DE69903816T2

DE69903816T2 - Selektive inhibitoren für den n-terminalen site der ace

Info

Publication number: DE69903816T2
Application number: DE69903816T
Authority: DE
Inventors: Marie-Therese Chauvet; Pierre Corvol; Joel Cotton; Philippe Cuniasse; Vincent Dive; Eric Ezan; Joel Menard; Annie Michaud; Athanasios Yiotakis
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1998-07-02
Filing date: 1999-07-01
Publication date: 2003-09-11
Anticipated expiration: 2019-07-02
Also published as: WO2000001706A1; DE69903816D1; ATE227294T1; JP2002519430A; ES2186366T3; FR2781230B1; DK1091966T3; EP1091966A1; EP1091966B1; US6482797B1; CA2335918A1; PT1091966E; FR2781230A1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Phosphinsäurepeptid-Derivat, das die N- terminale Stelle des Human-Angiotensin-Umwandlungs-Enzyms (ECA) selektiv blockieren kann, ohne die zweite aktive Stelle des ECA zu beeinflussen.
Diese Peptid-Derivate, die selektive Inhibitoren für die N-terminale Stelle des ECA darstellen, können in der Therapie verwendet werden, um die hämatopoietischen (blutbildenden) Stammzellen von Patienten, die einer aggressiven Chemotherapie oder Radiotherapie unterworfen sind, zu schützen.

Stand der Technik

Die Entwicklung von Pseudopeptid-Inhibitoren des ECA hat in den 1980er Jahren die Behandlung der arteriellen Hypertension, der Herzinsuffizienz und der chronischen Niereninsuffizienz wirklich revolutioniert. Es gibt heute ein ganzes Arsenal von synthetischen Inhibitoren des ECA, die in der Klinik verwendet werden. Unter ihnen bekannt sind das Captopril, das Enalapril und das Fosinopril, deren Formeln in der beiliegenden Fig. 1 angegeben sind.
Parallel zu diesen Arbeiten konnte dank der Klonierung des ECA-Systems im Jahre 1988 die Gruppe von P. Corvol das Vorhandensein von zwei aktiven Stellen in diesem Enzym nachweisen, wie von Soubrier et al. in "Proc. Natl. Acad. Bei. USA" (1988), 85, 9386-9390 [1] beschrieben.
Der formelle Nachweis dieser beiden aktiven Stellen des ECA, die beim Menschen verschiedene physiologische Funktionen steuern, stellt eine weitere Revolution auf diesem Gebiet dar und hat wichtige Konsequenzen in bezug auf die Therapien. Da die bis heute eingesetzten ECA-Inhibitoren in vitro in einem ähnlichen Umfang die beiden aktiven Stellen der ECA inhibieren (blockieren), kann die physiologische Funktion dieser beiden aktiven Stellen in vivo mit diesem Typ von Verbindungen nicht beeinflusst werden. Die ersten Inhibitoren, die zwischen den beiden aktiven Stellen des ECA unterscheiden können, wären jedoch extrem wertvoll.
Das ECA hydrolysiert mehrere natürliche Substrate, die an der Regulierung des Arterienblutdruckes, an dem zirkulierenden Blutvolumen und der cardiovasculären Hämodynamik beteiligt sind. Das Hauptsubstrat ist das Angiotensin I, ein inaktives Decapeptid, das nach der Hydrolyse des Carboxy-terminalen Dipeptids His-Leu zum Angiotensin II, einem Blutdruck steigernden und antinatriuretischen Peptid aktiviert wird. Parallel dazu inaktivert das ECA das Bradykinin, ein gefäßerweiterndes und natriuretisches Peptid, zu einem Heptapeptid, dann zu einem Pentapeptid, die beide inaktiv sind. Die beiden N- und C-terminalen Stellen des ECA sind auf ähnliche Weise an dieser Hydrolyse beteiligt.
Eine spezifische Funktion des N-terminalen Bereiches des ECA wurde vor kurzem durch die Gruppe von P. Corvol identifiziert. Wie von Lenfant et al. in "Proc. Natl. Acad. Bei. USA" (1989) 86, 779-782 [2], beschrieben, ist das N-Acetyl-Seryl- Aspartyl-Lysyl-Prolin-Peptid (AcSDKP) ein Inhibitor, der in natürlicher Weise beim Eintritt in die S-Phase der hämatopoietischen Stammzellen zirkuliert. Es blockiert auch den Eintritt in die S-Phase von anderen Zelltypen, wie z. B. der Hepatozyten in der Regenerationsphase, der Lymphozyten und mehrerer bekannter Zelllinien, wie von Lombard et al. in "Cell. Tissue Kinet." (1990) 23, 99-103 [3], beschrieben. Die inhibierende Wirkung des AcSDKP auf den zellulären Cyclus der hämatopoietischen Zellen ist spezifisch für normale hämatopoietische Zellen; die Leukämie-Zellen sind davon nicht betroffen. Das AcSDKP wurde daher vorgeschlagen als therapeutisches Agens zum Schützen der Knochenmarks-Vorstufen während der Chemotherapien. Die Verabreichung von AcSDKP verlängert daher die Überlebensdauer von mit zytotoxischen Agentien behandelten Mäusen (Bodgen et al., "Ann. N. Y. Acad. Bei." (1991), 628, 126-139 [4]). Wie von Rousseau et al. in "J. Biol. Chem." (1995) 270, 3656-3661 [5] und von Azizi et al. in "J. Clin. Invest." (1996), 97,839-844 [6] beschrieben, wird das AcSDKP in vitro und in vivo durch das ECA hydrolysiert, insbesondere durch den N-terminalen Bereich des Enzyms. In vitro wird das AcSDKP 50 mal schneller hydrolysiert durch den N-terminalen Bereich als durch den C-terminalen Bereich. Diese Entdeckung zeigt, dass es möglich ist, Inhibitoren zu entwickeln, die spezifisch sind für den N- oder C-terminalen Bereich des ECA, die es erlauben, auf Substrate einzuwirken, die an anderen Funktionen als der Regulierung des arteriellen Blutdruckes und des Hydronatriumstoffwechsels beteiligt sind.
Das ECA ist das hauptsächliche Enzym, ja sogar das ausschließliche Enzym für den Stoffwechsel von Plasma-AcSDKP. Die Verabreichung einer einzigen Dosis von Captopril an gesunde Patienten erhöht den Plasma-Gehalt des Peptids auf das 6- bis 7-fache. Ein für den N-terminalen Bereich selektiver Inhibitor würde es erlauben, ein solches Ergebnis zu erzielen, ohne den Stoffwechsel der Peptide zu modifizieren, die eine Rolle bei der Steuerung des Arterienblutdruckes und des Hydronatrium-Stoffwechsels spielen (Angiotensin, Bradykinin), im Gegensatz zu Captopril und anderen Inhibitoren für das Umwandlungsenzym, die derzeit verwendet werden. Inhibitoren für den N-terminalen Bereich des ECA wären somit von großem Interesse für den Schutz der hämatopoietischen Stammzellen von Patienten, die einer aggressiven chemotherapeutischen oder radiotherapeutischen Behandlung unterzogen werden. Der Inhibitor könnte vor oder gleichzeitig mit der Antikrebs-Therapie verabreicht werden.
Darüber hinaus wurde vor kurzem von Volpert et al in "J. Clin. Invest." (1996) 98, 671-679 [7], gezeigt, dass das Captopril, das die beiden aktiven Stellen des ECA inhibiert (blockiert) in vitro und in vivo versuchsweise eine Antikrebs-Schutzwirkung ausüben könnte. Der Mechanismus dieses Schutzeffekts ist nicht bekannt, er rührt jedoch zweifellos her von der Einwirkung des AcSDKP aufgrund seiner Eigenschaften auf den Eintritt in den zellulären Cyclus zahlreicher Zellentypen. Ein für den N- terminalen Bereich des ECA selektiver Inhibitor, der den Plasma-Gehalt an AcSDKP potenziert, ohne den Stoffwechsel der vasoaktiven Peptide zu modifizieren, könnte somit eine vorteilhafte Wirkung haben.
Die meisten starken Inhibitoren für ECA, die bis heute entwickelt wurden und in der Fig. 1 dargestellt sind, sind charakterisiert durch die Anwesenheit eines Pseudodipeptid-Körpers, auf den eine chemische Gruppe aufgepfropft wurde, die in vorteilhafter Weise mit dem Zinkatom in Wechselwirkung treten kann, das an der aktiven Stelle des ECA angeordnet ist. Das ECA gehört nämlich zur Gruppe der Metalloproteasen mit Zink und ist charakterisiert durch die Anwesenheit eines Zinkatoms in den beiden aktiven Stellen des Enzyms, wobei das Zinkatom eine wesentliche Rolle bei dem katalytischen Vorgang spielt. Zahlreiche Arbeiten haben gezeigt, dass die Synthese von Pseudopeptiden, die chemische Gruppen tragen, die das Zink in Form eines Chelats binden können, einen Zugangsweg für sehr starke Inhibitoren für Metallproteasen mit Zink liefern können. Unter den chemischen Gruppen, die mit Zink in Wechselwirkung treten können, sind zu finden unter den handelsüblichen Inhibitoren für ECA die Thiolgruppe HS (Captopril), die Carboxyalkylgruppe CH-COO (Enalapril) und die Phosphorylgruppe PO&sub2;-X mit X=NH, O, CH&sub2; (Fosinopril).
Die Dokumente FR-A-2 676 059 [8] und EP-A-0 725 075 [9] erläutern Peptid- Derivate, die als Inhibitoren für Proteasen mit Zink verwendbar sind, die Gruppen vom Phosphinsäure-Typ tragen, um mit dem Zink in Wechselwirkung zu treten. In FR-A-2 676 059 handelt es sich um Inhibitoren für Bakterienkollagenasen, während in EP-A-0 725 075 es sich um selektive Inhibitoren für Endopeptidase mit Zink 24-15 handelt, die gegenüber anderen Proteasen, wie z. B. dem Angiotensin-Umwandlungsenzym inaktiv sind.
In dem Dokument WO-A-98/18803 sind (α-Aminophosphino)peptid-Derivate der Formel beschrieben:
in der R&sub1; und R&sub2; für ein Wasserstoffatom stehen oder gemeinsam zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom ein Imin bilden, und R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6;, R&sub7; und R&sub8; unabhängig voneinander stehen für ein Wasserstoffatom oder Kohlenwasserstoffgruppen.
Diese Derivate stellen gemischte Inhibitoren für neutrale Endopeptidase und N-Aminopeptidase dar.
In dem Dokument EP-A-0 209 848 sind Inhibitor-Peptide für das Human- Angiotensin-Umwandlungsenzym der Formel A-B-D-E-G beschrieben, in der E der Formel entsprechen kann:
Bisher gab es keine selektiven Inhibitoren (Blockierungsmittel) für die N- terminale Stelle des Angiotensin-Umwandlungsenzyms.
Ziel der vorliegenden Erfindung sind neue Peptid-Derivate, die eine Phosphinsäure-Gruppe aufweisen, die selektive Inhibitoren (Blockierungsmittel) für die N- terminale Stelle dieses Enzyms darstellen.

Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung sind neue Peptid-Derivate, die eine Aminosäuresequenz der folgenden Formel aufweisen:
-Asp-Phe-Ψ(PO&sub2;CH&sub2;)-Ala-Xaa'- (I)
worin:
- Ψ(PO&sub2;CH&sub2;) anzeigt, dass die Peptid-Bindung (CONH) zwischen Ph und Ala durch die Phosphinsäure-Bindung PO&sub2;CH&sub2; ersetzt ist, und
- Xaa' einen Aminosäurerest darstellt.
In dieser Sequenz liegt die PO&sub2;CH&sub2;-Gruppe in der Form PO&sub2;&supmin; vor; sie ist somit an ein Gegenion wie K&spplus;, Na&spplus; oder irgendein anderes Metall, das pharmakologisch akzeptabel ist, assoziiert. Die Art des Gegenions hat keine Bedeutung, da die geladenen Gruppen in Wasser dissoziiert sind.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung weist das Peptid- Derivat nur die vier Aminosäuren dieser Sequenz auf und entspricht der folgenden Formel:
R¹-Asp-Phe-Ψ(PO&sub2;CH&sub2;)-Ala-Xaa'-NH&sub2; (II)
worin:
- R¹ die Acetyl- oder Benzyloxycarbonyl-Gruppe darstellt,
- Ψ(PO&sub2;CH&sub2;) anzeigt, dass die Peptid-Bindung (CONH) zwischen Phe und Ala durch die Phosphinsäure-Bindung PO&sub2;CH&sub2; ersetzt ist, und
- Xaa' für einen Aminosäurerest steht.
R&sub1; steht vorzugsweise für die Acetylgruppe.
In den oben angegebenen Formeln (I) und (II) können die für Xaa' verwendeten Aminosäuren natürliche oder nicht-natürliche Aminosäuren oder Pseudo- Aminosäuren sein.
Die natürlichen Aminosäuren können ausgewählt sein aus der Gruppe Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Norleucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Hydroxyprolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, Nitrophenylalanin, Homoarginin, Thiazolidin und Dehydroprolin.
Eine Pseudo-Aminosäure kann definiert werden als eine Aminosäure, in der die Amino- oder Carbonyl-Funktion durch eine andere chemische Gruppe ersetzt ist.
In diesen Formeln können die Aminosäuren Asp, Phe, Ala und Xaa' in der L- oder D-Form vorliegen. Das Peptid-Derivat kann somit aus einem einzigen Isomeren oder aus einer Mischung von vier Diastereoisomeren aufgebaut sein wegen der Anwesenheit von zwei asymmetrischen Zentren in dem Derivat.
In dem erfindungsgemäßen Peptid-Derivat ist die Aminosäure Xaa' vorzugsweise ausgewählt unter den folgenden Aminosäuren: Pro, Ala, Thr, Lys und Leu, die eine geringe Aktivität gegenüber der C-terminalen Stelle von ECA aufweisen.
Vorzugsweise steht Xaa' für Ala, da diese Aminosäure die Aktivität des Peptid- Derivats in bezug auf die Inhibierung der N-terminalen Stelle des Enzyms verstärkt, wobei dieses eine geringe Inhibierungs-Aktivität für die C-terminale Stelle aufweist.
Die erfindungsgemäßen Peptid-Derivate unterscheiden sich von den in EP-A-0 725 075 beschriebenen Peptid-Derivaten, weil sie vor dem Pseudo-Phe einen Asp- Rest aufweisen, der es ermöglicht, das Peptid-Derivat gegenüber der C-terminalen Stelle des Angiotensin-Umwandlungsenzyms inaktiv zu machen und somit die gewünschte Selektivität zu verleihen. Darüber hinaus waren die Peptid-Derivate von EP-A-0 725 075 gegenüber diesem Enzym inaktiv, während die erfindungsgemäßen Derivate gegenüber dem N-terminalen Abschnitt dieses Enzyms aktiv sind.
Die Anwesenheit der Reste Asp und Pseuko-Phe macht es möglich, dass die Peptid-Derivate auf die Unterzentren S1 und S2 des Enzyms einwirken, was eine wenig übliche Eigenschaft für einen ECA-Inhibitor ist. Noch überraschender ist jedoch, dass dieses Peptid-Derivat in der C-terminalen Position seiner Struktur eine Carboxamid-Gruppe trägt, während alle bisher beschriebenen ECA-Inhibitoren systematisch eine freie Carboxylat-Gruppe aufweisen. Dieses Peptid-Derivat ist somit sehr originell, sowohl was seine chemische Struktur als auch was seine Inhibitor- Aktivität angeht.
Obwohl jede Konfiguration der Aminosäuren Phe und Ala geeignet ist, ist es bevorzugt, dass Phe die R-Konfiguration aufweist. Darüber hinaus ist es ebenfalls bevorzugt, dass der Aminosäure-Rest Ala die S-Konfiguration hat. Das bevorzugte Peptid-Derivat entspricht somit der Formel:
Ac-Asp-(R)Phe-Ψ(PO&sub2;CH&sub2;)-(S)Ala-Ala-NH&sub2; (III)
worin:
- Ac die Acetylgruppe darstellt und
- Ψ(PO&sub2;CH&sub2;) anzeigt, dass die Peptid-Bindung (CONH) zwischen Phe und Ala durch eine Phosphinsäure-Bindung (PO&sub2;CH&sub2;) ersetzt ist.
Die erfindungsgemäßen Peptid-Derivate können nach klassischen Verfahren hergestellt werden, beispielsweise demjenigen, wie es in FR-A-2 676 059 beschrieben ist, oder auch nach einem Synthese-Verfahren in der Feststoffphase, wie es beispielsweise in EP-A-0 725 075 beschrieben ist, bei dem man von einem Synthon der Formel ausgeht:
Fmoc-PheΨ(PO(Ad)-CH&sub2;)AlaOH
worin Fmoc für die (Fluorenylmethoxy)carbonyl-Gruppe steht und Ad für die Adamantylgruppe steht, und wobei man als festen Träger das 2-Chlorotrityl-Harz verwendet.
Dieses Synthon kann insbesondere nach dem Protokoll hergestellt werden, wie es von Yiotakis et al. in "J. Org. Chem.", 1996, 6.1, 6601-6605 [10] beschrieben ist.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die N-terminale Stelle des Human-Angiotensin-Umwandlungsenzyms selektiv inhibiert (blockiert), die ein Peptid-Derivat der vorstehend angegebenen Formel (I), (II) oder (III) umfasst.
Diese pharmazeutische Zusammensetzung ist insbesondere verwendbar zum Schützen von hämatopoietischen Stammzellen von Patienten, die einer aggressiven chemotherapeutischen oder radiotherapeutischen Behandlung, beispielsweise einer Antikrebs-Behandlung, unterzogen werden.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines Peptid-Derivats der Formel (I), (II) oder (III), wie es vorstehend beschrieben worden ist, zur Herstellung eines Arzneimittels, welches die N-terminale Stelle des Human-Angiotensin- Umwandlungsenzyms selektiv inhibiert (blockiert).
Ein solches Arzneimittel kann geeignet sein, die Proliferation (Vermehrung) der hämatopoietischen Stammzellen von Patienten zu steuern, die einer Antikrebs- Behandlung unterzogen werden.
Weitere Charakteristika und Vorteile der Erfindung ergeben sich beim Lesen der nachfolgenden Beschreibung, welche die Erfindung lediglich erläutert, ohne sie jedoch darauf zu beschränken, unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1, die bereits erwähnt worden ist, erläutert die Struktur der bekannten Inhibitoren für das Human-Angiotensin-Umwandlungsenzym gemäß Stand der Technik.
Fig. 2 erläutert die Inhibierungs- bzw. Blockierungs-Prozentsätze verschiedener Peptid-Gemische gegenüber der C-terminalen Stelle und der N-terminalen Stelle des Human-Angiotensin-Umwandlungsenzyms.
Fig. 3 erläutert die Inhibierungs- bzw. Blockierungs-Prozentsätze verschiedener Peptid-Derivate gegenüber der C-terminalen Stelle und der N-terminalen Stelle.
Fig. 4 stellt ein Chromatogramm dar, das durch Umkehrphasen-HPLC einer Mischung von Diastereoisomeren des Peptid-Derivats Ac-Asp-PheΨ(PO&sub2;CH&sub2;)Ala-Ala-NH&sub2; gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Fig. 5 stellt ein Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramm einer Mischung der beiden Diastereoisomeren des Peptid-Derivats Ac-Asp-PheΨ(PO&sub2;CH&sub2;)Ala-Ala-NH&sub2; gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
Fig. 6 erläutert den Inhibierungs- bzw. Blockierungs-Prozentsatz, der durch das Peptid-Derivat RXP 407 erhalten wird als Funktion der angewendeten Konzentration.
Fig. 7 erläutert die Entwicklung der Plasma-Konzentration eines erfindungsgemäßen Peptid-Derivats bei einer Ratte in Abhängigkeit von der Zeit.
Fig. 8 erläutert die Entwicklung der Plasma-Konzentration an dem Peptid Ac-Ser-Asp-Lys-Pro bei Mäusen in Abhängigkeit von der Zeit, die mit dem erfindungsgemäßen Inhibitor RXP 407 in Dosen von 0,1, 1 und 10 mg/kg (Kurven 4, 5 und 6) perfundiert wurden, von Mäusen, die mit Lisinopril in einer Dosis von 10 mg/kg perfundiert wurden (Kurve 7) und von Vergleichsmäusen, die nicht perfundiert wurden (Kurve T).
Fig. 9 erläutert die Entwicklung der Plasma-Konzentration an Angiotensin I (ng/ml/h) in Abhängigkeit von der Zeit bei Mäusen, die mit RXP 407 in Dosen von 0,1,1 und 10 mg/kg perfundiert wurden (Kurven 8, 9 und 10), von Mäusen, die mit Lisonopril in einer Dosis von 10 mg/kg perfundiert wurden (Kurve 11) sowie von Mäusen, die nicht perfundiert wurden (Kurve T).

Detaillierte Darstellung der Ausführungsformen

Beispiel 1

In diesem Beispiel wurden 20 Mischungen der allgemeinen Formel Ac-Xaa-Phe-Ψ(PO&sub2;CH&sub2;)-Ala-Xaa'-NH&sub2; synthetisiert, in der die Position Xaa durch eine Aminosäure bekannter Struktur besetzt ist, während in der Position Xaa' die 20 natürlichen Aminosäuren in äquimolarer Menge vorliegen.
Für diese Synthese wurde ein kombinatorisches chemisches Verfahren, wie von Jiracek et al in "J. Biol. Chem." (1995) 270, 21701-21706 [12], und von Jiracek et al in "J. Biol. Chem." (1996) 271, 19606-19661 [13], beschrieben, angewendet und es wurde ein Festphasen-Syntheseverfahren angewendet, wobei als Phosphinsäure- Block das Synthon Fmoc-PheΨ(PO(Ad)-CH&sub2;)AlaOH, hergestellt nach dem von Yiotakis et al. in "J. Org. Chem.", (1996) 61, 6601-6605 [10] für die Synthone vom Typ 5 beschriebenen Verfahren, verwendet wurde.

a) Synthese des Phosphinsäure-Blocks Fmoc-Phe(PO(Ad)-CH&sub2;)AlaOH

1. Herstellung des Blocks Z-Phe(PO&sub2;-CH&sub2;)AlaOet(Z = Benzyloxycarbonyl)

Eine Suspension von Z-Phe(PO&sub2;)H (1 mmol) und Hexamethyldisilazan (5 mmol) wird unter einer Argon-Atmosphäre 1 h lang auf 110ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen auf 90ºC wird Ethylmethylacrylat (1,3 mmol) innerhalb von 30 min zugetropft. Die Reaktionsmischung wird 3 h lang unter Rühren bei 90ºC stehen gelassen. Nachdem die Reaktionsmischung wieder auf eine Temperatur von 70ºC gebracht worden ist, tropft man 3 ml absolutes Ethanol zu. Nach der Rückkehr auf Umgebungstemperatur werden die flüchtigen Produkte durch Verdampfen unter Vakuum entfernt und das zurückbleibende Produkt wird in 10%igem NaHCO&sub3; aufgenommen. Diese wässrige Phase wird mit Ether gespült, mit 1 N HCl auf pH 1,5 angesäuert, danach wird der Niederschlag in Ethylacetat aufgenommen. Die organische Phase wird mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, zur Trockne eingedampft, wobei man den Block Z-Phe(PO&sub2;-CH&sub2;)AlaOet in einer guten Ausbeute erhält.

2. Herstellung des Blocks Z-Phe(PO(Ad)-CH&sub2;)AlaOet

Die Verbindung Z-Phe(PO&sub2;-CH&sub2;)AlaOet (1 mmol) wird in 95%igem Ethanol (25 ml) gelöst. Diese Lösung wird zu einer 0,5 M Lösung von Silbernitrat zugetropft. Nach 10 min werden 15 ml Wasser zu der Reaktionsmischung zugegeben und das Ethanol wird unter Vakuum verdampft. Die zurückbleibende wässrige Phase, die den Silber-Niederschlag enthält, wird mit einem Eiswasserbad abgekühlt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und unter Vakuum in Gegenwart von P&sub2;O&sub5; getrocknet, wobei man ein Silbersalz des Phosphinsäureblocks in einer Ausbeute von 90% erhält. Dieses Produkt (1 mmol) wird zu einer Lösung von Adamantylchlorid (1,2 mmol) in Chloroform (10 ml) zugegeben. Diese Mischung wird 30 min lang unter Rückfluss erhitzt. Das Silberbromid, das ausfällt, wird durch Filtration entfernt und die zurückbleibende Reaktionsmischung wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Das erwartete Produkt wird durch Flash-Chromatographie (Eluierungsmittel: Chloroform/Isopropanol (9 : 3)) gereinigt unter Erzielung einer Ausbeute von 80%.

3. Herstellung des Blocks Z-Phe(PO(Ad)-CH&sub2;)AlaOH

Der Block Z-Phe(PO(Ad)-CH&sub2;)AlaOet (1 mmol) wird in 10 ml Ethanol gelöst. Zu dieser Lösung wird 1 ml 4 N NaOH zugetropft. Nach 2-stündiger Reaktion wird das Ethanol unter Vakuum verdampft und der Rückstand wird mit 20 ml Wasser verdünnt. Die Reaktionsmischung wird durch ein Eisbad abgekühlt, dann mit 0,5 N HCl auf pH 2 angesäuert. Das ausgefällte Produkt wird in Ether aufgenommen, die organische Phase wird mit Wasser gespült, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, dann zur Trockne eingedampft, wobei man den verseiften Phosphinsäure-Block in einer Ausbeute von 95% erhält.

4. Herstellung des Blocks Fmoc-Phe(PO(Ad)-CH&sub2;)AlaOH

Zu einer Lösung von Methanol (10 ml), die den Phosphinsäure-Block Z-Phe(PO(Ad-)CH&sub2;)AlaOH (1 mmol) und Ammoniumformiat (4 mmol) enthält, werden 0,25 g 10% Pd/C zugegeben. Nach 12 min bei Umgebungstemperatur wird der Katalysator durch Filtrieren über Celite entfernt, dann wird der Rückstand unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Dieser Rückstand wird in Dichlormethan wieder aufgenommen, dann zur Trockne eingedampft. Dieses Verfahren wird mehrmals wiederholt. Dieser Rückstand wird mit Chloroform behandelt und der Überschuss an nicht umgesetztem Ammoniumformiat, das in Form eines Niederschlags vorliegt, wird durch Filtration entfernt. Das gebildete Produkt wird in Na&sub2;CO&sub3; (3 ml) aufgenommen. Die Reaktionsmischung wird unter Vakuum bis zur Hälfte eingedampft, dann werden 1,5 ml Wasser und 2 ml Dioxan zugegeben. Eine Lösung von Fmoc-Cl (1,2 mmol) in Dioxan (2 ml) wird zu der Reaktionsmischung zugegeben, dann wird mit einem Eisbad abgekühlt. Diese Lösung wird unter Rühren 2 h lang bei 4ºC und dann 4 h lang bei Umgebungstemperatur stehen gelassen. Die Reaktionsmischung wird mit 20 ml Wasser verdünnt, durch ein Eisbad abgekühlt und mit 2 N HCl auf pH 2 angesäuert. Das Produkt, das ausfällt, wird schnell in Ether aufgenommen. Diese organische Phase wird mit Wasser gespült, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, dann unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man das gewünschte Produkt erhält, das durch Flash- Chromatographie (Chloroform/Methanol = 9,5 : 0,5) in einer Endausbeute von 65% gereinigt wird.

b) Synthese von Phosphinsäurepeptiden

Zur Synthese von Phosphinsäurepeptiden wird die erste Aminosäure Xaa an das 2-Chlorotrityl-Harz gebunden durch Anwendung des Verfahrens von Barlos et al., beschrieben in "G. Int. J. Pept. Protein Res", 1991, 37, 513-520 [11]. Anschließend fixiert man an dieser ersten Aminosäure den Phosphinsäure-Block, dann die Aminosäuren Xaa'. Man eliminiert die Fmoc-Gruppe mit 30%igem Piperidin in N- Methylpyrrolidon und kuppelt die folgenden Xaa'-Reste an unter Verwendung einer Mischung von 2-((1H)Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorophosphat/Diisopropylethylamin. In diesem Verfahren werden die verschiedenen Stufen durch Anwendung von klassischen Verfahren durchgeführt unter Verwendung der Reagentien und Lösungsmittel, wie sie allgemein in der Peptidchemie verwendet werden, wie von Yiotakis et al. in "J. Org. Chem.", 1996, 61, 6601-6605 [10], beschrieben.
Man erhält so Peptid-Gemische, die 20 verschiedene Aminosäuren in der Xaa- Position und 20 verschiedene Aminosäuren in der Xaa'-Position enthalten, wobei die Peptid-Gemische voneinander getrennt und je nach Art der Aminosäure in der Xaa- Position identifiziert werden.
Diese Mischungen wurden bewertet in bezug auf die Endkonzentrationen an Peptid von 200 nM, um ihre Fähigkeit, das ECA zu inhibieren (zu blockieren) zu bestimmen. Zur Bestimmung des ECA wurde ein neues Substrat mit ausgelöschter Fluoreszenz von ECA (Mca-Ala-Ser-Asp-Lys-Dpa) entwickelt, wobei Mca das Methoxycoumarin und Dpa die 2-(N-Dinitrophenyl)aminopropionsäure darstellen. Dieses Substrat, das nicht fluoresziert, wenn es intakt ist, emittiert nach der Spaltung zwischen den Resten Asp und Lys durch ECA ein starkes Fluoreszenzsignal. Aufgrund dieses Substrat-Typs kann man das Inhibitor- bzw. Blockierungs-Vermögen einer sehr großen Anzahl von Verbindungen in Elisa-Platten testen.
Das Inhibitor- bzw. Blockierungs-Vermögen der Verbindungen wird in einem klassischen Konkurrenztest bestimmt, der auf dem Abbau des Substrats mit ausgelöschter Fluoreszenz Mca-Ala-Asp-Ser-Lys-Pro basiert. Der Abbau dieses Substrats durch ECA führt zur Beobachtung eines Fluoreszenzsignals bei 400 nm, wenn die Probe mit 328 nm angeregt wird. Die Inhibierungs- bzw. Blockierungsversuche werden in den Vertiefungen von Elisa-Platten durchgeführt in Puffer-Volumina von 200 uL: pH 6,8, 50 mM Hepes, 200 mM NaCl, 1 mM ZnCl&sub2; bei 25ºC in einer Apparatur vom Fluorolite 1000-Typ der Firma Dynatech, Die Konzentration des Substrats in einem Versuchstyp beträgt 20 uM. Für die Inhibierungs- bzw. Blockierungsversuche wird der Inhibitor 45 min lang mit dem Enzym kontaktiert, dann wird die Reaktion durch einfache Zugabe eines sehr geringen Volumens Substrat eingeleitet. Die Prozentsätze der Inhibierung (Blockierung) werden errechnet aus den Änderungen der Anfangsgeschwindigkeiten in Gegenwart des Inhibitors. Diese Abbaukinetiken werden bestimmt durch Aufzeichnung von Fluoreszenz-Änderungen innerhalb einer Zeitspanne von 40 min.
Die Inhibitor- bzw. Blockierungsaktivität jeder Mischung wird bewertet anhand von zwei Mutanten-Formen des ECA: der so genannten N-terminalen Form, in der die C-terminale Stelle inaktiv gemacht worden ist, und der C-terminalen Form, die eine N-terminale inaktive Stelle aufweist, wie von Wei et al. in "J. Biol. Chem." (1992) 267.13398-13405 [14], beschrieben. Diese Mutanten wurden aus CHO-Zellen hergestellt.
In der Fig. 2 sind die Inhibierungs- bzw. Blockierungs-Prozentsätze angegeben, die bei den N- und C-terminalen Mutanten von ECA als Funktion der Art der in der Xaa-Position der Inhibitoren vorliegenden Art der Aminosäure festgestellt wurden. Diese Figur zeigt, dass eine sehr große Anzahl von Substitutionen kompatibel ist mit der Inhibierung (Blockierung) sowohl der N-terminalen Stelle als auch der C- terminalen Stelle des ECA. Bezüglich der Selektivität ist jedoch festzustellen, dass nur die Anwesenheit eines Asparaginsäure-Restes in der Xaa-Position die Inhibie rung (Blockierung) der N-terminalen Stelle erlaubt, jedoch die Inhibitor-Mischung, die diesen Rest aufweist, gegenüber der C-terminalen Stelle von ECA inaktiv macht.
Diese Ergebnisse zeigen, dass es wesentlich ist, dass ein Asp-Rest in der Xaa-Position vorhanden ist, um einen selektiven Inhibitor für die N-terminale Stelle zu erhalten.

Beispiel 2

Auf der Basis der Ergebnisse des Beispiels 1 wurden nach dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 20 Phosphinsäure-Peptide der allgemeinen Formel Ac-Asp- PheΨ(PO&sub2;CH&sub2;)-Ala-Xaa'-NH&sub2; hergestellt, in denen die Xaa'-Position durch eine einzige Aminosäure besetzt war. Diese Peptide wurden wie in Beispiel 1 getestet zur Bestimmung ihrer Inhibitor- bzw. Blockierungs-Aktivität gegenüber den N-terminalen und C-terminal Stellen des ECA.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. 3 dargestellt, welche die Inhibierungs- bzw. Blockierungs-Prozentsätze dieser Peptide gegenüber den N-terminalen und C-terminalen Stellen des ECA als Funktion der Art des Restes in der Xaa'- Position erläutert.
Es sei darauf hingewiesen, dass bezüglich der N-terminalen Stelle die Inhibitoren in einer Konzentration von 100 nM untersucht wurden, während im Hinblick auf die C-terminale Stelle die angewendete Konzentration, um eine merkliche Inhibierung (Blockierung) festzustellen, auf 5 uM festgelegt wurde. Dieser Konzentrationsunterschied reflektiert die höhere Affinität dieser Verbindungen gegenüber der N- terminalen Stelle des ECA.
In der Fig. 3 ist festzustellen, dass die Anwesenheit der Prolin- und Alanin- Reste in der Xaa'-Position der Peptide eine Verbesserung der Selektivität zu Gunsten der N-terminalen Stelle erlaubt und dass die Reste Thr, Lys, Met und Leu gegenüber der C-terminalen Stelle des Enzyms sehr wenig aktiv sind.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wurden die Inhibierungs- bzw. Blockierungskonstanten Ki der in Beispiel 2 erhaltenen Verbindung Ac-Asp-PheΨ(PO&sub2;CH&sub2;)-Ala-Ala'-NH&sub2; gegen über den N-terminalen und C-terminalen Mutanten von ECA bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle I wiedergegeben.
Nach diesen Angaben stellt man fest, dass dieses Peptid um 3 Größenordnungen aktiver gegenüber der N-terminalen Stelle von ECA als gegenüber seiner C- terminalen Stelle ist.

Beispiel 4

In diesem Beispiel werden vier Analoge zum Peptid des Beispiels 3 synthetisiert, die verschiedene endständige Gruppen aufweisen, und es wird der Einfluss der N- und C-terminalen Gruppen auf die Selektivität für die N-terminale Stelle von ECA bestimmt unter Anwendung der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 1. Die Ergebnisse sind in der Tabelle II angegeben.
Die Ergebnisse der Tabelle II zeigen, dass die Anwesenheit der Carboxamid- Gruppe wesentlich ist für die Selektivität des Moleküls. Wenn nämlich die Anwesenheit einer Carboxylat-Gruppe die Affinität gegenüber der N-terminalen Stelle verstärkt, führt diese Modifikation zu einem Selektivitäts-Verlust, wobei diese neue Verbindung sehr aktiv gegenüber dem C-terminalen Bereich ist. In einem geringeren Maße ist zu erkennen, dass die Anwesenheit der N-Acetyl-Gruppe ebenfalls eine Rolle in bezug auf die Selektivität spielt. Das letzte Analogen zeigt, dass die Rolle sehr groß ist bei dem Asparaginsäure-Rest in der N-terminalen Position in bezug auf die Selektivität.

Beispiel 5

In diesem Beispiel wird der Einfluss der Konfiguration der Reste Phe und Ala, die den Phosphinsäure-Block einrahmen, auf die Affinität des Peptid-Derivats des Beispiels 3 in bezug auf die N-terminale Stelle untersucht.
Die Synthese des Peptids Ac-Asp-PheΨ(PO&sub2;CH&sub2;)-Ala-Ala-NH&sub2; führt zur Bildung einer Mischung von vier Diastereoisomeren aufgrund der Anwesenheit von zwei asymmetrischen Zentren in dieser Verbindung. Die Reinigung durch Hochleistungs-HPLC-Phasenumkehr-Flüssigchromatographie dieses Produkts an einer analytischen C18-Kolonne VYDAC, Spektren-System (λ = 220 nm, Durchflussmenge = 1 ml/min) erlaubt die Trennung von drei Fraktionen.
Die Fig. 4 erläutert das erhaltene Chromatogramm, das drei Peaks umfasst.
Auf der Basis der Stärke der HPLC-Peaks und des NMR-Spektrums des Phosphors wird gezeigt, dass der erste Peak zwei Diastereoisomere enthält, wobei die beiden anderen Peaks nur ein Diastereoisomeres enthalten. Die Bestimmung der Aktivität dieser Fraktionen zeigt, dass nur die erste Fraktion aktive Verbindungen enthält.

Beispiel 6

Da das Reinigungsverfahren des Beispiels 5 nicht die Trennung der beiden, in der dem ersten Peak entsprechenden Fraktion vorhandenen Diastereoisomeren erlaubt, wird eine Synthese des Peptids Ac-Asp-Phe-Ψ(PO&sub2;CH&sub2;)-Ala-Ala-NH&sub2; aus einem Phenylaminophosphinsäure-Rest mit der R-Konfiguration durchgeführt, um am Ende der Synthese eine Mischung von zwei Diastereoisomeren zu erhalten, die durch Umkehrphasen-HPLC leicht voneinander trennbar sind.
Zur Durchführung der Synthese des Peptids, das den Aminophenylphosphinsäure-Rest mit der R-Konfiguration enthält, synthetisiert man das Racemat dieser Aminophenylphosphinsäure, dann trennt man die Isomeren durch Umkristallisation in Gegenwart eines chiralen Amins nach dem von Baylis et al. in "J. Chem. Soc. Perkin. Trans" (1984), 2845-2849 [15], beschriebenen Verfahren. Man erhält so die optisch reinen Aminophenylphosphinsäure-Reste mit der Konfiguration R und S. Ausgehend von der Säure mit der Konfiguration R synthetisiert man den Block Fmoc(R)Phe(PO(Ad)-CH&sub2;)AlaOH wie in Beispiel 1, wobei man eine Mischung von zwei Diastereoisomeren erhält
Ac-Asp-(R)Phe(PO&sub2;CH&sub2;)(R)Ala-Ala-NH&sub2;
Ac-Asp-(R)Phe(PO&sub2;CH&sub2;)(S)Ala-Ala-NH&sub2;
die man durch C18-Umkehrphasen-HPLC voneinander trennt.
Die Synthese des Peptids Ac-Asp-PheΨ(PO&sub2;CH&sub2;)Ala-Ala-NH&sub2; wird durchgeführt durch Anwendung einer klassischen Festphasen-Synthesestrategie nach der Fmoc-Chemie, wobei man als festen Träger das Harz Rinkamid verwendet. Die Synthese dieses Peptids erfolgt durch aufeinanderfolgende Verkupplung der folgenden Blöcke: Fmoc-Ala, Fmoc-Phe(PO(Ad)-CH&sub2;)AlaOH und Fmoc-Asp(t-Bu). Die Kupplungen werden durchgeführt durch Anwendung einer in situ-Strategie unter Verwendung von 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorophosphat/Diisopropylethylamin. Die Kupplungs-Bedingungen sind die folgenden: 3 Äquivalente von Derivaten von Fmoc und 4 Äquivalente von Diisopropylethylamin in Dimethylfomamid werden zu dem Harz zugegeben und 30 min lang reagieren gelassen. Zur Spaltung der Gruppe Fmoc werden die folgenden Bedingungen angewendet: 50% Piperidin in Dimethylformamid für 30 min. Die Spaltung des Peptids des Harzes sowie die Abspaltung der Schutzgruppen werden durchgeführt durch Behandlung mit einer Trifluoressigsäure-Lösung, die 2,5% Wasser, 2,5% Thioanisol, 2,5% Phenol, 1,25% Ethandithiol und 1,25% Triisopropylsilan enthält. Die Reinigung des Produkts erfolgt durch C-18-Umkehrphasen-HPLC.
Die Fig. 5 erläutert das Chromatogramm, das unter diesen Bedingungen erhalten wird, das zwei Peaks umfasst, von denen nur einer, der erste, ein Inhibitor- bzw. Blockierungsvermögen gegenüber ECA aufweist. Dieser aktive Peak enthält ein Molekül, das charakterisiert ist durch ein Ki von 12 nM an der N-terminalen Stelle und durch ein Ki von 25 uM an der C-terminalen Stelle von ECA.
Die aktivste Fraktion des Peptids enthält einen Pseudoalanin-Rest mit der Konfiguration S. Die aktive Struktur des Peptids ist somit eine solche des Typs:
Ac-Asp-(R)Phe(PO&sub2;CH&sub2;)(S)Ala-Ala-NH&sub2; (III), nachstehend als RXP 407 bezeichnet. Die Inhibierungs- bzw. Blockierungskonstanten dieser optisch reinen Verbindung sind in der Tabelle III dargestellt.
Die Reinheit der Verbindung RXP 407 konnte nachgewiesen werden durch Massenspektrometrie (theoretische Masse 498,5, gefundene Masse 498) und durch magnetische Resonanzspektrometrie von Phosphor, des Protons und von Kohlenstoff 13.
Phosphor-Spektrum: d = 40,78 ppm, Referenz-Phosphorsäure (0 ppm) Protonen-Spektrum (ppm): Asp.: Ha, 4,28, Hb,b', 2,0 und 2,28; Phe: Ha, 4,08, Hb,b', 2,55 und 3,10, Ar, 7,13 und 7,22; Ala; Ha, 2,58, Hb, 1,08; Ala: Ha, 4,12, Hb, 1,28; P- CH2, 1,48 und 1,62; CH3-CO, 1,82. TSP (0 ppm).
Kohlenstoff 13-Spektrum (ppm): Asp: Ca, 55,3, Cb, 41,5, CO, 180,5; Phe: Ca, 54,5, Cb, 36, Ar, 129,8, 131,7, 132,5, 141,2; Ala: Ca, 37,6, Cb, 21,4, CO, 182,3; Ala: Ca, 53, Cb, 19,6, CO, 181,5; CH2-P, 34,4; CH3CO, 24,5 und 177. Referenz TSP (0 ppm).
Die Spektren wurden bestimmt in D&sub2;O in einer Apparatur vom Typ Bruker DRX, die mit einer Frequenz von 250 MHz für das Proton, von 101 MHz für den Phosphor und von 62 MHz für den Kohlenstoff arbeitet. Die Zuordnungen wurden mit Hilfe von zweidimensionalen Versuchen vom Typ COSY, TOCSY, HMQC und HMBC durchgeführt.
Die Verbindung RXP 407 ist sehr interessant, weil sie in der Lage ist, die beiden aktiven Stellen des ECA voneinander zu unterscheiden. Diese Verbindung ist ein starker Inhibitor der N-terminalen Stelle von ECA (Ki = 12 nM), er weist jedoch eine sehr geringe Affinität für die C-terminale Stelle auf (Ki = 25 uM). Außer dieser Eigenschaft ist festzustellen, dass dieses Molekül aufgrund der Reste Asp und Pseudo- Phe bei seiner Wechselwirkung die Unterzentren S&sub1; und S&sub2; von ECA beeinflusst, eine Eigenschaft, die für einen ECA-Inhibitor wenig üblich ist. Noch überraschender ist, dass dieses Molekül in der C-terminalen Position seiner Struktur eine Carboxamid- Gruppe aufweist, während alle ECA-Inhibitoren, die bisher beschrieben worden sind, systematisch eine freie Carboxylat-Gruppe aufweisen. Dieses Molekül scheint somit sehr originell im Hinblick auf die Art seiner chemischen Struktur und seine Inhibitor- bzw. Blockierungs-Aktivität zu sein.

Beispiel 7

In diesem Beispiel verwendet man das Peptid RXP 407 als Inhibitor für das natürliche ECA und man untersucht den Einfluss der Konzentration an RXP 407 (in nM) auf den Prozentsatz der Inhibierung (Blockierung) von ECA.
Das Inhibierungs- bzw. Blockierungsvermögen der Verbindung wird wie in Beispiel 1 bestimmt unter Verwendung von wildem Human-ECA, das von CHO- Zellen nach dem von Wei et al. in "J. Biol. Chem." (1992) 267, 13398-13405 [14], beschriebenen Protokoll hergestellt worden ist.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. 6 dargestellt, die das Inhibierungs- bzw. Blockierungsprofil erläutert, das man mit RXP 407 erhält in bezug auf die Inhibierung (Blockierung) von natürlichem ECA. Die Anwesenheit von zwei Stufen in der Inhibierungskurve zeigt das Vorhandensein der beiden aktiven Stellen in dem natürlichen ECA, wobei der linke Abschnitt der Kurve auf die Inhibierung des N-terminalen Bereichs von ECA zurückzuführen ist, während der rechte Abschnitt auf den C- terminalen Bereich desselben zurückzuführen ist. Die Knickpunkte scheinen auf dieser Kurve die IC50-Werte von RXP 407 gegenüber den N- und C-terminalen Stellen von natürlichem ECA anzuzeigen, die mit den Ki-Werten kompatibel sind, die ausgehend von ECA-Mutanten gemessen wurden.
Dieser letztgenannte Versuch zeigt, dass das RXP 407 ebenso gut wirksam ist wie ein selektiver Inhibitor für den N-terminalen Bereich des natürlichen Enzyms. Es ist interessant darauf hinzuweisen, dass die Form der Kurve darauf zurückzuführen ist, dass das in diesem Versuch verwendete Substrat ebenso gut gespalten wird durch den N-terminalen Bereich wie durch den C-terminalen Bereich.
Es ist somit möglich, RXP 407 zu verwenden, um Substrate zu identifizieren, die durch eine einzige der beiden aktiven Stellen des Enzyms gespalten werden. Für ein Substrat, das nur durch eine der beiden Stellen gespalten würde, würde die Inhibierungskurve nämlich nur eine Stufe und nicht zwei enthalten. Wenn das Substrat nur durch den N-terminalen Bereich gespalten würde, wäre der Knickpunkt der Kurve bei der Konzentration von RXP 407 von 100 nM angeordnet, während für ein Substrat, das nur durch den C-terminalen Bereich gespalten würde, der Knickpunkt zu 10 mM verschoben wäre.
Dieser neue Inhibitor ist somit ein sehr gutes Werkzeug für die Untersuchung der Selektivität von natürlichem ECA gegenüber dem Abbau von physiologischen Substraten.

Beispiel 8

In diesem Beispiel werden die Pharmakokinetik und der Stoffwechsel der Verbindung RXP 407 beim Tier untersucht.
Zu diesem Zweck führt man die Synthese eines RXP 407 durch, das drei Tritiumatome an der N-Acetyl-Gruppe aufweist, um eine Untersuchung über die Pharmakokinetik und den Stoffwechsel dieses Moleküls bei der Ratte durchführen zu können durch Injizieren dieses Produkts in Dosen von 0,1,1 und 5 mg/kg auf intravenösem Wege im Bolus.
Anschließend bestimmt man die Plasma-Konzentration von RXP 407 in Abhängigkeit von der Zeit.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. 7 dargestellt. Die Kurve 1 entspricht 0,1 mg/kg, die Kurve 2 entspricht 1 mg/kg und die Kurve 3 entspricht 5 mg/kg. Die gestrichelte Linie erläutert den Ki-Wert von RXP 407 (20 nM).
Man stellt somit fest, dass die Injektion einer Dosis von 5 mg/kg auf intravenösem Wege im Bolus zu Plasma-Konzentrationen von RXP 407 von 100 ng/ml Produkt während mehr als 4 h führt, was einer Konzentration entspricht, die gleich dem 10-fachen des Ki-Wertes dieses Inhibitors für die N-terminale Stelle ist.
In der Tabelle IV sind die Ergebnisse angegeben, die erhalten wurden in bezug auf die in vivo-Eliminierung von tritiiertem RXP 407 bei der Ratte. Diese Ergebnisse sind in % der injizierten Radioaktivität ausgedrückt. Sie zeigen, dass die Verbindung hauptsächlich mit dem Urin eliminiert wird (87% nach 24 h) und sehr wenig mit den Fäkalien eliminiert wird (13%). Keine Spur dieses Produkts ist in der Atemluft zu finden.
Aus dieser Tabelle ersieht man, dass die vier Ratten 100% (100,09 ± 7) des injizierten RXP 407 innerhalb von 48 h ausgeschieden hatten. Das Produkt wird hauptsächlich über den Urin ausgeschieden, in geringerem Umfang durch die Fäkalien, praktisch überhaupt nicht durch die Atemluft.
Darüber hinaus zeigt die Analyse der Struktur des Produkts im Urin und in den Fäkalien, dass RXP 407 keinerlei Verstoffwechselung erfahren hat.
Es wurde die Toxizität dieses Produkts bei der Maus bewertet. Dabei wurde festgestellt, dass bei einer Dosis von 25 mg/kg, injiziert auf intravenösem Wege, dieses Produkt kein Anzeichen von Toxizität bei der Maus erkennen lässt. Nach 7- tägiger Überwachung leben die behandelten Mäuse durchaus normal.
Das RXP 407 ist somit ein wirksamer Inhibitor. Der Vorteil dieses neuen Inhibitors für ECA beruht darauf, dass er der erste Inhibitor ist, der selektiv für die N- terminale Stelle dieses Enzyms ist. Die pharmakokinetischen Eigenschaften, das Fehlen einer Verstoffwechselung und somit die in vivo-Stabilität machen diesen Inhibitor zu einem idealen Produkt zum Blockieren der N-terminalen Stelle von ECA in therapeutischen Versuchen, ohne dass die physiologischen Funktionen, die durch die C-terminale Stelle des Enzyms gesteuert werden, beeinflusst werden.
Darüber hinaus erlaubt das RXP 407 in vivo die jeweilige Zuordnung der N- terminalen und C-terminalen Stellen des ECA beim Stoffwechsel von Ac-Ser-Asp- Lys-Pro. Die in vitro durchgeführten Versuche zeigen, dass die N-terminale Stelle von ECA viel wirksamer ist für die Spaltung dieses Peptids als die C-terminale Stelle, sodass die Steuerung des Stoffwechsels dieses Peptids mittels RXP 407 ein vernünftiges Ziel darstellt.

Beispiel 9

In diesem Beispiel wird der Einfluss der in vivo-Injektion von RPX 407 bei Mäusen untersucht.
Zu diesem Zweck unterwirft man die Mäuse einer 30-minütigen Perfusion (Infusion) von RXP 407 in Dosen von 0,1,1 und 10 mg/kg und man bestimmt die Konzentration des Peptids Ac-Ser-Asp-Lys-Pro-(Ac-SDKP) des Plasmas der Mäuse.
Das Peptid Ac-Ser-Asp-Lys-Pro wird bestimmt durch eine immunoenzymatische Konkurrenz-Dosierung(-Bestimmung) unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern und von Ac-SDKP, das an die Acetylcholinesterase von Elektrophorus Electricus gebunden ist.
Man führt die gleichen Messungen der Plasma-Konzentrationen an Ac-SDKP bei Mäusen durch, die mit Lisinopril in einer Dosis von 10 mg/kg perfundiert worden sind, und bei Vergleichsmäusen, die nicht perfundiert worden sind. Das Lisinopril ist ein Inhibitor, der klinisch verwendet wird, der auf nicht-selektive Weise die beiden aktiven Stellen von ECA blockiert.
Die Fig. 8 erläutert die erhaltenen Ergebnisse anhand der Konzentration von Ac-SDKP (nM) als Funktion der Zeit (in min).
Die Kurven 4, 5 und 6 beziehen sich auf Mäuse, die mit RXP 407 in Dosen von 0,1 mg/kg (Kurve 4), 1 mg/kg (Kurve 5) und 10 mg/kg (Kurve 6) perfundiert worden sind.
Die Kurve 7 bezieht sich auf Mäuse, die mit 10 mg/kg Lisinopril perfundiert worden sind.
Die Kurve T bezieht sich auf Vergleichs-Mäuse.
Man stellt fest, dass die Injektion von RXP 407 eine sehr starke Zunahme des Plasma-Gehaltes des Peptids Ac-SDKP hervorruft. Im Vergleich zu einem Inhibitor, der auf nicht-selektive Weise die beiden aktiven Stellen von ECA blockiert, stellt man fest, dass die Gehalte an Ac-SDKP in dem Plasma die gleichen sind wie diejenigen, die mit RXP 407 erhalten werden. Da man weiß, dass das RXP 407 nur eine der beiden Stellen von ECA blockiert, nämlich die N-terminale Stelle, kann man aus diesen Versuchen schließen: dass die C-terminale Stelle von ECA nicht beteiligt ist an dem Stoffwechsel von Ac-SDKP und dass vielmehr dieser Stoffwechsel nur von der N- terminalen Stelle von ECA abhängt, worin der Vorteil der Verwendung von RXP 407 gegenüber klassischen Inhibitoren von ECA besteht, welche die beiden Stellen von ECA auf nicht-selektive Weise blockieren. Dieser Versuch zeigt auch die wirksame in vivo-Aktivität von RXP 407.

Beispiel 10

In diesem Beispiel bestimmt man den Einfluss von RXP 407 auf die Gehalte an Renin, einem anderen Enzym, das in die Regulierung des arteriellen Blutdrucks eingreift. Die Blockierung von ECA durch einen klassischen Inhibitor für dieses Enzym führt zu einem Abstoppen der Hydrolyse von Angiotensin I zu Angiotensin II. Das Angiotensin I ist nämlich eines der physiologischen Substrate von ECA. Die Verringerung des Gehaltes an Angiotensin II in dem Plasma durch einen Retrokontroll-Mechanismus erhöht den Plasma-Gehalt von Renin, einem Enzym, das direkt in die Bildung von Angiotensin I aus dem Angiotensinogen eingreift.
Auf die Inhibierung von ECA kann somit eine indirekte Erhöhung des Plasma- Gehaltes an Renin folgen.
Dieser Gehalt kann bewertet werden anhand der Fähigkeit des Renins, in Plasma-Proben einen Überschuss an vorhandenem Angiotensin in dem Plasma der Maus zu hydrolysieren. Die Bildung von Angiotensin I wird danach durch eine radioimmunologische Analyse bestimmt und der Gehalt an Renin ist ausgedrückt in ng Angiotensin I, das pro ml Plasma und pro Stunde Inkubation gebildet worden ist.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. 9 angegeben für:
- Mäuse, die perfundiert worden sind mit RXP 407 in Dosen von 0,1 mg/kg (Kurve 8), 1 mg/kg (Kurve 9) und 10 mg/kg (Kurve 10),
- Mäuse, die perfundiert worden sind mit Linisopril in einer Dosis von 10 mg/kg (Kurve 11) und
- Vergleichs-Mäuse (Kurve T).
Die Fig. 9 zeigt, dass die Behandlung einer Maus mit Lisinopril zu einer Erhöhung des Renin-Gehaltes im Plasma führt, was der Inhibierungs- bzw. Blockierungswirkung von ECA durch diese Verbindung entspricht. Dagegen wird gezeigt, dass die Behandlung mit RXP 407 zu keiner Erhöhung des Renin-Gehaltes führt. Dieser Inhibitor erlaubt somit die selektive Inhibierung (Blockierung) des Abbaus des Peptids Ac-SDKP, ohne die Steuerung des arteriellen Blutdrucks zu beeinflussen. Diese Beobachtung, die sehr wichtig ist für die Selektivität der in vivo-Aktivität der Verbindung RXP 407 lässt vermuten, dass nur die C-terminale Stelle von ECA in die Hydrolyse von Angiotensin I eingreift, was erklärt, warum die Injektion von RXP 407 keinen Einfluss auf die Renin-Gehalte hat.
Die Gesamtheit dieser Versuche bestätigt daher den Vorteil der Verwendung von RXP 407 zur Steuerung der Plasma-Gehalt des Peptids Ac-SDKP. Erneut wurde gezeigt, dass dieses Peptid eine Schutzwirkung auf die Stammzellen von Knochenmark bei Chemotherapie- und Radiotherapie-Versuchen hat. Das RXP 407 ist somit in diesem Zusammenhang sehr nützlich durch die Mobilisierung der physiologischen Gehalte an dem Peptid Ac-SDKP über die Blockierung seiner Verstoffwechselung durch ECA.
Da das Peptid Ac-Ser-Asp-Lys-Pro ein Regulator für die Hämatopoese (Blutbildung) ist, wird vorgeschlagen, den erfindungsgemäßen Inhibitor in Chemotherapie- oder Radiotherapie-Antikrebs-Versuchen zu verwenden, um die Knochenmarkszellen zu schützen gegen die toxischen Wirkungen der Antikrebs-Behandlung. Es ist auch möglich, eine Anwendung auf dem Gebiet der Antikrebs-Therapie in Betracht zu ziehen, da es denkbar ist, dass das ECA in die Proliferation verschiedener Zelltypen eingreift über die Aktivität seines N-terminalen Bereichs.
Ein anderes Nebenprodukt dieses Inhibitors besteht darin, dass es ein sehr wirksames Werkzeug für die Untersuchung des jeweiligen Beitrags der N-terminalen und C- terminalen Stellen der wilden ECA beim Abbau verschiedener physiologischer Substrate dieses Systems darstellt.

Erwähnte Literaturhinweise

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[15] Baylis et al. "J. Chem. Soc. Perkin. Trans" (1984), 2845-2849 Tabelle I Tabelle II Tabelle III Tabelle IV % injizierte Radioaktivität

Claims

1. Peptid-Derivat, das die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

- Asp-PheΨ(PO&sub2;CH&sub2;)-Ala-Xaa'- (I)

worin:

- Ψ(PO&sub2;CH&sub2;) anzeigt, dass die Peptid-Bindung (CONH) zwischen Ph und Ala durch die Phosphin-Bindung PO&sub2;CH&sub2; ersetzt ist, und

- Xaa' einen Aminosäurerest darstellt,

wobei die PO&sub2;CH&sub2;-Gruppe in der Form PO&sub2;&supmin; vorliegt und mit einem pharmazeutisch akzeptablen Gegenion assoziiert ist.

2. Peptid-Derivat der folgenden Formel:

R¹-Asp-Ph-Ψ(PO&sub2;CH&sub2;)-Ala-Xaa'-NH&sub2; (II)

worin:

- R¹ die Acetyl- oder Benzyloxycarbonyl-Gruppe darstellt,

- Ψ(PO&sub2;CH&sub2;) anzeigt, dass die Peptid-Bindung (CONH) zwischen Phe und Ala durch die Phosphin-Bindung PO&sub2;CH&sub2; ersetzt ist, und

- Xaa' für einen Aminosäurerest steht,

wobei die PO&sub2;CH&sub2;-Gruppe in der Form PO&sub2; vorliegt und mit einem pharmazeutisch akzeptablen Gegenion assoziiert ist.

3. Peptid-Derivat nach Anspruch 2, in dem R¹ die Acetylgruppe darstellt.

4. Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in dem Xaa' Ala darstellt.

5. Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in dem der Rest Phe die R-Konfiguration hat.

6. Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 und 2, in dem der Rest Ala die R-Konfiguration hat.

7. Peptid-Derivat der Formel:

Ac-Asp-(R)Phe-Ψ(PO&sub2;CH&sub2;)-(S)Ala-Ala-NH&sub2; (III)

worin:

- Ac die Acetylgruppe darstellt und

- Ψ(PO&sub2;CH&sub2;) anzeigt, dass die Peptid-Bindung (CONH) zwischen Phe und Ala durch die Phosphin-Bindung (PO&sub2;CH&sub2;) ersetzt ist,

8. Pharmazeutische Zusammensetzung zur selektiven Hemmung der N- terminalen Stelle des humanen Angiotensin-Umwandlungsenzyms, die ein Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthält.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, die verwendbar ist zum Schützen der hämatopoietischen Stammzellen von Patienten, die einer aggressiven chemotherapeutischen oder radiotherapeutschen Behandlung unterzogen werden.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 8, in der die Behandlung eine Antikrebs-Behandlung ist.

11. Verwendung eines Peptid-Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur selektiven Hemmung der N-terminalen Stelle des humanen Angiotensin-Umwandlungsenzyms.

12. Verwendung nach Anspruch 11, bei der das Arzneimittel dazu bestimmt ist, die Vermehrung der hämatopoietischen Stammzellen von Patienten, die einer Antikrebsbehandlung unterzogen werden, zu steuern.