MX2013014923A - Formulaciones estables de una enzima degradadora de hialuronano. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones que son formulaciones estables de una enzima degradadora de hialuronano o son co-formulaciones estables de una insilina de acción rápida y un enzima degradadora de hialuronano, que incluyen una PH20 humana recombinante (rHuPH20).

Description

FORMULACIONES ESTABLES DE UNA ENZIMA DEGRADADORA DE HIALURONANO CAMPO DE LA INVENCION Se proporcionan composiciones . que son formulaciones estables de una enzima degradadora de hialuronano o son co-formulacionés estables de una insulina de acción rápida y una enzima degradadora de hialuronano, que incluye una PH20 humana recombinante (rHuPH20)..

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La diabetes da por resultado hiperglicemia crónica debido a la incapacidad del páncreas de producir cantidades adecuadas de insulina o debido a la incapacidad de las células de sintetizar, y liberar la insulina apropiadamente. La hiperglicemia también se puede experimentar por pacientes críticamente enfermos, que da por resultado mortalidad y morbilidad incrementada. La insulina se ha administrado como un producto terapéutico para tratar pacientes que tienen diabetes, incluyendo, por ejemplo, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 y diabetes gestacional, a fin de imitar, la respuesta endógena de la insulina que se presenta en los individuos normales. La insulina se ha , administrado a pacientes críticamente enfermos con hiperglicemia para controlar el nivel de glucosa en la sangre.

Típicamente, /. las ¦ insulinas de .. acción rápida se administran a estos sujetos en respuesta a la hiperglicemia o en la anticipación de la hiperglicemia, tal como después del consumo de una comida, que puede dar por resultado el control glicémico. Sin embargo, las formas de acción rápida actuales de insulina tienen un retraso en la absorción y acción, y por lo tanto no se aproximan a la acción rápida de la insulina endógena. De esta manera, estas formulaciones no actúan suficientemente rápido para detener la producción de glucosa hepática que. se presenta poco después, de esta primera . fase de liberación de insulina. Debido al retraso en la acción farmacológica, las preparaciones de insulina de acción rápida se deben administrar antes de los alimentos a fin de. lograr el. control glicémico deseado. Además, las dosis que. se deben administrar conducen a una duración, prolongada' de acción . que contribuye a la ¦..hipoglicemia, y en muchos casos, a la obesidad.

Las enzimas de.gradadoras de hialuronano son enzimas que muestran actividad terapéutica solas y/o: se co-administran sin agentes terapéuticos, tal como insulina. Pór ejemplo, se han desarrollado composiciones de insulina de. acción súper rápida que contienen una enzima degradadora de hialuronano .y una insulina de . acción rápida (por. ejemplo análogo de insulina de acción rápida) que da por resultado una composición que, cuando se administra a un sujeto, imita más estrechamente la liberación de insulina, post-prandial (es decir, natural) endógena de un sujeto no diabético comparada con la insulina , de acción rápida sola (véase por ejemplo Publicación de É.U.A. No. US2009Ó304.665) . Existe uña necesidad por formulaciones mejoradas y co-formúlaciones de enzimas degradadoras de hialuronáno. También existe, una necesidad por formulaciones de insulina estables mejoradas para tratar sujetos, por ejemplo, para controlar los niveles de glucosa en la sangre en los sujetos diabéticos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN . Se proporcionan en este documento composiciones de co-formulación estables gue contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una insulina¦ de acción rápida y una enzima degradadora de hialuronáno en una' cantidad suficiente para hacer la composición de acción súper rápida. Las co-formulaciohes estables proporcionadas se formulan .para inyección de fármacos múltiples (MDI) o se formulan para infusión de insulin subcutánea continua (CSII), cada una con requisitos diferentes para estabilidad. En particular, las co-formulaciones para CSII se formulan para ser estables en temperaturas elevadas y bajo agitación, mientras las có- formulaciones para¦ MDI se formulan para ser estables cuando se almacenan en temperaturas refrigeradas o . ambientales ..

Se . proporcionan en este documento composiciones de . co-formulación estables que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una insulina de acción- rápida, una enzima dégradadora de hialuronano en una cantidad suficiente para ser la composición de acción súper rápida, NaCl en una concentración- entre o aproximadamente entre' 50 mM a 200 mM, una cantidad efectiva anti-microbiana de, un conservador o mezcla de conservadores, y.. un agente o agentes estabilizantes. Las co-formulaciones proporcionadas tienen un pH de entre o aproximadamente entre 6.8. a 7.8 y se formulan tal que las composiciones son estables durante por lo menos 6 meses en una temperatura de o de aproximadamente 2°C a 8 ° C y/o para por lo . menos 14 días en una temperatura de o aproximadamente 20 °C a 30 °C.

En algunos ejemplos, la enzima dégradadora de hialuronano en la co-formulación estable proporcionada ..en esté documento, retiene por lo menos 50% de l actividad de hialuronidasa inicial por lo menos 6 meses en una temperatura de o de aproximadamente 2°C a 8°C y/o por lo menos 14 dias en una temperatura de o aproximadamente 20 °C a. 30 °C y/o la insulina retiene por lo menos 90%, de potencia o recuperación de nivel inicial de insulina en la composición durante por lo menos 6 meses a una temperatura de o de aproximadamente 2°C a 8°G y/o para al- menos 14 días en. una temperatura de o de aproximadamente 20°C a 30°C y/o la insulina retiene por lo menos 90% de la pureza de la insulina inicial durante por lo menos 6 meses en una temperatura de o de aproximadamente 2°C a 8°C y/o durante por lo menos 14 días en. una temperatura de o de aproximadamente 20 °C a 30 °C y/o la insulina retiene menor que .2% de ..especie de insulina de peso molecular alto (HMWt) por lo menos 6 meses a una temperatura de o de aproximadamente 2°C a 8°C y/o durante por lo menos 14. días en una temperatura. de' o de aproximadamente 20°C a 30°C. Por ejemplo, la enzima degradadora de hialuronano en la, co-formulación estable retiene por lo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de la actividad de hialuronidasa inicial por lo menos 6 meses en una temperatura de o de aproximadamente 2°C a 8°C y/o durante por lo menos.14 días en una. de o de. aproximadamente 20°C a 30°C y.. '.'la pureza :;o potencia de la insulina es por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más durante o lo menos 6 meses ' a una temperatura de o de aproximadamente 2°C a 8°C y/o. durante por lo menos .14 días en una temperatura de o de aproximadamente 20°C a,30°C.

En. algunas modalidades, el pH de las composiciones de las co-formulación estable proporcionadas en este documento está entre o aproximadamente entre 7.0 a 7.6. Por ejemplo, el pH de la có-formuláción estable es o es. de. aproximadamente 6.8 ± 0.2, 6.9 + 0.2, 7.0 ± 0.2, 7.1 ± 0.2, 7.2 ± 0.2, 7.3¦± 0.2, 7.4 ± 0.2, 7.5 ± 0.2., 7.6 ± 0.2, 7.7 ± 0.2 o 7.8 ± 0.2. La concentración, de NaCl en las composiciones de . co-formuláción ¦ estables' proporcionadas en este documento está entre o aproximadamente entre 80 m a 200 mM, 80 mM a 1 4 0 mM, 50 mM a 100 mM, 80 mM a 100 mM, 50 mM a 80 mM, 100 mM a 1 4 0 mM o 120 mM a 140 mM. Por ejemplo, la concentración de NaCl de la co-formuláción estable es ó es de aproximadamente por lo menos 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 7 0 mM, 75 I:IM , 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM, 100 mM, 120 mM, 125 mM, 130. mM, l35 mM, 140 mM, 145 mM, 150 mM, 155 mM, 160 mM, 165 mM, 17.0 mM, 175 mM, 180 mM, 185 mM, 190 mM, 195 mM o.200 mM. En estos ejemplos, la cantidad superior de NaCl en las composiciones' menor que 100 mM es hasta 1.10 mM', 120 mM, 130 mM, 140 mM;, 150 mM, 160 mM, 170 mM,, 180 mM,. 190 mM o 200 mM. En: algunos ejemplos, las co-formulaciones estables proporcionadas en este documento contienen una cantidad suficiente de un agente amortiguador para mantener un intervalo de pH de entre o de aproximadamente entre 6.8 a 7.8.

¦ En una modalidad, las . co-formulaciones estables proporcionadas en este documento son estables., en una temperatura de o. de aproximadamente 2°C a 8°C, -inclusive, durante por lo. menos 7 meses, por lo menos 8 meses, por lo menos 9 meses, por . lo menos 10 meses, por lo menos 11 meses, por lo menos 12 meses, 13 meses, 14 meses, .15 meses, 16 meses, 17 meses,. 18 meses, 19 meses, 20 meses, , 21 meses, '22 meses, 23 meses, 24 meses, 25 meses, 26 meses,.. 27 meses, -28 meses,.29 meses o 30 meses. Por ejemplo, las co^formulaciones son estables en una temperatura de o d aproximadamente 2°C' a 8°G, inclusive, durante por lo menos 18 meses o. por lo menos 24 meses. En otra modalidad, las co-formulaciones estables proporcionadas en este documento son estables en una temperatura de o aproximadamente 20°G a 30°C, inclusive, durante por lo menos 15 días, 20 días, '· 21 días, 22. dias, 23 días, 24 días, 25 días, 26 días, 27 días, 28 días,-. 29 días, 30 días, 35 días,. 40 días, 45 días o 50 días.. Por ejemplo, las co-formulaciones son estables en una temperatura de o de aproximadamente 20°C a 30°C, inclusive, durante por lo menos un rr.es .

También se proporcionan en este documento ^composiciones de co-formulación estables que contienen una. .cantidad terapéuticamente efectiva de una insulina de acción rápida., una enzima degr.adadora de ·. hialuronano en ..una cantidad suficiente para hacer la composición de acción ' súper rápida, NaCl en una concentración entre o aproximadamente entre 120 mM a 200 mM, una cantidad efectiva anti-microbiana de un conservador o mezcla de conservadores, un agente o agentes estabilizantes. Las . co-formulaciones proporcionadas' tiene un pH de entre o aproximadamente, ente 6.5 y 7.5 y las composiciones son estables durante. por lo menos 3 días en una temperatura de o. de aproximadamente .32 °C a' 40 °C o son estables durante po . lo menos 3 horas bajo agitación.

En algunos ejemplos, la co-formulacióri estable contiene además una cantidad efectiva de un inhibidor de hialuronidasa, tal como, pero no limitado a, proteínas, glicosaminoglicanos. . (GAG) , polisacáridos , ácidos grasos, lanostanoides , . antibióticos, anti-nematodos., compuestos orgánicos sintéticos, y/o un componente bioactivo derivado de las plantas. Ejemplo de un componente bioactivo derivado de planta es un alcaloide, antioxidante, polifenol, flavonoideá, térpenoides y/o . fármacos anti-inflamatorios . En algún ejemplo, el inhibidor de hialuronidasa en las co-formulaciones estables proporcionadas en este . documento no forma complejos covalentes con la enzima degradadora de hialuronano o insulina.' Inhibidores de hialuronidasa' ejemplos son, pero no se limitan a, un inhibidor de hialuronidasa en suero, glicoproteína de Withania somnífera (WSG) , heparina, sulfato de heparina, sulfato de dermatán, quitosanes, ß- (1, ) -galacto-oligosacáridos, verbascosa sulfatada, . planteosa sulfatada, pectina,. poli (estiren-4-sulfonato) , .sulfato de dextrario, alginato. de sodio, polisacárido . de Undaria pinnatifida, polímero, de condensación1 de ácido 'mandé1ico, ácido eicosatrienóico,. ácido nervónico, ácido leanólico, ácido aristoloquico, ajmalina, reserpina, flavona, desmetoxicentauredina, . quercetina, apigenina, kaempfero!, • silibina, luteolina, luteolina-7-gl.ucósido, floretina, apiina, hesperidina, hesperidina sulfonada, cal.icosin-7-?-ß- D-glucopiranosido, flavona-7-sulfato de sodio, flavona 7- fluoro-4 ' -hidroxiflavona, · 4 ' -clora- , 6-dimetox'ical'coná, 7- sulfato de 5-hidroxiflavona de sodio,, miricetina, rutina, morina, glicirrizina, vitamina C, ácido de D-isoascórbico , ,1,4-lactona D-sacari.na, ácido L-ascÓrbico-6-hexadecanoato (Vcpal), vitamina . 6 6-0-aci'lada, catequina, ácido nordihidrogüaiaretico, curcumina, galata de N-propilo, ácido tánico, ácido elagico., ácido gálico, ¦ florofucofuroecol A, diecol,.. 8, 8 ' -biecol, ' procianidina, gosipol, celecoxib, nimesulida, dexametásona, indometicina, . fenoprofenp, fenilbutazona, óxifenbutazona, salicilatos, cromoglicato de sodio, aurotiomalato de sodio, transilist, ' traxanox, ivermectina, lincomicina y espectin.omieina, sulfametoxazol' y trimertoprima, sulfato de neomicina, ácido 3a- acetilpoliporenico . A, (25S) - ( + ) -12a-hidroxi-3a- metilcarboxiacetato-24-metilanosta-8 , ácido 24.(31) -dieno-26- oico, lanostanoide, ácido poliporénico . C, PS53 (polímero . de ácido de h.idroquinona-sulfónico-formaldehido) , polímero de poli (stireno-4-sulfonato) , VERSA-TL 502, ácido. 1-tetradecano sulfónico, polímero de condensación de ácido mandélico (SAMMA) , 1, 3-diacetilbenzimidazol-2-tiona, binzimidazol-2-tiona N-monoacilada, benzimidasol-2-tiona N, N ' -diacilada, derivado de alq.uil-2-fenilindol, 3-propanoilbenzoxazol-2-tiona, derivado de. indol N-alquilado, derivado de' indol Ñ-acilado, derivado de benzotiazol, derivados de .indol-2^ y 3~ carboxamida N-susti.tui'dos , análogos halogenados · (cloro y fluoro) de derivados de indol-2 y 3-carboximida N-sustituidos, .2- ( 4-hidroxifenil ) -3-fenilindol , carboxamidas de indol, acetamidas. de. indol, 3-bénzolil-l-metil-4-fenil-4-piperidinol, derivado de benzoil fenil benzoata', derivado de L-arginina, HCL guanidinio, L-NAME, ' HCN, l'inamariná, amigdalina, hederagenina, aescina, CIS-hinoquiresinol y/o 1 , 3-di-p-hidroxife.ní1-4-penten-l-ona .

En algunas modalidades, las co-formulaciones estables proporcionadas en este documento contienen un. inhibidor de hialuronidasa que, es un oliqosacárido de hialuronano (HA) en una concentración de entre o aproximadamente entre 1 mg/mL a 20 mg/mL. En algunos. : ej emplos , el- oligosacárido HA es un disacárido o . tetrasacárido . En otros ejemplos, . el oligosacárido HA tiene un extremo reductor reaccionado.

Las co-formulaciones estables proporcionadas en este ¦ documento se formulan tal que la. enzima degradadora de . hialuronan.o en la co-formulación retiene por lo menos 50% de la actividad de hialuronidasa inicial durante por lo menos .3 días en una temperatura de o de aproximadamente 32 °C a 40°C o es estable durante por lo menos 3 horas bajo agitación y/o la insulina en la composición retiene por lo menos 90% de potencia o recuperación del nivel. iniciaP de insulina en . la composición durante por lo menos 3 días a una temperatura de o de aproximadamente 32°C a 40°C o es estable durante por lo menos 3 horas bajo agitación, y/o retiene por lo menos 90% de ¦ la pureza de insulina inicial durante por lo menos 3 días a una temperatura de o de aproximadamente 32°C a 40°C o es estable durante por. lo menos 3 horas bajo agitación y/o retiene menor que 2% de especie de insulina de peso molecular alto (HMWt) durante por lo menos 3 días, a una temperatura de o de aproximadamente 32°C a 40°C o es estable durante por lo menos 3 hora, bajo agitación. En un ejemplo, las co- formulaciones estables se formulan tal que la enzima degradadora de hialuronano en la composición retiene por lo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%,¦ 90%, 95% o más de la actividad de hialuronidasa inicial durante por lo menos . 3 días en una temperatura de o de aproximadamente¦ 32 °C a 40°C-. o és estable durante por lo menos 3 horas bajo ..'agitación. En otro ejemplo, las co-.formulaciones estables se formulan tal que la. pureza o potencia de la insulina es por , lo- menos 91%, 92%, '93%, 94%, 95%,' 96%, 97%, 9 8%,. 99 o. más durante por lo menos 3 días en una temperatura de o de aproximadamente 32 °C a 40°C o es estable; durante por. lo; menos 3 horas bajo agitación.

En algunas modalidades, el pH de las co-formulaci.ones estables proporcionadas en este documento es o es de aproximadamente 6.3 + 0.2, 6.4 ± 0.2, .6.5 + 0.2, 6.6 '+ 0.2, 6.7 ± 0.2, 6.8 +.0.2, 6.9 ± 0.2, 7.0 ± 0.2, 7.1 + 0.2, 7.2 + 0.2,. 7.3 ± 0.2, 7.4 + 0.2 o 7.5 ± 0.2. .En otras modalidades las . concentraciones, de NaCl de las composiciones de la co-formulació.n estable es entre o aproximadamente entre 150 mM a 200 mM o 160 mM a 180 mM. Por ejemplo, la concentración de NaCl es . o es - de aproximadamente 120 mM, 130 mM, 140. mM, 150 mM, 155 mM, 160 ,mM, 165 mM, 170 mM, 175 mM, 180 mM, 185 mM, 190 mM, 195 mM o 200 mM. En algunas modalidades, la, co-formulación estable es estable en o aproximadamente 37°C durante por lo menos 3 días. En otras modalidades, la co-formulación estable es adecuada durante por lo menos 4. días, por lo menos 5 días o por lo' menos 6 días. En algunas modalidades, las co-formulaciones estables contienen una cantidad suficiente de' un agente . amortiguador para mantener el intervalo de pH de entre o aproximadamente entre 6.5. a 7.5. . .

Las enzimas degradadoras de hialuronano contenidas en las composiciones de las co-formulaciones . estables proporcionadas en el presenté incluyen por , ejemplo, hialuronidasas , tal como hialuronidasas animales, incluyendo humanas, particularmente formas solubles de las mismas, y/o condroitinasas. Las^ enzimas · degradadoras de hialuronano ejemplares son hialuronidasas y/o condroitinasas. En algunas modalidades, la enzima degradadora. de hialuronano es una hialuronidasa que está activa en pH neutro. En . otras modalidades, la enzima degradadora de hialuronano carece¦ de una ancla glicosilfosfatidilinositol (GPI) o no: se asocia con membrana cuando se expresa de una. célula. Por. ejemplo, la enzima degradadora de . hialuronano contiene truncamiento extermínales de uno, o. más residuos, de aminoácido para remover todo o parte de un anclaje GPI. En algunos . ej emplos , la enzima .degradadora . de hialuronano. en las co-formulaciones estables proporcionadas. en este^ documento es una hialuronidasas que es una pH2.0. Ejemplar . de las hialuronidasas PH20 son hialuronidasas PH20 no humanas o humanas. Se incluyen hialuronidasas PH20 que tiene una secuencia dé aminoácidos que contiene por lo menos los aminoácidos .36-464 ¦ de SEQ ID NO: 1,. o tiene una secuencia de aminoácidos, que. tiene, por lo menos 85% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos que contiene por lo menos los aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 1 y retiene la actividad de hialuronidasa. Por ejemplo, la PH20 tiene por lo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%., 97%, 98% o 99% de. identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos que contiene por lo menos los aminoácidos 36-464 de SEQ . ID NO: 1 y retiene la actividad de hialuronidasa. Se incluyen polipéptido PH20 que tienen una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-te.rminal después de la posición del aminoácido 465, 466, 467, 468,. -469, ·470, 471, 472, 473,. 4.74, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, .487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497,.498, 499 o 500 de la secuencia dé aminoácidos expuesta en SEQ ID "NO: 1. Las variantes . incluyen polipéptidos PH20 que muestran . por lo menos 85% de identidad d'e secuencia a una secuencia de , aminoácidos que' contiene un truncamiento C-terminal después de la posición del aminoácido ;465.,. 466, 467, 468, 46.9, 470, .471, 472, 473, 474, 475, 476,. 477, 478, 479, 480, 481, .4.82, 483, 484, 485, .486,. 487, 4.88, 489, .490, 491, 492, 493, 4,94,. 495, 496, 497, '498, 499. o 500 .de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 y retienen la actividad de hialuronidasa. En algunos, ejemplos, la PH20 en las co-formulaciones estables proporcionadas, en este documento tiene por . lo menos 86%, 87%,..'88%, 89%/ .90%,. 91%, 92%, 93%, 94%, .95%, 96%,' 97%, 98% o -99% de identidad de secuencia a una, secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición . de aminoácido 465, 466, 467, 468, 469, 470., 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, ,481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, .488, 489, 490, 491, 492,. 493, 494, 495, 496, ¦ 497, 4.98, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 y retiene la actividad de hialuronidasa . En algunas modalidades, la enzima degradadora de hialuronano es un PH20 truncado que es un polipéptido PH20 truncado C-terminal que incluye cualquiera entre los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: -9, o variantes alélicas u otras variantes de los mismos .

En algunas modalidades, la cantidad de PH20 en las co-formulaciones estables, proporcionada en · este documento es entre o aproximadamente entre 0.1 pg/mL a 100 pg/mL, 1 pg/mL a 50 pg/mL o 1 pg/mL a 20 pg/mL. Por ejemplo, la cantidad de PH20 es o es de aproximadamente 5 pg/mL. En otras modalidades, la actividad especifica de la PH20 es o es á entre 75 Unidades (U) /pg a 120 U/pg . o es por lo menos, aproximadamente o es 75 Unidades (U) /pg, 80 U/pg, 85 U/pg, 90 U/pg, 100 U/pg, 110 U/pg o 120 U/pg. Las cantidades de un enzima degradadora de hialuronano en las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente es entre . o aproximadamente, entre 10 U/mL a 5000 U/mL, 50 U/mL A 4000 U/mL, 100 U/mL a 2000 U/mL, 300 U/mL á 2000 U/mL, 600 U/mL a 2000 U/mL, o 100 U/mL a 1000 U/mL. Por ejemplo, la cantidad de una enzima degradadora de hialuronano es por lo menos o es de aproximadamente o es 30 U'/mL, 35 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, .350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/mL, .500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/mL o 2000 U/mL. En una co-formulación estable ejemplar, . la cantidad de una enzima degradadora de hialuronano o. es o es de. aproximadamente 600 U/mL.

La insulina, de acción rápid puede ser,, por ejemplo, monomérica o multiméri'ca,¦ tal como .dimérica o hexamérica.. En una modalidad, la insulina de acción rápida es una insulina humana de acción rápida. En otra modalidad, la insulina de acción rápida es., una insulina regular, , por ejemplo, una insulina humana o una insulina de cerdo.. En un ejemplo, la insulina de acción rápida es una insulina ..regular, y la concentración de · NaCl de la . co-formulación estable proporcionada en la presente es de 50 mM a 80 mM. Entre las insulinas de .acción, rápida están las insulinas regulares, tal como, una insulina con una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 103 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 104 o una insulina cón una cadena A con una secuencia de aminoácidos expuesta como · posiciones de residuo de aminoácido 88-108.de. SEQ ID NO;: 123 y una cadena B con . una cadena de aminoácidos expuesta como posiciones ¦ de residuos de aminoácido 25-54 de SEQ ID NO: 123. La insulina puede ser insulina recombinante o se puede sintetizar o sintetizar parcialmente o se puede aislar de una fuente natural. La insulina de.. acción rápida puede ser. un análogo de'insulina. Ejemplar de análogos de insulina es un análogo de insulina seleccionado de entre una insulina que tiene una cadena A con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ NOS: 103 y una cadena B que tiene una secuencia dé aminoácidos expuesta en cualquiera" de SEQ NOS : 1.47-149. En, algunas co-formulaciones estables ejemplares . proporcionadas . en la presente, la insulina de acción . rápida es una insulina aspart que tiene ¦ una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ NOS: 103 (cadena A) y SEQ ID NO: 147 (cadena B) y la concentración de NaCl es entre o es de aproximadamente entre 80 mM a 160 mM. En otras co-formulaciones estables ejemplares proporcionadas en la presente, la insulina de acción ' rápida es una. insulina glulisina que tiene una secuencia- de aminoácidos expuesta en SEQ NOS: 103 (cadena A) ' y SEQ ID NO: 149 (cadena- B) y la concentración de NaC.i es entre, o es. de¦ aproximadamente entre 80 mM a 200 mM. En todavía otras co-formulaciones estables ejemplares proporcionadas en la presente, la insulina de acción rápida es una insulina lispro que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 103 (cadena- A) y SEQ ID NO: 148 ¡cadena - B) y la concentración de NaCl es entre o aproximadamente entre 50 mM a 120 mM. , En algunas modalidades, la insulina en la co-formulación estable . proporcionada en la presente está en una cantidad que es 10 U/mL a 1000 U/mL, 50 U/mL a 500.U/mL, 100 U/mL a 1000 U/mL o 500 U/mL a 1000 U/mL, inclusive. Por ejemplo, la cantidad de insulina de. acción rápida es por lo. menos o es de aproximadamente o es 10 U/mL, 20 U/mL, 30 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U./mL, 70. U/mL,' 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL o 1000 U/mL. .En una co-formulación estable . ejemplar, la cantidad de . insulina de acción rápida es o es. de aproximadamente 100 U/raL. En otra co-formulación estable ejemplar, la insulina de acción rápida es un análogo de insulina y la enzima degradadora de hialuronano es una pH20.

Las co-formulaciones estables proporcionadas en este documento incluyen opcionalmente ' un agente amortiguador, tal como, pero no limitado a, un agente de ligación no de metal o un agente de ligación de metal. En algunos ejemplos, el agente amortiguador se selecciona de entre Tris, histidina, fosfato o citrato. En una co-formulación ejemplar estable, el agente amortiguador es Tris. La concentración del agente amortiguador es entre, o es entre aproximadamente 1 mM a 100 mM, 10 mM a 50. mM o 20 mM a 40 mM. Por ejemplo, la concentración del agente amortiguador es o es aproximadamente o es por lo menos 1 mM, 5 mM, 10 mM, . 15 mM, 20/mM, ' 21 '.mM, 22 mM, 23. mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM,, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 ;mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 45 mM, 50' mM, 55 mM, 60 mM-, : 65 mM, 70 mM, 75 mM o más. En una co-formulación ejemplar estable, la concentración de agente amortiguador es o es de aproximadamente 30 mM.

. . Las composiciones de co-formulación estables proporcionadas en '. la presente incluyen una cantidad efectiva antimicrobiana¦ del conservador que extermina . o inhibe la propagación de organismos microbianos en. una muestra, de la composición tal que por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio en los organismos bacterianos . se · presentan a 7 di-as después de la incubación. En algunos, ejemplos, la cantidad efectiva anti-microbiana del conservador ' extermina o .inhibe la propagación de organismos microbianos tal que, cuando se somete a prueba en una prueba de . efectividad de conservador antimicrobiano (APET) , después de . la inoculación de la composición con un inoculo microbiano existe por lo menos una reducción de 1.0 logio unidades en los organismos bacterianos a 7 días después de la incubación, por lo menos una reducción de 3.0 logio unidades de' organismos, bacterianos a 14 días después de la inoculación, por lo menos sin incremento adicional en los organismos bacterianos después de 28 días después de la inoculación, y por lo menos sin incremento en los organismos fungióos después de 7 días después de la inoculación. En otros ejemplos, la ¦ cantidad : efectiva antimicrobiana ' del. conservador extermina o inhibe la propagación, de organismos microbianos tal que, cuando se somete a prueba en una prueba de efectividad de conservador anti-microbiano (APET), después de la. inoculación de la composición con un inoculo microbiano existe por lo menos una reducción de 1.0 iogio unidades de organismos bacterianos a 24 horas después de la inoculación,' por lo menos una . reducción de 3.0 . logio unidades de' organismos bacterianos a 7 días después de la inoculación, sin incremento adicional en los organismos bacterianos después de 28 días después de .la inoculación, por lo menos una reducción de 1.0 logio unidades de organismos fungióos -a 14 días después, de la inoculación, y por lo menos ningún, incremento adicional en los organismos fúngicos después de 28 días después de la inoculación. En todavía otro ejemplo, la cantidad efectiva anti-microbiana del conservador extermina o inhibe la propagación de organismos microbianos tal que, cando se somete a prueba en una prueba de efectividad de conservador antimicrobiano (APET), después de . la inoculación de la composición con un inoculo microbiano existe por lo menos /una reducción de 2.0 logio unidades de organismos bacterianos a 6 horas después de la^ inoculación, por lo menos una reducción de 3.0 logio unidades de los organismos bacterianos a 24 horas después de la inoculación, sin recuperación de. · organismos bacterianos después de 28 días después de. la inoculación de la composición con el inoculo microbiano, por lo menos una reducción de 2.0 logio unidades de organismos , fúngicos a .7 dias después de la inoculación, y por lo menos sin incremento adicional en los organismos fúngicós después de 28 días después de la inoculación.

LOs conservadores en . las co-formulaciones estables pueden incluir uno o más de conservadores fenólicos, conservadores no fenólicos o conservadores fenólicos · y conservadores no fenólicos. Por ejemplo, los conservadores se seleccionan de entre, pero no se limitan a, fenol, m-cresol, metilparabeno, alcohol bencílico, timerosal, cloruro de benzalconio, 4-cloro-l-butanol, diclorohidrato . de clorhexidina, digl.uconato de clorhexidina, L-.fenil.alanina, EDTA, bronopol, acetato fenilmercúr.ico, glicerol, imidurea-, clorhexidina, deshidroacetato de sodio,' o-cresol, p-cresol., clorocresol, cetrimida, cloruro de benzetonio, etil-parabeno, propilparabeno, butilparabeno y cualquier combinación de los mismos. En algunos ejemplos, la . co-formulación estable contiene un conservador individual. En otros ejemplos, la co-formulación estable contiene una mezcla de conservadores que contiene 2, 3 o 4 diferentes conservadores. En algunas modalidades, las- co-formulaciones. estables contienen por lo menos un conservador fenólico. En . una modalidad particular, el uno o más conservadores son fenol, m-cresol o fenol y m-cresol .

La. cantidad total del uno o más agentes conservadores como un porcentaje (%) de concentración, de masa (p/v) en las co-formulaciones estables proporcionada en la presente es o es entre 0.1% y 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15%. a 0.25%, 0.1% a .0.2%, 0.2% a 0.3% o 0.3% a 0.4% inclusive. En algunos ejemplos, los conservadores son fenol y. m-cresol y la cantidad como . un¦ % de¦ concentración de masa (p/v) en la formulación . es entre o · aproximadamente entre 0.1% -a 0.25% de fenol y. entre, o aproximadamente entre 0.05% a 0.2% de m-cresol, es entre o aproximadamente entre 0.10% a 0.2% fenol. y entre o aproximadamente entre 0.6% a 01.8% m-cresol, entre o aproximadamente entre 0.1% a 0.15% de fenol y 0.8%, a 0.15% m-cresol,-, es entre o aproximadamente entre 0.10% a 0.15% fenol y entre o aproximadamente entre 0.06 a 0.09% de m-cresol o es entre o aproximadamente entre 0.12% a 0.18% fenol y entre o aproximadamente entre 0.14 a 0.22% m-cresol. En las co-formulaciones ejemplares, los conservadores son fenol y m- cresol y la cantidad como' un % de concentración de masa (p/v) en la formulación es o- es de aproximadamente 0.1% de fenol y 0.075% de m-cresol,: es o es aproximadamente 0.1% de fenol y 0.15% de m-cresol, es o es aproximadamente 0.125% de fenol y 0.075% de m-cresol, es o es aproximadamente 0.13% de fenol y 0.075% de m-cresol, es o es aproximadamente 0.13% de fenol y 0.08% de m-cresol, es o es aproximadamente 0.15% de fenol y 0.175% de m-cresol o es o es aproximadamente 0.17% de fenol y 0.13% de m-cresol.

Las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente contienen un agente estabilizante que se selección de. entre, pero no se limita a, un aminoácido, derivado de aminoácido, amina, azúcar, polioles, sal o surfactante. En algunos ejemplos, las co-formulaciones estables contienen un agente estabilizante individual. En otros ejemplos, las co-formulaciones estables contienen 2, 3, .4, 5 o 6 agentes estabilizantes diferentes. En algunos ejemplos,', el agente estabilizante es un aminoácido, derivado de aminoácido o amina que se selecciona de entre L-Arginina, glutamina, ácido glutámico, glicina, lisina, metionma, prolina, Lys-Lys, Gly-Gly, óxido de Trimetilamina (TMAO) , betaina o. sales de los mismos. En un ejemplo particular, el aminoácido es lisina o prolina. La concentración del aminoácido es entre o entre aproximadamente 0.01 M a 1 M, 0.01 M a 0.1 M, 0.1 M a 0.75 M o 0.2 M a 0.5 , .', inclusive . En algunos ejemplos, 'el agente estabilizante es un azúcar o poli.ol que se selección de entre, . pero no limitado a, glicerol, sorbitol, : manitol, inositol, sacaros y. trehalosa . · En una co-formulación estable ejemplar, el agente estabilizante es un . surfactante y la cantidad de surfactante como un % de concentración de masa (p/v) en la formulación s entre o aproximadamente entre 0.005% a 1.0%, 0.01% a 0.5%, 0.01% a.0.1%, 0.01% a 0.05%, o 0.01¾ .a 0.021. Por ejemplo, el agente estabilizante es un surfactante y la cantidad de surfactante como un % de concentración de masa (p/v) en la formulación es' o és aproximadamente 0.001%, 0.005.%, 0.01%, 0.015%,. 0.02%, 0.025%, · 0.03%, 0.035%, 0.04%, .0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08% o 0.9%. El surfactante en las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente se pueden seleccionar de entre, pero no se limitan a, un polipropilenglicol , polietilenglicol, glicerina, sorbitol, poloxámero y polisorbato. Por ejemplo, el surfactante se selecciona de. entre poloxámero 188, polisorbato 20 o polisorbato' 80. En una co-formulación estable ejemplar, el agente estabilizante es un surfactante que es poloxámero 188 y ' se proporciona .en . una cantidad como un % de concentración de masa (p/v) de entre ·? aproximadamente entre 0.01%' a 0.05%. En otra co-formulación estable ejemplar,,, el agente estabilizante es un surfactante que es polisorbato 20 y se proporciona en una' cantidad como un % de. concentración de masa (p/v) de. entre, o aproximadamente entre 0.01% ' a 0.05% . Én todavía otra co-formulación estale ejemplar, el agente estabilizante es un surfactante que es polisorbato 80 y se proporciona en una cantidad como un % de concentración de masa (p/v) de entre o aproximadamente entre 0.01% a 0.05%.

Las co-formulaciones estables ¦ proporcionadas en la presente incluyen opcionalmente un modificador ' de tonicidad, que se. selecciona de entre, pero no limitado á, glicerina, sal, 'aminoácidos,, po.liálcoholes o trehalosa, para mantener la osmolaridad de entre o aproximadamente entre 245 mOsm/kg a 305 mOsm/kg.. En algún, ejemplo, el modificador de tonicidad mantiene la osmolaridad de la formulación de . aproximadamente o a 245 mOsm/kg, .250 mOsm/kg, 255 mOsm/kg, 260" mOsm/kg, . 265 mOsm/kg, 270 mOsm/kg, 275 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 285 mOsm/kg, 290 mOsm/kg, 300 mOsm/kg o 305 mOsm/kg.. En una co-formulación estable ejemplar.,., el modificador de tonicidad mantiene la osmolaridad de la , formulación de o de aproximadamente 27.5 mOsm/kg. En una modalidad, el modificador de. , tonicidad es glicerina que está presente en . la co-formulación en una concentración menor que 60 mM, menor que 55 mM, menor que 50 mM, menor que 45 mM, menor que 40 mM, menor que' 35 mM, menor que 30. mM, menor . que 25. mM, menor que 20 mM, menor que 15 mM, menor que 10 mM. En una co-formulación estable ejemplar, la insulina de acción rápida es un análogo de insulina que es insulina aspart y la formulación contiene glicerina en una concentración entre o aproximadamente entre 20 mM a 50 mM, inclusive. En otra co-formulación estable ejemplar,', la insulina de acción, rápida es una insulina regular o es insulina lispro y la formulación comprende glicerina en una concentración entre o aproximadamente entre 40 mM a 60 mM, inclusive .

En algunas modalidades, las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente contienen opcionalmente un antioxidante. En otras modalidades., las co-formulaciones estables proporcionadas en la . presente contienen opcionalmente un surfactante y/u oligosacáridos de hialurpnanó, y también contiene . un antioxidante. ' El antioxidante incluido en las co-formulaciones estables proporcionadas . en la presente se selecciona de entre, pero no se limita a, cisteina, triptofano y metionina. En una co-formulación estable ejemplar, el antioxidante es metionina. El antioxidante en las co-formulaciones. estables está en una concentración de entre o de aproximadamente entre 5 mM a 50 mM, 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mM a 20 mM, inclusive. En una modalidad ejemplar, el antioxidante es metionina y la concentración de metionina es entre o aproximadamente entre 10 mM a 20 ' mM.

Las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente contienen opcionalmente' zinc... Por ejemplo, en una modalidad, la insulina de acción rápida es insulina regular, insulina lispro o insulina aspart y la formulación contiene zinc. El zinc en las co-formulaciones estables se seleccionan de entre, pero no se limita a, oxidó de zinc, acetato de zinc o cloruro de zinc,; y. está presente en una concentración de entre o aproximadamente entre 0.001 a 0.1 mg por 100- unidades de .insulina (mg/lO.OOU) , 0.001. a 0.05 mg/100U o 0.01 a 0.05 mg/l00U.

Las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente contienen opcionalmente un compuesto- de nicotina, que se selecciona de entre, pero no se limita a, nicotinamida, . ácido nicotinico, niacina, niacinamidá, vitamina B3 y/o sales de los mismos y/o cualquier . combinación de los mismos. Los compuestos nicotinicos están presentes en una concentración de o de aproximadamente 1 mNf a 150 - mM, 10 mM á 150 mM, 50 mM a 100 mM o de, o de aproximadamente 80 mM.

Las co-formulaciones estables proporcionada en la presente contienen opcionalmente uno o más . aminoácidos, seleccionados de. entre/ pero no limitados a, arginina,' ácido glutámico, y/o sales dé los mismos y/o combinaciones de los mismos. Los aminoácidos están presentes en una/concentración de 1 a 100 mM, 10 a.100 mM, o de, o de aproximadamente 30 mM, 50 mM o 80 mM. .

Una co-formulación estable ejemplar proporcionada en la presente tiene un pH de entre o aproximadamente entre 7.0 a 7.6, y contiene una enzima degradadora de hialuronano que es una PH20 en una cantidad entre o aproximadamente entre 100 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; un análogo dé insulina.de acción rápida en una cantidad entre o aproximadamente entre 10. U/mL a 1000 U/mL, inclusive; un agente amortiguador Tris en una concentración de entre o aproximadamente entre 10 mM a.50 mM, inclusive; , NaCl en una concentración de . entre o aproximadamente entre 50 a 200 mM, inclusive; metionina en una concentración ientre o aproximadamente entre.5 mM a 50 mM, inclusive; glicerina en una concentración de entre o aproximadamente entre 0 mM a 50 mM, inclusive; un surfactante que es pcloxámero 188, polisorbato 20 o polisorbato 80 en un porcentaje (%). de. concentración de masa (p/v) de entre .' o aproximadamente entre . 0.01% a 0.5%; y- conservadores que contienen fenol en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre o entre aproximadamente entre 0.1% a 0.25% y m-cresol. en. un % p/v. de entre o entre aproximadamente 0.05% a 0w,2%. En otra modalidad, esta co-formulación estable ejemplar contiene además zinc en una concentración de 0....001' a 0.1 mg por 100 unidades de insulina (mg/100U) . En una modalidad, los conservadores en las co-formulaciones estables son, o son de aproximadamente 0.1% de fenol y 0.015%. de m-cresol, 0.125% de fenol y 0.075% de ,m-cresol, 0.13% . de fenol y 0.075% de -cresol, 0.13% de fenol., y 0.08% de m-cresol o 0.17% de fenol y 0.13% de m-cresol.

Una co-formulación estable ejemplar proporcionada en la presente tiene un pH entre o¦ aproximadamente entre 7.0 a 7,6 y contiene una insulina de acción rápida que es. insulina lispro en una cantidad entre o aproximadamente entre 1.0 U/mL a 1000 U/mL, inclusive;, una enzima degradadora de hialuronano que es una PH20 en . una . cantidad entre o aproximadamente entre 100 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; un agente amortiguador Tris en una concentración de entre o aproximadamente entre 25 mM a 35 mM, inclusive;. NaCl . en una concentración de entre o aproximadamente entre '50 mM a 120 mM, inclusive; metionina en una concentración entre o aproximadamente entre 10 mM a 30 mM, inclusive;.' glicerina en', una concentración de entre o aproximadamente entre 40 mM .a 60 mM, inclusive;' un surfactante que es poloxámero .188, polisorbato 20 o polisorbato 80 en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre o aproximadamente entre 0.01% a 0.05%, inclusive; zinc en una concentración de.0.017 a 0.024 mg por 100 unidades de insulina (mg/100U); y conservadores que contienen un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre o aproximadamente ' entre 0.08% a 0.17% de fenol, inclusive, y entre o aproximadamente entre 0.07% a 0.17% de m-cresol. En una modalidad, la concentración de NaCl es. entre o aproximadamente entre 70 mM a 100 mM. En otra modalidad, el pH es o es aproximadamente 7.1 ± 0.2, 7.2 ± 0.2, 7.3. ± O..2'o 7.4 ± 0.2. En una modalidad, los conservadores en las cp-formulaciones estables son o son de aproximadamente 0.1% de fenol y 0.015% de m-cresol, 0.125% fenol y 0.,075% de m-cresol, 0.13% de fenol y 0.075% de m-cresol, 0.13% de fenol y 0.08% de. m-cresol o 0.17% de fenol y 0.13% de m-cresol. .

Una co-formulación estable ejemplar proporcionada en la presente tiene un pH entre o aproximadamente entre 7.0 a 7.6 y contiene una insulina , de acción rápida que es insulina aspart en una cantidad entre o aproximadamente entre 10 U/mL a .1000 U/mL, inclusive;' una enzima degradadora de hialuronano que es una PH20 en una cantidad entre o aproximadamente entre 100 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; un agente amortiguador Tris en una concentración' de entre o aproximadamente entre 25 mM a 35 mM, inclusive; NaCl en una concentración de entre p aproximadamente entre' 80 mM a 160 mM, inclusive; metionina en una concentración .entre o aproximadamente entre 10 mM a 30 mM, inclusive; glicerina en una concentración de entre o aproximadamente entre 20 mM a . 50 mM, inclusive; un surfactante que es poloxámero. .188, polisorbato 20 ,,'? polisorbato 80 en un porcentaje .(%) de concentración de masa (p/v) de. entre o aproximadamente entre 0.01% a 0.05%, inclusive; zinc en una¦ concentración de. 0.017 a 0.024 mg por 100 unidades de .insulina (mg/lOOU) ; y conservadores que contienen un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre o aproximadamente entre 0.08% a 0.17% fenol, inclusive, y entre o aproximadamente entre 0.07% a 0.17% de m-cresol. En una modalidad, la concentración de NaCl es o es de aproximadamente entre 70 mM a 100 mM. En otra modalidad, el pH es o es de aproximadamente 7.2 ±. 0.2, 7.3 ± 0.2, 7.4 ± 0,2 o 7.5 ± 0.2. En una' modalidad, los conservadores en las co-formulaciones estables son o son de aproximadamente 0.1% de fenol y dé 0.015% m-cresol, 0.125% . de . fenol y'0.075% de m-cresol, 0.13% de fenol y 0.075% de m-cresol, 0.13% de fenol y 0.08% de m-cresol o 0.17% de fenol y 0.13% de m-cresol.

Una co-formuláción estable ejemplar proporcionada'' en ' la presente tiene un pH éntre o aproximadamente entre 7.0 a 7.6 y contiene una insulina de acción rápida que es insulina glulisina en una cantidad entre o aproximadamente entre 10 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; una enzima degradadora de hialuronano que es una PH20 ¦ en una . cantidad . entre ' -o aproximadamente entre 100. U/mL a 1000 U/mL, inclusive; un agente amortiguador Tris en una concentración de entre -o aproximadamente entre 25 mM a 35 mM, inclusive; NaCl en una concentración de entre o aproximadamente entre 80 mM a 200 mM, inclusive; metionina en una concentración entre o aproximadamente entre 10 mM a 30 mM, inclusive; glicerina en . una concentración de entre o aproximadamente ent.re 40 mM a 6,0 mM, inclusive; un surfactante que es poloxámero 188. en un porcentaje (%) de concentración de . masa (p/v.) de. entre .; o aproximadamente entre .0.01% a 0.05%, inclusive;' · y conservadores qué tiene un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre, o , aproximadamente entre 0.08% a 0.1:7% . fenol, inclusive, y entre o aproximadamente entre 0.07% a 0.17% m-cresol . En una modalidad, .la concentración de NaCl.es entre o aproximadamente entre 100 . mM a 150': mM.' En .otra ¦modalidad, el pH es. o es de aproximadamente 7.2 ±' 0.2, 7.3 '± 0.2, 7.4 ± 0.2 o 7.5 ± 0.2.

En una modalidad, la PH20 en las co-formulaciones estables proporcionadas, en la presente es una PH20 que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene por lo menos los aminoácidos 36-464 de . SEQ ID NO: 1, o- tiene una secuencia de aminoácidos que . tiene por lo menos .85%, 90% o 95% de . identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos que contiene por lo menos los aminoácidos 3.6-464 de SEQ ID NO: 1 y retiene la actividad de hialuronidasa . Por ejemplo, el polipéptido PH20 tiene una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal ' después de la posición de aminoácido 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 4.90, 491, 492', 493, 494, 495, 49-6, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos . expuesta en SEQ ID NO: .1, o es una variante de la misma que muestra por lo menos 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento . C-terminal después de la posición de aminoácido 465, 466,; 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 47,5, 476, 477, 478, 479, 480, 481, .482, 483, 484, 485, 486., 487, 488, 489, .490,. 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ .ID NO: 1 y retiene la actividad de hialuronidasa . En otro, ejemplo, el polipéptido PH20 tiene una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición de aminoácido 482 ¦ de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1,' o es una variante de la misma que muestra por lo menos 85%, .90% o 9.5% de identidad.de secuencia a una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición , de aminoácido 482 de . la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 y retiene la actividad de hialuronidasa. En una co-formulación estable . ej emplar, el polipéptido PH20 tiene una secuencia de aminorados expuesta en' cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9. La enzima degradadora de hi'al.uronano o PH20 en las co- formulaciones estables proporcionada en 'la presente se pueden producir y expresar .de células de . mamífero, por' ejemplo-, células de Ovario . de Hámster Chino (CHO) . En un ejemplo particular, la PH2Ó se designa rHuPH20.

. Las co-formulaciones estables . proporcionadas en la presente se pueden formular para la . administración de múltiples dosis . El volumen de las co-formulaciones estables puede ser entre o aproximadamente entre.0.5 mL a 50 mL, 1 mL a 40 mL, ¦ 1 mL a .20 mL,' 1 mL a 10 mL, o 3 mL a 10 mL, inclusive . Las . co-formulaciones estables proporcionadas en la presente se pueden formular para administración usando un vial, jeringa, pluma, depósito para una bomba o un sistema de bucle cerrado. En un ejemplo particular,., las co-formulaciones estables se formulan para administración usando una infusión de insulina subcutánea continua, que se proporciona por un sistema de bucle cerrado.

Las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente se pueden proporcionar en jeringas o viales, un sistema de bucle cerrado, ' una bomba de insulina' y/o una¦ pluma de insulina .

Se proporcionan métodos en los cuales las co-formulaciones estables se administran. Por ejemplo, se proporcionan en la presente métodos para tratar diabetes al administrar a un sujeto .una ¦ cantidad terapéuticamente 35 ¦ ¦ . .· . .¦¦ efectiva, de . una co-formulación estable' proporcionada en la presente. La diabetes que se trata incluye diabetes mell.itus tipo 1, diabetes ; mellitus tipo 2, o diabetes- gestacional. También se proporcionan en la presente métodos para controlar los niveles de glucosa en la sangre . en un sujeto al administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva., de una co-formulación estable proporcionada en la presente. Al practicar los métodos en la presente, las co-formulaciones estables se administran subcutánea o intraperitonealmente , por ejemplo, a través de una. jeringa o pluma de insulina, o . por infusión subcutánea continua. En la práctica de los métodos en la presente,, las co-formulaciones estables se pueden administrar antes . de una, comida como terapia de insulina prandial . En los métodos proporcionados en la presente, ¦ la co-formulación estable se puede administrar usando un método de administración para. lograr la infusión, de insulina subcutánea continua, tal . como a través de una pluma de . insulina o un sistema de bucle cerrado. Én algunos casos, los. métodos proporcionados en la presente incluyen administrar otro fármaco antidiabético, que se selecciona de entre., pero no se limita a, sulfonilureas , biguanidas, . meglitinidas , tiazolidinedionas , inhibidores de alfa-glucosidasa, ^análogos de péptido, incluyendo análogos de péptido similar a glucagón (GLP) y, análogos, de péptido inhibidor gástrico (GIP) e inhibidores de DPP-4..

También se proporcionan en la presente composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva, de una enzima degradadora .de hialuronano y lisil-lisina (Lys-Lys) en una cantidad para hacer la enzima degradadora de hialuronano estable. En algunos ejemplos, la concentración de Lys-Lys es entre o aproximadamente entre 5 mM a 120 mM, 10 mM a 100 mM, 10 mM a 50 mM, 30 mM a 110 mM, 30 m a 80 mM, 50 mM a 100 mM o 100 mM a 120 mM. En otros ejemplos, la concentración de Lys-Lys es por lo menos o por lo menos aproximadamente o es de 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM o 120 mM. Se proporcionan en la présente composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano y lisil-lisina (Lys-Lys) en una cantidad suficiente tal que la enzima degradadora de hialuronano retiene por lo menos 50% de la actividad de hialuronidas.a inicial durante por lo menos tres (3) días a 37 °C. En algunos ejemplos, la enzima degradadora de hialuronano retiene por lo menos 50%) de la actividad de hialuronidasa inicial a 37°C durante por lo menos 4 días, 5 días, 6 días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses,, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses . o más. En un ejemplo particular, la enzima degradadora de hialuronano retiene por lo menos 50% de la.- actividad de hialuronidasa inicial por lo menos un mes a 37°C. En otros ejemplos, la enzima degradadora de hialuronano retiene po.r lo menos. 60%, 70%, 75%, .80%, 85%, 90%, 95% o más de la actividad de hialuronidasa inicial. .

En algunos, ejemplos de las composiciones proporcionadas, el pH de la formulación es entre o aproximadamente- entre 6.5 a 8.0, 6.5 a 7.4, 6.8 a 7.8, -7.0 a 7.6 0 .6.8 a 7.2, inclusive. Por ejemplo, el pH. de la formulación es o es aproximadamente o por lo menos 6.5± 0.2, 6.6+ 0.2, 6.7± 0.2, 6.8 ± 0.2, 6.9 ± 0.2, 7.0 ± 0.2, 7.1 ± 0.2, 7.2 ±'0.2, 7.3.± 0.2, 7.4 ± 0.2, 7.5 ± 0.2,' 7.6 ± 0.2, 7.7 ± 0.2 o 7.8 ± 0.2.': Cualquiera de las composiciones proporcionadas que contienen una cantidad . terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano y lisil-lisina . (Lys-Ly.s) pueden contener adiciohalmente un agente, estabilizante.' Por ejemplo, las composiciones contienen un. agente estabilizante que se selecciona de entre un aminoácido, un .derivado de aminoácido, una amina, un azúcar, un poliol, una sal y, un surfactante. En algunos ejemplos, el agente estabilizante es un surfactante y la cantidad de surfactante,' como .un - % de concentración de masa ¦ (p/v) en la. formulación, es entre . o aproximadamente entre 0.0005% a 1.0%, 0.0005% a 0.005%, 0.00.1% a 0.01%, 0.01% a 0.5%, 0.01% a 0.1%, 0.01% a 0.05%, o 0.01% a- 0.02%, inclusive. En otros, ejemplos, el agen.te estabilizante es un surfactante y. la cantidad dé surfactante, como un % de concentración de masa (p/v) en la formulación, i o es aproximadamente o por lo menos 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035% , 0.04 % , 0'.045%, 0.05%., 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08% o 0.9%. El surfactante se puede . seleccionar de entre un polipropilenglicol, polietilenglicol ,. ¦ glicerina, sorbitol, poloxámero y polisorbato. En un ejemplo particular, el surfactante se selecciona de entre poloxámero 188, polisorbato 20 y polisorbato 80.

En algunos ejemplos, las composiciones proporcionadas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de · hialuronano y lisil-lisiná (Lys-Lys) también contienen. un antioxidante. Por ejemplo, las composiciones contienen un antioxidante que se selecciona de entre cisterna, . triptofano y metionina. En un ejemplo particular, el ánticxidante es metionina. En . algunos ejemplos, el antioxidante está presente en una. concentración de entre o de aproximadamente entre 5 mM a 50 m , 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM. o 10 mM' a 20. mM, inclusive ÷ En otros ejemplos, el antioxidante está presente en una concentración que es o es aproximadamente o es por lo menos 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM' o 50 mM.

En algunos ejemplos, las composiciones proporcionadas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano y lisil-lisina (Lys-Lys) también contienen un modificador de tonicidad para mantener la osmolaridad . de de entre o aproximadamente entre 24,5 mOsm/kg a 500 mOsm/kg, inclusive. En algunos ejemplos, las composiciones contienen un modificador de tonicidad para mantener la osmolaridad de la formulación de aproximadamente o por lo menos aproximadamente o 245. mOsm/kg,¦ 250 mOsm/kg, 255 mOsm/kg, .260 mOsm/kg, 265 mOsm/kg, 270 mOsm/kg, 2.75 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 285 mOsm/kg, 290 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 350 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 450 mOsm/kg- ó 500 mOsm/kg. En algunos ejemplos, el modificador de . tonicidad se selecciona de entre glicerina, NaCl, aminoácidos., póliálcoholes .o trehalosa. En un ejemplo particular, el modificador de tonicidad es NaCl y la concentración de NaCl es o es aproximadamente entre 20 mM a 200 mM, 40 mM a 160 mM, 80 m . a 120. mM, 20 mM a 80 mM. o 50 mM. a 150 mM, inclusive. En otros ejemplos, el modificador de tonicidad es NaCl y la concentración de NaCl. es 0 mM a 150 mM, 10 mM a' 50 mM,. 50 mM a 100 mM y 100 mM a 130 mM. En algún ejemplo, el' NaCl está. s en una concentración de menor que 150 mM, menor que 140 mM, menor que 130 mM, menor que 120 mM, menor que 110 mM, menor que 100 mM, menor .que 90 mM, menor que 80 mM, menor que 70 mM, menor que 60 mM, menor que 50 mM, menor que 40 mM, menor que 30 mM, menor que 20 mM, menor que 10 mM, o menos.

Cualquiera de las composiciones proporcionadas que contienen una cantidad terapéuticamente, efectiva de una enzima degradadora. de hialuronano y . lisil-lisina (Lys-Lys) también puede contener una cantidad suficiente de un agente amortiguador para mantener el intervalo de pH de entre o aproximadamente entre 6.5 a 8.0, 6.8 a 7.8, o 7.0 a 7.6, 6.5 a .7.2, 6.8 a.. 7.4, inclusive. En algunos ejemplos, el agente amortiguador se selecciona de entre Tris, histidina, fosfato y citrato. En un ejemplo particular, el agente amortiguador es un fosfato que es fosfato de sodio. En otro ejemplo particular, el agente amortiguador es Tris. En algunos ejemplos, la concentración del agente amortiguador en las composiciones es entre o es entré aproximadamente G mM a 10? mM, 10 mM a 80 mM, 5 mM a 50 mM o 20 mM a 40 mM, inclusive.

La enzima degradadora de hialuronano en cualquiera de las composiciones proporcionadas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano y . lisilrlisina (Lys-Lys) puede ser ¦. una hialuronidasa o una condroitinasa . En. algunos ejemplos, la enzima degradadora de hialuronano es una hialuronidasa que es activa en pH neutro. En algunos ejemplos, la enzima degradadora de hialuronano carece, de un ancla de glicosilfosfatidilinositol (GPI) o . no se asocia a membrana cuando se expresa.de una célula. En otros ejemplos, la enzima degrádadora de hialuronano es una enzima degrádadora de hialuronano que contiene truncamiento C-terminal · es de uno o más residuos de aminoácido para remover todo o parte de un ancla GPI .

En otros ejemplos de las composiciones proporcionadas, la enzima degrádadora de hialuronano es una hialuronidasa que es una PH20 o un fragmento truncado en C-terminal de la misma. En algunos ejemplos la enzima degrádadora de hialuronano es. una PH20 que es una PH20 no humana o humana. En algunos ejemplos, la PH20 tiene, una ' secuencia de aminoácidos que contiene por lo menos los aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 1, o tiene una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad dé secuencia a una secuencia de aminoácidos que contiene por lo menos los aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 1 y retiene la actividad de hialuronidasa. Po ejemplo, la PH20 tiene por lo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,. 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos que contiene por lo meno.s los aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 1 y retiene la actividad de hialuronidasa. En algunos ejemplos de las composiciones, la enzima degrádadora de hialuronano es un polipéptido PH2.0 que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la .posición de aminoácido 465, 466, 467, 4.68, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, o es una variante de la misma que muestra por lo menos 85% de identidad de secuencia . a una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento G-terminal después de la posición del aminoácido .4.65, .466, 467, 468, 469, 4.70, 471, 47'2, 473, 474, 475, 476, 477, /478, 479, 480, 48.1, 482, 483 484, 485, 486, 487, 488, 489, .490, 491, 492, 493, 494, 495,. 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID . NO: 1 y retiene la actividad de hialuronidasa .. En ejemplos particulares,. la enzima degradadora de hialuronano es una PH20 truncada C-terminal que tiene una secuencia de amino. expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9.

En algunos ejemplos de las composiciones proporcionadas, la cantidad de una enzima degradadora de. hialuronano es entre o aproximadamente entre 10 U/mL a 5000 U/mL, 50 U/mL a 4000 U/mL, 100 U/mL a 2000. U/mL, 300 U/mL a 2000 U/mL, 600 U/mL a 2000 U/mL, 100 U/mL a 1000 U/mL, 200 U/mL a 800 U/mL, 100 U/mL a 500 U/mL, o 150 U/mL a 300 U/ml, inclusive. . Por ejemplo', la cantidad.de una enzima degradadora de hialuronano es por lo menos o es aproximadamente o es 30 U/mL, 35 U/mL, 40 U/mL, 45 U/mL, 50 U/mL, 55 U/mL, .60 U/mL,. 65 ' U/mL, 70 U/mL, 75 U/mL, 80 U/mL, 85 U/mL, 90 U/mL, 95 U/mL, .100 U/mL, 105 U/mL, 110 U/mL, 115 U/mL, .120 U/mL, 125 U/mL, 130 U/mL, 135 U/mL, 140 U/mL, 145 U/mL, 150 U/mL, 155 U/mL, 160 U/mL, 170 U/mL, 180 U/mL, 190 U/mL, 200 U/mL,. 250 U/mL, 300' U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700. U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/mL. o 2000 U/mL. : En algunos ejemplos de las composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de , una enzima degradadora de . hialuronano y lisil-lisina (Lys-Lys), la concentración de Lys-Lys es 5 mM . a 50 mM, inclusive. Por ejemplo, la concentración de Lys-Lys es por lo menos 5 mM, ,10 o 50 mM; y/o es menor que 50 mM, '40 Se proporcionan en la presente composiciones que contienen una " cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano y lisil-lisina (Lys-Lys) en donde el pH de la · composición es entre o aproximadamente entre 6.5 a 7.2 y la composición' contiene una enzima degradadora de hialuronano en una cantidad que es entre o aproximadamente entre 100 U/mL a 500 U/mL, inclusive; Lys-Lys en una concentración que es entre o aproximadamente entre. .5 mM a 30 mM, inclusive; NaCl en una concentración menor que 140 mM NaCl; un surfactante que es polisorbato 80 en un porcentaje (%) de. concentración de masa, (p/v) de entre o aproximadamente entre 0.01% a 0.05%, inclusive; metionina en una concentración que es entre o aproximadamente entre 5 mM. a 20 mM, inclusive; . y fosfato de sodio en una concentración, que es entre o aproximadamente entre 5 mM a 50 mM, inclusive. En algunos ejemplos, la enzima degradadora. de hialuronano es una PH20 o un fragmento truncado en C-terminal de la misma.

En algunos ejemplos, el volumen de. las composiciones proporcionadas es entre o aproximadamente entre 0.5 mL a 50 mL, 1 mL a 40 mL, 1 mL a 20 mL, 1 mL a 10 mL, o 3 mL a 10 mL, inclusive. Las composiciones se pueden, formular para el suministro usando un vial, jeringa, pluma, depósito para una bomba o un sistema de bucle cerrado. También se proporciona en la presente una jeringa o vial que contiene cualquiera dé las composiciones proporcionadas en la presente.

También se proporcionan en la presente composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano, lisil-lisina (Lys-Lys) en una cantidad para hacer la enzima degradadora de hialuronano estable y una insulina de acción rápida. En algunos/ejemplos, la concentración de Lys-Lys es 30 mM a 120 mM, 50 mM a 105 mM o 80 mM a 100 mM, inclusive. En las composiciones proporcionadas, la insulina de acción rápida puede ser monomérica, dimérica o hexamérica. En. algunos . ejemplos, .la insulina de acción rápida es una insulina humana de acción rápida. En otros ejemplos, la insulina de acción rápida es una insulina regular. En un ej emplo . particular ¿ la insulina de acción rápida es una insulina regular que es. una insulina humana, o insulina de cerdo. En algunos ejemplos, la insulina de acción rápida es una insulina regular que es. una insulina con una cadena A . que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 103 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO': 104\ o una insulina con una cadena A con una secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones del residuo de. aminoácido 88-108 de SEQ ID NO: 123 y una cadena B, con ; una secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones de residuo.de aminoácido 25-54 de SEQ ID NO: 123. En todavía otros ejemplos de las composiciones proporcionadas, la insulina de acción . rápida es una insulina recombinante . La- insulina de acción rápida se puede sintetizar . o sintetizar parcialmente/. En . algunos ejemplos, la insulina se aisla.

En otros ejemplos de las composiciones proporcionadas., la insulina de acción rápida es un análogo de insulina.' En algunos ejemplos, el análogo de insulina se selecciona de entre insulina aspart,, insulina lispro e insulina glulisina. Por ejemplo, el. análogo de insulina se selecciona de una insulina que tiene una cadena A con una . secuencia de aminoácidos expuesta, en SEQ NOS: 103 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ NOS: 147-149. En cualquierá ... de las composiciones proporcionadas, la insulina de acción, rápida puede estar presente en una cantidad entre o aproximadamente entre 10 U/mL a 1000 U/mL, 20 . U/mL a 500 U/mL, 50 U/mL a 300 U/mL o 200 U/mL a 800 U/mL, inclusive. Por ejemplo, la cantidad de insulina de acción . rápida es por lo menos o es aproximadamente o es. 10 U/mL, 20 U/mL,. 30 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U./mL,' l50 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL o 1000 U/mL.

En ejemplos particulares . de las composiciones proporcionadas . que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano, lisil-lisina (Lys-Lys) en . una cantidad para hacer la .enzima degradadora 'de hialuronano estable y una insulina de acción rápida,, la insulina de acción rápida es un análogo, de insulina y la enzima . degradadora de hialuronano es .una PH20 o un fragmento truncado en C-terminal de la misma. En un ejemplo particular,- la insulina de acción rápida es un análogo de insulina que es glulisina y la concentración de Lys-Lys ..es 50 a 105. mM. En otro ejemplo, la insulina de acción rápida . es un análogo de insulina que es insulina aspart o insulina lispro y la concentración de Lys-Lys es -80 a 100 mM.

Cualquiera de las composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano, lisil-lisina (Lys-Lys) en una cantidad para hacer la enzima, degradadora de hialuronano estable y una insulina de acción rápida proporcionada en la presente- ueden ser para administración de dosificación individual o para administración¦ de múltiple dosificación. En ejemplos donde. la composición es para administración de¦ múltiple ...dosificación, la composición contiene una cantidad anti-microbianamente efectiva de un conservador o mezcla de conservadores. Los conservadores en la formulación pueden contener uno o más de conservadores . fenólicos, conservadores no fenólicos . o conservadores fenólicos y conservadores no fenólicos. En algunos ejemplos, . los conservadores se seleccionan- de entre fenol, m-cresol, metilparabeno, alcohol bencílico, timerosal, cloruro de benzaiconio, 4-cloro-l-butanol, diclorohidrato de clorhexidina, digluconato de clorhexidina, L-fenilalanina, EDTA, bronopol, acetato fenilmercúrico, glicerol, . imidurea, clorhexidina, deshidroacetato de sodio, o-cresol, .- p-cresol> clorocre.sol , cetrimida, cloruro de benzetonio, etil-parabeno, prdpilparabeno, butilparabeno y cualquier combinación de los mismos. En algunos ejemplos de las . composiciones proporcionadas para ' la administración de múltiple dosificación, la formulación contiene un conservador individual. En otros ejemplos de las composiciones proporcionadas . para ; la administración de ·, múltiple dosificación, la formulación contiene una mezcla de conservadores que contiene 2, 3 o 4 diferentes conservadores. En algunos ejemplos, las composiciones contienen por lo menos un conservador fenólico. En otros ejemplos, los conservadores son fenol, m-cresol o fenol y m-cresol..

En algunos ejemplos de las composiciones proporcionadas, la cantidad total, del uno o más agentes, conservadores como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) en la formulación es o es entre 0.1% y 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15% a 0.25%,. 0.1% a 0.2%, .0.2% a 0.3% o 0.3% a 0.4%, ¦ inclusive. En ejemplos particulares . de . las composiciones proporcionadas en donde los conservadores son fenol y m-cresol, la cantidad como un % de concentración de masa (p/v) en la formulación es entre o aproximadamente entre 0.1% a 0.25% de fenol y entre o aproximadamente entre 0.05%·.a 0.2%) de m-cresol, es entre o aproximadamente entre 0.10% a 0.2% de fenol y entre o aproximadamente entre 0.06% a 0.18% de m-crescl, es entre ó aproximadamente entre 0.1% a 0.15% de fenol y .0.08% a 0.15% de m-cresol, es entre o aproximadamente entre .0.10% a 0.15% de . fenol y entre o aproximadamente entre 0.06 a 0.09% de m-cresol o es entre o aproximadamente entre 0.12% a 0.18% de fenol .y entre o aproximadamente entre 0.14 a 0.22% de m-cresol,. inclusive. En otros ejemplos particulares de las composiciones proporcionadas en donde lós conservadores son fenol y m-cresol, la cantidad como un % de concentración de. masa: (p/v) en la formulación es o es de aproximadamente 0.1% de fenol y 0.075%) de m-cresol, es o es aproximadamente 0.1%) de fenol y 0.15% de m-cresol, es o es aproximadamente 0.125%) de fenol y 0.075%) m-cresol, es o es aproximadamente 0.13% de fenol y 0.075%) m-cresol, es o es aproximadamente 0.13% de fenol y 0.08%) de m-cresol, es o es aproximadamente 0.15% fenol y 0.175%) m-cresol o., es o s aproximadamente 0.1.7%) de fenol y 0.13% de m-cresol.

Se proporcionan en la presente composiciones que contienen una . cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano, lisil-lisina (Lys-Lys) en una cantidad para. hacer la enzima degradadora de hialuronano estable y una insulina de acción rápida en donde el pH de la composición es entre o aproximadamente entre 6.8 a 7.4; y la composición contiene una enzima, degradadora de hialuronano que es un PH20 en una cantidad entre o aproximadamente entre 100 U/mL a 1000 U/mL, inclusive;, un análogo insulina de acción rápida que es insulina glulisina es una cantidad entre o aproximadamente : entre 10 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; Lys- Lys en una concentración entre o aproximadamente entre 50 mM a 105 mM, inclusive; NaCl en una Concentración de .menor que 100 mM; un surfactante que es polisorbato .20 en . un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre o aproximadamente entre 0.0005% a 0.005%, inclusive; metionina en una concentración entre ¦ o aproximadamente entre 5 n*.M a 20. mM, inclusive; y conservadores que contienen fenol en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre o entre aproximadamente entre 0.1% a 0.25% y m-cresol en un % p/v de entre o entre' aproximadamente 0.05% a 0.2%.

Se proporcionan en la presente composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadorá de hialuronano, .lisil-lisina (Lys-Lys) en una cantidad para- hacer la enzima degradadorá de hialuronano estable y una insulina de- acción rápida en donde el pH de la composición es entre o aproximadamente . entre 6.8 a .7. ; y la composición contiene una enzima degradadorá de hialuronano que es una PH20 en una cantidad entre .o aproximadamente entre 100 U/mL a 1000 U/mL,. inclusive; a análogo de insulina de acción rápida que es insulina aspart o insulina lispro es. una cantidad entre o aproximadamente entre 10 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; Lys-Lys en una concentración entre o aproximadamente entre 80 mM a 100. mM, inclusive; NaCl en una concentración de menor que 30 mM; un surfactante que es polisorbato 20 en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre o aproximadamente, entre . 0.0005% a 0.005%, inclusive;. metioniña en una. concentración entre ;.o aproximadamente entre 5 mM a 20 mM, inclusive; y conservadores que contienen fenol en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre o entre aproximadamente entre 0.1%) a 0.25%) y m-cresol en un % p/v de entre o entre aproximadamente. 0.05% a 0.2%.

En algunos ejemplos, el volumen de las composiciones proporcionadas es entre o aproximadamente entre 0.5 mL a .50 mL, 1 mL a 40 mL, 1 mL a 20 mL, 1 mL a 10 mL, o 3 mL a 10 mL, inclusive. Las composiciones se pueden formular para suministro usando un vial, jeringa, pluma, depósito, para una bomba o un sistema de bucle cerrado. En algunos ejemplos, las composiciones se formulan para el suministro usando una infusión de insulina subcutánea continua. También se proporciona en la présente una jeringa o vial qe. contiene cualquiera de las composiciones proporcionadas, en la presente.

Se proporcionan en la presente composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano y. MgCl2 en una cantidad suficiente tal que la enzima degradadora de hialuronano retiene por lo menos 50%. de la actividad de hialuronida'sa inicial durante por. lo menos tres (3) días a 37°C. En algunos ejemplos, las composiciones contienen MgCl2 en una concentración que es entre o aproximadamente entre 50 mM a 150 mM, 75 mM a 125 mM o 80 mM a . 100 mM, inclusive . Por ejemplo, las composiciones contienen 'MgClz en una concentración que es por lo menos O es aproximadamente o és 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM o 150 ' mM. En algunos ejemplos de las composiciones, la enzima degradadora de hialuronano retiene por lo menos 50% de la actividad de hialuronidasa inicial a 37°C durante por . lo menos 4 días, 5 días, 6 dias, una semana., dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses., tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más. Por ejemplo, la enzima degradadora de hialuronano retiene por lo menos 50% de la actividad de hialuronidasa inicial durante por lo menos un mes a 37°C, tal como por lo menos 60%,. 70%, 75%, 80%,· 85%, 90%, 95% o más de la actividad de hialuronidasa inicial:.

Las composiciones proporcionadas que contienen una cantidad terapéuticamente- efectiva de una enzima degradadora dé hialuronano y MgC1.2 pueden tener un pH que es .entre o ¦aproximadamente entre 6.5 a 8.0, 6.5 a 7.4, 6.8 a 7.8, 7.0 a 7.6 o 6.8 a 7.2. En algunos ejemplos, el pH de la composición es o es aproximadamente o por lo menos 6.5± 0.2, 6.6± 0.2, 6.7± 0.2, 6.8. ± 0.2,. 6.9 ± 0.2, 7.0 ± 0.2, 7.1 ± 0.2, 7.2 ,± 0.2, 7.3 ± 0.2, -7.4 ± 0.2, 7.5 ± 0.2, 7.6 ± 0.2, 7.7 ± 0.2 o 7.8 ± 0.2. Las composiciones pueden contener además' un agente estabilizante que se selecciona de entre un aminoácido, un derivado de aminoácido, una amina, un azúcar, un poliol, una sal y un surfactante. En algunos ejemplos,' el agente estabilizante es un surfactante y la cantidad de surfactante'., como un % de concentración de masa (p/v) en la. formulación, es entre o aproximadamente entre 0.0005% a 1.0%, 0.0005% a 0.005%,. 0.001% a 0.01%, 0.01% a 0.5%, 0.01% a 0.1%, 0.01% a 0.05% .o. 0.01% a 0.02%, inclusive. Por ejemplo, el agente estabilizante es un surfactante y la cantidad de surfactante, como un % de concentración de masa (p/v) en la formulación, es o es aproximadamente o por lo menos 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%,. 0.07%, 0.08% o - 0.9%. En algunos ejemplos, el surfactante se ' selecciona de entre un polipropilenglicol , polietilenglicol, glicerina, sorbitol, poloxámero y polisorbato. En ejemplos particulares, el surfactante se selecciona de entre poloxámero 188, polisorbato 20 y polisorbato 80.

En algunos . ejemplos, las composiciones proporcionadas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano y . MgCl2 contienen un antioxidante que se . selecciona de entre cisteina, triptofano y metionina. En.. ejemplos particulares, el antioxidante es metionina. En algunos ejemplos, el antioxidante está en una concentración de entre o , de aproximadamente entre .5¦ mM a 50 'mM, 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mM a 20 mM, inclusive. Por ejemplo, el antioxidante es metionina y a concentración es o es aproximadamente o es por lo menos 5 mM, 10 mM, 15. mM, 20'. mM, .30 mM, 40 mM o 50 mM. En algunos ejemplos, las composiciones contienen una cantidad suficiente de un agente amortiguador para mantener el intervalo , de pH dé. entre o aproximadamente entre 6.5 a 8.0, 6.8 a 7.8, 7.0 a 7.6, 6.5.a 7.2 o 6.8 a 7.4. En algunos ejemplos,, el agente amortiguador se selecciona de entre Tris, histidina, fosfato y citrato. En un ejemplo particular, el agente amortiguador es clorhidrato de histidina. La ' concentración del agente amortiguador en las composiciones proporcionadas puede ser entre o entre aproximadamente 1. mM a 100 mM, 10 mM a 80 , mM, 5. mM a 50 mM o 20 mM a 40 mM.

En algunos ejemplos, las composiciones proporcionadas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano y MgCl2 que contiene una enzima degradadora de hialuronano es una hialuronidasa o una cóndroitinasa . En algunos ejemplos, la enzima degradadora · de hialuronano es una hialuronidasa . que es activa en pH neutro. En otros ejemplos, la enzima degradadora de hialuronano carece de un ancla de glicosilfosfatidilinositol (GPI) o no se asocia a la membrana cuando se expresa de una célula. Por ejemplo, , la enzima degradadora de hialu.ronano es una enzima degradadora de hialurbnano que contiene truncamientos C-terminales de uno- .o más residuos de aminoácido para remover todo o parte de un ancla GPI . .

En otros ejemplos, la enzima degradadora de hialuronano es una hialuronidasa que es una PH20 o' un fragmento truncado en C-terminal de la misma. La PH20 puede ser una PH20 no humana o humana. En algunos ejemplos de las composiciones proporcionadas, la PH20 tiene una secuencia de aminoácidos que contiene por. lo menos los aminoácidos 36-464 -de SEQ ID NO: 1, o tiene una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a una : secuencia de aminoácidos que contiene por lo menos, los aminoácidos 36-46.4 de SEQ ID NO: 1 y retiene la actividad de hialuronidasa. Por ejemplo, la PH20 tiene por lo menos 86%, 87%, 88%, .89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos, que contiene por lo menos los aminoácidos 36-464 de .SEQ ID NO: 1 y retiene la actividad de hialuronidasa. En otros ejemplos, el polipéptido PH20. tiene una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición .del aminoácido 465, 466, 467, 468., 469, 470, 471, 472, 473, 4.74, 475, 476, 477, 478, 479., 480,· 481, 482, 483, 484,, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, .493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia dé aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, o es una variante del mismo que muestra por lo menos. 85% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición del aminoácido. 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, .478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496,. 497, 498, 499 o 500 de la secuencia dé aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 y retiene la actividad de hialuronidasa . En ejemplos particulares, la enzima degradadora de hialuronano es una PH20 C-terminal truncada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9.

En. algunos ejemplos, las composiciones proporcionadas que contienen una- cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano y MgCl2 contiene una enzima degradadora de hialuronano en una cantidad que es entre o aproximadamente entre · 10 U/mL a 5000 U/mL, 50 U/mL a .4000 U/mL,. 100 U/mL a 2000 U/mL, 300 Ü/mL a 2000 U/mL, 600 U/mL a 2000 U/mL, 100 U/mL a 1000 U/mL, 200 U/mL a -800 U/mL, 100 U/mL a 500 U/mL,. o 150 U/mL a 300 U/ml, . inclusive. Por ejemplo-, las composiciones contienen una enzima dégradadora de hialuronano en .una cantidad que es por lo menos o es aproximadamente o es 30 U/mL, 35. U/mL, 40 U/mL', 45 U/mL, -5.0 U/mL, 55 U/mL, 60 U/mL, 65 U/mL, 7.0 U/mL,. 75 U/mL, 80. U/mL, 85 U/mL, 90. U/mL, 9.5 U/mL, 100 U/mL, 105 U/mL, 110 U/mL, 1 15 U/mL, 120 U/mL, 125 U/mL, 130 U/mL, 135 U/mL, 140 U/mL, 145 U/mL, 150 U/mL, .155 U/mL, 160 U/mL, 170 U/mL, 180 U/mL, 190 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300¦ U/mL, ' 35'0 U/mL, '400 'U/mL, 450 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/mL o 2000 U/mL.

Se proporcionan en la presente composiciones que contienen una. cantidad terapéuticamente, efectiva de una enzima degradadora dé hialuronano. y MgCl2 en donde el pH de la composición es entre o aproximadamente entre 6.5.a 7.2 y la composición contiene una enzima degradadora de hialuronano en una cantidad que es entre o aproximadamente entre 100 U/mL¦ a 500 U/mL, inclusive; MgCl2 en una concentración¦ que. es entre o aproximadamente ¦ entre 50 mM a 150 mM, inclusive ; ' un surfactante que es polisorbato 80 en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre o aproximadamente entre 0.01% a 0.05%, inclusive; metionina en una concentración que es entre o aproximadamente entre 5. mM a 20 mM, inclusive; y histidina/HCl en ¦ una concentración que es entre -o aproximadamente entre 5 mM a 50 mM, inclusive.

En algunos ejemplos, el volumen de las composiciones proporcionadas es .entre o aproximadamente entre 0.5 a 5.0 mL, 1 mL a 40 mL, 1 mL a 20 mL, 1 mL a 10 mL, o 3 mL a 10 mL, inclusive. Las composiciones se pueden formular para administración usando un vial, jeringa, pluma, depósito para una bomba o un sistema de circuito cerrado. También se proporciona en la presente una jeringa o vial qué. contiene cualquiera de las composiciones proporcionadas en la presente.

Las composiciones' proporcionadas en la presente ¦ que contiene una insulina, tal como una . insulina regular, o un análogo de insulina de acción rápida (por ejemplo aspart, lispro o glulisina u otro análogo de insulina) , se pueden usar en métodos y usos para tratar diabetes. Por ejemplo, se proporcionan en la presente métodos para tratar diabetes al administrar diabetes al administra a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de la composición estable anterior proporcionada en la presente. La diabetes que se. trata incluye diabetes mellitus · tipo 1, diabetes méllitus tipo 2 o diabetes gestacional . '. También se proporcionan en la presente métodos para controlar los niveles de glucosa en la sangre en un sujeto al administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición estable, proporciona en la presente que contiene una insulina de acción rápida. Al practicar los métodos en la presente, las composiciones estables . se administran subcutánea o intraperitonealmente, por ejemplo, a través de una jeringa o pluma de insulina o por infusión subcutánea continua, al practicar los métodos en la presente, las composiciones estables se pueden administrar ' antes de una comida como terapia de insulina prandial . En. los métodos proporcionados en la presente, las composiciones estables se pueden administrar usando un método de administración para lograr una infusión, de insulina subcutánea continua, tal como a través de una bomba de insulina o un sistema de bucle cerrado. En algunos casos, los métodos proporcionados en la presente incluyen administrar otro fármaco antidiabético, que se selecciona de entre, pero no se limita a, sulfonilureas , biguanidas, meglitinidas, tiazolidinedionas , inhibidores de alfa- glucosidasa, análogo de péptido, incluyendo análogos de péptido similar a glucagón (GLP) y, análogos de péptido inhibidor gástrico (GIP) e inhibidores de DPP-4.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A. Definiciones B. FORMULACIONES DE ENZIMA DEGRADADORA DE HIALURONANO Y GENERACIÓN DE CO-FORMULACIONES DE INSULINA 1. Formulaciones de Enzima Degradadora de H aluronano 2. Formulaciones de Insulina dé Acción Rápida 3. Enzima Degradadora de Hiáluronano y Co-Formulacionés de Insulina a. Requerimientos opuestos para estabilidad i. Conservadores ii. NaCl y pH b. Co-Formulación Compatible C. ENZIMAS DEGRADADORAS DE HIALURONANO 1. Hialuronidasas a. Hialuronidasas de tipo mamífero PH20 b. Hialuronidasas Bacterianas c. Hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos 2. Otras enzimas degradadoras de hialuronano 3. Enzimas degradadoras de hialuronano truncadas u otras formas solubles a. PH20 humana truncada C-terminal b. rHuPH20 4. Glicosilación de las enzimas degradadoras de hialuronano 5. Modificaciones de las enzimas degradadoras de hialuronano para mejorar sus propiedades farmacocinéticas D . FORMULACIONES DE ENZIMAS DEGRADADORAS DE HIALURONANO ESTABLES 1. Enzima Degradádora de Hialuronano 2. Catión Divalente 3. pH y solución amortiguadora 4. Surfactante 5. agente Anti-Oxidación 6. Modificador de Tonicidad 7. Otros Agentes o Excipientes 8. Formulaciones de Enzimas Degradadoras de Hialuronano Estables Ejemplares E. POLIPÉPTIDOS de INSULINA Insulinas de acción rápida a . Insulina regular b. análogos de acción rápida (también llamados Insulina de acción rápida) i. Insulina lispro ii . Insulina aspart iii. Insulina glulisina F. CO-FORMULACIONES ESTABLES DE INSULINA Y ENZIMA DEGRADADORA DE HIALURONANO 1. Componentes de Co-Formulaciones Estables a. Insulina de Acción Rápida b. Enzima Degradadora de Hialuronano c. Conservador d. NaCl e. pH £. solución amortiguadora g. Lys-Lys h. Excipientes Estabilizantes Ejemplares adicionales i . Surfactantes ii. Modificador de Tonicidad iii . Glicerina iv. Antioxidantes v. Zinc vi. estabilizador de Aminoácido vii. Inhibidor de Hialuronidasa viii . Compuesto Nicotinico ix. Otros Excipientes o Agentes 2. Co-formulaciones Estables Ejemplares a. CO-Formulaciones de Inyección de Múltiples Dosis Ejemplares (MDI) b. Co-formulaciones de Infusión de Insulina Subcutánea (CSII) Continuas Ejemplares c. Co-Formulaciones de Lys-Lys Ejemplares G. DOSIFICACIÓN Y ADMINISTRACIÓN Modo de administración a . Jeringas b. Pluma de insulina c. Bombas de insulina y otros dispositivos de suministro de insulin d. Sistemas de Bomba de Infusión Continua i. Sistemas de circuito abierto 11. Sistemas de circuito cerrado H, MÉTODOS PARA PRODUCIR ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN UNA INSULINA O ENZIMA DEGRADADORA DE HIALURONANO Y POLIPÉPTIDOS DE LOS MISMOS I. Vectores y Células 2. Porciones Ligadoras 3. Expresión a. Células Procarióticas b . Células de Levadura c. Células de Insecto d. Células de Mamífero e. Plantas 4. Técnicas de Purificación I. MÉTODOS PARA EVALUAR LA ESTABILIDAD Y ACTIVIDAD 1. Insulina 2. Enzimas degradadoras de Hialuronano J. USOS TERAPÉUTICOS 1. Diabetes Mellitus a . Diabetes tipo 1 b. Diabetes tipo 2 c. Diabetes gestacional 2. Terapia de insulina para pacientes criticamente enfermos ?. TERAPIAS DE COMBINACIÓN L. ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN Y KITS ?. EJEMPLOS A. DEFINICIONES A menos que., se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por una persona de experiencia en el campo a la cual las invenciones pertenecen. Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes publicadas y publicaciones, secuencias de GENBANK, . sitos de la red y otros materiales publicados referidos por toda la descripción completa en este documento, a menos que se indique de otra manera, se incorporan a manera de referencia en su totalidad.. En caso de que exista . una pluralidad de definiciones para, los 'términos en la presente, aquellos en esta sección prevalecerán. Donde se hace . eferencia a una URL u otro identificador o dirección, se entiende que tales identificadores pueden cambiar y la información particular en el internet puede venir e ir, pero la información equivalente se conoce y se puede acceder fácilmente, tal como al buscar en el internet y/ó bases de datos apropiadas. La referencia, a la misma evidencia la disponibilidad . y diseminación pública de esta información.

Como se usa en la presente, "insulina" se refiere a una hormona, precursor o análogo sintético p recombinante del mismo. que actúa para incrementar la captación y almacenamiento de glucosa y/o disminuir la producción de glucosa endógena .. .Una . insulina humana ejemplar se traduce como ' un polipéptido precursor de 110 aminoácidos, preproinsulina . (SEQ ID NO: 101), que contiene un péptido señal de 24 aminoácidos que dirige la' proteína al retículo endoplásmico (ER) en donde la secuencia señal se escinde, danto por resultado la proinsulina (SEQ ID NO: 102) . La proinsulina se procesa adicio almente. para liberar el péptido de cadena C- o de conexión de 31 .aminoácidos (que corresponde a los residuos de aminoácido 57 ao 87 del polipéptido de preproinsulina expuesto en SEQ ID NO: 101, y a los residuos de aminoácido 33 a '63 del polipéptido de proinsulina expuesto en SEQ ID NO: 102). La insulina, resultante contiene una cadena A de 21 aminoácidos (que corresponde a los residuos de aminoácido 90 a: 110: del polipéptido de preproinsulina expuesto en SEQ ID . O: 101, y a los residuos de aminoácido 66 a 86 del polipéptido de proinsulina expuesto en SEQ ID NO: 102) y una cadena B de 30 aminoácidos (que corresponde a los residuos de aminoácido 25 a 54 del polipéptido de preproinsulina expuesto en SEQ ID NO: .101, y a los' residuos de aminoácido 1 a 30 del polipéptido de proinsulina expuesto en SEQ ID NO: 102) que se ligan de manera cruzada por las ligaciones de disulfuro. Una insulina humana apropiadamente reticulada contiene tres puentes de disulfuro: uno entre la posición 7 de la cadena A y la posición 7 de la cadena B, una segunda posición 20 entre la cadena A y la posición 19 de la cadena B, y una tercera posición entre .6 y 11 de la cadena A. La referencia a la insulina incluye preproinsulina, proinsulina y polipéptidos de- insulina en formas de .cadena individual o de dos cadenas, formas truncadas de las mismas que tienen actividad, e incluyen variantes alélicas .y variantes de especies, variantes codificadas por las variantes de empalme, y otras- variantes, tal como análogos de insulina, incluyendo polipéptidos que tienen por . lo menos 40%, 45%, 50%, 55%., 60%, 65%, 70%, .75%, 80%, 85%, 90%,- 95%, 96%, 97%,. .98%, . 99% o más de identidad de secuencia al polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 101 o la forma madura del mismo. Los análogos de insulina, ejemplares incluyen aquellos expuestos en SEQ. ID NOS: 147-149, lb , y aquellos que contienen, una cadena A expuestos en SEQ ID NOS: 150, 156, 158, 160, 162 y 164 y/o una cadena B expuesta en SEQ ID NOS: 151, 153-155, 157, 159, 161, 163 y 165.

Los polipéptidos de insulina ejemplares son aquellos de origen de mamífero, incluyendo humano. Las ^secuencias de aminoácidos ejemplares de insulina de ; origen humano se exponen en SEQ ID NOS: 101-104. Los análogos de. insulina ejemplares incluyen aquellos expuestos en SEQ ID NOS: 147-149, 152, y aquellos que contienen una cadena A expuesta en SEQ ID NOS: 150, 156, 158, 160, 162 y 164 y/o una cadena B expuesta, en SEQ ID NOS: 151, 153-155, 157, 159, .161, 163 y 165. Los polipéptidos de insulina también .incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero no limitado a, cualquiera de los polipéptidos de insulina precursores expuestos en SEQ ID NOS: . 105-146. La referencia' a , una insulina incluye insulinas monoméricas y multiméricas, incluyendo insulinas hexaméricas, así como .insulinas humanizadas.

Como se usa en¦ la presente, "insulina de acción rápida" se refiere a cualquier insulina o composición de insulina de acción rápida para administración aguda a un suj etó, diabético en respuesta una . condición hiperglicémica actual, percibida o anticipada en el'.-, sujeto que surge en' el momento de, o de entre aproximadamente 4 horas después, de la administración de la insulina de acción rápida . (tal como una condición hiperglicémica prandial que resulta o anticipada a resultar de, el consumo de una comida) , mediante lo cual la insulina de acción rápida es capaz de prevenir, controlar o mejorar la condición hiperglicémica aguda. Típicamente una insulina de acción rápida es una insulina que muestra niveles de insulina pico en o aproximadamente no más de cuatro horas después ' de la administración subcutánea a un sujeto. Las insulinas de acción rápida incluyen insulinas récombinantes e insulinas aisladas (también referidas como insulinas "regulares") tal como la insulina vendida como HumulinMR R, insulinas porcinas e insulinas bovinas, así como análogos de, insulina de acción rápida (también llamados, análogos de insulina de .acción rápida en la presente) diseñados para hacer de acción rápida en, virtud de cambios de aminoácido. Las preparaciones de insulina regulares ejemplares, incluyen pero no sé limitan a, insulinas regulares humanas, tales como aquellas . vendidas bajo las marcas comerciales HumulinMR R, NóvolinMR R y VelosulinMR, Insulin Human, USP e Insulin Human Injection, USP, así como formulaciones acidas de insulina, tales como, por ejemplo, Toronto Insulin, Oíd Insulin,. y Clear Insulin, e insulinas de cerdo, regulares, tal como Iletin IIMR (insulina porcina) . Las insulinas . regulares tienen típicamente un inicio de .acción de entre 30 minutos a una hora, y un nivel de insulina pico de '2-5 horas post-administración .

Como se usa en l presente, los análogos de insulina de acción .' rápida (también llamados análogos de insulina de acción rápida) son. insulinas que tienen un inicio rápido de acción. Las insulinas rápidas son típicamente análogos de insulina que se han diseñado, tal como por la introducción de una o más instituciones de aminoácido, para ser más de acción rápida que las insulinas regulares. Los análogos de insulina de acción rápida tienen típicamente un inicio de acción de 10-30 minutos pos-inyección, con niveles de insulina picos observados 30-90. minutos pos-inyección/ Los análogos, de insulina de acción rápida ejemplares ' incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, insulina lispro (por ejemplo insulina HumalogMR) , insulina aspart (por ejemplo insulina NovoLogMR) , e insulina . glulisina (por ejemplo insulina ApidraMR) la composición de insulina de acción rápida vendida como VIAjectMR y VIAtabMR (véase, por ejemplo, Patente de EUA No. 7 , 279 , 457 ). También se incluyen cualquiera de. otras insulinas que tienen un inicio de acción de 30 minutos o menos y un nivel pico antes de 90 .minutos, típicamente -30-90 minutos pos-inyección. , Cómo se usa/ en la presente, una insulina humana se refiere a una insulina que es sintética o producida recombinantemente basada en el polipéptido humano, que incluye variantes alélicos y análogos de los mismos.

Como se usa en la presente, las insulinas humanas de acción rápida o composiciones de insulina de acción rápida humanas incluyen cualquier insulina humana o composición de una insulina humana que sea de acción rápida, pero excluye las insulinas no humanas,. tal como insulina de cerdo regular.

Como se usa en la presente, los "insulinas de acción basal," o "insulinas básales" se refieren a las insulinas administradas para mantener un nivel de insulina basal como parte de un régimen de tratamiento general para tratar una condición crónica tal como diabetes. Típicamente, la insulina de acción basal se formula para mantener un nivel de insulina de ' estado aproximadamente permanente por la liberación controlada de insulina cuando se administra periódicamente (una vez o dos veces diarias) . Las insulinas de- acción basal incluyen insulinas cristalinas (por ejemplo NPH y LenteMR, insulina protamina, insulina' surfen) , análogos de insulina basal (insulina glargina, HOE 9.01, NovoSol Basal), y otras formulaciones químicas de insulina (por ejemplo goma arábiga, lecitina o suspensiones de aceite) que retardan la . velocidad de absorción de la insulina regular. Como se usa en la presente, las insulinas de acción basal pueden incluir insulinas que se ¦ entienden ' típicamente como de acción prolongada (típicamente que alcanzan una concentración pico relativamente baja,: mientras que tienen una duración máxima de acción durante aproximadamente 20-30 horas) o de acción intermedia (que provocan típicamente concentraciones de insulina pico a aproximadamente. 4.-12 horas después de la administración) Como se usa en la presente, los términos "condición hiperglicémica" o "hiperglicemia" se refieren a. una elevación indeseada en la. glucosa en la. sangre.

Como se usa en la presente el término "condición hipoglicémica" o "hipoglicemia" se refiere a una ' reducción indeseada en la glucosa en la sangre..

Como se usa en la presente, el control glicémico o "controlar los niveles de' glucosa en la sangre" se refiere al mantenimiento de concentraciones de .glucosa en. la sangre en un nivel deseado, típicamente entre 70-130 mg/dL o 90-1 10 mg/dL.

Como se usa en la presente, un sistema de circuito cerrado en un sistema integrado para proporcionar un control glicémico continuo.. Los sistemas de circuitos cerrados contienen un mecanismo . para medir la glucosa en la sangre, un mecanismo para administrar una ' o más composiciones, incluyendo una composición de insulina, y un mecanismo para determinar la cantidad de insulina necesaria para ser administrada para lograr el control glicémico. Típicamente, por lo tanto, los sistemas de circuito cerrado, contienen un sensor de glucosa, un dispositivo, de administración de insulina, tal como una bomba de insulina, y un controlador que recibe información del sensor de glucosa y proporciona comandos al dispositivo de administración de /insulina'. Los comandos se pueden generar por software en el controlador. El software incluye típicamente un algoritmo para . determinar la cantidad de insulina requerida al ser administrada para lograr el control- glicémico, con base en los niveles de glucosa en la sangre detectados por el sensor de glucosa o anticipados por el usuario. Un sistema de circuito' abierto se refiere a dispositivos similares, excepto que los dispositivos no . miden y responden automáticamente a los niveles de glucosa.

Como se usa en la presente, . régimen de dosificación sé refiere a la cantidad de insulina administrada y la frecuencia de administración. El régimen de dosificación es una función de la enfermedad o condición que se. trata, y de esta manera puede¦ variar .

Como se usa en la presente, una enzima degradadora de hialuronano se refiere a una enzima que cataliza la escisión de un polímero: de. hialurano (también referido como un ácido hialurónico o HA) en fragmentos de peso molecular más pequeños. Ejemplares de las enzimas degrad doras de hialuronano son las hialuronidasas , y en particular condroitinasas y. liásas que tienen la capacidad de despolarizar el hialuronano. Las condroitinasas ejemplares que son enzimas degradadoras de hialuronano incluyen, pero ño se limitan a, condroitina ABC liasa (también conocida como condroitinasa ABC) , condroitina AC liasa (también conocida como condroitina sulfato liasa o condroitina. sulfato eliminasa) y condroitina C liasa. La Condroitina ABC liasa contienen dos enzimas, condroitina-sulfato-ABC¦ endoliasa (EC 4.2.2.20) y condroitina-sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2/2.21). Una condroitina-sulfato-ABC endoliasas ejemplares y condroitina-sulfato-ABC exoliasas . incluyen, pero no se limitan a, aquellas de Proteus vulgaris y Flavóbacterium heparinum (la condroitina-sulfato ABC endoliasa de Proteus vulgaris se expone en SEQ ID NO: 98; Sato y colaboradores; (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. .41 (1) : 39-46) . ' Las enzimas condroitinasa AC. ejemplares de las bacterias incluyen, pero no¦ se limitan a, aquellas de Flavobacterium heparinum, expuesta en SEQ ' ID NO: 99, Victivallís vadensis, expuesta en SEQ ID NO: 100 y Arthrobacter aurescens (Tkalec y colaboradores (2000) Applied and Environmental Microbiology 66 (1) : 29-35; Ernst y colaboradores (1995). Criti'cal^ Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30 (5) : 387-444).. Las enzimas condroitinasas C ejemplares de las bacterias incluyen, pero no se limitan a, aquellas .de Streptococcus y Flavobacterium (Hibi y colaboradores (1989) FEMS-Microbiol-Lett. .48(2): . 121-4; Mic elacci y colaboradores (.1976) J. Biol. Che . 251: 1154-8; Tsuda y colaboradores (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133). · Como se usa en la presente, la hialuronidasa se refiere a una, clase de enzimas degradadoras de hialuronanó. Las hialuronidasas incluyen hialuronidasas bactrianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1) , hialuronidasas de sangui uelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36), e hialuronidasas dé tipo mamífero (EC 3.2.1.35). Las Hialuronidasas incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero no limitado a, murino, canino, felino, leporino, aviar, bovino,- ovino, porcino, equino, piscino, ranino, bacteriano, y cualquiera de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos.' Hialuronidasa no humanas ejemplares .incluyen, hialuronidasas de vacas (SEQ ID NOS: 10-, 11, 6 y BH55 (Números de Patente de EUA, .747, 027:' y 5,827,721), avispa.de chaqueta · amarilla' (SEQ ID NOS : 12 y 13), abeja de la miel (SEQ ID NO:14), avispón de clara blanca (SEQ ID NO: 1.5), avispa de papel (SEQ ID NQ:16),. ratón (SEQ ID NOS¦': 17-19, 32), cerdo ( SEQ ID NOS : 20-21 ) , rata (SEQ- ID NOS í.22-24., 31), conejo (SEQ ID NO:25), oveja (SEQ ID NOS.:26, 27, 63 y 65), orangután (SEQ ID NO:28), mono cynomo.lgus (SEQ ID NO:29), cobayo (SEQ ID NO:30), chimpancé (SEQ ID. NO:185), mono Rhesus (SEQ ID NO: 186), Arthrobacter sp (cepa FB24) (SEQ ID NO: 67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO: 68), Propionibácterium acnés (SEQ ID NO: . 69), '.. Streptococus agalactiae (SEQ ID NO: 70) ; 18RS21 (SEQ ID NO: 71) ; serotipo 'la (SEQ ID NO: 72) ; serotipo III (SEQ ID NO : 73 ) , , Stafilococus aureus (cepa COL.) .(SEQ'; ID NO:74); cepa MRSA252 (SEQ. ID NOS : 75 y 76); cepa MSSA476 (SEQ ID NO:77); cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO: 78); cepa RF122 de bovino (SEQ ID NOS: 79. y 80); cepa USA300 (SEQ ID NO:81), Streptococus pneumoniae . ^(SEQ ID NO:82) ; cepa ATC'C;. BAA-255 / R6 (SEQ ID NO:83)'; serotipo 2, cepa D39 / NCTC 7466 (SEQ ID NO : 84 ),'. Streptococus piogenes (serotipo Mi) (SEQ ID NO: 85); serotipo M2, cepa MGAS10270 (SEQ ID NO: 86); serotipo M , cepa MGAS107.50 (SEQ ID NO: 87); serotipo M6 (SEQ ID NO:88); serotipo MI2, cepa MGAS2096 (SEQ ID NOS:8,9 y 90); serotipo M12, cepa MGAS9429 (SEQ ID NO:91)> serotipo M28 (SEQ ID NO: 92); Streptococus suis (SEQ ID NOS:93-95); Vibrio fischeri (cepa ATCC 700601/ ESI 14 (SEQ ID NO: 96)), y la enzima de hialuronidasa de. Streptomyces' hialuronoliticus, que es especifica para el ácido hialurónico y no escinde la condroitina o el sulfato de condroi.tina ( (Ohya, T. y Kaneko, Y. (1970) Biochím. Biophys. Acta 198:607). Las hialuronidasas también incluyen aquellas de origen humano. Hialuronidasas humanas ejemplares incluyen HYAL1 (SEQ ID NO: 36),' HYAL2 (SEQ ID NO: 37), HYAL3 (SEQ ID NO:38), HYAL4 (SEQ ID. NO : 39 ) , y PH20 (SEQ ID NO: 1)_. también se incluyen entre las hialuronidasas las hialuronidasas solubles, incluyendo, PH20 humana y de bovino, PH20 humana soluble y rHuPH20. Ejemplos de . hialuronidasas: solubles bovinas . u ovinas . comercialmente disponibles . VitraseMR (hialuronidasa ovina) y AmphadaseMR (hialuronidasa bovina).

La referencia a la enzima degradadora de hialuronano, hialuronidasa o ' PH20 incluye polipéptidos de enzima degradadora de hialuronano precursores y polipéptidos de enzima degradadora de hialuronanos maduros (tales como aquellos en los. cuales una secuencia señal se ha removido) formas truncadas de los mismos que tienen actividad, (por ejemplo C-terminalmente truncadas), e incluye variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de empalme, y otros variantes, incluyendo polipéptidos que tienen por lo menos 40%, 45%, .50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de. secuencia a los polipéptidos precursores expuestos en SEQ ID NOS: 1 y 10-48, 63-65,. 67-100, o la forma madura de los mismos. Por ejemplo, la referencia a la enzima degradadora de hia.luronano (por ejemplo PH20) incluye la.PH20 humana madura expuesta en SEQ ID NO: 2 y formas truncadas de la misma que tienen actividad, e incluyen variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas con variantes de empalme y otras variantes incluyendo polipéptidos que tienen por lo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,. 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a SEQ .ID. NO: 2. Por ejemplo, la referencia a la enzima degradadora de hialuronano también incluye las variantes del polipéptido precursor PH20 humano expuestas en SEQ ID NOS: 50-51. Las enzimas degradadoras de hialuronano también incluyen aquellas que contienen modificaciones químicas o pos-traduccionales y aquellas que ¦ no contienen modificaciones químicas o pos-traduccionales: . Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, pegilación, albúminación, glicosilación, . farnesilación, carbo.xilación, hidroxilación, fosforilación, y otras modificaciones de polipéptido conocidas en la técnica.

Como se usa en la presente, la PH20. se refiere a un tipo de hialuronidasa que se presenta en el esperma y es neutra-activa. La pH-20 se presenta sobre la superficie de los espermatozoides, y. en. el acrosoma derivado del ' lisosoma, donde se liga a la membrana acrosomal interna. La PH20 incluye aquellas de cualquier origen incluyendo, pero no limitado a, humano, chimpancé, mono Cynomolgus, mono Rhesus, murino,: bovino, ovino, cobayo, conejo y de origen¦ de. rata. Las proteínas PH20.ejemplares incluyen, . pero no se limitan a, ¦polipéptidos de^ PH20 de humano (polipéptido precursor expuesto en. SEQ ID NO:' 1, polipéptido maduro expuesto én SEQ ID NO: 2), bovino (SEQ ID NOS : 11 y 64) , conejo (SEQ ID NO: 25), PH20 de ovino .(SEQ ID NOS: 27, 63 y 65), mono cynomolgus (SEQ ID NO: 29) , cobayo (SEQ ID NO: 30) , rata (SEQ I.D NO: 31), ratón (SEQ ID NO: .32), chimpancé (SEQ ID NO: 185) y mono Rhesus (SEQ ID NO: .186) polipéptidos PH20. La referencia a la PH20 incluye polipéptidos PH20 precursores y polipéptidos PH20 maduros (teles como aquellos en los cuales se ha removido una secuencia señal) , formas truncadas de los mismos que¦ tienen actividad, e incluye . variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de empalme, y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen por lo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, .'75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a los polipéptidos precursores expuestos, en SEQ ID NO: 1, 10, 25, 27, 30-31, 63-65, 185-186, o las formas maduras de los mismos. Los polipéptidos PH20 también incluyen aquellos que contienen modificaciones químicas o pos-traduccionales y aquellos que no-', contienen modificaciones químicas pcs-traduccionalés . Tales modificaciones incluyen, pero no se limita a, PEGilación, . albúminación, glicosilación, farnesilación, carboxilación, hidrpxilación, fosforilación, y otras modificaciones de. polipéptidos conocidas en la técnica. Ejemplos de hi.aluronidasas ' solubles de bovino u : ovino comerciaimente disponibles son hialuronidasa VitraseMR (hialuronidasa. de ovino) e hialuronidasa Amfada-saMS (hialuronidasa de bovino) .

Como se usa en la presente, una hialuronidasa soluble se refiere a un polipáptido que se secreta de células y no se ancla o se asocia a la membrana, y per consiguiente se .puede caracterizar por' su solubilidad bajo condiciones fisiológicas. Las hialuronidasas solubles se pueden distinguir, por ejemplo, por su particiónamiento en la fase acuosa de una solución Tritón X-114 calentada a. 37°C (Bordier y colaboradores (1981) J.. Biol. Chem. , 256: 1604-7). Las hialuronidasasa . ancladas a la membrana, tal como hialuronidasas ancladas a lipidos, se dividirán en la fase rica en, detergente, pero se dividir en la fase deficiente del tratamiento o acuosa después del tratamiento con la Fosfolipasa-C . Incluidas entre la hialuronidasas solubles, son las hialuronidasas ancladas en la membrana en las cuales una o más regiones asociadas con el anclaje, de la hialuronidasa a la membrana se ha removido o modificado, donde la forma soluble retiene la actividad . de hialuronidasa. Por consiguiente, la hialuronidasa soluble, tal como polipéptidos PH20 solubles, incluyen formas truncadas de los mismos, por ejemplo., C-terminalmente truncadas en las cuales falta uno o más aminoácidos del ancla de glicosilfosfatidilinositol (GPI)... Las hialuronidasas solubles incluyen hialuronidasas solubles recombinantes aquellas obtenidas en o purificadas en fuentes naturales, tales como por ejemplo, extractos de testículos de ovejas o vacas. Ejemplar de estas hialuronidasas solubles son la PH20 humana. . Otras hialuronidasas solubles incluyen PH20 de ovino (SEQ ID NOS:27, 63, 65) y de bovino (SEQ ID NOS: 11, 64) PH20.

Como se usa en. la presente, PH20 o sHuPH20 humano soluble incluyen polipéptidos PH20 maduros que' carecen de todo o una porción del sitio de unión ¦ de glicosilfosfatidilinositol (GPI) en la C-terminal tal que la en la expresión, los polipéptidos no se asocian- con la membrana de una célula hospedera en . la cual se producen de modo que están secretados y, de esta manera solubles ; en el medio de cultivo celular'. Por consiguiente, la PH20 humana soluble incluye ¦polipéptidos. ??2?. humanos .truncados C-terminales. Los polipéptidos PH20 solubles o. truncados C-terminal ejemplares incluyen polipéptidos maduros que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9, 47-48, 234-254, y. 267-273, o un polipéptido que muestra por lo menos. 70%, 75%, 80%, 85%., 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, . 98%, .99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9, 47-48, 234-254, y 267-273. Los polipéptidos sHuPH20 incluyen polipéptidos maduros que ' tienen una secuencia de aminoácido expuesta en cualquiera de SEQ ID. NOS:4-9 y 47.-48. Los polipéptidos precursores tales como polipéptidos sHuPH20 ejemplares incluyen una secuencia señal. Ejemplares de los precursores son aquellos expuestos en SEQ ID NOS : 3 y 40-46, cada uno de cual contiene una secuencia señal de 35 aminoácidos en las. posiciones de aminoácido .1-35. Los polipéptidos. HupH20 solubles también incluyen ' aquellos degradados durante o después de los métodos de , producción y purificación descritos en la presente.

Como se usa en la presente, una PH20 humana recombinante preferida como rHuPH20 se refiere a una forma soluble secretada de PH20 humana que se expresa recombinañtemente en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) . La rHuPH20 soluble es el producto producido por el ácido nucleico que codifica una secuencia señal, tal. como la secuencia señal .nativa, e incluye ácido nucleico que codifica los aminoácidos 36-482 y por el cual una secuencia ejemplar, que incluye el ácido nucleico que codifica la secuencia señal nativa se expone en SEQ ID NO: 49. También se incluyen moléculas de DNA que son variantes alélicas de las mismas y otras ariantes solubles. El ácido nucleico que codifica la rHuPH20 soluble se expresa en células CHO, que secretan el pólipéptido maduro.. Como es producido en el medio de cultivo, existe heterogeneidad en la C-terminal de. modo que el producto incluye una mezcla de especies que pueden- incluir cualquiera o más de SEQ ID NOS: 4-9 en abundancia variada. Las variantes . alélicas correspondientes y otras variantes también se incluyen, incluyendo aquellas que corresponden a : los polipéptidos PH2Ó humanos precursores expuestos en SEQ ID NOS: 50-51. Otras variantes pueden tener 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, .91%, 92%., 93%, 94%, 95%, 96%,. 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOS:4-9 y 47-48 siempre y cuando retengan una actividad de hialuronidasa y sean solubles .

Como se usa en la presente, "composición de insulina de acción súper rápida" se refiere a una. composición de insulina que contiene una insulina de acción rápida, particularmente un análogo de insulina' de . acción rápida, tal como un análogo de insulina con' una insulina de inicio más rápido, y una enzima degradadora de hialuronano (tal como una,, pero no limitado a, preparaciones de rHuPH20), tal que la composición de insulina, durante los primeros cuarenta minutos después de la administración .parenteral a un sujeto proporciona, una exposición de insulina sistémica cumulativa en el sujeto que es mayor que la exposición de insulina sistémica cumulativa administrada al sujeto durante el mismo periodo después de la administración de la misma dosificación de una insulina de acción , rápida, por , la misma vía, en ausencia., de la enzima degradadora de hialuronano. La composición de insulina de acción súper rápida puede incluir opcionalmente una insulina de acción basal . .

Como se usa. en la presente, una formulación se refiere a una composición qué contiene por lo. menos un agente activo, o farmacéutico y uno o más excipientes...

Como se usa en la presente, un co-formulación se refiere a una composición que contiene dos o más agentes activos o farmacéuticos y uno o más excipientes. Por ejemplo, una' co- formulación de un insulina de acción rápida y una enzima degradadora de hialuronano contiene una insulina de acción rápida, una enzima degradadora de hialuronano y uno o más excipientes .

Como se. usa en la presente, una. composición se dice que es estable bajo condiciones definidas si los ingredientes activos en la misma, retiene por lo menos un nivel requerido de actividad y/o pureza y/o potencia o recuperación comparada con la actividad inicial y/o pureza y/o potencia o recuperación. Para . propósitos en la presente, una composición es . estable si retiene por lo menos 50% .de la actividad de la ¦enzima degradadora' de hialuronano y/o si retiene por lo menos 90% de la potencia o recuperación de insulina y/o por lo menos 9G% de la pureza de insulina.

Como se usa en .la presente, una co-formulación estable, que contiene por lo . menos dos ingredientes activos, es estable., si cada ingrediente activo tiene por lo menos el nivel requerido de actividad y/o pureza y/o potencia o recuperación, comparado con la actividad inicial y/o pureza y/o. potencia o recuperación. Para propósitos en la presente, una co-formulación es'· estable si retiene por lo menos 50% dé la enzima degradadora de hialuronano y se retiene por lo menos 90% de la potencia o recuperación de la insulina y/o por lo menos 90% de la pureza de la insulina.

Como se usa . en la presente, condiciones definidas se refiere a las condiciones de almacenamiento y/o uso.

Como se usa en la presente, "almacenamiento"' significa que la formulación no se administra inmediatamente a un sujeto una vez preparada, sino se mantiene por un período de tiempo bajo condiciones particulares (por ejemplo temperatura particular; tiempo, forma liquida liofilizada) antes del uso. Por ejémplo, una formulación líquida se puede mantener durante días,. semanas, meses . o años, antes. de la administración a. un sujeto bajo temperaturas, variadas tal como refrigerada (0o a 10° C, tal como 2° . C · a B° C) , temperatura ambiente- (por ejemplo temperatura .hasta 32° C, tal como 18° C a aproximadamente o a 32° C) , o temperatura elevada (por ejemplo 30° C a 42° C, tal como 32°. C a 37° C -o 35° C a 37° C) .

Como se usa en la presente, "uso", con referencia a una condición asociada a la estabilidad se refiere al acto de emplear la formulación para un. propósito específico.. Las aplicaciones particulares pueden influir en la actividad o propiedades de una proteína o agente. Por ejemplo, ciertas aplicaciones pueden requerir ' que la formulación , se someta a ciertas temperaturas durante ciertos periodos de tiempo, se somete a fluctuaciones a temperatura y o se somete a agitación, u otro movimiento similar que puede afectar la estabilidad (por ejemplo actividad y/o solubilidad) de lós agentes activos. Ejemplares de una condición son los métodos de infusión continuos, mediante los cuales, los. agentes activos se infunden continuamente de un sujeto desde una bomba asociada al usuario o infusor sobre un curso de varios días. Tal condición se puede asociar con agitación y fluctuaciones en temperatura.

Como se usa en la presente-, las condiciones definidas para almacenamiento, o uso. bajo las cuales la estabilidad se mide incluyen condiciones de . temperatura, tiempo de condiciones de almacenamiento y/o condiciones de uso. Por ejemplo, las. condiciones de temperatura definidas incluyen temperaturas bajas o refrigeradas de 2o C a 8° C, temperaturas ambientales de 20° C a 30° C o temperaturas elevadas de 32° C a 40° C. En otro ejemplo, condiciones de tiempo definidas se refiere a la longitud de almacenamiento bajo condiciones., de temperaturas variadas, tal. como almacenamiento durante días (por - lo menos 3 días,. 4 días, .5 días, 6 días o 7 días), semanas (por lo menos una semana, por lo menos dos semanas, ' por lo menos tres, semanas o por lo menos cuatro semanas) o meses (por lo menos 1 meses, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 12- meses, 18 meses, '24 meses o más) . En un ejemplo adicional, condiciones de uso definidas se refiere a las condiciones que interrumpen o alteran la mezcla de composición, tal como condiciones de agitación .

Como se usa en la presente,' una formulación de dosificación individual se ' refiere formulación o co-formula.ción para, administración, directa. Generalmente, una formulación de dosificación individual es una formulación que contiene una sola dosis de agente terapéutico para administración directa. Las' formulaciones de dosificación individual no contienen generalmente ningún conservador.

Como se usa en la presente, una formulación de múltiples dosis se refiere a la formulación que contiene múltiples dosis de un agente terapéutico y que se puede administrar directamente para proporcionar varias dosis individuales del agente terapéutico. Las dosis se pueden administrar durante el curso de minutos, horas, semanas, días o meses. Las formulaciones de múltiples dosis pueden permitir el ajuste de las dosis, agrupación de la dosis y/o separación de la dosis. Debido a que las formulaciones de múltiples dosis se usan, a través del tiempo, contienen- en general uno o más conservadores para prevenir el crecimiento microbiano. Las formulaciones de múltiples dosis se pueden formular para inyección o infusión (por ejemplo infusión continua).

Como se usa en la presente, una "co-formulación . de inyección de múltiples dosis estable- (MDI)" se refiere a una co-formulación estable . que es estable durante por lo menos .6 meses a una temperatura de o de aproximadamente 2°C a 8°C y/o durante por lo menos 14 días a una .temperatura de o de aproximadamente 20 °C a 30 °C, tal que el nivel requerido de actividad . y/o pureza y/o potencia o . recuperación se retiene durante el tiempo ' definido y la temperatura comparada con la actividad inicial y/o. pureza y/o potencia o recuperación. Por ejemplo, una formulación de inyección de múltiples estable retiene por lo menos 50% .de la actividad de la enzima degradadora de hialuronano y por lo menos 90% de la potencia o recuperación de la insulina y/o por lo menos. 90% de la pureza de la insulina durante por' lo menos 6 meses a una temperatura de o de aproximadamente.2°C a 8°C y/o durante por lo menos 14 días a una temperatura de o de aproximadamente 20 °C a. 30 °C.

Como se usa en la. presente, una "formulación de infusión de insulina continua estable" se refiere a una co-formulación estable que es estable durante por lo menos 3 días . a una temperatura de o de aproximadamente 32°C a 40°C, tal qué el nivel requerido de. actividad y/o pureza y/o potencia ..o recuperación se retiene durante el tiempo definido y . la temperatura comparada con la actividad inicial y/o pureza y/o potencia o recuperación. Por ejemplo, una formulación de infusión de insulina continua estable retiene por lo menos 50% de la actividad de la enzima degradadora de hialuronano y por 90% de la potencia o recuperación de la insulina y/o por lo menos 90% de la pureza de la insulina durante por lo menos 3 días en una temperatura de o de aproximadamente 32°C .a 40°C.

Como se usa en la presente, terapia de infusión de insulina subcutánea continua (CSII). se refiere a un régimen de dosificación de insulina mediante el cual la insulina se administra en velocidades programas durante un curso de varios días de un .infusor o bomba pequeñas subcutáneamente a través de un . equipo' de infusión conectado á la bomba. Típicamente, la terapia CSII continúa durante 2-4 días antes de que el equipo de infusión y el depósito de bomba se reemplacen. El tratamiento combina la liberación de insulina de línea basa continua (velocidad basal) y la dosis de bolo de insulina adicional antes de las' comidas sin respuesta a los altos valores .de glicemia (es decir bolo de corrección) . La terapia CSII usa generalmente un accionadp.r de jeringa accionada por batería, bomba de insulina u otro dispositivo similar para administrar una insulina de. acción rápida, en particular un análogo de insulina, de acuerdo con el régimen de dosificación. Generalmente, la programación de la liberación de insulina de linea base continua se ajusta por un médico para cada paciente. La dosis de bolo se determina con base en las necesidades prandialés y ' las respuestas glicémicas. Por consiguiente' la terapia CSII es especifica del paciente. Estará dentro del nivel de un médico experto y paciente determinar el régimen de dosificación de insulina particular para cada paciente dependiendo de las necesidades del paciente y los. otros parámetros específicos del paciente tales como peso, edad, ejercicio, dieta y síntomas clínicos del paciente .

Como se usa. en la presente, un agente estabilizante se refiere' al compuesto agregado a la formulación . para proteger ya sea la enzima degradadora de hialuronano o insulina o ambas de la degradación, como bajo las condiciones de sal, pH y temperatura en las cuales las co-fo.rmulaciones en la presente sé almacenan o se usan. De esta manera, se' incluyen agentes que previenen a las proteínas de la degradación de otros componentes en las composiciones. Los. agentes estabilizantes de proteínas ejemplares de tales agentes son los aminoácidos, derivados de aminoácido, aminas, azúcares, polioles, sales y soluciones amortiguadoras, ' surfa.ctantes , inhibidores o sustratos y otros agentes como se describe en la presente.

Como se usa en. la presente,. Lisil-lisina (Lys-Lys o dilisina) se refiere a un- dipéptido Lys-Lys , sal, derivado, análogo imitación del mismo. Por ejemplo, la referencia a Lys-Lys. incluye sales de los mismos, tal como la sal dé diclorohidrato de Lys-Lys, es decir diclorohidrato de Lis-Lis (o. diclorohidrato . de dilisina; H-Lys-Lys-OH HCl;) . El diclorohidrato de Lys-Lys se representa por . la . siguiente fórmula : La referencia a Lys-Lys también se refiere a derivados de la ' misma, tal como derivados que contienen grupos protegidos, tales .' como Frríoc-, Noc- o Cbz . Ejemplos de diclorohidratos de Lys-Lys comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a, aquellos disponibles de Sigma Aldrich, RnD Chem., MP Bio, Tetrahedron Scientific Inc., and Crescent Chemical .. Company. Un · diclorohidrato dé Lys-Lys comercialmente disponible . ejemplar' es el diclorohidrato de Lys-Lys disponible de Sigma Aldrich (Product No. L5502) o RnD Chem (Product No. G-2675) .

Como se. usa en la presente., una. prueba de efectividad anti-microbiana muestra la efectividad del sistema conservador, en un producto. Un producto¦ se inocula con una cantidad controlada de organismos específicos. La prueba luego compara el nivel de los microorganismos encontrados en la muestra de control versus la muestra de prueba durante su. período de 28 días. Los parámetros para llevar a cabo una prueba de efectividad anti-microbiana son conocidos por una persona de experiencia en el campo como se describe en la presente.

Como, se usa en la presente, una cantidad . antimicrobianamente efectiva o efectiva anti-microbiana de un conservador se refiere a · una cantidad del conservador que extermina o inhibe la propagación de organismos microbianos en . una muestra que' se puede introducir del almacenamiento ' o uso. Por ejemplo, para recipientes de múltiples' dosis, una cantidad antimicrobianamente efectiva de un conservador inhibe el crecimiento de microorganismos que se pueden introducir de extraer repetidamente las. dosis individuales. USP y EP (EPA y EPB) tienen requisitos anti-microbianos que determinan la efectividad conservadora, y que varían un rigor. Por ejemplo, una cantidad' efectiva anti-microbiana de un conservador es una cantidad tal que por lo menos una reducción unitaria de 1. O logio en los organismos bacterianos se presenta a 7 días después de la inoculación en una · rueba de efectividad conservadora, anti-microbiana (APET) . En un ejemplo particular, una cantidad efectiva anti-microbiana de un conservador es una cantidad tal que por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio en los organismos bacterianos se presenta 7 días después de la inoculación, por lo; menos una reducción unitaria de' 3.0 logio de organismos bacterianos se presenta 14 días, después de la inoculación , por . lo menos ningún, incrementó adicional de los organismos bacterianos se presenta después. de 28 días después de la inoculación; y por lo menos ningún incremento en los organismos ' fúngicos se presenta después de 7 días después de la inoculación. En un ejemplo adicional, una cantidad efectiva antimicrobiana de un conservador es una cantidad tal que por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio de organismos bacterianos se presenta a 24 horas después de la inoculación, por' lo. menos una reducción unitaria de 3.0 logio de organismos bacterianos se presenta 7 días después de la inoculación, ningún incremento adicional , en los organismos bacterianos se presenta después de 28 días después de la inoculación, por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio óe organismos fúngicos se presenta 14 días después de-la inoculación, y por lo menos ningún incremento adicipnal en los organismos fúngicos se presenta .después de 28 días después de la inoculación. En un ejemplo adicional, .una cantidad efectiva microbiana de un conservador es una cantidad tal que por lo menos una reducción unitaria de 2.0 logio de organismos bacterianos a 6 horas después de la' inoculación, 'por lo .menos una reducción unitaria de 3.0 logio de organismos bacterianos se presenta 2.4 horas después de la inoculación, ninguna recuperación de organismos bacterianos se presenta después de 28 días después de la inoculación de la composición con .el inoculo microbiano, por lo menos uña reducción de.' 2.0 logio unid.ades de organismos · fúngicos se presenta a .7. días, después de la inoculación, .y. al menos ningún incremento adicional en los organismos fúngicos se presenta después de 28 días siguientes a la inoculación.

Como se usa en la presente, el "excipiente" se refiere a un Compuesto en una formulación del agente activo que no proporciona el. efecto biológico del agente activo cuando se administra en la ausencia del agente activo. Los excipientes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, sales, soluciones amortiguadoras, estabilizant s, modificadoras de tonicidad, metales, polímeros, surfactantes , conservadoras., aminoácidos y azúcares.

Como se usa en la presente, una "solución amortiguadora" se refiere a una sustancia, generalmente, una solución, que puede mantener su pH constante, a. pesar de la adición de ácidos potentes .o bases potentes e influencias externas de temperatura, presión, volumen o potencial redox. La solución amortiguadora previene el cambio en ' la concentración de otra sustancia química, por ejemplo, sistemas donadores y aceptores de protones que previenen los cambios, marcados en la concentración de ion de hidrógeno (pH) . Los. alores de pH de todas las soluciones amortiguadoras son independientes de temperatura y concentración. La. elección de la solución amortiguadora para mantener un valor o intervalo de pH se puede determinar empíricamente por una persona de experiencia en el campo, basado en la capacidad de amortiguamiento conocido de las soluciones amortiguadoras cónocidas . Las soluciones amortiguadoras ejemplares incluyen pero no se limitan a, solución amortiguadora de bicarbonato,, solución amortiguadora de., cacodilato, solución . amortiguadora de fosfato o solución amortiguadora Tris.. Por ejemplo, la solución amortiguadora Tris ( trometamina) es una. solución amortiguadora basada en amina que tiene una pKa de 8.06 y tiene un intervalo de pH efectivo entre 7.9 y 9.2. Para estas soluciones amortiguadoras de Tris, el; pH se. incrementa a aproximadamente 0..03 unidades por disminución de temperatura de °C y disminuye 0.03 a 0.05 de unidades por dilución de diez veces.

Como se usa en la presente, la aGtividad.se refiere a una actividad funcional o actividades de un polipéptido '. o porción del mismo asociado con una proteína de . longitud completa (completa). Las actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad catalítica o enzimática, antigenicidad (capacidad de ligarse o competir con un polipéptido para ligarse a un anticuerpo anti polipéptido) , inmunogenicidad, . habilidad de formar multímeros, y la capacidad de ligarse específicamente a un receptor o ligando para el polipéptido.

Como se usa en la presente, la actividad de hialuronidasa se refiere a la capacidad de catalizar enzimáticamente la. escisión del ácido hialurónico. El ensayo XXII de la Farmacopea de Estados Unidos (USP) para la hialuronidasa determina la actividad de la hialuronidasa directamente al medir la cantidad de ácido hialurónico de peso molecular más alto y sustrato de hia.luronano (HA) permanece después de que la enzima se deja reaccionar con el AH durante 30 minutos a 37°C (USP XXII-NF XVII (.1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD) . Una Solución Estándar de Referencia se puede usar en un ensayo para determinar, la actividad relativa, en unidades, de cualquier hialuronidasa. Los ensayos in vitro para determinar la actividad de la. hialuronidasa de hialuronidasas , tal como rHuPH20 soluble, son conocidos en la técnica y se describen en la presente. Los ensayos ejemplares incluyen el ensayo de micro turbiedad descrito .a continuación (véase por ejemplo '.el Ejemplo 2) que mide la escisión del ácido . hiaíurónico por la hialuronidasa directamente al detectar el precipitado insoluble formado cuando el ácido hiaíurónico escindido se liga con la albúmina de suero. Se pueden usar estándares de referencia, por ejemplo, para generar una curva de estándar para determinar la actividad en Unidades de la hialuronidasa que se somete a prueba.

Como se usa en la presente, · "cantidad funcionalmente equivalente" o variaciones gramáticas de la misma, con referencia a una enzima degradadora de hialuronano, se refiere a la cantidad de enzima degradadora de hialuronano que logra el mismo efecto como una cantidad . (tal como un número conocido de actividad de hialuronidasa) de una enzima de referencia, tal como una hialuronidasa. La actividad de cualquier enzima degradadora de hialuronidasa se puede comparar con la actividad de rHuPH20 para determinar la ¦ cantidad' funcionalmente equivalente de. una enzima degradadora de hialuronano que · lograría el mismo efecto como, una cantidad conocida de rHuPH20. Por ejemplo, la capacidad de una. enzima degradadora de hialuronano para actuar como un agente de propagación o difusión se puede evaluar al inyectarlo en -la piel lateral de ratones con azul de tripano (véase por ejemplo la Publicación de Patente de EUA No. 20050260186), ya la cantidad de enzima' degradadora de hialuronano requerida para lograr la misma cantidad de difusión - como, por ejemplo, 100 unidades de un Estándar de Referencia de hialuronidasa, se puede determinar. La cantidad de enzima degradadora de hialuronano requerida es por lo tanto, funcionalmente equivalente a 100 unidades. En otro ejemplo, la capacidad de una enzima degradadora de hialuronano para incrementar él nivel y velocidad de absorción de una insulina coadministrada se puede evaluar en los sujetos humanos, tal como se describe posteriormente en el Ejemplo 1, ' y la cantidad de enzima degradadora de. hialuronano requerida para lograr el mismo incremento en el nivel y velocidad de absorción de la insulina como, como por; ejemplo, la cantidad administrada de ¦; r-HüPH20, se puede determinar (tal. como al evaluar la concentración de insulina máxima en la sangre (Cmax, ) el tiempo requerido para lograr la concentración de insulina máxima en .la sangre (tmax) y la exposición de la insulina sistémica y acumulativa durante un periodo de tiempo dado (AUC) .

. Como se usa en la presente, los residuos de o¡-aminoácidos de origen natural son los residuos de aquellos 20 a-aminoácidos encontrados en la naturaleza que se incorporan en la prcteína por el reconocimiento específico de · la molécula de tRNA cargado con su codón de mRNA cognado en ' humanos .

Como se usa en la presente, las cidos nucleicos incluyen D A, RNA y análogos de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser .de hebra individual o doble. Cuando se refieren a sondas o cebadores, que se etiquetan opcionalmente, tal como con una etiqueta detectable, tal como una fluorescente o radio etiqueta, se pueden contemplar moléculas de hebra individual. Tales moléculas son típicamente de una longitud tal que su objetivo es estadísticamente único o de número de copias bajo (típicamente menor que 5, generalmente menor que 3) para someter a prueba o cebar una biblioteca. Generalmente una sonda o cebador contiene por lo menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de secuencia complementaria a o idéntica a un gen de interés. Las sondas,, y cebadores pueden ser 10, 20, 30, 50, 100 o más de ácidos nucleicos de largo.

Como se usa en la presente, un péptido se refiere a un polipéptido que es mayor que o igual a dos aminoácidos en longitud, y menor que o igual a 40 aminoácidos en longitud...

Como se usa en la presente, los aminoácidos qué se presentan en varias secuencias de. aminoácidos proporcionadas en la presente se identifican de acuerdo con sus abreviaciones de tres letras o una letra conocidas (Tabla 1) . Los nucleótidos que se presentan en varios fragmentos de ácido nucleico se designan con las designaciones de-. una . letra estándares usadas rutinariamente en la técnica.

Como se usa en .la presente, un "aminoácido" es un compuesto orgánico que contiene un grupo de aminoácidos . y un grupo de ácido . carboxílico . Un polipéptido contiene . uñó o dos " aminoácidos . Para propósitos en la presente, los aminoácidos, incluyen los veinte aminoácidos de origen natural, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácido (es decir, aminoácidos en donde el -carbono tiene una cadena natural) .

Como se usa en la. presente, "residuos de aminoácido" se refiere a un aminoácido formado en la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus ligaciones de péptido. Los residuos . de aminoácido descritos en la presente se presumen que están en la forma isomérica "L". Los residuos en la forma isomérica "D" que se designan de esta manera, se pueden sustituir por cualquier residuo de L-amino ácido siempre y cuando la propiedad funcional deseada se retenga por el polipéptido. NH2 se refiere, al grupo amino libre presente en la amino terminal . de un polipéptido. COOH. se refiere ál grupo carboxi libre presente en el carboxilo. terminal de un polipéptido. En el mantenimiento con la nomenclatura de polipéptido de estándar descrita en J. Biol.

Chem., 243: 3557-3559 (1968),' y adoptada 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, las abreviaciones para los residuos de aminoácidos se muestran en la Tabla ,1: Tabla 1 - Tabla de Correspondencia Todas las secuencias de residuos de aminoácido representadas en la presente por las formulas tienen una orientación de izquierda a derecha en ..la dirección convencional del; amino-terminal al., carboxilo-terminal. Además, la frase "residuo de aminoácido"- sé define ampliamente para incluir los aminoácidos, listados en la . Tabla de . Correspondencia (Tabla 1) y. aminoácidos modificado e inusuales, tales como aquellos referidos en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e incorporados en la presente a manera de referencia. Adicionálmente , un guión en el inicio o final de una secuencia de residuos de aminoácido indica un péptido ligado a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácido, a un grupo amino-terminal tal como NH2 a un grupo carboxilo-terminal tal como COOH.

Como se usa en . la presente, "aminoácidos de origen natural" se refiere a los 20 L-aminoácidos que se presentan en los polipéptidos .

. Como se usa en la presente, "aminoácido no natural" se refiere, a un compuesto orgánico que tiene Una estructura similar a un aminoácido natural- pero . se ha modificado naturalmente para imitar la estructura y reactividad de un aminoácido natural.. Los aminoácidos de origen no natural incluyen de esta manera, por ejemplo, aminoácido's o análogos de aminoácidos diferentes a los -20 aminoácidos de origen natural e incluyen, pero no se limitan a, ¦ los D-isostereómeros de aminoácidos. Aminoácidos no naturales ejemplares se describen en este documento y se conocen por aquellos de experiencia en la técnica.

Como se usa en la 'presente, un constructo ' de DNA es una molécula de DNA dé hebra individual o doble hebra, lineal' o circular que contiene segmentos de DNA combinados y yuxtapuestos en una. manera no encontrada en la naturaleza. Los constructos de DNA existen como resultado de .la manipulación humana, ¦ e incluyen clones y otras.' copias de moléculas manipuladas.

Como se usa en la presente, un segmento de DNA es una porción de una molécula de DNA más grande que tiene, atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de DNA que codifica un . polipéptido especificado es una porción de una molécula de DNA más larga, tal como un plásmido o fragmento, de plásmido, que, cuando se lee de la dirección 5' a 3', codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido especificado.

Como se usa en la presente,' el término polinucleótido significa un polímero de hebra individual o doble, hebra de bases de desoxirribonucleótidos o ribo.nucleótidos leídos del extremo 5' al 3'. Los polipéptidos incluyen RNA y DNA, y se pueden aislar de fuentes naturales, sintetizadas in vitro, o preparadas a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula de polinucleótido se proporciona en la presente en términos de nücleótidos (abreviada "nt"). o pares base (abreviada "bp"). El término nucleótido se usa para moléculas de hebra, individual y doble hebra donde el contexto lo permita. Guando el término se aplica a moléculas de , hebra doble se usa para indicar una longitud completa y se entenderá que es equivalente al término pares base. Se reconocerá por aquellas personas en la técnica que dos obras de un polinucleótido de hebra doble puede diferir ligeramente en longitud y que los extremos del mismo se pueden . escalonar; de esta manera todos los nücleótidos dentro de una molécula de polinucleótido de hebra doble no se pueden parear. Tales extremos no pareados, en general, no excederán 20 nücleótidos en longitud.

Como se. usa en la presente, "similitud" entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la relación' entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias de . nücleótidos de los ácidos nucleicos. Similarmente se puede basar en el grado de identidad y/o homología de la secuencia de los residuos y los residuos contenidos en la misma. Los métodos., para evaluar él grado de similitud entre las proteínas o ácidos nucleicos son bien conocidos, por aquellas de experiencia . en la técnica. Por ejemplo, en un método para evaluar la similitud de secuencia, dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se alinean de una manera que produce un nivel máximo de identidad entre, las secuencias.

Como se usa en la presente, "identidad." se refiere al grado al cual las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son invariantes. La alineación de las secuencias de aminoácidos, y. algún grado las secuencias de nucleótidos, también' toman en cuenta diferencias conservadoras y/ó sustituciones frecuentes en los aminoácidos (o nucleótidos). Las diferencias conservadoras son aquellas que conservan las propiedades físico-químicas de los residuos implicados. Las alineaciones pueden, ser globales (la alineación de las secuencias comparadas sobre la longitud completa de las secuencias incluyen todos los residuos) o local (la alineación de una porción de las secuencias que incluye solo la región o regiones más similares) . "Identidad" per se tiene un significado reconocido en la técnica y se puede calcular usando . las técnicas . publicadas. (véase, por ejemplo: Computational Molecular Biology., Lesk, A.M., ed . , Oxford University Press , New . York, 1988; Biocomputing: nformatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed. , Academic Press, New 10c York, 1993; Computer Añalysis oí' Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and . Griffin, H . G . , '. eds .·, Humana Press, .New Jersey, 1994; Sequence Añalysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academice. Press, 1987; . and Sequence Ana.", ysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds..,' M Stockton Press, New York, 1991). Aunque existe . un número de métodos para medir la identidad entre dos polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad" es bien conocido por los técnicos expertos (Carillo, H. &¦ Lip.ton, D., SIAM .J Applied Math 48: 1073 (1988) ) .

¦ Como se usa en la presente, homólogo (con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos y/o. aminoácidos) significa aproximadamente mayor que o igual a .25% de .. homología de secuencia, típicamente, mayor que o igual a 25%, 40%, 50%., 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% homología de secuencia; el porcentaje preciso se puede especificar si es necesario. Para propósito en, la presente los términos "homología" ..y "identidad" se usan f ecuentemente de manera intercambiable, a menos que se indique de otra manera. En general, para la determinación del porcentaje de homología o identidad, las secuencias se alinean de modo que se obtiene la comparación de orden más alto (véase,, por ejemplo: Computational Molecular Biology, , Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and -Genome Projects, Smith, . D.W. , . ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, . Part I Griffin , . M . , and Griffin,. H.G., eds . Humana Press, New Jersey, 1994; Seguetee Analysis in Molecular' Biology, von Heinje, -G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., Stockton Press, New York, 1.991; Carillo y colaboradores (1988) SIAM J Applied Math - 48 : 1073) . Por homología de secuencia, el número de aminoácidos conservados se determina . por ¦ programas de algoritmos de alineación estándares, y se pueden usar con penalizaciones de espacio por omisiones establecidas para cada proveedor. Las moléculas de ácido nucleico sustancialmente homologas se hibridarán típicamente a la severidad moderada o en. la severidad alta todas juntas a la longitud del ácido nucleico de interés. También se contemplas las moléculas de ácido nucleico que contienen codones degenerados en lugar de los codones en la hibridación de la molécula de ácido nucleico.

Si cualquiera de las dos moléculas, tienen secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos que son por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% "idénticas" u "homologas" se pueden determinar usando algoritmo de computadora conocidos tal como el programa "FASTA", que usa por - ejemplo, los - parámetros por . omisión . como en Pearson. y colaboradores (19.88) Proc . Nati. Acad. Sci : . USA 55:2444 (otros programas incluyen el paquete de programa GCG (Devereux, J., y colaboradores, Nucleic Acids Research 12 (I) : 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., .y colaboradores, JMolec Biol 215:403 (1990)); Guide :to Huge 5 Computers, Martin J. Bishop, ed. , Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo y colaboradores (1988) SIAM J Applied Math 48: 1013). Por ejemplo, la función BLAST de la base de datos del Centro Nacional para Información de Biotecnología se puede usar para determinar la identidad. Otros programas ,10- comercial o públicamente disponibles incluyen, el programa " egAlign" de DNAStar (Madison, WI) . y el programa "Gap" de isconsin Genetics . Computer Group (UWG) (Madison WI) . El porcentaje de homología o identidad de las proteínas y/o moléculas de ácido nucleico se pueden determinar, por 15 ejemplo, al comparar la información de secuencia que usa un programa de computadora GAP (por ejemplo, . Needleman y colaboradores (1970) J. Mol. Biol. 48:443, como es revisado por Smith y Waterman (1981) Adv. Appl . Math. 2:482). Brevemente, el programa GAP define la similitud como el 20 número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos), que. son similares, divididos por' el número total de símbolos, de en lo más corto de las dos secuencias. Los parámetros por omisión para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para Identidad de .0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y colaboradores (1986) Nucí. Acids Res. 14:6745, como se . describe por Schwartz and Dayhoff, eds . , ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp . 353-358 (1979); (2) una penalización de 3.0 para cada espacio y una penalización de 0.10 adicional para cada símbolo.' en cada espacio; y (3) sin penalización para espacios finales.

Por o tanto, como se usa en la presente, el término "identidad" u "homología" representa una comparación entre un polipéptido o pol inucleótido de prueba o de referencia. Cómo se usa en la. presente, el término por lo menos "9.0% idéntico a" se refiere a los porcentajes de identidades de 90 a 100% relativo con la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de referencia, del polipéptido. La identidad de un nivel en un nivel de 90% o^ más indicativo del hecho que, asumiendo para propósitos de e emplificación se compare una" longitud de polipéptido de prueba y de referencia' de 100 aminoácidos. No más de 10% (es decir, 10 de' 100) de los aminoácidos en el polipéptido de prueba difiere de aquel del polipéptido de referencia. Se pueden hacer comparaciones similares 'entre los nucieótidos de prueba y de referencia. Tales diferencias se pueden representar como mutaciones . puntuales aleatoriamente distribuidas sobre la longitud completa de un polipéptido se pueden agrupar en una o más ubicaciones dé longitud variante de. hasta el máximo permisible, por ejemplo 10/100 diferencias de aminoácidos (aproximadamente 90% de identidad).' Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones .o supresiones de ácido nucleico o aminoácido. En. el nivel de las homologías de identidades por. arriba de 85.-90%, el resultado, debe ser independiente del conjunto, de parámetros de programa y espacio; estos altos niveles de identidad se pueden evaluar . fácilmente, de manera frecuente por la alineación manual sin depender de un software. ' Como se usa en la presente,, una secuencia alineada se refiere al . uso de homología (similitud y/o identidad) '.para alinear, posiciones correspondientes en : una secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Típicamente, se alinean 2 o más secuencias que se relacionan por 50% o. más de identidad. Un conjunto de secuencias alineados se refiere a. 2 o más secuencias que se . alinean en posiciones correspondientes se pueden incluir secuencias de alineación derivadas de RNAs, tal como ESTs y. otros. cDNAs, alineados con la secuencia de DNA genómico .

Como se usa en la presente, sustancialmente idéntico a un producto significa suficientemente similar de modo que la propiedad de intereses está suficientemente sin cambio de modo que el producto sustancialmente idéntico se . puede usar en lugar del producto.

Como se usa en la presente, también se entiende que los términos "sustancialmente idéntico" o "similar" varían con el contexto como es ¦ entendido por aquellas personas en la técnica relevante.

Como se usa en la presente, una variante alélica o variación alélica se refiere a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo, sitio cro osómico. La variación alélica .surge naturalmente a través de la mutación, y puede dar por resultado polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o puede codificar polipéptidos. que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. El término "variante alélica" también se usa en la presente para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Típicamente la forma de referencia del gen codifica una forma de ' tipo natural y/o forma predominante . de un polipéptido de una población o miembro. de referencia es singular de una especie. Típicamente, las variantes alélicas, que incluyen variantes entre especies tienen típicamente por lo menos 80%, 90% o mayor identidad de aminoácido con una forma de tipo natural y/o predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y si la comparació es ínter especie o intra ni especie. Generalmente, las variantes alélicas intra especie tienen por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90% o -95%'.. o mayor con una forma de tipo natural . y/o predominante, incluyendo .96%, 97%, 98% 99% o mayor identidad con una forma de tipo natural y/o predominante de . un polipéptido. La referencia a una variante alélica en la presenté se refiere generalmente a variaciones en las proteínas entre . los miembros de la misma especie.

Como se usa en la presente, "alelo," que se usa intercambiablemente en la presente con "variante alélica" se refiere a formas alternativas de un gen o porciones del mismo. Los alelos ocupan' el mismo sitio o posición en los cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, el sujeto se dice que es homocigoto para ese gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos diferentes alelos de un gen, el sujeto se dice que es homocigoto para el gen. Los alelos de un gen especifico pueden diferir entre si en un nucleótido individual o varios nucleótidos, y pueden incluir modificaciones tales como sustituciones, supresiones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también . puede ser una forma de un. gen gue contiene una mutación.

. Como se usa en la presente, las variantes de especies se refieren a variantes en los polipéptidos entre ..las diferentes especies, incluyendo · especies de mamíferos diferentes, tales como ratón y humano.

Como se usa en la presente, la modificación es en referencia a la modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o una secuencia, de nucleótidos en una molécula de . ácido · nucleico e incluye supresiones, inserciones, y reemplazos de aminoácidos y nucleótidos. Respectivamente. Los métodos para modificar un polipéptido son de : rutina para, aquellas personas expertas en la técnica, tal como al usar metodologías de DNA recombinante .

Como se usa en la presente, polipéptido o proteína aislada o purificada o porción biológicamente activa del mismo está sustancialmente libre del material celular u otras proteínas recombinantes de la célula o tejido, del cual la proteína, se . deriva,, sustancialmente libre de precursores químicos u otros, químicos cuando se sintetizan químicamente. Las preparaciones se pueden determinar para estar sustancialmente libres si se . presentan sin impurezas fácilmente detectables como se determina por los métodos estándares de análisis, tal como cromatografía, de .capa delgada .(TLC) , electroforesis en gel y cromatografía liquida de alto desempeño (HPLC) , usadas por aquellos de experiencia en el campo para, evaluar la pureza, o suficientemente puro tal que la purificación adicional no . alteraría detectablemente , las propiedades físicas y químicas., tal como actividades enzimáticas y biológicas, de, la sustancia. Los métodos para la purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente de manera química puros son conocidos per aquellas personas expertas en el campo. Un compuesto sustancialmente de manera química puro, sin embargo,, puede ser una mezcla de estereoisóme.ros . En estos casos, la purificación adicional podría incrementar la actividad específica del compuesto.

El término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas en las cuales, la proteína se separa de los. componentes celulares de las células de las cuales se aisla o se produce recombinantemente. En una modalidad, el término' sustancialmente libre del material celular incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tiene menor . que aproximadamente .30% (en pesó seco) de proteínas enzimáticas (también referidas en la presente como una proteína ¦ contaminante) , generalmente menor que aproximadamente 20% de proteínas no enzimáticas o 10% de proteínas no enzimáticas o menor que aproximadamente 5% de proteínas no enzimáticas. Cuandc la proteína enzimática se produce recombinantemente, también esta sustancíalménte libre del medio de cultivo, .es decir, el medio de cultivo representa, menor . que aproximadame te o a .20%, 10% y 5% del volumen de las preparaciones de proteínas enzimáticas.

Como se usa en la presente, , el término sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos incluye preparaciones de proteínas enzimáticas en las cuales la proteína se separa dé los precursores químicos u otros químicos que se implican en la síntesis de la proteína. El término incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menor que aproximadamente 30% (en peso seco) , 20%, .10% 5% o menos de precursores químicos o químicos ¦oi componentes no enzimáticos.

Como se usa en la presente, sintético, con. referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintética o un gen sintético o un péptido sintético se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido que se produce por métodos recombinantes y/o por métodos de síntesis química .

Como se usa en la presente, producción por medios recombinantes al usar métodos de DNA recombinantes significa el uso de los métodos bien conocidos de biología molecular •para expresar proteínas codificadas por el DNA clonado.

Como se usa en la presente, vector (o - plásmido) se refiere a elementos discretos que se usan para introducir un ácido nucleico het.erólogo en las células para ya sea expresión o replicación de las mismas. os vectores permanecen típicamente episomal, pero se pueden diseñar para efectuar la integración de un gen. o porción del mismo en un cromosoma del genoma . También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de . mamífero. La selección y uso de estos vehículos son .bien conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo.

Como se usa en ¦ la . presente,, un vector de · expresión incluye vectores . capaces de expresar DNA que se. diga de manera - operativa. consecuencia reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de: efectuar, la 'expresión de estos fragmentos de DNA. Estos segmentos . adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno p más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables , un potenciador, una señal de poliadenilación , y similares. Los vectores de expresión se derivan generalmente¦ de DNA plásmido o viral, o pueden contener elementos de ambos.' De esta manera, un. vector de expresión se refiere, a un constructo .de DNA o RNA recombinante ,' tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, en la introducción en una célula hospedera apropiada, da por resultado la expresión del DNA clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo . e incluyen aquellos que son replicablés en células eucarióticas y/ o células procarióticas y aquellos qué permanecen episomales o aquellos que se integran en el genoma de la célula hospedera.

Como se usa en la presente, el vector también incluye "vectores de virus" o "vectores virales." Los' vectores virales son virus diseñados que se ligan operativamente a los genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) , los genes exógenos. en las células.

Como se . usa en la presente, de manera operable o de manera operativa¦ ligada cuando se refiere a segmentos de D A significa que los .segmentos se arreglan de modo que funcionan al unísono para sus propósitos intencionados, por ejemplo, la transcripción inicial cadena abajo del promotor y cadena arriba de cualquiera de las secuencias transcritas. El promotor es usualmente el dominio, al¦ cual la maquina transcripcional se liga para iniciar la transcripción y procede a través del. segmento codificador al terminador.

Como se usa en la presente, el término evaluar se propone . para incluir una determinación cuantitativa y cualitativa en el . sentido de obtener un valor absoluto . para la actividad de una proteasa, o un dominio de la misma, presente en la muestra, y también para obtener un' índice, relación, porcentaje, valor visual u otro indicativo de nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta y la especie química detectada actualmente no' necesita por supuesto ser el . producto de proteólisis mismo pero por ejemplo puede ser un derivado del mismo o alguna- sustancia adicional.' La detección de un producto de escisión de una proteína de complemento, tal' como por SDS-PAGE y tinción de proteínas con azul de Coomassie. .

Como se usa en la presente, la actividad biológica se refiere a las actividades in vivo de un. compuesto o respuestas fisiológicas que resultan en la administración in vivo de un compuesto, composición u otra mezcla.- La actividád biológica, de esta manera, abarca efectos terapéuticos 'y actividad farmacéutica, de estos . compuestos, composiciones y mezclas. Las actividades biológicas se pueden observar en los sistemas in vitro diseñados para probar o usar estas actividades. De esta manera, ' para .propósitos en la presente una actividad biológica de una- proteása. es una actividad catalítica en la cual se hidroliza un polipéptido ..

Como se usa en la presente equivalente, cuando se refiere a dos secuencias de ácido nucleicos, significa que las dos secuencias, en cuestión codifican la misma secuencia de aminoácidos o. proteínas equivalentes. Cuando equivalentes se usa en referencia a dos proteínas o péptidos, significa que las dos proteínas o péptidos tienen sustancialmente .la misma secuencia de aminoácidos con únicamente sustituciones de aminoácido que no altera sustancialmente la actividad.'- o función de la proteína o pép ido.. Cuando equivalente se refiere a una propiedad, la propiedad no necesita estar presente al mismo grado (por ejemplo, dos péptidos pueden mostrar diferentes velocidades del mismo tipo de actividades enzimáticas ) , pero las actividades son usualmente de manera sustancial las mismas.

Como se usa en la. presente, una composición se refiere a cualquier mezcla. Puede ser una solución, suspensión, liquido, polvo, pasta, acuosa, no. acuosa..- o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en la presente, una combinación se refiere -a cualquiera sucesión entre dos o más artículos. La combinación puede ser dos o más artículos separados, tal como dos composiciones o dos colecciones, pueden ser una mezcla '.de las mismas, tal como una mezcla individual de los dos o más artículos, o cualquier variación de los mismos . Los . elementos de una combinación se asocian o se relacionan generalmente de manera funcional.

Como se usa en la presente, "enfermedad o. trastorno" se refiere a una condición patológica en un organismo que resulta de la causa o condición que incluye, pero no se limita a, infecciones, condiciones adquiridas, condiciones genéticas, y caracterizadas por síntomas identificables . Las enfermedades y trastornos de interés en la presente incluyen diabetes mellitus.

Como se usa en la presente, "tratar" a un sujeto con. una enfermedad o condición ' significa que los síntomas del sujeto se alivian parcial o totalmente, o : permanecen · estáticos después del tratamiento. Por consiguiente el . tratamiento abarca profilaxis, terapia y/o cura. Profilaxis se refiere a la prevención de una enfermedad potencial y/o prevención del empeoramiento de síntomas o progresión de una enfermedad. El tratamiento también abarca cualquier usó farmacéutico de una co-formulación de insulina y enzima degradadora de hialuronano proporcionado. en la presente.

Como se usa en la presente, un agente farmacéuticamente efectiva, incluye cualquier agente terapéutico o agentes bioactivos, que incluyen, pero, no se limitan a, por ejemplo, anestésicos, vasos constructores, agentes de . dispersión, fármacos terapéuticos convencionales, incluyendo fármacos de moléculas pequeñas y proteínas terapéuticas.

Como se usa en la presente, tratamiento significa cualquier manera' en la cual los síntomas de una condición, trastorno c enfermedad u otra indicación, se alivian o de otra manera se alteran benéficamente.

Como se usa. en la presente, un. efecto terapéutico significa un efecto que resulta del tratamiento, de un sujeto que altera, mejora típicamente o alivia los síntomas de una enfermedad o condición o que cura una enfermedad o condición. Una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de una composición, molécula o compuesto que da por resultado un efecto terapéutico después de la administración a un sujeto.

Como se Usa en la presente, el término' "sujeto" se refiere a un animal, incluyendo un mamífero, tal como un ser humano .

Como se usa en la . presente, un paciente se refiere a un sujeto, humano que . muestra síntomas de una enfermedad o trastorno .

Como se usa en la presente, mejora de los síntomas de una enfermedad o trastorno particular por un tratamiento, tal como por la administración de una composición farmacéutica u otro producto terapéutico, se refiere al cualquier reducción, ya sea permanente o temporal, de larga duración o transciente, de los síntomas que se pueden atribuir a o asociar con la administración de la composición o producto terapéutico.

Como se usa en la presente, prevención o. profilaxis se refiere a los métodos ' a los cuales se reduce' el riesgo de desarrollar enfermedad o condición. .

Como se usa en la presente', una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "dosis terapéuticamente efectivas" se refiere a una cantidad de un agente, compuesto, material, o composición que contiene un compuesto que es por lo menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Por consiguiente, es la cantidad necesaria para prevenir, curar, mejorar, detener o detener parcialmente un síntoma de¦ una enfermedad o trastorno.

Como se usa en la presente, una dosificación dé insulina terapéuticamente efectiva es . la cantidad de insulina requerida o suficiente para lograr el control glicémico. Esta cantidad se puede determinar empíricamente, tal como estimulación por. glucosa o comida. Las composiciones proporcionadas en la presente contienen una . cantidad terapéuticamente efectiva o concentración de insulina de modo que se administran dosificaciones terapéuticamente efectivas.

Como se usa en la presente, forma, de dosis unitaria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para sujetos humanos y animales y empacada individualmente como és conocido en la técnica.

Como sé usa en la presente, un "artículo de fabricación" es un producto que se fabrica y se vende. Como se .usa por toda esta solicitud, el término se propone para abarcar una composición de insulina de acción rápida y composición de enzima degradadora de hialuronano contenida en los- mismos o artículos separados de empaquetado.

Como se usa en- la presente, fluidos se refiere a cualquier composición que puede fluir. Los fluidos abarcan de esta manera composiciones' que están en la forma de semi-solidos, pastas, . soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras de estas composiciones..

.. Como se usa en. la presente, un "kit" se refiere a. una combinación de composiciones proporcionadas en la presente y a otro artículo para un propósito que , incluye, pero .no sé limita a, reconstitución, activación, instrumentos/dispositivos para administración, diagnosis, y evaluación de una actividad o propiedad biológica.. Los kits incluyen, opcionalmente instrucciones para el uso. · .

Como se usa en la presente, animal incluye cualquier animal, tal como., pero no limitado a primates incluyendo humanos, gorilas y monos; roedores, tales como .ratones . y ratas; aves de .corral, tales como, pollos.; rumiantes, tales como cabras, vacas, venado, oveja; cerdos y otros animales. Animales no humanos se excluyen humanos como el animal contemplado. Las enzimas proporcionadas en la presente son cualquier fuente, animal, planta, procariótica y fúngica. La mayoría de las enzimas son de origen animal, incluyendo origen de mamífero.

Como se usa en la . presente , un. control se refiere, a una 12.3 muestra, que es sustancialmente idéntica a la muestra de prueba, excepto que no se trata con un parámetro de prueba, o que, si es una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal afectado con la condición de interés. Un control también puede ser un control internó.

Como se usa en la presente, las formas singulares "un", "una", "la" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto o indique claramente de otra manera. De esta manera, por ejemplo, la referencia a un compuesto,, que comprende "un dominio extracelular" incluye compuestos, con uno o una pluralidad de dominios extracelulares .

Como se usa en la presente, intervalos y cantidades se pueden expresar como "aproximadamente" un. valor o intervalo particular. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por consiguiente "aproximadamente 5 bases" significa "aproximadamente 5 bases" y también "5 bases." Como se usa en la presente, "opcional" u "opcionalmente" significa el evento, o circunstancia subsecuentemente descrita que se presenta, o no,, y que la descripción incluye casos donde el evento o circunstancia no se presenta y casos donde se presentan. Por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido significa que el grupo está sin sustituir o está sustituido.

Como se usa en, la presente, las abreviaciones para cualquiera de los grupos protectores, aminoácidos y otros 124 . . ¦ .·.¦ compuestos, son, á. menos que se indique de otra manera, de acuerdo con su uso común, abreviaciones reconocidas, o la Comisión IUPAC-IUB en la Nomenclatura Bioquímica (véase, (1972) Biochemistry 11: 1726)..

B FORMULACIONES DE ENZIMA DEGRAD DORAS DE HIALURONANO Y GENERACIÓN DE CO-FORMULÁCIONES DE INSULINA.

Se proporcionan en la presente formulaciones estables de una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, por ejemplo una pH20. Generalmente, las enzimas degradadoras de hialuronano requieren- una · sal relativamente alta . a fin de retener la actividad enzimática (véase por ejemplo Publicación de. Patente de EUA ??·. US20110066111) . También, las formulaciones existentes también tienen albúmina de suero humano (HSA) para estabilidad. Se descubrió en este documento que la Lys-Lys y el cloruro de magnesio (MgCl2) estabilizan las enzimas degradadoras de hialuronano (por ejemplo una hialuronidasa soluble, por ejemplo pH20) más que el NaCl . Además, en presencia de Lys-Lys o MgCl2, la HSA no es necesaria ni requerida. Las formulaciones proporcionadas en la presente ofrecen ventajas sobre las formulaciones existentes, incluyendo estabilidad incrementada, en particular a temperaturas más . altas y para tiempos más prolongados. Se proporcionan en la presente formulaciones estables que contienen Lys-Lys y/o MgCl2. En particular, se . proporcionan en . l presente formulaciones estables de una enzima degradadora de hialuronano (por ejemplo una hialuronidasa soluble, por ejemplo pH20) qué contiene Lys-Lys como un estabilizador.

Las co-formulaciones de una enzima degradadora de hialuronano con otro agente terapéutico también, deben mostrar habilidad bajo varias ' condiciones . Esto puede ser un problema cuando los requisitos de formulación . del otro .agente terapéutico difiere, y . algunas veces se opone, los requisitos de formulación son requeridas para una enzima degradadora de hialuronano. Se- descubrieron en la. presente que esto es el caso para las co-formulaciones de una enzima degradadora de hialuronano e insulina cuando se mezclan.. Se proporcionan en las presentes co-formulaciones estables de . una enzima degradadora de hialuronano (por ejemplo, ; una hialuronidasa soluble tal como una pH20) y una insulina, por ejemplo, una insulina de acción rápida o análogo de insulina.

Las formulaciones estables, incluyendo las formulaciones comercializadas, de insulina de. acción rápida, contienen típicamente diferentes ¦ excipientes y componentes y./o diferentes concentraciones de excipientes . y componentes, que son requeridos para .la' estabilidad, solubilidad y actividad de la insulina, que aquellos encontrados en las formulaciones estables de enzimas de.gradadoras de hialuronano, tales, como hialuronidasas solubles. Estas formulaciones optimizadas de insulinas y hialuronidasas solubles son. incompatibles cuando se mezclan en una co-formulación, tal que la estabilidad, solubilidad y/o actividad de la insulina co-f'ormulada y el hialuronidasa soluble se reduce en gran medida. Esta compatibilidad es una barrera principal para desarrollar co-formulaciones estables de estbs agentes. . 1. Formulaciones de Enzima Degradadora de Hialuronano. Las formulaciones existentes de una enzima degradadora de hialuronano. contienen generalmente NaCl, típicamente NaGl 130 mM a 150 mM. . Por ejemplo, HylenexMR recombinant.e (inyección humana de hialuronidasa) contiene, por mi, 8.5 mg de NaCl (145 mM) , 1. mg de fosfato de sodio dibásico (9.9 mM). , 1.0 mg de albúmina humana, 0.9 mg. de disodio de edetato (2.4 mM) , 0.3 mg de CaCl2 (2.7 mM) y NaOH para ajusta el pH a 7.4. Otras formulaciones de hialuronidasas soluble humana, tal como las formulaciones rHuP.H20 . descritas en la Publicación dé Patente de EUA No. US2011/0053247 , . incluyen NaCl 130 mM, Hepes 1Q mM, pH 7.0; o histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6.0.

Las formulaciones de las enzimas degrada.doras de hialuronano, tales . como hialuronidasas, incluyendo. PH20 tal como rHuPH20, contienen diferentes componentes . que las formulaciones de . insulina. Por ejemplo, la PH20 . es más estable en valóres ele pH más bajos entre pH.5.5 .a 6.5. Además del pH más bajo, las formulaciones de hialuronidasa humana contienen más de NaCl que las formulaciones . de ' insulina, ambas de las cuales promueven la estabilidad de la proteina- y mantienen la actividad enzimática. También, las formulaciones de hialuronidasa soluble humana, tal como HylenexMR recombinante (inyección humana de hialuronidasa) han sido hasta la fecha formulaciones de dosis individual. Como tal, no contienen, ningún conservador. 2. Formulaciones de Insulina de Acción Rápida.

Las insulinas . de acción rápida, incluyendo, insulina regular y análogo de insulina de acción rápida se formulan típicamente para optimizar la solubilidad, estabilidad ¦ y pureza de la insulina . a temperaturas refrigeradas (por ejemplo 4°C, tal como . para almacenamiento a largo plazo) así como temperaturas elevadas (por ejemplo 25°C y 30°C). La.s formulaciones se hacen para conferir estabilidad a través del tiempo, en particular, para uso de múltiples dosis y empaquetado. Por ejemplo, las etiquetas para los productos de insulina comercializados, incluyendo HumulinMR, HumalogMR, NovologMR y ApidraMR, indican estabilidad de por lo. menos 24 meses a temperatura de almacenamiento de 2-8°C y 28 días, a 25°C o 30°C de almacenamiento. También, las formulaciones se cree que son estables para por. lo menos 6 días . a temperatura de almacenamiento de o de aproximadamente 37°C.

Aunque las . formulaciones óptimas para cada insulina pueden diferir, existen típicamente algunos puntos en común en las- formulaciones. Por ejemplo, las formulaciones de insulina, contienen típicamente una solución amortiguadora, modificador (s) de tonicidad y uno o más conservadores. Muchas insulinas de acción rápida también contienen zinc, mientras que algunas también contienen un estabilizador. Además, las formulaciones de insulina se preparan típicamente en pH neutro alto (por éjemplo 7.0-7.8). La Tabla 2 a continuación expone las formulaciones comercializadas seleccionadas de cuatro insulinas de acción rápida, incluyendo una insulina regular y tres análogos de insulina de acción rápida. 12.9 Insulina glulisina Apidra® Las formulaciones de insulina de acción rápida contienen un conservador, que. previene la contaminación microbiana que se introduce, en la formulación por el acceso repetido, tal como inserción repetida de una aguja, para dosificación múltiple. Aunque muchos conservadores se usan actualmente en productos de fármacos parenterales aprobados, los compuestos fenólicos tales como- fenol, metacresol (m-cresol) y parabenos se usan más comúnmente en formulaciones de insulina. Estos compuestos fenólicos no sirven solo como agentes .antimicrobianos efectivos, sino también pueden ligarse a sitios alostéricos en .''.el'- hexámero dé insulina y cambian la conformación total de la estructura de orden, más alto de insulina.. Esto, estabiliza los hexámeros al inhibir, la formación de agregados -filamentosos (fibrilos) , que se forman más fácilmente con los monómeros de insulina ' que ' los hexámeros (Rahuel-Clermont y colaboradores (1997) Biochemistry 36:5837-5845). Estos conservadores pueden actuar como estabilizadores, ' también pueden reducir la solubilidad de la insulina . si está presente en . una . concentración demasiado alta. De esta manera, la. concentración de conservadores en la insulina es critica a la estabilidad y solubilidad del agenté.

Uno o más modificadores de tonicidad, se incluyen típicamente en las formulaciones de insulina para ajustar la isotonicidad de la preparación.. Los modificadores de tonicidad ejemplares . que están f ecuentemente en las formulaciones de insulina incluyen glicerina y/o NaCl. Además de afectar la isotonicidad, el NaCl afecta la solubilidad de la insulina, tal que un incremento en la concentración de NaCl da por resultado una solubilidad reducida. Varias insulinas, incluyendo análogos de insulina, tienen diferentes solubilidades evidentes. De esta manera, la cantidad de NaCl que puede estar presente en l formulación sin afectar adversamente la solubilidad diferida entre las insulinas. Por ejemplo, la insulina glulisina . (por . ejemplo, ¦ insulina glulisina ApidraMR) es más soluble que la insulina aspart (por ejemplo insulina aspart NovoLogMR) , y de esta manera ' tolera más NaCl en la. formulación. En comparación, . la insulina lispro y la insulina regular son las menos solubles de las insulinas de acción rápida y contienen típicamente nada de NaCl en sus formulaciones.

Otros ' componentes también se pueden incluir en las formulaciones de insulina. Muchas' formulaciones, de insulina, incluyendo formulaciones de insulina aspart e insulina lispro, contienen iones de Zn +, que promueven y estabilizan .¦ ' .· : '¦ . · 131 la formación de . hexámeros . Aunque las formulaciones de insulina glulisina no contienen zinc, Contienen, polisorbato 20 (P20; Tween 20). como un estabilizador de proteínas. Las soluciones amortiguadoras usadas en las formulaciones de insulina de acción rápida pueden incluir, . por- ejemplo, solución amortiguadora de fosfato de . sodio dibásico y Trometamol (también conocido como Tris o THAM) . 3. Co-Formulaciones de Enzima Degradadora de Hialuronano e Insulina Las composiciones ' que contienen una insulina de acción rápida y una enzima degradadora de hialuronano (tal como una hialuronidasa soluble, por ejemplo rtíuPH20) ¦ producen una composición de insulina de acción súper rápida que imita más estrechamente la liberación de insulina postprandial endógena (es decir, natural) de un sujeto no diabético comparada con la insulina de acción rápida . sola (véase por ejemplo publicación de. EUA. No. US2009030.4665) . De está manera, las composiciones de . insulina de acción súper rápida se pueden usar para sujetos diabéticos para controlar más con .precisión los niveles de glucosa en la sangre y reducir las excursiones hiperglicémicas , comparadas con las : insulinas de acción rápida solas, proporcionando de esta manera un beneficio sustancial al paciente.

Las formulaciones de múltiples dosis de insulinas de acción rápida y. formulaciones de enzimas degradadorás de hialuronano, sin embargo, son incompatibles si el mezclado de las dos da por resultado típicamente una rápida, pérdida de estabilidad y actividad de- la enzima degradadora .de hialuronano además, de una pérdida rápida de solubilidad y estabilidad de la insulina. Hasta ahora, por lo tanto la administración de una composición de acción súper rápida se debe llevar a cabo inmediatamente después dé combinar^ la insulina y la enzima- degradadora de hialuronano' para prevenir la pérdida de actividad. Esto no es practicó y una carga inaceptable para , el paciente diabético'.

De esta manera, se proporciona en la presente co-formulaciones estables de una insulina, de acción rápida y una enzima degradadora de hialuronano (tal como una hialuronidasa soluble, por ejemplo rHuPH20) . ' Las co-formulaciones proporcionadas . en la presente se pueden, usar como agentes terapéuticos para el tratamiento de diabetes mellitus, en particular para el control de-, niveles de glucosa en la sangre postprandiales . Las co-formulaciones estables incluyen aquellas que son formulaciones de múltiples dosis que se pueden proporcionar, en .un vial, jeringa, pluma, depósito para una bomba o en un sistema de circuito cerrado o cualquier otro recipiente adecuado. a. Requisitos de Oposición para la Estabilidad.

Las barreras principales que previenen el desarrollo de las co-formulaciónes ¦ estables de insulina y enzimas degradadoras de hialuronano, tales como hialuronidasas solubles (por ejemplo rHuPH2'0) , incluyen la cristalización- y precipitación de insulinas de acción, rápida a temperaturas refrigeradas, y la estabilidad de la enzima degradadora de hialuronano a temperaturas elevadas. Típicamente., los excipientes y condiciones que previenen normalmente tales resultados son diferentes para los dos agentes activos. Algunos, excipientes y condiciones que ; son óptimas para mantener la solubilidad y .estabilidad .de las formulaciones de insulina pueden tener un efecto negativo en la estabilidad y actividad de las enzimas' degradadoras de hialuronano, tales como hialuronidasas. solubles (por. ejemplo rHuPH20) . A. -la inversa, ios excipientes y condiciones que son óptimas para la estabilidad de una. enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) tienen un efecto negativo de la estabilidad, y solubilidad de las insulinas.

Mezclar simplemente las formulaciones existentes de insulina, incluyendo análogos de insulina de acción . rápida, \ y las formulaciones existentes de las hialuronidasas solubles, tal como. rHuPH20, da por resultado una formulación que' no és estable bajo almacenamiento refrigerado a largo . plazo, o almacenamiento a temperatura ambiente o temperatura elevada. Esto es debido a la agregación rápida de la rHuPH20 y la pérdida de la. actividad enzimática, asi como pérdida de la actividad de insulina. Estos efectos perjudiciales son el resultado de . . múltiples . excipientes y. condiciones incompatibles, incluyendo, pero no- limitado a, el tipo y concentración . de . conservadores, concentración de . NaC.l, concentración de zinc, pH y temperatura de almacenamiento. De esta manera, la identificación de las formulaciones en las cuales ambas agentes permanecen solubles, estables y activos es extremadamente . problemático . i . Conservadores Los conservadores se incluyen en formulaciones de insulina de múltiples do.sis para prevenir la ¦ contaminación microbiana, que se . puede introducir en la formulación a través del acceso repetido al vial, cartucho de pluma-, u otro recipiente de múltiples dosis que contiene la formulación. Los conservadores deben estar típicamente presentes en las concentraciones suficientes para satisfacer las reglas reguladoras. Por ejemplo, los requisitos reguladores afirman que la eficacia antibacteriana de la formulación debe satisfacer los requisitos de prueba, de eficacia conservadora (PET) de los mercados objetivos.. Los requisitos PET de la farmacopea de los Estados Unidos (USP) . la farmacopea Europea (EP) digieren considerablemente, imponiendo ' •limitaciones adicionales en el .desarrollo de- formulaciones de múltiples dosis .

Las formulaciones de insulina comercializadas contienen típicamente fenol, meta-cresol (m-cresol) y/o metilparabeno-. Estos compuestos no solo sirven como agentes anti-microbianos efectivos, sino .también pueden actuar para estabilizar, las formas hexaméricas de las moléculas de insulina.' Sin embargo, la concentración y tipo de conservador usando en las formulaciones de insulina es importante. Por ejemplo, aunque los compuestos fenólicos pueden estabilizar las moléculas de insulina hexaméricas en concentraciones ¦ óptimas, la solubilidad de la insulina disminuye conforme la concentración con el conservador se incrementa. De esta manera, la concentración del conservador en las formulaciones de insulina . es crítica para tanto la estabilidad como solubilidad, así como la proporción de la actividad antimicrobiana esencial.

Aunque un componente necesario, los conservadores poseen un problema significativo en el desarrollo de. formulaciones de múltiples dosis, estables de proteínas debido a que inducen típicamente la agregación de la proteína en la solución acuosa. Por ejemplo, los conservadores- estables como fenol, m-cresol, y alcohol bencílico, han mostrado que inducen agregación de la hormona de crecimiento humana (Maa and Hsu (1996) Int. J. Pharm.140: 155-168), receptor de interlucina-1 recombinante (Remmele (1998) Pharm. Res.15 : 200-208) , factor 1 de crecimiento similar a insulina humana (Fransson .(1997) Pharm. Res. 14:606-612), rhIFN-? (Lam (1997) Pharm. Res. 14:725-729) y citocromos C (Singh y colaboradores (2011) J. Pharm Sci., 100: .1679-89) . El efecto .desestabilizante que los conservadores tienen en las proteínas en solución ha sido un factor limitante en el desarrollo de formulaciones de múltiples dosis,' y a' la fecha, más- agentes terapéuticos de proteína se han formulado para uso individual solamente.

Similar a la mayoría de . otros productos terapéuticos de proteínas, la hialuronidasa pH20, tal como rHuPH20, pierde rápidamente , la actividad en presencia de conservadores, probablemente debido al despegamiento de la proteína y de la formación de agregado subsecuente. Por ejemplo, como se muestran en los Ejemplos en la presente, los conservadores reducen, la actividad enzimática de la pH20, particularmente a temperaturas elevadas. Los resultados en la- presente se muestran por dispersión de luz dinámica (DLS) , calorimetría de exploración diferencial (DSC) y otras técnicas de caracterización química física que. la temperatura de fusión de la enzima deg'radádora de hialuronano ejemplar rHuPH20 se reduce significativamente cuando los conservadores fenólicos, tal como m-cresol, s agregan a la formulación. Por ejemplo., la temperatura de desplegamiento de la rHuPH20 se reduce de 44 °C a 24 °C. La temperatura de desplegamiento de la PH20 inferior conduce a la agregación de PH20 incrementada, ¦especialmente a temperaturas elevadas, y la actividad de la enzima reducida. .

Como se indica en lo anterior, estos compuestos fenólicos tal como fenol, m-cresol, y parabenos, son los mismos conservadores usados en las formulaciones de insulina. El efecto de .desestabilización es probablemente debido al carácter hidrofóbico de los conservadores fenólicos. La hidrofobicidad de los. compuestos fenólicos puede conducir a la interacción con rHuPH20 a través de la ligación especifica a la. proteína, alterando finalmente la integridad estructural de la rHuPH20. Esto, se traduce a una pérdida signi icativa de la actividad enzimática de la rHuPH20 en presencia de conservadores.

. Como se muestra en los Ejemplos en este documento, a que el nivel del conservador fenólico (por ejemplo -fenol,, m- cresol y metilparabeno) se incrementa, y/o la temperatura se incrementa, el impacto negativo en la actividad enzimática de la rHuPH20 también se incrementa.. Por ejemplo, la actividad enzimática de la rHuPH20 se reduce significativamente después de una semana de incubación a 35° C cuando . el nivel conservador total' estuvo relativamente alto (>Ó.2%). A temperatura ambiente y en concentraciones conservadoras más bajas, la enzima mantiene su actividad relativamente bien durante por lo menos un mes. Además, el. tipo de compuesto fenólico también impacta la actividad de la rHuPH20, tal que el m-cresol es el más perjudicial para la actividad de la rHuPH20, seguido. por el fenol y luego el. metilparabeno. Sin embargo, el metilparabeno, aunque el menos perjudicial a la actividad de la rHuPH20 de los compuestos fenólicos, también es menos efectivo como un antimicrobiano, también es menos efectivo como un antimicrobiano, y de esta manera no es un conservador óptimo. Otros conservadores, . tal como timerosal y sales de clorhexidina, parecen más compatibles con la rHuPH20 pero no se aceptan ampliamente. De esta manera, las formulaciones que contienen estos conservadores no tradicionales enfrentan .obstáculos reguladores adicionales. ·.' El efecto perjudicial de los conservadores en la actividad enzimática de la enzima degradadora de hialuronano ejemplar rHuPH20. se aumenta en gran medida a- temperaturas elevadas. Como se muestra en los ejemplos, los conservadores fenólicos tienen un. efecto negativo en la temperatura de fusión (Tm) de la enzima. Por .ejemplo., : la Tra para la rHuPH20 descendió por arriba de 40° C en ausencia de .conservador, hacia abajo a aproximadamente 26o' C en presencia de, por ejemplo, 0.25% de m-cresol. De esta manera, el m de rHuPH20 disminuye significativamente cuando^ se agrega el conservador a ' la rHuPH20 en solución. Como resultado, a temperaturas elevadas, la hialuronidasa soluble se despliega. Como se muestra en los Ejemplos, esta desnaturalización y agregación subsecuente se refleja en el tamaño incrementado de las moléculas de rHuPH20 en presencia de conservadores a temperaturas elevadas.

Por consiguiente, los conservadores, aunque requeridos para sus actividades antimicrobianas y útiles para su efecto estabilizante en la insulina hexamérica, pueden tener un efecto perjudicial en la estabilidad y actividad de las enzimas degradadoras de hialuronano, tal como rHuPH20, y en la insolubilidad de la insulina. ii. NaCl y pH Otro reto particular en el. desarrollo de las co-formulaciones estables de la¦ insulina y las. enzimas degradadoras de hialuronano (por ejemplo rHuPH20) es el hecho de que los intervalos de pH y la concentración de NaCl pata la estabilidad de la insulina son diferentes . que los intervalos de . pH . y concentración de NaCl óptimos para rHuPH20. Por ejemplo, la solubilidad de la insulina los análogos de insulina tienden a incrementarse con un pH más alto (por ejemplo >.7.2) y la concentración . más . baja de NaCl (por ejemplo <140'mM), las condiciones que tienen típicamente un efecto perjudicial en estabilidad de la enzima degradadora de hialuronano ejemplar rHuPH20, particularmente . -.a temperaturas elevadas, y sobre almacenamiento a largo plazo. Esta diferencia . se exacerba aún además en presencia de conservadores, que tienden a reducir la solubilidad- de la insulina y estabilidad de la rHuPH20.

La solubilidad . evidente de la . insulina regular y. los análogos de insulina, de acción rápida varia,: con la solubilidad que se incrementa de la insulina regular, que es la menos soluble, a la insulina lispro, después la insulina aspart. y finalmente la insulina glulisina que es la más soluble. La solubilidad se relaciona directamente con la tolerancia para el NaCl en la formulación, tal que ningún NaCl está presente en las soluciones . comercializadas que contienen insulina regular e insulina .lispro, una cantidad pequeña de NaCl (10 mM) está presente en las formulaciones comercializadas de la insulina aspart,. y una cantidad más grande de NaCl (85 mM) está presente en las formulaciones comercializadas de la insulina glulisina. ¦ El incremento de la concentración de NaCl de las formulaciones de · insulina puede dar por resultado cristalización/agregación de la insulina, particularmente '.. a temperaturas más bajas. La solubilidad . también se . afecta en gran medida por el. NaCl . ' Como se muestra en los Ejemplos, cuando la concentración de NaCl de las soluciones de insulina refrigeradas se incrementa de 50 mM a 140 mM, la solubilidad de la insulina regular, insulina aspart e insulina lispro disminuyó significativamente. Como se muestra en . los Ejemplos, sin embargo, es todo lo contrario . para la estabilidad de la enzima degradadora de hialuronano ejemplar rHuPH20. La estabilidad de la rHuPH20 en la solución a temperaturas elevadas (por ejemplo 25° C y 30° C) .se reduce en gran medida a través del tiempo conforme a la concentración de NaCl se disminuye de 140 mM a 50 mM.

La solubilidad de la insulina también se afecta en gran medida por el pH. Similar a. los efectos, de las concentraciones . más altas de NaCl en la solubilidad de la insulina, un efecto negativo similar en la solubilidad de la insulina se observó al disminuir el pH de 7.6 a 6.6. De esta manera, en pH bajo y NaCl alto, la solubilidad de la insulina se reduce en gran medida. A la inversa, las solubilidad de la insulina es máxima en NaCl bajo y pH alto. Similar a los requisitos opuestos de. la concentración de NaCl entre la insulina y la PH20, . los requisitos de pH . también son opuestos. La solubilidad de la rHuPH20 en solución a temperaturas elevadas (por ejemplo 25° C y 30° C) se reduce en gran medida a. través del tiempo conforme el pH se incrementa de 7.0 a 7.6. Las temperaturas refrigeradas, la rHuPH20 es relativamente estable sin considerar el pH- en la concentración de NaCl. ¦ De esta manera, la concentración de NaCl óptima y' el pH para la solubilidad de la insulina y la estabilidad de la enzima degradadora de hialuronano (por ejemplo., rHuPH20) parece incompatible. La solubilidad de la insulina es máxima en pH más alto y. concentración de NaCl más baja. Estas condiciones, sin embargo, son per udiciales a la enzima degradadora de hialuronano ejemplar rHuPH20, , que pierde estabilidad en pH más alto y concentración de NaCl más baja. La estabilidad de la rHuPH20 se puede incrementar al incrementar las concentraciones de NaCl y al reducir el pH . Sin embargo, estas, condiciones tiene un efecto negativo de la solubilidad de la insulina y los análogos de la insulina, que precipitan en p.H. bajo y concentración de NaCl alta. Por consiguiente, uno de : los problemas principales para, el desarrollo de las co-formulaciones estables de la insulina- y las enzimas degradadoras de hialuronano (por ejemplo r'HuPH20 u. otra enzima degradadora de hialuronano) . es identificar una concentración de NaCl y pH en la cual permanezca soluble y activa, y la enzima degradadora de hialuronano (por ejemplo rHuPH20). permanezca estable y activa. .Esto se ha logrado en la presente-. b. Co-formulación Compatible Los requisitos opuestos de la insulina y la hialuronidasa tal' como hialuronidasa pH20, para estabilidad significa que varios .parámetros, se deben balancear para optimizar la compatibilidad en una co-formulación. Las cq-formulaciones estables proporcionadas en la presente contienen el balance requerido de' conservadores, sal (por ejemplo NaCl) , pH, estabilizadores, y/o solución amortiguadora para retener los niveles, aceptables de la actividad de la enzima degradadora de hialuronano y la solubilidad y actividad de la- insulina. Como se plantea en lo anterior, los desafíos en la identificación de este balance fueron demasiados. En el primer caso, los conservadores, tales como conservadores fenólicos, que . se requieren como antibacteriancs en formulaciones de múltiples dosis, tienen efectos de desestabilizantes significativos en las enzimas degradadoras de hialuronano, ¦ tal como rHuPH20, dando por resultado una pérdida rápida de actividad. En segundo lugar, las concentraciones : dé NaCl óptimas y pH para la solubilidad y estabilidad de la insulina son muy diferentes a aquellas para la estabilidad de .las enzimas. degradadoras de hialuronano. La solubilidad de la insulina es máxima en pH más alto y concentración de NaCl más baja.'. Estas condiciones, sin embargo, son perjudiciales a la enzima degradadora de hialuronano ejemplar rHuPH20, que pierde estabilidad, en pH más alto y concentración de sal más baj a ." Esta . inestabilidad de. la rHuPH20 se exacerba además en presencia de conservadores. La estabilidad de la : rHuPH20 se puede incrementar al incrementar las concentraciones de NaCl y al reducir el pH. Sin embargo, estas condiciones tienen un efecto negativo en la solubilidad, de la insulina y los análogos de insulina, que se precipitan en pH bajo y concentración de sal alta.

De esta manera, son extremadamente difíciles las condiciones de identificación bajo las cuales tanto la enzima degradadora de hialuronano y la . insulina de acción rápida permanece soluble, estable y activa. Las co-formulaciones proporcionadas en la présente no obstante- proporcionan estás condiciones. No solo son la sal óptima (por ejemplo NaCl) , pH y combinaciones de conservadores identificadas, ¦ sino también los estabilizadores adicionales y soluciones amortiguadoras también se identifican que, cuando se combinan entre, si y, en algunos casos, la sal descrita, pH y conservadores, estabilizan adicionalmente la enzima degradadora de hialuronano y la insulina también . para mantener la solubilidad de . la insulina. Por ejemplo, se descubrió en la presente que la Lys-Lys es un estabilizador que en algunos casos, y con algunos análogos de insulina, se puede usar como un sustituto para; el NaCl tal que nada de concentraciones o concentraciones más bajas de Na.Cl se pueden usar en la formulación mientras que se retiene la actividad enzimática y la solubilidad dé la insulina.

Las siguientes secciones describen las. enzimas degradadoras de hialuronano ejemplares y las insulinas, para la inclusión en las formulaciones o co-formulaciones , formulaciones y co-formulaciones estables ejemplares, métodos para evaluar la estabilidad de actividad de las formulaciones y co-formulaciones , y -métodos para usar as formulaciones o co-formulaciones en varias enfermedades y condiciones.

C. ENZIMAS DEGRADADORAS DE HIALURONANO Se proporcionan- en la presente formulaciones estables de enzima degradadora de hialuronano. También se proporcionan en la presente, co-formulaciones estables que contienen una insulina y una enzima degradadora de. hialuronano. Por ejemplo, la descripción y los ejemplos en la presente muestran que las co-formulaciones estables de una insulina y una. enzima degradadora de hialuronano, tal como . una hialurónidasa, . se pueden hacer aunque cada una tenga individualmente requisitos opuestos para la estabilidad y actividad. Esto se ejemplifica en la presente con la PH20 (por ejemplo rHuPH20), pero se puede generar usar a otras enzimas degradadoras de hialuronano, tales como hialuronidasas solubles u otros polipéptidos PH20.

En particular, se proporcionan en la presente formulaciones o co-formulaciones que contienen una enzima degradadora de hialuronano que es una hialuronidasa, tal como una hialuronidasa truncada (por ejemplo C-terminalmente truncada) que carece de todo o una porción de un motivo de anclaje GPI . Estos polipéptidos de hialuronidasa se 'pueden expresar y secretar recombinanteménte de células en el medio en la expresión de las mismas. En virtud de la secreción en el medio, las hialuronidasas que se asocian normalmente con la membrana celular, cuando se truncan, pueden existir como productos de proteínas solubles. Está dentro del nivel de una persona experta en el campo genera y/o expresar enzimas degradadoras de hialuronano como es . proporcionado en la presente conocido en la técnica, y · hacer formulaciones, o co-formulaciones estables basadas en' la descripción y. enseñanzas én la presente.

Las enzimas, degradadoras de hialuronano actúan para degradar el hialuronano al escindir los polímeros de hialuronano, que se componen de unidades de disacáridos de repetición, ácido Drglucurónico (GlcA) y N-acétil-D-glucosamina (GlcNAc) , ligados juntos a través de ligaciones glicosídicas ß-1? y ß-1?3 alternantes. Las cadenas de hialuronano pueden alcanzar de aproximadamente '25,000 repeticiones de disacárido o más en longitud y los polímeros de hialuronano pueden variar · en tamaño de aproximadamente 5,000 a 20,000,000 Da in vivo. El hialuronano, también llamado ácido. hialurónico o hial.uronato, . es un glicosaminoglicano no sulfatado que se distribuye ampliamente por todos los tejidos conjuntivos, epiteliales y neurales. El hialuronano es un componente esencial de la ' matriz extracelular y un constituyente .principal de la barrera intersticial. Al . catalizar la hidrólisis del hialuronano, las enzimas degradadoras de hialuronano reducen la viscosidad del hialuronano, incrementando de esta manera la permeabilidad del tej.ido e incrementando la · velocidad de absorción de los fluidos administrados parenteralmente . Como tal., las^ enzimas degradadoras de . hialuronano, tales como hialuronidasas , se han usado, por ejemplo, como agentes de dispersión o de propagación en conjunción con otros ' agentes, fármacos y proteínas para potenciar su dispersión y administración.

Por consiguiente, las enzimas ' degradadoras de hialuronano incluyen cualquier enzima que tenga la capacidad de catalizador la escisión de una cadena ?· polímero de disacárido de. hialuronano. En algunos, ejemplos la enzima degradadora escinde' la ligación glicosidica '¦ ß-1?4 en la cadena o polímero. de: hialuronano. En otros ejemplos, la ' Í48 enzima degradadora . cataliza la escisión . de '. la ligación glicosidica ß-1?3' en la cadena o polímero de hialuronano. Ejemplar de las enzimas degradadoras de hialuronano en las co-formulaciones . proporcionadas . en la presente son hialuronidasas que se secretan en el medio cando se expresan de un sistema de . expresión celular, incluyendo hialuronidasas naturales que no contienen un ¦ ancla glicosil fosfatidilinositol (GPI) o hialuronidasas truncadas que carecen- de uno o más aminoácidos del ¦ ancla ¦ GPI o hialuronidasas que de otra manera no se asocian con la membrana celular cuando se expresan de la misma. Estás hialuronidasas se pueden producir recombinante o sintéticamente, otras . erizimas degradadoras de hialuronano ejemplares incluyen, pero no. se limitan a condroitinasas particulares y liasas que tienen la capacidad de escindir el hialuronano.

Las enzimas degradadoras de hialuronano proporcionadas en las co-formulaciones en. la presente también incluyen variantes alélicas o de especies u otras variantes, de una enzima degradadora. de. hialuronano como se describe en la presente. Por ejemplo, las enzimas degradadoras de hialuronano pueden contener una o más variaciones 'en su secuencia primaria, tales cerno sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácido. Una variante de la .enzima degradadora de hialuronano muestra, generalmente por lo menos o aproximadamente .60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia comparada con la . enzima degradadora de hialuronano que no contiene la variación. Cualquier variación se puede incluir ¦ en la enzima degradadora de hialuronano para los propósitos en la presente que proporcionan la enzima que retiene la actividad de hialuronidasa, tal como por . lo menos o aproximadamente 5%,·. 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, '40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de la actividad de la enzima degradadora de hialuronano que no contiene la variación (como es medida por ensayos in vitro y/o in vivo bien conocidos en la técnica y descritos en la presente .

. Varias formas de enzimas degradadora de' hialuronano, incluyendo hialuronidasas se han preparado y aprobado para uso terapéutico en sujetos, incluyendo humanos .. Por ejemplo, las preparaciones de hialuronidasa derivada de animal incluyen VitraseMR . ( ISTA Pharmaceuticals ) , una hialuronidasa testicular de ovino purificada, y AmphadaseMR (Amphastar Pharmaceuticals), úna hialuronidasa' testicular . de. ' bovino . La HylenexMR (Baxter.) es una' hialuronidasa recombinante humana producida por células, de Ovario de ' Hámster Chino (CHO) genéticamente diseñadas .que contienen ácido nucleico que codifica un polipéptido PH20 humano truncado (designado rHuPH20) . Se entiende que cualquier enzima degradadora de hialuronano, tal como cualquier hialuronidasa' se ·' puede incluir en las ' co- formulaciones estables proporcionadas en la presente (véase, por , ejemplo, Patente de E.U.A. No. 7,767,429, y Publicación de Patentes de E.U.A. Nos. 200402.68425 y 20100143457, que se incorporan a manera de referencia en su totalidad) .

Típicamente, para el uso en las formulaciones y co-formulaciones en la presente, una enzima degradadora de hialuronano humana, tal como una PH20 humana y en particular una PH20 humana truncada C-terminal como se describe en la presente, es usada. Aunque las enzimas degradadoras de hialuronano, tal como PH20, de otros animales se pueden usar, estas preparaciones son potencialmente inmunogénicas , puesto que son proteínas animales. Por ejemplo, una proporción significativa de pacientes muestra sensibilización previa secundaria a los alimentos ingeridos, y puesto que estas, son proteínas animales, todos los pacientes tienen un riesgo de sensibilización subsecuente. De esta manera, las preparaciones no humanas no pueden ' ser . adecuadas para -el uso crónico. Si las preparaciones no .humanas son- deseadas, se pueden preparar para tener inmunogenicidad reducida.' Estas modificaciones están, dentro del nivel de una persona experta en el campo y pueden incluir, por ejemplo, remoción y/o reemplazo de uno o más. epitopos antigénicos en la' molécula.

Las enzimas degradadoras ele . hialuronano, incluyendo hialuronidasas (por ejemplo, PH20), usadas en las formulaciones y co-formulaciones proporcionadas en la presente se pueden producir recombinantemente . o se .pueden purificar o purificar parcialmente de fuentes naturales, tales como,, por' ejemplo, de extractos de testículos. . Los métodos para la; .producción de proteínas recombinantes, incluyendo enzimas degradadoras de hialuronano recombinantes, se proporcionan en .cualquier lugar en este documento y son bien conocidos en el campo. 1. Hialuronidasas Las hialuronidasas son miembros, de una gran familia de enzimas degradadoras de hialuronano. Existen, tres clases generales de hialuronidasas: hialuronidasas de tipo, mamífero, hialuronidasas bacterianas e hialuronidasas de sanguijuelas> otros parásitos y crustáceos. Tales enzimas se pueden, usar en las co-formulaciones proporcionadas en la presente..'. a. Hialuronidasas de Tipo Mamí ero Las hialuronidasas de tipo mamífero. (EC 3.2.1.35) son endo-?-W-acetil-hexosaminidasas que hidrolizan la ligación glicosídica ß-1?4 del hialuronano en varias longitudes de oligosacáridos tales como tetrasacáridos y hexasacáridos .

Estas enzimas tienen actividades tanto hidrolíticas como transglicosidasa, y pueden degradar el hialuronano y los sulfatos de condroitina (CS), generalmente C4-S y C6-S. Las hialuronidasas de este tipo incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasas de vacas (bovino) (SEQ ID NOS : 10, 11 y 64 y BH55 (Patente de E.ü.A. Nos. 5, 747 , .027 .ya- 5, 827', 721) ), ' oveja (Ovis aries) (SEQ ID NO: 26, 27, 63 y 65), avispa de chaqueta amarilla (SEQ ID NOS: 12 y 13), abeja, de miel (SEQ ID NO: 14), abejorro de. cara blanca (SEQ ID NO: 15), avispa de papel (SEQ ID NO: 16), ratón (SEQ ID NOS: 17-19, 32), cerdo. (SEQ ID NOS:20-21), rata (SEQ ID NOS:22-24, 31), conejo (SEQ ID NO:25), orangután (SEQ ID NO:28), mono cynomolgus (SEQ ID NO: 29), cobayo (SEQ ID NO: 30), chimpancé (SEQ ID NO: 185), mono Rhesus (SEQ ID NO: 186) y hialuronidasas humanas.

Las hialuronidasas de mamífero .se pueden', subdividir adicionalmente en aquellos que . son activos .· neutros, encontrados predominantemente en los extractos de testículos, y activos en ácido, predominantemente encontrados en órganos tales como el hígado. Las hialuronidasas activas neutras ejemplares incluyen PH20, que incluye pero no · se limita a, PH20 derivada de especies diferentes tal como de ovino, (SEQ ID NO:27), bovino (SEQ ID NO: 11) y humana (SEQ ID NO: 1). La PH20 humana (también conocida como SPAM1 . o proteína superficial de esperma PH20) , se. une. generalmente a la membrana plasmática ' a través de ' un ancla de glicosilfosfatidil ínositol (GPI). Se implica naturalmente en la adhesión del espermatozoide-óvulo y : ayuda la penetración por el. espermatozoide de la capa de las células del cumulus al digerir el ácido hialurónico. Ejemplares de . las hialuronidasas usadas en las co-formulaciones en este punto son las hialuronidasas activas neutras.

Además de la PH20 humana (también llamada SPAM1),. cinco genes similares a hialuronidasa ' se han identificado en él genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 y HYALP1. El HYALP1 es un pseudogen, y el HYAL3 (SEQ ID NO:38) no ha mostrado que posee actividad enzimática hacia ninguno de los substratos conocidos. El HYAL4 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 39.) es . una condroitinasa y muestra poca actividad hacia el hialuronano. El HYAL1 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 36) es la enzima activa en ácido prototipica y PH20 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1) es la enzima activa neutra prototipica. Las hialuronidasas activas en ácido, tales como HYAL1 y HYAL2 (polipéptido . precursor expuesto en SEQ ID NO: 37) carecen generalmente de actividad catalítica en pH neutro (es decir pH 7) . Por ejemplo, el HYAL1 tiene poca actividad catalítica in vitro en pH 4.5 (Frost y colabcradóxes (1997) Anal. Biochem. 251:263- 269). El HYAL2 es una enzima activa en ácido con una actividad específica muy baja in . vitro. Las enzimas, similares :,a hialuronidasa también se pueden caracterizar por aquellas que se unen generalmente a la membrana plasmática a través de un ancla de glicosilfosfatidil-inositol (GPI) tal como HYAL2 humana , y PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova, y colaboradores (2003) Proc Nati Acad Sci EUA 100 (8) : 4-580-5) , y aquellas., que son generalmente solubles tal como ' HYALl (Frost y colaboradores (1997.) Biochem Biophys Res Co mun. 236(1): 10-5) .

PH20 La PH20, similar a otras hialuronidasas de mamífero, es una endo-p-N-acetil-hexosaminidasa que hidroliza la ligación glicosídica ß?—4 del ácido hialurónico en varias longitudes de , oligosacárido tal . como . tetrasacáridos y hexasacáridos . Tienen , actividades · tanto hidrolíticas como de transglicosidasa y pueden degradar el ácido hialurónico y sulfatos de condroitina, tales como C4-S y C6-S. La PH20 se implica naturalmente en la adhesión del espermatozoide-óvulo y ayuda a la penetración por el espermatozoide de la capa de las células del cúmulo al digerir el ácido. La PH20 se localiza en la superficie del espermatozoide, y en el acrosoma derivado de lisosoma, donde se. liga a la membrana acrosomal interior.. La membrana plasmática. PH20 .. tiene actividad de .hialuronidasa solo en pH neutro, mientras que la membrana acrosomal interior PH20 tiene actividad en pH tanto neutro como, ácido.. Ademas de ser una hialuronidasa, la PH20 también parece, que es un receptor para la señalización de células inducidas por HA, y un receptor para la. zona pelúcida que circunda el ovocito.

Las proteínas PH20¦ ejemplares incluyen, . pero no se limitan a, polipép.tidos PH20 humanos (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID ?0:· 2, polipéptido. maduro expuesto en SEQ ID NO: 2), de bovino (SEQ ID NOS: 11 y 64), de conejo (SEQ ID NO: 25) , PH20 de ovino (SEQ ID NOS: 27, 63 y 65) , monos cynomolgus (SEQ ID NO: 29), de cobayo (SEQ ID NO: 30), de rata (SEQ ID NO: 31), ratón (SEQ ID NO: 32), chimpancé (SEQ ID NO: 185) y mono Rhesus (SEQ ID NO: 186).

El PH20 de bovino es un polipéptido precursor de 553 aminoácidos (SEQ ID NO: 11). La alineación del PH20. de bovino con el. PH20 humano muestra solo una homología débil, con múltiples espacios que . existen del aminoácido 470 a través de las carboxi terminales respectivas debido a la ausencia de un ancla GPI en el polipéptido de bovino (véase- por ejemplo, Frost GI (2007) Expert Opin-, Drug. Deliv. :.. 427-440) . ' De hecho, las anclas GPI claras no se predicen en muchas otras especies de PH20 además de los humanos. De esta manera, los polipéptidos PH20 producidos de. ovino . y bovino existen naturalmente como, formas solubles. Aunque el PH20 de bovino existe unido muy sueltamente a la membrana plasmática, no se anclan a través de un ancla sensible a la fosfolipasa (Lalancette y colaboradores (2001) Biol Reprod. 65 (2) : 628- 36). Este factor único de la hialuronidasa de bovino ha permitido el uso de la enzima de hialuronidasa de testículos de bovino soluble, como¦· un extracto para el. uso clínico (WydaseMR, HyalaseMR) .

El transcripto PH20 mRNA humano se traduce normalmente para generar un pólipéptido precursor d 509 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) que contiene una secuencia señal de 35 aminoácidos en la N-terminal (posiciones del residuos de aminoácido 1-35) y . una secuencia . señal de unión de ancla de glicosilfosfatidilinositol (GPI) de 19 aminoácidos en la C-terminal (posiciones de residuos de aminoácido.491-509). El PH20 maduro es,' por' lo tanto, un pólipéptido de 474 aminoácidos expuesto en SEQ ID NO: 2. Después del transporte del pólipéptido precursor, al ER y¦ remoción del péptido señal, el péptido señal de unión a GPI C-terminal se escinde para ¦facilitar la unión covalente de un ancla' GPI al aminoácidos C-terminal recientemente formado en la posición de aminoácido que corresponde a la posición 490 del pólipéptido precursor expuesto en SEQ ID. NO: 1. De esta manera, se produce un pólipéptido maduro anclado a GPI de 474 aminoácidos con uña secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2.' .

Aunque el PH20 humano es una hialuronidasa' activa neutra cuando existe en la .membrana plasmática a trayés de- un ancla GPI, muestra actividad en pH tanto neutro como 'ácido cuando se expresa en la membrana acrosomal interior. Parece que el PH20 contiene dos sitios · catalíticos en distintas regiones del polipéptido: las. regiones Péptida 1 y Péptida 3 (Cherr.y colaboradores, (2001) Matrix Biology 20:515-525). .La región Péptida 1 del PH20, que corresponde a las posiciones de aminoácido 107-137 del · polipéptido maduro expuesto en SEQ . ID NO:2 y las posiciones 142-172 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1, es requerida para la actividad enzimática en el pH neutro. Los aminoácidos en las posiciones 111 y 113 (que corresponden al polipéptido PH20 expuesta en SEQ ID NO: 2) dentro de esta región, parece que es importante para la . actividad, ya que la mutagénesis por el reemplazo del aminoácido da por resultado polipéptidos PH20 con 3% de actividad de hialuronidasa o actividad de hialuronidasa no detectable, respectivamente, comparado con el¦ PH20 de tipo natural (Arming y colaboradores , . (1997) Eur. J. ' Blochem. 247 : 810-814) .

La región del Péptido 3,. que corresponde a las posiciones de aminoácido 242-262 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NG:2, y las posiciones 277-297 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1, parece que és importante para la actividad enzimatica en el pH ácido. Dentro de esta región, los aminoácidos en las posiciones 249 y 252 del polipéptido PH20 maduro parece que son esenciales para la actividad, y la mutagénesis de cualquiera de uno da por resultado un polipéptido esencialmente sin '.actividad (Arming y colaboradores, . (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-81 ).

Además de los sitios catalíticos, el PH20 también contiene un sitio de ligación a hialuronano. La evidencia experimental muestra que este sitio se localiza en la región Péptida 2, que corresponde a las posiciones de aminoácido 205-235 de polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1 y las posiciones 170-200 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO : 2. Esta región se conserva altamente. entre las hialuronidasas y es similar al motivo de ligación a heparina. La mutación del residuo de arginina en la posición 176 (que corresponde al polipéptido PH2ü maduro expuesto en SEQ ID NO: 2) á una glicina, da por resultado un polipéptido con solo aproximadamente 1%. de la actividad de hialuronidasa del polipéptido de tipo natural (Arming y colaboradores, (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).

Existen siete sitios de glicosilación ligados a N potenciales en el PH20 humano en N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 del polipéptido ejemplificado, en SEQ ID NO: 1.

Debido 'a que los aminoácidos 36 a 464 de SEQ ID NO: 1 .parece que contienen el ;, dominio de hialuronidasa .. PH20 humana mínimamente activa, el sitio de glicosilación N-ligado N-490 no se requiere para la actividad de la hialuronidasa apropiada. Existen seis ligaciones de disulfuro en el PH20 humano. Dos ligaciones de disulfuro entre los residuos de cisteína C60 y C351 y entre C224 y C238 del polipéptido e emplificado en SEQ . ID NO: 1. (que corresponde, a laso residuos C25 y C316, y C189 y C203 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2, respectivamente) .. Cuatro ligaciones de disulfuro adicionales se forman entre los residuos de cisteína C376 y C38.7; entre C381 y C435; entre C437 y C443; y entre C458 y C464 del polipéptido ejemplificado en SEQ ID NO: 1 (que corresponde .a los residuos C341 y C352;' entre C346 y C400; entre C402 y C408; y entre C423 y.C429 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2, respectivamente), b. Hialuronidasas Bacterianas Las hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1) degradan, el. hialuronano y, a varios grados, los sulfatos de condroitina y los sulfatos de dermatán. Las liasas .de hialuronano aisladas de bacterias difieren de las hialuronidasas , (de ; otras fuentes, pór ejemplo, hialuronoglucosaminidasas , EC 3.2.1.35) ¦ por su modo de acción. Son endo-p-N-acetilhexosaminidasas que catalizan una reacción de eliminación,, antes que de hidrólisis, de la ligación glicosidica ß1?4 entre los residuos de N-acetil-beta-D-glucosamina y ácido D-glucurónico en el hialuronano, produciendo 3- (4-desoxi-p-D-gluc-4-e'nuronosil) -N-acetil-D-glucosamina. tetra y hexasacáridos , y productos finales de disacárido. La reacción da .por resultado la formación de oligosacáridos con residuos de ácido hexurónico insaturado's en sus extremos no reductores.

Las hialuronidasas ejemplares de bacterias para co-formulaciones proporcionadas en la presente incluyen, pero no se limitan a, enzimas degradadora de hialuronano en los microorganismos, . incluyendo. cepas de Arthrobactér, Bdellovibrio, Clostridium, Micrococcus, Streptococcus, Peptococcus, Propionibacterium, Bacteroides, y Streptomyces'. Ejemplos particulares de estas enzimas incluyen, per no se limitan a Arthrobactér sp.¦ (cepa FB24) (SEQ ID NO:67)., Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO: 68), Propionibacterium acnés (SEQ ID NO : 69) , Streptococcus agalactiae¦ . ( (SEQ ID NO: 70); 18RS21 (SEQ ID NO:71); serotipo la (SEQ.ID NO:72).; serotipo III (SEQ . ID NO:73)), Staphylococcus aureus' (cepa COL) (SEQ ID NO:74); cepa MRSA252 ( SEQ ID NOS : 75 .y .76) ; cepa MSSA476 (SEQ ID NO:77); cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO: 78).; cepa de bovino RF122 (SEQ ,.ID NOS : 79 y 80) ; cepa USA300 (SEQ ID NO:81), Streptococcus pneumoniae ((SEQ ID NO: 82);. cepa ATCC BAA- 255 / R6 (SEQ ID- NO:83); serotipo 2, cepa D39 / NCTC 7466 (SEQ ID NO:84), Streptococcus pyogenes (serotipo Ml.) (SEQ ID NO: 85); serotipo M2 , cepa MGAS10270 (SEQ ID NO:86); serotipo M4 , cepa .MGAS10750 (SEQ ID NO : 87 ) ; serotipo M6 (SEQ ID NO:88); serotipo M1'2, cepa MGAS2096. (SEQ ID NOS:89 y 90); serotipo M12, cepa MGAS9429 (SEQ ID NO: 91)-; serotipo M28 (SEQ ID NO:92); Streptococcus suis (SEQ ID NOS: 93-95); Vibrio fischeri (cepa ATCC 700601/ES114 (SEQ ID NO:96)), y a enzima de hialuronidasa de Streptomyces hyaluronolyticus, que es especifica para el . ácido hialurónico y no escinde la condroitina o sulfato de condroitina (Ohya, T. y Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys . Acta 198:607). c. Hialuronidasas de sangu juelas, otros parásitos y crustáceos Las hialuronidasas de sanguijuelas, otros' parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36) son endo- -glucuronidasas que generan productos finales de tetra y hexasacárido . Estas enzimas catalizan la hidrólisis de las ligaciones 1?3. entre los residuos de ^D-glucuronato ' y . N-acetil-D-glucosamina en el hialuronato. Las hialuronidasas ejemplares de sanguijuelas incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasa de Hirudinidae (por ejemplo, Hirudo . medicinalís) , Erpobdellidae (por ejemplo, Nephelopsis obscura y Erpobdella punctata)., Glossiphoniidae' (por ejemplo, Desserobdella picta, Helobdella stagnalis, Glossiphonia complanata ,. Placobdella prnata y Theromyzon sp.) y Haemopidae (Haémopis marmorata) (Ilovingh y colaboradores (1999) Comp Biochem . Physiol B Biochem Mol Biol. 12403) : 319-26) . Una hialuronidasa ejemplar de bacterias que tienen, el mismo mecanismo de acción como la hialuronidasa.de sanguijuela es aquel de la cianobacteria, Synéchococcus sp. (cepa RCC307, SEQ ID NO: 97). 2. Otras enzimas degradadoras de hialuronano Además de la familia de hialuronidasa, otras enzimas degradadoras . de hialuronano se pueden usar en las formulaciones estables- proporcionadas én¦ la presente o las co-formulaciones con insulina proporcionadas en la presente. Por ejemplo, las. enzimas que incluyen condroitinasas particulares y liasas, que tiene la capacidad de .escindir el hialuronano se pueden emplear. Las condroitinasas ejemplares que pueden degradar el hialuronano incluyen, pero no se limitan a, condroitina ABC liasa . : (también conocida como condroitinasa ABC) , condroitina AC liasa (también conocida como condroitina sulfato-liasa ' o condroitina sulfato-eliminasa) y condroitina C liasa. Los métodos, para la producción y purificación de tales enzimas para el uso en las composiciones, combinaciones, y métodos proporcionados son conocidos en el campo (por ejemplo, Patente de E.U.'A. No. 6,054,569; Yamagata, y colaboradores (.1968) J. Biol. Chem. 243(7): 1523-1535; Yang y colaboradores. (1985) j.- Biol.. Chem. 160 (30) : 1849-1857.)'. .

La . condroitina ABG liasa contiene dos enzimas, condroitina-sulfato-ABC endoliasa (EC 4.2.2.20) .y condroitina-sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21) . (Hamai y colaboradores (1997) . J Biol Chem. 272 (1 ): 9123-30) , que degradan una variedad, de glicosaminoglicanos del tipo de condroitina-sulfato . y dermatán-sulfato . El . sulfato de condroitina, prcteoglicano de condroitina-sulfáto y sulfato de dermatán son¦ . los substratos preferidos para la condroitina-sulfato-ABC-endoliasa, pero la enzima también puede actuar en el hialuronano en una velocidad más baja. La condroitina-sulfato-ABC endoliasa degrada una variedad de glicosaminoglicano .del tipo condroitina-sulfato y dermatán-sulfato> produciendo una mezcla de oligosacáridos ?4-insaturados de diferentes tamaños que se degradan . finalmente a tetra y disacáridos A4-insaturados . L condroitina-sulf to-ABC exoliasa tiene la misma especificidad de substrato pero remueve los residuos . de disacárido de los' extremos no reductores de tanto' los sulfates de condroitina polimérica como sus fragmentos de oligosacáridos producidos por la condroitina-sulfato-AEC endoliasa (Hamai, A. y colaboradores (1997) j. Biol. Chem. 272:9123-9130)'. Las ·.' condroitina-sulfato-ABC endoüasas ejemplares y las condroitina-sulfato- ABC exoliasas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de Proteus vulgaris y Flavobacterium heparinum (la . condroitina-sulfato-ABC endoliása de Proteus vulgaris se expone en SEQ ID NO: 98 (Sato y colaboradores (1994) Appl. '. Microbio! . Biotechnol. 1 ( 1 ). : 39-46) .

La condroitina AC liasa (EC 4.2.2.5) está activa en ios sulfatos de. condroitina A y C, condroitina y ácido hialurónico, pero, no es activa en el sulfato de., dermatán (sulfato de condroitina B) . Las enzimas condroitinasa AC ejemplares de las bacterias incluyen, pero no se limitan a, aquellas de Flavobacterium heparinum y Victivallis vadensis, expuestos en SEQ ID NOS : 99 y 100, respectivamente, 'y Arthrobacter aurescens (Tkalec y colaboradores (2000) Applied and Environmental . Micr.obiology 66 (1) : 29-35; Ernst -y colaboradores (1.995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30 (5) : 387-444 ) .

La condroitinasa C escinde el tetrasacárido que produce sulfato de condroitina C más un disacárido 6-sulfatado insaturado (delta. Di-6S) . También escinde el disacárido no sulfatado insaturado que produce ácido hialurónico (delta Di-OS) . Las enzimas condroitinasa C ejemplare de las bacterias incluyen, pero no se limitan a, aquellas de Streptococcus y Flavobacterium (Hibi y. colaboradores . (1989) FEMS-Microbiol-Lett. ..48(2).: 121-4; Michelacci y colaboradores- (19.76) J.

.Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda y colaboradores (1999) Eur. J_. Biochem. 262:127-133) . 3. Enzimas degradadoras de hialuronano truncadas u otras formas solubles Las enzimas degradadoras de hialuronano pueden existir en forma ligada a la membrana o asociada a la membrana, o se puede secretar en el medio cuando se expresan de células y existen en consecuencia en forma soluble. Para propósitos en la presente, las enzimas degradadoras de hialuronano. incluyen cualquiera de las enzimas degradadoras de hialuronano que cuando se expresan y secretan de las células no se asocian con la membrana celular, y existen en consecuencia en forma soluble. Las enzimas degradadoras de . hialuronano solubles incluyen, pero no se limitan a hialuronidasas, incluyendo hialuronidasas 'no.- humanas (por ejemplo hialuronidasas animales o bacterianas), tal como PH20. de bovino, o PH20 de ovino, e hialuronidasas humanas tales como Hyall, - o · formas truncadas de hialuronidasas asociadas a la membrana no humanas o humanas, en particular formas de . PH20 humana, variantes alélicas de la misma y otras variantes de la misma. ¦Ejemplares de las enzimas degradadoras ' de hialuronano en las co-formulaciones en la- presente son formas truncadas de una enzima degradadora de hialuronano que carece de uno o más residuos de aminoácido de un ancla' de glicosiifosfatidilinosi.tol (GPI) y que retiene la actividad de la hialuronidasa.. En un ejemplo, la hialuronidasa humana PH20, que se ancla normalmente a la membrana a través de un ancla GPI, se puede, hacer soluble por el truncamiento de y remoción de todo o una porción, del. ancla GPI en -la C-terminal.

De esta manera, en algunos casos, una enzima degradadora de hialuronaho que.es normalmente anclada a GPI (tal como, por ejemplo, PH20 humana) se vuelve soluble: por el truncamiento en la C-terminal. Este truncamiento puede remover toda la. secuencia señal de unión al ancla GPI o puede remover solamente algo de la secuencia señal, de.¦ unión de ancla GPI. El pólipéptido resultante, sin. embargo, es soluble. En casos donde la enzima degradadora de hialuronano soluble retiene una porción de la secuencia señal de unión de ancla GPI, 1, 2,.3/ 4, 5, 6, 7, 8, .9, 10 o más de residuos de aminoácido en la secuencia señal de unión de ancla GPI se puede retener, con la condición de que el pólipéptido sea soluble- (es decir,:, secretado cuando se expresa de células) yu activo. Una. persona de experiencia en- la técnica puede determinar si un pólipéptido se ancla a GPI usando métodos bien conocidos en el campo. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, el uso de algoritmos, conocidos para predecir la presencia y ubicación de la secuencia señal de unión de ancla GPI y sitio ?, y- llevar. a cabo análisis de solubilidad antes y después de la digestión con la fosfolipasa C (PI-PLC) o .' D (PI-PLD.) especifica de : fosfatidilinositol .

Ejemplar de una hialuronidasa soluble es la ¦ PH20 de cualquier especie, tal como cualquiera expuesta en SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 3.0-32, 63-65 y 185-18.6, o formas truncadas de la misma que carece de todo., o una porción del ancla GPI C-terminal, siempre y cuando la hialuronidasa sea soluble y retenga la actividad, de. hialuronidasa. Las hialuronidasas solubles ejemplares que' están C-terminalmente truncadas y carecen de todo o una porción de la -secuencia señal de unión de ancla GPI incluyen, pero no.se limitan a, polipéptidos PH20 de : origen de primate, tales como, por ejemplo, polipéptidos PH20 humanas y de chimpancé. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 solubles se pueden hacer por el truncamiento C-terminal de cualquiera de los .polipéptidos maduros o precursores expuestos en SEQ ID. OS: .1, 2 o 185, -o alélicos u otra variación del mismo, incluyendo fragmento activo del mismo, en ' donde el . polipéptido resultante es soluble y carece de todo o una porción de los residuos de aminoácido de la secuencia señal de unión de ' ancla GPI. También se incluyen entre las hialuronidasas solubles, variantes alélicas u otras variantes de cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30-32, 63-65 y' 185-186, o formas truncadas de las mismas. Las variantes alélicas y-; otras variantes son conocidas por una persona de experiencia en l campo, : e incluyen . polipéptidos que tiene sesenta 60%, 70'%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, ,.98% o más de identidad de secuencia- a cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 2, 11 , 25, 27, 30-32, 63-65 y 185-186, o formas truncadas de los mismos. Las variantes de aminoácido incluyen mutaciones conservadoras . y no conservadoras. Se entiende que · los residuos que los residuos que son importantes o, de otra manera requeridos para la actividad de una hialuronidasa, tal como cualquiera descrito en lo anterior o conocida por una persona experta en el. campo, son generalmente invariantes, y no se pueden cambiar. Éstos incluyen, por ejemplo, residuos de sito activo. De . esta manera, por ejemplo, los residuos de aminoácido 111, 113 y 176 (que corresponde a los residuos en el polipéptido FH20 maduro expuesto en SEQ ID NO:2) de un polipéptido PH20 humano, o¦ forma soluble del mismo, son generálmente invariantes y no se alteran. Otros residuos que contienen glicosilación y formación' de ligaciones de disulfuro requeridos para el plegamiento apropiado también pueden ser invariantes. a. PH20 Humana Truncada en C-terminal Ejemplar de una hialuronidasa soluble es una PH20 humana truncada C-terminal. Las foirmas truncadas C-terminal de la PH20 humana recombinante se han producido y se pueden usar en las co-formulaciones descritas en la presente, la producción de estas formas solubles de PH20 se describe en la Patente de E.U.A. No.. 7, 76.7, 429 y Solicitud de Patente de E.U.A. Nos. US20040268425, US200502-60186, US20060104968 y ÜS2010Ó143457.

Por ejemplo,- los polipéptidos PH20 truncados eri C-terminal incluyen polipéptidos que contiene por lo menos 36-464 aminoácidos (la porción mínima requerida para la actividad de hialuroñidasa) , o incluyen una. secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% ,. por ejemplo al menos 86%, 87%, 88%,. 89%., 90%, 91%, 92%, . 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos que incluye por lo menos los aminoácidos 36-464 dé SEQ ID NO: 1 y retienen la actividad de hialuroñidasa. Incluidos entre estos polipéptidos están los polipéptidos PH20 humanos que carecen completamente de toda la secuencia señal de unión de ancla GPI. También incluidos entre estos polipéptidos están los polipéptidos PH20 humanos que carecen, de una porción de los residuos de aminoácido contiguos de , la secuencia señal de unión de ancla GPI (llamada PH20 soluble extendida (.esPH20),-véase, por ejemplo US20100143457 ) .. Los. polipéptidos PH.20 truncado en C-terminals pueden estar truncado en C-terminals por .1, 2, 3, 4,. 5, 6, 7,. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 5.5, 60 o más aminoácidos comparados con el polip.éptido de tipo natural de longitud completa, tal como el polipéptido de tipo natural de tipo natural de longitud completa- con Una secuencia expuesta en SEQ ID NOS: 1 o 2 , o variantes alélicas o de especies, u otras variantes ade los mismos. De esta manera, en lugar de tener un ancla GPI covalentemente unida a la C-terminal de la próteina en el ER y que se ancle a- la valva extracelular de la membrana plasmática, estos polipéptidos se secretan cuando se expresan de células y son solubles.

Los polipéptidos . PH20 humanos truncado en C-terminals ejemplares proporcionadas en la presente incluyen cualquiera que incluyan por lo menos los aminoácidos 36-46 de SEQ ID NO: 1 y están truncado en C-terminals después de la posición del aminoácido 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, .'472, 473, 474, 475, 476, 477,. 478, 479, 480, .481, 482, 483, '484, 485, 486, 4.87, 488, 489, -490, 491, 492, .493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de . la . secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, o una variante de la misma que muestra por lo menos 85% de identidad, de secuencia, tal como por lo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,. 95%, 96%, 97%, 98% de identidad de secuencia a la misma y retiene la aetividad.de hialuronidasa . . La . abla 3 ' proporciona ejemplos no limitantes de polipéptidos PH20 truncado en C-terminals ejemplares. En la Tabla 3 a continuación, la longitud (en aminoácidos) de los polipéptidos precursores y maduros, y el identificador se secuencia (SEQ ID NO) en el cual la secuencia de aminoácidos ejemplares de los . olipéptidos precursores y maduros de las proteínas PH20 C-terminalmente truncadas se exponen, se proporcionan. El polipéptido PH20 de tipo natural también se incluye en la Tabla 3 para comparación. Por ejemplo, los polipéptidos PH2Q truncado . en C-terminals ejemplares incluyen, pero no , se ,, limitan a, polipéptidos ·.. expuestos en ¦cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9, 47-4.8, 234-254,' y 267-273,· o un polipéptido que muestra por lo menos 70%, 75%, 80%,' 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%., 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,· 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9, 47- 8, 234-254, y 267-273. .. .

Tabla .3. Polipéptidos PH20 truncados en C-terminal ejemplares b. rHuPH20 Ejemplar de una forma truncada C-te.rminal de SEQ ID NO: 1 es un polipéptido del mismo que se trunca después del aminoácido 482 de la' secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1. Este polipéptido se puede generar de una molécula de. ácido nucleico que codifica los aminoácidos 1-482 (expuestos en SEQ ID N0:3) . Esta molécula de ácido nucleico ejemplar se expone en SEQ ID NO: 49. El procesamiento pos-traduccional remueve la secuencia señal de 35 aminoácidos, dejando un PH20 humano recombinante soluble de 447 aminoácido (SEQ ID. NO: 4). Ya que se produce en el medio de cultivo existe heterogeneidad en la C-terminal tal que el producto, designado rHuPH20, incluye una mezcla de especies que es pueden incluir en cualquiera o una o más de SEQ ID .NOS: 4-9 en abundancia- diversa. Típicamente, la rHuPH20 se produce en células que facilitan la N-glicosilación correcta para retener actividad, tales como células CHO (por ejemplo células DG44 CHO) ¦ 4. Glicosilación de las enzimas degradadoras de hialuronano La glicosilación, que incluye glicosilación N y ?-ligada, de algunas enzimas degradadoras de hialuronano, incluyendo hialuronidasas, puede .ser importante para su actividad y estabilidad catalítica. Mientras que se ..altera él tipo, de glicanc que modifica una glicoproteína puede' tener efecto notables en la antigenicidad . de la .proteína, plegamientc ¦ estructural, solubilidad, . y estabilidad, la mayoría de . enzimas no se cree que requieran glicosilación para la actividad , enzimática óptima. Para algunas hialuronidasas, la remoción de la glicosilación. N-ligada puede dar por resultado una inactivación casi completa de la actividad de hialuronidasa. De esta manera, para estas hialuronidasas , la presencia de glicanos N-ligados es critica para la generación de una enzima activa. . . .

Los oligosacáridos N-ligados se encuentran en varios tipos principales (oligomanosa, complejo, híbrido, sulfatado), todos de los cuales tienen núcleos (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc a través de nitrógeno de amida dé los residuos de Asn que se encuentran dentro de las secuencias -Asn-Xaa-Thr/Se.r (donde Xaa no es Pro) . La glicosilación en un sitio . -Asn-Xaa-Cys- se ha reportado para la proteína de coagulación C. En algunos casos, una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa, puede contener ligaciones tanto N-glicosídicas como O-glicosídicas . Por ejemplo, la PH20 tiene oligosacáridos O-ligados así como Oligosacáridos N-ligados. Existen siete sitios de glicosilación N-ligados potenciales en N82,. N166, N235,: N254, N368, N393, N490 de la PH20 humana ejemplificados en SEQ ID NO: 1. Los residuos de aminoácido N82, N166 y N254 se ocupan por los glicanos de tipo complejo mientras que los residuos de aminoácido N368 y N393.se ocupan por los glicanos de tipo mañosa alta. El residuo de aminoácido N235 se ocupa por aproximadamente 80% dé glicanos de tipo mañosa alta y 20% de glicanos de tipo complejo. Como se' indica en lo anterior, la glicosilación N-Ügadas a N490 no se requiere para. la actividad de la hialuronidasa.

En. algunos ejemplos, las enzimas degradadoras de hialuronano para . el uso en . las co-.formulaciones proporcionadas se glicosilan en uno o, todos los sitios de glicosilación. Por ejemplo, para la PH20 humana, o una forma soluble de la misma, 2, 3, 4, 5,· .o. 6. de los sitios dé N-glicosilación que corresponden a los aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368, y N393 de SEQ ID NO : . 1 se glicosilan. En algunos ejemplos las enzimas degradadoras de hialuronano se glicosilan en uno o más sitios, de glicosilación nativos. Generalmente, las formas solubles de la PH20. se producen usando sistemas de. expresión de proteínas que facilitan la N-glicosilación ' correcta para asegurar que el polipéptido retenga la actividad, puesto que la glicosilación es importante para la actividad catalítica y la estabilidad de las hialuronidasas . Estas células . incluyen, , por. ejemplo células de Ovario de Hámster Chino (CHO)- (por ejemplo, células DG44 CHO) .

En otros ejemplos, las enzimas degradadoras de hialuronano se modifican en .uno más sitios de glicosilación no nativos para conferir la glicosilación del polipéptido en uno o más sitios adicionales. En estos ejemplos, la unión de las porciones de azúcar adicionales puede potenciar las propiedades farmacocinéticas de la molécula, tal como la vida media mejorada y/o actividad mejorada.

En otros ejemplos, las enzimas degradadoras de hialuronano, tales como una PH20 c PH20 humana, incluidas en la co-formulación proporcionadas . en . la presente se desglicosilan parcialmente (o polipéptidos N-parcialmente glicosilados ) (véase por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No. US20100143457) . Las glicosidasas, o glicósido-hídrolasas, son enzimas que catalizan la hidrólisis de la ligación glicosidica para generare dos azúcares más pequeñas. Los tipos principales de N-glicanos en los vertebrados incluyen glicanos -de alta mañosa, glicanos híbridos y glicanos complejos. Existen varias glicosidasas que dan por resultado solo la desglicosilación de la proteína parcial, incluyendo: EndoFl, que escinde los glicanos dé tipo de. alta mañosa e híbridos; EndoF2, que escinde los glicanos de tipo complejo biantenario; EndoF3, que escinde los.- glicanos complejos biantenario y más ramificados y EndoH, que escinde los glicanos de tipo de alta mañosa en híbridos. Por: ejemplo, el tratamiento . de :1a PH20 (por ejemplo una PH20. recombinanté designada rHuPH20) con una o. todas las glicosidasas anteriores (por ejemplo EndoFl, EndoF2 EndoF3 y/o EndoH) da por resultado la desglicosilación parcial.' Estos polipéptidos PH20 parcialmente desglicosilados¦ 'pueden, mostrar actividad enz.imática de hialuronidasa que es comparable ' con. los polipéptidos completamente glicosilados. En contraste, el tratamiento de PH20 con PNGaseF, una glicosidasa que escinde todos los N-glicanos, o con el inhibidor, de GlcNA'c fosfotransferasa (GPT) tunicamicina, da. por, resultado la desglicosilación completa, de todos los N-glicanos . y por consiguiente los. hace PH20 enzimáticamente inactivos. De esta manera, aunque los sitios de glicosilación N-liados (tal como, por ejemplo,, aquellos en los aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368, y N393 de la' PH20 humana, ejemplificados en SEQ ID NO: 1) se pueden glicosilar, el tratamiento, con una o más glicosidasas puede hacer el grado de glicosilación reducido comparado con una hialuronidasa que no se digiere con una o , más glicosidasas.

Por consiguiente., las ¦ enzimas . degradadoras de hialuronano parcialmente desglicosiladas, .."tales como hialuronidasas solubles parcialmente, desglicosiladas, se pueden producir por digestión con una o 'más glicosidasas-, generalmente una glicosidasa que no remueve .. todos los N-glicanos pero, desglicosila solo parcialmente la proteína. Las enzimas degradadoras de hialuronano parcialmente desglicosiladas, incluyendo los polipéptidos PH20 solubles parcialmente desglicosilados, pueden tener 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% o , 80% del nivel de glicosilación . de un polipéptido completamente glicosilado. En'- un ejemplo, 1, 2, 3, , 5 o o de los sitios -de N-glicosilación que. corresponden a los aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368, y N393 de SEQ ID NO: 1 se desglicosilan parcialmente, tal que ya no contienen glicanos de tipo de ala mañosa o complejos, sino más bien contienen por lo menos una porción de N-acetilglucosamina . En algunos ejemplos, 1,.2 o 3 de los sitos de N-glicosilación que corresponden a los aminoácidos N82, N166 y N254 de SEQ ID NO: 1 se desglicosilan, es decir, no contienen una porción de azúcar. En otro ejemplos, 3, 4, 5, o 6 de los sitios de N-glicosilación que corresponden a los aminoácidos N32, N166, N235,' N254, N368, y N393 -de SEQ ID NO: 1 se glicosilan. Los. residuos de aminoácido, glicosilado's contienen mínimamente una porción de N-acetilglucosamina . Típicamente, las enzimas ' degradadoras de hialuronano parcialmente desgliCosiladas , incluyendo, los polipéptidos PH20 solubles parcialmente desglicosilados , muestran actividad de hialuronidasa que es 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%,.140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% o más de la actividad de hialuronidasa . mostrada por el polipéptido totalmente glicosilado. 5. Modificaciones de enzimas degradadoras de hialuronano para mejorar sus propiedades farmacocinéticas Las enzimas degradadoras de hialuronano se pueden modificar para mejorar sus propiedades farmacocinéticas , tal cómo ai incrementar su vida media in vivo y/o actividades. La modificación de las enzimas degradadoras de hialuronano para el uso en las formulaciones estables o co'-formulaciones proporcionadas en la presente o en cualquiera de las composiciones, combinaciones y/o métodos proporcionado.s pueden incluir unir, directa o indirectamente a través de un ligador, tal como eovalentemente o por otra ligación estable, un polímero, tal como dextrano, un polietilenglicol (pegilación (PEG) ) o porción de sialilo, u otro' de. estos polímeros tales como polímeros naturales o de azúcar.

La' pegilación de los productos terapéuticos se sabe que incrementa la resistencia a la proteólisis, incrementa la vida media en plasma, y disminuye la antigenicidad . e inmunogenicidad . La unión covalente. u otra estable (conjugación) de las moléculas polimérica, tal como porción ¦de polietilenglicol (PEG), a la enzima degradadora de hialuronano de esta manera puede, impartir, propiedades benéficas a la composición de enzima-polímero resultante. Estas propiedades incluyen biocompatibilidád mejorada, extensión dé la vida media de la proteína (y actividad enzimática.) en la sangre, células y/o en otros tejidos dentro .de un sujeto, protección efectiva de la proteína de las proteasas e hidrólisis, biodistribución mejorada, farmacócinética y/o farmacodinámica potenciadas, y solubilidad en agua incrementada.

Los polímeros ejemplares que se pueden conjugar a la enzima degradadora de hialuronano, incluyen los homopolímeros naturales y sintéticos, tales como polioles (es decir poli-OH) , poliaminas (es- decir poli-NH2) y ácidos policarboxilo {es decir poli-COOH) , y heteropolímeros adicionales es decir polímeros que comprenden uno o más grupos de acoplamiento diferentes por. ejemplo un grupo hidroxilo y grupos amina. Ejemplos de moléculas poliméricas . adecuadas incluyen moléculas poliméricas seleccionadas d entre óxidos de polialquileno (PAO), tales como polialquilenglicoles (PAG) , incluyendo ¦ polipropilenglicoles (PEG) , metoxipolietilenglicoles (mPEG) y polipropilenglicoles, éteres PEG-glicidílieos (Epox-PEG)., polietilenglicoles (PEGs) ramificados a PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG),' alcohol polivinílico (PVA) , policarboxilatos , polivinilpirrolidona, poli-D, L-aminoácidos , anhídrido de ' ácido polietilen-co-maléico, anhídrido de ácido poliestiren-co-maleico, dextranos incluyendo carbo'ximetil-dextranos , heparina, albúmina homologa, celulosas, incluyendo metil celulosas,, incluyen metilcelulosa, . . carboximetilcelulosa, ¦ etilcelulosa, hidroxietilcelulosa ' carboxietilcelulosa e hidroxipropilcelulosa, hidrolisados de.' quitosan, almidones tales como almidón de hidroxipropilo, glicógeno, agarosas y derivados de los mismos, goma de guar, pululan, inulina, goma de xantano,, carragenano, pectina, hidrolisados de ácido alginico y biopolímeros .

Típicamente, los polímeros son óxidos de polialquileno (PAO), tal como óxido de polietileno, tal como PEG, típicamente mPEG, que, en comparación co los polisacáridos tales como dextrano, pululano y similares . tiene pocos grupos reactivos capaces de reticulación-. Típicamente,, los polímeros son moléculas poliméricas no tóxicas. tál como (m) polietilenglicol. (mPEG) que se puede conjugar covalentemente a la enzima degradadora de hialuronano (por ejemplo, a los grupos de unión o sobre la superficie de la proteína) usando .química relativamente simple .

Las moléculas poliméricas adecuadas para la unión a la enzima degradadora de hialuronano incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) y derivados de PEG tales como metoxi-polietilenglicoles (mPEG)., éteres PEG-glicidílicos (Epox.-PEG) , PEG-oxicarbonilimidazol . (CDI-PEG) , PEGs ramificados, y óxido de polietileno (PEO) (véase por ejemplo Roberts y colaboradores, Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris y Zalipsky, S (eds.) "Poly (ethylen giyco.l) , Chemistry and Biplogical Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar y colaboradores, J. Pharm. Phar aceut . Sci. , 3(1): 125-136, 2000; Harris-, Nature Reviews 2:214 (2003); y Tsubery, J Biol. Chem 279 (37 ) : 3811'8-24, 2004) . La molécula polimérica puede ser de un peso molecular que varía típicamente de aproximadamente 3 kDa. a aproximadamente 60. kDa. En algunas modalidades la- molécula polimérica que se ' conjuga a una proteína, tal como rHuPH20, tiene un peso molecular de 5, 10, 15., .20, 25, 30, 35, 40, 45-, 50, 55, 60 o más de 60 kDa.

Varios métodos para modificar pólipéptidos ' al unir covalentemente (conjugar) un PEG o derivado de PEG (es decir, "PEGilación") son conocidos en el campo (véase por ejemplo, Publicación de . Patentes de E.U.A: Nos. 20060104968 y 20040235734; Patentes de E.U.A. Nos . 5, 672, 662. y 6,737,505) . Las técnicas para pegilación incluyen,, pero no se limitan a, ligadores especializados y químicas de acoplamiento (véase por ejemplo Harris,;. Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), unión de múltiples, porciones de PEG a un solo . sitio de conjugación (tal como a través del uso de PEG ramificados; véase por ejemplo, Veronese-, y colaboradores, .' Bioorg. Med. Che . Lett. 12: 177-180, 2002), PEGilación específica de sitio y/o mono-PEGilación (véase . por ejemplo, Chapman y colaboradores, Natura Biotech.. 17:78.0-783, 1999), Vy PEGilación enzimática dirigida al sitio (véase por ejemplo, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:4.87-504, 2.002) (véase, también., por ejemplo, Lü y Féli (1994) Int. J. Peptide ¦ Protein Res. 43: 127-138; Lu y Félix . (1993) Peptide . Res . 6: 142-6, 1993; Félix y colaboradores " ( 1995 ) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar y colaboradores (1994) J. Biol. Chem. 269: 13398-404; Brumeanu y colaboradores (1995) J Immunol. 154:3088-95; véase también, Caliceti y .colaboradores (2003) Adv. ürug Deliv.. Rev.' 55 (10): 1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8. Pt 2):3S-8S). Los métodos y técnicas descritos en el campo pueden producir proteínas que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8/ 9, 10 o más de 10 PEG: o derivados de . PEG unidos a una sola molécula de proteína {véase por ejemplo, Publicación de Patente de E.U.A. No. 20060104968) / Numeroso reactivos de PEGilación, se han descrito en el campo. Estos reactivos, incluyen, pero no se limitan a, PEG activado por N-hidroxisuccinimidilo (NHS) ,. mPEG succinimidilo, mPEG2-N-hidroxisuccinimida, mPEG succinimidilo aifa-metiibutanoato, mPEG succinimidil propionato, mPEG succinimidilo butánoato, éster succinimidilico de ácido mPEG carboximet.il 3-hidr oxibutanoicc, PEG-succinimidil propionato homobifuncional, PEG propionaldehido homobifuncional , PEG butiraldehído homobifuncional, PEG maleimida, PEG hidrácida, PEG de p-nitrofenil-carbonato, carbonato, de PEG-benzotrazole, PEG de propionaldehído, mPEG- butiraldehído., '¦ mPEG2 butiraldehído ramificado, mPEG acetilo, .mPEG piperidona, mPEG metilcetona, mPEG "sin ligador" maleimida, mPEG . vinil sulfona, mPEG . tiol, mPEG .ortopiridiltioester, . mPEG ortopiridil disulfuro, Fmoc-PEG-NHS , Boc-PEG-NHS., PEG-NHS-vinil sulfona, PEG-NHS de acrilato, PEG-NHS de. fluoresceina, y PEG-NHS de b.iotina {véase por ejemplo, Monfardini y colaboradores, Bioconjügate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese y colaboradores , J. Bioactive Compatible .Polimers 12: .197-207, 1997; U.S. 5,672,662; .U.S. 5,932,462;. U.S. 6, 495, 659; UrS. 6,737,505; U.S. 4,002,531; U.S. 4,179,337; U.S. 5,122,614; U.S. 5,324, 844; U.S. 5,446,090; U.S. 5,612,460; U.S. 5, 643, 575; U.S. 5, 766,581; U.S. 5, 795,- 569; U.S. 5, 808,096; U.S. 5, 900, 461; U.S. .5,919,455; U.S. 5 , 985 , 263 ; U . S . 5,990, 237; U.S. .6, 113, 906; U.S. 6, 214,966;. U.S. 6,258,351; U.S'. 6, 340, 742; U.S. 6,413,507·; U.S. 6,420,339; U.S. 6, 437, 025; U.S. 6, 448,369;-. U.S.' 6,461, 802; U.S. 6, 828, 401; U.S. 6, 858, 7.36; U.S. 2001/0021763; U.S. 2001/00445.26; U.S. 2001/0046481;. U.S.. 2002/0052430; U.S. .2002/0072573; U.S. 2002/0156047;¦ U.S.. 20.03/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U . S . . 2003/0220447 ; U.S. 2004/0013637;. US 2004/0235734; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 0.1064951; EP 0822199; WO 00176640; WO 0002017; WO 0249673; WO 0500360; WO 9428024; y WO 0187925)..

D . FORMULACIONES DE ENZIMAS DEGRADADORAS DE HIALURONANO ESTABLES Se proporciona, en la presente formulaciones estables de una enzima degradadora de hialuronano que tiene, u'n excipiente de estabilización que es u. catión divalente. Ejemplos de cationes divalentes . incluyen, pero no .se limitan a, lisil-lisina (dilisina; Lys-Lys) o magnesio (por ej emplo . gCl2) , o sales, derivados, análogos o imitaciones de los mismos. En ejemplos particulares, las formulaciones estables de una enzima, degradadora de hialuronano contiene Lys-Lys, o sales, derivados, análogos o imitaciones de las mismas, como un excipiente de estabilización. En , otros ejemplos, las formulaciones estables de una enzima degradadora de hialuronano. contiene MgCl2, o derivados, análogos o imitaciones de los mismos, como un agente de estabilización. Las enzimas degradadoras de hialuronano que contienen un catión divalente, por ejemplo Lys-Lys o MgCl2, son estables en temperaturas de mayor que o igual a 37 °C durante por lo menos tres (3) días, y generalmente por lo menos seis dias, 7 días (una semana) ,. dos semanas, tres semanas o cuatro semanas (un mes). Por ejemplo, estas formulaciones son estables a temperatura de mayor que o igual a 37°C a 42°C, . tal como por lo menos o aproximadamente 40 °C, durante por lo menos un meses, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses., seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, doce meses o. más.

Las formulaciones . existentes de las enzimas degradadoras de hialuronano contienen alguna de suero humano . (HSA) como un estabilizador. Por ejemplo, HylenexMR recombinante contiene 1.0 mg albúmina humana. Las formulaciones de enzimas degradadoras de hialuronano sin HSA estables se desean por varias razones. Primero, la HSA es. un producto derivado de la sangre, . y de esta manera no es frecuentemente' puro. Los degradantes y contaminantes de HSA pueden interferir con la actividad de la enzima. Además, la HSA sola también. se somete a problemas de estabilidad, puesto que puede formar . agregados bajo ciertas condiciones. Se descubrieron en la présente que las formulaciones sin HSA a través de una enzima degradadora de hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa. tal como una pH20, se puede hacer por la inclusión de un catión divalente, por ejemplo Lys-Lys.

También, como se plantea en cualquier lugar en la presente, la mayoría de' formulaciones existentes de una enzima degradadora de hialuronano, por una hialuronidasa tal como pH20, también contienen NaCl como un agente de estabilización. La presencia de NaCl en otras cantidades de entre o aproximadamente entre 130 mM a 150 mM.'de NaCl o. más se requieren generalmente para la actividad o estabilidad óptima de la enzima. Por ejemplo, la formulación de PH20 comercial HylenexMR contiene NaCl 145 mM. Como se muestra en los ejemplos en la presente, el catión divalente .Lys-Lys y MgCl2 muestran efectos de estabilidad en la enzima degradadora de hialuronano PH20 que se mejora sobre NaCl . Esto es ventajoso, puesto que se descubrió en la presente que la NaCl no estabiliza eficientemente la PH20 - en la incubación ..a temperaturas elevadas o aceleradas de mayor que 37 °C (véase por ejemplo los Ejemplos 23 y 24) . En contraste', la. actividad de PH20 en las formulaciones que contienen los . cationes divalentes, tal. como . Lys-Lys, se retiene a temperaturas elevadas-, tal que las formulaciones pueden mostrar hasta 70% o. más de actividad, y generalmente . a por . lo menos .o aproximadamente por lo menos 80%, 85%, 90%, o más de actividad, después-.. dé: la incubación durante .4 semanas a temperaturas de mayor que o igual a 37°C a 42°C, tal. como por lo menos o aproximadamente o de manera aproximada 40°C, durante por lo menos un mes. En los ejemplos de las formulaciones en la presente que contiene un catión . divalent.e como un estabilizador,¦ por ejemplo . Lys-Ly.s , la¦ actividad de la enzima degradadora. de hialuronano y las. temperaturas elevadas de por lo menos o aproximadamente por lo menos 38°C a 42°C, y en particular a 40°C, se incrementa por mayor que o por lo 'menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%/o más comparada con. la actividad de una enzima degradadora de hialuronano que no contiene el catión divalente- (por ejemplo contiene NaCl como un agente estabilizante) .

Se proporcionan en 1.a presente formulaciones de enzimas degradadoras de hialurona.no estables que tienen una cantidad terapéuticamente' efectiva de una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa. por ejemplo una pH20, (por ejemplo rHuPH20) y una cantidad de un catión divalente, tal como Lys-Lys o 'MgCl?, para hacer la formulación estable a temperaturas mayores que o igual a 37 °C durante por lo menos un mes. En ejemplos particulares, se proporcionan en la presente formulaciones de enzimas degradadoras de hialurona.no que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo. rHuPH20). y una cantidad .de Lys-Lys para hacer la formulación estable a temperaturas que mayores que o igual a 37°C durante por lo menos un mes. Por ejemplo, estas formulaciones son estables a temperaturas de mayor que o igual á 37 °C a 42 °C, tal como por lo menos o aproximadamente 40°C, durante por lo. menos un mes. Las formulaciones también contienen generalmente un surfactante, un agente anti-oxidación (por ejemplo metionina) , un pH de entre o aproximadamente entre . 6.5 a: 7.8 :y un agente amortiguador que mantiene.' el intervalo del pH. Opcionalmente , las formulaciones . ueden contener uno o más de otros agentes estabilizantes, modificadores de tonicidad, conservadores o excipientes .

Típicamente, los compuestos se formulan en. composiciones farmacéuticas usando técnicas y procedimientos bien conocidos en el campo {véase por ejemplo Ansel Introduction a Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126) . Las composiciones farmacéuticamente aceptables en vista' de las aprobaciones por una agencia reguladora u otra agencia preparada de acuerdo con la farmacopea generalmente reconocida para el uso en animales y en humanos. La formulación se debe adaptar al modo.de administración.

Las formulaciones estables se pueden proporcionar como una preparación farmacéutica en forma liquida como soluciones, jarabes o suspensiones. En forma líquida, las preparaciones farmacéuticas se pueden proporcionar, como una preparación concentrada que se diluye a una concentración terapéuticamente efectiva antes del uso. Generalmente, las preparaciones se proporcionan en una forma de dosificación que no requiere dilución para el uso, es decir formulaciones para administración directa. Estas preparaciones, líquidas se pueden preparar por medios convencionales con . aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, . derivados de celulosa o grasas comestibles/ hidrogenadas ) ; agentes emulsificantes (por ejemplo lecitina : o acacia); vehículos' no . acuosos (por ejemplo, aceites., de almendras, ésteres aceitosos, o aceites vegetales fraccionados) ;. conservadores (por ejemplo,, metilo .ó propil-p-hidroxiberizoatos o ácido sórbico) . En otro ejemplo, las preparaciones¦ farmacéuticas se pueden presentar en forma liofilizada para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Las formulaciones . se pueden preparar como formulaciones de dosis individual o. múltiples dosis.

El volumen de las formulaciones : proporcionadas en la presente puede ser cualquier volumen adecuado para el recipiente en el cual se proporciona. En algunos ejemplos, las formulaciones se proporcionan en . un vial, jeringa, ..o cualquier otro recipiente adecuado.' Por ejemplo, las formulaciones estables¦ proporcionadas en. la presente están entre o aproximadamente entre 0.1 mL a 500 mL, tal. como 0.1 raL a 100 mL, 1 mL a 100 mL, 0.1 mL a 50 mL, tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente ?· 0..1 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 10 mL,; .1.5 mL, .20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL o más. ' ' Se proporciona a continuación una descripción de los componentes que se' proporcionan en las formulaciones, de enzimas degradadoras de hialuronano estables en la presente. Las siguientes formaciones estables son ejemplares solamente y proporcionan una plataforma de la cual se pueden hacer ajustes menores. Se entiende que cambios muy pequeños en las concentraciones dé los^ diversos . excipientes y otros componentes (por ejemplo ± 15% de las concentraciones establecidas) , o cambios pequeños en el pH, se pueden hacer siempre que retengan algo si no de la estabilidad. de la enzima degradadora de hialuronano.. También se pueden hacer cambios adicionales al agregar b remover excipientes. Por ejemplo, el . tipo de. surfactante . estabilizante se puede cambiar. 1. Enzima Degradadora de Hialuronano.

La cantidad de enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) , en las formulaciones estables proporcionadas en la presente es una. cantidad para administración directa suficiente para lograr un. efecto terapéutico. En un ejemplo, la cantidad es . una cantidad para administración directa suficiente para degradar el ácido hialurónico (HA) en el espacio subcutáneo debajo de la superficie exterior de la piel humana. Por ejemplo, la cantidad de enzima degradadora de hialuronano en la formulación es una cantidad para administración directa para incrementar la dispersión y absorción de un agente terapéutico , co-inyectado o coadministrado . En otro ejemplo, la cantidad es una cantidad para administración directa suficiente, para degradar el ácido hialurónico (HA) que se- asocia con un tejido o célula enferma. Por ejemplo,' la cantidad es una cantidad para administración directa suficiente para degradar él HA asociado con células tumorales. En estos ejemplos, la cantidad es una cantidad para disminuir, o reducir la presión del fluido intersticial (IFP) o incrementar, el volumen vascular del tumor.

Por ejemplo, la cantidad es funcionalmente .equivalente a por lo menos o aproximadamente por lo menos 30 Unidades/mL. Por ejemplo, las formulaciones, proporcionadas en la presente contienen una enzima degradadora de hialuronano,. tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH-20) en una cantidad entre o aproximadamente entre 30 ¦ Unidades'/mL a 20,000 U/mL, 300 U/mL a 15,000 U/mL, 300 U/mL a 10,000 U/mL, 300 U/mL a 5, 000 U/mL, 300 U/mL a 3000 U/mL, 300 U/mL' a 2000 U/mL, 600. U/mL a''- 20, 0.00 U/mL, 600 U/mL a 15, 000 U/mL, 600 U/mL a 10, 000 U/mL, 600 U/mL a 6000 U/mL, 600 U/mL á 4000 U/mL, 600 U/mL a 2000 U/mL, 600 U/mL a- 1000 U/mL, 60 U/mL. a 600 U/mL, o 100 U/mL a 300 U/mL, tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos 30 U/mL, 35 U/mL, 40¦ U/mL,' 50 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, -500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL,. 1000 U/ml, 2000' U/mL, 3000 U/mL, 4000 U/mL, 5000 U/mL,' 6000 U/mL, 7000 U/mL, 8000 U/mL, 9000 U/mL, 10, 000 U/mL, 12,000 U/mL, 15, 000 U/mL .o 20,000 U/mL. Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente contienen una PH20 (por ejemplo rHuPH20) en una cantidad que es por lo menos 100 U/mL a. 300 U/mL, por ejemplo por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente o 100 U/mL, 115 U/mL, 120 U/mL, 125 U/mL, 130 U/mL, 135 U/mL, 140 U/mL, 145 U/mL, 150 U/mL, 155 U/mL, 160 U/mL, 165 U/mL, 170 U/mL, 175 U/mL, 180 U/mL, 185 U/mL, 190 U/mL, .'200 U/mL, 220 U/mL, 240 U/mL, 260 U/mL, 280 U/mL o 300 U/mL .

En las formulaciones estables proporcionadas en la presente la estabilidad de una enzima degradadora de hialuronano, incluyendo una . hialuronidasa tal como una PH20 (por ejemplo rHuPH20), -en la formulaciones es una función de la recuperación y/o actividad de la enzima a. temperaturas elevadas de mayor que o igual a 37°C a 42°C, tal como por lo menos o aproximadamente o alrededor de 37°C o 40°C, durante por lo menos tres (3) días, y generalmente por lo menos un mes como se describe en lo anterior. Los ensayos para evaluar estos parámetros se describen en la presente. Las formulaciones proporcionadas en la presente retienen la recuperación y/o actividad la hialuronidasa tal. que las formulaciones son adecuadas para uso terapéutico como, se describe en la. presente. En las formulaciones estables proporcionadas en^ la presente, la actividad de -la enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa, por ejemplo una,PH20, típicamente es mayor que o aproximadamente 50%,. tal como mayor que o por lo menos 55%, 60%, 65%', .70%, 194 ': . .· ' 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, . 96%, 97%, 98%, 99% o rnas de la actividad inicial de la enzima en la formulación antes de la exposición a las temperaturas de mayor que ;o igual . a 37 °C a 42°C durante por lo menos tres (3) ' días, y generalmente por lo menos un mes como se describe en la presente. Por ejemplo, la actividad de la enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa, por ¦ejemplo una PH20, típicamente es mayor que o aproximadamente' 50%, tal como mayor que o por lo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% dé . la · actividad de la misma formulación de enzimas cuando se almacenan a 4°C durante por lo menos un mes. Típicamente, las¦ .formulaciones de enzimas degradadoras de hialuronano estables proporcionadas en la presente muestran por lo menos 70% de la actividad inicial de la enzima durante por lo '. menos un mes bajo almacenamiento o uso a temperaturas de mayores que -o igual a 37 °C a 42 °C, tal como por lo menos o aproximadamente o alrededor de 37°C o .40°C. de esta manera, por ejemplo, en una solución formulada con 600 U/mL de una enzima degradadora de hialuronano,. por ejemplo rHuPH2Q, . por lo menos o aproximadamente, por. lo menos 360 Unidades/mL, 365 U/mL, 370 U/mL, 375 U/mL, 380 U/mL, 390 U/mL, 420 U/mL, '.480 U/mL, 540 U/mL, 546 U/mL, .552 U/mL, 558 U/mL, 564' U/mL, 570. U/mL, 576 U/mL, 582 U/mL, 588 U/mL, 594 U/mL o más de actividad se retienen a temperaturas de mayor' que o igual a 37 °C a 42 °C, tal como por lo menos o aproximadamente o alrededor de 37 °C 40°C, durante por lo menos un mes. En otros ejemplos, la estabilidad.se puede evaluar como una función de recuperación de enzima, por ejemplo, usando RP-HPLC. En estas muestras, en las formulaciones proporcionadas en la presente . la recuperación de la enzima de hialuronidasa es de entre . o aproximadamente entre 60% a 140%. Por ejemplo, en las formulaciones proporcionadas en la presente la recuperación de la enzima de hialuronidasa es entre o aproximadamente entre 3-7 ug/mL. 2. Catión Divalente.

Las formulaciones de enzimas degradadoras de hialuronano estables proporcionadas en la presente contienen una cantidad de un catión divalente para lograr por lo menos 50%, generalmente por lo menos 70% de la actividad enzimática inicial de la enzima degradadora. de hialuronano a temperaturas de entre o aproximadamente entre 37°C a 42°G, tal como por lo meno.s o aproximadamente o alrededor de 37 °C o 40°C, durante por lo menos tres (3) días y generalmente por lo menos, un mes (por ejemplo 4 semanas) como se describe . en la presente. Por ejemplo, la cantidad de catión divalente es una cantidad para lograr por lo menos 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 9.6%, 97%, 98%, 99% o más de la actividad enzimática de la enzima degradadora de hialuronano durante por lo menos tres (3) días, . y generalmente durante por lo menos 4 semanas a. temperaturas entre, o aproximadamente entre 37 °C a 42 °C, tal como por lo menos o aproximadamente o alrededor de .40 °C.

Por ejemplo, las formulaciones degradadoras de hialuronano estables proporcionadas en la presente pueden contener una cantidad .. de Lys-Lys, sal, derivado, análogo o imitación de la- misma, para logra, por lo menos 50%, y generalmente por lo menos 70%, de la actividad enzimática inicial de la enzima degradadora de hialuronano a temperaturas' entre . o aproximadamente entre 37°C a 42°C, tal como por lo menos o aproximadamente o alrededor de 40 °C, durante por lo menos tres (3) días y generalmente durante por lo menos 4 semanas. Esta formulación de enzimas degradadoras de hialuronano estables (por ejemplo, una hialuronidasa por ejemplo. una PH20) proporcionada en la presente contiene entre o aproximadamente entre 5.mM a 300 mM Lys-Lys, tal como 10 mM a 200 mM, 50 mM a 150 mM o 10 mM a. 50 mM. Por ejemplo, la formulación de enzimas degradadoras de hialuronano estable (pór ejemplo una hialuronidasa por ejemplo una PH20.) proporcionada en la presente contiene por . lo menos o aproximadamente por lo- menos o 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, .60 mM, 70 mM, 80 mM, .90 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 200 mM, 300 m o más de Lys-Lys.

En otro ejemplo, las formulaciones degradadoras de hialuronano estables proporcionadas en la presente pueden contener una cantidad de MgCl2, derivado, análogo ?· imitación del mismo, para logra por lo menos 50%, y generalmente por lo menos 70%, de la actividad enzimática inicial de la enzima degradadora de hialuronano a temperaturas entre o aproximadamente entre 37°C a 42 °C, . tal como por lo menos o aproximadamente ?. alrédedor de 40 °C, durante por lo menos tres (3) días y generalmente durante por lo menos 4 semanas. Esta formulación de enzimas degradadoras de . hialuronano estable (por ejemplo una hialuronidasa por ejemplo una PH20) proporcionada en la presente contienen entre o aproximadamente entre 5. mM a 300 mM de gCl2, tal como ¦10 mM a .200 mM, 50 mM a 150 mM o 10 mM .a 50 mM. Por ejemplo, la formulación de enzimas degradadoras de hialuronano estable (por ejemplo una hialuronidasa por ejemplo una .¦ PH2.0) proporcionada en la presente contiene . por lo menos o aproximadamente por lo 'menos o 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, .70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM,. 125 mM, 150 mM, 200 mM, 300 mM o más de MgCl2.

Como se plantea posteriormente, las formulaciones que contienen un catión divalente (por ejemplo Lys-Lys), si es necesario, también pueden contener un modificador de tonicidad (por ejemplo NaCl) . 3. pH y Solución Amortiguadora .

Se proporcionan en la presente formulaciones estables de una enzima degradadora de hialuronano tal como hialuronidasa por ejemplo una FH20 (por ejemplo. rHuPH20) que tiene un pH de entre o de aproximadamente entre 6.5 a 7.8 o 6.8 a 7.8 tal como entre o aproximadamente entre 6.5 a 7.5 o 7.0. a 7.6. La referencia al pH en la presente se basa en la medición' del pH a temperatura ambiente. Se entiende que el pH puede cambiar durante, el almacenamiento a través del tiempo, pero típicamente permanecerá entre o entre aproximadamente 6.5 a 7.8, por ejemplo entre o aproximadamente entre 6.8 a o a aproximadamente 7.8. Por ejemplo, el pH puede variar por ± 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6', 0.7, 0.8,. 0.9, 1.0, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 o más. De esta manera, s.e entiende que la referencia a una formulación que tiene un pH de aproximadamente o por lo menos pH 6.5, 6.6, 6.7-, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 >o 7.6 incluye co-formulaciones que tienen un pH de o aproximadamente o . por lo menos 6.5 + 0.2, 6.6 ± 0.2, 6.7 ± 0.2, 6.8 ± 0.2, 6.9 ± 0.2, 7.0 ± 0.2, 7.1 + 0.2, 7.2 ± 0.2, 7.3 ± 0.2, 7.4 ± 0.2, 7.5 ± 0.2 o 7.6 ± 0.2 cuando se prepara.

Si es necesario, el pH se puede ajusfar usando agentes de acidificación para reducir el pH o agentes alcanilizantes para incrementar el pH. Los agentes de acidificación ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ácido acético, ácido cítrico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico,' solución de fosfato de sodio monobásica, y ácido fosfórico. Los agentes alcanilizantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, solución de fosfato de sodio dibásico, .carbonato de sodio, o hidróxido de sodio.

Cualquier solución amortiguadora se puede usar en co-formulaciones proporcionadas en la presente siempre y cuando no afecten . adversamente la capacidad de la formulación, y soporte el requisito de intervalo de pH requerido.. Ejemplos de. soluciones amortiguadoras particularmente adecuadas incluyen Tris, suócinato, acetato, soluciones amortiguadoras de fosfato, histidina, citrato, aconitato, malato y carbonato. Aquellas personas de experiencia en el campo, sin embargo, reconocerán que las formulaciones proporcionadas en la presente no sé limitan a una solución amortiguadora particular, siempre y cuando la solución amortiguadora proporcione un grado , aceptable de estabilidad de pH, o "capacidad amortiguadora" en el intervalo ; indicado. Generalmente, una solución amortiguadora tiene, una capacidad amortiguadora adecuada -dentro de aproximadamente 1 unidad de pH de pK (Lachman. y colaboradores 1986) . La idoneidad de lá solución amortiguadora se puede evaluar con base en las tabulaciones pK publicadas o se puede. determinar empíricamente por los métodos bien conocidos en el campo. .El pH de la solución se puede ajustar al punto., final deseado dentro del intervalo como se describen en lo anterior, por ejemplo usando cualquiera ácido aceptable o base.

Las soluciones amortiguadoras que se pueden incluir en las co-formulaciones proporcionadas en la presente incluyen, pero. no se limitan a Tris (Trometamina) , histidina, soluciones amortiguadoras . de fosfato, tal como fosfato de sodio dibásico, y soluciones amortiguadoras y de. citrato. Por ejemplo, la solución amortiguadora puede ser una solución amortiguadora de clorhidrato de histidina (histidina/HCl ) . Generalmente, el agente amortiguador está presente en . una cantidad en la presente para mantener el intervalo de pH de la co-formulación entre o aproximadamente entre 6.5 a 7.8., por ejemplo entre o aproximadamente entre 6.8 a 7.8 tal como entre o aproximadamente entre 7.0 a. 7.6. Estos agentes amortiguadores pueden estar presentes en las formulaciones en concentraciones entre o aproximadamente entre 1. mM a 100 mM, tal como 10 mM a 50 mM o 20 mM a 40 mM, tal . como en . o aproximadamente .30 mM. Por ejemplo, esos - agentes amortiguadores pueden estar presentes en las co^formulaciones en una concentración de o aproximadamente o por lo menos .1 mM,. 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, .8 mM, 9. mM, 10 mM, 11 m , 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 m , 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45. mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, o más.

En algunos ejemplos, no ' es requerido un agente amortiguador, .. ¦ 4. Surfactante Las formulaciones estables proporcionadas en la presente contienen uno o más surfactantes. Estos: surfactantes. inhiben la agregación de la. enzima degradadora de hialuronano,.. tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) y minimizan la pérdida de absorción. Los surfactantes son generalmente surfactantes no iónicos . Los surfactantes que se pueden incluir en las formulaciones en la presente incluyen, pero- no se limitan a, ásteres de parciales y de ácido graso y esteres de alcoholes poliédricos tales como glicerol, o sp.rbitol, poloxémeros y polisorb'atos . Por ejemplo., los surfactantes ejemplares en las formulaciones en la presente incluyen, cualquiera o. más de poloxámero 188 (PLURONICSMR tal como PLURONICMR F68) , TETRONICSMR, polisorbato 20, polisorbato 80, PEG 400, PEG 3000, TweenMR (por' ejemplo TweenMR 20 o TweenMR 80), TritonMR X-100, SPANM\ MYRJMR, BRIJMR, CREMOPHORMR, polipropilenglicoles o polietilenglicol . En algunos ejemplos, las formulaciones n la presente contienen poloxámero 188, polisorbato 20, polisorbato 80, generalmente poloxámero 188. . . (pluronic F68) . Las formulaciones proporcionadas en la presente contienen generalmente por lo menos un surfactante, tal como 1, 2 o 3 surfactántes .

En las formulaciones proporcionadas . en la. presente, la cantidad total de uno o más surfactantes como 'un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) en l formulación puede ser, por ejemplo, entre de o entre aproximadamente de 0.0005% a 1.0%, tal como . entre o aproximadamente entre 0.0005% ¦¦¦ a 0.005%, 0.001% a .01%,. 0.01% a 0.5%, 0.01% a 0..1% o 0.01% a 0.02%. Generalmente, las formulaciones contienen por lo menos 0.01% de surfactante y contiene menor que 1.0%, taf menor que 0.5% o menor que 0.1% de surfactante. Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente pueden contener en o aproximadamente 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%·, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0..045%, 0.05%, 0.055% , 0.06% , 0.065%, 0.07%, 0.08%, o 0.09% de surfactante. En ejemplos particulares, las formulaciones proporcionadas en la presente contienen o contienen aproximadamente 0.01% a ' o .a aproximadamente 0.05%. de surfactante.

Se . descubrió en la presente que la oxidación de la enzima . se incrementa con niveles de incremento de surfactante. También, el surfactante poloxámero 188 provoca menos oxidación que los polisorbatos . Por consiguiente, las formulaciones en . la présente . contienen generalmente poloxámero 188. De esta manera, aunque los sur'factantes son capaces de estabilizar una enzima degradadora de hialuronano, la inclusión de. surfactantes en . las formulaciones proporcionadas en la presente puede., dar por resultado oxidación de la enzima degradadora de la hialuronano en altas concentraciones. . De esta manera, las concentraciones generalmente menores de surfactantes se usan en las co-formulaciones en la presente, por ejemplo, como un. porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de menor que 1.0% y generalmente entre o aproximadamente entre 0.01% o 0.05%, tal como 0.01%. también, como se. proporciona' en la presente. '.a continuación, opcionalmente un agente anti-oxidación se puede incluir en la formulación para reducir o prevenir la oxidación . 5. Agente Anti-Oxidación Las formulaciones proporcionadas en la presente - también pueden contener anti-oxidantes para reducir o prevenir la oxidación, en particular la oxidación de la enzima degradadora de hialuronano. Por ejemplo, los ejemplos en la presente muestran que la oxidación se puede efectuar por altas .concentraciones de surfactante. Los anti-oxidantes ejemplares incluyen, .. pero no se limitan a, cisterna, triptofano y metionina. En ejemplos particulares, el antioxidante, es metionina. Las formulaciones proporcionadas, en la presente pueden incluir un antioxidante en una concentración de entre o de aproximadamente entre 5 . mM' a o. - a aproximadamente' 50 mM, tal como. 5 mM a 40. mM, 5- mM a 20 mM o .10 mM a 20 mM. Por ejemplo, la metionina se puede proporcionar en las formulaciones en . la presente en una concentración de entre o de aproximadamente entre 5 mM a o aproximadamente 50 mM, . tal como 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mM a 20 mM. Por ejemplo, un anti-oxidante, por ejemplo metionina, se puede incluir en- una. concentración qüe es aproximadamente o es por lo menos 5 mM,. 10 mM, 11 mM, .12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, .24 mM, .25 mM, 26. mM, 27 mM, 28 mM, 29. mM, 30 mM, 35 mM, 40' mM, 45 mM o 50 mM. En algunos ejemplos, las co-formulaciones . contienen 10 mM a 20 ' mM de metionina, tal como o aproximadamente o por lo menos 10 mM o 20 mM de metionina. . " .* . · ' 6. Modificador de Tonicidad.

Opcionalmente, las formulaciones de enzima degradadorás de hialuronano estables proporcionadas en la presente pueden contener un modificador de tonicidad. En particular, un modificador de tonicidad' es necesario en las formulaciones que contienen menores concentraciones, de un catión divalente, tal como Lys-Lys, puesto que la tonicidad suficiente no se logra .

Por ejemplo., un modificador de tonicidad se incluye en las formulaciones en la presente para producir una solución con osmolaridad deseada. Las formulaciones proporcionadas en la presente tienen, una osmolaridad de entre o aproximadamente entre 245 mOsm/kg a 500 mOsm/kg. Por ejemplo, la osmolaridad es o es de aproximadamente o por lo menos 245 mOsm/kg, 250 mOsm/kg, 255 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 265. mOsm/kg, 270. mOsm/kg, 275 mOsm/kg, 280. mOsm/kg, 285 mOsm/kg, . 290 mOsm/kg, 295 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 350 mOsm/kg, 400. mOsm/kg, 450 mOsm/kg. o 500 mOsm/kg. Típicamente, una tonicidad modificada se incluye en las formulaciones en la presente que contienen un catión divalente, tal como Lys-Lys, en una concentración que es menor que 100 mM, tal como menor que 80; mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40. mM, 30 mM, 20 .mM, 10 mM o menor. Por ejemplo,, una tonicidad modificada se incluye en las formulaciones en la presente que contienen un catión divalente, tal como Lys-Lys, en una concentración de entre o aproximadamente entre 10 mM a 50 mM, tal como aproximadamente o. alrededor de 10 mM, .15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM o 50 mM. .

. Los modificadores de tonicidad incluyen,, pero no se limitan a, gliceri.na, NaCl, aminoácidos, poliálcoholes , trehalo.sa, y otras sales y/o azúcares. Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la . presente pueden incluir opcionalmente NaCl; como un tonificado de tonicidad. El · aCl se puede incluir en una concentración de.' entre o aproximadamente entre 0 mM' a 200 mM, tal como generalmente 30 mM a 100 mM, 50 mM a 1.60 mM, por ejemplo 50 mM a 120 mM o 80 mM a 140 mM. Generalmente, el NaCl es menor que .150 . mM,-- y generalmente menor que 140 mM, ' 130 mM, 120 mM, 1 10 mM, . 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20. mM, 10 mM o menos. La cantidad particular es una función, de la concentración de un catión divalente, por ejemplo Lys-Lys. Por ejemplo, mientras es más alta la concentración de Lys-Lys, es más baja la concentración de NaCl (o sin NaCl). La cantidad particular se puede determinar empíricamente al fin de retener la actividad y/o tonicidad en la enzima.

En otro ejemplo,, la glicerina (glicerol) se incluye opcionalmente en las formulaciones estables. Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente -contienen típicamente menor que 60 mM de glicerina, tal como menor que 55 mM, menor que .50 mM, menor que 45 mM, menor que 40 mM, menor que 35 mM, menor que 30 mM, menor que 25 mM, menor que 20 mM, menor que 15 mM, 10 mM o menor. La cantidad de glicerina depende típicamente en la cantidad de catión divalente (por ejemplo Lys-Lys) présente :. mientras -es más el catión divalente (por ejemplo Lys-Lys) presente en la formulación, es menor la glicerina requerida para lograr la osmolaridad deseada. De esta manera, en algunos, casos, poco. o nada de glicerina necesaria se incluye en la formulación. 7. Otros Agentes 6 Excipientes .

Las formulaciones estables próporcionadas en La presente pueden contener opcionalmente uno o más de otros agentes, portadores, excipientes o conservadores. Por . ejemplo, los estabilizadores . ejemplares que se pueden incluir opcionalmente en las formulaciones de enzimas degradadoras de hialuronano estable próporcionadas en la. presente, incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, derivado de aminoácido, aminas, azúcares, . polioles, sales y soluciones amortiguadoras, surfactantes , y otros agentes'. Por ejemplo, incluidos entre los tipos de estabilizadores que pueden estar contenidos opcionalmente en las formulaciones en lá presente es un estabilizador de aminoácido o ' un inhibidor de hialuronidasa (por ejemplo un sustrato de hialuronidasa, tal como hialuronano). Los^ estabilizadores de. aminoácidos ejemplares, derivados de aminoácidos o aminas ncluyen, pero no se limitan a, L- rginina, Glutamina, glicina, Lisina, Metionina, Prolina, Lys-Lys, Gly-Gly, óxido de Trimetilamina (TMAO) o betaina. Ejemplares de azúcares y polioles incluyen, pero no. se limitan a, glicerol, sorbitol, manitol, inositol, sacarosa o trehalosa. Ejemplares de sales . y soluciones amortiguadoras incluyen, pero no se limitan a, cloruro de magnesio, sulfato de sodio, Tris, tal como Tris. (100 m ) , o Benzoato de sodio. Surfactantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, poloxámero 188 (por ejemplo PluronicMR F68), polisorbato 80 (PS80), polisorbato 20 (PS20) . Otros estabilizadores incluyen, pero no. se limitan a, ácido hialurónico (HA) , albúmina de suero humana (HSA), ácido fenil butírico, ácido taurocólico, polivinilpirrolidona (PVP) o zinc. En ejemplos particulares en la presente, las enzimas •degradadoras de hialuronano estables, no contienen 'HSA'- 'y son formulaciones sin HSA.

Para formulaciones estables formuladas para administración de múltiples dosis, las formulaciones también pueden contener opcionalmente una cantidad de conservadores que, cuando se combinan con los componentes expuestos en lo anterior, dan por resultado una formulación estable. Guando se incluyen, los conservadores están : presentes · en una concentración suficiente para proporcionar los requisitos anti-microbianos de, por ejemplo, . la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) y la Farmacopea Europea (EP) .' La Tabla 22, en el Ejemplo . 7 posterior, expone" estos requisitos, incluyendo los requisitos anti-microbianos EP mínimos (EPA) y ¦ los requisitos . anti-microbianos EP preferidos (EPB).. Típicamente, las formulaciones que cumplen con los requisitos anti-microbianos EP' (EPA o EPE) contienen más conservador que aquellos formulados solamente para cumplir con los requisitos anti-microbianos USP. Generalmente, cuando se .incluyen, las formulaciones ' proporcionadas . en la presente contienen conservadores de una ..cantidad que muestra actividad antimicrobiana al exterminar o inhibir la propagación dé organismos microbianos en una muestra de la composición como se evalúa en una prueba de- efectividad conservadora anti-microbiana (APET) como se plantea en cualquier lugar en la presente. Los ejemplos, no limitantes de los conservadores se pueden incluir en las formulaciones proporcionadas en la presente incluyen, .pero no se limitan a, fenol, meta-cresol (m-cresol), metilparabeno, alcohol bencílico, timerosal, cloruro de benzalconio, 4-cloro-l-butanol , diclorohidrato de clorhexidina, digluconato de clorhexidina, L-fenilalanina, EDTA, bronopol . ( 2 -bromo-2-nitropropano-1 , 3-diol ) ,. acetato fenilmer.cúrico , glicerol (glicerina) , imidurea, clorhexidina, dehidroacetato de sodio, orto-cresol (o-cresol) , para-cresol (p-cresol) , clorocresol, cetrimida, cloruro de benzetonio, etilparabeno, propilparabeno o butilparabeno , y cualquier combinación de los mismos. En un ejemplo, el conservador de la formulación contiene por lo menos un conservador fenólico. Por ejemplo, la formulación contiene fenol , m-cresol o fenol y m-cresol. Cuando. se incluyen formulaciones proporcionadas en la presente, a cantidad total de uno o, más agentes conservadores como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) en la formulación puede ser, por ejemplo entre, o entre aproximadamente de 0.1%. a 0.4%, tal como 0.1% a 0.3%, 0.15%· a 0.325%, 0.15% a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a ?.' 3% , o 0.3% , a 0.4%, y generalmente menor que 0.4% (p/v) de conservador, por ejemplo., por lo menos o aproximadamente por lo menos .0.1% ·, 0.12%, 0.125%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16%, 0.17%, 0.175%, 0.18%, 0.19%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.325%, 0.35% pero, menor que 0.4% de conservador . total .

Opcionalmente , las formulaciones pueden incluir portadores tal como un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con la cual la formulación se administra.- Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados . se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin! Estas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, generalmente de forma purificada o en forma parcialmente purificada,. junto con una. cantidad adecuada del portador, para proporcionar la forma ¦ para la administración apropiada al paciente. Estos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceite, incluyendo' aquellos de. petróleo, de origen animal., vegetal, o sintético, tal como aceite de cacahuate, aceite de soja, aceite mineral y aceite de ajonjolí. El agua es ün portador típico cuando la composición . farmacéutica se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerol acuosas también se pueden emplear como portadores líquidos particularmente para soluciones inyectables.

Por ejemplo, los portadores farmacéuticamente aceptables usados en las preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes anti-microbianos., agentes isotónicos, soluciones amortiguadoras, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsificantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras .¦ sustancias farmacéuticamente aceptables . Ejemplos de vehículos acuosos incluyen Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer,. Inyección de Dextrosa Isotónica, Inyección de Agua Estéril, Inyección de Dextrosa y Ringer Lactada. Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites ; fijos · de origen vegetal, aceite de algodón, aceite de maíz, aceite de ajonjolí y aceite de cacahuate. Los agentes anti-microbianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas,. se pueden agregar a las · preparaciones parenterales empacadas en recipientes de múltiples dosis, que incluyen fenoles o. cresoles, mercuriales, alcohol bencílico clorobutanol , ésteres de ácido metil y propil p-hidroxibenzóico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de. benzetonio. Los agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Las soluciones amortiguadoras ' incluyen 212 ': . .· '¦ fosfato y citrato.. Los anti-oxidantes incluyen, bisulfato . ele sodio. Los anestésicos locales incluyen clorhidrato de procaina. Los agentes de suspensión, y dispersión incluyen carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropil metilcelulosa y polivinilpirrolidona. Agentes emulsificantes incluyen Polisorbato 80 (TWEEN 80) . Un agente secuestrante o quélante de iones de metal incluyen EDTA. Los portadores farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para vehículos miscibles en agua e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para el ajuste del pH.

Las composiciones pueden contener junto . con un ingrediente activo: un diluyente tal como lactosa,, sacarosa, fosfato de dicalcio, o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio y talco.; y un aglutinante tal como almidón, gomas naturales,, tal como goma de acacia, gelatina, glucosa, . melazas, polivinilpirrolidona, celulosa y. derivados de los mismos, povidona, crospovidonas y otros aglutinantes conocidos por aquellas personas con experiencia en el campo.

Por ejemplo, una próteína- excipiente se puede agregar a la formulación que . puede, ser cualquiera de una variedad de proteínas o . péptidos farmacéuticamente aceptables. Generalmente, la proteína excipiente se selecciona por su capacidad para ser administrada a un sujeto, mamífero sin provocar una respuesta inmune. Por ejemplo, la albúmina de suero humana es bien adecuada generalmente para el uso en las formulaciones farmacéuticas, aunque típicamente no se incluye en las formulaciones, estables en la presente. Otros excipientes de proteínas farmacéuticos conocidos incluyen, pero no se limitan a, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina,- tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato dé glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, · propileno, glicol agua y etanol. El excipiente se incluye 'en la formulación en una concentración suficiente para prevenir la absorción de la proteína al recipiente o vial de contención. La concentración del excipiente variará de acuerdo^ con el carácter del excipiente y la concentración de la proteína . en la co-formulación.

Una composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes amortiguadores de pH, por ejemplo, acetato, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sórbitán, acetato de sodio de trietanolamina, ' oleato de trietanolamina, y otros agentes. 8. Formulaciones de Enzimas Degradadoras de Hialuronano Estables Ejemplares.

Se proporcionan' en la presente formulaciones de enzimas degradadoras de hialúronano estables que son estables en temperaturas de 37 °C a.42 °C, tal como mayor que o igual a 37°C o 40°C,. durante por lo menos tres '(3) días, .-.y generalmente por lo menos un mes.

En un ejemplo, una .formulación ejemplar contiene: 100 U/mL a 1000 U/mL,, tal como 100 U/mL a 500. U/mL o 1.00 U/mL. a 300 U/mL de una enzimá degradadora de hialúronano tal cómo una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) , y en particular por lo menos aproximadamente por lo menos o aproximadamente 155' U/mL de una enzima degradadora . de hialúronano tal como una hialuronidasa por ejemplo PH20 (por ejemplo rHuPH20);. de o de aproximadamente 5 mM . a o a aproximadamente 20.0 mM, tal como 10 mM a 50 mM o 5 mM a 20 mM de Lys-Lys (por ejemplo por lo menos o aproximadamente por lo menos 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 ¦ mM o 50 mM) ; ; de' o de aproximadamente 0 mM a o a aproximadamente 300 mM de fosfato de sodio dibásico (por ejemplo de o de aproximadamente 0 mM a 150 mM o 5 .mM a 50 mM de fosfato de sodio dibásico, tal com.o por lo menos o aproximadamente por lo menos 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30. mM, 40 mM o 50 mM, 100 mM o 1.50 mM) ;. 0 mM a .o a aproximadamente 50 mM de metionina (por ejemplo entre .o aproximadamente entre 5¦ mM a 20 mM, tal como por lo menos o aproximadamente por lo. menos 5 mM, 10· mM, 20 mM, 30. mM, 40 mM o.50 mM de metionina) ; y de o de aproximadamente 0.01%. a o..a aproximadamente 0.5% de poloxámero 188, tal como de.0.01% a 0.05% (por ejemplo por lo menos aproximadamente por lo menos 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04% o 0.05% de polisorbato 80)'. Las formulaciones se preparan con un pH de o de aproximadamente 6.5 a 7.6, tal como, de o de aproximadamente 6.5 a 7.2 b 7.0. a o a aproximadamente , 7.6 (por ejemplo por lo . menos o aproximadamente por lo menos pH 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4., 7.5 o 7.6) . En ejemplos adicionales, el NaCl se incluye en una concentración menor que 140 mM. Por ejemplo, el NaCl se. incluye en una concentración de o aproximadamente 50". mM : a 150 mM, tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos 50 mM, . 60 mM, 70 mM, .80 mM, 90 mM o 100 mM.

En otro ejemplo, una formulación ejemplar contiene: .100 U/mL a 1000 U/mL, tal como 100 U/mL a 500 U/mL o 100 U/mL a 300 U/mL de una enzima degradadora de hialuronano . tal como ialuronidasa por ejemplo PH20 (por ejemplo rHuPH20) , y en particular por lo menos o aproximadamente 155 U/mL 'de una enzima degradadora de hialuronano tal . como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) ; de . o de aproximadamente 5 ' mM a o, a aproximadamente 200 ,mM, tal como entre o aproximadamente entre 50 mM a . 150 mM .MgCÍ2 (por ejemplo por lo menos o aproximadamente por lo menos 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 1 10 mM, 120 mM, 130 mM o 150 mM) ; de o de aproximadamente 0 mM a o a aproximadamente 300 mM de clorhidrato- de histidina (por ejemplo, de o de aproximadamente 0 mM a 150 mM o 5 mM a 50 mM de hidrocloruro de histidina, tal como por lo menos, o aproximadamente por lo menos 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM, ???,??? o 150 mM). ; de. o de aproximadamente 0 mM a o a aproximadamente 50 mM de metionina (por ejemplo entre o aproximadamente entre 5 mM a 20 mM, tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos 5 mM, 10 mM, 20 mM,. 30 mM, 40 mM o.50 mM de metionina); y de o . de aproximadamente 0.01% a o- a. aproximadamente. 0.5% de poloxámero 188, tal como .0.01% a 0.05% (por ejemplo por lo menos o aproximadamente por lo menos. 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04% o 0.05% de polisorbato 80). Las formulaciones se preparan con . un pH de o de aproximadamente 6.5 a- 7.6, tal como de o de .aproximadamente 6.5 a 7.2 o 7.0. a o a aproximadamente 7.6 (por ejemplo por lo menos. o aproximadamente por lo menos o aproximadamente por lo menos pH 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1 ,. 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 o 7.6) .

E. Polipéptidos de Insulina.

Se proporcionan en la presente co-formulaciones de una enzima degradadora de ' hialuronanó y una;, insulina/ Las 'co- formulaciones proporcionadas en la presente contienen¦ una insulina de acción rápida, tal como una- insulina regular o un análogo de insulina, por ejemplo llamado un análogo de acción rápida o un análogo de acción rápida, usado intercambiablemente en la presente se modifica (por ejemplo el reemplazo de aminoácidos) para reducir la auto. · asociación de la insulina, y. da por resultado una disociación' más rápida de los hexámeros.

La insulina es un polipéptido compuesto de 51 residuos de aminoácidos que es de 5808 Daltons en peso, molecular. Se produce en lós islotes de Langerhans de célula beta en el páncreas. Una insulina ejemplar humana se traduce como un polipéptido precursor de 110 aminoácidos, pre-proinsulina (SEQ ID NO.: .101)., · gue contiene un péptido señal de 24 aminoácidos a ER, la secuencia señal de escinde, dando por resultado de proinsulina (SEQ ID- NO-: 102). La molécula proinsulina se convierte subsecuentemente en una insulina madura por las acciones de las enzimas, proteoliticas , conocidas como pro-hormonas convertasas (PCI y PC2).y por las acciones, de la exoproteasa carboxipeptidasa E.. esto da . por resultado la remoción de 4 residuos de aminoácidos básicos y C-péptido de 31 aminoácidos restante o que conecta la .cadena (que corresponde a los residuos de aminoácidos 57 a 87 del polipéptido .de pre-proinsulina expuesta en SEQ ID NO: 101) .

La insulina resultante contiene' una cadena A de 21 aminoácidos (que corresponde a los residuos de aminoácido 66 a 86 del polipéptido pro-insulina expuesta en SEQ ID NO: 102) y una cadena B de 30 aminoácidos (que corresponde a los residuos de aminoácido 1 a 30 del polipéptido de. pro-insulina expuesto en SEQ ID NO: 102), que. se retícula por las ligaciones de disulfuro. Típicamente, la insulina madura contiene tres puentes de disulfuro: uno entre la posición 7 de la cadena A y la posición 7 de la .cadena B, un segundo entre la posición 20 de la cadena A y la posición 19 de la cadena B, y un tercero entre las posiciones 6 y 11 de la cadena A. La secuencia de la cadena A de una insulina 'madura se expone en SEQ ID NO: 10 y la secuencia de la cadena B se expone en SEQ ID NO: 104.

La referencia, a . la insulina incluye pre-proinsulina, proinsulina y polipéptidos de insulina en formas de cadena individual o de dos cadenas, formas truncadas de las mismas que tienen actividad, e incluye, variantes álélicas y de especies, variantes codificadas por variantes . de empalme y otras variantes, tales como análogo de insulina, u otras formas derivadas, incluyendo polipéptidos que tienen por lo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%', 90%, 95%,' 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad' de secuencia polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 101 o la forma madura del mismo, siempre y cuando la insulina se ligue al receptor de insulina' humana para iniciar una' cascada de señalización que da por resultado un incremento de la captación y de. almacenamiento de glucosa y/o una disminución de la producción de glucosa endógena. Por ejemplo, las insulinas incluyen variantes de especies de insulina ... Estas incluyen pero no se limitan a, insulinas derivadas de bovino (expuesta en SEQ ID N0-: 133) y porcina . (SEQ ID. NO: 123) . La insulina bovina ; difiere de la insulina humana en los aminoácidos 8 y 10' de la cadena A, y el aminoácido 30 de la cadena B. La. insulina porcina difiere solamente de la insulina humana en el aminoácido 30 en la cadena. B donde, similar . a la secuencia bovina existe una sustitución de alanina en lugar de treonina. Otras variantes de especies ejemplares de insulina se exponen en cualquiera de SEQ ID NOS: 105-146. . . ..

. También se incluyen entre las variantes de insulina, los análogos de insulina que contienen una o más modificaciones de aminoácido comparadas con una insulina humana expuesta en SEQ ID NO: 103 y 104 (cadenas A y B) . Estas variantes incluyen análogos de insulina de acción rápida o acción prolongada (todos designados en la presente como un análogo de insulina de acción rápida, aunque se. entiende-, que. para propósitos en la presente esta influye formas análogas de insulina de acción, rápida y acción prolongada) .. Los. análogos de insulina ejemplares (cadenas A y. B) , incluyendo formas análogas de acción rápida y acción prolongada, se exponen en SEQ ID NOS : 147-165, 182- 184). Por ejemplo, los análogos de insulina incluyen, pero no se limitan a, glulisina (LysB3., GluB29; expuesta en . SEQ ID NO: 103 (cadena A) ; y SEQ ' ID NO: 149 (cadena B) ) , H R-1.153 (LysB3, IleB28; expuesta en SEQ ID NO: 103 (cadena . A) y SEQ ID NO: 182 (cadena B) ) , HMR-1423 (GlyA21, HisB31, HisB32; expuesta en SEQ ID NO.: 183 -(cadena A) y SEQ ID NO: 184 (cadena B) ), insulina aspart (AspB2'8; expuesta en SEQ ID NO: 103 (cadena A) y SEQ ID NO: 147 (cadena B) ) , e insulina lispro (LysB28, ProB29; expuesta en SEQ ID. NO: 103 (cadena A) y SEQ ID. NO: 148 (cadena B) ) . En cada caso anterior, la nomenclatura de los análogos se basa en una descripción de la sustitución de aminoácidos en las posiciones especificas o en la cadena A o B de la. insulina, numerada de la N-terminal de la cadena, en la cual, el resto de la secuencia es aquella de la insulina humana natural.

Por consiguiente, la insulina regular como es proporcionada en. las co-formulaciones . en la presente es una insulina madura que- contiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID. NOS: 103 y 104. Ejemplar de . una insulina humana regular' es la insulina humana recombinante designada HumulinR R. Las . insulinas regulares también incluyen variantes de especies de insulina madura que tienen una cadena A y B, por ejemplo, formas maduras de cualquiera de SEQ ID NOS: 105-146. Otros análogos de insulina ejemplares incluidos en las co-formulaciones en la presente incluyen, pero no se limitan, a, una insulina que . tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 103. (cadena A) , y SEQ ID NO: 149 (cadena B) ; una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 103 (cadena A) y SEQ ID NO: 147 (cadena B) ; o una secuencia de aminoácidos expuesta, en SEQ ID NO: 103 (cadena A) y SEQ ID NO: 148 (cadena B) .

. Cualquiera de los polipéptidos de. insulina anteriores incluyen aquellos que se producen por el páncreas de cualquiera de las especies, tales como un humano, también incluyen insulinas que se producen sintéticamente o usando técnicas recombinantes.. Por ejemplo, . como se describe en cualquier lugar en la presente, la insulina se puede producir sintéticamente al expresar genes sintéticos para las cadenas A y B de insulina, al expresar la proinsulina completa y al exponerla a los método, enzimáticos y químicos apropiados para generar una insulina madura, o al expresar las cadenas A y B conectadas por un péptido ligador {véase por ejemplo DeFelippis y colaboradores (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics . '.En Diabetes Mellitus de Ellenberg y Rifkin (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional ) Las insulinas también incluyen formas monoméricas y oligoméricas , tales' como formas hexamér.icas . La insulina puede existir como un monómero conforme . circula en el plasma, y también se liga, a su. receptor mientras está en una forma monomérica. La ' insulina, sin embargo, tiene una propensión., a auto asociarse en los dimeros, y en. presencia de. iones de metal tal como Zn2+ puede asociarse fácilmente en las estructuras de orden más alto tal . como hexámeros . Existen dos sitios, de ligación dé afinidad alta simétricos para Zn, aunque otros sitios de ligación a zinc más débiles también se han reportado (véase por ej emplo, DeFelippis y colaboradores (2002) : Insulin Chemistry and Pharmacokinetics . En Diabetes Mellitus de Ellenberg y Rifkin (pp. . 481-500.) McGraw-Hill Professional ) . El auto asociación es, importante para la estabilidad de la molécula para . prevenir la degradación química y la desnaturalización física. De esta manera, en las vesículas de almacenamiento en las células beta, pancreáticas , la insulina existe como un hexámero. En la liberación en el espacio extracelular, sin embargo, se cree gue los hexámeros de insulina pueden' experimentar un cambio en el · pH a condiciones más neutras y los hexámeros que contienen ion de zinc se diluyen, lo cual estabiliza el hexámero. Puede haber otras razones que contribuyen a la desestab.ilización del •hexámero de insulina en el. espacio extracelular. La insulina de esta manera se encuentra predominantemente en la sangre como un monómero. Para tomar ventaja de los efectos de estabilización, las formulaciones más comerciales de insulina contienen iones de zinc y cantidades suficientes para promover la auto-asociación en los hexámeros. La estructura hexamérica, sin embargo, desácelera la velocidad de absorción de estas formulaciones en la administración subcutánea.

La insulina se usa como un agente terapéutico para el control glicémico, tal · como en pacientes diabéticos. Existen varios tipos de . formulaciones de insulina que. existen, dependiendo de si. la insulina está siendo administrada para controlar la glucosa para la terapia basal, para terapia prandiai, . o para una combinación de las mismas. Las formulaciones de insulina se pueden proporcionar solamente como formulaciones de acción rápida, solamente como formulaciones de acción basal (es decir formas de acción intermedia y/o acción prolongada), o como mezclas de las mismas (véase por ejemplo,. Tabla 2) . Típicamente, las mezclas contienen una insulina- de acción rápida e intermediario de acción prolongada. Por ejemplo, las insulinas de acción rápida se pueden combinar con una insulina NPH (una insulina de acción intermedia ejemplar como se plantea posteriormente) en varias relaciones : de mezcla incluyendo 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, y 50:50. Estas preparaciones pre-mezcladas pueden reducir el número de inyecciones de insulina diarias al proporcionar convencionalmente requisitos de . insulina tanto relacionados con las comidas como básales en- una sola formulación. ¦¦ · · -.

Las preparaciones de insulina incluyen un polipéptido de insulina o variante (es decir análogo) del mismo formulado en una manera específica.. En algunos casos,, son los componentes y sustancias en la formulación que imparten diferentes propiedades en. la insulina,, tal como duración de acción diferente. Por ejemplo, la mayoría de preparaciones de insulina contienen, un ión de metal, tal como zinc, en la formulación, que estabiliza la insulina, al promover la¦ auto-asociación de la molécula. La autoasociación en las formas hexaméricas pueden afectar la absorción de la insulina en la administración. Además, las formulaciones de insulina básales de acción más prolongada se preparan al precipitar la insulina de una solución amortiguadora de acetato (en lugar de fosfato), por la adición de zinc. Los cristales grandes de insulina con el contenido de . zinc alto, cuando se colectan y se re-suspenden en. una solución de acetato de sodio-cloruro de sodio (pH 7.2 a.7.5), se absorben lentamente después de la inyección subcutánea y e ercen una acción de duración prolongada. Esta preparación de cristal es nombrada suspensión de zinc de insulina prolongada (insulina ultralenta) . Otras preparaciones de insulina que contienen zinc incluyen, .por ejemplo, insulina. semi-lentas (suspensiones de zinc -de insulina rápida) e insulinas lentas (suspensiones de zinc de insulina), que' difieren predominantemente en la concentración de zinc usada. Las preparaciones de insulina que contienen zinc también incluyen aquella que se modifican por protamina, tal como insulina NPH.

En. otro ejemplo, -un agente de precipitación, tal como protamina, se pueden agregar a un polipéptido de insulina para genera una suspensión microcristalina . Típicamente, las insulinas cristalinas tienen una duración prolongada de acción comparadas con¦ las insulinas que no existen en forma cristalina. Una. insulina, de zinc de protamina,. cuando se inyecta subcutáneamente en' una suspensión acuosa, se disuelve solo lentamente en el sitio de deposición, y la insulina se absorbe en una velocidad retardada. La insulina.de suspensión de zinc de protamina se ha reemplazado en gran medida o la suspensión de insulina de isofano, también conocida como insulina NPH. Es. una suspensión de insulina de zinc de protamina modificada que es cristalina. Las concentraciones de insulina,, protamina, y zinc se arreglan, de esta manera que la preparación tiene¦ un inicio y una duración de acción intermedia entre aquella de insulina regular y. suspensión¦ de insulina de zinc de protamina.

Además, las diferencias . de pH en las¦ .preparaciones también incluyen en el tipo y propiedad de la insulina. La mayoría de insulina se . formula en pH neutro. Una excepción es la insulina glargina, que se proporciona, como una formulación comercial a pH 4.0. En virtud de la adición de dos argininas a la C-terminal de la cadena B, el punto isoeléctrico de la insulina glargina¦ se cambia haciéndola más soluble en un pH ácido. Existe un cambio de aminoácido adicional en la cadena A (N21G) para prevenir la desamidación y dimerización que resultan de una asparagina sensible al ácido. La secuencia de la cadena A de la-insulina glargina se expone en SEQ ID NO: 150 y la cadena B' se expone en SEQ ID NO: 151. Puesto que la exposición al . pH fisiológico se presenta en la administración, se forman microprecipitados, que hacen la glargina similar a una insulina de acción prolongada, cristalina . .

La Tabla 4 a continuación resume varios tipos de insulina, su inicio de acción y su aplicación.

Las insulinas más comúnmente usadas son las insulinas de acción rápida, que incluyen insulina regular (es decir insulina nativa o de tipo natural, incluyendo variantes alélicas y de especies de la misma) y análogos de insulina de acción rápida. Para propósitos en la presente, la referencia en la insulina es una insulina de acción rápida, a menos que se indique específicamente de otra manera.

Insulinas de Acción Rápida Las insulinas de acción rápida que se. pueden usar en las co-formulaciones proporcionadas en la presente de insulina y una enzima degradadora de hiáluronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20)., incluyen insulina regular, que es la insulina de tipo natural nativa, y análogos de insulina de acción rápida. En virtud de su velocidad de absorción rápida comparada con las insulinas de acción basal, las insulinas de acción rápida se usan predominantemente para propósitos de control pos-prandial . Las insulinas de. acción rápida ejemplares se exponen en la Tabla 5 a continuación. Las insulinas de acción rápida también incluyen cualquiera conocido en" el campo, tal como, pero no limitado a, cualquiera de las preparaciones de insulina y dispositivos dados a conocer, en la Patente de E.U.A. No. 7, 279, 457 y Publicación de Patente de E.U.A. Pub . Nos. 20070235365, . 20080039368, 20080039365, ' 20070086952, 20070244467, y 20,070191757. Cualquiera Insulina de acción rápida se puede combinar en co-formulaciones con una enzima degradadora de .hialuronano proporcionada en la presente. Esta formulación también puede incluir además una mezcla de una insulina de acción rápida con una insulina intermediaria o de acción prolongada, además de una enzima degradadora de hialuronano .

TABLA 5 a. Insulina Regular Las insulinas regulares incluyen el polipéptido de insulina nativo de tipo natural. Estas, incluyen- insulina humana,. asi como insulinas de bovino, porcino, y otras especies. Las insulinas humanas regulares se comercializan como HumulinMR R, NovolinMR R y VelosulinMR. La insulina porcina .se comercializa como IIMR. Generalmente, la insulina regular, cuando se administra subcutáneamente sola, , tiene un inicio de acción de 30 minutos. Los niveles de plasma máximos se observan en 1-3 horas y la duración de la .intensidad se incrementa con la dosificación. La vida media del plasma después de la administración subcutánea es de aproximadamente 1.5 horas .. ' / b. Análogos de Acción Rápida (también llamadas insulinas de acción rápida) Los análogos de insulina de acción rápida, que son llamadas frecuentemente insulinas de acción rápida en el campo, son formas modificas de insulina que ¦ contienen típicamente uno o más' cambios de aminoácido. Los análogos se diseñan para reducir la auto-asociación de la molécula de insulina para el propósito de incrementar la velocidad de absorción y el inicio de acción, como es comparado con la insulina regular. Generalmente, estos análogos se formulan ,en presencia de zinc,.' y dé esta manera existen como hexámeros de zinc estables. Debido a la modificación,, sin embargo, tienen una disociación más rápida del estado hexamérico después de la administración subcutánea comparada : con la insulina regular. i. Insulina Lispro la insulina lispro humana es una formulación de polipéptido de. insulina que contiene cambios de aminoácido én la posición 28 y 29 de la- cadena B tal que el Pro-Lys en esta posición en la cadena B de insulina de tipo natural expuesta en SEQ ID NO:. 104 se invierte a Lys-Pro. La secuencia de la insulina lispro se expene en SEQ ID NO: 103 (cadena A) y SEQ ID NO: 148 (cadena B) . Se comercializa bajo el nombre HumalogMR (insulina . lispro, origen de rDNA) . El resultado de la inversión de estos dos aminoácidos es un polipéptido con una propensió disminuida a asociarse, lo cual permite un inicio de acción más rápido. Específicamente, la. inversión de secuencia en la cadena B da por resultado la eliminación de dos interacciones hidrofóbicas y debilitamiento de las dos ligaciones de hidrógeno de hojas beta-plegada que estabiliza el dímero (véase por ejemplo, DeFelippis y colaboradores (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics .. En Diabetes Mellitus de Ellenberg .and Rifkin. (páginas 481-500) McGraw-Hill Professional.) . El polipéptido se auto-asocia y forma héxameros como resultado de los excipientes proporcionados en la formulación, tal. como agentes antimicrobiano's (por ejemplo m-cresol) y zinc para la estabilización . No obstante, debido a la modificación de aminoácidos, la insulina . lispro es de acción más rápida que la insulina regular, ii. Insulina Aspart La . insulina aspart humana es una formulación de polipéptido y de insulina que contiene una sustitución de aminoácido en la posición 28 de la cadena B de la insulina humana expuesta en . SEQ. ID NO: 104 de una prolina a un ácido aspártico. La secuencia de la insulina ' aspart se expone en SEQ ID NO : 103 (cadena A) y SEQ ID NO : 147 (cadena B) . Se comercializa bajo el nombre NovologMR (inyección de. insulina aspart [origen rDÑA] ).. La .modificación, en la insulina aspart confiere un grupo carboxilo de cadena lateral negativamente cargado para crear la repulsión de carga y deséstabilizar la interacción . de monómero-monómero . Además, la remoción de la prolina elimina ..una interacción hidrofóbica clave entre los monómeros . (véase por ejemplo, DeFelippis y colaboradores (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. En Diabetes Mellitus de Ellenberg and Rifkin (páginas 481-500) McGraw-Hill Professional ) ,. El análogo existe en gran medida como un monómero, y es menos propenso a agregarse comparado con otros análogos de acción rápida, tal como lispro. Generalmente, la insulina aspart y la insulina lispro son similares en sus propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas ' respectivas ; iii. Insulina Glulisina La"- insulina .glulisina humana es una formulación de polipéptido de insulina que contiene una sustitución .de aminoácido en la cadena B en la posición B3 de asparagina ,a lisina y en el aminoácido B29 de lisina a ácido glutámico comparado con la ..secuencia de la cadena. B dé ¦ la insulina humana expuesta en SEQ ID NO:- 104. La secuencia de la insulina glulisina' se expone en SEQ ID NO: 103: (cadena A)' y SEQ ID NO: 149 (cadena B) . Se comercializa bajo el nombre ApidraMR (inyección de insulina glulisina [origen de rDNA] ) . Las modificaciones hacen la molécula de: polipéptido menos propensa a la auto-asociación comparada con la" insulina humana. Diferente a otros análogos de insulina, el polipéptido se formula' comercialmente en ausencia del zinc promotor de hexámeros (Becker y colaboradores (2008). Clinical Pharmacokinetics, 47:7-20). Por consiguiente,, la insulina glulisina tiene una velocidad más rápida de inicio que la insulina lispro y la insulina aspart'.

F. CO-FORMULACIONES ESTABLES DE INSULINA Y ENZIMA DEGRADADORA DE HIALURONANO Se . proporcionan en la presente co-formulaciones estables de. insulina, en particular insulinas de acción rápida que incluyen insulina regular y análogos . de insulina de acción rápida (también llamados análogos- de insulina de acción rápida), y enzimas degradadoras de. hialuronano, tal como hialuronidasas solubles (por ejemplo . rHuPH20) . Ejemplares de las formulaciones . proporcionadas en, la. presente son las .co-formulaciones estables de un análogo . de insulina de acción rápida y una PH20 o fragmento C-terminalmente truncada, de la misma que es soluble y activa (por ejemplo rHuPH20) . Las composiciones proporcionadas que contienen, una enzima degradadora de hialuronano y una insulina de acción rápida ,se formulan para, estabilidad en varias . temperaturas o bajo varias condiciones,. Las co-formulaciones'; proporcionadas en la presente son estables en de o aproximadamente de" 0°C a ,40°C. o bajo varias condiciones de estrés (por ejemplo agitación) durante varias horas, días, semanas, meses o años como se describe en la presente. Por consiguiente, las formulaciones son adecuadas para uso de múltiples dosis o son adecuadas para otras condiciones de uso que requieren temperaturas agitación elevadas. Por ejemplo, las. co-formulaciones so adecuadas para formulaciones inyectables de múltiples . dosis (MDI) asi . como formulaciones de infusión subcutánea continuas (GSI) . Las co-formulaciones proporcionadas en la presente se formulan para la administración por vías ' subcutáneas-, intraperitoneales , intradérmicas, intramusculares, por inyección transdérmicas . Las formulaciones ejemplares- se formulan para administración subcutánea.

Las co-formulaciones estables proporcionadas' en la presente son formulaciones de ¦ múltiples dosis. Por consiguiente, todas las formulaciones proporcionadas en la presente contienen una insulina (por ejemplo una insulina de acción · rápida tal. como un análogo, de insulina de acción rápida), una enzima degradadora de hialuronano (por ejemplo una PH20) , un conservador y uno o más de. otros excipientes de estabilización.

Como se describe en la presente y se ejemplifica en los ejemplos, se . descubrió que debido a los requisitos opuestos para la estabilidad de las enzimas degradadoras de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) , y una insulina de acción rápida, las co-formulaciones no' se pueden lograr simplemente la mezcla las formulaciones de las dos. Por ejemplo, las concentraciones correctas de NaCl y pH son críticas a la estabilidad de las co-fo.rmulaciones de insulina y enzima degradadora de hialuronano (por. ejemplo rHuPH20 u otras hialuronidasas solubles y enzimas degradadoras de hialuronano).. La determinación de la concentración de NaCl óptima y el pH. sé cpmplica por el efecto opuesto estos parámetros tienen en la insulina y en la enzima degradadora de. hialuronano ejemplar rHuPH20. La solubilidád de la insulina es máxima en pH más alto y concentración, de NaCl. Estas condiciones., sin embargo, ¦ son perjudiciales , a la rHuPH20, que pierde estabilidad en pH más alto y reduce la concentración de NaCl. · La estabilidad de. la enzima degradadora de . hialuronano ejemplar rHuPH20 se puede incrementar al incrementar las concentraciones de NaCl y reducir el pH. Sin embargo, estas condiciones tiene un efecto negativo de la solubilidad de la insulina y los análogos de insulina., que se precipitan en pH baj.o y concentración de NaCl alta. De esta manera,' entre los objetivos en la presente es la provisión de¦ las concentraciones' de NaCl óptimas y pH para formulaciones estables de insulina y rHuPH20. (u . otras hialuronidasas solubles y enzimas degradadoras de hialuronano) o la provisión de co-formulaciones estables, que no contienen NaCl .o reducen las concentraciones . NaCl .

Como se describe en la presente, se pueden usar las diferentes formulaciones estables para inyección de múltiples fármacos (MDI) o se puede usar para¦ difusión de insulina subcutánea continua (CSII) . Los dos modos de .administración tienen diferentes requisitos para la estabilidad. En particular, las. co-formulaciones para. CSII necesitan se estables bajo condiciones aceleradas (o estrés), , tal como temperaturas elevadas y bajo agitación, mientrás que' las. co-formulaciones para MDI, que se pueden almacenar en temperaturas refrigeradas o ambientales . hasta, el' uso, nó necesitan ser estables a temperatura elevadas y bajo agitación. De esta · manera, como se describe en cualquier lugar en la presente,1 los excipientes o concentraciones de los excipientes que promueven la estabilidad bajo cada una de estas condiciones de almacenamiento no son necesariamente las mismas. Por ejemplo, los excipientes estabilizadores adicionales o concentraciones diferentes de excipientes estabilizadores' son aquellos para mantener la estabilidad en o aproximadamente 32-40 °C o bajo agitación que es requerida para mantener la estabilidad de la enzima degradadora de hialuronano y/o insulina en o a aproximadamente .20-30° C o en o a . aproximadamente 2-8 °C. Estos mismos estabilizadores no pueden ser compatibles con la estabilidad de . las formulaciones en las temperaturas más bajas.

Por ejemplo, se descubrió en la presente que- mientras que la insulina no es- generalmente estable bajo 'altas concentraciones de NaCl y bajas condiciones dé pH' cuando se almacena o se usa a bajas temperaturas menor que 32°C, estas condiciones son conductivas a la solubilidad dé la insulina en temperaturas más altas de 32°C a 40°C durante por lo¦menos 3 días. De esta manera, las condiciones de NaCl alto y pH pueden estar presentes en las co-formulaciones para el uso durante , el CSII, . que es una terapia de : administración que requiere estabilidad a temperaturas- más altas. Se muestra en la presente, que las formulaciones que contienen pH bajo (por ejemplo pH 5.8) y NaCl alto (por ejemplo 200 mM) son estables a temperaturas elevadas y, de esta . manera adecuadas para el CSII durante por lo¦ menos 3 días a 37°C. El pH bajo (por ¦ ejemplo pH 6.8.) el NaCl alto (por ejemplo 200 mM) no son adecuados para estabilidad bajo temperaturas más bajas de almacenamiento, tales como refrigeración a temperaturas ambiente .

También, el .hialuronano estabilizador (HA)' es un estabilizador eficiente y mantiene la estabilidad de la enzima degradadora · de hialuronano a temperaturas elevadas para el uso en CSII sin mostrar ningún efecto perjudicial en la solubilidad.de la insulina. En este caso, mientras que el hialuronano promueve la estabilidad de la enzima degradadora de hialuronano a temperatura elevada, la solución de la insulina se reduce a temperaturas refrigerada.. De esta manera, la presencia de HA en una formulación MDI para almacenamiento, a largo plazo en temperaturas menores pueden impactar la solubilidad.de la insulina.

También se descubrió en la. presente que Lys-Lys es un estabilizador particularmente bueno de una enzima degradadora de hialuronano, en particular a temperaturas elevada mayores que 37°C. Diferente a MgCl2, 'que también es un estabilizador particularmente potente de enzima degradadora de hialuronano a temperaturas elevadas, Lys-Lys se puede fabricar para ser compatible con las insulinas mientras¦ que. mantiene la solubilidad. Por ejemplo, las concentraciones menores de Lys-Lys y la presencia de uno o más de otros estabilizadores retiene la actividad de la enzima degradadora de hialuronano y ' la solubilidad de la insulina bajo condiciones aceleradas tales como temperaturas elevadas. Por lo tanto, tal Lys-Lys contiene co-formuláciones también pueden ser adecuadas para las aplicaciones CSII.

. Aunque los excipientes o concentraciones de excipientes para una formulación MDI o CSII estable no son necesariamente las mismas, las formulaciones MDI proporcionadas en la presente se pueden usar para generar las formulaciones CSII estables. De esta manera, en algunos ejemplos, las co-formuláciones MDI, qué son estables en a. temperaturas refrigeradas y ambientales pero no necesariamente a temperaturas elevadas y bajo estrés., se diluyen un diluyente que tiene un pH más bajo y una concentración de sal más. alta. Esto produce una formulación con. un pH más bajo y una concentración de sal más alta comparada con la formulación MDI, y' que por lo. tanto es estable a temperaturas elevadas y condiciones de estrés (por ejemplo bajo agitación) y son adecuadas para el CSII. Típicamente, tales co-formuláciones de CSII no se almacenan a temperaturas refrigeradas debido a la insolubilidad de la insulina en las composiciones con bajo pH y una concentración de sal alta.' Típicamente, los compuestos se . formulan en composiciones farmacéuticas que usan técnicas y procedimientos bien conocidos en el campo (véase por ejemplo, Ansel Introduction to Pharmaceutícal Dosage Forms , Fourth Edition, 1985, 126.)". Las composiciones farmacéuticamente aceptables se preparan en vista de las aprobaciones por una agencia reguladora u otra agencia preparada de acuerdo con la farmacopea generalmente reconocida para el uso en animales y en . humanos . La formulación debe adaptarse al modo de administración.

Las co-formul.aciones se .pueden proporcionar como una preparación farmacéutica en forma liquida comó soluciones, jarabes o suspensiones-. En forma liquida, las preparaciones farmacéuticas se pueden proporcionar como una preparación concentrada que se diluye a una concentración terapéuticamente efectiva antes del uso. Generalmente, las preparaciones se proporcionan en una forma de. dosificación que no requiere, dilución para el uso. Estas preparaciones liquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como, agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas '·.. comestibles hidrogenadas); agentes emulsif.icantes . {por ejemplo, lecitina o acacia) ;. vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres aceitosos, o aceites vegetales fraccionados) ; y. conservadores (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido . sórbico) . En otro ejemplo, las preparaciones farmacéuticas se pueden presentar en forma liofilizada para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso.

El volumen de las co-formulaciones, proporcionadas en la presente puede ser .cualquier volumen adecuado para el recipiente en el cual se proporciona. En algunos ejemplos., las co-formulaciones se proporcionan en un vial, jeringa, pluma, depósito para una bomba o un sistema de circuito cerrado., o cualquier otro recipiente adecuado.. Por ejemplo', las, co co-formulaciones proporcionadas en la presente son entre o aproximadamente entre 0.1 rtiL a 500 mL, tal como. 0.1 mL a 100 mL, 1 mL a .100 mL, O.l raL a 50 mL, tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente o 0.1 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 10 mL, 15 mL,. 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL o más.

Como se describe en la presente a continuación, en algunos ejemplos,, . las co-formulaciones se preparan como formulaciones concentradas de insulina y. enzimas degradadoras de hialuronano, que se diluyen subsecuentemente con .un diluyen te apropiado para el uso. En tales casos. ;las co-formulaciones ' concentradas se pueden formular específicamente para almacenamiento a largo plazo en, por ejemplo, de o de aproximadamente 2°C a o a aproximadamente. 8°C. En la dilución, la co-fo.rmulación se puede usar directamente para aplicaciones de MDI: Por otra parte, puesto que los requisitos de las formulaciones de•múltiples dosis. usadas en la terapia MDI . o para CSII pueden ser diferentes,, lós componentes del diluyente se pueden elegir para asegurar la estabilidad de la co-formulación diluida para aplicaciones de la co-formulación y a temperaturas elevadas o bajo agitación. Por ejemplo,, como se plantea en lo anterior y posteriormente a continuación, el. diluyente puede contener, por ejemplo, una cantidad o requisito o nivel de componentes o agentes desestabilizantes que es compatible con la estabilidad de la co-formulación a temperaturas elevadas o bajo condiciones de estrés (por ejemplo agitación),. que- son- condiciones características de. la terapia CSII. De. esta manera, cuando la co-formulación . concentrada de insulina y la enzima degradadora de hialuronano se diluye con el .diluyente, la nueva co-formulación diluida es estable en, por ejemplo, a temperaturas, elevadas tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos 32°C a 40°C, tal como aproximadamente o 37°C u otras condiciones de estrés (por ejemplo- agitación), por ejemplo, para el uso en la terapia CSII.

• Se proporciona a . continuación una descripción de los componentes que se proporcionan en las co-formulaciones estables en la presente. El balance particular.de requisitos para maximizar. la estabilidad de ambas proteínas como es contenido, en las co-formulaciones proporcionadas en la presente ahora . hacen la administración con una formulación inyectable de múltiples dosis y con un sistema CSII (por ejemplo administración de bomba cerradas) de la co- formulación lograble. Una descripción de cada ???· de. los componentes o condiciones, tales como excipientes, estabilizadores o pH, se proporciona a continuación. 1. Componentes de Co-Fonnulaciones Estables Se proporcionan en. la presente co-formulaciones estables que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva ,de una enzima degradadora de hialuronano,. tal como una hialuronidasa por ejemplo una¦ PH20 (por ejemplo rHuPH20). Las co-formulaciones también contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una .insulina de acción rápida, tal como análogo de insulina de acción rápida (por ejemplo acción rápida).. En los ejemplos de las co-formulaciones proporcionadas en la presente, las co-formulaciones contienen además NaCl en una concentración de entre o aproximadamente entre 50 mM . a 200 mM, tal como 80-140 . mM, un pH de entre o aproximadamente entre 6.5 a 8.0 por ejemplo, 6.5 a 7.8 o 6.8 a 7.8 tal como entre o aproximadamente entre 6.5 a 7.5 o 7.0 a 7.6, un agente amortiguador que mantiene el intervalo de pH, una cantidacl antimicrdbianamente efectiva de un conservador o mezcla de conservadores, y un agente estabilizante en una cantidad que, durante el curso . del almacenamiento (temperatura y tiempo) , retiene por lo menos 50% de la actividad de la enzima degradadora de hialuronano y retiene por lo menos 90% de la pureza, recuperación y/o potencia de la insulina. Por ejemplo,, las co-formulaciones .proporcionadas en la presente contienen 0.01% a 0.5% . de surfactante como un agente estabilizante.. Las co-formulaciones pueden contener opcionalmente agentes estabilizantes adicionales o un . agente anti-oxidación . En algunos ejemplos en la': presente., las co- formulaciones son estables durante por lo menos 6 meses a una temperatura de o de aproximadamente 2°C a o a aproximadamente 8°C y por lo¦ menos 14 días (es decir 2 semanas) en una temperatura de o aproximadamente 20°.C a o a aproximadamente 30°C. Estas co-formulaciones se pueden usar . para uso de inyección de múltiples dosis (MDI ) .. En otros ejemplos, '. las co-formulaciones proporcionadas en la. presente son estables bajo condiciones . aceleradas tales como temperaturas elevadas mayores que o aproximadamente mayor que 32°C tal como 35°C a 40°C, en particular mayor que o en aproximadamente o 37 °C o 40°C. y/o condiciones de agitación durante por lo menos 3 horas, y generalmente por lo menos 3 dias . Estas co- formulaciones se pueden usar para' métodos de infusión de insulina subcutánea continua (CSII).

También se proporcionan en la presente co^-formulaciones que. no. contienen ÑaCl o contienen una cantidad menor, de NaCl, tal como menor que 140 mM NaCl, y generalmente .0 mM a 100 mM •NaCl, por ejemplo, .0 mM a 50 mM, lO mM.a 40 mM, 2.0 mM a 3.0 mM, tal como por lo menos o aproximadamente al menos o NaCl 30 mM. En estos ejemplos, se descubrieron en la presente que la Lys-Lys se puede incluir en una cantidad para estabilizar la enzima degradadora de hialuronano e insulina, aún en ausencia de NaCl. Opcionalmente, el Na.Cl se puede incluir en estas formulaciones, por ejemplo, como un modificador de tonicidad. Esto se puede requerir, por ejemplo si la concentración de Lys-Lys es 50 mM de Lys-Lys o menos.

De esta manera, en algunos ejemplos de . las có-formulaciones proporcionadas en ¦¦ la. presente,- las co-formulaciones contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano, tal como hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) . Las co-formulaciones .. también contienen una . , cantidad terapéuticamente efectiva de una insulina de acción.' rápida, tal como un análogo de insulina de acción rápida (por ejemplo acción rápida) . En ejemplos de las co-formulaciones proporcionadas en la presente, las co-formulaciones contienen además Lys-Lys en . una concentración de entre .'o aproximadamente entre 50 mM a 120 mM, tal como 50 a 80 mM, 80 mM a 100 mM o .100 ' mM a 120 mM,, un pH de entre o aproximadamente entre 6.5 a 8.0, por ejemplo, 6.5 a 7.8 o 6.8 a .7.8 tal como entre o. aproximadamente entre 6,5 a 7.5 o 7.0 a 7.6, un agente ..amortiguador que mantiene el intervalo de pH, una cantidad: . anti-microbiológicamente efectiva de un conservador o mezclas de conservadores, y un agente estabilizante en una ¦ cantidad que, durante el curso del almacenamiento (temperatura y tiempo), retiene .' por lo , menos 50% de la actividad de la enzima degradadora de hialuronano- y retiene por lo menos 90% de la pureza, recuperación y/o .potencia de la insulina. Por ejemplo, las co^formulaciones proporcionadas en la. presente contienen de 0.0005% a. 1.0% (por ejemplo 0.0005% a 0.005%) de surfactante como un agente estabilizante. Las co-formulaciones pueden contener ¦ opcionalmente .agentes estabilizantes adicionales, modificadores de tonicidad, un agente anti-oxidación y/o otros excipientes. Por ejemplo, las co-formulaciones contienen NaCl como una concentración de menor que 140 mM, tal como entre o aproximadamente entre 0 mM ..a 100 mM, por ejemplo entre o aproximadamente entre 0 mM a 50 mM, 10 mM a .40 mM o 20 mM a 30 mM. En algunos ejemplos en la presente-, las co-formulaciones son estables durante por lo menos 6 meses a una temperatura de o de aproximadamente 2°C a o a aproximadamente 8°C y. por lo menos 14 días (es decir 2 semanas)' a una temperatura de o aproximadamente 2O°C a o a aproximadamente 30°C. Estas co-formulaciones' se pueden usar para uso de inyección de múltiples dosis (MDI). En otros ejemplos, las co-formulaciones proporcionadas en la. presente son estables bajo . condiciones . aceleradas . tales Como temperaturas elevadas mayores que o aproximadamente mayores que 32 °C tal como de 35 °C a 40°C, en particular, mayor que en o aproximadamente o 37°C o 40°C y/o condiciones de .agitación durante por lo menos 3 horas, y generalmente por lo menos 3 días. Estas co-formulaciones se pueden usar para métodos de infusión de insulina subcutánea continua (CSII) . a. Insulina dé acción rápida Las co-formulaciones proporcionadas en la presenté contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una insulina de acción rápida, tal como un análogo de insulina de acción rápida. La insulina puede ser cualquier insulina de acción rápida como se describe en la Sección E. La insulina de acción rápid puede ser insulina regular. En ejemplos particulares, la insulina es una insulina de acción rápida que es un análogo . de . insulina de acción, rápida, por ejemplo, insulina lispro, insulina aspart o insulina glulisina. Pór ejemplo., la cantidad terapéuticamente efectiva puede; ser una cantidad entre o aproximadamente entre 10 Unidades/mL a 1000 U/mL, 100 U/mL a 1000 U/mL, o 500 U/mL a 1000 U/mL, tal como por lo menos o aproximadamente por lo. menos 10 U/mL, 20 U/mL, 30' U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 .U/mL, 70. U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL,. 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, '300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/ml, 500 U/mL o 1000 U/mL. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen una insulina de . acción rápida, tal como un análogo de insulina de acción rápida (por ejemplo insulina lispro, insulina, aspart o insulina glulisina) en una cantidad que es por lo menos . o por lo menos aproximadamente o es o es aproximadamente lOO.U/mL.

En las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente., la estabilidad de la insulina, incluyendo análogos de insulina, en. las 'formulaciones es. una función de la recuperación, pureza y/o actividad de la insulina bajo almacenamiento en varias temperaturas (por ejemplo 2°C-8°C, 20°C-30°C o temperaturas elevadas de , por lo menos o aproximadamente 32 °C a 40°C) y tiempos (por ejemplo horas, días, semanas o meses) o condiciones de uso (por ejemplo agitación) como se describe en la presente. Los ensayos para evaluar estos parámetros se plantean a continuación. Las formulaciones proporcionadas en la presente retienen la recuperación, pureza, y/o actividad de insulina tal 'que. las formulaciones son. adecuadas para uso terapéutico como ¦ se describe en la presente. Por ejemplo,, en la . formulaciones proporcionadas en la presente, la pureza de la insulina (por ejemplo como se evalúa por RP-HPLC u otro método similar) a través del tiempo y bajo almacenamiento o condiciones de uso como se describe en la. presente es por lo menos' 85% de la pureza de la insulina en la formulación antes del almacenamiento o uso,, por ejemplo, .por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más .. Generalmente , para la pureza de la insulina (por ejemplo por RP-HPLC) la especificación aceptable objetivo es por lo menos o aproximadamente 90% de pureza o aproximadamente o mayor que 90% de pureza.' En otros ejemplos, la pureza de insulina se puede evaluar como una función de la agregación de la insulina, por ejemplo, usando cromatografía de exclusión de tamaño no . desnaturalizante o desnaturalizante (SEC) .. En estos ejemplos, en la formulaciones proporcionadas en la presente, a través del tiempo y bajo almacenamiento o condiciones de uso como se describe en la presente, la insulina en la formulación contiene menor que 2% en. péso molecular alto (HMWt) de especie de insulina por área pico, por ejemplo, menor que 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%,: 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1.0% o menor. A través del tiempo (por ejemplo horas, días, semanas o meses) y bajo almacenamiento (por ejemplo en varias temperaturas y tiempo) o condiciones de uso (por ejemplo agitación), como se describe en la presente, la insulina en la formulaciones proporcionadas en la presente retienen mayor . que o aproximadamente 90%, 91%, 92%, .93%-, 94%., 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de su recuperación o actividad. De esta mansera, en una. solución, formulada ¦ con 100 Unidades/mL de insulina, por lo menos . o aproximadamente 90 U/mL, 91 U/mL, 92 U/mL, 93 U/mL, 94 U/mL, 95 U/mL,. 96' U/mL, 97 U/mL, 98 U/mL o 99 U/mL permanece a través del tiempo de horas, días, semanas o meses bajo almacenamiento' o uso en temperaturas de 2°C-8°C, 20°C-30°C o temperaturas elevadas de por lo menos aproximadamente 32°C a 40°C o bajo, condiciones de agitación como se describe en la presente, b. Enzima Degradadora de Hiaiuronano Las co-formulaciónes proporcionadas. en la presente contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hiaiuronano, tal como cualquiera descrita en la Sección C, por ejemplo una hialuronidasa,. tal como una PH20 (por ejemplo rHuPH20). La cantidad de enzima degradadora de hiaiuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo a PH20 (por ejemplo rHuPH20) , en las co-formulaciónes proporcionadas en. la presente es una cantidad que es suficiente para hacer la composición de acción súper rápida. Por . ejemplo,'¦ la cantidad es funcionalmenté equivalente' a por lo menos o aproximadamente por lo menos 30 Unidades/mL. Por ejemplo, las co-formulaciónes proporcionadas en la presente contienen una enzima degradadora de hiaiuronano, tal como una hialuronidasa. por ejemplo a PH20 (por ejemplo rHuPH20) en una cantidad entre d aproximadamente entre 30 Unidades/mL . a 20,000 U/mL, 300 U/mL a 15,000 U/mL, 300 U/mL a 10,000 U/mL, 300 U/mL o para 5,000 U/mL, 300 U/mL a- 3000 U/mL, 300 U/mL a 2000, U/mL, 600 U/mL a 20,000 U/mL, 600 U/mL a' 15,000. U/mL, 600 U/mL a 10 , 000¦ U/mL,. 600 U/mL a 6000. U/mL, 600 U/mL a 4000 U/mL, 600 U/mL.a: 2000 U/mL, 600 U/mL a 1000 U/mL, 60 U/mL a 600 U/mL, o 100 U/mL a 300 U/mL, tal como por lo menos o aproximadamente por lo. menos 30 U/mL, 35 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400. U/mL, .500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/ml, 2000' U/mL, 3000 U/mL, 4000 U/mL, 5000 U/mL, 6000. U/mL, 7000' U/mL,' 8000 U/mL, 9000 U/mL, 10 ,000 U/mL, 12,000 U/mL, 1.5,000 U./mL .o 20,000 U/mL. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen¦ una PH20 (por ejemplo rHüPH20) que está en una cantidad que es por lo menos 100 U/mL a 1000 U/mL, por ejemplo .por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente o 60.0 U/mL.

En las co-formulaciones proporcionadas en la presente la estabilidad de una enzima degradadora de hialuronano, incluyendo una hialuronidasa tal como PH20 ; (por ejemplo rHuPH20) , en las formulaciones es una función de la recuperación y/o actividad de la enzima bajo almacenamiento en varias temperaturas (por ejemplo 2°C-8°C, 20°C-30°C o temperaturas elevadas de por lo menos o aproximadamente 32°C a 40°C) y. tiempos . (por ejemplo horas, días, semanas o meses) o condicione de uso (por ejemplo agitación) como se describe en la presente. Los ensayos para evaluar estos ' parámetros se plantean a continuación. Las formulaciones proporcionadas én la presente retienen recuperación y/o. la actividad de hialuronidasa. tal que las formulaciones son adecuadas para uso terapéutico como se describe en la presente. En las co-formulaciones estables proporcionadas, en la presente, la actividad de la enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa, por ejemplo una PH20, típicamente es mayor que o aproximadamente 50%, tal como mayor que ó' por lo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, . 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de .la actividad de la enzima . de la formulación antes del almacenamiento o uso. Generalmente, para la actividad de la hialuronidasa . la especificación aceptable objetivo para la estabilidad es por lo menos 62% de la actividad inicial de la enzima durante horas, ' días, semanas o meses bajo almacenamiento o uso a temperaturas de 2°C-8°C, 20°C-30°C o temperaturas elevadas de por lo menos o aproximadamente 32°C a 40°C o bajo condiciones de agitación como se describe . en la presente. De- esta manera, por ejemplo, en una solución ..formulada con 600 U/mL de una enzima degradadora de hialuronano., por ejemplo rHuPH20., por lo menos o aproximadamente, por lo menos 360 Unidades/mL, 365 U/mL, 370 U/mL, 375 U/mL, 380 U/mL, 390 U/mL, 420 U/mL, 480 U/mL, 540 U/mL, 546 U/mL, 552 U/mL, 558 U/mL, 564 U/mL,..570 U/mL, 576 U/mL, .582 U/mL, , 588 U/mL, 594 U/mL o más de actividad se retiene, a través del tiempo y bajo; almacenamiento o condiciones de uso. Por ejemplo, en las. co-.formulaciones estables proporcionadas en la presente, a través del tiempo y bajo almacenamiento o condiciones, de uso (por ejemplo agitación), por lo menos 375 U/mL de la actividad dé. la enzima degradadora de hialuronano se retiene. En otros ejemplos, la estabilidad se puede evaluar como una función de la recuperación de la enzima, por ejemplo, usando RP-HPLC. En estos ejemplos, en las formulaciones proporcionadas en- . la presente la recuperación de la enzima de hialuronidasa es de entre o aproximadamente entre 60% a 140%'. Por ejemplo, en las formulaciones proporcionadas en la ' presente la recuperación de la enzima de hialuronidasa es de entre o aproximadamente entre 3-7 yg/mL . c. Conservador Para el uso como una formulación de múltiples dosis, las ¦cc-formulaciones . proporcionadas en la. presente contienen conservadores ( s ) . Como se plantea en lo anterior, los conservadores pueden tener . un efecto prejudicial en la solubilidad de la insulina y la estabilidad y. actividad de las enzimas degradadora de hialuronano, tal como PH20 (por ejemplo rHuPH20) , mientras que al mismo tiempo estabilizan las moléculas de insulina hexaméricas y son necesarios como un agente antimicrobiano en formulaciones de múltiples dosis .

De esta manera, uno. de los objetos en la presente es identificar el tipo y concentración de los conservadores ( s) que se puede usar en las co-formulaciones estables de insulina, incluyendo . análogos de insulina de acción rápida, y enzima degradadora de hialuronano, tales como hialuronidasas solubles (po ejemplo rHuPH20) .

Un. uno o más .conservadores presentes , en la . co-formulación no pueden desestabilizar sustancialménte la enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PE20 (por ejemplo rHuPH20) ,. de modo que pierde su actividad durante las condiciones de almacenamiento (por ejemplo a través del tiempo . y en. temperatura variada) como se describe en la presente. Además, estos ' conservadores deben estar presentes en una concentración suficiente para estabilizar los hexámeros de insulina y ejercer el .efecto antimicrobiano requerido, pero no estar tan concentrados como para disminuir la solubilidad de . la insulina. De manera importante, los conservadores deben estar presentes en ; una concentración suficiente para proporcionar los requisitos antimicrobianos de, por ejemplo, la Farmacopea de los Estrados Unidos (USP) y la Farmacopea Europea (EP) .. La Tabla 22, en el Ejemplo 7E a continuación, expone estos . requisitos , incluyendo los . requisitos 'antimicrobianos . EP mínimos (EPA) y los requisitos antimicrobianos EP preferidos (EPB) .

Típicamente, las formulaciones que cumplen con los requisitos antimicrobianos EP (EPA o EPB) contienen más conservador que aquellos formulados . solo para cumplir con los requisitos antimicrobianos USP.

Por consiguiente, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen conservadores en una cantidad que muestra la actividad anti-microbiana al exterminar o al inhibir la propagación de organismos microbianos en una muestra de la composición como es evaluado en .una prueba de efectividad conservadora antimicrobiana (APET) . Una persona de experiencia en el campo está familiarizada con la prueba de eficacia de conservadora .antimicrobiana y los estándares que se cumplen bajo el USP y EPA o EPB a fin de cumplir con los requisitos mínimos . En general, la prueba de . efectividad de conservadora antimicrobiana implica estimular una composición, por ejemplo, una co-formulación proporcionada en la presente con . inóculos pre-escritos de microorganismos adecuados, es decir, bacteria, levadura y hongos, almacenar la preparación inoculada en una temperatura prescrita, retirar las muestras a intervalos especificados de tiempo y contar los organismos en la muestra (véase, Sutton and Porter, (2002) PDA Journal ¦ of Pharmaceutical Science and Technology 56.(11) ; 300-311; The United . States ; Pharmacopeial Convention, Inc., (effective January 1, 2002), The United States Pharmacopeia 25th Revisión, . Rockville, MD, .Capítulo <51> Antimicrobial Effectiveness Testing; and European Pharmacopoeia, Capítulo 5.1.3, Efficacy of Antimicrobial Preservation) . Los microorganismos usados en el estimulo incluyen generalmente tres · . cepas ··. de; bacterias, particularmente E. . coli. (ATCC No. 8739), Pseudo onas aeruginosa (ATCC No. 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC No. 6538), levadura {Candida albicans ATCC No. 10231) . y hongos (Aspergillus niger ATCC . No. 16404), todos de los cuales se agregan tal que la. composición inoculada contiene 105 o 106 de unidades formadoras de; colonias (cfu) de microorganismos por mi de composición. Las propiedades conservadoras de la composición se consideran adecuadas si, bajo las condiciones de la prueba, existe una falla significativa o ningún incremento, como se especifica en- la Tabla 6, a continuación, en el número de microorganismos en la composición inoculada después de los tiempos ' y en las temperaturas prescritas. Los criterios para la evaluación se proporcionan en términos de reducción logarítmica en el número de microorganismos, viables como es comparado con la muestra inicial o el punto de tiempo previo .

Específicamente, la composición, por ejemplo,' la co-formulación, se reparte en alícuotas en por lo menos -5 recipientes, uno cada uno para cada una de las bacterias u hongos (Escherichía . coli (ATCC No. 8739), ¦ Pseudomonas aeruginosa (ATCC No. 9027), Staphylococcus aureus (ATCC No*. 653.8), Candida . albicáns (ATCC No. 10231). y Aspergíllus niger (ATCC No. 16404 )). Cada recipiente luego se inocula con uno de los organismos de prueba para proporcionar un inoculo de 105 o 106 microorganismos por mL de la composición, con el inoculo que no excede 1% del volumen de la composición. Las composiciones inoculadas se mantienen en una temperatura entre 20 y 25°C durante un período de 28 días, y las muestras se removieron a 6 horas, 24 horas, 7 días, 14 días y 28 días, dependiendo de ¦ los criterios expuestos en la Tabla 6 anterior. El número, de microorganismos viables (cfu) en cada muestra . se determina por el conteo de placas por filtración con membrana. Finalmente, . la cfu para cada muestra se compara a ya sea el inoculo de la muestra previa y la reducción logarítmica se determina.

Bajo los estándares USP, la. velocidad o nivel de la actividad antimicrobiana de los conservadores en- las muestras inoculadas con los organismos microbianos es por lo menos 1.0 logio de unidad de reducción de los organismos bacterianos a 7 días después de la inoculación; por lo menos 3.0 logio de unidad -.de reducción de- los organismos bacterianos a 14 días después de la inoculación; y por lo menos ningún incremento adicional, es decir, no más de 0.5 logio unidad de incremento, en los organismos bacterianos desde el día.14 hasta el día 28 después de la inoculación de la composición con el inoculo microbiano. Para los organismos fúngicos de acuerdo con los estándares USP, la velocidad o nivel, de la actividad antimicrobiana de . los conservadores en las muestras inoculadas con los organismos microbianos es .por lo . menos ningún incremento de la cantidad inicial -después de -7, 14 y 28 días después de la¦ inoculación de la composición con el inoculo microbiano. Bajo los estándares EPB, o EP mínimos, la velocidad o nivel de la actividad antimicrobiana de los conservadores en las muestras inoculadas con los organismos microbianos es por lo menos 1 logio unidad de reducción de organismos bacterianos a 24 horas después' de la inoculación; por lo menos -a. 3 logio unidad de reducción' de organismo bacterianos a 7 días, después de la inoculación; y por lo menos ningún incremento adicional, es decir, no más de 0.5 logio unidad de incremente, en los organismos bacterianos 28 días, después de la inoculación de la composición con el inoculo microbiano. Los estándares ÉPA. requieren por lo menos una reducción de 2 logio unidades. de organismos bacterianos a 6 horas después de la inoculación, con por lo menos una reducción de 3 logio unidades de organismos bacterianos a 24 horas después de la inoculación, y ninguna recuperación de los organismo bacterianos 28 días después de la inoculación. Para los organismos fúngicos de acuerdo con los estándares EPB mínimos, la velocidad o nivel de la actividad antimicrobiana de los conservadores en las muestras inoculadas con los organismos microbianos es por lo .menos 1 logio unidad de reducción de organismos fúngicos en 14' días después de la inoculación y ningún incremento, e'n los organismos fungióos a 28 días después de la inoculación de la composición, y los estándares EPA incrementados requieren una reducción de 2 logio .'unidad a 7 días después de la inoculación y ningún incremento en los organismos fúngicos a 28 días después de la inoculación de la composición.

Los ejemplos no ¦ limitantes de conservadores que se pueden incluir en las co-formulaciones . proporcionadas en la presente incluyen, pero no se limitan a, fenol, meta-cresol (m-cresolj , metilparabeno, alcohol' bencílico, timerosal, cloruro, de benzalconio, 4-cloro-l-buta.riol, diclorohidrato de clorhexidina, digluconato de clorhexidina, L-fenilalanina , EDTA, bronopol (2-bromo-2-nitropropano-l, 3-diol) , acetato fenilmercúrico, glicerol (glicerina.) , imidurea, clorhexidina, dehidroacetató de sodio, orto-cresol (o-cresol) , para-cresol (p-cresol) , clorocresol, . cetrimida, cloruro benzetonio, etilparabeno, propilparabeno o butilparabeno y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en . la presente pueden contener un solo conservador. En otros ejemplos, las co-formulaciones contienen por lo menos dos diferentes conservadores o por lo menos tres diferentes conservadores. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente pueden contener dos conservadores . tales como L-fenilalanina y m-cresol, L-fenilalanina y metilparabeno, L-fenilalanina y fenol, m-cresol y metilparabeno, fenol y metilparabeno, '.m-cresol y fenol u otras combinaciones similares. En uri ejemplo, el conservador en la formulación contiene por lo menos un conservador f.enólico. Por ejemplo, la co-formulación contiene fenol, m-cresol o .fenol' y m-cresol.

En las co-formulaciones proporcionadas en la presente, la cantidad total del uno o más agentes conservadores como un porcentaje (%) de concentración de. masa (p/v) en la formulación puede ser, . por ejemplo, entre - de- o entre aproximadamente de 0.1% a 0.4%, tal como 0.1% á 0.3%, 0.15% á 0.325%, 0.15% a 0.25%, ' 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3%), o 0.3%) a 0.4%) . Generalmente, las co-formulaciones contienen- ! menor que 0.4% (p/v) de conservador. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen por lo menos o aproximadamente por lo menos 0.1%, 0.12%, 0.125%, 0·.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16%, .0.17%, 0.175%, 0.18%, . 0.19%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.325%, 0.35% pero menor que 0.4% de preservador total .

Los conservadores . ejemplares usados .en las cb-formulación estables de insulina y enzima degradadora .de hialurónano, tal. como h'ialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) un fenol y m-cresol. En. algunos ejemplos, el porcentaje (%) de la concentración de masa (p/v) del fenol en la co-formulación és mayor que el porcentaje (%) de. la concentración de masa (p/v) de m-cresol. Esto es debido, por lo menos en parte,, a los efectos más perjudiciales del ' m-cresol en la' estabilidad de la ' enzima degradadora de hialurónano (por ' ejemplo . rHuPH20) en solución, particularmente a temperaturas elevadas, comparado con el fenol (véase por. Ejemplo 7) . De esta . manera, en las c.o-formulaciones proporcionadas en la presente, la relación como un porcentaje de concentración de masa de fenol: meta-cresol es mayor que o es aproximadamente 1:1, 1.1:1, .1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1, 2.1 :.l , 2.2 : 1 , 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1, 3:1 o más." En- algunos ejemplos, las co-formulaciones .' estables proporcionadas en la presente contienen entre b entre aproximadamente 0.1% . a 0.25% de fenol, y entre o aproximadamente entre 0.05% a 0.2%) m-cresol, tal como entre o aproximadamente entre 0.10% a 0.2% de fenol y entre -o aproximadamente entre .0.06% a 0.18% m-cresol o entre o aproximadamente entre 0.1%) a 0.15%). de fenol . y entre o aproximadamente entre 0.08% a 0.15% de m-cresol. Por ejemplo, las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente contienen o contienen aproximadamente 0.1% de fenol y 0.075%) de m-cresol; 0.1%. de fenol y 0.15% de m-cresol; 0.125%) de fenol y 0.075% de ¦ m-cresoi ; 0.13% de . fenol y 0.075% de m-cresol; 0.13% de fenol y 0.08% de m-cresol; 0.15% de fenol y 0.175% de m-cresol; o 0.17% de fenol y 0.13% de m-cresol. d. NaCl Ejemplos de co-formulaciones estables proporcionadas en la presente de insulina y una enzima degradadora de hialuronano, tal . como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) pueden contener NaCl como un agente estabilizante. En las , co-formulaciones proporcionadas en la presente que contienen NaCl como urt agente estabilizante, la co-formulación puede tener una concentración de NaCl de entre o aproximadamente entre 50 mM a 200 mM, tal como entre . o aproximadamente entre 80 mM a 140 mM, 80 mM a 120 mM, 80 mM ' a 100 mM, 100 mM a 140 mM o 120 mM a , 140 mM. Por ejemplo, se proporcionan en la presente co-formulaciones de insulina, y una enzima degradadora de hialuronano que contiene aproximadamente o por lo menos o 50 mM,: 60 mM, 70 mM, 80 mM, 85mM, 90 mM, 95 mM, 100 mM, 105 mM, 110 mM, 115- mM, 120 mM, 125 mM, . 130 mM, 135 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM o 200 mX NaCl .

Además, se descubrió en la presente que mientras que las insulinas no son generalmente suficientemente, solubles en concentración de NaCl alta y condiciones de pH bajas, en las cuales de actividad de una enzima degradadora de hialuronano es óptima, la solubilidad de la insulina se afecta menos por el NaCl bajó condiciones aceleradas de temperatura elevada. De esta mansera, las co-formulaciones que son estables bajo condiciones aceleradas (por ejemplo temperatura elevada o agitación), tales como aquellas usadas para la. terapia CSII, contienen típicamente una concentración de NaCl más alta que las formulaciones .que son estables bajo temperaturas menores que 32 °C.

También se entiende que en las co-formulaciones proporcionadas en la presente, el pH articular en la co- formulación puede ser una función de las concentraciones · de NaCl, y vice versa. Por ejemplo, en las co-formulaciones que contienen un pH de o de aproximadamente 7.2, por ejemplo 7.2 ± 0.2 o más bajo, las co-formulaciones contienen generalmente una concentración de sal de o de aproximadamente entre 100 mM a 140 mM. En la co-formulación que. contiene , un pH o de aproximadamente 7.3, por ejemplo 7.3 ± 0.2 o más alto, las co-formulaciones contienen generalmente una concentración de sal de o de aproximadamente entre 50. a 100. mM NaCl. .

También, como se expone en los Ejemplos en la presente, la insulina y los análogos, de insulina tienen cada uno diferentes, requisitos de solubilidad, que es influenciado por el . nivel de NaCl y pH en la formulación. Generalmente, la insulina y la solubilidad de la insulina favorecen él pH alto y sal baja. Por ejemplo, la insulina regular - forma precipitados dentro de 1 semana a concentraciones altas de NaCl de. mayores que. 80 mM y a pH bajo 7.0. Pero, la insulina regular no forma . precipitados, durante cualquier- tiempo sometido a prueba mayor que 15 meses con concentraciones de NaCl de 80 mM o menos y un pH alto de 7.6. Similarmente , los análogos de insulina Lispro y. Aspart también muestran efectos dependientes de sal y pH en la solubilidad con los precipitados que' se forman ¦ generalmente' en las concentraciones de sal mayores que 80 mM y el pH bajo de 7.2 o 7.0. En contraste, en las concentraciones de sal bajas de 80 mM o menor y en pH alto de 7.4 o 7.6, las insulinas muestran mayor estabilidad y poco o nada de precipitación a través del tiempo. La insulina g'lulisina es la más soluble. De esta, manera, las insulinas menos solubles toleran menos sal comparadas con. las insulinas más solubles. De esta manera,. debido a la solubilidad evidente diferentes insulinas, la concentración de sal. para las¦ formulaciones proporcionadas en. la presente puede depender del¦ tipo de insulina en la formulación, ya que la solubilidad de la insulina se relaciona directamente con la tolerancia para la sal .

Está dentro del nivel de una persona de experiencia en la técnica, en vista de la descripción en la , presente, evaluar empíricamente la ' solubilidad y estabilidad de la insulina y las enzimas degradadoras de hialuronano en la presente como una función de la concentración, de-' NaCl, la insulina particular y los parámetros de^ estabilidad requeridos de la · formulación particular. e . pH Se proporcionan en la presente co-formulaciones estables de insulina y una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo. una PH20 (por ejemplo rHuPH20) que tiene un pH. de entre o de aproximadamente entre 6.5 .a 8.0, por ejemplo,. 6.5 a 7.8 o 6.8 a 7.8 tal como entre o aproximadamente entre .6.5 a 7.5 o 7.0 a 7.6. La' referencia a pH en la presente se basa en la medición de pH a temperatura ambiente. Se entiende que el pH puede cambiar durante almacenamiento a través del tiempo, pero típicamente permanecerá entre o entre aproximadamente pH 6.5 a 8.0,. por ejemplo entre o . · aproximadamente entre 6.8 . a o \.a aproximadamente 7.8. Por ejemplo, el pH puede variar, por ± 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 o más. De. esta manera, se entiende que la referencia a una co-formulación que tiene un pH de aproximadamente o por lo menos pH 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4. o 7.6 incluye cb-formulaciones que tienen un pH de o de aproximadamente o por lo menos 7.0 ± 0.2, 7.1 ± 0 2, 7.2 ± 0.2, 7.3 ± 0.2, 7.4 ± 0.2, 7.5 ± 0.2 o 7.6. ± 0.2 cuando se preparan.

Puesto que tanto, la sal como el pH son parámetros opuestos que influyen en la solubilidad de la insulina y la actividad de una . enzima degradadora . de hialuronano, su inclusión en la co-formulación se balancea por consiguiente. De esta manera,. por. ejemplo, generalmente . en las formulaciones proporcionadas en la presente, mientras es más baja la concentración . de sal, es más alto el pH. En otro ejemplo de las co-formulaciones proporcionadas en la presente, mientras es más alta la concentración de sal, es 263 más bajo el - pH. Está' dentro del nivel de una persona de experiencia en la .técnica someter a prueba los. requisitos . de pH y sal en las co-formulaciones para lograr una estabilidad deseada y retener la actividad de una enzima degradadora de hialuronano y solubilidad de una insulina como -se describe en la presente. Por¦ ejemplo, los requisitos de pH y sal óptimos se pueden obtener por técnicas de formulación conocidas por aquellas personas expertos' en el campo y ejemplificadas en la presente. Por e emplo, las concentraciones, de pH y sal óptimas- se pueden determinar al evaluar la. actividad o recuperación, de una enzima degradadora de hialuronano y solubilidad, y agregación o recuperación de una insulina bajo diferentes condiciones de pH o sal usando varios ' métodos conocidos por una persona de experiencia en el campo, por ejemplo, como se describe en la Sección H.2.

Por ejemplo, como se plantea en cualquier lugar en la presente, se descubrió en la presente que mientras que las insulinas generalmente no son suficientemente solubles en concentración de. sal alta y condiciones de pH bajo, en las cuales la actividad de la enzima degradadora de hialuronano es óptima, la solubilidad de la insulina se afecta menos por las condiciones dé pK-bajo, baje condiciones aceleradas de temperatura elevada. De esta manera, las. co-formulaciones que son estables bajo condiciones . aceleradas ¦ (por ejemplo temperatura o agitación elevada), tales- como aquellas usadas para la terapia de CSII, contienen típicamente pH más bajo que las formulaciones que son estables bajo temperaturas menores que 32°C.

Si es necesario, el pH se puede ajusfar usando a gentes acidificantes para reducir el pH o agentes alcalinizantes para incrementar el pH . Los agentes acidificantes ejemplares incluyen, pero no se. limitan a, ácido acético, ácido cítrico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, . solución de. fosfato de sodio. monobásica, ¦ y ácido fosfórico. Los agentes alcanilizantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, solución de fosfato de sodio dibásico, carbonato, de sodio, o hidróxido de sodio. f . Soluciones Amortiguadoras Cualquier solución amortiguadora se puede usar en las co-formulaciones proporcionadas en la presente siempre .y cuando no afectan adversamente la estabilidad dé la co-formulación, y soporte el requisito de intervalo de pH requerido. Ejemplos. de soluciones amortiguadoras particularmente adecuadas incluyen Tris, succinato, acetato, soluciones amortiguadoras de fosfato, citrato, aconitato, malato y carbonato. Aquellas personas de. experiencia en el campo, ¦ . sin embargo, reconocerán que las formulaciones proporcionadas en ' la presente no se limitan a . una solución amortiguadora particular, siempre y cuando la solución amortiguadora proporcione un grado aceptable de estabilidad de pH, o "capacidad amortiguadora" en el intervalo indicado.. Generalmente, una : solución amortiguadora tiene una capacidad amortiguadora adecuada dentro de aproximadamente 1 unidad de pH . de su pK (Lachman: y- colaboradores 1986) . La idoneidad amortiguadora se puede valuar con base en las tabulaciones de pK publicadas o se pueden determinar empíricamente por métodos bien conocidos en el' campo. El pH de la solución se puede ajustar al punto final deseado dentro del intervalo como se describe en lo anterior, por ejemplo, usando cualquier ácido o base aceptable. · . · Las soluciones amortiguadoras que se pueden incluir en las co'-formulacione.s proporcionadas en la presente incluyen, pero no se limitan a, Tris (Trometamina) , histidin , soluciones amortiguadoras de fosfato, tal como fosfato de sodio dibásico, y soluciones amortiguadoras de- citrato. Generalmente, el agente amortiguador está presente en una cantidad en la presente para mantener el intervalo de pH de la co-formulación entre o aproximadamente entre 6.5 a 8.0, por ejemplo entre o aproximadamente entre 6.8 a 7.8 tal como entre o aproximadamente entre 7.0 a- 7.6. Estos agentes amortiguadores pueden estar presentes en las co-formuláciones en concéntratenos entre, o aproximadamente entre 1 mM a 100 mM, tal como 10 mM a '50 mM o 20 mM a 40 mM, tal como en o aproximadamente . 30 mM. Por ejemplo, estos.. agentes amortiguadores pueden estar presentes en las co-formulacion.es en una concentración de o aproximadamente o por lo menos 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM,..l 1 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, .16 mM, 17 mM,- .18 mM', 19. mM, 20 mM,' 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, o más.

Ejemplares de las soluciones amortiguadoras en las co- formulaciones en .' la presente son las soluciones amortiguadoras de ligación no de metal tal como Tris, que reducen la precipitación de la insulina comparadas con las soluciones amortiguadoras de ligación a metal, tal como soluciones amortiguadoras de fosfato. La inclusión de Tris como una solución amortiguadora ¦ en las co."-formulaciort.es proporcionadas en- la presente tiene beneficios adicionale.s . Por ejemplo, el pH de una solución que se amortigua con Tris es afectado por la temperatura en la cual la solución se mantiene. De esta manera, cuando las co-formulaciones de insulina y enzima degradadora de hialuronano se preparan a temperatura ambiente a pH 7.3, en refrigeración, el. pH se ¦incrementa a aproximadamente pH 7.6. Este pH promueve la solubilidad dé la insulina en . una temperatura donde la insulina es de. otra manera probable que sea insoluble. A la' inversa, en temperaturas incrementadas, el pH de la formulación disminuye aproximadamente pH 7.1, lo cual promueve la estabilidad de la . enzima degradadora de hialuronano en una temperatura en la cual la enzima de otra manera es probable que sea inestable.. De esta manera, la solubilidad y estabilidad de insulina. y una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuron.idasa por ejemplo PH20 (por ejemplo rHuPH20) se maximiza cuando las có-formulaciones contienen Tris como una solución amortiguadora comparada con las otras soluciones amortiguadoras. Además, debido a que el Tris es un ión positivo, la adición de NaGl en la solución como un contraión no. se requiere. Esto también es benéfico a la estabilidad global 'de., la co-formulación debido a que el NaCl. en altas concentraciones es perjudicial a la solubilidad de la insulina.

Por ejemplo, el Tris incluye en las co-formulaciones proporcionadas en . la presente en . una concentración de o aproximadamente 10. mM a 50 mM, tal como, por ejemplo, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM o 50 mM.. En ejemplos particulares, las co-formulaciones contienen o contienen aproximadamente 20 mM a 30 mM Tris, tal como '21 mM, 22 mM, 23 mM, 24. mM, 25 mM, 26 mM,- 27 mM,. 28 mM, 29 mM o 30 mM Tris. En' ejemplos, particulares, las co-formulaciones proporcionadas . en la presente contienen Tris en una concentración de o aproximadamente 30 mM. g. Lys-Lys En ejemplos en la presente, las co-formulaciones contienen un catión divalente, y en particular lisil-^lisina (dilisina; Lys-Lys), o sal, derivado, análogo o imitación de la misma, suficiente para' estabilizar la . enzima dégradadora de hialuronano en. la co-formulación . Por ejemplo, el catión divalente Lys-Lys muestra menos efectos en la solubilidad de la ..insulina que MgCl2. La Lys-Lys se proporcion : en una cantidad que, cuándo 'se combina con los conservadores, y otros estabilizantes en el pH apropiado, como se plantea en lo anterior, da por resultado una co-formulación estable tal que la actividad dégradadora de hialuronano se retiene y los efectos en la solubilidad de la insulina se minimizan como se describe, en la presente en lo anterior.

Por ejemplo, Lys-Lys se puede incluir en las co-formulaciones proporcionadas en la presente en una cantidad entre o aproximadamente entre 50 mM a 120 mM, tal como entre o aproximadamente entre 50 a 80 mM, 80 a 100 mM o 100 a. 120 mM. Por ejemplo, Lys'-Lys se puede incluir en las co-formulaciones proporcionadas en la presente en . una cantidad que es por lo menos o por lo menos aproximadamente o es 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80' mM, 90 mM, 100 mM, 1 10 mM o 120 mM.

Típicamente, mientras es más alta la concentración de Lys-Lys es mejor la estabilidad de la co-formulación que contiene una PH20. e insulina o análogos de insulina. La cantidad particular de L.ys-Lys n la formulación, sin embargo, puede ser una función de la insulina particular. Por ejemplo, para lograr la estabilidad similar en una co-formulación , el análogo de insulina glulisina requiere que menos cantidad de Lys-Lys .(por ejemplo 50 a 105 mM) , seguido por los análogos . de insulina aspart y lispro (por ejemplo 80 a 100 mM) , con la insulina regular que requiere la cantidad más alta (por ejemplo 100 a 120 mM) . Está dentro del nivel de una persona experta en el campo, en vista de la descripción en la presente, evaluar empíricamente la solubilidad y estabilidad de la insulina y las enzimas degradadoras de hialuronano en la presente como una función de la concentración de . Lys-Lys, la insulina particular y los parámetros de estabilidad requeridos de la formulación particular.

En un ejemplo, las co-formulaciones que contienen insulina regular contienen generalmente 100 a 120 mM Lys-Lys, tal como por. lo menos o aproximadamente por lo menos o 100 mM, 105 mM, 110 mM., 115. mM o 120 mM. En otro ejemplo, las co-formulaciones que contienen la insulina aspart o insulina lispro contienen de 80 a 120 mM de Lys-Lys, tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos o 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM o 100 mM. En un ejemplo adicional, las co-formulaciones que contienen a insulina glulisina contienen 50 a 105 mM Ly.s-Lys, tal como por. lo. menos o aproximadamente por lo menos o 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75. mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM, 100 mM o 105. mM.

Típicamente, en los ejemplos en la presente donde .las co-formulaciones contienen Lys-Lys, la', adición de NaCl como un estabilizador no se requiere para mantener la estabilidad de los componentes. En algunos casos, los modificadores de tonicidad son requeridos por razones de tonicidad. Pór ejemplo, la cantidad de Lys-Lys en la co-formulación es menor que 50 mM/mL, se puede requerir un modificador de tonicidad. Está dentro del nivel de una persona experta, en el campo determinar si un modificador de tonicidad se debe incluir en la co-formulación . Como se plantea a continuación,. los modificadores de tonicidad ejemplares incluyen, pero no. se limitan a, glicerina, NaCl, aminoácidos, polialc.oholes, trehalosá, y otras sales y/o azúcares, . , Por consiguiente, en algunos ejemplos, las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente que contienen Lys-Lys también opcionalmente pueden contener NaCl. En estos ejemplos, el NaCl es generalmente menor que 140 mM, y típicamente menor que 100 mM, 90. mM, 80 mM, 70 mM, 50 mM, ..40 mM, .30 mM, 20 mM, 10 mM o menos. La cantidad particular de modificado de tonicidad se puede determinar empíricamente, a fin de retener la actividad y/o tonicidad de la enzima. h. Excipientes o Estabilizadores Ejemplares Adicionales Las co-formulaciones proporcionadas' en . la presente pueden opcionalmente contener otros componentes que, cuando se combinan con los conservadores, sal y estabilizadores en el pH apropiado, como se plantea en lo anterior, dan por resultado una co-formulación estable. Otros componentes incluyen por ejemplo, uno o más modificadores de tonicidad, uno o más agentes anti-oxidación, zinc u otro estabilizador..

Por ejemplo, la estabilidad de' la enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo- una PH20 (por ejemplo rHuPH20) se reduce en gran medida donde la co-formulaciones contienen NaCl bajo, pH alto, la, presencia de conservadores y no se almacena a temperatura elevadas (por ¦ejemplo 20°C a 30°C o más altas).. Similarmente, la estabilidad.de la insulina también se puede afectar por estos y otros parámetros. Esta inestabilidad se puede encontrar a algún grado por las . adiciones de uno d. más estabilizadores. Generalmente, las formulaciones proporcionadas en. la presente contienen un estabilizador o estabilizadores en una cantidad que, durante el curso de almacenamiento (temperatura . y tiempo), por lo menos 50% de la actividad . inicial (por ejemplo 375 U/mL) de la actividad de la enzima degradadora . de es retenida. Incluidos entre los .tipos de estabilizadores que se pueden contener ' en las formulaciones proporcionadas en la presente son . los · aminoácidos, derivados de aminoácido, aminas, azúcares, polioles, sales y soluciones amortiguadoras, su.rfactantes , y otros agentes. Las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen por lo meso un estabilizador. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más estabilizadores. Por consiguiente, cualquiera o más de aminoácidos, derivados de aminoácido, aminas, azúcares, polioles,. sales y soluciones amortiguadoras, surfactantes , y otros agentes . se .pueden incluir en las co-formulaciones en la presente. Generalmente, las co-formulaciones en la presente contienen por lo menos un surfactante y ¦ una solución amortiguadora' apropiada. Opcionalmente, · las co-formulaciones proporcionadas en la presente pueden contener otros estabilizadores adicionales.

Los estabilizadores de aminoácido ejemplares, derivados de aminoácido o aminas incluyen, pero, no se limitan a, L-Arginina, Glutamina, glicina, Lisina, Metionina, Prolina', Lys-Lys, Gly-Gly, Óxido de Trimetilamina (TMAO) o betaina. Ejemplares de azúcares y polioles incluyen, pero no se limitan a glicerol, . sorbitol, manitol, inositol, sacarosa o trehalosa. Ejemplares de sales y soluciones amortiguadoras incluyen, pero no. se limitan a, cloruro de magnesio, sulfato de sodio, Tris tal como Tris (100 mM) , o benzoato de sodio. Surfactantes ejemplares incluyen,. . pero no se limitan a, poloxámero 188. (por ejemplo PluronicMR F68), polisorbato 80 (PS80) , polisorbato. 20 (PS20) . Otros conservadores incluyen, pero no se limitan a, ácido hialurónico (HA), albúmina de suero humana (H3A) , . ácido fenil-butirico, ácido taurocólico, polivinilpirrolidona (PVP) o zinc, i. Surfactante En algunos ejemplos, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen uno o más surfactantes. Estos surfactantes inhiben la agregación de la ' enzima degradadora dé hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20)' y minimizan la pérdida absorbente. Los surfactantes son generalmente surfactantes no iónicos. Los Surfactantes que se pueden incluir .en ¦' las co-formulaciones en la- presente incluyen, pero no se limitan a, ésteres parciales y de ácido graso y éteres de alcoholes polihidricos tal .como glicerol, o sorbitol, poloxámeros y polisorbatos . Por ejemplo, los surfactantes ejemplares en las co-formulaciones en la presente incluyen cualquiera de uno o más del poloxámero 188 (PLÜRONICSMR tal como PLURONICMR F68) , TETRONICSMR, polisorbato 20, polisorbato 80, , PEG, 400, PEG 3000, TweenMR (por ejemplo TweenMR 20 o TweenMR, 80), TritonMR X- 100, SPANMR, MYRJMR, BRIJMR, CREMOPHORMR, polipropilengliGoles.; o polietilenglicoles . En algunos ejemplos, las có-formulaciones en la presente contienen poloxámero. 188, polisorbato ' 20, polisorbato 80, generalmente poloxámero 188 (pluronic F68.):. Las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen generalmente por lo menos un surfactante, tal como 1, 2 o 3 surfactantes .

En . las co-formulaciones proporcionadas en. la presente, la cantidad total del uno o más. surfactantes como un porcentaje (%) de concentración de , masa (p/v) en la formulación puede ser, por ejemplo, entre de o entre aproximadamente de 0,'.0005% a 1.0%, tal como entre de o entre aproximadamente' de .0.0005% a 0.005%, 0.001% a 0.01%, ' 0.01% a 0.5%, tal como. 0.01% a 0.1% o 0.01%¦ a ; 0.02% . Generalmente., las co-formulaciones contienen por lo menos 0.0005%, 0.005%, 0.05% o 0.01% de surfactante . y contienen menor que 1.0%, tal como menor que 0.5% o menor que 0.1%. de surfactante. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente pueden contener en o aproximadamente : 0.0005%, . 0.0001%, 0.005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015% , 0.02 % , 0..025% , · .0.03% , 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08%, o 0.09%.. . En ejemplos particulares, .las co-formulaciones proporcionadas en la presente, contienen o contienen aproximadamente 0.01% a o a aproximadamente 0.05% de surfactante.

Como se muestra en los Ejemplos en la presente, la estabilidad y actividad enzimática de una enzima degradadora de hialuronano - (por. ejemplo rHuPH20) no se afecta generalmente entre diferentes surfactantes o concentraciones de surfactante. No obstante, se descubrió en la presente que la oxidación de la enzima se incrementa con los niveles de incremento del surfactante. También, el surfactante poloxámero 188 provoca menos oxidación que los polisorbatos.. Por. consiguiente, las co-formulaciones en.-, la presente contienen generalmente poloxámero 188. De esta manera, aunque los surfactantes son estables para estabilizar una enzima degradadora de hialuronano, la inclusión , de surfactantes en las co-formulaciones proporcionadas en . la presente pueden dar por resultado la; oxidación de la enzima degradadora de hialuronano en altas concentraciones. De esta manera, las concentraciones generalmente menores de surfactantes se usan en las co-formulaciones en la presente, por ejemplo, como un porcentaje .(%) de concentración de masa (p/v) de menor que 1.0% y generalmente entre- o aproximadamente entre 0.0005% a 0.1%, tal como entre o aproximadamente entre 0.01% o 0.05%. También, como se proporciona en la presente a continuación, opcionalmente un agente anti-oxidación se puede incluir en la formulación . para reducir o prevenir la oxidación .

Las. co-formulaciones e emplares proporcionadas en la presente contienen poloxámero 188. El poloxámero 188 tiene una concentración de. micelas critica más alta (eme) . De esta manera, el uso del poloxámero 188 puede reducir la formación de micelas en la formulación, que a. su vez puede reducir la efectividad de los conservadores. De esta manera, entre las co-formulaciones proporcionadas en la presente, son aquellas que contienen o contienen aproximadamente 0.01% o 0.0'5% poloxámero 188.

En otros ejemplos, las co-formulaciones ejemplares proporcionadas en la presente contienen polisorbato 20. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen 0.0005%· a. 0.1%, tal como 0.000.5% a 0.01%, tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos o .0.001% polisorbato 20. ii. Modificador de- Tonicidad Por ejemplo,, los modificadores de tonicidad se pueden incluir en la formulación proporcionada en la presente para producir una solución con la osmolaridad deseada. Las co-formulaciones proporcionadas en la presente tienen, una osmolaridad de entre o aproximadamente entre 245 mOsm/kg a 305 mOsm/kg. Por ejemplo, la osmolaridad es o es aproximadamente .2.45. mOsm/kg, 250 mOsm/kg, 255 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 265 mOsm/kg, 270 mOsm/kg, 275 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 285 mOsm/kg, 2.90 mOsm/kg, 295 mOsm/kg, 300 mOsm/kg o 305 mOsm/kg. En . algunos, ejemplos, las co-formulaciones de una insulina y una enzima degradadora de hialuronano, ' tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) tiene una osmolaridad de o de aproximadamente 275 mOsm/kg.

Los modificadores de tonicidad incluyen, pero no se limitan a, glicerina, NaCl,. aminoácidos, polialcoholes , trehalosa, y otras sales y/o azúcares. Por ejemplo, NaCl se puede incluir en las co-formulaciones proporcionadas . en la presente en una concentración de entre o aproximadamente entre 0 mM a 20.0 mM, tal como, generalmente de 30 mM a 100 mM, 50 mM a 160 mM, por .ejemplo 50 mM a 120. mM o 80 mM a 140 mM, o 50 mM a 200 mM. Típicamente, cuando se usa como un modificador de tonicidad, por ejemplo, en las co-formulaciones que contienen Lys-Lys, el NaCl . se. proporciona en una concentración de menor que 140 mM, y generalmente menor que 130 mM, 120 mM, 1 10. mM, 100 mM, 90 mM, 80 mM, .70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20 mM, 10 m o menos.. La cantidad particular se puede determinar empíricamente a fin de retener la actividad enzimática, solubilidad y/o tonicidad de la insulina. iii . Glicerina En otros casos, la glicerina (glicerol) se. incluye en las co-formulaciones . Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen típicamente menor que 60 mM de glicerina, . tal como menor que 55 mM,. menor que 50 mM, menor que 45 mM, menor que 40 mM, menor que '35 mM, menor que 30 mM, menor, que 25 mM, menor que 20 mM, menor- que 15 mM, 10 mM o. menos. La cantidad de glicerina depende típicamente en la cantidad de NaCl. presente: mientras más NaCl está presente en la co-formulación , se requiere menos glicerina para lograr la osmolaridad deseada. De esta manera, por ejemplo, en las co-formulaciones que contienen', mayores concentraciones de NaCl, tal como aquellas formuladas con insulinas con mayor solubilidad evidente . (por ejemplo insulina glulisina) , poco o nada de glicerina se necesita incluir en la formulación. En contraste, en las co-formulaciones que contienen concentraciones . de NaCl ligeramente menores, tales como aquellas formuladas, con insulinas con solubilidad evidente más baja, (por ejemplo insulina aspart), la glicerina se puede incluir. Por ejemplo, las. co-formulaciones proporcionadas en la presente que contienen insulina aspart contienen, glicerina en . una concentración menor que 50 mM, tal como 20 mM. a 50 mM, por ejemplo en o aproximadamente 50 mM. En las co-formulaciones que contienen una . concentración de NaCl más baja uniforme, tales como aquellas formuladas con las insulinas con la solubilidad evidente más baja (por ejemplo insulina lispro.o insulina regular), la glicerina se incluye en una concentración de o de' aproximadamente, por ejemplo., 40 m a 60 mil iv Antioxidantes Las có-formulaciones proporcionadas en / la . presente también' contienen · antioxidantes para reducir o. prevenir la oxidación, en particular oxidación de la . enzima degradadora de hialuronano. Por ejemplo, los ejemplos en la presente muestran que la oxidación se puede . efectuar . por altas concentraciones de , surfactante u aligómeros de hialuronano. Los antioxidantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, 'cisterna, triptofano y metionina. En ejemplos particulares, el anti-oxidante es metionina. Las co-formulaciones proporcionadas en la presente que contienen una insulina .y una enzima degradadora de hialuronano, tal como ' una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) puede incluir un¦ antioxidante en una concentración' de entre o de aproximadamente, entre 5 mM a o a aproximadamente 50 mM, tal como 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mM . · 20 mM. Por ejemplo., la metionina. se puede proporcionar en las co-formulaciones en la presente en una concentración de; entre o de aproximadamente entre 5 mM a o a aproximadamente 50 mM, tal como 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM ó 10 mM a 20 mM. Por ejemplo, un antioxidante, pór ejemplo metionina, se puede incluir en una concentración que. es o es aproximadamente 5 mM, 10 mM, 11 mM, . 12. mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23: mM, 24 .mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45. mM o 50 mM. En algunos ejemplos, las co-formulaciones ·. contienen 10 mM a 20 mM de metionina, tal como o aproximadamente .10 mM o 20 mM metionina . v. Zinc En algunos casos, el zinc se incluye en las co-formulaciones como ¦ un estabilizador para los hexámeros de insulina. Por ejemplo, las formulaciones que · contienen insulina regular, insulina lispro o insulina aspart contienen típicamente zinc, mientras que las formulaciones que contienen insulina glulisina no contienen zinc. El zinc se puede proporcionar,, por ejemplo, como óxido de zinc, acetato de zinc o cloruro de zinc. El zinc puede estar presente e una composición proporciona en la ' presente en, entre o aproximadamente entre 0.001 a 0.1. mg por 100 unidades de insulina (mg/100- U), 0,001 a 0.05.'mg por 100U o 0.01 a 05 mg por 100 U. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente pueden contener zinc en. o aproximadamente 0.002 miligramos por 100 unidades de insulina (mg/100 U) , 0-.005 mg/10.0 U, 0.01 mg/100 U, 0.012. mg/100 U, - 0.014 mg/100 U, 0.016 mg/100 U, 0,017 mg/100 U, 0.018 mg/100 U, . 0.02 mg/100 U, 0.022 mg/100 U, 0.024 mg/100 U, 0.026 mg/100 U, 0.02.8 mg/100 U, 0.03 mg/??? U, 0.04 mg/100 U, 0.05 mg/100 U, 0.06 mg/100 U, 0.07.mg/100 U, 0.08 mg/100 ü o 0.1 mg/100 ?.· vi. Estabilizador de Aminoácido La co-formuláción proporcionada en la presente también contiene un estabilizador de aminoácido, que contribuye a la estabilidad de la preparación. El estabilizador puede se aminoácidos no polares, y básicos. Los aminoácidos no polares y básicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, alánina, histidina, arginina, lisina, ornitina, isoleucina, valina, metionina, glicina y prolina. Por ejemplo, el .estabilizador de aminoácido es glicina ' o prolina, típicamente glicina. El estabilizador puede ser un solo aminoácido o . puede ser una combinación de 2 o más de estos aminoácidos. Los estabilizadores . de . aminoácido pueden ser' aminoácidos naturales, análogos, de aminoácido, aminoácidos modificados o equivalentes de aminoácido. Generalmente, el aminoácido es . un L-aminoácido.. Por ejemplo, cuando la prolina se usa como el estabilizador, es .generalmente L-prolina. También es' posible usar equivalentes ·' de aminoácido, por ejemplo, análogos de prolina. La concentración del estabilizador de aminoácido, por ejemplo glicina, incluida en la co-formuláción¦ aría de 0.1 M a 1 M aminoácido, típicamente 0.1 M a 0.75 M, generalmente 0.2 M a 0.5 M, por ejemplo, por lo menos en o aproximadamente 0.1. M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3- M, 0.35 M, 0.4 M, 0.45 M, 0.5 M, 0.6 M, .0.7 M, 0.75 M o más. Él aminoácido, por ejemplo glicina, se puede, usar en una forma de una sal farmacéuticamente aceptable, tal como clorhidrato bromhidrato, sulfato, acetato, etc. La pureza del aminoácido, por ejemplo glicina, debe ser por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 99.5% o más. vil. Inhibidor de Hialuronidasa En algunos ejemplos de las co-formulacionés proporcionadas en la presente, la estabilidad de una enzima degradadora de hialuronano- y una insulina de acción rápida en una temperatura de o aproximadamente 20 °C a o a aproximadamente 30°C durante por lo menos 14 días (es decir 2 semanas) como se describe en la presente, en lo anterior se puede incrementar ¦ al incluir un inhibidor de hialuronidasa. Este inhibidor no es generalmente . adecuado para . las generaciones almacenadas a 2° C a 8° C, puesto, como se observa con el hialuronano (HA) en la presente, puede provocar que la insulina se agregue en temperaturas más bajas. En algunos ejemplos, se puede elegir un inhibidor de hialuronidasa que sea adecuado para el uso de 2° C a 8°· C.

En particular, . los inhibidores de hialuronidasa se incluyen en una co-f.ormulación para estabilizar la enzima degradadora de hialuronano a los efectos de los conservadores fenólicos. En ejemplos particulares, el inhibidor de hialuronidasa es uno que reacciona con la insulina o la enzima, degrádadora de hialuronano en una manera . asociada y no covalente,' y no .forma complejos covalentes con la insulina o una enzima degrádadora .de hialuronano. El inhibidor de hialuronidasa se proporciona por lo. menos en su concentración de equilibrio. Una persona de experiencia en el campo está familiarizado con varias clases ; de inhibidores de hialuronidasa (véase por ejemplo Girish y colaboradores (2009) Current Medicinal Chemistry, . 16:2261-2288, y referencias citadas en las presentes) . Una persona de experiencia en . el . campo . conoce o puede determinar por métodos estándares en el campo la concentración de equilibrio, de un inhibidor de hialuronidasa en una composición de reacción no estable en la presente.. La elección del inhibidor de hialuronidasa dependerá en la . enzima degrádadora . de hialuronano particular 'usada en la composición. Por ejemplo, el hialuronano es un inhibidor. de hialuronidasa ejemplar para el uso en las composiciones estables en la presente cuando la enzima degrádadora de hialuronano es una PH20.

Los inhibidores de hialuronidasa ejemplares para el uso como agentes estabilizantes en la presente incluyen, pero no se limitan a, una proteína, glicosaminoglicano (GAG.) , polisacáridos, ácido graso, lanostanoides , antibióticos, anti-nematodos, compuestos orgánicos sintéticos o un componente bioactivo derivado de plantas. Por ejemplo, un componente bioactivo derivado de plantas de hialuronidasa puede ser un alcaloide, antioxidante, polifenol,. fla.vonoides , terpenoides y fármacos anti-inflamatorios . Los inhibidores de hialuronidasa ejemplares incluyen, por ejemplo, inhibidor de hialuronidasa en suero, glicoproteína de Withania ' (WSG) , heparina, sulfato. de heparina, sulfato de dermatán, quitosanes, ß- ( 1 , 4) -galacto-oligosacáridos , verbascos sulfatada, planteosa sulfatada, pectina, poli (estireno-4-sulfonato) , sulfato ' de dextrano, alginato de sodio, polisacárido de Undaria pinnatifida, polímero de condensación de ácido mandélico, ácidos sicosatrienoico, ácido nervónico, ácido oleanólico, ácido aristoloquico, ajmalina, reserpina, flavona, desmetoxicentauredina, qüercetina, apigenina, kaempferol, silibina, luteolina, luteolin-7-glucosidp, floretina, apinina, hesperidina, hesperidina sulfonada, calicosin-7-0- -D-glucopiranosido, flavona-7-sulfato ¦ de sodio, flavona 7-fluoro-41 -hidroxiflavona, .A ' -cloro- , 6-dimetoxicalcona, 5-hidroxiflavona . :¦ 7-sulfato de 'sodio, miricetina, rutina, morina, glicirricina, vitamina C, ácido D-isoascorbico, 1,4-lactona D-sacarina, ácido L-ascórbico -6-hexadecanoato (Vcpal), vitamina C 6-O-acilada, catequina, ácido nordihidrogúaiaretico, curcumina, gálato de N-propilo, ácido tánico, ácido elagico, ácido gálico, florofucofuroecol A, diecol, 8 , 81 -biecól, procianidina, . gosipol, celecoxib, nimesulida, dexametasona, indometrina, fenoprofen, fenilbutazona, oxifenbutazona, salicilatos, cromogilicato de disodio, aurotiomalato de sodio, transilist, traxanox', ivermictina, linocomicina y espectinomicina, sulfámetoxazol y trimertoprima, sulfato de neomicina, ácido 3a-acetilpoliporenico A, ácido (25S) - (+) -12a-hidroxi-3a-metilcarboxiacetato-24-metilanosta-8 , 24 (31) -dieno-26-oico, lanosta.noide,¦ ácido poiiporénico C, PS53 (ácido hidroquinona-sulfónico-polímero formaldehido) , polímero de poli (estireno-4-sulfonato) , VERSA-TL 502, acido 1-tetradecano sulfónico, polímero de condensación de ácido mandélico (SAMMA) , 1,3-diacetilbenzimidazol-2-tiona, bencimidazol 2-tiona N-monoacilada, bencimidazol-2tiona, N, N ' -diacilada bencimidazol-2-tiona, derivado de alquil-2-fenilindol , 3-propanoilbenzoxazol-2-tiona, derivado de indoí N-alquilado, derivado de indol N-acilado, derivado de benzotiazol, derivado de indol-2- y 3-carboxamida N-sustituido,. análogos halogenados . (cloro y fluoro) de derivado de indol-2- y 3-carboxamida N-sustituido, 2- (4-hidroxifenil) -3-fenilindol , indol carboxamidas , indol acetamidas, 3-benzolil-l-metil-4-fenil-4-piperidinol,¦ derivado de benzoato de benzoil fenilo, derivado de 1-arginina, guanidinio¦ HCL, L-NAME, HCN, linamarina, amigdalina, hederagenina, · aescina, CIS-hinoquiresinol y 1, 3-di-p- hidroxifenil-4-penten-l-ona .

En algunos ejemplos, el agente estabilizante que. es un inhibidor de hialuronidasa es un polisacárido de N-acetilglucosamina y ácido glucurónico . En otro ejemplo, . el agente estabilizante, que es un inhibidor de hialuronidasa es una azúcar de amina con una azúcar negativamente cargada. En ejemplos adicionales, el agente estabilizante .que es un inhibidor de hialuronidasa es un aminometil indol ; o un derivado de ácido ascórbico.

Las co-formulaciones ejemplares proporcionadas en .la presente contienen agentes estabilizantes que es hialuronano (ácido hialurónico;. HA) el ácido hialurónico (HA, también conocido como hialuronano e hialuronatos ) es el sustrato natural para las enzimas degr.adadoras de hialuronano tal como hialuronidasa,. por ejemplo una pH20, que incluye rHuPH20. El HA es un glicosaminoglicano no sulfatado que se. distribuye ampliamente a través de los tejidos conjuntivos, epiteliales y neurales . Es un polímero de hasta 25, 000 disacáridos, por si ' mismos compuestos de ácido D-glucurónico y D-Ñ-acetilglueosamina . . El peso molecular del HA varia . 'de aproximadamente 5, .kDa a 200,000 kDa. Al ^catalizar la hidrólisis del hialuronano, rHuPH20 (y otras hialuronidasas' y enzimas degradadoras dé hialuronano) reduce la viscosidad del hialuronano, incrementando de esta manera la permeabilidad del tejido e incrementando la velocidad de absorción de los fluidos administrados parenteralmente. ¦ . "· Como se muestra ,.en la presente, el ácido hialurónico (HA) es un estabilizador eficiente de las. enzimas degradadoras de hialuronano en presencia de otra manera agentes desestabilizantes y- condiciones, tales como, por ejemplo, sal baja, . pH alto, la presencia de conservadores y temperaturas elevadas.. En particular, el HA parece que reduce o niega el efecto negativo que el pH más alto y/o temperaturas elevadas tienen típicamente en rHuPH20 y otras hialuronidasas . solubles y enzimas degradadoras de hialuronano, particularmente en presencia de conservadores fenólicos. Por ejemplo, como se muestra en -..los. estudios escritos a continuación {véase por ejemplo. 7.D y Ejemplo 17), la estabilidad de rHuPH20 se incrementa significativamente cuando, los oligómeros HA (4-.16mers) se incluyen en las co-formulaciones con insulina. Las concentración del incremento de la HA tienen propiedades estabilizantes.de incremento. Por ejemplo, después de 1 semana a 30 °C en pH, 7.1 con 1 mg/mL de HA y NaCl 75 mM, . la actividad de la rHuPH20 en 'la co-formulación de la rHuPH20/insulina disminuyó de 600 U/mL a 341 U/mL (es decir retuvo 57% de' la actividad original) . Cuando la concentración de HA se incrementó al 10 mg/mL, la actividad de la rHuPH20. disminuyo solamente de 600 U/mL a 510 U/mL (es decir retuvo 35% de la actividad original). Además, él HA reduce c niega el efecto desestabilizante, de que . un pH contiene en la rHu.PH20. Por ejemplo, después de 1. semana a 30°C en pH 7.1 con 5.5'· mg/mL de HA y NaCl 100. mM, 68% de la rHuPH20 permaneció. Este porcentaje estuvo esencialmente sin cambio cuando el pH se incrementó, a 7.5. Un impacto similar positivo del HA en estabilidad de rHuPH20 de rHuPH20 se observó a temperaturas' elevadas (véase por ejemplo el Ejemplo 17) . De esta manera se determina en la presente que él HA se puede incluir en. iás formulaciones de insulina, y rHuPH20 (u otras hialuronidasas solubles y enzimas degradadoras de hialuronano) para estabilizar efectivamente la rHuPH20..

De esta manera, se proporcionan en la presente . co-formulaciones que. contienen HA. Cualquier tamaño de HA se puede usar en las composiciones como ; un estabilizador: En algunos ejemplos, el HA es un disacárido, compuesto de ácido D-glucurónico y D-N^acetilglucosamina . En otros ejemplos, el HÁ es un oligosacárido, tal como un tetra . sacárido que contiene dos 2 unidades de disacárido. de repetición, o alternativamente,. el HA usado en las co-formulaciones proporcionadas en la. presente puede contener múltiples unidades de disacárido de. repetición, tales como 3, 4,-· 5, 6, 7,' 8, 9, 10, 1 1,, 12, 13, 14, 15,. 16, 17, 18, 1.9, 20, 25, 30 o más unidades de disacárido. En otro ejemplo, el Ha usado en las co-formulaciones proporcionadas en la presente tiene un peso molecular que es de o de aproximadamente 5 kDa a o a aproximadamente 5, 000 kDa; de o de aproximadamente 5 kba a o a aproximadamente 1 ,000 kDa; de o dé aproximadamente 5 kDa a o a aproximadamente 500 kDa; o de o de aproximadamente 5 kDa a o a aproximadamente 200 kDa. Los oligosacáridos de HA ejemplares para el uso en las co-formulaciones en la presente tienen un peso molecular de aproximadamente 6.4 kDa, 74.0 kDa. o .234.4 kDa. Por ejemplo, incluidas, entre las composiciones proporcionadas en la presente de insulina y una enzima degradadora de hialuronano, tal como una . hialuronidasa ((por ejemplo rHuP.H20)', son aquellas que contienen HA que tienen un peso molecular de por lo menos o aproximadamente 5 kDa, 6 kDa, .7 kDa 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 4Q'kDa, 50 kDa, 60. kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90· kDa,¦ 100. kDa, 120 kDa, 140 kDa, 160 kDa, 180 kDa, 200 kDa, '220 kDa,, 240 kDa, 260 kDa, 280 kDa, 300 kDa, 350 kDa,. 400 kDa, 450 kDa, o 500 kDa. En un ejemplo, el peso molecular del HA en la co-formulación es menor que, 10 kDa.

Se proporcionan en la presente, por lo tanto, co-formulaciones de insulina y una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) que contiene un oligosacárido de HÁ'.

Las co-formulaciones. contienen 1 mg/mL a 20 mg/mL de HA, tal como por lo menos o- aproximadamente 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL,' 9 mg/mL., 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL,. 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL,. 18 mg/mL, 19- mg/mL o 20 mg/mL o más de HA. Las co-formulaciones estables ejemplares de insulina, y rHuPH20 incluyen de o de aproximadamente 8 mg/mL a o a aproximadamente. 12 mg/mL de HA, tal como, por ejemplo 10 mg/mL o aproximadamente 10 mg/mL. En . algunos ej emplos , la relación molar de HA a la enzima degradadora de hialuronano es o es de aproximadamente 100, 000: 1, 95,000:. 1, 90,000: 1, 85,000: 1, 80,000: 1, 75,000: 1, 70, 000: 1, 65, 000 : 1, 60,000: 1, 55,00.0: 1, 50,000: 1, 45,000: - 1, 40, 000: 1, . 35, 000: 1, 30,000:1, 25,000: 1, 20,000: 1, 15,000: 1, 10, 000 : 1, 5, 000 : 1, 1,000: 1, 900: 1, 800: 1, 700: 1, 600: 1,. 500: 1, 400:1, 300: 1, 200: 1, o 100:. l o menos, viii. Compuesto Nicotinico.

En algunos ejemplos, un compuesto nicotinico se usa como un agente estabilizante. Los compuestos nicotinicos¦ incluyen, pero no se limitan a, nicotinamida, ácido nicotinico, niacina, niacinamida, vitamina B3 y/o sales de la misma y/o cualquier combinación de los mismos. En aplicaciones particulares, el agente estabilizante puede incluir un compuesto nicotinico y un aminoácido o aminoácidos (véase por ejemplo Solicitud de PCT Publicada . Internacional No. WO2010149772 ) . Por ejemplo,- el aminoácido puede ser arginina, ácido glutámico y/o sales de los mismos o combinaciones de los mismos . ix. Otros Excipientes o Agentes Opcionalmente, las co-formulaCiones pueden., incluir portadores tal como un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con los cuales la co-formulación se administra. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en. "Remington's . Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. Estas composiciones: contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, generalmente en forma purificada o forma parcialmente purificada, junto- con una cantidad adecuada del portador para proporcionar la forma de La administración apropiada al paciente. Estos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceite, incluyendo aquellos de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuate, aceite de soja, aceite mineral, y aceite de ajonjolí. El agua1 es un portador típico, cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerol acuosas también se' pueden emplear como portadores líquidos,. particularmente para soluciones inyectables.

Por ejemplo, los portadores farmacéuticamente aceptables usados en las preparaciones parenterales incluyen , ehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes anti-microbianos, agentes isotónicos, soluciones amortiguadoras, antioxidantes, anestésicos locales, .agentes de- suspensión y dispersión, agentes emulsificantes , agentes secuestrantes o quélantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables.- Ejemplos de vehículos acuosos incluyen inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa Isotónica, Inyección de Agua Estéril, Inyección de Dextrosa y Ringer Lactada . Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijos de origen vegetal, aceite, de algodón,, aceite de maíz, aceite de ajonjolí y aceite de cacahuate. Los agentes anti-microbianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas . se pueden agregar a las preparaciones parenterales empacadas en recipientes de múltiples dosis, que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales,, alcohol bencílico, clorobutanol , esteres de ácido metil y propil p-hidroxibenzóico, timerosal, cloruro de benzalconio¦ y cloruro de bencetonió. Los agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa; Las soluciones amortiguadoras incluyen fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Los anestésicos locales, incluyen clorhidrato de procaína. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen carboximeti lcelulosa de sodio, hidroxipropil metilcelulosa . y polivinilpirrolidona. . Los agentes emulsificantes incluyen Polisorbato 80 (Tween .80) . Un agente secuestrante o quelante de iones de metal incluye EDTA. Los portadores farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para vehículos- visibles en agua e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para el ajuste del pH.

Las composiciones pueden contener junto con un ingrediente activo:, un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato de dicalcio, o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio y talco; y un aglutinante tal como almidón, gomas naturales, tal como goma de acacia, gelatina,. glucosa, melazas, polivinilpirrolidona, celulosa y derivado de los mismos, povidona, crospovidonas y otros aglutinantes .'conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo.

Por ejemplo, una proteína excipiente se puede agregar a la co-formulación que puede ser cualquiera, de una variedad de proteínas o pépticos farmacéuticamen'ce aceptables. Generalmente, la proteína excipiente, se selecciona por su capacidad para ser. administrada a un sujeto mamífero sin provocar una respuesta inmune. Por ejemplo, la albúmina de suero humana es : bien adecuada para el uso. . en las formulaciones farmacéuticas. Otros excipientes de proteínas farmacéuticos conocidos incluyen, pero no se limitan a, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa,, gelatina, malta, arroz, harina,. tiza, gel .de sílice, estearatp de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua y etanol. El excipiente se incluye en la formulación en una concentración suficiente para prevenir la absorción de la proteína, al recipiente o al vial de contención. La concentración del excipiente variará de acuerdo con el carácter del excipiente y la concentración de la proteína en la co-formulación ..' ' .

Una composición, si desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsific.antes , o agentes amortiguadores de pH, por ejemplo, acetato, citrato de sodio, derivado de ciclodextrin.a, monolaurato de sorbitan, acetato de sodio de trietanolamina, oleato. de trietanolamina, y otros agentes. 2. Co-Formulaciones Estables Ejemplares. a. Co-Formulaciones de Inyección de Múltiples Dosis (MDI) Ejemplares.

Se proporciona, en la presente co-formulaciones estables de una insulina de . acción rápida, ' tal como un análogo de insulina de. acción rápida (acción rápida) , ¦ y una enzima degradadora de hialurónano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) que. son¦ estables durante por lo menos. 6 meses en una, temperatura de o de aproximadamente 2°G a o a aproximadamente 8 °C y por lo menos 14 días (es decir ' 2 semanas) en una temperatura, de o aproximadamente 20°C, a o a aproximadamente 30°C. Ejemplares de las co-formulaciones de MDI son aquellas que son estables durante por lo menos o aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60 o más meses a una temperatura de o de aproximadamente 2°C a o a aproximadamente 8°C, y durante por lo menos o aproximadamente 14, 15., 20, 25, 28, 30, 35, 40, 45 o .50 o más días a una temperatura de o aproximadamente 20 °C a. o a aproximadamente 30 °C.

Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente son estables en o a aproximadamente 2-8° C durante por lo menos un año, por ejemplo- por lo menos 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses,. 18 'meses, 19 meses, 20 meses, 21 meses, 22 meses, 23 meses, 24 meses, 25 meses, .26 meses, 27 meses, 28 meses, 29 meses,' 30 meses, -31 meses, 32 meses, 33. meses, 34 meses, 35 meses, 36 meses' o más. En particular, las formulaciones proporcionadas en la presente son estables en o a aproximadamente 2-8° C durante por lo menos 24 meses.

En otros ejemplos, las formulaciones proporcionadas en la presente son estables durante por lo menos una semana en. o 20-30° C, tal como en o aproximadamente. 22° C, 23° C, 24° C, 25° C, 26° . C, 27° C, 28° C, 29° C o 30° C, durante ' por lo menos una semana. . Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente son . estables . en o en aproximadamente 20-30° C durante por lo menos 7 días, 8, días, 9 días, 10 días, 11 días,'' 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días,, 18. días, 19 días, 20 días,, 21 días, .22 días, 23 días, 24 días, 25 días, 26 días, 27 días, 28 días, 29 días, un mes,. 2 meses, 3 meses, 4·.meses, 5 meses, 6 meses o más. En particular, las formulaciones proporcionadas en la presente son estables en o en aproximadamente 20-30° C, tal como en o aproximadamente 25° C o 30° C durante por lo menos un mes.

En algunos ejemplos, una co-formulación estable proporcionada en la. presente contiene 100 U/mL a 1000 U./mL de una ' enzima degradadora de hialuronano tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 · (por ejemplo rHuPH20 ) ,. '.· y en particular en o. aproximadamente o por lo menos 600 U/mL; 10 U/mL a 1000. U/mL de una insulina de acción rápida, en particular por lo menos o aproximadamente 100 U/mL; NaCl en una concentración entre o aproximadamente entre 50 mM a 20.0 mM; un pH de entre o aproximadamente entre 6.8 a. 7.8, tal como entre o aproximadamente entre. 7.0 ; a 7.6; un agente amortiguador que mantiene el . intervalo de pH entre o aproximadamente entre .6.8 a 7.8 o 7.? a 7.6; y una cantidad anti-mícrobianamente efectiva de un conservador o de una mezcla de conservadores de 0.1% a. 0.4%· de conservador como una concentración de masa (p/v) ; .y un agente estabilizante en una cantidad que, durante el curso del almacenamiento (temperatura y. tiempo, por lo menos .50%. de la actividad de la enzima degradadora. de hialuronano inicial, tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos 375 U/mL de la. actividad de la enzima degradadora de' hialuronano se . retiene . Con respecto al agenté amortiguador, cualquier agente amortiguador se puede usar que se puede incluir- en una cantidad para mantener el intervalo de PH20 de la co-formulación entre o aproximadamente entre 6.8 a 7.8 tal como entre o aproximadamente entre 7.0- a.7.6. Típicamente, el Tris se incluye en las . co-formulaciones proporcionadas ,én ia presente en una concentración de o aproximadamente 10 mM a 50 mM, tal como, por ejemplo, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, '30 mM, 35 mM, 40 mM, 45.mM.o- 50 mM. En ejemplos particulares, las co-formulaciones .. contienen o contienen aproximadamente 20 mM a 30 mM de Tris, tal como 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM., 25 mM, 26. mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM o 30 mM de Tris. En ejemplos particulares, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen Tris en una concentración de aproximadamente 30 mM. ¦ ..

Por ejemplo, 'ejemplar de estas formulaciones contienen 100 U/mL a 1000 U/mL de una enzima degradadora de hialuronano tal como hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) , y en particular en o aproximadamente o por lo menos 600 U/mL; 10 U/mL a 1000 U/mL de una insulina de. acción rápida, y en particular por lo menos, o. aproximadamente. 100 U/mL; NaCl en una concentración de entre o aproximadamente entre 80-140 mM; un pH de entre o aproximadamente entre 7.0.a 7.6;. un agente amortiguador que mantiene el intervalo de pH de entré o aproximadamente entre 7.0 a 7-.6; 0.1% a 0.4% de conservador como una concentración de masa (p/v).; y un agente estabilizante en una. cantidad que, durante el curso de almacenamiento (temperatura y tiempo) por lo menos 50% de la actividad de la enzima degradadora de hialuronano inicial se retiene, tal. como por lo menos o aproximadamente por lo menos 375 U/mL de la. actividad de la enzima degradadora de hialuronano se retiene. Por ejemplo, las. co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen 1 mM a .100 mM de un agente amortiguador (por ejemplo Tris) . Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen, 0.01%·· a 0.5% de surfactante. Las co-formulaciones ejemplares proporcionadas, en ' la presente también pueden contener,, menor que 60 mM de glicerina (glicerol) y 5 mM a ¦ o a aproximadamente 50. mM de un antioxidante.

Las siguientes formulaciones estables son ejemplares solamente y proporcionan una plataforma de la cual se 'pueden hacer ajustes menores. Se entiende que cambios muy pequeños en las concentraciones de los diversos excipientes ' y otros componentes (por ejemplo, ± 15% de. las concentraciones establecidas) o pequeños cambios en el pH, se pueden, hacer mientras que retengan algo si no ..todo de la solubilidad y estabilidad de la insulina y la estabilidad de la -enzima degradadora. de hialuronano . Los cambios adicionales también se pueden hacer al agregar o remover excipientes. Por ejemplo, el tipo de surfactante de estabilización se puede cambiar. Por ejemplo, .las co-formulaciones ejemplares en la presente contienen .100 U/mL a 1000 U/mL de una enzima degradadora de hialuronano tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20)> y en particular por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente 600 U/mL de una enzima degradadora de hialuronano tal como hialuronidasa por ..ejemplo PH20 (por ejemplo rHuPH20), 10 U/mL a 1000 U/mL de una insulina de acción rápida, y. en particular por lo menos, o . aproximadamente por lo .'menos o aproximadamente 100. U/mL de una insulina de acción rápida; de o . de aproximadaménte 10 mM a o aproximadamente..50 mM de .Tris (por ejemplo de o aproximadamente 20 mM a 40 mM de. Tris, tal como por lo menos , o aproximadamente por lo menos 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM o 40 mM) ; de o de aproximadamente 80 mM a o aproximadamente 140 mM de NaCl (por ejemplo por lo menos o aproximadamente . por lo menos 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110. mM, 120 mM, 130 mM, 1'40 mM, 150 mM o 160 mM de NaCl),- 'de o de aproximadamente 5 mM a o aproximadamente .50 mM de metionina (por ejemplo por lo menos o aproximadamente por lo menos '5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM de metionina) ; de o de aproximadamente 0 mM a o aproximadamente 50 mM de glicerina (por ejemplo por lo menos o aproximadamente por lo . menos 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50. mM de glicerina); de o de aproximadamente 0.01% a o aproximadamente 0,5% . de poloxámero 188, tal como 0.01% a 0.05% (po ejemplo por lo menos..o aproximadamente por lo menos 0.01%, 0.02%, 0.03%,. 0.04%. o 0.05% de poloxámero 18'8); de o de aproximadamente 0.1% á o aproximadamente 0.25% de fenol (por ejemplo por lo menos o aproximadamente por lo menos 0.1%, 0.12%, 0.125%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16% o 0.17% de fenol); y de o . de aproximadamente 0.05% a o aproximadamente 0.2% de m-creso.l (por ejemplo, por. lo menos o aproximadamente por lo menos 0.075%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.12%, 0:13%, .0.14%, 0.15% , .0.1.6% o 0.17% de m-cresol) . Las formulaciones se preparan con un pH de o de aproximadamente.- 7.0 a o aproximadamente' 7.6 (por ejemplo por lo menos o aproximadamente, por lo ; menos pH 7..0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, .7.5 o 7.6). En ejemplos adicionales, el ' zinc se incluye en una concentración de o aproximadamente 0.017 mg/100 U, 0.018 mg/100 U, 0.02 mg/100 U, 0.022 rr.q/100 U o 0.024 mg/100 U de.' insulina . · Como se plantea en lo anterior, las concentraciones de los diversos componentes en . las formulaciones se .pueden incrementar o disminuir dependiendo de las propiedades ¦particulares de la insulina. Por ejemplo, las formulaciones de insulinas con solubilidad evidente, más alta, tal como insulina aspart, típicamente, contiene una .concentración más alta de NaCl. y. una concentración más baja de gl'icerina comparada con las . formulaciones de insulinas con . solubilidad evidente más baja, tal como insulina lispro. Dependiendo de la concentración de NaCl, el pH particular de la formulación también puede variar entre diferentes insulinas..

Por ejemplo> . incluidas, entre las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente son las co- formulaciones estables de una insulina y una enzima degradadora de hialuro'nano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) que contiene entre o aproximadamente entre 50 a 120 mM de NaCl, por ejemplo 50 .mM a 100 mM, tal como.50 mM a 90 mM o 80 mM a 100 .mM. ,Estas co- formulaciones incluyen, aquellas .que contienen análogos de insulina lispro. . En otros ejemplos,, las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente son co-formulaciones estables de una . insulina y una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una ??2? (por ejemplo rHuPH20) que contiene entre o aproximadamente entre 80 mM a 160 mM de NaCl, tal como 100 mM a 140 mM por ejemplo 120 mM. Estas co-formulaciones incluyen aquellas que contienen insulina aspart. Por ejemplo se proporcionan en la presenté co-formulaciones rHuPH20 de insulina aspart o insulina lispro qué contienen o contienen aproximadamente 80 mM o 10? mM de NaCl .

En otro ejemplo, incluidas entre las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente son las co-formulaciones estables de una insulina y una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo , una PH20. (por ejemplo rHuPH20) que contiene entre o aproximadamente entre 80 mM a 200 mM, por ejemplo 100 mM a 150 mM, tal como 130 mM a 150 mM, 120 mM a 140. mM o 110 mM a 130 mM. Estas, co-formulaciones incluyen aquellas que contienen el análogo de insulina glulisina. En algunos ejemplos, las co-formulaciones que contienen, por ejemplo insulina glulisina, tienen una concentración de. sal (NaCl) de o de¦ aproximadamente 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110¦ mM, 120 mM, 121 mM, 122 mM, 123 mM, 124 mM, 125 mM, 126 mM, 127 mM, 128 mM, i.29 mM, 130 mM, 131 mM, 132 mM, 133. mM, 134 mM, 135 mM, 136 mM, 137 mM, 138 mM, 139 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM o 200 mM. Por ejemplo se proporcionan en la presente co-formulaciones de rHuPH20 e': insulina glulisina que contienen o contienen aproximadamente 120 mM o 140 mM de NaCl.

En los ejemplos de las co-formulaciones se proporcionan en la presente co-formulaciones de una insulina, tal como insulina aspart, y rHuPH20 que tiene un pH de o de aproximadamente 7.2., por ej.emplo 7.2 + 0.2. En otros ejemplos, las co-formulaciones de una insulina, tal como insulina lispro, : y ·· · rHuPH20 tienen un pH de o dé aproximadamente 7.4, por ejemplo 7.4 ± 0.2. En ejemplos adicionales, las co-formulaciones de una insulina, tal como insulina glulisina,' y rHuPH20. tienen un pH de o de aproximadamente 7.3 o. 7.4, por ejemplo 7.3 + 0.2 o .7.4 ± 0.2'..

Ejemplares de las · co-formulaciones proporcionadas en la presente que contienen una enzima degrádadora de hialuronano, tal como una , hialuronidasá por ejemplo una PH20 {por ejemplo rHuPH20) e insulina lispro son aquellas que contienen de .'o aproximadamente 25 mM a o aproximadamente 35 mM de Tris (por ejemplo en o aproximadamente 30 mM) ; de o de aproximadamente 70 mM a o aproximadamente 100 mM de NaCl (por ejemplo en o aproximadamente 8.0 mM o 100 mM de . NaCl) ;. de o de aproximadamente 10 mM a o aproximadamente .30 mM de .metionina (por ejemplo en¦· o aproximadamente . 10 mM o 20 mM. de metionina) ; de o de aproximadamente 40 mM a o aproximadamente 60 mM de glicerina (por ejemplo en o aproximadamente 50 mM de glicerina) ; de o de aproximadamente 0.005% a o aproximadamente 0.05%. de poloxámero 188 (por ejemplo, en o aproximadamente 0.01% de poloxámero 188); de o de aproximadamente 0.017 mg · de zinc/100 . U de insulina a ,o aproximadamente 0..024 mg de zinc/100 U de insulina (por ejemplo. 0.017 mg de zinc/100 U de insulina, 0.018.mg/100 U, 0.02 mg/100 U, 0.022 mg/100 U o 0.024 mg de . 'zinc/100 U de insulina); de o de aproximadamente 0.08% a o aproximadamente 0.17% de fenol (por ejemplo 0.1%, 0.125% o 0.13% de '. fenol) ; y de o de aproximadamente 0.07% a o aproximadamente 0.17% de m-cresol (por ejemplo 0.075%, 0.08%, 0.13% o 0.15% de m-cresol) . Por ejemplo, .las co-formulaciones pueden contener en o aproximadamente 0.1%· de fenol y 0.015% de m-cresol; en o aproximadamente 0.125% de- fenol y 0.075% de m-cresol; en o aproximadamente 0.13.% de fenol y 0.075% de m-cresol; en o aproximadamente 0.13% de fenol y 0.08% de de m-cresol; o en. o aproximadamente 0.1.7% dé fenol y 0.13% de m-cresol. Estas formulaciones de' la insulina lispro y una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble -(por ejemplo rHuPH20) , se preparan con un pH de aproximadamente 7.0 a o aproximadamente 7.5 (típicamente un pH de o aproximadamente pH 7.2) .

. . Ejemplares de, las co-formulaciones proporcionadas en la presente que contienen una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo Una PH20 (por ejemplo rHuPH20) e insulina aspart son aquellas que contienen de o de aproximadamente 25 mM a o aproximadamente 35 mM de Tris (por ejemplo en o aproximadamente 30 mM) ; dé. o de aproximadamente 70 mM a o. aproximadamente 100 mM de NaCl (por ejemplo, en o aproximadamente 80 mM o aproximadamente de 100 mM de NaCl)-; de o de aproximadamente 10 mM a o aproximadamente 30. mM de metionina (por ejemplo en o aproximadamente 10 mM o 20¦ mM de metionina); de o de aproximadamente 40 mM a o . de aproximadamente 60 mM de glicerina (por ejemplo en o aproximadamente .50 mM de glicerina); de o de aproximadamente 0.005% a o aproximadamente 0.05% de poloxámero 188' (por ejemplo en o aproximadamente- 0.01% de poloxámero 188); de o de - aproximadamente 0.017 mg de zinc/100 U de insulina a..o aproximadamente 0.024 mg de zinc/100 ' 11 de insulina, (por ejemplo 0.017 mg. de- zinc/100 U de insulina, 0.018 mg/100 U, 0.02 mg/100 U, 0.0.22 mg/100 u o.' 0.024- mg de zinc/100 U de insulina); de o de aproximadamente 0.08% a o aproximadamente 0.17% de fenol (por ejemplo 0.1%, 0.125% o 0.13% de fenol) ;':y de o de aproximadamente 0.07% a o aproximadamente 0.17% de m-cresol (por ejemplo 0.075%, 0.08%.,.. 0;13% o 0.15% -'de m- cresol) . Por ejemplo, las co-formulaciones pueden contener en o aproximadamente .0..1% de fenol y 0.015% de m -cresol; en o aproximadamente 0.125% de fenol y 0.075% de m-cresol; en o aproximadamente 0.13% de fenol y 0.075% de m-cresol; en o aproximadamente 0.13% de fenol y 0.08% de m-cresol; o en o aproximadamente 0.17% de fenol y. 0.13% de m-cresol. Estas formulaciones de la insulina aspart y una. enzima dégradadora de hialuronano, tal como una ialuronidasa por ejemplo un PH20 (por ejemplo rHuPH20) se preparan con un . pH de o aproximadamente 7.0 a o aproximadamente 7.6 (típicamente un pH de o aproximadamente pH 7.4) .

Ejemplares de las cq-formulaciones proporcionadas.. en la presente, que contienen una enzima dégradadora de hialuronano, tal cono una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por. ejemplo rHuPH20) e insulina glulisina son aquellas que contienen de o de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 35 mM de Tris (por ejemplo en o aproximadamente 30 mM) ; de o. de aproximadamente 100 mM a o aproximadamente 150 mM de NaCl (por ejemplo en o aproximadamente 100 . mM o 140 mM de . NaCl);. de .o de aproximadamente 10 mM o de' aproximadamente 30. mM de mefionina (por ejemplo en, o aproximadamente 10 mM o 20 mM de metionina) ; de o de aproximadamente 40 mM o 60 mM de glicerina (por ejemplo en o aproximadamente 50 mM. de glicerina); de. . o 'de aproximadamente 0.005% a o aproximadamente 0.05% de poloxámero (por ejemplo . en o aproximadamente 0.01%. de poloxámero . 188); de o de aproximadamente 0.08% a o aproximadamente .0.17% de fenol (por ejemplo 0.1%, 0.125% o 0.13% de. . fenol); .y. de o de aproximadamente. 0.0.7% o a aproximadamente 0.17% de m-cresol (por ejemplo 0.075%., 0.08%, 0.13% o 0.15% de m-cresol). Por ejemplo, las , co-formulaciones pueden contener en o aproximadamente 0.1% de fenol y 0,015% de m-cresol; en o aproximadamente 0.125% de fenol y 0.075% de m-cresol; en o aproximadamente 0.13% de fenol y 0.075% de m-cresol; en ..o aproximadamente 0.13% de fenol y 0.0.8% de m-cresol; o en o aproximadamente 0.17% de fenol y 0.13% de m-cresol. Estas formulaciones de insulina glulisina y una enzima degradador.a de hialuronano, tal como una hialuronidasa (por ejemplo rHuPH20). se preparan con un pH de o aproximadamente 7'.0 a -o aproximadamente 7.6 (típicamente, un pH de o aproximadamente pH 7.4)·. b. Co-formulaciones de Infusión de Insulina Subcutánea Continua Ejemplares (CSII) Be proporcionan' en la presente co-formulaciones estables que son estables en presencia de condiciones aceleradas o de estrés tales como temperaturas elevadas mayores que o aproximadamente mayores que 32° tal como , 35 °C a .40°C, en particular mayor que en. o aproximadamente o 37°C o 40°C y/o condiciones de agitación durante por lo menos 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, .3 días, .4 días, por lo menos.5 días, por lo menos 6 días o por lo menos 7 días, y generalmente . por lo menos 3 horas o por lo menos 3 días. Estas co-formulaciones estables son adecuadas para la administración por infusión de insulina subcutánea, continua (CSII) . ' Como se plantea en lo anterior, la concentración, cantidad o nivel de los componentes gue confieren estabilidad de las . co-formulaciones en la presente durante por lo menos 6 meses a temperaturas' de o de aproximadamente 2°C a o aproximadamente .8°C y por lo menos 14 días (es decir -2 semanas) en una temperatura de o .aproximadamente 20°C a . o aproximadamente 30 °C generalmente no son suficientes para conferir estabilidad de la co-formulacion bajo condiciones de estrés tal como temperatura elevada. Generalmente, estas¦ c.o-formulaciones son. estables bajo condiciones de estrés (por ejemplo temperatura' elevada) por menos de 24 ' horas, y generalmente menor que 8 horas, lo cual puede deteriorar sustancialmente su uso en aplicaciones, de múltiples dosis donde esas condiciones existen. Por ejemplo, la terapia CSII se asocia con la infusión continua de formulaciones . por una bomba u otro dispositivo que se usa en el exterior y cerca del cuerpo durante ' 24 horas al dia durante 2 a 3. días. La formulación de insulina o co-formulación se inyecta a través de una aguja en la pared abdominal o musió, la · inyección¦ que se - puede controlar por una bomba programada de modo que la formulación de insulina , o co-formulación se infusiona continuamente. Por lo tanto, las co^formulaciónes usadas para la terapia CSII se someten a temperaturas · corporales elevadas de por lo menos, aproximadamente o mayor que 37 °C .·: y condiciones de . agitación .

Por ejemplo, una enzima degradadora de hialuronano es particularmente inestable a temperaturas . elevadas mayores que 32 °C, y típicamente mayores que 37 °C o 40 °C. También se descubrió en la presente que aunque la insulina se cristaliza en 20C a 8°C en concentraciones de sal altas y pH bajo, no se cristaliza en condiciones de sal altas y pH bajo en temperaturas más altas de 32°C a 40°C. Por consiguiente, el requisito opuesto de la concentración de sal alta y pH bajo requeridos por las enzimas degradadoras de hialuronano (por ejemplo PH20) para mantener su estabilidad en temperaturas altas de 32°C a 40°C .es más compatible en temperaturas más altas curante por lo menos un período, de tiempo corto de por lo menos 3. días. También, las mismas .formulaciones de sal alta y pH bajo confieren .estabilidad similar entre los análogos de insulina, a pesar de las diferencias en la solubilidad evidente . que afectan la estabilidad de la insulina en las temperaturas más bajas.

Las co-formulaciones estables que son estables bajo condiciones de estrés, por ejemplo para el uso en la terapia CSII, contienen generalmente los mismos "componentes como las otras co-formulaciones proporcionadas en la presente. Estas co-formulaciones , sin embargo, difieren en que las co-formulaciones que son ' estables' bajo condiciones de estrés contienen generalmente una concentración de sal más alta, un pH más bajo, y/o la presencia de uno o más de otros excipientes que .. estabilizan suficientemente la enzima degradadora de hialuronano y/o la insulina generalmente durante por lo menos 2 a 3 días en temperaturas elevadas mayores que o aproximadamente mayores que 32° tal como 35 °C a 40°C, en particular mayor que en o aproximadamente o 37°C o 40°C y/o condiciones de agitación. Por ejemplo, la co-formulaciones proporcionadas en la presente que son estables en condiciones de. estrés de temperaturas elevadas o agitación contienen generalmente un inhibidor de hialuronidasa, tal como un. substrato - hialuronidasa (por ; ejemplo, hialuronano) como un excipiente.. , .

En un ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente que son estables en condiciones de estrés de temperaturas elevadas o agitación contienen una concentración de sal más alta¦ y un. pH más bajo' que las co-formulaciones proporcionadas en lo anterior en ' la S.ección E.l.a. P.ór ejemplo, se proporciona en la presente ;.co-formulaciones ' que son estables bajo ' condiciones de estrés (por ejemplo temperatura elevada de 32 °C a 40 °C o agitación) . durante por lo menos 3 días o 3 horas que contienen 120 mM de NaCl a 200 mM de NaCl y pH de 6.5 a 7.5. Como se plantea en lo anterior, sin embargo, la solubilidad de la insulina, particularmente en temperaturas refrigeradas, disminuye en estas condiciones de pH reducido y sal incrementadas. De esta manera, estas formulaciones no se almacenan típicamente en temperaturas refrigeradas o ambientales antes del uso.

En otro ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente que son estables en condiciones de ' estrés de temperaturas elevadas (por ejemplo 32°C a 40°C) durante por lo menos 3 días o agitación durante por. lo menos 3 horas contienen un inhibidor de hialuronidasa para estabilizar la enzima degradadora de hialuronano en. la co-formulación . Cualquiera de los. inhibidores de hialuronidasa descritos en lo anterior se pueden usar en una co-formulación en la presente que sea estable en condiciones de estrés de temperaturas elevadas (por ejemplo¦ 32 °.C a- 40°C) durante¦ por lo menos 3 días o- agitación durante por lo menos 3 horas. En ejemplos particulares, el inhibidor de hialuronidasa es un substrato de hialuronidasa, por ejemplo,, un hialuronano.

Como se muestra en los Ejemplos en la presente con el inhibidor de hialuronidasa, hialuronano, la presencia de un inhibidor de hialuronidasa estabiliza la actividad de la PH20, particularmente en presencia de 'conservadores especialmente a temperaturas elevadas, . tales como' bajo condiciones de estrés de temperaturas de 32°C a 40°C. Puesto que los oligómeros HA son el substrato/producto de la reacción enzimática de una enzima degradadora de hialuronano con hialuronano, los oligómeros de hialuronano pueden ligarse al sitio activo de la enzima y provocar el efecto de estabilización. ??· obstante, también se descubrió " que a través del tiempo bajo condiciones de estrés de temperaturas elevadas de 32°C a.40°C, tales como mayor que 1 semana o 2 semanas a 37 °C, .. la presencia de un inhibidor de hialuronidasa, tal como HA, en la co-formulación .puede dar por resultado la degradación de la insulina, dando por resultado de esta manera en aductos de análogos de HA-insulina covalentes. Por ejemplo, la presencia de altas concentraciones de HA en las co-formulaciones proporcionadas en la presente ha mostrado por la cromatografía liquida de alto desempeño de. fase inversa (RP-HPLC) que provocan la degradación de la insulina AspartMR después de 1 semana a 37 °C y la insulina . GlulisinaMR después dé 2 Semanas a 30 °C. Él análisis de espectrometría de masas-cromatografía líquida (LC-MS) indicó, que algunos de los productos de degradación son aductos de glicación análogos de HA-insulina covalentes formados por la reacción de insulina con el extremo reductor del HA. Por ejemplo, se determinó un pico que es el producto de la insulina . AspartM? y una HA de 7mer mientras que otro pico fue el producto -de la insulina AspartMR y un, HA de 2mer.

La presencia de un inhibidor.de hialuronidasa, tal como HA, también puede, tener efectos en la precipitación y cambio de color de la co-formulación . Por consiguiente, mientras que el HA mejora la estabilidad de la enzima degradadora de hialuronano en las condiciones de estrés de temperaturas elevadas de 32°C a.40°C, también puede tener efectos en la degradación de la insulina, precipitación y color .de cambio dé la co-formulación . Está dentro del nivel de una persona experta en el campo supervisar estas condiciones dentro de los parámetros de seguridad y farmacológicos deseados . y directrices. Generalmente, las . co-formulaciones estables proporcionadas . en la presente que contienen un inhibidor de hialuronidasa, tal como HA, son estables a temperaturas elevadas, tales como bajo condiciones de estrés de temperaturas de 32°C a 40°C durante por lo menos 3 horas pero no más de 7 días. debido a los efectos en estos parámetros.

En algunos ejemplos, proporcionados en la- presente, se usa un inhibidor de hialuronidasa que no es capaz, de formar complejos cóvalentes' con la insulina o enzimas degradadoras de hialuronano. Por consiguiente, los inhibidores no cóvalentes que actúan por la ligación asociativa se contemplan en las formulaciones en la presente. Por ejemplo, se proporcionan en la presente co-formulaciones que¦ contienen HA con un extremo reductor reaccionado de modo que ya no es posible formar aductos de glicación con la insulina. Por ejemplo, en algunos ejemplos, el HA usado en las co-formulaciones proporcionadas en la presente se han modificado por aminación reductiva. La ' aminación reductiva implica la formación de una base Schiff entre un aldehido y un amina, que luego se reduce para formar la amina más estable. El extremo reductor de un azúcar, es decir, HA, existe como una mezcla de equilibrio de la forma hemiacetal ¦ cíclica' y la forma de aldehido de cadena abierta.- Bajo condiciones adecuadas conocidas de una persona experta en el campo, lós grupos amina se condensarán con. el aldehido de azúcar para formar un ión de iminio que se puede reducir a una amina, con un agente reductor tal como cianoborohidruro de sodio (véase, por ejemplo Gildersleeve y colaboradores, (2008) Bioconjug Chem 19 (7) : 1485-1490) . El HA resultante no es 'reactivo a la insulina y es incapaz de formar aductos de glicación de insulina.

En particular, se proporciona en la presente una composición de co-formulación estable que es estable durante por lo menos 3 días en una temperatura de o de aproximadamente 32°C a' 40°C y/o es estable durante por lo menos 3 horas bajo agitación que contiene 100· Ü/mL a, 1000 U/mL de una enzima degradadora" de hialuronano tal como hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) , y en particular en o aproximadamente o por lo menos..600 U/mL; 10 U/mL a 1000. U/mL de una insulina de acción rápida y en particular por lo: menos o aproximadamente 100 U/mL.; NaCl en una concentración entre o aproximadamente 120 mM a 200 mM; un pH de entre o aproximadamente entre 6.5 a 7.5; una cantidad ahti-microbiológicamente efectiva de un conservador o mezcla de conservadores;' y uno o -más agente .o agentes estabilizantes, tal como un inhibidor de hialuronidasa, tal que por lo menos.50% de la actividad de la enzima degradadora de hialuronano inicial, tal como por lo . menos o aproximadamente por lo menos 375 U/mL de la actividad de la enzima degradádora de hialuronano se retiene. Por ejemplo., la co-formulación puede contener HA en una concentración dé entre o aproximadamente entre 1 mg/mL a 20 mg/mL. Las co-formulaciones .estables también pueden contener un agente amortiguador para mantener el intervalo de pH de entre o aproximadamente entre pH 6.5 (por ejemplo Tris) en una cantidad que es entre o aproximadamente entre 1. mM a 100 mM; una cantidad antimicrobianamente efectiva de un ' conservador - o una mezcla de conservadores, por ejemplo, un conservador fenólico (por ejemplo fenol y/o m-cresol) en una cantidad tal como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) , en la formulación que es o es entre 0.1% y 0.4%; un surfactante (por ejemplo poloxámero 188) como un %. de concentracion .de masa, (p/v) de entre o aproximadamente entre 0.005% a 1.0%; y ¦ opcionalmente un agente estabilizante adicional..

Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente que son estables bajo condiciones de estrés (por ejemplo temperatura elevadas de 32°C a 40°C o agitación) durante por lo menos. 3 dias o 3 horas contienen 120 mM a .200 mM, tal como 150 mM de NaCl a 200 mM de. NaCl o 160 mM de NaCl a 180 mM NaCl, por ejemplo en o aproximadamente 120 mM, 13,0 mM, 140 mM, 150 mM, 155 mM, 160 mM, 165 mM, 170 mM, 175 mM, 180 mM, 185 mM, 190 mM, 195 mM o 200 mM de' aCl. También, las co-formulaciones proporcionadas en la presente que son estables bajo condiciones de estrés (por ejemplo temperatura elevada de 32°C a 40°C o agitación) durante por lo menos .3 dias o 3 horas contienen un pH de 6.5 a 7.5 o 6.5 a 7.2, tal como o. aproximadamente un pH de 6.5 + 0.2, 6.6 + 0.2, 6.7 + ¦ ± 0.2, .6.8 ± 0.2, 6.9 ±.0.2, 7.0 ± 0.2, 7.1 ± 0.2, 7.2 ± 0.2, 7.3 ± 0.2, 7.4 ± 0.2 o 7.5 ~ 0.2.

En' ejemplos en la presenté, las co-^formulaciones proporcionadas en la presente que .son estables en condiciones de estrés de temperaturas elevadas (por ejemplo 32 °C a- 40°C) 0. agitación durante por. lo menos 3 días o 3 horas contienen hialuronano (ácido hi.alurónico; HA) que tiene un. peso molecular de 5 kDa. a : 50.00 kDa, 5 kDa a o aproximadamente 1, 000 kDa, 5 kDa a o aproximadamente 200 kDa, . o 5. kDa a o aproximadamente 50 kDa. En particular, el peso molecular del HA es menor que 10 kDa. El 'HA puede ser un oligosacárido, compuesto de disacáridos, tal como un 2mer a 30mer o a 4mer .a 16mer. Las co-formulaciones de la insulina y la enzima degradadora de. hialuronano tal como una . hialuronidasa, por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) contienen HA en una concentración de entre o aproximadamente entre 1 mg/mL a 20 mg/mL, tal como por lo menos' o aproximadamente 1 mg/mL, '2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/ml, 13 mg/mL, 14· mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL' o 20 mg/mL o más de HA. Las co-formulaciones ejemplares estables incluyen de o de aproximadamente 8 mg/mL de o aproximadamente 12 mg/mL de HA, tal como, por ejemplo 10 mg/mL o . aproximadamente 10 mg/mL. En algunos ejemplos, la relación molar de HA a enzima degradadora de hialuronano es o es de aproximadamente 100, 000:1, 95, 000:1, 90, 000:1, 85, 000:1, 80 , 000 : 1 , .75 , 000 : 1 , 70,000:1, 65,000:1, 60,000:1, 55,000:1, 50,000:1, .45,000:1, 40,000:1, 35, 000:1, 30, 000:1, 25, 000 : 1, 20, 000 : 1, 1.5, 000 : 1, 10,000:1, 5,000:1, 1,000:1, 900:1, 800:1,. 700:1, .600:1, 500:1, 400:1, 300 : 1 , 200 : 1 o 100 : 1 o menos .

Puesto que las formulaciones que son estables .'. a temperaturas elevadas (por ejemplo 32° C a 4.0° C) . o agitación, tal como se ' desea para formulaciones CSII, tienen un pH que se disminuye y la concentración dé sal se incrementa como es comparada con las co-formulaciones expuestas en lo anterior en la Sección E.1. que se pueden preparar o derivar de' las mismas. Esto, se puede lograr, por ejemplo, al diluir una co-formuláción tal como cualquiera proporcionada en la Sección E.l.a que es adecuada para MDI con un diluyente estabilizante que tiene un pH bajo .y una concentración de sal alta. Por ejemplo, el diluyente, puede ser una solución de NaCl alta con solución amortiguadora .en pH más bajo y conservadores. Por ejemplo., el diluyente puede contener 10 mM a 50 mM de Tris u otra solución amortiguadora similar; 120 mM a 200 mM de NaCl; 0.1% a 0.4% de conservador. El diluyente se puede preparar en un pH . de entre o aproximadamente entre 6.5 a 7.8. Por consiguiente, una co-formuláción estable proporcionada en la presente . que es estable a 2o C a 8 ° C o 20° C a 30° C se puede proporcionar y mezclar al diluyente para proporcionar una co-formuláción que es estable bajo condiciones de estrés bajo.' temperaturas elevadas (por ejemplo 32° C a 40° C) durante por lo menos .3 días o agitación durante por lo menos 3 horas.

Por ejemplo, cualquiera de las co-formulaciones MDI anteriores en la Sección E.l.a se pueden diluir con un diluyente estabilizante dando por resultado una formulación CSII con concentración de insulina más . baja, un pH de o de 6.8 a o a aproximadamente 7.0 (tal como a o aproximadamente 6.8, 6.9 o 7.0.) y una concentración de NaCl de o de aproximadamente .150 mM a o a aproximadamente 200 mM.

En otros ejemplos, la co-formulación MDI estable se puede proporcionar como una formulación MDI de concentración alta modificada que contiene concentraciones de insulina más alta en concentraciones de PH20 más altas y NaCl más bajo (entre o aproximadamente entre 80 mM a 150 mM) y capacidad amortiguadora más baja para proporcionar tonicidad aceptable y pH más bajo después del mezclado con el diluyente excipiente estabilizante. Por ejemplo, la concentración de insulina más alta puede ser, por ejemplo, 120 a 500 Unidades, tal como 150, 200 o 5.00 Unidades (U) y la concentración de PH20 más alta puede ser 6 a 25 g/mL, tal como 6 a 25 6, 7.5, 10 o 25 ug/mL. La dilución de. la formulación MDI de concentración alta modificada con un diluyente estabilizante puede proporcionar una formulación CSII con pH más bajó (por ejemplo 6.5 a 7.2) y NaCl incrementado (140 mM a 200 mM) que cualquiera de las co-formulaciones MDI proporcionadas en la Sección E.l.a anterior.

En un ejemplo adicional, cualquiera de las. formulaciones MDI proporcionadas en la presenté en la Sección . E.l.a se puede preparar y almacenar .en forma liofilizada. Inmediatamente antes del uso bajo condiciones de estrés, el producto liofilizado puede diluirse con un ¦' diluyen.te estabilizante que contiene pH más bajo (por ejemplo 6.5. a 7.-8) y NaCl incrementado (120 mM a 200 mM) dando por resultado una formulación CSII con pH más bajo- (por ejemplo 6.5 a 7.8) y NaCl incrementado (120 mM a 200 mM) que cualquiera de las co-formulaciones MDI proporcionadas en la Sección E.l.a anterior'.

Como se muestra en los ejemplos en la presente-, sin embargo, el hialuronano no es .adecuado para el uso con formulaciones almacenadas a 2 o C a 8 o C, puesto que provoca que la insulina se agregue a temperaturas más bajas. De esta manera, en los ejemplos anteriores donde la formulación estable CSII se genera de la dilución de. una formulación MDI y la co-formulación MDI o con formulación MDI Concentrada modificada no contiene un inhibidor de hialuronidasa, un inhibidor de hialuronidasa se puede incluir en el diluyente estabilizante a fin , de proporcionar la ¦. concentración apropiada de inhibidor de hialuronidasa' para mantener la estabilidad en la .co-formulación bajo condiciones de estrés a temperatura elevadas (por ejemplo 32° C .a 40° C) durante por lo menos 3 días o agitación durante por lo menos 3 horas, c. Co-formulaciones de Lys-Lys Ejemplares Se proporcionan en la presente co-formulaciones que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa, por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20), una cantidad terapéuticamente efectiva de una insulina de acción rápida, tal como un análogo, de insulina de acción rápida (por ejemplo, acción rápida), y una cantidad, de Lys-Lys para hacer la co-.formulación estable. Típicamente, las co-formulaciones son formulaciones de. múltiples dosis y también contienen una cantidad microbianamente efectiva de uno o más conservadores. Las co-formulaciones también contienen uno o más de otro estabilizador o excipientes. Estas co-formulaciones son estables durante por lo menos .6 meses a una temperatura de o de aproximadamente 2° C- . a o. a aproximadamente 8° C y por lo menos 14 días; (es decir 2 semanas) en una temperatura de. o aproximadamente 20° C a o", a aproximadamente 30° C .. En particular, . estas co-formulaciones son. estables bajo condiciones aceleradas tales' como temperaturas elevadas mayores que o aproximadamente mayores que 32° tales como 35° C a 40° C, en particular mayores que en o aproximadamente o 37° C o 40° C y/o condiciones de ¦ ? agitación durante por lo menos 3 horas y generalmente, por -3 días. Las co-formulaciones se pueden usar para · uso de inyección de múltiples dosis ( DI) o para métodos de. infusión de insulina subcutánea continua (CSII) .

Las formulaciones que contienen Lys-Lys estables ejemplares, se describen a continuación. Las siguiénte.s formulaciones estables son ejemplares solamente y proporcionan una plataforma a partir de la cual se pueden hacer ajustes menores. Se entiende que cambios muy pequeños en las concentraciones de los diversos, excipientes y otros componentes (por ejemplo + · 15% ' de las concentraciones establecidas), o. cambios pequeños en el pH se pueden hacer mientras retengan algo sino todo de la solubilidad y la estabilidad de la insulina y la estabilidad de la enzima degradadora de hialuronano . También se pueden hacer cambios adicionales al agregar o al remover excipientes.

Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen: 100 U/mL a 1000 U/mL de una enzima degradadora de hialuronano tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) , y en particular en o aproximadamente, o por lo menos' 600 U/mL; 10 U/mL a 1000 U/mL de una. insulina . de acción rápida, y en particular por lo menos aproximadamente 100 U/mL; las co-formulaciones contienen además. Lys-Lys en una. concentración de entre o aproximadamente entre 50 mM a 120 mM, tal como 50 a 80 mM, 80 mM a 100 mM o ,100 mM a 120 mM, : un pH ' de entre "o aproximadamente entre 6.5 a 8.0, por ejemplo, 6.5 a -7.8 o 6.8 a 7.8 tal como entre o aproximadamente entre 6.5 a 7.-5, 6.8 a 7.4 o 7.0 a 7.6, un agente amortiguador que mantiene el pH, en una cantidad anti-microbianamente efectiva de un conservador o mezclas, de conservadores, y un .agente estabilizante en una cantidad que, durante el . curso del almacenamiento (temperatura y tiempo) , retiene por lo menos 50% de la actividad de la enzima degradadora de hialuronano y retienen por lo menos 90% de la pureza, recuperación y/o potencia de la insulina. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen 0.0005% a 1.0% .(por ejemplo 0.0005% a 0.005%) de surfactante como un agente estabilizante. Las co-formulaciones pueden contener opcionalmente agentes estabilizantes adicionales, modificadores de tonicidad, un agente anti-oxidación y/o excipientes. Por ejemplo, las co-formulaciones contienen NaCl como una concentración de menor que 140 mM, tal como entre , o aproximadamente entre 0 mM a .100 "mM, por ejemplo entre o aproximadamente entre 0 mM a 50 mM, 10 mM- a 40 mM o 20 mM. a 30 mM. ¦ En un ejemplo, una formulación ejemplar .'contiene : 100 U/mL a 1000 U/mL,. de una enzima degradadora de hialuronano tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) , y en particular por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente 600 U/mL de una enzima degradado.ra de hialuronano tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20); 10 U/mL a 1000 U/mL de insulina glulisina, y en particular por lo menos o aproximadamente 100 U/mL de o de aproximadamente 50 mM a o a aproximadamente 105 mM de Lys-Lys (por ejemplo por lo menos o aproximadamente por lo. menos 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM o 100 mM) ;.¦ 0 mM a O a aproximadamente 50 mM de metionina (por ejemplo entre o aproximadamente entre 5 mM a 20 mM, tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM de metionina); y de o de aproximadamente 0.0005% a. o a aproximadamente 0.005% de polisorbato 20, tal como 0.001%· a 0.0.05% (por ejemplo por lo menos o aproximadamente por lo menos 0.0005%, 0.0001%, 0.005% o 0.001) polisorbato 20); y conservadores que incluyen fenol en un porcentaje .(%) de concentración de masa (p/v) de entre o . aproximadamente entre 0.01% a 0.25%) y m-cresol en un (%) p/v. de entre o aproximadamente 0.05% a 0.2%. Las formulaciones se preparan con un pH de o de aproximadamente 6.8 a 7. ,. (por ejemplo por lo menos o aproximadamente por lo menos pH 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 o .7.4). Ejemplos adicionales, del NaCl se incluye en una concentración menor que 140 mM. Por ejemplo, el NaCl se incluye, en la una concentración de menor que 10.0 mM, tal como por lo menos o aproximadamente por. lo menos 0 mM a 100 mM, por ejemplo por lo menos o aproximadamente por lo menos 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM o .90 mM..

En otro ejemplo, una formulación ejemplar contiene: 100 U/mL a 1000' U/mL, de una enzima degradadora.. de hialuronano tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) , y en particular por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente 600 U/mL de una enzima degradadora de hialuronano tal . como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH2'0) ; 10 U/mL a 1000 U/mL de insulina lispro o aspart, y en particular por lo menos o aproximadamente 100 U/mL de o de aproximadamente 80 mM a o a aproximadamente 100 mM de Lys-Lys (por ejemplo por. lo menos o aproximadamente por lo menos 80 mM, 85 mM, 90 mM, .95 mM o 100 mM) ; 0 mM. a o a aproximadamente 50 mM de metionina · (por ejemplo entre o aproximadamente entre 5 mM a 20 mM, tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos 5 mM, 10 mM, 20 mM., 30 mM, 40 mM o 50 mM de metionina); de o de aproximadamente 0.0005% a o a aproximadamente 0.005% de polisorbato 20, tal como 0.001% a. 0.005% (por ejemplo por lo menos o aproximadamente por lo menos 0.0005%, 0.0001%, 0.005% o 0.001%) polisorbato 20); y conservadores que incluyen fenol en urt porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre o entre aproximadamente entre 0.01% a 0.'25%) y m-cresol en un (%) p/v de entre o entre aproximadamente¦ 0.05% a 0.2% de fenol. Las formulaciones se preparan con un pH de. o de aproximadamente 6.8 a 7.4, (por ejemplo por lo menos o aproximadamente por lo menos pH 6.8, 6.9, 7.0, 7.1/ 7..2, 7.3 o .7.4) . En ejemplos adicionales, . el NaCl. se incluye en una concentración menor que 140 mM. Por ejemplo,, el NaCl se incluye en una concentración de menor que 100 mM, tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos 0 mM a 100 mM, por ejemplo por lo menos o aproximadamente¦ por lo menos 5.mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM o 9.0 mM.

G. Dosificación y Administración.

Las composiciones proporcionadas en la presente que son formulaciones estables · de una enzima degradadora de hialuronano se pueden formular como composiciones farmacéuticas para administración de una : o múltiples dosificaciones. Las . co-formulaciones de -una enzima degradadora de hialuronano y una insulina de acción rápida se formulan como composiciones farmacéuticas para administración de múltiples dosificaciones. Las formulaciones y las co-formulaciones se pueden formular por cualquier vía adecuada 332 , '· _ ' tal, por ejemplo', administración parenteral incluyendo subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ¦ y administración intra dérmica. Típicamente, las formulaciones o co-formulaciones proporcionadas en . la presente se administran subcutáneamente.

Las dosis terapéuticamente efectivas se pueden determinar empí icamente al . someter a prueba las formulaciones o co-formulaciones en sistemas in vitro e in vivo conocidos y también se pueden . individualizar para cada sujeto basado, en. tales factores como metabolismo, ingesta de alimentos y gravedad de la enfermedad. La concentración de una enzima degradadora de hialuronano y/o insulina seleccionada en la formulación o co-formulación depende, pór ejemplo, de la absorción, inactivación . y velocidades de excreción del complejo, las características físico químicas del. complejo,, el programa de dosificación, y la cantidad administrada, así. como otros factores conocidos por' aquellas personas de experiencia en el campo. Por ejemplo,- para las co-formulaciones con . insulina, se entiende que la dosificación precisa del tratamiento es una función de los niveles de glucosa, en la sangre en un sujeto, y se pueden determinar empíricamente usando algoritmos conocidos o por extrapolación de datos de prueba in vivo o in vitro, experiencia pasada del sujeto, conteo de carbohidratos para determinar el contenido de carbohidratos en una comida y, por lo tanto, el incremento de la glucosa en la sangre · prandial estimada y requisito de subsecuente . para insulina. Cabe destacar que las concentraciones y volúmenes de dosificación pueden variar co .cada sujeto tratado. Deberá entenderse adicionalmente que para cualquier sujeto particular,, los regímenes de dosificación específicos se deben ajusfar a través del tiempo de acuerdo con la necesidad del individuo y la evaluación del profesional de la persona que administra , o supervisa la administración de las formulaciones, y que los intervalos de concentración expuestos en la presente sean ejemplares solamente y no se propongan para limitar él alcance de los mismos. La cantidad de una ¦ insulina seleccionada que se administra para el tratamiento de una condición diabética se puede determinar por técnicas clínicas estándares. Además, los ensayos in vitro y los modelos animales, se pueden emplear para ayudar a identificar los intervalos de dosificación' óptimos.

Por consiguiente, la dosificación precisa, que se puede determinar empíricamente, puede depender de la enzima degradadora de hialuronano particular y/o insulina . contenida en las formulaciones · o co-formulaciones , el régimen y programa de dosificación, la vía de administración, el tipo de diabetes que se trata, la gravedad de la enfermedad y el sujeto que se trata. Generalmente, la insulina se proporciona en una, cantidad que logra un control glicémico. Po ejemplo, para lograr el control glicémico pos-prandial, a los sujetos diabéticos se les administra típicamente una/inyección de bolo de o aproximadamente 0.05 U de insulina de acción rápida por kg de peso corporal (U/kg) a 1.0 U/kg 30 minutos a 5 minutos antes de una comida, .cuando la insulina se administra si una enzima degradadora de hialuronano. Se entiende que esta dosis se puede incrementar . o disminuir cómo sea apropiado basado en, por ejemplo, metabolismo de un sujeto particular, el contenido de la comida, y los niveles de glucosa en la sangre. Se entiende además que el tiempo en el cual la insulina se administra . para el control glicémico pos-prandial se puede cambiar para estar más cercano a o además del tiempo de ingestión de una comida, y, en algunos casos, se puede cambiar tal que la insulina se administra en el momento de la comida o después de la comida.

Las insulinas de acción rápida se. administran típicamente en dosis de entre 0.05 Unidades/kg a. 0.25 Unidades/kg, tal como, por ejemplo, 0.10 Unidades/kg, aunque la dosis particular varía. Debido a las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas mejoradas de la insulina co-formulada con enzimas' degradadoras de hialuronano (tal como rHuPH20) , las co-formulaciones proporcionadas . se pueden administrar en dosis más bajas comparadas con la insulina de acción rápida administrada en la ausencia de una enzima degradadora de hialuronano. El grado el cual la cantidad de una insulina de acción rápida se puede reducir al administrarla como una co-formulación con una enzima degradadora de hialuronano depende, por ejemplo., del tipo de diabetes que el paciente tiene y el tipo de insulina contenida en la co-formulación . Típicamente, la reducción en la cantidad de la insulina de acción rápida administrada a pacientes diabéticos Tipo 2 cuando.se les administra como una co-formulación . con la enzima degradadora de hialuronano es mayor en la reducción de la cantidad de insulina de acción rápida administrada a pacientes diabéticos Tipo 1 cuando se les administra como una co-formulación con una- enzima degradadora de hialuronano. Por ejemplo, en casos donde un paciente diabético Tipo 1 y paciente diabético Tipo. · 2 a ambos se les administra 0.20 U/kg la insulina de acción rápido para controlar los niveles de glucosa pos-prandiales , y al paciente diabético Tipo 1 se les puede administrar 0.15 U/kg de insulina de acción rápida co^formuláda con una enzima degradadora de hialuronano para lograr el mismo o mejor control glicémico,. y al paciente diabético Tipo 2 se le puede administrar 0.10 U/kg de insulina de acción rápida co-formulada con una enzima degradadora de hialuronano para logra el mismo o mejor control glicémico.

Los. intervalos de dosificación ejemplares- para la administración parenteral, tal como subcutánea, de la insulina usando las, co-formulaciones con un enzima degradadora de hialuronanp proporcionada en la presente para controlar los niveles de glucosa en la sangre pos-prandial son de o aproximadamente 0.05 U/kg a 0.50 U/kg, tal como 0.05 U/kg, 0.06 U/kg, 0.07 U/kg, 0.08 U/kg, 0.09 U/kg, 0.10 U/kg, 0.11 U/kg, 0.12 U/kg, 0.13 U/kg, 0.14 U/kg, 0.15 U/kg, 0.20 U/kg, 0.25 U/kg, 0.30 U/kg, 0.40 U/kg, 0.50 U/kg o 1.0 U/kg. La dosificación particular depende de la enfermedad y el individuo .

Las co-formulaciones de la insulina, una enzima degradadora de hialuronano proporcionadas en la presente también se pueden administrar a sujetos diabéticos para efectua un control glicémico durante todo, el día y -.la noche, además del control glicémico pos-prandial. Típicamente, las dosificaciones . de la insulina administrada para proporcionar un control glicémico continuo son menores que aquellas requeridas para lograr el control glicémico pos-prandial. Las dosificaciones sin embargo, se pueden incrementar o disminuir basado en los niveles de glucosa en' la sangre. Los intervalos de dosificación ejemplares para la administración parentera.í, tal como subcutánea, de la insulina administrada como una co- formulación con una enzima degradadora de hialuronano para proporcionar un control glicémicó continuo son desde en o aproximadamente 0.001 U/kg a 0.30 U/kg, tal como 0.001 U/kg, 0.005 U/kg, 0.01 U/kg,. 0.02 U/kg, 0.05 U/kg a 0.30 U/kg,' tal como 0.05 U/kg, 0.0'6 U./kg, 0.07 U/kg, 0.08 U/kg, 0.09 U/kg, 0.10 U/kg, 0.11 U/kg, 0.12 U/kg, 0.13 U/kg, 0.14 U/kg, 0.15 U/kg, 0.20 U/kg, .0.25 U/kg, 0.30 U/kg,. 0.40 U/kg, .0.50 U/kg o 1.0 U/kg. La dosificación particular depende de la enfermedad, el tiempo :de . administración, y el individuo. Si es necesario, la. dosificación se determina empíricamente.

Se entiende que la dosificación y duración precisa del tratamiento es una función de la diabetes que se trata y que se puede determinar empíricamente usando, los protocolos de prueba conocidos o por la extrapolación de los datos de prueba in vivo o in vitro. Cabe destacar que los valores de dosificación también pueden variar con la gravedad de la diabetes y otros factores, tales como metabolismo, ingesta de alimento y peso corporal del sujeto. Se va a entender adicionalmente que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajusfar .a través del tiempo de acuerdo con la necesidad del individuo y la evaluación profesional de la persona que administra' o supervisa la administración de las . composiciones, y que los intervalos de concentración expuestas en la presente sean ejemplares solamente y no se propongan para limitar el alcance o uso de las composiciones o combinaciones que los contiene. Las composiciones se pueden administrar cada minuto, cada varios minutos, cada hora, diariamente, semanalmente, mensualmente , al año o una vez dependiendo del sujeto y el estado diabético. Generalmente, los regímenes de dosificación se eligen para limitar la toxicidad y/u otros efectos negativos, tal como la insulina en exceso. Cabe destacar que. el médico que atiende sabría cómo y cuándo terminar, interrumpir o. ajustar la terapia a una dosificación más baja. A la inversa, el médico que atiende también sabría cómo y cuándo ajustar el tratamiento a niveles más altos si la respuesta que indica no es la adecuada (excluyendo los efectos secundarios tóxicos) .

Modo de administración a. Jeringas o Viales Las formulaciones o co-formulaciones proporcionadas en la presente pueden administrar parenteralmente a un sujeto que usa uno "o más de varios modos de administración, incluyendo, pero no limitado a, jeringas, viales 1 u otros recipientes adecuados para formulaciones de una. dosis . o múltiples dosis. Por ejemplo, las jeringas de' un solo uso, incluyendo jeringas de insulina, se pueden usar para administrar las inyecciones discretas, por ej.emplo, inyecciones de bolo, de las composiciones... Las jeringas útiles para . la administración de las '. composiciones proporcionadas en la presente incluyen jeringas - de insulina., que se pueden diseñar para. contener concentraciones estándares de preparaciones de insulina,, incluyendo 100 U/ml de concentraciones de. preparaciones de insulina, tienen ¦marcas en las unidades de insulina, para ¦ facilidad de administración. b . Pluma de Insulina Una pluma de insulina es un sistema de administración que se puede usar para administrar las có-formulaciones proporcionadas en la presente. Las plumas de insulina incluyen aquellas con . cartuchos reemplazables rellenados con la composición que se. administra y aquellas con cartuchos no reemplazables. Las plumas de insulina con . cartuchos . no reemplazables están dispuestas típicamente de cuando el cartucho sea vaciado. Las plumas de insulina permiten la dosificación en, por ejemplo, la mitad de la. unidad, una unidad o dos incrementos de unidades, que se.; miden generalmente usando un dial de dosificación u otro mecanismo para ajustar la dosis {véase por ejemplo Patentes de E.U.A. Nos. 5,947,934, 6,074,372, 6, 110 , 149, .6, 524 , 280, 6,582,404). La co-formulación luego se administra por medio de una; aguja fina unida a la pluma. Las plumas de insulina son bien conocidas en el campo e incluyen aquellas descritas en cualquier lugar, incluyendo, pero no limitado a, · aquellas descritas en las Patentes- de E.U.A Nos . 5 , 947 , 934 , 4, 973, 318, 5, 462, 535, 5, 599, 323, 5, 626, 566, .5, 984, 906,. 6, 074, 372, 6,110,149, 6,302,869, 6,379,339 y 7,241,278). Otros dispositivos similares, tales como por ejemplo, aquellos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,947,934, 6,074,372, 6,110,149- y 6,379,339 también se pueden usar para administrar las composiciones proporcionadas en la presenté, ya sea como una co-formulación de insulina y enzima degradadora de hialuronano o separadamente como una composición de insulina y una composición de enzima degradadora de hialuronano. En algunos ejemplos, la- pluma . de insulina o dispositivos similares también contienen. un sensor o monitor que puede medir el nivel .de glucosa en . la sangre del sujeto {véase por ejemplo WO2003047426) .

Las plumas de insulina y los dispositivos de administración similares que se pueden usar, o modificados para ser usados, para administrar las co-formulaciones administradas en . la presente son bien conocidos en el campo e incluyen, pero no se limitan a, aquellos comercializados bajo las marcas comerciales AutopenMR (Owen Mumford, Inc.), Disetronic Pen (Disetronic Medical Systems), HumalogMR Pen (Eli Lilly and Company) , HumalogMR Mix 75/25 Pen, (Eli Lilly y Company), HumulinMR 70/30' Pen (Eli Lilly y Company) , HumulinMR N Pen (Eli. Lilly y Company), NovologMR FlexPen (Novo Nordisk), NovoPenMR 3 (Novo Nordisk), NovoPenMR 4 -. (Novo Nordisk)., NovoPen™ Júnior (Novo Nordisk), NovologMR Mix 70/30 FlexPen (Novo Nordisk), InDuoMR (Novo Nordisk), NovolinMR InnoLetMR: (Novo Nordisk), InnovoMR (Novo Nordisk), OptiPenMR (Sanofi-Aventis) OptiPenMR Pro2 (Sanofi-Aventis) , OptiSetMR (Sanofi-Aventis) y SoloSTARMR (Sanofi-Aventis ) . c. Bombas de insulina y otros dispositivos de administración de insulina.

Las co-fo.rmulaciones proporcionadas en . la presente se pueden administrar · a un sujeto diabético usando un dispositivo de administración de insulina, tal como' una bomba de insulina u otro dispositivo de. infusión continua similar. Los dispositivos de administración de insulina contienen típicamente, por lo menos un depósito dese.chable que contiene una formulación de insulina, una bomba (que incluye cualquiera de los controles, software, módulos de procesamiento y/o baterías) y un conjunto de infusión desechable, que incluye una cánula o aguja para la.. inyección subcutánea y un tubo que conecta la cánula o aguja al depósito de insulina .' Para el uso para las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente, el dispositivo de administración de. insulina puede contener un . depósito que .contiene la insulina co-formulada y la enzima degradadora de hialuronano. Las co-formulaciones se, pueden administrar continuamente o en inyecciones de bolo. Además, un usuario del dispositivo de administración . de insulina tiene la capacidad de influir en el. perfil de la insulina al ; formar el bolo. Por ejemplo, un bolo estándar¦ se puede administrar, que es una infusión similar a una inyección discreta en que toda la dosis se bombea inmediatamente. Un bolo prolongado es una infusión lenta a... través del tiempo que evita una dosis inicial alta y prolonga la acción de la composición. El bolo ¦de combinación que contiene tanto un bolo estándar como un bolo prolongado también se puede administrar usando una bomba de insulina u otro sistema de administración continúa. Los dispositivos de administración de insulina son conocidos en el campo se describen en cualquier lugar, incluyendo, pero no limitado a, en las Patentes dé. E.U.A. Nos. 6, 554, 798, 6, 641, 533, 6, 744, 350, 6, 852, 104,. 6, 872, 200, 6, 93,6, 02.9, 6,979,326, 6,999,854, 7,025,713 y 7,109,878. Los dispositivos de administración de. insulina también se pueden conectar a un monitor o sensor de glucosa, y/o pueden contener un medio •para calcular la dosis de insulina recomendada basado en los niveles de glucosa en la sangre, contenido de carbohidratos de una comida, u otra entrada. Los dispositivos de administración de . insulina adicionales pueden er implantarles p pueden estar externos al sujeto., d. Sistemas de Bomba de Infusión Continua Un dispositivo de administración de insulina para el uso con las co-formulaciones en la presente incluye una bomba de insulina u otros dispositivos similares capaces de la infusión de insulina subcutánea continua. Los dispositivos de administración de insulina, incluyendo sistemas de circuito abierto y circuito cerrado, contiene típicamente por lo menos un depósito desechable que contiene una. co-formulación de insulina, una bomba, (que. incluye cualquiera de los controles, software, módulos. de ' procesamiento y/o baterías) ' y un conjunto de infusión : desechaba, que incluye una aguja o cánula para la inyección subcutánea y un tubo que conecta la cánula o aguja al depósito de insulina. Los dispositivos de administración de circuito cerrado incluyen adicionalmente un monitor o sensor de glucosa. El dispositivo de administración de insulina puede contener un depósito que contiene una co-formulación de insulina de acción, súper rápida de insulina y una enzima degradadora de hialuronano.

Las. co-formulaciones de insulina se pueden administrar continuamente y/c en¦ inyecciones de bolo. · Los ·. usuarios ajustan la bomba para proporcionar una cantidad , de goteo constante o "basal" de formulación de insulina' continuamente por todo el día. Las bombas también liberan dosis adicionales ("bolo") de formulación de insulina en las comidas , y en los tiempos cuando el azúcar en la sangre es demasiada alta basada en una. entrada de usuario. La supervisión de la glucosa en la sarigre frecuente es esencial para determinar las dosificaciones de insulina, y para asegurar que la insulina se' administré apropiadamente. Esto se. puede lograr por supervisión manual, un monitor de glucosa separado contenido. Además, un usuario del.. dispositivo de administración de insulina tiene¦ la capacidad de influir en el perfil de la insulina al formar el bolo. Por ejemplo, se puede administrar un bolo estándar, que es ·. una' infusión similar a una inyección . discreta en que toda, la dosis se bombea inmediatamente. Un bolo prolongado es una infusión lenta a través, del tiempo que evita una dosis inicial alta, y prolonga la acción de la composición. Un bolo de combinación que contiene tanto un bolo estándar y como un bolo prolongado también se puede administrar usando una bomba de insulina u otro sistema de administración continua.

Los dispositivos de administración de insulinas son conocidos en el campo y se describen, en cualquier lugar, incluyendo, pero no limitado a, en¦ las Patentes de E.U.A. Nos. 6,55.4,798, 6, 641,533, 6, 744,350, 6,852,10,4, 6, 872,200, 6,936,029, 6,979,326, 6,999,854, 7,025,713 y 7, 109, 878. Los dispositivos de. administración de insulina también se conectan a un monitor o sensor de glucosa,' por ejemplo, un sistema de circuí Lo cerrado y/o puede contener un medi.o para calcular la dosis, de , insulina recomendada con base en los niveles de glucosa, en la sangre, contenidos de1 -.carbohidratos de una comida, u otra entrada. . Los dispositivos de administración de insulina adicionales pueden- ser implementables o pueden ser externos al sujeto. El uso de bombas de infusión de insulina externas requiere una selección cuidadosa de' individuos, supervisión /meticulosa,, y educación completa, y seguimiento permanente a .largo plazo. Este cuidado se proporciona generalmente por un equipo multidisciplinario de profesionales de la salud con pericia y experiencia específica en el manejo de individuos en el tratamiento de bomba de insulina. i. Sistemas de Circuito Abierto Los sistemas de circuito abierto, se pueden usar con las co-formulaciones proporcionadas en la presente.- Los sistemas de circuito abierto contienen típicamente por lo menos un depósito desechable. que contiene una formulación de insulina, una bomba (incluyendo cualquiera de controles, .software, módulos de procesamiento y/o baterías) y un conjunto de infusión desechable, que incluye una cánula o aguja para inyección subcutánea y . un tubo que conecta la cánula o aguja al depósito de insulina. El- sistema de circuito abierto infunde en dosis pequeñas (básales) . cada cinco minutos .y dosis grandes (bolo) que el paciente ajusta manualmente. Pero, un sistema de circuito abierto no. contiene generalmente un. monitor o sensor de glucosa y por lo tanto no puede responder a los cambios en los niveles de glucosa en suero del paciente .. Varios métodos y dispositivos usados para medir los niveles de glucosa en la sangre son conocidos por. una persona de experiencia en el campo. La técnica convencional usada por muchos diabéticos para supervisar personalmente sus niveles de glucosa en la sangre incluye la extracción periódica de sangre, la aplicación de la sangre a una tira de prueba, y la determinación del nivel de . glucosa en la sangre usando detección¦ calorimétrica, electroquímica o fotométrica. Se han desarrollado una variedad de dispositivos para supervisión continua o automática de analitos, tales como glucosa, en el torrente sanguíneo o fluido intersticial. Algunos de estos dispositivos usan sensores electroquímicos que se implantan directamente en un vaso sanguíneo o en tejido subcutáneo de un paciente. Los métodos y dispositivos ejemplares para supervisar los niveles de glucosa incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en las Patentes.de E.U.A. - Nos. 5,001,054, 5,009,230,, 5,713,353, 6,560,417, 6, 574, 490, 6, 892,-085, 6, 958, 809, 7,299, 081, 7, 774, 145, 7,826,879, 7,857,760 y 7,885,699, que se incorporan en la presente a manera de referencia.

Los sistemas de administración de insulina, tales, como ¦bombas dé insulina son conocidos en el. campo y se pueden usar en los sistemas de circuito abierto. Los dispositivos de administración de insulina de circuito . abierto ejemplares (tales como aquellos descritos en lo anterior) incluyen, pero no se limitan a, aquellos, descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,562,751, 4,678,408, 4 , 685 , 903 , , 373 , 527 , 4,573,994, .6,554,798, 6,641,533, 6,744,350, . 6,852,104, 6,872,200, 6, 936, 029, 6, 979, 326, . 6, 999, 854, 7, 109,878, 7, 938, 797 .'y 7,959,598, que se incorporan a manera de referencia en la presente. Estos sistemas similares, identificables fácilmente por una persona experta en el campo., . se pueden 'usar para administrar las co-formulaciones proporcionadas. en la presente. Los dispositivos de administración, de insulina contienen típicamente uno o más depósitos, que generalmente son desechables, que contienen una . preparación dé insulina, tal como una co-formulación de una insulina de acción rápida .y enzima degradadó'ra de hialuronano descrita en la présente. En algunos ejemplos,, las co-formulaciones se administran usando un tubo de infusión y una cánula y aguja. En otros ejemplos, el. dispositivo de infusión se une directamente a la piel y. las co-formulaciones fluyen del dispositivo de infusión, a través de una cánula o- aguj a : directamente en el cuerpo sin el uso . de un tubo. En ejemplos adicionales, el dispositivo de infusión está interno al cuerpo y se puede usar un tubo de infusión opcionalmente para administrar las co-formulaciories . ii. Sistemas de Circuito Cerrado Los sistemas de circuito cerrado, algunas veces referidos como un páncreas artificial son de. interés particular con para el uso con las co—formulaciones proporcionadas en la presente. Los sistemas . de circuitos cerrados se refieren a sistemas con un monitor de. glucosa continuo integrado, una bomba de insulina u otro sistema de administración y controlador que incluye un algoritmo matemático que calcula constantemente la infusión de insulina requerida para el control, glicémico basado en las mediciones del tiempo real de ios niveles de glucosa en la sangre. Estos sistemas, cuando, se optimizan, pueden facilitar el control glicémico constante y muy estrecho, similar a la respuesta de insulina natural' y el control glicémico observado en los sujetos no diabéticos sanos. Para ser efectivos, sin. embargo, los sistemas de circuito cerrado requieren tanto supervisión de glucosa continua confiable y precisa, y la administración de una insulina con una acción muy rápida. Por ejemplo, los retrasos en la absorción de insulina y la acción asociada con la administración subcutánea de las insulinas de acción rápida se pueden conducir a excursiones glicémicas pos-prandiales grandes (Hovorka y colaboradores (2006) Diabetic Med. 23:1-12). El retraso debido a la absorción de nsulina, la acción de la insulina, cinética de glucosa intersticial, y tiempo de transporte para los sistemas de supervisión basados en ex vivo, tales cómo aquellos basados en la técnica de micro diálisis, pueden dar por resultado un lapso de tiempo de 100 minutos o más total del tiempo de la administración de insulina al pico de su efecto reductor de glucosa detectable (Hovorka y colaboradores (2006) Diabetic . Med. '.23 1-12 ) . De esta manera, una. vez 'administrada, la insulina continuará incrementando su efecto medible por casi 2 horas. Esto puede complicar la reducción efectiva de la concentración de glucosa después de ' la ingestión de la . comida usando un sistema de circuito cerrado. Primero, tiene que ser detectado un incremento . de glucosa. Sin embargo, esto, sucede típicamente solo después de un lapso · de 10-40 minutos aproximados. El sistema debe determinar que se ha digerido la comida y administrar una dosis de insulina apropiada. La capacidad del sistema para compensarse secuencialmente una dosis de insulina . "mal calculada" es comprometida '· por retrasos largos y la incapacidad de "extraer" la insulina una vez administrada. Estos problemas, por lo menos en parte, se pueden . superar- al usar las co-formulaciones de una insulina de acción rápida y la enzima degradadora de. hialuronanó, tales como aquellas proporcionadas en la presente, que pueden mostrar, una velocidad y nivel incrementado de absorción y una mejora asociada en la farmacodinámica (véase por ejemplo US20090304665 y WO2009134380) . Las co-formulaciones de la insulina de acción rápida ' y una enzima degradadora de hialuronanó tienen una tma x reducida (es. decir logran una concentración máxima más rápida) que las insulinas de acción rápida sola y que están controlando los niveles de glucosa en la sangre más rápido . que las insulinas de acción rápidas solas. Esta velocidad incrementada de absorbancia e inicio de acción reduce el. lapso entre la acción de la .insulina y la supervisión de la glucosa y la entrada, dando por resultado un sistema de circuito cerrado más efectivo que pueda controlar estrechamente los niveles de glucosa en la sangre, reduciendo las excursiones glicémicas.

Los sistemas de circuito cerrado son bien conocidos en el campo y se han descrito en cualquier lugar, .incluyendo, pero no limitado a, Patentes de. E.U.A. Nos. 5,279,543, 5,569,186, 6,558, 351, 6,558,345, 6,589,229, 6,669,663, 6, 740, 072, 7, 267, 66.5 y 7, 354, 420, que se incorporan a manera de referencia en la presente. Estos sistemas similares, identificables fácilmente por una persona de experiencia en el campo, se pueden usar para administrar · las co- formulaciones proporcionadas en la presente. Los sistemas de circuito cerrado incluyen un sistema sensor para medir los niveles de glucosa en la sangre, un controlador y un sistema de administración. Este sistema integrado se diseña para un modelo de células beta pancreáticas (célula ß),. tal, que controla un dispositivo de infusión para administrar la insulina en un sujeto en un perfil de concentración similar como seria creado por las células ß humanas totalmente en función cuando responden a cambios, .en las concentraciones de glucosa en la sangre en el- cuerpo. De esta manera, el sistema simula la respuesta, de insulina¦ natural del cuerpo a los niveles, de glucosa en la. sangre y no solo hacen eficiente el uso de la insulina, sino también toma en. cuenta otras funciones corporales también puesto que la insulina tiene efectos tanto metabólicos como mitogénicos. Además, el control glicémico logrado usando un sistema de circuito cerrado se logra sin requerir ninguna información acerca del tamaño y tiempo de una comida u otros, factores. El sistema puede depender solamente en las mediciones de glucosa en la sangre en tiempo real. El · sensor de glucosa genera una señal del sensor representativa de los niveles de glucosa en la sangre en el cuerpo, . y proporciona la señal del sensor al controlador. El controlador recibe, la señal del sensor y genera, comandos . que se -comunican al sistema de administración de insulina. El sistema de administración; de insulina recibe los comandos e infunde la, insulina en el cuerpo, en respuesta a los comandos. Se proporcionan a continuación descripciones de los componentes ejemplares de los sistemas de. circuito cerrado que se pueden, usar para administrar las '. co-formulaciones de la insulina de acción rápida y una enzima degradadora de h.iáluronano proporcionada en la presente. Se entiende que uno de experiencia en el campo puede identificar fácilmente sistemas de circuito cerrado para las co-formulaciones. Estos, sistemas se han descrito en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, aquellos descritos en la Patente de E: u.A. . Nos. 5,279,543, 5,569,186, . 6,558,351, 6,558,345, 6,589,229,' 6, 669, 663, 6, 7.40,072, . 7, 267, 665 y 7,354,420. Los componentes individuales de los sistemas también se han descrito en el campo-, individualmente y en el contexto dé un sistema de circuito cerrado para el uso en el logro del control glicémico. Se entiende que los ejemplos proporcionados en la presente son ejemplares solamente, y que otros sistemas de circuito cerrado o componentes individuales se pueden usar para administrar las co-formulaciones proporcionadas en el presente.

Los sistemas de circuito cerrado contienen un sensor . o monitor de glucosa que funciona . continuamente. ¦·. Estps dispositivos pueden contener sensores de tipo aguja que se insertan bajo la piel y se unen a un transmisor pequeño que comunica los datos de glucosa inalámbricamente por telemetría de radio frecuencia a un receptor pequeño. En algunos ejemplos, el sensor se .inserta a través de. la piel del sujeto usando una aguja de inserción que se remueve y se elimina una vez que el sensor se coloca en el tejido subcutáneo. La aguja de inserción tiene una punta aguda y una ranura abierta para contener el sensor durante la inserción en la piel (véase por ejemplo Patente de E.U.A. Nos. 5,586,553 y 5,954,643). El sensor usado en el sistema de circuito cerrado puede contener opcionalmente tres electrodos que se . exponen al fluido intersticial (ISF) en el tej.ido subcutáneo. Los tres electrodos incluyen un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y contra electrodo que se usan para formar un circuito. Cuando se suministra un voltaje apropiado a través del electrodo de. trabajo y el electrodo de referencia, el. ISF proporciona impedáncia entre los electrodos. Una señal' de corriente análoga fluye desde .el electrodo de trabajo a través del cuerpo y al contra electrodo. El voltaje en el electrodo de trabajo se mantiene generalmente a tierra, y el voltaje en el electrodo de' referencia .se mantiene en ' un voltaje predeterminado Vset, tal. como, por ejemplo entre 300 y 700 mV. La reacción más prominente estimulada por la diferencia de voltaje entre los electrodos es la reducción de glucosa ya que el primero reacciona con la enzima glucosa oxidase (GOX) para generar el ácido glucónico y peróxido de hidrogeno (H202) . Luego el H202 se reduce a agua (H20) y (0") en la superficie .del electrodo de trabajo. El. O", extrae una carga positiva de los componentes eléctricos del sensor, repeliendo de esta manera un electrón y. provocando un flujo de corriente eléctrica. Esto da por resultado la. señal de corriente análoga, que es proporcional a la concentración de glucosa en el ISF que está en contacto con los electrodos- del sensor (véase por ejemplo Patente de E.U.A. No. 7,354,420) . .

En algunos ejemplos, más de un sensor se usa para medir la glucosa en la sangre.. Por ejemplo, se pueden usar sensores redundantes y al sujeto se le puede notificar cuando un sensor falla por. la electrónica del transmisor de monitor característica, de . telemetría . Un . indicador también, puede indicar al sujeto ¦ de cuál de los sensores aún está funcionando y/o el número de sensores que aún están funcionando. En otros ejemplos, las señales del¦ sensor se combinan a través de pfe-promedio u otros medios. Además, se pueden usar diferentes tipos de sensores. Por. ejemplo, ün sensor de glucosa interior y un sensor de glucosa externo se pueden usar para medir la glucosa en la sangre al mismo tiempo.

Los¦ sensores de glucosa que se pueden usar en un sistema de circuito cerrado . son bien conocidos y se pueden identificar fácilmente y/o opcionalmente , . modificar adicionalmente, por una persona de experiencia en el campo.. Los sensores de glucosa internos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,497, 772, 5, 660, 163, 5, 791, 344 , ' 5, '569, 186. y 6, 895, 265. Ejemplar de un sensor, de glucosa que usa fluorescencia es aquel descrito en la de E.U.A. No. 6,011,984. Los sistemas del sensor de glucosa también pueden . usar otras . tecnologías de detección, incluyendo haces de luz, conductividad, muestreo por chorro, micro diálisis, microporación, muestreo ultra sónico, iontoforesis inversa, u otro método (por ejemplo Patentes de E.U.A. Nos. 5,433,197 y 5,945,676, y Publicación de Patente Internacional . WO 19.9929230) . En algunos ejemplos, solo el electrodo de trabajo se sitúa en el tejido subcutáneo y en contacto con el ISF, y los contraelectrodos y los electrodos de referencia se localizan externos al cuerpo y en contacto con la piel. El contraelectrodo y el electrodo de referencia se pueden situar sobre la superficie de .un alojamiento del monitor y se puede mantener a la piel como parte de un monitor característico de telemetría. En ejemplos adicionales, el contra-electrodo y el electrodo de referencia se mantienen en la piel usando otros dispositivos, tal como corriendo un alambre a los electrodos y adhiriendo los electrodos a la piel, incorporando los electrodos en la 'parte 'inferior de un reloj que toca la piel. Además, más de un. trabajo se puede colocar el' tejido subcutáneo para redundancia. El fluido intersticial también se puede recolectar, del cuerpo de un sujeto y hacer fluir sobre un sensor externo que no se implanta en el cuerpo-.

El controlador recibe la entrada del sensor de glucosa. El controlador se diseña para modelar una célula . beta pancreática (célula, ß) y proporciona comandos a dispositivos de administración de insulina para infundir. la- cantidad requerida de insulina para el ¦ control glicémico. El controlador . usa . software con algoritmos para, calcular la cantidad requerida de insulina con base en los niveles de glucosa detectados por el sensor de glucosa. Los algoritmos ejemplares incluyen- aquellos que modelan las células ß estrechamente, puesto que los algoritmos que se diseñan. para minimizar las excursiones de glucosa en el cuerpo, sin considerar que tanta insulina se administra, pueden provocar ganancia de peso excesivo, hipertensión, y arterosclerosis . Típicamente, el sistema se propone . para emular el. patrón de insulina, in. vivo y para ajustar un patrón consistente con la adaptación de células' ß in vivo experimentadas por . los individuos sanos normales. Los algoritmos de control para los sistemas de circuitos cerrado incluyen aquellos usados por un controlador de derivado¦ integral proporcional (PID) . Los controladores derivados proporcionales y los algoritmos de control predictivo de modelo (MPC) también se pueden usar en algunos sistemas (Hovürka y colaboradores (2006) Diabetic Med. 23:1-12). Los algoritmos ejemplares incluyen, pero rio se limitar, a, a aquellos descritos por Hovorka y colaboradores {Diabetic Med. (2006) 23: 1-12), Shimoda y colaboradores, (Front Med Biol Eríg (1997) 8: 197-211), ' Shichiri y colaboradores [Artif. . Organs (1998) 22:32-42) , ·. Steil -y colaboradores .{Diabetes Technol Ther (2003). 5: 953- 964.), Kaletz y colaboradores, {Acta Diabetol. (1999) 36:215) y las Patentes de E.U.A. Nos.. 5,279,543, 5, 569,186, 6,558,35.1, 6, 558, 345, 6, 589, 229, 6, 740, 042,. 6, 66.9, 663, 6, 740, 07.2, 7,267,665 y 7,354,420 y la Publicación de Patente de E.U.A. No. 20070243567 En un ejemplo, un controlador PID se usa en el sistema de circuito cerrado.' Un controlador PID ajusta continuamente la infusión de insulina al evaluar las excursiones de glucosa desde tres puntos de vista a: la salida de la . glucosa objetivo (el componente proporcional), el área bajo la curva entre la glucosa, ambiental y. objetivo (el componente integral) , y el cambió en - la glucosa ambiental (el componente derivado) . Generalmente, la respuesta de. células ß in vivo, a los cambios¦ en la. glucosa se caracteriza . por las respuestas de insulina de "primera" y "segunda" fase. La respuesta de insulina bifásica de una célula ß se puede modelar usando los componentes de un controlador proporcional, más integral, más derivado (PID) {véase por ejemplo Patente de E.'U.A. No. 7, 354, 420) .

El controlado genera comandos para la administración de insulina deseada. Los sistemas de administración de insulina, tales como bombas de insulina, son conocidos en el campo y se pueden usar en los sistemas de circuito cerrado. Los dispositivos de administración de insulina ejemplares (tales como aquellos descritos en lo anterior) incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,562,751, 4,678,408, 4,685,903, 4,373,527, 4,573,994, 6, 554, 798, 6, 641, 533, 6,744, 350, .6, 852, 104,. . 6, 872, 200, 6, 936, 029, 6, 979, 326, 6, 999, 854, 7, 025, 713 y 7 , 109, 878. ' Los dispositivos de .administración de insulina contienen típicamente uno o más depósitos, que. generalmente son désechables, que contienen una preparación de insulina, tal como una co-formuiación de una insulina de acción rápida y enzima degradadora de hialuronano descrita en la presente. En algunos ejemplos, las co-formulaciones se. administran usando un tubo de infusión c una cánula o aguja.. En otros ejemplos, el dispositivo de infusión se une directamente a la 'piel ^ y las co-formulaciones fluyen del dispositivo de. infusión, a través de una cánula o aguja directamente en el cuerpo sin el uso de un tubo. En ejemplos adicionales,, el dispositivo de infusión está interno al' cuerpo y el tubo de infusión se puede usar opcionalmente para administrar las co-formulaciones. Los sistemas de circuito cerrado también pueden contener componentes adicionales, incluyendo, ' pero no limitado a, filtros, calibradores y transmisores.

H. MÉTODOS PARA PRODUCIR ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN UNA INSULINA O ENZIMA DEGRADADORA DE HIALURONANO Y POLIPEPTIDOS DE LOS MISMOS Los polipéptidos de una insulina y una enzima degradadora de . hialuronano expuestos en la presente se .pueden obtener por los. métodos bien conocidos en el campo para purificación de proteínas y expresión de · proteínas recombinantes. Los polipéptidos también se pueden sintetizar químicamente. Por ejemplo, la cadena A y la cadena B de la insulina se pueden sintetizar químicamente y luego reticular por las ligaciones de disulfuro a través, por ejemplo, de una reacción de . reducción-reoxidación . Cuando los polipéptidos se producen por medios recombinantes, se puede usar cualquier método conocido por aquellas personas de experiencia en el campo para la identificación de ácidos nucleicos que codifican los genes deseados. Cualquier método disponible en la técnica se puede usar para obtener un cDNA de longitud completa (es decir que abarca la región de- codificación completa) o clon de DNA genómico que codifica una hialuronidasa, tal como de una fuente de células b tejido. Las insulinas modificadas o variantes o enzimas degradadoras de hialuronano se . pueden diseñar de un polipéptido de tipo natural, tal como por mutagénesis dirigida al sitio..

Los. polipéptidos se pueden clonar o aislando usando cualquiera de los. métodos disponibles conocidos en el campo para clonar o aislar, moléculas de ácido nucleico. Estos métodos incluyen amplificación por PCR de ácidos nucleicos y clasificación de bibliotecas, incluyendo clasificación de hibridación de ácido nucleico, clasificación basada en anticuerpos y clasificación basada en actividad.

Los métodos para la amplificación de los ácidos nucleicos se pueden usar para aislar moléculas . de ' ácido nucleico que codifican un polipéptido deseado, incluyendo por ejemplo, métodos, de reacción' en cadena de la polimerasa (PCR) . Un material que contiene ácido nucleico se puede usar material de partida del cuál una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido deseado se puede aislar. Por ejemplo, la preparaciones de DNA . y mRNA, extractos de células, extractos de tejidos,- muestras de fluido (por ejemplo sangre, suero, saliva) y muestras de sujetos- sanos y/o enfermos se pueden usar en los métodos de amplificación. Las bibliotecas de ácido nucleico también se pueden usar como una fuente de material. Los cebadores se pueden diseñar para amplificar un polipéptido deseado.. Por ejemplo, los cebadores se pueden diseñar con base en las, secuencias¦ expresadas n las cuales se genera un polipéptido deseado. Los cebadores se pueden diseñar con base en la traducción posterior de una secuencia de aminoácidos de polipéptido. Las moléculas de ácido nucleico generadas por la amplificación se. pueden secuenciar y confirmar para codificar un polipéptido¦ deseado .

Las secuencias de nucleótidos adicionales se pueden unir a una molécula, de ácidó nucleico que codifica el polipéptido, incluyendo secuencias ligadoras que contienen sitios de endonucleasa de restricción para propósito de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteínas o un vector · diseñado para la amplificación de las secuencias de DNA de codificación de proteína núcleo. Además,, las secuencias de nucleótidos adicionales que especifican los elementos de DNA funcionales se puéden ligar relativamente a una molécula de ácido nucleico que¦ codifica el polipéptido. Ejemplos de estas secuencias incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras diseñadas para facilitar la expresión de la proteína intracelular , y las secuencias de secreción, por ejemplo · secuencias ¦ señal heterólogas diseñadas para facilitar la .. secreción de proteínas. Estas secuencias son conocidas ' por aquellas personas de experiencia en el campo. Las secuencias de residuos de nucleótidos adicionales tales como secuencias de bases que se especifican en las regiones de ligación a proteína también se pueden enlazar a las moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas. Estas regiones incluyen, pero no se limitan' a, secuencias de residuos que. facilitan o codifican las proteínas que facilitan la captación de la enzima en las células objetivo específicas, o de otra manera alteran la farmacocínética de · un producto de un · gen sintético. Por ejemplo, las enzimas se pueden ligar a las porciones de PEG.

Además, se pueden agregar etiquetas u otras porciones, por ejemplo, para ayudar en la detección o purificación por afinidad del polipéptido. Por ejemplo, las secuencias de residuos de nucleótidos adicionales tales; como secuencias de bases que especifican una etiqueta de epitopo u otro marcador detectable también se pueden ligar a las moléculas de ácido nucleico que codifican' enzimas. . Ejemplares de estas secuencias incluyen' secuencias de ácidos nucleicos que codifican una etiqueta His (por ejemplo, 6xHis, HHHHHH; SEQ ID NO:54) o etiqueta Flag (DYKDDDDK; SEQ . ID NO:55)..

Los ácidos nucleicos identificados, y aislados luego se pueden insertar en un vector de clonación apropiado.. Una gran variedad de sistemas de vector hospedero conocidas en el campo se pueden usar. Los vectores posibles incluyen, pero ño se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema del vector debe ser compatible con la célula hospedera usada. Estos vectores incluyen pero ño se limitan a, . bacteriófagos tales como derivados larnbda, o plásmidos tales como pCMV4, pBR322 o pUC derivados de plásmido o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) . Otros vectores de expresión incluyen el vector de expresión HZ24 ejemplificado en la presente. La inserción en un vector de clonación puede, por ejemplo, ser . lograda por la ligación del fragmento de DNA en un vector de clonación que tiene terminales cohesivas complementarias. L inserción se puede efectuar usando los vectores de clonación TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar ?1· DNA no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de DNA se pueden modificar enzimáticamente . Alternativamente, cualquier sitio deseado se puede producir . al ligar las secuencias de . nucleótidos (ligadores) en las terminales de DNA; estos ligadores ligados pueden contener oligonucleótidos químicamente, sintetizados específicos que codifican las secuencias de reconocimiento de endonucleasa de restricción. En un método alternativo, el vector y el gen de proteínas escindidos se pueden modificar por la cola homopoiimérica . Las moléculas . recombinantes también se pueden introducir en las células hospederas a través, por ejemplo, de transformación, transíección, infección, electroporación y sonoporación, de modo que se generan muchas copias de la secuencia de genes.

La insulina se puede producir usando una variedad de técnicas (véase,, por ejemplo Ladisch y colaboradores (1992) Biotechnol. Prog. 8 : 69-478) . En algunos ejemplos, el . ácido nucleico que codifica un polipéptido de preproinsulina o proinsulina se inserta en un vector de- expresión. En. la expresión, el polipéptido de preproinsulina o proinsulina se convierte a insulina por métodos énzimáticos o químicos que escinden la secuencia de señal y/o- el péptido C, dando por resultado las cadenas A y B que se reticulan . por las ligaciones de disulfuro- a través de, por ejemplo, una reacción de reducción - reoxidación, (véase, por ejemplo Cóusens y colaboradores, (1987) Gene 61:265-275, Chance' y colaboradores, (1993). Diabetes Care 4:147-154).' En otro ejemplo, el ácido nucleico que codifica la cadena A . y la cadena B de una insulina se inserta en uno o dos vectores de expresión para la co-expresión como un solo polipéptido de un vector de expresión o expresión como dos polipéptidos de uno o dos vectores de expresión. De esta manera, los polipéptidos de cadena A y B se pueden expresar separadamente y luego combinar para generar una insulina, o se pueden co-expresar, en ausencia de una. cadena C. En casos donde las' cadenas A y B se co-expresan como un solo polipéptido, el ácido nucleico que codifica las subunidades también puede codificar un ligador o espaciador entre la cadena B y la cadena A, tal como un ligador o espaciador descrito posteriormente. El ácido nucleico insertado en el vector de expresión puede contener, por ejemplo, ácido nucleico que codifica la cadena B de insulina, un ligador, tal como por ejemplo, un ligador de . alanina-alanina-lisina, y la cadena A, dando por' resultado la expresión de, por ejemplo, "cadena B de insulina-Ala-Ala-Lys-cadena A de insulina".

En modalidades especificas,' la transformación de las células hospederas con las moléculas de DNA recombinante que incorporan el gen de p'roteina aislado,. cDNA, o la secuencia de . DNA sintetizado permite la generación de múltiples copias del gen. De esta manera, el gen se puede ' obtener en grandes cantidades al desarrollar transformantes, al aislar las moléculas de DNA recombinante de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperar el gen insertado ' del DNA recombinante aislado. 1. Vectores y células Para la expresión recombinante de una o más de las proteínas deseadas, tal como cualquiera descrita en el presente, el ácido . nucleico que contiene , todo o una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína se puede insertar en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación de proteína insertada. . Las señales trans.cripcionales 'y traduccionales necesarias también se pueden suministrar por el promotor nativo para los genes de enzimas, y/o sus regiones de flanqueo.

También se proporcionan vectores que contienen un ácido nucleico que codifica la enzima. Las células que' contienen los vectores también se proporcionan. Las células incluyen células eucarióticas y procarióticas , y: los vectores son cualquier adecuado para el uso en la presente.

Se proporcionan células procarióticas y- eucarióticas, incluyendo células . endoteliales , que' contienen los vectores. Estas células incluyen células, bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Archea, células dé planta, células de insecto y células animales. Las células se usan para producir una proteína de la misma al desarrollar las células descritas en lo anterior bajo condiciones mediante las cuales la proteína codificada se expresa por la célula, y al recuperar la próteína expresada. Para propósitos en. la presente, por ejemplo, la enzima se puede secretar en .el medio .

Se proporcionan vectores que contienen una, secuencia de nucleótidos que - codifica el polipéptido de hialurohidasa soluble acoplado a la secuencia de señal nativa o heterólogá, asi como múltiples copias de la misma. Los vectores se pueden seleccionar para la expresión de la proteina enzimática en .la célula o tal que la proteina enzimática se expresa como una proteina secretada.

Se puede usar, una variedad, de sistemas de hospedero-vector para expresar la secuencia de codificación de proteina. Estos incluyen, pero no se limitan a sistemas . de células de mamífero infectadas con virus (por ejemplo, virus de vaccinia, adenovirus y otros virus) sistemas de células de insecto infectados con virus (por ejemplo, baculovirus ). ; microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levadura, o bacterias transformadas con bacteriófagos, DNA, DNA plásmido, o DNA cósmido. Los elementos de expresión de los vectores varían .en sus resistencias, y especificidades. Dependiendo del sistema de hospedero-vector usado, s puede usar cualquiera de una variedad de elementos de¦ transcripción y traducción adecuados.

Cualquiera de los métodos conocidos por. aquellas personas de experiencia en el campó para la inserción de fragmentos de DÑA en un vector se pueden usar para ' construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que contiene señales de control transcripcionales y/o traduccionales . apropiadas y secuencias de codificación - de proteínas. Estos . métodos . pueden incluir DNA recombinante in vitro y técnicas sintéticas y ¦ recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de las secuencias de ácidos nucleicos codifica la 'proteína, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos de los mismos, se pueden regular por una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que los genes o fragmentos de los mismos se expresan en . un hospedero transformado con las moléculas de DÑA recombinante. Por ejemplo, la expresión de. las proteínas- se puede controlar por cualquier promotor/potenciador' conocido en el campo. En una modalidad específica, el promotor no es nativo a los genes para una proteína deseada. Los promotores que se pueden usar incluyen, pero no se limitan al promotor temprano SV40 (Bernoist y Chambón, Nature 290:304-310 (1981)),. el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del . virus de sarcoma R'ous (Yámamoto y colaboradores Cell '. 22:787-797 (1980) ), el promotor de herpes de timidina cinasa (Wagner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 78:1441-1445 (1981) ), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al,. N' ature 296:39-42 (1982)); los vectores de expresión procarióticos tales como el promotor .de . ß-lactamasa (Jay et al, (1981) Proc ' Nati Acad Sci EUA 78:5543)' o el promotor tac (DeBoer . y colaboradores, Proc, Nati. Acad. Ciencia. EUA. 80:21-25, (1983)), véase también "Useful Proteins from Recombinant Bacteria"-: in Scientific American 242:79-94 (1980)); vectores de expresión de plantas que contienen el promotor de. nopalina . sintetasa (Herrera-Estrella et al, Nature 303:209-213 .(1984)) /o el promotor de 35S de RNA del virus de mosaico de la coliflor (Gardner y colaboradores, Nucleic Acids.. Res. 9:2871 (1981),)., y el promotor de la enzima fotosintética ribulpsa bifosfato carboxilasa (Herrera- Estrella y colaboradores, Nature 310:115-120 (1984)); elementos promotores de levaduras y otros hongos tales como ' el promotor Gal4, el promotor de alcohol deshidrogenasa, el promotor de fosfoglicerol cinas'a, el promotor de fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control transcripcional animal que.' muestran especificidad de tejido y se han usado en animales transgénicos : región de control del gen elastasa I - que es activo en las células acinares pancreáticas (Swift y colaboradores, Cell 38:639-646 (1984); Ornitz y . colaboradores, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); región de control del gen de insulina que es activo. en células beta pancreáticas, : (Hanahan : y colaboradores, Nature 315 : 115-122 (1985) ) ,. región de control del gen de inmunoglobulina que. es activo en las células linfoides (Grosschedl et al, Cell .38 : 647-658 (1984) (Grosschedl y colaboradores, Cell 38:647-658 (1984); Adams y colaboradores, Nature 318:533-538 (1985); Alexander y colaboradores , Mol. Cell Biol. 7 : 1436-1444 (1987)), región de control del virus de tumor mamario de ratón qué' es activo en las células testiculares., de mama, linfoides y mastocitos (Leder y colaboradores, Cell 45:485-495 (1986.)), región de control del gen de albúmina que es activo en el hígado (Pinckert y colaboradores, Genes and. Devel. 1:268-27-6 (1987)), región de control del gen de alfa-fetopro.teína que es activo en el hígado' (Krumlauf y colaboradores,. Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer y colaboradores., Science 235:53-58 1987)), región de control del gén de alfa-1 antitripsina que. es activo en el hígado (Kelsey y colaboradores, .Genes and Devel. 1:161-171 (1987)), región de beta globina que¦ es activo en las células (Magram y colaboradores, Nature 315:338-340 (1985); ¦ Kollias y colaboradores, Cell 46:89-94 (1986)), Kollias et al, Cell 46:89-94 (1986)) región de control del gen de proteína básica de mielina qué es activo en las¦ células de oligodendrocitos del cerebro (Readhead y colaboradores, Cell 48:703-712 (1987)), región de control del gen de cadena 2 ligera de miocina que es activa en el músculo esquelético (Shani, Nature 314:283-286 (1985)), y región de control de gen de la hormona de liberación gonadotrópica que . es activa en los go.nadotrofos del hipotálamo (Masón . y colaboradores, Science 23 : 1372-1378 (1986) ) . .

En una modalidad especifica, se usa un vector que contiene un promotor ligado operablemente . a ácidos nucleicos que codifican una proteína deseada, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo, . del mismo, uno o más orígenes de replicación, y opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia .a antibióticos). Los vectores plásmidos ejemplares, para la transformación de .células de E. coli, incluyen, por ej.emplo, los vectores de expresión pQE (disponibles de Qiagen, Valencia, CA, véase también literatura publicada por Qiagen que describe el sistema) . Los vectores pQE. tienen un promotor T5. fago (reconocido por la RNA polimerasa de E. coli) y un módulo de represión operador lac doble ; ara proporcionar la expresión de alto nivel estrechamente, regulada de proteínas recombinantes en E. coli, un sitio de ligación , ribos.omal sintético (RBS II) para la traducción eficiente, una secuencia de codificación de etiqueta 6XHis, terminadores transcripcionales t0 y TI, origen . de replicación ColEl., y un gen beta-lactamasa para conferir resistencia a la ampicilina..

Los vectores pQE ' ermiten la colocación de una etiqueta 6xHis en el ya sea la N- o C-terminal de la proteina recombinante . Estos plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30, y . pQE 31 que proporcionan múltiple sitios de clonación para los tres marcos de lectura y proporcionan la expresión de las proteínas N-terminalmente etiquetadas a 6xHis. Otros vectores plásmidos ejemplares para la transformación de células, de E. coli incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pET (véase, Patente de EUA No. 4,952,496; disponibles de Novagen, Madison, . WI; véase, también la. literatura publicada . por Novagen que describe él sistema) . Estos plásmidos incluyen pET lia, que contiene el promotor T71ac:, , el terminador 7, el operador lac de E. coli inducible, y el gen represor lac; pET 12a-c, que contiene el promotor T7, el terminador T7, y la señal de secreción ompT de E . coli, . y pET 15b y . pET19.b (Novagen, Mádison,. WI), que contiene una secuencia líder His-TagMR para el uso en la purificación con una columna His y un sitio de escisión de trombina que. permite la escisión después de la purificación sobre la columna, la región promotora T.7-lac y el terminador T7.

Ejemplar de un vector para la expresión de células de mamífero es el vector de expresión : HZ24. El vector de expresión HZ24 se derivó de la cadena principal del vector pCI (Promega) . Contiene DNA que codifica el. gen . de resistencia a beta-lactamasa (AmpR) ,. un origen Fl de replicapión, una región potenciadora/promotora inmediata-temprana de citomegalovirus (CMV)', y una señal de poliadenilación posterior SV40 (SV40¦)¦'.· El vector de. expresión también tiene un sitio de entrada de ribosoma interno - (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de dihidrofolato reductasa de ratón (DHFR) . 2. Porciones Ligadoras En algunos ejemplos, la insulina se . prepara ' al generar los polipéptidos de cadena A y cadena B con un ligador, tal que, por ejemplo, la C-terminal de la cadena B se une a la N-terminal de la . cadena A por un ligador corto. La cadena A y la ; cadena B se pueden expresar de un solo polipéptido que contiene un ligador o pueden expresar separadamente y luego unir por un ligador. La porción ligadora se selecciona dependiendo de las propiedades deseadas. La porción ligadora debe ser suficientemente larga . y suficientemente- flexible para permitir que la cadena A y la cadena B imiten la conformación natural de- la insulina.

Los ligadores . pueden ser cualquier porción adecuada a la cadena A y cadena ;B de la insulina. Estas porciones incluyen, pero no se limitan a., ligaciones peptidicas; ligaciones de aminoácido y péptido, que contienen típicamente entre uno y aproximadamente -60 aminoácidos; ligadores químicos, tal como reticuladores escindibles heterobifuncionales , ligadores fotoescindibles y ligadores escindibles.

. Las porciones ligadoras. pueden ser péptidos. El' péptido tiene tipicamente . de aproximadamente 2 a aproximadamente · 60 residuos de aminoácidos, por ejemplo de aproximadamente 5 á aproximadamente 40, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 residuos de aminoácidos. Los ligadores peptidicos se pueden codificar convenientemente por ácido nucleico e incorporar en proteínas de fusión én la expresión en la célula hospedera,, tal como E. coli. En un ejemplo, el ligador de alanina-alanína-lisina (AAK) (SEQ ID NO: 178) se codificada en un ácido nucleico entre el ácido nucleico que codifica la cadena B de insulina y el ácido nucleico, que codifica la cadena A, tal que en la expresión, se produce un polipéptido de "cadena B de insulina-AAK-cadena A de insulina". Los ligadores peptidicos pueden ser una secuencia de aminoácidos espaciadora flexible, .tal ' como aquella conocida en la investigación del anticuerpo de cadena individual. Ejemplos de. estas porciones ligadoras conocidas incluyen, pero no .se limitan a, R.PPPPC (SEQ '.ID NO: 166) o SSPPPPC (SEQ ID NO:167), GGGGS (SEQ ID NO : 168 ) , 15 (GGGGS) . (SEQ ID NO: 169), GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO: 170.) , GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO:171), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO:172), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO : 173) , GSTSGSGKPGSGEGSTKG ¦ (SEQ ID NO : 174 ) ,. EGKSSGSGSESKEF (SEQ .ID NO:175), SRSSG (SEQ ID NO: 176·) y SGSSC (SEQ ID NO:177) .

Alternativamente, la porción ligadora de péptido puede ser VM (SEQ ID NO: 179) o AM (SEQ ID NO: 180), o . tiene la estructura descrita por la fórmula: AM (G2 a 4S)'Xam'en donde- X es un número entero de l a 11 (SEQ ID NO: 181) . Las porciones de ligación adicionales se describen, por ejemplo, en Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati.., Acad. . Sci. U.S. A. 85:5879-5883; Whitlow, M . , y colaboradores (1993) Protein Engineering . 6:989-995; Newton y colaboradores (1996) Biochemistry 35:545-553; A. J. Cum er y coláboradorés (1992) Bioconj . Chem. 3:397-401; Ladurner y colaboradores (1997). J. Mol. Biol. 273:330-337; - y . Patente de- EUA No. 4, 894, 443.

, . En algunos ejemplos, los ligadores de péptido se codifican por el ácido nucleico y se. incorporan entre la cadena B y la cadena A en la expresión en una célula hospedera, tal como E. coli o S. cerevisiae. En otros ejemplos, un ligador de péptido se sintetiza por métodos químicos. Esto se puede llevar a cabo en un protocolo separado a la síntesis de una o más de^ la cadena A y B, después de lo cual los componentes ' se unen, tal como con él uso de ligadores heterobifuncionales . - Alternativamente, un ligador de péptido se puede sintetizar en la N- o C-terminal de una de las cadenas de insulina-, que luego se liga a la otra cadena a través del ligador · de péptido, tal como con un ligador heterobifuncional ..

Cualquier ligador' conocido por aquellas personas de experiencia en el campo se puede usa en el presente para ligar la cadena A y la cadena B de insulina. Los ligadores y ligaciones que son adecuados para ligar químicamente, las cadenas incluyen,.. pero no se limitan a, ligaciones, de disulfuro, ligaciones de tioéter, ligaciones de ' disulfuro impedidas y ligaciones covalentes entre los grupos .reactivos libres, tales como grupos amina y tiol. Estas ligaciones se producen usando reactivos heterobifuncionales para producir grupos tiol reactivos en uno o ambos de los polipéptidos .y luego hacer reaccionar los grupos . tiol . en un polipéptido con grupos tiol reactivos o grupos amina en lo cual los grupos maleimido reactivos o los grupos tiol' se pueden unir uno al otro. Otros ligadores. incluyen, ligadores escindibles de ácido, tales como bismaleimideotoxi propano, conjugados de lábil-transferrina ácidos y dihidrazida de ácido adípico, se escindirían en compartimentos intracelulares. más ácidos; reticuladores que se es.cinden en. la exposición a UV . o luz visible y ligadores, tales como los diversos dominios, tales como CH1, CH2, y CH3,. de la región constante de la IgGl humana (véase, Batra y colaboradores. (1993) Molecular Immunol. 30:379-386). En algunas modalidades, varios ligadores se pueden incluir a fin de tomar ventaja de las propiedades deseadas, de cada ligador. Los ligadores químicos y los ligadores de péptido se pueden insertar al- acoplar covalentemente el ligador a la cadena. A y cadena. B ' de la insulina. Los agentes heterobifuncionales , descritos posteriormente, se pueden' usar para efectuar tal acoplamiento covalente. Los ligadores de péptido .también se. pueden ligar por el DNA de expresión que codifica el ligador entre la cadena B y la cadena A.

Otros ligadores que se pueden usar para, unirse a la cadena¦ A y cadena B de la insulina incluyen: sustratos de enzimas, tales como, sustrato de catepsina B,. sustrato de catepsina D, sustrato, de tripsina, sustrato de trombina, sustrato de subtilisina, un sustrato de Factor Xa, y sustrato de enterocinasa; ligadores que incrementan la. solubilidad, flexibilidad y/o capacidad de escisión intracelular incluyen ligadores, tales como (glymser).n y (sermgly)n, en los. cuales..m es 1 a 6, de manera, preferente de l a 4, de manera más preferente 2 a 4, y n es 1 a 30, de manera preferente de l a 10, de manera más preferente de 1 a 4. (véase,- por ejemplo, solicitud de PCT Internacional No. WO 96/06641, que proporciona ligadores ejemplares) . En algunas modalidades, se pueden incluir varios , ligadores a fin de tomar ventajas de las propiedades deseadas de cada ligador. 3. Expresión Los polipéptidos de insulina y enzima degradadora de hialuronano se pueden producir por¦ cualquier método conocido por aquellas personas de experiencia en el campo, . incluyendo métodos in vivo e in vitro. Las proteínas deseadas se pueden expresar en cualquier organismo adecuado, para producir las cantidades requeridas y formas de las proteínas, tal como, por ejemplo, necesarios para la administración y tratamiento. Los hospederos de expresión incluyen organismos procarióticos y eucarióticos tales corno E. coli, levadura, plantas, células de insecto, células de mamífero, incluyendo líneas ele células humanas y animales . transgénicos . Los hospederos de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteínas, así como los tipos de modificaciones pos-traduccionales que están presentes en las proteínas expresadas. La elección del hospedero de expresión se puede hacer con base en estos y otros factores, tales como consideraciones regulatorias y de seguridad, costos de producción y la necesidad. y método para la purificación.'. .' Muchos vectores de expresión son disponibles y. conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo y se pueden usar para la expresión de proteínas. La elección del vector de expresión se influirá por la elección del sistema de expresión hospedero. En general, los vectores. de .expresión pueden incluir promotores transcripcionales y, opcionalmente , potenciadores , . señales de traducción, y señales de terminación, de transcripción y traduccionales . Los vectores de expresión que se usan para transformación estable tienen típicamente un marcador seleccionable que permite la selección y mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, un origen de replicación se puede usar para amplificar el número de copias del vector.

Los polipéptidos de hialuronidasa solubles también se pueden usar o expresar como fusiones de proteínas. Por ejemplo, una fusión de enzima se puede genera . para agregar funcionalidad adicional a una enzima. Ejemplos de¦ roteínas de fusión de enzima incluyen, pero no se limitan a, fusionés de ' una secuencia señal, una etiqueta, tal como para' la localización, por ejemplo, una etiqueta His6 o una etiqueta myc.o una etiqueta para purificación, por ejemplo, una fusión GST, y una secuencia para dirigir la secreción de proteínas y/o asociación de membranas. a. Células Procarióticas ¦ Las procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir, grandes cantidades de proteínas. La transformación de E. coli es una técnica simple y rápida bien conocida por aquellas personas de experiencia en el campo.

Los vectores de expresión para E. coli pueden, contener promotores inducibles, estos promotores son útiles para inducir altos niveles, de expresión de proteínas* y para expresar proteínas .que muestran alguna toxicidad a . las células hospederas. Ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor tac híbrido, los promotores T7 y SP6 RNA y el promotor ???, regulado por temperatura.

Las proteínas, tal como cualquier proporcionada ' en el presente, se pueden . expresar en el entorno citoplásmico de E. coli. El citoplasma es un entorno reductor y para algunas moléculas, esto puede dar por resultado la.' formación de cuerpos de inclusión insolubles. Los agentes de reducción tales como ditiotreitol y : ß-mercaptoetanol y desnaturalizantes, tales como guanidina-HCl y urea se pueden usar para resolubilizar las proteínas.: Un procedimiento alternativo es la expresión de proteínas en el espacio periplásmico de las bacterias qué proporciona un entorno oxidante e isomerasas similares a chaperonina y disulfuro, y puede conducir a ' la producción de proteína . soluble. Típicamente, una secuencia líder se fusiona a la proteína que se expresa que dirige la proteína al. periplasma. . El líder luego se remueve por las peptidasas de. señal dentro del periplasma. Los ejemplos de secuencias líder orientadas periplásmicas incluyen el líder pelB del ' gen de pectato liasa y el líder derivado del gen de alcalina fosfatasa. En algunos casos, la expresión periplásmica permite la. fuga 'de la proteína- expresada en el medio de cultivo. La secreción de proteínas permite una purificación rápida y simple del sobrenadante de cultivo. Las proteínas que no se secretan se pueden obtener del per.iplasma por' lisis osmótica. Similar .a la expresión citoplásmica, en algunos .casos las proteínas pueden ser insolubles y se pueden usar desnaturalizantes y agentes .' reductores para facilitar . la: solubilización y replegamiento . La . temperatura de . l inducción y el crecimiento también puede influir en los niveles, de expresión y . solubilidad, se usan típicamente temperaturas entre .25°C y 37°C. . Típicamente, las bacterias producen proteínas aglicosiladas . .'De. esta manera, si las proteínas requieren glicosilación para la función, se puede agregar glicosi.laci.ón in vitro después de la purificación de células hospederas, b. Células de levaduras Las levaduras tales como Saccharomyces cérevisiae , Schizosaccharomyces ¦ pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris son hospederos de ¦ expresión de levadura bien conocidos que se pueden usar para la producción de proteínas, tal como cualquiera descrita en la presente. La levadura se puede transformar con vectores de replicador, episomales o por integración cromosóraica estable por recombinación homologa. Típicamente, los promotores inducibles se usan para regular la expresión génica. Ejemplos de estos promotores incluyen GAL1, GAL7 y GAL5 y promotores de metalotion.eína,: tales como C0P1, A0X1 u otra.' Pichia u otro promotor de levadura. Los vectores de expresión , incluyen frecuentemente un marcador seleccionable tales como LEU2 TRP1, HIS3 y URA3 para selección y mantenimiento del DNA transformado. Las proteínas expresadas en la levadura son frecuentemente solubles. La co-expresión con chaperoninas tales como Bip y proteína de¦ disulfuro isomerasa puede mejorar los niveles . de expresión y .'. solubilidad. Adicionalmente, las proteínas expresadas en la levadura se pueden dirigir para la secreción usando fusiones de péptido señal de secreción, tal como la señal de secreción del factor alfa del tipo de , acoplamiento de levadura de Saceharomyces cerevisíae y se fusiona con las proteínas de superficie de las células de levadura, tal como el receptor de adhesión de acoplamiento Aga2p o la glucoamilasa de. Arxula adeninivorans . Un sitio de escisión de proteasa tal como para la, Kex-2 proteasa, se puede diseñar para, remover las . secuencias fusionadas de los polipéptidos expresados conforme salen de la ruta de secreción.' La levadura también es capaz de la glicosilación en los motivos Asn-X-Ser/Thr .

C. Células de Insecto . Las células de insecto, particularmente usando la expresión de baculovirus, son útiles para expresar polipéptidos tales como polipéptidos de hialuronidas'a . Las células de insecto expresan altos niveles de proteína y son capaces de la mayoría de la mayoría de las modificaciones pos-traduccionales usada por eucariotas superiores.. El baculovirus tiene un intervalo de hospedero restrictivo- que mejora la seguridad y reduce las preocupaciones reguladoras de la expresión eucariótica. Los vectores · de expresión típicos usan un promotor para la expresión de alto nivel tal como el promotor de pólihedriria dé baculovirus. Los sistemas de baculovirus comúnmente usados incluyen los baculovirus tales como virus . de . poiihedrosis nuclear, de Autographa cali fornica (AcNPV) , y el virus de poiihedrosis nuclear de Bombyx morí (BmNPV) y un línea de células de insecto tal como Sf-9 . derivada de Spodoptera . frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S). y Danaüs plexippus (DpNl). Para la expresión de alto nivel, la secuencia de . nucleótidos de la molécula que se expresa fusiona inmediatamente cadena abajo del codón de iniciación de polihédrina del virus. La señal de secreción del mamífero se procesan con precisión en las células de insecto y se pueden usar para secretar la proteína.. expresada en el medio .de .cultivo. Además,, las líneas de células Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpNl) producen proteínas, con patrones de glicosilacióh similares'.. los sistemas de células de mamífero.

Un sistema de . expresión alternativo en las células de insecto es el uso de células establemente transformadas. Las líneas de células tales como células Schneider 2 (S2) y Kc ( Drosophila melanogaster) y C7 (Aedes albopicius) se pueden usar para la expresión. El promotor de metalotiónina de Drosophila se puede usar para inducir : altos niveles de expresión en la presencia de la inducción del . metal pesado con cadmio o cobre. Los vectores de expresión, se mantienen típicamente por el uso de marcadores seleccionables . tales cómo neomicina e ' hidromicina . d. Células de Mamífero Los sistemas de expresión de mamíferos se pueden' usar para expresar proteínas que incluyen polipéptidos de hialuronidasas solubles. Los constructos de expresión se pueden transferir · a las células de mamífero por infección viral tales como adenovirus o por transferencia dé D A directa tales como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medios físicos tales como electroporación , y micro inyección. Los vectores¦ de expresión para las células de mamífero incluyen . típicamente un sitio de terminación mRNA, una recuadro TATA, una secuencia de iniciación traduccional (secuencia consenso Kozak). y elementos de poliadenilación . Los elementos IRES también se pueden agregar para permitir la expresión bicistrónica con otro gen, tal como un marcador, seleccionable . Estos vectores , incluyen frecuentemente promótor-potenciadores transcripcionales para la expresión de alto nivel, por ejemplo el promotor-potenciador SV40, el promotor de citomegalovirus humano (CMV) y la repetición, terminal larga del virus de sarcoma Rous (RSV) . Estos promotores-potenciadores . son activos, en muchos tipos de células. Los promotores de tipo tejido y. célula y regiones potenciadoras también . se pueden usar para la expresión. Las regiones promotoras-potenciadoras ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquellas de genes tales como elastasá I, insulina, i.nmunoglobulina, virus de tumor mamario de ratón, albúmina, alfa feto proteina, alfa 1 anti-tripsina, beta globina, proteina básica de mielina., cadena 2 ligera de miocina, y control del gen de la hormona de liberación gonadotrópica . Los marcadores seleccionables se pueden usar para seleccionar y mantener las ' células con el consulto de expresión. Ejemplos de genes marcadores seleccionables que incluyen, pero no se limitan a, higromicina B fosfotransferasa, adenosina desaminasa, xantina-guanina fosforibosil . transferasa, aminoglicósido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina cinasa. . Por ejemplo, la expresión se puede llevar a cabo en presencia de metotrexato para seleccionar solo aquellas células que expresan el gen. de DHFR. La fusión con las moléculas de señalización de superficie celular tal como TCR- ?: y FCERI-Y pueden , dirigir la expresión de las proteínas, en un estado activo en la superficie celular.

Muchas líneas de células son disponibles para la expresión de mamíferos incluyendo ratón,, rata, humano, .mono, pollo y células de hámster. Las líneas de : células ejemplares incluyen pero no se limitan a CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2 , NSO de ratón (no secretora) y otras líneas de .células de mieloma, líneas de células de hibridoma y heterohibridoma, linfocitos., fibroblastos, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, y células HKB. Las líneas de células también son disponibles adaptadas al medio sin. suero lo cual facilita la purificación de las proteínas . secretadas del medio de cultivo celular. Ejemplos incluyen células CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat # 11619-012) y la línea de células EBNA-1 sin suero (Pham y colaboradores, (2003) Biotechnol. Bioeng.. 84,: 332-42.) . también están disponibles las líneas de células . que se adaptan para desarrollarse en medios especiales optimizados para la expresión máxima. Por ejemplo, las. células. DG44 CHO se adaptan para desarrollarse en un cultivo de suspensión en un medio sin producto animal, químicamente definido. e. Plantas.

Células' de plantas transgénicas y plantas se pueden usar para expresar las proteínas tal como cualquiera descrito en la presente. Los constructos de. expresión se transfieren típicamente a las plantas usando transferencia de DNA directa ti como bombardeo de micro-proyectiles y transferencia mediada, por PEG de los protoplastos y con transformación mediada por agrobacterium. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias promotoras y secuenciadoras , elementos dé terminación transcripcionales y elementos de control traduccionales .. Los vectores , de expresión y las técnicas de transformación se liberan usualménte entre hospederos dicotiledóneos, tales como Arabidopsis y tabaco, y hospederos monocotiledóneas , tales como maíz y arroz. Ejemplos de promotores de plantas . usados para la expresión incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de ribosa bifosfato carboxilasa y ' ^los promotores de ubiquitina y UBQ3. Los marcadores seleccionables tales como higromicina, fosfomanosa- isomerasa y neomicina fosfotransferasa se usan frecuentemente para facilitar la selección y mantenimiento de las células transformadas; Las células de plantas transformadas .se pueden mantener en el cultivo como células, agregados' (tejido calloso) o regeneradas en plantas enteras. Las células de 338 plantas transgénicas también pueden incluir algas diseñadas para producir poiipéptidos de hialuronidasa . Debido que lás plantas tienen diferentes patrones- de glicosilación que las células de mamífero, esto puede influir en la elección de la proteína producida en estos hospederos. 4. Técnicas de Purificación .

El método para purificación de los poiipéptidos, que incluyen insulina y poiipéptidos de enzima degradadora de hialurohano u' otras . proteínas, de células hospederas dependerá de las células hospederas elegidas y los sistemas de expresión. Para las ' moléculas secretadas, las proteínas se purifican generalmente del medio de cultivo después de la remoción de las células.. Para la expresión intercelular, las células se pueden lisar y las proteínas se purifican del extracto. Cuando los organismos transgénicos tales como plantas transgénicas, y animales se usan para la expresión, los tejidos u órganos se pueden usar como material de partida para hacer un extracto de células lisadas., Adicionalmente, la producción de animales transgénicos puede incluir la producción de poiipéptidos en leche o huevos, que se pueden recolectar, y si es necesario, las proteínas se pueden extraer y purificar . adicionalmente usando métodos estándares en la técnica .

Las proteínas, tales como poiipéptidos de insulina o polipéptidos de enzima degradadora de hialuronano, se pueden purificar usando técnicas de purificación de proteínas estándares conocidas en el campo incluyen pero no limitado a, SDS-PAGE, fraccionamiento de tamaño y : cromatografía de exclusión de tamaño, precipitación de . sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico, tal como intercambio de aniones. Las técnicas de purificación, por -afinidad también se pueden usar para mejorar la eficiencia y pureza de las preparaciones. Por ejemplo, los anticuerpos, receptores y otras moléculas que digan las. enzimas de hialuronidasas.se pueden usar en la purificación por afinidad. Los constructos de expresión también se pueden diseñar para agregar una etiqueta de. afinidad a una proteína tal como un epítopo myc, fusión GST o . His6 y se purifican por afinidad con el anticuerpo myc, . resina de glutationa y resina de Ni, respectivamente. La pyreza se puede evaluar por cualquier método conocido en el campo incluyendo electroforesis en gel, métodos de HPLC ortogonales, técnicas de tinción y espectrofotométricas .

I. Métodos para Evaluar la Estabilidad y Actividad.

Los ensayos se pueden usar para . evaluar la estabilidad de las formulaciones o co-formulaciones proporcionadas en la presente, incluyendo co-formulaciones que contienen una insulina de acción rápida y enzima degradadora de hialuronano proporcionada en la presente. Estos ensayos pueden evaluar la estabilidad y. actividad de la enzima degradado a de hialuronano y/o estabilidad, actividad' o solubilidad de la insulina de acción rápida en las co-formulaciones . Estos ensayos se pueden usar, por ejemplo, para determinar la estabilidad de las co-formulaciones a través del tiempo en temperaturas de almacenamiento particulares sin condiciones., al evaluar la actividad, solubilidad, y estabilidad (por ejemplo formación de agregados, etc.) antes del almacenamiento y luego en varios puntos de tiempo posteriores. Los ensayos también se pueden usar para hacer ajustes . menores a las formulaciones proporcionadas '· en la presente mientras que retienen la estabilidad de ambos agentes activos.

I. Insulina La estabilidad y la solubilidad de la insulina de las co-formulaciones proporcionadas en la presente se pueden evaluar usando métodos y ensayos bien conocidos én el. campo. Por ejemplo, la estabilidad y solubilidad de la insulina se pueden evaluar por evaluación visual, clarificación ácida, microscopía óptica,, cromatografía de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) ,. y ensayos' in vivo y cromatografía de exclusión de tamaño desnaturalizante y no desnaturalizante (SEC) . En un ejemplo, la solubilidad y estabilidad de la insulina se determina por evaluación, visual, incluyendo cambios en el color, claridad, presencia de agregados o formación de grumos y adhesión de material, o escarchado, al recipiente que contiene las co-formulaciones proporcionadas en la presente. Los cambios visuales se confirman por la clarificación acida, en donde la falta de disolución después de la acidificación confirma la presencia de insulina desnaturaliza insoluble en · las co-formulaciones proporcionadas en la presente. Los cambios visuales en la insulina en las co-formulaciones proporcionadas en la presente también se pueden confirmar por microscopía óptica y/o micrografia por luz de fondo fluorescente. La solubilidad evidente por una insulina de acción rápida en las . co-formulaciones proporcionadas en la presente se puede' evaluar, por ejemplo, por RP- HPLC, tal como se describe en el Ejemplo 3. En los métodos expuestos en el Ejemplo 3, la solubilidad evidente se mide como el porcentaje de recuperación de insulina después del almacenamiento bajo varias condiciones .y puntos de tiempo. El porcentaje de recuperación se .determina como es comparado con una muestra de referencia. Además-, los productos de degradación de insulina, tal como desamido insulina, se pueden determinar por RP-HPLC. En un ejemplo, la estabilidad ' de la insulina en las co-formulaciones proporcionadas en la presente se valúa al medir la formación de .agregados que usan la cromatografía de exclusión de tamaño véase por ejemplo, Ejemplo 4). En este ejemplo, la SEC se usa para determinar la presencia de proteínas de peso molecular alto, es decir agregados.

La. actividad de la insulina también se pude valorar usando métodos y .' ensayos bien conocidos en el campo. Por ejemplo, la capacidad de una insulina, incluyendo composiciones de insulina y co-formulaciones , qüe actúan como un agente terapéutico se puede valorar in vivo o in vitro. Por ejemplos, los ensayos in vitro bien conocidos en el campo se pueden llevar a cabo para evaluar la capácidad de una insulina al ligarse al- receptor de insulina. En un ejemplo, se lleva a cabo un. ensayo de ligación competitivo en el cual se preparan membranas de células placentarias humanas como una fuente de . receptores de insulina y se incuban con la insulina humana radio etiquetada con o sin él análogo de insulina no etiquetado. La cantidad de insulina radio etiquetada ligada luego se detecta para determinar la capacidad del análogo de insulina a. competir para la ligación y se calcula la afinidad relativa del análogo de insulina para el receptor dé insulina placentario (véase por ejemplo Weiss y colaboradores; (2001) J.. Biol. Chem. 276:40018-40024). Otras fuentes receptoras de insulina, incluyendo otras células que expresan natural o recombinantemente el receptor de insulina, también se pueden usar en estos ensayos de ligación competitivos (Duttaroy y colaboradores, (2005) Diabetes 54:251-258) .

La capacidad de la insulina para estimular la captación de glucosa o efectuar cualquier . otro de sus resultados métabólicos típicos .se puede valuar in vitro..' Para medir la captación de glucosa 'estimulada por insulina, se ¦ incuban adipocitos con glucosa etiquetada, tal . como 2-desoxi-D- [2 , 6-3H] o D-[U-14C] con o sin insulina; La radioactividad incorporada, luego se mide' para determinar la cantidad de capacidad de glucosa 1 en presencia o ausencia de insulina (Louveau y colaboradores, (2004) J Endocrin. 181:271-280, Duttaroy y colaboradores, (2005) Diabetes 5 : 251-258 ) . Cuando se evalúa la actividad de un análogo de insulina, la actividad de la insulina humana también se puede evaluar y se usa para comparación. Los ensayos in vitro para evaluar la producción, de glucosa 'en las células H4IIE en presencia de insulina también' se pueden llevar . a cabo ' (Wang y colaboradores, (2000) J. Biochem., 275: 14717-147,21, Duttaroy y colaboradores, (2005) Diabetes 54:251-258).

Los estudios in vivo que usan modelos animales diabéticos o sanos o sujetos humanos también se llevan a cabo para evaluar . la., actividad terapéutica, de la insulina, incluyendo composiciones y co-formulaciones de. la insulina.

La insulina se puede administrar a modelos animales de diabetes para evaluar los efectos en los niveles de glucosa en la sangre, niveles de insulina circulantes, y hemoglobina. Ale (HbAlc) , por ejemplo. La hemoglobina Ale se., forma cuando la glucosa se une a .la hemoglobina, lo cual se presenta cuando los niveles de glucosa en la sangre sean, elevados. Los niveles de HbAlc en la muestra de sangre se pueden evaluar por, por ejemplo, HPLC, ELISA/ RIA. u otro inmunoensayo . Los valores de HbAlc '.normales para sujetos., sanos son aproximadamente 4.0-6.2 por ciento. La American. Diabetes Association recomienda que debe estar por debajo de 7% (o abajo de 6% en ciertas personas) para pacientes, con diabetes para ayudar a prevenir las complicaciones de la diabetes. Los niveles de insulina se pueden medir. por, por ejemplo, ELISA o RIA. Los niveles de glucosa se miden típicamente usando un sensor o analizador de glucosa.

Los modelos, animales para la diabetes tipo 1 incluyen ratones , diabéticos . no obesos (NOD). y rata BioBreeding (BB) (Atkinson y colaboradores, (1999) Nature Med. 5:601-604). Los modelos de animales para la diabetes tipo 2 incluyen,, pero no se limitan a, ob/ob y ratones db/db, que tienen mutaciones en el gen de leptina o el receptor de leptina, respectivamente, ratones KK, ratones Nagoya-Shibat.a-Yasuda . (NSY) , ratas obesas diabéticas Zucker · ( ZDF) y ratas Gato-Katazaki (GK) (Gefalu (2006) ILAR Journal .47 : 185-198) . En : otros ejemplos, los animales sanos se usan para probar la actividad de una insulina, con o sin una enzima degradadora de hiáluronano.. 2. Enzimas degradadoras de hiáluronano.

La actividad de una enzima degradadora de hiáluronano se puede evaluar usando métodos bien conocidos, en el campo. Por ejemplo, el ensayo USP XXII para la hialuronidasa determina la actividad indirectamente al medir la cantidad' .de ácido hialurónico no degradado,, y sustrato de hiáluronano (HA) · que permanece después de que enzima se deja reaccionar cón él HA durante 30 minutos a 37° C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-64.5 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD) . Un . Estándar de Referencia de Hialuronidasa (USP) o Solución de . Hialuronidasa Estándar de National Formulary . (NF) se puede usar en un ensayo, para evaluar la actividad, en unidades de cualquier hialuronidasa. En un ejemplo,, la actividad se mide usando un ensayo de micro turbiedad. Este se basa en la formación de un precipitado insoluble cuando el . ácido hialurónico se liga. con la albúmina de suero. La actividad se mide al incubar la hialuronidasa con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) durante un periodo de tiempo establecido (por ejemplo 10 minutos) y luego precipita el hialuronato de sodio no digerido con la adición de albúmina de suero acidificada.. La turbiedad de la muestra resultante se mide a 640 nm. después de. un periodo de desarrollo adicional. La disminución en la turbiedad que resulta de la actividad de la hialuronidasa en el sustrato de hialuronato de sodio es una medición de la actividad enzimática de la hialuronidasa (véase por ejemplo el Ejemplo- 2) .

En otro ejemplo, la actividad de la hialuronidasa se mide usando un ensayo de micro titulo en el cual el ácido hialurónico biotinilado residual se mide después de la incubación con hialuronidasa (véase por ejemplo Frost y Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, Publicación de Patente de E.U.A. No. 20050260.186) . Los grupos' carboxilos libres en los residuos de ácido, glucurónico . del ácido hialurónico se biotinilado, y el sustrato de ácido hialurónico o biotinilado se acopla covalentemente a una placa de micro titulo. Después de la incubación con la hialuronidasa, se detecta el sustrato del ácido hialurónico biotinilado residual usando unan reacción de avidina-péroxidasa, y se compara con aquella obtenida después de la reacción con los estándares de hialuronidasa de la actividad conocida. Otros ensayos para medir la actividad de la hialuronidasa' también son bien conocidos en el campo y se pueden usar en los métodos en la presente (véase por ejemplo Delpech y colaboradores, (1995) Anal. Biochem. 22.9:35-41; Takahashi y colaboradores, (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).

La capacidad de una- enzima degradadora de hialuronano para actuar como un¦ agente de dispersión .o difusión' también se puede evaluar. Por 'ejemplo, se puede inyectar colorante azul de tripano subcutáneamente con o sin- una enzima degradadora de hialuronano en la piel lateral en cada lado de los ratones desnudos. El área del colorante luego, se mide, tal como un micro calibrador, para determinar la capacidad de la enzima degradadora de hialuronano para actuar como un agente de propagación Publicación dé Patente de E.U.A. No. 20060104968). El efecto de la co-administración de la hialuronidasa con otro agente, tal como una insulina, en las propiedades farmacocinéticas y farmodinámicas . de ese agente también se pueden evaluar in vivo usando modelos animales y/o sujetos humanos, tal como en la instalación de una clínica.. La actividad funcional de una enzima degradadora de hialuronano que no es una hialuronidasa se puede comparar. con una hialuronidasa usando cualquiera de estos ensayos. Esto se puede hacer para determinar una cantidad ¦ furtcionalmente equivalente de unan enzima degradadora de. hialuronano. Por ejemplo, la capacidad de una enzima degradadora de hialuronano para actuar · como una agente de .'dispersión . y difusión se puede evaluar al inyectarlo en la piel lateral del ratón con azul de. tripano, y la cantidad requerida para lograr la misma cantidad de difusión como, por ejemplo, 1.00 396 unidades de un Estándar de Referencia de Hialuronidasa, se puede determinar. La cantidad de enzima degradadora de hialuronano no requerida es, por lo tanto, ,-funcionalmente equivalente a 100 unidades de hialuronidasa.

La estabilidad de la enzima degradadora de hialuronano en una composición, tal como en las co-formulacionés proporcionadas en la presente, también se pueden evaluar usando otros métodos y ensayos conocidos en el campo. Por ejemplo, la estabilidad se puede evaluar al determinar la actividad de hialuronidasa como se describe en lo anterior y en el Ejemplo 2, inspección visual, como se describe en lo anterior, porcentaje de recuperación y pureza de la proteína', a través del tiempo, como es medido por la cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) {véase por ejemplo, el Ejemplo 3), y temperatura de fusión evidente. La pureza de la proteína, como se determina por RP-HPLC, es el porcentaje de la enzima degradadora de hialuronano principal en la co-formulación, por ejemplo, rHuPH20, como es comparada con todas las especies de ' hialuronidasas presentes. El porcentaje de recuperación es el porcentaje relativo de la hialuronidasa en la co-formulación a través del tiempo y en varias condiciones de. almacenamiento, como es comparada con una muestra de referencia. En un ejemplo, la temperatura de fusión . de l hialuronidasa en las co-formulacionés proporcionadas en la presente, se determina al medir el radio hidrodinámico de las partículas por la dispersión de luz dinámica ( véa se , por ejemplo, el Ejemplo 7.B). Un incremento en el tamaño de partícula' y una disminución en la temperatura de fusión indican la desnaturalización y agregación subsecuente de la hialuronidasa . L estabilidad de la hialuronidasa en. las co-formulaciones proporcionadas .en la presente se puede determinar el medir., la oxidación de la hialuronidasa, ' tal como la rHuPH20, por RP-HPLC . El porcentaje de oxidación es una medición de la suma ¦ de las áreas picos de los picos mayores (ox-1) y menores (ox-2) ( véa se , por ejemplo, el Ejemplo . 10. B). Otros métodos conocidos por una persona experta de experiencia en el. campo que se puede usar para' determinar la estabilidad de la hialuronidasa en las co-formulaciones proporcionadas en la presente, incluyen electroforesis en. gel de poliacrilamida (PAGE) , inmuno tinción, espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR) , espectrometría, de masas, dicroísmo circular (CD) y ensayos .de fluorescencia basados en colorantes. · .

J. Usos terapéuticos Las co-formulaciones de una insulina de acción rápida y la enzima degradado.ra de hialuronano descritos én lá presente se pueden usar para el tratamiento de cualquier condición por lo cual se emplea una insulina de acción rápida. Las co-formulaciones . se pueden administrar subcutáneamente para tratar cualquier condición que sea apta para el tratamiento con insulina. Esta Sección proporciona usos, terapéuticos ejemplares desde la insulina de acción rápida. "Los usos terapéuticos descritos posteriormente son ejemplares y no limitan las aplicaciones de las co-formulaciones descritas . en la presente. Los usos terapéuticos incluyen,-, pero no se limitan, a, tratamiento para diabetes mellitus : tipo 1:, diabetes mellitus tipo 2, diabetes gestacional, y para el control glicémico en pacientes criticamente enfermos. Por ejemplo, las co-formulaciones de una insulina de. acción y rápida y enzima degradadora de. hialuronano se pueden administrar subcutáneamente en dosis discretas, tal como -,'a través de una jeringa o pluma de insulina, antes 'de una comida como terapia de insulina prandial en sujetos co.n diabetes para lograr el control glicémico. Las co-formulaciones también se pueden administrar subcutáneamente o intra peritonealmente usando una bomba de insulina o en el contexto de un sistema de circuito cerrado para controlar continuamente los niveles de¦ glucosa en la sangre o todo el día y noche y/o para controla las excursiones glicémica.s post-prandiales . Ésta dentro de la, experiencia de un médico que trata de identificar estas enfermedades o condiciones.

Como se plantea en lo anterior, las dosificaciones particulares y. protocolos del tratamiento, se individualizan típicamente para cada sujeto.' Si es necesario, una dosificación y duración particular y protocolo. del tratamiento se pude determinar o extra polar empíricamente. Por ejemplo, las dosis ejemplares de la insulina de acción rápida sin una enzima degradadora de hialuronano se pude usar como un puntó de partida para determinar las dosificaciones apropiadas de las có-formulaciones proporcionadas en la presente. Los niveles de dosificación se pueden determinar con base a una variedad de factores, tal como peso corporal del individuo, salud general, edad, ;la actividad del compuesto especifico empleado, sexo, dieta, actividad metabólica, concentraciones de glucosa en la sangre, tiempo de administración,, velocidad de excreción, . combinación de fármaco, la gravedad, y curso de la enfermedad, y la disposición del paciente a la enfermedad y la evaluación del médico que trata. En particular, los niveles de glucosa en la sangre, tal como es medido por un sensor de glucosa en la sangre, se pueden medir y se usa para, determinar lá cantidad de insulina y una enzima degradadora de hialuronano que se administra para lograr el control glicémico. Los algoritmos son¦ conocidos en el campo que se pueden usar para determinar una dosis basada en la velocidad de absorción¦ y el- nivel ' de absorción de las. co-formulaciones de una insulina de acción rápida y una enzima degradadora de hialuronano . proporcionada en la presente, también basado en los niveles de glucosa en la sangre. Las dosificaciones de la insulina para el control glicémico post-prandial también se pueden calcular y ajustar, por ejemplo,, al determinar el contenido de carbohidratos de una comida (véase, por ejemplo, Bergenstal y colaboradores, (2008) Diabetes Care 31: 1305-1310, Lowe . y colaboradores., (2008) Diabetes Res. ¦ Clin, Pract. 80:439-443, Chiesa y colaboradores, (2005) Acta Biomed. 76:44-48). 1. Diabetes Mellitus La diabetes mellitus (o diabetes) se caracteriza por un metabolismo de glucosa deteriorado. La glucosa en la sangre se deriva de carbohidratos absorbidos en los¦ intestinos . y producidos en el hígado. El incremento ..de los niveles de glucosa en la sangre, estimula la liberación de insulina. El influjo de glucosa post-prandial puede ser de 20 o 30 veces más alta que la producción hepática de la glucosa observada entre comidas. La' liberación de insulina de fase temprana, que dura 10 minutos o aproximadamente, suprime . la producción de glucosa hepática y procede a una fase más prolongada (tardía) de liberación, la cual dura dos horas o más y cubre el influjo de carbohidratos en el tiempo de la comida. Entre comidas, un nivel de insulina continua, o bajo, insulina basal, : cubre los. requisitos metabólicos en curso, .en particular para regular la producción de glucosa, hepática asi como la utilización de glucosa por el tejido liposo, tejido muscular y otros sitios de objetivo. Los pacientes con diabetes se presentan con niveles de glucosa ' en la sangre elevados (hiperglicemia) . La diabetes se puede ; clasificar en dos grupos principales: diabetes tipo 1 y diabetes tipo .2. La diabetes tipo 1,. o diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), se caracteriza por una pérdida de las células ß productoras de insulina de los islotes de Langerhans en el páncreas, conduciendo a una deficiencia de insulina. La causa primaria de la deficiencia de células ß es la -..autoinmunidad mediada por células T. La diabetes tipo 2, o. diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM) , se presenta en pacientes con una función de células ß. deterioradas. Esto.s pacientes tienen resistencia a la insulina o sensibilidad .a la insulina reducida, combinada con la secreción de. insulina reducida. La diabetes tipo 2 se puede desarrollar eventualmente en la. diabetes tipo.l. También se. incluye en la diabetes la diabetes gestacional.. A los pacientes con diabetes se les puede administrar insulina para mantener tanto los niveles de insulina básales como para, prevenir las excursiones glicémicas, tal como después de una comida, a. Diabetes Tipo 1 La diabetes tipo 1 es una enfermedad autoinmune dependiente de células T caracterizada por infiltración de los islotes de Langerhans, la unidad endocrina del páncreas, y la destrucción de células ß, que conduce a una deficiencia en la producción de insulina e hiperglicemia . La diabetes tipo 1 se diagnostica más comúnmente en niños y adultos jóvenes pero se puede diagnosticar en cualquier edad. Los pacientes con diabetes tipo 1 pueden presentar, además de bajos niveles de insulina- y altos niveles de ¦ glucosa, en la sangre, poliuria, polidipsia, polifagia, visión borrosa y fatiga.. Los pacientes se pueden diagnosticar al presentarse con niveles de '.glucosa en plasma en ayunas. en o aproximadamente 126 mg/.dL (7.0 mmol/1) , niveles" de glucosa . en plasma en o arriba . de 200 mg/dL (11.1 mmol/1) dos horas después de 75 g de una carga de glucosa oral, tal como en una prueba de tolerancia a la glucosa, y/o niveles, de glucosa en plasma aleatorios en o. arriba de 200 mg/dL (11.1 mmol/1) ..

El tratamiento primario para' pacientes con diabetes tipo 1 es la . administración de insulina como terapia de reemplazo, que se lleva a. cabo típicamente en conjunción con la supervisión de glucosa en la sangre. Sin . insulina de reemplazo suficiente, se puede desarrollar cetoacidosis diabética, que puede dar por resultado en coma o muerte.. A los pacientes se . les pueden administrar inyecciones subcutáneas . de . insulina de acción rápida usando, por ejemplo, una jeringa o pluma de insulina, o una bomba de. insulina. para mantener- los niveles .de. glucosa en la sangre apropiados por todo el día y también para controlar los niveles de glucosa post-prandiales .. En algunos casos, una bomba de insulina, que incluye en el contexto de. un sistema de circuito cerrado, se puede usar para administrar insulina intra-peritonealmente . De esta manera, '. los pacientes con diabetes tipo 1 se¦ les puede administrar- las co-formulaciones . de una, insuliná .de acción rápida y enzima degradadora de hialuronano. descrita en la presente subcutáneamente o intra-peritonealmente a través de una jeringa, pluma de insulina, o bomba de insulina, o cualquier otro medio útil para la administración de-, insulina, para controlar más rápidamente los niveles de glucosa . e insulina en la sangre. b. Diabetes Tipo 2 La diabetes tipo 2 se asocia con resistencia a la insulina y, en algunas poblaciones, también por insulinopenia (menos de la función de las células ß):.·. En la diabetes tipo 2, la liberación de fase 1 de la insulina está ausente, y la liberación de fase 2 se retrasa y es inadecuada. El fuerte repunte de la liberación de insulina que se presenta . en los sujetos sanos antes y después de una comida se retrasa, se prolonga, y es insuficiente en , cantidad en pacientes con diabetes tipo 2, dando por resultado: hiperglicemia . Los pacientes con diabetes tipo 2 se les puede administrar insulina para controlar los niveles de. glucosa en la sangre (Mayfield y colaboradores (2004) Am Fam Physican 70:489-500). Esto se puede hacer en combinación con otros tratamientos y regímenes de tratamiento, incluyendo dieta, ejercicio y otras terapias anti-diabéticas (por ejemplo sulfonilureas , biguanidas, meglitinidas, ' tiazolidinadionas e inhibidores de alfa-glucosidasa) .. De esta manera,, a los pacientes con diabetes tipo 2 se les pueden , administrar las co- formulaciones de una insulina de acción rápida y enzima degradadora de hialuronano descrita en la presente subcutánea o intra-peritonealmente a .través de jeringa, pluma de insulina o . bomba de insulina, o cualquier otro medio útil para administrar la insulina, para controlar más rápidamente los niveles de glucosa e insulina en la sangre.

C. Diabetes Gestacional Mujeres embarazadas quienes nunca han tenido diabetes antes pero que tienen . altos niveles dé glucosa, en la sangre durante el embarazo, son diagnosticadas con diabetes ¦gestacional. Esto tipo de diabetes afecta aproximadamente 1-14% de todas las mujeres embarazadas, dependiendo de la población estudiada (Carr y- colaboradores, (1998) Clinical Diabetes 16).. Mientras que la causa subyacente permanece desconocida, parece probable que las hormonas producidas durante el embarazo reducen la sensibilidad a la insulina de la mujer embarazada. El mecanismo de la resistencia de la insulina es probablemente un defecto post-receptor , puesto que se ha mostrado la . ligación de la ' insulina normal por las células sensibles a la insulina.' El páncreas libera 1.5-2.'5 veces más insulina a fin de responder al incremento resultante en la resistencia a la insulina. Los pacientes con función, pancreática normal son capaces de cumplir estas demandas. Los pacientes con su función pancreática al limite tienen, dificultad de incrementar la secreción .'de insulina y consecuentemente producir niveles inadecuados de insulina. La diabetes gestacional resulta de esta manera cuando existe una secreción de insulina retardada o insuficiente en presencia del incremento a la resistencia a la insulina periférica.

A los pacientes con diabetes gestacional se les puede administrar insulina para controlar el nivel de glucosa en la sangre. De esta . manera, los¦ pacientes con diabetes gestacional se les. puede administrar las co-formulaciones de una insulina de acción rápida y. enzima degradadora de hialuronano descrita en la presente, subcutáneamente a través de jeringa, pluma, de insulina, bomba de insulina o páncreas artificial, o cualquier otro medio para controlar más rápidamente los niveles de glucosa e insulina en la sangre. 2. Terapia de insulina para pacientes criticamente enfermos .

Lá hiperglicemia ' y la resistencia a la insulina se presenta frecuentemente en pacientes médica y/o quirúrgicamente, criticamente enfermos y se ha asociado con la morbilidad y mortalidad incrementada en pacientes diabéticos como no diabéticos y en pacientes con lesión traumática, apoplejía, .lesión cerebral' anóxica, infarto al miocardio agudo, cirugía post-cardiaca, y otras causas de enfermedad critica; (McCowen y colaboradores , (2001) Crit. Clin. Care 17: 107- 124 ).. Los pacientes críticamente enfermos con hiperglicemia se han tratado con insulina para controlar los niveles de glucosa en la sangre. Este tratamiento pude reducir la morbilidad y mortalidad entre este grupo (Van den Berghe y colaboradores . (2006) N. Eng. J Med. 354: 449-461). La insulina típicamente se administra intravenosamente al paciente, tal como por inyección con. una jeringa por un profesional médico o por infusión usando una bomba de insulina. En algunos ejemplos, los . algoritmos y software se usan para calcular la dosis. De esta manera, los .pacientes críticamente enfermos con hiperglicemia se les puede administrar una co-formulación de una insulina de acción rápida y enzima degradadora de hiáluronano descrita en la presente para controlar los niveles de : glucosa en la sangre, aliviando de esta manera la hiperglicemia y reduciendo la morbilidad y mortalidad.

K. Terapias de combinación Cualquiera, de las co-formulaciones de una insulina de acción rápida y enzima degradadora de hialuronano descritos en la presente se puede administrar en combinación con, antes de, intermitentemente con, o subsecuentemente a, ¦ otros agentes o procedimientos terapéuticos que incluyen, pero no se limitan a, otros productos biológicos y compuestas de moléculas pequeñas. Para cualquier enfermedad o. condición, incluyendo todas aquellas e emplificadas en lo anterior, por lo cual una insulina de acción rápida se indica o se ha usado y por el cual otros agentes y tratamientos son disponibles, las co-formulaciones se pueden usar en combinación con las mismas. Dependiendo dé ia enfermedad o condición, que se trata, las combinaciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, combinación con fármacos anti-diabéticos , que incluyen, pero no., se limitan a, sulfonilureas , . biguanidas, me.glitinidas , tiazolidinedionas-, inhibidores de alfa-glucosidasa, análogos de. péptido, incluyendo análogos de péptidos similar, a glucagón (GLP) ,. y, análogos de péptido inhibidor gástrico (GIP) e inhibidores de DPP- .. En otro ejemplo, las. co-formulaciones de una insulina de acción rápida y la enzima degradadora de hialuronano descrita' en la presente se puede, administrar en combinación co, antes de, intermitentemente con, o subsecuente a, con una o más de otras insulinas, incluyendo insulina de acción rápida, e insulinas de acción basal .

L. Artículos de Fabricación y Kits Las co-'formulaciones de una insulina . de acción rápida y la enzima degradádora de hialuronáno proporcionadas en la presente se pueden empacar como artículos de fabricación que contienen material de empaquetado,. una composición farmacéutica, que es efectiva para controlar los niveles de glucosa en la sangre, tal como en suj etos , diabéticos o críticamente enfermos, y una etiqueta que · indica que las co-formulaciones se van a usar para controlar los niveles de glucosa en la sangre.

Los artículos de fabricación proporcionados en la presente contienen . materiales de empaquetado. Los materiales de empaquetado para el uso en los productos farmacéuticos empaquetados son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo. Véase, por ejempló, las Patentes de E.U.A. Nos. 5, 323, 907, 5, 052, 558 y 5,033,252, cada una de la cual se. incorpora en la presente en su totalidad. Ejemplos de materiales de empaquetado farmacéuticos, incluyen, pero no se limitan a, paquetes de burbuja, botellas, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas, botellas, .y cualquier material de empaquetado adecuado. para una formulación seleccionada y modo propuesto de administración y tratamiento.

Las co-formulaciones de una insulina de acción rápida y la enzima degradadora de hialuronano también se pueden proporcionar como kits. Los kits . pueden incluir una co-formulación descrita en la presente y un articulo, para la administración. Los kits también pueden incluir composiciones farmacéuticas adicionales. En un ejemplo, los kits pueden incluir una o más de las co-formulaciones proporcionadas en la presente y una. o más de otras composiciones, de insulina tales, como por ejemplo, insulinas¦ de acción lenta o acción intermedia, incluyendo insulinas cristalinas, o cualquier combinación de .las mismas. Las co-formulaciones de la insulina de acción rápida y la enzima degradadora de hialuronano se puede suministrar con un dispositivo para la administración, tal como una jeringa, una pluma de insulina, una bomba o un depósito que se inserta en una pluma de insulina, una bomba u otro dispositivo de administración. El kit puede, opcionalmente, incluir instrucciones . para la aplicación incluyendo dosificaciones, regímenes de dosificaciones e. instrucciones .; para los .modos de administración. Los ¦ kits- también pueden incluir, una co-formulación descrita en la presente y un artículo para la diagnosis. Por ejemplo, estos kits pueden incluir un monitor o sensor de glucosa.

M. EJEMPLOS Los siguientes, ej emplos se. incluyen, para propósitos ilustrativos solamente y no se proponen para limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Insulina y Preparación Madre del Análogo de Insulina A. Insulina Regular Para la insulina regular, el polvo (Organon Insulin API, Insulina Humana Recombinante SIHR 143) se pesó y 'se- mezcló con una cantidad', apropiada de agua hasta que la solución contuvo aproximadamente 10-25 mg/mL. Se agregó HC1 1 M a la mezcla nebulosa a Una concentración final de HC1 20 .mM. La solución se mezcló suavemente con una barra, de agitación hasta que la insulina se. disolvió completamente y se agregó Tris 250 mM, pH 10.7 (Trizma, Cat. No. T60G6, Sigma) a una concentración de Tris . final de 20 mM. El pH se ajustó usando NaOH 1 M y luego se agregó agua, tal que la insulina se formuló como se describe en cada uno de los ejemplos individuales. a continuación. Esta- insulina ' contiene aproximadamente 13 ug/nL zinc.

B. Análogos de Insulina Para los análogos de insulina (ya sea insulina aspart' o insulina lispro),. .12 viales (10 mL cada uno) del producto comercial (Insulina lispro: Eli Lilly HumalogMR (insulina lispro) 100 ü/rr.L, Lote A572364; Insulina aspart: Novo Nordisk,. NovoRapidMR (insulina aspart), Lot XS60195; Insulina Glulisina: insulina ApidraR ) se combinaron y se concentraron usando un concentrador de columna Amicon Ultr cel-10 . K (Insulina lispro) o 3K (Insulina, aspart) hasta que la concentración final fue de aproximadamente .'. 5 veces, la concentración original. Los análogos de insulina se precipitaron por la adición de acetato de sodio. 1 M, pH 5.3 y cloruro de zinc 30 mM (ZnCl2, EMD, Cat o.. ZX0065-1) a 1/10 del volumen de solución de proteina. Las soluciones se colocaron sobre hielo durante -30 minutos seguido. por centrifugación, a 5600 rpm durante 20 minutos en una Centrifuga. Avanti J-E con un rotor de' con cubeta oscilante JS-5.3 (Beckman Coulter) . El sobrenadante se decantó, y la pelotilla se. resuspendió y lavó con acetato d sodio 20 mM, cloruro de zinc .2 mM, · solución con pH 5.5. La solución re suspendida se centrifugo como se describe en lo. anterior. La etapa de lavado se repitió un total de 5 veces. Un lavado final se llevó a cabo con acetato de sodio,.20 mM, pH 5.5 para remover todas las trazas de cloruro de zinc, La pasta de proteína resultante se disolvió con agua que contiene HC1 de 20 mM. Después de la dilución completa, se agregó Tris 250 mM, pH 10.7 a una concentración final de . Tris de 20, mM.. El pH de la solución resultante se ajustó tal que el análogo de insulina se formuló como se describe, en cada uno de los ejemplos individuales posteriores y la. concentración de la proteína se ajustó. a aproximadamente 15-20 mg/mL. Un' análogo de insulina preparado en esta forma . tuvo típicamente un rendimiento de aproximadamente 90%, con una concentración de conservador residual a menor que 100 veces el material -de partida . '¦ . ".

Ejemplo 2 Determinación de la actividad de hialuronidasa de rHuPH20 La actividad de hialuronidasa de rHuPH20 (obtenida por la expresión ,y secreción en las células CHO de uri ácido nucleico que codifica los aminoácidos 36-482 de SEQ ID NO: 1) se determinó usando un ensayo turbidimétrico . ??· los primeros dos ensayos (A y B)., la actividad de hialuronidása de rHuPH20 se midió al incubar la rHuPH20 con hialuronato de sodio (ácido . hialurónico) y luego al precipitar el hialuronato.de sodio no digerido, por la adición de albúmina de suero acidificada. En . el tercer ensayo (C) , la actividad 'de a hialuronidasa rHuPH20 se midió con base en la formación de un precipitado insoluole cuando el ácido hialurónico (HA) se liga con el cloruro de cetilpiridinio (CPC) . En todos los ensayos que contienen .600 U/mL de. rHuPH20 (5 g/mL) , . los criterios de aceptación fueron la actividad enzimática por arriba de 375 U/mL.

A. Ensayo de Microturbiedad En este ensayo, la actividad de. la hialüronidasa de rHuPH20 al incubar rHuPH20 soluble , con. hialuronato de sodio (ácido hialurónico) para un periodo de tiempo establecido (10 minutos) y luego al precipitar el hialuronato de sodio no digerido con la adición de albúmina de suero acidificada. La turbiedad de la muestra resultante se midió a 640 nm después de un periodo de desarrollo de 30 minutos. La disminución¦ en la turbiedad que; resulta de la actividad enzimática es sustrato de hialuronato de sodio fue una medición de en la actividad de la hialüronidasa de rHuPH20 de soluble. El método se llevó a cabo usando una curva de calibración generada con diluciones . de un estándar de referencia de trabajo de ensayo de rHuPH20 soluble, y ' se hicieron mediciones de la actividad de la muestra relativas con esta curva de calibración. Las diluciones de la muestra se prepararon en Soluciones Diluyentes de Enzimas. La Solución Diluyente de. Enzimas se preparó al disolver 33.0 + 0..05 mg de gelatina hidrolizada en 25.0 mL de solución amortiguadora de reacción PIPES 50 mM (NaCl 140 mM, PIPES 50 mM, pH 5.5) .y 25.0 mL de Agua Estéril para Inyección . (SWFI; Braun, número de producto R5000-1) y al diluirse 0.2 mL de una Solución de Albúmina, de Suero. Humana al 25% (US Biologicals) en la mezcla y con agitación vortic al durante 20 minutos. Esto sé llevó a cabo dentro de 2 horas de uso y se almacenó sobre hielo asta que fue necesario. Las muestras, se diluyeron a 1-2 U/mL estimado. Generalmente, la dilución máxima por etapa no excedió 1: 100 y el tamaño de la muestra inicial para la primera dilución , no . fue menor que 20 yL. Los .volúmenes mínimos de la . muestra . necesitaron . llevar a cabo el ensayo donde: muestras. , en proceso, Fracciones FPLC : 80 uL; Sobrenadantes del Cultivo de Tejido: 1 mL; Material Concentrado 80 \i ; Material Purificado o de Etapa Final: ,80 uL- . Las diluciones se hicieron en triplicado en una placa · de 96 pocilios de Ligación Bajas de Proteínas, y 30 ÚL de cada dilución se transfirió a placas de fondo negro/transparente Optilux (BD Biosciences) .

Las diluciones de la rHuPH20 soluble conocida con la concentración de 2.5 U/mL se prepararon en Solución- Diluyente de Enzimas para generar una curva estándar y se agregaron, a la placa Optilux en triplicado. Las diluciones incluyeron ¦ 0 U/mL, 0.25 U/mL, 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, 1.5 U/mL, 2.0 U/mL, .. y 2.5 U/mL-. Los pocilios de "Blanco .de Reactivo" contuvieron ,60 µ de Solución Diluyente de Enzimas se incluyeron en la placa como un control negativo. La placa luego se cubrió .y calentó sobre un bloque térmico, durante 5 minutos a 37°C. La cubierta se removió y la placa se agito durante 10 segundos. Después de la agitación, la placa se regresó al. bloque térmico, y el Dispositivo de Manejo de Liquido MULTIDROP 384 se cebó con 0.25 mg/mL de la solución de hialuronato de sodio caliente (preparada al disolver 100 mg de hialuronato . de ·" sodio (LifeCore Biomedical) en 20.0 mL de SWFI . Esto se mezcló al hacerlo girar y/u oscilar suavemente a 2-8 °C. durante 2-4 horas, o hasta que se disolvió completamente) .. La. placa de reacción se transfirió al MULTIDROP 384 y la. reacción se inició al presionar la tecla de inicio, para dispensar 30 ]i de hialuronato de sodio en cada pocilio. La placa luego se removió del MULTIDROP 384 y se agitó, durante. 10 segundos antes de ser transferida a un bloque térmico con la cubierta de la placa colocada . : La. placa se incubó a 37°C durante 10 minutos .

El MULTIDROP 384 se preparó para detener la reacción al cebar la máquina con Solución de Trabajo en Suero y. al cambiar el ajuste del volumen a .240 µL. (25 mL de Solución Madre en Suero [1 volumen de Suero de Caballo (Sigma) se diluyó con 9 volúmenes- de Solución Amortiguadora de Acetato 500 mM y el pH se ajustó a 3.1 con ácido clorhídrico 75 mL de Solución Amortiguadora de Acetato 500 m ) . La placa se removió del bloque térmico y se colocó sobre el MULTIDROP 384 y 240 de las Soluciones de Trabajo en Suero se dispensaron en los pocilios. La placa se -removió y se agitó sobre un. lector de placas durante. 10 segundos-. Después de 15 minutos adicionales, la turbiedad de la muestra se midió a 640 nm. y la actividad de la hialuronidasa (en.U/mL). de cada muestra se determinó por el ajuste, a la curva estándar.

La actividad especifica (Unidades/mg) se calculó al dividir la actividad de la hialuronidasa (ü/ml) por la concentración de proteínas (mg/mL) .

B. Ensayo de Turbiedad para la Actividad Enzimática de la rHuPH20 ¦ Las muestras se diluyeron con Diluyentes de Enzimas [66 mg de hidrolizado de gelatina (Sigma #G0262) disuelto en 50 mL de Solución Amortiguadora de Fosfato (fosfato -25 mM, pH 6.3, NaCl 140) y 50 mL · de Agua des-ionizada (DI)] para lograr una concentración, de enzimas esperada de entre 0.3 y 1.5 U/mL.

Cada uno de los dos tubos de prueba se etiquetó 1, 2, 3, 4, 5, o 6 Estándar, y los tubos de prueba duplicada para cada muestra al ser analizada (etiquetada por consiguiente) se colocaron en un calentador de bloque a 37 °C. Los volúmenes de Diluyente de Enzima mostrados en . la siguiente Tabla se agregaron en duplicado .a los tubos de prueba estándares. 0.5.0 mL de Solución de Sustrato de HA [l.O.mL de .5 mg/mL ácido hialurónico (ICN # 362421) en agua DI, 9 mL de agua de DI, .10 mL¦ de Solución Amortiguadora] se dispenso en todos los tubos de prueba estándares y. de muestra. Los volúmenes de 1.5 U/mL USP de Estándar de Hialuronidasa USP . (USP # 31200) en el Diluy.ente de Enzimas se dispensaron en. los tubos de - prueba estándares duplicados cómo se indica en la Tabla 7 '¦: a continuación. Cuando, todos los. tubos de prueba .estándares se hablan completado, 0.50 mL de cada muestra se dispensó en cada uno de los tubos de prueba de . muestra duplicados:. Después de .una incubación de 30 minutos a 37 °C, 4.0 mL de Solución de Trabajo en Suer.o {50 mL de Solución Madre en suero [1 volumen de suero de caballo (manada donadora, cultivo celular sometido a prueba, ¦ cultivo de hibridoma sometido a prueba, origen USA), 9 volumen de Solución Amortiguadora de Acetato 500 mM, a.justar a pH '3.1, permitir reposar a temperatura ambiente 18-24 horas, almacenar a 4°C] más. 150 mL de Solución Amortiguadora, de Acetato 500 mM } .'se agregó a los tubos de prueba estándares que luego se removieron del calentador de bloque, se mezcló y se colocó a temperatura, ambiente. Los tubos de prueba de muestra se procesaron de esta manera hasta que todos los tubos de prUeba estándares y de muestra se procesaron.

Una solución ."blanco" se preparó al combinar 0.5 mL de Diluyente.de Enzimas, 0.25 mL de Agua DI, 0.25 mL dé Solución Amortiguadora de Fosfato y 4.0 mL de Solución de Trabajo de Suero. La solución se mezcló y una alícuota se transfirió a una cubeta desechable. Esta muestra se usó para poner a cero el espectrofotómetro a 640 nm .

Después una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente una alícuota de cada tubo de prueba estándar se transfirió a su vez a una cubeta desechable y se midió la absorbancia a 640 nm. Este procedimiento se repitió para los tubos de prueba' de. muestras duplicados.

Una curva de calibración lineal se construyó al graficar la concentración ¦ de hialuronidasa (U/mL)- versus la absorbancia observada. El análisis de regresión lineal se usó para ajusfar los datos (excluyendo los datos para 0.0 U/mL del estándar de calibración) y para, determinar el coeficiente de inclinación, intersección y correlación (r2).. Una ecuación de regresión de curva estándar y la absorbancia de la muestra observada se usaron para determinar las concentraciones de la muestra..

C. Ensayo de Turbiedad para la Actividad Enzimática de rHuPH20 El método turbidimétrico para la determinación de la actividad de la hialuronidasa y la concentración de enzimas se basó en la formación de un precipitado insoluble cuando el ácido . hialurónicó (HA) se liga con el cloruro de cetilpiridinio (CPG) . La actividad se : midió al incubar la hialuronidasa- con hialuronano para un periodo de tiempo establecido (30 minutos) y luego al precipitar el hialuronano no digerido por la visión de CPC. La turbiedad de la muestra resultante se mide .a 640 nm y la disminución de la turbiedad que resultó de la actividad enzimática en el sustrato HA fue una medición de la potencia de la' hialuronidasa. El método se lleva a. cabo usando una curva de calibración' generada con diluciones del estándar de referencia de trabajo de ensayo de rHuPH20., y las mediciones de la actividad de las muestras se hicieron relativas con la curva de calibración. El método se propuso para el análisis de la actividad de la rHuPH20 .en soluciones' después -.de la dilución a una concentración de —2 U/mL. El intervalo cuantitativo fue de 0.3 a 3 U/mL, aunque para el desempeño : óptimo de prueba de rutina se obtuvo- en el intervalo de 1 a 3 U/mL.

El diluyente de enzima se preparó fresco al disolver 100 mg ± 10 mg de hidrolizado. de gelatina (Sigma #G0262) en 75 mL de la Solución Amortiguadora de Reacción (NaCl 140. mM, PIPES 50 mM ( 1 , -piperazina-bis- (ácido 2-etanosulfónico) ) , pH 5.3) ácido libre (Mallinckrodt #V249) y 74.4 mL de. Agua Estéril para' Irrigación (SWFI) y al agregar 0.6 mL Albúmina de Suero Humana al 25% (HSA) . Un blanco . de espectrofotómetro se preparó al agregar 1.0. mL de Diluyente . de Enzimas a un tubo de prueba y se colocó en un blogue térmico precalentado a 37°C. Se preparó un Estándar de Referencia Diluido, al hacer una dilución 1:25 del Estándar de Referencia de Trabajo de Ensayo rHuPH20 en. triplicado al agregar 120 pL¦· del Estándar de Referencia de Trabajo de Ensayo a 29.880 mL del Diluyent'e de Enzimas. Las diluciones apropiadas de cada muestra se prepararon en triplicado para producir ~2 U/mL de una solución .

Los volúmenes del Diluyente de Enzimas se dispensaron en triplicado en tubos de prueba Estándares de acuerdo con la Tabla 8. 500 de una solución de 1.0 mg/mL de hialuronato de sodio (Lifecore, #81, con un peso molecular promedio de 20-50 kDa) en SWFI se dispensó en todos los tubos de prueba excepto en el blanco, y los tubos se colocaron- en el bloque. térmico a 37°C durante 5 minutos. La cantidad del Estándar de Referencia Diluido indicado en la Tabla 7 se agregó a los tubos de prueba Estándares apropiados, se mezcló y se regresó al bloque térmico. 5.00 pL de cada muestra se agregaron a los tubos apropiados en triplicado. 30 minutos después de que se inició el primer, tubo Estándar, 4.0. mL de. . Solución de Detención (5.0 mg/mL de cloruro de. cetilpiridinio (Sigma, Cat # C-5460) se disolvió en SWFI y se hizó pasar a través de un filtro de 0.22 mieras) a todos los tubos (incluyendo el Blanco),, que luego ' se: mezclaron y se colocaron, a temperatura ambiente .

El espectrofotómetro se "blanqueó" a 640 nm de longitud de onda fija. Después . de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. Aproximadamente 1 mL de Estándar o Muestra se transfirió a una cubeta desechable y. la absorbancia se leyó a 640 nm. Los valores .de -datos sin procesar del Estándar y Muestra de referencia se analizaron empleando el software de computadora GRAPHPAD PRISMMR (Hearne Scientific Software) usando una función de descomposición exponencial limitada a .0 en la descomposición completa. Se determinó y se usó la curva estándar mejor ajustada para calcular las concentraciones de muestra correspondiente.

Ejemplo 3 RP-HPLC En este ejemplo, se usó la HPLC de fase inversa (RP-HPLC) para determinar la solubilidad evidente de la insulina y los análogos.' de insulina y el porcentaje de pureza de la rHuPH20. La solubilidad evidente.se midió. como el porcentaje de recuperación de insulina como es comparada con las formulaciones/condiciones iniciales.

Estándares de Referencia Para la insulina regular, HumulinMR (insulina, regular, 100' U) se usó como el estándar. Para la insulina lispro, un vial de USP Lispro se reconstituyó con 1.72 mL de HC1 0.01 N dando por resultado 3.5 mg/mL del estándar de referencia USP Lispro (100 U/mL) . Para la insulina aspart, un vial de EP Aspart se reconstituyó con G.00 mL de HC.1 0.01 N dando por resultado 3.89 mg/mL del estándar de referencia EP Aspart. Para la rHuPH20, se, usaron tres estándares de referencia, cada uno conteniendo 2.5 g/mL, 5.0 g/mL o.7.5. µg/mL de rHuPH20, generada al diluir 50 pg/mL de una muestra de rHuPH20 (Lot HUB0701EB) con una cantidad apropiada del diluyente de muestra ' (Tris 20 mM, NaCl 130 , mM, . 0.01% de Poloxámero 188, pH 7.3) .

Estándares Conservadores Se usaron tres estándares de referencia conservadores, cada uno conteniendo 0.05% de metacresol/fenol, · 0.10% de metacresol/fenol o 0.15% de metacresol/fenol .

Preparación de la Muestra Las muestras se diluyeron, si es necesario,, en diluyente de muestra tal que la insulina/análogo de insulina estuvo presente a- 100 U/mL ' y la rHuPH20 se presentó a 5 ug/mL. Las muestras se prepararon al retirar 100 µ? de cada vial en cada punto de tiempo y centrifugación antes de la carga. Las muestras se almacenaron en un automuestreador. a 4°C antes del uso, y se consideraron estables durante 3 días después, de la preparación. Todas las muestras se sometieron a prueba en duplicado . ¦ .

Para la insulina, se inyectaron .20 ] para cada operación de HPLC. Para la rHuPH20, 100. ]i se inyectaron para cada operación de HPLC.. Los parámetros de la columna HPLC ' y el método se. expone en la Tabla 9 a continuación.. El gradiente de HPLC se expone en la Tabla .10 a continuación.

A. Solubilidad de la Insulina Para determinar la solubilidad evidente, el área pieo del pico principal y pico de desamido de la insulina/análogo de insulina se integraron y se combinaron' conjuntamente para calcular el porcentaje relativo con los estándares.' La solubilidad se expresó como porcentaje relativo al estándar, con 100% que es 120 . U/mL. Los datos ' se procesaron usando Design-ExpertMR 7.0 (S.tatEase) y la característica de "datos históricos". El porcentaje de pureza de la insulina se expresó, como el porcentaje de la insulina principal versus todas las especies de insulinas.

B. Porcentaje de Pureza de la rHuPH20 y Porcentaje de Recuperación El porcentaje de pureza de la rHuPH20 se expresó como el porcentaje de la rHuPH20 versus- todas las especies de rHuPH20. El porcentaje de recuperación de la rHuPH20 se expresó como el porcentaje relativo al estándar, con 100% que es 5 g/mL. La especificación objetivo es 3-7 µg/mL (60-140%) Ejemplo 4 Cromatografía de Exclusión de Tamaño En este ejemplo, las formulaciones de insuliria/rHuPH20 se analizaron por la cromatografía líquida de alto desempeño de exclusión de. tamaño (SEC-HPLC) para determinar las cantidades relativas de la proteína de peso molecular, alto (HMWP) , es decir,, agregados covalentemente ligados, de insulina y rHuPH20 presentes en la muestra. Para la SEC de desnaturalización, la fase móvil fue L-arginina. y ácido acético glacial en acetonitrilo . Para la SEG no ' desnaturalización, . que . se usó como se describe en el Ejemplo 29, la fase móvil fue solución' salina amortiguada con fosfato . ' ¦ -A. SEC de Desnaturalización 1. Estándares de Referencia Humu.linKR R (insulina regular, Lilly, concentrada, NDC 0002-8501-01) o insulina humana USP (USP Cat ' # I1F270) y rHuPH20 (lote HUA0703MA o HUB0701EB con sus actividades especificas a 120,000 U/mg y 110,000 U.mg, respectivamente) se- usaron como estándares de referencia. Los estándares de referencia que contienen tanto insulina como rHuPH20, se prepararon en concentraciones similares a las concentraciones de muestra esperadas, es decir, 100 U/mL de insulina y 5 µg/mL de rHuPH20. Las formulaciones liquidas se diluyeron en diluyente Tris 25, mM, pH 7.3. Las cantidades pesadas de Insulina Humana ' USP se diluyeron en diluyente Tris enriquecido con TFA (2 µ? de TFA/mL de Tris). Las muestras de referencia se almacenaron en viales de HPLC a 10°C antes del uso. 2. Preparación de la Muestra Si es necesario, las muestras se diluyeron en diluyente Tris tal que la insulina estuvo presente en el intervalo de i-100 U/mL y la rHu.PH20 estuvo presente en el intervalo de 1- 1000 µ?/G???,. Las muestras se almacenaron en viales de HPLC a 10 °C antes del uso", por hasta 3 días. 3. Preparación de la HPLC La fase móvil se preparó al combinar. 650 mL, 1.0 rng/mL de L-arginina, 150 mL de ácido acético glacial y 200 mL de acetonitrilo . Los parámetros de la columna HPLC y el . método se exponen en la Tabla 11 a continuación. El pico de la rHuPH20. se presenta alrededor de 13.8 minutos y el pico de la insulina se presenta alrededor de 20.2 minutos.

B. SEC No Desnaturalizante 1. Estándares de Referencia HumalogMR 100, (insulina' lispro, Eli Lilly. Cat # VL-15.10), NovoLogMR 100 (insulina aspart, . Novo Nordisk Cat .'# 750111). y rHuPH20 . (lote T09RD02 [actividad especifica 122, OOOU/mg] , HUA0703MA [actividad especifica 120,000 ü/rag] · o HUB0701EB [actividad especifica 122,000 U/mg] ) se usaron como estándares de referéncia. Los estándares -de referencia, .que contienen tanto insulina como rHuPH20, se prepararon en concentraciones similares a las concentraciones de muestra esperadas, es decir, 100 U/mL de. insulina y 5 ug/mL de rHuPH20. Las muestras de referencia se almacenaron en viales de HPLC a 10°C antes del uso. 2. Preparación de la Muestra Si es necesario, las muestras se diluyeron en diluyente de muestra (Tris 20 mM, NaCl 130 mM, 0.01% de Poloxámero 188, pH 7.3) tal que la insulina estuvo presente en el intervalo de 1-100 U/mL la rHuPH20 estuvo presente; en el intervalo de 1-20 g/mL. Las muestras se almacenaron en viales de . HPLC a 1C °C antes del uso, por hasta 3 días. 3. Preparación de la HPLC Se preparó una Solución Salina Amortiguada con Fosfato (PBS) 0.5 X al diluir 10 X de PBS con agua de grado HPLC . Los parámetros' dé la columna. HPLC y el método se. exponen en la Tabla 12 a continuación. El pico de la rHuPH20 se presenta alrededor de 13 minutos y el pico de la insulina se presenta alrededor de 18.6 minutos.

C. Porcentaje de Pureza de la Insulina El porcentaje de pureza de la insulina se expresó como porcentaje del pico principal de la insulina versus los picos de la insulina totales. La especificación objetivo es menor que 2% de proteina de peso molecular alto, es decir, agregados ele insulina. ' Ejemplo 5 Métodos de Prueba - Osmolaridad, Turbiedad y pH En este, ejemplo, : se describen los métodos de prueba usado para terminar la apariencia, ' osmolaridad, turbiedad y pH¦ de las formulaciones de insulina/análogo de insulina y rHuPH20. Estos métodos de prueba se unan en los Ejemplos subsecuentes.

A. Apariencia 1. Análisis Visual La apariencia de 'las formulaciones, de insulina/rHuPH20 se determinó por el análisis visual, cualitativo de la solución de insulina/rHuPH20 en un vial de vidrio de tipo I. La evaluación de la coloración y claridad: de la solución se determinó por la comparación a aquella, del agua estéril US.P (o equivalente) para irrigación. (SWFI). La solución acuosa se determinó que es clara si su claridad fue la misma como aquella de la SWFI. La solución acuosa se determinó que és incolora si tuvo, la apariencia de la SWFI. Los viales se sometieron, a prueba a temperatura ambiente y se. tomó cuidado para no provocar turbulencia necesaria y/o burbujas de aire en las soluciones¦ mientras que se agita y/o se¦ invierte. Si es necesario, los viales se limpiaron sin derramamiento . o con paños .sin pelusa y' 70% de etanol antes de la prueba.. El procedimiento fue como sigue, una fuente de luz direccional con una lámpara de 150 W o mayor se encendió. Las muestras se prepararon en una . campana . Las muestras que se sometieron, a prueba se invirtieron suavemente para asegurar la homogeneidad antes de la¦ transferencia de >0.5. mL usando la técnica aséptica a un vial de vidrio de Tipo I para prueba. Se preparó una muestra SWFI de la misma manera. Los viales de muestra de prueba preparada y SWFI se. invirtieron suavemente para asegura la homogeneidad, teniendo¦ cuidado de no introducir ningunas burbujas de aire. Los viales de muestra de prueba y S FI. se compararon visualmente para. el color contra un fondo blanco con el . rillo de la fuente de luz. en un ángulo a través, del fondo de los viales. La solución se consideró incolora si tuvo la misma .apariencia de la SWFI . Los viales de muestra de prueba y SWFI se compararon visualmente para claridad contra un fondo negro, con el brillo de la fuente de luz en un ángulo a través del fondo ' de los viales. La solución se, consideró clara sl: su claridad fue la misma, como aquella de la SWFI.'. El color, claridad y la presencia y grado de cualquiera de las partículas visibles y/o materia extraña se registraron. Los criterios de aceptación fueron una solución incolora, transparente. . 2. Método Iluminador En. este método, él grado de claridad y la coloración de los líquidos se evaluaron para asegurar (visualmente) la calidad del producto contra las especificaciones de apariencia aplicables. La inspección se llevó 'a cabo' en una cabina de inspección específicamente diseñada con luz de intensidad alta,, contra un fondo blanco y negro. Un líquido es transparente si su opalescencia no es más pronunciada que aquella de la Suspensión de Referencia. I. Una solución acuosa es incolora si tiene ia apariencia del agua o no es más intensamente coloreada, que la solución de referencia especificada (solución de referencia B9) . .¦ Preparación de las Soluciones de Referencia Se prepararon soluciones de . referencia de ¦ color al mezclar HC1 diluido y Estándar B de Color. EP (Brown Standard Solution, Ricca Chemicál, #2880) como se expone en la Tabla 13 a continuación. Las soluciones de referencia B9, Bs, B7, ?d se almacenaron en viales de 2 mL sellados con un tapón y un cierre de cápsula. Las soluciones de referencia se prepararon diariamente. Se colocaron 2 mL de SWFI en un vial sellado con un tapón y cierre de cápsula y se almacenó por hasta 1 año .

Las soluciones de referencia de claridad se prepararon como sigue. Una suspensión opalescente primaria, se preparó al mezclar 25 mL de hexametilenetetramina (2.5 g . en 25 mL de SWFI) y 25 mL de-sulfato de hidrazina (l;.g en 100 mL de SWFI) y al permitir que la solución se asiente durante 24 horas. La suspensión se almacenó. por hasta 2 meses en un recipiente de vidrio. La solución Estándar o de Opalescencia se preparó al diluir 45 de la solución opalescente primaria a 2955 de SWFI y al mezclarse bien. Esta solución fue. estable durante 3 meses. Las suspensiones de referencia I y II se prepararon al mezclar El Estándar u Opalescencia y SWFI como' se expone én la Tabla 13 a continuación. Las suspensiones de ' referencia se almacenaron en viales de 2 mL sellado co un tapón y cierre cápsula y se prepararon diariamente.

Las muestras del producto se prepararon primero, al mezclar la solución de producto y luego al transferir 2 mL a un vial mientras que se trabaja en una campana Clase 10.0. Los viales se sellaron con un tapón y cierre de cápsula. Se preparó una cabina de inspección visual y. la intensidad de la fuente de luz. se - verificó para asegurar, una Lux mayor que 1750. Las muestras del producto se compararon a las soluciones y suspensiones de referencia por la inspección visual. El color se comparó con las soluciones SWFI y de Referencia ??, B7, B8 y Bg se observa horizontalmente contra un fondo blanco. La claridad'. se comparó con las suspensiones de referencia I y II como se observa verticalménte contra un fondo negro. El grado de coloración y claridad ¦ y · grado de opalescencia se registraron como se expone en la Tabla 14 a continuación .

B. Concentración Osmótica La concentración osmótica (osmolaridad) se. determinó por la medición de depresión de punto de congelación. El método de prueba se propone para el análisis de una solución acuosa con una concentración osmótica entre 100,. y 500 mOsm/kg de agua. La osmometría . de depresión de punto de congelación implica el pipeteado de una muestra de la solución que se somete a prueba en un tubo y se coloca el tubo en la cámara de enfriamiento de un osmómetro. La muestra se supera en frío (enfriada por debajo del punto de congelación) y . luego se sembró (cristalización iniciada) por uno de una variedad de métodos (es decir,, vibración mecánica, vibración ultrasónica, choque térmico o por la adición de partículas de semilla sólidas. La temperatura de la muestra se eleva debido al calor de la fusión liberada durante el proceso de congelación hasta el equilibrio; en este punto solo una pequeña fracción del agua se congela, después de lo cual más agua se congela y la temperatura comienza a disminuir nuevamente, dando por resultado una región plana, o meseta, en la curva de enfriamiento. La temperatura en la meseta es. el punto de congelación de la. muestra y se puede convertir a unidades de osmolaridad (concentración osmótica) al observar que 1.0 Osmol disminuye el punto de congelación del agua por 1.858°C, donde. 1.0 Osmol = 1.0 mol de partículas osmóticamente activas = F(?) . (C) , donde: .

F = coeficiente osmótico; n = número dé partículas que resultan de la disociación ; de cada molécula en solución; y C = concentración de cada molécula en mol/kg de agua.

Se llevó a cabo una verificación de calibración (0-2000 mOsm/kg de agua) antes de cada uso del osmómetro (MicroOsmette Freeze Point Osmometer, odel. #5004, .Precisión Systems Inc.) con 500 mOsm/kg y 200 mOsm/kg de estándares. Después del encendido inicial, 10-15 minutos de tiempo de calentamiento se permitieron para equilibrar completamente la temperatura.' Las muestras, la sonda y el cable de semilla se limpiaron con un Kim Wipe antes de cada uso. Las muestras para prueba se prepararon al pipetear 50. µL de la solución de insulina/rHuPH20 en un tubo de muestra seco, limpio. El tubo se colocó en el refrigerador bien y . la osmolaridad se midió de acuerdo con el procedimiento de operación estándar.' Este procedimiento se preparó dos veces más para un total de tres resultados independientes por muestra de insulina/rHuPH20. Los datos sin procesar para cada lectura se registraron y se consideró una lectura válida, si todas las tres , lecturas estuvieron dentro de ± 5 mOsm/kg. El valor promedio para cada ¦muestra se reportó.. La osmolaridad / varía con base en la ¦ ¦ formulación, y los criterios de aceptación . se listan a continuación en cada - e emplo individual.

C. Turbiedad La turbiedad se determinó al medir la absorbancia de solución de insulina/rHuPH20 a 350 nm. Cuando ía luz pasa a través de una solución, la intensidad se atenúa por la absorbancia y el efecto de dispersión de luz de la solución. Para medir el efecto, de dispersión de luz debido .a una proteina en una solución, la longitud de onda de 350 nm se seleccionó para evitar el efecto de la absorbancia .·' de la proteina. La cantidad de luz dispersada se afecta significativamente por la concentración y tamaño de la molécula/partículas. La OD350 de una i solución blanca que contiene todos os-, componentes excepto la proteina . se sustrae para obtener una lectura final. 200 µ? de muestras ' de cada formulación de in'sulina/rHuPH20 que se someten a prueba se transfirieron a tres pocilios adyacentes de una placa de microtitulo de fondo plano UV de 96 pocilios. 200 pL de cada mezcla de excipiente, respectivo' de cada muestra (menos la proteina) se agregaron a tres pocilios adyacentes de la placa de microtitulo para, uso como un blanco de muestra. Se usó la S FI (200 µ?) como un blanco de placa. La OD350 de cada muestra se leyó en un lector en un lector de placas UV-Vis Spectramax . 384. plus¦· (Molecule Devices) . Cada'1 . lectura registró, se promediaron las lecturas, por triplicado y la absorbancia promedio del blanco de excipiente respectivo se sustrajo y se registró la turbiedad ajustada por el blanco resultante .

D. pH El pH se midió como se describe en el Compendio de la Farmacopea de. E.U. <791> (pharmacopeia.cn/v292407 usp29nf24s0_c791.html). Los criterios de aceptación variaron por formulación y se listan¦ a continuación en cada ejemplo individual. En general, el control de pH estricto (es decir, ±0.2) fue necesario para asegurar la solubilidad de la insulina y la estabilidad de la PH20. Sin embargo, la insulina no conservada, la solubilidad de la insulina- no se afectó por el pH por lo tanto los criterios de aceptación son grandes, (es decir, pH 7.0 a 7.8).

Ejemplo 6 Estabilidad de la rHuPH20 en formulaciones comerciales de insulina y análogos de insulina.

En este ejemplo, la estabilidad de la rHuPH20 en las formulaciones de insulina comercial y análogo de insulina se determinó al medir la actividad enzimática de la rHuPH2C después del almacenamiento a 5° C y 25° C. En resumen, aproximadamente 1500 U/mL de rHuPH20 se preparó en una. solución amortiguadora que contiene Hepes 10 mM y NaCl 130 mM, pH 7.0. Subsecuentemente,. 0.4 m.L de Humulin"R comercial (cada mL contiene 100 U de insulina, 2.5 mg/mL de metacresol y 16 mL.de glicerina (Eli Lilly)) o HumalogMR (cada mL contiene 100 U de insulina, 3.15 mg/mL metacresol, 16 mg de glicerina, 1.88 mg de Na2HP04, 0.0197 mg de ion de zinc: (óxido de zinc), y cantidad de trazas de fenol (Eli Lilly).) se agregaron 3.6 mL de solución rHuPH20 para formar una mezcla de insulina-rHuPH20 o análogo de insulina-rHuPH20 (10x de dilución para, los productos de insulina, concentración de rHuPH20 final de 1350 U/mL) . Estas soluciones se almacenaron a 5o G y 25° C por hasta.l semana. La actividad enzimática de la rHuPH2O se midió en los dias 0, 1, 2, 3, y como se describe en el Ejemplo 2B anterior. Los resultados se exponen en la Tabla 15 ..a continuación. Como se muestra en la Tabla 15, 50% de la actividad de rHuPH20 ' se perdió para la combinación de HumalogMR-rHuPH20 (insulina lispro-rHuPH20 ) cuando' se incubó durante 2 dias o más tiempo a 25° C. No se observó pérdida significativa para la HumulinMR-rHuPH20 almacenada a 25° C, presumiblemente debido a un nivel más bajo de conservador en ese producto especifico y del factor de dilución.

Ejemplo 7 Efectos en los conservadores en la rHuPH20 En este ejemplo," varios conservadores de insulina y análogo de insulina comunes se evaluaron para sus efectos en la actividad enzimática y la estabilidad de rHuPH20. La actividad enzimática de la rHu-PH-20 se midió como ' se describe en el Ejemplo 2 anterior. Donde es aplicable, la estabilidad de la rHuPH20 se determinó por la cromatografía de . exclusión de tamaño (SEC) como se describe en el Ejemplo 4 anterior.

A. Actividad enzimática de la rHuPH20 En este ejemplo,, los conservadores de la insulina común y ¦ el análogo de insulina .fenol, N-'cresol y met ilparabeno se valuaron por sus efectos en la actividad enzimática de la rHuPH20 en concentraciones variantes, temperaturas y tiempo. Cada conservador se agregó (para una concentración final indicada . en la Tabla 16 .a continuación) a las formulaciones de insulina./rHuPH20 que contienen .3.7 mg/mL de polvo de . insulina (Organon Insulin API [Insulina Humana . Recombinante SIHR 143]' se usó. para preparar la solución madre como se detalla en el Ejemplo 1), y 20 g/mL de rHuPH20 en Tris/HC1.20 mM, pH 7.1. y. NaC.l 140 mM y las muestras se incubaron en la temperatura indicada para la cantidad de tiempo predeterminada.

Los resultados se muestran - en la Tabla 16 a continuación, que expone el conservador y su concentración, el tiempo y temperatura de incubación, y la actividad enzimática de la rHuPH20. Los resultados ' son dependientes de la temperatura. La actividad enzimática de la rHuPH20 se redujo, significativamente después de una semana- de incubación a 35°C cuando el nivel de conservador total es relativamente alto (>0.2%) . En contraste, a temperatura ambiente (25°C) y en ..concentraciones de conservadores más bajas, la rHuPH20 mantiene .su actividad relativa durante por lo menos un mes. Generalmente, conforme el nivel de los conservadores se incrementa, disminuye la actividad enzimática de la rHuPH20. Adicionalmente., parece que entre los tres conservadores, el m-cresol es el más perjudicial al rHuPH20' seguido por el fenol y metilparabeno .

LOD, nivel de. detección : . Metilparabeno no es soluble a 0.4%; estos números fueron inesperadamente bajos y se trataron como "valores atipicos".

B. Temperatura de fusión evidente (Tm) de la rHuPH20 En este ejemplo, la temperatura de fusión' (Tm) de rHuPH20 en la . presencia y. ausencia ¦ de m-cresol, propilparabeno . o fehoxietanol se determine al medir, el radio hidrodinámico de las partículas usando la dispersión de luz dinámica. El incremento del tamaño de partícula es debido de manera presumible a la desnaturalización y agregación subsecuente de la rHuPH20. Conforme la temperatura se incrementa, las proteínas se desplegarán lo que conducirá . a la formación de agregado.

¦ En resumen, la rHuPH20 (Lot HuB, 10 mg/mL de solución madre) se diluyó a. 1 mg/mL en Tris-HCl 25 mM, pH' 7.5. Los conservadores indicados se enriquecieron en las muestras de PH20 de una solución madre al 100%. El tamaño de partícula promedio Z se midió por dispersión de luz dinámica usando un dimensionador Malvern Zeta Nano-ZS como, una ·'. función para incrementar la temperatura. Un . total de 3 mediciones se hicieron en cada temperatura en una cubeta de cuarzo de volumen bajo (Helma., 3.00 mm) . La temperatura comenzó a 20°C, con una elevación de 2°C, a una temperatura final dé' 66°C, con un período de equilibrio de .5 minutos en cada temperatura. La intensidad de dispersión de luz se midió con un; detector de retro dispersión de 173° equipado' con el instrumento y los datos de partícula promedio Z acumulativos se calcularon con el software DTS (software de tecnología de dispersión) usando un índice' de refracción de 1.45 para las muestras de proteínas, y usando . un índice de refracción de 1.33 para el agua como dispersante. El punto de inflexión en -el eje de la temperatura en la cual existe .un incremento significativo en el tamaño de partículas se considera que es la TM evidente (temperatura de fusión) donde la proteína se desnaturaliza y comienza a agregarse.

Los resultados se muestran en la Tabla 17 a continuación, expone el tamaño de partícula promedio en varias temperaturas para 5 formulaciones de PH20 diferentes, como se muestra en la Tabla 17 a continuación. Los. datos en la Tabla 17 son un promedio de 3 mediciones por punto, en incrementos de temperatura de 2°C con un punto.de equilibrio de 5 minutos. Los resultados muestran que la Tm de la rHuPH20 descendió de aproximadamente 40°C sin ningún ¦ conservador . a 26°C en presencia de 0.25% de m-cresol. Se observó una tendencia similar usando calorimetría de exploración diferencial (DSC) para medir la Tm de la rHuPH20 con o sin m-cresol, sin embargo la Tm se redujo solamente, de manera aproximada 2°C en presencia de 0.25%. de. m-cresol.

C. Afinidad de ligación para la rHuPH20 La espectroscopia de fluorescencia de titulación se usó para medir la . afinidad de enlace evidente. de los conservadores a la rHuPH20 a fin de entender adicipnálrnente cómo interactúan los conservadores con la rHuPH20. Este estudio se llevó a cabo en BióDesign, ' LLC (Johnstown, CO) .

Los análogos de insulina Lispro (estándar de referencia USP, Cat. #1342321) y Aspart '(estándar de referencia EU, Cat. #Y0000349) se recibieron en · forma de .'polvo y se reconstituyeron con 857 pL. de agua des ionizada 18. ?O y 23 de HC1 1 mL. 120 de Tris 250 mM (pH 10.65) se agregaron a cada solución estándar llevando el pH a 7.4 y el volumen a l mL. 2,5 mL de 1 mg/mL. de soluciones de cada estándar y las dos soluciones de. insulina se prepararon por. dilución con Tris 30 mM, pH 7;.;4. Las soluciones fueron transparentes e incoloras en el momento de la dilución, excepto el estándar de la insulina Lispro USP que fue nebulosa en la .dilución, pero se volvió transparente con una hora de preparación. Las dos muestras se prepararon cada¦ una para insulina Aspart e insulina Lispro, con el estándar de referencia , y el' material fabricado. Los espectros de emisión de fluorescencia de 1 mg/mL de soluciones de insulina se recolectaron usando un Espectrofluorómetro Aviv Modelo ATF 105. y la versión de software Aviv 105 1.3. Se cargó una celda fluorescente de cuarzo con 2.5 raL de solución de cada medición. La excitación se llevó a cabo a 275 nm con un ancho de banda de 4 nm. Los espectros de emisión se recolectaron entre 340 nm y 280 nm con una resolución de 1 nm. El voltaje PMT se ajustó a 850 V, mientras que el voltaje PMT (QC) de referencia se ajustó '/a 250 V.

Los datos mostraron que aunque hubo alguna interacción entre los conservadores y la rHuPH20, los tres conservadores sometidos a prueba (m-cresol,' fenol, y alcohol bencílico) no alteraron la estructura de la .rHuPH20. , Las constantes de disociación evidentes (Kp) para las interacciones de la rHuPH2C con los conservadores, varió de. 40 a 3000 µ?, con la mayoría de datos típicamente en el intervalo de 50 a 100 µ?. Los datos también .indicaron que aunque la rHuPH20 es sensible a los compuestos fenóiicos, parece que esta., es una interacción específica y es sumamente dependiente en la temperatura ambiental. La conclusión de la interacción específica fue apoyada adicionaimente por el hecho de que la adición de un compuesto estructuralmente similar, fe.nilalanina, no protegió la rHuPH20 contra la degradación provocada por. el m-cresol o fenol . (véase Sección E posteriormente) .

D. Otros conservadores comunes.

A fin de determinar si la rHuPH20 es sensible a todos los conservadores o. solo aquellos usados típicamente en los productos de insulina, varios otros conservadores comerciales se sometieron a prueba para su efecto en la actividad enzimática y estabilidad de la rHuPH20. Adicionalmente, se agregó fenilalanina como un estabilizador potencial para evaluar si el efecto perjudicial de los conservadores en la actividad de la rHuPH20 es mediado solamente por el anillo fenólico presente en varios de los conservadores perjudiciales. Se planteó la hipótesis de que la fenilalanina podría ser capaz de competir con los conservadores . fenólicos y proporcionar un efecto estabilizante.

En estos estudios, un total de 100 µg/mL de la rHuPH2:0 se agregaron a las formulaciones base y contuvieron , RIS/HCL, pH 7.3, NaCl 140 mM, 0.01% polisorbato 80 y los conservadores seleccionados en el nivel especificado. La concentración elegida para cada uno de los conservadores' se basó principalmente en. los datos de literatura (véase, por ejemplo, Kibbe, A. H . , (2000) Handbook de Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, Pharmaceutical Press; Powell y colaboradores, (1998) PDA Journal de Pharmaceutical Science y . 450 . . ..

Technology) y los niveles conocidos por estar presentes en los productos comerciales existentes.

Los resultados se exponen en : . la Tabla 18-20 a continuación. Los resultados muestran que las sales de clorhexidina y. timerosal no afectan la actividad enzimática de la rHuPH20. En contraste, la adición de ya sea cloruro de benzalconio o 4-cloro-l-butanol provocaron una reducción significativa en la actividad enzimática . de la rHuPH20 después de solo.. 24 ; horas a 25 °C. La adición ya sea fenoxietanol o m-cresol provocó una . reducción en la. actividad de la rHuPH20 en. una manera dependiente de temperátura. A 4°C, la actividad de la rHuPH20 fue de aproximadamente la misma como la muestra de control que no contuvo un conservador, mientras que a 35°C la actividad¦ de la rHuPH20 se abolió en tan poco como 48 horas (véase Tabla 20) . El metilparabeno tuvo generalmente poco efecto en la actividad enzimática de la rHuPH20 a 25 °C o pocos periodos de tiempos cortos, por ejemplo, 24 horas, a 35°G, pero toda la actividad enzimática se perdió después de la incubación a 35°C durante 6 días. Adicionalmente, el metilparabeno es un conservador menos efectivo como es comparado con el m-cresol o fenol. La adicióh de la fenilalariina a ya sea la concentración- baja " (5 mM) o concentración alta (50 mM) no afectó la pérdida de la actividad de la rHuPH20 en presencia de los conservadores fenólicos m-cresol y metilparabeno .

La pérdida de . Ta actividad enzimática provocada por la adición de los conservadores y la temperatura elevada se atribuyó principalmente a la formación de los ' agregados de rHuPH20. Como se muestra en las Tablas 21-22 a continuación, a 35°C> una pérdida del pico principal, como es medido como la cromatografía de exclusión de tamaño fue concomitante con la pérdida o la actividad. enzimática de la rHuPH20 . (véase Tablas '21-22) . Adicionalmente , se observó, un pico . de. agregado significativo de las muestras que contienen m-cresol cuando se almacenaron a 35°C. Los conservadores, comunes provocan la pérdida de a actividad de la rHuPH20 a temperaturas elevadas a través del tiempo. Se identificaron los conservadores más compatibles, por ejemplo, timerosal y sales de clorhexidina.

E. Niveles conservadores y efectividad antimicrobiana Actualmente, . diferentes agencias reguladoras tienen diferentes criterios de la farmacopea para la efectividad antimicrobiana para los productos f rmacéuticos diseñados para múltiple dosificación. La Tabla 23. muestra ' los criterios para fármacos inyectables para cumplir con los criterios USP y EP. De esta manera, fue necesario determinar las concentraciones de conservadores mínimas necesarias para cumplir con los , diversos criterios a fin de evaluar adicionalmente los efectos.de los conservadores. en la rHuPH20.

Tabla 23. Requisitos USP y EP para la prueba de efectividad antimicrobiana Reducción de Logio unidades de inoculo medido inicial; sin incremento; no más de 0.5 Logio unidades de incremento que el valor previamente medido.

Varios lotes : de formulaciones que contienen diferentes niveles de conservadores con cantidades objetivo de, insulina y rHuPH20. se prepararon para la prueba de efectividad microbiana. Las pruebas se llevaron a cabo de acuerdo con la guía de EP y USP por un laboratorio analítico contratado por (Quadrants Scientific, Inc., San Diego, . CA) . Las formulaciones de insulina/rHuPH20 contuvieron: 100 U/mL de insulina (Organon Insulin. API, insulina Humana Recombinante SIHR 143), 5 µg./mL de rHuPH20, Tris/HCl de 20 mM, pH 7.2, NaCl de 150 mM y 0.02% de poloxámero 188. La insulina se preparó como se describe en el Ejemplo 1 anterior. Las diversas formulaciones que contienen conservadores se sometieron a prueba para efectividad antimicrobiana contra Aspergillus. niger, Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Staphylococcus aureus y Candida albicans . Las pruebas se condujeron al 1) agregar un inoculo . inicial (por lo' menos 105 CFU/mL) de cada bacteria a la muestra y 2) al medir la CFU/mL de cada bacteria a 6 horas, 1 día, y 7 dias . Los datos sin procesar (CFU/mL) se convirtieron a una reducción de log 10 unidades del inoculo medido. Las formulaciones se sometieron a prueba a una- temperatura de 37 °C y cada organismo se incubó separadamente con' cada formulación.

Los resultados se muestran en la Tabla 24, que establece los porcentajes de los .conservadores y si la combinación pasó o .falló a los criterios de efectividad antimicrobiana para EPA, EPB y USP. ' ^Resultado, basado en el valor de 7 días.

A :fin de determinar los niveles conservadores adecuados que cumplen con los criterios de efectividad ántimi.crobiana de USP, se llevó a cabo un estudio adicional de combinaciones de alcohol bencílico, fenol y m-cresol. -La formulación .básica contiene: 3.75 mg/mL de insulina (Grganon Insulin API , insulin Humana Recombinante SIHR 143 y la solución madre se preparó en la misma forma como se vería en el Ejemplo 1), 5 iq/mL de rHuPH20, Tris/.HCl 20 mM, pH 7.4, NaCl 140 mM y 0.02% de poloxámero 188. Los resultados, se muestran en la Tabla 25 a continuación, que expone los . porcentajes de los conservadores y si la combinación pasó o falló los efectos de efectividad antimicrobiana para USP. Con la excepción de la formulación # . 2, :todas las combinaciones pasaron a los criterios a los criterios de efectividad microbiana de USP. ·..· Tabla 25 . Pruebas de efectividad antimicrobiana USP de diferentes Se condujeron experimentos similares con otro porcentaje de combinaciones de. fenol y m-cresol.. Los resultados se representan en la Tabla 26.

Tabla 26. Niveles de conservadores mínimos necesarios para las directrices USP y EPB PA : Pseudomonas aeruginosa; EC: Escherichia coli; SA: Staphylpcoccus áureus ; . AN: Aspergillus niger; CA: Candida albicans .

Ejemplo 8 Efecto de las combinaciones de los conservadores y NaCl y pH en la solubilidad de la insulina y la actividad enzimatica de la rHuPH20 ? . Efecto de las combinaciones de los conservadores en actividad enzimatica de la rHuPH20.

Er. este ejemplo, las combinaciones de los conservadores de la insulina común y análogo de insulina se sometieron a prueba per sus efectos en la actividad enzimá.tica de la rfíuPH20 en concentraciones variantes a una temperatura de 30 °C durante 1. mes.; Cada conservador se agregó (para porcentajes finales indicados en la. Tabla 26 a continuación) a las formulaciones, de insulina/rHuPH20 que contienen 100 U/mL de insulina, "5 µg/mL (600 U/mL) de. rHuPH20, Tris/HCl 20 mM, pK 7.2, NaCl .150 mM y 0.02% de poloxámero 188 y las muestras se sometieron a prueba a T=0 y después de 1 mes de incubación a 30°C. La insulina se preparó como se describe en el Ejemplo 1 anterior y la rHuPH20 se preparó como se describe, en el Ejemplo 2.

Los resultados se exponen en la Tabla 27. a continuación, que expone los . conservadores en sus porcentajes, y la actividad enzimatica de la rHuPH20 en el tiempo T=0 y después de 1 mes de incubación a 30°C. Los resultados muestran que la incubación de la insUlina/rHuPH20 para 1 mes a -30°C en presencia de una o una. combinación de conservadores .fenólicos provoca una reducción, en la actividad enzimática de la rHuPH20.

En este ejemplo, las combinaciones del fenol y m-cresol se sometieron a prueba por' sus efectos en ¦ la actividad enzimática de las rHuPH20 y . concentraciones variantes., temperaturas y tiempos de incubación. Cada conservador se agregó (para porcentajes finales indicados en la Tabla 28 a continuación), a las formulaciones de ins,ulina/rHuPH20 que contienen 100 U/mL de. insulina, 5 g/mL (600 .U/mL) de rHuPH20, Tris/HCl 20· mM, pH 7.4, NaCl 50 mM, 50 mL de glicerina, metionina 50 mM, y 0.01% poloxámero 188..

Los resultados se exponen en la Tabla 28 a continuación, que expone los conservadores y sus porcentajes, la actividad enzimática de la rHuPH20 en varios tiempos de. incubación y temperaturas. Como se observe en lo anterior, la temperatura de almacenamiento tiene un efecto significativo en la actividad enzimática. Sin considerar el conservador, las muestras que se incubaron a 30°C. o 37 °C tuvieron actividad enzimática significativamente reducida como es- comparada con aquellas incubadas a 25 °C. Adicionalmente, el m-creso es más perjudicial en la actividad de la rHuEH20 que el .fenol. Ya que el porcentaje del m-creso se incrementó, la actividad enzimática de la rHuPH20 disminuyó.

ND, No determinado..

B. Efecto del NaCl y pH en la solubilidad de la insulina lispro y la actividad enzimática de la rHuPH20 En este ejemplo, se empleó un diseño de estudio factorial completo para determinar los efectos del NaCl y . pH en. la solubilidad de- la insulina lispro y', la actividad enzimática de la r.HuPH20 en presencia de 0.15% de méta-cresdl (m-cresol) y 0.15% de fenol. Cuatro valores de pH. diferentes y 4 concentraciones de NaCl se evaluaron, generando un; total de 16 muestras.

Todos los componentes, excepto- el pH . y NaCl 'se mantuvieron constantes a 120 U/mL de insulina lispro, 5 ug/mL de rHuPH20, Tris/HCl de 20 mM (Trizma,/ Sigma, Cat No. T6066):, 0.15% de rn-cresol, 0,15% de fenol, 0.01% de Poloxámero 188 (Poloxámero 188, Spectrum, Cat No. PI 169), y ZnCl2 agregado 0.1 mM (EMD, Cat No.. ZX0065-1). Los valores de pH probados fueron 7.0, 7.2, 7.4. y 7.6. Las concentraciones de NaCl sometidas a prueba fueron 50, 80, .110 y 140 mM. Los conservadores fueron fenol (Riedel-dh Haen, 16.017, múltiple compendia) y m-cresol (Fluka, Cat No. 65996) . El porcentaje de recuperación de insulina lispro . se determinó para cada muestra, después de almacenamiento a 2-8°C por 0, 0.25, 0.5, 1, 3, 5, 9 y 12 meses. La actividad enzimática de la rHuPH20 se midió par cada muestra, después de almacenamiento a' 5o .C durante 2 semanas, 1, 5, 9 y. 12 meses, a 25° C durante 1, 2 semanas y 1 mes, 30°. C durante 1 semana, y 2 semanas, y 35° C durante 1 semana. .. . ' .

Para preparar las 16 muestras, se prepararon 4 soluciones madre, cada una con una concentración de NaCl diferente. La insulina lispro se preparó como se describe en el Ejemplo 1 anterior,, con el pH de insulina final ajustado a 7.6. Todos los componentes comunes se agregaron a sus concentraciones finales. El pH de cada solución madre luego se tituló con NaOH 1N o 0.1 ·' N desde 7.6 hasta 7.0, secuencialmente . La precisión del pH se controló a ± 0.02. Cada vez que. se alcanzó el pH designado, se removió : 1 mL de la solución y se. rellenó en un vial de vidrio tipo-?· de 2. mL. Después que todas . las muestras se prepararon, se almacenaron a 2-8°C hasta que las pruebas se llevaron a cabo. La HPLC de fase inversa (RP-HPL.C) se llevó a cabo como se. describe en el ejemplo 3 anterior con las siguientes modificaciones. La fase móvil comenzó con el. 75%, 0.1% .de ácido trifluoroacético (TFA) en agua (A), y 25%-0.1% de TFA en . acetonitrilo (B) con un gradiente lineal. a 68% de A + 32% de B durante 16 minutos, con un. mantenimiento durante 4 minutos, seguido por un incremento lineal a , 100% de B durante 5 minutos.

La. Tabla 29: a continuación, expone la solubilidad, expresada como % restante de la concentración original (120 U/mL) , después del' almacenamiento a 2-8°C durante 12 meses. Las Tablas 30- 31. a continuación, exponen, la actividad enzimática de la rHuPH20 después de varios puntos de tiempo en diferentes temperaturas. La. Tabla 32 a continuación expone el porcentaje de recuperación de la rHuPH20 después de varios puntos de tiempo en diferentes temperaturas. Los resultados de la solubilidad de la insulina lispro y la actividad de la rHuPH20 se resumen a continuación.

Solubilidad de la Insulina Lispro Como se muestra en la Tabla 29 a continuación, la insulina Lispro es estable en concentraciones de sal bajas y pH alto. Por ejemplo, a un pH de' 7.6 la insulina Lispro fue estable durante por lo. menos 12 meses en NaCl de 50 y '80 mM, mientras que fue estable- durante solo 2 semanas NaCl G40 mM. En contraste, a un. pH de 7.0, la insulina lispro solo fue estable en NaCl 50 mM durante 5 meses. La solubilidad descendió por debajo de 65% cuando después de solo 1 semana en NaCl a 80, 110 o 140 mM NaCl.

Actividad Enzimática de la rHuPH20 Como se muestra en las Tablas 29-30 a continuación, la rHuFH20 es estable en concentraciones de sal altas y pH bajo. La rHuPH20 es estable a 5°C durante 12 meses, con una actividad de rHuPH20 más baja en NaCl 50 mM lueto en NaCl 140 mM. A 25°C, la actividad' enzimática de la rHu'PH20 se redujo en gran medida en. concentraciones de sal bajas después de solo una semana a un pH de 7.6 y después de 2 semanas a pH más bajo. A 30°C, la rHuPH20 retuvo la actividad enzimática útil solo en una concentración de NaCl 140 mM y. un pH de 7.0. Después de una semana a 35°C, . ningún significado de la actividad enzimática de' la rHuPH20 permaneció.

Tabla 30. Efecto dé la sal y pH en la Actividad Enzimática de la rHuPH20 a 35 "C, 30"C y 25"C " ¦„ ¦' = semana, M = mes *Por abajo del limite de detección.

Tabla 31. Efecto de la sal y pH en la actividad enzimática del rHuPH20 a 5°C = semana,, M = mes S = semana, = mes Ejemplo 9 Efecto de NaCl y pH en la estabilidad de la Insulina y actividad enzimática de la rHuPH20 bajo diferentes combinaciones de conservadores En . este, ejemplo, los efectos del NaCl y pH en la estabilidad de la insulina (insulina regular) y/o análogo . de insulina ( lispro o aspart ) , y la actividad enzimática de la rHuPH2C, se determinaron para varias condiciones de almacenamiento, incluyen almacenamiento a corto plazo y a largo plazo (7 días, 5 meses o 9 meses) a 2-8°C y almacenamiento a. corto plazo (un 'mes o menos) a temperaturas elevada,, que incluyen 35°C> 30°C y 25°C. .

Las formulaciones básicas se exponen en las secciones A-C a continuación. Para cada estudio individual, el pH y la concentración de . NaCl se varió mientras que los otros componentes de las composiciones permanecieron lo mismo. Para preparar las muestras para cada una de la insulina/análogo de insulinas en cada una de las combinaciones de conservadores predeterminadas, se prepararon 4 soluciones madre para cada uno de la insulina y/o análogos de insplina. Las soluciones madre de insulina y análogo de insulina se prepararon como se describe en el Ejemplo 1 anterior, con el pH de insulina final ajustado a 7.6. Cada solución madre contuvo los niveles apropiados de conservadores y la concentración de NaCl (50, 80, 110 o 140 mM) , y todos los otros componentes comunes que se agregaron a sus concentraciones finales. El pH de cada una de la solución madre luego se tituló con NaOH 1 o 0.1 N de 7.6 abajo del pH objetivo final, sécuencialmente . La precisión del pH se controló a ± 0.02. Cada vez que se alcanzó el pH designado, se removió 1 mL de la solución, se filtró a través de .un filtro PES de' 0.2 mieras, y se rellenó en un vial de vidrio de tipo 1 de 2 mL . Una vez que. todas las muestras se prepararon, se almacenaron a 2-8°C hasta que las pruebas se llevaron a cabo.

A. Estudio factorial completo para efectos de NaCl y pH en la solubilidad de la insulina/análogo de insulina a 2-8 °C durante 7 días En este ejemplo,- se empleó un diseño de estudio factorial completo para determinar los efectos de NaCl y pH en la solubilidad de la insulina regular y análogos lispro o aspart en la presencia de diferentes combinaciones de conservadores. Otros componentes de formulación, excepto el pH, NaCl y conservadores, se mantuvieron constantes a: 120 U/mL de insulina/análogo de insulina, .5 g/mL de rHuPH20 (600 U/mL) , Tris/HCl 20 ' mM (Trizma, Sigma, Cat No.;T606.6), 0.02% de PluronicMR. F68 (Poloxámero 188, Spectrum, Cat No. PI 169):, y ZnCl2 0.1 . mM (EMD, ¦ Cat No. ZX0065-1) . Se usaron tres combinaciones diferente de niveles de conservadores: 1) 0.15% de m-cresol (Fluka,. Cat No. 65996) y 0.2% de fenol (Riedel-dh Haen, 16017, múltiple . compendio) ; 2) 0.15% de m-cresol y 0.15% de fe ol; y 3) 0.15% de m-cresol y 0.2% de merilparabeno (Fluka, Cat No. 85265) . Con cada combinación de conservadores, se generó una combinación completa de 6 niveles de pH y ,4. niveles de concentraciones de. NaCl (total de 24 muestras). Los valores de pH probados fueron 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 y 7.6. Las. concentraciones de NaCl probadas fueron 50, 80, 110 y 140 mM.

Se llevó a cabo la HPLC de fase inversa ( P-HPLC) como se describe .en el. Ejemplo 3 anterior con las siguientes modificaciones. La. fase móvil comenzó con 75%, ¦ 0.1%, de ácido trifluoroacético (TFA) en agua (A), y 25%, 0.1% de TFA en acetonitrilo (B) con un gradiente lineal a 68% de A + 32¾ de B durante 16 minutos, con un mantenimiento durante 4 minutos, seguido por un incremento linea a 100% de B durante;'.5 minutos. Los resultados se muestran en las Tablas 33-35 '.a continuación, que exponen la solubilidad, expresada como % restante de la concentración original (120 U/mL) , después del almacenamiento a 2-8°C durante 7 días. La Tabla 33 expone los resultados para Lispro. La Tabla 34 expone los resultados para la insulina regular. La Tabla 35 expone los resultados para la Insulina áspart.

Las tres moléculas de insulina/análogo de insulina respondieron similarmente al pH y la concentración de NaCl . A un pH de bajo y en concentraciones de NaCl. altas, la insulina/análogo de - insulinas formaron cristales y precipitados, como . se indica por una disminución en el porcentaje de la insulina/análogo de. insulina restante." Estos resultados se verificaron por inspección visual. Los tres análogos de insulina/insulina fueron solubles . en todas las combinaciones de conservadores para pH > ,7.2 en NaCl 50 mM, pH > 7.4 en NaCl 80. mM y. a un pH de > 7.6 en NaCl 110 mM.

Similarmente, los tres análogos de insulina/insulina no fueron adecuadamente solubles (concentración observada < 90 U/mL o 75%). para pH < 6.8 en NaCl .140 mM y pH 6.6. en NaCl tanto 80 como .1.10 mM. Las tendencias exactas , para la solubilidad variaron: entre los tres análogos . de insulina/insulina .. Bajo las condiciones probadas, la insulina aspart fue la más¦ soluble seguido. por la insulina lispro y la insulina regular, que fue la menos soluble .. Hubo algunas diferencias en la compatibilidad conservadora, que a insulina aspart y la insulina regular má;s soluble en 0.15% de fenol y 0.15% de m-cfesol y la insulina lispro más soluble en 0.15% de m-cresol y 0.2% de metilparabeno . El metilparabeno parece. que es un mejor conservador cuando la concentración de sal es baja, sin embargo, en concentraciones de sal más altas, no se¦ observó diferencia entre, las muestras, que contienen fenol o metilparabeno.

La insulina regular no se disolvió completamente en concentraciones de NaCl más altas (¦> 110 mM) , aún a un pH de alto. La Tabla 34 confirma la solubilidad baja de la insulina, con más de 50% de las condiciones de prueba que tiene concentraciones . de insulina por: abajo de 90% de los valores originales después de solo 7 días a 2-8°C. La reducción de la concentración de fenol y/o reemplazo del fenol con metilparabeno incrementa la solubilidad ligeramente. Bajo estos experimentos,.. la pérdida en la solubilidad que acompaña un incremento; de 30 mM en la concentración de NaCl fue comparable a una reducción unitaria de pH 0.2. Estos datos muestran que las concentraciones ,.de NaCl altas afectarán la solubilidad de la insulina durante ? ? almacenamiento a 5°C y de esta manera las formulaciones de insulina regulares probablemente requerirán una concentración de NaCl reducida y/o pH incrementado relativo a los análogos de insulina .

B. Estudio de seguimiento con el nivel dé m-cresol reducido La solubilidad de la insulina se evaluó adicionalmente en un estudio de seguimiento simplificado co un nivel de m-cresol reducido. Se usaron cuatro combinaciones ' de niveles de conservadores:. 1) 0.1% de m-cresol y 0.15% de fenol; 2) 0.1% de m-cresol y 0.2%. de -fenol; 3) 0.1% de m-cresol. y 0.15% de metilparabeno; y.4) 0.1% de m-cresol y 0.2% de metilparabeno. Dos niveles de pH. (7.3 y 7.1) y dos concentraciones de NaCl (120 y 100 mM) se evaluaron. Los componentes de' formulaciones restantes se mantuvieron' contantes a: 120 U/mL de insulina regular, 5 ug/mL' . de . rHuPH20 (600 U/mL) , Tris/HCl 20 mM (Trizma, Sigma, Cat No. T6C66) , 0.02% de Polox.ámero 188 (Poloxámero 188, Spectrum, Cat No. PI 169), y ZnCl2 0.1 mM (EMD, Cat No. ZX0065-1) . Las formulaciones se prepararon y se sometieron a prueba como se describe en lo anterior.

Los resultados se -exponen en la Tabla 36 a . continuación . La solubilidad total de la insulina regular se incrementa ligeramente en presencia de cantidades menores de m-cresol, y adicionalmente, cuando el fenol se reemplaza con metilparabeno . - Tabla 36. Solubilidad de la insulina regular con niveles reducidos m-cresol a 2-8 °C C. Efecto a Largo Plazo del pH y NaCl en la Estabilidad de la rHuPH20 e Insulina En este ejemplo, se empleó un diseño de estudio factorial completo para determinar los efectos -del pH . y NaGl en la solubilidad de la insulina regular y la rHuPH20 a fin de identificar una condición que maximice la solubilidad de la insulina a 2-8 °C y maximice la estabilidad de la rHuPH20 a temperatura ambiente .o más alta en un nivel alto, de conservador. El nivel de conservador se ajustó, para' cumplir los criterios EP-A. Cuatro niveles de concentraciones de NaGl y 4 niveles de pH . se evaluaron generando un total de 16 muestras. Las muestras se evaluaron . para estabilidad bajo tanto condiciones aceleradas a · corto plazo (temperatura alta) como almacenamiento, a largo plazo a 2-8 °C.

La insulina regular (100 U/mL, preparada, como se describe en el Ejemplo 1 anterior, con un pH final de 7.0) y 5 \iq/ L de rHuPH20 se ·. formularon, en una solución amortiguadora común que contiene Tris/HCl 20 mM, ZnCl2 0.1 mM, 0.01% de Poloxámero 188, 0.15% de m-cresol y 0.2% de fenol. La solubilidad se determinó por RP-HPLC como se describe en el Ejemplo 3 anterior. La solubilidad se expresó como un porcentaje relativo comparado con el estándar, con 100% que es 100 U/mL. La actividad enzimática de la rHuPH20 se .evaluó como se describe . en. el Ejemplo 2 anterior. La RP-HPLC se usó para supervisar el contenido total y la pureza de la rHuPH20 (véase el Ejemplo 3 anterior) . Los datos se procesaron por el Design Expert 7.0 (StatEase) . Los análisis . ANOV7A y de correlación se llevaron a cabo por el software JMP 8.0.

Los resultados se exponen en las Tablas 37.-42 a continuación. Las Tablas 37-38 exponen la actividad enzimática de la rHuPH20 y la Tabla 39 expone el porcentaje de recuperación de la rHuPH20. Bajo condiciones aceleradas a corto plazo, la. actividad enzimática de la rHuPH20 se efectuó por el' pH, NaCl y . las temperaturas de almacenamiento, como se indica en la Tabla 37 a continuación.' Después de 1 semana de almacenamiento a. 35 °C, no hubo. actividad- rHuPH20 significativa restante. La actividad enzimática después del almacenamiento a 30 °C . se mejoró comparada a 35°C, pero la única formulación que retuvo >375 U/mL . tuvo una concentración de NaCl alta (140· rriM) y pH bajo (7.0) . En general,, mientras es más alto el pH y es más baja la concentración de sal, es maás baja la actividad enzimática. En una temperatura de almacenamiento de 25°C el efecto en la actividad enzimática rHuPH20 se redujo en . gran medida, aunque las tendencias observadas para 30°C permanecieron, especialmente para las formulaciones que tienen sal baja y pH alto. Una mayoría de las formulaciones mantuvo la actividad enzimática por arriba de los criterios establecidos de 375 U/mL en el punto de tiempo.de 4 semanas. A. 5°C no hubo esencialmente pérdida en la actividad enzimática de la rHuPH20, aún después del almacenamiento durante 1 mes. Esta tendencia continuó durante 9 meses de almacenamiento a 2-8°C, como se observa en la Tabla 38 a continuación. En resumen, la rHuPH20 mantiene la actividad enzimática. cuando se..; almacena a 25°C o a temperatura más baja, especialmente cuando la concentración de NaCl se mantiene arriba de 80 mM. La estabilidad disminuye rápidamente a temperaturas más altas que 25°C. La RP-HPLC se usó para supervisar el contiendo total de la- rHuPH20 y su pureza. Como se muestra en la Tabla 39 a continuación, la pérdida de la actividad enzimática se correlaciona con la pérdida del contenido de rHuPH20 . (análisis ' estadístico-, p<0.001). Un análisis de la pureza de . la rHuPH20 no-;reveló tendencias significativas o diferentes en los valores de pureza de. área pico relativos para el área pico principal de la rHuPH20 (datos no mostrados), indicando que.- la pureza es consistente y por lo tanto la pérdida de actividad es debido a una pérdida de contenido total.- La pérdida del contenido es probable debido al desplegamiento de la proteina ' en concentraciones de conservadores más altas y ¦ temperaturas', conduciendo la agregación y precipitación de la rHuPH20..

Las Tablas 40-41 exponen el porcentaje del pico principal de insulina y el porcentaje , de la recuperación de insulina después del almacenamiento a largo plazo a 2-8 °C. En la Tabla 38, el porcentaje de .la recuperación de insulina. 'se basó en la suma del pico principal de insulina y el pico del desamido. Como se muestra en la Tabla 40, el porcenta-je del pico principal de insulina permaneció .alto (aproximadamente 97%) sin cambios significativos, indicando que la pérdida no fue debido a la degradación química o física de la insulina, tal como desamidación ,o agregación. La inspección visual de los viales indicó mezclas de diminutos granos , brillantes \ o partículas cristalinas o similares cristalinas . claras -co unía solución nebulosa ocasional. Los datos en la Tabla 41 resumen (. ? 8 él contenido de insulina restante en solución en la formulación, en cada .punto de tempo la recuperación de la insulina como es comparada con las condiciones iniciales es una indicción de solubilidad. La precipitación/cristalización de la insulina varió dependiendo de los intervalos de pH. y concentraciones de NaCl sometidas a prueba. Generalmente, cuando . el pH fue bajo y la concentración .'. de sal alta (condiciones que favorecen la actividad de la. rHuPH20) , la insulina formó cristales muy . rápidamente y alcanzó condiciones de equilibrio en un par de meses. En concentración de sal baja y pH alto, la cristalización fue lenta y la mayoría de las moléculas. de insulina permanecieron en solución a 9 meses. Los' análisis estadísticos (véase Tabla 42 a continuación) de los datos de recuperación de la insulina mostraron que el pH, NaCl, tiempo, el .tiempo de pH*NaCl y NaCl* influyen significativamente en la solubilidad de la insulina. Estos resultados indicaron que la solubilidad dé la insulina ; por períodos de tiempo prolongados es dependiente a un pH de (mayor que .7.4) y NaCl bajo (menor que 80 mM) , en contraste directo a las condiciones que mantienen la actividad enzimática de la rIíuPH20.

Tabla 37. Actividad Enzimática de la rHuPH20 :Por abajo del nivel de detección El % de recuperación se basó en el área pico de medición total en comparación cón un estándar de referencia conocido..

Ejemplo 10 Desarrollo de la Formulación del Análogo de Insulina: Clasificación del Estabilizador para la Insulina Formulada con rHuPH20 Los conservadores protegen contra la contaminación microbiana potencial de la insulina que. es posible debido a la múltiple dosificación. Los conservadores típicos son m-cresol, fenol y parabenos . Estos conservadores sirven' .como antimicrobianos pero también sirven para estabilizar las estructuras del orden superior de la insulina. Los conservadores fenólicos se han mostrado que disminuyen la estabilidad de la rHuPH20. (véase Ejemplo 7) . En este ejemplo, varios estabilizadores se clasificaron . por su' capacidad de prevenir la degradación de rHuPH20 en presencia de los conservadores fenólicos' mientras que mantienen la estabilidad de la insulina/análogo de insulina. Los estabilizadores que se clasificaron incluyeron excipientes farmacéuticos comúnmente usados,, incluyendo aminoácidos y sus derivados, sales y especies de soluciones amortiguadoras, polioles y otros compuestos. La estabilidad se determinó por la actividad enzimática de la rHuPH20 y la solubilidad de la insulina. Los efectos estabilizantes específicos, incluyen la prevención de la pérdida absorbente y/u oxidación de la rHuPH20 y los efectos de. estabilización generales como es medido por la actividad enzimática. de la rHuPH20.

A. Efecto de varios surfactantes en la actividad enzimática de la rHuPH20 Varios surfactantes comunes, particularmente polisorbato 80 (PS80), polisorbato 20 (PS20) y poloxámero 188 (PluronicMR F68) se clasificaron por su capacidad de conservar las formulaciones de rHuPH20. Todas las formulaciones contuvieron 100 ug/mL de rHuPH2Q (12,000 U) y aCl 150 mM a un pH de 6.5. Las formulaciones. variaron en el surfactante y la concentración de surfactante y la solución amortiguadora (ya sea histidina o fosfato) . Las formulaciones se sometieron a agitación a 35°C durante 10 días, con las muestras analizadas para la actividad de rHuPH20 en los días. 3 y 10. La actividad enzimática de la: rHuPHZO se determinó como se describe en el Ejemplo 2 anterior. La estabilidad de la rHuPH20 se.- determinó al medir el pico de oxidación de la rHuPH20 por la RP-HPLC y por la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) (véase los Ejemplos 3 y 4 anteriores) .

¦ Las formulaciones y los resultados de la actividad enzimática de. rHuPH20 se exponen en la ; Tabla 43 a continuación. El análisis ANOVA de la' oxidación de r.HuPH20 como es medida por RP-HPLC no muestra diferencias significativas en la actividad enzimática con respecto al tipo de surfactante, concentración de surfactante, soluciones amortiguadora o tiempo de agitación (F = 0.6832, p = 0.6397)·. Adicionalmente , los resultados de . SEC no mostraron diferencia detectables en los tamaños de los . picos principales . (datos no mostrados ) .

Los resultados de la oxidación de . la rHuPH20 se exponen en la Tabla 44 a continuación. Los resultados muestran que el área pico de oxidación se incremento con los niveles de incremento del surfactante y e ' tiempo de agitación. El Polisorbato 20 se sabe que contiene cantidades medibles. de actividad de peróxido (véase, por ejemplo, Donbrow y colaboradores, (1.978) J. Pharm Sci.. 67 (12) : 1676-1681, o Kibbe, A.H., ed. (2000) Handbook of Pharmaceuticál Excipients. 3ra Edición, American Pharmaceuticál Association & Pharmaceuticál Press: Washington, DC & London, RU) . En este estudio, el polisorbato 20 usado fue un lote antiguo que dio por resultado alta oxidación de la.rHuPH20; en contraste, l Poloxáraero 188 provocó solo pequeñas trazas de. oxidación. El análisis multi-variado de varianza indicó que el tiempo de agitación asi como el tipo de surfactante y concentración efectúo .el nivel de oxidación de la rHuPH20 (véase Tabla 45 a continuación) . También,, fueron significativos los términos de interacción incluyendo el surfactante versus concentración, surfactante versus tiempo y concentración versus tiempo.

Con base en estos resultados, es claro que la adición del surfactante en las formulaciones de rHuPH20 podría reducir efectivamente, la pérdida ' de rHuPH20, presumiblemente debido a la prevención de la . pérdida absorbente y desnaturalización posible en la interfaz de aire-agua. Sin embargo., una desventaja potencial de la adición del surfactante es que puede incrementar la. oxidación para la rHuPH20'. .

B . Metionina 1. Efecto de la metionina en la prevención de la oxidación de la rHuPH20 La rHuPH20 tiene dos sitios de oxidación potenciales: Met458 y Met35. El pico "ox-1" corresponde a Met458 y. es el pico de oxi.dación principal cuando se somete a ensayo por la RP-HPLC. El pico "ox-2" contiene ambas oxidaciones de metionina. La oxidación de metionina se puede prevenir por la adició de metionina libre como un depurador para reaccionar con los compuestos oxidantes potenciales . a. Formulaciones de la rHuPH20 En este estudio, el efecto de la adición de la. metionina libre en la oxidación de la rHuPH20 en presencia de polisorbato 20, polisorbato 80 y/o Poloxámero 188 se evaluó. Cada formulación contuvo 5 g/mL de rHuPH20, 0.02% de surfactante designado, fosfato 50 mM, . pH '6.5, NaCl 150 mM "y metionina (de 0 a 50 mM) .· Las muestras, se incubaron .a 30 °C durante 72 horas y, se examinaron por la RP-HPLC como se expone en el Ejemplo 3 anterior. Los resultados se exponen en la Tabla 46. a continuación . Los análisis estadísticos se exponen en la Tabla . 47 a continuación. Los resultados indicaron que la metionina previene la oxidación de la rHuPH20 en una concentración de 2 mM.

* Significativo b. Formulaciones de rHuPH20/Insulina La metionina se sometió a prueba po su capacidad para prevenir la oxidación, de la rHuPH20 en las formulaciones de rHuPH20/insulina . Las formulaciones contuvieron 100 U/mL de insulina (Organon Insulin API, Insulina Humana Recombinante SIHR 143; la solución madre se preparó como se describe en el. Ejemplo 1), 5 g/mL. de rHuPH20, tris/HCl 20 mM, H 7.4, aCl 80 mM, 0.03% de . poloxámero 188, 0.1% de Fenol y 0.1% de m-cresol en la presencia o ausencia de metionina 40. mM. Las formulaciones se incubaron a 30°C durante 5 semanas, para evaluar el pico de oxidación de la rHuPH20. Los resultados mostraron que el pico ox-1. fue significativamente más pequeño como es medido por la RP-HPLC en las formulaciones que contuvieron metionina como es comparada con las formulaciones que no contuvieron metionina. 2. Metionina como un estabilizador general La metionina se evaluó adicionalmente por su capacidad para prevenir la pérdida de la actividad enzimática de la rHuPH20. en . temperatura más alta y el .contenido de conservadores. Se condujo un estudio de metodología de superficie de respuesta (RSM) diseñado de experimento (DOE). para evaluar el efecto de la metionina en la actividad enzimática de la. rHuPH20 en diferentes, niveles de concentración de NaCl y pH. Las . formulaciones básicas contuvieron 100 U/rnL de insulina (Organon Insulin API', Insulina Humana Recombinante SIHR 143, la solución madre se preparó como se describe en el Ejemplo 1), 5 ug/mL de rHuPH20, Tris/HCl 20 mM, 0.1% de m-cresol, 0.1% de fenol.-y 0.01% de poloxámero 188. El intervalo^ de concentración de metionina varió, entre 40 y 80 mM, el intervalo, de concentración de NaCl se varió entre 70 y 110 mM y el intervalo de pH fue entre 7.2 y 7.6. Las . formulaciones se incubaron en ya sea 30°C durante 4 semanas o 35°C durante 5 días y la actividad enzimática de la rHuPH20 se determinó como se expone en el Ejemplo 2 anterior.

Los datos se . exponen en la Tabla 48 a continuación. El análisis estadístico de los datos se expone en las Tablas 49-50 a continuación. Los datos muestran que la concentración del NaCl tiene un efecto: significativo . en estabilidad . de la rHuPH20 en tanto 30°C como 35°C- El pH tiene un efecto ·. significativo a 35°C. La metionina rio mostró un efecto estabilizante en la rHuPH20 entre 40 y 80 mM. Un estudio de seguimiento indicó que los resultados fueron los mismos en presencia o ausencia de metionina. Las formulaciones con una actividad enzimática de rHuPH20 de partida de 650 U/mL descendió a 525, y 522 ,U/mL para la metionina 1 y. 20.·. mM, respectivamente, después del almacenamiento a 30 °C durante un mes. De esta manera, la metionina actúa como un anti-oxidante , pero no mejora' la estabilidad total de la rHuPH20 contra el conservador y el estrés térmico.

* Significativo C. Clasificación de estabilizadores potenciales para las formulaciones de rHuPH2O/insulina Varios compuestos se clasificaron por su capacidad para actuar como estabilizadores de proteínas en las. formulaciones de rHuPH-20/insulin . Los excipientes incluyeron aminoácidos .y sus derivados, aminas, polioles, sales, y soluciones amortiguadoras y otros compuestos (véase Tabla 51 a continuación) . Cada compuesto se clasificó, típicamente en dos concentraciones, por su efecto en la. actividad enzimática de la rHuPH20 y solubilidad de la insulina. La formulación básica contuvo típicamente 100 U/mL de insulina/análogo dé insulina, 5 yg/mL de rHuPH20, Tris/HCl 20 mM, .0.15% de m-cresol y 0.2% de fenol en un pH 7.3 ±0.1. Las formulaciones que contuvieron NaCl 100-140 mM se usaron como, formulaciones de referencia y los estabilizadores de potenciales reemplazaron todo . o parte del NaCl . en las formulaciones. La actividad enzimática rHuPH20 se midió como se describe en el Ejemplo 2 anterior en' las muestras incubadas a' 30°C durante aproximadamente una semana. La solubilidad de la insulina .se evaluó por RP-HPLC (véase el Ejemplo .3 anterior) en- las muestras almacenadas a 5°C.

Los resultados se exponen en la Tabla 51 a continuación. La evaluación fue semi-cuantitativa en comparación con. el NaCl. Una mayoría de los compuestos sometidos a prueba no tuvo efecto en la estabilidad de la insulina - con ., el resto provocando una disminución en la solubilidad de la insulina. Los dates previos (véase los Ejemplos 8-9) indicaron que el pH y sal, dos condiciones que influyen potencialmente la carga de la proteína en solución, influyen la solubilidad de la insulina. En la clasi icación actual, las moléculas o compuestos que contienen cationes divalentes (Mg (cloruro de magnesio) y SO(2" (sulfato de sodio) y Lys-Lys) provocaron una severa precipitación de la insulina. Parece que un mecanismo repulscr de carga podría ser importante para, mantener las moléculas de insulina de la interacción entre si. Lys-Lys, cloruro de magnesio y oligómeros de ácido hialurónicO' (HA, 4-16mers) se identificaron como moléculas que estabilizaron la rHuPH20 más que el NaCl . Debido al hecho de que tanto la Lys-Lys como el cloruro de magnesio disminuyeron la solubilidad de la insulina, . estas moléculas . no se consideraron estabilizadores viables · en altas concentraciones. La reducción de la concentración de Lys-Lys reducirá su impacto en la solubilidad de la insulina.

Tabla 51. Resumen del cribado del estabilizador de rHuPH20/insulina D. Efecto de los oligomeros HA en las formulaciones de rHuPH20/insulina Los oligomeros ' HA se examinaron adicionalmente por su capacidad para estabilizar las ..formulaciones de rHuPH20/insulina . Los oligomeros HA son el substrato/producto de la reacción enzimática de la rHuPH20 con hialuronano, '¦¦ y como tal podrían ligarse posiblemente al sitio activo de la enzima provocando de esta manera el efecto estabilizante. Un estudio diseñado, de experimento. (DOE). 'se llevo a cabo para investigar los efectos del pH, concentración de NaCl . y concentración de oligómero HA en la estabilidad total de la rHuPH20/insulina.

La formulación básica contuvo 3.75-. mg/mL de . insulina (Organon Insulin API, Insulina Humana Recombinante SIHR 143, la solución madre se preparó como se describe en el Ejemplo 1), 5 g/mL de rHuPH2C, Tris/HCl 15 mM, 0.01% de ZnCl2,' 0.01% de poloxárnero 188, 0.15% de fenol y 0.15% de m-cresol. Se evaluaron un total de 17 muestra, con tres niveles de pH diferentes (7.1, 7.3 y 7.5), tres concentraciones de NaCl (50, 75 y 100 mM) y tres concentraciones de oligómero HA (1, 5.5 y 10 mg/mL). La actividad enzimática de la rHuPH20 se midió en las muestras incubadas a 30 °C durante 1 semana o en las muestras almacenadas a 2^8C.C durante ;9 meses. La oxidación de la rHuPH20 se midió por RP-HPLC en las muestras almacenadas a 5°C durante 9 meses. El contenido de insulina se removió por RP-HPLC para las almacenadas a 2-8°C durante , 9 meses.

Las formulaciones, y los resultados se exponen, en la Tabla 52 a continuación. El contenido de insulina se. expresa como % de recuperación a un estándar de referencia USP. El porcentaje (%) del área pico de oxidación de la r.HuPH20 es una . suma de los picos ox-1 (mayor) y ox-2 (menor) . Los análisis estadísticos se exponen en la Tabla 51 ¦ a continuación. Como se muestra en : 1a Tabla 53, ' la concentración de HA . y NaCl ambos tuvieron un efecto significativo en la actividad enzimática de la rHuPH20 cuando se midieron después de la incubación a 30 °C durante 1 semana. Conforme las concentraciones de NaCl y HA se incrementaron, la actividad enzimática de rHuPH20 se incrementó también. Esto fue particularmente cierto cuando ambas concentraciones de excipientes fueron más altas, indicando una interacción significativa entre los dos factores. (véase la Tabla 53, P = 0.0150) .

* Significativo Se notó que casi todos los estudios previos que evalúan las formulaciones de insulina/rHuPH20. en ausencia de HA, el .. incremento de pH tuvo un efecto negativo y significativo en la actividad enzimática .de la rHuPH20 especialmente en el intervalo de pH de 6.0 a 8.0. En contraste, en. este estudio en el cual el HA se incluyó en las formulaciones, el pH pareció que tiene poco o nada de efecto en la actividad enzimática de rHuPH20. De esta manera, parece que la presencia de HA en la formulación de insulina/r.HuPH20 reduce o niega el efecto negativo que el pH más alto puede tener en la actividad enzimática de la rHuPH20. '· Para evaluar adicionalmente la utilidad del HÁ como un estabilizador, el contenido de insulina se evaluó por RP-HPLC en las muestras que habían sido almacenadas a 2-8°C- durante 9 meses. Los resultados de los datos de¦ contenido de insulina y el análisis estadístico se muestran en las Tablas 54 y 55 a continuación. . Los resultados muestran claramente la importancia de la concentración de '. pH y NaCl , en la solubilidad de la insulina (p<0.0001 para ambos factores). Conforme el pH se incrementó, se disminuyó la solubilidad de la insulina. Conforme se incremento la concentración de NaCl, disminuyo la solubilidad de la insulina. El efecto de HA en las solubilidad/contenido de la insulina no fue significativo (p = 0.2755) . De esta, manera, los' oligómeros HA pueden ser un excipiente/estabilizador · para las formulaciones de rHuPH20/insulina o rHuPH20/análogo de insulina.

El almacenamiento a . largo plazo de las formulaciones que contienen oligómeros HA mostró un incremento significativo en el nivel de la oxidación de la rHuPH20 como es comparada, con las formulaciones que no incluyen el HA. agregado. El nivel de la oxidación pareció que se correlaciona bien con la concentración de HA, pero fue independiente del pH o concentración de NaCl (véase las Tablas 55 y 56 a continuación). El HA. contiene ácido glucurónico, que puede ser · un donador de oxigeno potencial de modo que un antioxidante o depurador de oxigeno podría ser. llamado para si el HA es un excipiente en las formulaciones de rHuPH20-insulina finales. . En este estudio algunas de las formulaciones se oxidaron en gran medida, todavía, la actividad enzimática . permaneció razonablemente intacta (véase la Tabla 55) , lo que confirmó que la rHuPH20 aún mantiene una actividad enzimática significativa. Los análisis' estadísticos multi-variados indicaron que las actividades enzimáticas de la rHuPH20 de estas muestras de almacenamiento a temperatura baja a largo plazo fueron significativamente afectadas por el ?? (p = 0.004, actividad enzimática . reducida) , pero no el pH o NaCl (p=0.1715 y.0.4766, respectivamente) (véase la. Tabla 56 a continuación) .

* Significativo * Significativo * Significativo Ejemplo 11 Efecto de la concentración dé sal, pH y solución amortiguadora en la rHuPH20 en presencia de metilparabeno En este ejemplo, se usó un diseñó experimental de Box-Behnken para determinar el pH óptimo, concentración de sal (NaCl) y concentración de solución amortiguadora (Hépes) para la estabilidad de la rHuPH20 a temperaturas elevadas en presencia del conservador fenólico metilparabeno. En este diseño del experimento del método de. superficie (RSM) de respuesta al experimento (DOE) , tres factores, particularmente concentraciones variantes de la solución amortiguadora y sal, y pH, se examinaron por sus efectos en la actividad de la rHuPH20 bajo condiciones .aceleradas-, mediante las cuales las muestras se sometieron al estrés, incluyendo temperatura y agitación elevadas .. Las respuestas medidas incluyeron actividad enzimática y pureza/contenido, como es medido por la HPLC de fase inversa-.

El estudio se basó en el paquete de software DOE Design-ExpertMR 7.1. (StatEase, Minneapolis, MN) . Los intervalos y los puntos medios de la concentración de Hepes, concentración de NaCl y pH usados en los experimentos se listan en la Tabla 57 a. continuación/ Para llevar a cabo el estudio, un total de 13 formulaciones diferentes, con 5 puntos centrales repetidos, se hicieron basado en una secuencia, aleatoria en que el software se generó. Cada muestra contuvo · 100 pg/mL de rHuPH20 (de una solución de 10 mg/mL en histidina/HCl , pH 6.5, NaCl 130 mM), 0.20% de metilparabeno (Fluka, Cat . No. 85265) y 0.025% de propilparabeno (American Custom Chemicals, San Diego, Cat .. . No. CHEM-19713), con concentraciones variantes de Hepes (Calbiochem, Cat- No . 391338 ) y NaCl . (EMD, SX0418-1) y pH como se especifica en la Tabla. 58 a continuación. El pH se ajustó usando NaOH o HC1 1.0 N. Las soluciones se repartieron en alícuotas en viales de vidrio de tipo 1 de 2 mL · (Wheaton, Cat. No. 223683) con tapones de caucho (Wheaton, Cat. No. 224100-072) y: se sellaron con tapas de alúmina, con 2 viales por formulación. Las muestras se colocaron en Una incubadora con la temperatura ajustada a 35°C. Un conjunto de viales se sometió a agitación usando un agitador Titer Píate (LabLine) a 60Ó rpm durante 3 días (35 + ag) . El otro conjunto de viales se mantuvo . a 35°C durante 5 días sin agitación. Las muestras se enviaron para prueba después del período de incubación.

Tabla 58. Diseño de Box-Behnken de RSM, incluyendo respuestas Porcentaje del pico principal de cromatografía exclusión de tamaño (SEC) como es comparado con una referencia.

La actividad enzimática se midió como se describe en el Ejemplo 2b anterior. La cromatografía de exclusión¦ de. tamaño (SEC) se usó para, evaluar la pureza al , medir el' porcentaje del pico principal como es comparado como una muestra de referencia (véase el Ejemplo 4 anterior) . La SEC se llevó a cabo usando las siguientes condiciones: Solución Salina Amortiguada con Fosfato IX (P'BS) , una. columna Toso Bioscience G2000 SWXL, y una velocidad de flujo ajustada a 1 mL/min. Los datos se recolectaron y como se describe en lo anterior y las medias se reportaron y se ingresaron en la tabla de diseño después de la secuencia de la muestra proporcionada por el software DOE . Los datos se muestran en la Tabla 58 en lo anterior.

Para los análisis de datos, los datos sin procesar se analizaron como sigue. Brevemente, los datos se ajustaron en un modelo cuadrático como el punto de partida. El ANOVA se llevó a cabo basado en el modelo cuadrático pero los parámetros necesitaron típicamente ser reducidos para hacer que el modelo cumpliera . más estrechamente con. todos los siguientes critérios: ' nivel significativo modelo P<0.05, valor p para la falta de ajuste (P>0.1) , . nivel de precisión adecuado >4, y la R ai cuadrado predicha dentro de 0.2 de la R al cuadrado ajustada. Finalmente, los análisis residuales , y las gráficas de diagnóstico se verificaron para asegurar que se cumplieran las suposiciones del AÑOVA. En algunos casos, los datos necesitaron ser transformados a fin de cumplir con esos criterios; .en esos casos, los datos sin procesar se transformaron por .una ecuación matemática' adecuada luego se siguieron los análisis estadísticos como se describe previamente. Los modelos de prueba ANOVA para el modelo usado para cada respuesta se exponen en la Tabla 59 a. continuación, que indica que. la respuesta, la ecuación modelo, sin una transformación se usó y el tipo de transformación, el valor p modelo y la falta de ajuste del valor p.

* A - NaCl; B .- solución amortiguadora Hepes; C - pH A. Efectos de pH, concentraciones de NaCl y solución amortiguadora en la rHuPH20 a temperatura acelerada con agitación Los modelos ANOVA muestran, que bajo agitación excesiva a 35°C, no tiene efecto de la actividad enzimática ' y contenido/pureza de la rHuPH20 (véase Tabla ..59 anterior, Respuesta 1 y 2, en donde la ecuación modelo no incluye solución amortiguadora) . La rHuPH20 se predijo que es más estable entre pH 6.5-7.3 con una concentración de NaCl entre 145-180 mM. Fuera de estos intervalos,' la actividad de la rHuPH20 predicha modelo declinaría, . en particular, cuando el pH es 8.0 y cuando la concentración de sal está en la concentración más baja (120 mM).. Bajo estas condiciones aceleradas, la. actividad de la rHuPH20 más alta^ medida fue de aproximadamente 8100 U/mL (STD 9 en la Tabla 56 anterior)., que es aproximadamente 65% de la^ actividad de la rHuPH20 (aproximadamente . 12,000 U/mL) con base, en 100 ug/mL de enzima. Se observaron resultados similares para la pureza/contenido de la rHuPH20 como se determinar, por SEC, con,, la pérdida del. contenido de pico principal para la formulación más estable aproximadamente 20% qué. de. la esperada .

Los intervalos óptimos para la concentración de sal y pH para la actividad enzimática de la rHuPH20, fueron ligeramente más reducidos que' aquellos para el contenido/pureza · de la rHuPH20. De esta manera, la actividad enzimática de la rHuPH20 es más. sensible a las condiciones de estrés, indicando por lo. tanto que la áctividad enzimática de la rHuPH20 es un mejor método para indicar la estabilidad.

B. Efectos del pH, concentraciones de NaCl y solución amortiguadora en la rHuPH20 en temperaturas elevadas sin agitación Los datos muestran que bajo menos condiciones de estrés (es decir, sin agitación),- mientras son más pequeñas las disminuciones en la actividad enzimática se observó menos pérdida de' pico principal. Por ejemplo, para las mejores muestras., solamente un¦ 20% dé. pérdida en actividad se observó (comparado con 35%. para las muestras incubadas con agitación) y se observó menos que .5% de pérdida en el pico medio (comparado con el 20% para las muestras incubadas con agitación). Adicionalmente, los modelos ANOVA muestran que la concentración de sal no tiene un efecto, significativo en la actividad enzimática. La rHuPH20 permanece enz imáticamente activa en un ph menor que 6.5, siempre y cuando la concentración de sal sea po.r lo menos 130 mM. Adicionalmente, la actividad enzimática óptima se observa con un . pH menor que 7.

Ejemplo 12 Estudio de Estabilidad de la Insulina lispro/rHuPH20 o Insulina aspart/RHuPH20 con conservadores Tablas de Datos Provisionales de Seis Meses En este ejemplo, la estabilidad de varias formulaciones de insulina lispro/rHuPH20 se evaluaron bajo tres condiciones de almacenamiento:; 5°C, 25 °C y 30 °C a través del tiempo. Uña formulación también, se evaluó bajo dos condiciones de estrés físicas aceleradas: ciclos de congelación/descongelación múltiples y agitación a 25 °C. Las formulaciones variaron a un pH de y los niveles conservadores. La estabilidad se evalúo al medir la apariencia .general . las características, la actividad enzimática de rHuPH20 . y. la pureza de ¦ rHuPH20 , y análogo de insulina.

Las formulaciones de insulina lispro/rHuPH20 se exponen en la Tabla 60 a continuación.

Un (1) mL de cada formulación se almacenó.' en viales de vidrio de 2 mL de borosilicato tipo 1 USP con un. tapón de caucho de clorobutilo y un sello de aluminio. en cada formulación, se incubó, individualmente, a 5±3°C, 25+2 °C y 30±3°C y se registraron las mediciones de estabilidad, a 0, 0.5, 1, 2, 3 y 6 meses. La Formulación #2 se sometió a agitación (agitación a 650 rpm) a 25°C durante. 24 horas. La Formulación #2 se sometió a.. 5 ciclos de congelación/descongelación al alterar la condición de almacenamiento entre un congelador a -30°C y a temperatura ambiente en la mesa. La muestra se dejo en cada condición durante por lo menos 2 horas para cada ciclo, (es decir,¦ 2 horas en el congelador a -30 °C, remoción, y colocación encima de la mesa a temperatura ambiente durante 2 horas se consideró 1 ciclo) .

La . estabilidad se evaluó al medir él pH., apariencia, incluyendo osmolaridad, turbiedad a 350 nm y observación cualitativa, actividad enzimática . de la rHuPH20, el porcentaje de ' pureza y porcentaje de recuperación de la rHuPH20 por RP-HPLC, el porcentaje de pureza y el porcentaje de recuperación de la insulina lispro por RP-HPLC, y el porcentaje de pureza de la insulina Lispro por la SEC no de desnaturalización y de desnaturalización (véase los. Ejemplos 1-5). Para la osmolaridad, los criterios de aceptación de estabilidad fueron 275 ± 30 mOsm/kg. Para la apariencia, los criterios de la aceptación de estabilidad fueron que fue una solución incolora,, transparente. La. actividad de la rHuPH20, los criterios de. la aceptación de estabilidad .fueron que la formulación mostró' > 375 U/mL (basado en > 75 U/ g) . El porcentaje de recuperación de la rHuPH20 por la RP-HPLC, la especificación aceptable objetivo fue 3-7 yg/mL (60-140%) por la RP-HPLC. Para la impureza¦ de la insulina por. RP-HPLC, la especificación aceptable objetivo fue > 90% de. pureza por la RP-HPLC. Para la recuperación de la insulina por RP-HPLC, la especificación aceptable objetivo fue .90-100 U/mL (90-110%) por la RP-HPLC. Para el porcentaje de pureza para la SEC no de desnaturalización, la especificación aceptable objetivo fue = 2% de. especies de insulina de Peso Molecular Alto (HM t) por área pico. Para la pureza de la insulina por la SEC de desnaturalización, la especificación aceptable objetivo fue = 2% de las especies de insulina, de Peso Molecular Alto ZHMWt) por el área pico con. la SEC de desnaturalización.

Los resultados se resumen a continuación. Se determinó .que en las formulaciones de insulina Lispro/rHuPH20 expuestas en la Tabla 58, las formulaciones # 1, # 2 y # 3 se formularon con' bajo contenido de insulina lispro a T = 0 (91.22%, 91.40% o 91.30%, respectivamente), mientras que las otras formulaciones contuvieron aproximadamente 100% del contenido de proteína. 1. Punto de Tiempo de 3 Meses a. Insulina lispro Todas las formulaciones sometidas " a prueba fueron estables a 5±3°C hasta el punto de tiempo de 3 meses para tanto la rHuPH20 . como la insulina . lispro. Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo, y temperaturas. El contenido de insulina li pro fue bajo (aproximadamente 91% de recuperación del objetivo) para las. formulaciones #l-#3, pero esto parece que es un error de preparación de la formulación ya que el porcentaje de recuperación fue constante, como .es esperado a 5°C.

. A 25±2°C, la, rHuPH20 en. todas las formulaciones fue estable, con la excepción de la formulación #8./que descendió •por debajo de 375 U/mL de la especificación objetivo para la actividad enzimática de la rHuPH20 entre. 2 y 3 meses. Esto no fue inesperado ya que la formulación #8 tuvo un pH alto y una concentración conservadora alta y en general, la rHuPH'20 es más estable a un pH de más bajo y una concentración conservadora más baja. La insulina lispro fue generalmente estable en toda las formulaciones a 25°C del punto de tiempo de 3 meses, pero la pureza comenzó a declinar ligeramente como fue evaluado por la RP-HPLC después de aproximadamente 1 mes . ' A 30±3°C solamente las formulaciones de . pH más bajo (#1 y #4, ambas con pH . 7.2) estuvieron, por encima de la especificación objetivo para la actividad enzimática de la rHuPH20 (>375 U/mL) después de 1 mes a 30°C. La Formulación # 2 estuvo por encima de' la especificación objetivo después de 2 semanas a 30°C .pero estuvo por debajo de 375 U'/mL por''.1 mes. La insulina lispro fue generalmente estable dentro de la especificación objetivo durante 3 meses en todas las formulaciones a 30°C, pero hubo üna disminución ligeramente mayor en la pureza que se observó a 25°C. La .disminución en la pureza se acompañó por una disminución en el contenido a 30°C que no fue evidente a 25°C. Después del punto de tiempo de 3 meses, se determinó la condición a 30 °C. b. Insulina Aspart Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo y temperaturas . Todas las formulaciones sometidas a prueba fueron estables a 5±3°C hasta el punto de tiempo de 3 meses para tanto la rHuPH20 como insulina aspart.

La rHuPH20 cumplió las especificaciones objetivo para todas las formulaciones mantenidas, a 25±2°C en los 3: meses con la excepción de la formulación #7 que descendió por debajo de 375 U/mL de la especificación objetivo para la actividad de la rHuPH20 entre 2 y 3 meses. Esto es ligeramente inesperado ya que las formulaciones #7 y #8 son idénticas excepto por los valores de pH (7.2 y' 7.6., respectivamente), y en general, la rHuPH20 había sido más estable en un pH más bajo. Este resultado inesperado es probable debido al..'hecho de que la formulación #7. comenzó en una actividad más baja (500 U/mL) y contenido (93.8%) que el objetivo (600 U/mL y 100%, respectivamente), y se. apoya adiclonalmente por los valores de pureza aceptables " para las formulaciones #7 y #8. La insulina aspart fue estable en todas las formulaciones a 25 °C del punto de tiempo de 3 meses pero hubo una tendencia hacia, abajo, ligera en la pureza y. % de recuperación. La rHuPH20 fue ' menos estable en todas las formulaciones mantenidas a -30±39C como es comparado con aquellas a 25°C. Las formulaciones de pH más bajo .(#1 y #4, ambas con pH 7.2) y las formulaciones de conservadores totales más bajas (#4. y #5, nivel de conservador total .= 0.175%) aún estuvieron por encima de la especificación objetivo para la actividad enzimática. de , la rHuEH20 después de 1 mes a 30 °C. La formulación #2 se ajustó por debajo de la especificación objetivo después' de 1 mes a 30°C y la formulación #6 estuvo ligeramente sobre la especificación objetivo para la actividad después de 1 mes pero ligeramente por debajo después de 2 semanas. Las formulaciones #l-#6 permanecieron generalmente dentro, de la especificación objetivo para la actividad enzimática¦ de la rHuPH20 después de 2 semanas a 3Ú°C. La insulina aspart. fue estable dentro de la especificación objetivo durante 3 meses en todas las formulaciones a 30°C pero hubo una tendencia hacia abajo ligeramente mayor' en la pureza y % de recuperación que se observó a 25°C. La porción del estudio, dé 30±3°C se terminó después del punto de tiempo de 3 meses. 2. Punto de Tiempo de 6 Meses a. Insulina Lispro Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo y . temperaturas . Todas las formulaciones sometidas a prueba fueron estables a 5°C en el punto de tiempo de 6 meses para tanto la rHuPH20 como la insulina lispro. El contenido bajo de insulina lispro (aproximadamente 91% de · recuperación del objetivo) para las formulaciones #l-#3 cümo se observó . previamente, pero el porcentaje de recuperación' aún fue igual a 5°C.

A 25°, la rHuPH20_ también fue estable (> 375 U/mL de la actividad r'HuPH20) para las formulaciones #1, #2, # y #5. Estas formulaciones estuvieron en un pH más bajo (7.2 o 7.4), con ya sea el nivel de conservadores USP actual . (#1, #2: 0.125% de fenol, 0.075% de m-cresol) o un. nivel de conservadores ligeramente más bajo. (#4, #5: 0.1% de fenol, 0.075% de m-cresol) . Todas las 8 formulaciones permanecieron dentro del porcentaje de. la especificación de recuperación de la rHuPH20 objetivo a 6 meses pero hubo una clara disminución con respecto a tanto la pureza como recuperación de la rHuPH20 por la RP-HPLC. La reducción de pureza por la RP-HPLC, contenido por RP-HPLC, y la pureza por la SEC no desnaturalización observada para la insulina lispro observada después de 3 meses a 25°C fueron más evidentes a los 6 meses. La pureza por la SEC de desnaturalización puede . estar disminuyendo muy. ligeramente pero todos los valores pico principales aún son > 99.4% de modo que cualquier pérdida es muy pequeña .hasta este punto, b. Insulina Aspart Todas las formulaciones fueron . transparentes e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo y temperaturas . Todas las formulaciones de prueba fueron estables a 5+3 °C en el punto de tiempo de. 6 meses para tanto la rHuPH20 como la insulina Aspart.

¦ La . rHuPH20 continuó cumpliendo con . las especificaciones de actividad objetivo para la actividad enzimática (> 375 U/mL) para 4 de las formulaciones mantenidas a 25±2°C (#1, #2, #4 y #5) a los 6 meses. Estas formulaciones estuvieron . en un pH más bajo. (7.2 o 7.4) con ya sea el nivel de conservadores de USP actuales (#1, #2:. 0.125% de fenol, 0.075% de m-cresol) o un nivel de conservadores ligeramente más bajo (#4, #5: Ó .1% de fenol,¦ Q .075%' -de m-cresol),; Todas las 8 las formulaciones permanecieron dentro- de la especificación del porcentaje de recuperación de rHuPH'20 objetivo a 6 meses pero hubo una clara . disminución observada con respecto a . tanto la pureza como . recuperación de la rHuPH20 por. la RP-HPLC. Las tendencias, hacia abajo para la insulina Aspart notadas después de 3 meses a 25°C fueron más evidentes a los. 6 .meses para la pureza por la RP-HPLC, contenido por la, RP-HPLC y pureza por la SEC no de desnaturalización. La pureza por la SEC de desnaturalización puede tener tendencia muy ligera hacia abajo pero todos los valores pico principales están aún a > 99.5%. de. modo que cualquier pérdida es muy pequeña hasta este punto. 3. Condiciones aceleradas - Agitación a 25°C y congelación/descongelación a. Insulina Lispro La formulación #2 estuvo ¦ nebulosa después de la agitación a 25°C durante 24 horas. La insulina Lispro fue estable para ambas condiciones, aunque el porcentaje de recuperación disminuyó a aproximadamente 75% después de 5 ciclos de congelación/descongelación. La rHuPH20 cumplió las especificaciones de . actividad objetivo (>375 U/mL)- para la muestra sometida a la agitación a '25°C durante 24 horas. Después de 5 ciclos de congelación/descongelación, la rHuPH20 fue enzimáticamente inactiva, b . Insulina Aspart Se obtuvieron resultados similares para la formulación #2 de Insulina Aspart como se obtuvo para la formulación de la Insulina ¦ Lispro bajo agitaciones o condiciones de congelación/descongelación .

Ejemplo 13 Estudio de Estabilidad de la Insulina Lispro/rHuPH20 , Insulina Aspart/rHuPH20 o Insulina Glulisina/rHuPH20 con Conservadores Variados Tablas de Datos Provisionales de Dos o Tres Meses En este ejemplo, la estabilidad de varias formulaciones de insulina Lispro-rHuPH20, insulina Aspart-rHuPH20 o Insulina. Glulisina-rHuPH20. se evaluaron bajo cuatro diferentes condiciones '· de almacenamiento: 5°C, .15°C,. 25°C y 30°C a través del: tiempo. Las formulaciones variaron a un pH de, concentración de sal y concentración de glicerina. La estabilidad.se. evaluó midiendo la apariencia general y las características, actividad enzimática de la rHuPH20 y pureza de la rHuPH20 y análogo de insulina. Este estudio se propuso para proporcionar datos de apoyo para el desarrollo clínico fase 3 en los 3 niveles de conservadores: los niveles de conservadores contenidos en las preparaciones de . insulina comercial (Novolog) o niveles de conservadores EP-B (Farmacopea Europea) y USP (Farmacopea del. los Estados Unidos) .

Las formulaciones ' de insulina Lisprú/rHuPH20 se expone en la Tabla 61 a continuación. Las formulaciones de la insulina Aspart/rHuPH20 se expone en; la Tabla 62. Las formulaciones, de insulina Glulisina/rHuPH20 se expone en la Tabla 63. La formulación base contuvo 3.5 mg/mL de insulina Lispro o Aspart, 600 U/mL de rHuPH20, Tris/HCl 30 mM, metionina 20 mM y 0.01% de Poloxámero 188. El pH, las concentraciones de NaCl y las concentraciones de glicerina se variaron dentro de. las tres concentraciones de conservadores base .

Para las formulaciones de insulina Lispro/rHuPH20 e insulina Aspart/rHuPH20 se expone en la Tabla 61 y 62, las formulaciones A1-A4 tienen el nivel de conservadores NovologMR comercial: 0.15% - de . fenol y 0.172% de m-cresol; las formulaciones B1-B5 tienen un nivel de. conservadores EP-B: 0.1% de fenol y 0.15% de m-cresol y formulación Ul tiene un nivel de conservador USP: 0.125% de fenol y .0.075% de m-cresol..

Además, para las .formulaciones de insulina Glulisina/rHuPH20 expuesta en la Tabla. '63, la formulación 1 tiene el nivel de conservador Novolo.gMR comercial:. 0.15% de fenol y 0.172% de m-cresol. La formulación 2 tiene un nivel de conservador EP-B: 0.1% de fenol y 0.15% de m-cresol. La formulación 3 tiene un nivel de conservador USP: 0.125% de fenol y 0.075% m-cresol. Las formulaciones 4-7. tienen el nivel. de conservador comercial NovologMR y varían en uno o más factores para comparación con la formulación 1. ' ·' Las variaciones entre las formulaciones indican en tipo en negrita. La formulación 4 tiene una- concentración más alta de NaCl y la formulación 7 tiene un surfactante diferente. Las formulaciones 5 y 6 varían de la forrculación 4 en la concentración de metionina y el pH.

Un (1) mL de cada formulación se almacenó y se incubó en varias temperaturas como se describe en el Ejemplo 13 anterior en el vial de vidrio de 2 mL de borosilicato Tipo 1 USP . con un tapón de caucho clorobutilo y un sello de aluminio. Las mediciones de estabilidad, se- grabaron -en varios tiempos: t = ?, . 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 6 o 9 meses. La estabilidad también se evaluó al medir el pH, apariencia, actividad enzimática de la rHuPH20, porcentaje de pureza y porcentaje de recuperación de la rHuPH20 .por. RP-HPLC, porcentaje de pureza y porcentaje . de recuperación, de la •insulina Lispro por, RP-HPLC, y el porcentaje de pureza de la insulina lispro -por la SEC no de desnaturalización y desnaturalización (véanse los Ejemplos l-÷5 y Ejemplo 13) . Los criterios de aceptación de estabilidad o la especificación objetivo para cada parámetro sometido a prueba son los mismos como se describe en el Ejemplo 13. Las muestras solo se evaluaron en un punto de tiempo subsecuente si los resultados indicaron >30% del nivel inicial. .

Los resultados se resumen a continuación. 1. Punto de Tiempo de 1 Mes a . Insulina Lispro Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo y temperaturas. Todas las formulaciones sometidas a prueba fueron estables a 5±3°C hasta el punto de tiempo de 1 mes para tanto la rHuPH20 como la insulina lispro. Las formulaciones a 15±2°C no se evaluaron en el punto de tiempo de un mes.

La rHuPH20 fue estable en la mayoría de las formulaciones mantenidas a 25±2°C a 1 mes con excepción .de las formulaciones Al, A2, A4 y-B4. Las formulaciones Al, A2 y B4 descienden por debajo de 375 U/mL de la especificación objetivo para la^ actividad enzimática de la rHuPH20 entre 2 semanas y 1 mes y la formulación A4 desciende por debajo de la especificación objetivo entre 1 y 2. semanas después .del almacenamiento a- 25°C. Estas formulaciones tuvieron niveles comerciales de Novolog o EP-B de conservadores con un pH alto (pH 7.6), que desfavorece la estabilidad de la rHuPH20. La formulación EP-B individual (B4) que tuvo < 375 U'/mL de actividad de hialuronidasa después de 1 mes a 25°C tuvo un ' pH 7.6 y una concentración de cloruro de sodio baja (50 mM) que se combinó fue desfavorable para la rHuPH20-. Las . otras formulaciones EP-B a pH 7.6 con concentraciones de cloruro de sodio más altas (80 mM o 100 mM) ambas permanecieron muy por arriba del nivel objetivo de 375 U/mL de actividad enzimática · de la rHuPH20. después de 1 mes a 25°C. Todas las- otras formulaciones estuvieron muy por arriba de la especificación objetivo después de 1 mes de almacenamiento a 25°C. La insulina iispro fue estable en todas las formulaciones a 25°C en el punto de tiempo de 1 mes pero el porcentaje de pureza por 1-a RP-KPLC comenzó a. disminuir ligeramente.

La rHuPH20 fue menos estable en todas las formulaciones mantenidas a 30±2°C como es comparada con aquellas a 25+2 °C. La . formulación USP mantuvo la actividad de la rHuPH20 aceptable a l mes a 30°C pero ninguno de las formulaciones o conservador comercial (A1-A4) o EP-B (B1-B5) permaneció por arriba de la especificación objetivo después de 1 semana de almacenamiento a 30 °C. La insulina lispro fue estable dentro de la especificación objetivo durante, 1 mes en todas las formulaciones a 30 °C pero el porcentaje de pureza por la RP- 529 .' ¦' '· ¦¦ HPLC estuvo disminuyendo ligeramente. ¦ .. b. Insulina Aspart Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo y temperaturas. Todas las formulaciones fueron estables'1 a 5+3 °C hasta- el punto de tiempo de 1 mes para tanto la rHUPH20 como la insulina Aspart. Las formulaciones a 15±2°C no se evaluaron en el punto de tiempo de un mes.

La rHuPH20 fue estable en todas las .formulaciones mantenidas a 25±2°C a 1 mes con la . excepción de las formulaciones A4 y¦ B4 que descendieron por abajo de 375 U/mL de. la especificación objetivo entre 1-2 semanas y 2 semanas-1 mes, respectivamente. Estas formulaciones tuvieron niveles del NovoLogMR comercial o EP-B de conservador con sal baja (50 mM) y pH alto (7.6), que cada uno son condiciones que desfavorecen la estabilidad de la rHuPH20. Todas las otras formulaciones estuvieron por arriba de . la especificación objetivo para la actividad enzimática de la rHuPH20 después de 1 mes de almacenamiento a 25°C. La insulina Aspart fue estable en todas las formulaciones a 25°C en el punto de tiempo de 1 mes. El contenido total de la insulina Aspart fue más bajo que el . esperado pero los valores son consistentes del tiempo=0.

La rHuPH20 fue menos estable en todas las formulaciones mantenidas a 30±2°C. como es comparada con aquellas a 25±2°C. La formulación USP (Ul) mantuvo la actividad de la; rHuPH20 aceptable a l mes a 30°C. Varias de las formulaciones EP-B mantuvieron la actividad de la rHuPH20 aceptable a 1 semana pero ninguna de las formulaciones de conservador NovologMR mantuvo la , actividad aceptable después., de 1 semana de almacenamiento a 30°C. La insulina Aspart fue estable dentro de la especificación objetivo durante 1 mes pará todas las formulaciones a 30°C pero hubo una tendencia hacia .abajo ligera notable para el porcentaje de pureza por la RP-HPLC. c. Insulina Glulisina Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo y¦ temperaturas . Todas las formulaciones fueron estables a 5±3°C hasta el punto de tiempo de 1. mes para tanto la rHUPH20 como la insulina Glulisina. Las formulaciones ' a 15±2°C no se evaluaron en. el punto de tiempo de un. mes.

La. rHuPH20 fue estable en todas ; las formulaciones mantenidas a 25±2°C hasta 1 mes. Hubo alguna tendencia hacia abajo ligera para algunas de las formulaciones con respecto. a la actividad de la rHuPH20 y la pureza de la rHuPH20 por RP-HPLC. La insulina Glulisina. fue estable en todas las formulaciones a 25.°C en el punto de. tiempo de 1. mes pero también mostraron una. tendencia hacia abajo ligera con respecto a la pureza y el porcentaje de recuperación.

La rHuPH20 fue menos estable en todas las .formulaciones mantenidas a 30±2°C como es comparada con aquellas a 25+2 °C. Cuatro (4) de los 7 artículos de prueba no lograron cumplir con la especificación de la actividad rHuPH20 objetivo de > 375 U/mL después de 1 semana a 30°C. la formulación 6 mostró actividad aceptable para solamente 1 semana, la formulación 2 mostró actividad aceptable durante 2. semanas, y la formulación USP (#3) mantuvo la actividad de la rHuPH20 aceptable (532 U/mL) a- 1 mes a 30°C. La insulina Glulisina fue estable dentro de la especificación objetivo durante .1 mes en todas las. formulaciones a 30°C, pero hubo una tendencia hacia abajo clara notable para el porcentaje de pureza y el porcentaje de recuperación por la RP-HPLC. 2. Punto de Tiempo Dos Meses a. Insulina Lispro Todas las formulaciones fueron, transparentes, e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo y temperaturas. Todas las formulaciones sometidas a prueba fueron, estables a 5±3°C hasta el punto de tiempo de 2. meses para tanto la rHuPH20 como la insulina lispro.

. . Todos los artículos de prueba también fueron estables a 15±2 °C-- hasta ¦ el punto · de tiempo de 2 meses para tanto la rHuPH20 como la insulina lispro. Hubo alguna tendenci muy ligera hacia abajo para la actividad enzimática de la rHuPH20 pero no hubo otra tendencia hacia, abajo obvia en la estabilidad.

La rHuPH20 no fue estable en las formulaciones .'de conservadores comerciales. (A1-A4) a 25±2°C a 2 meses, pero la formulación A3 tuvo buena actividad a l mes (436 U/mL) y solo estuvo ligeramente por debajo de la especificación de > 37-5 U/mL propuesta a 2 meses (361 U/mL). Cuatro (4) de las .5 formulaciones EP-B (Bl, B2, B3 y B5) estuvieron-' por · arriba -de 375 U/mL de la especificación objetivo después de 2 meses a 25 °C y tuvieron buena pureza y recuperación de la rHuPH20. La formulación USP (Ul). también estuvo por arriba de la especificación objetivo de la actividad de la rHuPH20 después de 2 meses a 25°C con un valor de 510 U/mL y los valores de pureza y recuperación correspondientemente altos. La insulina lispro fue estable en todas las formulaciones a.25°C ai puntó de tiempo de 2 meses pero las tendencias hacia · abajo identificadas en 1 mes continuaron'.

Como se identifica a 1 mes, .la rHuPH2.0 fue menos estable en todas las formulaciones mantenidas a 30±2°C como es comparada con aquellas ' a 25±2°C y todas las formulaciones A (conservador comercial) y B (conservador EP-B) estuvieron muy por debajo de la especificación de la actividad de la rHuPH20 objetivo por 2 meses a 30°C. La formulación USP solo mantuvo la actividad de la rHuPH20 aceptable (375 U/mL) a .los 2.meses a 30°C, pero muy por debajo de la especificación en el punto de tiempo de 1 mes (3.34 U/mL) . Esto puede ser debido a la variabilidad inherente en el ensayo de la actividad de rHuPH20 . o la variación de muestra, pero aún muestra, la tendencia hacia abajo 'general en la estabilidad a 30°C. La insulina lispro fue estable dentro de, la especificación objetivo durante 2 meses en todas las formulaciones a 30°C, pero hubo una tendencia hacia abajo definida notable para el porcentaje de pureza y recuperación por la RP-HPLC asi como el porcentaje de pureza para la SEC no de desnaturalización., b . Insulina Aspart Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo y temperaturas. Todas las formulaciones fueron estables , a 5±3°C . hasta el punto de tiempo de 2 meses para tanto, la rHuPH20 como la insulina Aspart. Todos, los artículos de prueba también fueron estables a 15±2°C hasta el punto de tiempo de 2 meses para tanto la rHuPH20 como la insulina Aspart. Se observó una ligera disminución . para la actividad enzimática de la rHuPH20, pureza, y, recuperación.

La rHuPH20 no fue estable en 3 de las 4 formulaciones de conservadores comerciales (A2, A3 y A4) a 25±2°C a 2 .meses, pero la formulación Al tuvo actividad aceptable a 2 meses (385 U/mL) y el articulo de prueba A3 estuvo solo ligeramente por debajo de la especificación de > 375.U/mL propuesta a 2 meses (357 U/mL). Tres (3) de las 5 formulaciones EP-B (Bl, B2 y B3) aún estuvieron muy por arriba de 375 U/mL de la especificación objetivo para la actividad¦ enzimática de la rHuPH2C después de 2 meses a 25°C y. estuvo aceptable pero no característicamente más baja que la pureza de la rHuPH20 esperada y recuperación con base en la experiencia con. las formulaciones similares. La formulación USP (Ul) aún estuvo muy por arriba de la especificación objetivo de la actividad de rHuPH20 después, de 2 meses a 25°C con un valor de 444 U/mL con la pureza y recuperaciones aceptables.. La insulina Aspart fue estable en todas las formulaciones a 25 °C en el punto de tiempo de 2 meses pero hubo tendencias hacia abajo ligeras en la pureza por la RP-HPLC y la SEC no de desnaturalización.

Como se identifica a 1 mes, la rHuPH20 fue menos, estable en todas las formulaciones mantenidas a 30±2°C¦¦ como, es comparada con aquellas a 25±2°C, y todas las formulaciones A y B estuvieron muy por debajo de la especificación de la actividad enzimática de la rHuPH20 objetivo por 2 meses a 30°C. La formulación USP (Ul) tuvo actividad de la rHuPH20 aceptable (382. U/mL) a 2 meses a 30°C. El porcentaje de pureza y recuperación de la rHuPH20 para la . formulación USP- fueron ligeramente más. bajas que lo esperado con base, en la experiencia con las formulaciones similares como se describe en lo anterior pero estuvieron entro: de los limites aceptables.. La insulina Aspart fue estable dentro- de la especificación objetivo durante 2 meses en todas las formulaciones a 30°C pero hubo una tendencia hacia abajo notable para el porcentaje de pureza para la RP-HPLC asi como el porcentaje de pureza para la SEC de desnaturalización y no de desnaturalización. El porcentaje de recuperaciones bajo observado para los puntos de tiempo previos ya no fue evidente y los valores para el porcentaje de recuperación de la insulina Aspart por la RP-HPLC se había incrementado ligeramente entre 1 y 2 meses para todas las temperaturas (más evidente a 30 °C) . c. Insulina Glulisina Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo y. temperaturas. Todas las formulaciones sometidas a prueba fueron estables dentro de las especificaciones objetivo a 5±3°C hasta el punto de tiemplo de 2 meses para tanto la rHuPH20 como la insulina Glulisina.

Todos los artículos de prueba fueron estables dentro de las especificaciones objetivó a 15±2°C en. el punto de tiempo de 2 meses para tanto la rHuPH20 como ia insulina Glulisina.

Los datos de 2 meses fueron de manera general ligeramente, más bajos para la actividad de la rHuPH20 y. recuperación pero el porcentaje de pureza permaneció el mismo, excepto en la formulación . #5 (sin metionina agregada) que tuvo un porcentaje de pureza significativamente más bajo a. 2 meses. La insulina glulisina también fue estable dentro de las espécificaciones objetivo a 15°C hasta él punto de tiempo de 2 meses, mostrando solamente valores ligeramente más bajos después- de 2 meses a 15°C para el porcentaje de. pureza . y recuperación.

La actividad de la rHuPH20 estuvo muy por arriba de las especificaciones preliminares (< 375 U/mL) para 3 de las '.7 formulaciones (#2, #3 y #6) mantenidas a 25±2°C a 2 meses y justo por arriba de las especificaciones para la formulación #4. En general estas formulaciones contuvieron ya sea los niveles más bajos de conservador (#2 y . #3) o sal más alta y pH más bajo (#6). La formulación #4, que estuvo justo por arriba, de la especificación de la actividad rHuPH20, tuvo el nivel más alto de conservador y pH en el estudio pero también contuvo la concentración más alta de NaCl . Hubo una¦ tendencia hacia abajo para todas las formulaciones, con respecto a la actividad, pureza, y contenido de la rHuPH20.' La' insulina Glulisina fue estable en todas las formulaciones a 25°C hasta el .punto de tiempo de 2 meses pero continuó, la tendencia ligeramente hacia abajo con respecto a la pureza y porcentaje de G?? ?e^???? identificados en 1 mes.

La rHuPH20 fué menos estable en todas las formulaciones mantenidas a 30±2°C como es comparada con aquellas a 25±2°C. Solamente la formulación de nivel de conservadores USP (#3) cumplió con la especificación de la actividad objetivo- > 375 U/mL después de 2 meses a 30°C. .la formulación #3 también mostró pureza y recuperación de la rHuPH20 aceptables que en el pun~o de tiempo . de 2 meses. La insulina Glulisina fue estable dentro de las especificaciones objetivo durante 2 meses en todas las formulaciones a 30 °C, pero hubo una tendencia hacia abajo -clara notable para el 'porcentaje de pureza y el porcentaje de recuperación para la RP-HPLC. 3. Punto de Tiempo de 3 Meses a. Insulina Lispro Todas las formulaciones fueron estables a 5±3°C hasta el punto de tiempo de 3 meses para tanto la rHuPH20 como la insulina lispro. La pureza de la rHuPH20 por lá RP-HPLC tuvo de alguna manera valores más bajos que los esperados, pero esto parece que es debido a la variación normal del ensayo. Todas las formulaciones fueron transparentes e- incoloras sin partículas , en todos l'os puntos de tiempo y temperaturas, excepto la formulación A3 que se identificó por contener "2 astillas extrañas rojas".

Todas las formulaciones cumplieron con todas . las especificaciones objetivo a 15±2°C hasta el punto de tiempo de 3 meses para tanto la rHuPH20 como la insulina lispro. La pureza de la rHuPH20 por la RP-HPLC también tuvo de alguna manera valores más bajos que los- esperados,, que corno se menciona previamente b parece que es debido a. la variación del ensayo normal. Existe alguna tendencia ligera hacia abajo para la actividad de la rHuPH20 y la pureza de la insulina Lispro por la SEC no de desnaturalización pero ninguna otra tendencia hacia abajo obvia.

¦ La rHuPH20 no fue estable en las formulaciones de conservadores comerciales (A1-A4) a 25±2°C hasta 3 meses. Cuatro (4) de las 5 formulaciones EP-B (Bl, B2 B3 y B5) aún estuvieron por arriba de los 375 U/mL de especificación objetivo para la ' actividad enzimática de la rHuPH20 después de 3 meses a 25 °C, y tuvieron una tendencia hacia abajo pero aceptable de la pureza y recuperación de la rHuPH20. La formulación USP . (Ul) aún estuvo muy. por encima de la especificación objetivo de la actividad de la rHüPH20 después de 3 meses a 25°C con un valor de 522 U/mL y valores- de pureza y recuperación correspondientemente altos. La insulina lispro fue estable, en todas las formulaciones a 25°C hasta el tiempo de 3 meses, pero fueron evidentes tendencias hacia abajo para la pureza de la insulina lispro por. la RP-HPLC y la SEC no de desnaturalización.

Como se identificó previamente, la rHuPH20 fue menos estable en todas las formulaciones mantenidas a 30+2 °C como es comparada con aquellas .a 25±2°C y todas las . formulaciones estuvieron por debajo de la especificación de la actividad rHuPH20 objetivo después de 3 meses a 30°C. La insulina lispro . .fue estable dentro de la especificación- objetivo durante 3 meses en todas las formulaciones a 3G°C, pero hubo tendencias hacia abajo definidas para el porcentaje de pureza por la RP-HPLC asi como el porcentaje de pureza para la SEC no de desnaturalización. b . Insulina Aspart Todas las formulaciones fueron, transparentes e incoloras sin . partículas en todos los puntos de tiempo y temperaturas . Todas las formulaciones de prueba fueron estables a 5±3°C hasta el punto de tiempo de 3 meses para tanto la rHuPH20 como la . insulina Aspart. Todas las formulaciones cumplieron con todas las especificaciones objetivo a 15±2°C hasta el punto de tiempo de 3 meses para tanto la rHuPH20 como la insulina Aspart. Hubo alguna tendencia hacia abajo para la actividad, pureza, y recuperación de la rHuPH20. La pureza de la insulina Aspart por la SEC no de', desnaturalización de alguna manera fue más baja que en el punto de tiempo- de - 2 meses, pero no es claro si esto es una tendencia hacia abajo o variabilidad normal del ensayo.

La rHuPH20 no fue estable, en las; formulaciones de conservadores comerciales pero la formulación Al estuvo . solo ligeramente por debajo de la especificación de la actividad de rHuPH20 objetivo. (< 375 U/mL) ¦ a¦ 3¦ meses (369 U/mL). Tres (3) de las 5 formulaciones EP-B (Bl, . B2. y B3) aún estuvieron muy por . arriba de los. 375 U/mL de especificación objetivo después de 3 meses., a 25±2°C y .tuvo una pureza y recuperación de la rHuPH20 aceptable pero inesperadamente más baja, como se menciona en el resumen de 2 meses.. La formulación USP (Ul) aún estuvo muy por encima de la especificación objetivo de la actividad de la rHuPH20 después de 3 meses á 25°C con un valor de 492 U/mL con pureza y recuperaciones aceptables. La insulina Aspart fue estable en todas las formulaciones a 25°C hasta el punto . de' tiempo de 3 meses pero hubo claras tendencias hacia abajo en la pureza por la RP-HPLC y " la SEC no de desnaturalización.

Como se plantea previamente, la rHuPH20 fue¦ menos estable, en todas, las formulaciones mantenidas a 30±2°C como es comparada con aquellas a 25±2°C. Todas las formulaciones . A y B estuvieron por debajo de la especificación de la actividad rHuPH20..objetivo por 1 mes a 30°C. La formulación USP (Ul) solo estuvo ligeramente .por abajo. de la especificación de > 375 U/ mL propuesta a 3 meses (371 U/mL) pero también tuvo un porcentaje de pureza y porcentaje de recuperación de la rHuPH20 baja por la RP-HPLC. La insulina aspart fue estable dentro de la especificación objetivo durante 3 meses en todas las formulaciones a 30°C por todas las técnicas excepto la SEC no de desnaturalización que mostró una declinación muy ligera da aproximadamente 97% de pico principal para todas las formulaciones. 4. Punto de Tiempo de 6 Meses a . Insulina Lispro Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo y temperaturas. Las formulaciones a 30+2 °C no se evaluaron en el punto de tiempo de 6 meses. .

Todas las formulaciones fueron estables a ,5±3°C y 15±2°C hasta el punto de tiempo de 6 meses para tanto la rHuPH20 como la insulina- lispro. Hubo alguna tendencia ligera hacia abajo para la. actividad de la rHuPH20 y el porcentaje de recuperación de la rHuPH20 para todas las formulaciones. La formulación A4 fue la menos estable en ambas temperaturas.

Solamente las formulaciones B3 y Ul cumplieron¦ con los requisitos de estabilidad a 25±2°C. Ambas de estas formulaciones tuvieron un pH de 7.4. y sal -80 mM. Las formulaciones restantes tuvieron actividad enzimática de la rHuPH20 menor que 375 U/mL. La pérdida en . la actividad coincidió con una pérdida' en el porcentaje de recuperació . de la rHuPH20. La SEC.no.de desnaturalización mostró una ligera tendencia hacia, abajo en el porcentaje de pureza de la insulina lispro. b. Insulina Aspart Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo y .temperaturas .

Las formulaciones a 30+2 °C no se evaluaron en el punto de tiempo de 6 meses.

Todas las formulaciones fueron estables a 5±3°C y 15±2°C hasta el punto de tiempo de 6 meses para tanto la rHuPH20 como la insulina aspart. Hubo alguna tendencia ligera hacia abajo para la actividad de la rHuPH20 y porcentaje de recuperación de la rHuPH20 para todas las formulaciones. La formulación A4 fue. la menos estable en ambas temperaturas.

Solo la formulación Ul cumplió con¦ los .'requisitos de estabilidad a 25±2°C. Las formulaciones restantes tuvieron menos actividad enzimática de la rHuPH20 menor que 375 U/mL. La pérdida en actividad coincidió con una pérdida en el porcentaje de recuperación de la rHuPH'20. La SEC no de desnaturalización mostró una ligera tendencia hacia¦ abaj o . en el porcentaje de pureza de la insulina aspart. 5. Punto de Tiempo de 9 Meses a. Insulina Lispro Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo temperaturas. Las formulaciones a.25±2°C y 30±2°C no se evaluaron en el punto de tiempo de 9 meses.

Todas las formulaciones fueron estables a 5±3°C y 15±2°C hasta el punto de tiempo de 9 meses para tanto la rHuPH20 como la insulina lispro. Hubo alguna tendencia ligera hacia abajo para la. actividad de la rHuPH20- y el porcentaje de recuperación de la rHuPH20 para todas las formulaciones. Como se observa a los..'6 meses, la Formulación A4. es. la. , menos estable en ambas temperaturas. b. Insulina Aspart Todas las formulaciones fueron transparentes e¦ incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo y temperaturas. Las formulaciones . a- 25±2°C y 30±2°C no se evaluaron en el punto de tiempo de 9 meses.

Todas las formulaciones fueron estables a 5±3.9C' y 15±2°C hasta el punto de tiempo de '9 meses para tanto la rHuPH20 como la insulina aspart. Hubo alguna tendencia ligera hacia abajo para la actividad de la rHuPH20 y el porcentaje de recuperación de la rHuPH20 para todas las formulaciones. Como se observó a 6 meses> la Formulación A4 fue la -menos estable en ambas temperaturas. .

Ejemplo 14 Estudio de Estabilidad Acelerada de la Aspart-rHuPH20 y Lispro-rHuPH20 : Congelación/Descongelación, Agitación y Alta Temperatura de Almacenamiento En este ejemplo,- la estabilidad de diversas formulaciones de insulina aspart-rHuPH20 e insulina. Lispro-rHuPH20 se evaluó bajo tres condiciones de estrés físicamente aceleradas: múltiples ciclos de congelación/descongelación; agitación a 25°C, y estrés térmico a 37°C. La estabilidad se evaluó al medir la apariencia y características: generales, la actividad enzimática de l rHuPH20 y rHüPH20 y la pureza del análogo de insulina.' Las formulaciones del análogo de insulina/rHuPH20 se exponen en la Tabla 64 a continuación. Una muestra de HumalogMr (insulina lispro, Formulación 4) y muestra de NovoLogMR (insulina aspart, Formulación 8) se', usaron como controles. Las formulaciones base contuvieron 3.47 mg/mL de insulina lispro o 3.5 mg/mL de insulina aspart, 600 U/mL de rHuPH20, Tris/HCl 30 mM, y 0.01% de 188. Las formulaciones 1 y 5 contuvieron adicionalmente NaCl 50 mM, metionina ' 100 mM, 0.13% dé fenol y 0.075% de m-cresol, con un pH de 7.4. Las Formulaciones 2. y 6 (formulaciones EP-B) contuvieron adicionalmente NaCl 80 mM, metionina 20 mM y glicerina 50 mM con un- nivel de conservadores EP-B: 0.15% de fenol y 0.175% de m-cresol. Las Formulaciones 3 y 7 (formulaciones USP) contuvieron adicionalmente NaCl 80 mM, metionina-. 20 mM y glicerina 50 mM con un nivel de conservadores USP: 0.13% de fenol y 0.075% de m^cresol.

Cada formulación se expuso a las siguientes condiciones de degradación aceleradas: (1) Agitación a 25°C: Cada formulación en una incubadora a 25°C equipada con un agitador .. Los viales permanecieron verticales con agitación a- 650 rpm. Las muestras se retiraron para análisis después de la agitación' durante 6, 12 y 24 horas. Todas las muestras se almacenaron 2-8 °C antés del análisis . (2) Multi-Ciclo de Congelación/Descongelación: Cada formulación se ' sometió a 5 ciclos . de congelación/descongelación al alternar la condición de almacenamiento entre un congelador a -30 °C y temperatura ambiente en . la mesa. Las muestras se dejaron · en cada condición durante ..por lo menos 2 horas para cada ciclo (es decir, 2 horas en' el congelador de -30°C, la remoción y colocación en la parte superior de la mesa a temperatura ambiente durante 2 horas se consideró un ciclo) . Las muestras se retiraron después de 1, 3 y 5 ciclos y se almacenaron a 2-80C antes del análisis. (3) Estrés Térmico: Cada formulación se mantuvo en una incubadora a 37°C. Las muestras se retiraron después de 8, 24 y 48 horas y las muestras se almacenaron a 2-8°C antes del análisis.

?G análisis-, se llevó a cabo antes y después de que se aplicaron las condiciones de estrés. Todas las formulaciones se caracterizaron por un conjunto completo de pruebas analíticas, incluyendo apariencia, osmolaridad, pH turbiedad, actividad enzimát-ica , de la hialuronidasa, pureza de la hialuronidasa y pureza de la insulina, pureza y contenido de HWM . (véase los .Ejemplos 2-5 y 12 anteriores/ para procedimientos de prueba) . Los critérios de aceptación de estabilidad, o especificación objetivo para cada parámetro probado son los mismos como se describe en el Ejemplo 12. Los resultados se resumen a continuación. 1. Agitación a 25°C Las formulaciones EP-B (#2 y #6) y las- formulaciones de control (#4 y #8) fueron transparentes e incoloras sin partículas en todos los puestos de tiempo. Las formulaciones UPS (#3 y #7) fueron transparentes e incoloras . después de'..6 horas de agitación pero se ha formado un precipitado por el punto de tiempo de 12 horas. Las formulaciones. #1" y #5 tuvieron el precipitado en el punto de tiempo de 6 horas.

La rHuPH20 fue estable ·. en todas las formulaciones' en todos los puntos de tiempo teniendo actividad .' enzimáti'ca de >375 U/mL. El porcentaje de recuperación de. la rHuPH20 disminuyó ligeramente, en todos los puntos de tiempo sucesivos, pero todas las formulaciones mantuvieron un nivel de recuperación aceptable. La insulina aspart y la Insulina lispro fueron estables en todos los puntos de tiempo. Los controles de NovoLogMR (insulina aspart) y HumalogMR (insulina lispro), fueron estables en todos los. puntos de tiempo. 2. Congelación/Descongelación Todas las formulaciones fueron transparentes e ' incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo. Después de 1 ' ·' . . ¦ / ' 548 ciclo de congelación/descongelación, la actividad enzimática de la rHuPH20 se disminuyó en gran medida (formulación más alta, #3, tuvo una actividad de 168 U/mL) aunque él porcentaje de pureza permaneció >95%. para todas las formulaciones y puntos de tiempo. Él porcentaje de recuperación de la rKuPH20 estuvo por abajo de los niveles aceptables para la. mayoría de las formulaciones. La insulina aspart y la insulina . lispro fueron estables en todos los puntos de tiempo. El NovoLogMR (insulina aspart) y HumalogMR (insulina lispro)., fueron estables en todos los puntos dé tiempo. ' ' 3. Estrés Térmico a 37°C Todas las formulaciones fueron transparentes, e incoloras sin partículas en todos los puntos de tiempo. Las formulaciones #1, #3, #5 y 17 tuvieron una actividad enzimática de la rHuPH20 aceptable (>375 U/mL) después de 8 horas a 37°C. La estabilidad de la rHuPH20 disminuyó en todos los puntos de tiempo sucesivos para toda las formulaciones, como es evidenciado por una disminución en la actividad de la rHuPH20 (por abajo de 375 U/mL) y una disminución en .el porcentaje de recuperación. La insulina aspart y la Insulina lispro fueron estables en todos los puntos de tiempo. Los controles de NovoLogMR (insulina aspart) y HumaiogMR (insulina lispro) fueron estables en todos los puntos de tiempo.

Ejemplo 15 Efecto de los Oligómeros HA en la estabilidad de la formulación de la insulina/rHuPH20 En este ejemplo, se evalúo el efecto de la adición de los oligómeros HA en la estabilidad de varias formulaciones de insulina/rHuPH20. Primero, las pruebas se contemplaron para evaluar la estabilidad bajo cuatro condiciones de almacenamientos: 5°C, 25°C, 30°C y 35°C.a través del tiempo. Segundo, se probó el efecto de los oligómeros de HA en la estabilidad de rHuPH20 en presencia de diferentes conservadores. Tercero, el efecto estabilizantes de diferentes tamaños de. oligómeros HA se evaluó para-, las formulaciones de la insulina aspart-rHuPH20.

A. Efecto de los oligómeros HA en la estabilidad de almacenamiento Las formulaciones contuvieron' varias cantidades de HA (10, 15 o 20 mg/mL). Las ' formulaciones adicionales contuvieron 15 mg/mL de HA con pH variante, glicerina y concentraciones de sal.

Las formulaciones de insulina/rHuPH20 se exponen en la Tabla 65 a continuación. Las formulaciones : básicas contuvieron 3.5. mg/mL de insulina, 600 U/mL (5 pg/mL) rHuPH20, Tris/HCÍ 30 mM, NaCl 80 mM, metionina .20 mM y 0.01% de Poloxámero 188 (Poloxámero 188) con 0.1% de fenol y 0.15% 55 C de m-cresol a un pH de 7.4. Las formulaciones ^ #2-#4 contuvieron adicionalmente 10, 15 y 20 mg/mL de oligómeros HA, respectivamente. Las formulaciones #1 y #6 contuvieron adicionalmente glicerina 50 mM, con la formulación. #6 que contiene 15 mg/mL de oligómeros HA. Las Formulaciones #5 y #7 variaron de la formulación #3 en su pH y concentraciones de NaCl. Se evaluaron tres formulaciones adicionales (#8-#10) que no contienen metionina, y cada uno que contiene 3.5 mg/mL de insulina, 600 U/mL de rHuPH20, 15 mg/mL de oligómeros HA, Tris/HCl 30. mM, NaCl 80. mM y 0.01% de Poloxámero 188 con 0.1% de fenol y 0.15%. de m-cresol a pH 7.4. La formulación #8 contuvo adicionalmente metionina 20 mM _ y la formulación #10 contuvo.. adicionalmente glicerina 50. mM.

Un (1) mL de cada formulación se almacenó en un vial de vidrio de 2 mL de · borosilicato tipo 1 USP con un tapón de caucho de clorobutilo y un sello de aluminio. Cada formulación se incubó, individualmente, a 5 + 3°C, 25 ± 2°C, 30 ± 2°C y 35 í 2°C y se' registraron las mediciones de estabilidad' en el tiempo t = 0,. 2, 5, 7 y 9 días, 1 y ;·2 semanas, 1 mes o 2 meses. La estabilidad se evaluó al medir el H, apariencia, osmolaridad, actividad enzimática de la rHuPH20, contenido- de rHuPH20 por la RP-HPLC, contenido de insulina por RP-HPLC, y el porcentaje de pureza de la insulina por la SEC no de desnaturalización (véase los Ejemplos 2-5 y Ejemplo 12). Los criterios de aceptación de estabilidad o especificación objetivo para cada parámetro sometido a prueba son los mismos como se describe en el Ejemplo 12. 1. 5°C Todas las formulaciones que contienen por lo menos 15 mg/mL de oligómeros de HA contuvieron partículas- visibles después de solamente 1 semana a 5°C. Las formulaciones que contienen solamente 10. mg/mL de .oligómeros de HA o sin oligómeros de HA ¦ fueron transparentes, incoloras y no contuvieron partículas después de 2 semanas a 5°C,. pero las partículas se. observaron después . de 1 mes. Todas, las formulaciones sometidas a. prueba fueron estables a 5°C hasta el punto de tiempo de 2 meses para la rHuPH20. La insulina fue . inestable en las. formulaciones que contienen 2.0 mg/mL de oligómeros de HA; (#4), 'que tiena un pH de más bajo (#5) y. que contienen sal más. alta (#7), después de solamente 1 mes a 5°C. 2. 25°C Las formulaciones #5 (pH bajo) y #7 (sal · alta) contuvieron partículas después de solamente 1 semana a .25°C. las formulaciones restantes todas fueron transparentes e incoloras y rio\ contuvieron ' partículas. Todas las formulaciones de prueba fueron estables a 25°C hasta el. punto de tiempo de 2 meses. para tanto la rHuPH20 como, la insulina. 3. 30°C Las formulaciones #5 (pH bajo), y #7. (sal . alta) contuvieron partículas después de solamente una semana a 30°C. Las formulaciones restantes todas fueron transparentes e incoloras y no contuvieron partículas,. Todas las formulaciones que contienen HA fueron estables, durante .1 mes a 30°C para la.rHuPH20.. Por el punto de tiempo de 2 meses, la actividad enzimática de la rHuPH20 había disminuido por abajo de los niveles, aceptables de 375 U/mL. La insulina fue estable en todas las formulaciones, en el .punto- de tiempo de un mes, con una' ' disminución . clara en la estabilidad observadas después de 2 meses a 25 °C. Los oligómeros HA adiciónales tuvieron un efecto . positivo claro en la estabilidad de la" 25°C sin afectar la estabilidad de la insulina.

Las Formulaciones 8-#10 se sometieron a prueba para la oxidación de la rHü-PH20 en el tiempo cero y después de 3 días a 25°C. La formulación #10 que contiene glicerina 50 mM mostraron oxidación incrementada después de solamente 3 días a 25°C. 4. 35°C Las formulaciones que. contienen oligómeros de HA . fueron estables durante 2 días a 35°C para la rHuPH20. A 5 días, solo las formulaciones #3 y #5, que contienen 15. mg/mL de oligómeros HA, con pH variante, fueron estables para la rHuPH20. El contenido de rHuPH20' fue bajo .en todas las formulaciones después de solo 2 días a 35°C. La adición de los oligómeros HA tuvo un efecto positivo ¦ claro en la estabilidad, de la rHuPH20 a 35°C sin afectar la estabilidad de la insulina.¦ B. Efectos de los Conservadores 1. Conservadores USP En este ejemplo, la capacidad de los oligómeros HA para estabilizar, las formulaciones de insulina aspart-rHuPH20 o insulina lispro-rHuPH20 que contienen niveles USP ' de conservadores se evaluó como se determina por la actividad enzimática de la. rHuPH20. Se sometieron a prueba las formulaciones F1-F7. Las formulaciones básicas contuvieron 3.5 mg/mL de insulina aspart o insulina lispro, 600 U/mL de rHuPH20, Tris/HCl 30 mM, ' pH 7.4, metionina 5¦ mM, 0.01% de Poloxámero 188, 0.125% de fenol y 0.075% de m-cresol . La formulación. Fl no . contuvo Insulina, aspart. ..La actividad enzimática de la rHuPH20 se midió . como se describe - en el Ejemplo 2B anterior. Los resultados se exponen en las .Tablas 66-67 a continuación. Todas las formulaciones fueron estables a 5°C durante 3 ó 6 días. Todas las formulaciones que contienen HA, sin considerar su pH y. concentraciones de NaCl tuvieron actividades enzimáticas más altas que las mismas formulaciones que no contuvieron HA. Como se muestra en la Tabla 66 a continuación, la formulación F4 que contiene .10 mg/mL de HA tuvo actividad enzimática de rHuPH20 mas alta a través del tiempo a 37 °C como es comparado con las formulaciones F2 y F3 que no contuvieron HA, ya .sea en el mismo pH. o más bajo. Para la formulación F5 (véase Tabla 67 - a continuación), que tuvo una -concentración reducida de NaCl, la adición de 10 mg/mL en la formulación limitó. la pérdida de la actividad de la- rHuPH20 debido a la concentración de NaCl más baja, que es desestabilizante para la rHuPH20 (véase, por ejemplo, F3) .

Tabla 66. Actividades enzimáticas para las formulaciones de Insulina Aspart-PH20 Tabla 67. Actividades enzimáticas para las formulaciones Insulina Lisp.ro-PH20 2. Conservador de Nivel EP-B En este ejemplo, la capacidad de los . oligómeros HA para estabilizar las · formulaciones de insulina-rHuPH2.0 con los niveles de EP-B ' de' los conservadores se evaluó como se determina por la actividad enzimática de la rHuPH20. Las formulaciones básicas con tuvieron 3.5 mg/mL de insulina, .600 U/mL de rHuPH20, Tris/HCl 30 mM, pH 7.4, metionina ,2.0 mM, 0.01% de Poloxámero. 188, ?.10%- de fenol y 0.15%· de m-cresol. La actividad enzimática de la . rHuPH20 se midió como se describe en el Ejemplo 2B anterior. Los resultados se exponen en la Tabla 68 a continuación. A 35° C, las formulaciones que contuvieron HA (F2-F6) todas tuvieron actividad enzimática de la rHuPH20. más altas que la formulación Fl, que no contuvo HA. En el día 9, solo aproximadamente 10% de la actividad enzimática se dejó para Fl, mientras que las . formulaciones F2-F6, dependiendo: de su pH, HA y concentración es de NaCl, aún tuvieron aproximadamente 30% a 60% de la actividad enzimática de la rHuPH20. Se observaron resultados similares para esas formulaciones incubadas a 30°C para un estudio de de estabilidad a largo, plazo. Como se muestra en la Tabla .68 a continuación, al final de 3 meses de almacenamiento a 30°C, aproximadamente 30% de la actividad enzimática de la rHuPH20 permaneció para la formulación Fl que no contuvo . HA; para todas las otras formulaciones que contuvieron HA, en promedio, permaneció ligeramente por arriba de 50% de la actividad enzimática de la rHuPH20.

A temperatura más baja, la rHuPH20 experimentó menos estrés térmico que podría explicar la diferencia más pequeña con respecto a los ': cambios de la actividád enzimática relativa entre las. formulaciones con y sin HA.. Se nota que bajo el mismo pH y condiciones de NaCl, la actividad de la rHuPH20 no se correlaciona con la concentración de HA sometida a prueba . en este estudio. Debido al hecho que el HA es un substrato para la rHuPH20, su mecanismo . estabilizante se liga más probablemente al efecto, de. ligación de enzima-substrato especifico. Esta interacción se afecta ciertamente por la relación molar entre las dos moléculas. En cierta relación de sustrato : enzima, se alcanza el efecto de estabilizante máximo y la adición de más HA no mejora adicionalmente la actividad. En esté ejemplo, aproximadamente 10 mg/mL de HA es necesario para estabilizar 5 g/mL; de la rHuPH20.

C. Efecto del peso molecular del HA en la estabilización de la rHuPH20 En este ejemplo, el efecto estabilizante de diferentes tamaño de oligóme os HA se evaluó para las formulaciones de insulina- aspart-rHuPH20 como se determina al medir, la actividad enzimática de la rHuPH20. ' Tres hialuronatos de sodio de peso molecular diferentes se adquirieron de Liféco.re Biomedical (Minnesota, EUA) : 6.4 kDa (Lot: GSP252- 5-7), 74 kDa (Lot :GSP252-60-2) y 234.4 kDa (Lot : 002799) .. Diez (10) mg de cada HA se agregó a 1 mL de una formulación de insulina aspart-P.H20 que contuvo 100 U/mL de insulina aspart, .5 pg/mL de rHuPH20, Tris/HCl 30 mM, pH 7.4, NaCl .80 mM, glicerol 50 mM, metionina 20 mM, 0.01% de Poloxámero 188, 0.10% de fenol, y 0.15% de, m-cresol. Una formulación que no contuvo HA también se incluyó en el estudio como un control. Estas soluciones se incubaron a 5°C y 37 °C por hasta 9 días para evaluar el efecto estabilizante de los diferentes tamaños de HA en la actividad enzimática de la rHuPH20. La actividad enzimática de la rHuPH20. se midió, como se describe¦ en el Ejemplo 23 anterior..

Los resultados 'se muestran en la Tabla 69 a continuación. La formulación de insulina aspart-rHuPH20 qué no contuvo HA (Fl) estuvo enzimáticamente inactiva después de 3 días de incubación a 37 °C. En contraste., las formulaciones F2-F4 retuvieron aproximadamente 30-40% de . la actividad enzimática de la . rHuPH20. En general, no hubo tendencia de que los polímeros HA más pequeños parecieron que proporcionaron una mejor protección que los más- grandes. Esto podría ser posible debido. al tamaño . del HA solo a la relación molar de HA rHuEH20..

Tabla 69. Efecto del peso molecular del HA en la actividad enzimática de la rHuPH20 Ejemplo 16 Estudio de la estabilidad de las formulaciones de insulina aspart/rHuPH20 En este ejemplo, se evaluaron varias formulaciones de insulina aspart/rHuPH20 para estabilidad bajo dos. condiciones de almacenamiento, 3'0°C y 37°C, y bajo condiciones aceleradas (agitación 25°C durante 9 días) . Las formulaciones de insulina/rHuPH20 sometidas a prueba, se exponen en. la Tabla 70 a continuación .. La formulación de referencia (#7) contuvo 3.5 mg/mL de insulina aspart, 600. U/mL (5 pg/mL) de rHuPH20, Tris/HCl 30 mM, NaCl 80 mM, glicerina 50 mM, metionina 20 mM y 0.01% de Poloxámero 188 (Poloxámero 188). con 0.1% de fenol y. 0.15% de^ m-^or.esol 'a pH 7.4. Las formulaciones #l-#3 variaron en los diferentes niveles de conservadores sometidos a prueba (0.13% de fenol y 0.12% de m-cresol) con 3 niveles diferentes de estabilizador Poloxámero 188. Las formulaciones #4-#6 variaron en los diferentes niveles de¦ conservadores sometidos a prueba (0.15% de fenol y 0.12% de m-cresol) con 3 niveles diferentes, .de estabilizador Poloxámero . 188. Las formulaciones #8 y #9 contuvieron . adicionalmente 10 mg/mL de oligómeros HA con la formulación #8 que tiene un nivel más bajo de glicerina (20 mM) . Las formulaciones #10 y #11 contuvieron un nivel más bajo de metionina (5 mM) y #11 con tuvo adicionalmente 10 mg/mL de oligómeros HA. 1 Tabla 70. Formulaciones que contienen 600 U/mL de rHuPH20 y 3.5 mg/mL de Insulina Aspart Un (1) mL de cada formulación se almacenó en un vial de vidrio de 2 mL de borosilicato tipo 1 USP con un tapón de caucho de clorobutilo y un sello de aluminio. Cada formulación se incubó individualmente, a 30 ± 2°C y .37'' ± 2°C y se registraron las mediciones de estabilidad en el tiempo' t = 0, 2, 4, 7 y 9 días, 2 semanas, 1 mes o 1.5 meses. Para cada formulación, un conjunto . de viales se sometió a agitación usando un agitador Titer Píate (LabLine) a 6.00 rpm durante 9 días a 25°C. El Novo LogMR (insulina aspart) también se sometió a las mismas condiciones de. agitación como un control.

La. estabilidad se. evaluó' al medir el pH, apariencia, osmolaridad, actividad-; en.zimática de la rHuPH20- contenido de la rHuPH20 por la RP-HPLC y contenido dé insulina por la RP-HPLC (véase los Ejemplos 2-5 y 12). Los criterios aceptables o especificación objetivo para los parámetros de estabilidad fueron los mismos como se exponen, en el Ejemplo 12. 1. 30°C Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras y no contuvieron partículas después de 2 semanas 30 °C. Todas las formulaciones sometidas a prueba fueron estables a 30°C hasta el punto .de 'tiempo de 2 semanas para tanto la rHuPH20 como la. insulina aspart, con una .tendencia hacia abajo ligera en la estabilidad observada para todas las formulaciones .a través del tiempo. Un efecto estabilizante en la actividad de la rHuPH20 se observó para las formulaciones que contienen oligóméros HA (#8., #9, ¦ #11)¦ como ¦ es evidenciado por .la actividad enzimática más alta y el contenido como es comparado con las formulaciones que no contuvieron oligomeros HA. Adicionalmente , , una disminución en las concentraciones ya sea de glicerina y metionina no dieron por. resultado un efecto visible en la estabilidad de estas formulaciones (#8, #9, y #11) Una comparación de las concentraciones de conservadores indicó que la disminución de la cantidad de metacresól y un incremento modesto en la cantidad dé fenol es benéfica para la estabilidad de la rHüPH20, pero el beneficio se elimina cuando la concentración de fenol es alta. En contraste, los cambios en las concentraciones de conservadores tuvieron poco efecto en la estabilidad de la insulina aspart, ya que una disminución moderada en el contenido de insulina aspart se observó para todas las formulaciones. Por ejemplo, la ' rHuPH2.0 fue más estable en las formulaciones que contienen 0.13% de fenol (#l-#3) que aquellas que contienen 0.15% de fenol (#4-#6). Las formulaciones que contienen concentraciones de fenol incrementadas y , concentraciones de' metacresól disminuidas ( #l-#3 ).. fueron más estables que las .' formulación de referencia (#7) que contuvo ur.a cantidad, más baja de fenol y una cantidad más alta de metacresól. En contraste, las formulaciones #4-#6 fueron tan estables como la formulación de referencia #7. 2. 37°C Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras y no contuvieron partículas después de 9 días a 37°C. Un efecto estabilizante en la actividad de la rHuPH20 se observó para las para las formulaciones que contienen oligómeros HA (#8,. #9, y. #11) como es evidenciado por la actividad enzimática más alta y el contenido después de 2 días a 37 °C como es comparada con las formulaciones que no contuvieron oligómeros HA, aunque ninguna de las formulaciones tuvo un nivel aceptable de la actividad enzimática de la rHuPH20. La pérdida de la actividad enzimática de la' rHuPH20 se asoció con la pérdida del contenido de rHuPH20. En .contraste, el contenido de insulina . aspart mostró una tendencia hacia abajo para las formulaciones que contienen oligómeros HA indicando que la insulina aspart no es. estable a. 37 °C en presencia de los oligómeros HA.

Similar a los .efectos observados a 25°C, una . comparación de las concentraciones de conservadores indicó que la disminución de la cantidad del metacresol y un incremento moderado en la cantidad de fenol es benéfica para la estabilidad de la. rHuPH20, pero el benefició se elimina cuando la concentración de fenol es al a. En contraste, los cambios en las concentraciones de conservadores tuvo poco efecto en la estabilidad de la insulina aspart, ya que una disminución moderada en el contenido de insulina se observó para toda las formulaciones. 3. Agitación a 25°C La rHuPH20 y la insulina aspart fueron estables en todas las formulaciones después de 24 o 48 horas a ' 25°C con agitación, aunque las formulaciones que contienen oligómeros HA (#8, #9, y #11) fueron nebulosas después de 24 horas.' El NOvologMR fue estable después de 24 horas a. 25°C con agitación. Los cambios en las . concentraciones de conservadores no .tuvo efecto en la estabilidad de la rHuPH20 o la insulina aspart.

Ejemplo 17 Formulaciones que contienen oligómeros HA y ión de metal divalente (Mg2+) En este ejemplo, el efecto de los niveles EP-B de los conservadores en- la actividad enzimática de la rHuPH20 se evalúo bajo dos condiciones de almacenamiento: 5°C en 5 días y 37 °C durante 3-5 días. Las formulaciones, contuvieron diferentes cantidades de oligómeros HA y ión de metal divalente (Xg2' ) . . .

Las formulaciones de rHuPH20 se exponen en la Tabla 71 a continuación-. Las formulaciones básicas . contuvieron 600 U/mL de rHuPH20, 3 Tris/HCl 0 mM, NaCl 200 mM, metionina 5 mM, 0.01% de Poloxámero 188 (Poloxámero' 188) con 0.100% de fenol y 0.150% de m-cresol a un pH de 6.8. Las formulaciones. 2 y.4 contuvieron adicionalmente 10 mg/mL de oligómeros HA y las formulaciones 3 y 5 contuvieron 20 mg/mL de oligómeros HA. Las formulaciones 2 y 3 contuvieron adicionalmente Mg2+ 3 mM y las formulaciones 4 y 5 contuvieron Mg2+ 10 mM.

Tabla 71. Formulaciones que contienen 600 U/mL de rHuPH20 Un (1) mL de¦ cada formulación se . almacenó en un vial de vidrio de 2 mL de borosilicato Tipo. 1 USP con un tapón de caucho de clorobutilo y un sello de aluminio..' Cada formulación se incubó, individualmente, a 5 . y 37 °C y se registraron las mediciones de estabilidad en el/tiempo t = 3, 4 y/o 5 días. La estabilidad se evaluó al medir el pH, apariencia, osmolaridad, actividad enzimática de la rHuPH20 y contenido de la rHuPH20 por la RP-HPLC (véase los Ejemplos -2- 3 y 5 y Ejemplo 12) . Los criterios de aceptación o la especificación objetivo para cada uno de los parámetros anteriores son. los mismos como se exponen en el Ejemplo 12.

Los resultados muestran que .todas las . formulaciones fueron transparentes . e incoloras sin partículas. La osmolaridad tendió a incrementarse con la adición de Mg2+. La actividad enzimática de la rHuPH20 y el contenido fue estable a 5°C para todas, las ' formulaciones. A 37°C, la actividad enzimática de la rHuPH20 disminuyó a 3 días y ..después de '.4 días, estuvo en la especificación objetivo aceptada de 375 U/mL. Después de 5' días, aproximadamente la mitad de la actividad enzimática de la rHuPH20 inicial permaneció. La reducción en la actividad se correlacionó con la reducción en el contenido de rH.uPH20.

Ejemplo 18 Estudio de las Formulaciones de Conservadores USP a 5°C o 37°C En este ejemplo, el efecto de ¦ los niveles USP de conservadores en la actividad enzimática de la rHuPH20 se evaluó bajo dos condiciones de almacenamiento: 5°C en 4 días y 37°C durante 2, 4, 6, 8 y 12 días. Las formulaciones contuvieron diferentes cantidades dé oligómeros HA y sal y pH variante. Las formulaciones de rHuPH20 se exponen en la Tabla 72 a continuación. Las formulaciones básicas contuvieron 600 U/mL de rHuPH20, .3.5 mg/mL de insulina aspart, ' insulina lispro o insulina regular, Tris/HCl 30 mM, metionina 5 mM, 0.01% de. Poloxámero 188 (Poloxámero. 188) con 0.12.5% de fenol y 0.075% de m-cresol. La formulación 1 no contuvo insulina. Las formulaciones 2-5 contuvieron insulina aspart, las formulaciones 6- contuvieron insulina regular y las formulaciones 10-13 contuvieron insulina ' lispro. Se prepararon cuatro formulaciones básicas para cada análogo de insulina. Las formulaciones 2, 6 y 10 fueron las mismas como 3, 7 y 11, respectivamente, con pH. variante (7.0 versus 7.2) . Las formulaciones 3,· 8 y 12 fueron las mismas como 4, 9 y 13, respectivamente, con NaCl variante. Etas formulaciones contuvieron adicionalmente 10 mg/mL de oligómeros HA.

Uno (1) mL de cada formulación se almacenó en un vial de vidrio de 2 mL de borosilicato tipo 1 USP con un tapón de caucho de clorobutilo y un ' sello de aluminio. Cada formulación se incubó, individualmente, a 5¦ y 37°C y se registraron las mediciones de estabilidad en el tiempo t = 2, 4, 6, 8 y/o 12 dias. La estabilidad se evaluó al medir el pH, apariencia, ¦ osmolaridad, actividad e.nzimática de la rHuPH20, contenido de rHuPH20 .por la RP-HPLC y el . contenido de insulina por la RP-HPLC (véase los Ejemplos 2-3, 5 y 12) . Los criterios aceptables y la especificación objetivo para la estabilidad en cada .uno de los parámetros sometidos a prueba fueron los mismos como se expone en' el Ejemplo 12.

Los resultados muestran que la formulación .1 y todas Las formulaciones de insulina aspart (#2-5) : fueron transparentes e incoloras sin partículas después de 12 días en ya sea 5 o 37°c . Los cristales se observaron en las formulaciones 6 y 8-9 y 11-13 después ' de 6 días a 5°C y. los cristales, se observaron en la formulación 10 después .de solo 2 días , a 5°C.

Todas las formulaciones fueron estables después de -4 días a 5°C. Las formulaciones de insulina lispro (#10-13) fueron estables durante 8 días, a 37°C. mientras, que las formulaciones de insulina (#6-9) · fueron estables durante solamente 2 días (con excepción de #7) a 37 °C. Las formulaciones de insulina aspart (#2;-5) fueron estables durante 4-6 días a 37 °C. El contenido, de rHuPH20 disminuyó a través del tiempo para todas las formulaciones a 37°.C. El contenido de insulina disminuyó a través del tiempo para todas las formulaciones .

Ejemplo 19 Pruebas de efectividad antimicrobiana de diferentes niveles de conservadores En este ejemplo, varios lotes de formulaciones que contienen diferentes niveles de conservadores con cantidades objetivo de insulina y rHuPH20 se prepararon para la prueba de efectividad microbiana. Las pruebas se llevaron a cabo de acuerdo, con la directriz de EP y USP por un laboratorio analítico contratado (Quadrants Scientific, Inc., San Diego, CA and Lancaster Laboratories, Lancaster, PA) . Las¦ diversas formulaciones que contienen conservadores se sometieron a prueba para la efectividad anti-microbiana contra las bacterias Pseudo onas aeruginosa , E. coli y Staphylococcus aureus y hongos Aspergillus niger y Candida albicans . Las pruebas se condujeron al 1) agregar un inoculo inicial (por lo menos 105 CFU/mL) de cada bacteria a la muestra y 2) medir la CFU/mL de cada bacteria u hongos a 24 horas., 7 .días y 14 días. Los datos sin procesar (CFU/mL) se convirtieron a una reducción de log 10 unidad del inoculo medido. Las formulaciones se sometieron a prueba en una temperatura de 37°C.

Todas las formulaciones contuvieron 100 U/mL de insulina o análogo de insulina y 5 g/mL de rHuPH20. Los componentes restantes variaron entre las formulaciones tal que el efecto de varios componentes se podría comparar. Los resultados se resumen en la. Tabla 73,' que resume los efectos de los diversos componentes de formulación' . en la efectividad antimicrobiana. Un efecto neutro indica que el componente indicado, y las concentraciones rio tienen efecto en la efectividad . antimicrobiana. Por ejemplo, el análogo, de insulina tiene i un. efecto neutro en la efectividad antimicrobiana, cuando ' se compara, con dos formulaciones que varían solamente en el análogo de insulina, es decir, insulina aspart o: insulina lispro. .La concentración de NaCl tuvo ya sea un efecto neutro o negativo en la efectividad antimicrobiana dependiendo de las formulaciones.

Ejemplo 20 Generación de una linea de células que expresan rHuPH20 soluble El plásmido HZ24 (expuesto en SEQ ID NO:52) se usó para transfectar células de Ovario de Hámster . Chino (CHO) {véase por ejemplo Patentes de E.U.A. Nos. .7, 76, 429 y 7, 781, 607- y Publicación de de E.U.A. No. 2006-0104968) . El ..vector plásmido HZ24 para la expresión' de la rHuPH20 soluble contiene una cadena, principal del vector pCI ..(Promega) , . DNA que codifica los -aminoácidos 1-482 de la. hialuronidasa PH20 humana (SEQ ID NO:49),. un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) del virus. ECMV .(Clontech), y el gen de dihidrofolato reductasa de ratón . (DHFR) . La cadena principal del vector pCI también incluye DNA que codifica el gen de resistencia a Beta-lactamasa (AmpR) , un origen , fl ' de replicación, una región potenciadora/promotora temprana intermedia de Citomegalovirus (CMV), un intrón quimérico, y una. señal de poliadenilación posterior SV40 (SV40) . El DNA que codifica el constructo de rHuPH20 soluble contiene un sitio Nhel y una secuencia consenso Kozak antes del DNA que codifica la metionina en la posición del aminoácido 1 de la secuencia señal de 35 aminoácido . nativa de ??2? humana, y un codón de detección después , del DNA que codifica la tirosiha que corresponde a .la posición de aminoácido . 482 de la hialuronidasa PH20 expuesta en SEQ ID NO: 1, seguido por un sitio de restricción BamHI . El constructo pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24),. por lo tanto, da por" resultado una sola especie de mRNA accionada por el promotor CMV que codifica los aminoácidos 1.-482 de la PH20 humana, (expuesta en SEQ ID NO: 3) y los' aminoácidos 1-186 de la dihidrofolato^reductas.a de ratón (expuesta en SEQ ID NO:53), separados por el sitio de entrada ribosomal interno (IRES) .

Las células DG44 CHO no transfectadas que se desarrollan en un medio CD-CHO Modificado GIBCO para células. DHFR (-), complementadas con Glutamina 4 mM y 18 ml/L-, de Plurionic F68/L (Gibco) , se sembraron a 0.5 x 106 células/mi n un matraz agitador . en .la preparación para la - transfecció . Las células se desarrollaron a 37°C en, CO2 al 5% en una incubadora humidificada, agitándose a 120 rp . El crecimiento exponencial de las., células DG44 CHO no transfectadas . se sometió a prueba para la viabilidad antes de la transfección .

Sesenta millones de células viables del cultivo de células DG44 CHO no transfectadas se colocaron en placas y se resuspendieron a una densidad de 2 x 107 células en 0.7 mL de solución amortiguadora de transfección 2x (2x HeBS : Hepes 40 mM, pH .7.0, NaCl 274 mM, KC1 10 mM, Na2HP04 1.4 mM, dextrosa 12 mM) . A cada alícuota de las células re-suspendidas, se agregaron 0.09 mL (250 µg) del plásmido HZ24 lineal (linealizado mediante digestión durante la noche con Cía Z (New Englánd Biolabs) , y la soluciones de células/DNA se transfirieron en cubetas de electroporación BTX (Gentronics) de 0.4 cm de espacio a temperatura ambiente. Se llevó a cabo una electroporación de control negativo, con DNA' no plásmido mezclado con las células. Las mezclas de células/plásmido se electroporaron con una descarga de capacitor de 330 V y 960 µ? o en 350 V y 960. µ?.

Las células se removieron de las cubetas después de la electroporación y se transfirieron . en .5 mL del medio - CD-CHO modificado para las células DHFR(-), complementadas con Glutamina 4 mM y' 18 ml/L Plurionic F68/L (Gibco) , Y se dejaron desarrollar en 'un pocilio de una placa, de cultivo de tejido de 6 pocilios sin selección durante 2 días a 3.7 °C en C02 al 5% en una incubadora humidificada .

Dos días pos-electroporación,. 0.5 mL del medio de cultivo de tejido se removió de cada pocilio y se. sometió a prueba para la presencia de actividad de hialuronidasa, usando el ensayo de microturbiedad descrito en el Ejemplo 2..

Las células de Transfección 2 (350V) se recolectaron del pocilio de cultivo de tejido, se contaron: y. se diluyeron a .1 x 104 a 2 x 104 de células viables por mL. Una alícuota de 0.1 mL de la suspensión de células se transfirió a cada pocilio de cinco, placas de cultivo de tejido de fondo redondo dé 96 pocilios. Cien microlitros de medio CD-CHO. (GIBCO) que contiene un suplemento GlutaMAXMR-l 4, mM. (GIBCOMR, Invitrogen Corporation) y sin suplementos de hipoxantina y timidina se agregaron a los pocilios que. contienen las células (volumen final 0.2 mL) . ' . ·. ¦ Se identificaron diez clones de las 5 placas desarrolladas sin metotrexato.

Seis clones HZ24 sé expandieron en el cultivo y se transfirieron en los. matraces agitadores como suspensiones de células individuales . . Os clones 3D3, 3E5, 2G8 , 2D9, ' 1E11 , y 4D10 se colocaron en placas en placas de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocilios usando, una estrategia de dilución infinita bidimensional en la . cual las células se diluyeron 1:2 abajo de la placa, y 1:3 a través de la placa, comenzando a 5000. células en el pocilio izquierdo' ] superior .

Los clones diluidos se desarrollaron en un fondo de 500 células DG44 CHO no transíectadas por pocilio, ; para proporcionar factores de crecimiento necesarios' para los días iniciales en el cultivo. Se hicieron diez placas por su'b-clon, con 5 placas que contienen metotrexato 50. nM y 5 placas sin metotrexato.

El clon 3D3 produjo 24 subclones visuales (13 del tratamiento sin metotrexato, y 11 del tratamiento con metotrexato. 50 . nM. La actividad de la ^hialuronidasa significativa se midió, en los sobrenadantes de'. 8 de los 24 subclones (>50 Unidades/mL) , y estos 8 subclones se expandieron en T-25 matraces de cultivo de tejido. Los clones aislados del protocolo de tratamiento de metotrexato se expandieron en presencia de metotrexato.50 nM. El clon 3D35M se expandió adicionalmente en metotrexato 500 nM dando origen a clones que se producen en exceso de 1,000 Unidades/ml en los matraces agitadores (clon 3D35M; o- Geni 3D35M) . Después se preparó un banco de células maestras (MCB) de las células 3D35M.

Ejemplo 21 Producción de Células Gen2 que contiena PH20 humana soluble <rHuPH20) La linea¦ de células Geni 3D35M descritas en el Ejemplo 20 se adaptaron a' niveles de metotrexato más altos para producir clones de generación 2 (Gen2). Las células 3D35M se sembraron de cultivos que contiene metotrexato establecidos en el medio CD CHO que contiene GlutaMAX-lMR 4 mM y .1.0 µ? de metotrexato. Las · células se adaptaron a un niel de metotrexato . más alto al desarrollar y al pasar las 9 veces durante un periodo de 46 días en una incubadora humidificada 37 °C, 7% de CO2. La población amplificada de las células se clonó al limitar, la dilución en las placas de cultivo de tejido de .96 pocilios que contienen, un medio con metotrexato 2.0 µ?. Después .de aproximadamente 4 semanas, los clones se identificaron y el clon 3?10? se seleccionó para expansión. Las células 3E10B se desarrollaron en el medio CD CHO que contiene GlutaMAX-lMR 4 mM y 2.0 µ? de metotrexato para 20 pasajes. Un banco de células maestras . (MCB) de la linea de células -3E10B se secretó y se congéló y. se usó para estudios subsecuentes.

La amplificación de la linea de células continuó al cultivar células 3E10B en. medio CD CHO que contiene; GlütaMAX-1MR 4 mM y 4.0 µ? de metotrexato. Después del 12 paso, las células se congelaron én viales como un banco de células de investigación (RCB) . Un vial del RCB . se descongeló' y se cultivó en un medio que contiene 8.0 µ? de metotrexato. Después de 5 días,' la concentración de¦ metotrexato en. el medio se incrementó a 16.0 µ?, luego 20.0 µ? 18. días después. Las células del 8 pasaje en el medio que. contiene 20.0 ·µ? de metotrexato se clonaron al limitar la dilución en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios, que contienen el, medio CD CHO que contiene GlutaMAX-lMR 4 mM y 20.0 µ? de metotrexato. Los clones se identificaron 5-6 semanas después y el clon 2B2 se seleccionó para expansión en el medio que contiene 20.0 µ? de metotrexato. Después del 11° pasaje, las células 2B2 se congelaron en viales como un banco de células de investigación (RCB) .

Las células 2B2 resultantes . son células DG44 CHO deficientes de , dihidrofolato-reductasa . (dhfr-).'. que ' expresan PH20 humana recombinante soluble (rHuPK20) . La PH20' soluble está presente en las células 2B2 en un número de copias de aproximadamente 2.0.6 copias/célula. El análisis de Southern blot del DNA de célula 2B2 genómica diferida con Spe I—, Xba I- y BamH I/HindIII que usa una sonda especifica, de rHuPH20 reveló el siguiente perfil de digestión de restricción: una banda de hibridación mayor de -7.7 kb y cuatro bandas de hibridación menores (-13.9, -6.6, -5.7 y -4.6 kb) con el DNA digerido con Spe I; una banda de hibridación mayor de -5.0 kb y dos bandas de. hibridación menores (-13.9 y -6.5 kb). co DNA digerido con Xba I; y una banda de hibridación individual de -1.4 kb Observador usando DNA 2B2 digerido con BamH I/Hind III. El análisis de secuencia del transcripto de mRNA indicó que el cDNA derivado (SEQ ID NO: 56) fue idéntico- a la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 49). excepto para una diferencia de par base en la posición 1131,. que se observó que es una timidina (T) en lugar de la citocina esperadas (C) . Esto es una mutación silenciosa,. sin efecto en la secuencia de aminoácidos.

Ejemplo 22 A. Producción de la rHuPH20 soluble en Gen2 en 300 L de Cultivo de Células Bioreactor Un vial de HZ24-2B2 se descongeló y se expandió de los matraces agitadores a través de matraces agitadores de 36L en un medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con 20 µ? de metotrexato y GlutaMAX-lMR (Invitrogen) . Brevemente, el vial de células se descongeló en un baño de^ agua a 37 °G, el medio se agregó y las células se centrifugaron. Las células se re-suspendieron en un matraz de agitación de 125 mL con 20 mL de medio reciente y se colocó en una incubadora a 37 °C, CO2 al 7%.. Las células se expandieron hasta. 40 mL en el matraz de agitación de 125 mL . Cuando la densidad celular alcanzó' mayor que' 1.5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz de agitación de 125 mL en 100 mL de volumen de cultivo . El matraz se incubó a 37 °C, CO2 al 7%. Cuando la densidad celular alcanzó mayor que 1.5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió , en un matraz de agitación de 250 mL en 200 mL de volumen de .'cultivo, y el matraz se incubó a 37°C, CO2 al 7%. Cuando la densidad celular alcanzó mayor que 1.5 x 106 células/mL,¦ el cultivo se expandió en un matraz de agitación de 1 L en 800 mL de volumen de cultivo y se incubó a 37°C, CO2 al.7%. Cuando la densidad celular, alcanzó mayor qué 1.5 x 106 células/mL el cultivo se expandió en un matraz de agitación de 6 L en 5000 mL de volumen de cultivo y se incubó a.. 37 °C, C02 al 7%. Cuando la densidad celular alcanzó mayor que 1.5 x 106 células/mL el cultivo' se expandió en un matraz de agitación de 36 L en 32 L de volumen de cultivo y se incubó a 37 °C, C02 al 7%.

Se esterilizó un reactor de 40.0 L y se agregaron 230 mL dé medio CD-CHO. Antes del uso, el reactor de verificó . por contaminación. Aproximadamente 30 L de células '· se transfirieron de '¦ los matraces de agitación, de 36L al bioreactor de 400 L (Braun) en una densidad de inoculación de 4.0 x 105 de células viables por mi y un volumen total de 260L. Los parámetros fueron el punto de ajuste de temperatura, 37 °C; Velocidad del Impulsor 40-55 RPM; Presión del Recipiente: 3. psi; Burbujeo del Aire .0.5-1.5 /Min.; Superposición del Aire: 3L/min. El reactor se muestreó diariamente para eonteo. de células, verificación de pH análisis de- medio, . producción y retención de proteínas. También, durante, la corrida se agregaron alimentaciones de nutrientes .. A 120 hrs (día 5), se agregaron 10.4L de Medio de Alimentación #1 (4 x CD-CHO + 33 g/L de Glucosa- + 160 mL/L de Glutamax-1MR + 83 mL/L de Yeastolato; + 33 mg/L de rHuInsulina) . A 168 horas (día 7), se. agregaron 10.8 L de Alimentación #2 (2 x CD-CHO + 33 g/L de. Glucosa + .80. mL/L de Giutamax-1MR + 167' .mL/L de Yeastolato + 0.92 g/L de Butirato de Sodio), y la temperatura del cultivo se cambión.a 36.5°C:. A 216 horas (día 9),, se agregaron 10.8 L de Alimentación #3 (1 x CD-CHO + 50 g/L de Glucosa + 50 mL/L de Glutamax-1MR + 250 mL/L de Yeastolato + 1.80 g/L de Butirato de Sodio) y la temperatura del cultivo se cambió a 36°C. A 264 horas (dia 11), se agregaron 10.8. L de Alimentación #4 (1 x CD-CHO + 33 g/L de Glucosa + 33 mL/L de Glutamax-1MR +. '250 mL/L de Yeastolato + 0.92 g/L de Butirato de Sodio), y la temperatura del cultivo se cambió, á 35.5°C. La adición del medio de alimentación se observó para potenciar notablemente la producción de la rHuPH20 soluble en las etapas finales de la producción. El reactor se cosechó a 14 o 15 días o cuando la viabilidad de las células descendió por abajo de 40%. El proceso dio por resultado una productividad final de 17,000 Unidades por mi '¦ con una densidad celular máxima .de 12 millones de células/mL.. En la cosecha,' el cultivo se muestreó para micoplasma, biocarga, endotoxina y viral in vitro e in vivo, Microscopía Electrónica de . Transmisión (TEM) y actividad enzi rr.ática .

El cultivo se bombeó por una bomba peristáltica a través de cuatro módulos del sistema de filtración Millistak (Millipore)¦ en paralelo, conteniendo cada uno una capa de tierra diatomácea de grado ' 4-8 µp\ y una capa de tierra diatomácea de grado 1.4-1.1 µp?, seguido por una membrana de celulosa, luego a través de un segundo sistema ;de filtración Millistak individual (Millipore) que. contiene·'¦ una capa de tierra diatomácea de grado 0.4-0.11 ]im y una capa de tierra diatomácea de grado a <0.1 µ?t?, seguido por una membrana de celulosa, y luego a través de un filtro final de 0.22 µ?? en una bolsa flexible.de un solo uso estéril con una. capacidad de 350 L. El fluido de cultivo celular cosechado se complementó con EDTA 10 mM y Tris 10 mM a un pH de 7.5. El cultivo se concentró 10 x con un aparato de filtración de flujo tangencial (TFF) usando cuatro., filtros de poliéter sülfona (PES) de corte de peso molecular (MWCO) 30 kDa Sartoslice TFF (Sarto.rius) , seguido por un intercambio de solución amortiguadora . lOx con Tris 10 mM, Na2S04 20 mM, pH 7.5 en. un filtro final de 0.22 pm en una bolsa de almacenamiento estéril. de 50 L.

La cosecha de diafiltrada, concentrada se- inactivo para el virus. Antes' de. la inactivación viral, se. preparó una solución de 10% de Tritón X-100, 3% de tri (n-butil) fosfato (TNBP) . La cosecha diafiltrada, concentrada se expuso a 1% de Tritón X-100, 0.3%. de TNBP durante 1 hora en un recipiente de reacción de vidrio de 36 L inmediatamente antes de la purificación en la columna Q.

B. Purificación de la rHuPH20 soluble en Gen2 Se preparó una columna de intercambio iónico Q Sepharose (Pharmacia) (9 L . de re ina, H= 29 cm, D= 20 cm) . Las' muestras de lavado se recolectaron para una determinación del ensayo de pH, conductividad y endotoxina (LAL) . La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2S04 20 mM, pH 7.5. Después -de la inactivación viral, la cosecha diafiltrada, concentrada se recolectó en la columna Q en una velocidad de flujo de 100 cm/hr. La columna se lavó' con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2S04 20 mM, pH 7.5 y Hepes 10 mM, NaCl 50. mM, pH 7.0. La proteína, se .'eluyó con Hepes 10 mM, NaCl 4.00 mM, pH 7.0 en. un filtro final de 0.22 ym en una bolsa estéril. Se sometió a prueba la bolsa de eluato para biocarga, concentración de. roteínas y. actividad de la hialuronidasa . Las lecturas de absorbancia A2go se tomaron en el inicio- y al final del i.ntercambio .

Después se llevó a cabo una cromatografía de interacción hidrofóbica Fenil-Sepharose (Pharmacia) . Se preparó una columna de Fenil-Sepharose' (PS) (19-21 L de resina, H=29 cm, D= 30 cm) . El lavado se recolectó y se muestreó para pH, conductividad y endotoxina (ensayo LAL) . La columna se equilibró con 5 volúmenes de. columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0.5 M, CaC12 0.1 mM, pH 7.0. El eluato de proteína de la columna Q sepharose se complementó con soluciones madre.de sulfato de amonio 2M, sulfato de potasio 1 M y CaCl2 1 M para producir concentraciones finales de-..5 mM, 0.5 M y 0.1 mM, respectivamente. La proteína, se cargó sobre la columna PS en una velocidad dé flujo de 100 cm/hr y el flujo de la columna, se recolectó a- través de^ la. misma. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0.5 M y CaC12 0.1 mM pH 7.0 a 100 cm/hr y el lavado se agregó al flujo recolectado.- Combinado con el. lavado de la columna, el flujo pasante se hizo pasar a través de un' filtro final de 0.22 pm en una bolsa estéril. El flujo a través se muestreó para biocar.ga, concentración de proteínas y actividad enzimática.

Se preparó una columna de boronato de aminofenilo (ProMedics) . El lavado se recolectó y se muestreó para pH, conductividad y endo-toxina (ensayo LAL) . La. columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de fosfato de.- potasio.5 mM, sulfato de amonio 0.5 M. El flujo PS pasante que contiene proteína purificada se cargó en la columna de boronato de aminofenilo en una velocidad de flujo de 100 cm/hr. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, ¦ sulfato de amonio 0.5 M, pH .7.0. .La columna, se lavó con bicina 20 mM, sulfato de amonio 0.5 M, pH 9.0. La columna se lavó con bicina- 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 9.0. La proteína se diluyó con Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6.9 y se hizo pasar a través de un filtro estéril en una bolsa estéril. La muestra eluída se sometió a prueba para biocarga, . concentración de proteínas y actividad énzimática.

Se preparó la columna de hidroxiapatita (HAP) (Biorad) . Se recolectó el ' lavado y se sometió a prueba para . pH, conductividad y endotoxina (ensayo LAL) . La columna se .equilibró con fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 ''mM,.' CaCl2 0.1.1 mM, pH 7.0. La proteína purificada con . boronato de aminofenilo se complementó a concentraciones finales de fosfato de potasio 5 mM y CaCl2 0.1 mM y se cargó sobre una columna HAP en una velocidad de flujo de 100 cm/hr. La columna se lavó. con. fosfato de potasio 5 mM, pH ? , NáGl 100 mM, CaCl2 0.1 mM. La columna luego se. lavó con fosfato de potasio 10 mM, pH 7, NaCl ' 100 mM, CaCl2 0.1 mM. La proteína se eluyó con fosfato ce potasio 70 mM, pH 7.0 y se hizo pasar . a través de un filtro estéril 0.22 µp? en una bolsa estéril. La ¦muestra eluída . se . . sometió a prueba para biocarga:, concentración de proteínas y actividad énzimática.

La proteína purificada HAP luego se Hizo pasar a través de un filtro de. remoción viral. El filtro Viosart esterilizado (Sartorius) primero se preparó al lavar con 2.L de fosfato de potasio 70 mM, pH 7.0. Antes del uso, la solución amortiguadora filtrada se muestreó. para · ; pH . y conductividad. La proteína purificada HAP se bombeó¦ a través de una bomba peristáltica a través del filtro de remoción viral de.20 nM. La proteína filtrada en. fosfato de potasio. 0 mM, pH 7.0 se hizo pasar a través de. un. filtro final de 0.22 µp\ en una bolsa estéril. La muestra filtrada viral se sometió a prueba para la concentración de proteínas, actividad enzimática, oligosacáridos, monosacáridos y perfil de ácido siálico.. La muestra -también se . sometió a prueba para impurezas relacionadas con el proceso.

La proteína en el material filtrado luego se concentró a 10 mg/mL usando un. sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) Sartocon Slice de corte de peso molecular .de 10 kD (MWCO) (Sartorius) . El filtro se preparó primero al. lavar con histidina 10 mM, NaCl 130' mM, pH 6.0 y el material perrneado se muestreó para pH y conductividad. Después de la concentración, la .proteína concentrada se muest.reó.. y se sometió \a prueba para ' concentración de proteína y actividad enzimática. . Se llevó -a cabo un intercambio de solución amortiguadora 6x en la proteína concentrada en la solución amortiguadora final: histidina 10. mM, NaCl 130 mM, pH 6.0. Después del intercambio de soluciones ... amortiguadoras, 1 proteína concentrada se hizo pasar a través de un filtro de 0.22 µp? . en una bolsa de almacenamiento estéril de 20 L. La proteína se muestreó y se sometió a prueba para/concentración de proteínas, actividad enzimática, . grupos sulfhidrilo libres, perfil de oligosacáridos y osmolaridad.

La proteína en volumén filtrada estéril luego se dispensó asépticamente en viales de . TefIon. estériles, de 20 mL en 30 mL (Nalgene) . Los viales luego se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -20 .± 5°C.

Ejemplo 23 Efecto de la lisil Usina como un estabilizador para rHuPH20 La lisil-lisina (Lys-Lys o dilicina) se somete a prueba por su capacidad de estabilizar la rHuPH20 a temperaturas elevadas. Se prepararon ocho formulaciones como, se describe en la Tabla 76 a continuación. Como un control, el HylenexMR (que contiene 167 U/mL de. rHuPH20, Na2P04 12.5 mM, NaCl 145 mM, 1 mg/mL de . HSA, CaCl2 2.7 mM, 0.1% de EDTA, pH 7.4; designado Fl) se sometió a prueba. Las formulacionés restantes se. generaron para contener 170 U/mL de rHuPH20, 0.01% Tween 80 y varios excipientes/estabilizadores como se expone en la Tabla.76. A cada formulación sometida a. prueba, se. agregó diclorohidrato de Lys-Lys ( (H-Lys-Lys-OH HC1; en una concentración dé ya sea RnD Chem #.G-2675) 50, 100 o 150 mM. Puesto que la Lys-Lys se usó como una . sal de cloruro, la osmolaridad vario entre las composiciones ,. como se , observa en la Tabla 76 a continuación..

Todas las formulaciones se rellenaron en viales de vidrio de borosiiicato tipo 1 USP de 2 mL con 13 mm 4432/50 tapones de caucho grises y se. sellaron con sellos de alúmina.. Los viales se incubaron a tres temperaturas diferentes, 5o C, 25° C y 40° C por hasta 3 meses. Las muestras se sometieron-a prueba en el tiempo 0, 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses y 3 meses, dependiendo de la. temperatura (véanse las Tablas 11-79) . En cada punto de. prueba, las muestras se removieron de las incubadoras y se sometieron a prueba para la actividad de la hialuronidasa como se describe en el Ejemplo 2.

Los resultados se muestran en las Tablas ' 77-79 a continuación, que - exponen la actividad de hialuronidasa en U/mL. Las muestras . se almacenaron a 5° C o 25° C,- se observaron pequeñas disminuciones en la actividad de la rHuPH20, pero todas, las muestras mantuvieron por los menos 135 U/mL de la actividad de la hialuronidasa (Tablas 77 y 78) . Además, no. se observaron diferencias significativas en la actividad de la hialuronidasa entre las composiciones, que contienen Lys-Lys . y composiciones que no contienen Lys-Lys: Para las muestras almacenadas a .40° C, todas las muestras habían disminuido, la actividad enzimática a través del tiempo. Las formulaciones Fl y F2 que no contuvieron Lys-Lys tuvieron la disminución más grande en la actividad de la hialuronidasa. Después de '2 semanas a 40°. C, la actividad de las formulaciones Fl y F2 estuvo por debajo de 135 U/mL. Las formulaciones que contienen Lys-Lys, en cualquier concentración, todas, mantuvieron su actividad . por ..arriba de 135 U/mL durante por 1?· menos 1 mes a 40° C.

Ejemplo 2 Efecto de concentraciones bajas de lisil lisina estabilidad de la rHuPH20 Varias formulaciones de rHuPH20 se sometieron' a prueba para efectos de concentraciones bajas de lisil lisina y pH en actividad de la rHuPH20 a temperaturas elevadas. Se evaluaron tres diferentes concentraciones de Lys-Lys (10, 30 y 50 mM) y tres diferentes pH (6.5, 7.0 y 7.5), generando' un' total- de 9 muestras. Las formulaciones sometidas a prueba se exponen en la Tabla 80 a continuación. Como un control, se sometió a prueba el HylenexMR (expuesta en el Ejemplo .'23; Fl)-. Las formulaciones F2- a FIO se generaron . para objetivo . a aproximadamente. U/mL dé rHuPH20, L-metionina 10. mM (Spectrum #M1441), 0.01% de polisorbato 80 (Baker #4117-04 )' y varias cantidades de H-Lys-Lys-OH HC1 (RnD Chem #G-2675) y. NaCl (Baker #3628) . Se usó IN NaOH (EMD #SX0607H-6) ' para ¿justar el pH. Se ajustó la concentración de NaCl de modo que todas las formulaciones. tuvieron- aproximadamente la , misma osmolaridad (300 , mOsm/Kg) . Todas las formulaciones se filtraron estériles a través de un filtro de 0.2 mieras.

Todas las formulaciones se rellenaron en 0.5 mL por vial en viales de vidrio de borosilicato de tipo 1 USP de 2 mL ' con 13 mm de tapones de caucho gris 4432/50 y se' sellaron con sellos de alúmina. Los- viales se incubaron a 40° C por hasta 8 semanas. Las muestras se sometieron a prueba en el tiempo 0, y 1, 2, 3, 4, y.8 semanas. En cada punto de tiempo, las muestras se removieron de las incubadoras y se sometieron .a prueba para la actividad de hialurortidasa como se describe en el Ej emplo 2.

Los resultados se muestran en ; la Tabla 81 a continuación, que expone la actividad de la hialuronidasa en U/mL y la actividad en la relación como es comparada con el tiempo 0. Las formulaciones F2-F9, conteniendo todas Lys-Lys, mostraron estabilidad de rHuPH20 mejorada sobre la fórmula de referencia Fl, sin considerar el pH . No sé observaron diferencias significativas entre las muestras .que contienen Lys-Lys 10, 30 o 50 mM, indicando que la adición de Lys-Lys 10 mM es suficiente para mejorar la estabilidad de la rHuPH20 a 40° C. Las formulaciones con un pH más alto (7.5) tuvieron actividad enzimática ' reducida comparada . con todas las muestras con pH más bajo (6.5 o 7.0).. Por ejemplo, para las muestras que tienen un pH de 6.5 ó 7.0, la actividad de la hialuronidasa después de. 4 semanas . de incubación a 40° ,C permaneció por arriba de 80% de la actividad inicial, mientras que las . muestras que tienen un pH de 7.5 retuvieron de manera aproximada 70% de la actividad inicial'. Después de 4 semanas, menor que 50% de la actividad de la rHuPH20 permaneció para la muestra de rHuPH20 (Fl) .

[Tabla 81. Actividad de lá Hialuronidasa a 40° C Ejemplo 25 Efecto de la lisil lisina en la actividad de la rHuPH20 y la estabilidad de la insulina en las co-formulaciones de rHuPH20/insulina La lisii-lisina se evaluó por su capacidad de estabilizar las co-formulaciones que contienen tanto rHuPH20 y un análogo de insulina. Las formulaciones se exponen, en la Tabla. 82 a continuación. Todas las. formulaciones contuvieron 600 U/mL de rHuPH20, 3.5 -mg/mL insulina glulisina, Tris/HCL 30 mM, metionina 5. mM,' 0.001% de polisorbato 20, pH 7.2, y 0.1% de. fenol y 0.15% de m-cresol como conservadores (niveles de conservadores EP-B) . Las formulaciones F5, Fl, F2 y F3 contuvieron NaCl .50 mM . y Lys-Lys 0 mM, 20 mM, 40 mM y 80 mM respectivamente. La. .formulación F4 contuvo una concentración más alta de NaCl (140 mM) y no contuvo Lys-Lys. La osmolaridad de las formulaciones F3 y F4 se ajustó con NaCl para ser aproximadamente las mismas.

Cada formulación se repartieron alícuotas a 1.0 mL y se rellenó . en un vial de vidrio de borosilicato Tipo 1 USP de 2 mL con 13 mm de tapones de cauchos grises 4432/50 y se selló con sellos de alúmina. Los viales se incubaron . a 5o C y 37° C. las muestras se retiraron en los - días 3 y 6 y se sometieron a prueba para la actividad . enzimática de la hialuronidasa, pH, os.molaridad y apariencia, como se describe en los Ejemplos 2 y 3. ¦ Tabla 82. Formulaciones que contienen 600 U/mL de rHuPH20 U/mL de glulisina La adición de. lisil-lisina no afecto la apariencia ya que todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras sin partículas visibles indicando estabilidad de la insulina.

La actividad de hialuronidasa como se extra polo de una curva estándar, de las formulaciones, sometidas a prueba se muestra en la Tabla 83 a continuación. Todas ' las formulaciones retuvieron la actividad de la hialuronidasa después de la incubación durante 6 días a 5o C. solamente la formula F3, que contuvo Lys-Lys de 80. mM, retuvo alguna actividad enzimática de hialuronidasa después de 3 días a 37° C.

Después de. 6 días -a 37° C, la F3 había perdido la mayoría de su actividad enzimática de hialuronidasa. Cuando la osmolaridad se controló para ser aproximadamente comparable, como en las formulaciones F3- y F4, la Lys-Lys' fue un mejor estabilizador de rHuPH20 que el NaCl, como es evidenciado por la actividad de la hialuronidasa incrementada.

Ejemplo 26 Comparación de la lisil lisina y NaCl o estabilidad de la rHuPH20 en co-formulaciones de rHuPH20/insulina Las co-formulaciones de insulina y NaCl sé sometieron .a prueba para los efectos de la lisil lisina y rHuPH20. en la estabilidad de la rHuPH20/insulina . Las formulaciones sometidas a prueb se generaron para tener una resistencia iónica igual, pero con una formulación que contiene lisil-lisina y NaCl y la otra formulación que contiene solamente NaCl. Específicamente, tres conjuntos de formulaciones de insulina glulisina y rHuPH20 que tienen diferentes niveles de resistencia iónica se prepararon. Las formulaciones se exponen en la Tabla 84' a continuación. Todas las formulaciones contuvieron 600 U./mL de rHuPH20, 3.5 mg/mL insulina glulisina, Tris/ HCL 30 mM, metionina 5 mM, 0.001% polisorbato 20, pH 7.2, y 0.1% fenol y 0.15% m-cresol como conservadores (niveles de conservadores EP-B) : . Las formulaciones Fl, F'3 y F5 contuvieron lisil-lisina y NaCl como se expone en . la Tabla 84 a continuación.. Las formulaciones F2, F4¦ y F6 contuvieron, solamente NaCl. Las formulaciones se sometieron a prueba para su-, pH actual y osmolaridad.

Cada formulación se¦ repartió en, alícuotas , a 1.0 mL y se rellenó en un vial de vidrio de borosilicato Tipo 1 de USP de 2 mL de tapones de caucho gris de 13 mm :4432/50 y se sellaron con sellos de alúmina.. Los viales se incubaron a 5o C y 30° C por hasta 4 semanas. Las muestras se retiraron en el día 6 y después de 2 y 4 semanas y se sometieron a prueba, la actividad enzimática de la hialuronidasa como se describe en el Ejemplo 2.

Los resultados ' se muestran en la Tabla 85 a continuación que expone la actividad enzimática de la hialuronidasa (U/mL) en los dias sometidos a prueba asi como el % de la actividad de la hialuronidasa comparada con la actividad, demostrada en TO (% a TO) . Un - análisis multi. variable de la actividad enzimática de rHuPH20 en respuesta, al tiempo de incubación, concentración de lisil-lisina y resistencia iónica se llevó a cabo con base en la actividad relativa a TO, y se analizó por JMP v. .8.02 (SAS Institutes) . Las formulaciones que tienen resistencia iónica más alta (F5 y F6) retuvo mayor actividad enzimática de .la¦ hialuronidasa que las formulaciones , que tienen resistencia iónica más baja (Fl y F2 ) (p<0.001) . Además, las formulaciones que contienen lisil-lisina tuvieron actividad significativamente más alta que aquellas · sin (p = 0.04) . La velocidad de la pérdida, de la actividad enzimática de la hialuronidasa. se co-rel'acionó con la resistencia iónica, indicando que la resistencia iónica más alta 'podría reducir significativamente la velocidad de degradación. Para las soluciones en la misma resistencia iónica (por ejemplo, F5 y F6) no se observó diferencia significativa después de un tiempo de dos semanas, -sin embargo después de 4 semanas a 30° C, se observó una diferencia significativa en. la.¦ actividad enzimática de la hialuronidasa, con F5 que contiene lisil-lisina reteniendo .91% de actividad pero F6, que no contuvo lisil-lisina,. teniendo¦ solamente 75% de actividad restante. La misma tendencia se observó para las formulaciones en la resistencia iónica más baja, con las formulaciones que contienen lisil-lisina que tienen actividad incrementada como es comparada con aquellos sin lisil-lisina.

Ejemplo 27 Efecto de la Lisil lisina como una Solución Amortiguadora y Efectos de la Temperatura en el cambio de pH de las Co- Pormulaciones de rHuPH20/insulina La lisil-lisina se evaluó por su capacidad de actuar como una solución, amortiguadora en las co-formulaciones que contienen rHuPH20 e insulina al reemplazar el Tris con lisil-lisina. Las formulaciones · sometidas a prueba se. exponen en la Tabla 86 a continuación. Todas las formulaciones se generaron para contener .600. U/mL de rHuPH20, .3.5. mg/mL de insulina glulisina, metionina 5 mM, 0.001% de polisorbato 20, p'H 7.2, y 0.1%> de fenol y 0.15% de m-eresol como conservadores (niveles de conservadores EP-B) . Cada formulación contuvo lisil-lisina 30, 50, 80 o .105 mM (Biopeptide,. G-267'5, Lot#1037762) . Ninguna formulación contuvo Tris/HCl. Se agregó NaCl para ajustar la osmolaridad final; a .380130 mOsm.

Cada formulación se repartió en alícuotas a 1.0 mL y se rellenó en un vial de vidrio.de borosilicato Tipo 1 USP de 2 mL con tapones de cauchos grises de 13 mm 4432/50 y se selló son sellos de alúmina. Los viales se incubaron a.5o C y 37° C. Las muestras se retiraron en los días 1, 4 y 6 y se sometieron a prueba para la actividad enzimática -.de la hialuronidasa, pH y osmolaridad, como se describe en los Ejemplos 2 y 3. Cada formulación también se somete' a prueba para evaluar la capacidad de la lisil-lisina para actuar como una solución amortiguadora en un intervalo de pH objetivo de 6.5 a 8.0 al generar una curva de filtración del pH como una función de la cantidad de titulador (NaOH IN; EMD, Cat No. SX0607H-6, Lot HC067239) que se agregó. .

Tabla 86. Formulaciones que contienen 600 U/mL de rHuPH20 y 3.5 U/mL de glulisina Los resultados se . muestran en la Tabla .87., que exponen la osmolaridad y la actividad enzimática de la hialuronidasa . Como se muestra en los ejemplos previos, la Lys-Lys estabilizó la rHuPH20 en las formulaciones conforme. La actividad de la', hialuronidasa se disminuyó menor con las concentraciones mayores del Lys-Lys. Además, la. lisil-lisina fue capaz de estabilizar la rHuPH20 más que el. NaCl en un nivel similar de resistencia iónica.

La Tabla 88 a continuación expone el pH en varias temperaturas y efecto en la temperatura del pH . La titulación de la lisil-lisina con NaOH reveló que la lisil-lisina puede servir como una solución amortiguadora en un intervalo de pH de 6.5 8.0, especialmente en concentraciones más altas (por ejemplo, 80 o 105 mM) . Como se muestra en la Tabla 88, el efecto de la temperatura (dpH/dT) , o relación del cambio en el pH al cambio a la temperatura, permaneció constante, a 0.033 U/°C, que es ligeramente más alta, que el reportado para el .Tris (-0.028 U/°C). Una solución amortiguadora ideal tiene un efecto de temperatura más grande, como en las temperaturas de almacenamiento más bajas (por ejemplo, '¦ 2-8 °C) la insulina se. beneficia de un pH más alto mientras que en, las ¦temperaturas más altas, la rHuPH20 se beneficia, de un pH más bajo. De esta manera, la lisil-lisina se muestra, que es tanto una solución amortiguadora óptima como, un estabilizador en las formulaciones que tienen tanto insulina como rHuPH20.

Ejemplo 28 Estabilidad de la rHuPH20 en las co-formulaciones de insulina que contienen lisil lisina a través del tiempo a 5o C, 30° C y 37° C.

. La lisil-lisina se sometió a prueba por sus capacidades de estabilizar las co-formulaciones de análogo de -insulin-a- rHuPH20 que contienen niveles de USP. de conservadores. ' Las formulaciones se exponen en la Tabla 89 a continuación.. Cada formulación contiene 600 U/mL de rHuPH20, 3.5 mg/mL análogo de . insulina (ya sea insulina glulisina o insulina aspart) , metionina 5 mM, 0.001% de surfactante (ya sea poloxámero 188 o polisorbato 20), y niveles de USP de conservadores (0.125% de fenol y 0.075% de m-cresol) . Para cada, análogo de insulina, dos formulaciones tuvieron un pH de 7.0 y dos formulaciones tuvieron un pH de 7.2. Además, en cada pH, una formulación contuvo solo lisil-lisina 100 mM mientras que la otra formulación contuvo NaCl 30 mM y lisil-lisina 80 mM. Como una comparación para la insulina aspart, la .· F9 se preparó conteniendo Tris/HCl de 30 mM.

Cada formulación se repartió en alícuotas a 1.0 mL y se rellenó en un vial de vidrio de borosilicato Tipo 1 USP de 2 mL con tapones de caucho grises 13 mm 4432/50 y selló, con sellos de alúmina. Los viales se incubaron a 5° C, 30° . C y 37° C por hasta 4 semanas. Las muestras se retiraron como se muestra en las Tablas 90 y 91 y se sometieron a prueba para la actividad enzimática de la rHuPH20 como se describe en el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en las Tablas 90 y 91- a continuación, que. exponen la actividad enzimática de la hialuronidasa en U/mL.

*F68=poloxámero 188. (Pluronic® F68) , PS20=polisorbato 20 1. Co-formulaciones de rHuPH20-insulina glulisina Como se muestra en la Tabla ' 90, las formulaciones de rHuPH20-insulina glulisina, la actividad de la hialuronidasa permaneció constante para todas las formulaciones a 5o C y 30° C. A 37° C, sé observó una disminución en la actividad de la hialuronidasa a través del tiempo a . través de todas¦ las formulaciones. Durante' el periodo de tiempo probado, las formulaciones se determinaron que son estables, puesto que ninguna de las formulaciones tuvo actividad de la hialuronidasa por debajo de 375 U/mL.

Tabla 90. Actividad de la hialuronidasa (formulaciones de rHuPH20- lulisina) 2. Co-formulaciones de rHuPH20-insulina aspart Cómo se muestra en la Tabla 91, para las formulaciones de rHuPH20-insulina. aspart, todas las: formulaciones fueron estables por hasta. 3 meses a 5° C. A 30° C, todas las formulaciones que contienen lisil-lisina son estables hasta por 4 semanas, mientras que las formulaciones F9 (que no contienen Lys-Lys) mostró una pérdida en la actividad de la hialuronidasa . A 37° C, todas las formulaciones habían disminuido la actividad de la hialuronidasa a. través del tiempo, con la velocidad de declinación . dependiendo de la formulación. Por ejemplo, después de .6 días a 37° C, la formulación F5 (que tiene Lys-Lys 100 mM y pH .7.0) tuvo actividad más alta, que- la formulación F8. (que tiene Lys-Lys 80 mM y pH 7.2) . En este punto de tiempo y temperatura, la formulación F9 que no contuvo lisin-lisina perdió casi toda la actividad de la hialuronidasa. - Ejemplo 29 Efecto de la Albúmina de Suero Humana (HSA) o Lisil-lisina en la Estabilidad de la rHuPH20 bajo Agitación y Estrés Térmico Las formulaciones de rHuPH20 se sometieron¦ a prueba para estabilidad . bajo ' condiciones aceleradas, incluyendo agitación y estrés térmico. Las formulaciones se exponen en la Tabla 92 a continuación. Cada formulación contuvo 160 U/mL de rHuPH20, Fosfato de Sodio. 12.5 mM, pH 7.0 y NaCl 145 . mM. Cada formulación contuvo adicionalmente uno o más de albúmina de suero humana (HS.A). , CaCl2, EDTÁ, polisorbato 80, metionina . y lisil-lisina, como se expone en Tabla 92 a continuación.

Cada formulación se repartió en alícuotas a 1.5 mL y se rellenó en un vial de vidrio de borosilicato Tipo 1 USP de '2 mL con tapones de caucho grises 13 mm 4432/50 y se selló con sellos de alúmina. Los viales que contienen las partículas visibles se excluyeron del estudio. . Las formulaciones se sometieron a prueba bajo estrés tanto de agitación como térmica. Para el estudio de agitación, 2 muestras de cada formulación se incubaron a 25° C se agitaron a 650 rpm durante 72 horas.. Para el estudio del estrés térmico, 4 muestras de cada formulación se incubaron a 40° C hasta por 4 semanas, con las muestras retiradas cada semana.

Todas las muestras se sometieron a prueba, para la actividad de la hialuronidasa como se describe en el Ejemplo 2. . La presencia de las partículas insolubles y solubles se sometió a prueba .usando un formadór de Imagen ¦ MicroFlow (MFI) . Para esto, cada formulación de rHuPH20 o muestra de control se midió con un Instrumento de Formación de Imágenes Micro-Flow Imaging instrument- Model .. 4200 (Brightwéll Technologies,. Inc., Ottawa, Canadá) . Para cada corrida, la solución amortiguadora blanca se filtró. a través de un filtro de 0.22 mieras y se lavó a chorro a través del sistema para proporcionar un fondo limpio y optimizar la iluminación. Para equilibrar el sistema, por lo menos 2 mL de una muestra se dispensaron antes del análisis. Una , (l). mi de las muestras se hizo correr a una velocidad de flujo de 170 µ??/min usando una bomba peristáltica. El ajuste del aumento fue de 5 X para permitir la detección de partículas- dentro, del intervalo de 1 a .100 µ?? con un campo de profundo de análisis de 100 \i . Las partículas se contaron y .se registraron automáticamente por máquina y se reportaron por número de partículas/mL . La solución amortiguadora o las soluciones que contuvieron la rHuPH20 pero no se. sometieron a la agitación se usaron como controles. La. cromatografía de exclusión de tamaño también se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados se muestran en las Tablas 93-95 a continuación. 1. Actividad de la hialuronidasa ¦ La Tabla 93 expone la actividad de la hialuronidasa en U/mL y el % de la actividad como se compara con el tiempo- 0 (TO) . Los resultados muestran que después de 8 días a 40° C, las formulaciones que.no contuvieron HSA (F4, F5 y F6) habían reducido la actividad, de la hialuronidasa comparada con las formulaciones Fl, F2 y F3 que contuvieron HSA. La formulación F7 , que contiene Lys-Lys, retuvo el nivel más alto de la actividad de hialuronidasa después de 15 días a 40o- C.

Después del estrés de agitación, las .formulaciones que contienen por lo menos 0.04% de polisorbato 80 metionina 10 m retuvieron la actividad de la hialuronidasa, como lo hizo la formulación que contiene Lys-Lys.. Las formulaciones F1-F4 tuvieron una ligera disminución en la actividad de la hialuronidasa .. En general, la formulación F7 (que contiene Lys-Lys) mostró la retención más grande en . la actividad enzimática de la rHuPH20 bajo la prueba ; de estrés térmica como la prueba de. agitación.

Presencia de la Proteina Agregada o los Agregados Insolubles La Tabla 9.4 expone los conteos de particulados (agregados insolubles) en el número de partícula/mL .para cada intervalo de tamaño de miera. Por. ejemplo, los intervalos de tamaño de miera que se sometieron a prueba usando el MFI fueron partículas (p) mayores que 5 micrómetros (µ?t pero menores que 10 µp (5<p<10), 10<p<25, 25<p<50 y p 5.0. Se generaron formulaciones de Control para Fl y F4 que no contuvieron rHuPH20, y. las formulaciones de control para las muestras F2 , F4 y F6 fueron las mismas formulaciones que no se agitaron .

La presencia o ausencia de HSA no afectó las muestras no agitadas de control, con cada una que. tiene conteos dé partícula aproximadamente iguales. Una vez agitadas, las formulaciones que ¦ contienen HSA pero, que carecen de polisorbato 80 (Fl y F2 ) tuvieron significativamente más partículas que las otras formulaciones, incluyendo F3 que soló difirió de. F2 por la adición de polisorbato SO. La adición de más de polisorbato 80 (F5 y F6 comparado con F4) no tuvo un efecto significativo en ..la reducción · de la formación de agregado. La formulación de F7 que contiene Lys-Lys tuvo los números, más pequeños de los agregados insolubles después de la agitación.

Tabla 94. Conteos de materiales particulados como és medido por MFI (número de partículas/mL) P - tamaño de partícula (mieras! 3. Cromatografía de Exclusión de Tamaño Los agregados solubles también se midieron por la cromatografía de exclusión de tamaño.. La Tabla 95 expone los agregados solubles (agregados de peso molecular alto) en mAu*min y el porcentaje del. área .pico . total. Las formulaciones F a F7' contuvieron muy poca proteína para detectar por la cromatografía de exclusión de tamaño. Las formulaciones F1-F3, que contienen HSA, mostraron niveles bajos de agregados ' de peso molecular alto después de la agitación a 25° C. la adición de polisorbato 80 redujo el número total de agregados (F3 comparado con Fl o F2) .

HM = alto peso molecular Puesto que las modificaciones serán evidentes para aquellas personas de experiencia en este campo, se propone que esta invención se . limité solamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas .

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se , considera Como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Una composición de co-.formulación estable co-formulación, caracterizada- porque : la composición tiene un pH de entre 6.8 a 7.8; y la composición comprende: una cantidad terapéuticamente efectiva de. una insulina de acción rápida; ¦· .' una enzima degradadora de hialuronano en una cantidad suficiente para hacer la composición de acción super-rápida, en donde una composición de insulina de acción super-rápida imita más estrechamente la liberación ¦ de insulina pos-prandial endógena de un sujeto no' diabético comparado con una insulina de acción rápida sola; NaCl en una concentración entre 50 mM a 200 mM;' una cantidad antimicrobianamente efectiva' de un conservador o mezcla de conservadores, en donde lá cantidad total del uno o más agentes conservadores como'.un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) en la formulación es¦ o está entre 0.1% y 0.4%, inclusive; y un agente o agentes estabilizantes, mediante lo cual la composición .es estable .durante por lo menos 6 meses a una temperatura, de 2°C a 8°C, inclusive, y/o durante por ló menos 14 días a una temperatura . de 20°C a 300 C, inclusive. 2. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación . l,. caracterizada porque . la concentración de NaCl es entre 80 mM a 200 mM, 80 mM a 140 mM, 50 mM.a 100 mM, 80 mM a 100 mM, 50 mM a 80 mM, 100 mM a 140 mM o. 120 mM a 140 mM. 3. Una composición de co-formulación estable, caracterizada porque: la. composición . tiene ' un pH de entre 6.5 a 7.5; la composición, comprende: una cantidad, terapéuticamente efectiva de. una insulina de acción rápida; una enzima degradadora de hialurónano en una cantidad suficiente para hacer la composición de' acción super-rápida, en donde una composición de insulina de acción super-rápida imita más estrechamente la liberación de insulina post-prandial endógena de un sujeto diabético comparado con la insulina de acción rápida sola; NaCl en una concentración entre 120 mM a 200 mM; una cantidad., antimicrobianamente efectiva de un conservador o mezcla de conservadores, en donde la cantidad total del uno o más agentes conservadores como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) en la formulación' es . o está entre 0.1% y 0.4%, inclusive; y . un agente o agentes estabilizantes;. mediante lo cual . la composición es estable durante por lo menos 3 días a una temperatura de 32 °C a 40 °C, y/o es estable durante por lo menos 3 horas bajo agitación.. . .4. La. co-formulación estable de conformidad con la reivindicación . 3, caracterizada porque . el agente estabilizante comprende un inhibidor de hialuronidasa . 5. La co-formulación estable . de conformidad .con la reivindicación 4, caracterizada porque el inhibidor de hialuronidasa se selecciona de entre una . proteína , un substrato de una enzima degradadora de hialuronano, polisacáridos, . ácidos . grasos, lanostanoides, antibióticos, anti-nematodos , compuestos orgánicos sintéticos y un componente bioactivo derivado de planta.. .6. La. co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 4 o reivindicación 5, caracterizada porque él inhibidor de hialuronidasa se selecciona de. .entre un glicosaminoglicano (GAG) , un. inhibidor de hialuronidasa en suero, glicoproteína de Withania somnífera (WSG) , heparina, sulfato de heparina, sulfato de dermatán, quitosanes, ß-(1, 4) -galacto-oligosacáridos, verbascosa sulfatada, planteosa . ¦ ß ? ¦ · '¦ sulfatada, pectina, poli'(estiren-4-sulfonato) , sulfato de dextrano, alginato. de . sodio, polisacárido · de Undaria pinnatifida, polímero de condensación de ácido mandélico, ácido eicosatrienóico, ácido nervónico, ácido oleanólico, ácido aristolóquico,¦ ajmalina, reserpina, flavona, desmetoxicentauredina, quercetina, apigenina,.. kaempferol, silibina, luteolina, luteolina-7-glucósido, floretina, apiina, hesperidina,- hesperidina sulfonada, calicosin-7-?-ß- D-glucopiranosido, flavona-7-sulfato de sodio, flavona 7-' fluoro-4.' -hidroxiflavona, 4 ' -cloro-4 , 6-dimetoxicalcona, 7- sulfato de 5-hidroxiflavona de sodio, miricétina, rutina, morina, glicirrizina, vitamina C, ' ácido D-isoascórbico, 1,4- lactona D-sacarina, .ácido L-ascórbico-6-hexadeeanoato (Vcpal) , vitamina . 6 6-O-acilada, " catequina, ácido . nordihidroguaiarético, 'curcumina, galato de N-propiÍo, ácido tánico, ácido elagico, ácido gálico, ; . florofucofu'roecol A, diecol, 8,8'-biecol, procianidina, gosipol, . celecoxib, nimesulida, dexametasona, indometacina, fenoprofeno, fenilbutazona, ¦ oxifenbutazona, sálicilatos, cromoglicato de sodio, aurotiomalató . de sodio, transilist, traxanox, ivermectina, lincomicina y espectinomicina, sulfametoxazol .. y trimertoprim, sulfato de : ne¦omi.¦cin'a, ·, ácido 3a- ' acetilpóliporenico A, ácido (25S) - (+ ) -12a-hidroxi-3.a- metilcarboxiacetato^24-metilanosta-8, 24 (31) -dieno-2-6-óico, lanostanoide, ácido poliporénico · C,. PS53 . (polímero . de ácido de hidrbquinona-sulfónico-formaldehido) , polímero de poli (estireno-4-sulfonato) , VERSA-TL 502, ácido 1-tetradecano sulfónico, polímero de condensación de ácido .mandélico (SAMMA) , 1, 3-diacetilbenzimidazol-2-tiona, bencimidazol-2-tiona N-monoacilada, ¦ benzimidasol-2-tiona N, N ' -diacilada, derivado de alquil-2-fenilindol , . 3-propanoilbenzo.xazol-2-tiona, derivado de indol N-alquilado, derivado de indol N-acilado, derivado de benzotiazol, derivados de indol-2- y 3-carboxamida N-sustituidos , análogos halogenados (cloro y fluoro) de derivados de indol-2 y . 3-cárboximida N— sustituidos,¦ .2- ( -hidróxifenil ) -3-fenilindol, carboxamidas de indol, acetamidás de ' indol, 3-benzo.lil-l-metil-4-fenil-4-piperidinol, derivado de benzoil fenil benzoato, derivado de L-arginina, HCL de guanidinio, L-NAME, HCN, linamarina, amigdalina, hederagenina, aescina, CIS-hinoquiresinol y/o 1 , 3-di-p-hidroxifenil-4-penten-l-ona . 7. La co-formulación estable dé conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-6, caracterizada porque el inhibidor de hialuronidasa es un substrato de hialuronidasa que es un. oligosacérido de hialuronano (HA) . . 8. La co-formulación estable de, conformidad con la reivindicación¦ 7 , caracterizada porque la concentración de HA es entre 1 mg/mL a 20 mg/mL. 9. La co- formulación · estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-8, caracterizada porque la concentración de NaCl es entre 150 mM a 200 mM o 160 mM a 180 mM. 1C. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano es una hialurónidasa o una condroitinasa . 11. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano es una hialurónidasa que es activa a un pH de neutro. 12. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque : la enzima degradadora de hialuronano carece de un ancla de glicosilfosfatidilinositol (GPI) o no se asocia a la membrana cuando se expresa de una célula; o la enzima degradadora de hialuronano contiene truncamientos en C-terminal de uno o más residuos de aminoácido para remover todo o parte de una ancla. GPI. 13. La co-formulación estable de. conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano es una hialurónidasa que es una PH20 o una forma C-terminal truncada de la. misma .. 14. La co-formulación estable de. conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizada, porque la enzima degradadora de hialuronano es . un polipéptido PH20 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 4-9, 47-48, 234-254, y 267-273, . 0 una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,. 95%, 96%, 97%, 98.%, 99% o más de identidad' de secuencia a cualquiera de las SEQ ID NOS: 4-9, 47-48, 234-254, y.267-273. 15. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 ,. caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano es un PH20 C-terminal truncado que comprende una secuencia de . aminoácidos expuesta en. cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9. . 16. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizada porque la cantidad de una enzima, degradadora de hialuronano es entre 10 U/mL a 20000 U/mL,. 10 U/mL a 15000 U/mL, 10. U/mL a 10000 U/mL, 10 U/mL a 5000 U/mL, 50 U/mL a 10000 U/mL, 50 15 U/mL a 4000 U/mL, .100 U/mL a.2000 U/mL, 300 U/mL a 2000 U/mL, 600 U/mL a 2000 U/mL, o 100 U/mL a.1000 U/mL. . 17. La co-formulación estable de conformidad con Cualquiera de las .reivindicaciones 1-16,. caracterizada porque la cantidad de una . enzima degradadora de hialuronano es-- por lo menos o es 30 U/mL, 35 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, .250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/mL, 500 20 U/mL, 600 U/mL, ' 700 U/mL, 800 U/mL, 900 5 U/mL, 1000 U/mL, 2000- U/mL, 3000 U/mL, .4000 U/mL, ¦ 5000 U/mL, 10000 U/mL, 15000 U/mL o 20000 U/mL. . 18. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizada . porque la insulina de acción rápida es una insulina regular. 10. 19. La co-formulación estable de. conformidad, con la reivindicación 18, caracterizada porque la insulina regular es una insulina humana o insulina de cerdo. 20. La co-fo.rmulacióh estable de conformidad con la reivindicación .18 o reivindicación 19, caracterizada porque 15 la insulina regular es una insulina - con una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en. SEQ ID NO: 103 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 104; o una insulina con una cadena A que . tiene una secuencia . de aminoácidos expuesta como 20 posiciones de residuo de aminoácidos 88-108 de SEQ ID. NO: 123 y una cadena B . que tiene una secuencia de. aminoácidos , expuesta como posiciones de residuos de aminoácido 25-54 de SEQ ID NO: 123. 21. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizada porque la insulina de acción rápida es un análogo de insulina. 22. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizada porque la insulina de acción rápida es un. análogo de insulina seleccionado de. entre insulina lispro, insulina aspart. .e insulina glulisina. 23. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 21 o reivindicación 22, caracterizada porque el análogo de insulina se selecciona de entre una insulina que tiene una , cadena · A con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ NOS: 103 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta, en cualquiera de SEQ NOS: 147-149. 24. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones .1-23, caracterizada porque la cantidad de insulina de acción rápida es 10 U/mL a 1000 U/mL, 50 U/mL a 500 ' U/mL, 100 U/mL a 1000 U/mL o 500 U/mL a 1000 U/mL, inclusive. ... 25.. La. co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24,. caracterizada porque el intervalo de pH se mantiene por un agente amortiguador seleccionado de entre Tris, histidina, fosfato y citrato. 26. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación .25, caracterizada porque . el agente amortiguador es Tris. 27. La co-formulación estable de conformidad' con la reivindicación 25 o reivindicación 26, caracterizada porque la concentración del agente amortiguador es entre o 1 mM a 100 mM, 10 mM a 50 mM o 20 mM' a 40 mM. 28. La co-formulación estable de. conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-27, caracterizada porque los conservadores en la formulación comprenden, uno., o más de conservadores fenólicos, conservadores no ¦ fenólicos o conservadores fenólicos y conservadores no fenólicos.. 29.. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, caracterizada porque los conservadores se seleccionan de entre fenol, m-cresol, metilparabeno, alcohol bencílico, timerosal, cloruro de benzalconio, 4-cloro-l-butanol, . diclorohidrato de clorhexidina, digluconato de clorhexidina, L-fenilalanina, EDTA, bronopol, acetato fenilmercúrico, glicerol, imidurea, clorhexidina, deshidroacetato de sodio, o-cresol, p-cresol, clorocresol, cetrimida, cloruro de bencetonio, etil-par'abeno., propilparabeno, . but.ilparabeno y cualquiera combinación de los mismos . 30.. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29, caracterizada porque la formulación contiene un solo conservador o una mezcla de conservadores que contienen 2, 3 o 4 diferentes conservadores. 31. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-30:, . caracterizada porque comprende por lo menos un conservador fenólico. 32. La co-formulación estable de. conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31, caracterizada porque los conservadores son fenol, m-cresol o fenol y m-crésol. 33. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizada porque la cantidad total de el uno o más agentes conservadores como un porcentaje (%) de concentración de .masa (p/v) en ,1a formulación es o, es entre 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15% a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3% o 0.3% a 0.4% inclusive. 34. La co-formulación estable de conformidad. con cualquiera de las reivindicaciones 1-33, caracterizada porque los conservadores son fenol y m-cresol y la cantidad como un % de concentración de masa (p/v) en. la; formulación es es entre 0.1% a 0.25% fenol y entre 0.05% a 0.2% m-cresol, es entre 0.10% a 0.2% de fenol y entre 0.6% a 0.18% de. m-cresol, entre 0.1% a 0.15% de fenol y 0.8% a 0.15% de m-cresol, es entre 0.10% a 0.15% de fenol y entre 0.06 a 0.09% de m-cres.ol o es entre 0.12%. a 0.18% de fenol y entre 0.14 ;a 0.22% de m- cresol. 35. La co-formulación · estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-34, caracterizada porque comprende un agente estabilizante que ' se selecciona, de entre un aminoácido, un derivado de aminoácido, una amina, un azúcar, polioles, una sal y un surfactante . 36. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el agente estabilizante es un aminoácido que es glicina o prolina. 37.. La co-formulación estable . de conformidad, con la reivindicación 35 o reivindicación 36, caracterizada porque la concentración del aminoácido es entre 0.01 M.a 1 M, 0.01 M a 0.1 , 0.1M a 0.75M o 0.2M a 0.5M, inclusive. 38. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 35, . caracterizada porque ' el. agente estabilizante es un aminoácido seleccionado de entre arginina, ácido , glutámico, y/o sales, de los mismos y/o combinaciones de los mismos. 39. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la concentración de los aminoácidos son. de 1 a 100 mM, 10 a 100 mM, o de 30 mM, 50 mM o 80 mM. 40. La co-formulación estable de conformidad ' con cualquiera de las reivindicaciones 1-39, caracterizada porque el agente estabilizante es un surfactante y la cantidad de surfactante como un % de concentración de masa (p/v) en la formulación es es entre 0.005% a 1.0%, .0.01% a .0.5%, 0.01% a 0.1%., 0.01% a 0.0.5%, . o 0.01% a 0.02%.. 41. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el surfactante se selecciona de entre polipropilenglicol, polietilenglicol , glicerina, sorbitoi, poloxámero y polisorbato. 42. La co- formulación estable, de conformidad con la reivindicación 40 o reivindicación 41,. caracterizada porque el surfactante se selecciona de entre poloxámero 188-, polisorbato 20 y polisorbato 80. · 43. Las co-formulaciones estables' de conformidad con cualquiera de las. reivindicaciones ' 1-42, caracterizada porque : · el agente estabilizante es ' un surfactante- que es poloxámero 188 y se proporciona en una cantidad como un % de concentración de masa (p/v) de entre 0.01% a 0.05%; o el agente estabilizante, es un surfactante' que es polisorbato 20 y se proporciona en una cantidad como un % de concentración de masa (p/v) de entre 0.01% a 0.05%; o el agente estabilizante es un surfactante que es polisorbato 80 y se proporciona en una cantidad como un % de concentración de masa (p/v) de entre 0.01% a 0.05%. 44. Las. co-formulaciones estables de conformidad, con cualquiera de las reivindicaciones 1-43, caracterizadas porque comprenden un modificador de tonicidad para mantener la osmolaridad de entre 245 mOsm/kg 305 mOsm/kg. 45. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque el modificador de tonicidad se selecciona de- entre glicerina, sal, aminoácidos, polialcoholes y trehalosa. 46. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 44 o reivindicación 45, : caracterizada porque comprende glicerina en. una concentración menor que 60.. mM, menor que 55 mM, menor que 50 mM, menor que 45 mM, menor que 40 mM, menor que 35 mM, menor que 30 mM, menor que 25 mM, menor que 20 mM, menor que 15 mM, menor que 10 mM. 47. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones. 44-46, caracterizada porque : la insulina de acción rápida es un análogo de insulina que es una insulina aspart y la formulación comprende glicerina en una concentración entre 20 mM a .50 mM, inclusive ; o la insulina de acción rápida es una insulina regular o es insulina lispro y la formulación comprende glicerina en una concentración entre o aproximadamente entre 40 mM a 60 mM, inclusive. 48. La co-formulación .estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4-7, caracterizada porque comprende un antioxidante. 49. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación .48, caracterizada porque el antioxidante ¦ es seleccionado de entre cisteina, triptofáno y metionina. 50. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 48 o reivindicación' 49, caracterizada porque el antioxidante es una concentración de entre 5 mM á 50: mM, '5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mM a 20 mM, inclusive. 51. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 49,. caracterizada porque el antioxidante es metionina y la concentración es entre o aproximadamente entre 10 mM a 20 mM. 52. La co-formulación - estable de conformidad con cualquiera de . las reivindicaciones 1-51,. caracterizada' porque comprende zinc. 53. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la concentración de zinc es entre 0.001 a 0.1 mg por 100 unidades de insulina (mg/100U) , ' 0.001 a 0.05 mg/1000U o 0.01 a 0.05 mg/100U.. 54. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-53, caracterizada porque además comprende un compuesto nicotinico. 55. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el compuesto nicotinico se selecciona de entre nicotinamida, ácido nicotinico, niacina, niacinamida, vitamina B3 · y/o sales de los mismos y/o cualquier combinación de los mismos. 56. La co-formulación estable de conformidad con. la reivindicación 54 o reivindicación 55,. caracterizada . porque los compuestos nicotinicos están. presentes ¦ en una concentración de 1 mm a 150 mM, 10. mM a 150 mM, 50 mM- .a LOO mM o de o de aproximadamente 80 mM. 57. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-56, . caracterizada porque la formulación tiene un pH de entre 7.0 a 7.6, y comprende: una enzima degrádadora de hialuronano que es un PH20 en una cantidad entre 100 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; un . análogo dé insulina de acción rápida en una cantidad de entre 10 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; un agente amortiguador Tris en una concentración entre 10 mM a 50 mM, inclusive; NaCl en una concentración entre 50 a 200 mM, inclusive; . metionina en una concentración entre 5 .'mM a 50 mM, inclusive; gl'icerina en una concentración de entre 0. mM a 50' mM, inclusive; un surfactante que es poloxámero .188, polisorbato 20 o polisorbato 80 en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre 0.01% a 0,5%; y un" conservador (es) que comprende (n) fenol, en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) d entre 0.1% a 0.25% y m-cresol en un % p/v de entre o entre aproximadamente 0.05% a 0.2%. 58. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque comprende zinc en una concentración de 0.001 a 0.1 mg por 100 unidades de insulina (mg/100U) . 59. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 57 o reivindicación 58, caracterizada porque: la' insulina ; de acción rápida es un análogo de, insulina de acción rápida que es insulina lispro, . la formulación tiene un pH entre 7.0 a 7.6; y la formulación comprende: una enzima degradadora de hialuronano que es un PH20 n una cantidad de entre o 100 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; insulina lispro en una cantidad entre 10 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; un agente amortiguador Tris en una concentración de entre 25 mM a 35 mM, inclusive; NaCI en una concentración .de entre. 50 mM a 120 mM, inclusive; metionina en una · concentración entre 10. mM a 30 mM, inclusive; glicerina en una concentración de entre 40 mM. a 60 mM, inclusive ; un. surfactante que es pcloxámero 188, poiisorbato 20 o polisorbato 80 en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre 0.01% a 0.05%, inclusive; zinc en una concentración de .0.017· a 0.024 mg por 100 unidades de insulina (mg/100U) ; y. conservadores que comprenden un porcentaje (%) de concentración de¦ masa (p/v) de entre 0.08% a 0.17% de fenol, inclusive, y entre 0.07% a 0.17% de m-cresol. 60. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque la concentración de NaCI es. entre 70 mM a 100 mM. 61. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 57 o reivindicación 58, caracterizada porque:' la insulina de acción rápida es un análogo, de insulina de, acción rápida que es insulina aspart, la formulación tiene un pH entre 7.0 a 7.6.; y la formulación comprende:. una enzima degradadora de hialuronano que es un PH20 én una cantidad entre. 100 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; . insulina aspart en una ¦ cantidad entre 10 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; · . un agente amortiguador Tris en una concentración de entre 25 mM a 35 mM, inclusive; NaCl en una concentración de entre 80 mM a 160 mM, inclusive; metionina ' en . una concentración entre 10 mM a 30 mM, inclusive ; glicerina en una concentración . de entre 20 mM a 50 mM-, inclusive; un surfactante que es un poloxámero 188, polisorbato 20 o polisorbato 80 en un porcentaje (%) de concentración .de masa (p/v) de entre 0.01% a 0.05%, inclusive; zinc en una. concentración de 0.017 a 0.024 mg por 100 unidades de insulina (mg/100U) ; y conservadores que comprenden un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre 0.08% a 0.17% de fenol, inclusive, y entre .0.07% a 0.17% de m-cresol. 62.. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la concentración de NaCl es entre 70 mM a 100 mM.-. 63. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 57 o reivindicación 58, caracterizada porque: la insulina de acción rápida, es un análogo dé. insulina de acción rápida que es insulina glulisina; la. formulación tiene un pH entre 7.0 a 7.6; y la formulación comprende: una enzima degradadora de hialuronano que es un PH20 en una cantidad entre .100 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; la insulina glulisina en una cantidad entre 10 U/mL a 1000 U/mL, . inclusive; un ¦ agente amortiguador Tris en una concentración de entre 25 mM a 35 mM, inclusive; NaCl en una concentración de entre 80 mM á 200 mM, inclusive; metionina¦ en una concentración entre 10 mM a 30 mM, inclusive ; glicerina en una concentración de entre 40 mM.ao 60 mM, inclusive; un surfactante que es poloxámero 188 en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre 0.01% a 0.05%, inclusive; y un conservador (es) ' que comprende (n)¦ un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre 0.08% a 0.17% de fenol, inclusive, y entre 0.07% a 0.17% m-cresol. 64. La co-formulación estable de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque la concentración de NaCl es entre 100 mM a 150 mM. 65. La co-fórmulación estable de conformidad con cualquiera de las. reivindicaciones 1-64, caracterizada se formula para administración de múltiples dosis. 66. Una composición, . caracterizada porque caracterizada porque comprende: una cantidad terapéuticamente efectiva dé una enzima degradadora de hialuronano; y lisil-lisina (Lys-Lys) en una cantidad para . hacer la enzima degradadora de hialuronano estable. 67. La composición de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada porque la cantidad de Lys-Lys es suficiente tal qué la enzima degradadora de hialuronano retiene por lo menos 50% de la actividad de la hialuronidasa inicial durante por lo menos tres (3) días a 37°C. .68. La composición de conformidad con la reivindicación 66 o . reivindicación 67,. caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano retiene por lo menos 50% de la actividad de la hialuronidasa inicial a 37°C durante por lo menos 4 días, 5 días, .6 días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes,, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o' más. 69. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-68, caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano retiene por ' lo menos 50% . de la actividad de la hialuronidasa inicial durante por lo menos un mes a 37 °C . 70. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-69 caracterizada porque la concentración de Lys-Lys es entre 5 mM a 12.0 m ,. 10 mM a 100 mM, 10 mM a 50 mM, 30 mM a 110 mM, .30 mM a 80 mM, 50 mM a 100 mM o 100 mM a 120 mM. 71. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-7.0, caracterizada, porque el pH-;de la formulación es entre 6.5 a 8.0, 6.5 a 7.4, 6.8· a 7.8,' 7.0·. a 7.6 o 6.8 a 7.2, inclusive . 72. La composición de conformidad . con cualquiera de las reivindicaciones 66-71, caracterizada porque la formulación comprende además un agente estabilizante. 73. La composición de conformidad con la reivindicación 72, caracterizada porque el agente estabilizante seleccionado de entre un aminoácido, un derivado de aminoácido,, una amina, un azúcar, un poliol, una sal y un surfactante. 74. La composición de conformidad con la reivindicación 72 o . reivindicación .73, caracterizada porque el agente estabilizante es un surfactante y la cantidad de surfactante, cómo un % de concentración de masa (p/v) en l'a formulación es, es entre 0.0005% a 1.0%, 0.000.5% a 0.005%,, 0.001% .a 0.01%, 0.01% a 0.5%, 0.01% a 0.1%, 0.01% a 0.05%, o 0..01% a 0.02%, inclusive. 75. La composición de conformidad con la reivindicación 73 o reivindicación 74', caracterizada porque el surfactante se selecciona de entre polipropilenglicol, polietilenglicol , glicerina, sorbitol, poloxámero y polisorbato. 76. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-75, caracterizada porque el surfactante se selecciona de entre poloxámero 188, polisorbato 20 y polisorbato 80. 77. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-76, caracterizada porque la composición comprende un antioxidante. 78. La composición de conformidad con la reivindicación 77, caracterizada porque el antioxidante se selecciona de entre cisteina, triptofano y metionina. 79.. La composición de conformidad con la reivindicación 78, caracterizada porque el antioxidante es metionina. 80. · La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones ¦ 77-79,· caracterizada porque el antioxidante está en una. concentración de entre 5 mM a 50 mM, 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mM a 20 mM, inclusive. 81. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-80,' caracterizada porque un modificador de tonicidad para mantener la osrnolaridad de entre 245 mOsm/kg a 500 mOsm/kg, inclusive. 82. La composición de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque el modificador de . tonicidad se selecciona de . . entre glicerina, sal, aminoácidos, polialcoholes y trehalosa. 83. La composición de conformidad con la reivindicación 81 o reivindicación 82, caracterizada porque el modificador de tonicidad es una sal que es NaCl y la concentración de NaCl es entre 20 mM a.200 mM, 40 mM a .160 mM, 80 mM a 120 mM, 20 mM a 80 mM o 50 mM a 150 mM, inclusive. 84. La composición de conformidad, con cualquiera de las reivindicaciones 66-83, caracterizada porque comprende NaCl en una concentración de menor que 150 mM, menor que 140 mM, menor que 130- mM, menor que 120 mM, menor que 110 mM, menor que 100 mM, menor; que 90 mM, menor que. 80 mM, menor que 70 mM, menor que 60 mM, menor que 50 mM, menor que 40 mM, menor que 30 mM, menor que 20 mM, menor que 10 mM, o menos. 85. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-84, caracterizada porque comprende una cantidad suficiente, de . un- agente amortiguador ..para mantener el intervalo de pH de entre 6.5 a 8.0, 6.8 a 7.8, 7.0 a 7.6, 6.5 a o. 6.8 a 7.4, inclusive, en donde el agente amortiguador se selecciona de entre Tris, histidina, fosfato y citrato. 86. La composición de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada porque el agente amortiguador es un fosfato que es fosfato de sodio. 87. La composición de conformidad con la reivindicación 85 o reivindicación 86, caracterizada porque la concentración del agente amortiguador es entre 1 mM a 100 mM, 10 mM a . '80 mM, 5 mM a 50 mM o .20 mM a 40 mM, inclusive. 88. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-87, caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano . es una hialuronidasa o una condroitinasa . 89. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-88, caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano es una hialuronidasa. que es .activa a un pH de neutro.. 90:. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-89, caracterizada porque: la enzima degradadora de hialuronano carece de un' ancla de glicosilfosfatidiiinositol (GPI) o no se asocia a la membrana cuando se expresa de- una célula; o la degradación de hialuronano contiene truncamientos C-terminales. de uno o más residuos de aminoácido, para remover todo o parte de un ancla GPI. 91. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-90, caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano es una hialuronidasa que es una PH20 o un fragmento, truncado en C-terminal del mismo. ' 92. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-91, caracterizada porque la .enzima degradadora de hialuronano es un poüpéptido P.H20 que tiene l secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ -ID NOS: 4-9, 47-48, . 234-254, y 267-273, o una .secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%., 86.%., 87%, 88%, 89%, 90%, 9.1%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de las - SEQ ID. NOS: 4-9,. 47-48, 234-254, y 267-273. 93. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-92, caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano es un PH20. C-terminal truncado que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta. en cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9. 94. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-93, caracterizada porque la cantidad de una enzima degradadora de hialuronano es entre 10 U/mL a 20,000 U/mL, 50 U/mL a 15,000 U/mL, 50 U/mL a 10,000 U/mL, 50 U/mL a 5000 U/mL, 50. U/mL a 4000 U/mL, 100 U/mL a 10000 U/mL, 100 U/mL a 5000 U/mL, 100 U/mL a 2000 U/mL, 30.0 U/mL a 5000 U/mL, 300 U/mL a 2000 U/mL, 600 U/mL . a ,5000. U/mL, 600 U/mL ;.a 2000 U/mL, 100 U/mL a 1000 U/mL, 200 U/mL a 800 U/mL, 100 U/mL a .500 U/mL, o .150. U/mL a 300 U/ml, inclusive. 95. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-94, caracterizada porque la concentración de Lys-Lys es 5 mM a 50 mM, inclusive.. 96. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-95, caracterizada porque: . el pH de' la composición es entre 6.5 a 7.2; y la composición comprende: una enzima degradadora de hialuronano en., una cantidad qué es entre 100 U/mL a 500 U/mL, inclusive; Lys-Lys en una concentración que es entre 5 mM' a 30 mM, inclusive; ' ' NaCl en una concentración menor que NaCl 1.40 mM; un surfactante que es polisorbato 80 en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre 0.01% a 0.05%, inclusive ; métionina en una concentración¦ que es entre .5 mM a 20 mM, inclusive; y ' fosfato de sodio en una concentración que .es entre 5 mM a 50 mM, inclusive. 97. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-96, caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano es un PH20 d un fragmento truncado en C-terminal del mismo. 98. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-97, caracterizada porque además comprende una insulina de acción rápida'. 99. La composición de conformidad con la reivindicación 98, caracterizada porque la concentración de Lys-Lys es 30 mM a 120 mM, 50 mM a 105 mM o 80 mM a 100 mM, inclusive. 100. La composición de conformidad con la reivindicación 98 o reivindicación 99, . caracterizada porque la insulina de acción rápida es una insulina regular. 101. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la insulina regular es una insulina humana o insulina de cerdo. 102. La composición de conformidad con la reivindicación 10,0 o reivindicación 101, caracterizada .porque la. insulina regular es una insulina . con una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 103 y una cadena B que tiene' una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 104; o una insulina con una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones de, residuos de¦ aminoácido 88-108 de SEQ ID NO: 123 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones de residuos de aminoácido 25-54 de SEQ ID NO: 123. 103. La composición de conformidad con la reivindicación 98. o reivindicación 99, caracterizada porque la insulina de acción rápida es un análogo de insulina.- 104. La composición de conformidad con la reivindicación 103, caracterizada porque el análogo de insulina se selecciona de entre insulina aspart, insulina lispro. e insulina glulisina. ¦ 105. La composición de conformidad con la reivindicación 103 o reivindicación 104,. caracterizada porque el análogo de insulina se selecciona de entre una. insulina que tiene una cadena A con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ NOS: 103 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ NOS: 147-149. 106. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 98-105, caracterizada porque la cantidad de insulina de acción rápida es entre 10 U/mL a 1000 U/mL, 20 U/mL. a 500 U/mL, 50. U/mL a 300 U/mL o 200 U/mL a 800 U/mL, inclusive . 107. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 98-106, caracterizada porque la insulina de acción rápida es un . análogo de insulina y la enzima degradadora de hialuronano es un PH20 o un fragmento truncado en C-terminal del mismo. 108. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 98-107, caracterizada porque: la insulina de acción rápida es un análogo de insulina que es glulisina y la concentración de' Lys-Lys es 50 a 105 mM; o .¦ ' ' ¦: ¦ ' .' la insulina de acción rápida es un análogo de insulina que es insulina aspart o insulina lispro y la concentración de Lys-Lys es 80 a 1.00 mM. 109. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-108, caracterizada porque es para administración de dosificación individual o' es para administración de múltiples dosificaciones. 110. La composición de conformidad con la reivindicación 109, caracterizada porque la composición es para administración de múltiples dosificaciones y comprende-, una cantidad anti-microbianamente efectiva, de un conservador ¦ o mezclas de conservadores. 111. La composición de conformidad- con la reivindicación 110, caracterizada porque los conservadores en la formulación comprenden uno o más de conservadores . fenólicos, conservadores no fenólicos o conservadores ' fenólicos .y conservadores no fenólicos. 112. La composición de conformidad con la reivindicación 110 o . reivindicación 111, caracterizada, porque los conservadores sé seleccionan de . entre fenol, m-cre.sol, metilparabeno, alcohol bencílico, timerosal,.. cloruro de benzalconio, 4-cloro-l-butanol, diclorohidrato de clorhexidina, digluconato de clorhexidina, L-fenilalanina, EDTA, bronopol, acetato, fenilmercurico, glicerol, . imidurea, clorhexidina, deshidroacetato de sodio, o-cresol, p-cresol, clorocresol, cetrimida, cloruro de bencetonio, étil-parabeno , propilparabeno, butilparabeno y cualquiera combinación de los mismos. 113. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 110-112, caracterizada porque la formulación contiene un solo conservador; o contiene una mezcla de conservadores que contiene 2, 3 o 4 diferentes conservadores. 114. La. composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones .110-113, caracterizada porque . comprende por lo menos un conservador fenólico. 115. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 110-114, caracterizada porque los conservadores son fenol, m-cresol o fenol y m-cresol. 116. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 110-115, . caracterizada porque la cantidad total de el uno o más agentes conservadores como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) en la formulación es es o es entre 0.1% y. 0.4%, 0.1%. a 0.3%, 0.15% 0.325%,; 0.15%. a. 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3% . o 0.3% a 0.4%, inclusive. : 117. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones .110-116, caracterizada porque' los conservadores son fenol y m-cresol y la cantidad como un % de concentración de masa (p/v) en la. formulación es es. entre 0.1% a 0.25% de fenol, y entre 0.05% a 0.2% de', m-cresol, es entre 0.10% a 0.2% de fenol y entre 0.06% a 0.18% de m-cresol, es entre 0.1% a 0.15% de fenol y 0.08% a 0.15%. de m-cresol, es entre 0.10% a 0.15% de fenol y entre. 0.06 a 0.09% de m-cresol o es entre 0.12% a 0.18% de fenol y entre 0.14, a 0.22% de m-cresol, inclusive. 118. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-117, caracterizada porque: el pH de la composición es entre.6.8 a 7.4 ;'· y. la. composición comprende : ¦ una enzima degradadora de hialuronano que es un PH20 en una cantidad entre 100 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; . . un análogo de insulina de acción rápida que es insulina glulisina en una cantidad entre 10 U/mL a 1Ó00 U/mL, inclusive; " Lys-Lys en una concentración . entre . 50 mM · a 105 mM, inclusive; NaCl en una concentración de meno que 100 mM; un surfactante que es polisorbato 2.0 en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre 0.0005% a 0.005%, inclusive; metionina en una concentración entre 5 mM a 20 mM, inclusive; y un conservador (es) que comprende (n) fenol en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre 0.1%. a 0.25% y m-cresol en un '% p/v de entre 0.05% a 0.2%. 119. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66-117, caracterizada porque: . el pH de . la composición es entre 6.8 a 7.4; y la composición comprende: una enzima degradadora de hialuronano que es un PH20 en una cantidad entre 100 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; un análogo de insulina de acción rápida que es insulina aspart o insulina lispro en una cantidad entre 10 U/mL a 1000 U/mL, inclusive; Lys-Lys en una concentración entre 80 mM a 100 mM, inclusive; NaCl en una concentración de menor que 30 mM; un surfactante que es polisorbato 20 en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) de entre 0.0005% a 0.005%, inclusive; meticnina en una concentración entre 5 mM a 20 mM, inclusive; y un conservador (es ) que comprende (n) fenol en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) d entré 0.1% a 0.25% y m-cresol en un % p/v de entre 0.05% a 0.2%. 120. Una composición, caracterizada porque comprende: una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima degradadora de hialuronano; y una concentración de gCl2 que es entre 50 mM a 1-50 mM, inclusive, tal que la enzima degradadora de hialuronano retiene por lo menos 50% de la actividad de la hialuronidasa inicial durante por. lo menos tres (3.) días a 37 °C. 121. La composición de conformidad con la reivindicación 120, caracterizada porque la concentración de MgCl2 es entre 75 mM a 125 mM o 80. mM a 100 mM, inclusive. 122. La composición de conformidad con la reivindicación 120 o reivindicación 121, caracterizada, porque la enzima degradadora de hialuronano retiene por . lo menos 50% de la actividad de - la hialuronidasa inicial a 37 °C durante por lo menos 4 días, 5 días, '6 días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más. 123. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120-122, caracterizada porque ' el pH de la composición es entre 6.5 a 8.0, 6.5 a 7.4, 6.8 a 7.8, 7.0 a 7.6 o 6.8 a 7.2. 124. La composición de conformidad con cualquiera de las 545 reivindicaciones 120-123, . caracterizada porque la composición comprende además un agente estabilizante. 125. La composición de conformidad con cualquiera .de las reivindicaciones 120-124, caracterizada porque' el agente estabilizante seleccionado .de entre, un aminoácido, · un derivado de aminoácido, un amina, un azúcar, un polio!,, una sal y un surfactante. 126. La composición de conformidad con la reivindicación 125, caracterizada porque el agente estabilizante - es ün surfactante y la cantidad de surfactante, como un % de concentración de masa (p/v) en la ' formulación : es , es entre 0.0005% a 1.0%, 0.0005% a 0.005%, 0,0.01% a 0,01%, '?.01% a 0.5%, 0.01% a 0.1%, 0.01% a 0.05%,. o 0.01% a 0.02%:, inclusive. 127. La composición de conformidad con la reivindicación 125 o reivindicación.126, caracterizada porque el surfactante seleccionado de entre a polipropilenglicol, polietile'nglicol, glicerina, sorbitol, poloxámero y polisorbato. 128. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 125-127, caracterizada porque el surfactante se selecciona de . entre poloxámero ¦ 188, polisorbato 20 y polisorbato 80. 129. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120-128, caracterizada porque la composición comprende un antioxidante. 130. La composición de conformidad con la reivindicación 129, caracterizada porque el antioxidante se selecciona de entre cisteina, triptofano y metionina.. 131. La composición de conformidad con la reivindicación 130, caracterizada porque el antioxidante es metionina. 132. La composición de conformidad . con cualquiera de las reivindicaciones' 129-131, caracterizada porque el antioxidante está en una concentración de entre 5 mM a 50 mM, 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mM a 20 mM, inclusive. 133. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120-132, caracterizada porque comprende una cantidad suficiente de agente amortiguador para mantener el intervalo de pH de entre 6.5 a 8.0, 6.8-a 7.8, 7.0 a 7...6, 6.5 a o 6.8 a 7.4, caracterizada porque el agente amortiguador se selecciona de entre Tris, histidina, fosfato y citrato. 134. La composición de conformidad con la reivindicación 133, caracterizada porque el agente amortiguador, es clorhidrato de histidina. 135. La composición de conformidad con la reivindicación 133 . o reivindicación ¦ 134, caracterizada' porque la concentración del agente amortiguador es entre mM a 100 mM, 10 mM 80 mM, 5 mM a 50 mM o 20 mM a 40 mM. 136. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120-135, caracterizada . porque la enzima degradadora de hialuronano es una hialuronidasa o una ccndroitinasa . . 137. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120-136, caracterizada porque la- enzima degradadora de hialuronano es una hialuronidasa que es activa a un pH de neutro. 138. La composición de conformidad con cualquiera .de las reivindicaciones 120-137, caracterizada porque enzima degradadora de hialuronano carece de un ancla de glicosilfosfatidilinositol (GPI) o no se asocia a la membrana cuando se expresa de una célula; o la enzima degradadora de hialuronano es una enzima degradadora. de hialuronano que contiene truncamientos .C-terminales de uno o más residuos.de aminoácido para remover todo o parte de. un ancla GPI. 139. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12.0-138, caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano es una hialuronidasa que es un PH20 o un fragmento truncado en C-terminal del mismo. 140. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120-139, caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano es un polipéptido PH20 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta, en cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9, .47-48, .234-254, y 267-273, o una/ secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 70%, 75%, 80%, .85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 9.0%, 91%, 92%, 93%, ' 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de las SÉQ ID NOS: 4-9, 47-48, 234-254, y 267-273.. 141. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120-140, caracterizada porque la enzima degradadora de hialuronano es un PH20 · C-te.rminal truncado que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta' en cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9. 142. La' composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120-141, caracterizada porque la cantidad de una enzima degradadora de hialuronano es entre 10 U/mL a 20,000 U/mL, 50 U/mL a 15,000 U/mL, 50 U/mL a 10,000 U/mL, 50 U/mL a 5000 U/mL, 50 U/mL a 4000 U/mL,. 100 U/mL a 10000 U/mL, 100 U/mL a 5000 U/mL, 100" U/mL a 2000 U/mL, 300 U/mL a 5000 U/mL, 300 U/mL a 2000 U/mL, 600 U/mL a 5000 U/mL, 600 U/mL a 2000 U/mL, 100 U/mL a 1000 U/mL, 200 U/mL a 800 U/mL, 100 U/mL a 500 U/mL, o 150 U/mL a 300 U/ml, inclusive. 143. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120-142, caracterizada porque: el pH de la composición es entre 6.5 a 7.2; y la composición. comprende ; . . una enzima degradadora de hialuronano en una cantidad que es' entre 100 U/mL a 500 U/mL, inclusive; 64.9 MgCl2 en una concentración que es entre 50 mM a 150 mM, inclusive; un surfactante que es polisorbáto 80 en un porcentaje (%) de concentración de masa (p/.v) de entre 0.01%. a 0.05%, inclusive; metionina en una concentración que es entre 5 mM a 20 mM, inclusive; y histidina/HCl en una concentración que es entre 5 mM a 50 mM, inclusive. 144. La co-formulación estable o composición . de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones . 1-143, caracterizada porque el volumen de la . composición es entre entre 0.5 mL a' 50 mL, 1 mL a 40 mL, 1 mL · a 20 mL, 1 mL a 1.0 mL, o 3 mL a 10 mL, inclusive. . 145. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65. y 98-119, caracterizada porque se formula para la administración usando un vial, jeringa, pluma, depósito para una bomba o un sistema de circuito cerrado. 146. La co-formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65. y -98-119, caracterizada porque se formula para la administración usando una infusión de insulina subcutánea continua.. . 147. La co-formulación estable o composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-146, caracterizada porque el pH es entre 6.8 a 7.2 148,. Una jeringa o vial, caracterizado porque . comprende la co-formulación estable' o composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-147.. 149. El sistema de circuito cerrado, .caracterizado porque comprende lá co-formulación estable o composición de conformidad con. cualquiera de las reivindicaciones 1-65, . 98-119 y 144-147. 150. Una bomba de insulina, caracterizada porque comprende la co—formulación estable o composición de conformidad con cualquiera de las- reivindicaciones 1-65, 98-119 y 144-147. 151. Una pluma de insulina, caracterizada porque comprende la co-formulación o composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65, 98-119 y 144-147. .. 152.. Un .' método para tratar diabetes, caracterizado porque' comprende administrar a un ' sujeto una ' cantidad terapéuticamente efectiva de una co-formulación estable o composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65, 98-119 y 144-147. 153. El método de' conformidad con la reivindicación.152, caracterizado porque la diabetes seleccionado- -de .entre diabetes mellitus tipo .1, diabetes mellitus tipo 2 y diabetés gestacional. 154. Un método para controlar los niveles de glucosa en la sangre en un sujeto, caracterizado, porque comprende administrar a un. sujeto una¦ cantidad terapéuticamente efectiva de una co-formulación estable o composición de conformidad con cualquiera . de las. reivindicaciones 1-65, 98-119 y 144-147. · 155. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones. , 152-154, caracterizado porque. además comprende administrar un fármaco antidiabético diferente.. . 156. La co-formulación estable ó composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65, 98-119 y 144-147, caracterizada para el uso en el tratamiento de diabetes o para el uso en el control de niveles de. glucosa en la sangre en un sujeto. 157. Uso de una co-formulación estable o composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65, 98-119 y .144-147, para tratar diabetes ó para controlar los niveles de glucosa, en la sangre en un sujeto. 158. Uso de una co-formulación · estable o composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65, 98-119 y 144-147, para la fabricación de un medicamento para tratar diabetes o para, controlar los niveles de glucosa en la sangre de un sujeto. ' 159. La co-formulación estable o composición o. uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 156-158, caracterizada porque la diabetes es seleccionada de . entre diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 y diabetes gestacional .