PT87652B - Processo para a preparacao de derivados peptidicos do acido boronico apropriados como inibidores de proteases semelhantes a tripsina - Google Patents

Description

A presente invençso refere-se genericamente a derivados de ácido alfa-amino-bordnico ao C-terminal da lisina, ornitina, arginina, homo-arginina e seus compostos analogos de iso-tie-urani© correspondentes e à sua utilização como inibibidores de serina protease idênticas a tripsina tais como a troabina, calicreina plasmática e plasmina.

Anteeedentes da Invenção

A actividade de diversos sistemas biológicos é determinada indirectamente por enzimas hidrolítío^{as ou} proteollticas que clivam as preteinas precursoras em localizações específicas. Existem quatro classes destas enzimas, metalo, tiol, ácido e serina proteases. Os sistemas tais como os de coagulg, ção sanguínea, de fibrinolise, complementar e de calicreina-quinina sã© todos regulados por uma sub-classe de serina pro teases, as proteases idênticas à tripsina, um grupo de enzimas que possui uma especificidade primária para os resíduos arginilo ou lisilo.

Para cada classe são idênticos os mecanismos de acção e os resíduos io local activo das enzimas assim como a sua sus, ceptibilidad· para os inibidores específicos da classe. Con-. tudo, a capacidade de um composto para inibir eficazmente uma protease particular ou uma sub-classe particular de proteases está fortemente dependente da estrutura e da composição do com posto.

Tem-se desenvolvido bastante investigação na área de inibição de proteases e diversos investigadores deste domínio experimentaram inibidores contendo boro.

Shenvi, patente de invenção norte-americana Νδ *+537773 (1985), refere por exemplo que os compostos análogos de ácido alfa-amino-borónico de aminoácidos contendo cadeias laterais alquílicas alifáticas e aromáticas são inibidores eficazes de metalo-enzimas. Além disso, Shenvi e outros, patente de invenção norte-americana Νδ *+*+99082 (1985) descreve que os ácidos alfa-amino-borónicos incorporados nos péptidos inibem as serinas proteases cujas exigências de especificidade primárias são ajustadas por cadeias laterais neutras tais como a elastase pan creática dos leucócitos, quimotripsina e catepsina G. Esta última Patente descreve tetrapeptidos constituídos por resíduos de ácido alfa-amino-borónico de C-terminal que constituem poderosos inibidores reversíveis de tais enzimas proteoliticas. Todavia os péptidos descritos não englobam os resíduos de acido alfa-amino-borónico de C-rterminal de lisina, ornitina, arginina, homo-arginina ou quaisquer dos seus sais de iso-tio-urânio correspondentes.

Koehler e outros, Biochemistry 10 : 2*+77 (1971) descrevem que 0 ácido 2-feniletano-borónico é um inibidor de quimotripsina. Matteson e outros, J. Am. Chem. Soc. 103: 5241 (1981), descrevem a síntese de ácido (R)-l-acetamido-2-feniletano-borónico e a sua utilização como inibidor de quimotripsina. Os autores apresentam um valor de yai.

Lienhard em Bnzvae Inibitors as Druas. Sandler, ed., University Park Press, Baltimore pp. 43-51 (1980) admite que os compostos análogos peptidicos de ácidos alfa-amino-borónico serão poderosos inibidores das serina e tiol-proteases.

Faz-se ainda referência a trabalhos como os de Kinder e outros, J. Med. Chem. 28: 1917-1925 (19θ5)> θπι que se descreve os ácidos N-aciln e dipeptido borónicos e os compostos análogos de difluoro-borano de fenil-alanina, fenil-glicina, alanina, valina e isoleucina e também Matteson, Organometallics 3.: 1284-1288 (1984), em que se descreve a sintese de esteres alfa-amido-bortínicos-gama substituídos. Estes últimos autores afir rnarn que estes compostos foram preparados como possíveis precur sores de compostos análogos ao ácido borónico de arginina e pro lina.

As proteases idênticas a tripsina são extremamente importantes para controlar diversos processos fisiológicos. Para a discussão de tal actividade ver Proteases and Biological Control, Reich, Rifkin e Shaw eds., Cold Spring Harbor Press (1975)”. A trombina, um tipo de protease idêntica à tripsina possui uma função clara e decisiva no processo de coagulação do sangue. A coagulação do sangue pode ocorrer segundo uma de duas cascatas de activações zimogénias. A última protease em cada uma destas vias é a trombina, a qual actua para hidrolisar o fi brinogénio formando a fibrina a qual por sua vez se agrega para

fõrmar um coágulo sanguíneo. Esta hidrólise catalisada pela trombina é essencial para o processo de coagulação sanguínea.,

A calicreina do plasma, outra protease idêntica à tri£ sina, também está envolvida no processo de coagulação do sangue, especialmente no início de uma das vias de coagulação do sangue. A calicreina actua também sobre o quininogénio para libertar o nonapéptíio, bradiquinina. A bradiquinina é um péptido hipotensor associado à dor. Além disso,pensa-se que a calicreína possui outras funções biológicas. Informação recente sugere que a calicreina do.plásma está envolvida nos estados de inflamação. Baumgarten e outros, J. Immun. 137: 977-982 (1986), por exemplo, referem elevados níveis de quinina β de calicreina em indivíduos alérgicos estimulados com alergeno.

Wachtfogel e outros, Blood 67: 1731-1737 (1986), referem que a calicreina do plasma agrega os neutrófilos humanos e liberta a elastase dos neutrófilos. A libertação de elastase e a associda destruição de tecidos determinada indirectamente pela elastase são fenómenos associados ao processo de inflamação.

A concepção de inibidores específicos de enzimas idênti cas à tripsina para controlar processos biológicos nao constitui um conceito novo. Têm-se desenvolvido esforços particulares para a preparação de inibidores de trombina para substituir a heparina no tratamento de tromboses sem os efeitos secundários associados à terapia com heparina, ver Markwardt TIPS 153-157 (I98O) e Green e outros, Thromb. Bes. 37: 1^5-153 (1985).

Kettner e outros, Methods in Enzimology 80: 826-8^-2 (1981) prepararam clorometilcetonas peptídicas altamente eficazes para di versas proteases idênticas à tripsina. Como exemplo, H-(B)Phe-Pro-ArgCí^Cl, é altamente eficaz na inibição de trombina <K_± = 37 nM) e, conforme demonstrado por Shaw e outros na paten te de invenção dos Estados Unidos Νδ 4318904 (1982), é eficaz para evitar a trombose coronária experimental no coelho. Do mesmo modo, Bajusz e outros, Int. J. Peptide Proteín Res. 12 : 217-221 (1979)> afirmam que o aldeído peptídico N-(D)Phe-Pro-Arg-H é um inibidor eficaz da trombina (K^ = 75 hK) e Tremoli e outros, Thromb. Res. 23: 549-553 (1981), afirmam que um compos to associado Boc-(D)Phe-Pro-Arg-H reduz a trombose venosa no rato.

Também se demonstrou que as amidas de arginina substituí da- compostas de aminas secundárias são eficazes como inibidores de trombina. Kikumoto e outros, Bioehemistry 23: 85-80 (1984), afirma que o ácido (2R-4R)-4-metil-V N²- (3-metil-l,2,3A^tetrahidr^o-8-quinolinil)sulfoⁿil J -L-arginil /-2-piperidina-carboxílico é um inibidor de trombina (K^ = 19 nM). Conforme descrito por Green e outros, Thromb. Res. 22: 145-153 (I985)) este inibidor aumenta os tempos de protrombina plasmáti ca, duas vezes, nos ensaios de coagulação do sangue in vitro, a 1 jdM, e reivindica-se que se trata de um agente que reforça a fi brinóllse para ser utilizada em combinação com o activador plasminogénio de tecidos segundo Yoshikuni e outros, Pedido de patente de invenção europeu O.I8I.267 (1986)”. Finamente, Sturzebecher e outros, Thromb. Res. 29: 635-642 (1983) e Kaizer e outros, Thromb. Res. 43: 613-620 (I986)”, afirmam que o piperideto de N-alfa-(2-naftil-sulfonil-glicil)-4-amidino-fenil-ala nina é 0 mais eficaz inibidor de trombina conhecido (K^ = 6 nM), e demonstra que é eficaz no rato e no murganho in vivo.

Apesar do que se disse anteriormente são necessárias novas e melhores classes de inibidores de trombina e de outras enzimas idênticas à tripsina para proporcionar agentes terapeu ticos potencialmente valiosos para o tratamento de perturbações associadas à coagulação do sangue, estados inflamatórios e outras doenças dos mamíferos. A presente invenção é objectivamente orientada para este fim.

SUMARIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona compostos de fórmula, ^RrZ(A₃)_q (Αρθ^-ΝΗ-ΟΗ-Β

Y_o

2 /FÓRMULA. 1/ na qual

Y^ e Y₂ representam cada um independentemente, um átomo de flúor ou um grupo hidroxi ou, considerados em con junto constituem um radical derivado de um composto di-hidroxi possuindo pelo menos dois grupos hidroxi separados por pelo menos dois átomos de ligação numa cadeia ou anel compreendendo a referida cadeia ou anel um a vinte atomOi de carbono e, opcionalmente, um heteroátomo que pode ser um átomo de azoto, enxofre ou oxigénio;

Rg representa um grupo alquilo substituido escolhido entre grupos de fórmula geral -(CHg)_z-X, -CHÍCH^)-(CHgíg-Xj

-CHg-CHCCHp-CHs-x, -(CH₂)₂-CH(CH₃)-X, e em que X representa um grupo

-(CH₂)₂-CH(CH₃)₂-X, -NH₂, -NH-C(NH)-NH₂ ou

-S-C(NH)-NH₂, e Z é um número de 3 a 5j n, o, p, e q representam, independentemente, o número 1 ou 0;

A^, θ ^3 independentemente, aminoácidos de configuração L ou D seleccionados no grupo cons tituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His,

Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Vai; e

R^ representa um péptido que comporta 1 a 20 aminoáci dos, um grupo acilo ou sulfonilo que comporta 1 a 20 átomos de carbono, o átomo de hidrogénio, ou um grupo de protecção ou N-terminal;

ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista fisiológico.

A presente invenção proporciona também composições cons tituídas por um ou vários compostos de fórmula geral I, e métodos para a utilização de tais compostos ou composições na inibi ção de serina-proteases idênticas à tripsina, tais como trombina e calicreína de plasma e para o tratamento de estados fisiológicos anormais, tais como os que implicam perturbações associa das à coagulação do sangue e estados inflamatórios, que sao induzidos por proteases idênticas à tripsina.

Além disso, proporciona também duas classes de compostos intermédios para os compostos anteriores. A primeira destas classes de compostos intermédios engloba os compostos de fór mula geral,

NH^-CH-B-Y. . HW

II

na qual representa um radical derivado de um composto dihidrg, xi que comporta pelo menos dois grupos hidroxi separados por pelo menos dois átomos de ligação numa cadeia ou anel, comportando a referida cadeia ou anel 1 a 20 átomos de carbono ;

representa um grupo alquilo substituído escolhido entre grupos de fórmula geral, -(CH₂)_z“Wp -CH(CH₃)-(CH₂)₂-Wp

-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-Wp -(CH^-CHCCH^-W.,^ e -(CH^-CíKCH^-Wi>

W e W-j- representam, independentemente um ãtomo de cloro ou bromo; e z representa um numero de 3 a 5.

A segunda classe de compostos intermédios engloba compostos de fórmula geral

Rl-/' (A₃)_q(A₂)_p(A₁)₀ 7_n-NH-CH-B-Y₃

III na qual

Ap A₂, Ay Y₃, Rp η, 0, p e q têm os significados defindos antes

R^ representa um grupo alquilo substituído escolhido nos grupos de fórmula geral, -(CH₂)_Z-W₂, -CH(CH₃)-(CH₂)₂«W₂,

-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-W₂, -(CH₂)₂-CH(CH₃)-W₂, θ

-(CH₂)₂-CH(CH₃)₂-W₂;

W₂ representa 0 átomo de cloro, bromo ou Ny e z representa um numero de 3 a 5.

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA

A figura 1 representa um gráfico de tempos de coagulação relativos em função da concentração de inibidor para dois inibidores da presente invenção, H-CDjPhe-Pro-boroArg-C^QHe Boc-(D)Phe-Phe-boroArg-C^₀H·^^. Os dados para a figura 1 foram obtidos através das Tabelas 3 e 4. Os tempos de coagulação relativos são os tempos de tromboplastina parcial activada (AOTT) ou os tempos de protrombina (PT), conforme o caso, na pre sença do inibidor, dividido pelo APTT ou o PT, respectivamente, na ausência do inibidor. A concentração do inibidor apresenta-se em unidades micromolares (yuM ).

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Os compostos principais da presente invenção, os compos tos de fórmula geral I, são os derivados peptldicos e N-acíclicos de ácidos alfa-amino-borónicos nos quais o resíduo C-terminal e constituído por lisina, ornitina, arginina, homo-arginina e correspondentes análogos de iso-tio-urdnio. Estes compostos caracterizam-se pela sua potência como inibidores de algumas en zimas proteolíticas idênticas à tripsina, especialmente a trombina humana, a calicreína do plasma e a plasmina.

átomo de boro terminal do ácido dos compostos da presente invenção pode estar opcionalmente sob a forma de um ácido bordnico não protegido, isto é, quando Yj θ ^Y2 ^rQP^resenta^rem> independentemente, um grupo hidroxilo, ou difluoreto de borano, isto é, quando Y₁ e Y'₂ representarem, cada um, -F, ou suas asso ciações. Em alternativa, o átomo de boro terminal pode ser

profcegldo com uma ampla diversidade de grupos de protecção em que Yj e Y₂ considerados em conjunto (-Y^-Y^-) formar um radical.

Os grupos de protecção apropriados em que Y^ e Y₂ repre sentam -Y^-Y₂- englobam os radicais derivados dos compostos, principalmente diáis, possuindo pelo menos dois grupos hidroxi separados pelo menos por dois átomos de ligação numa cadeia ou núcleo. 0 termo cadeia” significa radicais eventualmente ramificados. A cadeia ou núcleo é constituida por 1 a 20 átomos de carbono e pode englobar facultativamente um heteroátomo que pode ser um átomo de azoto, enxofre ou oxigénio. Os compostos abrangidos pelo âmbito da descrição anterior são por exemplo, o pinanodiol, pinacol, perfluoro-pinacol, etilenoglicol, dietilenoglicol, catecol, 1,2-ciclohexanodiol, 1,3-propanodiol, 2,2-bu tanodiol, 1,2-butanodiol, 1,4-butanodiol, glicerol, dietanolami na e outros aminoálcoois e compostos equivalentes que são evidentes para um especialista na matéria.

Em toda a Memória Descritiva aplicam-se as seguintes abre viaturas para os aminoácidos ou radicais de aminoácidos:

Ala = L-alanina

Arg = L-arginina

Asn = L-asparagina.

Asp = ácido L-aspártico

Cys = L-cysteína

Gin = L-glutamina

Glu = ácido L-glutânico

Gly = glicina

His = L-histidina

Ile = L-isoleucina

Leu = L-leucina

Lys = L-lisina

Met = L-metionina

Phe = L-fenilalanina

Pr© = L-prolina

Ser = L-serina

Thr = L-treonina

Trp = L-triptofano

Tyr = L-tirosina

Vai = L-valina

Quando precedidas por “D, as abreviaturas anteriores significam um aminoácido com a configuração D . Quando precedidas per existir ”D ou L, as abreviaturas anteriores significam que © aminoácido pode apresentar-se na configuração D ou na configu ração L .

Grupo de protecção N-terminal conforme aqui utilizado refere-se a diverses grupos de protecção amino-terminal utilizados na síntese dos pêptidos. Os exemplos de grupos adequados englobam os grupos de protecçao acilo, por exemplo, formilo, ace tilo (Ac), benzoílo (Bz), trifluoro-acetilo, e metoxi-succinilo (Me (MeOSuc)j grupos de protecção uretano aromáticos, por exemplo, benziloxi-carbonilo (Z); e grupos de protecção uretano alifáticos, por exemplo, terc.-butoxi-carbonilo (Boc) ou adamantiloxi-carbonilo. Mienhoffer, eds,, Peptides, Vol. 3-88 (1981)_} Academic Press, New York 1981, descreve diversos grupos de protecção amina adequados.

As fórmulas seguintes representam grupos de protecção

N-terminal preferidos:

II

AC « GH^-CBoc = (CH '

Bz

Os compostos da presente invenção que possuem grupos amino na cadeia lateral, por exemplo, em que A^, A₂ ou A^ representam Lys ou Arg, podem conter opcionalmente grupos de pr© tecção N-terminal adequados ligados às cadeias laterais; do mesmo modo, os resíduos aminoácidos que possuem cadeias laterais ácidas ou hidroxi podem ser protegidos sob a forma de esteres ou éteres t-butílicos, benzílicos ou outros ésteres ou éteres adequados.

Conforme indicado anteriormente, R₂ refere-se a um grupo alquilo constituído por 3 a 5 átomos de carbono ligados a um grupo amino, guanidino, ou iso-tio-urónio. De preferência, R₂ representa o grupo de fórmula geral “(θΗ₂)_ζ-Χ. Com maior preferência R₂ representa um grupo de fórmula geral -(CH₂)_Z-X em que z representa 3 ®u A. Os exemplos de grupos com maior prefe rência representados por R₂ englobam 3-gufenidino-propilo, 3-ami no-propilo, e 4-amino-butilo, sendo o mais preferencial, 3-guanidino-propilo.

ii

aminoácido de fórmula geral I em que o grupo carboxilo terminal, -CO₂H, tenha sido substituído por um grupo funcional borónico de fórmula geral,

Assim, boroarginina” ou boroArg- refere-se a análogos dó ácido borónico de arginina; borolisina ou boroLys refere-se a análogos de lisina do ácido borónico; e boroornitina ou boroOrn refere-se a análogos de ornitina do ácido borónico. 0 prefixo homo, tal como utilizado em homoboroarginia ou homoboroArg- refere-se a análogos de boroarginina em que a cadeia lateral possui um grupo metileno adicional. ^Hlrg” refere-se a análogos iso-tio-urónicos de arginina ou homo-arginina ea que o grupo tio-urónio , -S-C(NH)NH_2> substitui o grupo guanidino, -NH-C(NH)-NH₂, e borolrg- ou boro-homoIrg- é a abreviatura para o correspondente análogo de ácido bo rónico.

Na designação dos compostos da presente invenção, Y^ e Y₂ são simplificados pelo sufixo -F para os difluoroboranos (Y^ = Y₂ = -F), -OH” para os ácidos borónicos não protegidos (Y^ = Y₂ = -OH), “6^12 ^os ®^steres óe Pinacol (Y^ e Y₂ considerados em conjunto representam -C&H 1₂), e -C_1OH₁₆ para os ésteres de pinanodiol (Y-^ = Y₂ considerados em conjunto representam

A presente invenção contempla também os sais de fórmula geral I fisiologicamente aceitáveis. Estes sais englobam os sais

3Α ,% de adição de ácido, por exemplo, sais de ácido benzeno-sulfénico (BSA), ácido clorídrico (HC1), ácido bromídrico (HBr), ác^ do acético, ácido trifluoro-acético (TFA), ácido succínico, áci do cítrico ou outros sais de adição de ácido adequados. Quando utilizados na numenclatura de compostos da presente invenção, estes sais serão introduzidos no nome do composto através de n » • ·

As classes de compostos contempladas pelo âmbito da pre sente invenção englobam os seguintes aminoácidos de configuração D- ou L-. Uma primeira classe engloba os compostos em que A^ representa Ala, Pro, Gly, Vai, Leu, Ile, ou met, isto é, um aminoácido que possua uma cadeia lateral neutra. Uma segunda classe engloba os compostos em que A^ representa Phe, Trp ou Tyr, isto é, um aminoácido que possua uma cadeia lateral aromática. Uma terceira classe engloba os compostos em que A^ repre senta Lys ou Arg, isto é, um aminoácido básico, e uma quarta classe engloba compostos em que A^ representa Ser ou Thr, isto é, um aminoácido com uma cadeia lateral hidroxi. Finalmente, uma quinta classe engloba compostos em que A^ representa Asp, Glu, Asn ou Gin, isto é, um aminoácido com uma cadeia lateral ácida ou carboxamida. Os substituintes representados por A-^ pre feridos, englobam Lys, Phe, Pro, Ala, Leu, Gly, Glu, Vai,Thr, Ile, Met, Tyr, Trp, Arg,Asp, Asn, e Gin. Uma classe preferida de tais substituintes inclui Lys, Phe, Pro, Ala, Leu, Gly, Glu, Vai e Thr.

As classes principais anteriores englobam subclasses correspondentes a grupos preferidos representados por R^, e estas subclasses são ainda constituídas por grupos definidos pelos

grupos representados por A₂ preferidos e grupo de protecçâo N-terminal representado por R-^.

A₂ representa de preferencia todos os aminoácidos que possuam uma configuração D , mais preferencialmente (D)Phe ou outros grupos preferenciais como (D ou L) Phe, (D ou L) Ala, (D ou L) Phe, (D ou L) Ala, (D ou L) Leu, (D ou L) Pro, (D ou L) Glu e (D ou L) Gly. Outra classe de substituintes represen tados por A₂ engloba (L) Clu e (D) Val.

De preferência, os compostos de fórmula geral I possuem um total de dois a quatro substituintes aminoácidos, incluindo o aminoácido análogo de boro. Um composto de três aminoácidos que possua Pro na posição representada por A-^ e boroArg como análogo de boro aminoácido, tal como representado na fórmula ge ral

Rj.-CDÍPhe-Pro-boroArg^ é particularmente adequado como inibidor de trombina possuindo um valor ΟΙ^θ ignificativamente inferior a

Equivalentes dos compostos anteriores englobam os compostos constituídos pelos aminoácidos modificados ou menos vulgares, por exemplo norleucina, hidroxiprolina, ácido piroglutãnico ou outros derivados, incluindo os resíduos com grupos de protecçâo da cadeia lateral, suseeptíveis de serem englobados nos péptidos de ácido alf-amino-borónico da presente invenção.

Os compostos específicos abrangidos pelo âmbito da presente invençSo, designados de acordo com as invenções anteriormente descritas, englobam os exemplos seguintes:

Ac-(D_zL)Phe-boroArg-C_{x 0}Η_{χ f} «BSA Ac-Phe-boroOrn-C_{x θ} Η_{χ (}«BSA Ac-Phe-boroArg-C_{x 0} Η_{χ f}«HCI H- (D)Phe-Pro-borolrg-C_{x 0} Η_χe «HBr «HCI Boc-(D)Phe-Pro-borolrg-C_{x 0 e} «HBr Ac-Phe-boroIrg-C_xeH_{x t} «HBr Ac-Ala-Lys (Boc)-boroOrn-C_aíH_{x t} -BSA A.c-Ala-Lys (Boc)-borolrg-C_xΛΉ_{χ β} ·ΗΒγ Boc-(D)Phe-Pro-boroArg-C_{x f}«BSA

Boc—(D)Phe-Phe-Borolrg-C_{x O}H_{X f} »HBr H-{D)Phe-Pro-boroArg-C_xoH_xí «HCI Boc-(D)Phe-Phe-boroOrn-C_{x β}H_{x t} »BSA Boc-(D)Phe-Phe-boroArg-C_{x 0}Η_{χ (} «BSA Ac-Ala-Lys(Boc)-boroArg-C_{x 0}Η_{χ t} «BSA Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-C_xeH_1<-HCI Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH«HCl Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boxol r^-C_{x β} H_{x t}«HBr Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boxoOm-C_{x β} H_{x (}«BSA Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-C_x0 Η_{χ f}*BSA Bz-Pro-Phe-boroOrn-C₁₀H_x< »BSA Bz-Pro-Phe-boroArg-C_{x 0} Η_{χ e}\BSA Boc-Ala-Phe-(D,L,borolrg-C_e H_{2 2}·ΗΒ r Bz-Glu(OBu)-Gly-boroIrg-C_xoH_{x f} »HBr Bz-Glu-Gly-boroArg-C_{x 0} Η_{χ 6} -BSA Bz-Glu(OBu)-Gly-boroOrg-C_x „ Η_{χ f}«BSA Bz-Glu(OBu)-Gly-boroArg-C_ieH_{1 s} *BSA Bz-Pro-Phe-boroIrg-C_x0Η_χ-HBr Z-Phe-Gly-Gly-borolrg-C_x0Η_χ6 -HBr Boc-Ala-Phe-(D,L)borohomolrg-C_e Η_{χ 2} -HBr

Bz-Pro-Phe-boroArg-OH «HCl Bz-Pro-Phe-bocoArg-F H-(D)Phe-Pro-boroArg-C_ieH_ie *2HCl H-(D)Phe-Phe-boroArg-C,_eHj_f «2HC1 Ac-Ala-Lys-boroArg-Cj _βΗ₁₄ ·2Η0ΐ H-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-C, ₀ H₁, -HCl^BSA Boc-Ala-Phe-(D,L)bo roLys-C, h_{2 2} ·HCl H-Ala-Phe- (D, L)boroLys-^ Η_{χ 2} · 2HC1 Boc-CDíVal-Leu-boroLys-CjHj ₂ «HCl Ac-Phe-boroLys-CjHj₂ *HCl Bz-Glu-Gly-boroArg-C₁₀ H_{2 f} °BSA H-ÍDjPhe-Phe-boroIrg-CjjHj, »2HBr H-Leu-Gly-Leu-Ala-boroIrg-C₁₀H_{1 4} -2HBr H-Ala-Phe-(D,L)borolrg-CjH₂₂ «2HBr Bz-Glu-Gly-boroIrg-C₁₀H_le *HBr H-Ala-Phe-ÍDfDboroHomoIrg-Cj Η_{χ 2} «2HBr Ac-Ala-Lys-boroIrg-C_ieH_1<·2ΗΒΓ Bz-boroIrg-CjH₁₂ *HBr Bz-boroOrn-C_e H_{2 2} «BSA Bz-boroArg-C_eH₁₂-BSA

Ac-Leu-Thr {OBu) -bo τoOrn-C_{2 β} Η_{χ f} · BSA Ac-Leu-Thr(OBuJboroArg-Cj ₀ H_{t t} «BSA Ac-Leu-Thr-boroArg-Cj _β Η_χ, «BSA Ac-Lys(Boc)-Pro-boroOrn-Cj _e H_{2 g} «BSA Ac-Lys(Boc)-Pro—boroArg-C, ₀H_{x (}«BSA Ac-Lys-Pro-boroArg-C₁₀Η_{χ e} *BSA Ac-Ala-GlutOBuJ-boroOrn-Cj ₀Η_{χ e}-BSA Ac-Ala-Glu(OBu)-boroArg-C₁₀ Η_{χ 6}«BSA Ac-Ala-Glu-boroArg-Cj ₀ Η_{χ s}«BSA Boc-Val-Val-boroLys-CjΗ_χ2-BSA H-Val-Val-boroLys-C₆ Η_{χ 2} «BSA«TFA Boc-(D)Phe-Fhe-boroLys-C₆ Η_{χ 2}BSA H-(D)Phe-Phe-boroLys-C_ÉH₁₂ «BSA»TFA Boc-Glu-Phe-boroLys-CjH₂₂ *BSA PyroGlu-Phe-boroLys-CjHj₂ *BSA

A presente invenção proporciona também composições e métodos para inibir as serina proteases idênticas à tripsina que incluem mas não se limitam, a trombina, calicreína plasmática, plasmina, e para o tratamento de mamíferos em estados fisiológicos normais que abrangem mas não se limitam a coagulação do sangue e estados inflamatórios. As composições da pre sente invenção são constituídas por uma quantidade eficaz de um composto de fórmula geral I e de um veieulo ou diluente aceitável sob o ponto de vista fisiológico. Na prática do método da presente invenção, e possível utilizar os compostos ou composições isolados ou suas associações ou em combinação com outros agentes terapêuticos. Podem ser administrados oral, paren teral, intravenosa, subcutânea, intramuscular, rectal, nasal ou intraperitoneal ou através do cólon sob diversas formas de dosa gem. A dose útil que se deve administrar e o modo de administra çao variará com a idade, peso e com o animal mamífero tratado e com os compostos particulares utilizados. Tipicamente, inicia-se a terapia com baixos níveis de dosagem aumentando-se esta até se conseguir o efeito pretendido.

A presente invenção contempla também duas classes de compostos intermédios críticos para os compostos de fórmula geral I, os compostos de fórmula geral II e III. Os compostos intermédios de fórmula geral II englobam compostos de fórmula, geral,

NHo-CH-E-Y.

HW

II na qual

Y₃ representa um radical derivado de um composto dihidroxi comportando pelo menos dois grupos hidroxi separados por pelo menos dois átomos de ligação na cg.

deia ou anel, sendo a referida cadeia ou anel comportada⁷' por 1 a 20 átomos de carbono;

representa um grupo alquilo substituído seleccionado entre o grupo constituído por grupos de fórmula geral -(CH₂)_z-W₁, -CHÍCH^-tC^yWp -C^-CHCC^-W-j^, -(CH₂)₂-CH(CH₃)-·!^ e -CH^-CHÍCH^-W^

W e Wj representam, independentemente, um átomo de cloro ou bromo; e z representa um número inteiro de 3 θ 5.

Um composto particularmente preferido de fórmula geral II é aquele em que R^ representa um grupo de fórmula geral -(CH₂)_z-Wj e z representa o número 3 ou 4,

Utaa segunda classe de compostos intermédios engloba os compostos de fórmula geral

R_rr (A₃) _q(A₂) _P (A_T )₀,7_n-NH-CH-B-Y na qual

Ap A₂, A_3> Yp Rp η, o, p e q têm os significados definidos antes;

R^ representa um grupo alquilo substituído seleccionado entre o grupo constituído por grupos de fórmula geral

-(CH₂)_z-W₂, -CH(CH₃)-(CH₂)₂-W₂, -CH₂-CH(CH₃)- ch₂-w₂,

-(CH₂)₂-CH(CH₃)-W₂, e -(CH₂)₂-CH(CH₃)₂-W₂;

W₂ representa um átomo de cloro, bromo ou e z representa um número desde 3 a 5.

As classes de compostos abrangidos pela fórmula geral III são as descritas p^ra os análogos de fórmula ger?>l I. Compostos particularmente preferidos de fórmula geral III são aqueles em que representa um grupo de fórmula geral -(CH₂)_Z -W₂ θ z represen ta o número 3 ou *+.

Preparação de Inibidores

As temperaturas indicam-se em graus C. Os compostos numerados apresentados no esquema com o título Esquema, de Síntese”, que se ilustra a seguir, estão referidos no texto de acordo com os seus números respectivos. REN, conforme utilizados seguidamente significa ressonância magnética nuclear de protão.

Esq-.

esquema de síntese

^V‘»‘^UI_ Br-CHj-CHj-CHjCHCI.BOx-C.pH,, ((CHjJjSIhN

Ι(0Η,),5Ι1,ΝΧΙ· |

-- Br«CH,.CH,-CH,-CH>BO,-C_ieH₁₍ iquHCl |

---------- ----- , . Br-{CH,)₃-CH-BOj-C,₀H„ mp 144.145*C _^Pcptld*_ Peptid<-NH.CH.BO_í-C,_eH„

I

Br

Νι·Ν,' _*_ P»ptld*«NH-CH-BO,-C,_eH„ (CHx),

I

N,

H, MC 0-50,Η

ΝΗ·0Η·ΒΟ,·Ο,_βΗ_1β (CH,),

I

HH,· 0SO,· β

NH-CH-BO, *C_ieH_t, (CH,),

I

NH

I

C = NH I

NH,· 0SO,e

BCI,

OH

NH-CH-B^Z I 'OH (CH,),

I

NH

I

C = NH I nh,· cr

F > ⁷nh-ch-b^z I ^SF (CH,),

I

NH

I

C=NH

I nh,· cr nh-ch-bo,c„h_i( (CH,),

I s

I

C = NH

NH,· Br

Seguindo os procedimentos descritos é possivel obter compostos de fórmula gersl I, da presente invenção, com uma pureza irnediatamente utilizável, isto é, entre 80-100 %.

Os materiais iniciais encontram-se disponíveis com elevada pureza nos fornecedores de produtos químicos ou podem ser sintetizados facilmente de acordo com 'métodos convencionais.

esquema de síntese apresenta a ordem geral pela qual se sintg tizam os compostos da presente invenção. Os compostos de 1 a 4 preparam-se conforme descrito por Matteson e outros, Organometallics 3,: 1284-1288 (1984), modificado de modo a permitir a preparação em grande escala.

Preparam-se os compostos 1 por hidrogenação de um alceno halogenado com borano-catecol. Aquece-se os componentes em tetrahidrofurano ou noutro dissolvente inerte e isola-se o composto por destilação. Faz-se a trans-esterificação do éster catecólico do ácido (halogeno-alquil-substituido) borónico submetendo-o a reacção com um diol adequado (alfa-pinanodiol, pina col, 2,3-butanodiol, etc) em tetrahidrofurano. Prefere-se o (+)-alfa-pinanodiol tendo tendo em atenção as observações de Matteson e outros, J. Am. Chem. Soc. 103: 5241 (1981) que espe cificam que os impedimentos estéricos na molécula permitem a adição estereoespécifica do grupo -CHC1- na formação de compostos 3 e a introdução subsequente de um grupo amina na configura ção L. As estruturas de 3 a 9 no esquema de síntese estão apresentadas com o grupo de protecção pinanodiol. Para as preparações em grande escala consegue-se a remoção do catecol, um produto da reacção de esterificação, por cristalização com hexa no, um dissolvente em que 0 catecol possuí uma solubilidade li2k mitada. Seguidamente purificam-se os compostos 2 quer por cromatografia sobre gel de sílica, quer por destilação ou utiliza-se sem purificação adicional. Os compostos 2 , como ésteres de pinanodiol obtêm-se com um grau muito préximo de pure za analítica por remoção do dissolvente. Pode conseguir-se pu rificação adicional por cromatografia sobre gel de silica.

Para o éster de pinacol do composto 2 é preferível a purificação final por destilação.

Preparam-se os compostos 3 ^a partir de compostos 2 utilizando-se CHCl₂”Li⁺. Prepara-se este reagente tratando cloreto de metileno com n-butil-lítio em tetrahidrofurano à temperatura -100°C. Ao composto 2 , adiciona-se 0,65 equivalentes de cloreto de zinco a -100°C. Deixa-se a mistura retomar lenta mente a temperatura ambiente e mantém-se sob agitação durante a noite. Obtém-se o composto 3 apés a evaporação do dissolvente; dissolve-se depois 0 resíduo em hexano, lava-se a fase orgânica com água, seca-se com sulfato de magnésio e evapora-se, finalmente, o hexano. Utiliza-se um composto 3 sem purificação adicional, sob a forma de éster de pinanodiol e, em alternativa, pode destilar-se protegido sob a forma de éster pinacol.

Preparam-se compostos 4 tratando um éster do ácido (alfa-cloro substituído, composto 3 , com /(CH^^Si - N~Li⁺.

Dissolve-se hexametildissilazano em·tetrahidrofurano e adiciena-se um equivalente de n-butil-lítio à temperatura de -78°C.

Deixa-se a mistura retomar a temperatura ambiente e, apés novo arrefecimento para -/8°C, adiciona-se um equivalente do composto em tetrahidrofurano. Deixa-se a mistura atingir lentamente a temperatura ambiente e mantém-se sob agitação durante a noite.

Isola-se a amina protegida por alfa-bis/*trimetilsilanoJ evaporando o dissolvente e adicionando hexano sob condições anidras. Remove-se o resíduo insolúvel por filtração sob uma at mosfera de azoto proporcionando uma solução do composto 4 em hexano.

Obtém-se composto 5 arrefecendo a solução de um com posto 4 em hexano para -78°c e adicionando três equivalentes de cloreto de hidrogénio. Deixa-se a solução retomar lentamen te a temperatura ambiente e agita-se durante 1,5-2 horas.

Depois isola-se o composto 5 por filtração e purifica-se por dissolução em clorofórmio e eliminação do material insolúvel. Obtém-se o composto 5 sob a forma de um sólido cristalino branco por eliminação do clorofórmio por evaporação e cristsli zação do resíduo com acetato de etilo.

processo anterior de conversão de um composto 3 em um composto 5 proporciona, surpreendentemente, preparações analiticamente puras de compostos 5 ° que permite depois a obtenção de um composto 6 sem a dificuldade normalmente encon trada no acoplamento de material heterogéneo. Técnicas anteriores indicam ou sugerem, vincadamente, que um composto 4 de ve ser purificado antes da conversão em um composto 5. para se obterem amostras puras. 0 único procedimento conhecido para a preparação de ácidos alfa-amino-borónicos puros é o descrito por Shenvi na patente de invenção norte-americana N⁹ 4.537.773 e utilizado por Shenvi e outrosj Patente de invenção norte-americana N2 4Λ99.Ο82. Na descrição de Shenvi e outros purificam-se os análogos do composto 4 , por destilação, excepto os que possuírem cadeias laterais alquílieas ou aromáticas. Um composto 4 é instável, quando obtido por destilação segundo Shenvi et al, obtendo-se ua produto alterado. Pode preparar-se um composto 6 , a forma N-acíclica ou N-peptidílica de com postos 5 Por duas vias diferentes. A primeira consiste numa modificação do procedimento descrito por “Matteson e outros, Organometallics 3: 1282-1288 (1984)” em que se trata um composto 4 preparado in situ (sem evaporação de dissolventes e remoção de sais por filtração) com um equivalente de ácido acéti co e um excesso de anidrido acético para proporcionar N-acetil-NH-CH/* (CH₂)jBr jZB0₂-pinanodiol. Este método é aplicável à ligação do cloreto ácido, altamente reactivo, de N-acetil-fe nil-alanina (Ac-Pne-Cl) com uma modificação que consiste em se omitir o tratamento prévio com ácido acético. Quando se adiciona ácido acético em conjunto com Ac-Phe-Cl obtêm-se rendimentos extremamente baixos provavelmente devido à formação de um anidrido misto de Ac-Phe e ácido acético e acoplamento químico subsequente preferencial que origina H-acetil-HH-CHZ (¾)^ B0₂-pinacol. A aplicação do processo com anidrido misto para a preparação de compostos 6 origina rendimentos baixos do produto desejado e problemas difíceis na purificação. Deste mo do, admite-se que este método seja aplicável ao acoplamento de grupos alquilo, arilo e aminoácidos N-protegidos a um composto 4 , utilizando o método do cloreto ácido. Todavia, deve observar-se que existem limitações originadas pelo condicionameii to do processo de ligação pelo cloreto ácido. Em primeiro lugar, o procedimento não é facilmente aplicável à ligação peptidica devido a reacções secundárias, tais como a formação de oxazolinona, limitando a sua aolicannn _D „ . . . ., p ícaçao a um unico residuo aminoácido·

Sm segundo lugar, é necessário um grupo de protecçâo de ácido estável, devido ao excesso de HCl gerado durante a formação do cloreto ácido. Finalmente, a racemização do resíduo aminoácido é inerente ao processo.

segundo método para a preparação de compostos 6 consiste na ligação, a um composto 5 , de um grupo acilo ou de um péptido N-protegido com protecçâo adequada da cadeia lateral. Este método é claramente superior ao primeiro uma vez que é suficientemente versátil para permitir a síntese de qual quer péptido dentro dos limites normalmente encontrados durante a síntese de péptidos tais como a pouca solubilidade. E pos sível acoplar cloretos de ácido ou outras formas activas de grupos acilo. Para péptidos é preferível o procedimento, que utiliza anidrido misto, de Anderson e outros, J. Am. Chem. Soc. 82.2 5θ12 (I967). Os anidridos mistos de aminoácidos ou péptidos N-protegidos, desde um dipéptido até um tetrapeptido, coa grupos de protecçâo de cadeia lateral apropriados, preparam-se dissolvendo um péptido dado em tetrahidrofurano e adicionando um equivalente de N-metilmorfolina. Arrefece-se a solução para -20°C e adiciona-se um equivalente de cloroformato de isobutilo. Decorridos 5 minutos adiciona-se esta mistura um equivalente de trietilamina (ou outra base com impedimento estérico posterior) à solução do composto 5 dissolvido em clorofórmio frio ou em tetrahidrofurano. Agita-se normalmente a mis tura de reacção durante uma hora à temperatura de -20°C seguindo-se a agitação durante 1-2 horas à temperatura ambiente. Remove-se o material insolúvel por filtração e 0 dissolvente por evaporação; dissolve-se o resíduo em acetato de etilo.

Lava-se a solução organica com ácido clorídrico 0,20 N, com uma solução aquosa a 5 % dê carbonato de hidrogénio e sósdio e com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Depois seca-se a fase organica sobre sulfato de sodio anidro, filtra-se e submete-se a evaporação para se obter na maioria dos casos um produto parcialmente sólido. Para diversos compostos adaite-se não ser necessária a purificação do composto 6 .

Os métodos aplicados para a purificação dos compostos 6 são a cromatografia sobre gel de silica, cristalização, em alguns casos, e cromatografia por impregnação de gel utilizando Sephadex LH-20 e metanol como desenvolvente. & preferível o último método. Tipicamente, os espectros de NMR indicam a banda -CH₂-Br de 3,^5 delta e uma banda de singuleto estreita entre 0,80-0,95 delta para um dos grupos metilo do grupo de protecção de pinanodiol ou um singuleto de 1,3 delta para o grupo pinacol.

Converte-se depois o halogeneto de alquilo peptídico, um composto 6 , para a alquil-azida, um composto 7 , por tra tamento com dois equivalentes de azida de sódio em dimetilformamida a temperatura de 100°C durante 3 horas. Em todos os casos, esta reacção desenvolve-se moderadamente sem alteração das condições reaccionais. 0 espectro de RMN de um composto em CDCl^ indica tipicamente, para delta, entre 0,1-0,2 ppm acima do campo para -CEL-Br na conversão da azida. Pode obter -se purificação adicional por cromatografia em LH-20, que não é necessário para a maioria dos péptidos.

Os péptidos de boro-ornitina, os compostos 8 , preparam-se normalmente por hidrogenação catalítica das alquil-azi29

das, compostos 7 , na presença de Pd/C a 10 %' e de um equivalente de ácido benzeno-sulfónico em álcool. As hidrogenações' efectuam-se num aparelho de Parr. Em alternativa é possivel efectuar rs hidrogenações à pressão atmosférica e os ácidos minerais podem ser substituídos por ácido benzeno-sulfónico.

Deve notar-se a necessidade de utilizar grupos de protecção de péptidos estáveis durante a hidrogenação catalítica. Tais grupos de protecção de péptidos são conhecidos dos técnicos e encontram-se descritos em The Peptides (E. Gross e J. Meienhofer eds.) vol 3> Academic Press, New York, (1981)“. Os grupos de protecção preferidos são o grupo t-butiloxi-carbonilo para os gru pos amino e os ésteres e éteres t-butílicos^ para as cadeias laterais de ácido carboxílico e hidroxilo. Os grupos de protecção adequados englobam di-isopropil-metiloxi-carbonilo, t-amiloxicar bonilo, adamantiloxicarbonilo, bifenil-isopropiloxicarbonilo e tosilo. Ê de esperar que a conversão da azida em amida por redução com outros agentes de redução se possa obter utilizando-se reagentes tais como cloreto estanhoso e fosfitos de trialquilo conforme descrito por “Maiti e outros, Tetrahedron Lett., 27; 1423-142½ (1986) e Koziara e outros, Synthesis, 202-204 (198$)“. Oonsidera-se que estes reagentes são compatíveis com os grupos de protecção de péptidos que são instáveis nas condições de hidrogenação catalítica. Determina-se normalmente o cromatograma

TM dos péptidos de boro-ornitina sobre Sephadex LH-20” os quais são sólidos amorfos brancos após trituração com éter.

Os péptidos de boro-ornitina, os compostos 9 , preparam

-se deixando o correspondente péptido de boro-ornitina, um composto 8 , reagir com pelo menos um excesso de quatro vezes mais

3θ eianamida (50 mg/ml) em etanol absoluto à temperatura de 100°C. Inicialmente deixa-se os componentes reagir durante

2-3 dias sob uma atmosfera de azoto, em condensador arrefecj. do por água. Interrompe-se o arrefecimento por água e deixa-se a mistura de reacçao concentrar lentamente durante um perío do de vários dias. Verifica-se que a reacção está completa pelo aumento progressivo da intensidade do material de coloração com corante de Sakaguchi para o grupo guanidina da fracção de boro-arginina e o desaparecimento da coloração positiva com corante ninidrina, para o grupo amino de fracções de boro-orni tina em placas cromatográficas em camada de fase inversa tendo como desenvolvente metanol : água (85 : 15). Tipicamente, os péptidos de boro-orginina apresentam-se em riscas a partir da origem da placa, os péptidos de boro-ornitina deslocam-se como manchas discretas no meio de placa e a eianamida desloca-se com o desenvolvente permitindo que seja identificado cada componen te. As colorações específicas para 0 grupo guanidina e para o grupo amino, utilizam-se normalmente na sintese peptídica.

Os compostos 9 purificam-se por cromatografia de impregnação TM em gel utilizando Sephadex LH-20 e metanol como eluente.

Esta fase cromatográfica separa facilmente os péptidos de boro-arginia dos subprodutos de baixo peso molecular e da eianamida que não reagiu. Na maioria dos casos não é necessária outra purificação. Contudo, é essencial permitir que a reacção de guanidação do Composto 8 se complete totalmente uma vez que é difícil, se não mesmo impossível separar uma mistura de compostos 8 e 9 · Obtêm-se produtos finais sob a forma de sólidos brancos amorfos por trituração com éter e, na maioria dos

casos, são analiticamente puros conforme determinado por RMN, espectro de massa e análise de combustão.

Deve notar-se que se descobriu que a reacção de guanidação de um composto 8 com cianamida é muito dependente das condições de reacção. Em primeiro lugar, conforme snteriormen te se descreveu, é importante que a reacção se desenvolva durante um tempo suficientemente longo para originar uma conversão relativamente completa do composto 8 ro.oomposto 9.5?equentemente são necessários de reacção até 7 dias acompanhados com a concentração do reagentes por evaporação lenta dos dissolventes. Numa verificação inicial das reacções para proporcionar a guanidação do composto 8, composto 8 sob a forma de cloridrato foi submetido a refluxo com cianamida em etanol durante diversas horas. Não se detectou o produto desejado , o Composto . As tentativas para efectuar a guanidação de um composto 8 utilizando as condições bem sucedidas anteriormente descri tas, com a excepção de se ter substituído o tetrahidrofurano por etanol absoluto, não foram eficazes para proporcionar um produto detectável. De modo idêntico, quando se fez uma tenta tiva para efectuar a guanidação do composto 8 utilizando estas condições, com a excepção de o sal de ácido benzeno-sulfÕnico do grupo amido do pêptido de boro-ornitina ter sido neutralizado antes da guanidação, o composto 9 estava presente apenas em um nível detectável. As condições preferenciais implicam reacções com o sal de ácido benzeno-sulfónico do Compos, to 8 (não neutralizado). Também se fez a experiência de reacções bem sucedidas com o cloridrato correspondente.

Os métodos usuais de guanidação de pêptidos de orniti2

na para proporcionar os correspondentes péptidos de arginina, utilizados pelos especialistas em síntese de péptidos são a neutralização da amina do péptido de ornitina e o acoplamento com S-alquil- ou Q-alquil-isoureias ou nitrato de guanil-3,5~ -dimetil-pirazol, conforme descrito por Barany e outros em The Peptides (E. Gross e J. Meinhofer eds) vol 2, pp. 169-175, Academic Press, New York, (1980). Bannard e outros, Can. J. Chem. 36; 15^1-15^9 (1956)” confirmaram diferentes métodos de guanidação de aminas e descobriram que a utilização de guanil-3,5-dimetil-pirazol é superior à utilização de §-metil-isoureia, concluindo que a guanidação com cianamida é inaceitável apesar de descrita em literatura anterior. Ai reacções efectua das com hidrgeno. iodeto e hidrogénio de S-metil-isoureia em etanol e guanil-3,5-dimetil-pirazol sob uma diversidade de con dições, não foram susceptiveis de conseguir a guanidação do pé£ tido de boro-omitina. A falta de reactividade, neste caso, é provavelmente devida à formação de um complexo inteiro de base de ácido de Lewis entre o grupo amina da cadeia lateral da ornitina e o éster do ácido borónico. A síntese de compostos 9 por tratamento de compostos 0 com guanidina em etanol constitui também um étodo de síntese inaceitável. Isolou-se um composto 6 , com aproximadamente, 50 % de pureza a partir da reacção de guanidina com um composto 6 , com um rendimento inferior a 1 grupo guanidino de boro-arginina-pinanodiol comporta-se de modo idêntico ao do grupo guanidino do aminoácido arginina natural, quando incorporado na molécula. Por exemplo, pode fazer-se selectivamente a acilação de grupos alfa-amina aa com um anidrido sem afectar o grupo guanidina de boro-arginina. Deste modo, admite-se que seja possível preparar um composto 9 Por síntese de H-boro-arginina-plnanodiol e adicionando, subsequentemente, a forma N-protegida da porção peptídica da molécula utilizando o procedimento do anidrido misto e, de modo idêntico, é possível aumentar o comprimento de compostos análogos, di-, tri-, etc, peptídicos contendo boro-argi nina fazendo o acoplamento adicional de aminoácidos ou péptidos .

E possível conseguir-se purificação adicional dos péptidos de boro-arginina protegidos por cromatografia de permuta rnv iónica em SP Sephadex . Faz-se a dissolução dos péptidos em ácido acético a 20 % e aplicam-se à coluna na sua forma H⁺.

Após a lavagem da coluna com ácido acético a 20 %, faz-se a eiuição do produto utilizando um gradiente variável entre 0-0,3 N de ácido clorídrico em ácido acético a 20 /. Faz-se a eiuição do produto como mistura de éster de pinanodiol e ácido borónico isento de péptido. Obtém-se uma preparação homogénea tratando a mistura com pinanodiol sob condições anidras e trituran do o produto com éter.

Desenvolveram-se dois processos para a remoção do grupo de protecção pinanodiol para proporcionar, isento de ácido borónico, um composto 10. 0 primeiro é uma modificação do anterior processo de purificação no qual se efectua a co-eluição de uma mistura do ácido borónico livre e do ester de pinanodiol, a de uma coluna de permuta iónica. Estes compostos sepa ram-se facilmente por cromatografia em LH-20. 0 segundo proces so é uma modificação do método Kinder e outros, J. Chem. 28;

1917-1925 (1985) · Trats-se o éster de ácido borónic-o com

2-3 vezes um excesso de tricloreto de boro em cloreto de meti leno durante 5 minutos à temperatura de -78°C e deixa-se a mistura em agitação durante 15 minutos a 0°C, em banho de gelo, Adiciona-se água lentamente para hidrolisar 0 excesso de tricloreto de boro formando-se ácido bórico e ácido clorídrico. Dilui-se mais a reacção com ácido acético a 20 % para se obter uma concentração final de ácido clorídrico a 0,05 Μ. A concen tração de ácido clorídrico baseia-se na quantidade inicial de tricloreto de boro utilizada na reacção. Aplica-se a fase aquo TKí sa a uma coluna de SP-Sephadex e faz-se a eluição do produto sob a forma de cloridrato, conforme descrito antes. Obtêm-se pópetidos de ácido borónico livre sob a forma de sólidos amorfos brancos.

Pode converte-se um composto 10 em diflúoro-borano, um Composto 11, utilizando-se uma modificação do processo de Kinder e outros, J. Med. Chem. 28: 1917-1925 (1985)”. Trata-se o áci do borónico péptídico com um excesso molar quíntuplo de ácido clorídrico aquoso 0,50 N à temperatura ambiente. Remove-se 0 excesso do ácido clorídrico e a água por liofilização e triturs-se 0 só lido resultante com éter para se obter o produto desejado sob a forma de um sólido amorfo branco.

Na descrição anterio^ a preparação do ácido borónico livre, composto 10, efectua-se a partir do éster de boro-arginina-pinanodiol e a preparação do ácido diflúoro-borano, composto 11, efectua-se a partir de um composto 10. 0 procedimen to para a remoção do grupo de protecçâo éster deve aplicar-se aos péptidos acíclicos de boro-ornitina, boro-lisina e boro35

-homoarginina protegidos com pinanodiol, pinacol, ou outro grti po de protecção éster. De modo idêntico, os ácidos borónicoslivres correspondentes podem ser convertidos em difluoro-boranos.

Os grupos de protecção da cadeia lateral preferidos e os grupos de protecção N-términal da porção peptídica das moló cuias sao os que permanecem estáveis a hidrogenação catalítica e instáveis ao cloreto de hidrogénio anidro ou ao ácido trifluoro-aeético. Estes critérios são facilmente satisfeitos pelo grupo de protecção t-butiloxi-carbonilamino e éteres e ésteres t-butílicos para as cadeias laterais acidicas e hidroxílicas. Para se fazer a remoção destes grupos tratam-se os péptidos com ácido clorídrico 4N em dioxano à temperatura ambiente. Isola-se o péptido desprotegido evaporando o dissolvente ou fazendo a precipitação com éter. Deve tomar-se particular cuidado com os péptidos que contenham uma cadeia lateral acídiea ao remover -se todo o cloreto de hidrogénio por evaporação. Isto assegura que o péptido de boro-arginina se mantém sob a forma de sal do ácido benzeno-sulfónico. Outros péptidos são possíveis de isolar sob a forma de uma mistura de cloreto de hidrogénio/sal do ácido benzeno-sulfónico., ou a maior parte pode converter-se em cloridrato por passagem através de uma coluna de permuta iónica na forma ião CL,

Os derivados de iso-tiourónio de compostos 6 preparam-se por tratamento de um composto 6 com tioureia em etanol ab soluto para proporcionar compostos 12 , análogos dos ésteres dos péptidos de boro-arginina, compostos 10 . Normalmente dei xa-se em agitação os halogenetos alquilo com um excesso 4 a 5

Há vezes superior de tioureia, durante diversos dias à temperatu ra ambiente. Se necessário, separa-se o produto do composto 6 que não reagiu, por trituração com éter. 0 composto 6 dissol ve-se facilmente em éter para a maioria dos pêptidos, ao passo que o produto é insolúvel. Consegue-se a purificação final, re TM moção do excesso de tioureia, por cromatografia em Sephadex ‘ LH-20 em metanol e trituração com éter para proporcionar produtos finais sob a forma de bromidratos. Os grupos de protecçâo N-terminal e cadeia lateral removem-se por tratamento com brometo de hidrogénio anidro ou com outro ácido anidro.

Actividade Biológica

Demonstrs-se a actividade biológica dos compostos da presente invenção pelos dados in vitro e in vivo que dizem respeito à inibição de hidrólise de substrato sintético pelas enzi mas idênticas à tripsina, trombina humana e calicreína do plasma e inibição de reacções fisiológicas catalisadas por tais enzimas tal como a coagulação do sangue e inflamação.

Nos exemplos que se seguem mede-se a actividade hidrolltica de cada enzima na presença e na ausência de inibidores e determina-se a percentagem da actividade da enzima. Descobriu-se que os inibidores mais eficazes tanto da calicreína do plasma como da trombina são os inibidores de ligação lenta, cu ja eficácia aumenta progressivamente com o tempo até atingirem um estado estacionário. Um estado estacionário é atingido fácil e rapidamente e quase completo em 5 minutos. Avalia-se a actividade decorridos 10-20 minutos após se terem misturado os componentes para garantir que os componentes de reacção estão em equilíbrio. Determina-se a menor concentração de inibidor testado pela avaliação da concentração de enzima. Uma concentração de inibidor 5 vezes superior à concentração de enzima é a mais baixa concentração mantida de modo a observarem-se condições de reacção de pseudo-primeira ordem. A manutenção de condições de reacção de pseudo-primeira ordem e a sensibilidade dos respectivos ensaios determinam o nível do limite inferior do inibidor testado de 10 nM para os inibidores de calicreína e de5 nM para os inibidores de trombina.

Normalmente avalia-se a eficácia inibidora reversivel medindo os valores Kp as constantes de dissossiação para o com plexo enzima/inibidor. Este valor, por definição, é a concentração de inibidor necessária para inibir 50 % de enzima na ausência de substrato. Mas como o substrato possui um efeito pro tector, são necessárias concentrações superiores de inibidor pa ra se conseguir 50 % de inibição. Todavia, pode obter-se uma estimativa aproximada de a partir dos dados de actividade percentual (inibição) e da concentração de inibidor. E necessá rio um nível de inibidor aproximadamente 20 vezes superior a para inibir uma reacção a 95 % e um nível de inibidor aproximadamente 50 vezes superior a para uma inibição a 98 %.

Preferencialmente, a calicreína do plasma hidrolisa e liberta bradiquinina. Os péptidos de boro-erginina contendo Phe adjacente a boro-arginina são os inibidores mais eficazes desta enzima. Por exemplo, 10 nM de H-(D)Phe-Phe-boroArg-C-j_Ql^ inibe a calicreína para um valor superior a 95 %. Não se observam diferenças significativas entre a eficácia dos ésteres de pinanodiol de boro-Arginina e os correspondentes analogos de

is©tio-uréhi®(borolrg-). Além disso não se observam diferenças na eficácia do ácido bordnico desprotegido difluoroborano.

Obtêm-se para a trombina resultados aos obtidos com calicreína em ensaios com substratos sintéticos, com a exceção de a trombina possuir uma afinidade muito maior para inibidores com prolina no sítio adjacente à boro-arginina. 0 inibidor mais eficaz é Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-C₁₀H₁^, o qual inibe 99 % de trom bina numa concentração de 5 nM. 0 inibidor mais poderoso referido na literatura é o piperideto de N-alfa-(2-naftil-sulfonilglicil)-^Í+-amidino-fenilamina, o qual possui um valor de 6 nM. Esta referência foi descrita por ”B. Kaiser e outros, Thromb. Res. 43: 613-620 (I986) e Sturzebecher e outros, Thromb. Res.

29: 635-642 (1983). A relação entre a concentração do inibidor, Kp e a inibição percentual, coforme descrito antes, sugere que a de Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-C^QH^^ é de ordem picomolar. Além disso, a eficácia de inibidores possuindo uma sequência (D)Phe-Pro-boroArg- parece relativamente insensível à eventual presen ça ou de um grupo de protecção amino-terminal ou à sua natureza. Os compostps que possuem um grupo de protecção Boc, ou um grupo de protecção Ac ou os que não possuem grupos de protecção inibem a trombina do mesmo modo, apresentando, cada um, um valor de CI5Q inferior a $ nM.

Mede-se a éficácia de inibidores em reacções nas quais competem com substratos naturais para enzimas-alvo, in vitro, através de ensaios de coagulação do sangue. Utilizam-se dois ensaios diferentes, os ensaios de APTT (tempos parciais de troa boplastina activada) e ensaios de PT (tempos de protrombina). Estes ensaios imitam o processo de coagulação do sangue in vivo.

A coagulação do sangue ocorre em dois sistemas diferentes, con sistindo em uma cascata de fases de activação de zimogénio.

Estes sistemas designam-se por sistema intrínseco e sistema extrínseco (ver L. Lorand, Methods in Enzimology 43: 31-37 (1976). 0 sistema intrínseco inicia-se por superfícies carregadas negativamente nas quais a calicreína do plasma, facto XII e factor IX são activados e seguindo-se a activação IX e X e da protrombina nas fases dependentes do cálcio. A trombina, a Ultima protease da cascata, hídrolisa o fibrinogénio para formar fibrina originando a formaçao do coágulo. No ensaio de APTT faz-se a activação dos componentes do plasma por exposição a superfícies carregadas negativamente e depois medem-se os tempos de coagulâ ção após se ter adicionado cálcio ao sistema. No sistema extrínseco, a tromboplastina do tecido activa o factor VII o qual por sua vez activa o factor X originando a activação da trombina. Medem-se estes fenómenos através do ensaio de determinação dos tempos de protrombina.

Os péptidos de boro-arginina e os correspondentes análq gos de isotio-urónio inibem eficazmente a coagulação do sangue em ambos os ensaios. Os inibidores mais eficazes da presente invenção para a trombina são os mais eficazes em ambos os ensaios. Por outro lado, os inibidores de calicreína, apesar de serem inibidores de coagulação menos poderosos, inibem o ensaio de APTT (a calicreína está envolvida na iniciação deste ensaio) mais eficazmente do que o ensaio de PT. Isto está claramente demonstrado na figura 1 pelo efeito de H-(D)Phe-Pro-boroArgθ10^Ηΐ6 (inibidor da trombina) sobre os tempos de coagulação relativa do plasma. Demonstra por isso a selectividade que se poΜ-0 de conseguir fazendo variar um único aminoácido no tripeptido inibidor nua sistema biológico bastante complexo. Os níveis eficazes de inibidores da trombina são de idêntica ordem molar da heparina. Normalmente, 0,2 a 0,¼ unidades de heparina por ml de plasma aumentam os tempos de coagulação de 2 a 2,5 vezes. Se se admitir um peso molecular médio de 15000 para a heparina e uma actividade específica de 150 unidades/mg, a aua concentra ção molar é de 86 a 170 nM. A concentração dos péptidos de boro-arginina necessária para aumentar os tempos de coagulação no ensaio de ΑΡΤΙ está compreendida entre entre 170 e 230 nM. Faz-se observar que a heparina é ua cofactor para 0 inibidor da pr· tease de elevado peso molecular, a anti-trombina III.

Demonstrourse a estabilidade dos péptidos de boro-arginina no plasma humano mediante incubação com plasma numa concentração eficaz para retardar o processo de coagulação. Faz-se a remoção de amostras de inibidores em intervalos de tempo crescentes e mediu-se a sua capacidade para atrasar a cogulaçao em cada intervalo. A ausência de alteração no tempo de coagulação significa a ausência de alteração da actividade inibidora dos inibidores durante a incubação com plasma. Não se observou alteração significativa na actividade inibidora excepto 0 H-(D)Phe-Pro-boroArg-Ο^θΗ^^, perdeu a actividade decorridas 2¼ horas.

Os inibidores da presente invenção tambél são estáveis durante 2¼ horas em tampão fosfato a pH 7,5 excepto para H(D)Phe-Pro-boroArg-C-^H·^, que perde a actividade inibidora em uma hora. A maior instabilidade deste inibidor no tampão sugere que 0 tampão de fosfato desempenha uma função desestabilizadora do composto.

Os dados in vivo fornecidos indicam claramente a eficáh-1 cia dos compostos da presente invenção como inibidores dos sistemas de coagulação no sangue nos animais mamíferos.

Os compostos da presente invenção são também agentes an ti-inflamatórios eficazes conforme demonstrado pela inibição do edema da orelha de rato, quando se aplicam os compostos topicamente em conjunto com um agente irritante . A base molecular para esta actividade farmacológica é desconhecida, uma vez que ocorrem diversos fenómenos durante a inflamação. Contudo, adaite-se que as proteases que aumentam a permeabilidade vascular, tal como a calicreina do plasma a qual liberta quininas e enzimas do sistema complementar que libertam os pêptidos de anafilatoxina, estejam implicadas no processo inflamatório.

Finalmente, demonstrou-se que os pêptidos de boro-lisina inibem eficazmente a plasmina, uma enzima que desempenha um papel fundamental na hemostase.

Utilidade

Os ácidos alfa-amino-borónicos N-aciclicos e N-peptidicos que são análogos de omitina, arginina, lisina e de hemo-ar ginina da presente invenção constituem uma nova classe de poderosos inibidores reversíveis de enzimas idênticas à tripsina.

As enzimas idênticas à tripsina representam um grupo de protease que hidrolisam as ligações peptidicas em resíduos alcalinos libertando o resíduo lisilo ou arginilo C-terminal. Entre estas enzimas encontram-se as proteases do sistema de coagulação do sangue (factores XII a, Xla, IXa, Vila, Xa, e a trombina), o sis tema complementar (Cia, Clr, C3 convertase, factor D, etc), tri]3 sina pancreática (que desempenha uma função digestiva) e acrosib-2 na (a qual constitui uma protease associada com esperma e necessária para a fertilização).

Determinou-se a capacidade dos compostos da presente invenção para inibirem as proteases idênticas à tripsina por inibição de duas enzimas diferentes idênticas à tripsina, â trombina humana e à calicreína do plasma. Os compostos da pre sente invenção constituem inibidores muito mais poderosos para estas duas enzimas do que quaisquer outros inibidores reversíveis conhecidos. Por exemplo, o inibidor de trombina mais efi caz conhecido até ao presente é N-alfa-(2-naftil-sulfonilgliciD-^-amidino-fenilalanina piperidina, o qual possui um valor para Kq de 6 nK. Os compostos da presente invenção inibem quâ se completamente a trombina para uma concentração de 5 nK apon tando para um valor de Kq . inM e proporcionando assim compos tos excelentes para o contrÔlo de processos induzidos pela troa bina tais como a coagulação do sangue . 0 mais eficaz pêptido de boro-arginina inibe a coagulação do sangue conforme demonstrado pelo aumento dos tempos de APT e PT. 0 seu nível de eficácia é idêntico ao da heparina numa base molecular. Além disso, os compostos são estáveis no plasma humano. Estes compostos podem ser utilizados como anti-coagulantes na proporção de plasma para isolamento de proteínas assim como para ensaios cli nicos.

Un outro exemplo é a protease, plasmina, que desempenha uma função primordial para realizar a lise dos coágulos de sangue. Fez-se a preparação e o ensaio de péptidos contendo boro-lisina e descobriu-se que são inibidores activos de plasmina.

Os compostos da presente invenção são eficazes para con hâ trolar a proteélise in vivo e devem ser eficazes sob o ponto de vista farmacêutico no tratamento de doenças provodadas nos mamí feros por actividade de protease não controlada. Faz-se referen cia especial às condições associadas com a trombose e com coagu lopàtia destrutiva. A trombose coronária desempenha uma função especialmente importante no enfarte do miocárdio. Observa-se a coagulopatia destrutiva, um estado caracterizado pela diminuição de factores de coagulação do sangue e de inibidores de protease do plasma, nos doentes com pancreatite aguda e coagulação intravascular disseminada (DIC). Admite-se que os compostos da presente invenção possam ser utilizados em vez da heparina com a vantagem de cofactor plasmático da heparina, a anti-trombina III, não se consumida na reacção. Do mesmo modo também não se observou trombocitopenia, um efeito secundário do tratamentocom hepa rina. Além disso, espera-se que os compostos da presente invenção sejam valiosos para o tratamento de doenças em que exista uma deficiência de inibidores naturais de enzimas idênticas à tripsina, tal como o edema hereditário. Esta doença é originada por uma deficiência de inibidor Ci, o inibidor principal é calicreína do plasma.

Finalmente, os compostos da presente invenção demonstra ram actividade anti-inflamatória in vivo eficaz.

Exemplos de Síntese

Os exemplos que seguem ilustram os aspectos particulares desta invenção. Todos os pontos de fusão referidos não foram corrigidos. Todas as partes são em peso e todas as tempera turas são indicadas em graus Celsius. A ressonância magnética nuclear protónica (RNM ou iH RMN) indica os desvios químicos em unidades delta, partes por milhão abaixo do padrão interno de tetrametilsilano. As diversas abreviaturas utilizadas significam: TFA = ácido trifluoroacético; DMF = Ν,Ν-dimetilformamida; MS = espectrometria de massa; TLC = cromatografia de camada fina; RP-TLP = cromatografia de camada fina de fase inversa. As abreviaturas para os grupos de protecção éster para os ácidos bo rénicos: -C^H·^ ⁼ S^ruP° Pi^acol e = grupo pinanodiol.

°Irg^M é a abreviatura para o análogo isotio-urónio de arginina (Arg) e o prefixo homo” refere-se a estruturas nas quais a cadeia lateral contém um grupo metileno adicional. Todos os resíduos de aminoácidos se apresentam na configuração ”L“ salvo quando es, pecifiçado de outro modo.

A TLC e o RP-TLC foram efectuadas sobre placas de gel de sílica 6o da E. Merk (Clifton, NJ , (Catalog $ 5534, S. M. Scien ces, Gibbstown, NJ), e em placas de fase inversa Whataiann KC 18 F (Catalog $ 4803-600, Whatman Co., respectivamente.

Os compostos neutros fora, visualizados sob luz UV após exposição a vapores de iodo. Os compostos com grupo amina livre foram corados com ninidrina e os compostos com grupo guanidina foram cq rados com o corante de Sacaguchi. 0 corante de Saguchi apresen ta uma considerável especificidade para a guanidina mono-substi tuída tal como as que se encontram presentes nos péptidos de boro-argínina (ver Chemistry of the Amino Acids, 3,! (1964) Greenstein and Winit, eds,, Robert E. Krieger Publishing Co., Malanar, FL).

Exem4

Sxemplo la

Cloridrato de l-amino-4-bromobutil-pinanodiol,

NH₂-CH/· (CH₂)₃Br /Βθ₂’°1Ο^Ηΐ6 > ^HC1

Preparou-se boronato de 4-bromo-l-clorobutil-pinanodiol pelo método de Matteson e outros, Organometalllcs 1284-1288 , com a excepção de se terem modificado as condições para preparações e» grande escala. Numa experiência típica procedeu-se à hidroboração de brometo de alilo (173 mlj 2,00 mole) com catecol-borano (240 ml; 2,00 mole) por adição de borano e brometo de alilo e aquecendo depois a reacção durante 4 horas à temperatura de 100°C sob uma atmosfera de azoto. Isolou-se o produto 3-bromo-propilboronato-catecol (p.e. 95-102°C; 0,25 »m) com um rendimento de 49 por destilação. Trans-esterifica-se 0 éster de catecol (124 g; 0,32 mole) com (+)-alfa-pinanodiol (88 gj 0,52 mole) misturando os componentes em 50 »1 de tetrahidrofurano (THF) e deixando-se em agitação durante 0,5 horas à temperatura ambiente. Removeu-se 0 dissolvente por evaporação e adicionou-se 230 ml de hexano. Removeu-se o catecol sob a forma de um sólido cristalino. Obteve-se. Obteve-se remoção quantitativa por sucessivas diluições até 500 ml e até 1000 ml com hexano e fazendo a reacção dos cristais em cada diluição. Obteve-se 0 produto (147 g) sob a forma de um óleo, por evaporação do dissolvente.

Análise:

	C %	H %	Br s:
Calculado para θι3 Η22°2ΒΓΒ:	51,85	7,38	26,5¼
Encontrado :	52,85	7,30	26,58

Preparou-se boronato de 4-bromo-l-clorobutilo-pinanodiol por homologação do correspondente boronato de propilo. Dissolveu-se cloreto de metileno (34,8 ml; 0,540 mole) em 500 ml de THF, e adicionou-se lentamente n-butil-lítio 1,54 N ea hexano (350 ml; 0,540 mole), è temperatura de -100°C. Dissolveu-se boronato de 3-bromo-propil-pinanodiol (148 g; 0,490 mole) em 500 ml de THF, arrefeceu-se até ao ponto de congelamento da solução e adicionou-se à mistura de reacção. Dissolveu-se cloreto de zinco (33,5 èi 0,246 mole) em 250 ml de THF, arrefeceu-se para 0°C β adicionou-se à mistura de reacção em diversas porções Enquanto se agitava deixou-se a mistura reaccional retomar lenta mente a temperatura ambiente, durante a noite. Evaporou-se 0 dissolvente, dissolveu-se o residuo em hexano e lavou-se com água. Depois de se secar sobre sulfato de magnésio anidro e após a filtração removeu-se 0 dissolvente para proporcionar 0 produto desejado (l4o°).

Preparou-se primeiro boronato de l-amino-4-bromobutil-pi rjaanodiol dissolvendo hexametil-dissilizano (2â,0 g; 80,0 mmol ) e» 30 ml de THF, arrefecendo a solução para -78°C e adicionando n-butil-lítio 1,62 N em hexano (49»4 ml; 80,0 mmol ). Deixou-se a solução retomar lentamente a temperatura ambiente e de pois arrefeceu-se novamente para -78°C e adicionsu-se boronato de 4-bromo-l-clorobutil-pinanodiol (28,0 g; 80,0 mmol ) em 20 ml de THF. Deixou-se a mistura retomar lentamente a temperatura ambiente e agitou-se durante a noite. Removeu-se o dissolvente por evaporação e adicionou-se hexano anidro (400 ml) para propor cionar um precipitado que se removeu por filtração sob atmosfera de azoto. Arrefeceu-se o filtrado para -/8°C e adicionou-se ácido clorídrico 4n em dioxano (6o ml; 240 mmol). Deixou-se a reacção aquecer lentamente até à temperatura ambiente e agitou-se a essa temperatura durante duas horas. Isolou-se o pro duto resultante (20 g) sob a forma de um sólido, por filtração. Após secagem no vácuo dissolveu-se o produto bruto em clorofór mio e removeu-se o material insolúvel por filtração. Evaporou -se o filtrado e dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo.

0 produto cristalizou com acetato de 15,1 g (P.f. 142-144,5°C). = +16,7 +0,80, C = 1,0 em etanol absoluto.
Análise:	c $	H %	N %	B %
Calculado para C^H^NOgBrClB:	tf ,87	7,16	3,82	2,95
Encontrado:	U5.76	7,21	3,79	3,04

Exemplo 1b

Cloridrato de (D,L) l-amino-4-bromobutil-boronato de pinacol (D,L)NH₂-CH/(CH₂)₃Br_7B0₂-C₆H_l2, HCl

Preparou-se 4-bromo-l-clorobutilo boronato de pinacol pelo método descrito para o pinanodiol correspondente (Exemplo la) com a excepção de se ter substituido pinanodiol por pi nacol e destilou-se o 3-bromopropil-boronato de pinacol (p. e. 60-64°C; 0,35 »») θ 4-bromo-l-clorobutil-boronato de pinacol (p. e. 110~112°C; 0,20 mm).

Análise:

C % H %

Calculado para C^H^^BrClB; 40,38 6,45 Encontrado : 40,70 6,37 ^8 ►

Exemplo lc

Também se preparou o cloridrato de l-amino-M-bromobutil-boronato de pinacol de acordo com o processo descrito no exemplo la. 0 produto final cristalizou com acetato de etilo/ /hexano com um rendimento de 52 %·

Análise:

c %	H %	N %	Cl %	Br %
Calculado para C1()H22N02BrClB: 38,19	7,05	**Λ5	11,27	25 Λ
Encontrado : 38,28	7,39	M5	11,68	26 po

Cloridfrato de l-smino-4-clorobutil-boronato de pinacol (D,L)NH₂-CH2f (CH₂)₃C1^/BO₂-C₆H₁₂, HCl

Preparou-se 3-cioropropil-baronato de catecol (p.e. 8O-85°C, 0,30 mm e 3-cloropropil-boronato de pinacol (p.e. ó3°Cj 0,20 mm) pelo método descrito no exemplo la com a excepção de se ter substituído brometo de alilo por cloreto de alilo e de se ter substituído o pinanodiol por pinacol.

Análise:

	C %	H %	Cl χ
Calculado para	C9H18°2C1Bí 52,85	8,89	17,33
Encontrado :	53 Λ1	8,15	16,81
Efectuou-se	também a homologação	de acordo com 0

dimento descrito no exemplo la e isolou-se o produto por destilação (p, e. 95°C; 0,25 mm) com o rendimento de 65 M.

Análise:

	c χ	H %	Cl %
Calculado para C ^θΗ·^^02012Β:	27,2?	7,58	28,02
Encontrado :	27,17	7Λ5	27,75

Preparou-se cloridrato de l-amino-4-clorobutil-boronato de pinacol de acordo com um procedimento idêntico ao do exem pio la. 0 produto cristalizou com acetato de etilo para proporcionar 8,8 g (p. f. 132-135,5°C) e 2,2 g (p. f. 145-147°C). Utilizou-se o produto cujo ponto de fusão é de l45-l47°C para a análise.

Análise:

	C %	H %	N %	B %
Calculado para C^H22NO2C12B:	44,47	8,23	549	4,00
Encontrado :	44,01	8,23	4,77	3,80

Exemplo ld * Cloridrato de (D,L) l-amino-5-bromo-pentilboronato de pinacol (ϋ,1)ΝΗ₂-<2ϊΖ(0Η₂)^ΒΓ 7B0₂C₆H₁₂ .HCl.

Preparou-se bromobutil-boronato de pinacol pelo método descrito para a preparação de 3-bromopropil-boronato de pinanodiol (exemplo la) com a excepção de se ter substituído 0 brometo de alilo por 4-bromo-l-buteno e de se ter substituído 0 pina nodiol por pinacol. Isolou-se o produto sob a forma de um óleo (Ρ. θ. 77°C; 0,3 mm). A homologação proporcionou 5-bromo-l-cloropentil-boronato de penacol.

EM (Cl) para Cn^Hgl⁰2^BrC1B:

Calculado - H: 310,47

Encontrado - 310

Preparou-se o produto final, l-amino-5-bromopentil-boronato de pinacol, HCl de acordo com 0 procedimento do exemplo la com um rendimento de 35 %·

Análise:

	C χ	H %	N %	Cl %
Calculado para	CllH24N02BrBC1: ^θ’22	7,36	4,26	10,79 e
	Br %	B %
	24,32	3,29
Encontrado :	39,23	7,18	4,04	15,21 e
	Br %	B %
	25,66	3,75

Exemplo 2

Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH/' (CH^Br_/B0₂-C₁₀H_ló

Produziu-se Boc-(D)Phe-Pro-OH preparando primeiro o és ter benzílico dipeptídico e removendo depois o éster por hidro genação catalítica. Dissolveu-se boc-(D)Phe-OH (10,0 g; 37,7 m»ol ) em 50 ml de THF e adicionou-se K-metil-morfolino (4,l4 ml; 37,7 mmol ). Arrefeceu-se a solução para -20°C e adicionou-se cloroformato de isobutilo (4,90 ml; 37,7 mmol ). Decorridos 5 minutos adicionou-se H-Pro-OBzl,HC1 (9,11 g; 37,7 mmol) dissolvidos em 5θ ml de clorofórmio e arrefecidos para -20°C. Zdicionou-se trietilamina (5,25 ml; 37,7 mmol ) e agitou-se a mistura durante 1 hora à temperatura de -20°C e durante 2 horas à temperatura ambiente. Filtrou-se a mistura de reacção e evaporou-se o filtrado. Dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo e lavou-se com ácido clorídrico 0,2 N, com uma solução aquosa de carbonato de hidrogénio e sódio a f % e com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtro-se e evaporou-se para pro porcionar 15,2 g de Boc-^jPhe-í^o-OBzl sob a forma de metanol

e hidrogenou-se a uma pressão inicial de 40 psi (40x6,89xl°^l’a) nua aparelho de Parr na presença de 0,5 g de Pot/C a 10 %. Filtrou-se a solução de reacção através de Celite e evaporou-se para proporcionar um sélido. Isolou-se este material sólido e lavou-se com acetato de etilo e depois com éter para proporcio

nar 10,0 gramas do produto desejado (p	>. f. I7ó,5-l77°c).
Análise:	c %	H f0	N %
Calculado para	C19 h26N205: 62,95	7,24	7,73
Encontrado:	62,91	7,15	7,53

Preparou-se Boc-COPhe-Pro-NH-CHXCHg)^ acoplando o dipéptido a amina correspondente utilizando o processo de anidrido misto. Preparou-se o anidrido misto de Boc-(D)Phe-Pro-OH dissolvendo este ácido (4,94 gj 13,8 amol ) e» de THF e adicionando N-metil-morfolina (1,50 ml; 13,8 mmol ). Arrefece-se a solução para -20° C e adicionou-se cloroformato de isobutilo (1,77 «lj 13,8 mmol). Depois de se agitar durante 5 minutos a -20°C, adicionou-se a mistura à amina de acordo com o processo do exemplo la, dissolveu-se N^-CH/ (CHgJ^Br _/BQg-CiqHi£ .HC1 (5,0 g; 13,6 mmol ) em 10 ml de clorofórmio arrefecido. Adicionou-se THF arrefecido (10 ml) e trietilamina (1,90; 13,6 mmol ) e agitou-se a mistura durante uma hora a -20°C e durante aproximadamente 2 horas à temperatura ambiente. Filtrou-se a mistura e evaporou-se o líquido do filtrado. Dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo e lavou-se com ácido clorídrico 0,2 N, com uma solução aquosa de carbonato de hidrogénio e sódio a 5 % β com uma solução aquosa saturada de cio £2 reto de sódio. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o dissolvente para proporcionar 9,0 g de um óleo. Dissolveu-se este material em metpnol e fez-se a cromatografia numa coluna de 2,5 x 50 cm de LH-20. Juntaram-se as fracçoes contendo o produto desejado e evaporou -se para proporcionar 5>8 g de ubj produto sólido. A TLC com metanol/clorofórmio (1í9) forneceu uma mancha única de Rf = 0,70. EM (FAB) para C^H^N^OçBBrs

Calculado + Hs 67^,30 Encontrado; 67^-,30

Exemplo 3

Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH/ (¾)^ -7B0₂”^C10^Hl6

Dissolveu-se Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH/' (CH^Br Jk0₂C₁₀H_l6, o produto do exemplo 2 (4,4 g; 6,54 mmol ) em 7 ml de DMF e adicionou-se azida de sódio (0,919 g; 14,1 mmol ). Aqueceu-se a mistura a 100°C durante 3 horas. Adicionou-se acetato de eti lo (100 ml) à mistura de reacção e lavou-se com água e com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtrou-se e submeteu-se a evaporação. Obteve-se 4,1 g de um produto sólido. Fezse a cromatografia deste mpterial sobre uma coluna de 2,5 x 50 cm de LH-20 em metanol. Juntaram-se as fracçôes contendo o pro duto desejado e evaporou-se o liquido para proporcionar 2,3 gra mas de azida. A TLC em metanol/clorofórmio (1:9) indicou-se uma mancha única de Rf = 0,76.

Análise:

	c í	H %	N %	B %
Calculado para C^H^gNgOgB:	62,35	7,63	13,33	1,70
Encontrado :	63,63	8,02	11,50	1,80

EM (FAB) para C^H^NgOgB

Calculado + H: 637,39 Encontrado: 637, ^9

Exemplo 4

Derivado do ácido benzeno-sulfónico de Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH/~

Dissolveu-se a azida do exemplo 3 (J,tO g; 13,8 mmol ) em 150 ml de metanol e bidrogenou-se num aparelho de Parr a 40 psi (40 x 6,89 x 10? Pa na presença de 0,30 g de Pd/C e de acido benzeno-sulfónico (2,19 g; 13,θ mmol ). Decorrida 1 hora re moveu-se o catalisador e evapora-se a solução para se obter um sólido que se triturou com hexano proporcionando 9,9 gramas do produto desejado, A RP-TLC em metanol/água (85:15) visualizava com UV, uma mancha de UV, RF = 0,91 e uma mancha positiva, à ni nidrina, de RF = 0,52.

Exemplo 5

Derivado de ácido benzeno-sulfónico de Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH/ (CH₂)₃-NH-C(NH)NH₂ 7B0₂-C₁₀H_l6

Derivado do ácido benzeno-sulfónico de Boc-(D)Phe-Pro-boroArg- ^cio^hi6·

5it

ç.

Submeteu-se a refluxo à temperatura de 100° o derivado do ácido benzeno-sulfónico de Boc-(D)Phe-Pro-boroArg-C^QH^^ do exemplo 4 (4,6 g; 6,11 mmol ) em 20 ml e etanol absoluto conten do cianamida (50 mg/ml). Controlou-se o desenolvimento da reac ção por RP-TLC com metanol/água (85:15) tendo-se observado o desaparecimento da mancha revelada com ninidrina da amina inicial (Rf 0,54) e o aparecimento da banda de Sakaguchi do produto (Rf 0-0,13). Foi possível detectar o produto após refluxo durante 18 horas cujo nível aumentos progressivamente com o tempo. Decorridos 7 dias não foi possível detectar amina e con centrou-se a solução de reacção até aproximadamente 50 % da solução através de evaporação passiva. Filtrou-se a solução de reacção, concentrou-se e fez-se a cromatografia numa coluna de 2,5 x 100 cm de LH-20 com metanol. Juntaram-se as fracções con tendo o produto desejado e submeteu-se a evaporação para propor cionar 3,7 gramas do produto desejado- Cristalizou-se uma porção (2,3 g) de acetato de etilo/hexano para proporcionar 0,89 gramas e obteve-se o residuo (1,2 g) no estado sólido, por trituração com éter, em experiências separadas.

EM (FAB) para C^H^N^SB:

Calculado + H: 653,42 Encontrado : 653,38

Análise:

	C %	u d χί /z	N /	B.%
Calculado para C^qH^N^O^SB.H^qí	57,95	7Λ3	10,14	1,30
Encontrado :	57,20	7,lA	10,94	1,02

ExemExemplo 6

Dicloridrato de H-ÍDÍPhe-Pro-boroArg-C^Q ^H16

Fez-se reagir o derivado do ácido benzeno-sulfónico de Boc-(D)Phe-Pro-boroArg-C-^₀H^^, o produto do exemplo 5 (1,17 gra mas; 1,5^ mmol ) com 5 ml de ácido clorídrico 4N em dioxano durante 15 minutos à temperatura ambiente. Precipitou-se o produto por adição de éter, isolou-se e lavou-se com éter e secou-se no vácuo. Seguidamente dissolveu-se em 10 ml de água e aplicou-se a uma coluna de permuta iónica de 5 ml de BIO-RAD AGI X8™ (forma Cl, BIO-RAD Co., Richmond, GA) e lavou-se a coluna com água (aproximadamente 3θ ml). Evaporou-se o desenvolvimento sob vácuo e triturou-se o resíduo com éter para proporcionar o produto desejado (0,80 g).

EM (FAB) para C^H^N^B:

Calculado + H: 553,37

Encontrado: 553,θ 53θΛθ (não identificado).

Análise de H-(D)Phe-Pro-boroArg-C^QH·^^ 1BSA.TFA:

Encontrado: 553,

Exemplos 7-8

Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-C₁₀H_l6,HCl (Exemplo 7) Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH,HCl (Exemplo 8)

Fez-se reagir o derivado do ácido benzeno-sulfónico de

Boc-ÍDjPhe-Pro-boroArg-C^H^, o produto do exemplo 5 (0,86 g;

1,13 mmol ) com TSA anidra (aproximadamente 5 ml durante 15 minutos à temperatura ambiente. Removeu-se o excesso de TFA por evaporação e triturou-se o residuo com éter para proporcionar

Sé

0,76 g. Dissolveu-se este produto (0,70 g; 0,91 mmol ) numa mistura constituída por 2 ml de dioxano e 1 ml de ãgua. Adicionou-se anidrido acético (0,46 ml; 5,0 mmol ) e carbonato de hidrogénio e sódio (0,42 g; 5,0 mmol )* Agitou-se a mistura durante 20 minutos a. temperatura ambiente. Adicionou-se acetato de etilo (50 ml) e água (5 ml). Fez-se a separação das fases e secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtrou-se e preparou-se o dissolvente por evaporação para proporcionar 0,56 grama ide um sélido parcial.

Dissolveu-se a amostra em 4 ml de ácido acético glacial e diluiu-se com 16 ml de água. Aplicou-se imediatamente auma coluna contendo 15 ml de SP-Sephadex ¹¹ (forma H ) e equilibrou-se com ácido acético a 20 Lavou-se a coluna com 300 ml de ácido acético a 20 % e depois desenvolveu-se com gradiente linear variável desde 100 ml de ácido acético a 20 % até 100 ml de ácido acético a 20 % contendo ácido clorídrico 0,50 N. As fracções recolhidas desde 0 ácido clorídrico 0,08 até 0,17 N continham o N-acetilpéptido (0,29 g) sob a forma de uma mistu ra de ácido borónico livre e de éster de pinanodiol.

Fez-se a separação do éster de pinandiol e do ácido bo rónico livre por cromatografia, numa coluna de 2,5 x 100 cm de LH-20 em metanol. 0 volume das fracções foi de 8,2 ml. Fez-se a eluição do éster de pinanodiol (100 mg) nas fracções de 41 a 43 enquanto o ácido borónico livre diluiu (131 mg) nas fracções 45 - 129.

EM(FAB) (Exemplo 7).·

Ac-ÍDjPhe-Pro-boroArg-CqgHq^ para Ο^Η^Ν^Ο^Β:

Calculado + jj. 595,33

1Ζ

Encontrado : 595,33

EM(FAB) (Exemplo 8):

Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH.HCl) para ^C21^H33^N6°5^:

Calculado + Η: 449,60 Encontrado : 579,24-581,2¼

Não foi possível interpretar o último resultado. Contudo, a RMN apresentou-se consistente com a estrutura do ácido borónico livre uma vez que as bandas definitivas do grupo pina nodiol tal como os singuletos dos grupos metilo observados para valores delta O,85(3H), 1,3O(3H), e 1,36(3H) estavam ausentes. Como prova adicional de estrutura fez-se nova esterifica ção de uma amostra de ácido boroónico livre para proporcionar o produto do exemplo 7· Tratou-se uma amostra analítica (20 mg) com pinanodiol duas vezes em excesso (1¼ mg) em 3 ml de metanol, durante 5 minutos. Evaporou-se o dissolvente e removeu-se o excesso de pinanodiol triturando a amostra com éter para proporcio nar o produto (26 mg).

MS(FAB) (Encontrado: 595,38) e a RMN apresentaram-se consistentes co» os valores esperados para o produto esterifica do e eram quase idênticos aos do produto de pinanodiol do exemplo 7.

Exemplo 9

Cloridrato de A c-Phe-boroA.rg-C₁₀H^^

Preparou-se Ac-Phe-NH-CH/ (CH^Br J7BO₂-C₁₀H_l6 pelo pro cedimento descrito no exemplo 2. Preparou-se o anidrido misto de Ac-Phe-OH (0,565 g; 2,73 mmol) em 10 ml de THF e acoplou-se a NH2-CH/(CH2)3Br J%O2-CioHi6,HC1 (o produto do exemplo la,

1,00 g; 2,73 mmol ) dissolvido em 10 ml de THF fria para propor cionar 1,47 g de uma espuma branca. Agitou-se este material com hexano durante a noite para proporcionar um composto sólido; 1,01 g (p. f. 1O6,5-1O9°C).

Análise:

C X	Η X	H %	Br #	B %
Calculado para C25B36N2°4BrB: 57,81	7,oo	5Λο	15,4o	2,08
Encontrado: 58,33	7,33	^,76	14,18	1,80

EM(FAB) para ^c2S^H36^N2°4^BrBí Calculado + H: 519t20 Encontrado: 519,23

Preparou-se Ae-Phe-NH-CH^f (CH^)^ -/ΒΟ^^θΗ·^ tratando Ac—Phe-NH-CH/(CH₂)₃Br _7B0₂-C₁₀H_l6 (3,22 g; 6,20 mmol ) com azida de sodio de acordo com o procedimento descrito no exemplo

3. Fez-se s cromatografia de produto de reacção (3,03 g) sobre LH-20. Juntaram-se as fracções contendo o produto desejado e evaporou-se. Triturou-se o resíduo com hexano para proporcionar 2,21 g da azida.

Preparou-se o derivado do ácido benzeno sulfénico de Ac-Phe-boroOrn-C_lúH₁^ a partir de Ac-Phe-NH-CH/· (CH₂)^N^_7B0₂“^C10^Hl6 4,59 mmol ) pelo procedimento do exemplo 4 com a excepção de se ter efectuado a hidrogençao sob pressão atmosférica. Apés a filtração e a evaporação do dissolvente obteve-se o produto desejado (2,22 g) por trituração com eter.

Preparou-se o derivado do ácido benzeno-sulfonico do

Ac-Phe-boroArg-C^QH.j-6 (2,0 g; 3>26 mmol ) com 10 ml de uma solu ção de cisnamida (100 mg/ml) em etanol. Utilizou-se o processo de guanidàção do exemplo 5 com a excepção de o tempo de reac ção ser de 3 dias e de a mistura de reacção conter uma mistura de material inicial e de produto. Isto exigiu uma fase de purificação adicional que, provavelmente, poderia ter sido eliminada com um tempo de reacção mais longo. Concentrou-se a solução e efectuou-se a cromatografia numa coluna de 2,5 x 100 cm de LH-20 com metanol. Juntarsm-se as fracções contendo o produto desejado, detectadas pela coloração de Sakaguchi e sub meteram-se a evaporação para proporcionar 1,4 g. Dissolveu-se o material resultante (1,2 g) em 6 ml de ácido acético e diluiu-se com 30 ml de agua obtendo-se uma solução leitosa. Aplicou-se esta solução a uma coluna de 30 ml de SP-Sephadex C-25 (forma H⁺) equilibrada com ácido acético aquoso a 20 f>. Lavou-se a coluna com 240 ml de ácido acético a 20 % e, em seguida aplicou-se um gradiente linear desde 250 ml de ácido acé tico a 20 % até 250 ml de ácido acético a 20 % contendo ácido clorídrico 0,30 N. Juntaram-se as fracções eluídas da coluna desde ácido clorídrico 0,12 N até 0,16 N para se obterem 0,42 g do pêptido desejado sob a forma de uma mistura de ácido boróni co livre e éster de pinanodiol. Dissolveu-se a mistura em metanol (10 ml) e adicionou-se 80 mg de pinanodiol para se esterificar o ácido borónico livre. Depois de se agitar durante 30 minutos evaporou-se o dissolvente e triturou-se 0 residuo com éter para se obterem 0,28 g do produto desejado.

Análise:

	C %	H $	N fo	Β M
Calculado para	C26H40N5°4B,HC1’2H20: 54,78	8,15	12,30	1,90
Encontrado :	55,34	7,83	11,66	1,99

MS (FAB) para

6ο

Calculado + Hj 498,32 Encontrado ; 498,31

Exemplo 10

Ac-(D,L)boroArg-C^H₁₂

Preparou-se o composto intermédio, Ac-(D,L)Phe-(D,L)-NH-CH/* (CH₂)₃Br 78O₂-C^H₂₂, através de uma modificação dos procedimentos dos exemplos lb e 2. Preparou-se o cloreto de ácido de Ae-Phe-OH fazendo reagir Ac-Phe-OH (30 g; 0,145 mol ) com pentacloreto fosforoso (30 g; 0,144 mol ) em 175 de THF a —10°C. Agitou-se 0 meio de reacção a 0°C durante aproximada mente 1 hora e depois, diluiu-se com éter arrefecido até ao vo lume de 350 ml. Isolou-se o produto no estado sólido, lavou-se com éter arrefecido e secou-se sob vácuo para se obterem 21 g. Dissolveu-se 0 derivado de Ac-Phe activado (14,8 gj 65,6 mmol ) em 40 ml de THF e adicionou-se ao produto de reacção de 4-bromo-l-clcrobutil-boronato de pinacol e de hexametil-dissilizano (preparado numa escala de 20 mmol ) a -78°C. Deixou-se a mistura de reacção retomar a temperatura ambiente e depois agitou-se durante a noite. Bemoveu-se o dissolvente por evapo ração. Dissolveu-se 0 resíduo em acetato de etilo e lavou-se sucessívamente com água, solução de carbonato de hidrogénio e sódio a 5 % e com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Secou-se a fase orgânica e a mistura resultante sobre sul fato de sódio anidro e concentrou-se para proporcionar 0 produto desejado sob a forma de um sólido cristalino (1,37 g; P· f.

l46,5-l48°C). Numa experiência separada obteve-se a análise se

6l guinte.

Análise:

	c %	H f	N %	Br %	B %
Calculado para C^H^I^Q^BrB:	53,98	6,92	6,00	17,10	2,31
Encontrado :	5¼ 54	6,78	5,39	16,46	3Λο

Converteu-se o brometo de alquilo na azida correspondente pelo processo do exemplo 3· θ produto cristalizou com acetato de etilo (p. f. l43-l44°C).

Análise:

	c M	TT f/7 Xi fG	N %	B %
Calculado para C^H-^N^O^E:	58,74	7,53	16,31	2,53
Encontrado :	58,85	7,48	16,53	2,93

Converteu-se a azida no éster Ac-(D,L)Phe-(D,L)boro0rn-C^H₁₂ do ácido benzeno-sulfúnico pelo processo do exem pio 4 com a excepção de se ter efectuado a hidrogenação à pressão atmosférica.

Fez-se reagir o derivado Ac-(D,L)Phe-(D,L)boroOrn”^C6^H12 ^do ácido benzeno-sulfúnico (0,243 g; 0,433 mmol ) com cia namida (0,020 gj 0,476 maol ) à temperatura de 100°C em 2 ml de etanol absoluto, durante a noite. Concentrou-se a solução e tri turou-se com éter para proporcionar 0,21 g de um produto súlido branco. A RP-TLC do material forneceu coloração positiva da banda característica com o corante de Saxsguehi para os péptidos de boro-arginina, Rf entre 0 e 0,53 θ unis mancha discreta de Rf = 0,68, correspondente ao material inicial que não reagiu. Tratou-se novamente o produto (81 mg) com 2 ml de cianamida (10 mg/ml durante a noite, de acordo com o procedimento anterior pa ra proporcionar 71 mg, após trituração com éter.

MS (FAB para

Calculado + Hí 446,30

Encontrado : 446,23 e 404,19 (correspondente ao pepti do de boroOrn que não reagiu ) .

Note-se que o método do exemplo 5 é um método superior para a preparação de péptidos de boro-arginina, diferente por se utilizar maior excesso de cianamida e tempos de reacção mais longos.

Exemplo 11

Derivado Boc-íDPhe-Phe-boroArg-C^QH^^ do ácido benzeno-sulfónico.

Preparou-se Boc-(D)Phe-Phe-QH de acordo com 0 método des crito, para Boc-(D)PHe-Pro-OH, no exemplo 2, Após a hidrogensção do éster benzllieo o material cristalizou com clorofórmio/he

xano proporcionando 0 péptido desejado	(P. f.	133-133,5°C).
Análise:	C %	H %	N %
Calculado para ^2^23^2^5: 60,96	6,86	6,73
Snc.ontrsdo :	66,75	6,79	6,56

Preparou-se Boe-(D)Phe-Phe-NH-CH/· (Cf^J^br -7^θ2”^10^ΐ6 acoplando Boc-(D)Phe-Phe-QH (6,00 g; 14,5 mmol ) a NEL-CH/ (CH₂)^Br JBO^-C^qH-^^.HCI (exemplo la; 5:33 g; 14,5 mmol ) utilizando o procedimento descrito no exemplo 2 com a excepção de se ter eliminado a fase de cromatografia sobre LH-20. 0 produto cristalizou com acetato de etilo para proporcionar 2,47 é (P. F. 132-134°c) na primeira colheita e 5,05 g (P.F. 133-135°C) &

numa segunda colheita. A RP-TLC em metanol/água (85í15) formou uma mancha simples, Rf = 0,29.

Análise:

n cl V /ΰ	H %	N /	Br %
61,32	7,11	5,80	11,03
61,21	7,02	5,59	10,22

Encontrado :

Preparou-se Boc-(D)Phe-?he-NH-CH/ (¾)^ -/^BO2^cio^Hl6 tratando o correspondente brometo de alquilo (7,15 gj 9,87 mmo les) com azida de sódio utilizando o procedimento do exemplo 3, com excepção de não ser necessária cromatografia em LH-20 para purificação. Obteve-se o produto a partir de uma solução de acetato de etilo/hexano sob a forma de gel e isolou-se e lavou-se com hexano para proporcionar 3,0 g na primeira colheita e 2,9 g numa segunda colheita.

Preparou-se o derivado de Boc-(D)Phe-Phe-boroOrn-CjgH^^ do ácido benzeno-sulfónico a partir de azida (5,37 ; 7,32 mmoles) pelo procedimento do exemplo 4 para proporcionar 5,33 g·

A RP-TLC com metanol/água (85:15) indicou uma intensa mancha co rada pela ninidrina, Rf = 0,42, e uma leve mancha ã luz ultravioleta (UV), 0,92 (a mancha para UV de Rf = 0,92 e típica dos compostos de guanidina ou amina dos sais do ácido benzeno-sulfó nico).

EK(FAE) para C^H^N^B:

Calculado + H: 661,76 Encontrado : 661,1½.

Obteve-se Boc-(D)Phe-Phe-boroArg-C^QHj^ pelo procedimento do exemplo 5. Tratou-se 0 pêptido de boro-ornitina (4,83 gj 5,90 mmoles) (50 mg/ml) em 20 ml de etanol absoluto, dursnte 7 dias. Removeu-se uma porção da mistura de reacção correspondente a 1,0 g de material inicial e aqueceu-se separadamente, sem condensador de refluxo, durante a noite, para proporcionar a conversão completa da amina no composto de guanidina. Após cromatografia sobre LH-20 e trituração do produto com éter obteve-se 0,52 g do produto desejado.

Análise:

	C X	H %	N X	Β X
Calculado para C^H^N^O^SB:	61,38	7,16	9,76	1,25
Encontrado :	59,69	7,41	9,82	1,26

EM(FAB) para C^H^N^B

Calculado + H: 703.43 Encontrado: 703,49

Exemplo 12

H-(D)?he-?he-boroArg-C₁₀H_ló.2HC1

Tesbloqueou-se o derivado Boc-(D)Phe-Phe-boroArg-C₁gH₁^ (exemplo 11; 0,59 g; 1,25 mmol ) pelo procedimento do exemplo 6 com a excepção de se ter aplicado a amostra a uma coluna de per muta iónica com etanol a 20 X e de se ter eluido a coluna com etanol a 20 %. Obteve-se o produto (0,424 g) sob a forma de um sólido branco.

SM (FAB) para :

Calculado + H: 603,38 Encontrado : 603,41

Exem·

Exemplo 13

A c-Ala-L j- s (Èoc)-boroArg-ύ^θΗ^^ ãcido benzeno-sulfónico.

Preparou-se Ac-Ala-Lys(Boc)-0H acoplando o ester N-hidroxi-succinimidico de Ac-Ala-OH, preparado pelo método de ' Anderson e outros, J. Am. Chem. Soc. 86: 1839, (19óh-)“, a H-Lys(Boc)-OH. Dissolveu-se o éster N-hidroxi-succinimídico de Ac-Ala-OH (6,25 g; 27,4 mmol) em 30 ml de dioxano e adiciona-se a uma solução de H-Lys(Boc) (7,50 Si 39Λ mmol) dissolvido numa solução constituída por 30 ml de hidróxido de sódio 1,0 N e de trietilamina (2,12 ml; 15,0 mmol ). Agitou-se a mistura de reacção durante a noite e depois acidificou-se com ácido cloridri co. Adicionou-se uma quantidade suficiente de cloreto de sódio seco até saturar a solução. Extraiu-se o produto com acetato de etilo e lavou-se com ácido clorídrico 0,2 H preparado na solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Secou-se a fase organica sobre sulfato de sódio anidro e filtrou-se. Bemoveu-se o dissolvente por evaporação. 0 produto cristalizou com acetato de etilo/hexano para proporcionar 7,3 g (P. F. 86-89°C).

Preparou-se Ac-Ala-Lys(Boc)-ΝΗ-0ΗΓ (CH^Br ^B0₂ ^C10^Hl6 pelo procedimento do exemplo 2 com a excepção de se ter purificado o produto por cristalização fraccionada com acetato de eti lo. 0 produto (1,13 g) obtido na segunda e terceira colheitas apresentou uma mancha única na RP-TLC em metgnol/água (85:15), com um valor Rf = 0,51. Expôs-se a placa de TLC a vapores de ácido clorídrico tendo-se detectado a amina resultante após adição do corante de ninidrina.

Preparou-se Ac-Ala-Lys (Boc J-MH-CH/· (CH₂)~N. J^BO^-C^^H^ a partir do correspondente brometo de alquilo (1,95 g, 2,90 mmoles) pelo procedimento do exemplo 3 com a excepção de se ter purificado o produto por cristalização com acetato de etilo em substituição de cromatografia sobre LH-20. 0 produto bruto (1,60 g) cristalizou para proporcionar 0,55 g (B. F. 79“ -84°C) e 0,96 g de residuo. Apresenta-se a seguir a análise do produto cristalino.

Análise:

	C	H %	N M	B %
Calculado para C-,nHcoNr,0-,3: 30 52 7 7	56,86	8,29	15,48	1,71
Encontrado :	56,76	8,26	15,89	1,65

Preparou-se o derivado Ac-Ala-L>s(Boc)-boroOrn-C^QH^^ do ácido benzeno-sulfónico a partir da correspondente alquilazida (0,433 §5 0,683 mmol ) utilizando 0 método descrito no exemplo 4. Removeu-se o catalisador e o dissolvente e a seguir obteve-se 0 produto (0,45) por trituração com éter.

EM(FAB) para CjoWt*

Calculado + H: 608,42 Encontrado : 608,49

Preparou-se Ac-Ala-Lys(Boc)-boroArg-CjQH·^^ .ácido benzeno-sulfónico fazendo reagir o correspondente péptido de boro-ornitina com cianamida, utilizando o método descrito no exemplo 5. Triturou-se com éter as fracções obtidas por cromatogra fia contendo 0 produto desejado, para proporcionar 0,83 g de um produto sólido branco.

Análise:

Η / N % B 7

Calculado para C37H62N7010BS: 55,00 7,75 12,14 1,34 Encontrado : 54,09 7,53 12,22 1,34 &

Exemplo 14

Ac-Ala-Lys-boroArg-CjjQ^^^HCl

Desbloqueou-se o derivado Ac-Ala-L^s(Boc)-boroArg-Cj₀H₁^ do ácido benzeno-sulfónico (0,200 g; 0,248 mmol ) pelo procedimento utilizado no exemplo 6. Após permuta iónica, evaporação de dissolvente, secagem sob vácuo e trituração com éter obteve-se 0,14 g do composto.

EK(FAB) para ^C26^H48^N7°5^B:

Calculado + H: 550,39 Encontrado ; 550,42

Exemplo 15

Derivado Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-Ο^θΗ^^ do ácido benzeno-sulfónico.

Preparou-se Boc-Leu-Ala-OBzl pelo procedimento utilizado para a síntese do exemplo 2. Dissolveu-se Boc-Leu-Ala-OBzl (23,7 g; 57,7 mmol ) com 40 ml de ácido trifluoroacético anidro. Decorridos 15 minutos removeu-se o excesso de ácido trifluoroacético por evaporação e tratou-se o resíduo com éter pa-

ra proporcionar 0 derivado H-Leu-Ala-OBzl do ácido trifluoro-
acético sob a forma	de um produto cristalino (22	,8 g).
Análise;	c %	H %	N %
Calculado para	C18H25N2°5F3: 53,19	6,21	6,89
Encontrado ;	53,37	5,68	6,84

Preparou-se Boc-Gly-Leu-Ala-OBzl acoplando Boc-Gly-OH (5,70 g, 32,6 mmoles) a H-Leu-Ala-0Bzl utilizando o procedimen·

to do anidrido misto descrito no exemplo 2. Obteve-se o prodju to (13,8 g) no estado sólido amorfo. Desbloqueou-se Boc-Gl^-Leu-Ala-OBzl com ácido trifluoroacêtico pelo procedimento do trifluoroacetato ser solúvel em éter. Dissolveu-se a preparação em acetato de etilo e trata-se com cloreto de hidrogénio anidro. 0 produto resultante precipitou por adição de éter para proporcionar 7,7 g de cloridrato de H-Gly-Leu-Ala-OBzl .HC1 acoplando Eoc-Leu-OH (2,62 g; 10,5 mmoles) a H-Gly-Leu-Ala-OBzl utilizando o procedimento de anidrido misto descrito no exemplo

2. 0 produto resultante cristalizou com acetato de etilo/hexa no para proporcionar 2,7 g (P. F. 95-96°C na primeira colheita. Análise :

	C /	H %	N /
Calculado para	C29W7:: 61,89	8,26	9,96
Encontrado :	62,00	8,40	9,83
Preparou-se	Boc-Leu-Glj-Leu-Ala-	OH por	hidrogenação ca-
talítica do éster benzilico (2,6 g; 4,62	mmoles) segundo o pro-

cedimento descrito no exemplo 2 para proporcionar 2,1 g. 0 pro-

duto resultante cristalizou com acetato	de etilo aquecido origi
nando 1,4 g.
Análise:		c $	H %	N %
Calculado	para	55,90	8,55	11,86
Encontrado	• •	55 Λ2	8,47	11,73

Preparou-se Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-NH-CH/’ (CH₂)^Br _/B0₂’^C10^Hl6 ^ac°Pl^and0 Boc-Leu-Gl^-Leu-Ala-OH (1,49 gj 2,96 mmoles) à amina do exemplo la, utilizando o procedimento do exemplo 2 com a excepção da base de cromatografia que se eliminou. 0 pro

duto cristalizou com acetato de etilo/hexano para proporcionar

1,17 g. A TLC em metanol/clorofórmio (1:9) indicou uma mancha tínica de Rf = 0,68.

Análise:

	V /a	TT cs? Xl	N %	B %
Calculado para C^H^N^OgBrB:	55,10	8,11	8,93	1,38
Encontrado :	55,96	8,30	8,71.	1,33

Preparou-se a azida correspondente pelo procedimento des crito no exemplo 3 ^coin um rendimento de 97 % θ converteu-se ea Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroOrn-C^QH^^ pelo método descrito no exemplo 4. Preparou-se uma amostra analítica precipitando o produto com éter e fazendo depois a cromatografia em LH-20 seguida de nova precipitação com clorofórmio e hexano.

EM(FAB) para C^H^NgOgB

Calculado + H: 721,50 Encontrado: 721,55

Preparou-se o derivado Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-C^gH^ pelo método descrito no exemplo 5· Fez-se reagir o corresponden te pêptido de boro-ornitina (0,695 g; 0,791 mmol ) com 5 ml de uma solução de cianamida (50 mg/ml) em etanol absoluto. Submeteu-se a mistura anterior a uma cromatografia e triturou-se com éte^ obtendo-se 0,4l g do produto desejado.

EK(BAR) para CgyH^NgOgB:

Calculado + H: 763,53

Encontrado: 763,8.

Exem20

Exemplo 16

H.Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-CjQH^g .HC1. Aeido benzeno-sul fónico

Faz-se reagir o derivado Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-^C10^Hl6 ^do ®^ci(3° benzeno-sulfónico (exemplo 15; 0,050 g; 0,0543 mmol ) com 2 ml de cloreto de hidrogénio 4N em dioxano, durante 5 minutos à temperatura ambiente. Removeu-se o dissolvente e excesso de cloreto de hidrogénio por evaporação. Secou-se a amostra com hidróxido de potássio sob vácuo, durante a noite, e depois triturou-se com éter para proporcionar o produto (46 mg) sob a forma de um sal misto.

SM(BAR) para C^H^NgOgB:

Calculado + H: 663,47 Encontrado: 663,5θ

Exemplo 17

Derivado Bz-Glu(0Bu)-Gly-boroArg-C^^H^g -sulfónico do ácido benzenoPreparou-se Bz-Glu(0Bu)-Gly-NH-CH/ (CH^Br /B0₂“^C10^Hl6 mediante ligação de Bz-Glu(0Bu)-Gly-0H è amina, de acordo com o método descrito no exemplo 2. Preparou-se a azida correspondente pelo método descrito no exemplo 3 e preparou-se o péptido de boro-ornitina pelo método descrito no exemplo 4.

EM(BAB) para C^H^N^B:

Calculado + H: 613,38 Encontrado: 613,60

2λ

Obteve-se ο produto final pelo método descrito no exem pio 5 ·

SK(B/F) para C^H^N^B:

Calculado + H: 655,40 Encontrado: 655,37

Analise:

	f d υ /σ	H %	Ν X	B %
Calculado para C^^Hc?N^310SB:	57,62	7,08	10,34	1,33
Encontrado :	57,43	7,25	9,91	1,23

Sxemplo 18

Bz-Glu-Gly-boroArg-CqQHq^ .acido benzeno-sulfónico.

Dissolveu-se o derivado Bz-01u(0Bu)-Gl>-boroArg-CqQHq^ do ácido benzeno-sulfónico (0,13 g; 0,16 mmol ) em 5 ml de dioxano, adicionou-se ácido benzeno-sulfónico (0,10 g$ 0,66 mmol ) e agitou—se a solução durante a noite a temperatura ambiente. Depois concentrou-se a solução até aproximadamente 1 ml por evaporação e a seguir triturou-se com éter para proporcionar um pro duto sólido (0,14 g). ]?ez-se a cromatografia do material numa coluna de 2,5 x 50 cm de LH-20 em metanol. £ubmeteu-se a evapo ração as fracções contendo o produto desejado e triturou-se o resíduo com éter para proporcionar 53 mg do produto desejado EK(hAP) para

Calculado + H: 599,34

Encontrado: 599,35 + 613,36 (não identificado).

Exem22

Exemplo 18a

Bz-Glu-Glj-boroArg-CjgH^^ .ácido benzeno-sulfonico

Tratou-se o derivado Bz-Glu(OBu)-Gl^-boroArg-C^QH^^ do ácido benzeno-sulfónico (exemplo 17; 0,20 g; 0,246 mmol ) com cloreto de hidrogénio anidro pelo procedimento descrito no exemplo 6, durante 45 minutos. Depois de se ter triturado o material com éter a RMN indicou que aproximadamente 30 % do grupo de protecção t-butilo estava ainda presente. Seguidaraen te fez-se reagir o produto com TFA anidro dursnte 45 minutos s temperatura ambiente. Removeu-se o TFA por evaporação e tritu rou-se o resíduo com éter para proporcionsr 143 mg.

EM(EAE) para C^H^N^OpE:

Calculado + H: 599,34 Encontrado; 599,35

Exemplo 19

I Bz-Pro-Bhe-boroArg-CjQH^^ .ácido benzeno sulfonico.

Preparou-se Bz-Pro-Phe-OH (P. F. 200-201°C) pelo meto do descrito no exemplo 2 para a síntese de péptidos.

Análise:

	C /	H 7	N %
Calculado para	C21H22N2°4: 68,82	5,06	7,(6
Encontrado :	68,91	6,09	7Λ7
Preparou-se	Bz-Pro-Phe-NH-CH/ (CH	2)3Br	/BOg-C^gH·,' SCO

piando Bz-Pro-Phe-OH a amina utilizando o método geral descri to no exemplo 2 com a excepção de se ter eliminado a fase de cromatografia. A TLC em metanol/clorofórmio (1:9) indicou-uma mancha principiai de Rf = 0,72 e uma risca com Rf = 0,86.

EM(EAR) para C^H^N^EBr:

Calculado + H: 678,27 Encontrado: 677,95

Converteu-se 0 halogeneto de alquilo em azida e no péptido de boro-ornitina de acordo com os procedimentos descri tos nos exemplos 3 ® **·

EM(EAP) para (Ez-Pro-Phe-boroOrn-C^H^) C^H^r^Q^B:

Calculado + H: 615,37

Encontrado : 615,42

Preparou-se 0 derivado Bz-Pro-Phe-boroArg-C^Q^^ do ácido benzeno-sulfónico pelo método descrito no exemplo 5· EM (BAR) para C^H^N^B:

Calculado + H: 657,39·

Encontrado: 657,13·

Análise:

Calculado para Ο^Η^Ν^ΟθεΒ: Encontrado :

c %	H %	N %	B f,
61,90	6,82	10,31	1,33
60,16	7,27	9,79	1,44

Sxemplo 20

Bz-Pro-Phe-bo roArg-OH.HC1

Dissolveu-se o derivado Bz-Pro-Phe-boroArg- ^e10^Hl6 ^d° ácido benzeno-sulfónico (Composto do Exemplo 19; 0,64 g; 0,70 mmol ) em 4 ml de cloreto de metileno e arrefeceu-se para

-78°C. Adicionou-se a um balão contendo 4 tricloreto de boro 1,0 N (Aldrich Chemical Co, Milwaukee, WI) a 50 % com cloreto de metileno, em banho de neve carbónica. Agitou-se a solu ção durante 5 minutos a -78°C, depois transferiu-se o balão para banho de gelo a 0°C e agitou-se a solução durante 15 minutos. Adicionou-se lentamente água fria (5 ml) e depois diluiu-se a solução até 120 ml com ácido acético a 20 A fase orgânica separada removeu-se e eliminou-se. Aplicou-se a fase aquosa a uma coluna de 20 ml de SP-Sephadex que se equilibrou com ácido acético a 20 f. Lavou-se a solução com aproximadamente 150 ml de a'cido acético a 20 % e depois submeteu-se a um gradiente linear desde 200 ml de ácido acético a 20 fo até 200 ml de ácido acético a 20 f> contendo ácido clorídrico 0,30 N. Eluiu-se o pro duto quando a concentração do ácido clorídrico estava compreendida entre 0,08 e 0,15 N. Obteve-se o produto desejado (0,19 g) após evaporação do dissolvente, secagem do resíduo sob vácuo e trituração com éter.

SM(BAR) para C^H^N^B:

Calculado + H: 52379

Encontrado: 579,34 (não identificado)

Análise:

	C %	Η %	K %	B %
Calculado para C^H^N^O^CIB:	53,29	6,55		1,84
Encontrado :	53,27	6,58	13,25	1,89

A esterificação do produto com pinanodiol conforme descrito no exemplo 8a proporcionou um produto cujas caracteristicas de RMN e de SM foram oonsistente.com o éster inicial do exemplo 19.

EM(BAP) para CyH^N^B:

Calculado + H: 657,4°

Encontrado: 657,39

Exemplo 21

Cloridrato de Bz-Pro-Phe-boroArg-F. Bz-Pro-Phe-NH-CH/?(CH₂)₃NH-C(NH)NH₂ JBF'₂ .HC1

Preparou-se Bz-Pro-Phe-boroArg-F através de uma modificação do procedimento descrito por Kinder e outros, J. Ked. Chem., 28: 1917-1925- (1985)”. Dissolveu-se ácido borónico livre (Composto do Exemplo 20; 0,100 g; 0,179 mmol ) em 2 ml de água. Adicionou-se-lhe 0,040 ml de ácido fluorídrico a 48 % à tempera tura ambiente. Formou-se quase instantaneamente um precipitado gomoso. Agitou-se a reacção durante 10 minutos e depois congelou-se a mistura e eliminou-se a água e o excesso de ácido fluo rídrico sob vácuo. Dissolveu-se o residuo em metanol, concentrou-se e triturou-se em éter. Obteve-se um rendimento de 0,093 g.

EK(BAB) para C^H^N^BF^

Calculado + H: 527,29

Encontrado: 5^7,31 β massas adicionais características do ácido borónico livre.

Análise;

C % H / Hf B f

Calculado para C^H^N^BF^l.I^O: 53,47 6,25 14,47 1,86 e

F f

6,54

C % Η # N % Β % Έ ?₀

Encontrado : 54,00 6,4θ 13,48 1,95 7,06 .

Exemplo 22

Bromidrato de Boc-ÍDÍPhe-Pro-boroIrg-C^Q^^

Borolrg- é a abreviatura para -NH-CH/'(CH₂)jS-C(NH)NH_2-/

B0₂“ em que o grupo iso-tio-urónio substitui o grupo guanidina de boro-arginina.

Dissolveu-se Boc-(D)Phe-Pro-MH-CH/' (CH₂)^Br -7Βθ2“^10^ΐ6 (Composto do exemplo 2; 1,00 g; l,6l mmol ) em 4 ml de etanol ab soluto e adicionou-se tio-ureia (0,37 g; 4,82 mmol ). Agitou-se a mistura durante a noite à temperatura ambiente. Concentrou-se a solução e triturou-se o residuo com éter para proporcionar 0,58 g de um produto sólido. Fez-se a cromatografia do produto sólido resultante numa coluna de 2,5 x 50 cm de LH-20 em metanol. Submeteu-se a evaporação as fracções reunidas contendo o produto desejado para proporcionar 0,26 g. Triturou-se a amostra com éter para proporcionar 0,150 g de um sólido amorfo.

EM (BAR) para C^H^N^BS s Calculado + H: 670,38 Encontrado: 670,39

Análise:

c /	H %	N %	B %
Calculado para C-^H^N^O^SErB; 54,40	7,13	9,33	1,44
Encontrado : 54,10	7,39	9,27	1,47

resíduo solúvel em éter obtido nesta reacção era constituído principalmente por material inicial que se converteu em sal de iso-tio-urónio em períodos de reacção mais longos.

TL

Utilizou-se este procedimento geral para a preparação de outros sais de iso-tio-urónio com a excepçao de se ter utilizado em .alguns casos um excesso 4 vezes superior de tio-ureia e um tempo de reacção de 3-4 dias.

Sxemplo 23

Bromidrato de H-(D)Phe-Pro-boroIrg-C^QH^^

Fez-se reagir Bromidrato de Boc-(D)Phe-Pro-boroIrg“^C10^Hl6 «Aposto ^do θΧθ®Ρΐο 22; 0,050 g; 0,067 mmol ) com 1 mL de ácido clorídrico 4 N em dioxano durante 15 minutos com éter para proporcionar 0,040 g de um sólido branco.

EM(BAR) para C^H^N^SB:

Calculado + H: 571,29 Encontrado: 570,47.

Exemplo 24

Bromidrato de Ac-Ala-LysíBoeJ-boroIrg-CjQH.^

Fez-se reagir Ac-Ala-Lys(Boc)-NH-CHZ (CH^J^Br JTBO^-^c10^Hló (a partir do exemplo 13; 0,700 g; 1,04 mmol) com tio-ureia (0,320 g; 4,00 mmol) durante 4 dias em 4 ml de etanol absoluto. Purificou-se o produto pelo procedimento descrito no exemplo 22. Após a cromatografia obteve-se 0,28 gramas do produto desejado. A trituração com éter proporcionou 0,173 g de um produto branco no estado sólido amorfo.

EK(BAR) para C^H^N^O^SB:

Calculado + H; 667,8 Encontrado: 667.

zs

Análise:

Calculado para

Encontrado :

C X ^C31^H56^N4°7^{SBrB: 1+9} ’⁷⁹ 49,20

TJ Π /0	N X	Β X
7,56	11,24	1,44
7,62	11,31	1,36

Exemplo 25

Ac-Ala-Lys-boroIrg-CjQH^^^HBr.

Dissolveu-se Ac-Ala-LysíBocJ-boroIrg-C-j^H^ .HBr (o com posto do exemplo 24; 0,050 g; 0,067 mmol ) em 1 ml de metanol e fa-se borbulhar através da solução de brometo de hidrogénio gasoso durante 10 minutos. Removeu-se o dissolvente por evaporação e triturou-se o residuo com éter para proporcionar o produto desejado no estado sólido (49 mg).

SM (BAR) para C^H^N^SB:

Calculado + H: 567,35 Encontrado: 567,41

Exemplo 26

Ae-Phô-borolrg-C^H.^, HBr

Faz-se reagir Ac-Phe-NH-CH/* (CHp^Br /Β^’^Ο^ΐό ^^do exemplo 9; 1,00 g; 2,4l mmol ) com um excesso 3 vezes superior de tio-ureia em 5 ml de etanol absoluto de acordo com o procedimento descrito no exemplo 22. Obteve-se um produto branco (0,284 g) no estado sólido amorfo. Obteve-se mais produto fazendo reagir novsmente com tio-ureia qualquer material remanescente solúvel em éter e repetindo o procedimento de purificação.

EM(BAR) para C^H^N^SB;

Calculado + H: 515,29 Encontrado: 515,29

Analise:

	c %	H %	N X	B %
Calculado para C^H^N^O^SB:	52,44	6,79	9,“n	1,82
Encontrado :	52,83	6,89	8Λ7	1,85

Exemplo 27

Bz-Pro-Phe-bo rol rg-C-^θΗ^, HBr

Utilizou-se Bz-Pro-Phe-NH-CH,/(CH₂)₃Br J^B0₂C₁₀H_1ó (pro duto do exemplo 19; 0,500 g; 0-737 mmol ) para se preparar o produto deste exemplo de acordo com o procedimento descrito no exemplo 22. Obteve-se um produto branco (0, 356 g) sob a forma sólida.

EM (BAR) para C^H^gN^SB:

Calculado + H: 674,35 Encontrado: 474,27·

Ana'lise: '

	C %	H %	N °/ô	B %
Calculado para C^H^N^Q^SBBr:	57,29	6,56	9,28	1,43
Encontrado:	57,46	6,45	8,78	1,38

Sxemplo 28

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroIrg- ^C10^Hl6’ ^HBr

Utilizou-se Boe-Leu-Gly-Leu-Ala-NH-CH/' (CH^Br „/B0₂”^C10^Hl6 (P^r°ú^ut° ^do exemplo 15; 0,770 g; 0,980 mmol ) para se preparar o composto analogo de iso-tio-urénio deste exemplo uti lizando o procedimento descrito no exemplo 22.

Apés a cromatografia. dos produtos de reacção obteve-se o produto final (0,400 g) sob a forma de um solido branco, por trituração com hexano.

EM(BAR) para C^^N^SB:

Calculado + H:	780,48
Encontrado:	780,52
Análise:	C %	xi tf n fi	N %	B %
Calculado para	C37H67N50ifSBrB: 57,62	7,36	11,39	1,26
Encontrado :	51,03	7,86	11,14	1,18

Exemplo 29

H-Leu-Gly-Leu-Ala-boroIrg-C^QH^, 2HBr

Dissolveu-se boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroIrg-C^glíj^.HBr (composto do exemplo 28; 0,100 g; 0,12 mmol ) em 1 ml de metanol e adicionou-se 1 ml de brometo de hidrogénio 0,7 N em cloreto de metileno. Agitou-se a mistura durante 15 minutos à tem peratura ambiente. Removeu-se o dissolvente e o excesso de bro meto de hidrogénio por evaporação e triturou-se o residuo com éter para proporcionar o produto desejado com um rendimento qua se quantitativo.

EM (BAR) para

Calculado + H: 680,4-3

Encontrado: 680,50.

Exem81

Exemplo 30

Bz-GluíOBuJ-Gly-boroIrg-C-^gH-j^^, HBr

Utilizou-se bz-Glu(OBu)-Gly-NH/f (CEUp^Br-^ΒΟ^θΗ·^ (produto do exemplo 17; 0,295 gj 0,433 mmol ) para se preparar o composto análogo de iso-tio-uránio (0,220 g) utilizando o pro eedimento descrito no exemplo 22.

EK(EAR) para C^H^N^SB:

Calculado + H: 672,36 Encontrado: 672,3.

Análise:

	C /	tr H /ú	N %	B %
Calculado para Ο-,-,Η^,ΝρΌ,,βΒΒΓ: 33 51 5 7	52,66	6,8¼	9,31	1,44
Encontrado:	52,38	6,76	8,81	1,46

Exemplo 31

Bz-Glu-Gly-boroIrg-C^Hj^, HBr

Dissolveu-se Bz-GluOBuJ-Gl^-boroIrg-C^^^ .HBr (0 pro duto do exemplo 30; 0,050 g; 0,066 mmol ) em 1 ml de TFA e agitou-se durante uma hora à temperatura ambiente. Adicionou-se brometo de hidrogénio em cloreto de metileno (0,35 mole) e evaporou-se 0 liquido da solução resultante. Triturou-se o residuo com éter para proporcionar 47 mg.

EK(BAR) para C₂9^H42^N5°7^SB:

Calculado + H: 6l6,3O Encontrado: 616,34

Exemplo 32

Boc- (D )Phe-Phe-boroIrg-C]_QH]_6,3Br

Utilizou-se Boc-(D)Phe-Phe-NH-CH/ (CH^Br-7^2^3.0^6 (composto do exemplo 11; 1,50 g; 2,07 mmol) para se preparar o composto análogo de iso-tio-urdnio (0,90 g) utilizando o proc· dimento descrito no exemplo 22.

EM(BAR) para C.gH^N^SB:

Calculado + Hz 719,84 Encontrado: 720

Análise:

Calculado para C^gH^^N^O^SBBr: Encontrado:

V /Q	Η í	N %-	B %
56,99	6,94	8,75	1,35
55,89	6,37	8,59	1,18

Exemplo 33

H-(D)Phe-Phe-borolrg-C_1QH₁₆, 2HBr

Fez-se reagir Boc-(B)Phe-Phe-boroIrg-C^QH-j_g .HBr (com posto do exemplo 20; 0,20 g; 0,25 mmol ) com brometo de hidro génio utilizando o procedimento descrito no exemplo 29 para proporcionar 188 mg do produto desejado.

SM(BAR) para C^H^N^SB:

Calculado + H: 620,34 Encontrado: 620,40

Exemplo 34

Z-Phe-Gly-Gly-borolrg-C-^QH^g

Preparou-se Z-Phe-Glj-Gly-NH-CH/' (CH^Br /80₂-C₁₀H_l2 por ligação de Z-Phe-Gly-OH à amina (exemplo la), utilizando-se o procedimento descrito no exemplo 2.

Análise;

C fc	H ;<	N M	B #
Calculado para C^H^N^OpBBr; 57,93	6,40	7,72	1Λ9
Encontrado: 58,42	6,83	7,7^	1,96

Converteu-se 0 halogeneto de alquilo (1,00 g; 1,38 mmol ) no composto análogo de iso-tio-urónio pelo método do exem pio 22 para proporcionar um produto branco (0,87 g) no estado sólido amorfo.

EM (BAR) para C^H^N^SB:

Calculado + H;	721,36
Encontrado:	721,32
Análise;	C X	Η X	R fo	B f
Calculado para	C36H50N6°7SBBr: ^>°°	6,31	10,50	1,35
Encontrado:	53,17	6,50	10,03	1,25

Exemplo 35

Boc-Ala-Phe-(B,L)boroIrg-CgH₁₂, HBr

Preparou-se Boc-Ala-Phe-OMe utilizando o procedimento do anidrido misto no exemplo 2.

Análise:

	C f	H g	N f
Calculado para	61,70	7Λ8	7,33
Encontrado:	61,51	7,56	7,32

Fez-se a hidrólise do éster metilico com uma base para proporcionar Boc-Ála-Phe-OH com um rendimento de 56 fó.

Preparou-se Boc-Ala-Phe-SHI-CH/ (CH^^Br ./BO^CgHj^ acoplando Boc-Ala-Phe-OH e NH₂-CH/· (C^^Br ^Β0₂“6^Η^₂ .HCl (exem pio lb) utilizando o método descrito no exemplo 2, exceptuando a cromatografia em LH-20,

Fez-se reagir Boc-Ala-Phe-NH-CH/(CHp^Br (1,00 gj 1,72 maol ) com tio-ureia utilizando o procedimento descrito no exemplo 22 para proporcionar o composto branco aná logo de iso-tio-urúnio (0,485 ê) no estado sólido.

EM(BAR) para ^C2S^H4ó^fl5°6^sb:

Calculado + H:	592,33
Encontrado:	592,60
Análise:	C X	H £	N X	Β X
Calculado para	c28H47N5°6SBBrí 50,00	7,06	10,41	1,61
Encontrado:	^9,50	7,24	10,22	1,41

Exemplo 36

H.Ala-Phe-(D ,L)bo.roIrg-C₆H₁₂, 2HBr

Fez-se reagir Boc-Ala-Phe-boroIrg- ^C6^H12’ HBr (exemplo

35; 0,10 g; 0,149 mmol ) com brometo de hidrogénio pelo procedimento descrito no exemplo 29 para proporcionar o produto desejado com um rendimento quase total.

EM (BAR) para C^H^gN^O^SB;

Calculado + H: 492,28 Encontrado: 492,26

Exemplo 37

Boc-Ala-Phe-(D,L)boroHomoIrg-C^H^₂, HBr

Acoplou-se Boc-Ala-Phe-0H (do exemplo 35) à amina (exem pio ld) para proporcionar Boc-Ala-Phe-NH-CH/(CH₂)^Br J^BO^-C^Hj^

Utilizou-se o procedimento do exemplo 2 com a excepção de não ter sido necessário a realização da fase de cromatografia em

LH-20 para purificação. Obteve-se uma amostra analítica por cromatografia sobre gel de sílica utilizando acetato de etilo como eluente.

SM(BAR) para Ο,,θΗ^Ιϊ^ΟgBrB:

Calculado + H: 610,27 Encontrado: 610,24

Análise:

	C %	H %	N %	Br %	B %
Calculado para C^H^N^O^BrB:	55,19	7,28	6,90	13,11	1,78
Encontrado:	55,30	7,39	6,40	12,07	1,95

Fez-se reagir brometo de alquilo (0,537 g; 0,883 mmol ) com tio-ureia utilizando o procedimento do exemplo 22. Obteve-se um produto amorfo (0,23 g) no estado sólido após trituração com éter.

EM (BAR) para :

Calculado + H: 606,35 Encontrado: 606,38

Analise j

	C %	H %	N %	B %
Calculado para Cz^H^N^O^SBBr:	50,73	7,21	10,20	1,57
Encontrado:	50,22	7Λ6	9,74	1,55

Exemplo 38

H-Ala-Phe-(L,L)boroHomoIrg-C₆H₁₂ , 2HBr

Fez-se reagir Boc-Ala-Phe-(D,L)boroHomoIrg-C^H^₂ .HBr (composto do Exemplo 37; 0,050 gj 0,073 njnol ) com ácido bromí drico pelo procedimento descrito no exemplo 29 para proporcio nar 44 mg do produto desejado.

EM(BAR) para ^C24^H40^N5°4^SBj

Calculado + H: 506,30

Encontrado: 506,39

Exemplo 39

Boc-Ala-Phe-(D,L)boroLys-CgH^₂, HCl derivado de Boc-Ala-Phe-NH-CH/' (CH^ME^ 7B0₂ ^C6^H12 do ácido benzeno sulfónico.

Converteu-se Boc-Ala-Phe-NH-CH/' (CH₂)^£r TBO.-C^(do exemplo 35) na alquilazida utilizando o procedimento do exemplo 3 com ^a excepção de não ter sido necessária a fase cro matográfica em LH-20 para purificação. Hidrogenou-se a azida utilizando o método descrito no exemplo 4 com a excepção de se terem utilizado dos equivalentes de ácido benzeno-sulfónico e sendo o tempo de hidrogenação de 2 horas, para proporcionar o produto final com um rendimento de 4θ % (P. F. 154-1ÓO°C, dec.) EM (BAR) para =

Calculado + H: 547,38 Encontrado: 547,43

Exemplo 40

Derivado de H-Ala-?he-(D,L)boroLys-CgH₁₂, TFA do ácido benzeno-sulfónico

Fez-se reagir o derivado Boc-Ala-Pne-(D ,L)boroLys-CgH-^₂ do ácido benzeno-sulfónico (composto do exemplo 39) com ácido trifluoro-acético durante uma hora à temperatura ambiente.

Evaporou-se o dissolvente e triturou-se o resíduo com éter para se obter um produto sólido.

SM (BAR) para C^H^N^B:

Calculado + H: 447,31 Encontrado: 447,31

Análise:

	C %	H %	N f	B %
Calculado para C^jH^N^O^SF^B.2EL)0j	49,34	6,68	7,42	1,43
Encontrado :	49,26	5,94	7,12	1,34

Exemplo 4l

Derivado de Boc-ÍDRal-Leu-borcLys-C^H.^. do ácido benzeno-sulfónico oc-(D)Val-Leu-OH pelo método descrito no ! o éster benzílico com o rendimento de

0_c:

Calculado + H: 421,27 Encontrado: 421,38

Após hidrogenação obteve-se o ácido livre com um rendimento de 100 % sob a forma de um; sólido cristalino branco. Análise:

Preparou-se B exemplo 2. Obteve-se 76 X.

BK(BAH) para C^H.gtq

		p tí	H %	N X
Calculado para	Cl6H29N2°5:	59,3*f	8,87	8,50
Encontrado :	59,3*1	8,87	8,50

Acoplou-se Boc-(D)Val-Leu-0H à amina (exemplo ld) utilizando-se métodos descritos no exemplo 37 para o acoplamento de Boc-Ala-Phe-OH para proporcionar

Boc-(D)Val-Leu-NH-CH/f (CH^Er _/B0₂-C₆H₁₂ com um rendimento de 97

SM (BAR) para ^^H^N^O^BBrj Calculado + Hz 6o4,31 Encontrado: 604,31

Converteu-se brometo de alquilo na azida corresponden te com um rendimento de 85 % pelo método descrito no exemplo 3 e hidrogenou-se a azida pelo método descrito no exemplo 39 P^ara proporcionar o produto final branco no estado sólido, com um rendimento de 62 %.

EM (BAR) para

Calculado + H: 541,4l Encontrado: 541,46

Análise:

Encontrado:

C X	Η X	N %	- /
54,62	8,61	7,73	1,1+9
54,53	8,59	7,9^	1,98

Exemplo 42

Derivado do Ae-Phe-boroLys-C^H₁₂ ·όο ácido benzeno-sulfóco

Preparou-se o composto do exemplo 42 de acordo com o procedimento descrito no exemplo 39.

Preparou-se Ac-Phe-NH-CH/ (CH₂)^Br com um rendimento de 72 X.

EM(BAR) para ^22^34^2θ4^^Γ! Calculado + H: 481,00

Encontrado: 481,21

Obteve-se a azida com um rendimento de 57 Obteve-se o produto final com um rendimento de 5θ M·

EM(EAR) para C^H^N^Bs

Calculado + H: 418,29 Encontrado: 418,31

Análise:

	C /	H %	N %	B %
Calculado para C29IÍ42^3°7SB*H2C):	56,66	7,47	7,08	1,82
Encontrado:	56,88	7Λ3	7,22	1,53

Exemplo 43

Bz-(D,L)boroIrg-CgH₁₂, HBr

Preparou-se Bz-(B,L)KH-CH/' (CH. ).Br 7B0₅-C_LH_1o fazendo reagir a amina (Exemplo lb; 3,0 g; 15,9 mmol ) com um equivaleu te de cloreto de benzoílo e dois equivalentes de carbonato de hidrogénio e sódio numa mistura constituída por 4 ml de dioxano e 4 ml de água a 0°C. Após a mistura inicial dos reagentes diluiu-se a reacção com 6 ml de dioxano/água a 50 % e deixou-se aquecer até à temperatura ambiente. Agitou-se a mistura de reac ção durante aproximadamente 30 minutos à temperatura ambiente e depois extraiu-se o produto com acetato de etilo e, em seguida lavou-se com água, ácido clorídrico 0,2 N, solução aquosa a 5 % de carbonato de hidrogénio e sódio e com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Secou-se a fase orgânica sobre sul fato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se para proporcionar um produto cristalino. Após isolamento e lavagem com acetato de etilo obteve-se 3,6 g do composto (?. F. 176-177°C).

Análise:

	f-. S’ υ	H /	N %	B /
Calculado para C, JHocM0oBrB: 17 25 3	53 ,Ά	6,59	3,67	2,83
Encont rado:	54,50	6,76	3,68	d ,84

Converteu-se o halogeneto de alquilo (1,00 g; 2,62 mmoles) so sal correspondente de iso-tio-urónic pelo procedimen to descrito no exemplo 22. Obteve-se 0,84 g de um produto bran co no estado sólido.

EM(BAR) para C-^fLgN^SB:

Calculado + H: 378,20 Encontrado; 378,21

Análise:

	C %	H %	N /	B /
Calculado para C^gH^N^G^SBBr:	47,18	6,33	9,17	2,36
Encontrado :	46,11	6,71	8,97	2,22

Exemplo 44

Derivado de Bz-(D,L)boroIrg-C^H₁₂· 8o ácido benzeno-sulfónico

Converteu-se o halogeneto de alquilo (exemplo 43; 2,0 g; 525 mmol ) em 0,27 de azida (P. F. 138-139°C) utilizando 0 procedimento do exemplo 3· Converteu-se a azida no derivado de Bz-boro-C^H^ 80 ácido benzeno-sulfónico com um rendimento quase quantitativo utilizando o procedimento do exemplo 4.

EM (BAR) para 8 3.8¾ 7^2^3^⁵

Calculado + H: 319,22 319,26

Encontrado:

Fez-se reagir o derivado Bz-boroOrn-C^H^* do ácido benzeno-sulfónico (0,90 g; 1,84 mmol ) com cianamida utilizan do o procedimento do exemplo 5, obtendo-se 0,65 g de produto cristalino (P. F. 242-244°C).

EM(BAB) para :

Calculado + H: 361,24. Encontrado: 361,24.

Análise;

Calculado para

Encontrado :

:₂U^H35h°6^SB!

/·{ /£* v /d	H %	N %	D tf* D /tf
crcr çc	6,82	10,81	2,08
54,6o	6,70	11,24	1,87

Exemplo 45

Derivado do Ac-Leu-Thr(OBu)-boroArg-C^QH₁^. do ácido benzeno- sulfónico

Preparou-se Ac-Leu-Thr(0Bu)-0H acoplando Ac-Leu-OSu a h-Thr(0Bu)-0H utilizando-se o procedimento do exemplo 13 para a sintese de pébtidos com a excepção de se ter obtido o produto final sob a forma de um sólido branco amorfo após cromatografia em LH-20. Acoplou-se Ac-Leu-Thr(0Bu)-0H (3,29 g; 9,90 mmol ) s amina (exemplo la) utilizando o procedimento de anidrido misto do exemplo 2, com a excepção de não ter sido necessária a fase de cromatografia em LH-20.

Obteve-se 5,39 g de Ac-Leu-Thr(0Bu)-NH-CHZ (CHZ-ft/BO,.d j 2.

^Cl8^Hl4 ^{soB a} ^^{onES 8e 13111} branco amorfo. Converteu-se o halogeneto de alquilo na azida correspondente com um rendimen to de 82 % utilizando o procedimento do exemplo 3 com a excepção de não ser necessária a fase de cromatografia para purificação

adicional. Hidrogenou-se s azida (3,88 g; 6,42 mmol )pelo pro cedircento do exemplo 4. Obteve-se o produto Ac-Leu-Thr(OBu)-boroOrn-C^QH^. ácido benzeno-sulfónico com um rendimento de /4 % após cromatografia em LH-20 e trituração com éter.

EM (BAR) para. ^c30^H55^Kit°6^B!

Calculado + H: 579,43.

Encontrado: 579,48.

Converteu-se o péptido de boro-ornítina no produto final com um rendimento de 86 % pelo procedimento do exemplo 5· EM(BAR) para C^jE^N^O^Bí

Encontrado:

Análise:

Encontrado

621,45.
621,50.
	C /	H %	N %	B %
'37Η63Ν6εΟ9Β:	57,05	8,17	10,79	1,39
	56,47	8,01	10,93	1,34

Exemplo 46

Derivado Ac-Leu-Thr-boroArg-C-^θΗ^^. do ãcido benzeno-sulfónico

Dissolveu-se o derivado Ac-Leu-Thr(Bu)-boroArg-C₁₀H₁^ (exemplo 45; 0,200 g; 0,257 mmol ) numa mistura de 2 ml de cio reto de metileno e de 2 ml do ácido clorídrico 4 N: dioxano e deixou-se em agitação durante 3θ minutos à temperatura ambiente. Evaporou-se o dissolvente e secou-se o residuo sob vácuo intenso. Obteve-se o produto desejado sob a forma de um sólido bran co com um rendimento de 97 /por trituração com éter.

EM (BAR) para C^H^N^B: Calculado + H: 565,39. Encontrado: 565,48*

Exemplo 47

Derivado Ac-Lys(Boc)-Pro-boroArg-Cj,₀H^^. do ácido benzeno-sulfónico

Preparou-se Ac-Lys(Boc)-Pro-OH pelos métodos descritos no exemplo 13. Obteve-se um sólido branco (P. F. l6O-l6l,5°C) após cristalização com acetato de etilo. Acoplou-se Ac-Lys(Boc) -Pro-OH (3,15 δ; 8,18 mmol ) à amina (exemplo la) utilizando o procedimento do exemplo 2. Utilizou-se 5,8 g do produto sem pu rificação adicional. Converteu-se a azida com um rendimento de 73 % pelo método do exemplo 3? após croinatografia em LH-20.

A hidrogenaçãp pelo método do exemplo 4, cromatografia em LH-20 e trituração da amostra com éter proporcionaram 0 derivado

Ac-Lys (Boe)-Pro~boroQm- ^C1O^H16 do ácido benzeno-sulfónico, com um rendimento de 81 SM(BAR) para CyH^N^B:

Calculado + H: 634,43 Encontrado: 634,46 pêptido de boro-ornitina com cianamida pelo procedimento do

1,8 gramas do produto desejado sob EM (BAR) para C^H^N^B:

(2,0 g; 2,55 mmol ) reagiu exemplo 5 para proporcionar a forma de um sólido branco.

Encontrado:

Calculado + H: 676,46

676,41

Análise:	C /	H %	N /	B /
Calculado para	56,23	7,&t	11,77	1,30
Encontrado:	56,06	7,48	11,75	1,22

Exemplo 48

Ac-Lys-Pro-boroArg-C^H^, 2HC1

Fez-se reagir o derivado Ac-Lys(Boc)-Pro-boroAT^,g-C₁₀^ do ácido benzeno-sulfónico (exemplo 47; 0,30 g; 0,360 mmol ) com uma mistura 50:50 de ácido acático glacial e de ácido clorí drico 4N : dioxano, durante 15 minutos à temperatura ambiente. Evapora-se o resíduo em água e fez-se passar por uma coluna de 5 ml de AG1-X8 (forma CL). Evaporou-se a amostra e triturou-se o resíduo com éter para proporcionar o produto desejado sob a forma de um sólido branco (230 mg).

SM(BAR) para C^H^H^B:

Calculado + H: 576,40 Encontrado: 576,45

Exemplo 49

Derivado Ac-Ala-Glu(OBu)-boroArg-C^QH^^ . do ácido benzeno -sul fónico

Preparou-se Ac-Ala-Glu(0Bu)-0H acoplando Ac-Ala-OSu a

H-Glu(0Bu)-0H utilizando o procedimento do exemplo 13. 0 pro-

duto cristalizou com acetato de etilo/hexano (P.	F. 147,5-148¾.
Análise:	c .·.	H /	S <S
Calculado para	53,14	7,66	8,85
Encontrado:	53,28	7,53	9,08

Preparou-se Ac-Ala-Glu(OBu)-NH-CH/f (CHp^Br 7B0₂-C₁₍^_l6 pelo método descrito no exemplo 2 com a excepção de se ter utilizado clorofórmio em vez de acetato de etilo para a fase orgânica durante o processamento inicial da reacção e de não se ter utilizado cromatografia em LH-20. Obteve-se o produto desejado com um rendimento de 87 % sob a forma de um sélido parcialmente cristalino apos evaporação da fase orgânica. Conver teu-se o brometo de alquilo em azida pelo procedimento do exem pio 3· Obteve-se o produto desejado (P. F. l63,5-l66°C) com um rendimento de 50 % cristalizando o produto de reacção impuro com clorofórmio.

Analise:

C % Η % N % B %

Calculado para C^H^N^B: 53,51 7,55 6,69 1,73 Encontrado : 55,51 7,50 6,50 1,66

Preparou-se o péptido de boro-Ornitina pelo método do exemplo 4 para proporcionar 0 produto desejado com um rendimen to de 79 %

EM (BAR) para C^H^N^O^B:

Calculado + H: 5^5,38 Encontrado: 565,51

Obteve-se 0 produto final amorfo e branco no estado sélido com um rendimento de 70 % utilizando o procedimento do exemplo 5.

EM(EAB) para C^H^N^O^B:

Calculado + H: 607,40.

Encontrado: 607,41.

Análise:

	C /ó	H %	N %	B %
Calculado para C^H^N^O-^h	S: 5^,96	7,53	10,99	1,41
Encontrado :	ν A	7,71	11,27	1,21

Exemplo 50

Derivado Ac-Ala-Glu-boroArg-C^H^^. do ácido benzeno-sul fónico

Dissolveu-se Ac-Ala-GluíBuj-boroArg-C^H^^ .ácido benzeno-sulfónico (Exemplo 49; 0,10 g; 0,131 mmol ) em 10 ml de ácido acético e fez-se borbulhar HC1 anidro através da solução durante 20 minutos. Agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 1,5 horas e evaporou-se o dissolvente para proporcionar um óleo. Obteve-se o produto desejado sob a forma de um sólido branco (82 mg) após secagem scb vácuo e trituração com éter.

SM (BAR) para Cg^H^N^O^B:

Calculado + H: 551,3**

Encontrado: 551,41

Também se fez a preparação dos compostos seguintes utilizando essencialmente os processos descritos nos exemplos 39 β 4θ, anteriormente referidos.

Boc-Val-Val-boroLys-C^H^g .BSA;

H-Val-Val-boroLjS-C^H₁₂ .BSA.TFA;

Boc-(D)Phe-Phe-boroLys-C^Hjg .BSA;

H-ÍDjPhe-Phe-boroLjs-C^g .ESA.TFA

Boc-Glu-Phe-boroL^s-C^Hjg .BSA roGlu-Phe-boroL^s-C<Hj_2 ·BSA

5Z

Exemplos Biológicos

Nos exemplos seguintes^tc significa micro.

Exemplos 51 - 71

Inibição de calicreina de plasma humano.

Obteve-se calicreina de plasma humano em Protegen AG (Suíça). A sua actividade específica, descrita pelo fornecedor, é de 15 unidades por miligrama. Define-se a unidade como a quantidade de enzima necessária para hidrolisar um mieromole de substrato, H-(D)Pro-Phe-Arg-p-nitroanilida (Kabi S23Q2), por minuto para uma concentração de substrato de 0,50 mH à tem peratura de 25°C em 50 mK de tampão fosfato de potássio, pH tí,Q.

Preparou-se uma solução de s£ock de enzima (1 unidade/ml) em 50 % de glicerol/tampão fosfato de sódio 0,10 K, pH

7,5, contendo cloreto de sódio 0,^0 k e 0,1 % de P3G 6000 (polietilenoglicol). Em ensaios normalizados adicionou-se 10 microlitros da solução de calicreina de stoek. a 990 microlitros de uma solução constituída por 0,20 mM de S2302 em 0,10 mM de tampão fosfato de sódio, pH 7,5, contendo cloreto de sodio 0,20 K e 0,1 X de PEG à temperatura de 25°C. Avaliou-se o efei to dos inibidores controlando a actividade enzimática determinada pela medição do acre'scimo no tempo da absorvência a 405 nm, tanto na presença como na ausência de inibidores. A Tabela 1 apresenta os níveis inibidores e a actividade remanescente medi da no intervalo de tempo compreendido entre 10 e ^0 minutos após o início da reacçao.

A actividade dos elementos de controlo foi de

Ο,0092+0,0095 minutos^-!.

Tabela 1

Inibição da calicreina do plasma humano

Cone. Actividade

Sx.	Inibidor	(nE)	Percentual
51	Boc-dJPhe-Phe-boroIrg-C-^QHj!^ .HBr	10
52	H-(D)Phe-Phe-boroArg-C10Hló .2HC1	10	2,6
53	Boe-CDjPhe-Phe-boroArg-C^QH·^^ .BSA	10	2»
54	Boe-Ala-Phe-(D,L)boroIrg-C^H^2 «HBr	10	15
55	Bz-Pro-Phe-boroArg-C^H.j.6 ,tíSA	10	15
56	Bz-Pro-Phe-boroArg-OH.HCl	10	16
57	Bz-Pro-Phe-boroArg-F	10	18
58	Boc-Leu-uly-Leu-Ala-boroArg-C-jθΗ-^ .BSA	10	30
59	Ac-Ala-LysCBocí-boroArg-C^H-^ «BSA	10	34
60	Ac-Phe-boroArg-C^QH^^ .HCI	10	48
61	Ac-ÍDj-Phe-Pro-boroArg-CjQH·^ .HCI	10	56
62	H-(D)Phe-Pro-boroArg-C^QH^^2.HCl	10	61
63	Ac-Ala-Lys(Boc)-boroIrg-C1QH1^ .HBr	50	1,4
64	Ez-Glu(OBu)-Gl^-boroArg-C10H1^ .BSA	50	11
65	Ac-Phe-boroIrg-C-^H^ .HBr	50	17
66	Bz-Glu-Gly-boroArg-C^Q^^ .BSA	50	39
67	Ac-Ala-Lys-boroArg-C-^H.^ .2HC1	50	39
68	Boc-Ala-Phe-(D ,L)borohomoIrg-Cj+H12 «HBr	100	38
69	Boc-Ala-Phe-(B ,L)boroL,ys-C^H^ .HCI	1000	17
70	Boc-(E )Phe-Phe-boroOrn-C-L0H-L^ .BSA	10000	39
71	Boc-(D)Phe-Pro-boroO rn-CjqH-^ ·BSA	10000	100

Exemplos 72-110

Inibição de Trombina (Actividade da Ssterase)

Obteve-se trombina humana (actividade especifica de 2345 unidades NIH/mg) do R. Q. P. Laboratories, South Bend, IN) (Lot HT102). de reserva de trombina em tampão PIPES 0,010M pH 6,0, contendo cloreto de sódio 0,75&· Efectuaram-se os ensaios da trombina de acordo com o procedimento de Green and Shaw, Anal. Biochem., 93 : 223 (1979), em tampão fosfato de sódio, pH 7,5, contendo cloreto de sódio 0,20 M e 0,1 % de PEG 6000. A concentração inicial do substrato foi de 0,10 mM e a concentração da trombina foi de 1,0 nK (com base no peso). A Tabela 2 apresenta os níveis inibidores e a actividade remanescente medida no intervalo de tempo compreendido entre 10 e 20 mi nutos após 0 início da reacção. A actividade da trombina para os elementos de controlo foi de 0,0076 + 0,0005 minutos”⁴.

Ta1Ô0

Tabela 2

Inibição de Trombina

Conc. Percentagem (nM) Actividade

Ex. Inibidor

72	Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-Cx0 Hx 4 «HCl	5	1
73	Boc-(D)Phe-Pro-borolrg-Cx 0 Ηχ f ·ΗΒr	5	3
74	Boc-(D)Phe-Pro-boroArg-CieH1 f«BSA	5	3
75	Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH«HCl	5	3
76	H-(D)Phe-Pro-borolrg-C10Hlt «HBr«HCl	5	4
77	H-(D)Phe-Pro-boroArg-Cx 0Ηχf«2HC1	5	7
78	Boc-(D)Phe-Phe-Bo rolrg-Cx β Ηχ 4 B r	5	48
79	H-(D)Phe-Phe-boroArg-Cx β Ηχf·2HC1	10	10
80	H-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-CX0HXÍ «HCl-BSA 10	25
81	Boc-(D)Phe-Phe-boroArg-Cx 0 Ηχ e-BSA	10	32
82	H-Leu-Gly-Leu-Ala-boroIrg-CX0HXÍ -2HBr	10	37
83	Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-Cj β Ηχ 4-BSA	10	38
84	H-(D)Phe-Phe-bo rοIrg-Cxβ Ηχ 6 · 2HB r	10	49
85	Bz-Glu(OBu)-Gly-boroArg-Cj β Hx(-BSA	10	52
86	Bz-Glu(OBu-Gly-borolrg-Cx 0 Hx («HBr	10	59
87	Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroIrg-Cj βΗχ e «HBr	10	66
88	Boc-(D)Phe-Pro-boroOrn-Cl0Hlt «BSA	100	18
89	Ac-Ala-Lys(Boc)-boroArg-Cj βΗιβ-BSA	100	18
90	Z-Phe-Gly-Gly-boroIrg-Cj 0 Ηχ e «HBr	100	46
91	Bz-Glu-Gly-boroArg-Cj 0 Ηχ 4-BSA	100 *	46
92	Ac-Ala-Lys(Boc)-boroXrg-CX0H1 («HBr	100	55
93	Bz-Pro-Phe-boroArg-OH »HCl	1000	18
94	Bz-Pro-Phe-boroArg-F	1000	18
95	Bz-Pro-Phe-borolrg-Cx 0 Ηχ 6 *HBr	1000	21
96	Boc-(D)Val-Leu-boroLys-C6 Ηχ 2 «HCl	1000	21
97	Bz-Pro-Phe-boroArg-Cx 0 Ηχ 6 «BSA	1000	24
98	Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroOrn-Cx „ Ηχ fi-BSA	1000	24
99	Boc-Ala-Phe-(D,L)boroIrg-Ce Hx 2-HBr	1000	28
100	Bz-Glu-Gly-boroIrg-Cx0Ηχ6-HBr	1000	39
101	Ac-Ala-Lys-boroArg-Cx 0 Ηχ 6 *2HCl	1000	45

101

Tabela 2 (continuação)

Cone. Percentagem (nM) Actividade

Ex. Inibidor

102 Ac-Phe-boroArg-C_l0H_1<-HCI 1000 53

103 Ac-Phe-borolrg-C_ieH_tí·ΗΒγ 1000 64

104 Ac-Ala-Lys-boroIrg-C_leH_lí·2ΗΒγ 1000 68

105 H-Ala-PheHDfUboroIrg-C, H₁₂-2HBr 10000 23

106 Boc-Ala-Phe-(D,L)borohomoIrg-C_tΗ_χ2-HBr 10000 32

107 Boc-Ala-Phe-(D_r*L)boroLys-C_íH₁₂-HCI 10000 46

108 H-Ala-Phe—(D,L)boroHomoIrg-C_íHj₂*2HBr 10000 47

109 H-Ala-Phe-DjUboroLys-CjΗ_{χ 2}’2HCl 10000 89

110 Ac-Phe-boroLys-C₆H₁₂-HCI 10000 97

Exemplo 111-124

Inibição de coagulação do sangue conforme demonstrado por determinação de APTT e PT.

Determinou-se o efeito de inibidores de protease sobre a coagulação do sangue in vitro medindo os seus efeitos sobre dois parâmetros clínicos diferentes, os tempos de trombóplastina parcial activada (APTT) e os tempos de protrombina (PT). Os reagentes para cada um destes ensaios foram fornecidos por General Diagnostics, Jessup MD. Fez-se a preparação de soluções de Stock de inibidores em 25 mM de tampão HEPES pH 7,5, contendo cloreto de sódio 0,10 M. Para o ensaio de APTT fez-se a incubação ds solução inibidora (0,100 ml) com plasma humano normal (0,100 ml) e com reagente APTT activado (0,100 ml).

Após incubação durante 0,5 minutos a temperatura de 37°C ^ádi“

4:

cionou-se cloreto de cálcio (0,100 ml) e mediu-se, em segundos, os tempos de coagulação com o auxílio de um fibrometro. Na Tabela 3 apresentou-se os efeitos da variação de concentrações de inibidor sobre os tempos de coagulação do sangue comparados com os tempos de coagulação dos elementos de controlo realizados sem a presença de inibidor.

Para os ensaios de PT fez-se a incubação das soluções inibidoras (0,100 ml) com plasma humano normal (0,100 ml), durante 2 minutos a 37°C. Adicionou-se depois o reagente simplas, tina (0,200 ml) e fez-se a medição dos tempos de coagulação con forme indicado na Tabela 4.

A Tabela 5 proporciona um resumo dos resultados das Tabelas 3 e 4, apresentando as concentrações aproximadas de inibi dor necessárias para aumentar para o dobro os tempos de tromboplastina parcial activada (2 x APTT) e os tempos de protrombina (2 x PT).

Composto

Designação nas

Tabelas 3-5, 7-10 Nome do Inibidor

A Boc-(D)Phe-Pro-boroArg-C^QH^g

B H-(B)Phe-Pro-boroArg-CjQHj6

C Boc-(D)Phe-Pro-boroIrg-C₁QH^g

D Boc-(D)Phe-Phe-BoroIrg-C₁₀H₁^

S Boc(D)Phe-Phe-boroArg-C₁₀Hj_Lg . F Ac-Phe-boroArg-C₁₀ ^H16

G Ac-Phe-boroIrg-Cjj

Ta103

Tabela 3

Tempo de Tromboplastina Parcial Activada * (medida em segundos)

Número do Sxemplo

111	112	113	114	115	116	117
A	( B	Composto C	D	s	F	G
35,3	32	32,8	31+,7	3*+,7	33,7	33,8
			35,8	36,8	35	35,2
	36,5	39,2
3ú,6	44,2	46,9	!+5,2	40,5	35,2	36,2
4θ	71,5	67	46,2	43,6	36,7	39,3
61,2	158,7	16o
			60,7	52,8	44,8	58,2
113,3	169,7	197,8
128,7	21,9,7	301,8	75,7	5“t,8	58,2	66,7
			94,8	61,3	144,2	98,4

Ta104

Tabela 4

Tempos de Protrombina (media em segundos)

Número do Exemplo

Cnc. (riM)	118	119	120	121	122__ E	F	.......124 G
A	B	Composto C D
0	15,5	15,8	14,4	15,3	16,7	15,7	15,3
12,5	16,4	20,1	ló, 3
250	17,1	22,5	20,8
500	21,5	33,8	27,2	15,7	19,8		13,7
625		W,5
750	26,7	85,3	44	17,2	22		lh-,9
875	40,1
1000	>200	>250	152,7	19,9	29,3	16,2	19,7
2000				23,¼	39	20,8	43,6
4000					70,8	51,5

Tabela 5

	Inibição de Coagulação de	Sangue
	Concentração	Cale.
Composto	2X APTT(riK)	2XPT(nE)
A	230	800
B	170	460
C	200	650
D	370	1200
E	375	2600
F	325	2500
G	625	1200

Exem·

1Q£

Sxemplos 125-127

Inibição de coagulação do sangue conforme demonstrado por determinação de tempos de Trombina (TT).

Determinou-se o efeito do inibidor de protease Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH (exemplo 8) sobre a coagulação do sangue in vitro medindo o seu efeito sobre os tempos da trombina (TT). Aqueceu-se à temperatura de 37°C uma mistura de 0,2 ml de plasma normal de coelho e de 0,05 ml de tampão contendo um inibidor numa concentração 6 vezes superior à concentração final desejada. Iniciou-se a coagulação por adição de trombina (0,05 ml Pâ ra uma concentração 6 vezes superior à concentração final). A trombina utilizada foi adquirida em Sigma Chemical Company (Número T-6634, actividade de 1190 unidades NIH por mg de proteína) e preparada em tampão. 0 tampão utilizado para o inibidor e para a trombina foi o tampão Tris 0,1 M (12,10 g/1) contendo 0,154 M de NaCl (8,84 g/1) e 2,5 mg/ml de albumina de soro de bovino, pH 7Λ· 0s tempos de coagulação, medidos ea segundos, foram determinados utilizando um fibrdmetro. Na tabela 6 apresentam-se os efeitos do inibidor sobre os tempos de coagulação do sangue comparados com os tempos de coagulação de sangue nos elementos de controlo em que a experiência se efectuou na au sência de inibidores. Os valores representam a média de pelo me nos três determinações. Quando a coagulação não ocorreu decorri dos 30 segundos, interrompeu-se a reacção.

Ta106

Tabela 6

Tempos de Trombina

Ex.	Cone, de Trombina ( /U/ml)	Cone, do Inibidor (nM)	Tempos de T rombina
—	0,75	0	> 300
—	0,83	0	226,9 + 14,8
—	1.	0	147,2 + 9,1
—	1,2	0	121,1 + 0,8
—	d	0	51,0 + 0,6
—	3	0	40,0 ± 1,9
—	4	0	24,4 + 0,3
125	4	150	> 300
126	4	100	62,4 + 7,2
127	4	50	32,7 ± 0,8

tempo médio necessário para a coagulação, medido em segundos, + desvio padrão.

Exemplos 128 - 132

Estabilidade dos inibidores no plasma humano, medida por APTT

Determínou-se a estabilidade dos inibidores no plasma pela sua capacidade para inibirem a coagulação do sangue. Em primeiro lugar diluiu-se para 50 X, utilizando plasma normal humano, soluções de reserva (l,QyíiM) dos inibidores que se pretendiam ensaiar em 25 de tampao HEPES , pH 7,5, contendo cloreto de sódio 0,10 M. Fez-se a preparação des misturas a 0°C e re tiraram-se depois aliquotas (0,200 ml) que incubaram durante

107

minutos £ temperatura de 37°C. Adicionou-se um volume igual de reagente APTT activado e fez-se a medição dos tempos de coagulação conforme descrito nos exemplos 111 a 117. A concentração final de inibidor durante os ensaies de coagulação foi de 250 nM. Na tabela 7 apresentam-se os tempos de incubação (indi cados em horas) e o tempo de coagulação (medido em segundos) pa ra os inibidores individuais. Os valores para os compostos Ξ e F foram determinados simultaneamente com os elementos de contro lo. Os valores para os compostos A, B e C foram obtidos num dia diferente.

Tabela 7

Estabilidade dos Inibidores em Plasma Humano

Número do Exemplo

Controlo	128	129	130	131	132
F	E	A	B	c
Incuba-
ção tempo
(h)			Tempo	de Coa	gulação	(seg)
0	*tl,5	76,3	637	817	•t r* r·. Ipíí ,<£·	2037
n J J2	42,7	76,4	73,^	84,7	157,7	2077
1	*+2,7	76,7	ó6,2	79,7	163,7	214,2
a	42,7	79,6	67,7	86,7	152,8	203,7
.3	44,8	77,8	61,7
4	447	81,8	58,2	93,2	157,7	209,7
P ✓	*»5,7	80,8	61,3
6	^5,2	79,3	57,3
24	357	737	6*t,7	927	109,3	2U3,7
48	477	49,3	58,7

Exem·

108

Exemplos 133 - 1j6

Estabilidade dos inibidores em tampão

Fez-se a incubação dos inibidores, cada um ra concentração de 1,0yuE, r temperatura ambiente em tampão de fosfato de sódio 0,20 E, pH 7,5, contendo cloreto de sódio 0,20 E e 0,10 f de PEG . Retiraram-se aliquotss (4,0yUl) que se testa, ram de acordo com o teste de trombina conforme descrito nos nos exemplos de 72 a 110. Na tabela 8 indica-se a percentagem de actividade de trombina remanescente após a incubação e o tem po de permanência dos inibidores em tampão de fosfato de sódio. Com os inibidores A e C há pequena perda de actividade de inibidor . 0 inbidor B perde a sua actividade biológica decorri do um período de uma hora.

Tabela 8

Estabilidade dos Inibidores em Tampão

Actividade percentual de Trombina

Exemplo N2	Composto	0 h	6,5 b	24 h
133	A jii	o ,3	1,6	0,8
13h	c			0,9
135	c	65		77
		0 h	0,5 h	1 h
136	B	2,0	15	100
Exemplos 137	- 142
Inibição de coagulação	do sangue	após dose	oral in vivo

Anestesiaram-se ratos machos (ratos CB Sprag^e Bawley,

109

130-140 g, fornecidos por Charles Siver Labs, Inc., Wilmington, MA) con pentobarbital sódico (150 mg/Kg, i.p.). Fez-se uma in cisão na linha média da superfície ve.ntral do pescoço, e inseriu-se um cateter de polietileno numa das artérias carétidas e ajustou-se à parte anterior do pescoço. Depois de recuperados da anestesia, extrairam-se amostras de sangue através do cateter da artéria carétida para controlo, com anticoagulante de citrato de sédio e centrifugou-se (2000 x g, 10 minutos). Transferiu-se o plasma para tubos de plástico e conservados em refrigeração até ao momento do ensaio. Fez-se a medição dos tempos de trombina utilizando um fibrómetro, conforme descrito nos exemplos de 125 a 127.

Administrou-se aos ratos quer o inibidor de protease Ac-(P)Phe-Pro-boroArg-QH num veiculo, quer o veículo isolado, por via oral em um volume inferior a 4 ml. 0 veículo utilizado foi dimetilsulféxido a 5 X em solução de cloreto de sódio. Extrairam-se amostras de sangue decorridos diversos intervalos de tempo após a dose oral e fez-se o ensaio conforme anteriormente descrito. Na tabela 9 seguinte apresentam-se os resulta dos, em que os tempos de coagulação estão indicados em segundos. No caso em que o tempo de coagulação exceda 300 segundos, está indicado y 300. Os dados restantes indicam o tempo médio necessário para a coagulação medido em segundos, + o desvio pad rão.

F*P r* _

J. Cl*

110

Tabels 9

Inibição de Coagulação do Sangue Após Dosagem Oral In Vivo

Ex. Tempo ContrÔlo Concentração de Inibidor (h)1 mg_2 mg_10 mg

137	.5	63	+	13	> 300	> 300	> 300
136	1	52	+	26	? 300	ND*	χ 300
139	2	55	+	11	> 300	ND*	> 300
140	3	3^	+	12	> 300	ND*	> 300
141	4	41			47+4	54 + 29	ND+
142	6	50			46 + 3	44 + 4	ND
*

* ND = não determinado

Exemplo 143

Inibição in vivo de coagulação do sangue após administração oral

Para se demonstrar melhor a capacidade deste composto para inibir a coagulação de sangue in vivo, anestesiaram-se ra tos com pentobarbital sódico (50 mg/kg, i.p.), inseriu-se um cateter na veia jugular, fechou-se a incisão. Depois de recuperar da anestesia, os ratos foram tratados oralmente com 5 mg Ag de inibidor de protease Ac-(L)Phe-Pro-boroArg-0H dissol vido em água ou com igual volume de água. Trinta a sessenta minutos mais tarde todos os ratos receberam uma perfusão de trombina na proporção de 500 unidades/kg durante um periodo de 1 mi nuto. Os 14 ratos administrados com ãgua, morreram decorridos 10 minutos após a perfusão da trombina. Em contraste, decorri111

doe 10 minutos apenas morreram 8 dos 17 ratos tratados com agua contendo o inibidor e os restantes sobreviveram durante 1 hora, tendo sido sacrificados decorrido esse tempo.

Exemplos 144 - 162

Inibição in vivo de coagulação do sangue após administração oral, pelo coldnica e rectal.

Procedimento Geral:

Anestesiaram-se ratos machos Lewis pesando entre 300-350 g, com pentobarbital sodico (50 mg/kg, i.p.) e aplicou-se um cateter na veia jugular, utilizando um tubo maleável ligado a um tubo de polietileno, calibre 50. Ajustou-se 0 tubo è parte dorsal e ligou-se a uma seringa através de uma torneira. Fez-se a extracçao de amostra de sangue (0,5 ml) antes da administração e no fim de diversos intervalos de tempo apos a administração com 0 ir.ibidor de protease Ac-(D)Phe-Pro~boroArg-0H, com uma seringa citratada com tampão de citrato antes de cada recolha. As amostras de sangue foram depois transferidas para recipientes contendo tampão de citrato. Do mesmo modo, após cada recolha limpou-se a canula com uma solução de cloreto de sódio. As amostras de sangue foram imediatamente centrífuga das (2500 rpm durante 15 minutos) e utilizou-se 0,2 ml de amostra de plasma para as medições do tempo de coagulação. As medi ções de tempo de coagulação foram efectuadas do modo s seguir descrito utilizando-se um fibrdmetro. Primeiro colocou-se pias ma (0,2 ml) numa tina e adicionou-se tampão Tris, pH 7,4 (50 mi crolitros). Durante 1 minuto incubou-se a 37°C a solução de plasma/tampão, adicionou-se 50 microlitros de uma solução de

112

trombina 24 yu/ml em tampão Tris e fez-se a medição do tempo de coagulação em segundos. Nos casos em que o tempo de coagulação excedeu 300 segundos, está como 300,

Administração Oral:

Esperou-se que os ratos, com veia jugular anteriormente adaptada com uma canula, recuperassem da anestesia antes de se administrar a dose oral. Administrou-se por via oral forçada, a solução aquosa de inibidor de protease Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-0H, constituída por 3 mg de inibidor por kg de peso de ratos (aproximadamente 1 mg por rato) num volume de 0,75 ml de ãgua de peso de rato. Os resultados apresentam-se na Tabela 10 seguinte.

Administração por via Coltíhica:

Fez-se uma incisão de 3 cm no abdómen do rato a cuja veia jugular fora adaptada uma cânula, enquanto se encontravam ainda sob anestesia. Localizou-se o cólon e apertou-se em ambas as extremidades. Pela extremidade inicial injectou-se na cavidade do cólon uma solução aquosa de inibidor de protease Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-0H, constituída por 3 mg de inibidor por kg de peso de rato (aproximadamente 1 mg/rato) num volume de 1 ml de água por kg de peso de rato. Fechou-se a incisão utilizando grampos para ferimentos. Os resultados estão indicados na Tabela 11 seguinte.

Administração Rectal procedimento para a administração rectal no rato a, cuja veia jugular fora adaptada uma canula, foi descrito por

U3

Kamiya et al., J, Pharm, Sei., 71: 621 (I982). Res timidamente, prepara-se um dispositivo constituído por membranas de borracha de silício de 0,89 cm e de 0,71 cm ligadas por um fio de cm de comprimento. Insere-se este dispositivo no recto do ra to introduzindo-se primeiro a membrana grande, e cola-se ao ánus utilizando uma cola adequada. Efectua-se a administração por injecção através da membrana exposta. A dose rectal foi de mg de inibidor de protease Ac-(r)Phe-Pro-boroArg-OH por kg de peso do rato (aproximadamente 1 mg/rato) num volume de 0,6 ml de água por kg de rato. Os resultados estão indicados na Tabela 12 seguinte.

Tabela 10

Inibição in vivo de

Sx.	Coagulação do sangue após administração oral
Tempo (h)	Controlo*	Inibidor
144	0,00	49,7	57,3
145	o,25	67,4	> 300
146	0,50	51,8	} 300
14?	1,00	43,6	> 300
148	2,00	42,5	> 300
149	3,00	58,4	300
150	4,00	42,7	> 300
* Os	dados representam a	média para	2 ratazanas
** os	dados representam, a	média para	3 ratazanas

Ta114

Tabela 11

Inibição in vivo de

Ex. 151	Coagulação do Sangue Após Administração pelo v
Tempo (h) 0,0	Contrõlo* 59,9	Inibidor' 59,4
152	o,5	42,7	> 300
153	1,0	42,7	> 300
154	e. ,0	52,1	> 300
155	M	54,2	7 300
156	5,0	57,9	7 300
*	os dados representam a	média para 2	ratazanas
**	os dados representam a	, média pera 3	ratazanas
		Tabela 12
	Inibi	ção in vivo 1	de
	Coagulação -do Sangue	Apos Administração rectal
M1 T	Tempo (h)	Controlo*	J Inibidor
		. 41 « IU· JWMIN-MM	—.....
157	0	53,9	66,4
158	0,25	52,3	> 300
159	0,5	43,1	γ 300
160	1,0	52,7	> 300
161	2,0	42,5	> 300
162	4,0	75,6	>300
X	dados obtidos a partir	de 1 ratazana
XX	os dados representam a	média para 3	ratazanas

Sxemilã

Exemplos I63 - 168

Inibição In vivo de inflamação induzida por óleo de cróton

Fez-se a preparação de 2 soluções, a primeira constituída por 5 / de óleo de cróton, um conhecido agente inflamatório, em veículo de acetona (solução de cróton) e a segunda constituída por 5 % de óleo de cróton em veículo de acetona à quel se adicionou 10 mg/yul de um composto da presente invenção (solução do composto). Aplicou-se à orelha direita de ca, da animal (ratos) Sprague Dawley 130-140 g, fornecidos por Charles River Labs, Inc., Wilmington, MA), a solução de cróton (lOyíil), ou, em alternativa, a solução do composto (10/Ul). Aplicou-se à orelha esquerda de cada animal apenas o veículo de acetona (solução de acetona) (lOyul). Os animais foram sa crificados e uma hora após o tratamento, faz-se a remoção das suas orelhas, cortaram-se discos com um quarto de polegada de diâmetro (0,ó cm) e efectuou-se a sua pesagem. Mediu-se a intumescência pela diferença em peso entre a orelha direita tra tada com sólução de cróton e a orelha esquerda tratada com so lução de acetona. Faz-se a comparação dos resultados com os obtidos com indometacina, um conhecido anti-inflamatório não esteróide (solução de indometacina), que se preparou e aplicou por um processo essencialmente idêntico ao de. solução do composto. Os dados médios estão indicados na Tabela 13 para 0 composto F , Ac-Fhe-boroArg-C^QHq^. 0 termo dose” utilizado a seguir indica a quantidade de ingrediente activo anti-inflamatório em microgramas (composto A, C, L, Ξ, F ou G, ou indome tacina, conforme for o caso) na solução aplicada a cada orelha direita, e n” indica o número de ratos utilizados em cada ensaio. DP” significa desvio padrão. Os exemplos de 164 a l6cí na Tabela 14, demonstram a actividade anti-inflamatória par? os compostos A, C, D, Ξ, F e 0 que foram experimentados essencialmente nas mesmas condições (dose = lOOyúg).

Tabela 13 > . :—

Inibição de Inflamação Induzida por oleo de cróton

Exemplo 163

Dose	Medi?	Média	Média
Orelha	Orelha	Orelha	Intumeí		Inibição
Direita	Direita	Esquerda	cencia		Percentual
.Solução (ug/orelha	Wt, (mg)	Wt. (mg)	(mg X SS)		n
Cróton 0	27,4	16,3	11,1 χ	1,5	0	tí
Indornet. 100	20,6	15,6	5,0 ±	2,8	55	8
Composto F 100	18,9	16,6	2,3 ±	0,7	79	8
		Tabela. 14

Inibição de Inflamação Induzida por tíleo de Cróton

Exemplo NQ	Composto	Inibição Percentual
164	G	69
165		82
166	D	93
167	A	59
168	C	76

Claims (20)

1. Reivindicaçóes

   -1171,- Processo para a preparação de compostos de fórmula geral ' ^B2 ^Y2 na qual Y^ _e representam, cada um, um grupo hidroxi,

   Rg representa um grupo alquilo substituído escolhido entre grupos de fórmula geral -(CHg)_z-X, -CH(Hg)-(CHg)g-X, —CHg-CH(CHg)-CHg-X, -(CHg)g-CH(CH₃)-X, e

   -(CHg)₂-CH(CH₃)g-X, em que X representa um grupo -NHg,

   -NH-C(NH)-NHg ou -S-C(NH)-NHg, e Z representa um número de

   -118

   3 a 5;

   η, ο, ρ e q representam, independentemente, ou o número 1 ou 0;

   A.j, β Α^, independentemente, representam aminoácidos de configuração L ou D seleccionados do grupo que consiste em Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ile,

   Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Vai; e representa um pêptido que compreende 1 a 20 aminoácidos aproximadamente, um grupo acilo ou um grupo sulfonilo com 1 a 20 átomos de carbono aproximadamente, um átomo de hidrogénio, ou um grupo protector N-terminal;

   e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico, caracterizado pelo facto:

   A(i) de se dissolver um composto de fórmula geral /' ^R2 ^Y2 na qual e Y₂, considerados em conjunto, formam um radical derivado de um composto di-hidroxi que comporta pelo menos dois grupos hidroxi separados por pelo menos dois átomos de ligação numa cadeia ou anel, compreendendo a referida cadeia ou anel um a vinte átomos de carbono e, opcionalmente, um heteroãtomo que pode ser um átomo de azoto, enxofre ou oxigénio;

   e os outros símbolos têm os significados definidos antes,

   -119no seio de um ãcido orgânico e de se submeter a uma cromatografia de permuta iónica mediante aplicação de um gradiente de concentração de 0-0,3N de ãcido inorgânico em ácido orgânico, e (ii) de se separar mediante cromatografia de coluna ou HPLC para se obter um composto de fórmula geral I na qual Y₁₌Y₂=OH; ou

   B(i) de se fazer reagir o composto de fórmula geral indicada antes em A(i) com um excesso de BCl^ no seio de cloreto de metileno a uma temperatura compreendida entre -78° e 0°C;

   (ii) de se fazer contactar com ãgua para hidrolisar qualquer excesso de BCl^;

   (iii) de se diluir com uma quantidade suficiente de ãcido orgânico aquoso (1 a 50%) para se obter uma concentração de HCl compreendida entre 0,01 e 0,05M?

   (iv) de se separar na fase aquosa, que é então (v) submetida a uma cromatografia de coluna de permuta iónica, para se obter um composto de fórmula geral I na qual Y^=Y₂=OH.
2. 2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se fazer reagir ainda um composto de fórmula geral I, na qual Y₁ e Y₂ representam, cada um, um grupo hidroxi, com um excesso de ácido fluorídrico aquoso para se obter o difluoroborano.

   120-
3. 3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de os símbolos Y₁ e Y₂, considerados em conjunto, formarem um éster borónico de pinanodiol, pinacol ou butano-diol.
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de Y^ e Y₂, considerados em conjunto, formarem um éster borónico de (+)-alfa-pinanodiol.
5. 5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-4, caracterizado pelo facto de o símbolo representar um aminoácido com a configuração L ou D escolhido no grupo que consiste em Lys,' Phe, Pro, Ala, Leu, Gly, Glu, Val, Thr, Ile,

   Met, Tyr, Trp, Arg, Asp, Asn e Gin.
6. 6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de o símbolo A^ representar um aminoácido com a configuração L ou D escolhido no grupo que consiste em Lys, Phe, Pro, Ala, Leu, Gly, Glu, Val e Thr.
7. 7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de o símbolo A^ representar um aminoácido com a configuração D.
8. 8. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de o símbolo A^ representar

   -121Phe.
9. 9. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de o símbolo A₂ representar um aminoácido com a configuração D ou L escolhido no grupo que consiste em Phe, Ala, Leu, Pro, Glu e Gly.
10. 10. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de o símbolo R₂ representar um grupo alquilo substituído escolhido no grupo que consiste em — (CH_)-X.

    2 z
11. 11. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o símbolo Z representar um número de 3 a 4.

    I
12. 12. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o símbolo R₂ representar um radical escolhido entre 3-guanidino-propilo, 3-amino-propilo e 4-amino-butilo.
13. 13. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o símbolo R₂ representar 3-guanidino-propilo.
14. 14. - Processo de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 4, caracterizado pelo facto de se obter o composto Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH, a partir dos compostos iniciais correspondentemente

    -122substituídos.
15. 15. - Processo para a preparação de uma composição apropriada para inibir uma serina protease semelhante à tripsina em um mamífero, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de um composto preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1, 5 e 14, como ingrediente activo, com um diluente ou veículo fisiologicamente aceitável.
16. 16. - Processo para a preparação de uma composição apropriada para inibir a trombina em um mamífero, caracterizado pelo facto de se misturar uma' quantidade eficaz de um composto preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1, 5 e 14, como ingrediente activo, com um diluente ou veículo fisiologicamente aceitável.
17. 17. - Processo para a preparação de uma composição apropriada para inibir calicreína do plasma em um mamífero, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de um composto preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1 ou 5, como ingrediente activo, com um diluente ou veículo fisiologicamente aceitável.
18. 18. - Processo para a preparação de uma composição apropriada para inibir a plasmina em um mamífero, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de um composto preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1 ou 5, como ingrediente activo, com um diluente ou veículo fisiologicamente aceitável.
19. 19.- Processo para a preparação de uma composição apropriada para tratar a coagulação do sangue em um mamífero, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de um composto preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1,

    5 ou 14, como ingrediente activo, com um diluente ou veículo fisiologicamente aceitável.
20. 20.- Processo para a preparação de uma composição apropriada para tratar a inflamação em um mamífero, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de um composto preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1 ou 5, como ingrediente activo, com um diluente ou veículo fisiologicamente aceitável,