HU205141B - Process for producing peptide boronic acid derivatives inhibiting trypsin-like protease, as well as pharmaceutical compositions comprising such compounds as active ingredient - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás C-terminálison lizin, omitin, illetve arginin, homoarginin, vagy ezeknek megfelelő izotiouróniumsók a-amino-boronsav-származé kait tartalmazó peptidek előállítására, amelyek tripszin-szerű szerin-proteázokat — például trombint, plazma-kallikreint és plazmint — gátló hatással rendelkeznek, továbbá eljárás a hatóanyagként e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.

Számos biológiai rendszer aktivitását olyan hidrolitikus vagy proteolitikus enzimek mediálják, amelyek a prekurzor proteineket egy meghatározott helyen hasítják el. Ezeknek az enzimeknek négy osztálya ismert, mégpedig metallo-, tiol-, sav- és szerin-proteázok. A vér-koagulálást, fibrinolízist, komplement-rendszert és kallikrein-kinin-rendszert a szerin-proteázok egy alosztálya, a tripszin-szerű proteázok szabályozzák, ez az enzimcsoport az arginil- vagy lizil-maradékokra specifikus elsődlegesen. .

Az egyes osztályokon belül az enzimek hatásmódja és aktív hely maradékai, valamint az osztály-specifikus inhibitorokkal szembeni érzékenységük hasonló. Egy vegyületnek egy meghatározott proteázra, vagy a proteázok egy meghatározott alosztályára kifejtett gátló hatása azonban nagymértékben függ az adott vegyület szerkezetétől és összetételétől.

A proteázok gátlása területén kiterjedt kutatómunka folyik, és az ezen a területen dolgozó kutatók közül sokan vizsgáltak bór-tartalmú inhibitorokat.

Shenvi (4 537 773 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, 1985) például beszámol arról, hogy alifás és aromás oldalláncokat tartalmazó aminosavak α-amino-boronsav-analógjai gátolják a metalloenzimeket. Shenvi és munkatársai azt is leírták (4 499 082 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, 1985), hogy a peptidekbe beépített aamino-boronsavak azokat a szerin-proteázokat gátolják, amelyek elsődleges specifícitási feltétele a semleges oldallánc, ilyenek például a pankreász- és leukocita-elasztáz, a kimotripszin és a katepszin G. Az utóbbi szabadalmi leírásban C-terminálison α-amino-boron sav-maradékot tartalmazó tetrapeptideket ismertetnek, az ilyen proteolitikus enzimek erőteljes, reverzibilis inhibitoraiként. A fenti peptidek azonban nem tartalmazzák C-terminálisukon a lizin, omitin, arginin, homoarginin vagy a megfelelő izotiouróniumsók a-amino-boronsav-származékait.

Kaehler és munkatársai leírták, hogy a 2-feniletán-boronsav a kűnotripszint gátolja [Biochemistry 10, 2477 (1971)J. Matteson és munkatársai ismertették az (R)-l-acetamido-2-fenil-etán-boronsav szintézisét, és kimotripszin-inhibitorként való alkalmazását [J. Am. Chem. Soc. 103,5241 (1981)]. A szerzők szerint a Kj pmól/l.

Lienhard feltételezte, hogy az a-amino-boronsavak a szerin- és tiol-proteázok erőteljes inhibitorai [Enzyme Inhibitors as Drugs, szerk: Sandler, University ParkPress, Baltimore, 43-51. oldal (1980)].

Megemlíthetjük még Kinder és munkatársai munkáját, akik ismertették az N-acil- és dipeptid-boronsavakat, és a fenilalanin, fenilglicin, alanin, valin és izoleucin difluor-borán-analógjait [J. Med. Chem. 28, 1917-1925 (1985)]; valamint Matteson munkáját, aki leírta az α-amido-szubsztituált boronsav-észterek szintézisét [Organometallics, 3, 1284-1288 (1984)].

Az utóbbi irodalmi helyen megemlítették, hogy ezeket a vegyületeket az arginin és prolin boronsav-analógjainak lehetséges prekurzoraiként állították elő.

A tripszin-szerű proteázok számos' fiziológiás folyamat szabályozásában rendkívül jelentős szerepet töltenek be. A fenti aktivitást például a „Proteases and Biological Control” (Reich, Rifkin és Shaw szerk.,

Cold Spring Harbor Press 1975) c. könyvben foglalták össze. A tripszin-szerű proteázok egyike, a trombin a vér alvadásában játszik világos és meghatározó szerepet. A vér koagulációja a zimogén aktiválás két kaszkádjának egyikén keresztül megy végbe. Ezektíen a fo- , lyamatokban minden esetben a trombin az utolsó pro- * teáz, amely úgy hat, hogy a fibrinogént fibrinné hidrolizálja, ami viszont aggregálódva vérrögöt képez. A trombin által katalizált hidrolízis létfontosságú a véralvadási folyamatban.

A plazma kallikrein — egy másik tripszin-szerű proteáz — szintén szerepet játszik a véralvadási folyamatban, mégpedig a véralvadás egyik útjának iniciálásával. A kallikrein a kininogénre is háti hogy felszabadítsa a bradikinin nonapeptideL A bradikinin egy vérnyomáscsökkentő hatású peptid, amely kapcsolatban van a fájdalommal. Ezenkívül a kallikrein feltehetően egyéb biológiai funkciókkal is rendelkezik. Újabb vizsgálatokból következtetni lehet arra, hogy a kallikreinnek szerepe van a gyulladásban is. Baumgarten és munkatársai például kimutatták, hogy allergénnek kitett allergiás egyedekben a kinin és kallikrein szintje növekedik [J. Immun. 137, 977-892 (1986)]. Wachtfogel és munkatársai ismertették, hogy a plazma kallikrein aggregálja a humán neutrofileket és szabaddá teszi a neutrofil elasztázt [Blood 67, 1731-1737 (1986)]. Az elasztáz felszabadulása és az ezzel járó elasztáz-mediálta szövet-roncsolódás a gyulladási folyamattal kapcsolatos események.

Tripszin-szerű enzimek specifikus inhibitorainak tervezése a biológiai folyamatok szabályozása céljából nem új ötlet. Különösen nagy súlyt fektettek a trombin inhibitorai előállítására, hogy a trombózis kezelésében a heparint helyettesítem tudják egy olyan vegyü- $ lettel, amely nem váltja ki a heparin-terápiában észlelt mellékhatásokat [Markwardt TIPS 153-157 (1980), és Green és munkatársai Throm. Rés. 37, 145-153 s (1985)]. Számos tripszin-szerű proteázra ható, nagyhatású peptid-klór-metil-keton-származékot is előállítottak [Kettner és munkatársai: Methods in EnzymoIogiSO, 826-842 (1981)]. Ezek egyike, a H-(D)PhePro-Arg-CH₂C1 erősen gátolja a trombint (Kj= 37 mmól/l), és hatásos a szívkoszorúér-trombózis megelőzésében, nyúllal végzett kísérletben. Hasonlóképpen, Bajusz és munkatársai [Int. J. Peptid Protein Rés.

, 217-221 (1979)] ismertették a H-(D)Phe-ProArg-H peptid-aldehidet, mint a trombin egy hatásos inhibitorát (K= 75 nmól/1), és Tremoli és munkatársai

HU 205 141 Β [Thromb. Rés. 23, 549-553 (1981)] leírták, hogy egy hasonló vegyület, a Boc-(D)Phe-Pro-Arg-H csökkenti a vénás trombózis méretét patkányban.

Szekunder aminokból álló szubsztituált argininamidokról is kimutatták, hogy trombin-gátló aktivitással rendelkeznek. Kikumoto és munkatársai leírták, hogy (2R,4R)-4-metil-l-[N²-[(3-metil-l,2,3,4tetrahidro-8-kinolil)-szulfonil]-L-arginil}-2-piperid inkarbonsav gátolja a trombint Kj= 19 nmól/ [Biochemistry 25, 85-90 (1984)]. Green és munkatársai kimutatták, hogy ez az inhibitor növeli a plazma protrombin-időket in vitro véralvadási vizsgálatokban, mégpedig 1 gmól/l koncentráció esetén kétszeresére [Thromb. Rés. 37,145-153 (1985)], és ezt a vegyületet szöveti plazminogénaktivátorral kombinációban alkalmazva fibrinolízist fokozó szerek hatóanyagaként igényelték a 0 181267 számú európai szabadalmi leírásban (Yoshikuni és munkatársai, 1986). Végül, Struzebecher és munkatársai [Thromb. Rés. 29,635642 (1983)] és Kaiser és munkatársai [Thromb. Rés. 43,613-62Ö (1986)] leírták, hogy az N-a-(2-naftilszulfonil-glicil)-4-amidino-fenil-alanin-piperidin a trombin leghatásosabb ismert inhibitora (K= 6 nmól/l), és az in vivő hatást is bizonyították egérben és patkányban.

A fentiek ellenére, a trombin és az egyéb tripszinszerű enzimek inhibitorainak új és hatásosabb csoportjára van szükség ahhoz, hogy a véralvadási rendellenességek, gyulladás és egyéb betegségek gyógyítására alkalmas hatásos és értékes hatóanyagokat nyerjünk.

A találmány közelebbről az (I) általános képletű vegyületek — a képletben

Y¹ és Y² jelentése egymástól függetlenül hidroxilcsoport, fluoratom vagy együtt egy dihidroxi-vegyületböl származó csoportot jelentenek, amely legalább két hidroxilcsoportot tartalmaz, amelyeket egymástól legalább két, telített láncban vagy gyűrűben lévő, egymással kapcsolódó szénatom választ el, ahol a fenti lánc 2-4 szénatomos, a gyűrű pedig 8-12 szénatomot tartalmaz,

R² jelentése -(CH₂)_Z-X általános képletű szubsztituált alkilcsoport, ahol

X jelentése -NHj, -NHC(NH)-NH₂ vagy -SC(NH)NH₂ képletű csoport, és , z értéke 3-5, n, o, pés q értéke egymástól függetlenül 0 vagy 1,

A¹ és A² jelentése egymástól függetlenül D- vagy L-konfigurációjú alanin, oldalláncban lévő karboxilcsoportján adott esetben 1-6 szénatomos alkilcsoporttal védett aszparaginsav vagy glutaminsav, piroglutaminsav (csak A² esetén), glicin, izoleucin, leucin; oldalláncban lévő aminocsoportján adott esetben (1-6 szénatomos)alkoxi-karbonil-csoporttal védett lizin, feniialanin, prolin, oldalláncban lévő hidroxilcsoportján adott esetben 1-6 szénatomos alkilcsoporttal védett treonin (csak A¹ esetében), szerin (csak A¹ esetében) és valin közül választott aminosavból származó maradék,

A³ jelentése D- vagy L-konfigurációjú glicin, alanin, leucin, valin, izoleucin és feniialanin közül választott aminosavból származó maradék, és

R¹ jelentése hidrogénatom, (1-6 szénatomos)alkoxi-karbonil-csoport, 2-6 szénatomos alkanoilcsoport, benzoilcsoport, benzil-oxi-karbonil-csoport vagy leucil-, izoleucil- vagy valil-csoport—.

és győgyászatilag elfogadható sóik előállítására vonatkozik,

A találmány tárgya továbbá hatóanyagként'egy (I) általános képletű vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására szolgáló eljárás, amely készítmény tripszin-szerű szerin-proteázok — például trombin és plazma kallikrein — gátlására és kóros állapotok, például véralvadási rendellenességek, tripszin-szerű proteázok által médiáit gyulladások kezelésére használhatók.

A leírás ismerteti az © általános képletű vegyületek új köztitermékeinek két csoportját is.

Az egyik csoportot a (II) általános képletű új köztitermékek — a képletben

Y³ jelentése dihidroxi-vegyületből származó csoport, amely legalább két hidroxilcsoportot tartalmaz, amelyeket egymástól egy telített láncban vagy gyűrűben lévő, legalább két kapcsolódó szénatom választel, és a fenti gyűrű 8-12 szénatomot, míg a lánc 2-4 szénatomot tartalmaz,

R³ jelentése -(CH^-W¹ általános képletű szubsztituált alkilcsoport,

W és W¹ jelentése egymástól függetlenül klór- vagy bróm-atom, és z értéke 3-5 — alkotják.

Az új köztitermékek másik csoportját a ©I) általános képletű vegyületek — a képletben

A¹, A², A³, Y³, R¹, n, o, p és q jelentése a fent megadott,

R⁴ jelentése -(CH₂)_Z-W², általános képletű szubsztituált alkilcsoport,

W² jelentése klór- vagy brómatom, vagy azidocsoport, és z értéke 3-5 —képezik.

Az

1. ábra mutatja a relatív alvadási időket az inhibitor-koncentráció függvényében, két találmány szerinti eljárással előállított inhibitor, a H-(D)Phe-Pro-boroArg-Ci₀H₁₆ és a Boc-(D)Phe-Phe-boroArg-C ₁₀Hi₆ esetén. Az L ábra a 3. és 4. táblázat adatainak felhasználásával készült A relatív alvadási időt úgy kapjuk, hogy az inhibitor jelenlétében mért áktivált parciális tromboplasztin időket (APTT) vagy protrombin időket (PT) osztjuk az inhibitor nélkül mért APTT-vel, illetve PT-vel. Az inhibitor koncentrációt gmól/l-ben adjuk meg.

A találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületek az α-amino-boronsavak N-acil vagy peptid-származékai, amelyekben a C-terminális maradék lizinből, omitínből, és argininből, homoargininből, illetve a megfelelő izotiourónium-analőgokból áll. Ezekre a vegyületekre jellemző, hogy gátolják bi3

HU 205 141 Β zonyos tripszin-szerú proteolitikus enzimek, különösen a humán trombin, plazma kallikrein és plazmin aktivitását.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek terminális boronsav-része védőcsoport nélküli boronsavformában — amikor Y¹ és Y² jelentése azonban hidroxilcsoport —, vagy borán-difluorid formájában— amikor Y¹ ésY² jelentése azonosan fluoratom —, vagy ezek kombinációjában lehet. A terminális boronsav ezenkívül különféle védőcsoportokkal védett formában is lehet, amikoris Y¹ és Y² együtt képeznek egy maradékot (-Y^Y²-).

Megfelelő védőcsoport — amikor Y¹ és Y² együtt és egy -YLy²- csoportot képeznek — olyan vegyietekből, lényegében diótokból származó maradékokat jelent, amelyekben legalább két hidroxilcsoport van, amelyeket egy telített láncban vagy gyűrűben lévő, legalább két kapcsolódó szénatom választ el egymástól. A lánc egyenes vagy elágazó lánc egyaránt lehet. A lánc 2-4 szénatomot, míg a gyűrű 8-12 szénatomot tartalmazhat A fenti vegyületekre példaként a pinándiolt, pinakolt, perfluor-pinakott, etilénglikolt, dietilénglikolt, katecholt, 1,2-ciktohexán-diolt, 1,3-propán-diolt, 2,3-bután-diolt, 1,2-bután-diolt, 1,4-bután-diolt, glicerint, dietanol-amint és egyéb amino-alkohotokat, és az ezekhez hasonló vegyületeket említhetjük.

Az aminosav-maradékok és aminosavak jelölésére használt rövidítések jelentése az alábbi.

L-alanin

L-arginin

L-aszparaginsav

L-glutaminsav piroglutaminsav glicin

L-izoleucin. L-leucin

L-lizin

L-fenilalanin

Ala

Arg

Asp

Glu pyroGlu

Gly

He

Leu

Lys

Phe

Pro

Ser

Thr

Val

L-prolin

L-szerin

L-treonin

L-valin.

A fenti rövidítések D előtaggal alkalmazva a megfelelő D-konfígurációjú aminosavakat jelentik. A Dvagy L-előtaggal együtt alkalmazott fenti rövidítés azt jelenti, hogy az aminosav D- vagy L-konfígurációban lehet

A leírásban az R¹ jelentése megadott, N-terminális védőcsoport, 2-6 szénatomos alkanoilcsoport, például acetilcsoport, fenil-(l-4 szénatomos)-alkanoil-csoport, például benzoilcsoport, és (1-6 szénatomos)alkoxi-karbonil-csopart, például terc-butoxi-karbonilcsoport lehet

Az R¹ jelentésére megadott N-terminális védőcsoport előnyösen acetilcsoport [Ac, (a) képlet], terc-butoxi-karbonil-csoport [Boc, (b) képlet], benzoilcsoport [Bz, (c) képlet] vagy benzil-oxi-karbonil-csoport (Z) lehet

Azok az (Γ) általános képletű vegyületek, amelyek oldalláncban lévő aminocsoportokat tartalmaznak, így amelyekben A¹, A² vagy A³ jelentése Lys, adott esetben (1-6 szénatomos)alkoxi-karbonil-védőcso portot tartalmazhatnak az oldalláncban; hasonlóképpen a Glu és Thr savas illetve hidroxil-oldalláncai is tartalmazhatnak 1-6 szénatomos alkil-, mint például terc-butil-észter vagy -éter védőcsoportokat.

Mint már említettük, R² jelentése 3-5 szénatomos alkilcsoport, amely egy amino-, guanidino- vagy izotiourónium-csoporthoz kapcsolódik. R² jelentése (CH₂)_Z-X általános képletű csoport, előnyösen R² jelentése -(ΟΗ^-Χ általános képletű csoport, ahol z értéke3 vagy4. R² jelentése előnyösebben például 3-guanidino-propil-, 3-amino-propil- vagy 4-amino-butilcsoport lehet, legelőnyösebben 3-guanidino-propilcsoportot jelent.

A boro előtaggal jelölt aminosavak olyan aminosavakat jelentenek az (I) általános képletben, amelyekben a terminális karboxilcsoport (-COOH) helyén egy (e) általános képletű funkciós csoport van.

így a boroarginin vagy boroArg az arginin boronsav-analógját jelenti; a borolizm vagy boroLys a lián boronsav-analógját; aboroomitin vagy boroOm az ornitín boronsav-analógját jelenti. A homo előtag, például a homoboroargininben vagy homoboroArg-ben olyan boroarginin-analógot jelent, amelyben a szénlánc az argininhez képest egy metíléncsoporttal hoszszabb. Az Irg az arginin vagy homoarginin izotiourónium-analógját jelenti, amelyekben a guanidinocspport [-NH-C(NH)-NH₂] tiouróniumcsoparttal [-S-C(NH)NH₂] van helyettesítve, és a borolrg vagy borohomolrg a megfelelő boronsav-analóg rövidítése.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek nevében az -F utótagot használjuk, ha Y¹=Y²=F, azaz a difluor-boránok esetén; az -OH utótagot, ha Y¹=Y²=-OH, azaz a védetten boronsav esetén; a C,

es

C₁₀H₁₆ utótagot a pinándiol-észter esetén, amikor Y¹ és Y² együtt -C₁₀H₁₆O₂ csoportot képeznek.

A találmány szerinti eljárás az (I) álalános képletű vegyületek gyógyászatiiag elfogadható sói előállítására is vonatkozik. Ezek a sók savaddíciós sók, például benzolszulfonsawal (BSA); hidrogén-kloriddal (HC1), hidrogén-bromiddal (HBr), ecetsavval, trifluor-ecetsawal (TFA), borostyánkősawal, citromsawal vagy más, megfelelő savval képezett addíciós sók lehetnek. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek nevében ezeket a sókat a vegyület nevével egy köti össze.

A találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületeket az alábbi csoportokba sorolhatjuk, ahol a megnevezett aminosavak D- vagy Lkonfígurációban tehetnek.

Az első csoportba tartoznak azok a vegyületek, amelyek (I) általános képletében A¹ jelentése Ala, Pro, Gly, Val, Leu vagy Ile, azaz semleges oldalláncú aminosav.

A második csoportba tartoznak azok a vegyületek, amelyek (I) általános képletében A¹ jelentése Phe, azaz egy aromás oldalláncot tartalmazó aminosav.

A harmadik csoportba azok a vegyületek sorolhatók, amelyek (I) általános képletében.Á¹ jelentése Lys, azaz egy bázikus aminosav.

A negyedik csoportba azok a vegyületek tartoznak, amelyek (I) általános képletében A¹ jelentése Ser vagy Thr, azaz hidroxil-oldalláncot tartalmazó aminosav.

Az ötödik csoportba sorolhatjuk azokat a vegyületeket, amelyek. (I) általános képletében A¹ jelentése Asp vagy Glu, azaz savas oldalláncot tartalmazó aminosav.

A¹ előnyös jelentése például Lys, Phe, Pro, Alá, Leu, Gly, Glu, Val, Thr, Ile vagy Asp lehet. A szubsztituensek egyik előnyös csoportját képezik a Lys, Phe, Pro, Alá, Len, Gly, Glu, Val és Thr.

A fenti alapvető csoportok R² előnyös jelentésének megfelelően alcsoportokra oszthatók, és ezek az alcsoportok is tovább oszthatók A² és az N-terminális R¹ védőcsoport előnyös jelentéseinek megfelelően újabb csoportokra.

Á² jelentése előnyösen bármely fend aminosav lehet, amely D-konfigurációban van, legelőnyösebben (D)Phe,

A² további előnyös jelentése (D vagy L)Phe, (D vagy L)Ala, (D vagy L)Leu, (D vagy L)Pro, (D vagy L)Glu (D vagy L)Gly. A² jelentése alapján egy újabb csoportot azok a vegyületek alkothatnak, amelyek képletében A² jelentése (L)Glu vagy (D)Val.

Az 0) általános képletű vegyületekben előnyösen összesen 2-4 aminosav-szubsztituens van, beleértve a boro-aminosav-analógokat is. Egy három aminosav szubsztituenst tartalmazó vegyület amelyben A¹ jelentése Pro és a boro-aminosav-analóg boroArg, például egy 0-a) általános képletű vegyület, különösen jó trombin-inhibitor, IC₅₀ értéke sokkal kisebb, mint 5 nmól/1.

A fenti vegyületekkel egyenértékűek azok az 0) ált. képletű vegyületek, amelyek egy kevésbé gyakori, vagy módosított aminosavat, azaz piroglutaminsavat tartalmaznak.

Áz 0) általános képletű vegyületekre példaként név szerint az alábbi vegyületeket említjük.

Ac-0>JL)Phe-boroArg-C ₁₀H₁₆.BSA

Ac-Phe-boroOm-C ₁₀H₁₆.BSA .

• Ac-Phe-boroArg-C _1OH₁₆.HC1 , / H-(D)Phe-Pro-boroIrg-C ₁₀H₁₆ .HBr.HCI

Boc-(D)Phe-Pro-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr

Ác-Phe-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr

Ac-Ala-Lys(Boc)-boroOm-C loHia-BSA

Ac-Ala-Lys)Boc)-borolrg-C ₁₀H₁₆-HBr

Boc-(D)Phe-Pro-boroArg-C ₁₀H₁₆.BSA

Boc-(D)Phe-Phe-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr

H-(D)Phe-Pro-boroArg-C _1OH₁₆.HC1

Boc-0})Phe-Phe-boroOm-C ₁₀Hi₆.HC1

H-(D)Phe-Pro-boroArg-C _1OH₁₆.HC1

Boc-(D)Phe-Phe-boroOm-C ₁₀H₁₆.BSA

Boc-(D)Phe-Phe-boroArg-C ₁₀H₁₆ .BSA

Boc-(D)Phe-Phe-boroArg-C ₁₀H₁₆.BSA

Ac-Ala-Lys(Boc)-boroArg-C i₀H₁₆.BSA

Ac-0))Phe-Pro-boroArg-C ₁₀H₁₆.HCl·

141 B

Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH.HCl .

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroIrg-C l₀Hi₆.HBr

Boc-Leu-GlyLeu-Ala-boroOm-C iqH^.BSA

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg- C 10¾‘BSA

Bz-Pro-Phe-boroOm-C ₁₀H₁₆.BSA

Bz-Pro-Phe-boroArg-C ₁₀H₁₆.BSA

Boc-Ala-Phe-(DT)boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr

Bz-Glu(OBu)-Gly-boroIrg-C₁₀H₁₆,HBr

Bz-Glu-Gly-boroArg-C ₁₀H₁₆.BSA

Bz-Glu(OBu)-Gly-boroOrg-C _WH₁₆ .BSA.....

Bz-Glu(OBu)-Gly-boroArg-C₁₀H₁₆.BSA .

Bz-Pro-Phe-b.oroIrg-C ₁₀H₁₆-HBr

Böc*Ala-Phe-(D,L)borohomoIrg-C i₀H₁₆.HBr

Bz-Pro-Phe-BoroArg-OH.HCl

Bz-Pro-Phe-boroArg-F

H-(D)Phe-Pro-boroArg-C iqH₁₆.2HC1

H-(D)Phe-Phe-boroArg-C ₁₀H_tó.2HCl

Ac-Ala-Lys-boroArg-C ₁₀Hi₆,2HC1

H-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-C ₁₀ H₁₆ .HC1.BS A

Boc-Alá-Phe-(DJL)boroLys-C ₆H₁₂.HC1

H-Ala-Phe-(D0.)boroLys-C ₆H₁₂

Boc-(í))Val-Leu-boroLys-C ₆H₁₂ .HCI

Ac-Phe-boroLys-C ₆H₁₂ .HCI

Bz-Gu-Gly-boroArg-C ₁₀H₁₆.BSA

H-(D)Phe-Phe-boroIrg-C ₁₀ H₁₆.2HBr

H-Leu-Gly-Leu-Ala-boroIrg-C ₁₀H_lö.2HBr

H-Ala-Phe-0)JL)boroIrg-C ₆H₁₂.2HBr

Bz-Glu-Gly-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr • H-Ala-Phe-(DJL)boroHomoIrg-C ₆H₁₂.2HBr

Ac-Ala-Lys-boroIrg-C ₁₀H₁₆.2HBr

Bz-boroIrg-C₆H₁₂ .HBr

Bz-boroOm-C₆H₁₂.BSA ·

Bz-boroArg-C₆H₁₂.BSA

Ac-Leu-Thr(OBu)-boroOm-C ₁₀H₁₆.BSA

Ac-Leu-Thr(OBu)boroArg-C ₁₀H₁₆.BSA

Ac-Leu-Thr-boroArg-C _1QH₁₆.BSA

Ac-Lys(Boc)-Pro-boroOm-C 10¾ 'BSA

Ac-Lys(Boc)-Pro-boroArg-C i₀H₁₆.BSA

Ac-Lys-Pro-boroArg-C ioHi₆.BSA

Ac-Ala-Blu(OBu)-boroOm-C _1oH₁₆ .BS A

Ac-Ala-Glu(OBu)-boroArg-C ₁₀H₁₆ .BSA

Ac-Ala-Glu-boroArg-C ₁₀H₁₆.BSA

Boc-Val-Val-boroLys-C ₆H₁₂

H-Val-Val-boroLys-C ₆Hi₂.BSA.TA

Boc-(D)Phe-Phe-boroLys-C ₆H₁₂ .BS A

H-(D)Phe-Phe-boroLys-C ₆H₁₂ .BSA.TFA

Boc-Glu-Phe-boroLys-C ₆H₁₂.BSA

PyroGlu-Phe-boroLys-C ₆H₁₂.BSA

A találmány hatóanyagként egy 0) általános képletű vegyületet, vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására is vonatozik, amelyek a hatóanyag tripszin-szerű szerin-proteázokat — többek között trombita, plazma kallikreint és plazmint gátló hatása következtében különféle kóros állapotok, például véralvadási és gyulladással járó rendellenességek kezelésére alkalmazhatók.

A találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítmények az (I) általános képletű vegyület hatásos mennyiségét tartalmazzák, gyógyászatilag el5

HU 205141 Β fogadható hordozóanyagokkal vagy egyéb hígítóanyagokkal összekeverve. A gyógyászati készítmények hatóanyagként egy vagy több © általános képletű vegyületet tartalmazhatnak, adott esetben más hatóanyagokkal kombinálva. Az © általános képletű vegyületeket orálisan, parenterálisan, intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan, vastagbélen keresztül, rektálisan, nazálisán vagy intraperitoneálisan alkalmazhatjuk, különféle dőzisformákban. Az adott esetben célszerűen alkalmazott dózisforma, és az adagolás módja a kezelendő alany korától és testtömegétől, és az adott vegyülettől függően változik. Általában a kezelést alacsonyabb dózis-szintekkel indítjuk, és a dózist a kívánt hatás eléréséig növeljük.

A találmány szerinti eljárásban kritikus köztitermékként alkalmazott vegyületek két csoportra oszthatók, a (Π) és a ©I) általános képletű vegyületekre.

A (Π) általános képletű vegyületekben

Y³ jelentése dihídroxi.-vegyületből származó csoport, amely legalább két hidroxilcsoportot tartalmaz, amelyeket egymástól egy telített láncban vagy gyűrűben lévő, legalább két kapcsolódó szénatom választ el, és a fenti gyűrű 8-12 szénatomot, míg a lánc 2-4 szénatomot tartalmaz,

R³ jelentése -(CHj^-W¹ általános képletű szubsztituált alkilcsoport,

Wés W¹ jelentése egymástól függetlenül klór- vagy brómatom és z értéke 3-5.

Különösen előnyösek azok a vegyületek, amelyek (© általános képletében

R³ jelentése -(CBy_z-W^l, ahol z értéke 3 vagy 4.

A köztitermékek másik csoportját a ©Ί) általános képletű vegyületek alkotják, a képletben

A¹, A², A³, Y³, R¹, n, o, p és q jelentése a fenti,

R⁴ jelentése -(CH^^-W² általános képletű szubsztituált alkilcsoport,

W² jelentése klór- vagy brómatom, vagy azidocsoport, és z értéke 3-5.

A (HT) általános képletű vegyületek az analóg © általános képletű vegyületekkel azonos csoportokra oszthatók. Különösen előnyösek azok a vegyületek, amelyek ©I) általános képletében

R⁴ jelentése -(CH₂)_Z-W² és z értéke 3 vagy 4.

Az © általános képletű vegyűleteket az 1. reakcióvázlatban összefoglalt eljárásokkal állíthatjuk elő. A reakcióvázlatban szereplő számozott vegyületekre a megfelelő számokkal utalunk a leírásban. NMR jelentése proton-magmágneses rezonancia.

A találmány szerinti eljárással az © általános képletű vegyületek megfelelő tisztasággá, azaz 80-100% tisztaságú formában állíthatók elő.

A kiindulási vegyületek nagy tisztaságú formában kaphatók a kereskedelmi forgalomban, vagy szakemberek számára jól ismert, egyszerű eljárásokkal állíthatók elő. Az 1. reakcíóvázlatban ismertetjük azt az általános sorrendet, amellyel az © általános képletű vegyűleteket előállíthajuk. Az (1)-(4) vegyűleteket

Matteson és munkatársai [Organometallics 3, 1284— 1288 (1984)] eljárása szerint állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy az eljárást üzemi méretű előállításra alkalmassá tettük bizonyos módosításokkal.

Az (1) vegyületet egy alkén-halogenid pirokatechin-boránnal való hidrobórozásával állítjük elő. Areaktánsokat tetrahidrofuránban, vagy egyéb inért oldószerben melegítjük, és a terméket desztillálással izoláljuk. A halogénatommal szubsztituált alkil-boronsav-katechol-észtert átészterezzük oly módon, hogy tetrahidrofuránban megfelelő diollal (a-pinándíollal, pinakollal, 2,3-butándiollal, stb.) reagáltatjuk. A (+)-a-pinándiol előnyös Matteson és munkatársai [J. Am. Chem. Soc. 103, 5241 (1981)] azon megfigyelése szerint, hogy a molekulában lévő szférikus gátlás lehetővé teszi a -CHCI- csoport sztereospecifikus addícióját a (3) vegyület képződésekor, és az aminocsoport ezt követő bevitelét L-konfigurációban.

A (3)-(9) vegyiileteket a 1. reakcióvázlatban pinándiol védőcsoporttal mutatjuk be. Nagy léptékű előállítás során az észterezési reakció termékeként kapott pirokatechint hexánból való kristályosítással távolítjuk el, amely oldószerben a pirokatechin csak korlátozott mértékben oldódik. A (2) vegyületet ezután vagy szilikagélen, kromatográfiás eljárással, vagy desztillálással tisztitjük, vagy további tisztítás nélkül használjuk fel. A (2) vegyületet mint pinándiol-észtert közel analitikai tisztasággal kapjuk az oldószer eltávolítása után. További tisztítást szilikagélen, kromatográfiás eljárással érhetünk el. Ha a (2) vegyület pinakol-észter, a végső tisztítást előnyösen desztillálással végezzük.

A (3) vegyületeta (2) vegyületből állítjuk elő, homologizálással, CHC^'Li·*· reagenst használva. Ezt a reagenst úgy állítjuk elő, hogy metilén-kloridot n-butil-lítiummal kezelünk, tetrahidrofuránban, -100 ’C-on. A (2) vegyülethez-100 ’C-on 0,65 ekvivalens cink-kloridot adunk. Az elegyet lassan szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, és egy éjszakán keresztül keverjük. Az oldószer elpárologtatósa után (3) vegyületet kapunk maradékként, amelyet hexánban oldunk, majd a szerves fázist vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk és végül a hexánt elpárologtatjuk. A (3) vegyületet további tisztítás nélkül használjuk fel, ha pinándiol-észter formájában védtük, vagy desztillálással tisztítjuk, ha pinakol-észter formájában van védve.

A (4) vegyületet úgy állítjuk elő, hogy a (3) vegyületet, az α-fclór-szubsztituált boronsav-észtert [(CHgjjSi^N'Li'*· reagenssel kezeljük. A fenti reagenst úgy állítjuk elő, hogy hexametil-diszilazánt tetrahidrofuránban oldunk, és -78 ’C-on hozzáadunk egy ekvivalens n-butil-lítiumot Az elegyet szobahőmérsékletre hagyjuk melegendi, majd újra -78 ‘C-ra hűtjük, és hozzáadunk 1 ekvivalens (3) vegyületet tetrahidrofuránban. Az elegyet lassan szobahőmérsékletre hagyjuk melgedni, és egy éjszakán keresztül keverjük. Az a-bisz(trimetíl-szilán)-védett amint úgy izoláljuk, hogy az oldószert elpárologtatjuk és vízmentes körülmények között hexánt adunk a maradékhoz.

HU 205141 Β

Az oldhatatlan maradékot nitrogén-atmoszférában, szűréssel eltávolítva kapjuk a (4) vegyület hexános oldatát

Az (5) vegyületet úgy állítjuk elő, hogy a (4) vegyület hexános oldatát -78 ’C-ra hűtjük, és hozzáadunk 3 ekvivalens hidrogén-kloridot. Az oldatot lassan szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, és 1,5-2 órán keresztül keverjük. Az (5) vegyületet ezután szűréssel izoláljuk, és továbbtisztítjuk oly módon, hogy kloroformban oldjuk, és az oldhatatlan anyagot szűréssel eltávolítjuk. Az (5) vegyületet a kloroform elpárologtatása és a maradék etil-acetátból való átkristályosítása után fehér, kristályos anyag formájában kapjuk.

A fenti eljárás, azaz a (3) vegyület (5) vegyületté alakítása meglepő módon analitikailag tiszta (5) vegyületet eredményez, amelynek eredményeként a (6) vegyület mindazon nehézségek nélkül állítható elő, amivel egyébként egy heterogén anyag kapcsolása járna. A szakirodalom szerint a (4). vegyületet tisztítani kell, vagy ajánlatos tisztítani (5) vegyületté való alakítása előtt ahhoz, hogy tiszta anyagot kapjunk. Az egyetlen eljárást amellyel tiszta amino-boronsavak állíthatók elő, Shenvi ismertette a 4 537 773 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, és azt a 4 499 082 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban használták Shenvi és munkatársai. Az utóbbi szabadalmi leírás szerint a (4) vegyülettel analóg vegyületeket — amelyek annyiban térnek el, hogy aromás és alkil-oldalláncokat tartalmaznak — desztillálással tisztítják. A (4) vegyület á Shenvi és munkatársai által alkalmazott desztillálás körülményei között nem stabil, és szerkezete megváltozik.

A (6) vegyületet—azaz az (5) vegyület N-acil- vagy N-peptidil-származékát — két, egymástól különböző úton állíthatjuk elő.

Az egyik eljárás Metteson és munkatársai [Organometallics 3, 1284-1288 (1984)] eljárásának módosított változata, amelynek értelmében az in situ (oldószer elpárologtatósa és a sók szűréssél való eltávolítása nélkül) előállított (4) vegyületet egy ekvivalens ecetsavval és ecetsavanhidrid feleslegével kezelve N-acetil-NH-CH-[(CH₃)₃Br]BC^-pinándiolt kapunk. Ez az eljárás alkalmazható az N-acetil-fenilalanin igen reakcióképes savkloridjának (Ac-Phe-Cl) kapcsolására, azzal az eltéréssel, hogy az ecetsavval végzett előzetes kezelést elhagyjuk. Ha az Ac-Phe-Cl-t ecetsavval együtt adagoljuk, rendkívül alacsony hozamot kapunk, valószínűleg amiatt, hogy az Ac-Phe és az ecetsav vegyes anhidridet képez, és eztkövetően kémiailag kedvezőbb egy olyan kapcsolási reakció, amelynek eredményeként N-acetil-NH-CH[(CH₃)₃Br]BOj-pinakol keletkezik. Ha a (6) vegyületet vegyes anhidrid módszerrel állítjuk elő, a kívánt termék hozama igen alacsony, és a tisztítás nagy nehézségekkel jár. Ezért úgy tűnik, hogy ez az eljárás alkil-, aril-, és N-védett aminosavak (4) vegyülettel való kapcsolására alkalmas, savkloridos módszer alkalmazásával. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy a savkloridos kapcsolási eljárás követelményei miatt vannak bizonyos korlátozások. Először, az eljárás nem könnyen alkalmazható peptid kapcsolására, a mellékfeakciók — például oxazolinon-képződés—miatt, így a módszer csak egyszerű aminosav-maradékok esetén alkalmazható. Másodszor, savstabil védőcsoportot kell alkalmazrti a savklorid képződése-során felszabaduló sósav-felesleg miatt Végül, az eljárással jár az aminosav-maradék racemizációja.

A (6) vegyület előállításának másik módja az, hogy egy acilcsoportot vagy egy N-védett pepiidet megfelelő oldallánc-védéssel kapcsolunk az (5)’ vegyülethez. Ez az eljárás nyilvánvalóan előnyösebb az előzőnél, mivel megfelelően rugalmas, azaz lehetővé teszi bármilyen peptid szintézisét, természetesen azon korlátozások között, amelyekkel egy peptid szintézisénél általában számolni kell, ilyen például a korlátozott oldhatóság. A kapcsolásra alkalmas a savklorid, vagy az acilcsoport bármely más reakcióképes formája. A pepiidet tekintve a vegyes anhidrid eljárás előnyös [Anderson és munkatársai: J. Am. Chem. Soc. 89, 5012 (1967)]. A különböző hosszúságúi dipeptidtől tetrapeptidig terjedő, megfelelő oldallánc-védőcsoportokkal ellátott peptidek, vagy N-védett aminosavak vegyes anhidridjeit úgy állítjuk elő, hogy az adott pepiidet tetrahidrofiiránban oldjuk, és hozzáadunk egy ekvivalens N-metíl-morfolinL Az oldatot -20 ’Cra hűtjük, és hozzáadunk egy ekvivalens izöbutíl-klórformiátot. 5 perc múlva az így kapott elegyet és egy ekvivalens trietíl-amint (vagy más, sztérikusan gátolt bázist) adunk az (5) vegyület hideg kloroformmal, vagy tetrahidrofuránnal készült oldatához. A reakcióelegyet szokásos módon, 1 órán keresztül -20 ’C-on keverjük, majd 1-2 órán keresztül szobahőmérsékleten továbbkeverjük. Az oldhatatlan anyagot szűréssel eltávolítjuk, és az oldószert elpárologtatjuk. A maradékot etil-acetátban oldjuk. A szerves oldatot 0,20 n hidrogén-klorid-oldattal, 5%-os vizes nátrium-kloridoldattal mossuk. A szerves fázist ezután vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük, és bepáróljük. Maradékként legtöbb esetben részben szilárd anyagot kapunk. Számos esetben a kapott (6) vegyület további tisztítása nem szükséges. Abban az esetben, ha mégis tisztítani kívánjuk, a tisztítást szilikagélen, kromatográfiás eljárással, néhány esetben kristályosítással, és Sephadex™ LH-20-οη végzett gélszűréses kromatográfiás eljárással, eluensként metanolt használva végezhetjük. Az utóbb említett tisztítási eljárás előnyös. A (6) vegyület NMR-spektrumában jellegzetes a -CH₂-Br sávja 6 3,45-nél és egy erős szingulett sáv δ 0,80-0,95-nél a pinándiol-védőcsoport egyik metilcsoportjára, vagy szingulett δ 1,3-nál a pinakolcsoportra.

A (6) peptid-alkil-halogenidet ezután (7) alkil-aziddá alakítjuk, két ekvivalens nátrium-aziddal dimetilformamidban, 100 ’C-on 3 órán keresztül kezelve. Ez a reakció minden esetben könnyen lejátszódik anélkül, hogy a reakciókörülményeket változtam! kellene. A (7) vegyület NMR-spektruma CDCl₃-ban jellegzetesen mutatja a -CH₂-Br δ 0,1-0,2 ppm-es felfelé való eltolódását az aziddá váló átalakulás következtében. A (7) vegyület további tisztítását LH-20-οη kromatog7

HU 205141 Β ráfiásan végezhetjük, de számos peptid esetén erre nincs szükség.

A (8) boroornitin-peptideket a (7) alkil-azidok katalitikus hidrogénezésével állítjuk elő, 10% fémet tarvivalens benzolszulfonsav jelenlétében, alkoholban. A hidrogénezést Parr-készülékben végezzük. A hidrogénezést azonban atmoszférikus nyomáson is lejátszathatjuk, és benzolszulfonsav helyett ásványi savat is használhatunk. Megjegyezzük, hogy olyan peptid-védőcsoportokat kell használni, amelyek katalitikus hidrogénezéssel szemben stabilak. Az ilyen védőcsoportok szakemberek által jól ismertek, például a „The Peptides” (E, Gross és J. Meíenhofer szerk., 3. kötet, Academic Press, New York, 1981) c. könyvben találhatók, Előnyös védőcsoportok az aminocsoport védésére a terc-butoxi-karbonil-csoport, és a hidroxil és karboxil-oldalláncok védésére a terc-butíl-éterek és észterek. Védőcsoportként megfelelnek még például a diizopropil-metíl-oxi-karbonil-, terc-amil-oxi-karbonil-, adamantil-oxi-karbonil-, bifenil-izopropoxi-karbonil- és tozilcsoport. Az azidot természetesen már redukálőszerrel is aminná alakíthatjuk, a redukálószer például ón(H)-klorid vagy trialkil-foszfitok lehetnek [Maiti és munkatársai: Tetrahedron Lett, 27, 1423— 1424 (1986; és Koziara és munkatársai: Synthesis, 202-204 (1985)]. A fenti reagensek összeférhetők a katalitikus hidrogénezéssel szemben labilis védőcsoportokkal. A boroornitin-peptideket szokásosan Sephadex™ LH-20-οη kromatografálva tisztítjuk, és éterrel való eldörzsölés után fehér, amorf anyag formájában kapjuk.

A (9) boroarginin-peptideket úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő (8) boroomitin-peptidet legalább négyszeres feleslegben lévő ciánamiddal (50 mg/ml) reagáltatjuk, vízmentes etanolban, 100 ’C-on. A reaktánsokat kezdetben nitrogénatmoszférában reagáltatjuk 2-3 napon keresztül, vízzel hűtött hűtőt alkalmazva. A vízhűtést ezután megszűntetjük, és a reakcióelegyet hagyjuk lassan koncentrálódni, néhány napon keresztül. A reakció lejátszódását a boroarginin-maradék guanidinocsoportjára jellemző Sakaguchi-festéssel megfestett anyag intenzitásának növekedése, és a boroomitin-maradék aminocsoportjára jellemző pozitív ninhidrid-festődésű anyag eltűnése jelzi, fordított fázisú vékonyréteg-lemezen, metanol és víz 85:15 térfogatarányú elegyével futtatva. Jellegzetes módon a boroarginin-peptidek sávosan modzulnak gl a fglgsop= pentési ponttól, a boroomitin-peptiddt különálló foltot adnak a lemez közepén, és a ciánamid az oldószerfronttal együtt mozog, ezáltal minden komponens azonosítható. A guanidocsoportra és aminocsoportra jellemző festéseket a peptidkémiában szokásos módon végezzük. A (9) vegyületet gélszűréses kromatográfiás eljárással tisztítjuk, Sephadex™ LH-20 oszlopon, és eluensként metanolt használunk. Ezzel a kromatográfiás eljárással könnyen elválaszthatjuk a boroargininpeptideket a kismolekulás melléktermékektől és a ieagálatlan ciánamidtól, Legtöbb esetben nem szükséges további tisztítást alkalmazni. Azonban elengedhetet8 len, hogy a (8) vegyületet teljes egészében guanidinszármazékká alakítsuk, mivel a (8) és (9) vegyületek elegyét igen nehéz, vagy éppen lehetetlen szétválasztani. A végtermékeket amorf, fehér por formájában kapjuk éterrel való eldörzsölés után, és a legtöbb esetben ezek analítikailag tiszták, NMR- és tömegspektrumuk, valamint elégetéses analízisük szerint.

Megjegyezzük, hogy a (8) vegyület ciánamiddal való guanidilezése nagymértékben függ a reakciókörülményektől. Amint azt fent említettük, igen fontos, hogy a reakciót megfelelő ideig hagyjuk végbemenni, hogy a (8) vegyület lényegében teljes egészében (9) vegyületté alakulhasson, Hosszú reakcióidő — ami hét nap is lehet —, és a reaktánsoknak az oldószerek elpárolgásából adódó, kapcsolódó koncentrálódása gyakran szükséges ehhez. A (8) vegyület guanidilezésére alkalmas reakciók előzetes tanulmányozása során a (8) vegyületet hidrogén-klorid-sója formájában etanolban, néhány órán keresztül visszafolyató hűtő alatt forraltuk a ciánamiddal. Nem mutattunk ki (9) vegyületet, mint kívánt terméket Ha a (8) vegyületet úgy próbáltuk guanidilezni, hogy a fent említett, eredményes reakciókörülményeket alkalmaztuk, azzal az eltéréssel, hogy tetrahidrofurán helyett vízmentes etanolban dolgoztunk, szintén nem kaptunk kívánt terméket Hasonló módon, ha a (8) vegyületet az eredményes reakció körülményei között guanidilezzük, azzal az eltéréssel, hogy a reakció előtt a boroomitin aminocsoportjának benzolszulfonsavas sóját semlegesítjük, csak alig kimutatható mennyiségben keletkezik a kívánt (9) vegyület Az előnyös reakciókörülmények közé tartozik az is, hogy a (8) vegyület benzolszulfonsav vas, nem semlegesített sójával végezzük a reakciót A reakció a megfelelő hidrogén-klorid-sóval is végbemegy.

Az omitin-peptidek guanidilezésére szokásosan alkalmazott eljárás — amelynek eredményeként a megfelelő arginin-peptideket kapjuk — szerint az omitinpeptid aminocsoportját semlegesítjük és S-alkil- vagy O-alkil-tiokarbamiddal, vagy guanil-3,5-dimetil-pirazol-nitráttal kapcsoljuk, Bárány és munkatársai [”The Peptides”, E. Gross és J. Meíenhofer szerk., 2. kötet 169-175. oldal, Academic Press, New York, 1980] eljárása szerint. Az amurok guanidilezését Bannard és munkatársai [Can. J. Chem. 36, 1541-1549 (1958)] foglalták össze, és azt találták, hogy a guanil-3,5-dimetil-pitazol előnyösebben használható, mint az Smetil-izqkarbgmid, és óbból azt a kövefezfétést vonták b, hogy a guanidilezés ciánamiddal nem bhetsó» ges, noha azt az irodalomban korábban leírták,

S-metil-izokarbamid-hidrogén-jodiddal etanolban, és guanil-3,5-dimetil-pxrazollal különböző reakciókörülmények között nem sikerült guanidilezni a boroomitin-peptidet A reakciókészség hiánya ebben az esetben valószínűleg egy belső Lewis-sav-báziskomplex kialakulásának tulajdonítható, az omitin-oldallánc amxnocsoportja és a boronsav-észter között A (9) vegyület előállítása a (6) vegyület guanidinnel való kezelésével, etanolban, szintén eredménytelen volt A (6) vegyület és guanidin reagáltatása után a reakcióe1

HU 205141 Β légyből kb, 50%-os tisztaságú (9) vegyületet tudtunk izolálni, 1%-nál kisebb hozammal.

A boroarginin-pinándiol guanidinocsoportja — ha már beépült a molekulába — a természetes aminosavak közé tartozó arginin guanidinocsoportjához hasonlóan viselkedik. Például az a-amino-csoportokat szelektíven acilezhetjük egy anhidriddel anélkül, hogy a boroarginin guanidinocsoportja reakcióba lépne. így feltételeztük, hogy a (9) vegyület előállítható a H-boroarginin-pinándiol szintézisével, és a vegyület peptid-része N-védett formájának ezt követően hozzáadásával, vegyes anhidrid módszert használva, és hasonlóképpen, a boroarginint tartalmazó di-, tri- és hosszabb peptid-analógok hossza is növelhető további aminosavak vagy peptidek kapcsolásával.

A védett boroarginin-peptidek további tisztítását SP Sephadex™-en végzett ioncserélő kromatográfiás eljárással végezhetjük. A peptideket 20%-os ecetsavban oldjuk, és a H⁺-formában lévő oszlopra visszük. Az oszlopot 20%-os ecetsavval mossuk, majd a terméket 20%-os ecetsavban 0-0,3 n hidrogén-klorid grádienssel eluáljuk. A termék pinándiol-észter és szabad peptid-boronsav elegyének formájában eluálódik. Homogén terméket kapunk, ha az elegyet vízmentes körülmények között pinándiollal kezeljük, és a termékeket éterrel eldörzsöljük.

A pinándiol-védőcsoport eltávolítására két eljárást dolgoztunk ki, a reakció termékeként a szabad boronsav formában lévő (10) vegyületet kapjuk.

Az egyik eljárás szerint a fenti tisztítási eljárást módosítjuk, amelyben a szabad boronsav és a pinándiol-észter elegyét eluáljuk az ioncserélő oszlopról. A fenti vegyületeket LH-20-οη kromatografálva könynyen elválaszthatjuk egymástól.

A másik eljárás — amely Kinder és munkatársai [J. Med. Chem. 28, 1917-1925 (1985)] eljárásának módosított változata — szerint a borönsav-észtert 2-3szoros feleslegben lévőbór-trikloriddal kezeljük metilén-kloridban, -78 ’C-on, 5 percen keresztül, és az elegyet 15 percen át 0 ’C-on, jégfürdőn keverjük. A bórtriklorid feleslegét víz lassú hozzáadásával boronsavra és hidrogén-kloridra hidrolizáljuk. A reakcióelegyet 20%-os ecetsavval továbbhígítjuk, amíg a hidrogénklorid koncentrációja az elegyben 0,05 mól/1 lesz. A hidrogén-klorid koncentrációja a reakcióban eredetileg alkalmazott bőr-triklorid mennyiségén alapul. A vizes fázist SP-Sephadex™ oszlopra visszük, és a terméket hidrogén-klorid-só formájában eluáljuk a fentieknek megfelelően. A szabad boronsav-peptideket fehér, amorf szilárd anyag formájában kapjuk.

A (10) vegyületet (11) képletű difluor-boráhná alakíthatjuk, Kinder és munkatársai [J. Med. Chem. 28, 1917-1925 (1985)] eljárásának egy módosított változata szerint. A peptid-boronsavat 5-szörös mólfeleslegben lévő 0,50 n vizes hidrogén-fluoriddal kezeljük, szobahőmérsékleten. A hidrogén-fluorid feleslegét és a vizet liofilizálással eltávolítjuk, és a kapott szilárd anyagot éterrel eldörzsöljük. A kívánt terméket fehér, amorf szilárd anyag formájában kapjuk.

A fentiek szerint a (10) szabad boronsavat boronarginin-pinándiol-észterből, és a (11) difluor-boránsavat (10) vegyületből állítjuk elő. Az észter-védőcsoport eltávolítására használt eljárás alkalmazható a pinándiol-, pinakol- vagy egyéb észter-védőcsoporttal védett boroomitin-, borolizin-, és borohomoargininacil-peptidekre is. A megfelelő szabad bórsavak is hasonlóképpen alakíthatók difluor-boránokká.

Előnyösek azok az oldallánc-védőcsoportok és Nterminális védőcsoportok a molekula peptid-részében, amelyek katalitikus hidrogénezéssel szemben stabilak, és vízmentes hidrogén-kloridra vagy trifluorecetsavra érzékenyek. A fenti követelményeknek amio-védőcsoportként a terc-butoxi-karbonil-csoport, a hidroxil-, és karboxil-oldalláncok védőcsoportjaként a terc-butil-éterek és észterek felelnek meg. A fenti csoportok eltávolítása céljából a peptideket 4 n hidrogén-klorid-oldattal kezeljük, dioxánban, szobahőmérsékleten. A védőcsoport nélküli peptideket vagy az oldószer elpárologtatósával, vagy éteres kicsapással izoláljuk. A savas oldalláncot tartalmazó peptidek esetén különös gondot kell fordítani arra, hogy bepárlással az összes hidrogén-kloridot eltóvolítsuk. Ezzel biztosítjuk azt, hogy a boroarginin-peptid benzolszulfonsavas só formájában maradjon. A többi pepiidet vagy vegyes hidrogén-klorid-benzolszulfonsav-só formájában izolálhatjuk, vagy Cl'-formában lévő anioncserélő oszlopon átfolyatva hidrogén-klorid-sóvá alakíthatjuk,

- A (6) vegyület izotiourónium-származékait úgy állíthatjuk elő, hogy a (6) vegyületet vízmentes etanolban tiokarbamiddal kezeljük. A reakció eredményeként a (1Ö) peptid-boroarginin-észterek analógjait, a (12) vegyületeket kapjuk. Szokásos módon úgy járunk el, hogy az alkü-halogenideket 4-5-szörös feleslegben lévő tiokarbamiddal szobahőmérsékleten néhány napon keresztül keverjük. A terméket a reagálatlan (6) vegyülettől szükség esetén éterrel való eldörzsöléssel választjuk el. A (6) vegyület a legtöbb peptid esetében éterben jól oldódik, míg a tennék abban oldhatatlan. A tiokarbamid feleslegének eltávolítására végső tisztításként Sephadex™ LH-20-οη kromatografálunk, metanolban, és éterrel eldörzsöljük a terméket, amelyet hidrogén-bromid-só formájában kapunk, Az oldallánc- és N-terminális védőcsoportokat vízmentes hidrogén-bromiddal vagy más vízmentes savval végzett kezeléssel távolítjuk el.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek biológiai aktivitását az alábbiakban ismertetjük.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek biológiai aktivitását in vitro és in vivő vizsgálati eredményekkel bizonyítjuk, amelyek szerint a vegyületek gátolják a szintetikus szubsztrátok tripszin-szerű enzimek — a humán trombin és plazma kallikrein — általi hidrolízisét, és gátolják a fenti enzimek áltól katalizált fiziológiai reakciókat, például a véralvadást és gyulladást.

Az alább közölt példákban az egyes enzimek hidrolitikus aktivitását az inhibitor jelenlétében és tóvollétében egyaránt mérjük, és meghatározzuk a %-os enzim-aktivitást. Azt tapasztaljuk, hogy a plazma-kal9

HU 205 141 Β likrein és a trombin leghatásosabb inhibitorai azok a lassan kötődő inhibitorok, amelyek hatásossága az idővel egyre inkább növekedik, egyensúlyi állapot eléréséig. Az egyensúlyi állapotot viszonylag gyorsan elérik ezek a vegyületek, a reakció 5 percen belül lejátszódik. Az aktivitást a reaktánsok összekeverése után 10-20 perccel méqük, amikor a komponensek már biztosan egyensúlyban vannak. Az inhibitor legalacsonyabb vizsgált koncnetrációját az enzim becsült koncentrációjával határozzuk meg. A legalacsonyabb vizsgált koncentráció esetén az inhibitor koncentrációja az enzim koncentrációjának 5-szöröse, így látszólag elsőrendű reakciókörülményeket kapunk. A látszólag elsőrendű reakció körülményeinek fenntartása és a megfelelő vizsgálati elrendezés érzékenysége miatt az inhibitor legalacsonyabb vizsgált koncentrációja 10 nmől/l a kallikrein inhibitorokra és 5 nmól/l a trombin-inhibitorokra.

A reverzibilis inhibitor-hatást rendszerint a IQ érték mérésével határozzuk meg, ami az enzim-inhibitor-komplex dissziciációs állandóját jelenti. Ez az érték definíció szerint az inhibitor azon koncentrációja, ami a szuhsztrát távollétében az enzim 50%-os gátlásához szükséges. A szuhsztrát védőhatást fejt ki, emiatt az 50%-os gátlás eléréséhez magasabb koncentrációk szükségesek. Azonban a %-os aktivitás (gátlás) adatokból és az inhibitor koncentrációjából egy közelítő IQ értéket kaphatunk. A IQ-nél kb. 20-szor nagyobb inhibitor-koncentráció kell ahhoz, hogy a reakciót 95%-ban gátoljuk, és kb. 50-szer nagyobb koncentráció szükséges a reakció 98%-os gátlásához.

A plazma kallikrein elsősorban bradikinint szabadít fel és hidrolizál. Ennek az enzimnek leghatásosabb inhibitorai azok a boroarginm-peptidek, amelyek a boroargininnel szomszédos helyzetben Phe-t tartalmaznák. Például 10 nmől/l H-(D)Phe-Phe-boroArgC₁₀H₁₆ több, mint 95%-ban gátolja a kallikreinL Nem tapasztalható jelentős különbség a boroarginin-pirándiol-észter és a megfelelő izotiourónium-analógok (borolrg-) hatásossága között. Ezenkívül, nincs különbség a védetten boronsavszármazék és a megfelelő difluor-boránok aktivitása között sem.

A kallikreinnel kapott eredményekhez hasonló eredményeket kapunk trombinnal is, szintetikus szubsztrátokkal végzett vizsgálatokban, azzal az eltéréssel, hogy a trombin sokkal nagyobb affinitást mutat azokhoz az inhibitorokhoz, amelyek a horoargininnel szomszédos helyzetben prolint tartalmaznak. A leghatékonyabb inhibitor az Ac-(D)Phe-Pro-boroArgθιο^ΐ6> amely 5 nmól/l koncentrációban 99%-ban gátolja a trombint. Az irodalomból ismert leghatásosabb inhibitor az N-a-(2-naftil-szuIfonil-glicil)-4-amidi no-fenilalanin-piperidin, amelynek IQ értéke 6 nmól/l [B. Kaiser és munkatársai: Thromb. Rés. 43 , 613-620 (1986); és Sturzebecher és munkatársai: Thromb. Rés. 29, 635-642 (1983)]. Az inhibitor-koncentráció, a IQ és a %-os gátlás közötti fent ismertetett összefüggés alapján az Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-C₁₀H₁₆ IQ értéke pikomólos nagyságrendű. Ezenkívül, a (D)Phe-ProboroAig szekvenciát tartalmazó inhibitorok aktivitása úgy tűnik, hogy viszonylag független attól, hogy van-e amino-terminális védőcsoport a vegyületben, és ha van akkor az milyen természetű. A Boc-védőcsoportot vagy Ac-védőcsoportot tartalmazó, és védőcsoportot nem tartalmazó ilyen vegyületek hasonló mértékben gátolják a trombint, IC₅₀ értékük 5 nmól/l-nél kisebb.

A falálmán yszerinti eljárással előállított inhibitorok azon reakcióit, amelyekben természetes szúbsztrátokkal versenyeznek a célenzimekért, in vitro véralvadási vizsgálatokban méqük. Két különböző vizsgálatot alkalmazunk, az APTT (aktivált részleges tromboplasztin-idők) és PT (protrombin-idők) vizsgálatot Ezekben a vizsgálatokban az in vivő véralvadási folyamatot utánozzuk. A véralvadás két út egyikén mehet végbe, mindkét út zimogén aktiválási lépések kaszkádjából áll. A véralvadás útja intrinsic vagy entrinsic út lehet [lásd L. Lorand: Methods in Enzymology 45,3137 (1976)]. Az intrinsic utat negatív töltésű felületek indítják meg, amelyekben a plazma kallikrein, a ΧΠ faktor és a XI faktor aktiválódik, majd a IX faktor és X faktor, és a protrombin aktiválódik kalcium-függő lépésekben. A kaszkád utolsó proteáza, a trombin a fibrinogént fibrinné hidrolizálja. Amelynek eredményeként vérrög képződik. Az APTT vizsgálatban a plazma-komponenseket negatív töltésű felületeknek kitéve aktiváljuk, majd méq'ük az alvadási időket, miután a rendszerhez kalciumot adunk. Az entrinsic úton a tromboplasztin aktiválja a VII faktort, amely azután a trombin aktiválásához' vezető X faktort aktiválja. Ezeket a folyamatokat a protrombin-idő vizsgálatban méqük.

A boroarginin-peptidek, és a megfelelő izotiourónium-analógok hatásosan gátolják mindkét vizsgálatban a véralvadást. A trombin találmány szerinti eljárással előállított leghatásosabb inhibitorai a legaktívabbak mindkét vizsgálatban. Másrészről, a kallikrein inhibitorai amellett, hogy a véralvadást kevésbé gátolják, az APTT vizsgálatban (amikoris a kallikrein a folyamat beindításában szerepet játszik) hatásosabbak, mint a PT-vizsgálatban. Ez jól látható az 1. ábrán, amely a H-(D)Phe-Pro-boroArg-C₁₀H_I6 (trombin-inhibitor) hatását mutatja a plazma relatív alvadási idejére. Ez bizonyítja a szelektivitást, amelyet egy meglehetősen komplex biológiai rendszerben-egy tripeptid egyetlen aminosavjának megváltoztatásával érhetünk el. A trombin-inhibitorok hatásos koncentrációi a heparinéval azonos moláris nagyságrendűek. Rendszerint 0,2-0,4 egység heparin/ml plazma 2-2,5-szörösére növeli az alvadási időket. Ha a heparin átlagos molekulatömegét 15000-nek tételezzük fel, és specifikus aktivitása 150 egység/mg, akkor moláris koncentrációja 86-170 nmól/L A boroarginin-peptideknek az APTT-vizsgálatban az alvadási idők növeléséhez szükséges koncentrációja 170 és 230 nmől/l között van. Megjegyezzük, hogy a heparin a nagy molekulatömegű proteáz-inhibitor, az anti-trombin ΙΠ egy kofaktora.

A boroarginin-peptidek stabilitását humán plazmában úgy vizsgáljuk, hogy azokat a véralvadást késlelte10

HU 205 141 Β tő koncentrációban inkubáljuk a plazmával. Egyre növekvő időközökben mintát veszünk az inhibitorból, és megvizsgáljuk minden egyes minta véralvadást gátló képességét. Ha a véralvadás idők nem változnak, az inhibitorok aktivitása sem változott a plazmában való inkubálás alatt Az inhibitorok aktivitásában nem észlelünk jelentős változást, kivéve a H-(D)Phe-Pro-boroArg-C ₁₀H₁₆-ot, amelynek aktivitása 24 óra alatt elveszett A találmány szerinti eljárással előállított inhibitorok 24 órán keresztül stabilak foszfát-pufferben (pH 7,5) is, kivéve a H-(D)Phe-Pro-boroArg-Ci₀H₁₆ot, amely 1 órán belül elvesztette aktivitását. Ennek a vegyületnek fokozott instabilitása pufferben azt jelenti, hogy a foszfát-puffemek szerepe van a vegyület destabilizálásában.

A közölt in vivő adatok világosan jelzik a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek hatásosságát emlős szervezetekben, véralvadást gátló szerek hatóanyagaként.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek gyulladásgátló gyógyászati készítmények hatóanyagaként is használhatók, amint azt a patkányfülÖdéma-vizsgálat eredményei bizonyítják, amikoris a vegyületeket egy irritáló anyaggal együtt helyileg alkalmazzuk. A fntí gyógyászati hatás molekulüis alapja ismeretlen, mivel a gyulladás során számos folyamat végbemegy. Azonban feltételezik, hogy a gyulladási folyamatokban része van az érpermeabilitást fokozó proteázoknak, például a plazma-kallikreinnek, amely kinineket szabadít fel, és a komplement rendszer enzimjeinek, amelyek az anafílatoxin-peptideket szabadítják fel.

Végül kimutattuk, hogy a borolizin-peptidek gátolják a plazmint, a vérzéscsillapítás egyik kulcsfontosságú enzimjét.

A találmány szerinti eljárással előállított N-acil- és N-peptídil-a-amino-boronsav-származékok — amelyek az omitin, arginin, lizin és homoarginin analógjai — a tripszinhez hasonló enzimek erőteljes, reverzibilis inhibitorainak egy új csoportját képezik. A tripszin-szerú enzimek a proteázok egyik csoportját alkotják, amelyek bázikus maradékoknál hidrolizálják a peptid-kötést, és ezáltal vagy egy C-terminális arginil, vagy egy lizil-maradékot szabadítanak fel. A fenti enzimek közé tartoznak a véralvadási rendszer proteázai (XÍIa, Xla, Ka, VHa, Xa faktor és trombin), a fibrinolitikus rendszer proteázai (plazminogén-aktivátorok és plazmin), a komplement rendszer proteázai (Cls, Clr, C3-konvertáz, D faktor, stb.), a pankreásztripszin (amely az emésztésben játszik szerepet) és akrozin (amely egy, a spermával kapcsolatos proteáz, és a megtermékenyítéshez szükséges).

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek tripszin-szerú proteázokat gátló aktivitását két különböző tripszin-szerú enzim, a humán trombin és a plazma kallikrein gátlásának meghatározásával mutattuk ki. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek mindkét enzimet sokkal erősebben gátolják, mint az eddig ismert más inhibitorok, például az eddig leghatásosabb trombin-inhibitorként ismert vegyület, az N-a-(2-naftil-szulfonil-glicil)-4-amidino-fenilala nil-piperidin, amelynek Kj értéke 6 nmől/L A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek majdnem teljes mértékben gátolják a trombint 5 nmól/1 koncentrációban, amelynek megfelelően Kj értékük 1 nmól/1, és így kiváló hatóanyagokat jelentenek a trombin-mediálta folyamatok, például véralvadás szabályozására. A leghatásosabb boroarginin-peptid véralvadást gátló hatását az APTT-idő és PT-idő növelésével mutattuk ki. A hatás nagyságrendjei móltömegre számítva hasonló a heparinéhoz. Ezenkívül, a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek humán plazmában stabilak. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket antikoagulánsként használhatjuk a protein-izolálás céljára Szolgáló plazma-készítményekben, továbbá klinikai vizsgálatok céljára is használhatók.

A proteázok egy további példája a plazmin, amely a vérrögök lizisébe játszik döntő szerepet. A borolizint tartalmazó peptidek vizsgálataink szerint plazmint gátló hatással rendelkeznek.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek in vivő alkalmasak a proteolízis szabályozására, és gyógyszerkészítmények hatóanyagaként a nem megfelelő proteáz-aktívitásból származó betegségek kezelésére használhatók, az ember- és állatgyógyászatban. A fenti betegségek közé tartoznak a trombózissal és a kóros véralvadással kapcsolatos állapotok. A szívizom-infarktusban jelentős szerepe van a szívkoszorúér-trombózisnak. A kóros véralvadás — az az állapot, amelyet a véralvadási faktorok csökkenése és a plazma proteáz-inhibitor csökkenése jellemez — kimutatható akut pankreatitiszben és szóródott intravászkuláris koagulációban (DIC) szenvedő betegekben. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek várhatóan a heparin helyett alkalmazhatók, azzal az előnnyel, hogy a heparin plazma-kofaktora, az antitrombin III nem vesz részt a reakcióban, Ezenkívül a heparin-kezelés mellékhatásaként fellépő trombocitopénia sem figyelhető meg. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek továbbá várhatóan olyan betegségek kezelésére is használhatók, amelyekben a tripszin-szerú enzimek természetes inhibitorai hiányoznak, ilyen például az örökletes ödéma. Ennek a betegségnek a Cl-inhibitor hiánya az oka, amely a plazma kallikrein fő inhibitora.

Végül, a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek in vivő gyulladáscsökkentő hatását is bizonyítottuk.

A találmányt közelebbről példák segtségével kívánjuk ismertetni. Az olvadáspontokat nem korrigáltuk. A proton-magmágneses rezonancia spektrum (NMR és 1H-NMR) a kémiai eltolódásokat delta egységben adja meg, ppm-ben, a belső tetrametil-szilán standardtól lefelé.

A leírásban használt rövidítések jelentése az alábbi:

TFA trifluor-ecetsav

DMF Ν,Ν-dimetil-formamid

MS tömeg-spektrométria

TLC vékonyréteg-kromatográfia

HU 205141 Β

RP-TLC fordított fázisú vékonyréteg-kromatográfia.

A boronsavak észter-védőcsoportjainak rövidítései az alábbiak:

-C₆H₁₂ pinakol-csoport

-C₁₀H₁₆ pinándiol-csoport.

Irg az arginin (Arg) izotiouróniuin-analógját jelenti, és a homo előtag olyan szerkezetre utal, amelyben az oldallánc egy további metiléncsoportot tartalmaz. Minden aminosavmaradék L-konfigurációban van, hacsak azt másként nem jelezzük.

A TLC-t E. Merck Silica Gél 60 lemezen (katalógusszáma 5534, EM. Sciences, Gibbstone, NJ, USA); a RP-ILC-t Whatman KC18F Reverse Phase lemezen katalógusszáma 4803-600, Whatman Co., Clifton, NJ, USA) végezzük. A semleges vegyületeket UVfényhen és jódgőznek kitéve tettük láthatóvá. A szabad aminocsoportot tartalmazó vegyületeket ninhidrinnel a guanidinocsoportot tartalmazó vegyületeket Sakaguchi-festéssel festettük meg. A Sakaguchi-festés jelentős specifitást mutat a monoszubsztituált guanidinekre, például a találmány szerinti eljárással előállított boroarginin-peptidekre [lásd Chemistry of the Amino Acids, 3, (1984), Greensteín és Winitz szerk., Róbert E. Krieger Publishing Co., Malahar, FL].

la. példa l-Amino-4-bróm-butil-boronsav-pinándiol-észter-ftidrogén-klorid előállítása [NH₂-CH[(CH₂)₃Br]-BOj-C₁₀H₁₆.HCl]

A 4-brőm-l-ldór-butil-boronsav-pinándiol-észtert Matteson és munkatársai [Organometallics 5, 1284— 1288 (1984)] módszere szerint állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy a körülmények módosításával lehetővé tettük a nagy léptékű előállítást.

173 ml (2,00 mól) allil-bromidot 240 ml (2,00 mól) katechol-boránnal reagáltatunk oly módon, hogy a borúm az allil-bromidhoz adjuk, majd a reakcióelegyet 4 órán keresztül 100 ’C-on nitrogénatmoszférában melegítjük. A 3-brőm-propil-boronsav-katechol-észtert desztillálással választjuk el, a hozam 49%, forráspontja 95-102 ’C 0,25 mm nyomáson.

124 g (0,52 mól) katechol-észtert 88 g (0,52 mól) (+)-a-pinándiollal átészterezünk, oly módon, hogy a komponenseket 50 ml tetrahidrofuránban elegyítjük, és 0 ’C-on 0,5 órán keresztül, majd szobahőmérsékleten 0,5 órán keresztül keverjük. Az oldószert elpárologtatjuk, és hozzáadunk 250 ml hexánt A katecholt kristályos, szilárd anyag formájában eltávolítjuk. A katecholt kvantitatíve úgy távolítjuk el, hogy hexánnal egymás után 500 ml-re, majd 1000 ml-re hígítunk, és minden egyes hígítás után eltávolítjuk a kivált kristályokat.

147 g terméket kapunk az oldószer eltávolítása után, olaj formájában.

Elemanalízis eredmények a Ci-,Ηο-,Ο-,ΒγΒ összegképlet alapján:

számított: C: 51,85, H: 7,38, Br: 26,54%, talált: C: 52,85, H: 7,30, Br: 26,58%.

A 4-brőm-l-kIór-butiI-boronsav-pinándiol-észtert a megfelelő propil-boronsav-észter homologizálásával állítjuk elő. 34,8 ml (0,540 mól) metilén-kloridot oldunk 500 ml tetrahidrofuránban, és -100 'C-on lassan hozzáadunk 350 ml 1,54 n (0,540 mól) hexános n-butil-Iítium-oldatot.

148 g (0,490 mól) 3-bróm-propil-boronsav-pinándiol-észtert 500 ml tetrahidrofuránban oldunk, az oldat fagyáspontjának megfelelő hőmérsékletre lehűtjük, és a reakcióelegyhez adjuk.

33,5 g (0^246 mól) cink-kloridot 250 ml tetrahidrofuránban oldunk, 0 ’C-ra hűtjük, és részletekben a reakcióelegyhez adjuk. A reakcióelegyet keverés közben lassan, egy éjszakán keresztül hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. Az oldószert elpárologtatjuk, és a maradékot hexánban oldjuk, vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk és szűrjük.

Az oldószer eltávolítása után 140 g kívánt terméket kapunk.

Az l-amino-4-bróm-butil-boronsav-pmándiol-észtert úgy állítjuk elő, hogy először 28,0 g (80,0 mól) hexametil-diszilazánt 30 ml tetrahidrofuránban oldunk, az oldatot -78 ’C-ra hűtjük, és hozzáadunk

49,4 ml 1,62 n hexános n-butil-lítium-oldatot (80,0 mmól). Az oldatot lassan szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, majd újra -78 ’C-ra hűtjük, és hozzáadunk 28,0 g (80,0 mmól) 4-bróm-I-klőr-butil-boronsav-pinándiol-észtert 20 ml tetrahidrofuránban. A reakcióelegyet lassan szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, és egy éjszakán keresztül keverjük. Az oldószert elpárologtatjuk, és 400 ml vízmentes hexánt adunk hozzá. A kivált csapadékot nitrogénatmoszférában szűréssel eltávolítjuk. A szűrietet -78 'C-ra lehűtjük, és hozzáadunk 60 ml 4 n dioxános hidrogén-klorid-oldatot (240 mmól). A reakcióelegyet lassan szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, és ezen a hőmérsékleten 2 órán keresztül keverjük. A terméket szilárd anyag formájában, szűréssel választjuk el. 20 g terméket kapunk, amelyet vákuumban szárítunk, majd a nyersterméket kloroformban oldjuk és az oldhatatlan anyagot szűréssel eltávolítjuk. A szűrletet bepároljuk és a maradékot etil-acetátban oldjuk. A terméket etilacetátból kristályosítjuk.

15,1 g cím szerinti vegyületet kapunk. Olvadáspont: 142-144,5 ’C.

[a^jys+ló,?! 0,80 (c= 1,0, abszolút etanolban)

Elemanalízis eredmények a C^H^NC^BrClB összegképlet alapján:

számított: C:45,87,H:7,16,N:3,82,B:2,95%, talált: C: 45,76, H: 7,21, N: 3,79, B: 3,04%.

lb. példa (Df)-l-Amino-4-bróm-butil-boronsav-pinakol -észter-hidrogén-klorid előállítása [QJL)-NH₂-CH[(CH₂)₃Br]-BO_z-C₆H₁₂.HCl]

A 4-bróm-l-klór-butiÍ-boronsav-pinakol-észtert az la. példában a megfelelő pinándiol-észter előállítására ismertetett eljárással állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy a pinándiolt pinakollal helyettesítjük, és így 3bróm-propil-boronsav-pinakol-észtert (forráspontja 60-64 ’C, 0,35 mm nyomáson) és 4-brőm-l-klőr-bu12

HU 205 141 Β til-boronsav-pinakol-észtert (forráspontja 1 ΙΟΙ 12 °C, 0,20 mm nyomáson) választjuk el desztillálással.

Elemanalízis eredmények a Ci₀H₁₉O₂BrClB öszszegképlet alapján:

számított: C: 40,38,H: 6,45%, talált: C: 40,70, H: 6,37%.

A cím szerinti l-amino-4-bróm-butil-boronsav-pinakol-észter-hidrogén-kloridot szintén az la. példában leírt módon állítjuk elő. A végterméket etil-acetát és hexán elegyéből kristályosítjuk, a hozam 52%.

Elemanalízis eredmények a C₁₀H₂₂NO₂BrClB összegképlet alapján:

számított: C: 38,19, H: 7,05, N: 4,45,

Cl: 11,27, Br: 25,41%, talált: C: 38,38, H: 7,39, N: 4,25,

Cl: 11,68, Br: 26,00%.

le. példa

Ι-Αηύήσ-4-klór-butil-boronsav-pinakol-észter

-hidrogén-klorid előállítása [(D^)-NH₂-CH[(CH₂)₃C1]BO₂-C₆H₁₂.HC1]

A 3-klór-propil-boronsav-totechol-észtert (forráspontja 80-85 ’C, 0,30 mm nyomáson) és a 3-klór-propil-boronsav-pinakol-észtert (forráspontja 63 ’C, 0,20 mm nyomáson) az la. példában leírtak szerint állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy allil-bromid helyett allil-kloridot és pinándiol helyett pinakolt használunk.

A homologizálást is az la. példában ismertetett módon végezzük, és a terméket desztillálással választjuk el, forráspontja 95 ’C, 0,25 mm nyomáson, a hozam 65%.

Elemanalízis eredmények a C₁₀H₁₉O₂Cl₂Bösszegképlet alapján:

számított: C: 47,47, H: 7,58, Cl: 28,02%, talált: C: 47,17, H: 7,45, Cl: 27,75%.

Az l-amino-4-klór-butil-boronsav-pinakol-észterhidrogén-kloridot az la. példában leírtakkal analóg módon eljárva állítjuk elő. A terméket etil-acetátból kristályosítva 8,8 g 132-135,5 ’C olvadáspontú, és 2,2 g 145-147 ’C olvadáspontú anyagot kapunk A 145— 147 ’C olvadáspontú terméket használjuk elemanalízis céljára.

Elemanalízis eredmények a C₁₀H₂₂NO₂Cl₂B öszszegképlet alapján:

számított: C: 44,47, H: 8,23, N: 5,19, B: 4,00%, talált: C:44,01,H:8,23,N:4,77,B:3,80%.

1. példa (DJL)-l-Amino-5-bróm-pentil-boronsav-pinako l-észter-hidrogén-klorid előállítása [(D^-N^-CHKCI^^BrlBqi-CgH^.HCl]

A 4-bróm-butil-boronsav-pinakol-észtert az la. példában a 3-bróm-propil-boronsav-pinándiol-észter előállítására ismertetett eljárással analóg módon állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy allil-bromid helyett 4-bróm-l-butént, és pinándiol helyett pinakolt használunk. A terméket olaj formájában izoláljuk, forráspontja 77 ’C, 0,3 mm nyomáson.

Homologizálással 5-bróm-l-klór-pentil-boronsavpinakol-észtert kapunk.

MS (Cl) a C,, H₉₁0₂BrClB összegképlet alapján: számított+H 310,47 talált: 310.

Az l-amino-5-bróm-pentil-boronsav-pinakol-észter-hidrogén-kloríd végterméket az la, példában leírtak szerint állítjuk elő, a hozam 35%.

Elemanalízis eredmények a CiiH₂₄NO₂BrBCl összegképlet alapján:

számított: C: 40,22, H: 7,36, N: 4,26, Cl: 10,79,

Br:24,32,B:3,29%, talált: C: 39,23, H: 7,18, N: 4,04, Cl: 15,21,

Br:25,66,B:3,75%.

2. példa

Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH[(CH ^BrjBOj-C^Hj ₆ előállítása

A Boc-(D)Phe-Pro-OH-t úgy állítjuk elő, hogy először előállítjuk a dipeptid-benzil-észtert, majd az észtercsoportót katalitikus hidrogénezéssel eltávolítjuk.

10,0 g (37,7 mmól) Boc-(D)Phe-OH-t 50 ml tetrahidrofuránban oldunk és hozzáadunk 4,14 ml (37,7 mmól) N-metil-morfolint. Az oldatot -20 ’C-ra hűtjük és hozzáadunk 4,90 ml (37,7 mmól) izobutil-klőrformiátot. 5 perc elteltével hozzáadjuk 9,11 g (37,7 mmól) H-Pro-OBzl.HCl 50 ml kloroformmal készült, -20 ’C-ra hűtött oldatát.

A reakciőelegyhez 5,25 ml (37,7 mmől) trietilamint adunk, és -20 ’C-on 1 órán keresztül, majd szobahőmérsékleten 2 órán keresztül keverjük. A reakcióelegyet szűrjük, és a szűrletet bepároljuk. A maradékot etil-acetátban oldjuk, és 0,2 n hidrogén-kloridoldattal, 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, és telített, vizes nátrium-klorid-oldattal mossuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük és bepároljuk.

15,2 g Boc-(D)Phe-Pro-OBzI-t kapunk, olaj formájában.

15,2 g fenti benzil-észtert 100 ml metanolban oldunk, és Parr-készülékben, 2,76 x 10⁵ Pa kiindulási nyomáson hidrogénezzük, 0,5 g 10% fémet tartalmazó szénhordozós palládiumkatalizátor jelenlétében. A reakcióelegyet Celite™-en átszűrjük és szárazra pároljuk. A topott szilárd anyagot elválasztjuk és etilacetáttal, majd éterrel mossuk.

10,0 g kívánt vegyületet kapunk, olvadáspontja 176,5-177 ’C.

Elemanalízis eredmények a C₁₉H₂₆O₂O₅ összegképlet alapján:

számított C: 62,95, H: 7,24,N: 7,73%, talált: C: 62,91, H: 7,15,N: 7,53%.

A Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH/(CH₂)₃Br/BOjCi₀Hi₆-ot úgy állítjuk elő, hogy a fenti dipeptidet a megfelelő aminnal kapcsoljuk, vegyes anhidrid eljárást alkalmazva.

A Boc-(D)Phe-Pro-OH vegyes anhidridjének előállítására a fenti sav 4,94 g-ját (13,6 mmól) 30 ml tetrahidrofuránban oldjuk, és hozzáadunk 1,50 ml (13,6 mmól) N-metil-morfolint. Az oldatot -20 ’C-ra hűtjük, és hozzáadunk 1,77 ml (13,6 mmól) izöbütil-klór13 formiátoL Az elegyet -20 °C-on 5 percen keresztül keverjük, majd hozzáadjuk az la. példa szerint előállított 5,0 g (13,6 mmól) N^CHKCH^BrJBC^C₁₀H₁₆ .HC110 ml hideg kloroformmal készült oldatához. Hozzáadunk 10 ml tetrahidrofuránt és 1,90 ml (13,6 mmól) trietil-amint és az elegyet -20 ’C-on 1 órán keresztül, majd szobahőmérsékleten kb. 2 órán keresztül keveqük. Az elegyet szűqük és a szűrletet bepároljuk. A maradékot etil-acetátban oldjuk és 0,2 n hidrogén-klorid-oldattal, 5%-os vizes nátriumhidrogén-karhonát-oldattal, és telített, vizes nátriumklorid-oldattal mossuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük, és az oldószert elpárologtatjuk.

9,0 g olajat kapunk, amelyet metanolban oldunk, és

2,5 x 50 cm-es oszlopon LH-20-οη kromatografálunk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepáröljuk. 5,8 g szilárd anyagot kapunk, amely TLC-vel (futtatóelegy: metanol és kloroform 1:9 térfogataiányű elegye) egyetlen foltot ad, Rf= 0,70.

MS ©AB) aC^₃H₄₉N₃O₆BBr összegképlet alapján: számított +H:674,30, talált:674,30.

5. példa

Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH[(CH ₂)₃N₃]BO₂-C₁₀ H₁₆ előállítása

4,4 g (6,54 mmól) Boc-(D)Phe-Pro-NHCH[(CH₂)3Br]-BO₂-C₁₀H₁₆-ot — amelyet a 2. példában állítottunk elő — 7 ml dimetil-formamidban oldunk, és hozzáadunk 0,919 g (14,1 mmól) nátriumazidoL Az elegyet 100 ’C-on 3 órán keresztül melegítjük. Hozzáadunk 100 ml etil-acetátot, és a reakciőelegyet vízzel és telített, vizes nátrium-klorid-oldattal mossuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük, és bepároljuk. A kapott 4,1 g szilárd anyagot 2,5x50 cm-es oszlopon LH-20-οη, metanollal kromatografáljuk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk.

2,3 g cím szerinti azidot kapunk, amely TLC-vel (futtatóelegy: metanol és kloroform 1:9 térfogatarányú elegye) egyetlen foltot ad, Rj= 0,76.

Elemanalízis eredmények a ¢33H_4gN₆O₆B összegképlet alapján:

számított: C:62,35,H:7,63,N: 13,33,B: 1,70%, talált: C: 63,63,H: 8,02,N: 11,58,B: 1,80%.

MS (FAB) aC3₃ H₄₈N₆O₆B összegképlet alapján: számított+H: 637,39, talált: 637,49.

4. példa

Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH[(CH ^ΝΗ^-ΒΟ^ ₀H₁₆.benzolszulfonsav előállítása

8,80 g (13,8 mmól) 3. példa szerint előállított azidot 150 ml metanolban oldunk, és Parr-készülékben 2,76 xlO⁵ Pa kiindulási nyomáson hidrogénezzük, 0,50 g 10% fémet tartalmazó szénhordozós palládiumkatalizátor és 2,19 g (13,8 mmól) benzolszulfonsav jelenlétében.

óra elteltével a katalizátort leszűrjük, és az oldatot bepároljuk. A kapott szilárd anyagot hexánnal eldörzsöljük.

9,9 g kívánt terméket kapunk.

RP-TLC (metanol és víz 85:15 térfogatarányú elegye) szerint egy UV-foIt látható, Rf= 0,91, és egy ninhidrin-pozitív folt, Rf=0,52.

5. példa

Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH[(CH ₂)₃‘NH CÍNHjNBjjBOj-CioH^. benzolszulfonsav előállítása [Boc-(D)Phe-Pro-boroArg-C ₁₀H₁₆. benzolszulfonsav]

4,6 g (6,11 mmól) 4. példa szerint előállított Boc(D)Phe-Pro-boroOm-C ₁₀H₁₆ .benzolszulfonsavat 20 ml, 50 mgtal ciánamidot tartalmazó vízmentes etanolban 100 ’C-on visszafolyató hűtő alatt forralunk. A reakció lefolyását RP-TLC-vel követjük, futtatóelegyként metanol és víz 85:15 térfogatarányú elegyét használva megfigyelhető az amin kiindulási anyag ninhidrin-pozitív foltjának (Rf= 0,54) eltűnése és a tennék Sakaguchi-festéssel festődő foltjának (Rf= 0-0,13) megjelenése. A tennék 18 órán keresztül visszafolyató hűtő alatti forralás után kimutatható, és koncentrációja az idővel növekszik. 7 nap múlva az amint nem lehet kimutatni, ekkor a reakcióelegyet közelítőleg 50%-os oldattá koncentráljuk, spontán bepárlással. A reakcióelegyet leszűrjük, koncentráljuk és 2,5x100 cm-es, LH-20 töltetű oszlopon metanollal kromatografáljuk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk. 3,7 g kívánt' terméket kapunk, amelynek 2,3 g-ját etil-acetát és hexán elegyéből kristályosítjuk.

0,89 g anyagot kapunk, és éteres éldörzsöléssel a maradékból 1,2 g szilárd anyagot, független kísérletekben.

MS ©AB aC₃₃H₅₃N₆O₆SB összegképlet alapján: számított+H: 653,42, talált:653,38.

Elemanalízis eredmények a C^HjgNgOgSB.E^O összegképlet alapján:

számított C: 57,95,H: 7,43,N: 10,14,B: 1,30%, talált: C: 57,20, H: 7,14,N: 10,94,B: 1,01%.

6. példa

H-(D)Phe-Pro-boroArg-C _1OH₁₆.2HC1 előállítása

1,17 g (1,54 mmól) 5. példa szerint előállított Boc(D)Phe-Pro-boroArg-C ₁₀H₁₆.benzolszulfonsavat 5 ml 4 n dioxános hidrogén-klorid-oldattal reagáltatunk, szobahőmérsékleten, 15 percen keresztül. A terméket éter hozzáadásával kicsapjuk, elválasztjuk és éterrel mossuk, majd vákuumban szárítjuk. Ezután 10 ml vízben feloldjuk, és 5 mlBIO-RAD AGIX8™mel töltött ioncserélő oszlopra (CT forma, BIO-RAD Co., Richmind, CA) visszük, és az oszlopot kb. 30 ml vízzel mossuk.

Az effluenst vákuumban bepároljuk, és a maradékot éterrel eldörzsöljük.

0,80 g cím szerinti terméket kapunk.

MS ©AB) a C2₉H₄₅N₆O₄B összegképlet alapján:

HU 205 141 B számított+H: 553,37, talált: 553,40 és 538,40 (nem azonosított).

Elemanalízis eredmények a H-(D)Phe-Pro-boroArg-C_1OH₁₆.1BSA.TFA képlet alapján: talált: 553,4.

7-8. példa

Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-C _1OH₁₆.HC1 (7. példa) és Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH.HCl (8. példa) előállítása

0,86 g (1,13 mmól) 5. példa szerint előállított Boc(D)Phe-Pro-boroArg-C ₁₀H₁₆ .benzölszulfonsavat szobahőmérsékleten 15 percen keresztül kb. 5 ml vízmentes trifluor-ecetsavval reagáltatunk. A TFA feleslegét bepárlással eltávolítjuk, és a maradékot éterrel eldörzsöljük. 0,76 g terméket kapunk.

0,70 g (0,91 mmól) fenti terméket 2 ml dioxán és 1 ml víz elegyében oldunk. Hozzáadunk 0,47 ml (5,0 mmól) ecetsavanhidridet és 0,42 g (5,0 mmól) nátrium-hidrogén-karbonátot. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 20 percen keresztül keverjük. Hozzáadunk 50 ml etil-acetátot és 5 ml vizet. A fázisokat szétválasztjuk és a szerves fázist vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk, szűrjük, és az oldószert bepárlással eltávolítjuk.

0,56 g részben szilárd terméket kapunk.

A fenti anyagot 4 ml jégecetben oldjuk és 15 ml vízzel hígítjuk. Azonnal 15 ml SP-Sephadex™-et (H forma) tartalmazó oszlopra visszük, amelyet 20 t%-os ecetsavval ekvilibrálunk. Az oszlopot 300 ml 20 t%-os ecetsáwal mossuk, majd 100 ml 20 tömeg%-os ecetsavból és 100 ml, 0,30 n hidrogén-kloridot tartalmazó 20 tömeg%-os ecetsavból kialakított lineáris gradienssel eluáljuk. A 0,08-0,17 n hidrogén-klorid-tartalmú frakciók tartalmazzák az N-acetil-peptidet (0,29 g), a szabad boronsav és a pinándiol-észter elegyeként.

A pinándiol-észtert és a szabad boronsavat 2,5x100 cm-es, LH-20 töltetű oszlopon, metanollal kromatografálva választjuk szét egymástól. 8,2 ml-es frakciókat szedünk. A 41—43. frakciókban eluálódik a pinándiol-észter (102 mg), míg a szabad boronsav (131 mg) a45-129.frakciókban lassan eluálódik.

MS (FAB) a 7. példa termékére [Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-C₁₀H₁₆] a C₃₁H₄₇N₆O_SB Összegképlet alapján:

számított+H: 595,33, talált: 595,33.

MS (FAB) a 8. példa termékére [Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH.HCl] aC₂₁H₃₃N₆O₅ összegképlet alapján: számított+H: 449,60, talált: 579,24-581,24.

Az utóbbi eredményt nem lehet megmagyarázni. Az NMR-spektrum azonban a szabad boronsav szerkezetével konzisztens, mivel a pinándiol-csoportra jellemző sávok, így a delta 0,85 (3H), 1,30 (3H) és 1,36 (3H) metilcsoport szingulettek hiányoznak. A szerkezet további bizonyítéka, hogy a szabad boronsav egy részét újraészterezve a 7. példa szerinti terméket kapjuk.

Analitikai mennyiségű (20 mg) mintát hétszeres feleslegben lévő (14 mg) pinándiollal kezelünk 3 ml metanolban 5 percen keresztül. Az oldószert elpárologtatjuk és a pinándiol feleslegét éterrel eldörzsölve távolítjuk el. 26 mg terméket kapunk.

• MS (FAB) talált: 595,38) és NMR-spektrum megegyezik az észterre várt értékekkel, és majdnem azonos a 7. példa szerinti pinándiol-észter megfelelő adataival.

9. példa

Ac-Phe-boroArg-C _1OH₁₆.HC1 előállítása

Az Ac-Phe-NH-CH[(CHj)₃Br]BOj-C₁₀H₁₆-ot a 2. példában leírtak szerint állítjuk elő.

0,565 g (2,73 mmól) Ac-Phe-OH vegyes anhidridjét 10 ml tetrahidrofuránban állítjuk elő, és 10 ml hideg tetrahidrofuránban oldott 1,00 g (2,73 mmól) la. példa szerint előállított NH₂CH[(CH₂)₃Br]BC^C₁₀H₁₆.HCl-hez kapcsoljuk. 1,47 g fehér habot kapunk.

Az így kapott anyagot egy éjszakán keresztül hexánnal keverjük. 1,01 g fenti vegyületet kapunk, szilárd anyag formájában, olvadáspontja 106,5—109 ’C.

Elemahalízis eredmények a ^25^Η36^2θ4^ΒΓ® öszszegképlet alapján:

számított: C: 57,81, H: 7,00, N: 5,40,

Br: 15,40,B: 2,08%, talált: - C: 58,33, H: 7,33, N: 4,76,

Br: 14,183:1,80%.

MS (FAB) a C₂₅ H₃₆N₂O₄BrB összegképlet alapján: számított +H: 519,20, talált: 519,23.

Az Ac-Phe-NH-CH[(CH₂)₃N₃]BO_i-C_wH₁₆-ot úgy állítjuk elő, hogy 3,22 g (6,20 mmól) Ac-Phe-NHCHKCIijLBrjBC^-CKjHjg-ot a 3. példában leírtak szerint nátrium-aziddal kezelünk. 3,03 g így kapott terméket LH-20-οη kromatografálunk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk. A maradékot hexánnal eldörzsölve 2,21 g megfelelő azidot kapunk.

Az Ac-Phe-boroOm-C₁₀H₁₆ .benzölszulfonsavat úgy állítjuk elő, hogy 2,21 g (4,59 mmól) Ac-Phe-NHCH[(d4)₃N₃]BO2-C_1QH₁₆-ot a 4. példában leírtak szerint kezelünk, azzal az eltéréssel, hogy a hidrogénezést atmoszférikus nyomáson végezzük. Szűrés és bepárlás után 2,22 g kívánt terméket kapunk, éteres eldörzsöléssel.

Az Ac-Phe-boroArg-C₁₀H₁₆ .benzölszulfonsavat úgy állítjuk elő, hogy 2,0 g (3,26 mmól) Ac-Phe-boboOm-C _joH₁₆ .benzolszulonsavat 10 ml 100 mg/ml koncentrációjú etanolos cián-amid-oldattal kezelünk. A guanidilezést az 5. példában leírtak szerint végezzük, azzal az eltéréssel, hogy a reakcióidő 3 nap, és a reakcióelegy a kiindulási anyag és a tennék elegyét tartalmazza. Ezért egy további tisztítási lépésre van szükség, ami valószínűleg elhagyható, ha hosszabb reakcióidőt alkalmazunk.

Az oldatot koncentráljuk és 2,5x100 cm-es LH-20 oszlopon kromatografáljuk, metanolban. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat — amelyeket Sakaguchi-festéssel mutatunk ki — összegyűjtjük és bepároljuk. 1,4 g anyagot kapunk.

HU 205 141 Β

1,2 g így kapott terméket 6 ml ecetsavban oldunk és ml vízzel hígítva opálos oldatot kapunk. Az oldatot 20 t%-os vizes ecetsavoldattal ekvilibrált SP-Sephadex™ C-25 (H⁺-forma) oszlopra visszük. Az oszlopot 240 ml 20 tömeg%-os ecetsavoldattal mossuk, majd 250 ml 20 tömeg%-os ecetsavoldatból és 250 ml, 0,30 n hidrogén-klorid-tartalmú 20 tömeg%-os ecetsavoldatból kialakított lineáris gradienssel eluáljuk. A 0,12-0,16 n hidrogén-klorid-tartalmú oldattal eluálódó frakciókat összegyűjtve 0,42 g kívánt pepiidet kapunk, szabad boronsav és pinándiol-észter elegyeként. Az elegyet 10 ml metanolban oldjuk és a szabad boronsavat 80 mg pinándiollal észterezzük. Az elegyet 30 percen keresztül keveqük, az oldószert elpárologtatjuk, és a maradékot éterrel eldörzsöljük. 0,28 g kívánt terméket kapunk.

Elemanalízis eredmények a

C₂₆H₄₀N5O₄B.HC1.2I^O összegképlet alapján: számított: C: 54,78,H: 8,15,N: 12,30, B: 1,90%, talált: C:55,34,H:7,83,N:11,66,B: 1,99%.

MS (FAB) aCjgH^^C^B összegképlet alapján: számított+H: 498,32, talált: 498,31.

10. példa

Ac-(DL)Phe-(DL)boroArg-C ₆H₁₂ előállítása

Az Ac-0)L)-Phe-(DL)-NH-CH[(CH₂)₃Br]BO_iC₆H₁₂ köztíterméket az lh. és 2. példa szerinti eljárások módosított változatával állítjuk elő.

Az Ac-Phe-OH savkloridját úgy állítjuk elő, hogy 30 g (0,145 mól) Ac-Phe-OH-t 30 g (0,144 mól) foszfor-pentafcloríddal reagáltatunk 175 ml tetrahidrofuránban, -10 ’C-on. Areakcióelegyet 0 ’C-on kb. 1 órán keresztül keveq'ük, majd hideg éterrel 350 ml térfogatra hígítjuk. A terméket szilárd anyag formájában választjuk el, hideg éterrel mossuk, és vákuumban szárítjuk. 21 g kívánt terméket kapunk.

14,8 g (65,6 mmól) aktivált Ac-Phe-származékot 40 ml tetrahidrofuránban' oldunk, és hozzáadjuk 20 mmól 4-hróm-l-klőr-butil-horonsav-pinakol-észter és 20 mmól hexametil-diszilazán reakciótermékéhez -78 ‘C-on. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, majd egy éjszakán keresztül keveqük. Az oldószert bepárfással eltávolítjuk. A maradékot etil-acetátban oldjuk, és egymás után vízzel, 5 íömeg%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és telített, vizes nátrium-klorid-oldattal mossuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk és koncentráljuk. 1,37 g kívánt terméket kapunk, kristályos szilárd anyag formájában, olvadáspontja 146,5-148 ’C. Egy másik kísérletben az alábbi anaÜziseredményeket kapjuk:

Elemanalízis eredmények a C₂₁H₃₂N₂O₂₄BrB összegképlet alapján:

számított: C: 53,98, H: 6,29, N: 6,00, rW.17,10,B:2,31%, talált: C: 54,54, H: 6,78, N: 5,98,

Br 16,46,B:3,40%.

Az alkil-bromidot a 3. példában leírtak szerint aziddá alakítjuk. A terméket etil-acetátból kristályosítjuk, olvadáspontja 143-144 ’C.

Elemanalízis eredmények a C2iH₃₂N₅O4B összegképlet alapján:

számított: C: 58,74,H: 7,53, N: 16,31,B: 2,53%, talúlt: C: 58,85, H: 7,48,N: 16,53,B: 2,93%.

Az azidot a 4. példában leírtak szerint alakítjuk Ac(DL)Phe-(DL)boroOm-C ₆H₁₂ .benzolszulfonsawá, azzal az eltéréssel, hogy a hidrogénezést atmoszférikus nyomáson végezzük.

0,243 g (0,433 mmól) Ac-(DL)Phe-(DL)boroOmC₆H₁₂.benzolszulfonsavat 0,020 g (0,476 mmól) ciánamiddal reagáltatunk 2 ml vízmentes etanolban, 100 ‘C-on, 1 éjszakán keresztül. Az oldatot koncentráljuk és éterrel eldörzsöljük. 0,21 g fehér, szilárd anyagot kapunk.

Az anyag RP-TLC analízisével 0-0,55 Rf értéknél Sakaguchi-festéssel pozitív foltot kapunk, ami a boroArg-peptidek jelenlétére utal, és egy 0,68 Rf értékű, különálló foltot, ami a változatlanul maradt kiindulási anyagnak felel meg.

mg terméket újra 2 ml 10 mg/ml koncentrációjú ciánamiddal kezelünk egy éjszakán keresztül a fentiek szerint. Éteres eldörzsölés után 71 mg kívánt terméket kapunk. MS (FAB) a C₂₂H₃₇N₅O₄B összegképlet alapján:

számított +H:446,30, talált: 446,23 és 404,19 (ami a reagálatlan boroOm-peptidnek felel meg).

Megjegyezzük, hogy az 5. példa szerinti eljárás igen előnyös a boroArg-peptidek előállítására, és csak abban különbözik, hogy a ciánamidot nagyobb feleslegben használjuk és hosszabb reakcióidőt alkalmazunk.

11. példa

Bov-(D)Phe-Phe-boroArg-C ιο^16· benzolszulfonsav előállítása

A Boc-(D)Phe-Phe-OH-t a 2. példában a Boc(D)Phe-Pro-OH előállítására használt eljárással analóg módon állítjuk elő A benzil-észter hidrogénezése után az anyagot kloroformból kristályosítva kapjuk a kívánt pepiidet, olvadáspontja 133-133,5 ’C.

Elemanalízis eredmények a C₂₃H_2gN₂O₅ összegképlet alapján:

számított: C:66,96, H: 8,68, N: 6,79%, talált: C:66,75,H:6,79,N:6,56%.

A Boc-(D)Phe-Phe-NH-CH[(CH₂)₃Br]-C₁₀H₁₆-ot úgy állítjuk elő, hogy 6,00 g (14,5 mmól) Boc-(D)PhePhe-OH-t 5,33 g (14,3 mmól) NE^CH[(Cf^)₃Br]BG^-C₁₀H₁₆.HCl-dal kapcsolunk, a 2. példában leírtak szerint, azzal az eltéréssel, hogy elhagyjuk az LH-20-οη való kromatografálást A terméket etil-acetátból kristályosítva 2,47 g kívánt terméket kapunk első hozadékként, olvadáspontja 132134 ‘C, és 5,05 g anyagot második hozadékként, olvadáspontja 133-135 ’C. RP-TLC analízissel egyetlen foltot kapunk metanol és víz 85:15 arányú elegyével futtatva, Rf értéke 0,29.

Elemanalízis eredmények a C₃₇H₅₁N₃O₆BrB öszszegképlet alapján:

HU 205 141 Β számított: C:6l,32,H:7,ll,N:5,80,Br: 11,03%, talált: · C: 61,21, H: 7,02, N: 5,59, Br: 10,22%

A ' Boc-(D)Phe-Phe-NH-CH[(CH₂)₃N₃]BC^C₁₀H₁₆-ot úgy állítjuk elő, hogy 7,15 g (9,87 mmól) megfelelő alkil-bromidot a 3. példában leírt módon nátrium-aziddal kezelünk, azzal az eltéréssel, hogy az LH-20-οη végzett kromatográfiás lépésre nincs szükség a tisztításhoz. A kívánt tennék etil-acetát és hexán elegyével készült oldatból gél formájában kiválik, amelyet elválasztunk és hexánnal mosunk. 3,0 g első hozadékot és 2,9 g második hozadékot kapunk.

A Boc-(D)Phe-Phe-boroOm-Cj ₀ H₁₆ .benzolszulfonsavat 5,37 g (7,82 mmól) megfelelő azidból állítjuk elő, a 4. példában lent módon. 5,33 g kívánt terméket kapunk, amelynek RP-TLC analízisével, metanol és víz 85:15 térfogatarányú elegyével futtatva egy intenzív ninhidrin-pozitív foltot kapunk, Rf értéke 0,42, és egy gyenge UV-foltot, Rf értéke 0,92 (a 0,92 Rf értékű UV-folt a benzolszulfonsav-só formájában lévő aminokra vagy guanidino-vegyületekre jellemző).

MS (FAB) aC3₇H₅₃N₄O₆B összegképlet alapján: számított+H: 661,76, talált: 661,14.

A Boc-(D)-Phe-Phe-boroArg-C₁₀H₁₆-ot az 5. példában leírtak szerint állítjuk elő. 4,83 g (5,90 mmól) megfelelő boroOm-peptidet 20 ml 50 mg/nú koncentrációjú abszolút etanolos cián-amid-oldattal kezelünk 7 napon keresztül. A reakcióelegy egy —1,0 g kiindulási anyagnak megfelelő—részét külön, visszafolyató hűtő alkalmazása nélkül melegítjük egy éjszakán keresztül, üy módon az amint teljes egészében guanidino-vegyületté alakítjuk. LH-20-οη végzett kromatográfiás tisztítás és a tennék éterrel való eldörzsölése után 0,52 g kívánt terméket kapunk.

Elemanalízis eredmények a C₄₄H₆₁N₆O₉SB öszszegképlet alapján:

számított: C: 61,38,Η: 7.16.N: 9,76,B: 1,25%, talált C:59,69,H:7,41,N:9,82,B: 1,26%.

MS (FAB) a C₃₈ H₅₅N₆O₆B összegképlet alapján: számított+H: 703,43, talált: 703,49.

12. példa

H-(D)-Pfte-Phe-boroArg-C ₁₀H₁₆.2HC1 előállítása

0,59 g (1,25 mmól) 11. példa szerint előállított Boc(D)Phe-Phe-boroArg-C ₁₀H₁₆.benzolszulfonsav védőcsoportját a 6. példa szerint távolítjuk el, azzal az eltéréssel, hogy a mintát 20 tömeg%-os etanolban visszük fel ioncserélő oszlopra, és az eluálást 20 tÖmeg%-os etanollal végezzük, 0,424 g cím szerinti vegyületet kapunk, fehér, szilárd anyag formájában.

MS (FAB) a Cj₃ H₄₇N₆O₄B összegképlet alapján: számított+H: 603,38, talált: 603,41.

13, példa

Ac-Ala-Lys(Boc)-boroArg-C ₁₀Hi₆. benzolszulfonsav előállítása

Az Ac-Ala-Lys(boc)-OH-t úgy állítjuk elő, hogy az

Ac-Ala-OH N-hidroxi-szukcinimid-észterét — amelyet Anderson és munkatársai [J. Am. Chem. Soc. 86, 1839 (1964)] eljárása szerint állítunk elő — ΗLys(Boc)-OH-val kapcsoljuk. 6,25 g (27,4 mmól) AcAla-OH-N-hidroxi-szukcinimid-észtert 30 ml dioxánban oldunk, és 7,50 g (30,4 mmól) H-Lys(Boc)-OH 30 ml 1,0 n nátrium-hidroxid-oldattal és 2,12 ml (15,0 mmól) trietil-aminnal készült oldatához adjuk. A reakcióelegyet egy éjszakán keresztül keverjük, majd hidrogén-kloriddal megsavanyítjuk. Az-oldathoz szilárd nátrium-kloridot adunk, amíg az oldat nátriumkloriddal majdnem telített lesz. A terméket etil-acetáttal extraháljuk és 0,2 n telített nátrium-klorid-oldattal készített hidrogén-klorid-oldattal mossuk A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk és szűrjük. Az oldószert bepárlással eltávolítjuk. A terméket etil-acetát és hexán elegyéböl kristályosítva 7,3 g kívánt terméket kapunk, olvadáspoútja 8689 ’C.

Az Ac-Ala-Lys(Boc)-NH-CH[(CH₂)₃Br]BC^Ci₀Hi₆-ot a 2. példában leírtak szerint állítjuk elő, azzal-az eltéréssel, hogy a terméket etil-acetátból frakcionált kristályosítással tisztítjuk.

A második és harmadik hozadékiként kapott 1,13 g kívánt termék RP-TLC analízisével, metanol és víz 85:15 térfogatarányú elegyével futtatva egyetlen foltot kapunk, amelynek Rf értéke 0,51. A TLC-lemezt hidrogén-klorid-gőznek tesszük ki és a kapott amint ninhidrines festéssel dekantáljuk.

1,95 g (2,90 mmól) megfelelő alkil-bromidból a 3. példa szerinti eljárással állítjuk elő az Ac-AlaLys(BOC)-NH-CH[(CH2)₃N₃]BC^-CjQHjg-ot, azzal az eltéréssel, hogy a terméket nem LH-20-οη kromatografálva tisztítjuk, hanem etil-acetátból végzett kristályosítással. 1,60 g nyerstermékből kristályosítással 0,55 g kívánt terméket kapunk, olvadáspontja 79-84 ’C; és 0,96 g maradékot. A kristályos termék analíziseredményei az alábbiak.

Elemanalízis eredmények a C₃₀H₅₂N₇O₇B összegképlet alapján:

számított C; 56,86, H: 8,29,N: 15,48,B: 1,71%, talált: C: 56,76, H: 8,26, N: 15,89,B: 1,65%.

Az Ac-Ala-Lys(Boc)-boroOm-C₁₀H₁₆.benzolszulfonsavat 0,433 g (0,683 mmól) megfelelő alkil-azidból állítjuk elő, a 4. példában leírt eljárással. A katalizátort és az oldószert ellávolítva 0,45 g kívánt terméket kapunk éteres eldörzsöléSsel.

MS 8FAB) a C₃₀H5₄N₅O₇B összegképlet alapján: számított +Η: 608,42, talált: 608,49.

Az Ac-Ala-Lys(Boc)-boroArg-C_löH₁₆.benzolszulfonvsavat úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő boroOmpeptidet az 5. példában leírták szerint cián-amiddal reagáltatjuk. A kívánt terméket tartalmazó kromatográfiás frakciókat éténél eldörzsölve 0,83 g kívánt terméket kapunk, fehér, sziláid anyag formájában.

Elemanalízis eredmények a C₃₇H₆₂N₇Oj₀BS öszszegképlet alapján:

számított: C: 55,00,H: 7,75,N: 12,14,B: 1,34%, talált: C: 54,09, H: 7,53, N: 12,22,B: 1,34%.

HU 205141 Β • 2

14. példa

Ac-Ala-Lys-boroArg-C _1OH_1Ő.2HC1 előállítása

0,200 g (0,248 mmól) Ac-Ala-Lys(Boc)-boroArgCi_QH₁₆.benzolszulfonsavból a védőcsoportot a 6. példában leírtak szerint távolítjuk el. Az ioncserélő gyantán való kromatografálás, az oldószer eltávolítása, vákuumban való szárítás és éteres eldörzsölés után 0,14 gkívánt terméketkapunk.

(MS (FAB) aCjö^gNjOsB összegképlet alapján: számított +H: 550,39, talált:550,42.

15. példa

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-C ioH₁₆. benzolszulfonsav előállítása

A Boc-Leu-Ala-OBzl-t a 2. példában a dipeptidek előállítására ismertetett eljárással állítjuk elő.

23,7 g (57,7 mmól) Boc-Leu-Ala-OBzl-t 40 ml vízmentes trifluor-ecetsavban oldunk. 15 perc múlva a trifluor-ecetsav feleslegét bepárlással eltávolítjuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. 22,8 g H-Leu-AlaOBzLtrifluor-ecetsavat kapunk, kristályos anyag formájában.

Elemanalízis eredmények a C₁₈H25N₂O₂F₃ öszszegképlet alapján:

számított: C:53,19,H:6,21,N:6,89%, talált: C: 53,37,H: 5,68,N: 6,84%.

A Boc-Gly-Leu-Ala-OBzl-t úgy állítjuk elő, hogy 5,70 g (32,6 mmól) Boc-Gly-OH-t H-Leu-Ala-OBzl< rel kapcsolunk, a 2. példában ismertetett vegyes anhidrides eljárással. 13,8 g terméketkapunk, amorf szilárd anyag formájában. A Boc-Gly-Leu-Ala-OBzl védőcsoportját trifluor-ecetsavval távolítjuk el, a HLeu-Ala-OBzI előállítására ismertetett eljárással, azzal az eltéréssel, hogy a kapott trifluor-ecetsavas só éterben oldódik. A terméket etíl-acetátban oldjuk és vízmentes hidrogén-kloriddal kezeljük. A kapott terméket éter hozzáadásával kicsapjuk. 7,7 g H-Gly-LeuAla-OBzl.HCl-t kapunk, első hozadékkénL

A Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-OBzl-t úgy állítjuk elő, hogy 2,62 g (10,5 mmól) Boc-Leu-OH-t kapcsolunk a H-Gly-Leu-Ala-OBzl-hez ,a 2. példában ismertetett vegyes anhidrides eljárással. A kapott terméket etilacetát és hexán elegyéből kristályosítjuk. 2,7 g kívánt terméket kapunk első hozadékként, olvadáspontja 95-96’C.

Elemanalízis eredmények a CiqH^NaOv összegképlet alapján:

számított C: 61,89, Η: 8,26, N: 9,96%, talált C: 62,00,H: 8,40,N: 9,83%.

A Boc-Leu-Gly-Ala-OH-t úgy állítjuk elő, hogy 2,6 g (4,62 mmól) megfelelő benzil-észtert a 2. példában leírtak szerint katalitikusán hidrogénezünk. 2,1 g kívánt terméket kapunk, amelyet forró etil-acetátból kristályosítunk. 1,4 g tiszta terméket kapunk.

Elemanalízis eredmények a C2₂H₄₀N₄O₇ összegképlet alapján:

számított C: 55,90, Η: 8,55, N: 11,86%, talált: C: 55,42, H: 8,47, N: 11,73%.

A Boc-Leu-Gly-Ala-NH-CH[(CH₂)₃Br]BC^C₁₀H₁₆-ot úgy állítjuk elő, hogy 1,40 g (2,96 mmól) Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-OH-t az la. példa szerint előállított aminnal kapcsolunk a 2. példában ismertetett eljárással, azzal az eltéréssel, hogy a kromatográfiás lépést elhagyjuk. Á terméket etil-acetát és hexán elegyéből kristályosítva 1,17 g kívánt terméket kapunk, amely TLC-vel metanol és kloroform 1:9 térfo gatarányú elegyével futtatva egyetlen foltot ad, Rf értéke 0,68.

Elemanalizis eredmények a C₃₆H₆₃N₅O₄BrB öszszegképlet alapján:

számított: C: 55,10%, H: 8,11,N: 8,93, B: 1,38%, talált- C: 5,96, H: 8,30, N: 8,74,B: 1,33%.

A megfelelő azidot a 3. példában leírtak szerint állítjuk elő, 97%-os hozammal, és a 4. példában leírtak szerint eljárva alakítjuk Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroOm-Ci₀H₁₆-tá. Analitikai minta előállítása céljából a terméket éterrel kicsapjuk, majd LH-20-szaI töltött oszlopon kromatografáljuk, és kloroformból, hexánnal újra kicsapjuk.

MS (FAB) aC₃₆H₆₅N₆O_gB összegképlet alapján: számított+H: 721,50, talált: 721,55.

A Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-C₁₀H_I6.benzolszulfonsavat az 5. példában leírtak szerint állítjuk elő. 0,695 g (0,791 mmól) megfelelő boroOrn-peptidet 5 ml 50 mg/ml koncentrációjú abszolút etanolos ciánamid-oldattal reagáltatunk. A kapott elegyet kromatografálva és éterrel eldőrzsölve 0,41 g kívánt termőket kapunk.

MS (FAB) aC₃₇H₆₇N₈O₈B összegképlet alapján: számított+H: 763,53, talált: 763,8.

16. példa

H-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-C ₁₀H₁₆. HCl.benzolszulfonsav előállítása

0,050 g (0,0543 mmól) 15. példa szerint előállított Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-C ιο^ΐό- benzolszulfonsavat 2 ml 4 n dioxános hidrogén-klorid-oldattal reagáltatunk 5 percen keresztül, szobahőmérsékleten. Az oldószert és a hidrogén-klorid feleslegét bepárlással eltávolítjuk. A maradékot kálium-hidroxid felett, vákuumban szárítjuk egy éjszakán keresztül, majd éterrel eldörzsöljük. 46 mg kívánt terméket kapunk, vegyes só formájában.

MS (FAB) aC₃₂H_5gN₈O₆B összegképlet alapján: számított+H: 663,47, talált: 663,50.

17. példa

Bz-Glu(OBu)-Gly-boroArg-C ιο^16· benzolszulfonsav előállítása

A Bz-Glu(OBu)-Gly-NH-CH[(CH₂)₃Br]BO,C₁₀H₁₆-ot úgy állítjuk elő, hogy a Bz-Glu(OBu)-GIyOH-t a 2. példában leírtak szerint a megfelelő aminhoz kapcsoljuk. A megfelelő azidot a 3. példában leírtak szerint állítjuk elő, és a megfelelő boroOm-peptidet a 4. példában ismertetett eljárással kapjuk.

MS (FAB) aC3₂H₄₉N₄O₇B összegképlet alapján:

HU 205141 Β számított +H: 613,38, talált: 613,60.

A cím szerinti terméket az 5. példában leírtak szerint állítjuk elő.

MS (FAB) a C₃₃ H₅₁N₆O₇B összegképlet alapján: számított+H: 655,40, talált: 655,37%.

Elemanalízis eredmények a C₃₉H5₇N₆O₁₀SB öszszegképlet alapján:

számított: C: 57,62, H: 7,08, N: 10,34, Β: 1,33%, talált: C; 57,43, H: 7,25, N: 9,91, B: 1,23%.

18. példa

Bz-Glu-Gly-boroArg-C ₁₀H₁₆ .benzolszulfonsav előállítása

0,13 g (0,16 mmól) Bz-Glu(OBu)-Gly-boroArgCj₀Hi₆.benzolszulfonsavat 5 ml dioxánban oldunk, hozzáadunk 0,10 g (0,66 mmól) benzolszulfonsavat és az oldatot szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül keverjük. Az oldatot ezután kb. 1 ml-re koncentráljuk bepárlással, majd éterrel eldörzsöljük. 0,14 g szilárd anyagot kapunk, amelyet 2,5 x 50 cm-es LH-20-töltetű oszlopon metanollal kromatografálunk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat bepárolva és a maradékot éterrel eldörzsölve 53 mg kívánt terméket kapunk.

MS (FAB)aC2₉H₄₃N₆O₇B összegképlet alapján: számított+H: 599,34, talált: 599,35+613,36 (nem azonosított).

18a. példa

Bz-Glu-Gly-BoroArg-C joH₁₆ .benzolszufonsav előállítása

0,20 g (0,246 mmól) a 17. példa szerint előállított Bz-glu(OBu)-Gly-boroArg-C₁₀H₁₆. benzolszulfonsavat a 6. példában leírtak szerint 45 percen keresztül vízmentes hidrogén-kloriddal kezelünk. Az anyagot éterrel eldörzsöljük, majd felvesszük az NMR-spektrumot. Az NMR-spektrum szerint a terc-butil-védőcsoport kb. 30%-a még mindig jelen van. A terméket ezután szobahőmérsékleten 45 percen keresztül vízmentes trifluor-ecetsawal reagáltatjuk. A trifluorecetsavat bepárlással eltávolítjuk és a maradékot éterrel éldörzsöljük. 143 mg cím szerinti terméket kapunk.

MS (FAB)aG2₉H₄₃N₆O₇B összegképlet alapján: számított+H: 599,34, talált: 599,35.

19. példa

Bz-Pro-Phe-boroArg-C ₁₀H₁₆ .benzolszulfonsav előállítása

A Bz-Pro-Phe-OH-t a 2. példában a dipeptidek előállítására ismertetett eljárással állítjuk elő, olvadáspontja 200-201 ‘C.

Elemanalízis eredmények a C₂iH₂₂N₂O₄ összegképlet alapján:

számított: C: 68,82,H: 6,06,N: 7,65%, talált: ‘ C:68,91,H:6,09,N:7,47%.

A Bz-Pro-Phe-NH-CH[(CH₂)₃Br]BOj-C₁₀H₁₆-ot úgy állítunk elő, hogy a Bz-Pro-Phe-OH-t a megfelelő aminhoz kapcsoljuk a 2. példában ismertetett eljárással, azzal az eltéréssel, hogy a kromatográfiás lépést elhagyjuk. A termék TLC analízise metanol és kloroform 1:9 térfogatarányű elegyével futtatva Rf 0,72 értéknél egy fő foltot ad, és Rf 0,86 értéknél nyomnyi mennyiségű anyag jelenlétére utal.

MS (FAB) aC₃₅H₄₅N₃O₅BBr összegképlet alapján: számított+H: 678,27 talált: 077,95.

Az alkil-halogenidet a 3. példában, leírtak szerint alakítjuk a megfelelő aziddá, amelyből a 4. példában leírtak szerint állítjuk elő a megfelelő boroOm-peptidet.

MS (FAB) a C₃₅H₄₇N₄O₅B Összegképlet, alapján (Bz-Pro-Phe-boroOm-C ₁₀H₁₆): ^A' számított+H: 615,37, talált: 615,42

A Bz-Pro-Phe-boroArg-C₁₀H₁₆ .benzolszulfonsavat az 5. példában ismertetett eljárással állítjuk elő.

MS (FAJB)aC₃₆H₄₉N₆O₅B összegképlet alapján: számított +H: 657,39, talált: 657,13.

Eiemanalízis eredmények a C₄₂H₅₅N₆O₈SB öszszegképlet alapján:

számított: C: 61,90,H: 6,82,N: 10,31, B: 1,33%, talált: C: 60,16, H: 7,27,N: 9,79, B: 1,44%.

20. példa

Bz-Pro-Phe-boroArg-OH.HCl előállítása

0,64 g (0,79 mmól) 19. példa szerint előállított BzPro-Phe-boroArg-C ₁₀H₁₆ .benzolszulfonsavat 4 ml metilén-kloridban oldunk, és az oldatot -78 ’-ra hűtjük. Az oldatot 4 ml 0,50 n bór-trildoridot tartalmazó lombikba öntjük, amelyet úgy állítunk elő, hogy 1,0 n bór-trikloridot (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA) 50%-ra hígítunk vízmentes metilén-kloriddal, szárazjég-fürdőn.

A kapott elegyet -78 ’C-on 5 percen keresztül keverjük, majd a lombikot 0 ’C-os jégfürdőre tesszük és az oldatot 15 percen keresztül keverjük. Lassan hozzáadunk 5 ml hideg vizet, majd az oldathoz 20 tömeg%-os ecetsawal 120 ml-re hígítjuk. A szerves fázist elválasztjuk és elöntjük. A vizes fázist 20 ml SPSephadex™ töltetű oszlopra visszük, amelyet 20 tömeg%-os ecetsavoldattal ekvilibráltunk. Az oszlopot kb. 150 ml 20 tömeg%-os ecetsavoldattal mossuk, majd 200 ml 20 tömeg%-os ecetsavból és 200 ml 0,30 n hidrogén-kloridot tartalmazó 20%-os ecetsavból kialakított lineáris gradienssel eluáljuk. A 0,08-0,15 n hidrogén-klorid-koncentrációnál elüálódó frakciókból kapjuk a kívánt terméket. Az oldószer elpárologtatása, a maradék vákuumban való szántása és éterrel való eldörzsölése után 0,19 g kívánt terméket kapunk.

MS (FAB)aC2₆H₃5N₆O₅B összegképlet alapján: számított+H: 523,29, talált: 579,34 (azonosítatlan).

Elemanalízis eredmények a C₂₆H₃₆O₅C1B összegképlet alapján:

számított: C: 53,29, H: 6,55, N: 14,34, B: 1,84%, talált: C: 53,27, H: 6,58,N: 13,25, B: 1,89%.

HU 205141 Β

A kapott terméket a 8a. példában leírtak szerint észterezzük pinándiollal. A kapott termék NMR- és MS-adatai azonosak a 19. példában kiindulási anyagként használt észterével.

MS (FAB)aCj₆H₄₉N₆O₅B összegképlet alapján: számított+H: 657,40 talált: 657,39.

21. példa

Bz-Pro-Phe-boroArg-FHCl előállítása [Bz-Pro-Phe-NH-CH[(CH₂)₃NH-C(NH)NH₂]BF₂.

HQ]

A Bz-Pro-Phe-boroArg-F-ot Kinder és munkatársai eljárásának [I. Med. Chem. 28, 1917-1925 (1985)1 módosított változatával állítjuk elő.

0,100 g (0,179 mmól) szabad boronsavat (20. példa vegyülete) 2 ml vízben oldunk. Az oldathoz szobahőmérsékleten 0,040 ml 48 t%-os hidrogén-fluoridot adunk. Szinte azonnal gumiszerű csapadék válik ki. A reakcióelegyet 10 percen keresztül keveqük, majd megfegyasztjuk és a hidrogén-fluorid és víz feleslegét vákuumban eltávolítjuk.

A maradékot metanolban oldjuk, koncentráljuk, és éterrel eldörzsöljük. 0,093 g terméket kapunk.

MS (FAB)aC₂₆H₃₃N₆O₃BF₂ összegképlet alapján: számított+H: 521(29, talált: 527,31 és egy másik, a szabad boronsavra jellemző tömegcsúcs.

Elemanalízis eredmények a C₁₆H₃₄N₆O₃BF₂.H₂O összegképlet alapján:

számított: C: 53,47, H: 6,25, N: 14,47,

B:1,86,F:6,54%, talált: C: 54,00, H: 6,40, N: 13,48,

B:l,95,F:7,06%.

22. példa

Boc-(D)Phe-Pro-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr előállítása

A borolrg az -NH-CH[(CH₂)₃S-C(NH)NH₂]BO₂csoportot jelenti, amelyben, a boroArg guanidinocsoportját izotiouróniumcsoport helyettesíti.

1,00 g (161 mmól) Boc-(D)Phe-Pro-NHCHjXCH^BrlBOj-CjQH^-ot (2. példa szerinti vegyület) 4 ml vízmentes etanolban oldunk, és hozzáadunk 0,37 g (4,82 mmól) tiokarbamidoL Az elegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten keveqük. Az oldatot koncentráljuk és a maradékot éterrel eldőrzsöljük.

0,58 g szilárd anyagot kapunk, amelyet 2,5x50 cmes LH-20 töltetű oszlopon metanolban kromatografálunk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk. 0(26 g terméket kapunk, amelyet éterrel eldöizsölünk.

0,150 g terméketkapunk, amorf, szilárd anyag formájában.

MS (FAB)aC₃₄H₅₃N₅O₆BS összegképlet alapján: számított+H: 670,38, talált: 670,39.

Elemanalizis eredmények a C₃₄H₅₃N₅O₆SBrB összegképlet alapján:

számított: C: 54,40, H: 7,13,N: 9,33, B: 1,44%, talált: C: 54,10, H: 7,39,N:9,27, B: 1,47%.

A fenti reakció termékeként kapott, éterben oldódó maradék főleg a kiindulási anyagból áll, amelyet hosszabb reakcióidőt választva izotiourónium-sővá alakíthatunk.

A fenti általános eljárást alkalmazzuk más izotiourónium-sók előállítására is, azzal az eltéréssel, hogy bizonyos esetekben a tiokarbamidot 4-szeres feleslegben alkalmazzuk, és a reakcióidő 3-4 nap.

23. példa

H-(D)Phe-Pro-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBrJHCl előállítása f,050 g (0,067 mmól) Boc-(D)Phe-Pro-boroIrgC₁₀H₁₆.HBr-ot (22. példa szerinti vegyület) 1 ml 4 n hidrogén-kloriddal reagáltatunk dioxánban, szobahőmérsékleten, 15 percen keresztül. Az oldószert elpárologtatjuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. 0,40 g cím szerinti vegyületet kapunk, fehér, szilárd anyag formájában.

MS (FAB) aCoo^eNrCbSB összegképlet alapján: számított+H: 571,29, talált: 570,47.

24. példa

Ac-Ala-Lys(Boc)-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr előállítása

0,700 g (1,04 mmól) 13. példa szerint előállított AcAla-Lys(Boc)-NH-CH[(CH₂)₃Br]BO₃-C₁₀H₁₆-ot 0,320 g (4,00 mmól) tiokarbamiddal reagáltatunk, 4 napon keresztül, 4 ml vízmentes etanolban. A terméket a 22. példában ismertetett módon tisztítjuk. A kromatográfiás tisztítás után 0,28 g kívánt terméket kapunk, amelyet éterrel eldörzsölünk.

0,173 g kívánt terméket kapunk, amorf, szilárd anyag formájában.

MS (FAB) aC_3í H₅₅N₆O₇SB összegképlet alapján: számított+H: 667,8, talált: 667.

Elemanalízis eredmények a C₃₁H₅₅N₆O₇SBrB összegképlet alapján:

számított C: 49,79, H: 7,56, N: 11,24,B: 1,44%, talált: C: 49,20, H: 7,62, N: 11,31,B: 1,36%.

25. példa

Ac-Ala-Lys-Borolrg-C _I0H₁₆.2HBr előállítása

0,050 g (0,067 mmól) Ac-Ala-Lys(Boc)-boroIrgCi₀H₁₆.HB^r-ot (24. példa szerinti vegyületet) 1 ml metanolban oldunk, és az oldaton 10 percen keresztül hidrogén-bromid-gázt buborékoltatunk keresztül. Az oldószert bepárlással eltávolítjuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük.

mg kívánt terméket kapunk, szilárd anyag formájában.

MS (FAB) aC₃₆H₄₇N₆O₅SB összegképlet alapján: számított+H: 567,35, talált: 567,41.

HU 205 141 Β

26. példa

Ac-Phe-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr előállítása

1,00 g , (2,41 mmól). Ac-Phe-NHCH[(CH₂)₃Br]BC^-C₁₀H₁₆-ot (9. példa szerint előállítva) 3-szoros feleslegben lévő tiokarbamiddal reagáltatunk 5 ml vízmentes etanolban, a 22. példában leírtak szerint. 0,284 g terméket kapunk, szilárd, amorf anyag formájában.

Az éterben oldódó anyagot ismét tiokarbamiddal reagáltatjuk és megismételjük a tisztítási műveletet, így további terméket kapunk.

MS (FAB) a C₂₆H₃₉N₄O₄SB összegképlet alapján: számított+H: 515,29, talált: 515,29.

Elemanaiízis eredmények a C₂₆H₃₉N₄O₄SB öszszegképlet alapján:

számított: C: 52,44, H: 6,79, N: 9,41, B: 1,82%, talált: C: 52,83,H: 6,89,N: 8,47,B: 1,85%.

27. példa

Bz-Pro-Phe-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr előállítása

0,500 g (0,737 mmól) Bz-Pro-Phe-NHCH[(CH₂)₃Br]BÓ_2i-C₁₀H₁₆-ot (19. példa terméke) a

22. példában leírtak szerint alakítunk cím szerinti vegyületté.

0,358 g cím szerinti vegyületet kapünk, fehér, szilárd anyag formájában.

MS (FAB) aC₃₆H₄₈N₅O₅SB összegképlet alapján: számított+H: 674,35, talált: 674,27.

Elemanalízis eredmények a C₃₆H₄₉N₅O₅SBBr Összegképlet alapján:

számított: C: 57,29, H: 6,56, N: 9,28, B: 1,43%, talált: C: 57,46, H: 6,45,N: 8,78,B: 1,38%.

28. példa

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr előállítása

0,770 g (0,980 mmól) Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-NHCH[(CH2)₃Br]BC^-C₁₀H₁₆-ot (15. példa szerinti vegyület) a 22. példában leírtak szerint alakítunk cím szerinti vegyületté.

A reakciótennék kromatográfiás tisztítása után 0,400 g kívánt terméket kapunk hexános eldörzsöléssel, fehér, szilárd anyag formájában.

MS (FAB) aC₃₇H₆₆N₇O₈SB összegképlet alapján: számított+H: 780,48, talált: 780,52.

Elemanalízis eredmények a C₃₇H₆₇N₅O₈SB öszszegképíet alapján:

számított: C: 51,62,H: 7,86,N: 11,39,B: 1,26%, talált: C:51,03,H:7,86,N: 11,14, B: 1,18%.

29. példa

H-Leu-Gly-Leu-Ala-boroIrg-C ι₀Η_1ή.2ΗΒτ előállása

0,100 g (0,12 mmól) Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroIrg-C₁₀H₁₆.HBr-t (28. példa szerinti előállított vegyületet) 1 ml metanolban oldunk, és hozzáadunk 1 ml 0,7 n hidrogén-bromidot metilén-kloridban. Az elegyet szobahőmérsékleten 15 percen keresztül keverjük. Az oldószert és a hidrogén-bromid feleslegét bepárlással eltávolítjuk, és a maradékot éterrel eldörzsöljük.

Kívánt terméket kapunk, közel 100%-os hozammal.

MS (FAB) aC₃₂H₅gN₇O₆SB összegképlet alapján: számított +H: 680,43, talált: 680,50.

30. példa

Bz-Glu(OBu)-Gly-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr előállítása

0,293 g (0,433 mmól) Bz-Glu(OBu)-Gly-NHCH[(CH₂)₃Br]BC^-[(CH₂)₃Br]-ot (17. példa szerinti terméket) a 22. példában leírtak szerint alakítunk cím szerinti izotiourónium-származékká.

0,220 g cím szerinti vegyületet kapunk.

MS (FAB) aC₃₃H₅₀N₅O₇SB összegképlet alapján: számított +H: 672,36, talált: 672,3.

Elemanaiízis eredmények a C₃₃H₅iN₅O₇SBBr összegképlet alapján:

számított: C: 52,66,H: 6,84, N: 9,31,B: 1,44%, talált: C: 52,38,H:6,76,N:8,81,B: 1,46%.

31. példa

Bz-Glu-Gly-borolrg-C ₁₀H₁₆.HBr előállítása

0,050 g (0,066 mmól) Bz-Glu(OBu)-Gly-boroIrgG₁₀H₁₆.HBr-t (30. példa szerinti terméket) 1 ml trifluor-ecetsavban oldunk, és az oldatot szobahőmérsékleten 1 órán keresztül keverjük. Hozzáadunk 0,35 mmól hidrogén-bromidot metilén-kloridban, és a kapott oldatból a folyadékot bepárlással eltávolítjuk. A maradékot éterrel eldörzsöljük.

mg cím szerinti vegyületet kapunk,

MS (FAB) aC₂oH₄₂N<0₇SB összegképlet alapján: számított+H: · 616,30, talált 616,34.

32. példa

Boc-(D)Phe-Phe-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr előállítása

1,50 g (2,07 mmól) 11, példa szérinti előállított Boc(D)Phe-Phe-NH-CH[(CH₂)₃Br]BO^-C₁₀H₁₆-ot a 22. példában leírtait szerint izotiourónium-száhnazékká,

0,90 g cím szerinti vegyületet kapunk.

MS (FAB) a C₃gH₅₄N₅O₆SB összegképlet alapján: számított +H: 719,84, talált: 720.

Elemanalízis eredmények a C_3gH₅₅N₅O₆SBBr összegképlet alapján:

számított: C: 56,99, H: 6,94, N: 8,75, B: 1,35%, talált: C: 55,89,H: 6,87, N: 8,59, B: 1,18%.

33. példa

H-(D)Phe-Phe-boroIrg-C ₁₀H_lő.2HBr előállítása

0,20 g (0,25 mmól) 32. példa szerint előállított Boc(D)Phe-Phe-boroIrg-C ₁₀H₁₆,HBr-t a 29. példában leírtak szerint hidrogén-bromiddal reagáltatunk.

188 mg cím szerinti vegyületet kapunk.

HU 205141 Β

MS (FAB) aC3₃H₄₆N₅O₄SB összegképlet alapján: számított+H: 620,34, talált: 620,40.

34. példa

Z-Phe-Gly-Gly-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr előállítása

A Z-Phe-Gly-Gly-NH-CH[(CH₂)₃Br]BO_iC₁₀H₁₆-ot úgy állítjuk elő, hogy Z-Phe-Gly-Gly-OHt az la, példa szerinti aminnal kapcsolunk, a 2. példában ismertetett eljárással.

Elemanalízis eredmények a C₃5H₄₆N₄O₇BBr öszszegképlet alapján:

számított: C: 57,93,H: 6,40,N: 7,72, B: 1,49%, talált: C:58,42,H:6,83,N:7,74,B: 1,96%.

1,00 g (1,38 mmól) alkil-halogenidet a 22. példában ismertetett módon alakítunk a megfelelő izotlourónium-származékká.

0,87 g cím szerinti vegyületet kapunk, fehér, amorf, szilárd anyag formájában.

MS (FAB) aC3₆H₄₉N₆O₇SB összegképlet alapján: számított+H: 721,36, talált:721,32.

Elemanalízis eredmények a C₃₆H₅₀N₆O₇SBBr összegképlet alapján:

számított· C: 54,00,H: 6,31,N: 10,50,B: 1,35%, talált: C: 53,17, H: 6,50,N: 10,03, B: 1,25%.

35. példa

Boc-Ala-Phe-(DL)boroIrg-C ₆H₁₂.HBr előállítása

A Boc-AIa-Phe-OMe-t a 2. példa szerinti vegyes anhidrides eljárással állítjuk elő.

Elemanalízis eredmények a ε₁₈Η₂₆Ν₂Ο₅ összegképlet alapján:

számított: C: 61,70, H: 7,48, N: 7,99%, talált: C:61,51,H:7,56,N:7,92%.

A metil-észtert bázissal hidrolizálva 56%-os hozammal Boc-Ala-Phe-OH-t kapunk.

A Boc-Ala-Phe-NH-GH[(CH₂)₃Br]BO₂-C₆H₁₂-t úgy állítjuk elő, hogy a Boc-Ala-Phe-OH-t az lb. példa szerinti b®₂-CH[(CH₂)3Br]BO_i-C₆H₁₂-rel kapcsoljuk, a 2. példa szerinti eljárással, azzal az eltéréssel, hogy az LH-20-οη végzett kromatográfiás lépést elhagyjuk.

1,00 g (1,72 mmól) Boc-Ala-Phe-NHCHKCH^BrjBC^-CgH^-t a 22. példában leírtak szerint tiokarbamiddal reagáltatva 0,485 g izotiourónium-származékot kapunk, fehér szilárd anyag formájában.

MS (FAB)aC₂₈H₄₆N₅O₆SB összegképlet alapján: számított+H: 592,33, talált 592,60.

Elemanalízis eredmények a C^₈H₄₇N₅O₆SBBr összegképlet alapján:

számított C: 50,00, H: 7,06,N: 10,41,B: 1,61%, talált: C:49,50,H: 7,24, NT: 10,22, B: 1,41%.

36. példa

H-Ala-Phe-(DL)boroIrg-C ₆H₁₂.2HBr előállítása

0,10 g (0,149 mmól) 35. példa szerint előállított Boc-Ala-Phe-boroIrg-C ₆H₁₂.HBr-t a 29. példában leírt módon hidrogén-bromiddal reagáltatva közel 100%-os hozammal kapjuk a cím szerinti vegyületet.

MS (FAB) aC2₃H₃₈N₅O₆SB Összegképlet alapján: számított+H: 492(28, talált· 492,26.

37. példa

Boc-Ala-Phe-(DL)boroHomoIrg-C ₆H₁₂HBr (Boc-Ala-Phe-Í®-CH[(CH₂)₄S-C(NH)NH₂]BO₂C₆H₁₂.HBr)

A 35. példa szerint előállított Boc-Ala-Phe-OH-t az ld. példa szerinti aminnal kapcsolva kapjuk a BocAla-Phe-NH-CH[(CH₂)₄Br]BC^-C₆H₁₂-t. A kapcsolást a 2. példában leírtak szerint végezzük, azzal az eltéréssel, hogy a tisztításhoz nem szükséges az LH-20on végzett kromatográfiás lépés. Analitikai tisztaságú mintát kapunk szilikagélen végzett kromatográfiával, az eluálást etil-acetáttal végezve.

MS (FAB) aC2₈H₄₅N₃O₆BrB összegképlet alapján: számított +H: 610,27, talált: 610,24.

Elemanalízis eredmények a C2_gH₄₅N₃O₆BrB öszszegképlet alapján:

számított: C: 55,19, H: 7,28, N: 6,90,

Br:13,ll,B:l,78%. talált: C: 55,30, H: 7,39,N: 6,40,

Br: 12,07,B: 1,95%.

0,537 g (0,883 mmól) fenti alkil-bromidot a 22. példában leírtak szerint tiokarbamiddal reagáltatunk.

Éteres eldörzsölés után 0,23 g terméket kapunk, fehér, amorf, szilárd anyag formájában.

MS (FAB) a H₄₈N₅O₆S összegképlet alapján: számított+H: 606,35, talált: 606,38.

Elemanalízis eredmények a C₂9H₄₉N₅O₆SBBr összegképlet alapján:

számított: C: 50,73,H: 7,21,N: 10,20,B: 1,57%, talált: C: 50,22, H: 7,46, N: 9,74, B: 1,55%.

38. példa

H-Ala-Phe-(DL)boroHomoIrg-C ₆H₁₂.2HBrelőállítása

0,050 g (0,073 mmól) 37. példa szerint előállított Boc-Ala-Phe-(DL)boroHomoIrg-C₆H₁₂.HBr-ot a 29. példában leírtak szerint hidrogén-bromiddal reagáltatunk.

mg kívánt terméket kapunk.

MS (FAB)aC5₄H_4nNrO₄SB összegképlet alapján: számított+H: . 506,30, talált: 506,39.

39. példa

Boc-Ala-Phe-(DL)boroLys-C ₆H₁₂.BSAelőállítása |Boc-Ala-Phe-NH-CH[(CH₂)₄NH2]BOj-C₆H₁₂.b enzolszulfonsav]

A 35. példa szerint előállított Boc-Ala-Phe-NH22

HU 205141 Β

CH[(CH₂)₄Br]BO_z-C₆H₁₂-t a 3. példában leírtak szerint alkil-aziddá alakítjuk, azzal az eltéréssel, hogy az LH-20-οη végzett kromatográfiás lépés nem szükséges a tisztításhoz.

Az azidot a '4. példában leírtak szerint hidrogénezzük, azzal az eltéréssel, hogy 2 ekvivalens benzolszulfonsavat használunk, és a hidrogénezést 2 órán keresztül folytatjuk,

A kívánt terméket 40%-os hozammal kapjuk, olvadáspontja 154-160 °C (bomlás közben).

MS (FAB)aC₂₈H₄₆N₄Ó₆B Összegképlet alapján: számított+H: 547,38, talált 547,43.

40. példa

H-Ala-Phe-(DL)-boroLys-C ₆H₁₂. TFA.benzolszulfonsav előállítása

A 39. példa szerint előállított Boc-Ala-Phe-(DL)boroLys-C ₆H₁₂ .benzolszulfonsavat. szobahőmérsékleten 1 őrén keresztül trifluor-ecetsavval reagáltatjuk. Az oldószert elpárologtatjuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük.

A kívánt terméket szilárd anyag formájában kapjuk.

MS (FAB) aC₂₃H₃₉N₄O₄B összegképlet alapján: számított +H: 447,31, talált: 447,31.

Elemanalízis eredmények a

C₃₁ H₄₆N₄O₉SF₃B.2Hj,O összegképlet alapján: számított: C:49,34,H:6,68,N:7,42,B: 1,43%, talált: C: 49,26, H:5,94, N: 7,12, B: 1,34%.

41. példa

Boc-(D)Vcd-Leu-boroLys-C ₆H₁₂. benzolszulfonsav előállítása

A Boc-(D)Val-Leu-OH-t a 2. példában ismertetett eljárással állítjuk elő. A benzil-észtert 76%-os hozammal kapjuk,

MS (FAB)aC2₃H₃₆N₂O₅ összegképlet alapján: számított+H: 421,27, talált: 421,38.

A megfelelő szabad savat hidrogénezéssel állítjuk elő, a hozam 100%, A tennéket fehér, kristályos anyag formájában kapjuk.

Elemanalízis eredmények a C₁₆H2^N₂O₅ összegképlet alapján:

számított· C: 59,34, H: 8,87, N: 8,50%, talált: C: 59,34, H: 8,87,N: 8,50%.

A Boc-(D)Val-Leu-OH-t az ld. példa szerint előállított aminnal kapcsoljuk, a 37. példában a Boc-AlaPhe-OH kapcsolására ismertetett eljárással.

Boc-^Val-Leu-NH-CHKCH^BrJBOj-CgH^-t kapunk, a hozam 97%.

MS (FAB) aC₂₇H₅₁ N₃O₆BBr Összegképlet alapján: számított+H: 604,31, talált: 604,31.

Az alkil-bromidot a 3. példában ismertetett eljárással alakítjuk a megfelelő aziddá, a hozam 85%.

Az azidot a 39. példában leírtak szerint hidrogénezve kapjuk a kívánt terméket, fehér, szilárd anyag formájában, a hozam 62%.

MS (FAB) a C₂₇ H_S3 N₄O₆B összegképlet alapján: számított+H: 541,41, talált: 541,46.

Elemanalízis eredmények a

C₃₃H₅₉N₄O₉SB.1,5%O összegképlet alapján: számított: C: 54,62, H: 8,61, N: 7,73, B: 1,49%, talált: C: 54,58,H: 8,59,N: 7,92,B: 1,98%.

42, példa

Ac-Phe-boroLys-C ₆H₁₂.benzolszulfonsav előállítása

A cím szerinti vegyületet a 39. példában leírtak szerint állítjuk elő.

Az Ac-Phe-NH-CH[(GH₂)₄Br]BOj-G₆Hi₂-t 72%os hozammal állítjuk elő.

MS (FAB) a C₂₂H₃₄N₂Ö₄BBx összegképlet alapján: számított +H: 481,00, talált: 481,21.

Az azidot 57%-os hozammal kapjuk, amelyből a cím szerinti terméket 50%-os hozammal állítjuk elő.

MS (FAB) aC22H₃₇N₃O₄B összegképlet alapján: számított+H: 418,29, talált: 418,31.

Elemanalízis eredmények a C₂₉H₄₂N₃O₇SB.í^O összegképlet alapján:

számított: C: 56,66, H: 7,47, N: 7,08, B: 1,82%, talált: C: 56,88, H: 7,43, N: 7,22, B: 1,53%.

43. példa

Bz-(DL)boroIrg-C ₆H₁₂.HBr előállítása

A Bz-(DL)-NH-CH[(GH₂)₃Br]Bq_z-C₆H₁2-öt úgy állítjuk elő, hogy az lb. példa szerint előállított amin 5,0 g-ját (15,9 mmól) ekvivalens mennyiségű benzoilkloriddal és két ekvivalens mennyiségű nátrium-hidrogén-karbonáttal reagáltatjuk 4 ml dioxán és 4 ml víz elegyében, 0 °C-on, A reakcióelegyet keverjük, majd 6 ml 50 t%-os dioxán-víz eleggyel hígítjuk, és szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni. A reakcióelegyet közelítőleg 30 percen keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd a terméket etil-acetáttal extraháljuk, vízzel, 0,2 n hidrogén-klorid-oldattal, 5 tömeg%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és telített, vizes nátrium-klorid-oldattal mossuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük és bepároljuk.

A kapott kristályos anyagot elválasztjuk és etil-acetáttal mossuk.

3,26 g kívánt terméket kapunk, olvadáspontja 176177 °C.

1,00 g (2,62 mmól) fenti alkil-halogenidet a 22. példában leírtak szerint alakítunk a megfelelő izotiourónium-származékká.

0,84 g tennéket kapunk, fehér, szilárd anyag formájában.

MS (FAB)aC₁₈H₂₈N3O₃SB összegképlet alapján: számított+H: 378,20, talált: 378,21.

Elemanalízis eredmények a C₁₈H₂₈N₃O₃SB öszszegképlet alapján:

HU 205141 Β számított: C: 47,18,Η: 6,38,N:9,17, B: 2,36%, talált: C:46,11,H: 6,71,N: 8,97,B: 2,22%.

44. példa

Bz-(DL)boroArg-C ₆H₁₂.benzolszulfonsav előállítása

2,0 g (5,25 mmól) 43. példa szerinti alkil-halogenidet a 3. példában leírtak szerint aziddá alakítunk. 0,97 gterméketkapunk, olvadáspontja 138-139 ’C.

Az azidot a 4. példában leírtak szerint közel 100%os hozammal alakítjuk a megfelelő Bz-boroOmC₆Hi₂.benzolszulfonsawá.

MS (FAB)aC₁₈H₂₇N₂O₃B összegképlet alapján: számított+H: 319,22, talált: 319,26.

0,90 g (1,84 mmól) Bz-boroOm-C_gH₁₂.benzolszulfonsavat az 5. példában leírtak szerint cián-amiddal reagáltatva 0,65 g kristályos terméket kapunk, olvadáspontja 242-244 ’C. .

MS (FAB) aC₁₈H₂₉N₄O₃B összegképlet alapján: számított +H: 361,24, talált 361,24.

Elemanalízis eredmények a C2₄H₃₅N₄O₆SB öszszegképlet alapján:

számított C: 55,59, H: 6,82,N: 10,81, B: 2,08%, talált C: 54,60, H: 6,70, N: 11,24,B: 1,87%.

45. példa

Ac-Leu-Thr(OBu)-boroArg-C ₁₀H₁₆. benzolszulfonsav előállítása

Az Ac-Leu-Thr(OBu)-OH-t úgy áUítjuk elő, hogy az Ac-Leu-OSu-t H-Thr(OBu)-OH-hoz kapcsoljuk, a

13. példában leírtak szerint, azzal az eltéréssel, hogy a végterméket LH-20-οη végzett kromatográfiás tisztítás után amorf, fehér, szilárd anyag formájában kapjuk.

3,29 g (9,90 mmól) Ac-Leu-Thr(OBu)-OH-t az la. példa szerinti aminnal kapcsolunk, a 2. példában ismertetett vegyes anhidrides eljárással, azzal az eltéréssel, hogy az LH-20-οη végzett kromatográfiás lépést elhagyjuk. 5,39 g Ac-Leu-Ihr(OBu)-NHCHKCH^BrjBOj-C^Hig-ot kapunk, fehér, amorf anyag formájában.

A kapott alkil-halogenidet a 3. példában leírtak szerint alakítjuk a 82%-os hozammal a megfelelő aziddá, azzal az eltéréssel, hogy a további tisztításhoz nincs szükség kromatográfiás lépésre.

3,88 g (6,42 mmól) azidot a 4. példában leírtak szerint hidrogénezünk. Az Ac-Leu-Thr(OBu)-boroOmC₁₀H₁₆ .benzolszulfonsav terméket LH-20-οη végzett kromatográfiás tisztítás és éteres eldörzsölés után 74%-os hozammal kapjuk.

MS (FABJaC^HjjN.^OgB összegképle alapján: számított+H: 579,43, talált: 579,48.

A boroOm-peptidet az 5. példában ismertetett eljárással alakítjuk végtermékké, a hozam 86%.

MS (HAB) aC₃₁H₅₇N₆O₆B összegképlet alapján: számított+H: 621,45, talált: 621,50.

Elemanalizis eredmények a C₃₇H₆₃N₆SO^B Öszszegképlet alapján:

számított: C:57,05,H:8,17,N: 10,79,B: 1,39%, talált: C: 56,47,H: 8,01,N: 10,93,B: 1,34%.

46. példa

Ac-Leu-Thr-boroArg-C ₁₀Hi₆ .benzolszulfonsav előállítása

0,200 g (0,257 mmól) 45. példa szerint előállított Ac-Leu-Thr(OBu)-boroAig-C k)H₁₆. benzolszulfonsavat 2 ml metilén-klorid és 2 ml 4 n dioxános hidrogén-klorid elegyében oldunk, és az elegyet szobahőmérsékleten 30 percen keresztül keverjük. Az oldószert elpárologtatjuk és a maradékot nagyvákuumban szárítjuk. A kívánt terméket éteres eldörzsöléssel fehér, szilárd anyag formájában kapjuk, a hozam 97%.

MS (FAB)aC₂₇H₄₉N₆O₆B összegképlet alapján: számított +Η: 565,39, talált: 565,48.

47. példa

Ac-Lys(Boc)-Pro-boroArg-C ioHiő· benzolszulfonsav előállítása

A 13. példában leírtak szerint állítjuk elő az AcLys(Boc)-Pro-OH-t A terméket etil-acetátból átkristályosítva fehér, szilárd anyag formájában kapjuk, olvadáspontja 160-161,5 ’C.

3,15 g (8,18 mmól) Ac-Lys(Boc)-Pro-OH-ta2. példában leírtak szerint eljárva az la. példa szerinti aminnal kapcsolunk. 5,8 g terméket kapunk, amelyet további tisztítás nélkül felhasználunk a következő reakciólépésben.

A fenti terméket a 3. példában leírtak szerint alakítjuk a megfelelő aziddá, a hozam LH-20-οη végzett kromatografálás után 73%.

Az azidot a 4. példában leírtak szerint hidrogénezve, LH-20-οη kromatografálva, majd éterrel eldörzsölve Ac-Lys(Boc)-Pro-boroOrn-C₁₀H₁₆.benzolszulfonsavat kapunk, a hozam 81%.

MS (FABJaC-jnHcrNcO^B összegképlet alapján: számított+H: 634,43, talált: 634,46.

2,0 g (2,53 mmól) boroOm-peptidet az 5. példában ismertetett módon reagáltatunk cián-amiddal. 1,8 g kívánt terméket kapunk, fehér, szilárd anyag formájában.

MS (FAB) a C^ H_S7N₇O₇B összegképlet alapján: számított+H: 676,46, talált: 676,41.

Elemanalízis eredmények a C^H^N-yO^BS öszszegképlet alapján:

számított· C: 56,23,H: 7,64,N: 11,77, B: 1,30%, talált: C: 56,06, H: 7,48, N: 11,75,B: 1,22%.

48. példa

Ac-Lys-Pro-boroArg-C _1OH₁₆.2HC1 előállítása

0,30 g (0,360 mmól) 47. példa szerint előállított AcLys(Boc)-Pro-boroArg-C ₁₀ H₁₆-benzolszulfonsavat jégecet és 4 n dioxános hidrogén-klorid 50:50 térfogatarányú elegyével reagáltatunk, szobahőmérsélde24

HU 205141 Β ten, 15 percen keresztül. Az oldószert elpárologtatjuk és a maradékot vákuumban szárítjuk. A maradékot vízben újraoldjuk, és 5 ml Agl-X8 (Cl'-forma) töltetű oszlopon átfolyatjuk. A mintát bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük.

230 mg kívánt terméket kapunk, fehér, szilárd anyag fonnájában.

MS (FAB) aC2gH₄₉N₇O₅B összegképlet alapján: számított+H: , 576,40, talált: 576,45.

49. példa

Ac-Ála-Glu(OBu)-boroArg-C ₁₀H₁₆. benzolszulfonsav előállítása

Az Ac-Ala-Glu(OBu)-OH-t a 13. példában leírtak szerint állítjuk elő, Ac-Ala-OSu és H-Glu(OBu)-OH kapcsolásával. A terméket etil-acetát és hexán elegyéből kristályosítjuk, olvadáspontja 147,5-148 °C.

Elemanalízis eredmények a Ci₄H₂₄N₂O₆ összegképlet alapján:

számított: C: 53,14, H: 7,66,N: 8,85%, talált: C: 53,28, H: 7,53, N: 9,08%.

Az Ac-Ala-Glu(OBü)-NH-CH[(CH₂)₃Br]BC^C₁₀H₁₆-ot a 2. példában leírtak szerint állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy szerves fázisként etil-acetát helyett kloroformot használunk a reakcióelegy kezdeti feldolgozására, és az LH-20-οη végzett kromatográfiás lépést elhagyjuk. A kívánt terméket részben kristályos anyag formájában kapjuk a szerves fázis elpárologtatása után, a hozam 87%.

Az alkil-bromidot a 3. példában leírtak szerint alakítjuk megfelelő aziddá. A nyersterméket kloroformból kristályosítva 50%-os hozammal kapjuk a kívánt terméket, olvadáspontja 163,5-166 ’C.

Elemanalízis eredmények a összegképlet alapján:

számított: C: 53,51, H: 7,55,N:6,69,B: 1,73%, talált: C:55,51,H:7,50,N:6,50,B;l,66%.

A boroOm-peptidet a 4. példában leírtak szerint állítjuk elő, a kívánt termék hozama 79%.

MS (FAB) aC_2S H_4QN₄O₇B összegképlet alapján: . számított +H:565,38,⁴ talált:565,51.

A kívánt végterméket az 5. példában ismertetett eljárással állítjuk elő, fehér, szilárd, amorf anyag formájában, a hozam 70%.

MS (FAB)aC₂₉H₅₁ N₆O₇B összegképlet alapján: számított +H:607,40, talált:607,41.

Elemanalízis eredmények a C₃₅H₅₇N₆O₁₀BS ősz? szegkéület alapján:

számított C: 54,96, H: 7,53, N: 10,99, B: 1,41%, talált: C: 54,36, Η: 7,71,N: 11,27, B: 1,21%..

50. példa

Ac-Ala-Glu-boroArg-C ₁₀H₁₆ .benzolszulfonsav előállítása

0,10g(0,131 mmól) 49. példa szerint előállított AcAla-Glu(OBu)-boroArg-C ₁₀H₁₆ .benzolszulfonsavat 10 ml ecetsavban oldunk, és az oldatba 20 percen keresztül vízmentes hidrogén-kloridot buborékoltatunk. Az oldatot szobahőmérsékleten 1,5 órán keresztül keverjük, és az oldószert elpárologtatjuk. A kapott olajat vákuumban szárítva és éterrel eldörzsölve 82 mg kívánt terméket kapunk, fehér, szilárd anyag formájában.

MS (FAB)aC₂₅ H₄₃N₆O₇B összegképlet alapján: számított +H: 551,34, talált: 551,41.

Lényegében a 39. és 40. példában leírtak szerint eljárva állítjuk elő az alábbi vegyületeket is:üá

	Összegképlet	Tömegspektrometriás adatok Móltömeg talált	számított
Boc-Val-Val-boroLys-C 6HI2 .BSA	^26^2^4θ6®	527,4	527,53
H-Val-Val-boroLys-C 6Hi2.BSA.TFA	C2jH44N4O4B	426,34	427,34
Boc-(D)Phe-Phe-boroLys-C 6H12.BSA	^34^2^4θ6®	623,4	623,52
H-(P)Phe-Phe-boroLys-C 6H19.BSA.TFA	C29H44N4O4B	522,34	523,34
Boc-Glu-Phe-boroLys-C 6H12.BSA	C3oH49N4OgB	604,37	. 604,45
PyroGlu-Phe-boroLys-C 6H12.BSA	^25Η40^4θ5®	487,3	487,39
H-(D)Val-Leu-boroLys.C fiH19 .BSA.TFA	C99H43N4B	440,35 ·	440,36

Biológiai példák 51-71. példa

Humán plazma kallikrein gátlása A humán plazma kallikreint a Protogen AG-tól (Svájc) szereztük be. A gyártó által megadott fajlagos aktivitás 15 egység/mg. 1 egység alatt az enzim azon mennyiségét értjük, ami 1 gmól szubsztrát, vagyis H(D)Pro-Phe-Ag-p-nitro-anilid (Kabi S2302) hidrolizálásához szükséges, 1 perc alatt, 0,5 mmól/l szubsztrátkoncentráció mellett, 25 ’C-on, 50 mmól/l koncentrációjú kálium-foszfátpuffer-oldatban, pH 8,0 értéken.

Az enzimből 1 egység/ml koncentrációjú törzsoldatot készítünk, 0,20 mól/1 nátrium-kloridot és 0,1 tömeg% PEG 6000-et (polietilénglikolt) tartalmazó 50 tömeg% glicerint-0,10 mól/1 nátrium-foszfát-puffer (pH7,5) eleggyel.

A standard vizsgálati eljárásban 10 μΐ kallikreintörzsoldatot adunk 25 ’C-on 990 μΐ oldathoz, amely 0,20 mől/1 nátrium-kloridot és 0,1 tömeg% PEG-et tartalmazó 0,10 mmől/1 koncentrációjú nátrium-fosz25

HU 205141 Β fát pufferben (pH 7,5/0,20 mmól/l S2302-ből áll. Az inhibitorok hatását az enzimaktivitás mérésével értékeljük ki, az enzimaktivitást az abszorpció növekedésének mérésével határozzuk meg, 405 nm-en, az idő függvényében, az inhibitor jelenlétében vagy távollétében. Az 1. táblázatban megadjuk az inhibitor-koncentrációkat és a reakció kezdetétől számított 1020 percen belüli időközben mérhető maradék aktivitást. A kontrollok aktivitása 0,0092 ± 0,0095 perc⁴.

1. táblázat: Humán plazma kallikrein gátlása

Példa száma	Inhibitor	Konc. (nmól/1)	Aktivitás (%)
51.	Boc-(D)Phe-Phe-boroIrg-C 10H16.HBr	10	2
52.	H-(D)Phe-Phe-boroArg-C 1OH16.2HC1	10	2,6
53.	Bor-(D)Phe-Phe-boroArg-C 10H16.BSA	10	5,2
54.	Boc-Ala-Phe-(P JL)boroIfg-C 6H12 .HBr	10	15
55.	Bz-Pro-Phe-boroArg-C 10H16.BSA	10	15
56.	Bz-Pro-Phe-boroArg-OH.HCl	10	16
57.	Bz-Pro-Phe-boroArg-E	10	18
58.	Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-C 10H16.BSA· .	10	30
59.	Ac-Ala-Lys(Boc)-boroArg-C 10H16 .BSA	10	34
60.	Ac-Phe-bóroArg-C 1OH16.HC1	10	48
61.	Ac-(D)-Phe-Pro-boroArg-C 1OH16.HC1	10	56
62.	H-(D)PHe-Pro-boroArg-C 1OH16.2HC1	10	61
63.	Ac-Ala-Lys(Boc)-boroIrg-C 10H16.HBr	50	1,4
64.	Bz-Glu(OBu)-Gly-boroArg-CI0H16.BSA	50	11
65.	Ac-Phe-boroIrg-C 10H16.HBr	50	17
66. .	Bz-GIu-Gly-boroArg-C 10H16.BSA	50	39
67.	Ac-Ala-Lys-boroArg-C 1OH16.2HC1	50	39
68,	Boc-Ala-Phe-(D,L)borohomoIrg-C 6H12.HBr	100	38
69.	Boc-Ala-Phe-(D,L)boroLys-C 6H12.HCI	1000	17
70.	Boc-(D)Phe-Phe-boroOm-C 10H16.BSA	10000	39
71.	Boc(D)Phe-Pro-boroOm-C ,nH,fi.BSA	10000	100

72-110. példa

Trombin (észteráz aktivitás) gátlása A humán trombint (fajlagos aktivitása 2345 NIH egység/mg) az R.Q.P. Laboratories (South Bend, IN, USA) állította elő (Lót HT102). A trombin-törzsoldatot0,75 mól/I nátrium-kloridot tartalmazó 0,010 mól/l koncentrációjú PIPES-pufferrel (pH 6,0) készítjük. A trombin-vizsgálatokat Green és Shaw [Anal. Biochem. 93,223 (1979)] módszere szerint végezzük, 0,20 mól/l nátrium-kloridot és 0,1 tömeg% PEG 6000-et tartalmazó nátrium-foszfát-pufferben (pH 7,5). A szubsztrát kezdeti koncentrációja 0,10 mmól/1, és a Kombin koncentrációja 1,0 nmól/I (tömeg alapján). Az inhibitor-koncentrációkat és a reakció kezdetétől számított 10-20 percen belüli időközben mért maradék aktivitásokat a 2. táblázatban foglaljuk össze. A trombin aktivitása a kontroliokban 0,0076 ± 0,0005 perc'¹.

2. táblázat: Trombin gátlása

Példa	Inhibitor	Konc.	Aktivitás
száma		(nmól/1)	(%)
72.	Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-C 1OH16.HC1	5	1
73.	Boc-(D)Phe-Pro-boroIrg-C 10H16.HBr	5	3
74.	Boc-(D)Phe-Pro-boroArg-C 10H16.BSA	5	3
75.	Ac-(D)-Phe-Pro-boroArg-OH.HCl	5	3

76. H-(D)Phe-Pro-boroIrg-C ₁₀H₁₆.HBr.HCl

77. H-(D)Phe-Pro-boroArg-C _1OH₁₆.2HC1

78. Boc-(D)Phe-Phe-boroIrg-C _I0H₁₆.Br

79. H-(D)Phe-Phe-boroArg-C _1OH₁₆.2HC1

80. H-Leu-GIy-Leu-Ala-boroArg-C _1OH₁₆.HC1.BSA

81. Boc-(D)Phe-Phe-boroArg-C ₁₀H₁₆.BSA

5	4
5	7
5	48
10	10
10	25
10	32

HU 205141 Β

2. táblázat folytatása:Trombin gátlása

Példa száma	Inhibitor	Konc. (nmól/l)	Aktivitás (%)
82.	H-Leu-Gly-Leu-Ala-boroIrg-C 10H16.2HBr	10 '	37
83.	Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-C 10H16 .BSA	10	38
84.	H-(D)Phe-Phe-boroIrg-C 10H16.2HBr	10	49
85.	Bz-Glu(OBu)-Gly-boroArg-C10H16.BSA	10	52
86.	Bz-Glu(OBU)-Gly-boroIrg-C 10H16.HBr	10	59
87.	Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-borofrg-C 10Hi6 .HBr	10	66
88.	Boc-(D)Phe-Pro-boroOm-C i0H16.BSA	100	18
89.	Ac-Ala-Lys(Boc)-boroArg-C 10Hi6.BSA	100	18
91.	Bz-Glu-Gly-boroArg-C 10H16.BSA	100	46
92.	Ac-Ala-Lys(Boc)-boroIrg-C 10H16.HBr	100	55
93.	Bz-Pro-Phe-boroArg-OH.HCl	1000	18
94.	Bz-Pro-Phe-boroArg-F	1000	18
95.	Bz-Pro-Phe-boroIrg-C 10H16.HBr	1000	21
96.	Boc-(D)Val-Leu-boroLys-C 6H12 .HC1	1000	21
97.	Bz-Pro-Phe-boroArg-C 10H16.BSA	1000	24
98.	Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroOm-C 10H16 .BSA	1000	24 z
99.	Boc-Ala-Phe-(DJL)boroIrg-C 6H12.HBr	1000	24
100.	Bz-GIu-Gly-boroIrg-C 10H16.HBr	1000	39
101.	Ac-Ala-Lys-boroArg-C 10Hj6.2HC1	1000	45
102.	Ac-Phe-boroArg-C 1OH16.HC1	1000	53
103.	Ac-Phe-boroIrg-C 10H16.HBr	1000	64
104.	Ac-Ala-Lys-boroIrg-C 10H16.2HBr	1000	68
105.	H-Ala-Phe-(DU)boroIrg-C 6H12.2HBr	10000	23
106.	Boc-Ala-Phe-(DJL)borohomoIrg-C 6Hi2 .HBr	10000	. 32
107.	Bor-Ala-Phe-(D,L)boroLys-C 6H12 .HC1	1000	46
108.	H-Ala-Phe-(DU)boroHomoIrg-C 6H12.2HBr	1000	47
109.	H-Ala-Phe-(DU)boroLys-C6H12.2HCl κ	10000	89
110.	Ac-Phe-boroLys-C fiH19.HCl	10000	97

111-124. példa

Véralvadás gátlása APTT és PT meghatározás szerint

A proteáz-inhibitorok véralvadásra kifejtett hatását in vitro úgy határozzuk meg, hogy mérjük azok hatását két különböző klinikai paraméterre, az aktivált részleges tromboplasztin-időre (APTT) és protrombin-időre (PT).

A fenti vizsgálatokhoz szükséges reagenseket a General Diagnostics (Jessup Md, USA) állítja elő.

Az inhibitorokból 0,10 mól/l nátrium-kloridot tartalmazó 25 mmól/l koncentrációjú HEPES-pufferrel (pH 7,5) készítünk törzsoldatokat.

Az ATPP-vizsgálatban 0,100 ml inhibitor-oldatot 0,100 ml normál humán plazmával és 0,100 ml automatizált APTT-reagenssel inkubálunk. Az elegyet 37 “C-on 5 percen keresztül inkubáljuk, majd hozzáadunk 0,100 ml kalcium-kloridot és az alvadási időket fibrométerrel méqük, másodpercben, A különböző koncentrációban jelenlévő inhibitorok alvadási időkre kifejtett hatását a kontroll (inhibitor távollétében mért) alvadási időkkel összehasonlítva a 3. táblázatban ismertetjük.

A PT-vizsgálatban 0,100 ml inhibitor-oldatokat

0,100 ml normál humán plazmával inkubálunk 37 ’Con, 2 percen keresztül. Ezután hozzáadunk 0,200 ml siplastin-reagenst és mérjük az alvadási időket. Az eredményeket a 4. táblázatban ismertetjük.

Az 5. táblázatban foglaljuk össze a 3. és 4. táblázat eredményeit, ismertetve az inhibitornak az aktivált részleges tromboplasztin-idők és a protrombin-idők kétszeresére növeléséhez szükséges közelítő koncent45 rációt (2xAPTT, illetve 2xPT).

A 3-5. és 7—10. táblázatokban az egyes vegyületeket az alábbiak szerint jelöljük:

Vegyület jelölése	Inhibitor neve
A	Boc-(D)-Phe-Pro-boroArg-C i0H16
B	H-(D)Phe-Pro-boroArg-C 10H16
C	Boc-(D)Phe-Pro-boroIrg-C io^i6
D	Boc-(D)Phe-Phe-boroIrg-C 10H16
E	Boc-(D)Phe-Phe-boroArg-C 10H16
F	Ac-Phe-boroArg-C i0H16
G	Ac-Phe-boroIrg-C 10H16

HU 205141 Β

3. táblázat Aktíváit részleges tromboplasztin-idők (másodpercben)

Példa száma

Konc.	111.	112.	113.	114.	115.	116.	117.
(nmől/1)				Vegyület
	A	B	C	D	E	F	•G
0	35,3	32	32,8	34,7	34,7	33,7	33,8
50				35,8	36,8	35 ,	35,2
62,5		36,5	39,2
125	36,6	44,2	46,9	45,2	41,6	35,2	36,2
200	40,2	71,5	67	46,2	43,6	36,7	39,3
250	81,2	158,7	160
275				60,7	52,8	44,8	58,2
300	113,3	169,7	197,8
350	128,7	249,7	301,8	75,7	54,8	58,2	66,7
550				94,8	61,3	144,2	98,4

4. táblázat: Protrombin-idők (másodpercben)

	Példa száma
Konc.	118.	119.	120.'	121.	122.	123.	124.
(nmól/1)				vegyület
	A	B	C	D	E	F	G
0	15,5	15,8	14,4	. 15,8	16,7	15,7	15,3
12,5	16,4	20,1	16,8
250	17,1	22,5	20,8
500	21,5	33,8	27,2	15,7	19,8		13,7
625		46,5 .
750	26,7	85,3	44	17,2	22		14,9
875	40,1
1000	>200	250	152,7	19,9	29,3	16,2	19,7
2000				23,4	39	20,8	43,6
4000				49,2	70,8	51,5

5. táblázat Véralvadás gátlása

Vegyület	Számított 2xAPTT (nmól/l)	koncentráció 2xPT (nmól/l)
A	230	800
B	170	460
C	200	650
D	370	1200
E	375	2600
F	325	2500
G	625	1200

125-127. példa

Véralvadás gátlása TT meghatározással kimutatva

Az Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH (8. példa szerinti vegyület), mint proteáz-inhibitor véralvadásra kifejtett hatását in vitro a trombin-időkre (ΤΓ) kifejtett hatásával határozzuk meg.

0,2 ml normál nyúlplazma és 0,05 ml, a kívánt végkoncentráció hatszorosának megfelelő mennyiségű inhibitort tartalmazó pufferoldat elegyét 37 ’C-ra melegítjük. A véralvadást 0,05 ml, a végkoncentráció hatszorosát tartalmazó trombin hozzáadásával indítjuk meg. A használt trombint a Sigma Chemical Company-től szereztük be .(száma: T-6634, aktivitása 1190 NIH egység (mg protein) és pufferben oldottuk. Az inhibitor és trombin oldására alkalmazott puffer 0,154 mól/1 nátrium-kloridot (8,84 g/1) 2,5 mg/ml marha-szérumalbumint tartalmazó 0,1 mól/l (12,10 g/1) koncentrációjú Tris-puffer, pH 7,4. A másodpercben mért alvadási időket fibrométerrel határozzuk meg. Az inhibitor alvadási időre kifejtett hatását a kontroll (inhibitor távollétében mért) alvadási idővel összehasonlítva a 6. táblázatban ismertetjük. A közölt értékek legalább három mérés átlagát jelentik. Ha a véralvadás nem következik be 300 másodpercen belül, a reakcót

HU 205 141 Β befejezzük.

6. táblázat Trombin-idők

Példa száma Oig/ml)	Trombin konc. (nmól/1)	Inhibitor konc. másodperc	Trombin-idők’
—	0,75	0	>300
-	0,83	0	226,9± 14,8
—	1	0	147,2± 9,1
-	1,2	0	121,1± 0,8
—	2	0	51,8+ 0,6
—	3	0	40,0± 1,9
..	4	0	24,4+ 0,3
125,	4	150	>300
126.	4	100	62,4± 7,2
127.	4	50	32,7+ 0,8

128-132, példa

Inhibitorok stabilitása humán plazmában, APTTvel mérve

Az inhibitorok stabilitását a plazmában véralvadást gátló képességük alapján határozzuk meg.

Először a vizsgálandó inhibitor 1,0 gmól/l koncentrációjú, 0,10 mól/l nátrium-kloridot tartalmazó 25 mmól/1 koncentrációjú HEPES pufferrel (pH 7,5) készült törzsoldatát normál humán plazmával 50%-ra hígítjuk. Az elegyet 0 ’C-ra hűtjük, majd 0,200 ml-es alikvotokat veszünk belőle, és 37 ’C-on 2 percen ke*alvadáshoz szükséges átlagidő, másodpercben, ± standard deviáció resztül inkubáljuk. Hozzáadunk azonos térfogatú automatizált APTT-reagenst, és az alvadási időket a 111-117. példában leírtak szerint meghatározzuk. Az inhibitor végkoncentrációja a véralvadás-vizsgálatban 250 nmótyl. Az egyes inhibitorok inkubációs idejét (órában) és az alvadási időket (másodpercben) a 7. táblázatban ismertetjük.

Az E és F vegyület értékeit a kontrollal egyidőben határozzuk meg. Az A, B és C vegyület esetén a meghatározást másik napon végezzük.

7. táblázat: Inhibitorok stabilitása humán plazmában

	Koltroll	128. F	129. E	Példa száma 130. Vegyület A	131. B	132. C
Inkubációs		Alvadási idő (másodperc)
idő (óra)
0	41,5	76,363,2	81,2	152,2	203,2
0,5	42,7	76,4	73,2	84,7	157,7	207,2
1	42,7	76,7	66,2	79,7	163,7	214,2
2	42,7	79,6	67,7	86,7	152,8	203,7
3	44,8	77,8	61,7
4	44,2	81,8	58,2	98,2	157,7	209,7
5	45,7	80,8	61,3
6	45,2	79,3	.57,3
24	35,2	73,9	64,7	92,2	109,3	248,7
48	47,2	49,3	58,7

133-136. példa

Inhibitorok stabilitása pifferben

Az egyes inhibitorokat 1,0 gmól/l koncentrációban, szobahőmérséldeten, 0,20 mól/l nátrium-kloridot és 0,10 tömeg% PEG-et tartalmazó 0,20 mól/l koncentrációjú nátrium-foszfát-pufferben (pH 7,5) inkubáljuk. Az elegyből 4,0 μΐ-es alikvotokat veszünk, és a

72-110. példában ismertetett trombin-vizsgálattal mérjük a trombin-gáüó aktivitást. Az inkubálás után maradt %-os trombin aktivitást és az inhibitorok nátrium-foszfát pufferben való inkubációs idejét a 8. táblázatban foglaljuk össze.

Az A és C inhibitorok esetén az inhibitor-aktivitás 60 csak kis mértékben csökken. A B inhibitor 1 óra alatt

HU 205 141 Β elveszti biológiai aktivitását

8. táblázat: Inhibitorok stabilitása pufferben

Példa száma	Vegyület	0	Trombin aktivitás (%) Inkubációs idő (óra) 6,5	24
133.	A	3,3	1,6	0,8
134.	C	3,0		0,9
135.	C	65		77
		0	0,5	1
136.	B	2,0	15	100

137-142. példa

Véralvadás gátlása in vivő, orális adagolás esetén

130-140 g-os, hím patkányokat (Spargue Dawley CD patkányok, Charles River Labs, Inc., Wilmington,

MA, USA) 50 mg/kg intraperitoneálisan adott nátrium-pentobarbitállal altatunk. A nyak ventrális felületét középvonalban bemetsszük, és a nyaki verőerek egyikébe polietilén katétert illesztünk, majd a nyak hátsó részén kivezetjük. Az ébredés után a nyaki verő- 25 érben lévő katéterből kontroll vérmintákat veszünk, nátrium-citráttal meggátoljuk az alvadást, és 2000 gvel 10 percen keresztül centrifugáljuk. A plazmát műanyag csövekbe visszük át, és a vizsgálat elkezdéséig jégen tartjuk. A trombin-időket fibrométerrel mér- 30 jük, a 125-127. példákban ismertetett módon.

A patkányoknak orálisan 4 ml-nél kisebb térfogatban vagy Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH proteáz-inhibitort adunk hordozóban, vagy magát a hordozót. A 20 hordozó 5 tömeg% dimetil-szulfoxidot tartalmazó fiziológiás sóoldat.

Az orális kezelés után különböző időközökben vérmintát veszünk, és a fentiek szerint vizsgáljuk. Az eredményeket a 9. táblázatban ismertetjük, az alvadási időket másodpercben adjuk meg.

Ha az alvadási idő 300 másodpercnél hosszabb, azt a eredmény mutatj a. A többi adat az alvadáshoz szükséges átlagos időt jelenti másodpercben, + standard deviáció.

9. táblázat: véralvadás gátlása in vivő, orális adagolás esetén

Példa száma	Idő (óra)	Kontroll	Inhibitor koncentráció
lmg	2 mg	10 mg
137.	0,5	68+ 18	>300	>300	>300
138.	1	52+26	>300	ND	>300
139.	2	44+ 11	>300	ND	>300
140.	3	34+ 12	>300	ND	>300
141.	4	41	47+4	54+29	ND
142	6	50	46± 3	44+4	ND

ND= nem vizsgáltuk

143. példa

Véralvadás gátlása in vivő, orális adagolás esetén

A fenti vegyület véralvadást gáűó in vivő hatásának további bizonyítására a patkányokat 50 mg/kg i.p. dő- 50 zisban nátrium-pentobarbitállal altatjuk, a nyaki vénába katétert illesztünk, és a bevágást zárjuk. Ébredés után a patkányokat orálisan kezeljük vagy 5 mg/kg vízben oldott Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH proteáz-inhibitorral vagy azonos térfogatú vízzel. 30-60 perc múl- 55 va minden patkánynak 500 egység/kg dózisban trombin-infúziőt adunk, egy percen keresztül. Mind a 14 patkány, amely csak vizet kapott, 10 percen belül elpusztul a trombin-infiízió után. Ezzel szemben az inhibitor-tartalmú vízzel kezelt állatok közül 17 állatból 60 csak8 pusztul el 10 percen belül. A többi megéri az egy órát, amikoris ezeket az állatokat altatással elpusztítjuk.

144-162. példa

Véralvadás gátlása in vivő, orális, vastagbélen keresztüli és rektális adagolás esetén

Általános eljárás

300-350 g-os hím Lewís patkányokat 50 mg/kg i.p. adott nátrium-pentobarbitállal altatunk, és a nyaki vénát kanülözzük, egy polietilén 50 csőhöz kapcsolt elasztikus szilikoncső segítségével. A csövet a nyak hátsó részén kivezetjük, és egy elzárócsapon keresztül egy fecskendőhöz csatlakoztatjuk. A proteáz inhibitor Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH beadagolása előtt, és után bizonyos időközökben 0,5 ml vérmintákat veszünk és minden egyes mintavétel előtt, és után bizonyos időközökben 0,5 ml vérmintákat veszünk a minden egyes mintavétel előtt citrát-puffert tartalmazó vákuumos tárolókba visszük át. Minden egyes mintavétel után a kanült is átöblítjük sóoldattal. A vérmintákat ezuíán azonnal centrifugáljuk, 2500 g-vel 15 percen keresztül, és az alvadási vizsgálathoz 0,2 ml plazma-mintákat alkalmazunk. Az alvadási időket fibrométer segítségével határozzuk meg, az alábbiak szerint

Először a fibrométer csészéjébe 0,2 ml plazmamintát mérünk, és hozzáadunk 50 μΐ Tris-puffert (pH 7,4). A plazma-puffer-oldatot 37 °C-on 1 percen keresztül ínkubáljuk, hozzáadunk 50 μΐ 24 μg/ml koncentrációjú Tris-pufferes trombin-oldatot, és mérjük az alvadási időt, másodpercben. Ha az alvadási idő 300 másodpercnél hosszabb, azt a 300 értékkel jelöljük az alábbi táblázatban.

Orális adagolás

Ébredés után a nyaki vénában kanülözött patkányoknak orálisan adjuk a vizsgálandó vegyületet. A proteáz-inhibitor Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH vizes oldatát 3 mg inhibitor/kg testtömeg dózisban közelítőleg 1 mg/patkány dózisnak felel meg) 0,75 ml víz/kg patkány dözistérfogatban adagoljuk, gyomorszondán

10. táblázat: Véralvadás gáti keresztül. Az eredményeket a 10. táblázatban ismertetjük.

Vastagbélen keresztüli adagolás A nyaki vénában kanülözött patkányok hasán altatás alatt 3 cm-es bemetszést teszünk. A vastagbelet megkeressük, és kezdetét és végét lekötjük. A vastagbélüregbe annak kezdeténél 3 mg inhibitor/kg testtömeg (kb. 1 mg/patkány) dózisban 1 ml víz/kg testtömeg dózistérfogatot használva beinjektáljuk a próteáz-in3 hibitor Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH vizes oldatát. A bemetszést sebcsipesszel elzárjuk. Az eredményeket a

11. táblázatban ismertetjük.

Rektális adagolás

A nyaki vénában kanülözött patkányok rektális ke5 zelését Kamiya és társai [J. Pharm. Sci. 71, 621 (1982)] eljárása szerint végezzük. Röviden, egy olyan eszközt készítünk, amely 0.89 cm-es és 0,71 cm-es szilikongumi válaszfalakból és az azokat összekötő 2 cmes huzalból áll. Az eszközt a végbélbe illesztjük, elő3 szőr a nagyobb válaszfalat, és a végbélnyílást megfelel lő ragasztóval beragasztjuk. A dozírozást a külső válaszfalon keresztüli injektálással végezzük. A rektális dózis 3 mg proteáz-inhibitor Ac-öD(Phe-Pro-boroArg-OH/kb testtömeg kb. 1 mg/patkány), 0,6 ml víz/kg j patkány dózistérfogatban. Az eredményeket a 12. táblázatban ismertetjük, in vivő, orális adagolás mellett

Példa száma	Idő óra	Kontroll*	Inhibitor”
144.	0,00	49,7	57,3
145.	0,25	67,4	300
146.	0,50	51,8	300
147.	1,00	43,6	300
148,	2,00	42,5	300
149.	3,00	58,4	300
150.	4,00	42,7	300

*az adatok 2 patkányra kapott átlagértéket jelentenek **az adatok 3 patkányra vonatkozó középértéket jelentenek

11. táblázat: Véralvadás gátlásain vivő, vastagbélen

keresztüli adagolás esetén
Példa	Idő	Kontroll	Inhibitor”
száma	(óra)
151.	0,0	59,9	59,4
152.	0,5	42,7	300
153.	1,0	42,7	300
154.	2,0	52,1	300
155.	4,0	54,2	300
156.	5,0	57,9	300

az adatok 2 patkányra kapott átlagértéket jelentenek **az adatok 3 patkányra vonatkozó középértéket jelentenek

HU 205141 Β

12. táblázat: Véralvadás gátlása in vivő, rektális adagolás mellett

Példa száma	Idő (óra)	Kontroll*	Inhibitor”
157.	0	53,9	66,4
158.	0,25	52,3	300
159.	0,5	43,1	300
160.	1,0	52,7	300
161.	2,0	42,5	300
162.	4,0	75,6	300

*az adatokat 1 patkánnyal kapjuk **az adatok 3 patkányra kapott középértékeket jelentenek

163-168. példa

Krotonolajjal indukált gyulladásgátlás in vivő

Két oldatot készítünk, az egyik 5 tömeg% krotonolajat ismert gyulladáskeltő anyag) tartalmaz aceton hordozóban (krotonolajos oldat) a másik 5 tömeg% krotonolajat tartalmaz aceton hordozóban, amelyhez 10 mg/ml koncentrációban adjuk a találmány szerinti eljárással előállított vegyületet (vegyületet tartalmazó oldat).

A kísérleti állatok 130-140 g-os Spargue Dawley CD patkányok, Charles Kiver Labs, Inc., Wilmington,

MA, USA) jobb fülére 10 μΐ krotonolajos oldatot, illetve 10 μΐ vegyületet tartalmazó oldatot viszünk fel, szintén 10 μΐ mennyiségben.

A kezelés után 1 órával az állatokat leöljük, a fiile- 30 két eltávolítjuk, és 0,63 cm átmérőjű korongokat vágunk ki belőlük, majd ezeket lemérjük. A gyulladást a krotonolajos oldattal kezelt jobb fül és az aceton oldattal kezelt bal fül tömege közötti különbségként mérjük. Az eredményeket indometacin öismert nemszteroid gyulladásgátló anyag) összehasonlítjuk. Az indometacinból a fentiekhez hasonlóan oldatot készí20 tünk (indometacines oldat) és a vegyületet tartalmazó oldathoz hasonlóan alkalmazzuk. Az eredményeket a

13. táblázatban ismertetjük, az F vegyületre, vagyis az Ac-Phe-boroArg-C ₁₀H₁₆-ra.

A táblázatokban a dózis a gyulladásgátló hatású 25 anyag mennyiségét jelenti μg-ban (az A, C, D, E, F vagy G vegyület, illetve indometacin esetén) a jobb fülre felvitt oldatban, és n a vizsgálatban alkalmazott patkányok számát jelenti. SE a standard hibát jelenti.

A14. táblázatban a 164-168. példák az A, C, D, E, F és G vegyüíetek gyulladásgátlő hatását mutatják, amelyet ugyanilyen körülmények között határozunk meg (a dózis 100 μg).

13. táblázat: Krotonolajjal indukált gyulladás gátlása in vivő

Példa száma	Oldat	Dózis (jobb fül) (μ-g/fül)	Középérték jobb fül (mg)	Középérték bal fül (mg)	Középérték Gyulladás (m± SE)	Gátlás /%/	n
163	krotonolajos	0	27,4	16,3	11,1+ 1,5	0	8
	indometacines	100	21,6	15,6	5,0+ 2,8	55	8
	F vegyületes	100	18,9	16,6	2,3± 0,7	79	8

14. táblázat Krotonolajjal indukált gyulladás gátlásain vivő

Példa száma	Vegyület	Gátlás (%)
164.	G	69
165.	E	82
166.	D	93
167.	A	59
168.	C	76

169-179. példa

Plazmin gátlása borolizin-peptiddel

A találmány szerinti eljárással előállított peptidek hatását a vérrögök oldásában kulcsfontosságú proteázra, a plazminra is megvizsgáltuk. A trombinnal, és plazma kallikreinnel ellentétben — amelyek elsősor50 bán az arginil-maradékoknál hidrolizálják a peptidkötéseket — a plazmin elsősorban a lizil-maradékok peptid-kötéseit hidrolizálja. A borolizin-peptidek plazmint gátló hatását az alábbiak szerint vizsgáljuk.

A humán plazmából izolált plazmint az American

Diagnostics, Greenwich, Ct, Amerikai Egyesült Államok gyártja. A készítményben az aktív hely koncentrációt Coleman és munkatársai módszere szerint határozzuk meg /Methods in Enzymol. 45,12 (1974)/. Az enzim vizsgálatát Perkin-Elmer Lambda 4C spektro60 fotométenel végezzük, amelyhez Perkin-Elmer

HU 205 141 Β

7300 komputert kapcsolunk.

A vizsgálatban használt puffer 50 mmól/1 koncentrációjú Tris-puffer (pH 7,40), amely 110 mmól/1 nátrium-kloridot, 0,1% polietilénglikol 6000-et és 0.30 mmól/1 H-(D)Val-Leu-Lysp-pnitro-anilidet tártál- 5 máz. Ehhez a vizsgálati elegyhez adjuk a vizsgálandó inhibitor megfelelő koncentrációit, majd a plazmint és 25 ‘C-on, 405 nm-en méijük a fényabszorpció növekedését az idő függvényében. Mivel az inhibitor lassan kötődik, a reakciósebességet úgy határozzuk meg, hogy 10 perces reakcióidő után húzzuk meg az abszorpció —idő görbe tangensét. Minden egyes vizsgálatban inhibitor nélküli kontroli-kísérletet is végzünk, és a plazmin koncentrációja minden egyes esetben kisebb, mint az inhibitor-koncentráció 10%-a. Az eredményeket a 15. táblázatban foglaljuk Össze.

15. táblázat: Plazmin gátlása

Példa száma	Inhibitor	Koncentráció (nmól/)	Aktivitás (%)
169.	Boc-Val-Val-boroLys-C 6Hj2	100	57
170.	H-V al-Val-boroLys-C 6H12	100	50
171.	Boc-(D)Phe-Phe-boroLys-C 6HI2	25	50
172.	H-(D)Phe-Phe-boroLys-C 6H12	100	50
173.	Boc-(D)Val-Leu-boroLys-C 6H12	50	38
174.	H-(D)Val-Leu-boroLys-C 6H12	70 '	50
175.	Boc-Ala-Phe-boroLys-C 6H12	20	53
176.	H-Ala-Phe-boroLys-C 6H12	40	41
177.	Boc-Glu-Phe-boroLys-C 6H12	40	43
178.	Ac-Phe-boroLys-C 6H12	40	50
179.	PyrGlu-Phe-boroLys-C fiH„	40	38

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (26)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás az (I) általános képletű vegyületek — a képletben

   Y¹ és Y² jelentése egymástól függetlenül hidroxilcsoport, fluoratom vagy együtt egy dihidroxi-vegyületből származó csoportot jelentenek, amely legalább két hidroxilcsoportot tartalmaz, amelyeket egymástól legalább két, telített láncban vagy gyűrűben lévő, egymással kapcsolódó szénatom választ el, ahol a fenti lánc
2. 2-4 szénatomos, a gyűrű pedig 8-12 szénatomot tartalmaz,

   R² jelentése -(CH₂)_Z-X általános képletű szubsztituált alkilcsoport, ahol

   X jelentése -NH2, -NHC(NH)-NH₂ vagy -SC(NH)NH₂ képletű csoport, és z értéke 3-5, n, 0, p és q értéke egymástól függetlenül 0 vagy 1,

   A¹ és A² jelentése egymástól függetlenül D- vagy L-konfigurációjú alanin, oldalláncban lévő karboxilcsoportján adott esetben 1-6 szénatomos alkilcsoporttal védett aszparaginsav vagy glutaminsav, piroglutaminsav (csak A² esetén), glicin, izoleucin, leucin; oldalláncban lévő aminocsoportján adott esetben (1—6 szénatomos)alkoxi-karbonil-csoporttal védett lizin, fenilalanin, prolin, oldalláncban lévő hidroxilcsoportján adott esetben 1-6 szénatomos alkilcsoporttal védett treonin (csak A¹ esetében), szerin (csak A¹ esetében) és valin közül választott aminosavból származó maradék,

   A³ jelentéseD-vagy L-konfigurációjú glicin,alanin, leucin, valin, izoleucin és fenilalanin közül választott aminosavból származó maradék, és

   R¹ jelentése hidrogénatom, (1-6 szénatomos)alkoxi-karbonil-csoport, 2-6 szénatomos alkanoilcsoport, benzoilcsoport, benzil-oxi-karbonil-csoport vagy leucil-,izoleucil-vagy valil-csoport— és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve,hogy (a) olyan (I) általános képletű előállítására, amelyek képletében

   Y¹ és Y² együtt egy dihidroxi-vegyületből származó csoportot jelentenek, amely legalább két hidroxilcsoportot tartalmaz, amelyeket egymástól legalábbkét, telített láncban vagy gyűrűben lévő, egymással kapcsolódó szénatom választ el, ahol a fenti lánc 2-4 szénatomos, agyűrő pedig8-12 szénatomot tartalmaz,

   R² jelentése -(CH₂)_Z-X általános képletű szubsztituált alldlcsoport, ahol

   Xjelentése-NH₂, z értéke 3-5, és n, 0, p. q, A¹, A², és A³ jelentése a tárgyi körben megadott, egy (II) általános képletű vegyületet — a képletben

   Y³ jelentése egy dihidroxi-vegyületből származó csoport, amely legalább két hidroxilcsoportot tartalmaz, amelyeket egymástól legalább két, telített láncban vagy gyűrűben lévő, egymással kapcsolódó szénatom választ el, ahol a fenti lánc 2-4 szénatomos, a gyűrő pedig 8-12 szénatomot tartalmaz,

   R³ jelentése -(CH₂)_Z-W¹ általános képletű szubsztituált alkilcsoport,

   W és W¹ jelentése egymástól függetlenül klór- vagy brómatomés z értéke 3-5— egy (TV) általános képletű aminosavval vagy pepiiddel —aképletben R¹, A¹, A², A³, n, o,p és q jelentése a tárgyi körben megadott—reagáltatunk, a kapott (V) általános képletű vegyületet—a képletben Y³, R³, W¹, WjR¹, A¹, A², A³, n,o, p és q jelentése a fent megadott — egy alkálifém-aziddal reagáltatjuk, és a kapott (V) általános képletű vegyületet—a képletben Y³, R³, W, R¹, A¹, A², A³, n, o, p és q jelentése a fent megadott, és W¹ jelentése azidocsoport—ásványi vagy szerves sav jelenlétében redukáljuk; vagy (b) olyan © általános képletű vegyületek előállítására, amelyekképletében

   Y¹ és Y² együtt egy dihidroxi-vegyületből származó csoportot jelentenek, amely legalább két hidroxilcsoportot tartalmaz, amelyeket egymástóllegalábbkét, telített láncban vagy gyűrűben lévő, egymással kapcsolódó szénatom választ el, ahol a fenti lánc 2-4 szénatomos, a gyűrűpedig8-12 szénatomot tartalmaz,

   R²jelentése-(CH₂)_Z-Xáltalános képletűszubsztituált alkilcsoport, ahol

   X jelentése-NHC(NH)NH₂, z értéke 3-5, és n, o, p. q, A¹, A² és A³ jelentése a tárgyi körben megadott, 1 egy általánosképletű vegyületet—a képletben

   R²jelentése-(CH₂)_Z-Xáltalános képletű szubsztituált alkilcsqpor t, ahol

   Xjelentése -NHj, és ζ, Y¹, Y², n, o, p, q, Al, A² és A³ jelentése a fent megadott—ciánamiddalreagáltatunk, vagy (c) olyan © általános képletű vegyületek előállítására,amelyekképletében

   Y¹ és Y² együtt dihidroxi-vegyületbőlszármazó csoportot jelentenek, amely legalább két hidroxilcsoportot tartalmaz, amelyeket egymástól legalább két, teb'tett láncban vagy gyűrűben lévő, egymással kapcsolódó szénatom választ el, aholafenti lánc 2-4 szénatomos, a gyűrű pedig8-12 szénatomot tartalmaz,

   R²jelentése-(CH₂)_Z-Xáltalánosképletű szubsztituált alkilcsoport, ahol

   Xjelentése -SC(NH)NH₂,' z értéke 3-5, és n, o, p, q, A¹, A² és A³ jelentése a tárgyi körben megadott,

   W CO általános képletű vegyületet—aképletben

   R³ jelentése -(CH^-W¹ általános képletű szubsztituált alkilcsoport, ahol

   W¹ jelentése klór-vagy brómatom és

   R¹, Y³, A¹, A², A³, n, o,p,q és W jelentése a fenti (a) eljárásban megadott— tiokarbamíddalreagáltatunk, vagy (d) olyan © általános képletű vegyületek előállítására, amelyekképletében

   Y¹ és Y² jelentése azonosan hidroxilcsoport és

   R¹, R², A¹, A², A³, n, o, p és q jelentése a tárgyi körben megadott, egy © általános képletű vegyületet—a képletben

   Y¹ és Y² együtt egy hidroxi-vegyületből származó csoportot jelentenek, amely legalább két hidroxilcsoportot tartalmaz, amelyeket egymástól legalább két, telítet láncban vagy gyűrűben lévő, egymással kapcsolódó szénatom választ el, ahol a fenti lánc 2-4 szénatomos, a gyűrű pedig 8-12 szénatomot tartalmaz, és

   R¹, R², A¹, A², A³, n, o, p és q jelentése a tárgyi körben megadott — hidrolizálunk, vagy (e) olyan © általános képletű vegyületek előállítására, amelyekképletében

   Y¹ és Y² jelentése azonosan fluoratom és

   R¹, R², A¹, A², A³, n, o, p és q jelentése a tárgyi körben megadott, egy ©általánosképletű vegyületet—a képletben

   Y^l és Y² jelentése azonosan hidroxilcsoport és

   R¹, R² A¹, A², A³, n, o, p és q jelentése a tárgyi körben megadott—vizes hídrogén-fluoriddal reagáltatunk, és kívánt esetben (i) egy szabad bázis formájában kapott © általános képletű vegyületet savaddíciós sóvá alakítunk, vagy (ii) egy savaddíciós só formájában lévő © általános képletű vegyületet szabadbázissáalakítunk.

   2. Az 1. igénypont szerinti (d) eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási anyagként használt © általános képletű vegyületet (a) (i) vizes szerves savban oldjuk, és ioncserélő kromatográfiának vetjük alá, egy szerves savban 0-0,3 n ásványi savkoncentráció-gradienst alkalmazva, és (ii) oszlopkromatográfiás eljárással vagy molekulaszűrésen alapuló kromatográfiás eljárással elválasztjuk,vágy (b) (i) feleslegben lévő bór-triHoriddal reagáltatjuk, metilén-kloridban, -78 ’C és 0 ’C közötti hőmérsékleten, (ii) abór-triHoridfeleslegétvízzelelhidrolizáljuk, (iii) 1—50 tÖmeg%-os vizes szerves savval hígítva a hidrogénklorid koncentrációját 0,01-0,05 mól/I-re állítjuk, (iv) a vizes fázist elválasztjuk, majd (v) ioncserélőkromatögráfiás eljárásnak vetjük alá.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti (d) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan © általános képletű vegyületet használunk, amelynekképletében

   Y¹ és Y² együtt pinándiolból, pinakolbói vagy butándiolból származó észterező csoportot jelentenek.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Y¹ és Y² együtt (+)-a-pmándiolból származó észterező csoportotjelentenek.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti (d) vagy (e) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan © általános képletű vegyületet használunk, amelynekképletében

   A¹ jelentése L- vagy D-konfigurációjú lizin, fenilalanin, prolin, alanin, leucin, glicin, glutaminsav, valin, treonin, izoleucin vagy aszparaginsav.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti (d) vagy (e) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan © általános képletű vegyületet használunk, amelynekképletében

   A¹ jelentése L- vagy D-konfigurációjú lizin, feniialanin, prolin, alanin, lencin, glicin, glutaminsav, valin vagytreonin.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti (d) vagy (e) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan © általános képletű vegyületet használunk, amelynek képleté34

   HU 205141 Β ben az

   A² jelentésére megadott aminosav D-konfigurációjú.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti (d) vagy (e) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként (I) általános képletű vegyületet használunk, amelynek képletében A²jelentésePhe.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti (d) vagy (e) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan 0) általános képletű vegyületet használunk, amelynek képletében

   A² jelentése L- vagy D-konfigurációjú fenilalanin, alanin,Ieucin,prolin,glutaminsavvagyglicm.
10. 10. Az 1. igénypont szerinti (d) vagy (ej eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan 0) általánosképletű vegyületét használunk, amelynek képletében

    R²jelentése-(CI^)_Z-Xáltalánosképletűszubsztitnált alkilcsoport, ahol zértéke 3-4..
11. 11. A10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R² jelentése 3-guanidino-propil-, 3-aminopropil- vagy 4-amino-butil-csoport.
12. 12. A11. igénypont szerinti eljárás,azzal jellemezve, hogy R²jelentése3-guanidino-propil'csoport.
13. 13. Az I. igénypont szerinti (d) eljárás Ac-(D)PhePro-boroArg-OH előállítása, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk
14. 14. Az 1. igénypont szerinti (a) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan 0V) általános képletű vegyületet használunk, amelynekképletében

    A¹ jelentése L- vagy D-konfigurációjú lizin, fenilalanin, prolin, alanin, Ieucin, glicin, glutaminsav, valin, treonin, izoleucin vagy aszparaginsav. ; ‘
15. 15. A15. igénypont szerinti eljárás,azzal jellemezve, hogy A¹ jelentése L- vagy D-konfigurációjú lizin, fenilalanin, prolin, alanin, Ieucin, glicin, glutaminsav, valin vagy treonin.
16. 16. Az 1. igénypont szerinti (a) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan 01) általános képletű vegyületet használunk, amelyek képletében az

    A² jelentésére megadott aminosav D-konfigurációjú.
17. 17. A16. igénypont szerinti eljárás, űzzű/ jellemezve,hogy

    A² jelentése fenilalanin.
18. 18. Az 1. igénypont szerinti (a) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan 01) általános képletű vegyületet használunk, amelynekképletében

    A² jelentése L- vagy D-konfigurációjú fenilalanin, alanin, Ieucin, prolin, glutaminsav vagy glicin.
19. 19. Az 1. igénypont szerinti (a) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan (Π) általános képletű vegyületet használunk, amelynekképletében

    R³ jelentése -(CH₂)_Z-W¹ általános képletű szubsztituált alkilcsoport, ahol

    W¹ jelentése klór- vagy brőmatom és zértéke 3-4.
20. 20. Az 1. igénypont szerinti (c) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan (V) általános képletű vegyületet használunk, amelyek képletében

    A¹ jelentése L- vagy D-konfigurációjú lizin, fenilalanin, prolin, alanin, Ieucin, glicin, glutaminsav, valin, treonin, izoleucin vagy aszparaginsav.
21. 21. A20.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,hogy

    A¹ jelentéseL- vagy D-konfigurációjú lizin, fenilalanin, prolin, alanin, Ieucin, glicin, glutaminsav, valin vagy treonin.
22. 22. Az 1. igénypont szerinti (c) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan (V) általános képletű vegyületeket használunk, amelynekképletében az

    A² jelentésére megadott aminosav D-konfigurációjú
23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy A² jelentése fenilalanin.
24. 24. Az 1. igénypont szerinti (c) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan (V) általános képletű vegyületet használunk, amelynekképletében

    A² jelentése L- vagy D-konfigurációjű fenilalanin, alanin, Ieucin, prolin, glutaminsav vagy glicin.
25. 25. Az 1. igénypont szerinti (c) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan (V) általános képletű vegyületet használunk, amelynek képletében

    R³ jelentés -(CH₂)_Z-W¹ általános képletű csoport, ahol

    W¹ jelentéseklór- vagy brómatom és zértéke 3-4.
26. 26. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított 0) általános képletű vegyületet — amelynek képletében Y¹, Y², R², n, o, p, q, A¹, A², A³ és R¹ jelentése az 12. igénypontban megadott —, vagy annak egy gyógyászatilag elfogadható sóját a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozóés/vagy egyéb segédanyagokkal Összekeverünk és gyógyászati készítménnyé alakítunk.