMP, was vermuten lässt, dass das Unterzentrum S1' jedes MMP empfindlich sein kann gegenüber der Art des Restes R³. Diesbezüglich ist es interessant festzustellen, dass das MMP-11 das einzige MMP ist, das einen Phenethyl-Rest bevorzugt gegenüber einem Phenylpropyl-Rest (Verbindungen 8 und 9).
Der Vergleich zwischen den Verbindungen 9, 10 und 11, die sich nur durch ein einziges Atom (C, O, S) im Bereich des Restes R³ unterscheiden, lässt das Vorhandensein einer spezifischen Wechselwirkung zwischen dem Schwefelatom in der γ-Position von R³ der Inhibitoren und dem Unterzentrum S1' der MMP vermuten. Unabhängig von dem MMP ist die Verbindung 11 immer die wirksamste unter diesen drei Inhibitoren.
In der Tabelle 6 sind die Inhibitoren charakterisiert durch die Anwesenheit eines Phenyl-Restes in R² anstelle eines Methyl-Restes (Tabelle 5). Der Vergleich zwischen den Tabellen 5 und 6 zeigt, dass die Anwesenheit eines Benzyl-Restes global die Erhöhung der Affinität der Inhibitoren erlaubt. In dem spezifischen Fall von MMP-11 führt die Substitution Methyl → Benzyl zu einer viel stärkeren Affinitätserhöhung bei diesem MMP als bei den anderen. Dieses Ergebnis weist hin auf die Bevorzugung des Unterzentrums S1 von MMP-11 für einen Benzyl-Rest gegenüber einem Methyl-Rest.
Die Einführung einer größeren Vielfalt in Bezug auf R³ in dieser Versuchsreihe erlaubte es, den Einfluss des Restes R³ besser zu erkennen. Diese Versuchsreihe zeigt, dass es zur Erzielung von hochwirksamen Phosphinsäure-Inhibitoren gegenüber bestimmten MMP erforderlich ist, in die Position R³ eine lange Arylalkylkette einzuführen. Die Verbindung 18 ist somit ein Beispiel für einen sehr starken Inhibitor für MMP-8, MMP-11, MMP-2 und MMP-9.
In Bezug auf diese MMP stellt man fest, dass die in dieser Untersuchung genannten Inhibitoren weniger wirksam zu sein scheinen gegenüber MMP-14.
Darüber hinaus scheinen diese Pseudopeptide allgemein weniger aktiv zu sein gegenüber MMP-1 und MMP-7.
Es ist festzustellen, dass die Verbindung 14, die einen Phenethylrest für R³ aufweist, sehr wirksam zu sein scheint gegenüber MMP-11, dass sie jedoch viel weniger aktiv ist gegenüber den anderen MMP.
In der Tabelle 7 ist die Bedeutung des Tryptophan-Restes im Bereich der R⁴ sowie die Bedeutung der Konfiguration des Tryptophan-Restes erläutert. Die Verbindung 24 zeigt, dass der Tryptophan-Rest in diesen Inhibitoren durch einen anderen aromatischen Dpa (Dinitrobenzyl)-Rest ersetzt sein kann im Falle von MMP-11 und MMP-8.
Die Tabelle 8 erläutert den Effekt von verschiedenen Modifikationen im Bereich der Gruppe R¹ (Tabelle IV). Die Analyse der Ergebnisse zeigt, dass die Art von R¹ die Affinität der Verbindungen gegenüber verschiedenen MMP beeinflusst. Die Verbindung 31 ist ein Beispiel für einen sehr starken Inhibitor gegenüber MMP-11, der eine bestimmte Selektivität für dieses Enzym aufweist. Die Verbindungen 34 und 35 stellen Beispiele für starke Inhibitoren dar, in denen R¹ einer natürlichen Aminosäure entspricht.
Beispiel 29
In diesem Beispiel wird der Einfluss der Konfiguration der beiden Positionen R² und R³ auf die Wirksamkeit der Pseudopeptide als Inhibitor für MMP untersucht. Der in den vorhergehenden Beispielen angewendete Syntheseweg zur Herstellung der Phosphinsäure-Derivate dieses Patents führt zur Gewinnung jedes Inhibitors in Form einer Mischung von vier Diastereoisomeren, die aus der Anwesenheit von zwei asymmetrischen Zentren im Bereich der α-Kohlenstoffatome, welche die Reste R² und R³ tragen, resultiert. Um den Einfluss der Konfiguration dieser zwei Positionen zu bewerten, wurde die Verbindung 15 erneut synthetisiert, wobei man von der optisch reinen Aminosäure Phenylalaninhosphinsäure in der R- oder S-Konfiguration ausging. Jede Synthese führte zu einer Mischung von zwei Diastereoisomeren: Z-(S)PheY(PO₂CH₂)(S)pPhe-Trp-NH₂ und Z-(S)PheY(PO₂CH₂)(R)pPhe-Trp-NH₂ oder Z-(R)PheY(PO₂CH₂)(S)pPhe-Trp-NH₂ und Z-(R)PheY(PO₂CH₂)(R)pPhe-Trp-NH₂ die durch Umkehrphasen-HPLC leicht voneinander trennbar sind. Die Tabelle 9 zeigt die Aktivität der vier Diastereoisomeren der Verbindung 15 gegenüber verschiedenen MMP. Es ist interessant darauf hinzuweisen, dass für diese Klasse von Phosphinsäure-Verbindungen mindestens drei Diastereoisomere auf nahezu äquivalente Weise die verschiedenen MMP inhibieren (hemmen). Diese Eigenschaft kann sich als sehr wichtig in Bezug auf den Stoffwechsel und die Pharmakokinetik erweisen, abgesehen davon, dass sie ein Mittel zur Steuerung der Selektivität der Inhibitoren ist, wobei beide Parameter für die Stereochemie der Moleküle empfindlich sein können.
Die Ergebnisse der Charakterisiierung durch Portonen-, C¹³- und Phosphor-NMR der RI-Fraktion der Verbindung 15 sind in der Anlage dargestellt.
Beispiel 30
In diesem Beispiel wird die antitumorale Wirksamkeit der Verbindung 15 (RI-Fraktion) der Tabelle 9 bestimmt (RXPO3).
Das für den Test der Effekte dieses RXPO3-Inhibitors in vivo angewendete tumorbildende Modell besteht in einer subcutanen Aufpfropfung von malignen Maus-C26-Zellen auf syngenetische Mäuse (die einen genetischen Hintergrund (Grundstock) aufweisen, der mit demjenigen der injizierten Zellen kompatibel ist).
Die Zellen C26, die aus einem Colon-Krebs der Maus Balb c stammen (Corbett et al., "Cancer Res", 1975, 35: 2434–2439 [15]) werden bis zur Subkonfluenz kultiviert. Nach der Tryptinisierung werden die Zellen 10 min lang mit 1000 g zentrifugiert. Der Zentrifugenrückstand wird gewaschen und in PBS 1X wieder suspendiert. Ein Volumen von 200 ml, das 5 × 10⁴ Zellen C26 enthält, wird subcutan an zwei Stellen des Rückens der Mäuse im Alter von 8 bis 9 Wochen injiziert. Der Inhibitor wird in PBS 1X solubilisiert und die Verabreichung von 150 mg Inhibitor in einem Volumen von 150 ml erfolgt auf intraperitonealem Wege. Die Behandlung beginnt am Tag der Injektion der C26-Zellen und wird fortgesetzt für 25 Tage mit einer täglichen Injektion. Die Tumor-Volumina werden alle Tage gemessen.
Es wurden drei identische und voneinander unabhängige Tumorgenese-Versuche durchgeführt nach dem oben genannten Versuchsprotokoll. Die erhaltenen Ergebnisse waren ähnlich. Eines davon ist nachstehend angegeben.
Der Versuch wurde mit 12 Tieren durchgeführt, 6 davon wurden mit 150 μg/Inhibitor/Maus/Tag behandelt und 6 Tiere dienten als Vergleichstiere (150 μl PBS 1X). Die 2 zeigt die Mittelwerte der Tumorvolumina in Abhängigkeit von der seit der Injektion der C26-Zellen verstrichenen Zeit (Tage 10 bis 25).
Man stellt fest, dass die Tumoren am Tage J10 aufzutreten beginnen und dass ihre mittleren und Mittelwerte der Volumina bei den mit dem Inhibitor RXPO3 behandelten Tieren immer kleiner sind. Diese Differenz in Bezug auf die Größe der Tumoren liegt in der Größenordnung von 50% am Tag J15 bis zum Tag J20. Danach scheint die Wirksamkeit des Inhibitors geringer zu sein. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit kürzlich gemachten Beobachtungen bei einem anderen Tumorbildungs-Modell, bei dem wilde Tiere oder Tiere mit einem Defizit für die Expression von Stromelysin-3 (MMP11) eingesetzt wurden, und die zeigen, dass diese Matrizen-Metallprotease beteiligt ist an den Anfangsstufen der Implantation und die Entwicklung von Tumoren fördert. Nach diesem Modell muss die Wirksamkeit der Inhibitoren maximal sein während der ersten Tage der Entwicklung des Tumors.
Angezogene Druckschriften

[1]: Brown, "Medical Oncology", 1997, 14, Seiten 1–10.
[2]: Beckett et al, 1998, "Exp. Opin. Ther. Patents", 8, Seiten 259–289.
[3]: Goulet et al, "Bioorg. Med. Chem. Lett." 4, 1994, Seiten 1221–1224.
[4]: Caldwell et al, "Bioorg. Med. Chem. Letter" 6, 1996, Seiten 323–328.
[5]: FR-A-2 676 059.
[6]: FR-A-2 689 764.
[7]: EP-A-0 725 075
[8]: Yotakis et al, "J. Org. Chem.", 1996, 61, Seiten 6601–6605.
[9]: Jiracek et al, "J. Biol. Chem.", 1995, 270, Seiten 21701–21706.
[10]: "J. Biol. Chem.", 1996, 271, Seiten 19606–19611.
[11]: Eistetter et al, "J. Med. Chem.", 25, Seiten 109–113, 1982.
[12]: Baldwin et al, "J. Chem. Soc. Chem. Comm." 1986, Seiten 1339–1340.
[13]: Baylis et al, "J. Chem. Soc. Perkin Trans I", 1984, Seiten 2845–2853.
[14]: Horowitz et al, "Proc. Natl. Acad. Sci." USA, 1987, 84, Seiten 6654–6658.
[15]: Corbett et al., 1975, "Cancer Res", 35: 2434–2439.

Tabelle 1 Acrylat der Formel:
Tabelle 2 Acrylat der Formel:
Tabelle 3
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Tabelle 4
Block 3b: ZAlaΨ(PO₂CpH₂)hPheOEt.

δ(ppm) Ref. ¹HCHCl₃(7,26 ppm). Temp.: 298 K Lösungsmittel: CDCl₃
Ref. ¹³C CDCl₃(77,36 ppm).
Ref. ³¹P H₃PO₄(0 ppm).

Block 3d: ZAlaΨ(PO₂CpH₂)Ser(Bn)OEt.

δ(ppm) Ref. ¹H CHCl₃ (7,26 ppm). Temp.: 298K Lösungsmittel: CDCl₃
Ref. ¹³C CDCl₃(77,36 ppm).
Ref. ³¹P H₃PO₄(0 ppm).

Block 3e: ZAlaΨ (PO₂CpH₂)Cys(Bn)OEt.

δ(ppm) Ref. ¹H CHCl₃(7,26 ppm). Temp.: 298 K Lösungsmittel: CDCl₃
Ref. ¹³C CDCl₃(77,36 ppm).
Ref. ³¹P H₃PO₄(0 ppm).

Block 3f: ZPheΨ(PO₂CpH₂)hPheOEt.

δ(ppm) Ref. ¹H CHCl₃(7,26 ppm). Temp.: 298 K Lösungsmittel: CDCl₃
Ref . ¹³C CDCl₃(77,36 ppm).
Ref. ³¹P H₃PO₄(0 ppm).

Block 3g: ZPheΨ(PO₂CpH₂)pPheOEt.

δ(ppm) Ref. ¹H CHCl₃ (7,26 ppm). Temp.: 298 K Lösungsmittel: CDCl₃
Ref. ¹³C CDCl₃ (77,36 ppm).
Ref. ³¹P H₃PO₄ (0 ppm).

Block 3h: ZPheΨ(PO₂CpH₂)bPheOEt.

Block 3i: ZPheΨ(PO₂CpH₂)HeptOEt.

Block 3j: ZPheΨ(PO₂CpH₂)Ser(Bn)OEt.

δ(ppm) Ref. ¹H CHCl₃ (7,26 ppm). Temp.: 298 K Lösungsmittel: CDCl₃
Ref. ¹³C CDCl₃(77,36 ppm).
Ref. ³¹P H₃PO₄(0 ppm).

Block 3k: ZPheΨ(PO₂CpH₂)Cys(pOMeBn)OEt.

δ(ppm) Ref. ¹H CHCl₃(7,26 ppm). Temp.: 298 K Lösungsmittel: CDCl₃
Ref. ¹³C CDCl₃(77,36 ppm).
sRef . ³¹P H₃PO₄(0 ppm).

Verbindung 15: ZPheΨ(PO₂CpH₂)pPheTrpNH₂ RI-Fraktion der Tabelle 9

Claims

Phosphinsäurepseudopeptid der Formel
worin bedeuten: – R¹ eine eine Aminfunktion blockierende Gruppe, ausgewählt unter den t-Butoxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, Cinnamoyl-, Pivaloyl-, N-Fluorenylmethoxycarbonyl-, Acetyl-, Benzyloxyacetyl-, Phenylaminoacetyl-, (m-Chlorophenyl)aminoacetyl-, (2-Hydroxy-5-chlorophenyl)aminoacetyl-, Indolyl-2-carbonyl-, 4,6-Dichloroindolyl-2-carbonyl-, Chinolyl-2-carbonyl- und 1-Oxa-2,4-dichloro-7-naphthalincarbonyl-Gruppen oder den Rest einer Aminosäure oder einen Peptidrest, dessen terminale Aminfunktion blockiert ist durch eine Blockierungsgruppe, ausgewählt unter den t-Butoxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, Cinnamoyl-, Pivaloyl-, N-Fluorenyl-methoxycarbonyl-, Acetyl-, Benzyloxyacetyl-, Phenylaminoacetyl-, (m-Chlorophenyl)aminoacetyl-, (2-Hydroxy-5-chlorophenyl)aminoacetyl-, Indolyl-2-carbonyl-, 4,6-Dichloroindolyl-2-carbonyl-, Chinolyl-2-carbonyl- und 1-Oxa-2,4-dichloro-7-naphthalincarbonyl-Gruppen, – R² die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Norieucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Hydroxyprolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Thyrosin, Valin, Nitrophenylalanin, Homoarginin, Thiazolidin und Dehydroprolin, – R³ 1) die Seitenkette einer natürlichen Aminosäure, ausgenommen Gly und Ala, die unsubstituiert oder durch eine Arylgruppe substituiert ist, 2) eine Aralkylgruppe, oder 3) eine Alkylgruppe mit mindestens 3 Kohlenstoffatomen, und – R⁴ eine Dinitrobenzylgruppe oder eine Seitenkette einer natürlichen oder nichtnatürlichen Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histitidin, Iso-Leucin, Leucin, Norleucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Hydroxyprolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Thyrosin, Valin, Nitrophenylalanin, Homoarginin, Thiazolidin und Dehydroprolin.
Pseudopeptid nach Anspruch 1, worin R² steht für die Methyl- oder Benzylgruppe.
Pseudopeptid nach Anspruch 1, worin R³ steht für die Seitenkette einer Aminosäure, ausgewählt unter Phe und Leu oder für einen Rest Ser oder Cys, dessen Seitenkette durch eine Arylalkylgruppe substituiert ist.
Pseudopeptid nach Anspruch 1, worin R³ steht für eine Aralkylgruppe, ausgewählt unter den Gruppen der Formel:
worin n steht für eine ganze Zahl von 1 bis 4, und der Formel:
worin p steht für die Zahl 1 oder 2.
Pseudopeptid nach Anspruch 1, worin R³ steht für eine Gruppe, die einer der folgenden Formeln entspricht:
(CH₃)₂-CH-CH₂- (IV)
Pseudopeptid nach Anspruch 1, in der R³ steht für die Gruppe der Formel:
Pseudopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin R⁴ steht für eine Gruppe der Formel:
Pseudopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin R¹ steht für eine Gruppe, ausgewählt unter den Acetyl-, Benzyloxyacetyl-, Phenylaminoacetyl-, m-Chlorophenyl)aminoacetyl-, (2-Hydroxy-5-chloro-phenyl)aminoacetyl-, Indolyl-2-carbonyl-, 4,6-Dichloro-indolyl-2-carbonyl-, Chinolyl-2-carbonyl- und 1-Oxa-2,4-dichloro-7-naphthalincarbonyl-Gruppen.
Pseudopeptid nach Anspruch 1, das der Formel entspricht:
worin Z steht für die Benzyloxycarbonylgruppe.
Pseudopeptid nach Anspruch 9, worin das asymmetrische Kohlenstoffatom des Ganzen die Konfiguration L hat
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als Inhibitor mindestens einer Metalloprotease mit Zinkmatrix, die umfasst mindestens ein Pseudopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, in der die Metallprotease mit Zinkmatrix ausgewählt ist unter MMP-2, MMP-8, MMP-9 und MMP-11.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 und 12 für die Behandlung einer Erkrankung, die durch die Überexpression von Matrizenproteasen charakterisiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13 für die Behandlung von Krebs.
Verwendung eines Phosphinsäurepseudopeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Arzneimittels, das mindestens eine Metallprotease mit Zinkmatrix inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 15, bei der die Metallprotease mit Zinkmatrix ausgewählt ist unter MMP-2, MMP-8, MMP-9 und MMP-11.
Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, bei der das Arzneimittel zur Behandlung einer Erkrankung bestimmt ist, die durch die Überexpression von Matrizenproteasen charakterisiert ist.
Verwendung nach Anspruch 17, bei der die Krankheit Krebs ist.