JP2002519430A

JP2002519430A - ヒトアンギオテンシン変換酵素のｎ−末端部位選択的阻害薬

Info

Publication number: JP2002519430A
Application number: JP2000558107A
Authority: JP
Inventors: ディーヴ，ヴィンサン; コトン，ジョエル; キュニアス，フィリップ; イオタキス，アタナシオス; コルヴォル，ピエール; ミショー，アニー; ショーヴェ，マリー−テレーズ; メナール，ジョエル; エザン，エリック
Original assignee: コミツサリアタレネルジーアトミーク; アンスチチュナショナルドラサントエドラルシェルシュメディカル（アンセルム）
Priority date: 1998-07-02
Filing date: 1999-07-01
Publication date: 2002-07-02
Also published as: FR2781230A1; PT1091966E; EP1091966A1; US6482797B1; DE69903816T2; ATE227294T1; CA2335918A1; ES2186366T3; DE69903816D1; DK1091966T3; EP1091966B1; FR2781230B1; WO2000001706A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトアンギオテンシン変換酵素のＮ-末端部位選択的阻害薬として有用なペプチド誘導体に関する。前記誘導体は、以下の式：-Ａｓｐ-Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)-Ａｌａ-Ｘａａ’-に従うアミノ酸配列を含んでなり；式中：Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)は、ＰｈｅとＡｌａとの間のペプチド結合（ＣＯＮＨ）がホスホニック結合ＰＯ_２ＣＨ_２で置換されていることを示し；そしてＸａａ’はアミノ酸残基を表す。前記誘導体は、特に攻撃性の化学治療又は放射線治療を受けている患者の造血系細胞を保護するための製薬製剤において使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、ヒトアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）のＮ-末端部位を、ＡＣ
Ｅの第二の活性部位無しに、選択的に阻害するホスフィニックペプチド誘導体に
関する。ＡＣＥのＮ-末端部位の選択的阻害薬（インヒビター）である前記ペプチド誘
導体は、攻撃性の化学治療又は放射線治療を受けている患者の造血系細胞を保護
するための治療目的で使用できる。

【０００２】（関連技術の現状）１９８０年代に、疑似ペプチドＡＣＥ阻害薬の開発が、動脈性高血圧、心臓疾
患及び慢性腎不全の治療を純粋に革命を起こした。このようにして、現在、臨床
実務で使用される広範な合成ＡＣＥ阻害薬が存在する。これらの中で、それらの
構造をＦｉｇ１に与えるカプトプリル、エナラプリル及びフォシノプリル(fosin
opril)が知られている。

【０００３】この研究に並行して、１９８８年のP.CovolのグループでのＡＣＥ酵素のクロ
ーニングにより、前記酵素における２つの活性部位の存在が示され、これは、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 9386-9390 [1]においてSoubrier等によ
り記載されている通りである。

【０００４】前記の２つのＡＣＥ部位がヒトにおける別々の生理学的機能を調節するという
公式見解は、この分野でのもう一つの革命を象徴し、治療的タームの有意な重要
性を有している。今日までに開発された全てのＡＣＥ阻害薬は、インビトロで両
方の活性ＡＣＥ部位を同程度に阻害するので、このタイプの化合物により前記２
つの活性部位の生理学的機能をインビボで治療することはできない。しかしなが
ら、２つの活性ＡＣＥ部位の間を識別できる最初の阻害薬は極めて価値がある。

【０００５】ＡＣＥは、動脈圧、循環血液容量及び心臓血管血行動態の調節に含まれる幾つ
かの天然基質を加水分解する。主要な基質はアンギオテンシンＩという不活性デ
カペプチドであり、これは、Ｈｉｓ-Ｌｅｕカルボキシ末端ジペプチドの加水分
解の後に、アンギオテンシンＩＩという昇圧性及び抗ナトリウム輸送性のペプチ
ドに活性化される。並行して、ＡＣＥはブラジキニンという血管拡張性及びナト
リウム輸送性のペプチドを、共に不活性なヘプタペプチド、次いでペンタペプチ
ドに不活性化する。ＡＣＥの２つのＮ-及びＣ-末端部位は、この加水分解に類似
の形式で含まれている。

【０００６】ＡＣＥのＮ-末端の特異的機能は、P. Corvolのグループによって最近同定され
た。Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 779-782 [2]においてLenfant等に
より記載されているように、Ｎ-アセチル-セリル-アスパルチル-リシル-プロリ
ン（ＡｃＳＤＫＰ）は、造血系細胞のＳ相への進入の天然循環阻害薬である。そ
れはまた、Cell. Tissue. Kinet (1990) 23, 99-103 [3]においてLombard等によ
って記載されているように、再生相における血液細胞、リンパ球及び幾つかの安
定な細胞系といった他の細胞型のＳ相への進入も阻害する。造血細胞の細胞周期
に対するＡｃＳＤＫＰの阻害作用は正常な造血細胞に特異的であり；白血球細胞
は関与しない。従って、ＡｃＳＤＫｐは、化学治療中の延髄性前駆体の防止のた
めの治療薬として提案された。実際に、ＡｃＳＤＫＰは細胞毒性薬で処理したマ
ウスの生存を延長させる（Bodgen等, Ann. N.Y. Acad. Sci. (1991) 628, 126-1
39 [4]）。J. Biol. Chem. (1995) 270, 3656-3661 [5]のRousseau等及びJ. Cli
n. Invest. (1996) 97, 839-844 [6]のAzizi等に記載されているように、ＡｃＳ
ＤＫＰはＡＣＥによって、より詳細には酵素のＮ-末端ドメインによってインビ
トロ及びインビボで加水分解される。インビトロでは、ＡｃＳＤＫＰは、Ｃ-末
端ドメインによるよりＮ-末端ドメインによって５０倍速く加水分解される。こ
の発見は、動脈圧調節及びハイドロナトリウム代謝以外の機能に含まれる基質に
作用することを可能にする、ＡＣＥのＮ-又はＣ-末端ドメインの特異的阻害薬を
開発することができることを示している。

【０００７】ＡＣＥは、血漿ＡｃＳＤＫＰの代謝において主要な、排他的でさえある酵素で
ある。健常な志願者におけるカプトプリルの１回投与は、ペプチドの血漿レベル
を６−７倍上昇させた。Ｎ-末端ドメインの選択的阻害薬は、カプトプリルや今
日までに使用されている他の変換酵素阻害薬とは異なり、動脈圧の調節及びハイ
ドロナトリウム代謝で役割を担うペプチド（アンギオテンシン、ブラジキニン）
の代謝を改変することなく、そのような結果を得ることを可能にする。従って、
ＡＣＥのＮ-末端ドメイン阻害薬は、攻撃性の化学治療又は放射線治療処理を受
けている患者の造血系細胞の保護のために極めて興味深いものである。この阻害
薬は、抗癌治療の前又は同時に投与することができる。

【０００８】さらに、J. Clin,. Invest. (1996) 98, 671-679 [7]においてVolpert等によ
り、ＡＣＥの両方の活性部位を阻害するカプトプリルが、インビトロ及びインビ
ボで、保護的な抗癌効果を実験的に発揮することが示された。この保護的効果の
メカニズムは知られていないが、おそらくＡｃＳＤＫＰが、その多くの型の細胞
の細胞周期への進入に対する特性により含まれているであろう。従って、血管作
動性ペプチドの代謝を改変することなく、ＡｃＳＤＫＰの血漿レベルを潜在的に
するＡＣＥのＮ-末端ドメインの選択的阻害薬は、有利な効果を有しているであ
ろう。

【０００９】今日までに開発され、Ｆｉｇ１に例示した強力なＡＣＥ阻害薬の殆どは、活性
ＡＣＥ部位に局在する亜鉛原子と好ましく相互作用する化学的基がグラフトされ
た疑似ジペプチド細胞の存在を特徴とする。確かに、ＡＣＥは亜鉛金属酵素分解
酵素のグループに属し、酵素の両方の活性部位における亜鉛原子の存在を特徴と
しており、亜鉛原子は触媒において必須の役割を担う。多くの研究は、亜鉛をキ
レートできる化学基を含む疑似ペプチドの合成が、極めて強力な亜鉛金属タンパ
ク質分解酵素阻害薬への利用を提供することを示した。市販のＡＣＥ阻害薬にお
ける亜鉛と相互作用できる化学基は、ＨＳチオール基（カプトプリル）、ＣＨ-
ＣＯＯカルボキシアルキル基（エナラプリル）及びＸがＮＨ、Ｏ、ＣＨ_２である
場合のＰＯ_２-Ｘホスホリル基（フォシノプリル）である。

【００１０】文献FR-A-2 676 059 [8]及びEP-A-0 725 075 [9]は、亜鉛と相互作用するホス
フィン型の基を含む、亜鉛プロテアーゼ阻害薬として使用できるペプチド誘導体
を例示している。FR-A-2 676 059では、前記誘導体は細菌性コラゲナーゼ阻害薬
であるが、EP-A-0 725 075では、それらは選択的２４−１５亜鉛エンドペプチダ
ーゼ阻害薬であり、アンギオテンシン変換酵素といった他のプロテアーゼに対し
ては不活性である。このように、今日まで、アンギオテンシン変換酵素のＮ-末端の選択的阻害薬
は存在しない。

【００１１】本発明は、特に前記酵素のＮ-末端の選択的阻害薬であるホスフィニック基を
含む新規なペプチド誘導体に関する。

【００１２】（本発明の説明）本発明によると、前記の新規なペプチド誘導体は、下記式： -Ａｓｐ-Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)-Ａｌａ-Ｘａａ’- （Ｉ）（式中： Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)は、ＰｈｅとＡｌａとの間のペプチド結合（ＣＯＮＨ）がホ
スホニック結合ＰＯ_２ＣＨ_２で置換されていることを示し、そしてＸａａ’はアミノ酸残基を表す）に従うアミノ酸配列を含んでなる。

【００１３】この配列において、ＰＯ_２ＣＨ_２基はＰＯ_２ ⁻形態であり；従って、Ｋ^＋、Ｎ
ａ^＋又は他の任意の生理学的に許容される対イオンを伴う。水中では、荷電した
基が分離するので、対イオンの型は重要ではない。

【００１４】本発明の特別な実施態様によると、ペプチド誘導体はこれらの配列の４つのア
ミノ酸のみを含み、下記式：Ｒ^１-Ａｓｐ-Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)-Ａｌａ-Ｘａａ’-ＮＨ_２（ＩＩ）（式中：Ｒ^１は、アセチル又はベンジルオキシカルボニル基を表し、 Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)は、ＰｈｅとＡｌａとの間のペプチド結合（ＣＯＮＨ）がホ
スホニック結合ＰＯ_２ＣＨ_２で置換されていることを示し、そしてＸａａ’はアミノ酸残基を表す）に従う。好ましくは、Ｒ^１はアセチル基を表す。

【００１５】上に与えた式Ｉ及びＩＩにおいて、Ｘａａ’に用いられるアミノ酸は天然又は
非天然のアミノ酸、又は疑似アミノ酸である。天然アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シ
ステイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、
ロイシン、ノルロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、
ヒドロキシプロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン
、ニトロフェニルアラニン、ホモアルギニン、チアゾリジン及びデヒドロプロリ
ンから選択できる。

【００１６】疑似アミノ酸は、アミノ又はカルボニル官能基が他の化学基に置換されたアミ
ノ酸として定義される。前記式において、アミノ酸Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ａｌａ及びＸａａ’はＬ又はＤ型
であってよい。従って、ペプチド誘導体は、誘導体における２つの対象中心の存
在により、単一の異性体又は４つのジアステレオ異性体であってよい。

【００１７】本発明によるペプチド誘導体において、アミノ酸Ｘａａ’は、好ましくはＡＣ
ＥのＣ-末端部位に対して低い活性を持つ以下のアミノ酸：Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔ
ｈｒ、Ｌｙｓ及びＬｅｕから選択される。好ましくは、Ｘａａ’はＡｌａを表すが、これは、このアミノ酸が酵素のＮ-
末端部位の阻害についてペプチド誘導体を強化する一方、Ｃ-末端部位への低い
阻害活性を有するからである。

【００１８】本発明のペプチド誘導体は、EP-A-0 725 075に記載されたペプチド誘導体と、
それらが疑似-Ｐｈｅの前にＡｓｐ残基を含み、ペプチド誘導体をアンギオテン
シン変換酵素のＣ-末端に対して不活性にし、よって所望の選択性を提供してい
る点において相違する。さらに、EP-A-0 725 075のペプチド誘導体は、この酵素
に対して不活性であったが、本発明の誘導体は前記酵素のＮ-末端部分に対して
活性である。

【００１９】Ａｓｐ及び疑似-Ｐｈｅ残基の存在は、ペプチド誘導体が酵素の副次的部位Ｓ
１及びＳ２に対して作用することを可能にし、それはＡＣＥ阻害薬に通常の特性
である。更にまた驚くべき事実は、前記ペプチド誘導体がその構造のＣ-末端位
置においてカルボキシレート基を含む一方、今日までに記載された全てのＡＣＥ
阻害薬は遊離のカルボキシアミド基を含む。このように、前記ペプチド誘導体は
、その化学構造及びその阻害活性の点で元々悩みの種である。

【００２０】本発明では、任意のＰｈｅ及びＡｌａアミノ酸配置が好適であるが、Ｐｈｅに
ついてはＲ配置を有するのが好ましい。さらに、Ａｌａアミノ酸についてはＳ配
置を有するのが好ましい。このように、好ましいペプチド誘導体は下記式：Ａｃ-Ａｓｐ-_（Ｒ）Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)-_（Ｓ）Ａｌａ-Ａｌａ-ＮＨ_２
（ＩＩＩ）（式中：Ａｃはアセチル基を表し、 Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)は、ＰｈｅとＡｌａとの間のペプチド結合（ＣＯＮＨ）がホ
スホニック結合ＰＯ_２ＣＨ_２で置換されていることを示す）に従う。

【００２１】本発明のペプチド誘導体は、FR-A-2 676 059に記載されているような従来の方
法を用いて、あるいはEP-A-0 725 075に記載されたような固相合成法を用いて、
下記式：Ｆｍｏｃ-ＰｈｅΨ(ＰＯ(Ａｄ)-ＣＨ_２)ＡｌａＯＨ（式中、Ｆｍｏｃは(フルオレニルメトキシル)カルボニル基を表し、Ａｄはアダ
マンチル基を表す）のシントンに基づいて、そして固体基質として２-クロリト
リチル樹脂を用いて調製できる。

【００２２】このシントンは、特にJ. Org. Chem., 1996, 61, 6601-6605 [10]においてYio
takis等によって記載されたプロトコールに従って調製してよい。また本発明は、上記に与えた式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに従うペプチド誘導体を含
んでなる、ヒトアンギオテンシン変換酵素のＮ-末端部位を選択的に阻害する製
薬製剤にも関する。

【００２３】前記製薬製剤は、攻撃性の化学治療又は放射線治療、例えば癌治療を受けてい
る患者の造血系細胞を保護するために特に使用できる。また本発明は、上記の式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに従うペプチド誘導体の、ヒトア
ンギオテンシン変換酵素のＮ-末端部位を選択的に阻害する医薬製品の製造のた
めの使用にも関する。

【００２４】このような医薬製品は、癌治療を受けている患者の造血系細胞の増殖の調節を
意図するものとすることができる。本発明の他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して、以下の説明を読むこと
により更に明確に理解されるが、それは当然に例示として与えられるものであり
、限定するものではない。

【００２５】（実施態様の説明）実施例１この実施例では、一般式Ａｃ-Ｘａａ-ＰｈｅΨ(ＰＯ_２ＣＨ_２)Ａｌａ-Ｘａａ
’-ＮＨ_２に従う２０の混合物を合成したが、式中、Ｘａａの位置は知られた構
造のアミノ酸で占められる一方、Ｘａａ’の位置は、等モル形式での２０の天然
アミノ酸によって占められる。

【００２６】この合成のために、J. Biol. Chem. (1995) 270, 21701-21706 [12]においてJ
iracek等により、及びJ. Biol. Chem. (1996) 271, 19606-19661 [13]においてJ
iracek等によって記載された化学的手法の組み合わせを、ホスフィニックブロッ
クとしてJ. Org. Chem., 1996, 61, 6601-6605 [10]においてYiotakis等によっ
て５つのタイプのシントンについて記載された方法に従って得られたシントンＦ
ｍｏｃ-Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ(Ａｄ)-ＣＨ_２)ＡｌａＯＨを用いた固相合成とともに使
用した。

【００２７】ａ）Ｆｍｏｃ-Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ(Ａｄ)-ＣＨ_２)ＡｌａＯＨホスフィニックブロ
ックの合成１．Ｚ-Ｐｈｅ(ＰＯ_２-ＣＨ_２)ＡｌａＯｅｔブロック（Ｚ＝ベンジルオキシカ
ルボニル）の調製Ｚ-Ｐｈｅ(ＰＯ_２)Ｈ（1 mmol）及びヘキサメチジシラザン(5 mmol)の懸濁物
を、アルゴン雰囲気中で110℃に1時間加熱した。90℃まで冷却した後、メチルア
クリル酸エチル（1.3 mmol）を滴状で30分添加した。反応物を、90℃で撹拌しな
がら3時間放置した。反応混合物を70℃にした後、3mlの無水エタノールを滴下し
た。室温に戻した後、揮発性生成物を真空下で気化させて除去し、残りの生成物
を10%のＮａＨＣＯ_３中に取り込んだ。この水相をエーテルで洗浄し、1NのＨＣ
ｌでｐＨ1.5まで酸性化し、次いで沈殿物を酢酸エチルに取り込んだ。この有機
相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、気化させて乾燥し、Ｚ-Ｐｈｅ(ＰＯ_２-ＣＨ_２)Ａｌ
ａＯｅｔブロックを良好な収率で得た。

【００２８】２）Ｚ-Ｐｈｅ(ＰＯ(Ａｄ)-ＣＨ_２)ＡｌａＯｅｔブロックの調製Ｚ-Ｐｈｅ(ＰＯ_２-ＣＨ_２)ＡｌａＯｅｔ化合物（1 mmol）を95%エタノール（2
5 ml）に溶解させた。この溶液を、0.5Mの硝酸銀溶液に滴下した。10分後、反応
混合物に15mlの水を添加し、真空下でエタノールを気化させた。銀沈殿物を含有
する残りの水相を、水及びアイスバスで冷却した。形成された沈殿物を濾過し、
冷水で洗浄し、Ｐ_２Ｏ_５の存在下で真空乾燥させてホスフィニックブロックの銀
塩を90%の収率で得た。この生成物（1 mmol）を、クロロホルム（10ml）中の臭
化アダマンチル溶液（1.2 mmol）に添加した。この混合物を30分間還流煮沸した
。沈殿物である臭化銀を濾過で除去し、残りの反応混合物を真空下で気化して乾
燥させた。予測される生成物をフラッシュクロマトグラフィー（溶離剤：クロロ
ホルム／イソプロパノール、9:3）により80%の収率で精製した。

【００２９】３）Ｚ-Ｐｈｅ(ＰＯ(Ａｄ)-ＣＨ_２)ＡｌａＯＨブロックの調製Ｚ-Ｐｈｅ(ＰＯ(Ａｄ)-ＣＨ_２)ＡｌａＯＨブロック（1 mmol）をエタノール（
10 ml）に溶解させた。この溶液に、4Nのソーダを滴状で添加した。2時間の反応
の後、真空下でエタノールを気化させ、残りを20mlの水で希釈した。反応混合物
をアイスバスで冷却し、次いで0.5NのＨＣｌでpH2まで酸性化した。沈殿した生
成物をエーテルに取り込み、有機相を水ですすぎ、ＮａＳＯ_４で乾燥し、次いで
気化して乾燥させて、ケン化ホスフィニックブロックを95%の収率で得た。

【００３０】４）Ｆｍｏｃ-Ｐｈｅ(ＰＯ(Ａｄ)-ＣＨ_２)ＡｌａＯＨブロックの調製Ｚ-Ｐｈｅ(ＰＯ(Ａｄ)-ＣＨ_２)ＡｌａＯＨホスフィニックブロック（1 mmol）
及びギ酸アンモニウム（4 mmol）を含有するエタノール（Rml）に、0.25gの10%
Ｐｄ／Ｃを添加した。室温で12分後、セライト上の濾過で触媒を除去し、次いで
残りを真空中で乾燥させた。前記残物をジクロロメタンに取り込み、次いで気化
して乾燥させた。この手法を数回繰り返した。前記残物をクロロホルムで処理し
、未反応で沈殿物形態で存在する過剰のギ酸アンモニウムを濾過で除去した。形
成された生成物をＮａ_２ＣＯ_３（3 ml）中に取り込んだ。反応混合物を真空中で
１／２まで蒸発させ、次いで1.5mlの水及び2mlのジオキサンを添加した。ジオキ
サン（2 ml）中のＦｍｏｃ-Ｃｌ（1.2 mmol）溶液を反応混合物に添加し、アイ
スバスで冷却した。この溶液を撹拌しながら、4℃で2時間、次いで室温で4時間
放置した。反応混合物を20mlの水で希釈し、アイスバスで冷却し、2NのＨＣｌで
ｐＨ２まで酸性化した。沈殿した生成物を即座にエーテルに取り込んだ。この有
機相を水ですすぎ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、次いで気化して乾燥させて、必要と
する生成物を得たが、これはフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム／メ
タノール、9.5:0.5）により65%の最終収率で精製した。

【００３１】ｂ）ホスフィニックペプチド合成ホスフィニックペプチド合成のために、第１のアミノ酸Ｘａａを、G. Int. J.
Rept. Protein., Res, 1991, 37, 513-520 [11]においてBarlos等によって記載
された技術を用いて２-クロロトリチル樹脂に結合させた。ホスフィニックブロ
ックは、次いで第１のアミノ酸、次いでＸａａ’アミノ酸に固定した。Ｆｍｏｃ
基をＮ-メチルピロリドン中の30%ピペリジンで除去し、続くＸａａ’残基を２-(
１Ｈ)ベンゾトリアゾール-１-イル)-１，１，３，３-テトラメチルウロニウム
ヘキサフルオロホスフェート／ジイソプロピルエチルアミンを用いて結合させた
。この方法において、種々の工程は、Yiotakis等, J. Org. Chem. (1996) 61, 6
601-6605 [10]に記載されたように、ペプチド化学で一般に使用される試薬及び
溶媒を用いて従来の技術で実施した。

【００３２】このように、ペプチド混合物は、Ｘａａ位置において２０の異なるアミノ酸及
びＸａａ’位置において２０の異なるアミノ酸を含み、このペプチド混合物は、
Ｘａａ位置のアミノ酸の型に従って分離され同定された。

【００３３】前記混合物は、それらのＡＣＥ阻害能力を決定するために、200nMの最終ペプ
チド濃度で評価した。ＡＣＥを検定するために、新たにクエンチした蛍光ＡＣＥ
基質（Ｍｃａ-Ａｌａ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ-Ｄｐａ）を開発したが、ここでＭ
ｃａはメトキシクマリンであり、Ｄｐａは２-(Ｎ-ジニトロフェニル)アミノプロ
ピオン酸である。前記の基質は、未変性のときにのみ蛍光性であり、ＡＣＥによ
ってＡｓｐとＬｙｓの間が分裂された後に強力な蛍光シグナルを放出する。この
タイプの基質を用いて、ＥＬＩＳＡプレートにおける非常に多数の化合物の阻害
力を試験することができる。

【００３４】化合物の阻害力は、クエンチされた蛍光基質Ｍｃａ-Ａｌａ-Ａｓｐ-Ｓｅｒ-Ｌ
ｙｓ-Ｐｒｏの分解に基づく従来の競合試験において決定される。ＡＣＥによる
前記基質の分解は、試料を328nmで励起した場合に400nmにおける蛍光シグナルの
観察をもたらす。阻害実験は、ＥＬＩＳＡプレートにおいて、200μl容量のバッ
ファー：pH 6.8、50mM Ｈｅｐｅｓ、200mM ＮａＣｌ、1mMＺｎＣｌ_２中で、25℃
で、Dynatech Fluorolite 1000型ユニットにおいて実施した。典型的な実験の基
質濃度は20μMである。阻害実験のために、阻害薬を酵素存在下に45分間配し、
次いで極めて少容量の基質を単に添加することにより反応を開始させた。阻害割
合は、阻害薬存在下での初期速度変化から計算した。分解速度は40分の時間間隔
に渡る蛍光変化の記録から決定した。

【００３５】各混合物の阻害活性は、ＡＣＥの２つの変異形態：J. Biol. Chem. (1992) 26
7, 13398-13405 [14]においてWei等によって記載されているような突然変異誘発
によりＣ-末端を不活性としたＮ-末端形態及び不活性なＮ-末端を含むＣ-末端形
態について評価した。前記変異体はＣＨＯ細胞から作成した。

【００３６】Ｆｉｇ２において、ＡＣＥのＮ-及びＣ-末端変異体について、阻害薬のＸａａ
位置に存在するアミノ酸の型の関数として阻害割合が与えられている。この図は
、極めて多数の基質が、ＡＣＥのＮ-末端及びＣ-末端部位の両方の阻害を両立し
ていることを示す。しかしながら、選択性の点では、Ｘａａ位置にアスパラギン
残基が存在するもののみが、Ｎ-末端部位の阻害が可能である一方、この残基を
含む阻害薬の混合物をＡＣＥのＣ-末端部位に対して不活性とすることを注記し
ておく。従ってこれらの結果は、選択的Ｎ-末端部位阻害薬を得るためには、Ｘａａ位
置にＡｓｐ残基を持つことが必須であることを示している。

【００３７】実施例２実施例１の結果に基づき、実施例１と同様の方法に従って、一般式Ａｃ-Ａｓ
ｐ-ＰｈｅΨ(ＰＯ_２ＣＨ_２)-Ａｌａ-Ｘａａ’-ＮＨ_２（ここで、Ｘａａ’は単一
のアミノ酸で占められる）に従う２０のホスフィニックペプチドを合成した。前
記ペプチドは、実施例１におけるように、ＡＣＥのＮ-末端及びＣ-末端部位に対
するそれらの阻害活性を試験した。得られた結果をＦｉｇ３に示すが、それはＡＣＥのＮ及びＣ-末端部位に対す
る前記ペプチドの阻害割合を、Ｘａａ’位置の残基の型の関数として示している
。

【００３８】Ｎ-末端部位について、阻害薬は100nMの濃度で実験したが、Ｃ-末端部位につ
いては、注目に値する阻害を観察するのに使用した濃度は5μMであることを記す
のは重要である。濃度における前記の相違は、これらの化合物のＡＣＥのＮ-末
端に対するより良い親和性を反映している。Ｆｉｇ３において、Ｘａａ’位置におけるプロリン及びアラニン残基の存在に
より、Ｎ-末端部位を選択する選択性の程度を向上させ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｍｅ
ｔ及びＬｅｕ残基の酵素のＣ-末端部位に対する反応性が極めて低いことを観察
した。

【００３９】実施例３この実施例では、実施例２で得られたＡｃ-Ａｓｐ-ＰｈｅΨ(ＰＯ_２ＣＨ_２)Ａ
ｌａ-Ｘａａ’-ＮＨ_２化合物の阻害定数Ｋｉを、ＡＣＥのＮ-及びＣ-末端変異
体について決定する。得られた結果を表Ｉに与える。このデータに従って、前記ペプチドがＡＣＥのＮ-末端部位に対して、そのＣ-
末端部位よりも３オーダーの大きさで活性が高いことが観察された。

【００４０】実施例４実施例３において異なる末端基を有するペプチドの４つの類似物を合成し、Ｎ
-及びＣ-末端基のＡＣＥのＮ-末端部位に対する選択性に対する影響を、実施例
１におけるのと同じ方法を用いて決定した。結果を表ＩＩに与える。

【００４１】表ＩＩの結果は、カルボキシアミド基の存在が分子の選択性に必須であること
を示している。確かに、カルボキシレート基の存在はＮ-末端部位に対する親和
性を強化するが、この新たな化合物はＣ-末端ドメインにおいて非常に活性であ
るので、この改変は選択性の低下を誘発する。程度は低いが、Ｎ-アセチル基の
存在も選択性において役割を担うことが示された。最後の類似物は、Ｎ-末端位
置のアスパラギン残基が選択性において非常に重要な役割を担うことを明らかに
した。

【００４２】実施例５この実施例では、ホスフィニックブロックを取り囲むＰｈｅ及びＡｌａ残基の
立体配置の、実施例３のペプチド誘導体のＮ-末端部位に対する親和性に対する
影響を研究した。Ａｃ-Ａｓｐ-Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)Ａｌａ-Ａｌａ-ＮＨ_２ペプチドの合成
は、前記化合物における２つの対象中心の存在により、４つのジアステレオ異性
体の混合物をもたらした。この生成物のSpectra System VYDAC分析用C18カラム
での逆相ＨＰＬＣ高速液体クロマトグラフィー精製（λ＝220nm、流速＝1 ml/分
）を用いて３つのフラクションに分離した。

【００４３】Ｆｉｇ４は得られたクロマトグラムを示し、３つのピークを有している。ＨＰＬＣピークの強度及びリンぼＮＭＲスペクトルに基づいて、第１のピーク
が２つのジアステレオ異性体を含み、他の２つのピークは１つのみのジアステレ
オ異性体を含むことが示された。これらのフラクションの活性の測定により、第
１のフラクションのみが活性化合物を含むことが示された。

【００４４】実施例６実施例５の精製方法は、第１のピークに相当するフラクションに存在する２つ
のジアステレオ異性体を分離することができないので、合成終了時に、逆相ＨＰ
ＬＣで容易に分離できる２つのジアステレオ異性体の混合物を得るために、Ａｃ
-Ａｓｐ-Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)-Ａｌａ-ＡｌａＮＨ_２ペプチドを、Ｒ配置の
フェニルアミノホスフィニック残基から合成した。

【００４５】Ｒ配置のアミノフェニルホスフィニック残基を含むペプチドを合成するために
、前記アミノフェニルホスフィン酸のラセミ体を合成し、J. Chem. Soc. Perkin
. Trans (1984) 2845-2849 [15]においてBaylis等によって記載されている方法
に従って、キラルアミンの存在下で再結晶化させることにより異性体を分離した
。このように、光学的に純粋なＲ及びＳ配置のアミノフェニルホスフィン酸残基
を得た。C18逆相ＨＰＬＣで分離される２つのジアステレオ異性体Ａｃ-Ａｓｐ-_（Ｒ）Ｐｈｅ(ＰＯ_２ＣＨ_２)_（Ｒ）Ａｌａ-Ａｌａ-ＮＨ_２Ａｃ-Ａｓｐ-_（Ｒ）Ｐｈｅ(ＰＯ_２ＣＨ_２)_（Ｓ）Ａｌａ-Ａｌａ-ＮＨ_２の混合物を得るために実施例１と同様ににＲ配置の酸Ｆｍｏｃ_（Ｒ）Ｐｈｅ(Ｐ
Ｏ(Ａｄ)-ＣＨ_２)ＡｌａＯＨを用いた。

【００４６】Ａｃ-Ａｓｐ-ＰｈｅΨ(ＰＯ_２ＣＨ_２)Ａｌａ-Ａｌａ-ＮＨ_２ペプチドは、従来
の固相合成手法を用いて、固相基質としてRinkアミド樹脂を使用して、Ｆｍｏｃ
化学によって合成した。前記ペプチドの合成は、以下のブロック：Ｆｍｏｃ-Ａ
ｌａ、Ｆｍｏｃ-Ｐｈｅ(ＰＯ(Ａｄ)-ＣＨ_２)ＡｌａＯＨ及びＦｍｏｃ-Ａｓｐ(t-
Ｂｕ)を連続的に結合させることにより実施した。結合は、２-(１Ｈベンゾトリ
アゾール-１-イル)-１，１，３，３-テトラメチルウロニウム-ヘキサフルオロホ
スフェート／ジイソプロピルエチルアミンを用いたオンサイト手法で作成した。
結合条件は以下の通り：ジメチルホルムアミド中の３のＦｍｏｃ誘導体当量及び
４のジイソプロピルエチルアミン当量を樹脂に添加して30分間反応させた。Ｆｍ
ｏｃ基を分離させるために以下の条件：ジメチルホルムアミド中50%のピペリジ
ンを30分間用いた。樹脂からのペプチド及び保護基の分離は、2.5%の水、2.5%の
チオアニソール、2.5Mのフェノール、1.25%のエタンジチオール及び1.25%のトリ
イソプロピルシランを含むトリフルオロ酢酸溶液での処理により実施した。生成
物はC18逆相ＨＰＬＣで精製した。

【００４７】Ｆｉｇ５は、これらの条件下で観察されたクロマトグラムを示し、２つのピー
クを含むが、その一方、第１のもののみがＡＣＥに阻害力を持つ。活性なピーク
は、ＡＣＥのＮ-末端に対する１２nMというＫｉ及びＣ-末端部位に対する25μM
というＫｉにより特徴付けられる分子を含有する。

【００４８】ペプチドの最も活性なフラクションは、Ｓ配置の疑似-アラニン残基を含む。
従って、ペプチドの活性構造は以下の通り：Ａｃ-Ａｓｐ-_（Ｒ）Ｐｈｅ(ＰＯ_２
ＣＨ_２)-_（Ｓ）Ａｌａ-Ａｌａ-ＮＨ_２（ＩＩＩ）であり、以下ＲＸＰ４０７と呼
称する。この光学的に純粋な化合物の阻害定数は表ＩＩＩに与える。ＲＸＰ４０７化合物の純度は、マススペクトル（理論的重量498.5、実験的重
量498）及びリン、プロトン及び炭素１３の磁気共鳴により確定した。

【００４９】リンスペクトル：ｄ＝40.78 ppm、参照リン酸（0 ppm）。プロトンスペクトル（ppm）：Ａｓｐ：Ｈａ、4.28、Ｈｂ，ｂ’、2.0及び2.28
、Ｐｈｅ：Ｈａ、4.08、Ｈｂ，ｂ’、2.55及び3.10、Ａｒ、7.13及び7.22；Ａｌ
ａ：Ｈａ、2.58、Ｈｂ、1.08；Ａｌａ：Ｈａ、4.12、Ｈｂ、1.28；Ｐ-ＣＨ２、1
.48及び1.62；ＣＨ３-ＣＯ、1.82、参照ＴＳＰ（0 ppm）。炭素１３スペクトル（ppm）：Ａｓｐ：Ｃａ、55.3、Ｃｂ、41.5、ＣＯ、180.5
；Ｐｈｅ：Ｃａ、54.5、Ｃｂ、36、Ａｒ、129.8、131.7、132.5、141.2；Ａｌａ
：Ｃａ、37.6、Ｃｂ、21.4、ＣＯ、182.3；Ａｌａ：Ｃａ、53、Ｃｂ、19.6、Ｃ
Ｏ、181.5；ＣＨ２-Ｐ、34.4；ＣＨ３-ＣＯ、24.5及び177、参照ＴＳＰ（0 ppm
）。スペクトルは、Ｄ_２Ｏ中で、プロトンについては250MHz、リンについては101M
Hzそして炭素については62MHzで作動するBruker DRX型ユニットにおいて測定し
た。帰属は、COSY、TOCSY、HMQCお酔いHMBC型の二次元の実験を用いて行った。

【００５０】ＲＸＰ４０７化合物は、ＡＣＥの２つの活性部位間を識別できるので非常に興
味深い。この化合物は、ＡＣＥのＮ-末端部位の強力な阻害薬（Ｋｉ＝12nM）で
あるが、Ｃ-末端部位には極めて低い親和性しか持たない（Ｋｉ＝25μM）。この
特性に加えて、この分子が、Ａｓｐ及び疑似-Ｐｈｅ残基が与えられると、その
相互作用に、ＡＣＥのＳ_１及びＳ_２補助部位を含み、これはＡＣＥ阻害薬にとっ
て通常の特性ではないことを記しておくのは重要である。更に驚くべきことに、
前記の分子は、その構造のＣ-末端位置にカルボキシアミド基を含むが、これま
でに記載された全てのＡＣＥ阻害薬は系統的に遊離のカルボキシレート基を有す
る。このように、前記の分子は、その化学構造からもその阻害活性からも極めて
独創的である。

【００５１】実施例７この実施例では、ＲＸＰ４０７ペプチドをＡＣＥ阻害薬として用い、ＲＸＰ４
０７の（nMでの）濃度のＡＣＥ阻害割合への影響を実験した。化合物の阻害力は、参考文献Wei等, J. Biol. Chem. (1992) 267, 13398-1340
5 [14]に記載されたプロトコールに従ってＣＨＯ細胞から作成された野生型ヒト
ＡＣＥを用いて実施例１のように決定した。

【００５２】得られた結果をＦｉｇ６に示すが、これは天然ＡＣＥ阻害についてＲＸＰ４０
７で得られる阻害プロフィールを示している。阻害曲線における２つのレベルの
存在は、天然ＡＣＥにおける２つの活性部位の存在を表しており、曲線の左側は
ＡＣＥのＮ-末端ドメインの阻害により、右側はＣ-末端ドメインによる。この曲
線に現れる変曲点は、天然ＡＣＥのＮ及びＣ-末端部位に対するＲＸＰ４０７の
ＩＣ５０値を示し、これらはＡＣＥ変異体を用いて測定したＫｉ値に匹敵する。

【００５３】この実験は、ＲＸＰ４０７は確かに天然酵素のＮ-末端ドメインの選択的阻害
薬のように振る舞うことを示している。曲線の形状は、この実験に使用した基質
がＮ-末端及びＣ-末端ドメインによって等価に分離するという事実によることを
記しておくのは興味深い。このように、ＲＸＰ４０７は、酵素の２つの活性部位の一方のみによって分離
する基質を同定するのに使用することができる。確かに、２つの活性部位の一方
のみで分離する基質については、阻害曲線は２つではなく１つのレベルのみを含
むであろう。基質がＮ-末端ドメインのみで分離する場合、曲線の変曲点は100nM
のＲＸＰ４０７濃度の周辺に位置するが、Ｃ-末端ドメインのみで分離する基質
は、変曲点が10mMへ移動するであろう。このように、この新規な阻害薬は、生理学的基質の分解に対する天然ＡＣＥの
選択性を研究するための非常に優れた道具である。

【００５４】実施例８この実施例では、ＲＸＰ４０７化合物の薬物動態及び代謝を動物で実験した。この目的のために、Ｎ-アセチル基に３つのチタン原子を含むＲＸＰ４０７を
合成し、前記生成物を0.1、1及び5mg/kgの用量で静脈内ボーラスにより注入する
ことによって、ラットにおける前記分子の薬物動態及び代謝実験を実施できるよ
うにした。

【００５５】次いで、時間の関数としての血漿ＲＸＰ４０７濃度を測定した。得られた結果をＦｉｇ７に示す。曲線１は0.1mg/kg、曲線２は1mg/kgそして曲
線３は5mg/kgに対応する。点線曲線は、ＲＸＰ４０７（20nM）のＫｉを示す。

【００５６】このように、5mg/kg用量の静脈内ボーラスによる１回の注入は、4時間に渡る1
00ng/mlの生成物という血漿ＲＸＰ４０７濃度を導き、それは前記阻害剤のＮ-末
端部位に対するＫｉの10倍に等しい濃度である。表ＩＶは、ラットにおけるインビボでのトリチウム化ＲＸＰ４０７の排出につ
いて得られた結果を含む。これらの結果は、注入された放射活性の％として表示
されている。これらは、化合物が、本質的に尿中に（24時間後87%）、そして極
めて少量が便に（13%）排出されることを示している。気道には、この生成物の
痕跡は検出されない。

【００５７】この表に従うと、４匹のラットは、48時間で注入されたＲＸＰ４０７の100%（
100.09+-7）を排出することがわかる。生成物の大部分は尿中に、極めて少量が
便に排出され、特に気道には全く排出されない。さらに、尿及び便中の生成物の構造の分析は、ＲＸＰ４０７は如何なる代謝も
受けないことを示している。

【００５８】この生成物の毒性をマウスで評価した。このようにして、前記生成物は、25mg
/kgの用量で、マウスにおいて毒性の徴候を誘発しないことがチェックされた。
観察の7日後、処理したマウスは完全に正常に生存していた。このように、ＲＸＰ４０７は有効な阻害薬である。この新規なＡＣＥ阻害薬の
興味は、それがこの酵素のＮ-末端部位の最初の選択的阻害薬であるという事実
にある。薬物動態学的特性、代謝が存在しない、従ってインビボで安定なことは
、治療プロトコールにおいて、この酵素のＣ-末端によって制御される生理学的
機能に影響を与えることなくＡＣＥのＮ-末端部位を阻害ために理想的な生成物
である。

【００５９】さらに、ＲＸＰ４０７は、インビボにおいて、Ａｃ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ-Ｐ
ｒｏの代謝におけるＡＣＥのＮ-末端及びＣ-末端部位の各々の寄与を確立するこ
とができる。インビトロで行われた実験は、ＡＣＥのＮ-末端が前記ペプチドの
分解に対してＣ-末端よりも極めて有効であることを示し、従って、ＲＸＰ４０
７を介する代謝の制御は合理的な目的である。

【００６０】実施例９この実施例では、マウスにおけるインビボでのＲＸＰ４０７の注入の効果を実
験した。この目的のために、マウスに、0.1、1及び10mg/kgの用量でのＲＸＰ４０７の3
0分間の注入を施し、マウス血漿のＡｃ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ-Ｐｒｏ-(Ａｃ-Ｓ
ＤＫＰ)ペプチド濃度を測定した。Ａｃ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ-Ｐｒｏは、ポリクローナル抗体及び起電盤エレク
トリクスアセチルコリンエステラーゼに結合したＡｃ-ＳＤＫＰを用いた競合的
粘液酵素アッセイによって測定した。

【００６１】同様の血漿Ａｃ-ＳＤＫＰ測定を、10mg/kg用量のリシノプリルを注入したマウ
ス及び非注入の対照マウスにも行った。リシノプリルは臨床的実務で使用されて
いる阻害薬で、ＡＣＥの両方の活性部位を非選択的に阻害する。Ｆｉｇ８は、得られた結果、即ち、時間（分）の関数としてのＡｃ-ＳＤＫＰ
濃度（ｎＭ）を示す。

【００６２】曲線４、５及び６は、0.1mg/kg（曲線４）、1mg/kg（曲線５）及び10mg/kg（
曲線６）の用量でのＲＸＰ４０７を注入したマウスに関するものである。曲線７は、10mg/kgのリシノプリルを注入したマウスに関するものである。

【００６３】曲線Ｔは対照マウスのに関するものである。ＲＸＰ４０７の注入が、Ａｃ-Ｓ
ＤＫＰペプチドの血漿レベルの極めて重大な増加を誘発することが観察された。
ＡＣＥの両方の活性部位の非選択的阻害薬と比較して、血漿中のＡｃ-ＳＤＫＰ
レベルは、ＲＸＰ４０７で得られたものと同様であることを注記しておく。ＲＸ
Ｐ４０７が２つのＡＣＥ部位の一方、Ｎ-末端のみを阻害するので、これらの実
験から、ＡＣＥのＣ-末端部位はＡｃ-ＳＤＫＰの代謝に含まれておらず、一方、
前記代謝はＡＣＥのＮ-末端のみに依存していると結論でき、従って、ＡＣＥの
両方の部位を非選択的に阻害する従来のＡＣＥ阻害薬に比べてＲＸＰ４０７を用
いることは興味深い。またこの事件は、ＲＸＰ４０７のインビボ活性における有
効性も示した。

【００６４】実施例１０この実施例では、動脈圧調節に含まれる他の酵素であるレニンのレベルに対す
るＲＸＰ４０７の効果を決定する。前記酵素の従来の阻害薬でのＡＣＥの阻害は
、アンギオテンシンＩのアンギオテンシンＩＩへの加水分解を停止させる。アン
ギオテンシンは確かにＡＣＥの生理学的基質の一つである。逆調節メカニズムに
よる血漿中のアンギオテンシンＩＩレベルの低下はｈ、アンギオテンシノーゲン
からのアンギオテンシンＩの生成に直接含まれる酵素のレニンの血漿レベルを増
加させる。このように、ＡＣＥの阻害は血漿レニンレベルによって間接的に監視できる。

【００６５】このレベルは、血漿試料中でレニンがマウス血漿に存在する過剰のアンギオテ
ンシノーゲンを加水分解する能力により評価できる。次いでアンギオテンシンＩ
の形成を放射免疫学的アッセイにより測定し、レニンレベルを、インキュベーシ
ョン1時間当たりの血漿1ml当たりに形成されたアンギオテンシンＩのngで表示す
る。

【００６６】以下について得られた結果をＦｉｇ９に与える： 0.1mg/kg（曲線８）、1mg/kg（曲線９）及び10mg/kg（曲線１０）の用量での
ＲＸＰ４０７を注入したマウス、 10mg/kgのリシノプリルを注入したマウス（曲線１１）、及び対照マウス（曲線Ｔ）。

【００６７】Ｆｉｇ９は、リシノプリルでのマウスの処理が血漿レニンレベルの増加を誘発
することを示し、これはこの化合物のＡＣＥ阻害効果と一致する。しかしながら
ＲＸＰ４０７での処理はレニンの増加を誘発しないことが示された。このように
、この阻害薬は、動脈圧調節に影響を与えずにＡｃ-ＳＤＫＰペプチドの分解を
選択的に阻害することを可能にする。この観察は、ＲＸＰ４０７化合物のインビ
ボでの活性の選択性という点で非常に重要であり、アンギオテンシンＩの加水分
解にはＡＣＥのＣ-末端のみが含まれていることを示唆し、よってＲＸＰ４０７
注入がレニンレベルに影響しない理由を説明している。

【００６８】このように、これら全ての実験は、Ａｃ-ＳＤＫＰペプチドの血漿レベルを制
御するためのＲＸＰ４０７の使用の興味深さを確認した。前記ペプチドが化学治
療及び放射線治療プロトコールにおいて骨髄系細胞に対して保護効果を有するこ
とが示されたことが思い出される。従って、ＲＸＰ４０７は、Ａｃ-ＳＤＫＰペ
プチドの生理学的レベルを、そのＡＣＥでの代謝の阻害を介して動かすことによ
り、この状況において極めて有用であろう。

【００６９】ペプチドＡｃ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ-Ｐｒｏペプチドは血液新生レギュレータ
であるので、本発明による阻害薬を、抗癌化学治療又は放射線治療プロトコール
において、癌治療の毒性効果に対する骨髄細胞を保護するために使用することを
提案することができる。また、ＡＣＥの、そのＮ-末端ドメインの活性を介する
種々の細胞型の増殖に対する効果も考えられるので、癌治療の分野における応用
も考えられる。

【００７０】前記阻害薬の他の重要性は、それが、前記酵素の種々の生理学的基質の分解に
おけるＡＣＥのＮ-及びＣ-末端部位の各々の寄与を研究するための極めて有効な
道具となることである。

【００７１】引用した参考文献

【００７２】

【００７３】

【００７４】

【００７５】

【図面の簡単な説明】

【Ｆｉｇ１】既に述べたように、従来技術に従う公知のヒトアンギオテン
シン変換酵素の構造を例示する図である。

【Ｆｉｇ２】種々のペプチド混合物の、ヒトアンギオテンシン変換酵素の
Ｃ-末端部位及びＮ-末端部位に対する阻害割合を示す図である。

【Ｆｉｇ３】種々のペプチド誘導体の、Ｃ-末端部位及びＮ-末端部位に対
する阻害割合を示す図である。

【Ｆｉｇ４】本発明によるペプチド誘導体Ａｃ-Ａｓｐ-ＰｈｅΨ(ＰＯ_２
ＣＨ_２)-Ａｌａ-Ａｌａ-ＮＨ_２のジアステレオ異性体混合物の逆相ＨＰＬＣによ
り得られたクロマトグラムを示す図である。

【Ｆｉｇ５】本発明によるペプチド誘導体Ａｃ-Ａｓｐ-ＰｈｅΨ(ＰＯ_２
ＣＨ_２)Ａｌａ-Ａｌａ-ＮＨ_２の２つのジアステレオ異性体混合物の逆相ＨＰＬ
Ｃクロマトグラムを示す図である。

【Ｆｉｇ６】用いた濃度の関数としてのペプチド誘導体ＲＸＰ４０７によ
り得られた阻害割合を示す図である。

【Ｆｉｇ７】ラットにおける本発明のペプチド誘導体の血漿濃度の時間の
関数としての変化を示す図である。

【Ｆｉｇ８】本発明の阻害薬ＲＸＰ４０７を０．１、１及び１０ｍｇ／ｋ
ｇ用量で注入したマウス（曲線４、５及び６）、リシノプリルを１０ｍｇ／ｋｇ
の用量で注入したマウス（曲線７）及び非注入対照マウス（曲線Ｔ）における、
Ａｃ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ-Ｐｒｏペプチドの血漿濃度の時間の関数としての変
化を示す図である。

【Ｆｉｇ９】ＲＸＰ４０７を０．１、１及び１０ｍｇ／ｋｇ用量で注入し
たマウス（曲線８、９及び１０）、リシノプリルを１０ｍｇ／ｋｇの用量で注入
したマウス（曲線１１）及び非注入対照マウス（曲線Ｔ）における、アンギオテ
ンシンＩの血漿濃度（ｎｇ／ｍｌ／ｈ）の時間の関数としての変化を示す図であ
る。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年６月２０日（２０００．６．２０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１２】（本発明の説明）本発明によると、前記の新規なペプチド誘導体は、下記式： -Ａｓｐ-Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)-Ａｌａ-Ｘａａ’- （Ｉ）（式中： Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)は、ＰｈｅとＡｌａとの間のペプチド結合（ＣＯＮＨ）がホ
スフィニック結合ＰＯ_２ＣＨ_２で置換されていることを示し、そしてＸａａ’はアミノ酸残基を表す）に従うアミノ酸配列を含んでなる。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１４】本発明の特別な実施態様によると、ペプチド誘導体はこれらの配列の４つのア
ミノ酸のみを含み、下記式：Ｒ^１-Ａｓｐ-Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)-Ａｌａ-Ｘａａ’-ＮＨ_２（ＩＩ）（式中：Ｒ^１は、アセチル又はベンジルオキシカルボニル基を表し、 Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)は、ＰｈｅとＡｌａとの間のペプチド結合（ＣＯＮＨ）がホ
スフィニック結合ＰＯ_２ＣＨ_２で置換されていることを示し、そしてＸａａ’はアミノ酸残基を表す）に従う。好ましくは、Ｒ^１はアセチル基を表す。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２０】本発明では、任意のＰｈｅ及びＡｌａアミノ酸配置が好適であるが、Ｐｈｅに
ついてはＲ配置を有するのが好ましい。さらに、Ａｌａアミノ酸についてはＳ配
置を有するのが好ましい。このように、好ましいペプチド誘導体は下記式：Ａｃ-Ａｓｐ-_（Ｒ）Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)-_（Ｓ）Ａｌａ-Ａｌａ-ＮＨ_２
（ＩＩＩ）（式中：Ａｃはアセチル基を表し、 Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)は、ＰｈｅとＡｌａとの間のペプチド結合（ＣＯＮＨ）がホ
スフィニック結合ＰＯ_２ＣＨ_２で置換されていることを示す）に従う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者コトン，ジョエルフランス国エフ−91400 オルセー，ブールヴァールドゥモンデトゥール 159 (72)発明者キュニアス，フィリップフランス国エフ−75020 パリ，リュデピレネー 361 (72)発明者イオタキス，アタナシオスギリシア国ジーアール−153 42 アテネ，アグパラスケヴィ，リュパラディソン７ (72)発明者コルヴォル，ピエールフランス国エフ−75007 パリ，リュドゥセーヴル 88 (72)発明者ミショー，アニーフランス国エフ−93100 モントレイユ，アヴェニューパストゥール９ (72)発明者ショーヴェ，マリー−テレーズフランス国エフ−92310 セーヴル，レジダンスデュパルクエッフェル，リュブリュイェール 32 (72)発明者メナール，ジョエルフランス国エフ−75013 パリ，スクワールデュポールルワヤル 11 (72)発明者エザン，エリックフランス国エフ−92240 マラコフ，リュヴィクトルユーゴ 16 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA07 BA01 BA09 BA16 BA33 CA59 DC50 NA14 ZA511 ZB261 ZC201 ZC202 4H045 AA10 AA30 BA13 BA50 DA57 EA23 EA24 FA31 FA33 FA58 GA21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式： -Ａｓｐ-Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)-Ａｌａ-Ｘａａ’- （Ｉ）（式中： Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)は、ＰｈｅとＡｌａとの間のペプチド結合（ＣＯＮＨ）がホ
スホン結合ＰＯ_２ＣＨ_２で置換されていることを示し、そしてＸａａ’はアミノ酸残基を表す）に従うアミノ酸配列を含んでなるペプチド誘
導体。
【請求項２】下記式：Ｒ^１-Ａｓｐ-Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)-Ａｌａ-Ｘａａ’-ＮＨ_２（ＩＩ）（式中：Ｒ^１は、アセチル又はベンジルオキシカルボニル基を表し、 Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)は、ＰｈｅとＡｌａとの間のペプチド結合（ＣＯＮＨ）がホ
スホニック結合ＰＯ_２ＣＨ_２で置換されていることを示し、そしてＸａａ’はアミノ酸残基を表す）に従うペプチド誘導体。
【請求項３】Ｒ^１がアセチル基を表す、請求項２に記載のペプチド誘導体
。
【請求項４】Ｘａａ’がＡｌａを表す、請求項１から３のいずれか１項に
記載のペプチド誘導体。
【請求項５】Ｐｈｅ残基がＲ配置を有する、請求項１から４のいずれか１
項に記載のペプチド誘導体。
【請求項６】Ａｌａ残基がＳ配置を有する、請求項１又は２に記載のペプ
チド誘導体。
【請求項７】下記式：Ａｃ-Ａｓｐ-_（Ｒ）Ｐｈｅ-Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)-_（Ｓ）Ａｌａ-Ａｌａ-ＮＨ_２
（ＩＩＩ）（式中：Ａｃはアセチル基を表し、 Ψ(ＰＯ_２ＣＨ_２)は、ＰｈｅとＡｌａとの間のペプチド結合（ＣＯＮＨ）がホ
スホニック結合(ＰＯ_２ＣＨ_２)で置換されていることを示す）に従うペプチド誘
導体。
【請求項８】請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチド誘導体を含
んでなる、ヒトアンギオテンシン変換酵素のＮ-末端部位を選択的に阻害する製
薬製剤。
【請求項９】攻撃性の化学治療又は放射線治療を受けている患者の造血系
細胞を保護するために使用できる、請求項８に記載の製薬製剤。
【請求項１０】治療が癌治療である、請求項８に記載の製剤。
【請求項１１】請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチド誘導体の
、ヒトアンギオテンシン変換酵素のＮ-末端部位を選択的に阻害する医薬製品の
製造のための使用。
【請求項１２】医薬製品が、癌治療を受けている患者の造血系細胞の増殖
の調節を意図する、請求項１１に記載の使用。