FI97297B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten booriaminohappojohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

- 97297

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten booriaminohap-pojohdannaisten valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö koskee yleisesti menetelmää 5 lysiinin, ornitiinin ja arginiinin, homoarginiinin ja niiden vastaavien isotiouronianalogien C-pään alfa-aminoboo-rihappojohdannaisten valmistamiseksi. Yhdisteet ovat käyttökelpoisia trypsiinin kaltaisten seriiniproteaasien, kuten trombiinin, plasman kallikreiinin ja plasmiinin, inhi-10 biittoreina.

Hydrolyyttiset tai proteolyyttiset entsyymit, jotka katkaisevat prekursoriproteiinit spesifisistä kohdista, välittävät monien biologisten systeemien aktiivisuutta. Näitä entsyymejä on olemassa neljä luokkaa, metallopro-15 teaasit, tioliproteaasit, happamat proteaasit ja seriini-proteaasit. Sellaisia systeemejä kuin veren hyytymistä, fibrinolyysiä, komplementtia ja kallikreiinikiniiniä säätelee seriiniproteaasien alaluokka, joka on ryhmä trypsiinin kaltaisia proteaasientsyymejä, joilla on primaarispe-20 sifisyys arginyyli- tai lysyylitähteisiin.

Kunkin luokan sisällä toimintamekanismi ja entsyymien aktiivisella kohdalla olevat tähteet kuten myös niiden herkkyys luokkaspesifisille inhibiittoreille ovat samanlaisia. Yhdisteen kyky tehokkaasti inhiboida tiettyä 25 proteaasia tai tiettyä proteaasien alaluokkaa riippuu vahvasti yhdisteen rakenteesta ja koostumuksesta.

Proteaasi-inhibitioalueella on tehty paljon tutkimusta, ja monet tämän alueen tutkijat ovat kokeilleet booria sisältäviä inhibiittoreita.

30 Shenvi, US-patentti 4 537 773 (1985) esimerkiksi raportoi, että alifaattisia ja aromaattisia alkyylisivu-ketjuja sisältävien aminohappojen alfa-aminoboorihappo-analogit ovat tehokkaita metalloentsyymien inhibiittoreita. Lisäksi Shenvi et ai., US-patentti 4 499 082 (1985), 35 esittävät, että peptideihin inkorporoidut alfa-aminoboo- - 97297 2 rihapot inhiboivat seriiniproteaaseja, joilla primaarisina spesifiteettivaatimuksina ovat neutraalit sivuketjut, kuten haiman ja leukosyyttien elastaasia, kymotrypsiiniä ja katepsiini G:tä. Tämä jälkimmäinen patentti esittää C-5 pään alfa-aminoboorihappotähteistä koostuvat tetrapeptidit tällaisten proteolyyttisten entsyymien potentiaalisina, reversiibeleinä inhibiittoreina. Esitetyt peptidit eivät kuitenkaan sisältäneet lysiinin, ornitiinin, arginiinin, homoarginiinin tai minkään vastaavien isotiouronisuolojen 10 alfa-aminoboorihappotähdettä C-päässä.

Koehler et ai., Biochemistry 10: 2 477 (1971), raportoivat, että 2-fenyylietaaniboorihappo on kymotrypsii-nin inhibiittori. Matteson et ai., J. Am. Chem. Soc. 103: 5 241 (1981), kuvaavat (R)-l-asetamido-2-fenyylietaaniboo-15 rihapon synteesin ja sen käytön kymotrypsiinin inhibiittorina. Tekijät osoittavat Ki-arvoksi 4 μΜ.

Lienhard pohtii teoksessa Enzyme Inhibitors as Drugs, Sandler, toim.. University Park Press, Baltimore, sivut 43 - 51 (1980), että alfa-aminoboorihappojen pepti-20 dianalogit voivat olla seriini- ja tioliproteaasien poten tiaalisia inhibiittoreita.

Muita julkaisuja ovat Kinder et ai.'n, J. Med. Chem. 28: 1 917 - 1 925 (1985), julkaisu, joka kuvaa N-asyyli- ja dipeptidiboorihapot ja fenyylialaniinin, fenyy-. 25 liglysiinin, alaniinin, valiinin ja isoleusiinin difluori- boraanianalogit, ja Mattesonin, Organometallics 3: 1 284 -1 288 (1984), julkaisu, joka kuvaa alfa-amido-gamma-subs-tituoitujen booriestereiden synteesit. Jälkimmäiset tekijät esittävät, että nämä yhdisteet valmistettiin arginii-30 nin ja proliinin boorihappoanalogien mahdollisiksi prekur-soreiksi.

Trypsiinin kaltaiset proteaasit ovat erittäin tärkeitä useiden fysiologisten prosessien kontrolloinnissa. Sellaisten aktiivisuuksien selvitystä varten katso teosta 35 "Proteases and Biological Control", Reich, Rifkin ja Shaw, 97297 3 toim., Cold Spring Harbor Press (1975). Trombiinilla, joka on yksi trypsiinin kaltainen proteaasi, on selvä ja ratkaiseva rooli veren hyytymisprosessissa. Veren hyytyminen voi tapahtua jommallakummalla tsymogeeniaktivaatiokaska-5 dilla. Molemmissa näissä reiteissä viimeinen proteaasi on trombiini, joka toimii hydrolysoiden fibrinogeeniä fibrii-niksi, joka puolestaan aggregoituu muodostaen verihyyty-män. Tämä trombiinin katalysoima hydrolyysi on elintärkeä veren hyytyrni sproses s i1le.

10 Plasman kallikreiini, joka on toinen trypsiinin kaltainen proteaasi, ottaa myös osaa veren hyytymisproses-siin, spesifisesti yhden veren hyytymisprosessireitin aloitukseen. Kallikreiini vaikuttaa myös kininogeeniin vapauttaen nonapeptidiä, bradykiniiniä. Bradykiniini on ki-15 puun liittyvä hypotensiivinen peptidi. Lisäksi kallikreii-nilla on ajateltu olevan muita biologisia funktioita. Nykyinen tietämys viittaa siihen, että plasman kallikreiini ottaa osaa tulehdukseen. Baumgarten et ai., J. Immun. 137: 977 - 982 (1986), esimerkiksi raportoivat kohonneita ki-20 niini- ja kallikreiinitasoja allergeenille altistetuilla allergisilla yksilöillä. Wachtfogel et ai., Blood 67: 1 731 - 1 737 (1986), raportoivat, että plasman kallikreiini aggregoi ihmisen neutrofiilejä ja vapauttaa neutrofiilien elastaasia. Elastaasin vapautuminen ja siihen liittyvä 25 elastaasin välittämä kudostuho ovat tulehdusprosessiin liittyviä tapahtumia.

Trypsiinin kaltaisten entsyymien spesifisten inhibiittorien suunnittelu biologisten prosessien kontrolloimiseksi ei ole uusi ajatus. Erikoisia ponnistuksia on teh-30 ty trombiini-inhibiittorien valmistamiseksi korvaamaan he-pariini tromboosin hoidossa ilman hepariiniterapiaan liittyviä sivuvaikutuksia, katso Markwardt, TIPS: 153 - 157 (1980) ja Green et ai., Thromb. Res. 37: 145 - 153 (1985). Kettner et ai., Methods in Enzymology 80: 826 - 842 35 (1981), ovat valmistaneet erittäin tehokkaita peptidikloo- 4 57297 rimetyyliketoneja monille trypsiinin kaltaisille proteaa-seille. Yksi esimerkki, H-(D)Phe-Pro-ArgCH2Cl, on erittäin tehokas trombiinin inhibitiossa (Kx - 37 nM) ja estää tehokkaasti sepelvaltimotukosta kanimallissa, kuten Shaw et 5 ai.’n US-patenttijulkaisussa 4 318 904 (1982) on osoitettu. Samalla tavalla Bajusz et ai., Int. J. Peptide Protein Res. 12: 217 - 221 (1979), raportoivat, että peptidialde-hydi H-(D)Phe-Pro-Arg-H on tehokas trombiini-inhibiittori (KA - 75 nM), ja Tremoli et ai., Thromb. Res. 23: 549 - 553 10 (1981), raportoivat, että sukulaisyhdiste, Boc-(D)Phe-Pro-

Arg-H pienentää rotan laskimotukoksen kokoa.

Sekundaarisista amiineista koostuvien substituoitu-jen arginiiniamidien on myös näytetty olevan tehokkaita trombiinin inhibiittoreita. Kikumoto et ai., Biochemistry 15 23: 85 - 90 (1984), raportoivat, että (2R,4R)-4-metyyli- 1{N2-[(3-metyyli-l,2,3,4-tetrahydro-8-kinolinyyli)sulfo-nyyli]-L-arginyyli}-2-piperidiinikarboksyylihappo on trombiinin inhibiittori (K± 19 nM). Kuten Green et ai., Thromb. Res. 37: 145 - 153 (1985), ovat raportoineet, tämä 20 inhibiittori nostaa plasman protrombiiniaikoja in vitro veren hyytymiskyvyn mittausmenetelmissä kaksinkertaisesti pitoisuutena 1 μΜ, ja Yoshikuni et ai.’n EP-hakemuksessa 0 181 267 (1986) se on patenttivaatimusten kohteena fibri-nolyyttiseksi parannusaineeksi käytettäväksi kombinaationa . 25 kudoksenplasminogeeniaktivaattorin kanssa. Lopuksi

Sturzebecher et ai., Thromb. Res. 29: 635 - 642 (1983), ja Kaiser et ai., Thromb. Res. 43: 613 - 620 (1986), raportoivat, että N-alfa-(2-naftyylisulfonyyliglysyyli)-4-ami-dinofenyyli-alaniinipiperidiini on tehokkain tunnettu 30 trombiinin inhibiittori (Ki * 6 nM), ja osoittavat, että se on tehokas in vivo hiirillä ja rotilla.

Huolimatta edellä mainituista uusia ja parempia trombiinin ja muiden trypsiinin kaltaisten entsyymien in-hibiittoriluokkia tarvitaan, jotta saadaan potentiaali-35 sesti arvokkaita terapeuttisia aineita veren hyytymisen • 97297 5 häiriöiden, tulehduksen ja muiden nisäkkäiden sairauksien hoitoon. Esillä oleva keksintö on suunnattu tähän lopputulokseen.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää yhdisteiden 5 valmistamiseksi, joilla on kaava /γ1 R1- [ (A3 >„( a2 1 (A1) ] -NH-CH-B ^ (I) 4 F υ 11 o \ o

K Y

10 jossa Y1 ja Y2 ovat toisistaan riippumattomasti OH-ryhmiä tai fluoriatomeja tai yhdessä muodostavat ryhmän, joka on johdettu dihydroksiyhdisteestä, jossa on ainakin kaksi 15 hydroksiryhmää, joita erottaa ainakin kaksi yhdistävää atomia ketjussa tai renkaassa, jolloin ketju tai rengas sisältää 2-20 hiiliatomia ja mahdollisesti heteroatomin, joka voi olla N, S tai 0; R2 on substituoitu alkyyli, joka on -(CH2),-X, 20 -CH(CH3)-(CH2)2-X, -CH2-CH(CH3)-CH2-X, -(CH2)2-CH(CH3)-X tai -(CH2)2-CH(CH3)2-X, jolloin X on -NH2, -NH-C(NH)-NH2 tai -S-C(NH)-NH2 ja z on 3 - 5; n, o, p ja g ovat toisistaan riippumattomasti joko 1 tai 0; . 25 A1, A2 ja A3 ovat toisistaan riippumattomasti Ii ta! D-muodossa olevia aminohappoja ryhmästä Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ja Vai; ja R1 on 1 - noin 20 hiiliatomia sisältävä asyyli- tai 30 sulfonyyliryhmä, vety tai N-terminaalinen suojaryhmä; tai niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että 35 A) booriaminohappojohdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava 97297 6 R1_(A3) (A2)(A1) ] -NH-CH-B-Y3 · HW (9)

q p on I

R

5 jossa Y3 on ryhmä, joka on johdettu dihydroksiyhdistees-tä, jossa on ainakin kaksi hydroksiryhmää, joita erottaa ainakin kaksi yhdistävää atomia ketjussa tai renkaassa, jolloin ketju tai rengas sisältää 2-20 hiiliatomia; 10 R3 on substituoitu alkyyli -(CH^-W1, -CH( CH3) -CH2 )2-W1, -CH2-CH( CH3) -CHj-W1, -(CH^-CHtCH^-W1 tai -(CH^-CHiCHjJj-W1, jolloin W1 on NHC(NH)NH2; ja n, °> P, q, z, A1, A2, A3 ja R1 ovat edellä määriteltyjä, ja 15 H on Cl, Br, -C6H5S03 tai muu orgaanisen hapon anioni, a) yhdiste, jolla on kaava ΝΗ,-CH-B-Y3 · HW (5) 20 i3a jossa Y3 ja z ovat edellä määriteltyjä, W on Cl tai Br ja R3· on substituoitu alkyyli -(CH2)Z-Wla, -CH(CH3 )-CH2 )2-Wla, -CH2-CH(CH3)-CH2-Wla, - (CH2) 2-CH (CH3) -Wla tai 25 -(CH2)2-CH(CH3)2-Wla, jossa Wla on Cl tai Br, φ saatetaan reagoimaan aminohapon tai peptidin kanssa, jolla on kaava 30 jossa A1, A2, A3, R1, n, o, p ja g ovat edellä määriteltyjä, jolloin saadaan yhdiste, jolla on kaava R1[(A3)o(A2)o(A1)] -NH-CH-B-Y3 . HW (6)

q p u 11 ok 35 RJD

97297 7 jossa Y3, W, R1, A1, A2, A3, n, o, p ja q ovat edellä määriteltyjä, R3b on substituoitu alkyyli -(CH2)1-W2, -CH(CH3)-CH2)2-W2, -CH2-CH(CH3)-CH2-W2, - (CH2) 2-CH(CH3) -W2 tai -(CH2)2-CH(CH3)2-W2, jossa W2 on Cl tai Br, tai 5 b) saatetaan edellä saatu kaavan 6 mukainen yhdiste reagoimaan alkalimetalliatsidin kanssa, jolloin saadaan yhdiste, jolla on kaava R1[(A3)(A2)(A1) ] -NH-CH-B-Y3 · HW (7) " P υ 11 low, 10 RJt) jossa Y3, R3b, W, R1, A1, A2, A3, n, o, p ja q ovat edellä määriteltyjä ja W2 on N3; pelkistetään edellä saatu kaavan 7 mukainen yhdiste orgaanisen- tai mineraalihapon, 15 edullisesti bentseenisulfonihapon, läsnä ollessa, jolloin saadaan yhdiste, jolla on kaava R1[(A3)(A2)(A1)1-NH-CH-B-Y3 · HW (8) q P on ^3c 20 jossa Y3, R1, A1, A2, A3, n, o, p ja q ovat edellä määriteltyjä, W on Cl, Br, -C6H5S03 tai muu orgaanisen hapon anioni ja R3c on substituoitu alkyyli -(CH2)t-W2a, -CH(CH3)-CH2)2-W2\ -CH2-CH(CH3)-CH2-W2\ -(CH2)2-CH(CH3)-W2e 25 tai -(CH2)2-CH(CH3)2-W2a, jossa W2a on NH2, minkä jälkeen edellä saatu kaavan 8 mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan edelleen syanamidin kanssa alemmassa alkoholissa 50 -150 °C:n lämpötilassa, tai B) booriaminohappojohdannaisen valmistamiseksi, 30 jolla on kaava R1[(A3)rt(A2) (A1) ] -NH-CH-B-Y3 · HW (10) 4 P u il | g R 1 jossa - 97297 8 Y3 on ryhmä, joka on johdettu dihydroksiyhdistees-tä, jossa on ainakin kaksi hydroksiryhmäft, joita erottaa ainakin kaksi yhdistävää atomia ketjussa tai renkaassa, jolloin ketju tai rengas sisältää 2-20 hiiliatomia ja 5 mahdollisesti heteroatomin, joka voi olla N, S tai O; R3 on substituoitu alkyyli, joka on -(CH^-W1, -CHiCHaMCH^-W1, -CHa-CHiCHaJ-CHj-W1, -(CH2)2-CH(CHa)-Wx tai -(CH2)2-CH(CH3)2-w\ jossa W1 on -SC(NH)-NH2 ja W on Cl tai Br, 10 n, o, p, q, z, A1, A2, A3 ja R1 ovat edellä määri teltyjä, kaavan 6 mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan tiourean kanssa, ja/tai C) kaavan I mukainen yhdiste, jossa Y1 ja Y2 yhdessä muodostavat ryhmän, joka on johdettu dihydroksiyhdis- 15 teestä, jossa on ainakin kaksi hydroksiryhmää, joita erottaa ainakin kaksi yhdistävää atomia ketjussa tai renkaassa, jolloin ketju tai rengas sisältää 2 - noin 20 hiiliatomia ja mahdollisesti heteroatomin, joka voi olla N, S tai 0, 20 a. (i) liuotetaan vesipitoiseen orgaaniseen hap poon ja liuokselle tehdään ioninvaihtokromatografia käyttäen orgaanisessa hapossa olevaa 0 - 0,3 N mineraalihap-pokonsentraatiogradienttia, ja ii) erotetaan pylväskromatografisesti tai geeli-.· 25 suodatusta käyttäen, jolloin saadaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa Y1 ja Y2 ovat OH-ryhmiä; tai b. (i) saatetaan reagoimaan BC13-ylimäärän kanssa metyleenikloridissa -78 - 0 eC:ssa, ii) saatetaan kosketukseen veden kanssa ylimääräi- 30 sen BCl3:n hydrolysoimiseksi, iii) laimennetaan sopivalla vesipohjaisella 1 -50-%:isella orgaanisella hapolla, jotta saadaan HCl:n kon-sentraatioksi 0,01 - 0,05 M, iv) erotetaan vesifaasiin, jolle sitten 35 v) suoritetaan ioninvaihtokromatografia, jolloin 97297 9 saadaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa Y1 ja Y2 ovat 0H-ryhmiä, ja/tai D. kaavan I mukainen yhdiste, jossa Y1 ja Y2 ovat hydroksyyliryhmiä, saatetaan edelleen reagoimaan vesipoh-5 jäisen fluorivetyhappoylimäärän kanssa, jolloin saadaan kaavan I mukaista yhdistettä, jossa Y1 ja Y2 ovat fluori-atomeja, ja haluttaessa muutetaan saatu kaavan 1 mukainen yhdiste fysiologisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

10 Keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdisteitä voi daan käyttää farmaseuttisissa koostumuksissa, jotka sisältävät yhden tai useamman edellä mainitun kaavan mukaisen 1 yhdisteen trypsiinin kaltaisten seriiniproteaasien, kuten trombiinin ja plasman kallikreiinin, inhiboimisessa, ja 15 trypsiinin kaltaisten proteaasien välittämien epäsäännöllisten fysiologisten tilojen, kuten veren hyytymisen häiriöiden ja tulehduksen, hoidossa.

Lisäksi keksinnön kohteena on kaksi keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttökelpoista välituoteyhdiste-20 luokkaa. Ensimmäinen tällainen välituote-luokka sisältää yhdisteet, joilla on kaava NH2-CH-B-Y3 · HW (II) *3 25 jossa Y3 on ryhmä, joka on johdettu dihydroksiyhdistees-tä, jossa on ainakin kaksi hydroksiryhmää, joita erottaa ainakin kaksi yhdistävää atomia ketjussa tai renkaassa, 30 jolloin ketju tai rengas sisältää 2-20 hiiliatomia; R3 on substituoitu alkyyli -(CH2)1-Wle, -CH( CH3 ) - ( CH2 )2-Wla, -CH2-CH(CH3)-CH2-Wla, -(CH2)2-CH(CH3)-WU tai -( CH2 )2-CH( CH3 )2-Wla; W ja W1* ovat toisistaan riippumattomasti Cl tai Br; 35 ja z on 3 - 5.

97297 10

Toinen välituoteluokka sisältää yhdisteet, joilla on kaava R1-[(A3)g(A2)p(A1>Q]n-NH-CH-B-Y3 (III) 5 R4 jossa Y3 on ryhmä, joka on johdettu dihydroksiyhdistees-tä, jossa on ainakin kaksi hydroksiryhmää, joita erottaa 10 ainakin kaksi yhdistävää atomia ketjussa tai renkaassa, jolloin ketju tai rengas sisältää 2-20 hiiliatomia; R* on substituoitu alkyyli -(CH2)r-W2, -CH(CH3)-(CH2)2-W2, -CH2-CH(CH3)-CH2-W2, -(CH2)2-CH(CH3)-W2 tai - (CH2) 2-CH (CH3) 2-W2; 15 W2 on Cl, Br tai N3; z on 3 - 5; A1, A2 ja A3 ovat toisistaan riippumattomasti L- tai D-muodossa olevia aminohappoja ryhmästä Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, 20 Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ja Vai, R1 on 1 - noin 20 hiiliatomia sisältävä asyyli- tai sulfonyyliryhmä, vety tai N-terminaalinen suojaryhmä; ja n, o, p ja q ovat toisistaan riippumattomasti 1 tai 0.

Kuvio 1 esittää graafisesti suhteelliset hyytymis-25 ajat inhibiittorikonsentraation funktiona kahdelle keksin- * nön mukaisesti valmistetulle inhibiittorille, H-(D)Phe-Pro-booriArg-C10Hu ja Boc-(D)Phe-Phe-booriArg-C10H16. Tiedot kuvioon 1 saatiin taulukoista 3 ja 4. Suhteellinen hyyty-misaika saadaan jaettaessa inhibiittorin läsnä ollessa 30 saadut aktivoidut osittaiset tromboplastiiniajat (APTT) tai protrombiiniajat (PT), kuten asia voi olla, inhibiittorin poissa ollessa saaduilla APTT:11a ja vastaavasti PT:llä. Inhibiittorikonsentraatio esitetään mikromooleina.

Esillä olevan keksinnön kaavan I mukaiset yhdisteet 35 ovat alfa-aminoboorihappojen N-asyyli- ja peptidijohdannaisia, joissa C-pään tähde koostuu lysiinistä, ornitii- - 97297 11 nlsta ja arginiinista, homoarginiinista ja niiden vastaavista isotiouronianalogeista. Näille yhdisteille on luonteenomaista niiden kyky toimia tiettyjen trypsiinin kaltaisten, proteolyyttisten entsyymien, nimittäin ihmisen 5 trombiinin, plasman kallikreiinin ja plasmiinin, inhibiittoreina .

Kaavan I mukaisten yhdisteiden hapan terminaalinen boori voi valinnaisesti olla suojaamaton boorihappo, kun Y1 ja Y2 kumpikin ovat -OH, tai boraanidifluoridi, kun Y1 ja 10 Y2 kumpikin ovat -F, tai niiden yhdistelmä. Vaihtoehtoisesti terminaalinen boori voi olla suojattu monenlaisilla suojaryhmillä, jolloin Y1 ja Y2 yhdessä (-Y1-Y2-) muodostavat ryhmän.

Sopivia suojaryhmiä, kun Y1 ja Y2 ovat -Y1-Y2-, ovat 15 ryhmät, jotka on johdettu yhdisteistä, pääasiassa dioleis-ta, joissa on ainakin kaksi hydroksiryhmää, joita erottaa ainakin kaksi yhdistävää atomia ketjussa tai renkaassa. Määritelmä "ketju" kuvaa sekä haarautunutta että haarautu-matonta ryhmää. Ketju tai rengas muodostuu 2-20 hiili-20 atomista ja mahdollisesti voi sisältää heteroatomin, joka voi olla N, S tai O. Edellä mainitussa kuvauksessa tarkoitetut yhdisteet sisältävät esimerkiksi pinaanldiolin, pi-nakolin, perfluoripinakolin, etyleeniglykolin, dietyleeni-glykolin, katekolin, 1,2-sykloheksaanidiolin, 1,3-propaa-, 25 nidiolin, 2,3-butaanidiolin, 1,2-butaanidiolin, glysero-

Iin, dietanoliamiinin ja muita aminoalkoholeja, ja muita vastaavia yhdisteitä, jotka ovat ilmeisiä alan ammattimie-hille.

Läpi koko selitysosan on aminohappotähteistä tai 30 aminohapoista käytetty seuraavia lyhennyksiä:

Ala - L-alaniini Arg = L-arginiini Asn = L-asparagiini Asp - L-asparagiinihappo 35 Cys * L-kysteiini

Gin = L-glutamiini - 97297 12

Glu - L-glutamiinihappo Gly - glysiini His - L-histidiini lie - L-isoleusiini 5 Leu - L-leusiini

Lys - L-lysiini Met L-metioniini Phe - L-fenyylialaniini Pro - L-proliini 10 Ser * L-seriini

Thr L-treoniini Trp = L-tryptofaani Tyr = L-tyrosiini Val - L-valiini 15 Milloin etuliite on "D", edellä mainitut lyhennyk set osoittavat D-muodossa olevaa aminohappoa. Milloin etuliite on "D tai L", edellä mainitut lyhennykset osoittavat, että aminohappo voi olla joko D- tai L-muodossa.

Tässä käytettynä "N-pään suojaryhmä" viittaa eri-20 laisiin peptidisynteesissä käytettyihin aminopään suoja-ryhmiin. Esimerkkejä sopivista ryhmistä ovat asyylisuoja-ryhmät, esimerkiksi formyyli, asetyyli (Ac), bentsoyyli (Bz), trifluoriasetyyli ja metoksisukkinyyli (MeOSuc); aromaattiset uretaanisuojaryhmät, esimerkiksi bentsyyli-25 oksikarbonyyli (Z); ja alifaattiset uretaanisuojaryhmät, esimerkiksi tert-butoksikarbonyyli (Boc) tai adamantyyli-oksikarbonyyli. Gross ja Mienhoffer, toim., The Peptides, 3: 3-88 (1981), Academic Press, New York 1981, esittävät useita sopivia amiinin suojaryhmiä.

30 Seuraavat edustavat edullisia N-pään suojaryhmiä R1: 0

II

Ac - CHg-C-Boc - (CH3)3CO^- - Q>i il ittrt «Iti lii M . .

- 97297 13 - · Ο-τ 5 Kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa on esimerkiksi sivuketjuaminoryhmiä, joissa A1, A2 tai A3 ovat Lys tai Arg, voivat valinnaisesti sisältää sopivia N-pään suojaryhmiä liittyneenä sivuketjuihin; samalla tavalla happamia tai hydroksisivuketjuja omaavat aminohappotähteet voivat olla 10 suojattuja t-butyylillä, bentsyylillä tai muilla sopivilla estereillä tai eettereillä.

Kuten aiemmin on esitetty, R2 viittaa amino-, guani-dino- tai isotiouroniryhmään liittyneeseen, 3-5 hiiltä sisältävään alkyyliryhmään. R2 on edullisesti -(CH2)l-X.

15 Vielä edullisempana pidetään, että R2 on -(CH2)c-X, jossa z on 3 - 4. Esimerkkejä vielä edullisempana pidetyistä R2-ryhmistä ovat 3-guanidinopropyyli, 3-aminopropyyli ja 4-aminobutyyli. Edullisin on 3-guanidinopropyyli.

"Boori-"-etuliitteellä varustetut lyhennykset ja 20 termit osoittavat kaavan I mukaisia aminohappoja, joissa terminaalinen karboksyyliryhmä -C02H on korvattu funktionaalisella booriryhmällä 25 -B<f • 2 Näin ollen "booriarginiini" tai "booriArg-" viittaa arginiinin boorihappoanalogeihin; "boorilysiini" tai "boo-30 riLys-" viittaa lysiinin boorihappoanalogeihin; ja "boori-ornitiini" tai "booriOrn-" viittaa ornitiinin boorihappoanalogeihin. Etuliite "homo", kuten "homobooriarginiini" tai "homobooriArg-", viittaa booriarginiinianalogeihin, joiden sivuketjussa on lisämetyleeniryhmä. "Irg" viittaa 35 arginiinin tai homoarginiinin isotiouronianalogiin, joissa isotiouroniryhmä -S-C(NH)NH2 korvaa guanidinoryhmän -NH- - 97297 14 C(NH)-NH2, ja "boorilrg-" tai "boorihomolrg-" on vastaavan boorlhappoanalogin lyhennys.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä nimettäessä Y1 ja Y2 on yksinkertaistettu loppuliitteellä "-F" difluoriboraa-5 neissa (Y1 = Y2 = -F), "-0H" suojaamattomissa boorihapoissa (Y1 Y2 » -OH), "-C6H12" pinakoliestereissä (Y1 ja Y2 yhdessä ovat -02C6H12) ja ”-C10H16" pinaanidioliestereissä (Y1 ja Y2 yhdessä ovat -O2C10H16).

Esillä oleva keksintö sisältää myös kaavan I mu-10 kaisten fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistuksen. Nämä suolat sisältävät happoadditiosuolat, esimerkiksi bentseenisulfonihapon (BSA), suolahapon (HC1), bromive-tyhapon (HBr), etikkahapon, trifluorietikkahapon (TFA), meripihkahapon ja sitruunahapon suolat tai muut sopivat 15 happoadditiosuolat. Käytettäessä kaavan I mukaisten yhdisteiden nimeämisessä nämä suolat esitetään yhdisteen nimessä tunnuksella ".".

Kaavan I mukaisten yhdisteiden piiriin kuuluviksi ajatellut yhdisteluokat sisältävät seuraavat D- tai L-20 muodon omaavat aminohapot. Ensimmäinen luokka sisältää yhdisteet, joissa A1 on aminohappo Ala, Pro, Gly, Vai, Leu, Ile tai Met, ts. aminohappo, jolla on neutraali sivuketju. Toinen luokka sisältää yhdisteet, joissa A1 on aminohappo Phe, Trp tai Tyr, ts. aminohappo, jolla on aromaattinen 25 sivuketju. Kolmas luokka sisältää yhdisteet, joissa A1 on aminohappo Lys tai Arg, ts. emäksinen aminohappo, ja neljäs luokka sisältää yhdisteet, joissa A1 on aminohappo Ser tai Thr, ts. aminohappo, jolla on hydroksisivuketju. Lopuksi viides luokka sisältää yhdisteet, joissa A1 on amino-30 happo Asp, Glu, Asn tai Gin, ts. aminohappo, jolla on hapan tai karboksiamidosivuketju. Edullisesti A1-substituen-tit käsittävät aminohapot Lys, Phe, Pro, Ala, Leu, Gly, Glu, Vai, Thr, Ile, Met, Tyr, Trp, Arg, Asp, Asn ja Gin. Yksi edullinen tällaisten substituenttien luokka käsittää 35 aminohapot Lys, Phe, Pro, Ala, Leu, Gly, Glu, Vai ja Thr.

- 97297 15

Edellä mainitut pääluokat sisältävät alaluokkia, jotka vastaavat edullisia R2 arvoja, ja nämä alaluokat on edelleen jaettu A2 ja N-pään suojaryhmän Rl edullisten merkitysten mukaisiin ryhmiin.

5 Edulliset A2-merkitykset käsittävät kaikki D-muodon omaavat aminohapot, eudllisimmin (D)Phe:n. Muut edulliset A2-merkitykset ovat (D- tai L-) Phe, (D- tai L-) Ala, (D-tai L-) Leu, (D- tai L-) Pro, (D- tai L-) Glu ja (D- tai L-)Gly. Toinen A2-substituenttiluokka käsittää (L)-Glu:n ja 10 (D-)Val:n.

Kaavan I mukaisilla yhdisteillä on edullisesti kaikkiaan 2-4 aminohapposubstituenttia mukaan lukien booriaminohappoanalogi. Kolmen aminohapon yhdisteet, joissa on Pro A1-kohdassa ja booriArg booriaminohappoanalogina, 15 kuten /γ1 R1-(D)Phe-Pro-boroArg , \Y2 20 ovat erikoisen sopivia trombiinin inhibiittoreiksi IC50-arvon ollessa merkittävästi pienempi kuin 5 nM.

Edellä mainittujen yhdisteiden ilmeisiä ekvivalentteja ovat yhdisteet, jotka sisältävät vähemmän yleisiä tai 25 modifioituja aminohappoja, esimerkiksi norleusiinia, hyd-roksiproliinia, pyroglutamiinihappoa tai muita johdannaisia, mukaan lukien sivuketjun suojaryhmiä omaavat tähteet, jotka voidaan inkorporoida esillä olevan keksinnön alfa-aminoboorihappopeptideihin.

30 Kaavan 1 mukaiset spesifiset yhdisteet, jotka on nimetty yllä kuvattujen sopimusten mukaisesti, sisältävät seuraavat esimerkit:

Ac- (D, L) Phe-boor iArg-C10H16 · BSA

Ac-Phe-booriOrn- c10h16.bsa 35 Ac-Phe-booriArg-C10H16 · HC1 - 97297 16 H- (D) Phe - Pro - boor i I r g -C10H16HBr · HC1 Boc-(D)Phe-Pro-booriIrg- C10H16.HBr Ac-Phe-boorilrg- C10H16 · HBr Ac-Ala-Lys (Boc) -booriOrn-C10H16 · BSA 5 Ac-Ala-Lys(Boc)-boorilrg- C10H16 · HBr

Boc- (D) Phe-Pro-booriArg-C10H16 · BSA Boc-(D)phe-Phe-booriIrg- C10H16*HBr H- (D) Phe-Pro-boorlArg-C10H16 · HC1 Boc- (D) Phe-Phe-booriOrn-C10H16 · BSA 10 Boc- (D) Phe-Phe-boorlArg-C10H16 · BSA

Ac-Ala-Lys(Boc)-boorlArg- c10h16.bsa Ac- (D) Phe-Pro-booriArg-C10H16 · HC1 Ac-(D)Phe-Pro-booriArg-OH·HC1 Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boorilrg- C10H16.HBr 15 Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-booriOrn-C10H16*BSA

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-booriArg- C10H16BSA Bz-Pro-Phe-booriOrn-C10H16 · BSA Bz-Pro-Phe-booriArg-C10H16 · BSA Boc-Ala-Phe-(D, L) boori Irg-C6H12·HBr 20 Bz-Glu( OBu) -Gly-booriIrg-C10H16 · HBr

Bz-Glu-Gly-booriArg-C10H16 · BSA Bz-Glu( OBu) -Gly-booriOrg-C10H16 · BSA Bz-Glu (OBu) -Gly-booriArg-C10H16 · BSA Bz-Pro-Phe-boorilrg- C10H16.HBr 25 Z-Phe-Gly-Gly-booriIrg-C10H16HBr

Boc-Ala-Phe-(D, L)boorihomoIrg-C6H12HBr Bz-Pro-Phe-booriArg-OH·HC1 Bz-Pro-Phe-booriArg-F H- (D) Phe-Pro-booriArg-C10H16 · 2HC1 30 H- (D )Phe-Phe-booriArg-C10H16 · 2HC1 : Ac-Ala-Lys-booriArg-C10H16*2HCl H-Leu-Gly-Leu-Ala-boor iArg-C10H16HCl · BSA Boc-Ala-Phe-(D, L) boor iLys-C6H12 · HC1 H-Ala-Phe- (D, L)booriLys-C6H12 · 2HC1 35 Boc-( D )Val-Leu-booriLys-C6H12 *HC1 - 97297 17

Ac-Phe-booriLys-C6H12 · HC1 Bz-Glu-Gly-booriArg- c10h16-bsa H- (D )Phe-Phe-booriIrg-C10H16 · 2HBr H-Leu-Gly-Leu-Ala-boorilrg- C10H16.2HBr 5 H-Ala-Phe- (D, L )booriIrg-C6H12 · 2HBr

Bz-Glu-Gly-booriIrg-C10H16 · HBr H-Ala-Phe- (D, L )boorihomoIrg-C6H12 · 2HBr Ac-Ala-Lys-booriIrg-C10H16· 2HBr Bz-booriIrg-C6H12 · HBr 10 Bz-booriOrn-C6H12 · BSA

Bz-booriArg-C6H12 · BSA Ac-Leu-Thr (OBu) -booriOrn-C10H16 · BSA Ac-Leu-Thr(OBu)-booriArg- c10h15-bsa Ac-Leu-Thr-booriArg- c10h16-bsa 15 Ac- Lys (Boc) -Pro-boorlOrn-C10H16 · BSA

Ac - Lys (Boc) - Pro-boor iArg-C10Hl6 · BSA Ac- Lys-Pro-booriArg-C10H16 · BSA Ac-Ala-Glu (OBu) -booriOrn-C10H16 · BSA Ac-Ala-Glu (OBu) -booriArg-C10H16 · BSA 20 Ac-Ala-Glu-booriArg-C10H16 · BSA

Boc-Val-Val-booriLys-C6H12»BSA H-Val-Val-boorlLys-C6H12 · BSA · TFA Boc- (D) Phe-Phe-boorlLys-C6H12 · BSA H- (D )Phe-Phe-booriLys-C6H12 · BSA· TFA . 25 Boc-Glu-Phe-booriLys-C6H12*BSA

PyroGlu-Phe-booriLys-C6H12 · BSA

Kaavan 1 mukaiset yhdisteet voidaan formuloida farmaseuttisiksi koostumuksiksi trypsllnin kaltaisten serii-nlproteaaslen, mm. trombllnln, plasman kalllkrelinln ja 30 plasmllnln, inhlbolmiseksl el kuitenkaan rajoittuen vain näihin, ja epäsäännöllisten fysiologisten tilojen, mm. veren hyytymisen ja tulehduksen, hoitamiseksi, nisäkkäillä ei kuitenkaan rajoittuen vain näihin. Tällaiset koostumukset sisältävät tehokkaan määrän kaavan I mukaista 35 yhdistettä ja fysiologisesti hyväksyttävän kantajan tai « - 97297 18 lalmennusaineen. Yhdisteitä tai koostumuksia voidaan käyttää yksinään tai yhdistettynä toistensa kanssa tai yhdistettynä toisten terapeuttisten aineiden kanssa. Ne voidaan antaa suun kautta, parenteraalisesti, laskimonsisäisesti, 5 ihonalaisesti, lihaksensisäisesti, paksusuolen kautta, peräsuolen kautta, nenän kautta tai vatsaontelon kautta monina eri annosmuotoina. Käyttökelpoinen annosmäärä ja annostustapa vaihtelee riippuen iästä, painosta ja hoidettavasta nisäkkäästä ja erityisistä käytettävistä yhdis-10 teistä. Hoito aloitetaan tyypillisesti matalammilla annos-määrillä annosten kasvaessa, kunnes haluttu vaikutus saavutetaan .

Kuten edellä on mainittu, esillä oleva keksintö koskee myös kaavan I mukaisille yhdisteiden valmistukses-15 sa käytettyä kahta kriittistä välituoteluokkaa, kaavojen II ja III mukaisia yhdisteitä.

Erikoisen edullinen kaavan II mukainen yhdiste on yhdiste, jossa R3 on -(CH^-W1 ja z on 3 - 4.

Kaavan III piiriin kuuluvien yhdisteluokkien on 20 ajateltu olevan sellaisia kuin on kuvattu analogisille kaavan I mukaisille yhdisteille. Erikoisen edullinen kaavan III mukainen yhdiste on yhdiste, jossa R4 on -(CH2)2-W2 ja z on 3 - 4.

Keksinnön mukaisesta menetelmää selostetaan seuraa-25 vassa yksityiskohtaisesti. "Synteesikaavio"-nimisessä kaavakuvassa esitettyihin numeroituihin yhdisteisiin viitataan tekstissä niiden vastaavien numeroiden mukaisesti. "NMR" tässä käytettynä tarkoittaa protonin ydinmagneettis-ta resonanssia. Lämpötilat ovat °C:ina.

- 97297 19

SYNTEESIKAAVIO

Br-CH2 -CH=CH2 +H-B^ '^Tl)-> Br-CH2 -CH, -CH, -B^ 5 1 /°V> plnaanidioli_^ Br-CH2 -CH2 -CH2 -B I / 10 2 CHC1,~LI*_^ Br-CH2-CH2-CH2CHCl-BO2-C10H16 3

C (CH3 )3Si )2N

15 [(CH3)3S1]2N~LI* v Br-CH2-CH2-CH2-CH-BO2-C10H16 NH/C1' 3 ekvlv. HC1_v Br- (CH2 )3-CH-BO2-C10H16 20 5

sp. 144 - 145 °C

Peptidi_^ Peptidi-NH-CH-BO2-C10H16 (CH2)3 25 Br - 6

Na*N3~_v Peptidi-NH-CH-BO2-C10H16 (p2)3 30 N3 7 H2 Pd/C_ Peptidi-NH-<pH-BO2-C10H16 0-SO3H ^ (CH2)3 35 NH3* 0SO3" 8 97297 20 syanamidi_ Peptidi-NH-CH-BO2-C10H16 etanoli 100 °C ' (CH2)3

NH

5 ONH

NH3*0SO3- 9

°H

10 ioninvaihto_ Peptidi-NH-CH-B^ tai BC13 ' | 0f«2)3

VH

C=NH

15 NH3+C1' 10

/Y

vesipohjainen HF_^ Peptidi-NH-CH-BtT

20 | ' F

(CH2)3

NH

<p=NH

NH3*C1' 25 11 * t tiourea_^ Peptidi -NH-CH-BO2-C10H16 (ch2)3

S

30 C=NH

NH3*Br_ 4 »

Keksinnön mukaisia menetelmiä käyttäen kaavan I mukaisia yhdisteitä on mahdollista saada korkean käyttö-35 kelpoisen puhtausasteen omaavina, se on 80 - 100-%:isen puhtaassa muodossa. 1

lit.* Il lii II l 14 II

- 97297 21

Korkean puhtausasteen omaavia lähtömateriaaleja on saatavana kemikaalitoimittajilta tai niitä voidaan helposti syntetisoida menetelmillä, jotka ovat alan ammattimiesten tiedossa. Synteesikaavio näyttää yleisjärjestyksen, 5 jossa kaavan I mukaiset yhdisteet syntetisoitiin. Yhdisteet 1-4 valmistettiin, kuten ovat kuvanneet Matteson et ai., Organometallics 3: 1 284 - 1 288 (1984), paitsi että menetelmää modifioitiin mahdollistamaan valmistus suuressa mittakaavassa.

10 Yhdiste 1 valmistetaan alkeenihalogenidin hydrobo- raatiolla katekoliboraanin avulla. Komponentteja kuumennetaan tetrahydrofuraanissa tai jossain muussa inertissä liuottimessa, ja tuote eristetään tislaamalla. Halogeeni-substituoitu alkyyliboorihappokatekoliesteri transesteröi-15 dään antamalla sen reagoida sopivan diolin (alfa-pinaani-dioli, pinakoli, 2,3-butaanidioli, jne.) kanssa tetrahydrof uraanissa. (+ )-alfa-pinaanidiolia pidetään edullisempana Matteson et ai.'n, J. Am. Chem. Soc. 103: 5 241 (1981), huomioiden perusteella, joiden mukaan eteeriset esteet 20 molekyylissä sallivat -CHCl-ryhmän stereospesifisen lisäyksen yhdistettä 3 muodostettaessa ja sitä seuraavan aminoryhmän lisäyksen ML"-muotoon. Rakenteet 3-9 syntee-sikaaviossa näytetään pinaanidiolin suojaryhmän kanssa. Suuren mittakaavan valmistuksessa katekolin, esteröinnin 25 reaktiotuotteen, poisto saadaan aikaan kiteyttämällä hek-saanista, liuottimesta, johon katekolilla on rajoitettu liukenevuus. Yhdiste 2 puhdistetaan sitten joko kromato-grafiällä silikageelissä tai tislaamalla, tai se käytetään ilman lisäpuhdistusta. Yhdiste 2 saadaan pinaanidiolieste-30 rinä lähes analyyttisesti puhtaassa muodossa poistamalla liuotin. Lisäpuhdistus voidaan saada aikaan silikageeli-kromatografiällä. Yhdisteen 2 pinakoliesterille suositellaan loppupuhdistusta tislaamalla.

Yhdiste 3 valmistetaan yhdisteen 2 homologaatiolla 35 käyttäen CHCl2’Li*:ia. Tämä reaganssi tehdään käsittelemällä metyleenikloridia n-butyylilitiumilla tetrahydrofuraanissa - 97297 22 »100 °C:ssa. Yhdisteeseen 2 lisätään 0,65 ekvivalenttia slnkkikloridia -100 °C:ssa. Seoksen annetaan lämmetä hitaasti huoneen lämpötilaan ja sekoitetaan yön yli. Yhdiste 3 saadaan haihduttamalla liuotin, sitten liuottamalla 5 jäännös heksaanlln, pesemällä orgaaninen faasi vedellä, kuivaamalla se magnesiumsulfaatilla ja lopuksi haihduttamalla heksaanl. Yhdistettä 3 käytetään liman lisäpuhdis-tusta, kun se on suojattu plnaanidioliesterlnä ja vaihtoehtoisesti se voidaan tislata, kun se on suojattu plnako-10 llesterlnä.

Yhdiste 4 valmistetaan käsittelemällä alfa-kloori-substltuoltua boorihappoesteriä, yhdistettä 3, ((CH3)3Si)2-N'Li*:lla. Heksametyylidisilatsaani liuotetaan tetrahydrofuraaniin ja lisätään ekvivalenttinen määrä n-15 butyylilitiumia -78 °C:ssa. Seoksen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan, jäähdytetään uudelleen -78 °C:een, ja sitten lisätään ekvivalenttinen määrä yhdistettä 3 tetrahydrof uraanissa. Seoksen annetaan hitaasti saavuttaa huoneen lämpötila ja sekoitetaan yön yli. Alfa-bis(trimetyy-20 lisilaani)-suojattu amiini eristetään haihduttamalla liuo tin ja lisäämällä heksaania vedettömissä olosuhteissa. Liukenematon jäännös poistetaan suodattamalla typpivaipan alla, jolloin saadaan yhdisteen 4 heksaaniliuos.

Yhdiste 5 saadaan jäähdyttämällä yhdisteen 4 hek-25 saaniliuos -78 °C:een ja lisäämällä kolme ekvivalenttista määrää suolahappoa. Liuoksen annetaan hitaasti lämmetä huoneen lämpötilaan ja sekoitetaan 1,5-2 tuntia. Yhdiste 5 eristetään sitten suodattamalla ja puhdistetaan edelleen liuottamalla kloroformiin ja poistamalla liukenematon ma- 30 teriaali. Yhdiste 5 saadaan valkoisina kiteinä poistamalla kloroformi haihduttamalla ja kiteyttämällä jäännös etyyliasetaatista.

Yllä oleva menetelmä yhdisteen 3 muuttamiseksi yhdisteeksi 5 johtaa yllättävästi analyyttisesti puhtaisiin 35 yhdisteen 5 preparaatteihin, mikä sitten sallii yhdisteen 6 saamisen ilman vaikeuksia, joita normaalisti kohdataan « :H SM i Silti I I t ret - 97297 23 yhdistettäessä heterogeenistä materiaalia. Alalla opetetaan tai vahvasti kehotetaan, että yhdiste 4 pitää puhdistaa ennen sen muuttamista yhdisteeksi 5, jotta saadaan puhtaita näytteitä. Ainoa tunnettu menetelmä puhtaiden 5 alfa-aminoboorihappojen valmistamiseksi on se, jonka ovat esittäneet Shenvi et ai. US-patentissa 4 537 773 ja jota ovat käyttäneet Shenvi et ai. US-patentissa 4 499 082. Shenvi et ai.'n julkaisussa yhdisteelle 4 analogisia yhdisteitä, paitsi että niissä on aromaattisia ja alkyylisi-10 vuketjuja, puhdistetaan tislaamalla. Yhdiste 4 on epästabiili Shenvi et ai. esittämälle tislaukselle ja saadaan muuttunut tuote.

Yhdiste 6, yhdisteen 5 N-asyyli- tai N-peptidyyli-muoto, voidaan valmistaa kahdella eri reitillä. Ensimmäi-15 nen on modifikaatio menetelmästä, jonka ovat esittäneet Matteson et ai., Organometallics 3: 1 284 - 1 288 (1984), jossa yhdistettä 4 valmistettuna in situ (ilman liuottimen haihdutusta ja suolojen poistoa suodattamalla), käsitellään ekvivalentilla määrällä etikkahappoa ja ylimäärällä 20 etikkahappoanhydridiä, jotta saadaan N-asetyyli-NH- CH[ (CH2)3Br]B02-pinaanidiolia. Tämä menetelmä on käyttökelpoinen yhdistettäessä erittäin reaktiivinen N-asetyyli-fenyylialaniinin hapan kloridi, (Ac-Phe-Cl), sillä modifikaatiolla, että esikäsittely etikkahapolla jätetään poi-25 s. Kun etikkahappoa lisätään yhdessä Ac-Phe-Cl:n kanssa, saadaan erittäin pienet saannot, mikä ilmeisesti johtuu Ac-Phe:n ja etikkahapon muodostamasta seka-anhydridistä ja sitä seuraavasta kemiallisesti suotuisammasta yhdistymisestä, joka johtaa N-asetyyli-NH-CH[(CH2)3Br]B02-pinakolin 30 syntymiseen. Seka-anhydridimenetelmän käyttäminen yhdisteen 6 valmistuksessa johti halutun tuotteen mataliin saantoihin ja vaikeisiin ongelmiin puhdistuksessa. Näin ollen näyttää siltä, että tämä menetelmä on käyttökelpoinen yhdistettäessä alkyyli-, aryyli- ja N-suojattuja ami-35 nohappoja yhdisteeseen 4 käyttäen hapan kloridi-menetelmää. Kuitenkin on huomattava, että siinä on rajoituksia t • 97297 24 johtuen happaman kloridin liittämismenetelmän vaatimuksista. Ensiksi menetelmä el ole helposti käytettävissä peptidien liittämisessä, koska sivureaktiot, kuten oksatsolino-nin muodostuminen, rajoittavat sen käyttöä yhdelle amino-5 happotähteelle. Toiseksi vaaditaan happostabiili suojaryh- mä johtuen ylimääräisestä HCl:stä, jota syntyy happaman kloridin muodostuessa. Lopuksi aminohappotähteen rasemi-soituminen kuuluu luonnostaan menetelmään.

Toinen menetelmä yhdisteen 6 valmistamiseksi on 10 asyyliryhmän tai sopivan sivuketjusuojauksen omaavan N-suojatun peptidin liittäminen yhdisteeseen 5. Tämä menetelmä on selvästi ensimmäistä parempi, koska se on tarpeeksi monipuolinen ja sallii minkä tahansa peptidin syn-tetisoimisen normaalisti peptidisynteesissä kohdattavien 15 rajoitusten, kuten riittämättömän liukenevaisuuden, puitteissa. Happamia klorideja tai muita asyyliryhmien aktiivisia muotoja voidaan liittää. Peptideille suositellaan seka-anhydridimenetelmää, jonka ovat kuvanneet Anderson et ai., J. Am. Chem. Soc. 89: 5 012 (1967). N-suojatuista 20 aminohapoista tai sopivat sivuketjujen suojaryhmät omaa-vista, pituudeltaan dipeptidistä tetrapeptidiin vaihtele-vista peptideistä valmistetaan seka-anhydrIdi liuottamalla kyseinen peptidi tetrahydrofuraaniin ja lisäämällä yksi ekvivalentti N-metyylimorfoliinia. Liuos jäähdytetään 25 -20 °C:een ja lisätään ekvivalentti isobutyyliklooriformi- aattia. Viiden minuutin kuluttua lisätään tämä seos ja yksi ekvivalentti trietyyliamiinia (tai jotain muuta stee-risesti estettyä emästä) yhdisteen 5 liuokseen, joka on liuotettu joko kylmään kloroformiin tai tetrahydrofuraa-30 niin. Reaktioseosta sekoitetaan rutiinisti yksi tunti -20 °C:ssa, jota seuraa 1-2 tunnin sekoitus huoneen lämpötilassa. Liukenematon materiaali poistetaan suodattamalla, liuotin poistetaan haihduttamalla, ja jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin. Orgaaninen liuos pestään 0,2 N 35 suolahapolla, 5-%:isella, vesipohjaisella natriumbikarbonaatilla ja kyllästetyllä, vesipohjaisella natriumklori- - 97297 25 dilla. Orgaaninen faasi kuivataan sitten vedettömän nat-riumsulfaatin päällä, suodatetaan ja haihdutetaan, jotta saadaan useimmissa tapauksissa osittain kiinteää ainesta. Joukolle yhdisteitä yhdisteen 6 lisäpuhdistusta pidettiin 5 tarpeettomana. Yhdisteen 6 puhdistuksessa käyttökelpoisia menetelmiä ovat silikageelikromatografia, kiteytys joissain tapauksissa ja geelipermeaatiokromatografia käyttäen Sephadex™ LH-20-geeliä ja metanolia liuottimena. Jälkimmäistä menetelmää pidetään parempana. NMR-spektri osoitti 10 tyypillisesti -CH2-Br vyöhykkeen deltassa 3,45 ja terävän yksittäisvyöhykkeen deltassa 0,80 - 0,95 yhdelle pinaani-diolin suojaryhmän metyyli ryhmälle tai yksittäisvyöhykkeen deltassa 1,3 pinakoliryhmälle.

Alkyylihalogenidipeptidi, yhdiste 6, muutetaan sit-15 ten alkyyliatsidiksi, yhdisteeksi 7, käsittelemällä kahdella ekvivalentilla natriumatsidia dimetyyliformamidissa 100 °C:ssa kolme tuntia. Tämä reaktio tuntui kaikissa tapauksissa sujuvan tasaisesti muuttamatta reaktio-olosuhteita. CDCl3:ssa olevan yhdisteen 7 NMR-spektri osoitti 20 tyypillisesti -CH2-Br:n deltan arvon kohoavan 0,1 - 0,2 ppm sen muuttuessa atsidiksi. Lisäpuhdistus voidaan saada aikaan LH-20-kromatografiällä, mutta monelle peptideistä se ei ole tarpeen.

Booriornitiinipeptidit, yhdiste 8, valmistetaan 25 rutiinisti alkyyliatsidien, yhdiste 7, katalyyttisellä hydrauksella, kun läsnä on 10 % Pd/C:tä ja yksi ekvivalentti bentseenisulfonihappoa alkoholissa. Hydraukset suoritetaan Parr'in laitteessa. Hydraukset voidaan vaihtoehtoisesti suorittaa normaalissa ilmanpaineessa ja mineraa-30 lihapot voivat korvata bentseenisulfonihapon. On huomattava, että on tarpeellista käyttää peptidin suojaryhmiä, jotka ovat stabiileja katalyyttiselle hydraukselle. Tällaiset peptidin suojaryhmät ovat tuttuja alan ammattimie-hille, ja niistä on keskusteltu teoksessa The Peptides (E. 35 Gross ja J. Meienhofer, toim.) osa 3, Academic Press, New York, (1981). Suositeltavia suojaryhmiä ovat t-butyyliok- • 97297 26 sikarbonyyliryhmä aminoryhmille ja t-butyylieetterit ja -esterit hydroksi- ja karboksyylihapposivuketjuille. Muita sopivia suojaryhmiä ovat di-isopropyylimetyylioksikarbo-nyyli, t-amyylioksikarbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli, 5 bifenyyli-isopropyylioksikarbonyyli ja tosyyli. On odotettavissa, että atsidin muuttaminen amiiniksi pelkistämällä voidaan saada aikaan muilla pelkistävillä aineilla käyttäen sellaisia reagensseja kuin tinakloridia ja trialkyy-lifosfiitteja, kuten ovat kuvanneet Maiti et ai., Tetra-10 hedron Lett. 27: 1 423 - 1 424 (1986), ja Koziara et ai., Synthesis: 202 - 204 (1985). Näiden reagenssien odotetaan sopivan yhteen sellaisten peptidisuojaryhmien kanssa, jotka ovat labiileja katalyyttiselle hydraukselle. Booriorni-tiinipeptidit kromatografoidaan rutiinisti Sephadex™ LH-15 20-geelillä ja ovat valkoista, ei-kiteistä kiinteää ainesta eetteritrituraation jälkeen.

Booriarginiinipeptidit, yhdiste 9, valmistetaan antamalla vastaavan booriornitiinipeptidin, yhdiste 8, reagoida ainakin nelikertaisen syanamidiylimäärän kanssa 20 (50 mg/ml) absoluuttisessa etanolissa 100 °C:ssa. Aluksi komponenttien annetaan reagoida 2-3 päivää typpivaipan alla vesijäähdytteisessä kondensoijassa. Vesijäähdytys lopetetaan, ja reaktioseoksen annetaan konsentroitua hitaasti useiden päivien ajan. Reaktion loppuun meneminen . 25 määritetään Sakaguchi-värin värjäämän materiaalin inten siteetin progressiivisella nousulla, jolloin väri reagoi booriarginiin guanidinoryhmän kanssa, ja ninhydriinivä-rillä positiiviseksi värjäytyvän materiaalin katoamisella, jolloin väri reagoi booriornitiinin aminoryhmän kanssa, 30 metanoli:vesi-seoksessa (85:15) ajetuilla käänteisfaasi-ohutkerroslevyillä. Tyypillisesti booriarginiinipeptidit tekevät levyn alkukohdasta lähtevän juovan, booriornitii-nipeptidit kulkevat erillisinä täplinä levyn keskellä ja syanamidi kulkee liuosrintamassa sallien kunkin komponen-35 tin tunnistuksen. Spesifisiä värejä guanidinoryhmälle ja aminoryhmälle käytetään yleisesti peptidisynteesissä. Yh- i· · ärt t liiti I I : i 97297 27 diste 9 puhdistettiin geelipermeaatiokromatografialla käyttäen Sephadex™ LH-20-geeliä ja metanolia liuottimena. Tämä kromatografinen vaihe erottaa helposti booriarginii-nipeptidit matalan molekyylipainon omaavista sivutuotteis-5 ta ja reagoimattomasta syanamidista. Useimmissa tapauksissa mitään lisäpuhdistusta ei tarvita. Kuitenkin on välttämätöntä, että yhdisteen 8 guanidaatioreaktion annetaan mennä loppuun, koska on vaikeaa, ellei peräti mahdotonta, erottaa yhdisteitä 8 ja 9 erilleen seoksesta. Lopputuot-10 teet saadaan ei-kiteisenä, valkoisena kiinteänä aineksena trituroimalla eetterillä, ja useimmissa tapauksissa ne ovat analyyttisesti puhtaita NMR-, massaspektri- ja polt-toanalyyseillä määritettynä.

On huomattava, että yhdisteen 8 guanidaation syana-15 midilla on havaittu olevan erittäin riippuvainen reaktio-olosuhteista. Ensiksikin, kuten yllä on keskusteltu, on tärkeää, että reaktiota suoritetaan riittävän pitkään, jotta saavutetaan suhteellisen täydellinen yhdisteen 8 muuttuminen yhdisteeksi 9. Usein vaaditaan reaktioaikoja 20 aina seitsemään vuorokauteen asti ja siihen liittyvä rea-genssien konsentroiminen hitaalla liuottimien haihdutuksella. Etsittäessä alunperin yhdisteen 8 guanidaation reaktio-olosuhteita, yhdistettä 8 kuumennettiin palautus-jäähdyttäen suolahapon suolana syanamidin kanssa etanolis-25 sa useita tunteja. Haluttua tuotetta, yhdistettä 9, ei ollut havaittavissa. Yritykset guanidoida yhdiste 8 käyttäen yllä mainittuja onnistuneita olosuhteita paitsi, että absoluuttinen etanoli korvattiin tetrahydrofuraanilla, eivät antaneet havaittavaa tuotetta. Samalla tavalla, kun 30 yritettiin guanidoida yhdiste 8 käyttäen näitä olosuhteita paitsi, että booriornitiinipeptidin aminoryhmän bentseeni-sulfonihapposuola neutraloitiin ennen guanidaatiota, yhdistettä 9 oli läsnä vain töin tuskin havaittava määrä. Suositeltavat olosuhteet sisältävät reaktiot yhdisteen 8 35 bentseenisulfonihapposuolan kanssa (neutraloimaton). On- 97297 28 nistuneita reaktioita on myös suoritettu vastaavan suola-happosuolan kanssa.

Tavalliset peptidisynteesialan asiantuntijoiden käyttämät ornitiinipeptidien guanidaatiomenetelmät vas-5 taavien arginiinipeptidien saamiseksi ovat ornitiinipep-tidin amiinin neutralointi ja liittäminen yhteen joko S-alkyyli- tai O-alkyyli-isourean tai guanyyli-3,5-dimetyy-lipyratsolinitraatin kanssa, kuten Barany et ai., The Peptides (E. Gross ja J. Meienhofer, toim.), osa 2, 169 -10 175, Academic Press, New York, (1980), ovat kuvanneet.

Bannard et ai., Can. J. Chem. 36: 1 541 - 1 549 (158), ovat tutkineet erilaisia amiinien guanidaatiomenetelmiä ja ovat havainneet, että guanyyli-3,5-dimetyylipyratsoli on parempi käytössä kuin S-metyyli-isourea, ja ovat päätel-15 leet, että guanidaatio syanamidilla ei ole otollinen, vaikka se on kuvattu varhaisemmassa kirjallisuudessa. Reaktioissa, jotka suoritettiin S-metyyli-isoureavetyjodi-dilla etanolissa ja guanyyli-3,5-dimetyylipyratsolilla erilaisissa olosuhteissa, ei onnistuttu guanidoimaan boo-20 riornitiinipeptidiä. Reaktiivisuuden puute tässä tapauksessa johtuu luultavasti sisäisen Lewis'in happo-emäskomp-leksin muodostumisesta ornitiinin sivuketjun aminoryhmän ja boorihappoesterin välillä. Yhdisteen 9 synteesi käsittelemällä yhdistettä 6 guanidiinilla etanolissa ei myös-25 kään ollut otollinen synteesimenetelmä. Yhdistettä 9, noin 50-%:isesti puhtaana, eristettiin guanidiinin ja yhdisteen 6 välisestä reaktiosta talteen vähemmän kuin 1 %.

Booriarginiinipinaanidiolin guanidinoryhmä käyttäytyy samalla tavoin kuin luonnollisen arginiiniaminohapon 30 guanidinoryhmä, kun se on inkorporoitu molekyyliin. Esimerkiksi alfa-aminoryhmät voidaan selektiivisesti asyloida anhydridillä vaikuttamatta booriarginiinin guanidinoryh-mään. Näin ollen oletettiin, että yhdiste 9 voidaan valmistaa H-booriarginiinipinaanidiolin synteesillä ja sen 35 jälkeen lisäämällä molekyylin peptidiosan N-suojattu muoto 97297 29 käyttäen seka-anhydridimenetelmää ja että samalla tavalla booriarglniinia sisältäviä di-, tri-, jne. peptidianalo-geja voidaan pidentää liittämällä lisäaminohappoja tai peptidejä.

5 Suojattujen booriarginiinipeptidien lisäpuhdistus voidaan suorittaa ioninvaihtokromatografialla SP-Sepha-dex-™-geelillä. Peptidit liuotetaan 20-%:iseen etikkahap-poon ja laitetaan pylvääseen sen H*-muotona. Kun pylväs on pesty 20-%:isella etikkahapolla, tuote eluoidaan ajamalla 10 0 -0,3 N kloorivetyhappogradientti 20-%:isessa etikkaha- possa. Tuote eluoidaan pinaanidioliesterin ja vapaan boo-rihappopeptidin seoksena. Homogeeninen preparaatti saadaan aikaan käsittelemällä seosta pinaanidiolilla vedettömissä olosuhteissa ja trituroimalla tuote eetterillä.

15 On kehitetty kaksi menetelmää pinaanidiolin suoja- ryhmän poistamiseksi, jotta saadaan vapaa boorihappo, yhdiste 10. Ensimmäinen on modifikaatio yllä olevasta puhdistusmenetelmästä, jossa vapaan boorihapon ja pinaanidioliesterin seos koeluoituu ioninvaihtopylväästä. Nämä kom-20 ponentit on helppo erottaa LH-20-kromatografiällä. Toinen menetelmä on modifikaatio menetelmästä, jonka ovat kuvanneet Kinder et ai., J. Med. Chem. 28: 1 917 - 1 925 (1985). Boorihappoesteriä käsitellään 2 - 3-kertaisella ylimäärällä booritrikloridia metyleenikloridissa viisi . 25 minuuttia -78 °C:ssa, ja seoksen annetaan sekoittua 15 minuuttia 0 °C:ssa jäähauteessa. Lisätään hitaasti vettä, jotta ylimääräinen booriritrikloridi hydrolysoituu boori-hapoksi ja suolahapoksi. Reaktiota laimennetaan edelleen 20-%:isella etikkahapolla niin, että saadaan lopulliseksi 30 suolahapon konsentraatioksi 0,05 M. Suolahapon konsentraa- tio perustuu reaktiossa alunperin käytettyyn booritriklo-ridin määrään. Vesifaasi laitetaan SP-Sephadex™-pylvää-seen, ja tuote eluoidaan vetykloridisuolana, kuten yllä on kuvattu. Vapaat boorihappopeptidit saatiin valkoisena, ei-35 kiteisenä kiinteänä aineksena.

30 57257

Yhdiste 10 voidaan muuttaa difluoriboraaniksi, yhdisteeksi 11, käyttämällä modifikaatiota menetelmästä, jonka ovat kuvanneet Kinder et ai., J. Med. Chem. 28; 1 917 - 1 925 (1985). Boorihappopeptidiä käsitellään vii-5 sinkertaisella molaarisella ylimäärällä 0,5 N vesipohjais ta fluorivetyhappoa huoneen lämpötilassa. Ylimääräinen fluorivetyhappo, ja vesi poistetaan lyofilisoimalla, ja tuloksena syntynyt kiinteä aine trituroidaan eetterillä, jotta saadaan haluttu tuote valkoisena, ei-kiteisenä kiin-10 teänä aineksena.

Edellä olevassa kuvauksessa vapaa boorihappo, yhdiste 10, valmistetaan booriarginiinipinaanidioliesteristä ja difluoriboraanihappo, yhdiste 11, valmistetaan yhdisteestä 10. Esterisuojaryhmän poistamismenetelmän tulisi 15 olla sovellettavissa booriornitiinin, boorilysiinin ja boorihomoarginiinin asyylipeptideihin, jotka on suojattu joko pinaanidioli-, pinakoli- tai muilla esterisuojaryh-millä. Samalla tavalla vastaavat vapaat boorihapot voidaan muuttaa difluoriboraaneiksi.

20 Edullisia molekyylien peptidiosan sivuketjujen suo- jaryhmiä ja N-pään suojaryhmiä ovat ryhmät, jotka ovat stabiileja katalyyttiselle hydraukselle ja alttiita vedettömälle suolahapolle tai trifluorietikkahapolle. Nämä vaatimukset täyttää hyvin aminon suojaryhmä t-butyylioksikar-. 25 bonyyli ja t-butyylieetterit ja -esterit hydroksi- ja hap- t pamille sivuketjuille. Näiden ryhmien poistamiseksi peptidejä käsitellään 4 N suolahapolla dioksaanissa huoneen lämpötilassa. Suojaamaton peptidi eristetään joko haihduttamalla liuotin tai seostamalla eetterillä. Erikoisen huo-30 lellinen pitää olla happaman sivuketjun omaavien peptidien kanssa, jotta saadaan poistettua kaikki suolahappo haihduttamalla. Tämä varmistaa, että booriarginiinipeptidi säilyy bentseenisulfonihapposuolana. Muut peptidit voidaan eristää joko kloorivety-bentseenisulfonihapposuolaseokse-35 na, tai useimmat voidaan muuttaa vetykloridisuolaksi ajamalla Cl‘-ionimuodossa olevan anioninvaihtopylvään läpi.

‘I ·»-« Silli I I i *1 - 97297 31

Yhdisteen 6 isotiouronijohdannaiset valmistetaan käsittelemällä yhdistettä 6 tiourealla absoluuttisessa etanolissa, jotta saadaan yhdiste 12, booriarginiinipep-tidiesterin, yhdisteen 10, analogi. Rutiinisti alkyyliha-5 logenidin annetaan sekoittua 4 - 5-kertaisessa ylimäärässä tioureaa useita vuorokausia huoneen lämpötilassa. Tuote eristetään tarvittaessa reagoimattomasta yhdisteestä 6 trituroimalla eetterillä. Yhdiste 6 on helposti liukeneva eetteriin useimmilla peptideillä, kun taas tuote on liuke-10 nematon. Lopullinen puhdistus, ylimääräisen tiourean poistaminen, saadaan aikaan kromatografialla Sephadex™ LH -geelillä metanolissa ja trituroimalla eetterillä, jolloin saadaan lopputuotteet vetybromidisuoloina. Sivuketjuja N-pään suojaryhmät poistetaan käsittelemällä vedettö-15 mällä vetybromidilla tai muulla vedettömällä hapolla.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden biologinen aktiivisuus osoitetaan sekä in vitro että in vivo -tuloksilla, jotka liittyvät trypsiinin kaltaisten entsyymien, ihmisen trombiinin ja plasman kal-20 likreiinin, aiheuttaman synteettisen substraatin hydro-lyysin inhibitioon ja näiden entsyymien katalysoimien fysiologisten reaktioiden, kuten veren hyytymisen ja tulehduksen, inhibitioon.

Seuraavissa esimerkeissä kunkin entsyymin hydro-25 lyyttinen aktiivisuus määritetään sekä inhibiittorin läs- * nä ollessa että poissa ollessa, ja prosenttinen entsyymi-aktiivisuus mitataan. On havaittu, että sekä plasman kal-likreiinin että trombiinin tehokkaimmat inhibiittorit ovat hitaasti sitoutuvia inhibiittoreita, joiden tehokkuus nou-30 see progressiivisesti ajan funktiona, kunnes saavutetaan steady state -tila. Steady state -tila saavutetaan melko nopeasti ja on lähes täydellinen viiden minuutin sisällä. Aktiivisuus mitataan 10 - 20 minuutin kuluttua siitä, kun komponentit on sekoitettu, jotta varmistutaan, että reak-35 tiokomponentit ovat tasapainossa. Matalin testattu inhi-biittorikonsentraatio ratkaistaan arvioidun entsyymikon- 97297 32 sentraation perusteella. Inhibiittorikonsentraatio, joka on viisinkertainen verrattuna entsyymikonsentraatioon, on matalin ylläpidetty konsentraatio niin, että ensimmäisen kertaluokan pseudoreaktio-olosuhteet havaitaan. Ensimmäi-5 sen kertaluokan pseudoreaktio-olosuhteiden ylläpito ja asianomaisten kokeiden herkkyys asettavat matalimman testatun inhibiittorirajatason 10 nM:ksi kallikreiini-inhi-biittoreille ja 5 nMrksi trombiini-inhibiittoreille.

Reversiibeli inhibiittorin tehokkuus määritetään 10 tavallisesti mittaamalla K*:t, entsyymi-inhibiittorikomp- leksin dissosiaatiovakiot. Tämä arvo on määritelmän mukaan se inhibiittorikonsentraatio, joka tarvitaan inhiboimaan entsyymi 50-%:isesti substraatin poissa ollessa. Mutta substraatilla on suojaava vaikutus, minkä vuoksi tarvitaan 15 korkeampia inhibiittorikonsentraatioita 50-%:isen inhibi tion saavuttamiseen. Siitä huolimatta voidaan aktiivisuus-prosentti (inhibitio) -tulosten avulla saada kohtalainen arvio Kt:stä ja inhibiittorikonsentraatiosta. Noin 20 kertaa K^tä korkeampi inhibiittoritaso tarvitaan inhiboimaan 20 reaktio 95-%:isesti ja noin 50 kertaa K^tä korkeampi inhi-biittoritaso tarvitaan 98-%:iseen inhibitioon.

Plasman kallikreiini hydrolysoituu helposti ja vapauttaa bradykiniiniä. Booriarginiinipeptidit, joissa on Phe booriarginiinin vieressä, ovat tämän entsyymin tehok-. 25 kaimpia inhibiittoreita. Esimerkiksi 10 nM H-(D)Phe-Phe- booriArg-C10H16 inhiboi kallikreiiniä yli 95-%risesti. Mitään merkittäviä tehokkuuseroja ei ole havaittavissa boo-riarginiinipinaanidioliestereiden ja vastaavien isotiouro-nianalogien (boorilrg-) välillä. Mitään eroja ei myöskään 30 ole havaittavissa suojaamattoman boorihapon ja vastaavan difluoriboraanin tehokkuuksissa.

Samanlaisia tuloksia kuin kallikreiinillä saadaan trombiinilla kokeissa, jotka tehdään synteettisillä substraateilla, paitsi että trombiinilla on paljon suurempi 35 affiniteetti inhibiittoreille, joilla on proliini booriarginiinin vieressä. Tehokkain inhibiittori on Ac-(D)Phe- •<t äiti t i i m - 97297 33

Pro-booriArg-C10H16, joka inhiboi trombiinin 99-%:isesti 5 nM:n konsentraationa. Vahvin kirjallisuudessa kuvattu inhibiittori on N-alfa-(2-naftyylisulfonyyliglysyyli)-4-amidinofenyylialaniinipiperidiini, jonka Kt on 6 nM. Sen 5 kuvasivat B. Kaiser et ai., Thromb. Res. 43: 613 - 620 (1986), ja Sturzebecher et ai., Thromb. Res. 29: 635 - 642 (1983). Suhde inhibiittorikonsentraation, KA:n, ja inhibi-tioprosentin välillä, kuten aiemmin on kuvattu, antaa olettaa, että Ac(D)Phe-Pro-booriArg-C10H16:n Kt on pikomoo-10 liluokkaa. Lisäksi sekvenssin (D)Phe-Pro-booriArg-omaavien inhibiittorien tehokkuus ei tunnu olevan kovin herkkä ami-nopään suojaryhmän läsnä tai poissa ololle tai sen luonteelle. Sellaiset yhdisteet, joissa on Boc- ja Ac-suoja-ryhmät ja joissa ei ole mitään suojaryhmiä, inhiboivat 15 trombiinia samalla tavalla, kunkin IC50-arvon ollessa alle 5 nM.

Inhibiittoreiden tehokkuus reaktioissa, joissa ne kilpailevat kohde-entsyymien luonnollisten substraattien kanssa, määritetään in vitro veren hyytymiskokeissa. Käy-20 tetään kahta erilaista koetta, APTT- (aktivoidut partiaa-liset tromboplastiiniajat) ja PT- (protrombiiniajat) kokeita. Nämä kokeet matkivat veren hyytymisprosessia in vivo. Veren hyytyminen tapahtuu jommalla kummalla kahdesta reitistä kummankin sisältäessä tsymogeeniaktivaatiovai-25 heiden kaskadit. Reitit on nimetty sisäiseksi ja ulkoiseksi reitiksi [katso L. Lorand, Methods in Enzymology 45: 31 - 37 (1976)]. Sisäisen reitin aloittavat negatiivisesti varatut pinnat, joissa plasman kallikreiini, faktori XII ja faktori IX aktivoituvat, ja sitten faktorit IX ja X ja 30 protrombiini aktivoituvat kalsiumista riippuvaisissa vaiheissa. Kaskadin viimeinen proteaasi, trombiini, hydrolysoi fibrinogeenin fibriiniksi, mikä johtaa hyytymän muodostumiseen. APTT-kokeessa plasman komponentit aktivoidaan altistamalla ne negatiivisesti varatuille pinnoille, sys-35 teemiin lisätään kalsiumia ja sitten hyytymisajat määritetään. Ulkoisessa reitissä kudoksen tromboplastiini ak- - 97297 34 tivoi faktori VII:n, joka sitten aktivoi faktori X:n johtaen trombiinin aktivaatioon. Näitä tapahtumia mitataan protrombiiniaikakokeissa.

Booriarginiinipeptidit ja vastaavat isotiouroniana-5 logit inhiboivat tehokkaasti veren hyytymistä molemmissa kokeissa. Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetut tehokkaimmat trombiini-inhibiittorit ovat tehokkaimpia molemmissa kokeissa. Toisaalta kallikreiinin inhibiittorit, jotka ovat vähemmän vahvoja hyytymisen inhibiittorei-10 ta, inhiboivat APTT-koetta (kallikreiini ottaa osaa aloitukseen tässä kokeessa) tehokkaammin kuin PT-koetta. Tämä on selvästi osoitettu kuviossa 1 H-(D)Phe-Pro-booriArg-Ci0Hi6: n (trombiini-inhibiittori) vaikutuksella plasman suhteellisiin hyytymisaikoihin. Se osoittaa selektiivisyyden, 15 joka voidaan saada aikaan melko monimutkaisessa biologisessa systeemissä vaihtelemalla yhtä aminohappoa tripepti-di-inhibiittorissa. Trombiini-inhibiittorien tehokkuus-tasot ovat samaa molaarisuusluokkaa kuin hepariinilla. Tavallisesti 0,2 - 0,4 yksikköä hepariinia per ml plasmaa 20 nostaa hyytymisaikoja 2 - 2,5-kertaisesti. Jos oletetaan hepariinin keskimääräiseksi molekyylipainoksi 15 000 ja spesifiseksi aktiivisuudeksi 150 yksikköä/mg, sen molaari-nen konsentraatio on 86 - 170 nM. Booriarginiinipeptidien konsentraatiot, jotka vaaditaan nostamaan hyytymisaikoja . 25 APTT-kokeessa, ovat alueella 170 - 230 nM. On huomattava, että hepariini on korkean molekyylipainon omaavan proteaa-si-inhibiittorin, antitrombiini III:n, kofaktori.

Booriarginiinipeptidien stabiilisuus ihmisen plasmassa osoitetaan inkuboimalla niitä plasman kanssa sellai-30 sena konsentraationa, joka on tehokas hidastamaan hyyty-misprosessia. Otetaan inhibiittorinäytteitä pidentyvin aikavälein, ja niiden kyky hidastaa hyytymistä mitataan kullakin aikavälillä. Muuttumattomuus hyytymisajassa osoittaa inhibiittoreiden inhibitioaktiivisuuden muuttu-35 mattomuutta plasmainkubaation aikana. Mitään merkittävää muutosta inhibitioaktiivisuudessa ei havaittu paitsi H- . 97297 35 (D)Phe-Pro-booriArg-C10H16:lla/ joka menetti aktiivisuutensa 24 tunnin jälkeen. Kaavan I mukaiset inhibiittorit ovat myös stabiileja 24 tuntia fosfaattipuskurissa pH:ssa 7,5 paitsi H-(D)Phe-Pro-booriArg-C10H16, joka menetti inhibitio-5 aktiivisuutensa yhdessä tunnissa. Tämän inhibiittorin suurempi epästabiilisuus puskurissa antaa olettaa, että fosfaattipuskurilla on rooli yhdisteen destabiloinnissa.

Saadut in vivo tulokset osoittavat selvästi tutkittavien yhdisteiden tehokkuuden veren hyytymisen inhibiit-10 toreina nisäkässysteemeissä.

Kaavan I mukaiset yhdisteet ovat myös tehokkaita tulehduksen vastaisia aineita, minkä osoittaa rotan korva-ödeeman inhibitio, kun yhdisteitä annetaan paikallisesti ärsykeaineen kanssa. Tämän farmakologisen aktiivisuuden 15 molekyylitausta on tuntematon, koska tulehduksen aikana esiintyy monia tapahtumia. Kuitenkin proteaasien, jotka kohottavat verisuonten läpäisykykyä, kuten kiniinejä vapauttavan plasman kallikreiinin ja anafylatoksisia peptidejä vapauttavien komplementtisysteemin entsyymien, on 20 ajateltu ottavan osaa tulehdusprosessiin.

Lopuksi boorilysiinipeptidien osoitettiin inhiboivan tehokkaasti plasmiinia, entsyymiä, jolla on avainrooli verenvuodon tyrehdyttämisessä.

N-asyyli- Ja N-peptidi-alfa-aminoboorihapot, jotka . 25 ovat ornitiinin, arginiinin, lysiinin ja homoarginiinin analogeja esillä olevassa keksinnössä, edustavat uutta, tehokasta trypsiinien kaltaisten entsyymien reversiibelien inhibiittorien luokkaa. Trypsiinin kaltaiset entsyymit ovat ryhmä proteaaseja, jotka hydrolysoivat peptidisidok-30 siä emäksisten tähteiden kohdilta vapauttaen joko C-ter- minaalisen arginyyli- tai lysyylitähteen. Näiden entsyymien joukossa ovat veren hyytyrnissysteemin proteaasit (faktorit Xlla, XIa, IXa, Vila, Xa ja trombiini), fibrino-lyyttisen systeemin proteaasit (plasminogeeniaktivaattorit 35 ja plasmiini), komplementtisysteemin proteaasit (Cls, Clr, C3-konvertaasi, faktori D, jne.), haiman trypsiini (jolla 97297 36 on ruuansulatus!unktio) ja akroslini (joka on spermaan liittyvä proteaasl ja jota tarvitaan hedelmöityksessä).

Kaavan I mukaisten yhdisteiden kyky inhiboida tryp-siinin kaltaisia proteaaseja on määritetty inhiboimalla 5 kahta erilaista trypsiinin kaltaista entsyymiä, ihmisen trombiinia ja plasman kallikreiiniä. Kaavan I mukaiset yhdisteet ovat paljon tehokkaampia näiden molempien entsyymien inhibiittoreita kuin muut tunnetut reversiibelit inhibiittorit. Esimerkiksi tähän mennessä tehokkain rapor-10 toitu trombiini-inhibiittori on N-alfa-(2-naftyylisulfo-nyyliglysyyli)-4-amidinofenyylialaniinipiperidiini, jonka K1 on 6 nM. Kaavan I mukaiset yhdisteet inhiboivat trombii-nin lähes kokonaan konsentraationa 5 nM osoittaen K±:tä <1 nM, ja näin ovat loistavia kandidaatteja trombiinin 15 välittämien prosessien, kuten veren hyytymisen, kontrollointiin. Tehokkain booriarginiinipeptidi inhiboi veren hyytymistä, mikä osoitettiin APT-aikojen ja PT-aikojen kohoamisena. Sen tehokkuustaso on molekulaarisin perustein samanlainen kuin hepariinilla. Lisäksi yhdisteet ovat sta-20 blileja ihmisen plasmassa. Yhdisteitä voidaan käyttää an-tikoagulantteina plasman valmistuksessa proteiinieristystä varten kuten myös kliiniseen testaukseen.

Lisäesimerkki on plasmiiniproteaasi, jolla on keskeinen rooli verihyytymlen hajotuksessa. Valmistettiin • 25 boorilysiiniä sisältäviä peptidejä, jotka testattiin ja joiden havaittiin olevan plasmiinin aktiivisia inhibiittoreita .

Kaavan I mukaiset yhdisteet ovat tehokkaita proteo-lyysin kontrolloinnissa ±n vivo, ja niiden pitäisi olla 30 farmaseuttisesti tehokkaita hoidettaessa nisäkkäiden tau teja, jotka syntyvät kontrolloimattomasta proteaasiaktii-visuudesta. Huomattavia näiden joukossa ovat tilat, jotka liittyvät verisuonitukoksiin ja konsumptikoagulopatiaan. Sepelvaltimotukoksella on tärkeä myötävaikuttava rooli 35 sydänlihaksen infarktissa. Konsumptikoagulopatiatilaa, jolle on tunnusomaista veren hyytymistekijöiden ja plas- - 97297 37 man proteaasi-inhibiittorin tasojen aleneminen, havaitaan potilailla, joilla on akuutti haimatulehdus ja disseminoi-tunut intravaskulaarinen koagulaatio (DIC). On odotettavaa, että kaavan 1 mukaisia yhdisteitä voi käyttää hepa-5 riinin tilalla, jolloin saadaan se etu, ettei hepariinin plasmakofaktoria, antitrombiini lll:a, kuluteta reaktiossa. Myöskään hepariinihoidon sivuoiretta, verihiutaleiden vähäisyyttä, ei pitäisi havaita. Lisäksi kaavan 1 mukaisten yhdisteiden odotetaan olevan arvokkaita hoidettaessa 10 trypsiinin kaltaisten entsyymien luonnollisten inhibiittorien puutostauteja, kuten perinnöllistä ödeemaa. Tämä sairaus syntyy plasman kallikreiinin pääinhibiittorin, Cl-inhibiittorin, puutoksesta.

Lopuksi esillä olevan keksinnön yhdisteet ovat 15 osoittaneet tehokasta tulehduksen vastaista aktiivisuutta in vivo.

Synteesiesimerkit

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksinnön yksityiskohtaiset suoritustavat. Kaikki ilmoitetut sulamispisteet 20 ovat korjaamattomia. Kaikki osat ovat paino-osia ja kaikki lämpötilat ilmoitetaan celsiusasteina. Protonin ydin-magneettinen resonanssi (NMR tai 1H-NMR) ilmoittaa kemialliset muutokset delta-yksiköinä, miljoonasosaa sisäisestä tetrametyylisilaani-standardista alaspäin. Käytettyjä eri 25 lyhennyksiä ovat TFA = trifluorietikkahappo; DMF = N,N-dimetyyliformamidi; MS - massaspektrometria; TLC ohut-kerroskromatografia; RP-TLC - käänteisfaasiohutkerroskro-matografia. Boorihappojen esterin suojaryhmät on lyhennetty: -C6H12 = pinakoliryhmä ja -C10H16 - pinaanidioliryhmä. 30 "Irg" on lyhennys arginiinin (Arg) isotiouronianalogille, ja etuliite "homo" osoittaa rakenteita, joissa sivuketju sisältää lisämetyleeniryhmän. Kaikki aminohappotähteet ovat "L"-muodossa, ellei toisin ole määritetty.

TLC:t ja RP-TLC:t suoritettiin E. Merck Silica Gel 35 60 -levyillä (luettelonumero 5534, E. M. Sciences, Gibbs- town, NJ) ja Whatman KC18F -käänteisfaasilevyillä (luette- . 97297 38 lonumero 4803-600, Whatman Co., Clifton, NJ), vastaavassa järjestyksessä. Neutraalit yhdisteet osoitettiin UV-valon alla ja jodihöyryaltistuksen jälkeen. Vapaita aminoryhmiä sisältävät yhdisteet värjättiin ninhydriinillä, ja gua-5 nidinoryhmiä sisältävät yhdisteet värjättiin Sakaguchi-värillä. Sakaguchi-värillä on melkoinen spesifisyys mono-substituoiduille guanidineille, kuten sellaisille, joita on läsnä booriarginiinipeptideissä (katso Chemistry of the Amino Acids 3: (1984) Greenstein ja Winitz, toim., Robert 10 E. Krieger Publishing Co., Malabar, FL).

Esimerkki la l-amino-4-bromibutyyliboronaattipinaanidioli·vety-kloridi NH2-CH[ (CH2 )3Br ] BO2-C10H16 · HC1 4-bromi-l-klooributyyliboronaattipinaanidioli val-15 mistettiin menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Matteson et ai., Organometallics 3: 1 284 - 1 288 (1984), paitsi että olosuhteita modifioitiin suuren mittakaavan valmistusta varten. Tyypillisessä kokeessa hydroboorattiin allyylibro-midia (173 ml, 2,00 mol) katekoliboraanilla (240 ml, 20 2,00 mol) lisäämällä boraania allyylibromidiin ja sitten kuumentamalla reaktiota neljä tuntia 100 °C:ssa typpi-il-makehässä. Tuote, 3-bromipropyyliboronaattikatekoli (kp. 95 - 102 eC, 0,25 mm) eristettiin 49 %:n saannolla tislaamalla. Katekoliesteri (124 g, 0,52 mol) transesteröitiin 25 (+)alfa-pinaanidiolilla (88 g, 0,52 mol) sekoittamalla komponentit 50 ml:aan tetrahydrofuraania (THF) ja antamalla niiden sekoittua 0,5 tuntia 0 °C:ssa ja 0,5 tuntia huoneen lämpötilassa. Liuotin poistettiin haihduttamalla, ja 250 ml heksaania lisättiin. Katekoli poistettiin ki-30 teisenä, kiinteänä aineena. Kvantitatiivinen poisto saa tiin aikaan peräkkäisillä laimennuksilla 500 ml:aan ja 1 000 ml:aan heksaania ja poistamalla kiteet kussakin laimennuksessa. Tuote (147 g) saatiin öljynä haihdutettaessa liuotin.

35 C13H2202BrB:n analyysi: 97297 39

Laskettu: C 51,85 %, H - 7,38 % ja Br - 26,54 %. Havaittu: C - 52,85 %, H - 7,30 % ja Br - 26,58 %.

4-bromi-l-klooributyyliboronaattipinaanidioli valmistettiin vastaavan propyyliboronaatin homologaatiolla.

5 Metyleenikloridi (34,8 ml, 0,540 mol) liuotettiin 500 ml:aan THF:a ja 1,54 N n-butyylilitiumia heksaanissa (350 ml, 0,540 mol) lisättiin hitaasti -100 °C:ssa. 3-bro-mipropyyliboronaattipinaanidioli (148 g, 0,490 mol) liuotettiin 500 ml:aan THF:a, jäähdytettiin liuoksen jäätymis-10 pisteeseen ja lisättiin reaktioseokseen. Sinkkikloridi (33,5 g, 0,246 mol) liuotettiin 250 ml:aan THF:a, jäähdytettiin 0 °C:seen ja lisättiin reaktioseokseen useina erinä. Reaktioseoksen annettiin sekoittamalla lämmetä hitaasti yön yli huoneen lämpötilaan. Liuotin haihdutettiin, ja 15 jäännös liuotettiin heksaaniin ja pestiin vedellä. Kun oli kuivattu vedettömällä magnesiumsulfaatilla ja suodatettu, liuotin poistettiin, jolloin saatiin haluttu tuote (140 g).

l-amino-4-bromibutyyliboronaattipinaanidioli val-20 mistettiin liuottamalla ensin heksametyylidisilatsaani (28,0 g, 80,0 mol) 30 ml:aan THF:a, jäähdyttämällä liuos -78 °C:seen ja lisäämällä 1,62 N n-butyylilitiumia heksaanissa (49,4 ml, 80,0 mol). Liuoksen annettiin lämmetä hitaasti huoneen lämpötilaan ja sitten jäähdytettiin uudel-25 leen -78 °C:seen ja lisättiin 4-bromi-l-klooributyylibo-ronaattipinaanidioli (28,0 g, 80,0 mol) 20 ml:ssa THF:a. Seoksen annettiin hitaasti lämmetä huoneen lämpötilaan ja sekoittua yön yli. Liuotin poistettiin haihduttamalla, ja kuivaa heksaania (400 ml) lisättiin, jolloin saatiin saos-30 tuma, joka poistettiin suodattamalla typpi-ilmakehässä. Suodos jäähdytettiin -78 eC:seen ja lisättiin 4 N vetyklo-ridia dioksaanissa (60 ml, 240 mmol). Reaktion annettiin hitaasti lämmetä huoneen lämpötilaan, jossa sitä sekoitettiin kaksi tuntia. Tuloksena syntynyt tuote (20 g) eris-35 tettiin kiinteänä aineena suodattamalla. Vakuumikuivatuk- - 97297 40 sen jälkeen raakatuote liuotettiin kloroformiin, ja liukenematon materiaali poistettiin suodattamalla. Suodos haihdutettiin, ja jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin. Tuote kiteytyi etyyliasetaatista saannolla 15,1 g (sp.

5 142 - 144,5 eC). [a]“= +16,7 ± 0,80, C - 1,0 absoluutti sessa etanolissa.

Ci4H26N02BrClB: n analyysi:

Laskettu: C - 45,87 %, H - 7,16 %, N - 3,82 % ja B * 2,95 %.

10 Havaittu: C = 45,76 %, H = 7,21 %, N = 3,79 % ja B * 3,04 %.

Esimerkki Ib (D, L)l-amino-4-bromibutyyliboronaattipinakoli *HC1 (D, L )NH2-CH[ (CH2 )3Br] B02-C6H12 ·HC1 15 4-bromi-l-klooributyyliboronaattipinakoli valmis tettiin menetelmällä, joka on kuvattu vastaavalle pinaani-diolille (Esimerkki la), paitsi että pinakoli korvasi pi-naanidiolin, ja 3-bromipropyyliboronaattipinakoli (kp.

60 - 64 eC, 0,35 mm) ja 4-bromi-l-klooributyyliboronaatti-20 pinakoli (kp. 110 - 112 °C 0,20 mm) tislattiin.

Ci0Hi902BrClB: n analyysi:

Laskettu: C - 40,38 % ja H - 6,45 %.

Havaittu: C - 40,70 % ja H - 6,37 %.

1 -amino-4-bromibutyyliboronaattipinakoli · vetyklori-25 di valmistettiin myös esimerkin la menetelmällä. Lopputuote kiteytettiin etyyliasetaatti:heksaanista saannolla 52 %.

C10H22NO2BrClB:n analyysi:

Laskettu: C - 38,19 %, H - 7,05 %, N - 4,45 %, Cl -30 11,27 % ja Br - 25,41 %.

Havaittu: C = 38,28 %, H - 7,39 %, N - 4,25 %, Cl - 11,68 % ja Br = 26,00 %.

97297 41

Esimerkki le l-amino-4-klooributyyliboronaattipinakoli·vetyklo-ridi (D,L)NH2-CH[(CH2)3C1]B02-C6H12»HC1 3- klooripropyyliboronaattikatekoli (kp. 80 - 85 eC, 5 0,30 mm) ja 3-klooripropyyliboronaattipinakoli (kp. 63 eC, 0,20 mm) valmistettiin esimerkin la menetelmällä, paitsi että allyylikloridi korvasi allyylibromidin ja pinakoli korvasi pinaanidiolin.

C9H1802ClB:n analyysi: 10 Laskettu: C - 52,85 %, H - 8,89 % ja Cl « 17,33 %.

Havaittu: C = 53,41 %, H - 8,15 % ja Cl = 16,81 %.

Homologaatio suoritettiin myös esimerkin la menetelmällä ja tuote eristettiin tislaamalla (kp. 95 °C, 0,25 mm) 65 %:n saannolla.

15 C10H19O 2Cl2B:n analyysi:

Laskettu: C = 47,47 %, H « 7,58 % ja Cl = 28,02 %.

Havaittu: C = 47,17 %, H - 7,45 % ja Cl = 27,75 %.

l-amino-4-klooributyyliboronaattipinakoli *HC1 valmistettiin samanlaisella menetelmällä kuin esimerkissä la. 20 Tuote kiteytyi etyyliasetaatista saannoilla 8,8 g (sp.

132 - 135,5 eC) ja 2,2 g (sp. 145 - 147 eC). Tuotetta, joka suli 145 - 147 °C:ssa, käytettiin analyyseissä. Ci0H22NO2C12B : n analyysi:

Laskettu: C - 44,47 %, H = 8,23 %, N = 5,19 % ja B = 25 4,00 %.

Havaittu: C - 44,01 %, H = 8,23 %, N * 4,77 % ja B « 3,80 %.

Esimerkki Id (D,L)l-amino-5-bromipentyyliboronaattipinakoli·HC1 30 (D, L )NH2-CH[ ( CH2 )4Br] B02C6H12 · HC1 4- bromibutyyliboronaattipinakoli valmistettiin menetelmällä, joka on kuvattu 3-bromipropyyliboronaattipi-naanidiolille (esimerkki la), paitsi että 4-bromi-l-butee-ni korvasi allyylibromidin ja pinakoli korvasi pinaanidio- 35 Iin. Tuote eristettiin öljynä (kp. 77 °C, 0,3 mm). Homolo- . 97297 42 gaatio tuotti 5-bromi-l-klooripentyyliboronaattipinakolin. cuH2i°2BrC1B:n MS(CI):

Laskettu - H: 310,47.

Havaittu: 310.

5 Lopputuotel-amino-5-bromipentyyliboronaattipinako- li«HCl valmistettiin esimerkin la menetelmällä saannolla 35 %.

CnH24N02BrBCl:n analyysi:

Laskettu: C - 40,22 %, H - 7,36 %, N - 4,26 %, Cl -10 10,79 %, Br - 24,32 % ja B = 3,29 %.

Havaittu: C - 39,23 %, H - 7,18 %, N = 4,04 %, Cl -15,21 %, Br - 25,66 % ja B « 3,75 %.

Esimerkki 2

Boc- (D )Phe-Pro-NH-CH[ (CH2 )3Br] BO2-C10H16 15 Boc-(D)Phe-Pro-0H tuotettiin valmistamalla ensin dipeptidibentsyyliesteri ja sitten poistamalla esteri katalyyttisellä hydrauksella. Boc-(D)Phe-0H (10,0 g, 37,7 mmol) liuotettiin 50 ml:aan THF:a ja N-metyylimorfo-liinia (4,14 ml, 37,7 mmol) lisättiin. Liuos jäähdytettiin 20 -20 °C:seen ja lisättiin isobutyyliklooriformiaattia (4,90 ml, 37,7 mmol). Viiden minuutin kuluttua lisättiin 50 ml:aan kloroformia liuotettu ja -20 °C:seen jäähdytetty H-Pro-OBzl»HCl (9,11 g, 37,7 mmol). Lisättiin trietyyli-amiini (5,25 ml, 37,7 mmol), ja seosta sekoitettiin yksi 25 tunti -20 °C:ssa ja kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Reaktioseos suodatettiin, ja suodos haihdutettiin. Jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja pestiin 0,2 N suolahapolla, 5-%:isella vesipohjaisella natriumbikarbonaatilla ja kyllästetyllä vesipohjaisella natriumkloridillä. Orgaani-30 nen faasi kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 15,2 g Boc-(D)Phe-Pro-OBzl:a öljynä. Bentsyyliesteri (15,2 g) liuotettiin 100 ml:aan metanolia, ja hydrattiin 276 kPa:n (40 psi:n) alkupaineella Parr'in laitteessa, kun läsnä oli 35 0,5 g 10 % Pd/C:tä. Reaktioliuos suodatettiin CeliteTO,n 97297 43 läpi ja haihdutettiin, jolloin saatiin tulokseksi kiinteä aine. Tämä kiinteä materiaali eristettiin ja pestiin etyyliasetaatilla ja sitten eetterillä, jolloin saatiin 10,0 g haluttua tuotetta (sp. 176,5 - 177 eC).

5 C19H26N205:n analyysi:

Laskettu: C - 62,95 %, H - 7,24 % ja N - 7,73 %.

Havaittu: C = 62,91 %, H - 7,15 % ja N - 7,53 %.

Boc- (D)Phe-Pro-NH-CH[ (CH2 )3Br] BO2-C10H16 valmistettiin liittämällä dipeptidi vastaavaan amiiniin käyttäen 10 seka-anhydridimenetelmää. Boc-(D)Phe-Pro-OH:n seka-anhyd- ridi valmistettiin liuottamalla tämä happo (4,94 g, 13.6 mol) 30 ml:aan THF:a ja lisäämällä N-metyylimorfolii-nia (1,50 ml, 13,6 mol). Liuos jäähdytettiin -20 °C:seen ja lisättiin isobutyyliklooriformiaattia (1,77 ml, 15 13,6 mol). Viiden minuutin sekoituksen jälkeen -20 °C:ssa seos lisättiin amiiniin NH2-CH[ (CH2)3Br]BO2-C10H16*HCl (5,0 g, 13.6 mol) liuotettuna 10 ml:aan kylmää kloroformia kuten esimerkissä la. Lisättiin kylmää THF:a (10 ml) ja trietyy-liamiinia (1,90 ml, 13,6 mmol), ja seosta sekoitettiin 20 yksi tunti -20 °C:ssa ja noin kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Seos suodatettiin, ja suodoksen neste haihdutettiin. Jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja pestiin 0,2 N suolahapolla, 5-%:isella vesipohjaisella natriumbikarbonaatilla ja kyllästetyllä vesipohjaisella natriumklo-25 ridilla. Orgaaninen faasi kuivattiin vedettömällä natrium- sulfaatilla ja suodatettiin, ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin saannoksi 9,0 g öljyä. Tämä materiaali liuotettiin metanoliin ja kromatografoitiin 2,5 x 50 cm:n LH-20-pylväässä. Haluttua tuotetta sisältävät fraktiot 30 yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin saannoksi 5,8 g kiinteää ainetta. TLC metanoli:kloroformilla (1:9) osoitti yhden täplän, jonka Rf oli 0,70.

C33H49N306BBr:n MS(FAB):

Laskettu +H: 674,30.

35 Havaittu: 674,30.

- 97297 44

Esimerkki 3

Boc- (D )Phe-Pro-NH-CH[ ( CH2 )3N3]B02-C10H16

Esimerkin 2 tuote Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH[(CH2)3Br] -BO2-C10H16 (4,4 g, 6,54 mmol) liuotettiin 7 ml:aan DMF:a Ja 5 natriumatsidia (0,919 g, 14,1 mmol) lisättiin. Seosta kuumennettiin 100 °C:ssa kolme tuntia. Reaktioseokseen lisättiin etyyliasetaattia (100 ml), ja se pestiin vedellä ja kyllästetyllä vesipohjaisella natriumkloridilla. Orgaaninen faasi kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla, suo-10 datettiin ja haihdutettiin. Tuloksena saatiin 4,1 g kiinteää ainetta. Tämä materiaali kromatografoitiin 2,5 x 50 cm:n LH-20-pylväässä metanolissa. Haluttua tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja neste haihdutettiin, jolloin saatiin saannoksi 2,3 g atsidia. TLC metanoli:klo-15 roformissa (1:9) osoitti yhden täplän, jonka Rf oli 0,76. C33H4eN606B:n analyysi:

Laskettu: C - 62,35 %, H = 7,63 %, N - 13,33 % ja B = 1,70 %.

Havaittu: C = 63,63 %, H - 8,02 %, N = 11,58 % ja B - 20 1,80 «.

C33H48N606B:n MS(FAB):

Laskettu +H: 637,39.

Havaittu: 637,49.

Esimerkki 4 25 Boc- (D)Phe-Pro-NH-CH [ (CH2)3NH2] BO2-C10H16 · bentseeni- sulfonihappo

Esimerkin 3 atsidi (8,80 g, 13,8 mmol) liuotettiin 150 ml:aan metanolia ja hydrattiin Parr'in laitteessa 276 kPa:ssa (40 psi), kun läsnä oli 0,50 g 10 % Pd/C:tä ja 30 bentseenisulfonihappoa (2,19 g, 13,8 mmol). Tunnin kuluttua katalyytit poistettiin, ja liuos haihdutettiin, jolloin saatiin kiinteää ainetta, joka trituroitiin heksaa- nilla, jolloin saatiin 9,9 g haluttua tuotetta. RP-TLC me-tanoli:vedessä (85:15) osoitti UV-täplän, jonka Rf oli 35 0,91, ja ninhydriinipositiivisen täplän, jonka Rf oli 0,52.

97297 45

Esimerkki 5

Boc - ( D ) Phe-Pro-NH-CH [ ( CH2)3-NH-C( NH )NH2]B02-C10H16 ‘ bentseenisulfonihappo

Boc- (D )Phe-Pro-booriArg-C10H16 · bentseenisulf onihappo 5 Esimerkin 4 Boc- (D)Phe-Pro-booriOrn-C10H16· bentseeni sulf onihappo (4,6 g, 6,11 mol) kuumennettiin palautusjääh-dyttäen 100 °C:ssa 20 ml:ssa syanamidia (50 mg/ml) sisältävää absoluuttista etanolia. Reaktion edistymistä seurattiin RP-TLC:llä metanoli:vedessä (85:15), jossa seurattiin 10 lähtömateriaalin amiinin (Rf 0,54) ninhydriinitäplän häviämistä ja tuotteen Sakaguchi-juovan (Rf 0 - 0,13) ilmestymistä. Tuote voitiin havaita 18 tunnin refluksoinnin jälkeen, ja sen taso nousi progressiivisesti ajan myötä. Seitsemän vuorokauden kuluttua amiinia ei voitu havaita, 15 ja reaktioliuos konsentroitiin noin 50-%:iseksi liuokseksi passiivisella haihduttamisella. Reaktioliuos suodatettiin, konsentroitiin ja kromatografoitiin 2,5 x 100 cm:n LH-20-pylväässä metanolissa. Halutun tuotteen sisältävät fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 3,7 g 20 haluttua tuotetta. Osa (2,3 g) kiteytettiin etyyliasetaatti :heksaanista saannon ollessa 0,89 g, ja jäännös (1,2 g) saatiin kiinteänä aineena trituroimalla eetterillä. C34H53N606SB: n MS (FAB):

Laskettu +H: 653,42 25 Havaittu: 653,38 : C40H59N609SB·H20:n analyysi:

Laskettu: C - 57,95 %, H - 7,43 %, N = 10,14 % ja B - 1,30 %.

Havaittu: C - 57,20 %, H = 7,14 %, N = 10,94 % ja B -30 1,01 %.

Esimerkki 6 H- (D) Phe-Pro-booriArg-C10H16 · 2HC1 Esimerkin 5 tuotteen Boc-(D)Phe-Pro-booriArg-CioHie·bentseenisulfonihapon (1,17 g, 1,54 mmol) annettiin 35 reagoida 5 ml:n kanssa 4 N suolahappoa dioksaanissa 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Tuote saostettiin lisää- 46 - 97297 mällä eetteriä, eristettiin ja pestiin eetterillä ja kuivattiin vakuumissa. Sitten se liuotettiin 10 ml:aan vettä ja ajettiin 5 ml:n BIO-RAD AG1 X8™ -anioninvaihtopylvää-seen (Cl'-muodossa, BIO-RAD Co., Richmond, CA) ja pylväs 5 pestiin vedellä (noin 30 ml:11a). Ulosvirrannut neste haihdutettiin vakuumissa, ja jäännös trituroitiin eetterillä, jolloin saatiin haluttu tuote (0,80 g).

C29H45N604B:n MS(FAB):

Laskettu +H: 553,37 10 Havaittu: 553,40 ja 538,40 (tunnistamaton) H- (D) Phe-Pro-booriArg-C10Hl6 · 1BSA · TFA: n analyysi:

Havaittu: 553,4

Esimerkit 7-8

Ac- (D) Phe-Pro-booriArg-C10H16 · HC1 (esimerkki 7) 15 Ac-(D)Phe-Pro-booriArg-OH»HCl (esimerkki 8)

Esimerkin 5 tuotteen Boc-(D)Phe-Pro-booriArg-C10H16· bentseenisulfonihapon (0,86 g, 1,13 mmol) annettiin reagoida vedettömän TFA:n (noin 5 ml) kanssa 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Ylimääräinen TFA poistettiin haih-20 duttamalla, ja jäännös trituroitiin eetterillä, jolloin saannoksi saatiin 0,76 g. Tämä tuote (0,70 g, 0,91 mmol) liuotettiin seokseen, joka sisälsi 2 ml dioksaania ja 1 ml vettä. Lisättiin etikkahappoanhydridiä (0,47 ml, 5,0 mmol) ja natriumbikarbonaattia (0,42 g, 5,0 mmol). Seosta sekoi-25 tettiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Lisättiin etyy-liasetaattia (50 ml) ja vettä (5 ml). Faasit erotettiin, ja orgaaninen faasi kuivattiin vedettömällä natriumsulfaa-tilla, suodatettiin ja liuotin poistettiin haihduttamalla, jolloin saatiin 0,56 g osittain kiinteää ainetta.

30 Näyte liuotettiin 4 ml:aan jääetikkahappoa ja lai mennettiin 16 ml:11a vettä. Se ajettiin välittömästi 15 ml:aa SP-Sephadex™:ää (H*-muodossa) sisältävään pylvääseen ja tasapainotettiin 20-%:11a etikkahapolla. Pylväs pestiin 300 ml:11a 20-%:ista etikkahappoa ja sitten ajet-35 tiin lineaarinen gradientti 100 ml 20 % etikkahappo - 100 ml 20 % etikkahappo, joka oli säädetty 0,30 N:ksi suo- ii mi i kiu i:i i m , - 97297 47 lahapon suhteen. Kerätyt 0,08 - 0,17 N -fraktiot sisälsivät N-asetyylipeptidin (0,29 g) vapaan boorihapon ja pi-naanidioliesterin seoksena.

Pinaanidioliesteri ja vapaa boorihappo erotettiin 5 kromatografoimalla 2,5 x 100 cm:n LH-20-pylväässä metano- lissa. Fraktion koko oli 8,2 ml. Pinaanidioliesteri (102 mg) eluoitui fraktioissa 41 - 43, kun taas vapaa boorihappo (131 mg) eluoitui hitaasti fraktioissa 45 - 129.

MS(FAB) (esimerkki 7): 10 C31H47N605B:n Ac-(D)Phe-Pro-booriArg-C10H16:

Laskettu +H: 595,33 Havaittu: 595,33 MS(FAB) (esimerkki 8): C2iH33N605:n Ac-(D )Phe-Pro-booriArg-OH· HC1: 15 Laskettu +H: 449,60

Havaittu: 579,24 - 581,24 Jälkimmäistä tulosta ei voida selittää. Kuitenkin NMR oli yhdenmukainen vapaan boorihapon rakenteen kanssa, koska tarkat pinaanidioliryhmän vyöhykkeet, kuten delta-20 arvoissa 0,85 (3H), 1,30 (3H) ja 1,36 (3H) havaitut metyy-liryhmien yksittäisvyöhykkeet puuttuivat. Lisätodisteena rakenteelle vapaa boorihapponäyte esteröitiin uudestaan ja saatiin esimerkin 7 tuote. Analyyttistä näytettä (20 mg) käsiteltiin 2-kertaisella ylimäärällä pinaanidiolia 25 (14 mg) 3 ml:ssa metanoiia viisi minuuttia. Liuotin haih dutettiin, ja ylimääräinen pinaanidioli poistettiin tritu-roimalla näyte eetterillä, jolloin saatiin tuote (26 mg).

MS(FAB) (Havaittu: 595,38) ja NMR olivat yhdenmukaisia sen kanssa, mitä odotettiin esteröidylle tuotteelle ja olivat 30 lähes identtisiä esimerkin 7 pinaanidiolituotteen kanssa.

Esimerkki 9

Ac-Phe-booriArg-C10H16 · HC1

Ac-Phe-NH-CH[ (CH2 )3Br]BO2-C10H16 valmistettiin esimerkissä 2 kuvatulla menetelmällä. Ac-Phe-0H:n (0,565 g, 35 2,73 mmol) seka-anhydridi valmistettiin 10 ml:aan THF:a ja liitettiin 10 ml:aan kylmää THF:a liuotettuun - 97297 48 NH2-CH( (CH2)3Br )-BO2-C10H16*HCl:ään (esimerkin la tuote, 1,00 g, 2,73 mmol), jolloin saatiin 1,47 g valkoista vaahtoa. Tätä materiaalia sekoitettiin heksaanin kanssa yön yli, jolloin saatiin 1,01 g kiinteää ainetta (sp. 106,5 -5 109 eC).

C25H36N204BrB;n analyysi:

Laskettu: C - 57,81 %, H - 7,00 %, N - 5,40 %, Br - 15,40 %, B - 2,08 %.

Havaittu: C - 58,33 %, H - 7,33 %, N - 4,76 %, Br -10 14,18 %, B = 1,80 %.

C25H36N2°4BrB· n MS (FAB):

Laskettu +H: 519,20 Havaittu: 519,23

Ac-Phe-NH-CH[ (CH2 )3N3]BO2-C10H16 valmistettiin käsit-15 telemällä yhdistettä Ac-Phe-NH-CH[(CH2)3Br]B02-C10H16 (3,22 g, 6,20 mmol) natriumatsidilla esimerkissä 3 kuvatulla menetelmällä. Reaktion tuote (3,03 g) kromatografoltiin LH20:ssä. Halutun tuotteen sisältävät fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin. Jäännös trituroitiin heksaanil-20 la, jolloin saatiin 2,21 g atsidia.

Ac-Phe-booriOrn-C10H16*bentseenisulfonihappo valmistettiin Ac-Phe-NH-CH[(CH2)3N3]B02-C10Hl6:sta (2,21 g, 4,59 mol) esimerkin 4 menetelmällä, paitsi että hydraus suoritettiin normaalissa ilmanpaineessa. Suodatuksen ja 25 liuottimen haihdutuksen jälkeen haluttu tuote (2,22 g) saatiin trituroimalla eetterillä.

Ac-Phe-booriArg-C10H16·bentseenisulfonihappo valmistettiin käsittelemällä Ac-Phe-booriOrn-C10H16*bentseenisul-fonihappoa (2,0 g, 3,26 mmol) 10 ml:11a syanamidiliuosta 30 (100 mg/ml) etanolissa. Käytettiin esimerkin 5 guanidaa- tiomenetelmää, paitsi että reaktioaika oli kolme vuorokautta ja reaktioseos sisälsi lähtömateriaalin ja tuotteen seoksen. Tämä vaati lisäpuhdistusvaiheen, mikä luultavimmin olisi voitu eliminoida pidemmällä reaktioajalla. 35 Liuos konsentroitiin ja kromatografoitiin 2,5 x 100 cm:n LH-20-pylväässä metanolissa. Halutun, Sakaguchi-värillä 97297 49 detektoidun tuotteen sisältävät fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin saannoksi 1,4 g. Tuloksena syntynyt materiaali (1,2 g) liuotettiin 6 ml:aan etikka-happoa ja laimennettiin 30 ml:11a vettä, jolloin saatiin 5 maitomainen liuos. Se ajettiin 30 ml:n SP-Sephadex™ C-25 (H*-muodossa) pylvääseen, joka oli tasapainotettu 20-%:isella vesipohjaisella etlkkahapolla. Pylväs pestiin 240 ml:11a 20-%:ista etikkahappoa, ja sitten ajettiin lineaarinen gradientti 250 ml 20-%:inen etlkkahappo - 250 ml 10 20-%:inen etlkkahappo, joka sisälsi 0,30 N suolahappoa.

Pylväästä eluoidut 0,12 N - 0,16 N -vetykloridifraktiot yhdistettiin, jolloin saatiin 0,42 g haluttua peptidiä vapaan boorihapon ja pinaanidiollesterin seoksena. Seos liuotettiin metanoliin (10 ml) ja lisättiin 80 mg pinaani-15 diolia, jotta saatiin esteröityä vapaa boorihappo. 30 minuutin sekoituksen jälkeen liuotin haihdutettiin ja jäännös trituroitiin eetterillä, jolloin saatiin 0,28 g haluttua tuotetta.

C26H40N5O4B · HC1 · 2H20: n analyysi: 20 Laskettu: C - 54,78 %, H - 8,15 %, N - 12,30 % ja B - 1,90 %.

Havaittu: C - 55,34 %, H = 7,83 %, N = 11,66 % ja B = 1,99 %.

C26H40N5O4B:n MS(FAB): 25 Laskettu: +H: 498,32 Havaittu: 498,31

Esimerkki 10

Ac-(D, L)Phe-(D, L)booriArg-C6H12 Välimuoto Ac- (D, L)Phe-(D, L) -NH-CH[ (CH2 )3Br] B02C2H12 30 valmistettiin esimerkkien Ib ja 2 menetelmien modifikaa-; tiolla. Ac-Phe-0H:n happokloridi valmistettiin antamalla

Ac-Phe-0H:n (30 g, 0,145 mol) reagoida fosforipentaklori-din (30 g, 0,144 mol) kanssa 175 ml:ssa THF:a -10 °C:ssa. Reaktiota sekoitettiin O °C:ssa noin 1 tunti, sitten lai-35 mennettiin 350 ml:ksi kylmällä eetterillä. Tuote eristettiin kiinteänä aineena, pestiin kylmällä eetterillä ja 97297 50 kuivattiin vakuumissa saannon ollessa 21 g. Aktivoitu Ac-Phe johdannainen (14,8 g, 65,6 nunol) liuotettiin 40 ml:aan THF:a, ja se lisättiin 4-bromi-l-klorobutyyliboronaattipi-nakolin ja heksametyylidisilatsaanin (valmistettu 20 mil-5 limoolin mittakaavassa) reaktiotuotteeseen -78 °C:ssa. Reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitten sekoitettiin yön yli. Liuotin poistettiin haihduttamalla. Jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja pestiin peräkkäin vedellä, 5-%:isella natriumbikarbonaattiliuok-10 sella ja kyllästetyllä vesipohjaisella natriumkloridilla. Tuloksena syntyneen seoksen orgaaninen faasi kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla ja konsentroitiin, jolloin saatiin haluttu tuote kiteisenä kiinteänä aineena (1,37 g, sp. 146,5 - 148 °C). Erillisessä kokeessa saatiin seuraava 15 analyysi.

C21H32N204BrB:n analyysi:

Laskettu: C * 53,98 %, H = 6,92 %, N = 6,00 %, Br = 17,10 % ja B = 2,31 %.

Havaittu: C - 54,54 %, H = 6,78 %, N = 5,89 %, Br * 20 16,46 ja B - 3,40 %.

Alkyylibromidi muutettiin vastaavaksi atsidiksi esimerkin 3 menetelmällä. Tuote kiteytettiin etyyliasetaatista (sp. 143 - 144 eC).

C21H32N504B:n analyysi: 25 Laskettu: C - 58,74 %, H - 7,53 %, N = 16,31 % ja B - 2,53 %.

Havaittu: C = 58,85 %, H « 7,48 %, N = 16,53 % ja B * 2,93 %.

Atsidi muutettiin Ac-(D,L)Phe-(D,L)boori0rn-30 C6H12*bentseenisulfonihapoksi esimerkin 4 menetelmällä paitsi, että hydraus suoritettiin ilmakehän paineessa.

Ac- (D, L )Phe- (D, L )boori0m-C6H12 · bentseenisulfonihap-po (0,243 g, 0,433 mmol) saatettiin reagoimaan sulfoniha-pon (0,020 g, 0,476 mmol) kanssa 100 °C:ssa 2 ml:ssa abso-35 luuttista etanolia yön yli. Liuos konsentroitiin ja tritu-roitiin eetterillä, jolloin saatiin 0,21 g valkoista kiin- 97297 51 teää ainetta. Aineen RP-TLC osoitti luonteenomaisen juovan, joka värjäytyy positiivisesti Sakaguchi-värillä boo-riarginiinipeptideillä, Rf 0,68, mikä vastaa reagoimatonta lähtömateriaalia. Tuote (81 mg) saatettiin reagoimaan 5 2 ml:n kanssa syanamidia (10 mg/ml) yli yön edellä kuva tulla menetelmällä, jolloin eetterillä trituroinnin Jälkeen saatiin 71 mg tuotetta.

C22H37N504B:n MS(FAB):

Laskettu: +H: 446,30 10 Havaittu: 446,23 ja 404,19 (vastaa reagoimatonta booriOrn-peptidiä).

Huomaa, että esimerkin 5 menetelmä on parempi menetelmä booriarginiinipeptidien valmistuksessa ja eroaa siinä, että siinä käytetään suurempaa syanamidiylimäärää ja 15 pidempiä reaktioaikoja.

Esimerkki 11

Boc- (D) Phe-Phe-booriArg-C10H16 · bentseenisulfonihappo Boc-(D)Phe-Phe-OH valmistettiin menetelmällä, joka on kuvattu Boc-(D)Phe-Pro-OH:lle esimerkissä 2. Bentsyyli-20 esterin hydrauksen jälkeen materiaali kiteytyi kloroformi :heksaanista antaen halutun peptidin (sp. 133 - 133,5 eC).

C23H2eN205:n analyysi:

Laskettu: C * 66,96 %, H = 6,86 % ja N * 6,79 %.

25 Havaittu: C - 66,75 %, H = 6,79 % ja N * 6,56 %.

Boc-(D)Phe-Phe-NH-CH[(CH2)3Br]BO2-C10H16 valmistettiin liittämällä Boc-(D)Phe-Phe-OH (6,00 g, 14,5 mmol) yhdisteeseen NH2-CH[(CH2)3Br]BO2-C10H16*HCl (esimerkki la, 5,33 g, 14,5 mol) käyttäen esimerkissä 2 kuvattua menetel-30 mää, paitsi että LH-20-kromatografiavaihe jätettiin pois. Tuote kiteytyi etyyliasetaatista antaen saannoksi 2,47 g (sp. 132 - 134 °C) ensimmäisessä keräyksessä ja 5,05 g (sp. 133 - 135 eC) toisessa keräyksessä. RP-TLC metano-li:vedessä (85:15) osoitti yhden täplän, jonka Rf oli 35 0,29.

C37H51N306BrB: n analyysi: • 97297 52

Laskettu: C - 61,32 %, H - 7,11 %, N - 5,80 % ja Br - 11,03 %.

Havaittu: C - 61,21 %, H - 7,02 %, N - 5,59 % ja Br - 10,22 %.

5 Boc-(D)Phe-Phe-CH[(CH2)3N3]B02-C10H16 valmistettiin käsittelemällä vastaavaa alkyylibromidia (7,15 g, 9,87 mol) natriumatsidilla käyttäen esimerkin 3 menetelmää, paitsi että LH-20-kromatografiavaihetta ei tarvittu puhdistukseen. Tuote ilmaantui näkyviin etyyliasetaat-10 ti:heksaaniliuoksesta geelinä, ja se eristettiin ja pestiin heksaanilla, jolloin saatiin saannoksi 3,0 g ensimmäisessä keräyksessä ja 2,9 g toisessa keräyksessä.

Boc- (D )Phe-Phe-booriOrn-C10H16 · bentseenisulfonihap-po valmistettiin atsidista (5,37 g, 7,82 mmol) esimerkin 15 4 menetelmällä, jolloin saatiin 5,33 g. RP-TLC metano- li:vedessä (85:15) osoitti vahvan, ninhydriinipositiivisen täplän, jonka Rf oli 0,42, ja heikon ultraviolettivalo (UV)-täplän, jonka Rf oli 0,92. (UV-täplä Rf:llä 0,92 on tyypillinen amiineilla tai guanidinoyhdisteillä, jotka 20 ovat bentseenisulfonihapposuoloja).

C37H53N406B: n MS(FAB):

Laskettu +H: 661,76 Havaittu: 661,14

Boc-(D)Phe-Phe-booriArg-C10H16 saatiin esimerkin 5 25 menetelmällä. Booriornitiinipeptidiä (4,83 g, 5,90 mmol) 4 käsiteltiin syanamidilla (50 mg/ml) 20 ml:ssa absoluuttista etanolia seitsemän vuorokautta. 1,0 g:aa lähtömateriaalia vastaava osa reaktioseoksesta otettiin eroon ja kuumennettiin erikseen takaisinvirtauskondensoijan poissa ol-30 lessa yön yli, jotta saatiin amiini muuttumaan täydellisesti guanidinoyhdisteeksi. LH-20-kromatografian ja tuotteen eetteritrituraation jälkeen saatiin 0,52 g haluttua tuotetta.

C44H61N609SB:n analyysi: 35 Laskettu: C - 61,38 %, H - 7,16 %, N = 9,76 % ja B - 1,25 %.

il 1 »»'t imi I H M : : - 97297 53

Havaittu: C* 59,69%, H - 7,41 %, N*9,82%jaB- 1,26 %.

C3eH55N606B:n MS(FAB):

Laskettu +H: 703,43.

5 Havaittu: 703,49.

Esimerkki 12 H- (D )Phe-Phe-booriArg-C10H16 · 2HC1

Boc (D) Phe-Phe-booriArg-C10H16 · bentseenisul f onihaposta (esimerkki 11, 0,59 g, 1,25 mol) poistettiin suojaryhmä 10 esimerkin 6 menetelmällä, paitsi että näyte ajettiin ioninvaihtopylvääseen 20-%:isessa etanolissa ja pylväs eluoitiin 20-%:isella etanolilla. Tuote (0,424 g) saatiin valkoisena kiinteänä aineena.

C33H47N604B:n MS(FAB): 15 Laskettu +H: 603,38.

Havaittu: 603,41.

Esimerkki 13

Ac-Ala-Lys( Boc) -booriArg-C10H16 · bentseenisul f onihappo Ac-Ala-Lys(Boc)-0H valmistettiin liittämällä Ac-20 Ala-0H:n N-hydroksisukkinimldiesteri, joka valmistettiin menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Anderson et ai., J. Am. Chem. Soc. 86: 1 839 (1964), yhdisteeseen H-Lys(Boc)-0H. Ac-AlaOH:n N-hydroksisukkinimidi (6,25 g, 27,4 mmol) liuotettiin 30 ml:aan dioksaania, ja liuos lisättiin H-Lys-25 (Boc)-OH-liuokseen (7,50 g, 30,4 mmol), joka oli liuotettu 30 ml 1,0 N natriumhydroksidia ja trietyyliamiinia (2,12 ml, 15,0 mmol) sisältävään liuokseen. Reaktioseosta sekoitettiin yli yön ja tehtiin sitten happamaksi suolahapolla. Lisättiin sopivasti kuivaa natriumkloridia niin, 30 että liuos lähes kyllästyi. Tuote uutettiin etyyliasetaattiin ja pestiin 0,2 N suolahapolla, joka oli valmistettu kyllästettyyn vesipohjaiseen natriumkloridiin. Orgaaninen faasi kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin yllä ja suodatettiin. Liuotin poistettiin haihduttamalla. Tuote ki-35 teytettiin etyyliasetaatti:heksaanista, jolloin saatiin saannoksi 7,3 g (sp. 86 - 89 °C).

- 97297 54

Ac-Ala-Lys(Boc) -NH-CH[ (CH2 )3Br ] BO2-C10H16 valmistettiin esimerkin 2 menetelmällä, paitsi että tuote puhdistettiin f rationaalisella kiteytyksellä etyyliasetaatista. Toisella ja kolmannella keräyksellä saatu tuote (1,13 g) 5 osoitti RP-TLC:ssa metanoli:vedessä (85:15) yhden täplän, jonka Rf oli 0,51. TLC-levy altistettiin suolahappohöy-ryille, jolloin tuloksena syntynyt amiini havaittiin nin-hydriinivärin lisäyksen jälkeen.

Ac-Ala-Lys( Boc) -NH-CH [ (CH2 )3N3] B02-C10Hl6 valmistet-10 tiin vastaavasta alkyylibromidista (1,95 g, 2,90 mmol) esimerkin 3 menetelmällä, paitsi että tuote puhdistettiin kiteyttämällä se etyyliasetaatista eikä LH-20-kromatogra-fiällä. Raakatuote (1,60 g) kiteytyi antaen saannoksi 0,55 g (sp. 79 - 84 °C) ja 0,96 g jäännöstä. Kiteisen 15 tuotteen analyysi on seuraavana.

C3oH52N7°7B:n analyysi:

Laskettu: C - 56,86 %, H - 8,29 %, N = 15,48 % ja B - 1,71 %.

Havaittu: C «= 56,76 %, H = 8,26 %, N = 15,89 % ja B « 20 1,65 %.

Ac-Ala- Lys (Boc) -booriOm-C10H16 · bentseenisulfonihappo valmistettiin vastaavasta alkyyliatsidista (0,433 g, 0,683 mmol) käyttäen esimerkissä 4 kuvattua menetelmää. Katalyytti ja liuotin poistettiin, minkä jälkeen tuote 25 (0,45 g) saatiin trituroimalla eetterillä.

C3oH54N507B:n MS(FAB):

Laskettu +H: 608,42.

Havaittu: 608,49.

Ac-Ala-Lys( Boc) -booriArg-C10H16 · bentseenisulf onihappo 30 valmistettiin antamalla vastaavan booriornitiinipeptidin reagoida syanamidin kanssa käyttäen esimerkissä 5 kuvattua menetelmää. Halutun tuotteen sisältävät kromatografiafrak-tiot trituroitiin eetterillä, jolloin saatiin saannoksi 0,83 g valkoista kiinteää ainetta.

35 C37H62N7010BS:n analyysi: . 97297 55

Laskettu: C - 55,00 %, H - 7,75 %, N - 12,14 % ja B - 1.34 %.

Havaittu: C - 54,09 %, H - 7,53 %, N - 12,22 % ja B - 1.34 %.

5 Esimerkki 14

Ac-Ala-Lys-booriArg-C10H16 · 2HC1

Ac-Ala-Lys (Boc) -booriArg-C10H16 · bentseenisulf oniha-posta (0,200 g, 0,248 mmol) poistettiin suojaryhmät esimerkin 6 menetelmällä. Ioninvaihdon, liuottimen haihdutuk-10 sen, vakuumikuivatuksen ja eetteritrituraation jälkeen saatiin 0,14 g materiaalia.

C26H48N705B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 550,39.

Havaittu: 550,42.

15 Esimerkki 15

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-booriArg-C10H16 · bentseenisulfoni- happo

Boc-Leu-Ala-OBzl valmistettiin esimerkin 2 dipepti-disynteesimenetelmällä. Boc-Leu-Ala-OBzl (23,7 g, 20 57,7 mmol) liuotettiin 40 ml:aan vedetöntä trifluorietik- kahappoa. 15 minuutin kuluttua ylimääräinen trifluorietik-kahappo poistettiin haihduttamalla, ja jäännöstä käsiteltiin eetterillä, jolloin saatiin H-Leu-Ala-OBzl·trifluori-etikkahappo kiteisenä tuotteena (22,8 g).

25 CieH25N205F3:n analyysi:

Laskettu: C = 53,19 %, H = 6,21 % ja N 6,89 %.

Havaittu: C « 53,37 %, H = 5,68 % ja N = 6,84 %.

Boc-Glu-Leu-Ala-OBzl valmistettiin liittämällä Boc-Gly-OH (5,70 g, 32,6 mmol) yhdisteeseen H-Leu-Ala-OBzl 30 käyttäen esimerkissä 2 kuvattua seka-anhydridimenetelmää.

Tuote (13,8 g) saatiin ei-kiteisenä kiinteänä aineena. Yhdisteestä Boc-Gly-Leu-Ala-OBzl poistettiin suojaryhmä trifluorietikkahapolla H-Leu-Ala-OBzl:n valmistuksessa kuvatulla menetelmällä paitsi, että trifluorietikkahapposuo-35 la oli eetteriin liukeneva. Preparaatti liuotettiin etyy- . 97297 56 liasetaattiin, ja liuosta käsiteltiin vedettömällä suolahapolla. Syntynyt tuote saostettiin eetterilisäyksellä H-Gly-Leu-Ala-OBzl«HCl:n saannon ollessa 7,7 g ensimmäisessä keräyksessä.

5 Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-OBzl valmistettiin liittämällä

Boc-Leu-OH (2,62 g, 10,5 mmol) yhdisteeseen H-Gly-Leu-Ala-OBzl käyttäen esimerkissä 2 kuvattua seka-anhydridimene-telmää. Syntynyt tuote kiteytettiin etyyliasetaatti:hek-saanista, jolloin saatiin ensimmäisestä keräyksestä saan-10 noksi 2,7 g (sp. 95 - 96 °C).

C29H46N407:n analyysi:

Laskettu: C - 61,89 %, H - 8,26 % ja N = 9,96 %.

Havaittu: C * 62,00 %, H 8,40 % ja N = 9,83 %.

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-OH valmistettiin bentsyylies-15 terin (2,6 g, 4,62 nunol) katalyyttisellä hydrauksella esimerkissä 2 kuvatulla menetelmällä, jolloin saatiin saannoksi 2,1 g. Syntynyt tuote kiteytettiin kuumasta etyyliasetaatista, jolloin saatiin saannoksi 1,4 g.

C22H4oN4°7;n analyysi: 20 Laskettu: C - 55,90 %, H - 8,55 % ja N - 11,86 %.

Havaittu: C - 55,42 %, H - 8,47 % ja N = 11,73 %.

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-NH-CH( (CH2)3Br )B02-C10H16 valmistettiin liittämällä Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-OH (1,40 g, 2,96 mmol) esimerkin la amiiniin. Tämä tehtiin käyttäen 25 esimerkin 2 menetelmää, paitsi että kromatografiavaihe jätettiin pois. Tuote kiteytyi etyyliasetaatti:heksaanista antaen saannoksi 1,17 g. TLC metanoli:kloroformissa (1:9) osoitti yhden täplän, jonka Rf oli 0,68. c36H63N5°8BrB: n analyysi: 30 Laskettu: C - 55,10 %, H - 8,11 %, N - 8,93 % ja B - 1,38 %.

Havaittu: C = 55,96 %, H - 8,30 %, N = 8,74 % ja B « 1,33 %.

Vastaava atsidi valmistettiin esimerkissä 3 kuva-35 tulla menetelmällä saannon ollessa 97 %, ja se muutettiin 97297 57 yhdisteeksi Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-booriOrn-C10Hl6 esimerkissä 4 kuvatulla menetelmällä. Valmistettiin analyyttinen näyte seostamalla tuote eetterillä ja sitten kromatografoimalla se LH-20:lla ja saostamalla se kloroformista heksaanilla.

5 C36H65N608B: n MS(FAB):

Laskettu + H: 721,50.

Havaittu: 721,55.

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-booriArg-C10H16 · bentseenisulfoni-happo valmistettiin esimerkissä 5 kuvatulla menetelmällä. 10 Vastaavan booriornitiinipeptidin (0,695 g, 0,791 mmol) annettiin reagoida 5 ml:n syanamidiliuoksen (50 mg/ml) kanssa absoluuttisessa etanolissa. Yllä oleva seos kroma-tografoitiin ja trituroitiin eetterillä, jolloin saatiin 0,41 g haluttua tuotetta.

15 C37H67Na08B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 763,53.

Havaittu: 763,8.

Esimerkki 16 H-Leu-Gly-Leu-Ala-booriArg-C10H16*HCl »bentseenisulfo- 20 nihappo

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-booriArg-C10Hu · bentseenisulf oni-hapon (esimerkki 15, 0,050 g, 0,0543 mmol) annettiin reagoida 2 ml:n kanssa 4 N suolahappoa dioksaanissa viisi minuuttia huoneen lämpötilassa. Liuotin ja ylimääräinen 25 suolahappo poistettiin haihduttamalla. Näyte kuivattiin kaliumhydroksilla vakuumissa yön yli ja trituroitiin sitten eetterillä, jolloin saatiin tuote (46 mg) sekasuolana. C32H59N806B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 663,47.

30 Havaittu: 663,50.

Esimerkki 17

Bz-Glu(0Bu )-Gly-booriArg-C10H16*bentseenisulfonihappo

Bz-Glu(OBu)-Gly-NH-CH[(CH2)3Br]BO2-C10H16 valmistettiin liittämällä Bz-Glu(0Bu)-Gly-0H amiiniin esimerkissä 2 35 kuvatun menetelmän mukaisesti. Vastaava atsidi valmistet- 97297 58 tiin esimerkissä 3 kuvatulla menetelmällä, ja booriorni-tiinipeptidi valmistettiin esimerkissä 4 kuvatulla menetelmällä.

C32H49N«°7B:n MS(FAB): 5 Laskettu + H: 613,38.

Havaittu: 613,60.

Lopullinen tuote saatiin esimerkissä 5 kuvatulla menetelmällä.

C33H5iN607B:n MS(FAB): 10 Laskettu + H: 655,40.

Havaittu: 655,37.

C39H57N60 10SB:n analyysi:

Laskettu: C - 57,62 %, H = 7,08 %, N = 10,34 % ja B = 1,33 %.

15 Havaittu: C - 57,43 %, H = 7,25 %, N * 9,91 % ja B - 1,23 %.

Esimerkki 18

Bz-Glu-Gly-booriArg-C10H16 · bentseenisulf onihappo Bz-Glu (OBu) -Gly-booriArg-C10H16 · bentseenisulf onihappo 20 (0,13 g, 0,16 mmol) liuotettiin 5 ml:aan dioksaa- nia, lisättiin bentseenisulfonihappoa (0,10 g, 0,66 mmol), ja liuosta sekoitettiin yön yli huoneen lämpötilassa. Sitten liuos konsentroitiin noin 1 ml:ksi haihduttamalla, minkä jälkeen se trituroitiin eetterillä, jolloin saatiin . 25 kiin-eää ainetta (0,14 g). Materiaali kromatografoitiin 2,5 x 50 cm:n LH-20-pylväässä metanolissa. Halutun tuotteen sisältävät fraktiot haihdutettiin, ja jäännös trituroitiin eetterillä, jolloin saatiin 53 mg haluttua tuotetta.

30 C29H43N607B: n MS(FAB):

Laskettu + H: 599,34.

Havaittu: 599,35 + 613,36 (tunnistamaton).

Esimerkki 18a

Bz-Glu-Gly-booriArg-C10H16 · bentseenisulf onihappo 35 Bz-Glu( OBu) -Gly-booriArg-C10H16 · bentseenisulfonihap poa (esimerkki 17, 0,20 g, 0,246 mmol) käsiteltiin vedet- 97297 59 tömällä suolahapolla esimerkissä 6 kuvatulla menetelmällä 45 minuuttia. Materiaalin eetteritrituraatlon jälkeen NMR osoitti, että noin 30 % t-butyylisuojaryhmistä oli edelleen jäljellä. Tuotteen annettiin sitten reagoida vedettö-5 män TFA:n kanssa 45 minuuttia huoneen lämpötilassa. TFA poistettiin haihduttamalla, ja jäännös trituroitiin eetterillä, jolloin saatiin saannoksi 143 mg.

C29H43N607B:n MS (F AB):

Laskettu + H: 599,34.

10 Havaittu: 599,35.

Esimerkki 19

Bz-Pro-Phe-booriArg-C10H16 · bentseenisulf onihappo Bz-Pro-Phe-OH (sp. 200 - 201 °C) valmistettiin esimerkissä 2 kuvatulla dipeptidisynteesiin käytetyllä mene-15 telmällä.

C21H22N204:n analyysi:

Laskettu: C = 68,82 %, H = 6,06 % ja N 7,65 %.

Havaittu: C 68,91 %, H - 6,09 % ja N 7,47 %.

Bz-Pro-Phe-NH-CH[ (CH2 )3Br]B02-C10H16 valmistettiin 20 liittämällä Bz-Pro-Phe-OH amiiniin käyttäen esimerkissä 2 kuvattua yleistä menetelmää paitsi, että kromatografiavai-he jätettiin pois. TLC metanoli:kloroformissa (1:9) osoitti päätäplän Rf-arvolla 0,72 ja jäljen Rf-arvolla 0,86. C35H45N305BBr: n MS (FAB): 25 Laskettu + H: 678,27.

Havaittu: 677,95.

Alkyylihalogenidi muutettiin atsidiksi ja boorior-nitiinipeptidiksi menetelmillä, jotka on kuvattu esimer keissä 3 ja 4.

30 (Bz-Pro-Phe-booriOrn-C10H16)C35H47N405B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 615,37.

Havaittu: 615,42.

Bz-Pro-Phe-booriArg-C16H16 · bentseenisulf onihappo valmistettiin esimerkissä 5 kuvatulla menetelmällä.

35 C36H49N605B: n MS (FAB): 97297 60

Laskettu + H: 657,39.

Havaittu: 657,13.

C42H55N608SB: n analyys i:

Laskettu: C - 61,90 %, H - 6,82 %, N - 10,31 % ja B = 5 1,33 %.

Havaittu: C - 60,16 %, H = 7,27 %, N - 9,79 % ja B = 1,44 %.

Esimerkki 20

Bz-Pro-Phe-booriArg-OH·HCl 10 Bz-Pro-Phe-boor iArg-C10H16 · bentseenisulf onihappo (esimerkin 19 yhdiste, 0,64 g, 0,79 mmol) liuotettiin 4 ml:aan metyleenikloridia Ja jäähdytettiin -78 °C:een. Se lisättiin kulvajäissä olevaan pulloon, joka sisälsi 4 ml 0,50 N booritrikloridia, joka oli valmistettu laimentamal-15 la 1,0 N booritrikloridi (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) 50-%:iseksi kuivalla metyleenikloridilla. Liuosta sekoitettiin viisi minuuttia -78 eC:ssa, sitten pullo siirrettiin 0 °C:een jäähauteeseen, jossa liuosta sekoitettiin 15 minuuttia. Lisättiin hitaasti kylmää vettä (5 ml), sit-20 ten liuos laimennettiin 120 ml:ksi 20-%:isella etikkaha-polla. Eronnut orgaaninen faasi poistettiin ja hylättiin. Vesifaasi ajettiin 20 ml:n SP-Sephadex™ -pylvääseen, joka oli tasapainotettu 20-%:isella etikkahapolla. Pylvästä pestiin noin 150 ml:11a 20-%:isella etikkahappoa, sitten 25 ajettiin lineaarinen gradientti 200 ml 20-%:inen etikka-happo - 200 ml 20-%:inen etikkahappo, joka oli 0,30 N suolahapon suhteen. Tuote eluoitui, kun suolahapon konsent-raatio oli 0,08 ja 0,15 N välissä. Haluttu tuote (0,19 g) saatiin liuottimen haihdutuksen, jäännöksen vakuumikuiva-30 tuksen ja eetteritrituraation jälkeen.

C26H35N605B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 523,29.

Havaittu: 579,34 (tunnistamaton).

C26H36N605C1B: n analyysi: 35 Laskettu: C - 53,29 %, H = 6,55 %, N = 14,34 % ja B = 1,84 %.

- 97297 61

Havaittu: C - 53,27 %, H - 6,58 %, N - 13,25 % ja B - I, 89 %.

Tuotteen esteröinti pinaanidiolilla, kuten on kuvattu esimerkissä 8a, antoi tuotteen, jonka NMR- ja MS-5 ominaisuudet olivat yhdenmukaisia esimerkin 19 lähtöeste-rille.

C36H49N605B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 657,40.

Havaittu: 657,39.

10 Esimerkki 21

Bz-Pro-Phe-booriArg-F*vetykloridi Bz-Pro-Phe-NH-CH [ (CH2) 3NH-C (NH )NH2]BF2 · HC1 Bz-Pro-Phe-booriArg-F valmistettiin Kinder et ai., J. Med. Chem. 28: 1 917 - 1 925 (1985) kuvaaman menetelmän 15 modifikaatiolla. Vapaa boorihappo (esimerkin 20 yhdiste, 0,100 g, 0,179 mmol) liuotettiin 2 ml:aan vettä. Siihen lisättiin 0,040 ml 48-%:ista fluorivetyhappoa huoneen lämpötilassa. Lähes heti muodostui kumimainen saostuma. Reaktiota sekoitettiin kymmenen minuuttia, sitten seos jäädy-20 tettiin, ja ylimääräinen fluorivetyhappo ja vesi poistettiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin metanoliin, konsentroitiin ja trituroitiin eetterillä. Saatiin 0,093 g saanto.

C26H33N603BF2: n MS (FAB): 25 Laskettu + H: 527,29.

Havaittu: 527,31 ja lisäksi vapaalle boorihapolle ominaisia massa-arvoja.

C26H34N603BF2C1 ·H20:n analyysi:

Laskettu: C = 53,47 %, H - 6,25 %, N = 14,47 %, B - 1,86 % 30 ja F - 6,54 %.

Havaittu: C - 54,00 %, H - 6,40 %, N - 13,48 %, B - 1,95 % ja F = 7,06 %.

Esimerkki 22

Boc- (D) Phe-Pro-booriIrg-C10H16 ♦ HBr 35 Boorilrg- on lyhennys ryhmälle -NH-CH[(CH2)3S- C(NH)NH2]B02, jossa isotiouroniryhmä korvaa booriarginiinin - 97297 62 guanldinoryhmän. Boc- (D) Phe-Pro-NH-CH [ (CH2 )Br ] BO2-C10H16 (esimerkin 2 yhdiste, 1,00 g, 1,61 mmol) liuotettiin 4 ml:aan absoluuttista etanolia ja lisättiin tioureaa (0,37 g, 4,82 mmol). Seosta sekoitettiin yön yli huoneen 5 lämpötilassa. Liuos konsentroitiin, ja jäännös trituroi-tiin eetterillä, jolloin saatiin 0,58 g kiinteää ainetta. Syntynyt kiinteä aine kromatografoitiin 2,5 x 50 cm:n LH-20-pylväässä metanolissa. Halutun tuotteen sisältämät yhdistetyt fraktiot haihdutettiin, jolloin saatiin 0,26 g 10 tuotetta. Näyte trituroitiin eetterillä, jolloin saatiin 0,150 g ei-kiteistä kiinteää ainetta.

C34H53N506BS: n MS (FAB):

Laskettu + H: 670,38.

Havaittu: 670,39.

15 C34H53N506SBrB:n analyysi:

Laskettu: C - 54,40 %, H - 7,13 %, N - 9,33 % ja B « 1,44%.

Havaittu: C * 54,10 %, H « 7,39 %, N = 9,27 % ja B - 1,47 %.

20 Tästä reaktiosta saatu eetteriin liukeneva jäännös sisälsi pääasiassa lähtömateriaalia, joka muuttui isotio-uronisuolaksi pidemmillä reaktioajoilla.

Tätä yleismenetelmää käytettiin valmistettaessa muut isotiouronisuolat, paitsi joissain tapauksissa käy-25 tettiin nelinkertaista tioureaylimäärää ja 3 - 4 vuorokauden reaktioaikoja.

Esimerkki 23 H- (D )Phe-Pro-booriIrg-C10H16 · HBr, HC1 Yhdisteen Boc- (D )Phe-Pro-booriIrg-C10H16 · HBr (esimer-30 kin 22 yhdiste, 0,050 g, 0,067 mmol) annettiin reagoida 1 ml:n kanssa 4 N suolahappoa dioksaanissa 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Liuotin haihdutettiin, ja jäännös trituroitiin eetterillä, jolloin saatiin saannoksi 0,040 g valkoista kiinteää ainetta.

35 C29H45N504SB:n MS (FAB): 63 97297

Laskettu + H: 571,29.

Havaittu: 570,47.

Esimerkki 24

Ac-Ala-Lys (Boc) -booriIrg-C10H16 · HBr 5 Yhdisteen Ac-Ala-Lys(Boc)-NH-CH[(CH2)3Br]B02-C10H16 (esimerkistä 13, 0,700 g, 1,04 mmol) annettiin reagoida tiourean (0,320 g, 4,00 mmol) kanssa neljä vuorokautta 4 ml:ssa absoluuttista etanolia. Tuote puhdistettiin esimerkissä 22 kuvatulla menetelmällä. Kromatografian jälkeen 10 saatiin 0,28 g haluttua tuotetta. Eetteritrituraatio antoi 0,173 g tuotetta ei-kiteisenä valkoisena kiinteänä aineena.

C3iH55N607SB : n MS ( FAB):

Laskettu + H: 667,8.

15 Havaittu: 667.

C3iH56N607SBrB: n analyysi:

Laskettu: C = 49,79 %, H = 7,56 %, N - 11,24 % ja B - 1,44 %.

Havaittu: C - 49,20 %, H - 7,62 %, N = 11,31 % ja B * 20 1,36 %.

Esimerkki 25

Ac-Ala-Lys-boorilrg- C10H16 · 2HBr

Ac-Ala-Lys (Boc )-booriIrg-C10H16· HBr (esimerkin 24 yhdiste, 0,050 g, 0,067 mmol) liuotettiin 1 ml:aan metano- . 25 lia, ja vetybromidikaasun annettiin kuplia liuoksen läpi • * kymmenen minuuttia. Liuotin poistettiin haihduttamalla, ja jäännös trituroitiin eetterillä, jolloin saatiin haluttu tuote kiinteänä aineena (49 mg).

C36H47N605SB:n MS (FAB): 30 Laskettu + H: 567,35.

Havaittu: 567,41.

Esimerkki 26

Ac-Phe-booriIrg- C10H16.HBr

Yhdisteen Ac-Phe-NH-CH [ (CH2 )3Br] BO2-C10H16 (esimer-35 kistä 9, 1,00 g, 2,41 mmol) annettiin reagoida kolminker- « 97297 64 täisessä ylimäärässä tioureaa 5 ml:ssa absoluuttista etanolia seuraten esimerkissä 22 kuvattua menetelmää. Tuote (0,284 g) saatiin valkoisena, ei-kiteisenä kiinteänä aineena. Tuotetta saatiin lisää antamalla minkä tahansa jäl-5 jellä olevan eetteriliukoisen materiaalin reagoida uudes taan tiourean kanssa ja toistamalla puhdistusmenetelmä. C26H39N4°4SB:n MS(FAB):

Laskettu + H: 515,29.

Havaittu: 515,29.

10 C26H39N404SB:n analyysi:

Laskettu: C - 52,44 %, H = 6,79 %, N - 9,41 % ja B = 1,82 %.

Havaittu: C = 52,83 %, H - 6,89 %, N = 8,47 % ja B = 1,85 %.

15 Esimerkki 27

Bz-Pro-Phe-booriIrg-C10H16 · HBr

Yhdistettä Bz-Pro-Phe-NH-CH[(CH2)3Br]B02-C10H16 (esimerkin 19 tuote, 0,500 g, 0,737 mmol) käytettiin tämän esimerkin tuotteen valmistamiseen seuraten esimerkissä 22 20 kuvattua menetelmää. Tuote (0,358 g) saatiin valkoisena kiinteänä aineena. c36H4eN5°5SB:n MS(FAB):

Laskettu + H: 674,35.

Havaittu: 674,27.

25 C36H49N505SBBr:n analyysi:

Laskettu: C « 57,29 *, H - 6,56 t, N = 9,28 % ja B = 1,43 %.

Havaittu: C - 57,46 %, H *= 6,45 %, N = 8,78 % ja B « 1,38 %.

30 Esimerkki 28

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-booriIrg-C10H16*HBr Yhdistettä Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-NH-CH[(CH2)3Br]B02-Ci0H16 (esimerkin 15 tuote, 0,770 g, 0,980 mmol) käytettiin tämän esimerkin isotiouronianalogin valmistukseen käyttäen 35 esimerkissä 22 kuvattua menetelmää. Reaktiotuotteiden kro- 97297 65 matografian jälkeen lopputuote (0,400 g) saatiin valkoisena kiinteänä aineena heksaanilla trituroimalla. C37H66N7°eSB:n MS(FAB):

Laskettu + H: 780,48.

5 Havaittu: 780,52.

C37H67N50eSBrB:n analyysi:

Laskettu: C = 51,62 %, H - 7,86 %, N - 11,39 % ja B = 1,26 %.

Havaittu: C - 51,03 %, H - 7,86 %, N - 11,14 % ja B = 10 1,18 %.

Esimerkki 29 H-Leu-Gly-Leu-Ala-booriIrg-C10H16 · 2HBr Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-booriIrg-C10H16·HBr (esimerkin 28 yhdiste, 0,100 g, 0,12 mmol) liuotettiin 1 ml:aan meta-15 nolla, ja liuokseen lisättiin 1 ml 0,7 N vetybromidia me-tyleenikloridissä. Seosta sekoitettiin 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Liuotin ja ylimääräinen vetybromidi poistettiin haihduttamalla, ja jäännös trituroitiin eetterillä, jolloin saatiin haluttu tuote lähes kvantitatiivi-20 sella saannolla.

C32H5eN706SB:n MS(FAB):

Laskettu + H: 680,43.

Havaittu: 680,50.

Esimerkki 30 25 Bz-Glu(OBu)-Gly-booriIrg-C10Hl6*HBr

Yhdistettä Bz-Glu(OBu) -Gly-NH[ (CH2 )3Br ] BO2-C10H16 (esimerkin 17 tuote, 0,293 g, 0,433 mmol) käytettiin valmistettaessa isotiouronianalogi (0,220 g) käyttäen esimerkissä 22 kuvattua menetelmää.

30 C33H50N5O7SB: n MS(FAB):

Laskettu + H: 672,36.

Havaittu: 672,3.

C33H5iN5°7SBBr: n analyysi:

Laskettu: C * 52,66 %, H * 6,84 %, N = 9,31 % ja B « 35 1,44 %.

97297 66

Havaittu: C - 52,38 %, H - 6,76 %, N - 8,81 % ja B - 1,46 %.

Esimerkki 31

Bz-Glu-Gly-boorilrg- C10H16 · HBr 5 Bz-Glu(OBu)-Gly-booriIrg-Cl0H16·HBr (esimerkin 30 tuote, 0,050 g, 0,066 mmol) liuotettiin 1 ml:aan TFA:ia ja sekoitettiin 1 tunti huoneen lämpötilassa. Lisättiin vety-bromidia metyleenikloridissa (0,35 mmol) ja syntyneen liuoksen neste haihdutettiin. Jäännös trlturoitiin eette-10 rillä, jolloin saatiin saannoksi 47 mg.

C29H42N507SB: n MS (FAB):

Laskettu + H: 616,30.

Havaittu: 616,34.

Esimerkki 32 15 Boc-( D)Phe-Phe-booriIrg-C10H16«HBr

Yhdistettä Boc-(D)Phe-Phe-NH-CH[(CH2)3Br]B02-C10H16 (esimerkin 11 yhdiste, 1,50 g, 2,07 mmol) käytettiin valmistettaessa isotiouronianalogi (0,90 g) käyttäen esimerkissä 22 kuvattua menetelmää.

20 C38H55N506SB:n MS (FAB):

Laskettu + H: 719,84.

Havaittu: 720.

C38H55N506SBBr: n analyysi:

Laskettu: C * 56,99%, H· 6,94%, N= 8,75 % ja B * 25 1,35 %.

Havaittu: C - 55,89 %, H - 6,87 %, N - 8,59 % ja B -1,18 %.

Esimerkki 33 H- (D) Phe-Phe-booriIrg-C10H16 · 2HBr 30 Yhdisteen Boc-(D)Phe-Phe-booriIrg-C10H16*HBr (esi merkin 20 yhdiste, 0,20 g, 0,25 mmol) annettiin reagoida 4 vetybromidin kanssa esimerkissä 29 kuvatun menetelmän mukaisesti, jolloin 188 mg haluttua tuotetta.

C33H46N504SB:n MS (FAB): 35 Laskettu + H: 620,34.

Havaittu: 620,40.

- 97297 67

Esimerkki 34 Z-Phe-Gly-Gly-booriIrg-C10H16»HBr Z -Phe-Gly-Gly-NH-CH [ (CH2) 3Br ] B02-C10H12 valmistettiin liittämällä Z-Phe-Gly-Gly-OH amiiniin (esimerkki la) käyt-5 tämällä esimerkissä 2 kuvattua menetelmää.

C35H46N407BBr;n analyysi:

Laskettu: C - 57,93 %, H - 6,40 %, N = 7,72 % ja B « 1,49 %.

Havaittu: C - 58,42 %, H - 6,83 %, N - 7,74 % ja B - 10 1,96 %.

Alkyylihalogenidi (1,00 g, 1,38 mmol) muutettiin isotiouronianalogiksl esimerkin 22 menetelmällä, jolloin saatiin tuote (0,87 g) valkoisena, ei-kiteisenä kiinteänä aineena.

15 C36H49N607SB:n MS(FAB):

Laskettu + H: 721,36.

Havaittu: 721,32.

C36H50N6O7SBBr: n analyysi:

Laskettu: C 54,00 %, H - 6,31 %, N = 10,50 % ja B -20 1,35 %.

Havaittu: C - 53,17 %, H - 6,50 %, N - 10,03 % ja B » 1,25 %.

Esimerkki 35

Boc-Ala-Phe- (D, L )booriIrg-C6H12»HBr 25 Boc-Ala-Phe-OMe valmistettiin käyttäen esimerkissä 2 kuvattua seka-anhydridimenetelmää. cieH26N6°7:n analyysi:

Laskettu: C - 61,70 %, H - 7,48 % ja N * 7,99 %.

Havaittu: C - 61,51 %, H ® 7,56 % ja N = 7,92 %.

30 Metyyliesteri hydrolysoitiin emäksellä, jolloin saatiin Boc-Ala-Phe-OH saannolla 56 %. Boc-Ala-Phe-NH- CH[ (CH2 )3Br]B02C6H12 valmistettiin liittämällä Boc-Ala-Phe-OH yhdisteeseen NH2-CH[(CH2)3Br]B02-C6H12«HCl (esimerkki la) käyttäen esimerkissä 2 kuvattua menetelmää paitsi, että 35 LH-20-kromatografiaa ei käytetty.

- 97297 68

Yhdisteen Boc-Ala-Phe-NH-CH [ (CH2)3Br] B02-C6H12 (1,00 g, 1,72 mmol) annettiin reagoida tiourean kanssa käyttäen esimerkissä 22 kuvattua menetelmää, jolloin saatiin isotiouronianalogi (0,485 g) valkoisena kiinteänä 5 aineena.

C2BH46N5°6SB:n MS(FAB):

Laskettu + H: 592,33.

Havaittu: 592,60.

C28H47N506SBBr: n analyysi: 10 Laskettu: C = 50,00 %, H 7,06 %, N * 10,41 % ja B = 1,61 %.

Havaittu: C - 49,50 %, H - 7,24 %, N - 10,22 % ja B - 1,41 %.

Esimerkki 36 15 H-Ala-Phe-(D, L)booriIrg-C6H12*2HBr

Boc-Ala-Phe-booriIrg-C6H12*HBr :n (esimerkki 35, 0,10 g, 0,149 mmol) annettiin reagoida vetybromidin kanssa esimerkissä 29 kuvatulla menetelmällä, jolloin saatiin haluttu tuote lähes kvantitatiivisella saannolla.

20 C23H38N506SB:n MS(FAB):

Laskettu + H: 492,28.

Havaittu: 492,26.

Esimerkki 37

Boc-Ala-Phe- (D, L )boorihomoIrg-C6H12 · HBr 25 Boc-Ala-Phe-NH-CH[ (CH2 )4-S-C( NH )NH2] B02-C6H12 ♦ HBr

Boc-Ala-Phe-OH (esimerkistä 35) liitettiin amiiniin (esimerkki Id), jolloin saatiin Boc-Ala-Phe-NH-CH[ (CH2)4Br]B02-C6H12. Käytettiin esimerkin 2 menetelmää paitsi, että LH-20-kromatografiavaihetta ei tarvittu puh-30 distukseen. Analyyttinen näyte saatiin silikageelikroma- tografiällä käyttäen etyyliasetaattia eluenttina. C28H45N306BrB:n MS(FAB):

Laskettu + H: 610,27.

Havaittu: 610,24.

35 C28H45N306BrB:n analyysi:

• I

97297 69

Laskettu: C - 55,19 %, H - 7,28 %, N - 6,90 %, Br - 13,11 % ja B - 1,78 %.

Havaittu: C - 55,30 %, H - 7,39 t, N - 6,40 %, Br - 12,07 % ja B « 1,95 %.

5 Alkyylibromidin (0,537 g, 0,883 mmol) annettiin reagoida tiourean kanssa käyttäen esimerkin 22 menetelmää. Tuote (0,23 g) saatiin ei-kiteisenä, valkoisena kiinteänä aineena eetteritrituraation jälkeen.

C29H48N506S:n MS(FAB): 10 Laskettu + H: 606,35.

Havaittu: 606,38.

C29H49N5°6SBBr: n analyysi:

Laskettu: C - 50,73 %, H 7,21 %, N - 10,20 % ja B = 1,57 %.

15 Havaittu: C = 50,22 %, H * 7,46 %, N = 9,74 % ja B = 1,55 %.

Esimerkki 38 H-Ala-Phe- (D, L )boorihomoIrg-C6H12 · 2HBr Boc-Ala-Phe-(D, L)boorihomoIrg-C6H12*HBr:n (esimer-20 kin 37 yhdiste, 0,050 g, 0,073 mmol) annettiin reagoida vetybromidin kanssa esimerkissä 29 kuvatulla menetelmällä, jolloin saatiin 44 mg haluttua tuotetta.

C24H40N5O4SB: n MS ( FAB):

Laskettu + H: 506,30.

25 Havaittu: 506,39.

Esimerkki 39

Boc-Ala-Phe- (D, L )booriLys-C6H12 · HC1 Boc-Ala-Phe-NH-CH [ (CH2 )4NH2]B02-C6H12 »bentseenisulfo- nihappo 30 Boc-Ala-Phe-NH-CH [ (CH2 )4Br] B02-C6H12 (esimerkistä 35) muutettiin alkyyliatsidiksi käyttäen esimerkin 3 menetelmää paitsi, että LH-20-kromatografiavaihetta ei tarvittu puhdistukseen. Atsidi hydrattiin käyttäen esimerkissä 4 kuvattua menetelmää paitsi, että käytettiin kahta ekviva-35 lenttia bentseenisulfonihappoa ja hydrausaika oli kaksi 70 97297 tuntia, jolloin saatiin lopputuote saannolla 40 % (sp.

154 - 160 *C).

C28H46N406B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 547,38.

5 Havaittu: 547,43.

Esimerkki 40 H-Ala-Phe- (D, L )booriLys-C6H12 · TFA · bentseenisulf oni- happo

Boc-Ala-Phe- (D, L)booriLys-C6H12·bentseenisulfoni-10 hapon (esimerkin 39 yhdiste) annettiin reagoida trifluori- etikkahapon kanssa yksi tunti huoneen lämpötilassa. Liuotin haihdutettiin, ja jäännös trituroitiin eetterillä, jolloin saatiin saannoksi kiinteää ainetta.

C23H39N4°4B:n MS(FAB): 15 Laskettu + H: 447,31.

Havaittu: 447,31.

C31H46N409SF3B · 2H20: n analyysi:

Laskettu: C - 49,34 %, H - 6,68 %, N - 7,42 % ja B = 1,43 %.

20 Havaittu: C = 49,26 %, H = 5,94 %, N * 7,12 % ja B * 1,34 %.

Esimerkki 41

Boc- (D) Val-Leu-booriLys-C6H12 · bentseenisulf onihappo Boc-(D)Val-Leu-OH valmistettiin esimerkissä 2 ku-25 vatulla menetelmällä. Bentsyyliesteri saatiin saannolla 76 %.

C23H36N205:n MS(FAB):

Laskettu + H: 421,27.

Havaittu: 421,38.

30 Hydrauksen jälkeen vapaa happo saatiin 100 %:n saannolla valkoisena, kiteisenä kiinteänä aineena.

C16H29N205: n analyysi:

Laskettu: C 59,34 %, H 8,87 % ja N = 8,50 %.

Havaittu: C - 59,34 %, H - 8,87 % ja N - 8,50 %.

35 Boc-(D)Val-Leu-OH liitettiin amiiniin (esimerkki

Id) käyttäen esimerkissä 37 kuvattua Boc-Ala-Phe-OH:n • 97297 71 liittämismenetelmää, jolloin saatiin Boc-(D)Val-Leu-NH-CH[(CH2)4Βγ]B02-C6h12 97 % saannolla.

C27H5iN306BBr:n MS(FAB):

Laskettu + H: 604,31.

5 Havaittu: 604,31.

Alkyyllbromldl muutettiin vastaavaksi atsldlksl 85 %:n saannolla esimerkissä 3 kuvatulla menetelmällä, ja atsidi hydrattiin esimerkissä 39 kuvatulla menetelmällä, jolloin saatiin lopputuote valkoisena kiinteänä aineena 10 62 %:n saannolla.

C27H53N406B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 541,41.

Havaittu: 541,46.

C33H59N409SB· 1 ·5H20:n analyysi: 15 Laskettu: C - 54,62 %, H - 8,61 %, N - 7,73 % ja B - 1,49 %.

Havaittu: C - 54,58 %, H - 8,59 %, N = 7,92 % ja B = 1,98 %.

Esimerkki 42 20 Ac- Phe-boor iLys-C6H12 · bentseenisul f onihappo

Esimerkki 42 valmistettiin esimerkissä 39 kuvatun menetelmän mukaisesti.

Ac-Phe-NH-CH[(CH2)4Br ] B02-C6H12 valmistettiin 72 %:n saannolla.

25 C22H34N204BBr: n MS(FAB):

Laskettu + H: 481,00.

Havaittu: 481,21.

Atsidi saatiin 57 %:n saannolla. Lopputuote saatiin 50 %:n saannolla.

30 C22H37N304B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 418,29.

Havaittu: 418,31.

C29H42N307SB·H20:n analyysi:

Laskettu: C - 56,66 %, H - 7,47 %, N = 7,08 % ja B = 35 1,82 %.

- 97297 72

Havaittu: C - 56,88 %, H - 7,43 %, N - 7,22 % ja B - 1,53 %.

Esimerkki 43

Bz-(D, L)booriIrg-C6H12*HBr 5 Bz-(D,L)NH-CH[(CH2)3Br]B02-C6H12 valmistettiin anta malla amiinin (esimerkki Ib, 5,0 g, 15,9 mmol) reagoida ekvivalentin bentsoyylikloridimäärän ja kahden ekvivalentin natriumbikarbonaattimäärän kanssa seoksessa, joka sisälsi 4 ml dioksaania ja 4 ml vettä 0 °C:ssa. Kun reagens-10 sit oli sekoitettu, reaktio laimennettiin 6 ml:11a 50-%:ista dioksaani:vesi-liuosta, ja sen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan. Reaktioseosta sekoitettiin noin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, ja sitten tuote uutettiin etyyliasetaattiin ja pestiin vedellä, 0,2 N suolahapolla, 15 5-%:isella vesipohjaisella natriumbikarbonaatilla ja kyllästetyllä vesipohjaisella natriumkloridilla. Orgaaninen faasi kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin yllä, suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin kiteinen tuote. Eristämisen ja etyyliasetaattipesun jälkeen saatiin 3,26 g 20 yhdistettä (sp. 176 - 177 eC).

C17H25N03BrB:n analyysi:

Laskettu: C - 53,44 %, H * 6,59 %, N - 3,67 % ja B - 2,83 %.

Havaittu: C - 54,50 %, H = 6,76 %, N = 3,68 % ja B = 25 2,84 %.

Alkyylihalogenidi (1,00 g, 2,62 mmol) muutettiin vastaavaksi isotiouronisuolaksi esimerkissä 22 kuvatulla menetelmällä. 0,84 g tuotetta saatiin valkoisena kiinteänä aineena.

30 C18H2eN303SB:n MS(FAB):

Laskettu + H: 378,20.

Havaittu: 378,21. cieH29N3°3SBBr:n analyysi:

Laskettu: C - 47,18 %, H - 6,38 %, N - 9,17 % ja B -35 2,36 %.

<· . 1-11.1. lii li M i iU , 97297 73

Havaittu: C - 46,11 %, H * 6,71 %, N * 8,97 % ja B * 2,22 %.

Esimerkki 44

Bz- (D, L )booriArg-C6H12 · bentseenisulf onihappo 5 Alkyylihalogenidi (esimerkki 43, 2,0 g, 5,25 mmol) muutettiin 0,97 g:ksi atsidia (sp. 138 - 139 eC) käyttäen esimerkin 3 menetelmää. Atsidi muutettiin Bz-booriOrn-C6H12»bentseenisul£onihapoksi lähes kvantitatiivisella saannolla käyttäen esimerkin 4 menetelmää.

10 C10H27N2O3B: n MS(FAB):

Laskettu + H: 319,22.

Havaittu: 319,26.

Bz-booriOrn-C6H12·bentseenisulfonihapon (0,90 g, 1,84 mmol) annettiin reagoida syanamidin kanssa käyttäen 15 esimerkin 5 menetelmää, jolloin saatiin 0,65 g kiteistä tuotetta (sp. 242 - 244 °C).

C18H29N403B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 361,24.

Havaittu: 361,24.

20 C24H35N406SB:n analyysi:

Laskettu: C - 55,59 «, H - 6,82 %, N - 10,81 % ja B - 2,08 %.

Havaittu: C - 54,60 %, H 6,70 %, N - 11,24 % ja B - 1,87 %.

. 25 Esimerkki 45 * Ac-Leu-Thr(OBu)-booriArg-C10H16· bentseenisulf onihappo

Ac-Leu-Thr(0Bu)-0H valmistettiin liittämällä Ac-Leu-OSu yhdisteeseen H-Thr(0Bu)-0H käyttäen esimerkin 13 dipeptidisynteesimenetelmää paitsi, että lopputuote saa-30 tiin ei-kiteisenä, valkoisena kiinteänä aineena LH-20-kro- matografian jälkeen. Ac-Leu-Thr(0Bu)-0H (3,29 g, 9,90 mmol) liitettiin amiiniin (esimerkki la) käyttäen esimerkin 2 seka-anhydridimenetelmää paitsi, että LH-20-kromatografiavaihetta ei tarvittu. Ac-Leu-Thr(OBu)-NH-35 CH[ (CH2)3Br]B02C10H16 saatiin ei-kiteisenä, valkoisena kiin- 97297 74 teänä aineena, 5,39 g. Alkyylihalogenidi muutettiin vastaavaksi atsidiksi 82 %:n saannolla käyttäen esimerkin 3 menetelmää paitsi, että kromatografiavaihetta ei tarvittu lisäpuhdistukseen. Atsidi (3,88 g, 6,42 mmol) hydrattiin 5 esimerkin 4 menetelmällä. Tuote, Ac-Leu-Thr(OBu)-booriOrn- C10H16>bentseenisulfonihappo, saatiin 74 %:n saannolla tuotteen LH-20-kromatografian ja eetteritrituraation jälkeen. C3oH55N4°6B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 579,43.

10 Havaittu: 579,48.

Booriornitiinipeptidi muutettiin lopputuotteeksi 86 %:n saannolla esimerkin 5 menetelmällä.

C3iH57N606B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 621,45.

15 Havaittu: 621,50.

C37H63N6SOgB: n analyysi:

Laskettu: C - 57,05 %, H * 8,17 %, N * 10,79 % ja B = 1,39 %.

Havaittu: C = 56,47 %, H - 8,01 %, N = 10,93 % ja B -20 1,34 %.

Esimerkki 46

Ac-Leu-Thr-booriArg-C10H16 · bentseenisulf onihappo Ac-Leu-Thr (OBu) -booriArg-C10H16 · bentseenisulf onihappo (esimerkki 45, 0,200 g, 0,257 mmol) liuotettiin seokseen, 25 jossa oli 2 ml metyleenikloridia ja 2 ml 4 N HCl:dioksaa- nia, ja sen annettiin sekoittua 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Liuotin haihdutettiin, ja jäännös kuivattiin korkeassa vakuumissa. Haluttu tuote saatiin valkoisena kiinteänä aineena 97 %:n saannolla trituroimalla eetteril-30 lä.

. C27H49N606B: n MS(FAB):

Laskettu + H: 565,39.

Havaittu: 565,48.

75 97257

Esimerkki 47

Ac-Lys( Boc) -Pro-booriArg-C10H16 · bentseenisulfonihappo Ac-Lys(Boc)-Pro-OH valmistettiin esimerkissä 13 kuvatuilla menetelmillä. Se saatiin valkoisena kiinteänä 5 aineena (sp. 160 - 161,5 eC) etyyliasetaatista kiteytettynä. Ac-Lys(Boc)-Pro-0H (3,15 g, 8,18 mmol) liitettiin amiiniin (esimerkki la) käyttäen esimerkin 2 menetelmää. Tuotetta, 5,8 g, käytettiin ilman lisäpuhdistusta. Se muutettiin atsidiksi 73 %:n saannolla esimerkin 3 menetelmäl-10 lä LH20-kromatografian jälkeen. Hydraus esimerkin 4 menetelmällä, LH-20-kromatografia ja näytteen trituraatio eet terillä antoi Ac-Lys(Boc)-Pro-booriOrn-C10H16»bentseenisul-fonihapon 81 %:n saannolla.

C32H55N507B:n MS(FAB): 15 Laskettu + H: 634,43.

Havaittu: 634,46.

Booriornitiinipeptidin (2,0 g, 2,53 mmol) annettiin reagoida syanamidin kanssa esimerkin 5 menetelmällä, jolloin saatiin 1,8 g haluttua tuotetta valkoisena kiinteänä 20 aineena.

C33H57N707B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 676,46.

Havaittu: 676,41.

C39H63N7°iobs:n analyysi: 25 Laskettu: C = 56,23 %, H = 7,64 %, N = 11,77 % ja B = 1,30 %.

Havaittu: C - 56,06 %, H = 7,48 %, N - 11,75 % ja B - 1,22 %.

Esimerkki 48 30 Ac-Lys-Pro-booriArg-C10H16· 2HC1

Ac-Lys (Boc) -Pro-booriArg-C10H16 · bentseenisulfonihapon (esimerkki 47, 0,30 g, 0,360 mmol) annettiin reagoida 50:50 jääetikkahappo- ja 4 N HC1:dioksaani-seoksen kanssa 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Liuotin haihdutettiin, 35 ja jäännös kuivattiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin ve- - 97297 76 teen ja ajettiin 5 ml AG1-X8-pylvään (Cl~-muodossa) läpi. Näyte haihdutettiin, ja jäännös trituroitiin eetterillä, jolloin saatiin haluttu tuote valkoisena kiinteänä aineena (230 mg).

5 C2eH49N705B: n MS ( FAB ) :

Laskettu + H: 576,40.

Havaittu: 576,45.

Esimerkki 49

Ac-Ala-Glu( OBu) -booriArg-C10H16 · bentseenisulf onihappo 10 Ac-Ala-Glu(0Bu)-0H valmistettiin liittämällä Ac-

Ala-OSu H-Glu(0Bu)-0H:hon käyttäen esimerkin 13 menetelmää. Tuote kiteytyi etyyliasetaatti:heksaanista (sp.

147,5 - 148 eC).

Ci4H24N206:n analyysi: 15 Laskettu: C 53,14 %, H 7,66 % ja N = 8,85 %.

Havaittu: C - 53,28 %, H = 7,53 % ja N - 9,08 %.

Ac-Ala-Glu(0Bu)-NH-CH[ (CH2)3Br]B02-C10H16 valmistettiin esimerkin 2 menetelmällä paitsi, että orgaaniseen faasiin käytettiin kloroformia etyyliasetaatin sijasta 20 reaktion alussa eikä LH-20-kromatografiaa käytetty. Haluttu tuote saatiin 87 % saannolla osittain kiteisenä kiinteänä aineena orgaanisen faasin haihdutuksen jälkeen. Al-kyylibromidi muutettiin atsidiksi esimerkin 3 menetelmällä. Haluttu tuote (sp. 163,5 - 166 °C) saatiin 50 %:n 25 saannolla kiteyttämällä raaka reaktiotuote kloroformista.

C28H47N607B:n analyysi:

Laskettu: C - 53,51 %, H - 7,55 %, N - 6,69 % ja B - 1,73 %.

Havaittu: C - 55,51 %, H * 7,50 %, N « 6,50 % ja B = 30 1,66 %.

Booriornitiinipeptidi valmistettiin esimerkin 4 * menetelmällä, jolloin saatiin haluttu tuote 79 % saannolla.

C28H«9N407B: n MS (FAB): 35 Laskettu + H: 565,38.

Havaittu: 565,51.

97297 77

Lopputuote saatiin valkoisena, ei-kiteisenä kiinteänä aineena 70 %:n saannolla käyttäen esimerkin 5 menetelmää.

C„H51N607B:n MS(FAB): 5 Laskettu + H: 607,40.

Havaittu: 607,41.

C35H57N6Oi0BS : n analyysi:

Laskettu: C - 54,96 %, H * 7,53 %, N - 10,99 % ja B - 1,41 %.

10 Havaittu: C - 54,36 %, H - 7,71 %, N = 11,27 % ja B - 1,21 %.

Esimerkki 50

Ac-Ala-Glu-booriArg-C10H16 · bentseenisulf onihappo Ac-Ala-Glu( OBu) -booriArg-C10H16 · bentseenisulf onihappo 15 (esimerkki 49, 0,10 g, 0,131 mmol) liuotettiin 10 ml:aan etikkahappoa, ja vedettömän HCl:n annettiin kuplia liuoksen läpi 20 minuuttia. Liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 1,5 tuntia, ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin öljymäistä ainetta. Haluttu tuote saatiin valkoisena 20 kiinteänä aineena (82 mg) vakuumikuivatuksen ja eetteri-trituraation jälkeen.

C25H43N607B:n MS(FAB):

Laskettu + H: 551,34.

Havaittu: 551,41.

25 Myös seuraavat yhdisteet valmistettiin käyttäen oleellisesti samoja menetelmiä kuin yllä olevissa esimerkeissä 39 ja 40:

Boc-Val-Val-booriLys-C6H12*BSA; H-Val-Val-booriLys-C6H12*BSA*TFA; 30 Boc- (D) Phe-Phe-booriLys-C6H12 · BSA; H - (D )Phe-Phe-booriLys-C6H12 · BSA · TFA; Boc-Glu-Phe-booriLys-C6H12 «BSA; PyroGlu-Phe-booriLys-C6H12 · BSA.

Biologiset esimerkit 35 Seuraavissa esimerkeissä μ tarkoittaa mikroa.

97297 78

Esimerkit 51 - 71

Ihmisen plasman kallikreiinin inhibitio

Ihmisen plasman kallikreiini saatiin Protogen AG:Itä (Sveitsi). Toimittajan ilmoittama spesifinen aktii-5 visuus on 15 yksikköä per mg. Yksikkö on määritelty ent-syymimääräksi, joka tarvitaan hydrolysoimaan 1 mikromooli substraattia, H-(D)Pro-Phe-Arg-p-nitroanilidia (Kabi S2302) per minuutti 0,50 mM:n substraattikonsentraatiossa 25 °C:ssa 50 mM kaliumfosfaattipuskurissa, pH 8,0. Entsyy-10 min kantaliuos (1 yksikkö/ml) valmistettiin 50-%:inen glyseroli - 0,10 M natriumfosfaattipuskuriin, pH 7,5, joka sisälsi 0,20 M natriumkloridia ja 0,1 % PEG 6 000:tta (po-lyetyleeniglykoli). Standardikokeissa 10 pl:aa kallikreiinin kantaliuosta lisättiin 990 pl:aan liuosta, jossa oli 15 0,20 mM S2302:ta 0,10 mM natriumfosfaattipuskurissa, pH

7,5, joka sisälsi 0,20 mM natriumkloridia ja 0,1 % PEG:ia, 25 °C:ssa. Inhibiittorien vaikutukset mitattiin tarkastelemalla entsymaattista aktiivisuutta, joka määritettiin mittaamalla absorbanssin nousua 405 nm:n aallonpituudella 20 ajan funktiona sekä inhibiittorien läsnä että poissa ollessa. Taulukko 1 osoittaa inhibiittorien tasot ja jäljellä olevan aktiivisuuden mitattuna aikavälillä 10 - 20 minuuttia reaktion aloituksen jälkeen. Kontrollien aktiivisuudet olivat 0,0092 ± 0,0095 min'1.

« • 97297 79

Taulukko 1

Ihmisen plasman kallikreiinin inhibitio

Kons. Aktii- 5 (nM) visuus-

Koe Inhibiittori__%_ 51 Boc-(D)Phe-Phe-booriIrg-C10H16*HBr 10 2 52 H-(D)Phe-Phe-booriArg-C10H16»2HCl 10 2,6 53 Boc- (D) Phe-Phe-booriArg-C10H16BSA 10 15 10 54 Boc-Ala-Phe-( D, L)booriIrg-C6H12 · HBr 10 15 55 Bz-Pro-Phe-booriArg-C10H16 · BSA 10 15 56 Bz-Pro-Phe-booriArg-OH »HC1 10 16 57 Bz-Pro-Phe-booriArg-F 10 18 58 Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-booriArg-C10H16*BSA 10 30 15 59 Ac-Ala-Lys(Boc)-booriArg-C10H16»BSA 10 34 60 Ac-Phe-booriArg-C10H16»HCl 10 48 61 Ac-(D)-Phe-Pro-booriArg-C10H16*HCl 10 56 62 H-(D)Phe-Pro-booriArg-C10H16*2HCl 10 61 63 Ac-Ala-Lys(Boc)-booriIrg-C10H16»HBr 50 1,4 20 64 Bz-Glu(OBu)-Gly-booriArg-C10H16*BSA 50 11 65 Ac-Phe-booriIrg-C10H16»HBr 50 17 66 Bz-Glu-Gly-booriArg-C10H16 · BSA 50 39 67 Ac-Ala-Lys-booriArg-C10H16*2HCl 50 39 68 Boc-Ala-Phe-(D, L)boorihomoIrg-C6H12· HBr 100 38 25 69 Boc-Ala-Phe-(D,L) boor iLys-C6H12*HCl 1000 17 70 Boc- (D) Phe-Phe-booriOrn-C10H16 · BSA 10000 39 71 Boc- (D) Phe-Pro-booriOrn-C10H16 · BSA 10000 100

Esimerkit 72 - 110

Trombiinin inhibitio (esteraasiaktiivisuus)

30 Ihmisen trombiini (spesifinen aktiivisuus 2345 NIH

yksikköä/mg) saatiin R.Q.P. Laboratories -yhtiöstä (South Bend, IN) (Lot HT102). Trombiinista valmistettiin kanta-liuos 0,010 M PIPES-puskuriin, pH 6,0, joka sisälsi 0,75 M natriumkloridia. Trombiinikokeet suoritettiin Greenen ja 35 Shaw'n, Anal. Biochem. 93: 223 (1979), kuvaaman menetelmän mukaisesti natriumfosfaattipuskurissa, pH 7,5, joka sisäl- . 97297 80 si 0,20 mM natriumkloridia ja 0,1 % PEG 6 000:tta. Substraatin alkukonsentraatio oli 0,10 mM ja trombiinin kon-sentraatio oli 1,0 nM (painoon perustuen). Taulukko 2 osoittaa inhibiittoritasot ja jäljellä olevan aktiivisuu-5 den mitattuna aikavälillä 10 - 20 minuuttia reaktion aloituksen jälkeen. Trombiinin aktiivisuus kontrolleissa oli 0,0076 ± 0,0005 min’1.

Taulukko 2

Trombiinin inhibitlo 10 Rons. Aktii- (nM) visuus-

Koe Inhibiittori_% 72 Ac (D) Phe-Pro-booriArg-C10H16 · HC1 5 1 73 Boc- (D) Phe-Pro-booriIrg-C10H16 · HBr 5 3 15 74 Boc-(D)Phe-Pro-booriArg-C10Hl6*BSA 5 3 75 Ac-(D)Phe-Pro-booriArg-OH·HC1 5 3 76 H- (D )Phe-Pro-booriIrg-C10H16 · HBr · HC1 5 4 77 H- (D) Phe-Pro-boor iArg-C10H16 · 2HC1 5 7 78 Boc-(D)Phe-Phe-booriIrg-C10H16Br 5 48 20 79 H-(D)Phe-Phe-booriArg-C10H16*2HCl 10 10 80 H-Leu-Gly-Leu-Ala-booriArg-C10H16*HCl»BSA 10 25 81 Boc-(D)Phe-Phe-booriArg-C10H16»BSA 10 32 82 H-Leu-Gly-Leu-Ala-booriIrg-C10H16*2HBr 10 37 83 Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-booriArg-C10H16*BSA 10 38 25 84 H-(D)Phe-Phe-booriIrg-C10H16*2HBr 10 49 85 Bz-Glu( OBu) -Gly-booriArg-C10H16 · BSA 10 52 86 Bz-Glu(OBu)-Gly-booriIrg-C10H16*HBr 10 59 87 Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-booriIrg-C10H16*HBr 10 66 88 Boc-(D)Phe-Pro-booriOrn-C10H16*BSA 100 18 30 89 Ac-Ala-Lys(Boc)-booriArg-C10H16*BSA 100 18 90 Z-Phe-Gly-Gly-booriIrg-C10H16*HBr 100 46 91 Bz-Glu-Gly-booriArg-C10H16»BSA 100 46 92 Ac-Ala-Lys(Boc)-booriIrg-C10H16*HBr 100 55 93 Bz-Pro-Phe-booriArg-OH·HC1 1000 18 35 94 Bz-Pro-Phe-booriArg-F 1000 18 95 Bz-Pro-Phe-booriIrg-C10R16*HBr 1000 21 - 97297 81 (Taulukko 2 jatkuu) Kons. Aktii- (nM) visuus-

Koe Inhibiittori_% 96 Boc-(D)Val-Leu-boorlLys-C6H12*HCl 1000 21 5 97 Bz-Pro-Phe-booriArg-C10H16*BSA 1000 24 98 Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-booriOrn-C10H16»BSA 1000 24 99 Boc-Ala-Phe(D, L)booriIrg-C6H12«HBr 1000 28 100 Bz-Glu-Gly-booriIrg-C10H16 · HBr 1000 39 101 Ac-Ala-Lys-booriArg-C10H16 · 2HC1 1000 45 10 102 Ac-Phe-booriArg-C10H16*HCl 1000 53 103 Ac-Ala-Lys-booriIrg-C10H16*HBr 1000 64 104 Ac-Ala-Lys-booriIrg-C10H16· 2HBr 1000 68 105 H-Ala-Phe- (D, L)booriIrg-C6H12· 2HBr 10000 23 106 Boc-Ala-Phe-(D, L)boorihomoIrg-C6H12» HBr 10000 32 15 107 Boc-Ala-Phe-(D, L)booriLys-C6H12*HCl 10000 46 108 H-Ala-Phe-(D, L)boorihomolrg-C6H12· 2HB 10000 47 109 H-Ala-Phe-(D, L)booriLys-C6H12· 2HC1 10000 89 110 Ac-Phe-booriLys-C6H12 · HC1 10000 97

Esimerkit 111 - 124 20 Veren hyytymisen inhibitio osoitettuna APTT:n ja PT:n määrityksillä

Proteaasi-inhibiittorien vaikutus veren hyytymiseen in vitro määritettiin mittaamalla niiden vaikutusta kahteen erilaiseen kliiniseen parametriin, aktivoituihin par-25 tiaalisiin tromboplastiiniaikoihin (APTT) ja protrombiini- aikoihin (PT). Reagenssit kuhunkin näistä kokeista toimitti General Diagnostics, Jessup, MD. Inhibiittoreista valmistettiin kantaliuokset 25 mM HEPES-puskuriin, pH 7,5, joka sisälsi 0,10 M natriumkloridia. APTT-kokeessa inhi-30 biittoriliuosta (0,100 ml) inkuboitiin normaalin ihmisen plasman (0,100 ml) ja valmiin APTT-reagenssin (0,100 ml) kanssa. Kun oli inkuboitu viisi minuuttia 37 “Crssa, lisättiin kalsiumkloridia (0,100 ml), ja hyytymisajat mitattuina sekunteina määritettiin fibrometrillä. Vaihtelevien 35 inhibiittorikonsentraatioiden vaikutukset veren hyytymis- aikoihin verrattuna inhibiittorin poissa ollessa suori- 82 97297 tettujen kontrollien hyytymisaikoihin osoitetaan taulukossa 3.

PT-kokeissa inhibiittoriliuoksia (0,100 ml) inku-boitiin normaalin ihmisen plasman (0,100 ml) kanssa kaksi 5 minuuttia 37 °C:ssa. Sitten lisättiin simplastiinirea-genssia (0,200 ml) ja mitattiin hyytymisajat, jotka on osoitettu taulukossa 4.

Taulukossa 5 on taulukkojen 3 ja 4 tulosten yhteenveto osoittaen likimääräiset inhibiittorikonsentraatiot, 10 jotka tarvitaan kohottamaan aktivoituja partiaalisia trom-boplastiiniaikoja (2 X APTT) ja protrombiiniaikoja (2 X PT) kaksinkertaisesti.

Yhdisteen nimi taulukoissa 3-5, 7-10_Inhibiittorin nimi_ 15 A Boc-(D)Phe-Pro-booriArg-C10H16 B H-(D)Phe-Pro-booriArg-C10H16 C Boc-(D)Phe-Pro-booriIrg-C10H16 D Boc-(D)Phe-Phe-booriIrg-C10H16 E Boc- (D) Phe-Phe-booriArg-C10H16 20 F Ac-Phe-booriArg-C10H16 G Ac-Phe-booriIrg-C10H16 ! tu.i a.m uin < . 97297 83

Taulukko 3

Aktivoidut partiaaliset tromboplastiiniajat (mitattu sekunteina)

Esimerkin numero 5 111 112 113 114 115 116 117

Kons. Yhdiste

(nM)_A_B_C_D_E_F_G

0 35,3 32 32,8 34,7 34,7 33,7 33,8 50 35,8 36,8 35 35,2 10 62,5 36,5 39,2 125 36,6 44,2 46,9 45,2 40,5 35,2 36,2 200 40,2 71,5 67 46,2 43,6 36,7 39,3 250 81,2 158,7 160 275 60,7 52,8 44,8 58,2 15 300 113,3 169,7 197,8 350 128,7 249,7 301,8 75,7 54,8 58,2 66,7 550 94,8 61,3 144,2 98,4

Taulukko 4 20 Protrombiiniajat (mitattu sekunteina)

Esimerkin numero 118 119 120 121 122 123 124

Kons. Yhdiste

(nM)_A B_C_D_E_F_G

25 0 15,5 15,8 14,4 15,8 16,7 15,7 15,3 12,5 16,4 20,1 16,8 250 17,1 22,5 20,8 500 21,5 33,8 27,2 15,7 19,8 13,7 625 46,5 30 750 26,7 85,3 44 17,2 22 14,9 875 40,1 1000 >200 >250 152,7 19,9 29,3 16,2 19,7 2000 23,4 39 20,8 43,6 4000 49,2 70,8 51,5 97297 64

Taulukko 5

Veren hyytymisen inhlbltlo

Laskettu konsentraatlo 5 Yhdiste 2X APTT(nM) 2XPT(nM) A 230 800 B 170 460 C 200 650 D 370 1200 10 E 375 2600 F 325 2500 G 625 1200

Esimerkit 125 - 127 15 Veren hyytymisen inhlbltlo osoitettuna TT-määrityk- sillä

Proteaasi-inhibiittorin Ac-(D)Phe-Pro-booriArg-OH (esimerkki 8) vaikutus veren hyytymiseen in vitro määritettiin mittaamalla sen vaikutus trombiiniaikoihin (TT). 20 Seosta, jossa oli 0,2 ml normaalia kanin plasmaa ja 0,05 ml puskuria, joka sisälsi inhibiittoria kuusinkertaisen määrän haluttua loppukonsentraatiota, lämmitettiin 37 °C:een. Hyytyminen aloitettiin lisäämällä tromblinia (0,05 ml, jossa oli kuusinkertainen loppukonsentraatiomää-; 25 rä). Käytetty trombiini hankittiin Sigma Chemical Company -yhtiöstä (numero T6634, aktiivisuus 1190 NIH yksikköä per mg proteiinia) ja valmistettiin puskuriin. Sekä inhibiittoriin että trombiiniin käytetty puskuri oli 0,1 M Tris-puskuri (12,10 g/1), joka sisälsi 0,154 M NaCl:a 30 (8,84 g/1) ja 2,5 mg/ml härän seerumin albumiinia, pH 7,4.

: Hyytymisajat mitattuina sekunteina määritettiin käyttäen fibrometriä. Inhibiittorin vaikutukset veren hyytymisai-koihin verrattuna inhibiittorien poissa ollessa suoritettujen kontrollien veren hyytymlsaikoihin, osoitetaan tau-35 lukossa 6. Arvot edustavat ainakin kolmen määrityksen kes- 97297 85 kiarvoa. Jos hyytyminen ei tapahtunut 300 sekunnin sisällä, reaktio lopetettiin.

Taulukko 6 Trombiiniajat 5 Koe Trombiinikons. Inhibiittorikons. Trombiiniajät* _(u/ml)_(nM)_ 0,75 0 > 300 --- 0,83 0 226,9 ± 14,8 1 0 147,2 ± 9,1 10 --- 1,2 0 121,1 ± 0,8 2 0 51,8 ± 0,6 3 0 40,0 ± 1,9 --- 4 0 24,4 ± 0,3 125 4 150 > 300 15 126 4 100 62,4 ± 7,2 127 4 50 32,7 ± 0,8 ^hyytymiseen tarvittu keskimääräinen aika sekunteina mitattuna, ± standardihajonta 20 Esimerkit 128 - 132

Inhibiittorien stabiilisuus ihmisen plasmassa APTTillä mitattuna

Inhibiittorien stabiilisuus plasmassa määritettiin niiden kykynä inhiboida veren hyytymistä. Ensiksi testat-25 tavien inhibiittorien 0,10 M natriumkloridia sisältävässä 25 mM:ssa HEPES-puskurissa, pH 7,5, olevat kantaliuokset (1,0 μΜ) laimennettiin 50-%:iksi normaalilla Ihmisen plasmalla. Seokset valmistettiin 0 eC:ssa, sitten siitä otettiin pieniä määriä (0,200 ml) ja inkuboitiin kaksi minuut-30 tia 37 eC:ssa. Lisättiin sama tilavuus valmista APTT-rea-genssia ja hyytymisajat mitattiin, kuten on kuvattu esimerkeissä 111 - 117. Inhibiittorin loppukonsentraatio hyytymiskokeissa oli 250 nM. Inkubaatioajat (tunteina) ja hyytymisajat (mitattuna sekunteina) yksittäisille inhi-35 biittoreille esitetään taulukossa 7. Arvot yhdisteille E

• 97297 86 ja F määritettiin yhtä aikaa kontrollin kanssa. Arvot yhdisteille A, B ja C saatiin eri päivänä.

Taulukko 7

Inhibiittorien stabiilisuus ihmisen plasmassa 5 Esimerkin numero _128 129 130 131 132

Yhdiste

_Kontrolli F_E_A_B_C

Inkubaatio- Hyytymisaika (sekunteina) 10 aika (tuntej a) 0 41,5 76,3 63,2 81,2 152,2 203,2 0,5 42,7 76,4 73,2 84,7 157,7 207,2 1 42,7 76,7 66,2 79,7 163,7 214,2 15 2 42,7 79,6 67,7 86,7 152,8 203,7 3 44,8 77,8 61,7 4 44,2 81,8 58,2 98,2 157,7 209,7 5 45,7 80,8 61,3 6 45,2 79,3 57,3 20 24 35,2 73,9 64,7 92,2 109,3 248,7 48 47,2 49,3 58,7

Esimerkit 133 - 136

Inhibiittorien stabiilisuus puskurissa Inhibiittoreita kukin 1,0 μΜ:η konsentraationa in- , 25 kuboitiin huoneen lämpötilassa 0,20 M natriumfosfaattipus- * kurissa, pH 7,5, joka sisälsi 0,20 M natriumkloridia ja 0,10 % PEG:iä. Otettiin pieniä määriä (4 μΐ), ja määritettiin trombiinikokeella, kuten on kuvattu esimerkeissä 72 - 110. Inkubaation jälkeen säilyneet trombiiniaktiivi-30 suusprosentit ja inhibiittorien natriumfosfaattipuskurissa oloaikojen pituudet on ilmoitettu taulukossa 8. Inhibiittorit A ja C menettivät vain vähän inhibiittoriaktiivi-suuttaan. Inhibiittori B menetti biologisen aktiivisuutensa tunnin sisällä.

(I · - U-i Kill I I I tt '1 97297 87

Taulukko 8

Inhibiittorien stabiilisuus puskurissa

Trombiiniaktilvisuusprosentti 5 Esimerkin nro Yhdiste 0 tuntia 6,5 tuntia 24 tuntia 133 A 3,3 1,6 0,8 134 C 3,0 0,9 135 C 65 77 10 0 tuntia 0,5 tuntia 1 tunti 136 B 2,0 15 100

Esimerkit 137 - 142

Veren hyytymisen inhibitio in vivo suuannostuksen 15 jälkeen

Urosrotat (Sprague Dawley CD -rotat, 130 - 140 g, toimittanut Charles River Labs., Inc., Wilmington, MA) anestesoitiin natriumpentobarbitaalilla (50 mg/kg, i.p.). Tehtiin keskilinjaviilto kaulan vatsanpuoleiselle pinnalle 20 ja polyetyleenikatetri insertoitiin yhteen pään valtimoon ja kiinnitettiin niskan taakse. Rottien toivuttua anestesiasta, otettiin pään valtimon katetrista kontrolliverinäytteet, antikoaguloitiin natriumsitraatilla ja sentrifu-goitiin (2000 x g, 10 minuuttia). Plasma siirrettiin muo-25 viputkiin, ja putkia pidettiin jäissä, kunnes käytettiin kokeissa. Trombiiniajat mitattiin käyttäen fibrometriä, kuten on kuvattu esimerkeissä 125 - 127.

Rotille annettiin joko proteaasi-inhibiittoria Ac(D)Phe-Pro-booriArg-OH vehikkelissä tai pelkkää vehikke-30 liä letkuruokintana suun kautta tilavuudessa, joka oli pienempi kuin 4 ml. Käytetty vehikkeli oli 5-%:inen dime-tyylisulfoksidi suolaliuoksessa. Otettiin verinäytteitä eri aikoina suuannostuksen jälkeen ja mitattiin kuten edellä. Tulokset näytettyinä hyytymisaikoina sekunneissa 35 on annettu alla olevassa taulukossa 9. Kun hyytymisaika ylitti 300 sekuntia, se on ilmoitettu alla merkinnällä 97297 88 >300. Muut tulokset näyttävät hyytymiseen tarvitun keskimääräisen ajan sekunteina mitattuna, ± standardihajonta. Taulukko 9

Veren hyytymisen inhibitio in vivo suuannostuksen 5 jälkeen

Koe Aika Kontrolli Inhibiittorin konsentraatio _(tuntia)_ 137 0,5 68 ± 18 > 300 > 300 > 300 10 138 1 52 ± 26 > 300 ND* > 300 139 2 55 ± 11 > 300 ND* > 300 140 3 34 ± 12 > 300 ND* > 300 141 4 41 47 i 4 54 i 29 ND* 142 6 50 46 i 3 44 i 4 ND* 15 *ND = ei mitattu

Esimerkki 143

Veren hyytymisen in vivo inhibitio suuannostuksen jälkeen 20 Lisätodisteeksi tämän yhdisteen kyvystä inhiboida veren hyytymistä in vivo, rotat anestesoitiin natriumpen-tobarbitaalilla (50 mg/kg, i.p.), insertoitiin kaulasuoni-katetri ja viilto suljettiin. Anestesiasta toivuttua rottia käsiteltiin suun kautta joko 5 mg/kg annoksella veteen 25 liuotettua proteaasi-inhibiittoria Ac-(D)Phe-Pro-boori-Arg-OH tai samalla tilavuudella vettä. 30 - 60 minuuttia myöhemmin rotat saivat trombiini-infuusioannoksen 500 yk-sikköä/kg yhden minuutin sisällä. Kaikki neljätoista rottaa, jotka olivat saaneet vain vettä, kuolivat kymmenen 30 minuutin sisällä trombiini-infuusiosta. Päinvastoin vain kahdeksan rottaa 17:stä, joita oli käsitelty inhibiittoria sisältävällä vedellä, kuoli kymmenen minuutin sisällä, ja jäljelle jääneet elivät yhden tunnin, jolloin ne lopetettiin.

97297 89

Esimerkit 144 - 162

Veren hyytymisen in vivo inhibitio suu-, paksusuoli- ja peräsuoliannostuksen jälkeen

Yleiset menetelmät: 5 300 - 350 g painavat Lewis-urosrotat anestesoitiin natriumpentobarbitaalilla (50 mg/kg, i.p.), ja kaulasuoni kanyloitiin käyttäen silastic-letkua, joka oli kiinnitetty polyetyleeni-50-letkuun. Letkut kiinnitettiin niskan taakse ja yhdistettiin ruiskuun päässä olevan hanan avulla. 10 Otettiin verinäytteitä (0,5 ml) ennen ja eri aikoina pro-teaasi-inhibiittorin Ac-(D)Phe-Pro-booriArg-0H annostuksen jälkeen ruiskuun, joka oli huuhdottu sitraattipuskurilla ennen kutakin keräystä. Verinäytteet siirrettiin sitten tyhjiöastioihin, jotka sisälsivät sitraattipuskuria. Myös-15 kin jokaisen keräyksen jälkeen kanyyli huuhdottiin suolaliuoksella. Verinäytteet sentrifugoitiin sitten välittömästi (2 500 kierrosta minuutissa 15 minuutin ajan), ja plasmanäytteistä käytettiin 0,2 ml hyytymisaikamittauksis-sa. Hyytymisaikamittaukset suoritettiin käyttäen fibromet-20 riä, kuten seuraavaksi on kuvattu. Ensiksi plasma (0,2 ml) sijoitettiin fibrokuppiin ja lisättiin Tris-puskuria (50 mikrolitraa), pH 7,4. Plasma-puskuriliuosta inkuboi-tiin 37 °C:ssa yksi minuutti, lisättiin 50 mikrolitraa Tris-puskurissa olevaa 24 μ/ml trombiiniliuosta, ja hyyty-25 misaika mitattiin sekunteina. Kun hyytymisaika ylitti 300 sekuntia, se on ilmoitettu seuraavassa merkinnällä >300.

Suuannostus:

Kaulasuonikanyloitujen rottien annettiin toipua anestesiasta, ennen kuin niille annettiin annos suun 30 kautta. Annettiin proteaasi-inhibiittorin Ac-(D)Phe-Pro-booriArgOH vesiliuosta, joka sisälsi 3 mg inhibiittoria " per kg rotan painoa (noin 1 mg/rotta) tilavuudessa 0,75 ml vettä per kg rotan painoa, käyttäen letkuruokintaa. Tulokset näytetään alla olevassa taulukossa 10.

35 Paksusuoliannostus: 90 97297

Tehtiin 3 cm:n viilto kaulasuonikanyloitujen rottien vatsaan, kun ne vielä olivat anestesiassa. Paksusuoli paikannettiin ja sidottiin kiinni sekä alku- että loppu-päästä. Lisättiin proteaasi-inhibiittorin Ac-(D)Phe-Pro-5 booriArg-OH vesiliuosta, joka sisälsi 3 mg inhibiittoria per kg rotan painoa (noin 1 mg/rotta) tilavuudessa 1 ml vettä per kg rotan painoa, paksusuolen ontelon alkupäähän. Viilto suljettiin käyttäen haavaliittimiä. Tulokset näytetään alla olevassa taulukossa 11.

10 Peräsuoliannostus:

Peräsuoliannostusmenetelmä kaulasuonikanyloituihin rottiin oli sellainen, jonka ovat kuvanneet Kamiya et ai., J. Pharm. Sei., 71: 621 (1982). Lyhyesti kuvattuna, valmistettiin laite, joka koostui 0,89 cm:n ja 0,71 cm:n si-15 likonikumiseptumeista, joita yhdisti 2 cm:n pituinen me-tallilanka. Tämä laite asetettiin rotan peräsuoleen, suuri septumi ensin, ja liimattiin peräaukkoon käyttäen sopivaa liimaa. Annostus suoritettiin injektoimalla ulos tulevan septumin kautta. Peräsuoliannos oli 3 mg proteaasi-inhi-20 biittoria Ac-(D)Phe-Pro-booriArg-OH per kg rotan painoa (noin 1 mg/rotta) tilavuudessa 0,6 ml vettä per kg rotan painoa. Tulokset esitetään alla olevassa taulukossa 12. Taulukko 10

Veren hyytymisen in vivo inhibitio suuannostuksen 25 jälkeen

Koe Aika (tuntia) Kontrolli1 Inhibiittori2 144 0,00 49,7 57,3 145 0,25 67,4 > 300 30 146 0,50 51,8 > 300 147 1,00 43,6 > 300 148 2,00 42,5 > 300 149 3,00 58,4 > 300 150 4,00 42,7 > 300 35 :i »tt-.t a: lit i 11 *fr tulokset edustavat kahden rotan keskiarvoa 2 tulokset edustavat kolmen rotan keskiarvoa 97297 91

Taulukko 11

Veren hyytymisen In vivo inhibitio paksusuoliannos-tuksen j älkeen 5 Koe Aika (tuntia) Kontrolli1 Inhibiittori2 151 0,0 59,9 59,4 152 0,5 42,7 > 300 153 1,0 42,7 > 300 154 2,0 52,1 > 300 10 155 4,0 54,2 > 300 156 5,0 57,9 > 300 * tulokset edustavat kahden rotan keskiarvoa ** tulokset edustavat kolmen rotan keskiarvoa 15 Taulukko 12

Veren hyytymisen in vivo inhibitio peräsuoliannos-tuksen jälkeen

Koe Aika (tuntia) Kontrolli1 Inhibiittori2 20 157 0 53,9 66,4 158 0,25 52,3 > 300 159 0,5 43,1 > 300 160 1,0 52,7 > 300 161 2,0 42,5 > 300 25 162 4,0 75,6 > 300 tulos saatu yhdestä rotasta 2 tulokset edustavat kolmen rotan keskiarvoa Esimerkit 163 - 168 30 Krotonöljyn indusoiman tulehduksen in vivo inhibi tio

Valmistettiin kaksi liuosta, joista ensimmäinen sisälsi 5 % tunnettua tulehdusta aiheuttavaa ainetta, kro-tonöljyä, asetonikantajassa (krotonliuos) ja toinen si-35 sälsi 5 % krotonöljyä asetonikantajassa, johon oli lisätty 10 mg/ml keksinnön mukaisesti valmistettua yhdistettä (yhdisteliuos). Krotonliuosta (10 μΐ) tai vaihtoehtoises- 97297 92 ti yhdisteliuosta (10 μΐ) pantiin kunkin eläimen oikeaan korvaan (Sprague Dawley CD -rotat, 130 - 140 g, toimittanut Charles River Labs, Inc., Wilmington, MA). Kunkin eläimen vasempaan korvaan pantiin pelkkää asetonikantajaa 5 (asetoniliuos) (10 μΐ). Yhden tunnin kuluttua käsittelystä eläimet lopetettiin, niiden korvat poistettiin, ja 1/4 tuuman läpimittaiset levyt irrotettiin ja punnittiin. Turpoaminen mitattiin painoeroina krotonliuoksella käsitellyn oikean korvan ja asetoniliuoksella käsitellyn vasemman 10 korvan välillä. Tuloksia verrattiin tunnetun ei-steroidin tulehduksen vastaisen aineen, indometasiinin, antamiin tuloksiin (indometasiiniliuos), joka liuos valmistettiin ja annettiin olennaisesti samalla tavalla kuin yhdiste-liuos. Keskiarvotulokset esitetään taulukossa 13 yhdis-15 teelle F, Ac-Phe-booriArg-C10H16. Määritelmä "annos" alla käytettynä osoittaa aktiivisen tulehduksen vastaisen aineen määrän pg:na (yhdisteet A, C, D, E, F tai G tai, kuten asia voi olla, indometasiini) kuhunkin oikeaan korvaan annetussa liuoksessa ja "n” osoittaa kussakin tes-20 tissä käytetyn rottamäärän. "SE" merkitsee standardivir-hettä. Esimerkit 164 - 168 taulukossa 14 osoittavat tulehduksen vastaista aktiivisuutta yhdisteille A, C, D, E, F ja G, jotka testattiin oleellisesti samoissa olosuhteissa (annos - 100 pg).

25 Taulukko 13

Krotonöljyn indusoiman tulehduksen inhibitio Esimerkki 163

Turpoaai-

Olkean kor- Oikean vasanaan aan kaa· 30 van annos korvan korvan kiarvo Inhibitio-

Lluoa (ug/korva) keskipaino keskipaino (ag+SE) prosentti n

Kroton 0 27.4 16.3 11.Iti.5 0 8

Indoaa- tasilnl 100 20.6 15.6 5.0±2.8 55 8 35 Yhdiste P 100 18.9 16.6 2.3t0.7 79 8 97297 93

Taulukko 14

Krotonöljyn indusoiman tulehduksen inhibitio Esimerkin numero Yhdiste Inhibitioprosentti 164 G 69 5 165 E 82 166 D 93 167 A 59 168 C 76

Claims (14)

97297

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen boo-riaminohappojohdannaisen valmistamiseksi, jolla on ylei-5 nen kaava /γ1 R1- [ (A3 ) (A2 ) (A1) ] -NH-CH-B^ (I) 4. il I λ \ o RZ YZ 10 jossa Y1 ja Y2 ovat toisistaan riippumattomasti OH-ryhmiä tai fluoriatomeja tai yhdessä muodostavat ryhmän, joka on johdettu dihydroksiyhdisteestä, jossa on ainakin kaksi 15 hydroksiryhmää, joita erottaa ainakin kaksi yhdistävää atomia ketjussa tai renkaassa, jolloin ketju tai rengas sisältää 2-20 hiiliatomia ja mahdollisesti heteroatomin, joka voi olla N, S tai 0; R2 on substituoitu alkyyli, joka on -(CH2)t-X,

20 -CH(CH3)-(CH2)2-X, -CH2-CH(CH3)-CH2-X, -(CH2)2-CH(CH3)-X tai -(CH2)2-CH(CH3)2-X, jolloin X on -NH2, -NH-C(NH)-NH2 tai -S-C(NH)-NH2 ja z on 3 - 5; n, o, p ja q ovat toisistaan riippumattomasti joko 1 tai 0;

25 A1, A2 ja A3 ovat toisistaan riippumattomasti Ii ta! D-muodossa olevia aminohappoja ryhmästä Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ja Vai; ja R1 on 1 - noin 20 hiiliatomia sisältävä asyyli- tai 30 sulfonyyliryhmä, vety tai N-terminaalinen suojaryhmä; tai sen fysiologisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että A) booriaminohappojohdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava 35 97297 H1-(A3)(A2)(A1)]-NH-CH-B-Y3 ♦ HW (9) 4 tf t» ii I o RJ 5 jossa Y3 on ryhmä, joka on johdettu dihydroksiyhdistees-tä, jossa on ainakin kaksi hydroksiryhmää, joita erottaa ainakin kaksi yhdistävää atomia ketjussa tai renkaassa, jolloin ketju tai rengas sisältää 2-20 hiiliatomia;

10 R3 on substituoitu alkyyli -(CH^-W1, -CHiCHaJ-CH^-W1, -Ci^-CHiCH^-CHj-W1, -(CH^-CHiCH^-W1 tai -(CHjJj-CHfCHj)^1, jolloin W1 on NHC(NH)NH2; ja n, o, p, q, z, A1, A2, A3 ja R1 ovat edellä määriteltyjä, ja 15. on Cl, Br, -C6H5S03 tai muu orgaanisen hapon anioni, a) yhdiste, jolla on kaava NH--CH-B-Y3 · HW (5) 20 k3a jossa Y3 ja z ovat edellä määriteltyjä, W on Cl tai Br ja R3a on substituoitu alkyyli -(CH^.-W1*, -CH(CH3 )-CH2)2-Wla, -CH2-CH(CH3)-CH2-Wla, -(CH2 )2-CH( CH3 )-Wla tai . 25 -(CH2 )2-CH(CH3)2-Wla, jossa Wla on Cl tai Br, saatetaan reagoimaan aminohapon tai peptidin kanssa, jolla on kaava R1[(A3)q(A2)p(A1)o]n- 30 jossa A1, A2, A3, R1, n, o, p ja q ovat edellä määriteltyjä, jolloin saadaan yhdiste, jolla on kaava R1[(A3)n(A2)n(A1)ft] -NH-CH-B-Y3 . HW (6) y p ° 11 I <jk 35 RJO 97297 jossa Y3, W, R1, A1, A2, A3, n, o, p ja q ovat edellä määriteltyjä, R3b on substltuoltu alkyyli -(CH2),-W2, -CH(CH3)-CH2)2-W2, -CH2-CH(CH3)-CH2-W2, -(CH2)2-CH(CH3)-W2 tai -(CH2)2-CH(CH3)2-W2, jossa W2 on Cl tai Br, tai 5 b) saatetaan edellä saatu kaavan 6 mukainen yhdiste reagoimaan alkalimetalliatsidin kanssa, jolloin saadaan yhdiste, jolla on kaava H1t(A3)(A2)(A1)1-NH-CH-B-Y3 · HW (7) SI P un ok 10 r3D jossa Y3, R3b, W, R1, A1, A2, A3, n, o, p ja q ovat edellä määriteltyjä ja W2 on N3; pelkistetään edellä saatu kaavan 7 mukainen yhdiste orgaanisen- tai mineraalihapon, 15 edullisesti bentseenisulfonihapon, läsnä ollessa, jolloin saadaan yhdiste, jolla on kaava R1[(A3) (A2)_(A1)] -NH-CH-B-Y3 · HW (8) 4. un | o R3C 20 jossa Y3, R1, A1, A2, A3, n, o, p ja q ovat edellä määriteltyjä, W on Cl, Br, -C6H5S03 tai muu orgaanisen hapon anioni ja R3c on substituoitu alkyyli -(CH2)l-W2‘, -CH(CH3)-CH2)2-W2\ -CH2-CH(CH3)-CH2-W2‘, - (CH2) 2-CH (CH3) -W2a 25 tai -(CH2)2-CH(CH3)2-W2‘, jossa W2a on NH2, minkä jälkeen ede llä saatu kaavan 8 mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan edelleen syanamidin kanssa alemmassa alkoholissa 50 -150 eC:n lämpötilassa, tai B) booriaminohappojohdannaisen valmistamiseksi, 30 jolla on kaava R1[(A3)rr(A2)n(A1) ] -NH-CH-B-Y3 · HW (10) q P un | «a R3 35 jossa 97297 Y3 on ryhmä, joka on johdettu dihydroksiyhdistees-tä, jossa on ainakin kaksi hydroksiryhmää, joita erottaa ainakin kaksi yhdistävää atomia ketjussa tai renkaassa, jolloin ketju tai rengas sisältää 2-20 hiiliatomia ja 5 mahdollisesti heteroatomin, joka voi olla N, S tai 0; R3 on substituoitu alkyyli, joka on -(CH2),-WX, -CH(CH3)-(CH2)2-WX, -CH2-CH (CH3) -CH2-WX, -(CH2 )2-CH( CH3)-W1 tai -(CH2)2-CH(CH3)2-W1, jossa W1 on -SC(NH)-NH2 ja W on Cl tai Br, 10 n, o, p, q, z, A1, A2, A3 ja R1 ovat edellä määri teltyjä, kaavan 6 mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan tiourean kanssa, ja/tai C) kaavan I mukainen yhdiste, jossa Y1 ja Y2 yhdessä muodostavat ryhmän, joka on johdettu dihydroksiyhdis-15 teestä, jossa on ainakin kaksi hydroksiryhmää, joita erottaa ainakin kaksi yhdistävää atomia ketjussa tai renkaassa, jolloin ketju tai rengas sisältää 2 - noin 20 hiiliatomia ja mahdollisesti heteroatomin, joka voi olla N, S tai O, 20 a. (i) liuotetaan vesipitoiseen orgaaniseen hap poon ja liuokselle tehdään ioninvaihtokromatografia käyttäen orgaanisessa hapossa olevaa 0 - 0,3 N mineraalihap-pokonsentraatiogradienttia, ja ii) erotetaan pylväskromatografisesti tai geeli-25 suodatusta käyttäen, jolloin saadaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa Y1 ja Y2 ovat OH-ryhmiä; tai b. (i) saatetaan reagoimaan BCl3-ylimäärän kanssa metyleenikloridissa -78 - 0 °C:ssa, ii) saatetaan kosketukseen veden kanssa ylimääräi-30 sen BCl3:n hydrolysoimiseksi, iii) laimennetaan sopivalla vesipohjaisella 1 - a · 50-%:isella orgaanisella hapolla, jotta saadaan HCl:n kon-sentraatioksi 0,01 - 0,05 M, iv) erotetaan vesifaasiin, jolle sitten - 97297 v) suoritetaan ioninvaihtokromatografia, jolloin saadaan kaavan 1 mukainen yhdiste, jossa Y1 ja Y2 ovat OH-ryhmiä, ja/tai D. kaavan I mukainen yhdiste, jossa Y1 ja Y2 ovat 5 hydroksyyliryhmiä, saatetaan edelleen reagoimaan vesipoh jaisen fluorivetyhappoylimäärän kanssa, jolloin saadaan kaavan I mukaista yhdistettä, jossa Y1 ja Y2 ovat fluori-atomeja, ja haluttaessa muutetaan saatu kaavan 1 mukainen yhdiste fysiolo-10 gisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi Ac-(D)Phe-Pro-booriArg-OH.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-15 n e t t u siitä, että valmistetaan peptidi Boc- (D) Phe-Phe-booriIrg-C10H16Br.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi Bz-Glu( OBu )-Gly-booriIrg-C10H16HBr.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan peptidi Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boorilrg- C10H16HBr.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi . 25 Ac-Ala-Lys(Boc)-booriIrg-OH-HCl.

7. Yhdiste, tunnettu siitä, että sillä on kaava NH2-<jJH-B-Y3 · HW (II)

30 R3 jossa Y3 on ryhmä, joka on johdettu dihydroksiyhdistees-tä, jossa on ainakin kaksi hydroksiryhmää, joita erottaa 35 ainakin kaksi yhdistävää atomia ketjussa tai renkaassa, jolloin ketju tai rengas sisältää 2-20 hiiliatomia; 97297 R3 on substituoitu alkyyli -(CH2)l-W1“, -CH(CH3)-(CH2)2-Wle, -CH2-CH(CH3)-CH2-Wle, -(CH2 )2-CH( CH3 )-Wle tai -(CH2)2-CH(CH3)2-wu; W ja Wle ovat toisistaan riippumattomasti Cl tai Br? 5 ja z on 3 - 5.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että R3 on -(CHjJ.-W1 ja z on 3 tai 4.

9. Yhdiste, tunnettu siitä, että sillä on 10 kaava H1[(A3)(A2) (A1) 1 -NH-CH-B-Y3 (III) 4 tr on | a R 15 jossa Y3 on ryhmä, joka on johdettu dihydroksiyhdistees-tä, jossa on ainakin kaksi hydroksiryhmää, joita erottaa ainakin kaksi yhdistävää atomia ketjussa tai renkaassa, jolloin ketju tai rengas sisältää 2-20 hiiliatomia;

20 R4 on substituoitu alkyyli -(CH2)t-W2, -CH(CH3)-(CH2)2-W2, -CH2-CH(CH3)-CH2-W2, -(CH2)2-CH(CH3)-W2 tai - ( CH2) 2-CH (CH3) 2-W2; W2 on Cl, Br tai N3; z on 3 - 5;

25 A1, A2 ja A3 ovat toisistaan riippumattomasti L- tai D-muodossa olevia aminohappoja ryhmästä Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ja Vai, R1 on 1 - noin 20 hiiliatomia sisältävä asyyli- tai 30 sulfonyyliryhmä, vety tai N-terminaalinen suojausryhmä; ja n, o, p ja q ovat toisistaan riippumattomasti 1 tai 0.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että R4 on -(CH2)X-W2 ja z on 3 tai 4. 97297