EA033472B1 - Композиция для стабилизации гиалуронидазы и ее применение - Google Patents

Abstract

Предусмотрены композиции, содержащие растворимую гиалуронидазу и Lys-Lys в количестве, обеспечивающем стабильность гиалуронидазы и содержащих ее композиций.

Description

Область техники

Предусмотрены составы (композиции), которые представляют собой стабильные композиции фермента, разрушающего гиалуронан, или стабильные совместные композиции быстродействующего инсулина и фермента, разрушающего гиалуронан, в том числе рекомбинантного человеческого PH20 (rHuPH20), которые дополнительно содержат Lys-Lys.

Предшествующий уровень техники

Диабет приводит к хронической гипергликемии из-за неспособности поджелудочной железы вырабатывать достаточное количество инсулина или из-за неспособности клеток должным образом синтезировать и высвобождать инсулин. Гипергликемия также может развиваться у критически больных пациентов, что приводит к увеличению смертности и осложнениям. Инсулин был введен в качестве терапевтического средства для лечения пациентов, имеющих диабет, в том числе, например, диабет 1 типа, диабет 2 типа и гестационный диабет, для имитации эндогенной инсулиновой реакции, которая возникает у нормальных индивидуумов. Инсулин также вводят критически больным пациентам с гипергликемией, чтобы контролировать уровень глюкозы в крови.

Как правило, быстродействующие инсулины вводят таким субъектам в ответ на гипергликемию или в ожидании гипергликемии, например, после потребления пищи, что может привести к гликемическому контролю. Однако современные быстродействующие формы инсулина имеют задержку в абсорбции и действии и, следовательно, не приближаются по быстроте действия к эндогенному инсулину. Таким образом, такие композиции не действуют достаточно быстро для того, чтобы прекратить выработку глюкозы в печени, которая происходит вскоре после этой первой фазы высвобождения инсулина. Из-за задержки в фармакологическом действии быстродействующие препараты инсулина следует вводить заблаговременно до приема пищи для того, чтобы достичь желаемого гликемического контроля. Кроме того, дозы, которые должны быть введены, приводят к увеличению длительности действия, что способствует гипогликемии, а во многих случаях и ожирению.

Деградирующие гиалуронан ферменты представляют собой ферменты, проявляющие терапевтическую активность сами по себе и/или при совместном введении с терапевтическими агентами, такими как инсулин. Например, были разработаны композиции сверхбыстродействующего инсулина, содержащие деградирующий гиалуронан фермент и быстродействующий инсулин (например, быстродействующий аналог инсулина), что дает композицию, которая при введении субъекту лучше имитирует эндогенное (т.е. естественное), возникающее после приема пищи высвобождение инсулина у субъектов, не страдающих диабетом, по сравнению с введенеием только быстродействующего инсулина (см., например,

- 1 033472 опубликованную заявку США № US 20090304665). Существует потребность в улучшенных композициях и совместных композициях деградирующих гиалуронан ферментов. Также существует потребность в улучшенных стабильных композициях для лечения субъектов, например, для контроля уровня глюкозы в крови у субъектов с диабетом.

Сущность изобретения

Изобретение предусматривает композиции, содержащие гиалуронидазу и лизил лизин (Lys-Lys) в количестве, достаточном, чтобы сделать гиалуронидазу стабильной.

В изобретении раскрыта композиция для стабилизации гиалуронидазы PH20, содержащая растворимый полипептид PH20, и лизил лизин (Lys-Lys) в количестве, достаточном, чтобы сделать растворимый полипептид PH20 стабильным, за счет чего растворимый полипептид PH20 в составе заявленной композиции обладает повышенной гиалуронидазной активностью при инкубации при температуре от 37 до 42°С включительно по сравнению с идентичной композицией, но не содержащей Lys-Lys.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения концентрация Lys-Lys в композиции составляет между 5 и 120 мМ, 10 и 100 мМ, 5 и 50 мМ, 10 и 50 мМ, 30 и 110 мМ, 30 и 80 мМ, 50 и 100 мМ или 100 и 120 мМ.

Согласно другому варианту выполнения изобретения концентрация Lys-Lys составляет от 5 до 300 мМ.

Согласно иному варианту выполнения изобретения концентрация Lys-Lys составляет от 50 до 150 мМ, включая граничные значения.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения концентрация растворимого полипептида PH20 составляет по меньшей мере 10 ед./мл.

Согласно другому варианту выполнения изобретения концентрация растворимого полипептида PH20 составляет между 10 и 5000 ед./мл, включая граничные значения.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения композиция дополнительно включает стабилизирующий агент, выбранный из аминокислоты, производного аминокислоты, амина, сахара, полиола, соли и поверхностно-активного вещества.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения стабилизирующий агент представляет собой поверхностно-активное вещество, и количество поверхностно-активного вещества в виде % массовой концентрации (мас./об.) в композиции составляет между 0,0005 и 1,0%, 0,0005 и 0,005%, 0,001 и 0,01%, 0,01 и 0,5%, 0,01 и 0,1%, 0,01 и 0,05% или 0,01 и 0,02%, включая граничные значения.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения поверхностно-активное вещество выбрано из полипропиленгликоля, полиэтиленгликоля, глицерина, сорбитола, полоксамера и полисорбата.

Согласно другому варианту выполнения изобретения поверхностно-активное вещество выбрано из полоксамера 188, полисорбата 20 и полисорбата 80.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения композиция включает антиоксидант или модификатор тоничности.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения композиция содержит достаточное количество буферного агента для поддержания диапазона pH между 6,5 и 8,0, 6,8 и 7,8, 7,0 и 7,6, 6,5 и 7,2, или 6,8 и 7,4, включая граничные значения, где буферный агент выбран из Трис, гистидина, фосфата и цитрата.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения растворимый полипептид PH20 активен при нейтральном pH.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения растворимый полипептид PH20 укорочен с С-конца.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения растворимый полипептид PH20 выбран из овечьей PH20, бычей PH20 и растворимой человеческой PH20, где у растворимой человеческой PH20 отсутствует вся последовательность присоединения гликозилфосфатидилинозитольного (GPI) якоря или ее часть.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения полипептид PH20 имеет последовательность аминокислот, приведенную в любой из SEQ ID NO: 4-9, 47-48, 234-254 и 267-273, или последовательность аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 91% или большую идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO: 4-9, 47-48, 234-254 и 267-273.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения укороченный с С-конца PH20 включает последовательность аминокислот, приведенную в любой из SEQ ID NO: 4-9.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения количество растворимого полипептида PH20 в композиции составляет между 10 и 20,000 ед./мл, 50 и 15,000 ед./мл, 50 и 10,000 ед./мл, 50 и 5000 ед./мл, 50 и 4000 ед./мл, 100 и 10000 ед./мл, 100 и 5000 ед./мл, 100 и 2000 ед./мл, 300 и 5000 ед./мл, 300 и 2000 ед./мл, 600 и 5000 ед./мл, 600 и 2000 ед./мл, 100 и 1000 ед./мл, 200 и 800 ед./мл, 100 ед/мл и 500 или 150 и 300 ед./мл, включая граничные значения, или количество растворимого полипептида PH20 в композиции составляет или составляет по меньшей мере 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000, 15000 или 20000 ед./мл.

- 2 033472

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения pH композиции составляет между 6,5 и 7,2;

и композиция включает растворимый полипептид PH20 в количестве между 100 и 500 ед./мл, включая граничные значения;

Lys-Lys в концентрации между 5 и 30 мМ, включая граничные значения;

NaCl в концентрации менее 140 мМ;

поверхностно-активное вещество, которое представляет собой полисорбат 80, в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,01 и 0,05%, включая граничные значения;

метионин в концентрации, которая составляет между 5 и 20 мМ, включая граничные значения; и натрия фосфат в концентрации, которая составляет между 5 и 50 мМ, включая граничные значения. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения композиция дополнительно содержит быстродействующий инсулин, а концентрация Lys-Lys в ней составляет между 30 и 120 мМ, 50 и 105 мМ или 80 и 100 мМ, включая граничные значения.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения быстродействующий инсулин представляет собой регулярный инсулин или быстродействующий аналог инсулина.

Согласно другому варианту выполнения изобретения быстродействующий инсулин представляет собой регулярный инсулин, и регулярный инсулин представляет собой человеческий инсулин или свиной инсулин.

Согласно иному варианту выполнения изобретения быстродействующий инсулин представляет собой аналог инсулина, и аналог инсулина выбран из инсулина аспарт, инсулина лизпро и инсулина глулизин.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения аналог инсулина выбран из инсулина, имеющего А-цепь с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 103, и В-цепь с последовательностью аминокислот, приведенной в любой из SEQ ID NO: 147-149.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения количество бысродействующего инсулина составляет между 10 и 1000 ед./мл, 20 и 500 ед./мл, 50 и 300 ед./мл или 200 и 800 ед./мл, включая граничные значения.

В изобретении раскрыта также описанная композиция, которая предназначена для введения одной дозой или предназначена для введения множеством доз. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения такая композиция предназначена для введения множеством доз и включает эффективное против микроорганизмов количество консерванта или смеси консервантов.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения pH композиции составляет между 6,8 и 7,4; и композиция включает

PH20 в количестве между 100 и 1000 ед./мл, включая граничные значения;

быстродействующий аналог инсулина, который представляет собой инсулин глулизин в количестве между 10 и 1000 ед./мл, включая граничные значения;

Lys-Lys в концентрации между 50 и 105 мМ, включая граничные значения;

NaCl в концентрации менее 100 мМ;

поверхностно-активное вещество, которое представляет собой полисорбат 20, в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,0005 и 0,005%, включая граничные значения;

метионин в концентрации между 5 и 20 мМ, включая граничные значения; и консервант (консерванты), который включает фенол в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,1 и 0,25% и м-крезол в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,05 и 0,2%.

Согласно другому варианту выполнения изобретения pH композиции составляет между 6,8 и 7,4; и композиция включает

PH20 в количестве между 100 и 1000 ед./мл, включая граничные значения;

быстродействующий аналог инсулина, который представляет собой инсулин аспарт или инсулин лизпро в количестве между 10 и 1000 ед./мл, включая граничные значения;

Lys-Lys в концентрации между 80 и 100 мМ, включая граничные значения;

NaCl в концентрации менее 30 мМ;

поверхностно-активное вещество, которое представляет собой полисорбат 20, в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,0005 и 0,005%, включая граничные значения;

метионин в концентрации между 5 и 20 мМ, включая граничные значения; и консервант (консерванты), который включает фенол в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,1 и 0,25% и м-крезол в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,05 и 0,2%.

В изобретении раскрыт шприц или флакон, содержащие описанную стабильную композицию.

В изобретении раскрыта система с обратной связью, содержащая стабильную композицию по любому из пп.20-30 и одно или более из датчика глюкозы, системы доставки для доставки композиции и программного обеспечения для соединения функций доставки и мониторинга, что позволяет доставлять композицию для осуществления гликемического контроля.

В изобретении раскрыта инсулиновая помпа, содержащая стабильную композицию.

- 3 033472

В изобретении раскрыта инсулиновая шприц-ручка, содержащая стабильную композицию.

В изобретении раскрыт способ лечения диабета, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества стабильной композиции. Согласно одному из вариантов диабет выбран из сахарного диабета 1 типа, сахарного диабета 2 типа и гестационного диабета.

В изобретении раскрыт способ контроля уровня глюкозы в крови у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества стабильной композиции.

В изобретении раскрыто применение стабильной композиции для лечения диабета или для контроля уровня глюкозы в крови у субъекта.

В изобретении раскрыто применение стабильной композиции для производства лекарственного средства для лечения диабета или для контроля уровня глюкозы в крови у субъекта. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения диабет выбран из сахарного диабета 1 типа, сахарного диабета 2 типа и гестационного диабета.

Далее описаны совместные композиции, содержащие терапевтически эффективное количество быстродействующего инсулина, деградирующий гиалуронан фермент в количестве, достаточном, чтобы сделать композицию сверхбыстродействующей, NaCl в концентрации между или примерно между 50 и 200 мМ, эффективное количество противомикробного консерванта или смеси консервантов и стабилизирующий агент или агенты. Предусмотренные совместные композиции имеют pH между или примерно между 6,8 и 7,8 и составлены таким образом, что композиции являются стабильными по меньшей мере в течение 6 месяцев при температуре между или примерно между 2 и 8°С и/или по меньшей мере в течение 14 дней при температуре между или примерно между 20 и 30°С.

В некоторых примерах деградирующий гиалуронан фермент в стабильной совместной композиции сохраняет по меньшей мере 50% начальной гиалуронидазной активности по меньшей мере в течение 6 месяцев при температуре между или примерно между 2 и 8°С и/или по меньшей мере в течение 14 дней при температуре между или примерно между 20 и 30°С, и/или инсулин сохраняет по меньшей мере 90% активности или обнаружения от начального уровня исулина в композиции по меньшей мере в течение 6 месяцев при температуре между или примерно между 2 и 8°С и/или по меньшей мере в течение 14 дней при температуре между или примерно между 20 и 30°С, и/или инсулин сохраняет по меньшей мере 90% начальной чистоты инсулина по меньшей мере в течение 6 месяцев при температуре между или примерно между 2 и 8°С и/или по меньшей мере в течение 14 дней при температуре между или примерно между 20 и 30°С, и/или инсулин сохраняет меньше чем 2% содержание высокомолекулярных (HMWt) форм инсулина по меньшей мере в течение 6 месяцев при температуре между или примерно между 2 и 8°С и/или по меньшей мере в течение 14 дней при температуре между или примерно между 20 и 30°С. Например, деградирующий гиалуронан фермент в стабильной совместной композиции сохраняет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95% или больше от начальной гиалуронидазной активности по меньшей мере в течение 6 месяцев при температуре между или примерно между 2 и 8°С и/или по меньшей мере в течение 14 дней при температуре между или примерно между 20 и 30°С и по меньшей мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше от чистоты или активности инсулина по меньшей мере в течение 6 месяцев при температуре между или примерно между 2 и 8°С и/или по меньшей мере в течение 14 дней при температуре между или примерно между 20 и 30°С.

pH стабильных совместных композиций, описанных здесь, находится между или примерно между 7,0 и 7,6. Например, pH стабильной совместной композиции составляет или составляет примерно 6,8±0,2, 6,9±0,2, 7,0±0,2, 7,1±0,2, 7,2±0,2, 7,3±0,2, 7,4±0,2, 7,5±0,2, 7,6±0,2, 7,7±0,2 или 7,8±0,2. Концентрация NaCl в стабильных совместных композициях составляет между или примерно между 80 и 200 мМ, 80 и 140 мМ, 50 и 100 мМ, 80 и 100 мМ, 50 и 80 мМ, 100 и 140 мМ или 120 и 140 мМ. Например, концентрация NaCl стабильной совместной композиции составляет или составляет примерно по меньшей мере 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200 мМ. В таких примерах самое высокое количество NaCl в композициях меньше 100 мМ, достигает 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 мМ. В некоторых примерах стабильные совместные композиции, предусмотренные здесь, содержат достаточное количество буферного агента для поддержания pH в диапазоне между или примерно между 6,8 и 7,8.

Описанные здесь стабильные совместные композиции являются стабильными при температуре между или примерно между 2 и 8°С включительно в течение по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, 13 месяцев, 14 месяцев, 15 месяцев, 16 месяцев, 17 месяцев, 18 месяцев, 19 месяцев, 20 месяцев, 21 месяца, 22 месяцев, 23 месяцев, 24 месяцев, 25 месяцев, 26 месяцев, 27 месяцев, 28 месяцев, 29 месяцев или 30 месяцев. Например, совместные композиции являются стабильными при температуре между или примерно между 2 и 8°С включительно в течение по меньшей мере 18 месяцев или по меньшей мере 24 месяцев. В другом примере стабильные совместные композиции являются стабильными при температуре между или примерно между 20 и 30°С включительно в течение по меньшей мере 15 дней, 20 дней, 21 дня, 22 дней, 23 дней, 24 дней, 25 дней, 26 дней, 27 дней, 28 дней, 29 дней, 30 дней, 35 дней, 40 дней, 45 дней или 50 дней. Например, совместные композиции являются стабильными

- 4 033472 при температуре между или примерно между 20 и 30°С включительно в течение по меньшей мере месяца.

Описанные здесь стабильные композиции составлены таким образом, что деградирующий гиалуронан фермент в совместных композициях сохраняет по меньшей мере 50% от начальной гиалуронидазной активности в течение по меньшей мере 3 дней при температуре между или примерно между 32 и 40°С или является стабильным в течение по меньшей мере 3 ч при перемешивании, и/или инсулин в композиции сохраняет по меньшей мере 90% активности или обнаружения от начального уровня инсулина в композиции в течение по меньшей мере 3 дней при температуре между или примерно между 32 и 40°С или является стабильным в течение по меньшей мере 3 ч при перемешивании, и/или сохраняет по меньшей мере 90% начальной частоты инсулина в течение по меньшей мере 3 дней при температуре между или примерно между 32 и 40°С или является стабильным в течение по меньшей мере 3 ч при перемешивании, и/или сохраняет содержание меньше чем 2% высокомолекулярных (HMWt) форм инсулина на протяжении по меньшей мере 3 дней при температуре между или примерно между 32 и 40°С или является стабильным в течение по меньшей мере 3 ч при перемешивании. В одном из примеров стабильные совместные композиции составлены таким образом, что деградирующий гиалуронан фермент в композиции сохраняет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95% или больше от начальной гиалуронидазной активности в течение по меньшей мере 3 дней при температуре между или примерно между 32 и 40°С или является стабильным в течение по меньшей мере 3 ч при перемешивании. В другом примере стабильные совместные композиции составлены таким образом, что чистота или активность инсулина составляет по меньшей мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше в течение по меньшей мере 3 дней при температуре между или примерно между 32 и 40°С, или она является стабильным в течение по меньшей мере 3 ч при перемешивании.

В некоторых примерах pH стабильной совмсестной композиции составляет или составляет примерно 6,3±0,2, 6,4±0,2, 6,5±0,2, 6,6±0,2, 6,7±0,2, 6,8±0,2, 6,9±0,2, 7,0±0,2, 7,1±0,2, 7,2±0,2, 7,3±0,2, 7,4±0,2 или 7,5±0,2. В других вариантах воплощения концентрация NaCl в стабильных совместных композициях составляет между или примерно между 150 и 200 мМ или 160 и 180 мМ. Например, концентрация NaCl составляет или составляет примерно 120, 130, 140, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200 мМ. В некоторых примерах стабильные совместные композиции являются стабильными при температуре или примерно при температуре 37°С в течение по меньшей мере 3 дней. В других примерах стабильные совместные композиции являются стабильными в течение по меньшей мере 4 дней, по меньшей мере 5 дней или по меньшей мере 6 дней. В некоторых примерах стабильные совместные композиции содержат достаточное количество буферного агента для поддержания pH в диапазоне между или примерно между 6,5 и 7,5.

Деградирующие гиалуронан ферменты, содержащиеся в стабильных совместных композициях, описанных здесь, включают, например, гиалуронидазы, такие как гиалуронидазы животных, в том числе человека, в частности их растворимые формы и/или хондроитиназы. Примерами деградирующих гиалуонан ферментов являются гиалуронидазы и/или хондроитиназы. В некоторых примерах деградирующий гиалуронан фермент представляет собой гиалуронидазу, активную при нейтральном pH. В некоторых примерах деградирующий гиалуронан фермент не имеет гликозилфосфатидилинозитольного (GPI) якоря или не связан с мембраной при экспрессии из клеток. Например, деградирующий гиалуронан фермент является укороченным с С-конца на один или несколько аминокислотных остатков для удаления всего или части GPI якоря. В других примерах деградирующий гиалуронан фермент в стабильных совместных композициях, предусмотренных здесь, представляет собой гиалуронидазу PH20. Примером гиалуронидаз PH20 являются не человеческие или человеческие гиалуронидазы PH20. Включены гиалуронидазы PH20, которые имеют аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 из SEQ ID NO: 1, или имеют аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности, содержащей, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 из SEQ ID NO: 1, и сохраняют гиалуронидазную активность. Например, PH20 по меньшей мере на 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, содержащей, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 из SEQ ID NO: 1, и сохраняет гиалуронидазную активность. Включены полипептиды PH20, которые имеют аминокислотную последовательность, укороченную с С-конца после аминокислот в положениях 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1. Варианты включают полипептиды PH20, которые по меньшей мере на 85% идентичны аминокислотной последовательности, укороченной с С-конца после аминокислот в положениях 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484,485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, и сохраняют гиалуронидазную активность. В некоторых примерах PH20 в стабильных совместных композициях, описанных здесь, по меньшей мере на 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, укороченной с С-конца после аминокислот в положениях 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484,

- 5 033472

485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, и сохраняет гиалуронидазную активность. В некоторых вариантах воплощения деградирующий гиалуронан фермент представляет собой укороченный PH20, являющийся укороченным с С-конца полипептидом PH20, и включает любой из полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность, приведенную в любом SEQ ID NO: 4-9, или аллельные варианты или другие их варианты.

В некоторых примерах количество PH20 в стабильных композициях, описанных здесь, находится между или примерно между 0,1 и 100 мкг/мл, 1 и 50 мкг/мл или 1 и 20 мкг/мл. Например, кличество PH20 составляет или составляет примерно 5 мкг/мл. В других примерах удельная активность PH20 составляет или составляет примерно от 75 до 120 ед./мкг или составляет по меньшей мере, или составляет примерно, или составляет 75, 80, 85, 90, 100, 110 или 120 ед./мкг. Количество деградирующего гиалуронан фермента в стабильных композициях, предусмотренных здесь, составляет между или примерно между 10 и 5000 ед./мл, 50 и 4000 ед./мл, 100 и 2000 ед./мл, 300 и 2000 ед./мл, 600 и 2000 ед./мл или 100 и 1000 ед./мл. Например, количество деградирующего гиалуронан фермента составляет по меньшей мере, или составляет примерно, или составляет 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 или 2000 ед./мл. В примере стабильной совместной композиции количество деградирующего гиалуронан фермента составляет или составляет примерно 600 ед./мл.

Быстродействующий инсулин может быть, например, мономерным или мультимерным, например димерным или гексамерным. В одном из примеров быстродействующий инсулин представляет собой быстродействующий человеческий инсулин. В другом примере быстродействующий инсулин представляет собой регулярный инсулин, например человеческий или свиной инсулин. В одном из примеров быстродействующий инсулин представляет собой регулярный инсулин, и концентрация NaCl в стабильной совместной композиции, описанной здесь, составляет от 50 до 80 мМ. Среди быстродействующих инсулинов существуют регулярные инсулины, такие как инсулин с А-цепью, имеющей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 103, и В-цепью, имеющей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 104, или инсулин с А-цепью с аминокислотной последовательностью, приведенной в виде аминокислотных остатков в положениях 88-108 в SEQ ID NO: 123, и В-цепью с аминокислотной последовательностью, приведенной в виде аминокислотных остатков в положениях 25-54 в SEQ ID NO: 123. Инсулин может быть рекомбинантным инсулином или может быть синтезированным или частично синтезированным или может быть выделенным из природного источника. Быстродействующий инсулин может быть аналогом инсулина. Примером аналогов инсулина является аналог инсулина, выбранный из инсулина, имеющего А-цепь с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ NO: 103, и В-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ NO: 147-149. В некоторых примерах стабильных совместных композиций, предусмотренных здесь, быстродействующий инсулин представляет собой инсулин аспарт, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ NO: 103 (А-цепь) и в SEQ ID NO: 147 (В-цепь), и концентрация NaCl составляет или составляет примерно от 80 и 160 мМ. В другом примере стабильных совместных композиций, предусмотренных здесь, быстродействующий инсулин представляет собой инсулин глулизин, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ NO: 103 (А-цепь) и в SEQ ID NO: 149 (В-цепь), и концентрация NaCl составляет или составляет примерно от 80 и 200 мМ. В еще одном примере стабильной совместной композиции, описанной здесь, быстродействующий инсулин представляет собой инсулин лизпро, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 103 (А-цепь) и в SEQ ID NO: 148 (В-цепь), и концентрация NaCl составляет или составляет примерно от 50 до 120 мМ.

В некоторых примерах инсулин в стабильных совместных композициях, предусмотренных здесь, находится в количестве от 10 до 1000 ед./мл, от 50 до 500 ед./мл, от 100 до 1000 ед./мл или от 500 до 1000 ед./мл включительно. Например, количество быстродействующего инсулина составляет по меньшей мере или примерно составляет 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500 или 1000 ед./мл. В примере стабильной совместной композиции количество быстродействующего инсулина составляет или составляет примерно 100 ед./мл. В другом примере стабильной совместной композиции быстродействующий инсулин представляет собой аналог инсулина, и деградирующий гиалуронан фермент представляет собой PH20.

Стабильные совместные композиции необязательно включают буферный агент, включая, но не ограничиваясь этим, не связывающие металл вещества или связывающие металл вещества. В некоторых примерах буферный агент выбирают из Трис, гистидина, фосфата и цитрата. В примере стабильной совместной композиции буферный агент представляет собой Трис. Концентрация буферного агента находится между или примерно между 1 и 100 мМ, 10 и 50 мМ или 20 и 40 мМ. Например, концентрация буферного агента составляет, или составляет примерно, или по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 мМ или больше. В примере стабильной совместной композиции концентрация буферного агента составляет или составляет примерно 30 мМ.

Стабильные совместные композиции, предусмотренные здесь, включают эффективное против мик

- 6 033472 роорганизмов количество консерванта, которое убивает или ингибирует размножение микроорганизмов в образце композиции, такое, которое обеспечивает, по меньшей мере, снижение количества бактериальных организмов в 1,0 logic раз через 7 дней после инокуляции. В некоторых примерах эффективное против микроорганизмов количество консерванта убивает или ингибирует размножение микроорганизмов таким образом, что при проверке в тесте эффективности противомикробного консерванта (АРЕТ) после инокуляции композиции микробным инокулятом происходит снижение количества бактериальных организмов по меньшей мере в 1,0 log₁₀ раз через 7 дней после инокуляции, снижение количества бактериальных организмов по меньшей мере в 3,0 log₁₀ раз через 14 дней после инокуляции, по меньшей мере, не наблюдается дальнейшего роста бактериальных организмов через 28 дней после инокуляции и, по меньшей мере, не наблюдается дальнейшего роста грибковых организмов через 7 дней после инокуляции. В других примерах эффективное против микроорганизмов количество консерванта убивает или ингибирует размножение микроорганизмов таким образом, что при проверке в тесте эффективности противомикробного консерванта (АРЕТ) после инокуляции композиции микробным инокулятом происходит снижение количества бактериальных организмов по меньшей мере в 1,0 log₁₀ раз через 24 ч после инокуляции, снижение количества бактериальных организмов по меньшей мере в 3,0 log₁₀ раз через 7 дней после инокуляции, по меньшей мере, не наблюдается дальнейшего роста бактериальных организмов через 28 дней после инокуляции и происходит снижение количества грибковых организмов по меньшей мере в 1,0 log₁₀ раз через 14 дней после инокуляции и, по меньшей мере, не наблюдается дальнейшего роста грибковых организмов через 28 дней после инокуляции. Еще в одном примере эффективное против микроорганизмов количество консерванта убивает или ингибирует размножение микроорганизмов таким образом, что при проверке в тесте эффективности противомикробного консерванта (АРЕТ) после инокуляции композиции микробным инокулятом происходит снижение количества бактериальных организмов по меньшей мере в 2,0 log₁₀ раз через 6 ч после инокуляции, по меньшей мере, снижение количества бактериальных организмов по меньшей мере в 3,0 log₁₀ раз через 24 ч после инокуляции, бактериальные организмы не обнаруживаются через 28 дней после инокуляции композиции микробным инокулятом, происходит снижение количества грибковых организмов по меньшей мере в 2,0 log₁₀ раз через 7 дней после инокуляции и, по меньшей мере, не наблюдается дальнейшего роста грибковых организмов через 28 дней после инокуляции.

Консервант (консерванты) в стабильных совместных композициях могут включать один или несколько фенольных консервантов, не фенольных консервантов или фенольных консервантов и не фенольных консервантов. Например, консервант (консерванты) выбирают из фенола, м-крезола, метилпарабена, бензилового спирта, тимеросала, хлорида бензалкония, 4-хлор-1-бутанола, хлоргексидина дигидрохлорида, хлоргексидина диглюконата, L-фенилаланина, ЭДТА, бронопола, фенилртутьацетата, глицерола, имидомочевины, хлоргексидина, дегидроацетата натрия, о-крезола, п-крезола, хлоркрезола, цетримида, бензетония хлорида, этилпарабена, пропилпарабена, бутилпарабена и любой их комбинации, но не ограничиваясь этим. В некоторых примерах стабильная совместная композиция содержит единственный консервант. В других примерах стабильная совместная композиция содержит смесь 2, 3 или 4 разных консервантов. В некоторых примерах стабильная совместная композиция содержит по меньшей мере один фенольный консервант. В конкретном примере один или несколько консервантов представляют собой фенол, м-крезол или фенол и м-крезол.

Общее количество одного или нескольких консервирующих веществ, выраженное в процентном содержании концентрации по массе (массовой концентрации) (мас./об.) в стабильных совместных композициях составляет или составляет примерно между 0,1 и 0,4%, 0,1 и 0,3%, 0,15 и 0,325%, 0,15 и 0,25%, 0,1 и 0,2%, 0,2 и 0,3% или 0,3 и 0,4% включительно. В некотрых примерах консерванты представляют собой фенол и м-крезол, и количество, выраженное в % массовой концентрации (мас./об.), в композиции составляет или составляет примерно от 0,1 до 0,25% фенола и составляет или составляет примерно от 0,05 до 0,2% м-крезола, составляет или составляет примерно от 0,10 до 0,2% фенола и составляет или составляет примерно от 0,6 до 0,18% м-крезола, составляет или составляет примерно от 0,1 до 0,15% фенола и от 0,8 до 0,15% м-крезола, составляет или составляет примерно от 0,10 до 0,15% фенола и составляет или составляет примерно от 0,06 до 0,09% м-крезола или составляет или составляет примерно от 0,12 до 0,18% фенола и составляет или составляет примерно от 0,14 до 0,22% м-крезола. В примерах совместных композиций консервант (консерванты) представляют собой фенол и м-крезол, и количество, выраженное в % массовой концентрации (мас./об.), в композиции составляет или составляет примерно 0,1% фенола и 0,075% м-крезола, составляет или составляет примерно 0,1% фенола и 0,15% м-крезола, составляет или составляет примерно 0,125% фенола и 0,075% м-крезола, составляет или составляет примерно 0,13% фенола и 0,075% м-крезола, составляет или составляет примерно 0,13% фенола и 0,08% мкрезола, составляет или составляет примерно 0,15% фенола и 0,175% м-крезола или составляет или составляет примерно 0,17% фенола и 0,13% м-крезола.

Стабильные совместные композиции, предусмотренные здесь, содержат стабилизирующее вещество, выбранное из аминокислоты, производного аминокислоты, амина, сахара, полиола, соли и поверхностно-активного вещества (сурфактанта), но не ограничиваясь этим. В некоторых примерах стабильные совместные композиции содержат единственное стабилизирующее вещество. В других примерах ста- 7 033472 бильные совместные композиции содержат 2, 3, 4, 5 или 6 разных стабилизирующих веществ. В некоторых примерах стабилизирующее вещество представляет собой аминокислоту, производное аминокислоты или амин, выбранные из L-аргинина, глутамина, глутаминовой кислоты, глицина, лизина, метионина, пролина, Lys-Lys, Gly-Gly, оксида триметиламина (ТМАО), бетаина или их солей. В конкретном примере аминокислота представляет собой глицин или пролин. Концентрация аминокислоты находится между или примерно между 0,01 и 1М, 0,01 и 0,1М, 0,1 и 0,75М или 0,2 и 0,5М включительно. В некоторых примерах стабилизирующее вещество представляет собой сахар или полиол, выбранные из глицерола, сорбитола, маннитола, инозитола, сахарозы и трегалозы, но не ограничиваясь этим.

В примере стабильной совместной композиции стабилизирующее вещество представляет собой поверхностно-активное вещество и количество поверхностно-активного вещества, выраженное в % массовой концентрации (мас./об.) в композиции, составляет или составляет примерно от 0,005 до 1,0%, от 0,01 до 0,5%, от 0,01 до 0,1%, от 0,01 до 0,05% или от 0,01 до 0,02%. Например, стабилизирующее вещество представляет собой поверхностно-активное вещество и количество поверхностно-активного вещества, выраженное в % массовой концентрации (мас./объ.) в композиции, составляет или составляет примерно 0,001, 0,005, 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,08 или 0,9%. Поверхностно-активное вещество в стабильных совместных композициях может быть выбрано из полипропиленгликоля, полиэтиленгликоля, глицерина, сорбитола, полоксамера и полисорбата, но не ограничиваясь этим. Например, поверхностно-активное вещество выбирают из полоксамера 188, полисорбата 20 или полисорбата 80. В примере стабильной совместной композиции стабилизирующее вещество представляет собой поверхностно-активное вещество, которое является полоксамером 188 и которое предусмотрено в количестве, выраженном в % массовой концентрации (мас./об.) и составляющем между или примерно между 0,01 и 0,05%. В другом примере стабильной совместной композиции стабилизирующее вещество представляет собой поверхностно-активное вещество, которое является полисорбатом 20 и предусмотрено в количестве, выраженном в % массовой концентрации (мас./об.) и составляющем между или примерно между 0,01 и 0,05%. В еще одном примере стабильной совместной композиции стабилизирующее вещество представляет собой поверхностно-активное вещество, которое является полисорбатом 80 и предусмотрено в количестве, выраженном в % массовой концентрации (мас./об.) и составляющем между или примерно между 0,01 и 0,05%.

Стабильные совместные композиции необязательно включают модификатор тоничности, выбранный из глицерина, соли, аминокислот, многоатомных спиртов или трегалозы, но не ограничиваясь этим, для поддержания осмолярности между или примерно между 245 и 305 мОсм/кг. В некоторых примерах модификатор тоничности поддерживает осмолярность композиции на уровне или на уровне примерно 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 300 или 305 мОсм/кг. В примере стабильной совместной композиции модификатор тоничности поддерживает осмолярность композиции на уровне или на уровне примерно 275 мОсм/кг. В одном из примеров модификатор тоничности представляет собой глицерин, находящийся в совместной композиции в концентрации меньше чем 60 мМ, меньше чем 55 мМ, меньше чем 50 мМ, меньше чем 45 мМ, меньше чем 40 мМ, меньше чем 35 мМ, меньше чем 30 мМ, меньше чем 25 мМ, меньше чем 20 мМ, меньше чем 15 мМ или меньше чем 10 мМ. В примере стабильной совместной композиции быстродействующий инсулин представляет собой аналог инсулина, например инсулин аспарт, и композиция содержит глицерин в концентрации между или примерно между 20 и 50 мМ включительно. В другом примере стабильной совместной композиции быстродействующий инсулин представляет собой регулярный инсулин или инсулин лизпро, и композиция содержит глицерин в концентрации между или примерно между 40 и 60 мМ включительно.

В некоторых примерах стабильные совместные композиции, предусмотренные здесь, необязательно содержат антиоксидант. В других примерах стабильные совместные композиции необязательно содержат поверхностно-активное вещество и/или олигосахариды гиалуронана и также содержат антиоксидант. Антиоксидант, включенный в стабильные совместные композиции, выбирают из цистеина, триптофана и метионина, но не ограничиваясь этим. В примере стабильной совместной композиции антиоксидант представляет собой метионин. Антиоксидант в стабильных совместных композициях находится в концентрации между или примерно между 5 и 50 мМ, 5 и 40 мМ, 5 и 20 мМ или 10 и 20 мМ включительно. В одном примере антиокисдант представляет собой метионин, и концентрация метионина составляет между или примерно между 10 и 20 мМ.

Стабильные совместные композиции необязательно содержат цинк. Например, в одном из вариантов воплощения быстродействующий инсулин представляет собой регулярный инсулин, инсулин лизпро или инсулин аспарт, и композиция содержит цинк. Цинк в стабильных совместных композициях выбирают из оксида цинка, ацетата цинка или хлорида цинка, но не ограничиваясь этим, и он присутствует в концентрации между или примерно между 0,001 и 0,1 мг на 100 единиц инсулина (мг/100 ед.), 0,001 и 0,05 мг/100 ед. или 0,01 и 0,05 мг/100 ед.

Стабильные совместные композиции необязательно содержат никотиновое соединение, выбранное из никотинамида, никотиновой кислоты, ниацина, ниацинамида, витамина B₃ и/или их солей и/или любых их комбинаций, но не ограничиваясь этим. Никотиновое соединение (соединения) представлено в концентрации между или примерно между 1 и 150 мМ, от 10 и 150 мМ, от 50 и 100 мМ или примерно 80 мМ.

- 8 033472

Стабильные совместные композиции необязательно содержат одну или несколько аминокислот, выбранных из аргинина, глутаминовой кислоты и/или их солей и/или их комбинаций, но не ограничиваясь ими. Аминокислоты находятся в концентрации от 1 до 100 мМ, от 10 до 100 мМ или примерно 30, 50 или 80 мМ.

Например, стабильная совместная композиция имеет pH между или примерно между 7,0 и 7,6 и содержит деградирующий гиалуронан фермент, являющийся PH20, в количестве между или примерно между 100 и 1000 ед./мл включительно; быстродействующий аналог инсулина в количестве между или примерно между 10 и 1000 ед./мл включительно; буферный агент Трис в концентрации между или примерно между 10 и 50 мМ включительно; NaCl в концентрации между или примерно между 50 и 200 мМ включительно; метионин в концентрации между или примерно между 5 и 50 мМ включительно; глицерин в концентрации между или примерно между 0 и 50 мМ включительно; поверхностно-активное вещество, представляющее собой полоксамер 188, полисорбат 20 или полисорбат 80, в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,01 и 0,5%; и консервант (консерванты), содержащий фенол в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,1 и 0,25% и м-крезол в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,05 и 0,2%. В другом примере стабильная совместная композиции также содержит цинк в концентрации от 0,001 до 0,1 мг на 100 ед. инсулина (мг/100 ед.). В одном примере консерванты в стабильных совместных композициях представляют собой или представляют собой примерно 0,1% фенола и 0,015% м-крезола, 0,125% фенола и 0,075% м-крезола, 0,13% фенола и 0,075% м-крезола, 0,13% фенола и 0,08% м-крезола или 0,17% фенола и 0,13% м-крезола.

В одном примере стабильная совместная композиция имеет pH между или примерно между 7,0 и

7,6 и содержит быстродействующий инулин, например инсулин лизпро, в количестве между или примерно между 10 и 1000 ед./мл включительно; деградирующий гиалуронан фермент, который представляет собой PH20, в количестве между или примерно между 100 и 1000 ед./мл включительно; Трис буферный агент в концентрации между или примерно между 25 и 35 мМ включительно; NaCl в концентрации между или примерно между 50 и 120 мМ включительно; метионин в концентрации между или примерно между 10 и 30 мМ включительно; глицерин в концентрации между или примерно между 40 и 60 мМ включительно; поверхностно-активное вещество, представляющее собой полоксамер 188, полисорбат 20 или полисорбат 80, в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,01 и 0,05% включительно; цинк в концентрации 0,017 и 0,024 мг на 100 ед. инсулина (мг/100 ед.); и консервант (консерванты), который содержит в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,08 и 0,17% фенола включительно и между или примерно между 0,07 и 0,17% м-крезола. В одном из примеров концентрация NaCl составляет между или примерно между70 и 100 мМ. В другом примере pH составляет или составляет примерно 7,1±0,2, 7,2±0,2, 7,3±0,2 или 7,4±0,2. В одном из примеров консерванты в стабильных совместных композициях представляют собой или представляют собой примерно 0,1% фенола и 0,015% м-крезола, 0,125% фенола и 0,075% м-крезола, 0,13% фенола и 0,075% м-крезола, 0,13% фенола и 0,08% м-крезола или 0,17% фенола и 0,13% м-крезола.

В одном примере стабильная совместная композиция имеет pH между или примерно между 7,0 и

7,6 и содержит быстродействующий инсулин, например инсулин аспарт, в количестве между или примерно между 10 и 1000 ед./мл включительно; деградирующий гиалуронан фермент, представляющий собой PH20, в количестве между или примерно между 100 и 1000 ед./мл включительно; Трис буферный агент в концентрации между или примерно между 25 и 35 мМ включительно; NaCl в концентрации между или примерно между 80 и 160 мМ включительно; метионин в концентрации между или примерно между 10 и 30 мМ включительно; глицерин в концентрации между или примерно между 20 и 50 мМ включительно; поверхностно-активное вещество, представляющее собой полоксамер 188, полисорбат 20 или полисорбат 80, в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,01 и 0,05% включительно; цинк в концентрации от 0,017 до 0,024 мг на 100 ед. инсулина (мг/100 ед.); и консервант (консерванты), который содержит в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,08 и 0,17% фенола включительно и между или примерно между 0,07 и 0,17% м-крезола. В одном из примеров концентрация NaCl составляет или составляет примерно от 70 и 100 мМ. В другом примере pH составляет или составляет примерно 7,2±0,2, 7,3±0,2, 7,4±0,2 или 7,5±0,2. В одном примере консерванты в стабильных совместных композициях представляют собой или представляют собой примерно 0,1% фенола и 0,015% м-крезола, 0,125% фенола и 0,075% м-крезола, 0,13% фенола и 0,075% м-крезола, 0,13% фенола и 0,08% м-крезола или 0,17% фенола и 0,13% м-крезола.

В одном примере стабильная совместная композиция имеет pH между или примерно между 7,0 и

7,6 и содержит быстродействующий инсулин, например инсулин глулизин, в количестве между или примерно между 10 и 1000 ед./мл включительно; деградирующий гиалуронан фермент, представляющий собой PH20, в количестве между или примерно между 100 и 1000 ед./мл включительно; Трис буферный агент в концентрации между или примерно между 25 и 35 мМ включительно; NaCl в концентрации между или примерно между 80 и 200 мМ включительно; метионин в концентрации между или примерно между 10 и 30 мМ включительно; глицерин в концентрации между или примерно между 40 и 60 мМ вклю-

- 9 033472 чительно; поверхностно-активное вещество, представляющее собой полоксамер 188, в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,01 и 0,05% включительно; и консервант (консерванты), который имеет процентное содержание массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,08 и 0,17% фенола включительно, и между или примерно между 0,07 и 0,17% м-крезола. В одном примере концентрация NaCl составляет или составляет примерно от 100 до 150 мМ. В другом примере pH составляет или составляет примерно 7,2±0,2, 7,3±0,2, 7,4±0,2 или 7,5±0,2.

В одном из примеров PH20 в стабильных совместных композициях представляет собой человеческий PH20, который имеет аминокислотную последовательность, включающую, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 из SEQ ID NO: 1, или имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85, 90 или 95% идентична аминокислотной последовательности, содержащей, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 из SEQ ID NO: 1, и сохраняет гиалуронидазную активность. Например, полипептиды PH20 имеют аминокислотную последовательность, укороченную с С-конца после аминокислоты в положении 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, или представляют собой ее вариант, который по меньшей мере на 85, 90 или 95% идентичен аминокислотной последовательности, укороченной с Сконца после аминокислоты в положении 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, и сохраняет гиалуронидазную активность. В другом примере полипептид PH20 имеет аминокислотную последовательность, укороченную с С-конца после аминокислоты в положении 482 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, или представляет собой ее вариант, который по меньшей мере на 85, 90 или 95% идентичен аминокислотной последовательности, укороченной с С-конца после аминокислоты в положении 482 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, и сохраняет гиалуронидазную активность. В примере стабильной совместной композиции полипептид PH20 имеет аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 4-9. Деградирующий гиалуронан фермент или PH20 в стабильных совместных композициях может быть получен из или экспрессирован в клетках млекопитающих, например клетках яичника китайского хомячка (СНО). В конкретном примере в качестве PH20 предусмотрен rHuPH20.

Стабильные совместные композиции могут быть составлены для многоразового введения (введения множеством доз). Объем стабильных совместных композиций может составлять или составлять примерно от 0,5 до 50 мл, от 1 до 40 мл, от 1 до 20 мл, от 1 до 10 мл или от 3 до 10 мл включительно. Стабильные совместные композиции могут быть составлены для доставки с использованием флакона, шприца, шприц-ручки, резервуара помпы или системы с обратной связью. В конкретном примере стабильные совместные композиции составлены для доставки с помощью непрерывной подкожной инфузии инсулина, что обеспечивается системой с обратной связью.

Стабильные совместные композиции могут быть предусмотрены в шприцах или флаконах, системах с обратной связью, инсулиновых помпах и/или инсулиновой шприц-ручке.

Описаны способы, в которых вводят стабильные совместные композиции. Например, в настоящем документе описаны способы лечения диабета путем введения субъекту терапевтически эффективного количества стабильной совместной композиции, предусмотренной в настоящем документе. Подвергающийся лечению диабет включает сахарный диабет 1 типа, сахарный диабет 2 типа или гестационный диабет. Также в настоящем документе описаны способы контроля уровня сахара в крови у субъектов путем введения субъекту терапевтически эффективного количества стабильной совместной композиции, описанной в настоящем документе. В настоящем документе при осуществлении способов стабильные совместные композиции вводят подкожно или внутрибрюшинно, например, с помощью шприца или инсулиновой шприц-ручки или путем непрерывной подкожной инфузии. В настоящем документе при осуществлении способов стабильные совместные композиции могут быть введены перед приемом пищи в качестве прандиальной терапии. В описанных в настоящем документе способах стабильные композиции могут быть введены с использованием устройства доставки для достижения непрерывной подкожной инфузии инсулина, например, с помощью инсулиновой помпы или системы с обратной связью. В некоторых примерах описанные здесь способы включают введение других антидиабетических препаратов, выбранных из сульфонилмочевины, бигуанидов, меглитинидов, тиазолидиндионов, ингибиторов альфаглюкозидазы, аналогов пептидов, в том числе аналогов глюкагонподобного пептида (GLP) и аналогов желудочного ингибирующего пептида (GIP) и ингибиторов DPP-4, но не ограничиваясь этим.

Также здесь предусмотрены композиции, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента, где деградирующий гиалуронан фермент является гиалуронидазой, и лизил лизин (Lys-Lys) в количестве, достаточном для стабилизации деградирующего гиалуронан фермента. В некоторых примерах концентрация Lys-Lys находится между или примерно между 5 и 120 мМ, 10 и 100 мМ, 10 и 50 мМ, 30 и 110 мМ, 30 и 80 мМ, 50 и 100 мМ или 100 и 120 мМ. В других примерах концентрация Lys-Lys составляет по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, или составляет 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 или 120 мМ. Здесь предусмотрены композиции, содержащие

- 10 033472 терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и лизил лизин (Lys-Lys) в количестве, достаточном для того, чтобы деградирующий гиалуронан фермент сохранял по меньшей мере 50% от начальной гиалуронидазной активности в течение по меньшей мере 3 дней при 37°С. В некоторых примерах деградирующий гиалуронан фермент сохраняет по меньшей мере 50% от начальной гиалуронидазной активности при 37°С в течение по меньшей мере 4, 5, 6 дней, одной недели, двух недель, трех недель, одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев или больше. В конкретном примере деградирующий гиалуронан фермент сохраняет по меньшей мере 50% от начальной гиалуронидазной активности в течение по меньшей мере одного месяца при 37°С. В других примерах деградирующий гиалуронан фермент сохраняет по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или больше от начальной гиалуронидазной активности.

В некоторых примерах предусмотренных композиций pH композиции находится между или примерно между 6,5 и 8,0, 6,5 и 7,4, 6,8 и 7,8, 7,0 и 7,6 или 6,8 и 7,2 включительно. Например, pH композиций составляет или составляет примерно или по меньшей мере 6,5±0,2, 6,6±0,2, 6,7±0,2, 6,8±0,2, 6,9±0,2, 7,0±0,2, 7,1±0,2, 7,2±0,2, 7,3±0,2, 7,4±0,2, 7,5±0,2, 7,6±0,2, 7,7±0,2 или 7,8±0,2.

Любая из предусмотренных композиций, содержащая терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и лизил лизина (Lys-Lys), может также содержать стабилизирующее вещество. Например, композиции могут содержать стабилизирующее вещество, выбранное из аминокислоты, производного аминокислоты, амина, сахара, полиола, соли и поверхностно-активного вещества. В некоторых примерах стабилизирующее вещество представляет собой поверхностно-активное вещество, и количество поверхностно-активного вещества, выраженное в % массовой концентрации (мас./об.) в композиции, составляет между или примерно между 0,0005 и 1,0%, 0,0005 и 0,005%, 0,001 и 0,01%, 0,01 и 0,5%, 0,01 и 0,1%, 0,01 и 0,05% или 0,01 и 0,02% включительно. В других примерах стабилизирующее вещество представляет собой поверхностно-активное вещество, и количество поверхностно-активного вещества, выраженное в % массовой концентрации (мас./об.) в композиции, составляет или составляет примерно или составляет по меньшей мере 0,001, 0,005, 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,08 или 0,9%. Поверхностно-активное вещество может быть выбрано из полипропиленгликоля, полиэтиленгликоля, глицерина, сорбитола, полоксамера и полисорбата. В конкретном примере поверхностно-активное вещество выбирают из полоксамера 188, полисорбата 20 и полисорбата 80.

В некоторых примерах предусмотренные композиции, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и лизил лизина (Lys-Lys), также содержат антиоксидант. Например, композиции содержат антиоксидант, выбранный из цистеина, триптофана и метионина. В конкретном примере антиоксидант представляет собой метионин. В некоторых примерах антиоксидант находится в концентрации между или примерно между 5 и 50 мМ, от 5 и 40 мМ, от 5 и 20 мМ или от 10 и 20 мМ включительно. В других примерах антиоксидант находится в концентрации, которая составляет или составляет примерно или составляет по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 мМ.

В некоторых примерах предусмотренные композиции, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и лизил лизина (Lys-Lys), также содержат модификатор тоничности для поддержания осмолярности между или примерно между 245 и 500 мОсм/кг включительно. В некоторых примерах композиции содержат модификатор тоничности для поддержания осмолярности композиции на уровне примерно или по меньшей мере примерно или на уровне 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 300, 350, 400, 450 или 500 мОсм/кг. В некоторых примерах модификатор тоничности выбирают из глицерина, NaCl, аминокислот, многоатомных спиртов или трегалозы. В конкретном примере модификатор тоничности представляет собой NaCl, и концентрация NaCl составляет или составляет примерно от 20 до 200 мМ, от 40 до 160 мМ, от 80 до 120 мМ, от 20 до 80 мМ или от 50 до 150 мМ включительно. В других примерах модификатор тоничности представляет собой NaCl, и концентрация NaCl составляет от 0 до 150 мМ, от 10 до 50 мМ, от 50 до 100 мМ, от 100 до 130 мМ. В некотором примере NaCl находится в концентрации меньше чем 150 мМ, меньше чем 140 мМ, меньше чем 130 мМ, меньше чем 120 мМ, меньше чем 110 мМ, меньше чем 100 мМ, меньше чем 90 мМ, меньше чем 80 мМ, меньше чем 70 мМ, меньше чем 60 мМ, меньше чем 50 мМ, меньше чем 40 мМ, меньше чем 30 мМ, меньше чем 20 мМ, меньше чем 10 мМ или меньше.

Любая из предусмотренных композиций, содержащих терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и лизил лизина (Lys-Lys), также может содержать достаточное количество буферного агента для поддержания pH в диапазоне между или примерно между 6,5 и 8,0, 6,8 и 7,8 или 7,0 и 7,6, 6,5 и 7,2, 6,8 и 7,4 включительно. В некоторых примерах буферный агент выбирают из Трис, гистидина, фосфата и цитрата. В конкретном примере буферный агент представляет собой фосфат, а именно фосфат натрия. В другом конкретном примере буферный агент представляет собой Трис. В некоторых примерах концентрация буферного агента в композиции находится между или примерно между 1 и 100 мМ, 10 и 80 мМ, 5 и 50 мМ или 20 и 40 мМ включительно.

Деградирующий гиалуронан фермент в любой из предусмотренных композиций, содержащих терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и лизил лизина (Lys-Lys),

- 11 033472 может представлять собой гиалуронидазу. В некоторых примерах деградирующий гиалуронан фермент представляет собой гиалуронидазу, активную при нейтральном pH. В некоторых примерах деградирующий гиалуронан фермент не имеет гликозилфосфатидилинозитольного (GPI) якоря или не связан с мембраной при экспрессии из клетки. В других примерах деградирующий гиалуронан фермент представляет собой деградирующий гиалуронан фермент, укороченный с С-конца на один или несколько аминокислотных остатков для удаления всего или части GPI якоря.

В других примерах предусмотренных композиций деградирующий гиалуронан фермент представляет собой гиалуронидазу, которая является PH20 или его укороченным с С-конца фрагментом. В некоторых примерах деградирующий гиалуронан фермент представляет собой PH20, являющийся не человеческим или человеческим PH20. В некоторых примерах PH20 имеет аминокислотную последовательность, которая содержит, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 из SEQ ID NO: 1, или имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности, содержащей, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 из SEQ ID NO: 1, и сохраняет гиалуронидазную активность. Например, PH20 по меньшей мере на 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен аминокислотной последовательности, содержащей, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 из SEQ ID NO: 1, и сохраняет гиалуронидазную активность. В некоторых примерах композиций деградирующий гиалуронан фермент представляет собой полипептид PH20, который имеет аминокислотную последовательность, укороченную с С-конца после аминокислоты в положении 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, или представляет собой ее вариант, который по меньшей мере на 85% идентичен аминокислотной последовательности, укороченной с С-конца после аминокислоты в положении 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, и сохраняет гиалуронидазную активность. В конкретных примерах деградирующий гиалуронан фермент представляет собой укороченный с С-конца PH20, который имеет аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 4-9.

В некоторых примерах предусмотренных композиций количество деградирующего гиалуронан фермента составляет или составляет примерно от 10 до 5000 ед./мл, от 50 до 4000 ед./мл, от 100 до 2000 ед./мл, от 300 до 2000 ед./мл, от 600 до 2000 ед./мл, от 100 до 1000 ед./мл, от 200 до 800 ед./мл, от 100 до 500 ед./мл или от 150 до 300 ед./мл включительно. Например, количество деградирующего гиалуронан фермента составляет по меньшей мере или примерно или составляет 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 или 2000 ед./мл.

В некоторых примерах композиций, содержащих терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и лизил лизина (Lys-Lys), концентрация Lys-Lys составляет от 5 до 50 мМ включительно. Например, концентрация Lys-Lys составляет по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 30 или 50 мМ и/или меньше чем 50, 40, 30, 20 или 10 мМ.

Здесь предусмотрены композиции, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и лизил лизина (Lys-Lys), где pH композиции находится между или примерно между 6,5 и 7,2, и композиция содержит деградирующий гиалуронан фермент в количестве между или примерно между 100 и 500 ед./мл включительно; Lys-Lys в концентрации между или примерно между 5 и 30 мМ включительно; NaCl в концентрации меньше чем 140 мМ NaCl; поверхностно-активное вещество, представляющее собой полисорбат 80, в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,01 и 0,05% включительно; метионин в концентрации между или примерно между 5 мМ и 20 мМ, включительно; и натрия фосфат в концентрации между или примерно между 5 и 50 мМ включительно. В некоторых примерах деградирующий гиалуронан фермент представляет собой PH20 или его фрагмент, укороченный с С-конца.

В некоторых примерах объем предусмотренных композиций составляет между или примерно между 0,5 и 50 мл, 1 и 40 мл, 1 и 20 мл, 1 и 10 мл или 3 и 10 мл включительно. Композиции могут быть составлены для доставки с использованием флакона, шприца, шприц-ручки, резервуара помпы или системы с обратной связью. Также здесь предусмотрены шприц или флакон, содержащие любую из предусмотренных здесь композиций.

Также здесь предусмотрены композиции, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента, лизил лизин (Lys-Lys) в количестве, достаточном для стабилизации деградирующего гиалуронан фермента, и быстродействующий инсулин. В некоторых примерах концентрация Lys-Lys составляет от 30 до 120 мМ, от 50 до 105 мМ или от 80 до 100 мМ включительно. В предусмотренных композициях быстродействующий инсулин может быть мономерным, димерным или гексамерным. В некоторых примерах быстродействующий инсулин представляет собой быстродействующий человеческий инсулин. В других примерах быстродействующий инсулин представляет собой регулярный инсулин. В конкретном примере быстродействующий инсулин представляет собой регулярный инсулин, являющийся человеческим инсулином или свиным инсулином. В некоторых примерах быстро

- 12 033472 действующий инсулин представляет собой регулярный инсулин, являющийся инсулином с А цепью, имеющей аминокислотную последовательностью, приведенную в SEQ ID NO: 103, и В цепью, имеющей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 104, или инсулином с А цепью, имеющей аминокислотную последовательность, приведенную как аминокислотные остатки в положениях 88-108 в SEQ ID NO: 123, и В цепью, имеющей аминокислотную последовательность, приведенную как аминокислотные остатки в положениях 25-54 в SEQ ID NO: 123. В других примерах предусмотренных композиций быстродействующий инсулин представляет собой рекомбинантный инсулин. Быстродействующий инсулин может быть синтезированным или частично синтезированным. В некоторых примерах инсулин является выделенным.

В других примерах предусмотренных композиций быстродействующий инсулин представляет собой аналог инсулина. В некоторых примерах аналог инсулина выбирают из инсулина аспарта, инсулина лизпро и инсулина глулизина. Например, аналог инсулина выбирают из инсулина, имеющего А-цепь с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ NO: 103, и В-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ NO: 147-149. В любой из предусмотренных композиций быстродействующий инсулин может находиться в количестве между или примерно между 10 и 1000 ед./мл, 20 и 500 ед./мл, 50 и 300 ед./мл или 200 и 800 ед./мл включительно. Например, количество быстродействующего инсулина составляет, по меньшей мере, или составляет примерно, или составляет 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 ед./мл.

В конкретных примерах предусмотренных композиций, содержащих терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента, лизил лизин (Lys-Lys) в количестве, достаточном для стабилизации деградирующего гилуронан фермента, и быстродействующего инсулина, быстродействующий инсулин представляет собой аналог инсулина, и деградирующий гиалуронан фермент представляет собой PH20 или его фрагмент, укороченный с С-конца. В конкретном примере быстродействующий инсулин представляет собой аналог инсулина, например глулизин, и концентрация Lys-Lys составляет от 50 до 105 мМ. В другом примере быстродействующий инсулин представляет собой аналог инсулина, например инсулин аспарт или инсулин лизпро, и концентрация Lys-Lys составляет от 80 до 100 мМ.

Любые из предусмотренных здесь композиций, содержащих терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента, лизил лизин (Lys-Lys) в количестве, достаточном для стабилизации деградирующего гилуронан фермента, и быстродействующий инсулин, могут предназначаться для однократного введения (введения одной дозой) или для многократного введения (введения множеством доз). В примерах, где композиции предназначены для многократного введения, композиция содержит эффективное против микроорганизмов количество консерванта или смеси консервантов. Консервант (консерванты) в композиции может содержать один или несколько фенольных консервантов, не фенольных консервантов или фенольных консервантов и не фенольных консервантов. В некоторых примерах консервант (консерванты) выбирают из фенола, м-крезола, метилпарабена, бензилового спирта, тимеросала, хлорида бензалкония, 4-хлор-1-бутанола, хлоргексидина дигидрохлорида, хлоргексидина диглюконата, L-фенилаланина, ЭДТА, бронопола, ацетата фенилртути, глицерола, имидомочевины, хлоргексидина, дегидроацетата натрия, о-крезола, п-крезола, хлоркрезола, цетримида, бензетония хлорида, этилпарабена, пропилпарабена, бутилпарабена и любой их комбинации. В некоторых примерах предусмотренных здесь композиций для многократного введения композиция содержит единственный консервант. В других примерах предусмотренных здесь композиций для многократного введения композиция содержит смесь консервантов, содержащую 2, 3 или 4 разных консерванта. В некоторых примерах композиции содержат по меньшей мере один фенольный консервант. В других примерах консервант (консерванты) представляет собой фенол, м-крезол или фенол и м-крезол.

В некоторых примерах предусмотренных композиций общее количество одного или нескольких консервантов, выраженное в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.), в композиции составляет или составляет от 0,1 до 0,4%, от 0,1 до 0,3%, от 0,15 до 0,325%, от 0,15 до 0,25%, от 0,1 до 0,2%, от 0,2 до 0,3% или от 0,3 до 0,4% включительно. В конкретных примерах предусмотренных композиций, где консерванты представляют собой фенол и м-крезол, количество, выраженное в % массовой концентрации (мас./об.), в композиции составляет или составляет примерно от 0,1 до 0,25% фенола и составляет или составляет примерно от 0,05 до 0,2% м-крезола, составляет или составляет примерно от 0,10 до 0,2% фенола и составляет или составляет примерно от 0,06 до 0,18% м-крезола, составляет или составляет примерно от 0,1 до 0,15% фенола и от 0,08 до 0,15% м-крезола, составляет или составляет примерно от 0,10 до 0,15% фенола и составляет или составляет примерно от 0,06 до 0,09% м-крезола, или составляет или составляет примерно от 0,12 до 0,18% фенола и составляет или составляет примерно от 0,14 до 0,22% м-крезола включительно. В других конкретных примерах предусмотренных композиций, где консерванты проедставляют собой фенол и м-крезол, количество, выраженное в % массовой концентрации (мас./об.), в композиции составляет или составляет примерно 0,1% фенола и 0,075% м-крезола, составляет или составляет примерно 0,1% фенола или 0,15% м-крезола, составляет или составляет примерно 0,125% фенола и 0,075% м-крезола, составляет или составляет примерно 0,13% фенола и 0,075% м-крезола, составляет или составляет примерно 0,13% фенола и 0,08% м-крезола, составляет или составляет примерно 0,15% фенола и 0,175% м-крезола или составляет или составляет примерно 0,17% фенола

- 13 033472 и 0,13% м-крезола.

Здесь предусмотрены композиции, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента, лизил лизин (Lys-Lys) в количестве, достаточном для стабилизации деградирующего гилуронан фермента, и быстродействующий инсулин, где pH композиции составляет или составляет примерно от 6,8 до 7,4; и композиция содержит деградирующий гиалуронан фермент, представляющий собой PH20, в количестве между или примерно между 100 и 1000 ед./мл включительно; быстродействующий аналог инсулина, представляющий собой инсулин глулизин в количестве между или примерно между 10 и 1000 ед./мл включительно; Lys-Lys в концентрации между или примерно между 50 и 105 мМ включительно; NaCl в концентрации меньше чем 100 мМ; поверхностно-активное вещество, представляющее собой полисорбат 20, в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,0005 и 0,005% включительно; метионин в концентрации между или примерно между 5 и 20 мМ включительно и консервант (консерванты), содержащий фенол в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,1 и 0,25% и м-крезол в мас./об. между или примерно между 0,05 и 0,2%.

Здесь предусмотрены композиции, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента, лизил лизин (Lys-Lys) в количестве, достаточном для стабилизации деградирующего гилуронан фермента, и быстродействующий инсулин, где pH композиции составляет или составляет примерно от 6,8 до 7,4; и композиция содержит деградирующий гиалуронан фермент, представляющий собой PH20, в количестве между или примерно между 100 и 1000 ед./мл включительно; быстродействующий аналог инсулина, представляющий собой инсулин аспарт или инсулин лизпро в количестве между или примерно между 10 и 1000 ед./мл включительно; Lys-Lys в концентрации между или примерно между 80 и 100 мМ включительно; NaCl в концентрации меньше чем 30 мМ; поверхностноактивное вещество, представляющее собой полисорбат 20, в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,0005 и 0,005% включительно; метионин в концентрации между или примерно между 5 и 20 мМ включительно; и консервант (консерванты), содержащий фенол в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,1 и 0,25% и мкрезол в % мас./об. между или примерно между 0,05 и 0,2%.

В некоторых примерах объем предусмотренных композиций составляет или составляет примерно от 0,5 до 50 мл, от 1 до 40 мл, от 1 до 20 мл, от 1 до 10 мл или от 3 до 10 мл включительно. Композиции могут быть составлены для доставки с использованием флакона, шприца, шприц-ручки, резервуара помпы или системы с обратной связью. В некоторых примерах композиции составлены для доставки с помощью непрерывной подкожной инфузии инсулина. Также здесь предусмотрены шприц или флакон, содержащие любую из предусмотренных здесь композиций.

Здесь описаны композиции, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и MgCl2 в достаточном количестве, чтобы деградирующий гиалуронан фермент сохранял по меньшей мере 50% начальной гиалуронидазной активности в течение по меньшей мере трех дней при 37°С. В некоторых примерах композиции содержат MgCl₂ в концентрации между или примерно между 50 и 150 мМ, 75 и 125 мМ или 80 и 100 мМ включительно. Например, композиции содержат MgCl2 в концентрации, которая составляет по меньшей мере, или составляет примерно, или составляет 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 мМ. В некоторых примерах композиций деградирующий гиалуронан фермент сохраняет по меньшей мере 50% начальной гиалуронидазной активности при 37°С в течение по меньшей мере 4, 5, 6 дней, одной недели, двух недель, трех недель, одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев или больше. Например, деградирующий гиалуронан фермент сохраняет по меньшей мере 50% начальной гиалуронидазной активности в течение по меньшей мере одного месяца при 37°С, например по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или больше от начальной гиалуронидазной активности.

Описанные композиции, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и MgCl₂, могут иметь pH в диапазоне между или примерно между 6,5 и 8,0, 6,5 и 7,4, 6,8 и 7,8, 7,0 и 7,6 или 6,8 и 7,2. В некоторых примерах pH композиции составляет или составляет примерно или по меньшей мере 6,5±0,2, 6,6±0,2, 6,7±0,2, 6,8±0,2, 6,9±0,2, 7,0±0,2, 7,1±0,2, 7,2±0,2, 7,3±0,2, 7,4±0,2, 7,5±0,2, 7,6±0,2, 7,7±0,2 или 7,8±0,2. Композиции могут также содержать стабилизирующий агент, выбранный из аминокислоты, производного аминокислоты, амина, сахара, полиола, соли и поверхностно-активного вещества. В некоторых примерах стабилизирующий агент представляет собой поверхностно-активное вещество, и количество поверхностно-активного вещества, выраженное в % массовой концентрации (мас./об.), в композиции составляет между или примерно между 0,0005 и 1,0%, 0,0005 и 0,005%, 0,001 и 0,01%, 0,01 и 0,5%, 0,01 и 0,1%, 0,01 и 0,05% или 0,01 и 0,02% включительно. Например, стабилизирующий агент представляет собой поверхностно-активное вещество, и количество поверхностно-активного вещества, выраженное в % массовой концентрации (мас./об.), в композиции составляет или составляет примерно или по меньшей мере 0,001, 0,005, 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,08 или 0,9%. В некоторых примерах поверхностноактивное вещество выбирают из полипропиленгликоля, полиэтиленгликоля, глицерина, сорбитола, по- 14 033472 локсамера и полисорбата. В конкретных примерах поверхностно-активное вещество выбирают из полоксамера 188, полисорбата 20 и полисорбата 80.

В некоторых примерах композиции, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и MgCl₂, содержат антиоксидант, выбранный из цистеина, триптофана и метионина. В конкретных примерах антиоксидантом является метионин. В некоторых примерах концентрация антиоксиданта находится между или примерно между 5 и 50 мМ, 5 и 40 мМ, 5 и 20 мМ или 10 и 20 мМ включительно. Например, антиоксидантом является метионин, и его концентрация составляет или составляет примерно или по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 мМ. В некоторых примерах композиции содержат достаточное количество буферного агента для поддержания pH в диапазоне между или примерно между 6,5 и 8,0, 6,8 и 7,8, 7,0 и 7,6, 6,5 и 7,2 или 6,8 и 7,4. В некоторых примерах буферный агент выбирают из Трис, гистидина, фосфата и цитрата. В конкретном примере буферный агент представляет собой гистидин гидрохлорид. Концентрация буферного агента в предусмотренных композициях может быть между или примерно между 1 и 100 мМ, 10 и 80 мМ, 5 и 50 мМ или 20 и 40 мМ.

В некоторых примерах композиции, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и MgCl₂, содержат деградирующий гиалуронан фермент, являющийся гиалуронидазой или хондроитиназой. В некоторых примерах деградирующий гиалуронан фермент представляет собой гиалуронидазу, активную при нейтральном pH. В некоторых примерах деградирующий гиалуронан фермент не имеет гликозилфосфатидилинозитольного (GPI) якоря и не связан с мембраной при экспрессии из клетки. Например, деградирующий гиалуронан фермент представляет собой деградирующий гиалуронан фермент, укороченный с С-конца на один или несколько аминокислотных остатков для удаления всего или части GPI якоря.

В некоторых примерах деградирующий гиалуронан фермент представляет собой гиалуронидазу PH20 или ее укороченный с С-конца фрагмент. PH20 может быть не человеческой или человеческой PH20. В некоторых примерах композиций PH20 имеет аминокислотную последовательность, которая содержит, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 из SEQ ID NO: 1, или имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности, содержащей, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 из SEQ ID NO: 1, и сохраняет гиалуронидазную активность. Например, PH20 по меньшей мере на 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, содержащей, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 из SEQ ID NO: 1, и сохраняет гиалуронидазную активность. В некоторых вариантах полипептиды PH20 имеют аминокислотную последовательность, укороченную с С-конца после аминокислот в положениях 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, или представляют собой вариант, который по меньшей мере на 85% идентичен аминокислотной последовательности, укороченной с С-конца после аминокислот в положениях 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, и сохраняет гиалуронидазную активность. В конкретных примерах деградирующий гиалуронан фермент представляет собой укороченный с С-конца PH20, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 4-9.

В некоторых примерах композиции, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и MgCl2, содержат деградирующий гиалуронан фермент в количестве между или примерно между 10 и 5000 ед./мл, 50 и 4000 ед./мл, 100 и 2000 ед./мл, 300 и 2000 ед./мл, 600 и 2000 ед./мл, 100 и 1000 ед./мл, 200 и 800 ед./мл, 100 и 500 ед./мл или 150 и 300 ед./мл включительно. Например, композиции содержат деградирующий гиалуронан фермент в количестве, которое по меньшей мере или примерно или составляет 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 или 2000 ед./мл.

Здесь описаны композиции, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента и MgCl₂, где pH композиции находится в диапазоне между или примерно между 6,5 и 7,2, и композиция содержит деградирующий гиалуронан фермент в количестве между или примерно между 100 и 500 ед./мл включительно; MgCl₂ в концентрации между или примерно между 50 и 150 мМ включительно; поверхностно-активное вещество, которое представляет собой полисорбат 80, в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,01 и 0,05% включительно; метионин в концентрации между или примерно между 5 и 20 мМ включительно; и гистидин/HCl в концентрации между или примерно между 5 и 50 мМ включительно.

В некоторых примерах объем композиций составляет между или примерно между 0,5 и 50 мл, 1 и 40 мл, 1 и 20 мл, 1 и 10 мл или 3 и 10 мл включительно. Композиции могут быть созданы для доставки с использованием флакона, шприца, шприц-ручки, резервуара помпы или системы с обратной связью. Также здесь описан шприц или флакон, содержащие любую из описанных композиций.

Описанные здесь композиции, содержащие инсулин, например регулярный инсулин или быстродействующий аналог инсулина (например, аспарт, лизпро или глулизин или другие аналоги инсулина),

- 15 033472 могут быть использованы в способах и применениях для лечения диабета. Например, здесь описаны способы лечения диабета путем введения субъекту терапевтически эффективного количества любой из вышеуказанных стабильных композиций, предусмотренных здесь. Подвергающийся лечению диабет включает сахарный диабет 1 типа, сахарный диабет 2 типа или гестационный диабет. Также описаны способы контроля уровня глюкозы в крови у субъектов путем введения терапевтически эффективного количества предусмотренной здесь стабильной композиции, содержащей быстродействующий инсулин. При осуществлении способов по настоящему документу стабильные композиции вводят подкожно или внутрибрюшинно, например, с помощью шприца или инсулиновой шприц-ручки или путем непрерывной подкожной инфузии. При осуществлении способов по настоящему документу стабильные композиции можно вводить перед приемом пищи в качестве прандиальной инсулиновой терапии. В описанных здесь способах стабильные композиции можно вводить с использованием устройства доставки для достижения непрерывной подкожной инфузии инсулина, например, с помощью инсулиновой помпы или системы с обратной связью. В некоторых примерах предусмотренные здесь способы включают введение других антидиабетических препаратов, выбранных из сульфонилмочевины, бигуанидов, меглитинидов, тиазолидиндионов, ингибиторов альфа-глюкозидазы, аналогов пептидов, в том числе аналогов глюкагонподобного пептида (GLP) и аналогов желудочного ингибирующего пептида (GIP) и ингибиторов DPP-4, но не ограничиваясь ими.

Подробное описание изобретения

A. Определения.

B. Композиции деградирующего гиалуронан фермента и создание совместных композиций с инсулином.

1. Композиции деградирующего гиалуронан фермента.

2. Композиции быстродействующего инсулина.

3. Совместные композиции деградирующего гиалуронан фермента и инсулина.

a) . Противоположные требования к стабильности

i) консерванты;

ii) NaCl и pH.

b) . Совместимая совместная композиция.

C. Деградирующие гиалуронан ферменты.

1. Гиалуронидазы.

а). Гиалуронидазы млекопитающих PH20.

2. Укороченные гиалуронидазы и другие растворимые формы.

a) . Человеческий PH20, укороченный с С-конца.

b) . rHuPH20.

3. Гликозилирование деградирующих гиалуронан ферментов.

4. Модификации деградирующих гиалуронан ферментов для улучшения их фармакокинетических свойств.

D. Стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента.

1. Деградирующий гиалуронан фермент.

2. Двухвалетный катион.

3. pH и буфер.

4. Поверхностно-активное вещество.

5. Антиоксидантный агент.

6. Модификатор тоничности.

7. Другие агенты и вспомогательные вещества.

8. Примеры стабильных совместных композиций деградирующего гиалуронан фермента.

E. Полипептиды инсулина.

Быстродействующие инсулины.

a) . Регулярный инсулин.

b) . Быстродействующие аналоги (также называемые быстродействующими инсулинами)

i) инсулин лизпро;

ii) инсулин аспарт;

iii) инсулин глулизин.

F. Стабильные совместные композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента.

1. Компоненты стабильных совместных композиций.

a) . Быстродействующий инсулин.

b) . Деградирующий гиалуронан фермент.

c) . Консервант.

d) . NaCl.

e) . pH.

f) . Буфер.

g) . Lys-Lys.

- 16 033472

h) . Примеры дополнительных вспомогательных веществ или стабилизаторов

i) поверхностно-активное вещество;

ii) модификатор тоничности;

iii) глицерин;

iv) антиоксиданты;

v) цинк;

vi) аминокислотный стабилизатор;

vii) ингибитор гиалуронидазы;

viii) никотиновое соединение;

ix) другие вспомогательные вещества или агенты.

2. Примеры стабильных совместных композиций.

a) . Примеры совместных композиций для многократного введения (MDI).

b) . Примеры композиций для непрерывной подкожной инфузии инсулина (CSII).

c) . Примеры Lys-Lys совместных композиций.

G. Дозировки и введение. Способ введения.

a) . Шприцы.

b) . Инсулиновая шприц-ручка.

c) . Инсулиновые помпы и другие устройства доставки инсулина.

d) . Помповые системы непрерывной инфузии

i) системы без обратной связи;

ii) системы с обратной связью.

H. Способы получения нуклеиновых кислот, кодирующих инсулин или деградирующий гиалуронан фермент и их полипептиды.

I. Векторы и клетки.

2. Линкерные фрагменты.

3. Экспрессия.

a) . Прокариотические клетки.

b) . Дрожжевые клетки.

c) . Клетки насекомых.

d) . Клетки млекопитающих.

e) . Растения.

4. Технологии очистки.

I. Способы оценки стабильности и активности.

1. Инсулин.

2. Деградирующие гиалуронан ферменты.

J. Терапевтическое применение.

1. Сахарный диабет.

a) . Диабет 1 типа.

b) . Диабет 2 типа.

c) . Гестационный диабет.

2. Инсулиновая терапия для критически больных пациентов.

K. Комбинированная терапия.

L. Изделия и наборы.

M. Примеры.

А. Определения.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой относится изобретение (изобретения). Все патенты, патентные заявки, опубликованные заявки и публикации, последовательности GenBank, базы данных, веб-сайты и другие опубликованные материалы, указанные в описании, если не указано иное, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. В том случае, если существует множество определений терминов, используемых в данном описании, указанные в этом разделе определения предпочтительны. При ссылке на URL или другой такой идентификатор или адрес следует понимать, что такие идентификаторы могут измениться и конкретная информация в интернете может появляться и исчезать, но эквивалентная информация является известной и ее можно легко найти, например, с помощью функции поиска в интернете или соответствующих базах данных. Ссылка на это доказывает наличие и публичное распространение такой информации.

В настоящем документе инсулин относится к гормону, его предшественнику или синтетическому или рекомбинантному аналогу, который действует, чтобы увеличить поглощение и хранение глюкозы и/или уменьшить эндогенную продукцию глюкозы. В качестве примера человеческий инсулин транслируется в виде 110-аминокислотного полипептида-предшественника, препроинсулина (SEQ ID NO: 101), содержащего сигнальный пептид из 24 аминокислот, который направляет белок в эндоплазматический ретикулум (ER), где сигнальная последовательность отщепляется, в результате чего образуется проинсу

- 17 033472 лин (SEQ ID NO: 102). Проинсулин обрабатывается далее, чтобы освободить С- (или соединительный) пептид из 31 аминокислот (соответствующей аминокислотным остаткам от 57 до 87 полипептида препроинсулина, приведенного в SEQ ID NO: 101, и аминокислотным остаткам от 33 до 63 полипептида проинсулина, приведенного в SEQ ID NO: 102). В результате инсулин содержит А-цепь из 21 аминокислоты (соответствующую аминокислотным остаткам от 90 до 110 полипептида препроинсулина, приведенного в SEQ ID NO: 101, и аминокислотным остаткам от 66 до 86 полипептида проинсулина, приведенного в SEQ ID NO: 102) и В-цепь из 30 аминокислот (соответствующую аминокислотным остаткам от 25 до 54 полипептида препроинсулина, приведенного в SEQ ID NO: 101, и аминокислотным остаткам от 1 до 30 из полипептида проинсулина, приведенного в SEQ ID NO: 102), которые сшиты дисульфидными связями. Надлежащим образом сшитый инсулин человека содержит три дисульфидных мостика: один между остатком в положении 7 А-цепи и остатком в положении 7 В-цепи, второй между остатком в положении 20 А-цепи и остатком в положении 19 В-цепи и третий между остатками в положениях 6 и 11 А-цепи. Указание инсулина включает полипептиды препроинсулина, проинсулина и инсулина в одноцепочечной или двухцепочечной форме, их укороченные формы, которые имеют активность инсулина, и включает аллельные варианты и видовые варианты, варианты, кодируемые вариантами сплайсинга, и другие варианты, такие как аналоги инсулина, в том числе полипептиды, которые имеют по меньшей мере 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность последовательности с полипептидом-предшественником, приведенным в SEQ ID NO: 101, или его зрелой формой. Примеры аналогов инсулина включают такие, которые приведены в SEQ ID NO: 147-149, 152, и такие, которые содержат А-цепь, приведенную в SEQ ID NO: 150, 156, 158, 160, 162 и 164, и/или В-цепь, приведенную в SEQ ID NO: 151, 153-155, 157, 159, 161, 163 и 165.

Примеры полипептидов инсулина представляют собой полипептиды млекопитающих, в том числе человека. Примеры аминокислотных последовательностей инсулина человеческого происхождения приведены в SEQ ID NO: 101-104. Примеры аналогов инсулина включают аналоги, приведенные в SEQ ID NO: 147-149, 152, и аналоги, которые содержат А-цепь, приведенную в SEQ ID NO: 150, 156, 158, 160, 162 и 164, и/или В-цепь, приведенную в SEQ ID NO: 151, 153-155, 157, 159, 161, 163 и 165. Полипептиды инсулина также включают любой из инсулинов не человеческого происхождения, включая, но не ограничиваясь ими, любой из полипептидов-предшественников инсулина, приведенных в SEQ ID NO: 105146. Указание инсулина включает мономерные и мультимерные инсулины, в том числе гексамерные инсулины, а также гуманизированные инсулины.

В настоящем документе быстродействующий инсулин относится к любому инсулину или композиции быстродействующего инсулина для срочного введения субъекту с диабетом в ответ на фактическое, воспринимаемое или ожидаемое состояние гипергликемии у субъекта, которое должно возникнуть в момент или в течение около 4 ч после введения быстродействующего инсулина (например, состояние гипергликемии, возникшее в результате приема пищи или ожидаемое в результате потребления еды), в результате чего быстродействующий инсулин способен предотвратить, контролировать или смягчить острое гипергликемическое состояние. Обычно быстродействующий инсулин является инсулином, который проявляет пиковые уровни инсулина через или примерно через не более чем 4 ч после подкожного введения субъекту. Быстродействующие инсулины включают рекомбинантные инсулины и выделенные инсулины (также называемые регулярные инсулины), такие как инсулины, продаваемые как Humulin® R, свиные инсулины и бычьи инсулины, а также быстрые аналоги инсулина (также называемые быстродействующие аналоги инсулина в данном описании), измененные для быстрого действия с помощью аминокислотных замен. Примеры препаратов регулярных инсулинов включают, но не ограничиваются ими, регулярные инсулины человека, такие как продаваемые под торговыми марками Humulin® R, Novolin® R и Velosulin®, Insulin Human, USP и Insulin Human Injection, USP, а также кислые композиции инсулина, такие как, например, Toronto Insulin, Old Insulin и Clear Insulin, и регулярные инсулины свиньи, такие как Iletin II® (свиной инсулин). Регулярные инсулины обычно имеют начало действия от 30 мин до 1 ч, а пиковый уровень инсулина через 2-5 ч после введения.

В настоящем документе быстрыми аналогами инсулина (также называемыми быстродействующими аналогами инсулина) являются инсулины, имеющие быстрое начало действия. Быстрыми инсулинами, как правило, являются аналоги инсулина, которые были изменены, например, путем введения одной или более аминокислотных замен, для того чтобы действовать быстрее, чем регулярные инсулины. Быстродействующие аналоги инсулина обычно имеют начало действия через 10-30 мин после инъекции, пиковые уровни инсулина наблюдаются через 30-90 мин после инъекции. Примеры быстродействующих аналогов инсулина включают, но не ограничиваются ими, например, инсулин лизпро (например, Humalog® инсулин), инсулин аспарт (например, NovoLog® инсулин) и инсулин глулизин (например, Apidra® инсулин), композиции быстродействующего инсулина, продаваемые под названиями VIAject® и VIAtab® (см., например, патент США № 7279457). Также в это понятие включены любые другие инсулины, которые имеют начало действия через 30 мин или меньше и пиковый уровень менее чем через 90 мин, обычно через 30-90 мин после инъекции.

В настоящем документе человеческий инсулин относится к инсулину, который является синтетиче- 18 033472 ским или созданным рекомбинантным способом на основании человеческого полипептида, включая его аллельные варианты и аналоги.

В настоящем документе быстродействующие человеческие инсулины или композиции человеческого быстродействующего инсулина включают любой человеческий инсулин или композицию человеческого инсулина, которые являются быстродействующими, но не включают не человеческие инсулины, такие как свиной регулярный инсулин.

В настоящем документе термины базально действующие инсулины, или базальные инсулины относятся к инсулинам, вводимым для поддержания базального уровня инсулина, как часть общей схемы лечения для лечения хронического состояния, такого как диабет. Как правило, базально действующие инсулины вводят в композиции для поддержания приблизительно стационарного уровня инсулина с помощью контролируемого высвобождения инсулина при периодическом введении (например, один или два раза в день). Базально действующие инсулины включают кристаллические инсулины (например, NPH и Lente®, протамин-инсулин, инсулин аминохинурид (surfen)), базальные аналоги инсулина (инсулин гларгин, НОЕ 901, NovoSol Basal) и другие химические композиции инсулинов (например, с гуммиарабиком, лецитином или масляные суспензии), которые замедляют скорость абсорбции регулярного инсулина. В настоящем документе базально действующие инсулины могут включать инсулины, которые обычно понимаются как инсулины пролонгированного действия (как правило, достигают относительно низкой пиковой концентрации, в то время как имеют максимальную продолжительность действия в течение примерно 20-30 ч) или средней продолжительности действия (как правило, пиковые концентрации инсулина достигаются примерно через 4-12 ч после введения).

В настоящем документе термины гипергликемическое состояние или гипергликемия относятся к нежелательному высокому уровню глюкозы в крови.

В настоящем документе термин гипогликемическое состояние или гипогликемия относится к нежелательному падению уровня глюкозы в крови.

В настоящем документе гликемический контроль или контроль уровня глюкозы в крови относится к поддержанию концентрации глюкозы в крови на желаемом уровне, обычно между 70-130 мг/дл или 90-110 мг/дл.

В настоящем документе система с обратной связью является интегрированной системой для обеспечения непрерывного гликемического контроля. Системы с обратной связью содержат механизм для измерения уровня глюкозы в крови, механизм для доставки одной или нескольких композиций, в том числе композиции инсулина, и механизм для определения количества инсулина, необходимого для доставки для достижения гликемического контроля. Как правило, поэтому системы с обратной связью содержат датчик глюкозы, устройство для доставки инсулина, такое как инсулиновая помпа, и контроллер, который принимает информацию от датчика глюкозы и обеспечивает команды для устройства для доставки инсулина. Команды могут быть получены с помощью программного обеспечения в контроллере.

Программное обеспечение, как правило, включает в себя алгоритм для определения количества инсулина, необходимого для доставки для достижения гликемического контроля, исходя из уровня глюкозы в крови, определенного датчиком глюкозы или ожидаемого пользователем.

Системы без обратной связи относятся к устройствам, подобным системе с обратной связью, за исключением того, что устройства не измеряют автоматически и не отвечают на уровень глюкозы.

В настоящем документе режим дозирования относится к количеству вводимого инсулина и частоте его введения. Режим дозирования зависит от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и, таким образом, может изменяться.

В настоящем документе деградирующий гиалуронан фермент, называемый также ферментом, разрушающим хиалуронан, относится к ферменту, который катализирует расщепление полимера гиалуронана (также называемого хиалуронаном или гиалуроновой кислотой или HA) на фрагменты с меньшей молекулярной массой. Примерами деградирующих гиалуронан ферментов являются гиалуронидазы и конкретно хондроитиназы и лиазы, которые обладают способностью к деполимеризации гиалуронана. Примеры хондроитиназ, которые являются деградирующими гиалуронан ферментами, включают, но не ограничиваются ими, хондроитин-АВС-лиазы (также известные как хондроитиназы ABC), хондроитинАС-лиазы (также известные как хондроитинсульфатлиазы или хондроитинсульфатэлиминазы) и хондроитин-С-лиазы. Хондроитин-АВС-лиазы включают два фермента, хондроитин-сульфат-АВС-эндолиазу (ЕС 4.2.2.20) и хондроитин-сульфат-АВС-экзолиазу (ЕС 4.2.2.21). Примеры хондроитин-сульфат-АВСэндолиаз и хондроитин-сульфат-АВС-экзолиаз включают, но не ограничиваются ими, ферменты из Proteus vulgaris и Flavobacterium heparinum (хондроитин-сульфат-АВС-эндолиаза Proteus vulgaris приведена в SEQ ID NO: 98; Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(l):39-46). Примеры хондроитиназ-АС из бактерий включают, но не ограничиваются ими, фермент из Flavobacterium heparinum, приведенный в SEQ ID NO: 99, из Victivallis vadensis, приведенный в SEQ ID NO: 100, и из Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(l):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444). Примеры хондроитиназ-С из бактерий включают, но не ограничиваются ими, ферменты из Streptococcus и Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127- 19 033472

133).

В настоящем документе гиалуронидаза относится к классу ферментов, деградирующих гиалуронан (хиалуронан). Гиалуронидазы включают бактериальные гиалуронидазы (ЕС 4.2.2.1 или ЕС 4.2.99.1), гиалуронидазы пиявок, других паразитов и ракообразных (ЕС 3.2.1.36) и гиалуронидазы млекопитающих (ЕС 3.2.1.35). Гиалуронидазы включают любую из гиалуронидаз не человеческого происхождения, включая, но не ограничиваясь ими, гиалуронидазы мыши, собаки, кошки, зайца, птиц, быка, овцы, свиньи, лошади, рыб, лягушек, бактериальные гиалуронидазы, и любые гиалуронидазы из пиявок, других паразитов и ракообразных. Примеры не человеческих гиалуронидаз включают гиалуронидазы коровы (SEQ ID NO: 10, 11, 64 и ВН55 (патенты США № № 5747027 и 5827721), складчатокрылой осы (SEQ ID NO: 12 и 13), медовой пчелы (SEQ ID NO: 14), белоголового шершня (SEQ ID NO: 15), бумажной осы (SEQ ID NO: 16), мыши (SEQ ID NO: 17-19, 32), свиньи (SEQ ID NO: 20-21), крысы (SEQ ID NO: 22-24, 31), кролика (SEQ ID NO: 25), овцы (SEQ ID NO: 26, 27, 63 и 65), орангутанга (SEQ ID NO: 28), обезьян циномолгус (SEQ ID NO: 29), морской свинки (SEQ ID NO: 30), шимпанзе (SEQ ID NO: 185), макакирезуса (SEQ ID NO: 186), Arthrobacter sp. (штамм FB24) (SEQ ID NO: 67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO: 68), Propionibacterium acnes (SEQ ID NO: 69), Streptococcus agalactiae (SEQ ID NO: 70); 18RS21 (SEQ ID NO: 71); серотипа Ia (SEQ ID NO: 72); серотипа III (SEQ ID NO: 73), Staphylococcus aureus (штамм COL) (SEQ ID NO: 74); штамма MRSA252 (SEQ ID NO: 75 и 76); штамма MSSA476 (SEQ ID NO: 77); штамма NCTC 8325 (SEQ ID NO: 78); штамма бычий (bovine) RF122 (SEQ ID NO: 79 и 80); штамма USA300 (SEQ ID NO: 81), Streptococcus pneumoniae (SEQ ID NO: 82); штамма ATCC BAA-255/R6 (SEQ ID NO: 83); серотипа 2, штамма D39/NCTC 7466 (SEQ ID NO: 84), Streptococcus pyogenes (серотип M1) (SEQ ID NO: 85); серотипа M2, штамма MGAS10270 (SEQ ID NO: 86); серотипа M4, штамма MGAS10750 (SEQ ID NO: 87); серотипа M6 (SEQ ID NO: 88); серотипа М12, штамма MGAS2096 (SEQ ID NO: 89 и 90); серотипа М12, штамма MGAS9429 (SEQ ID NO: 91); серотипа М28 (SEQ ID NO: 92); Streptococcus suis (SEQ ID NO: 93-95); Vibrio fischeri (штамм ATCC 700601/ES114 (SEQ ID NO: 96)), и фермент гиалуронидазу Streptomyces hyaluronolyticus, который является специфичным для гиалуроновой кислоты и не расщепляет хондроитин или хондроитинсульфат (Ohya, Т. and Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607). Гиалуронидазы также включают гиалуронидазы человеческого происхождения. Примеры человеческих гиалуронидаз включают HYAL1 (SEQ ID NO: 36), HYAL2 (SEQ ID NO: 37), HYAL3 (SEQ ID NO: 38), HYAL4 (SEQ ID NO: 39) и PH20 (SEQ ID NO: 1). Также гиалуронидазы включают растворимые гиалуронидазы, включая овечью и бычью PH20, растворимую человеческую PH20 и растворимую rHuPH20. Примерами коммерчески доступных бычьих или овечьих растворимых гиалуронидаз являются Vitrase® (овечья гиалуронидаза) и Amphadase® (бычья гиалуронидаза).

Ссылка на деградирующие гиалуронан ферменты включает предшественники деградирующих гиалуронан ферментов и зрелые деградирующие гиалуронан ферменты (например, такие, в которых была удалена сигнальная последовательность), формы с укорочениями, которые обладают активностью (например, укороченные с С-конца формы), и включает аллельные варианты и видовые варианты, варианты, кодируемые вариантами сплайсинга, и другие варианты, в том числе полипептиды, которые имеют по меньшей мере 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность последовательности с полипептидами-предшественниками, приведенными в SEQ ID NO: 1 и 10-48, 63-65, 67-100, или их зрелыми формами. Например, ссылка на деградирующий гиалуронан фермент (например, PH20) включает в себя зрелую человеческую PH20, приведенную в SEQ ID NO: 2, и ее формы с укорочениями, которые обладают активностью, и включает аллельные варианты и видовые варианты, варианты, кодируемые вариантами сплайсинга, и другие варианты полипептидов, в том числе такие, которые имеют по меньшей мере 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2. Например, ссылка на деградирующий гиалуронан фермент также включает человеческий полипептид-предшественник PH20, варианты которого приведены в SEQ ID NO: 50-51. Деградирующие гиалуронан ферменты также включают те, которые содержат химические или посттрансляционные модификации, и те, которые не содержат химических или посттрансляционных модификаций. Такие модификации включают, но не ограничиваются ими, пегилирование, альбуминирование, гликозилирование, фарнезилирование, карбоксилирование, гидроксилирование, фосфорилирование и другие модификации полипептида, известные в данной области.

В настоящем документе PH20 относится к типу гиалуронидаз, которые находятся в сперме и являются активными в нейтральной среде. PH20 находится на поверхности сперматозоидов и в происходящей из лизосомы акросоме, где она связана с внутренней мембраной акросомы. PH20 включает в себя PH20 любого происхождения, включая, но не ограничиваясь ими, PH20 человека, шимпанзе, макака, макака-резуса, мыши, коровы, овцы, морской свинки, кролика и крысы. Примеры белков PH20 включают, но не ограничиваются ими, полипептиды PH20 человека (полипептид-предшественник, приведенный в SEQ ID NO: 1, зрелый полипептид, приведенный в SEQ ID NO: 2), быка (SEQ ID NO: 11 и 64), кролика (SEQ NO ID NO: 25), PH20 овцы (SEQ ID NO: 27, 63 и 65), обезьяны циномолгус (SEQ ID NO: 29), морской свинки (SEQ ID NO: 30), крысы (SEQ ID NO: 31), мыши (SEQ ID NO: 32), шимпанзе (SEQ ID NO: 185) и макака-резус (SEQ ID NO: 186). Ссылка на PH20 включает полипептиды-предшественники PH20 и зрелые полипептиды PH20 (такие как полипептиды, в которых была удалена сигнальная последователь

- 20 033472 ность), формы с укорочениями, которые обладают активностью, и включает аллельные варианты и видовые варианты, варианты, кодируемые вариантами сплайсинга, и другие варианты, в том числе полипептиды, которые имеют по меньшей мере 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность последовательности с полипептидами-предшественниками, приведенными в SEQ ID NO: 1, 11, 25, 27, 30-31, 63-65, 185-186, или их зрелыми формами. Полипептиды PH20 также включают полипептиды, которые содержат химические или посттрансляционные модификации и полипептиды, которые не содержат химических или посттрансляционных модификаций. Такие модификации включают, но не ограничиваются ими, пегилирование, альбуминирование, гликозилирование, фарнезилирование, карбоксилирование, фосфорилирование, гидроксилирование и другие модификации полипептида, известные в данной области. Примерами коммерчески доступных бычьих или овечьих растворимых гиалуронидаз являются гиалуронидаза Vitrase® (овечья гиалуронидаза) и гиалуронидаза Amphadase® (бычья гиалуронидаза).

В настоящем документе растворимая гиалуронидаза относится к полипептиду, который секретируется из клетки и не является заякоренным в мембране или связанным с ней, и, следовательно, может быть охарактеризована его растворимость в физиологических условиях. Растворимые гиалуронидазы можно отличить, например, по распределению в водной фазе раствора Тритон Х-114, нагретого до 37°С (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7). Заякоренные в мембране гиалуронидазы, такие как гиалуронидазы с липидным якорем, будут распределяться в богатой детергентами фазе, но будут распределяться в бедной детергентами или водной фазе после обработки фосфолипазой С. К числу растворимых гиалуронидаз относятся заякоренные в мембране гиалуронидазы, в которых одна или несколько областей, связывающих гиалуронидазу с мембраной, были удалены или изменены, и при этом растворимая форма гиалуронидазы сохраняла активность. Таким образом, растворимая гиалуронидаза, такая как растворимые полипептиды PH20, включает ее укороченные формы, например, укороченные с С-конца формы, в которых отсутствует одна или более аминокислот гликозилфосфатидилинозитольного (GPI) якоря. Растворимые гиалуронидазы включают рекомбинантные растворимые гиалуронидазы и растворимые гиалуронидазы, которые содержатся в природных источниках или очищены из них, например экстрактах из семенников овец или коров. Примером таких растворимых гиалуронидаз является растворимая человеческая PH20. Другие растворимые гиалуронидазы включают овечью (SEQ ID NO: 27, 63, 65) и бычью (SEQ ID NO: 11, 64) PH20.

В настоящем документе растворимая человеческая PH20 или sHuPH20 включает зрелые полипептиды, лишенные всей или части сайта связывания гликозилфосфатидилинозитола (GPI) на С-конце, так что при экспрессии полипептиды не связаны с мембраной клетки-хозяина, в которой они продуцируются, так что они секретируются и, таким образом, растворимы в клеточной культуральной среде. Следовательно, растворимая человеческая PH20 включает укороченные с С-конца полипептиды человеческой PH20. Примеры растворимых или укороченных с С-конца полипептидов PH20 включают зрелые полипептиды, имеющие последовательность аминокислот, приведенную в любой из SEQ ID NO: 4-9, 47-48, 234-254 и 267-273, или полипептиды, которые обладают по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 4-9, 47-48, 234-254 и 267-273. Примеры полипептидов sHuPH20 включают зрелые полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 4-9 и 47-48. Полипептиды-предшественники таких примеров полипептидов sHuPH20 содержат сигнальную последовательность. Примерами предшественников являются такие полипептиды, которые приведены в SEQ ID NO: 3 и 40-46, каждый из которых содержит сигнальную последовательность длиной 35 аминокислот, находящуюся в аминокислотных позициях 1-35. Растворимые полипептиды HuPH20 также включают полипептиды, которые разрушаются во время или после получения и очистки способами, описанными в данном документе.

В настоящем документе рекомбинантная человеческая PH20, называемая rHuPH20, относится к секретируемой растворимой форме человеческой PH20, которая рекомбинантно экспрессирована в клетках яичника китайского хомячка (СНО). Растворимой rHuPH20 является продукт, полученный с помощью нуклеиновой кислоты, которая кодирует сигнальную последовательность, например нативную сигнальную последовательность, и включает в себя нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислоты 36-482, в качестве примера может служить последовательность, включающая нуклеиновую кислоту, кодирующую нативную сигнальную последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 49. Кроме того, включены молекулы ДНК, которые являются их аллельными вариантами и другими растворимыми вариантами. Нуклеиновая кислота, кодирующая растворимую rHuPH20, экспрессируется в клетках СНО, которые секретируют зрелый полипептид. При получении в культуральной среде существует гетерогенность последовательности С-конца, так что продукт включает смесь полипептидов, которые могут включать в себя любой один или более из SEQ ID NO: 4-9 в различной представленности. Также включены соответствующие аллельные варианты и другие варианты, в том числе соответствующие полипептидампредшественникам человеческой PH20, приведенным в SEQ ID NO: 50-51. Другие варианты могут иметь 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO: 4-9 и 47-48, с условием, что они сохраняют активность гиалуронидазы и растворимы.

- 21 033472

В настоящем документе сверхбыстродействующая композиция инсулина относится к композиции, содержащей быстродействующий инсулин, как правило, быстродействующий аналог инсулина, такой как аналог инсулина с более быстрым началом действия, и деградирующий гиалуронан фермент (включая, но не ограничиваясь, препараты rHuPH20), так что композиция инсулина в течение первых сорока минут после парентерального введения субъекту обеспечивает кумулятивную системную экспозицию инсулина у субъекта, которая является большей, чем кумулятивная системная экспозиция инсулина, предоставленная субъекту за тот же период после введения той же самой дозы того же быстродействующего инсулина тем же путем, но в отсутствие деградирующего гиалуронан фермента. Сверхбыстродействующая композиция инсулина, как описано здесь, необязательно может включать в себя базально действующий инсулин.

В настоящем документе состав или композиция относится к композиции, содержащей по меньшей мере один активный фармацевтический агент и одно или более вспомогательных веществ.

В настоящем документе совместный состав, называемый также совместной композицией, относится к составу (композиции), содержащей два или более активных фармацевтических агентов и одно или более вспомогательных веществ. Например, совместная композиция быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента содержит быстродействующий инсулин, деградирующий гиалуронан фермент и одно или более вспомогательных веществ.

В настоящем документе композиция считается стабильной при определенных условиях, если активные ингредиенты в ней сохраняют, по меньшей мере, необходимый уровень активности и/или чистоты и/или удельной активности или уровень обнаружения вещества по сравнению с начальной активностью и/или чистотой и/или удельной активностью или уровнем обнаружения вещества. Для целей данного изобретения композиция считается стабильной, если она сохраняет по меньшей мере 50% активности деградирующего гиалуронан фермента, и/или если она сохраняет по меньшей мере 90% активности или обнаружения инсулина и/или по меньшей мере 90% чистоты инсулина.

В настоящем документе стабильная совместная композиция, которая содержит по меньшей мере два активных игредиента, является стабильной, если каждый активный ингредиент сохраняет, по меньшей мере, требуемый уровень активности и/или частоты и/или удельной активности или обнаружения по сравнению с начальным уровнем активности и/или чистоты и/или удельной активности или обнаружения. Для целей данного изобретения совместная композиция считается стабильной, если она сохраняет по меньшей мере 50% активности деградирующего гиалуронан фермента, и если она сохраняет по меньшей мере 90% удельной активности или обнаружения инсулина и/или по меньшей мере 90% чистоты инсулина.

В настоящем документе определенные условия относятся к условиям хранения и/или применения.

В настоящем документе хранение означает, что подготовленную композицию не вводят субъекту сразу, но выдерживают в течение определенного периода времени в определенных условиях (например, при конкретной температуре, времени, в жидкой или лиофилизированной форме) перед применением. Например, жидкий препарат можно хранить в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет до введения субъекту при различных температурах, таких как температура в холодильнике (от 0 до 10°С, например, от 2°С до 8°С), температура в помещении (температура окружающей среды, комнатная температура) (например, температура вплоть до 32°С, такая как от 18°С до примерно или точно 32°С) или повышенная температура (например, от 30 до 42°С, такая как от 32 до 37°С или от 35 до 37°С).

В настоящем документе применение со ссылкой на состояние, связанное со стабильностью, относится к акту использования композиции для определенной цели. Конкретные применения могут влиять на активность или свойства белка или агента. Например, некоторые применения могут требовать, чтобы композиция подвергалась воздействию определенных температур в течение определенных периодов времени, подвергалась колебаниям температуры и/или подвергалась перемешиванию, встряхиванию, взбалтыванию или другому подобному движению, которое может повлиять на стабильность (например, активность и/или растворимость) активных агентов. Примерами состояния являются способы непрерывной инфузии, при которых активные агенты непрерывно вливаются субъекту через связанную с ним помпу или устройство инфузии в течение курса из нескольких дней. Такое состояние может быть связано с перемешиванием и колебаниями температуры.

В настоящем документе определенные условия хранения или применения, при которых измеряется стабильность, включают температурные условия, время воздействия условий хранения и/или условий применения. Например, определенные температурные условия включают низкие температуры или температуру охлаждения от 2 до 8°С, температуру окружающей среды от 20 и 30°С или повышенные температуры от 32 до 40°С. В другом примере определенные условия времени относятся к продолжительности хранения при различных температурных условиях, например к хранению в течение дней (по меньшей мере 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней или 7 дней), недель (по меньшей мере одной недели, по меньшей мере двух недель, по меньшей мере трех недель или по меньшей мере, в течение нескольких недель) или месяцев (по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев, 24 месяцев и более). В другом примере определенные условия применения относятся к условиям, которые нарушают или изменяют композиционную смесь, например условия перемешивания.

- 22 033472

В настоящем документе композиция в виде единичной дозированной формы (однодозовая композиция) относится к композиции или совместной композиции для прямого введения. Как правило, композиция в виде единичной дозированной формы представляет собой композицию, которая содержит одну дозу терапевтического агента для прямого введения. Единичные дозы лекарственных композиций, как правило, не содержат консервантов.

В настоящем документе многодозовая композиция (композиция для введения множеством доз) относится к композиции, содержащей несколько доз терапевтического агента, которую можно непосредственно вводить, чтобы обеспечить несколько единичных доз терапевтического агента. Дозы можно вводить в течение минут, часов, недель, дней или месяцев. Многодозовые композиции могут позволить корректировать дозы, объединять дозы и/или разделять дозы. Поскольку многодозовые композиции используются в течение долгого времени, они обычно содержат один или несколько консервантов для предотвращения микробного роста. Многодозовые композиции могут быть составлены для инъекции или инфузии (например, для непрерывной инфузии).

Используемый здесь термин стабильные многодозовые инъекционные (MDI) совместные композиции относится к стабильной совместной композиции, которая является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев при температуре примерно от 2 до 8°С и/или по меньшей мере 14 дней при температуре примерно от 20 до 30°С, так что необходимый уровень активности и/или чистоты и/или удельной активности или обнаружения вещества сохраняется в течение заданного времени и при заданной температуре по сравнению с начальной активностью и/или чистотой и/или удельной активностью или обнаружением вещества. Например, стабильные многодозовые инъекционные композиции сохраняют по меньшей мере 50% активности деградирующего гиалуронан фермента и по меньшей мере 90% активности или обнаружения инсулина и/или по меньшей мере 90% чистоты инсулина в течение по меньшей мере 6 месяцев при температуре примерно от 2 до 8°С и/или по меньшей мере 14 дней при температуре примерно от 20 до 30°С.

Используемый здесь термин стабильная композиция для непрерывный инфузии инсулина относится к стабильной совместной композиции, которая является стабильной в течение по меньшей мере 3 дней при температуре примерно от 32 до 40°С, так что необходимый уровень активности и/или чистоты и/или удельной активности, или обнаружения вещества сохраняется в течение заданного времени и при заданной температуре по сравнению с начальной активностью, и/или чистотой, и/или удельной активностью, или обнаружением вещества. Например, стабильная композиция инсулина для непрерывной инфузии сохраняет по меньшей мере 50% активности деградирующего гиалуронан фермента и по меньшей мере 90% активности или обнаружения инсулина и/или по меньшей мере 90% чистоты инсулина по меньшей мере в течение 3 дней при температуре примерно от 32 до 40°С.

В настоящем документе терапия непрерывной подкожной инфузии инсулина (CSII) относится к режиму дозирования инсулина, при котором инсулин вводят путем инфузии с запрограммированными скоростями в течение нескольких дней небольшим инфузионным устройством или помпой (насосом) подкожно через инфузионный набор, соединенный с помпой. Как правило, терапия CSII продолжается в течение 2-4 дней до того, как инфузионный набор и резервуар помпы необходимо заменить. Лечение сочетает в себе непрерывное базовое высвобождение инсулина (базальная скорость) и дополнительные болюсные дозы инсулина до еды и в ответ на высокие значения гликемии (т.е. корректирующий болюс). Терапия CSII обычно использует драйвер шприца на батарейках, инсулиновую помпу или другое подобное устройство для доставки быстродействующего инсулина, в частности аналога инсулина, в соответствии с режимом дозировки. Как правило, график базового непрерывного высвобождения инсулина устанавливается врачом для каждого пациента. Болюсные дозы определяются на основе потребностей в приеме пищи и гликемических ответов. Таким образом, терапия CSII специфична для конкретного пациента. Определения конкретного режима дозирования инсулина для каждого пациента в зависимости от потребностей пациентов и других параметров конкретного пациента, таких как вес, возраст, физические упражнения, диета и клинические симптомы пациента, находится в пределах ведения врача и пациента.

В настоящем документе стабилизирующий агент относится к соединению, добавленному в композиции для защиты деградирующего гиалуронан фермента, либо инсулина, либо обоих от деградации, например, под действием солевых условий, условий pH и температуры, в которых совместные композиции хранятся или используются. Таким образом, включены агенты, которые предотвращают деградацию белков под воздействием других компонентов в композиции. Примерами таких агентов являются аминокислоты, производные аминокислот, амины, сахара, полиолы, соли и буферы, поверхностно-активные вещества, ингибиторы или субстраты и другие агенты, описанные в данном документе.

В настоящем документе лизил лизин (Lys-Lys или дилизин) относится к дипептиду Lys-Lys, его соли, производному, аналогу или миметику. Например, ссылка на Lys-Lys включает его соли, такие как соль дигидрохлорид Lys-Lys, т.е. Lys-Lys дигидрохлорид (или дилизин дигидрохлорид; H-Lys-Lys-OH HCl). Lys-Lys дигидрохлорид имеет следующую формулу:

- 23 033472

Ссылка на Lys-Lys также включает его производные, такие как производные, содержащие защищенные группы, такие как Fmoc-, Noc- или Cbz. Примеры коммерчески доступных дигидрохлоридов Lys-Lys включают, но не ограничиваются веществами, которые имеются в продаже в фирмах Sigma Aldrich, RnD Chem., MP Bio, Tetrahedron Scientific Inc. и Crescent Chemical Company. Примером коммерчески доступного дигидрохлорида Lys-Lys является дигидрохлорид Lys-Lys, имеющийся в продаже в фирме Sigma Aldrich (Product No. L5502) или RnD Chem (Product No. G-2675).

В настоящем документе тест противомикробной эффективности демонстрирует эффективность системы консервантов в продукте. Продукт инокулируют контролируемым количеством конкретных организмов. При тесте затем сравнивают содержание микроорганизмов, обнаруживаемых в контрольном образце, относительно опытного образца в течение периода 28 дней. Параметры для выполнения теста противомикробной эффективности известны специалистам в данной области и описаны здесь.

В настоящем документе противомикробное или эффективное против микроорганизмов количество консерванта относится к количеству консерванта, которое убивает или ингибирует размножение в образце микроорганизмов, которые могут быть внесены при хранении или применении. Например, для многодозовых контейнеров эффективное против микроорганизмов количество консерванта ингибирует рост микроорганизмов, которые могут быть внесены при повторном заборе индивидуальных доз. USP и ЕР (ЕРА и ЕРВ) вводят требования по стерильности, которые определяют эффективность консерванта и которые различаются по жесткости. Например, эффективное против микроорганизмов количество консерванта является таким количеством, при котором происходит по меньшей мере 1,0 log₁₀ уменьшение количества бактерий в течение 7 дней после инокуляции в тесте проверки эффективности противомикробного консерванта (АРЕТ). В конкретном примере эффективное противомикробные количество консерванта представляет собой такое количество, при котором происходит уменьшение количества бактерий по меньшей мере в 1,0 log₁₀ раз в течение 7 дней после инокуляции, происходит уменьшение количества бактерий по меньшей мере в 3,0 log₁₀ раз в течение 14 дней после инокуляции, по меньшей мере, не происходит дальнейшее увеличение количества бактерий после 28 дней после инокуляции, и, по меньшей мере, не происходит никакого увеличения количества грибковых организмов после 7 дней после инокуляции. В другом примере эффективное противомикробное количество консерванта представляет собой такое количество, при котором происходит уменьшение количества бактерий по меньшей мере в 1,0 log10 раз через 24 ч после инокуляции, происходит уменьшение количества бактерий по меньшей мере в 3,0 log₁₀ раз через 7 дней после инокуляции, не происходит дальнейшее увеличение количества бактерий через 28 дней после инокуляции, происходит уменьшение количества грибковых организмов по меньшей мере в 1,0 log10 раз через 14 дней после инокуляции, и, по меньшей мере, дальнейшее увеличение количества грибковых организмов не происходит через 28 дней после инокуляции. В качестве дополнительного примера эффективное против микроорганизмов количество консерванта представляет собой такое количество, при котором происходи уменьшение количества бактерий по меньшей мере в 2,0 log₁₀ раз через 6 ч после инокуляции, происходит уменьшение количества бактерий по меньшей мере в 3,0 log₁₀ раз через 24 ч после инокуляции, бактерии не обнаруживаются через 28 дней после инокуляции композиции микробным инокулятом, происходит уменьшение количества грибковых организмов по меньшей мере в 2,0 log₁₀ раз через 7 дней после инокуляции, и, по меньшей мере, не происходит дальнейшее увеличение количества грибковых организмов через 28 дней после инокуляции.

В настоящем документе термин вспомогательное вещество относится к соединению в композиции активного агента, которое не обеспечивает биологическое действие активного агента при введении в отсутствие активного агента. Типичные вспомогательные вещества включают, но не ограничиваются ими, соли, буферы, стабилизаторы, модификаторы тоничности, металлы, полимеры, поверхностноактивные вещества, консерванты, аминокислоты и сахара.

В настоящем документе буфер относится к веществу, как правило, к раствору, который может поддерживать постоянное значение pH несмотря на добавление сильных кислот или сильных оснований и внешних воздействий температуры, давления, объема или окислительно-восстановительного потенциала. Буфер предотвращает изменение концентрации другого химического вещества, например, представляет собой донорную и акцепторную систему протонов, которая предотвращает заметные изменения

- 24 033472 в концентрации водородных ионов (pH). Значения pH всех буферов являются температурно- и концентрационно-зависимыми. Выбор буфера для поддержания значения или диапазона pH может быть сделан эмпирически специалистом в данной области на основании известной буферной емкости известных буферов. Примеры буферов включают, но не ограничиваются ими, бикарбонатный буфер, какодилатный буфер, фосфатный буфер или Трис-буфер. Например, Трис-буфер (трометамин) является буфером на основе амина, который имеет pKa 8,06 и имеет эффективный диапазон действия pH между 7,9 и 9,2. Для Трис-буфера pH увеличивается примерно на 0,03 единицы на каждый 1°С снижения температуры и уменьшается от 0,03 до 0,05 единицы при десятикратном разведении.

В настоящем документе активность относится к функциональной активности или активности полипептида или его части, связанной с полноразмерным (полным) белком. Функциональные активности включают, но не ограничиваются ими, каталитическую или ферментативную активность, антигенность (способность связывать или конкурировать с полипептидом за связывание с антителом против полипептида), иммуногенность, способность образовывать мультимеры и способность специфически связываться с рецептором или лигандом полипептида.

В настоящем документе активность гиалуронидазы относится к способности ферментативно катализировать расщепление гиалуроновой кислоты. Анализ Фармакопеи США (USP) XXII определяет активность гиалуронидазы косвенно путем измерения количества субстрата гиалуроновой кислоты более высокой молекулярной массы, или гиалуронана (HA), оставшегося после реакции фермента с HA в течение 30 мин при 37°С (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). При анализе может быть использован стандартный раствор сравнения, чтобы установить относительную активность в единицах для любой гиалуронидазы. In vitro анализы для определения гиалуронидазной активности гиалуронидаз, таких как растворимая rHuPH20, известны в данной области и описаны здесь. Примеры анализов включают микротурбидиметрический анализ, описанный ниже (см., например, пример 2), который измеряет расщепление гиалуроновой кислоты гиалуронидазой косвенно путем обнаружения нерастворимого осадка, образованного при связывании нерасщепленной гиалуроновой кислоты с сывороточным альбумином. Стандартные образцы могут быть использованы, например, для получения стандартной кривой для определения активности в единицах для испытываемой гиалуронидазы.

В настоящем документе функционально эквивалентное количество или грамматические варианты этого словосочетания со ссылкой на деградирующий гиалуронан фермент относится к количеству деградирующего гиалуронан фермента, которое достигает такого же эффекта, как количество (например, известное число единиц активности гиалуронидазы) фермента сравнения, такого как гиалуронидаза. Например, активность любого деградирующего гиалуронан фермента можно сравнить с активностью rHuPH20, чтобы определить функционально эквивалентное количество деградирующего гиалуронан фермента, которое позволит достичь того же эффекта, как и известное количество rHuPH20. Например, способность деградирующего гиалуронан фермента действовать в качестве распространяющегося или диффундирующего агента может быть оценена путем введения его в кожу на боку мышей с трипановым синим (см., например, опубликованную заявку США № 20050260186), а количество деградирующего гиалуронан фермента, необходимое для достижения такой же диффузии, может быть определено, как, например, 100 единиц стандарта сравнения гиалуронидазы. Требуемое количество деградирующего гиалуронан фермента, следовательно, функционально эквивалентно 100 Ед. В другом примере способность деградирующего гиалуронан фермента к увеличению уровня и скорости абсорбции при совместном введении с инсулином может быть оценена у человека так, как описано ниже в примере 1, и может быть определено количество деградирующего гиалуронан фермента, необходимое для достижения того же увеличения уровня и скорости абсорбции инсулина, как, например, для вводимого количества rHuPH20, (например, путем оценки максимальной концентрации инсулина в крови (Cmax); времени, необходимого для достижения максимальной концентрации инсулина в крови (Tmax) и кумулятивной системной экспозиции инсулина в течение заданного периода времени (AUC).

В настоящем документе остатки встречающихся в природе α-аминокислот представляют собой остатки 20 встречающихся в природе α-аминокислот, которые включаются в белок посредством специфического распознавания нагруженной молекулы тРНК с ее соответствующим кодоном у человека.

В настоящем документе нуклеиновые кислоты включают ДНК, РНК и их аналоги, в том числе пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) и их смеси. Нуклеиновые кислоты могут быть одно- или двухцепочечными. При описании зондов или праймеров, которые могут быть необязательно мечены, например, детектируемой меткой, например флуоресцентной или радиоактивной меткой, предусмотрены одноцепочечные молекулы. Такие молекулы, как правило, имеют такую длину, что их мишень является статистически уникальной или малокопийной (обычно менее 5, в целом, менее 3) для зондирования или праймирования библиотеки. Обычно зонд или праймер содержит, по меньшей мере, последовательность из 14, 16 или 30 непрерывных нуклеотидов, комплементарную или идентичную интересующему гену. Зонды и праймеры могут быть нуклеиновыми кислотами длиной 10, 20, 30, 50, 100 или более оснований.

В настоящем документе пептид относится к полипептиду, длина которого больше или равна двум

- 25 033472 аминокислотам и меньше или равна 40 аминокислотам.

В настоящем документе аминокислоты, которые находятся в различных последовательностях аминокислот, предусмотренных здесь, обозначены в соответствии с их известными трехбуквенными или однобуквенными аббревиатурами (табл. 1). Нуклеотиды, которые находятся в различных фрагментах нуклеиновых кислот, обозначены теми стандартными однобуквенными обозначениями, которые используются обычно в данной области.

В настоящем документе аминокислота представляет собой органическое соединение, содержащее аминогруппу и карбоксильную группу. Полипептид содержит два или более остатка аминокислот. Для целей данного изобретения аминокислоты включают двадцать встречающихся в природе аминокислот, неприродные аминокислоты и аналоги аминокислот (т.е. аминокислоты, в которых α-углерод имеет боковую цепь).

В настоящем документе аминокислотный остаток относится к аминокислоте, образующейся при химическом расщеплении (гидролизе) полипептида по его пептидным связям. Аминокислотные остатки, описанные здесь, как предполагается, находятся в L-изомерной форме. Аминокислотные остатки в Dизомерной форме, которые обозначены таких образом, могут быть заменены на L-аминокислотный остаток, если сохраняется желаемое функциональное свойство полипептида. NH₂ относится к свободной аминогруппе, присутствующей на аминоконце полипептида. СООН относится к свободной карбоксильной группе, присутствующей на карбоксильном конце полипептида. В соответствии со стандартной номенклатурой полипептидов, описанной в J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968), и принятой 37 С. F.R. §§ 1. 821-1. 822, сокращения для аминокислотных остатков показаны в табл. 1.

Таблица 1

Таблица соответствия

Символ
1-буквенный	3-буквенный	АМИНОКИСЛОТА
Y	Туг	Тирозин
G	Gly	Глицин
F	Phe	Фенилаланин
М	Met	Метионин
А	Ala	Аланин
S	Ser	Серин
I	lie	Изолейцин
L	Leu	Лейцин
Т	Thr	Треонин
V	Val	Валин
Р	Pro	Пролин
К	Lys	Лизин
Н	His	Гистидин
Q	Gln	Глутамин
Е	Glu	Глутаминовая кислота
Z	Glx	Glu и/или Gln
W	Trp	Триптофан
R	Arg	Аргинин
D	Asp	Аспарагиновая кислота
N	Asn	Аспарагин
В	Asx	Asn и/или Asp
С	Cys	Цистеин
X	Xaa	Неизвестная или другая

Все последовательности аминокислотных остатков представлены здесь формулами, которые ориентированы слева направо в обычном направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Кроме того, фраза аминокислотный остаток в широком смысле включает аминокислоты, перечисленные в таблице соответствия (табл. 1), и модифицированные и необычные аминокислоты, такие как те, которые указаны в 37 CF.R. §§ 1. 821-1. 822, и включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. Кроме того, тире в начале или в конце последовательности аминокислотных остатков указывает на пептидную связь с другой последовательностью из одного или нескольких аминокислотных остатков, с концевой аминогруппой, такой как NH2, или с концевой карбоксильной группой, такой как СООН.

В настоящем документе природные аминокислоты относятся к 20 L-аминокислотам, которые встречаются в полипептидах.

В настоящем документе не встречающаяся в природе аминокислота относится к органическому соединению, которое имеет структуру, аналогичную природной аминокислоте, но было структурно мо- 26 033472 дифицировано для имитации структуры и реакционной способности природной аминокислоты. Не встречающиеся в природе аминокислоты, таким образом, включают, например, аминокислоты или аналоги аминокислот, отличные от 20 встречающихся в природе аминокислот, и включают, но не ограничиваются ими, D-изостереомеры аминокислот. Примеры неприродных аминокислот описаны здесь, и они известны специалистам в данной области.

В настоящем документе конструкция ДНК состоит из одно- или двухцепочечной, линейной или кольцевой молекулы ДНК, которая содержит сегменты ДНК, скомбинированные и составленные в порядке, не встречающемся в природе. ДНК-конструкции образуются в результате манипуляций человека и включают в себя клоны и другие копии созданных молекул.

В настоящем документе сегмент ДНК является частью более крупной молекулы ДНК, имеющей заданные атрибуты. Например, сегмент ДНК, кодирующий указанный полипептид, представляет собой часть более длинной молекулы ДНК, такой как плазмида или фрагмент плазмиды, который при считывании в направлении 5'-3' кодирует последовательность аминокислот указанного полипептида.

В настоящем документе термин полинуклеотид означает одно- или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидных оснований, считываемых от 5'- к З'-концу. Полинуклеотиды включают РНК и ДНК и могут быть выделены из природных источников, синтезированы in vitro, или получены из комбинации натуральных и синтетических молекул. Длина полинуклеотидной молекулы дана здесь в терминах нуклеотидов (сокращенно нт) или парах оснований (сокращенно п.о. (bp)). Термин нуклеотиды используется для одно- и двухцепочечной молекулы, если позволяет контекст. Когда этот термин применяется к двухцепочечным молекулам, он используется для обозначения общей длины и предполагается эквивалентным термину пара оснований. Как будет понятно специалистам в данной области, две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут слегка отличаться по длине, так что их концы могут быть расположены со сдвигом таким образом, что все нуклеотиды в пределах двухцепочечной полинуклеотидной молекулы могут не быть спарены. Такие неспаренные концы не будут, в общем, превышать 20 нуклеотидов в длину.

В настоящем документе сходство между двумя белками или нуклеиновыми кислотами относится к родству между последовательностями аминокислотных остатков в белках или нуклеотидными последовательностями в нуклеиновых кислотах. Сходство может быть основано на степени идентичности и/или гомологии последовательностей остатков и остатков, содержащихся в последовательности. Способы оценки степени сходства между белками или нуклеиновыми кислотами известны специалистам в данной области. Например, при одном способе оценки сходства последовательностей две аминокислотные последовательности нуклеотидов выравнивают таким образом, чтобы добиться максимального уровня идентичности между последовательностями.

В настоящем документе идентичность относится к степени, в которой аминокислотные или нуклеотидные последовательности инвариантны. Выравнивание аминокислотных последовательностей и в некоторых случаях нуклеотидных последовательностей также может учитывать консервативные различия и/или частые замены аминокислот (или нуклеотидов). Консервативные различия являются различиями, при которых сохраняются физико-химические свойства вовлеченных остатков. Выравнивания могут быть глобальными (выравнивание сравниваемых последовательностей по всей длине последовательностей и включая все остатки) или локальными (выравнивание частей последовательностей, которые включают только наиболее похожую область или области). Идентичность как таковая несет признанный в данной области смысл и может быть рассчитана с использованием опубликованных способов. (См., например, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). В то время как существует множество способов измерения идентичности между двумя полинуклеотидами или полипептидами, термин идентичность хорошо известен специалистам в данной области (Carrillo, Н. & Lipton, D., SIAM J. Applied Math 48:1073 (1988)).

В настоящем документе гомологичные (по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты и/или аминокислотной последовательности) означает гомологию последовательностей от 25% или больше, как правило, больше или равно 25, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90 или 95% гомологии последовательностей; точный процент может быть указан, если это необходимо. Для целей настоящего изобретения термины гомология и идентичность часто используются взаимозаменяемо, если не указано иное. В общем, для определения процента гомологии или идентичности последовательности выравнивают, так что достигается максимальное соответствие (см., например, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J. Applied Math 48:1073). По гомологии последовательностей число кон- 27 033472 сервативных аминокислот определяется стандартными программами с алгоритмами выравнивания, также могут быть использованы штрафы за разрыв, установленные по умолчанию каждым поставщиком программного обеспечения. По существу, гомологичные молекулы нуклеиновых кислот будут гибридизоваться обычно при умеренной жесткости условий или при высокой жесткости по всей длине интересующей нуклеиновой кислоты. Предусмотрены также молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат вырожденные кодоны вместо кодонов гибридизующихся молекул нуклеиновой кислоты.

Являются ли любые две молекулы нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичными или гомологичными, может быть определено с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа FASTA, с использованием, например, параметров по умолчанию, как описано Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (другие программы включают пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):351 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul, S.F., et al., J. Molec Biol. 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, и Carrillo et al. (1988) SIAM J. Applied Math 48:1013). Например, функция BLAST базы данных Национального центра биотехнологической информации может быть использована для определения идентичности. Другие коммерчески или публично доступные программы включают программу DNAStar MegAlign (Madison WI) и программу Gap (Madison WI) Генетической компьютерной группы Университета Висконсин (UWG). Процент гомологии или идентичности белков и/или молекул нуклеиновой кислоты может быть определен, например, путем сравнения информации о последовательности с использованием компьютерной программы GAP (например, Needleman et al. (1970) J. Mol Biol. 48:443, в редакции Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482). Вкратце, программа GAP определяет сходство как количество выровненных символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот), которые совпадают, разделенное на общее число символов в наименьшей из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для не идентичности) и взвешенную матрицу сравнения Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, как описано в Schwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) штраф 3,0 для каждого разрыва и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом разрыве; и (3) отсутствие штрафа для концевых разрывов.

Таким образом, в настоящем документе термин идентичность или гомология представляет сравнение между тестируемой последовательностью и последовательностью сравнения полипептида или полинуклеотида. В настоящем документе термин по меньшей мере на 90% идентична относится к проценту идентичности от 90 до 100% по отношению к последовательности сравнения нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности полипептида. Идентичность на уровне 90% или более указывает на факт, что если для иллюстративных целей сравнивают тестируемый полипептид и полипептид сравнения, составляющие в длину 100 аминокислот, не более 10% (т.е. 10 из 100) аминокислот в тестируемом полипептиде отличаются от полипептида сравнения. Подобные сравнения могут быть сделаны между тестируемым полинуклеотидом и полинуклеотидом сравнения. Такие различия могут быть представлены как точечные мутации, случайным образом распределенные по всей длине полипептида, или они могут быть сгруппированы в одном или нескольких местах разной длины до максимально допустимой, например 10/100 аминокислот (приблизительно 90% идентичности). Различия определяются как замены, вставки или делеции нуклеиновых кислот или аминокислот. При уровне гомологии или идентичности выше примерно 85-90% результат не должен зависеть от программы и установленных параметров разрывов; такие высокие уровни идентичности можно оценить легко, часто с помощью ручного выравнивания, не полагаясь на программное обеспечение.

В настоящем документе выровненная последовательность относится к использованию гомологии (сходства и/или идентичности) для выравнивания соответствующих позиций в последовательности нуклеотидов или аминокислот. Как правило, две или более последовательностей, которые идентичны на 50% или более, могут быть выровнены. Выравнивание множества последовательностей относится к 2 или более последовательностям, которые выровнены в соответствующих положениях, и может включать в себя выравнивание последовательностей, полученных из РНК, таких как EST и другие кДНК, с геномной ДНК.

В настоящем документе, по существу, идентичен продукту означает существенное сходство, настолько, что интересующее свойство достаточно неизменно, так что, по существу, идентичный продукт может быть использован вместо продукта.

В настоящем документе также подразумевается, что термины по существу, идентичны или сходны изменяются в зависимости от контекста, как понятно специалистам в данной области.

В настоящем документе аллельный вариант или аллельная вариация относится к любой из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельный вариант естественно возникает в результате мутации и может привести к фенотипическому полиморфизму в популяциях. Мутации генов могут быть молчащими (без изменения в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин аллель

- 28 033472 ный вариант также используется здесь для обозначения белка, кодируемого аллельным вариантом гена. Обычно контрольная форма (форма сравнения) гена кодирует форму дикого типа и/или преобладающую форму полипептида в популяции или у одного контрольного члена вида. Как правило, аллельные варианты, которые включают в себя межвидовые и внутривидовые варианты, как правило, имеют по меньшей мере 80, 90% или большую идентичность последовательности аминокислот с вариантом дикого типа и/или преобладающей формой у того же вида, степень идентичности зависит от гена и от того, является ли сравнение межвидовым или внутривидовым. Как правило, внутривидовые аллельные варианты имеют по меньшей мере примерно 80, 85, 90 или 95% идентичности или более с вариантом дикого типа и/или преобладающей формой, в том числе 96, 97, 98, 99% или больше идентичности с вариантом дикого типа и/или преобладающей формой полипептида. Ссылка на аллельный вариант в данном документе, как правило, относится к вариантам белков между представителями того же вида.

В настоящем документе термин аллель, который используется здесь взаимозаменяемо с термином аллельный вариант, относится к альтернативным формам гена или его части. Аллели занимают тот же локус или ту же позицию в гомологичных хромосомах. Когда субъект имеет два одинаковых аллеля гена, субъект называется гомозиготным по этому гену или аллелю. Когда субъект имеет два различных аллеля гена, субъект называется гетерозиготным по гену. Аллели конкретного гена могут отличаться друг от друга одним нуклеотидом или несколькими нуклеотидами, и могут включать модификации, такие как замены, делеции и вставки нуклеотидов. Аллель гена также может быть формой гена, содержащей мутацию.

В настоящем документе видовые варианты относятся к вариантам полипептидов у разных видов, в том числе у различных видов млекопитающих, таких как мышь и человек.

В настоящем документе модификация относится к модификации последовательности аминокислот полипептида или последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты и включает в себя делеции, вставки и замены аминокислот и нуклеотидов соответственно. Способы модификации полипептида являются обычными для специалистов в данной области и включают, например, способы с использованием методик рекомбинантной ДНК.

В настоящем документе выделенный или очищенный полипептид, или белок, или его биологически активная часть не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков из клетки или ткани, из которой белок получен, или, по существу, свободен от химических предшественников или других химических веществ, если синтезирован химически. Препараты могут быть определены как, по существу, свободные, если они кажутся свободными от легко обнаруживаемых примесей по данным стандартных способов анализа, например тонкослойной хроматографии (ТСХ), гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используемых специалистами в данной области для оценки такой чистоты, или достаточно чистые, если при дальнейшей очистке не обнаруживаются изменения физических и химических свойств, таких как ферментативные и биологические активности вещества. Способы очистки соединений для получения, по существу, химически чистых соединений известны специалистам в данной области. По существу, химически чистое соединение, однако, может представлять собой смесь стереоизомеров. В таких случаях дальнейшая очистка может повысить удельную активность соединения.

Термин по существу, свободен от клеточного материала включает препараты белков, в которых белок отделен от клеточных компонентов клеток, из которых он выделен или рекомбинантно получен. В одном варианте осуществления термин по существу, свободный от клеточного материала включает препараты белков-ферментов, имеющие менее чем примерно 30% (по сухому весу) белков не ферментов (также называемых здесь загрязняющими белками), как правило, менее чем примерно 20% белков не ферментов, или 10% белков не ферментов или менее примерно 5% белков не ферментов. Когда белокфермент получен рекомбинантным способом, он также является, по существу, свободным от культуральной среды, т.е. культуральная среда составляет менее или примерно 20, 10 или 5% от объема препарата белка-фермента.

В настоящем документе термин по существу свободный от химических предшественников или других химических веществ включает препараты белков-ферментов, в которых белок отделен от химических предшественников или других химических веществ, которые использовали в синтезе белка. Термин включает препараты белков-ферментов, имеющие менее примерно 30% (по сухому весу), 20%, 10%, 5% или менее химических предшественников, или химических веществ, или компонентов не ферментативной природы.

В настоящем документе синтетический со ссылкой, например, на синтетические молекулы нуклеиновой кислоты, или синтетический ген, или синтетический пептид, относится к молекуле нуклеиновой кислоты или полипептидной молекуле, которую получают с помощью рекомбинантных способов и/или с помощью способов химического синтеза.

В настоящем документе получение с использованием способов рекомбинантной ДНК означает использование известных способов молекулярной биологии для экспрессии белков, кодируемых клонированной ДНК.

В настоящем документе вектор (или плазмида) относится к дискретному элементу, который ис

- 29 033472 пользуется для введения гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетки как для ее экспрессии, так и для репликации. Векторы обычно остаются эписомными, но могут быть разработаны таким образом, чтобы осуществить интеграцию гена или его части в хромосому генома. Предусмотрены также векторы, которые являются искусственными хромосомами, такими как дрожжевые искусственные хромосомы и искусственные хромосомы млекопитающих. Выбор и использование таких переносчиков хорошо известны специалистам в данной области.

В настоящем документе экспрессионный вектор включает векторы, способные к экспрессии ДНК, которая функционально связана с регуляторными последовательностями, например промоторными участками, которые способны вызывать экспрессию таких фрагментов ДНК. Такие дополнительные сегменты могут включать промотор и терминатор и, необязательно, могут включать в себя одну или несколько точек начала репликации, один или несколько маркеров для селекции, энхансер, сигнал полиаденилирования и тому подобное. Экспрессионные векторы обычно получены из плазмидной или вирусной ДНК или могут содержать элементы обоих. Таким образом, экспрессионный вектор относится к рекомбинантной ДНК- или РНК-конструкции, такой как плазмида, фаг, рекомбинантный вирус или другой вектор, которая при введении в соответствующую клетку-хозяина приводит к экспрессии клонированного фрагмента ДНК. Соответствующие экспрессионные векторы хорошо известны специалистам в данной области и включают векторы, которые способны к репликации в эукариотических клетках и/или в прокариотических клетках, и векторы, которые остаются эписомными, или векторы, которые встраиваются в геном клетки-хозяина.

В настоящем документе вектор также включает вирусные векторы. Вирусные векторы являются искусственными вирусами, которые функционально связаны с экзогенными генами для передачи (как переносчики и челноки) экзогенных генов в клетки.

В настоящем документе оперативно или функционально связаны при обсуждении сегментов ДНК означает, что сегменты расположены так, что они функционируют в соответствии со своим назначением, например, транскрипция инициируется ниже промотора и выше транскрибируемой последовательности. Промотор обычно является доменом, с которым связывается транскрипционный аппарат для инициации транскрипции и прохождения через кодирующий сегмент до терминатора.

В настоящем документе термин оценка включает качественное и количественное определение для получения абсолютного значения активности протеазы или ее домена, присутствующего в образце, а также для получения индекса, соотношения, процента, визуального или другого значения, указывающего на уровень активности. Оценка может быть прямой или косвенной, и фактически обнаруженные химические вещества не обязательно должны быть сами по себе продуктом протеолиза, но могут быть, например, его производными или некоторыми дополнительными веществами. Например, обнаружение продукта расщепления белка комплемента может осуществляться, например, с помощью SDS-PAGE и окрашивания белка кумасси синим.

В настоящем документе биологическая активность относится к активности соединения in vivo или физиологическим реакциям, которые проявляются in vivo при введении соединения, композиции или другой смеси. Биологическая активность, таким образом, охватывает терапевтические эффекты и фармацевтическую активность таких соединений, композиций и смесей. Биологическая активность может наблюдаться в системах in vitro, предназначенных для тестирования или применения таких активностей. Таким образом, для целей настоящего изобретения биологическая активность протеазы является ее каталитической активностью, при которой полипептид подвергается гидролизу.

Используемый здесь термин эквивалентны, когда речь идет о двух последовательностях нуклеиновых кислот, означает, что эти две обсуждаемые последовательности кодируют одинаковую последовательность аминокислот или эквивалентные белки. Когда термин эквивалент используется в отношении двух белков или пептидов, это означает, что два белка или пептида имеют, по существу, одинаковую аминокислотную последовательность, которая включает только такие аминокислотные замены, которые существенно не изменяют активность или функцию белка или пептида. Когда термин эквивалент относится к свойству, свойство не обязательно должно проявляться в той же степени (например, два пептида могут демонстрировать различные скорости одного типа ферментативной активности), но активности, как правило, по существу, одинаковы.

В настоящем документе композиция относится к любой смеси. Это может быть раствор, суспензия, жидкость, порошок, паста, она может быть водной, неводной или любой их комбинацией.

В настоящем документе комбинация относится к любой связи между или среди двух или более элементов. Комбинация может быть комбинацией двух или более отдельных элементов, таких как две композиции или две подборки, может быть их смесью, такой как смесь двух или более элементов, или любым их вариантом. Элементы комбинации, как правило, функционально связаны или иным образом связаны между собой.

В настоящем документе заболевание или расстройство относится к патологическому состоянию организма, возникшему в результате причины или состояния, включая, но не ограничиваясь, инфекции, приобретенные состояния, генетические состояния, и характеризуется идентифицируемыми симптомами. Интересующие заболевания и расстройства включают здесь сахарный диабет.

- 30 033472

В настоящем документе термин лечение субъекта с заболеванием или состоянием означает, что симптомы субъекта частично или полностью улучшаются или остаются неизменными в ходе лечения. Поэтому лечение включает в себя профилактику, терапию и/или излечение. Профилактика относится к предотвращению потенциальной болезни и/или предупреждению ухудшения симптомов или прогрессирования болезни. Лечение также включает в себя любое фармацевтическое применение совместной композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, предусмотренной здесь.

В настоящем документе фармацевтически эффективный агент включает в себя любой лекарственный агент или биологически активный агент, включая, но не ограничиваясь, например, анестетики, сосудосуживающие средства, диспергирующие агенты, обычные терапевтические лекарственные средства, в том числе низкомолекулярные лекарственные средства и терапевтические белки.

В настоящем документе лечение означает любой способ, при котором симптомы состояния, расстройства или заболевания или иного показания уменьшаются или иным образом предпочтительно изменяются.

В настоящем документе терапевтический эффект означает эффект в результате лечения субъекта, который изменяет, обычно улучшает или облегчает, симптомы заболевания или состояния, или который лечит заболевание или состояние. Терапевтически эффективное количество относится к количеству композиции, молекулы или соединения, которое приводит к терапевтическому эффекту после введения субъекту.

В настоящем документе термин субъект относится к животному, в том числе к млекопитающему, такому как человек.

В настоящем документе пациент относится к субъекту-человеку, обладающему симптомами заболевания или расстройства.

В настоящем документе облегчение симптомов конкретного заболевания или расстройства путем лечения, например путем введения фармацевтической композиции или другого терапевтического средства, относится к любому уменьшению, будь-то постоянному или временному, продолжительному или краткосрочному, симптомов, которое может быть отнесено или связано с введением композиции или терапевтического средства.

В настоящем документе предотвращение или профилактика относится к способам, при которых риск развития заболевания или состояния уменьшается.

В настоящем документе термин терапевтически эффективное количество или терапевтически эффективная доза относится к количеству агента, соединения, материала или композиции, содержащих соединение, которое, по меньшей мере, является достаточным для получения терапевтического эффекта. Таким образом, это количество, необходимое для предотвращения, лечения, облегчения, прекращения или частичного прекращения симптома заболевания или расстройства.

В настоящем документе терапевтически эффективная доза инсулина является количеством инсулина, требуемым или достаточным для достижения гликемического контроля. Это количество может быть определено эмпирически, например с помощью нагрузки глюкозой или приема пищи. Композиции, предусмотренные здесь, содержат терапевтически эффективное количество или концентрацию инсулина таким образом, чтобы были введены терапевтически эффективные дозы.

В настоящем документе единичная дозированная форма относится к физически дискретным единицам, пригодным для людей и животных и упакованным по отдельности, как известно в данной области.

В настоящем документе изделие является продуктом, который производится и продается. В данном документе термин охватывает композицию быстродействующего инсулина и композицию деградирующего гиалуронан фермента, содержащиеся в одной или отдельных упаковках.

В настоящем документе жидкость относится к любой композиции, которая может течь. Жидкости, таким образом, включают композиции, которые находятся в виде полутвердых веществ, паст, растворов, водных смесей, гелей, лосьонов, кремов и другие подобные композиции.

В настоящем документе набор относится к комбинации композиций, предусмотренных здесь, и еще одного объекта, предназначенного для таких целей как восстановление, активация, введение, диагностика и оценка биологической активности или свойств, а также инструментов/устройств для доставки, но не ограничиваясь ими. Наборы необязательно включают инструкции по применению.

В настоящем документе животное включает любое животное, включая, но не ограничиваясь ими, приматов, включая человека, горилл и обезьян; грызунов, таких как мыши и крысы; птиц, таких как куры; жвачных животных, таких как козы, коровы, овцы, олени, свиньи и другие животные. Указание животных, не являющихся человеком, исключает людей из списка предполагаемых животных. Ферменты, предусмотренные здесь, могут происходить из любого источника, животных, растений прокариотов и грибов. Большинство ферментов имеют животное происхождение, включая млекопитающих.

В настоящем документе контроль относится к образцу, который, по существу, идентичен тестируемому образцу, за исключением того, что он не подвергнут воздействию тестируемого параметра, или, если это образец плазмы, он может быть взят от нормального добровольца, не подверженного интересующему состоянию. Контроль также может быть и внутренним контролем.

В настоящем документе формы единственного числа включают указание на множественное число,

- 31 033472 если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на соединение, включающее внеклеточный домен, включает соединения с одним или множеством внеклеточных доменов.

В настоящем документе диапазоны и размеры могут быть выражены как примерно определенное значение или диапазон. Примерно также включает точное количество. Поэтому примерно 5 оснований означает около 5 оснований, а также 5 оснований.

В настоящем документе необязательный или необязательно означает, что описываемое далее событие или обстоятельство происходит или не происходит, и что описание включает случаи, когда указанное событие или обстоятельство имеет место, и случаи, когда этого не происходит. Например, необязательно замещенная группа означает, что группа является незамещенной или замещенной.

В настоящем документе аббревиатуры любых защитных групп, аминокислот и других соединений, если не указано иное, соответствуют их общепринятому использованию, признанными сокращениям или рекомендациям Комиссии по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB (см. (1972) Biochemistry 11:1726).

В. Композиции деградирующего гиалуронан фермента и создание совместных композиций с инсулином.

Здесь предусмотрены стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента, например, растворимой гиалуронидазы, например PH20. Обычно для сохранения ферментативной активности деградирующих гиалуронан ферментов требуются относительно высокие концентрации солей (см., например, опубликованную заявку США № US 20110066111). Существующие композиции для стабильности также содержат человеческий сывороточный альбумин (HSA). Здесь обнаружено, что Lys-Lys и хлорид магния (MgCl2) стабилизируют деградирующие гиалуронан ферменты (например, растворимую гиалуронидазу, например PH20) лучше, чем NaCl. Более того, в присутствии Lys-Lys или MgCl₂ HSA не является обязательным и вовсе не требуется. Предусмотренные здесь композиции имеют преимущества по сравнению с существующими композициями, в том числе повышенную стабильность, в частности, при более высоких температурах и в течение более длительного времени. Здесь предусмотрены стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента (например, растворимой гиалуронидазы, например PH20), содержащие Lys-Lys в качестве стабилизатора.

Совместные композиции деградирующего гиалуронан фермента с другим терапевтическим агентом также должны быть стабильными при различных условиях. Это может быть проблемой в том случае, если требования к композиции другого терапевтического агента отличаются, а иногда являются противоположными требованиям к композиции для деградирующего гиалуронан фермента. Здесь обнаружено, что это имеет место для совместных смешанных композиций деградирующего гиалуронан фермента и инсулина. Здесь предусмотрены стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента (например, растворимой гиалуронидазы, такой как PH20) и инсулина, например быстродействующего инсулина или аналога инсулина.

Стабильные композиции, в том числе продаваемые композиции быстродействующих инсулинов, как правило, содержат различные вспомогательные вещества и компоненты и/или различные концентрации вспомогательных веществ и компонентов, являющиеся необходимыми для стабильности, растворимости и активности инсулина и отличающиеся от тех, которые входят в состав стабильных композиций деградирующих гиалуронан ферментов, таких как растворимые гиалуронидазы. Эти оптимизированные композиции инсулинов и растворимых гиалуронидаз не совместимы при смешивании друг с другом в совместные композиции, так что стабильность, растворимость и/или активность совместных композиций инсулина и растворимой гиалуронидазы значительно снижается. Такая несовместимость является основным препятствием для разработки стабильных совместных композиций этих агентов.

1. Композиции деградирующего гиалуронан фермента.

Существующие композиции деградирующего гиалуронан фермента обычно содержат NaCl, как правило, от 130 до 150 мМ NaCl. Например, рекомбинантная Hylenex® (человеческая гиалуронидаза для инъекций) содержит на 1 мл 8,5 мг NaCl (145 мМ), 1,4 мг двухосновного фосфата натрия (9,9 мМ), 1,0 мг человеческого альбумина, 0,9 мг динатрия эдетата (2.4 мМ), 0,3 мг CaCl₂ (2,7 мМ) и NaOH для доведения pH до 7,4. Другие композиции человеческих растворимых гиалуронидаз, такие как композиции rHuPH20, описанные в опубликованной заявке США № US 2011/0053247, включают 130 мМ NaCl, 10 мМ Hepes, pH 7,0 или 10 мМ гистидина, 130 мМ NaCl, pH 6,0.

Композиции деградирующих гиалуронан ферментов, таких как гиалуронидазы, в том числе PH20, например rHuPH20, содержат компоненты, отличные от компонентов, присутствующих в композициях инсулина. Например, PH20 наиболее стабилен при более низких значениях pH между pH 5,5 и 6,5. В дополнение к более низкому pH композиции человеческой гиалуронидазы содержат больше NaCl, чем композиции инсулина, где оба компонента обеспечивают стабильность и поддерживают ферментативную активность. Также композиции человеческой гиалуронидазы, такой как рекомбинантная Hylenex® (человеческая гиалуронидаза для инъекций), представляют собой композиции для однократного введения. В связи с этим они не содержат никаких консервантов.

2. Композиции быстродействующего инсулина.

- 32 033472

Композиции быстродействующих инсулинов, в том числе регулярного инсулина и быстродействующих аналогов инсулина, как правило, составлены для оптимизации растворимости, стабильности и чистоты инсулина при охлаждении (например, при 4°С, для долговременного хранения), а также при повышенных температурах (например, при 25 и 30°С). Композиции созданы для обеспечения стабильности в течение продолжительного периода времени, в частности, для применения многократным введением и в многодозовых упаковках. Например, на этикетках для реализуемой продукции инсулина, в том числе торговых марок Humulin®, Humalog®, Novolog® и Apidra®, указана стабильность в течение по меньшей мере 24 месяцев при температуре хранения 2-8°С и 28 дней при хранении при 25 или 30°С. Также, как полагают, композиции стабильны в течение по меньшей мере 6 дней при температурах хранения примерно 37°С.

Хотя оптимальные композиции для каждого инсулина могут различаться, как правило, существует некоторая общность композиций. Например, композиции инсулина, как правило, содержат буфер, модификатор (модификаторы) тоничности и один или несколько консервантов. Многие быстродействующие инсулины также содержат цинк, тогда как некоторые также содержат стабилизатор. Более того, композиции инсулина, как правило, готовят при высоком нейтральном pH (например, 7,0-7,8). В табл. 2 ниже приведены некоторые имеющиеся в продаже композиции четырех быстродействующих инсулинов, в том числе регулярного инсулина и трех быстродействующих аналогов инсулина.

Таблица 2

Композиции быстродействующего инсулина

Инсулин	АФИ (ед/мл)	pH	Zn	Буфер	Модификатор тоничности	Стабилизатор	Консервант
NaCl	Глицерин	Фенол	мкрезол
Humulin® рекомбинантный инсулин	100 или 500	7,0- 7,8	0,017 или 0,085 мг/мл	Натрия фосфат ДВУХОСНОВНЫЙ	-	16 мг/мл (170 мМ)	-
Humalog® инсулин лизпро	100	7,0- 7,8	0,0197 мг/мл	1.88 мг/мл (13,2 мМ) натрия фосфата двухосновного	-	16 мг/мл (170 мМ)	-	следы	3.15 мг/мл (0,315 %)
NovoLog®	100	7,2- 7,6	0,0196 Мг/мл	1,25 мг/мл (7 мМ) динатрия	0,58 мг/мл	16 мг/мл (170 мМ)	-	1.5 мг/мл	1.72 мг/мл
инсулин аспарт				гидрофосфата дигидрата	(10 мМ)			(0,15 %)	(0,172 %)
Apidra® инсулин глулизин	100	7,3	-	6 мг/мл (50 мМ) Трис	5 мг/мл (85 мМ)	-	0,01 % полисорбат 20	-	3.15 мг/мл (0,315 %)

Композиции быстродействующего инсулина содержат консервант, который предотвращает внесение в композицию микробного загрязнения при многократном доступе, например при повторяющемся внесении иглы в случае многократного введения. Хотя в настоящее время в утвержденных парентеральных лекарственных препаратах используют множество консервантов, в композициях инсулина наиболее часто используют фенольные соединения, такие как фенол, метакрезол (м-крезол) и парабены. Эти фенольные соединения служат не только в качестве эффективных противомикробных агентов, но также могут связываться с аллостерическими сайтами в гексамере инсулина и изменять общую конформацию структуры высшего порядка инсулина. Это стабилизирует гексамеры путем ингибирования образования нитевидных агрегатов (фибрилл), которые легче образуются из мономеров инслина, чем из гексамеров (Rahuel-Clermont et al. (1997) Biochemistry 36:5837-5845). Хотя эти консерванты могут выступать в качестве стабилизаторов, они также могут снижать растворимость инсулина, если присутствуют в слишком высокой концентрации. Таким образом, концентрация консервантов в инсулине является критичной для стабильности и растворимости агента.

Как правило, для регулирования изотоничности препарата в композиции инсулина включены один или несколько модификаторов тоничности. Примеры модификаторов тоничности, которые часто присутствуют в композициях инсулина, включают глицерин и/или NaCl. Помимо влияния на изотоничность, NaCl влияет на растворимость инсулина, таким образом, что повышение концентрации NaCl приводит к понижению растворимости. Различные инсулины, в том числе аналоги инсулина, имеют разную относительную растворимость. Таким образом, количество NaCl, которое может присутствовать в композиции без отрицательного влияния на растворимость, будет различаться между инсулинами. Например, инсулин глулизин (например, инсулин глулизин Apidra®) лучше растворим, чем инсулин аспарт (например, инсулин аспарт NovoLog®), и поэтому допускает больше NaCl в композиции. Для сравнения инсулин лизпро и регулярный инсулин являются наименее растворимыми из быстродействующих инсулинов и, как правило, не содержат NaCl в их композициях.

Другие компоненты также могут быть включены в композиции инсулина. Многие композиции инсулина, в том числе композиции регулярного инсулина, инсулина аспарт и инсулина лизпро, содержат

- 33 033472 ионы Zn²⁺, которые способствуют образованию и стабилизируют образование гексамера. Хотя композиции инсулина глулизина не содержат цинк, они содержат полисорбат 20 (Р20; Tween (Твин) 20) в качестве стабилизатора белка. Буферы, используемые в композициях быстродействующего инсулина, могут включать, например, буфер двухосновного фосфата натрия и трометамол (также известный как Трис или

ТНАМ).

3. Совместные композиции деградирующего гиалуронан фермента и инсулина.

Композиции, содержащие быстродействующий инсулин и деградирующий гиалуронан фермент (такой как растворимая гиалуронидаза, например rHuPH20), образуют композиции сверхбыстродействующего инсулина, которые лучше имитируют эндогенное (т.е. естественное) высвобождение инсулина после приема пищи у субъектов, не страдающих диабетом, по сравнению с введением только быстродействующего инсулина (см., например, опубликованную заявку США № US 20090304665). Таким образом, такие композиции сверхбыстродействующего инсулина могут быть использованы субъектами с диабетом для более точного контроля уровня глюкозы в крови и снижения гипергликемических колебаний по сравнению с введением только быстродействующих инсулинов, что обеспечивает существенное преимущество для пациента.

Композиции быстродействующих инсулинов для многократного введения и композиции деградирующих гиалуронан ферментов, тем не менее, не совместимы, и их смешивание, как правило, приводит к быстрой потере стабильности и активности деградирующего гиалуронан фермента, наряду с быстрой потерей растворимости и стабильности инсулина. Поэтому до сих пор введение композиции сверхбыстродействующего инсулина должно было проводиться немедленно после смешивания инсулина и деградирующего гиалуронан фермента для предотвращения потери активности. Это непрактично и неприемлемо для пациентов с диабетом.

Таим образом, здесь предусмотрены стабильные совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента (такого как растворимая гиалуронидаза, например rHuPH20). Предусмотренные здесь совместные композиции могут использоваться в качестве терапевтического средства для лечения сахарного диабета, в частности для контроля уровня глюкозы в крови после приема пищи. Стабильные совместные композиции включают композиции для многократного введения, которые могут быть предусмотрены во флаконе, шприце, шприце-ручке, резервуаре помпы или в системе с обратной связью или в любом подходящем контейнере.

а). Противоположные требования к стабильности.

Основными препятствиями для разработки стабильных совместных композиций инсулина и деградирующих гиалуронан ферментов, таких как растворимые гиалуронидазы (например, rHuPH20), являются кристаллизация и преципитация быстродействующих инсулинов при охлаждении, и стабильность деградирующего гиалуронан фермента при повышенных температурах. Как правило, вспомогательные вещества и условия, которые обычно предотвращают такие результаты, различаются для двух активных агентов. Некоторые вспомогательные вещества и условия, которые являются оптимальными для поддержания растворимости и стабильности композиций инсулина, могут оказывать отрицательное воздействие на стабильность и активность деградирующих гиалуронан ферментов, таких как растворимые гиалуронидазы (например, rHuPH20). С другой стороны, вспомогательные вещества и условия, являющиеся оптимальными для стабильности деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), оказывают отрицательное воздействие на стабильность и растворимость инсулинов.

Простое смешивание существующих композиций инсулина, в том числе быстродействующих аналогов инсулина, и существующих композиций растворимых гиалуронидаз, таких как rHuPH20, приводит к образованию композиции, не являющейся стабильной при долговременном хранении в замороженном виде, при хранении при температуре окружающей среде или при повышенной температуре. Это связано с быстрой агрегацией rHuPH20 и потерей ферментативной активности, также как и потерей активности инсулина. Эти неблагоприятные эффекты возникают из-за нескольких несовместимых вспомогательных веществ и условий, включая тип и концентрацию консервантов, концентрацию NaCl, концентрацию цинка, pH и температуру хранения, но не ограничиваясь этим. Таким образом, создание композиции, в которой оба агента остаются растворимыми, стабильными и активными, представляет собой чрезвычайно важную задачу.

i). Консерванты.

Консерванты включены в многодозовые композиции инсулина для предотвращения микробного загрязнения, которое может быть внесено в композицию при многократном доступе к флакону, картриджу шприца-ручки или другому многодозовому контейнеру, содержащему композицию. Консерванты, как правило, должны присутствовать в концентрациях, достаточных для удовлетворения нормативных правил. Например, нормативные требования утверждают, что противомикробная эффективность композиции должна удовлетворять требованиям теста эффективности консерванта (PET) для потенциального рынка. Требования, предъявляемые к PET фармакопеей США (USP) и европейской фармакопеей (ЕР), значительно различаются, что налагает дополнительные ограничения на разработку многодозовых композиций.

- 34 033472

Продаваемые композиции инсулина, как правило, содержат фенол, метакрезол (м-крезол) и/или метилпарабен. Эти соединения не только служат в качестве противомикробных веществ, но также могут стабилизировать гексамерные формы молекул инсулина. Тем не менее, важна концентрация и тип использованного в композициях инсулина консерванта. Например, хотя фенольные соединения в оптимальных концентрациях могут стабилизировать гексамерные молекулы инсулина, растворимость инсулина снижается с увеличением концентрации консерванта. Таким образом, концентрация консерванта в композициях инсулина является критичной как для стабильности, так и для растворимости, а также обеспечивает необходимую противомикробную активность.

Несмотря на то, что консерванты являются необходимым компонентом, они представляют собой значительную проблему для разработки стабильных, многодозовых композиций белков, поскольку консерванты, как правило, индуцируют агрегацию белка в водном растворе. Например, для таких консервантов как фенол, м-крезол и бензиловый спирт, было показано, что они индуцируют агрегацию гормона роста человека (Маа and Hsu (1996) Int. J. Pharm. 140:155-168), рекомбинантного рецептора интерлейкина-1 (Remmele (1998) Pharm. Res. 15:200-208), инсулиноподобного фактора роста I человека (Fransson (1997) Pharm. Res. 14:606-612), rhIFN-γ (Lam (1997) Pharm. Res. 14:725-729) и цитохрома с (Singh et al. (2011) J. Pharm Sci., 100:1679-89). Дестабилизирующее воздействие, которое консерванты оказывают на белки в растворе, являлось лимитирующим фактором для разработки многодозовых композиций, так что на сегодня большинство белковых лекарственных средств создано только для однократного применения.

Как и большинство других белковых лекарственных средств, гиалуронидаза PH20, такая как rHuPH20, быстро теряет активность в присутствии консервантов, вероятно, из-за разворачивания белка и последующего образования агрегата. Например, как показано в примерах в настоящем документе, консерванты снижают ферментативную активность PH20, в особенности при повышенных температурах.

Приведенные здесь результаты динамического рассеяния света (DLS), дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) и других методов определения физико-химических характеристик показывают, что температура плавления деградирующего гиалуронан фермента rHuPH20 значительно снижается при добавлении к композиции фенольных консервантов, таких как м-крезол. Например, температура разворачивания rHuPH20 снижается с 44 и 24°С. Более низкая температура разворачивания PH20 приводит к повышенной агрегации PH20, в особенности, при повышенных температурах, и к снижению ферментативной активности.

Как отмечалось выше, эти фенольные соединения, такие как фенол, м-крезол и парабены, являются теми самыми консервантами, которые используются в композициях инсулина. Дестабилизирующее воздействие, скорее всего, связано с гидрофобной природой фенольных консервантов. Гидрофобность фенольных соединений может привести к взаимодействию с rHuPH20 посредством неспецифического связывания с белком, что, в конечном счете, нарушает структурную целостность rHuPH20. Это приводит к значительной потере ферментативной активности rHuPH20 в присутствии консервантов.

Как показано в примерах в настоящем документе, если возрастает уровень фенольного консерванта (например, фенола, м-крезола и метилпарабена), и/или повышается температура, отрицательное влияние на ферментативную активность rHuPH20 также увеличивается. Например, ферментативная активность rHuPH20 значительно снизилась после инкубации в течение одной недели при 35°С при относительно высоком общем уровне консервантов (>0,2%). При комнатной температуре и более низких концентрациях консерванта фермент достаточно хорошо сохраняет свою активность в течение по меньшей мере одного месяца. Кроме того, тип фенольного соединения также влияет на активность rHuPH20, так м-крезол является наиболее неблагоприятным для активности rHuPH20, далее следует фенол и потом метилпарабен. Тем не менее, метилпарабен, несмотря на то, что среди фенольных соединений он оказывает наименьшее отрицательное влияние на активность rHuPH20, также наименее эффективен в качестве противомикробного вещества и поэтому не является оптимальным консервантом. Другие консерванты, такие как тимеросал и соли хлоргексидина, лучше совместимы с rHuPH20, но широко не распространены. Таким образом, композиции, содержащие эти нетрадиционные консерванты, сталкиваются с дополнительными нормативными трудностями.

Неблагоприятное воздействие консервантов на ферментативную активность деградирующего гиалуронан фермента, например rHuPH20, значительно усиливается при повышенных температурах. Как показано в примерах, фенольные консерванты оказывают отрицательное влияние на температуру плавления (Tm) фермента. Например, Tm для rHuPH20 снизилась со значения выше 40°С в отсутствие консерванта до примерно 26°С в присутствии консерванта, например 0,25% м-крезола. Таким образом, Tm rHuPH20 значительно снижается при добавлении консерванта к раствору rHuPH20. В результате при повышенных температурах растворимая гиалуронидаза разворачивается. Как показано в примерах, эта денатурация и последующая агрегация находят отражение в увеличенном размере молекул rHuPH20 в присутствии консервантов при повышенных температурах.

Таким образом, консерванты, хотя и необходимы из-за их противомикробной активности и полезны вследствие их стабилизирующего воздействия на гексамерный инсулин, могут оказывать наблагоприятное воздействие на стабильность и активность деградирующих гиалуронан ферментов, таких как rHuPH20, и на стабильность инсулина.

- 35 033472 ii). NaCl и pH.

Другой особенной трудностью в разработке стабильных совместных композиций инсулина и деградирующего гиалуронан фермента (например, rHuPH20) является то, что оптимальные pH и диапазоны концентраций NaCl для растворимости инсулина отличаются от оптимальных pH и диапазонов концентраций NaCl для rHuPH20. Например, растворимость инсулина и аналогов инсулина имеет тенденцию возрастать при более высоких pH (например, >7,2) и более низкой концентрации NaCl (например, <140 мМ), при этом эти условия, как правило, оказывают неблагоприятное воздействие на стабильность деградирующего гиалуронан фермента, например rHuPH20, в особенности при повышенных температурах при долговременном хранении. Это различие еще более усиливается в присутствии консервантов, которые имеют тенденцию понижать растворимость инсулина и стабильность rHuPH20.

Относительная растворимость регулярного инсулина и быстродействующих аналогов инсулина изменяется, где растворимость увеличивается от регулярного инсулина, наименее растворимого, до инсулина лизпро, далее инсулина аспарт и, в конечном счете, до инсулина глулизина, который является наиболее растворимым. Растворимость непосредственно связана с допустимым содержанием NaCl в композиции, т.е. NaCl отсутствует в продаваемых растворах, содержащих регулярный инсулин и инсулин лизпро, небольшое количество NaCl (10 мМ) присутствует в продаваемых композициях инсулина аспарт, и большее количество NaCl (85 мМ) присутствует в продаваемых композициях инсулина глулизина.

Увеличение концентрации NaCl в композициях инсулина может приводить к кристаллизации/агрегации инсулина, в особенности при пониженных температурах. NaCl также сильно влияет на растворимость. Как показано в примерах, при повышении концентрации NaCl в охлажденных растворах инсулина с 50 до 140 мМ, растворимость регулярного инсулина, инсулина аспарт и инсулина лизпро значительно снижается. Как показано в примерах, тем не менее, для стабильности деградирующего гиалуронан фермента, например rHuPH20, верно обратное. Стабильность rHuPH20 в растворе при повышенных температурах (например, 25 и 30°С) сильно снижается с течением времени, если концентрация NaCl снижается с 140 до 50 мМ.

На растворимость инсулина также сильно влияет pH. Аналогично воздействию более высоких концентраций NaCl на растворимость инсулина, схожий отрицательный эффект на растворимость инсулина был обнаружен при понижении pH с 7,6 до 6,6. Таким образом, при низком pH и высокой концентрации NaCl растворимость инсулина сильно снижается. С другой стороны, растворимость инсулина максимальна при низкой концентрации NaCl и высоком pH. Аналогично противоположным требованиям к концентрации NaCl для инсулина и PH20, требования к pH также противоположны. Стабильность rHuPH20 в растворе при повышенных температурах (например, 25 и 30°С) сильно снижается с течением времени, если pH повышается с 7,0 до 7,6. При охлаждении rHuPH20 относительно стабилен вне зависимости от pH и концентрации NaCl.

Таким образом, оптимальная концентрация NaCl и pH для растворимости инсулина и стабильности деградирующего гиалуронан фермента (например, rHuPH20) несовместимы. Растворимость инсулина максимальна при более высоких pH и более низкой концентрации NaCl. Эти условия, тем не менее, неблагоприятны для деградирующего гиалуронан фермента, например rHuPH20, который теряет стабильность при более высоком pH и более низкой концентрации NaCl. Стабильность rHuPH20 можно повысить за счет увеличения концентраций NaCl и снижения pH. Тем не менее, такие условия оказывают отрицательное воздействие на растворимость инсулина и аналогов инсулина, которые выпадают в осадок при низком pH и высокой концентрации NaCl. Таким образом, одной из основных задач для разработки стабильных совместных композиций инсулина и деградирующего гиалуронан фермента (например, rHuPH20 или другого деградирующего гиалуронан фермента) является определение концентрации NaCl и pH, при которых инсулин сохраняет растворимость и активность, и деградирующий гиалуронан фермент (например, rHuPH20) сохраняет стабильность и активность. Это было достигнуто в настоящем документе.

b). Совместимая совместная композиция.

Противоположные требования инсулина и гиалуронидазы, такой как гиалуронидаза PH20, означают, что для оптимизации совместимости в совместной композиции должны быть сбалансированы несколько параметров. Предусмотренные здесь стабильные совместные композиции содержат требуемый баланс консервантов, соли (например, NaCl), pH, стабилизатора (стабизаторов) и/или буфера для сохранения приемлемых уровней активности деградирующего гиалуронан фермента и растворимости и активности инсулина. Как обсуждалось выше, было несколько трудностей в определении этого баланса. В первую очередь, консерванты, такие как фенольные консерванты, необходимые в качестве противомикробных веществ в многодозовых композициях, оказывают значительное дестабилизирующее воздействие на деградирующие гиалуронан ферменты, такие как rHuPH20, что приводит к быстрой потере активности. Во-вторых, оптимальные концентрации NaCl и pH для растворимости и стабильности инсулина сильно отличаются от концентрации NaCl и pH для стабильности деградирующих гиалуронан ферментов. Растворимость инсулина максимальна при более высоком pH и более низкой концентрации NaCl. Эти условия, тем не менее, являются неблагоприятными для деградирующего гиалуронан фермента, например rHuPH20, который теряет стабильность при более высоком pH и более низкой концентрации со- 36 033472 ли. Нестабильность rHuPH20 еще более усиливается в присутствии консервантов. Стабильность rHuPH20 можно повысить за счет увеличения концентраций NaCl и снижения pH. Тем не менее, такие условия оказывают неблагоприятное воздействие на растворимость инсулина и аналогов инсулина, которые выпадают в осадок при низком pH и высокой концентрации соли.

Таким образом, определение условий, при которых как деградирующий гиалуронан фермент, так и быстродействующий инсулин, остаются растворимыми, стабильными и активными, представляет собой чрезвычайно сложную задачу. Предусмотренные здесь совместные композиции, тем не менее, удовлетворяют этим условиям. Определены не только оптимальные комбинации соли (например, NaCl), pH и консерванта, но также определены дополнительные стабилизаторы и буферы, которые при комбинировании друг с другом и в некоторых случаях с описанными солью, pH и консервантами дальше стабилизируют деградирующий гиалуронан фермент и инсулин, а также поддерживают растворимость инсулина. Например, здесь было обнаружено, что Lys-Lys является стабилизатором, который в некоторых случаях и для некоторых аналогов инсулина может быть использован в качестве заместителя NaCl, таким образом, что в композиции могут быть использованы более низкие концентрации NaCl с сохранением ферментативной активности и стабильности инсулина.

В следующих разделах описаны примеры деградирующих гиалуронан ферментов и инсулинов для включения в композиции и совместные композиции, примеры стабильных композиций и совместных композиций, способы оценки стабильности и активности композиций и совместных композиций, способы применения композиций и совместных композиций в различных заболеваниях и состояниях.

С. Деградирующие гиалуронан ферменты.

В настоящем документе предусмотрены стабильные композиции гиалуронидазы. Также в настоящем документе предусмотрены стабильные совместные композиции, содержащие инсулин и деградирующий гиалуронан фермент. Например, в описании и примерах в настоящем документе описано, что стабильные совместные композиции, содержащие инсулин и деградирующий гиалуронан фермент, такой как гиалуронидаза, могут быть получены несмотря на то, что каждый из компонентов имеет противоположные требования для стабильности и активности. В настоящем документе это продемонстрировано для PH20 (например, rHuPH20), но может быть распространено на другие деградирующие гиалуронан ферменты, такие как растворимые гиалуронидазы или другие полипептиды PH20.

В частности, в настоящем документе предусмотрены стабильные композиции или стабильные совместные композиции, содержащие деградирующий гиалуронан фермент, который представляет собой гиалуронидазу, такую как укороченная гиалуронидаза (например, укороченная с С-конца), у которой отсутствует весь мотив GPI якоря или его часть. Такие полипептиды гиалуронидазы могут быть рекомбинантно экспрессированы и секретированы из клеток при экспрессии. При секреции в среду гиалуронидазы, которые в норме связаны с мембраной, при укорочении могут существовать в виде растворимых белков. Создание и экспрессия предусмотренных в настоящем документе или известных в уровне техники деградирующих гиалуронан ферментов, а также получение стабильных композиций и совместных композиций на основе приведенного в настоящем документе описания и раскрытия находится в пределах компетенции квалицированного специалиста в данной области.

Деградирующие гиалуронан ферменты разрушают гиалуронан путем расщепления полимеров гиалуроновой кислоты, которые состоят из повторяющихся единиц дисахаридов, D-глюкуроновой кислоты (GlcA) и N-ацетил-О-глюкозамина (GlcNAc), связанных посредством чередующихся β-1^4 и β-1^3 гликозидных связей. Цепи гиалуроновой кислоты могут содержать около 25000 дисахаридных повторов или более, а полимеры гиалуронана могут варьировать в размерах от примерно 5000 до 20000000 Да in vivo. Гиалуроновая кислота, также называемая гиалуронаном или гиалуронатом, является не сульфатированным глюкозаминогликаном и широко распространена во всех соединительных, эпителиальных и нервных тканях. Гиалуроновая кислота является важным компонентом внеклеточного матрикса и основной составляющей интерстициального барьера. Посредством каталитического гидролиза гиалуроновой кислоты деградирующие гиалуронан ферменты снижают вязкость гиалуронана, тем самым увеличивая проницаемость тканей и скорость абсорбции жидкостей, вводимых парентерально. Таким образом, деградирующие гиалуронан ферменты, такие как гиалуронидазы, были использованы, например, как диспергирующие агенты или агенты для усиления распространения в сочетании с другими агентами, лекарственными композициями или белками для улучшения дисперсии и доставки последних.

Соответственно, деградирующие гиалуронан ферменты включают любые ферменты, обладающие способностью катализировать расщепление цепи или полимера дисахаридов гиалуронана. В некоторых примерах деградирующий фермент расщепляет β-1^4 гликозидную связь в цепи или полимере гиалуронана. В других примерах деградирующий фермент катализирует расщепление гликозидной связи β-1^3 в цепи или полимере гиалуронана. Примерами деградирующих гиалуронан ферментов в совместных композициях, представленных здесь, являются гиалуронидазы, которые секретируются в среду клеточными системами экспрессии, в том числе природные гиалуронидазы, которые не содержат гликозилфосфатидилинозитольный якорь (GPI), или укороченные гиалуронидазы, которые не имеют одной или нескольких аминокислот GPI якоря, или гиалуронидазы, которые по другой причине не связаны с клеточ- 37 033472 ной мембраной при экспрессии из клеток. Такие гиалуронидазы могут быть получены рекомбинантным или синтетическим путём.

Деградирующие гиалуронан ферменты, предусмотренные в способах данного документа, также включают аллельные или видовые или другие варианты деградирующего гиалуронан фермента, как описано здесь. Например, деградирующие гиалуронан ферменты могут содержать одно или несколько изменений первичной последовательности, таких как аминокислотные замены, вставки и/или делеции. Вариант деградирующего гиалуронан фермента обычно имеет по меньшей мере или около 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность последовательности с деградирующим гиалуронан ферментом, не содержащим изменение. Любое изменение может быть включено в деградирующий гиалуроновую кислоту фермент для целей настоящего изобретения при условии, что фермент сохраняет активность гиалуронидазы, например по меньшей мере или примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или более от активности деградирующего гиалуронан фермента, не содержащего изменений (что определено in vitro и/или in vivo анализами, хорошо известными в данной области техники и описанными в данном документе).

Различные формы деградирующих гиалуронан ферментов, в том числе гиалуронидазы, были получены и утверждены для терапевтического применения в различных субъектах, включая человека. Например, препараты гиалуронидаз животного происхождения включают Vitrase® (ISTA Pharmaceuticals), очищенную гиалуронидазу яичек овец и Amphadase® (Amphastar Pharmaceuticals), гиалуронидазу яичек крупного рогатого скота. Hylenex® (Baxter) представляет собой человеческую рекомбинантную гиалуронидазу, полученную путем генной инженерии в клетках яичника китайского хомячка (СНО), содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую укороченный человеческий полипептид PH20 (обозначаемый rHuPH20). Очевидно, что любой деградирующий гиалуронан фермент, такой как любая гиалуронидаза, может быть включен в стабильные совместные композиции, предусмотренные в данном документе (см., например, патент США № 7767429 и опубликованные заявки США №№ 20040268425 и 20100143457, которые во всей своей полноте включены в настоящий документ посредством ссылки).

Как правило, для применения согласно настоящему документу применяется человеческий деградирующий гиалуронан фермент, такой как человеческая PH20 и, в особенности, укороченная с С-конца человеческая PH20, которая описана здесь. Несмотря на то, что могут быть использованы деградирующие гиалуронан ферменты, такие как PH20, от других животных, такие препараты являются потенциально иммуногенными, поскольку это белки животных. Например, значительная часть пациентов демонстрирует предварительную сенситизацию вторично по отношению к употребляемой пище, и поскольку это животные белки, то все пациенты имеют риск последующей сенситизации. Таким образом, препараты не человеческого происхождения не могут быть пригодны для хронического применения. Если желательно применять препараты не человеческого происхождения, то у них может быть уменьшена иммуногенность. Такие модификации находятся в пределах уровня знаний специалиста в данной области и могут включать в себя, например, делецию и/или замену одного или более антигенных эпитопов молекулы.

Гиалуронидазы (например, PH20), используемые в совместных композициях, предусмотренных в настоящем документе, могут быть получены рекомбинантными способами или могут быть очищены или частично очищены из природных источников, таких как, например, экстракты семенников. Способы получения рекомбинантных белков, в том числе рекомбинантных деградирующих гиалуронан ферментов, представлены здесь и хорошо известны в данной области.

1. Гиалуронидазы.

Гиалуронидазы входят в большое семейство деградирующих гиалуронан ферментов. Есть три основных класса гиалуронидаз: гиалуронидазы млекопитающих, бактериальные гиалуронидазы и гиалуронидазы пиявок, других паразитов и ракообразных. Эти ферменты могут быть использованы в совместных композициях, представленных здесь.

а). Гиалуронидазы млекопитающих.

Гиалуронидазы млекопитающих (ЕС 3.2.1.35) являются эндо-Р-Ы-ацетилгексозаминидазами, которые гидролизуют β-1^4 гликозидные связи гиалуроната с образованием олигосахаридов различной длины, таких как тетрасахариды и гексасахариды. Эти ферменты имеют как гидролитические, так и трансгликозидазные активности, и могут деградировать гиалуронан и хондроитинсульфаты (CS), обычно C4-S и C6-S. Гиалуронидазы этого типа включают, но не ограничиваются ими, гиалуронидазы коров (крупного рогатого скота) (SEQ ID NO: 10, 11 и 64 и ВН55 (патенты США №№ 5747027 и 5827721)), овец (Ovis aries) (SEQ ID NO: 26, 27, 63 и 65), складчатокрылой осы (SEQ ID NO: 12 и 13), медоносной пчелы (SEQ ID NO: 14), белолицего шершня (SEQ ID NO: 15), бумажной осы (SEQ ID NO: 16), мыши (SEQ ID NO: 17-19, 32), свиньи (SEQ ID NO: 20-21), крысы (SEQ ID NO: 22-24, 31), кролика (SEQ ID NO: 25), орангутана (SEQ ID NO: 28), обезьян циномолгус (SEQ ID NO: 29), морской свинки (SEQ ID NO: 30), шимпанзе (SEQ ID NO: 185), макака-резуса (SEQ ID NO: 186) и человека.

Гиалуронидазы млекопитающих могут быть далее подразделены на гиалуронидазы, которые являются активными в нейтральных условиях, преимущественно гиалуронидазы из экстрактов яичек, и гиалуронидазы, которые являются активными в кислых условиях, преимущественно из таких органов, как

- 38 033472 печень. Примеры активных в нейтральной среде гиалуронидаз включают PH20, включая, но не ограничиваясь этим, PH20, полученную из различных видов, такую как овечью (SEQ ID NO: 27), бычью (SEQ ID NO: 11) и человеческую (SEQ ID NO: 1). Человеческая PH20 (также известная как SPAM1 или поверхностный белок спермы PH20), как правило, прикреплена к мембране через гликозилфосфатидилинозитольный якорь (GPI). В естественных условиях это необходимо для взаимодействия сперматозоида и яйцеклетки и проникновения сперматозоидов через слой клеток кумулюса посредством расщепления гиалуроновой кислоты. Примерами гиалуронидаз, используемых здесь в совместных композициях, являются активные в нейтральной среде гиалуронидазы.

PH20.

PH20, как и другие гиалуронидазы млекопитающих, является эндо-З-Л-ацетилгексозаминидазой, которая гидролизует гиалуроновую кислоту по β 1 —>4 гликозидной связи на олигосахариды различной длины, такие как тетрасахариды и гексасахариды. Эти ферменты обладают гидролитической и трансгликозидазной активностями и могут расщеплять гиалуроновую кислоту и хондроитинсульфаты, такие как C4-S и C6-S. PH20 в естественных условиях участвует в адгезии сперматозоида и яйцеклетки и обеспечивает проникновение сперматозоидов через слой клеток кумулюса за счёт расщепления гиалуроновой кислоты. PH20 расположен на поверхности сперматозоидов и в акросоме (производной лизосомы), где он связывается с внутренней акросомной мембраной. PH20 плазматической мембраны имеют гиалуронидазную активность только при нейтральном pH, в то время как PH20 внутренней акросомной мембраны обладает активностью и в нейтральной, и в кислой среде. В дополнение к этому гиалуронидаза PH20 также, по-видимому, является рецептором для HA-индуцированного клеточного сигналинга и рецептором для зоны пеллюцида, окружающей яйцеклетку.

Примеры белков PH20 включают, но не ограничиваются ими, человеческую PH20 (полипептидпредшественник представлен в SEQ ID NO: 1, зрелый полипептид представлен в SEQ ID NO: 2), бычью PH20 (SEQ ID NO: 11 и 64), PH20 кролика (SEQ ID NO: 25), овечью PH20 (SEQ ID NO: 27, 63 и 65), PH20 обезьян циномолгус (SEQ ID NO: 29), PH20 морской свинки (SEQ ID NO: 30), PH20 крысы (SEQ ID NO: 31), PH20 мыши (SEQ ID NO: 32), PH20 шимпанзе (SEQ ID NO: 185) и PH20 макака-резуса (SEQ ID NO: 186).

Бычий PH20 является 553-аминокислотным полипептидом-предшественником (SEQ ID NO: 11). Выравнивание бычьего и человеческого PH20 показывает только небольшую степень гомологии, с множеством разрывов, присутствующих от аминокислоты 470 до соответствующего карбоксиконцевого остатка из-за отсутствия GPI якоря в бычьем полипептиде (см., например, Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427-440). На самом деле, наличие GPI якоря не предсказывают для PH20 многих других видов, кроме человека. Таким образом, полипептиды PH20, полученные из овец и крупного рогатого скота, естественно существуют как растворимые формы. Хотя бычий PH20 существует в виде очень слабо прикрепленного к плазматической мембране белка, он не закреплен с помощью чувствительного к фосфолипазе якоря (Lalancette et al. (2001) Biol. Reprod. 65(2):628-36). Эта уникальная особенность бычьей гиалуронидазы позволила использовать растворимую бычью гиалуронидазу яичек в виде экстракта для клинического применения (Wydase®, Hyalase®).

мРНК-транскрипт человеческой PH20 обычно транслируется в 509-аминокислотный полипептидпредшественник (SEQ ID NO: 1), содержащий сигнальную последовательность из 35 аминокислот на Nконце (позиции аминокислотных остатков 1-35) и 19-аминокислотную сигнальную последовательность присоединения гликозилфосфатидилинозитольного якоря (GPI) на С-конце (позиции аминокислотных остатков 491-509). Зрелая PH20, таким образом, является полипептидом из 474 аминокислот; представленным в SEQ ID NO: 2. После транспорта полипептида-предшественника в ЭР и удаления сигнального пептида С-концевой сигнальный заякоривающий пептид GPI расщепляется для облегчения ковалентного прикрепления GPI-якоря к вновь образованной С-концевой аминокислоте в положении аминокислоты, соответствующий положению 490 полипептида-предшественника, приведенного в SEQ ID NO: 1. Таким образом, производится 474-аминокислотный GPI-заякоренный зрелый полипептид с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2.

Хотя человеческая PH20 является активной в нейтральной среде гиалуронидазой, которая закреплена на плазматической мембране через GPI, когда она экспрессируется на внутренней мембране акросомы, она проявляет активность как в нейтральной, так и в кислой среде. Похоже, что PH20 содержит два каталитических центра на отдельных участках полипептида: участки пептид 1 и пептид 3 (Cherr et al., (2001) Matrix Biology 20:515-525). Участок пептида 1 PH20, который соответствует положениям аминокислот 107-137 зрелого полипептида, приведенного в SEQ ID NO: 2, и позициям 142-172 полипептидапредшественника, приведенного в SEQ ID NO: 1, является необходимым для активности фермента при нейтральном pH. Аминокислоты в положениях 111 и 113 (соответствующие положениям в зрелом полипептиде PH20, представленном в SEQ ID NO: 2) в пределах этого участка должны быть важными для активности, так как мутагенез заменой аминокислотного остатка приводит к образованию полипептида PH20 с 3% гиалуронидазной активности или недетектируемой гиалуронидазной активностью, соответственно, по сравнению с полипептидом PH20 дикого типа (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810- 39 033472

814).

Участок пептида 3, который соответствует положениям аминокислот 242-262 зрелого полипептида, приведенного в SEQ ID NO: 2, и положениям 277-297 полипептида-предшественника, приведенного в SEQ ID NO: 1, по-видимому, важен для активности фермента при кислых значениях pH. В пределах этого участка аминокислоты в положениях 249 и 252 зрелого полипептида PH20, по-видимому, важны для активности, так как мутагенез одного из двух аминокислотных остатков приводит к образованию полипептида, по существу, лишенного активности (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).

В дополнение к каталитическим центрам PH20 также содержит гиалуронансвязывающий сайт. Экспериментальные данные показывают, что этот участок расположен в участке пептида 2, что соответствует положениям аминокислот 205-235 полипептида-предшественника, приведенного в SEQ ID NO: 1, и положениям 170-200 зрелого полипептида, приведенного в SEQ ID NO: 2. Эта область высоко консервативна среди гиалуронидаз и похожа на гепаринсвязывающий мотив. Мутация остатка аргинина в положении 176 (соответствующем зрелому полипептиду PH20, приведенному в SEQ ID NO: 2) на глицин приводит к полипептиду с активностью гиалуронидазы лишь около 1% от активности полипептида дикого типа (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).

Есть семь потенциальных сайтов N-гликозилирования в человеческом PH20 в позициях N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 полипептида, приведенного в SEQ ID NO: 1. Поскольку аминокислоты с 36 по 464 из SEQ ID NO: 1, по-видимому, содержат активный минимальный домен человеческой гиалуронидазы PH20, сайт N-гликозилирования N-490 не требуется для активности гиалуронидазы. В человеческом PH20 есть шесть дисульфидных мостиков. Две дисульфидные связи между остатками цистеина С60 и С351 и между С224 и С238 полипептида показаны в SEQ ID NO: 1 (соответствуют остаткам С25 и C316, С189 и С203 зрелого полипептида, приведенного в SEQ ID NO: 2 соответственно). Еще четыре дисульфидные связи образуются между остатками цистеина С376 и С387; между С381 и С435; между С437 и С443 и между С458 и С464 полипептида, представленного в SEQ ID NO: 1 (соответствуют остаткам С341 и С352; С346 и С400; С402 и С408 и С423 и С429 зрелого полипептида, приведенного в SEQ ID NO: 2 соответственно).

2. Укороченные гиалуронидазы и другие растворимые формы.

Деградирующие гиалуронан ферменты могут существовать в связанной с мембраной или ассоциированной с мембраной форме или могут секретироваться в среду при экспрессии из клеток и тем самым существовать в растворимой форме. Для целей данного изобретения деградирующие гиалуронан ферменты включают любые деградирующие гиалуронан ферменты, которые при экспрессии и секреции из клеток не связаны с клеточной мембраной, и, таким образом, существуют в растворимой форме. Растворимые деградирующие гиалуронан ферменты включают, но не ограничиваются ими, не человеческие гиалуронидазы (например, животного или бактериального происходжения), такие как бычья PH20 или овечья PH20, и гиалуронидазы человека, такие как гиалуронидазы Hyal1, или укороченные формы не человеческих или человеческих мембранно-связанных гиалуронидаз, в частности укороченные формы человеческой PH20, их аллельные варианты и другие варианты. Примерами деградирующих гиалуронан ферментов в предусмотренных в настоящем документе совместных композициях являются укороченные формы деградирующего гиалуронан фермента, которые не имеют одного или нескольких аминокислотных остатков в гликозилфосфатидилинозитольном (GPI) якоре и которые сохраняют гиалуронидазную активность. В одном примере человеческая гиалуронидаза PH20, которая обычно заякорена в мембране с помощью GPI, может быть сделана растворимой путем укорочения и удаления всей или части GPI-якоря на С-конце.

Таким образом, в некоторых случаях деградирующий гиалуронан фермент, который обычно GPIзаякорен (как, например, человеческая PH20), становится растворимым путем укорочения с С-конца. Такое укорочение может привести к удалению всей сигнальной последовательности присоединения GPIякоря или только некоторой части этой сигнальной последовательности. Полученный полипептид, однако, является растворимым. В случаях, когда растворимый деградирующий гиалуронан фермент сохраняет часть сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря, в сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря могут быть сохранены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислотных остатков при условии, что полипептид растворим (т.е. при экспрессии секретируется из клетки) и активен. Специалист в данной области может определить, является ли полипептид GPI-заякоренным, используя способы, хорошо известные в данной области. Такие способы включают используемые известные алгоритмы для прогнозирования наличия и расположения сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря и ω-сайта, а также выполнение анализов растворимости до и после расщепления фосфатидилинозитол-специфическими фосфолипазами С (PI-PLC) или D (PI-PLD), но не ограничиваются ими.

Примерами растворимой гиалуронидазы являются PH20 из любых видов, такие как любая из представленных в SEQ ID NO: 1, 2, 11, 25, 27, 30-32, 63-65 и 185-186, или их укороченные формы, в которых отсутствует весь или часть С-концевого GPI-якоря, при условии, что гиалуронидаза растворима и сохраняет гиалуронидазную активность. Примеры растворимых гиалуронидаз, которые укорочены с С-конца и в которых отсутствует вся или часть сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря, включают, но не ограничиваются ими, полипептиды PH20 приматов, такие как, например, полипептиды PH20

- 40 033472 человека и шимпанзе. Например, растворимые полипептиды PH20 могут быть получены путем Сконцевого укорочения любого из зрелых полипептидов или полипептидов-предшественников, представленных в SEQ ID NO: 1, 2 или 185, или их аллельных или других их вариантов, включая их активные фрагменты, в результате чего полипептид становится растворимым и не имеет всех или части аминокислотных остатков из сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря. Также среди растворимых гиалуронидаз имеются аллельные варианты или другие варианты любой из SEQ ID NO: 1, 2, 11, 25, 27, 30-32, 63-65 и 185-186, или их укороченные формы. Аллельные варианты и другие варианты известны специалисту в данной области и включают полипептиды, имеющие 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или большую степень идентичности с любой из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 11, 25, 27, 30-32, 63-65 и 185-186, или их укороченными формами. Варианты аминокислот включают консервативные и не консервативные мутации. Понятно, что остатки, которые важны или необходимы для активности гиалуронидазы, такие как любой из описанных выше или известных специалисту в данной области, как правило, инвариантны и не могут быть изменены. К ним относятся, например, остатки активного центра. Так, например, аминокислотные остатки 111, 113 и 176 (что соответствует остаткам в зрелом полипептиде PH20, представленном в SEQ ID NO: 2) человеческого полипептида PH20 или его растворимой формы, как правило, инвариантны и не заменяются. Другие остатки, которые обеспечивают гликозилирование и образование дисульфидных связей, необходимые для правильного сворачивания, также могут быть инвариантными.

а). PH20 человека, укороченная с С-конца.

Примером растворимой гиалуронидазы является укороченная с С-конца человеческая PH20. Укороченные с С-конца формы рекомбинантного человеческого белка PH20 были получены и могут быть использованы в совместных композициях, описанных в данном документе. Получение таких растворимых форм PH20 описано в патенте США № 7767429 и патентных заявках США US 20040268425; US 20050260186, US 20060104968 и US 20100143457.

Например, укороченные с С-конца полипептиды PH20 включают полипептиды, которые содержат, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 (минимальная часть, необходимая для активности гиалуронидазы) или включают в себя последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, например по меньшей мере 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 97, 98% идентичности с последовательностью аминокислот, которая включает, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 из SEQ ID NO: 1, и сохраняют гиалуронидазную активность. Такие полипептиды PH20 человека включают полипептиды, которые полностью лишены всей сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря. Также среди этих полипептидов PH20 человека есть такие, которые не имеют части последовательно расположенных аминокислотных остатков в сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря (называются удлинёнными растворимыми PH20 (esPH20); см., например, US 20100143457). Укороченные с С-конца полипептиды PH20 могут быть укорочены с С-конца на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 или более аминокислот по сравнению с полноразмерным полипептидом дикого типа, например полноразмерным полипептидом дикого типа с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1 или 2, или его аллельными или видовыми вариантами, или другими вариантами. Таким образом, вместо того, чтобы GPI-якорь ковалентно связывался с С-концом белка в ЭР, и белок прикреплялся к внеклеточной стороне плазматической мембраны, эти полипептиды секретируются при экспрессии из клеток и являются растворимыми.

Примеры укороченных с С-конца полипептидов человеческой PH20, представленных здесь, включают любые полипептиды, которые содержат, по меньшей мере, аминокислоты 36-464 из SEQ ID NO: 1 и укорочены с С-конца после аминокислоты в положении 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 1, или ее варианта, который имеет идентичность последовательности с ней по меньшей мере 85%, например имеет идентичность последовательности с ней по меньшей мере 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% и сохраняет гиалуронидазную активность. В табл. 3 приведены не ограничивающие примеры укороченных с С-конца полипептидов PH20. В табл. 3 ниже указаны длина (количество аминокислот) предшественников и зрелых полипептидов и идентификатор (SEQ ID NO) последовательности, с которым приведены примеры аминокислотных последовательностей предшественников и зрелых полипептидов укороченных с С-конца белков PH20. Для сравнения в таблицу также включен полипептид PH20 дикого типа. Например, примеры укороченных с С-конца полипептидов PH20 включают, но не ограничиваются полипептидами, приведенными в любой из SEQ ID NO: 4-9, 47-48, 234-254, и 267-273, или полипептидами, которые проявляют по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 4-9, 47-48, 234-254, и 267-273.

- 41 033472

Таблица 3

Примеры укороченных с С-конца полипептидов РН20

Полипептид	Предшественник (аминокислоты)	Предшественник SEQ ID NO	Зрелый полипептид (аминокислоты)	Зрелый полипептид SEQ ID NO
Дикий тип	509	1	474	2
SPAM1-SILF	500	223	465	267
SPAM-VSIL	499	190	464	234
SPAM1-IVSI	498	224	463	268
SPAM1-FIVS	497	191	462	235
SPAM1-MFIV	496	225	461	269
SPAM1-TMFI	495	192	460	236
SPAM1-ATMF	494	226	459	270
SPAM 1-S ATM	493	193	458	237
SPAM1-LSAT	492	227	457	271
SPAM1-TLSA	491	194	456	238
SPAM1-STLS	490	196	455	240
SPAM1-PSTL	489	195	454	239
SPAM1-SPST	488	228	453	272
SPAM1-ASPS	487	197	452	241
SPAM1-NASP	486	229	451	273
SPAM1-YNAS	485	198	450	242
SPAM1-FYNA	484	199	449	243
SPAM1-IFYN	483	46	448	48
SPAM1-QIFY	482	3	447	4
SPAM1-PQIF	481	45	446	5
SPAM1-EPQI	480	44	445	6
SPAM1-EEPQ	479	43	444	7
SPAM1-TEEP	478	42	443	8
SPAM1-ETEE	477	41	442	9
SPAM1-METE	476	200	441	244
SPAM1-PMET	475	201	440	245
SPAM1-PPME	474	202	439	246
SPAM1-KPPM	473	203	438	247
SPAM1-LKPP	472	204	437	248
SPAM1-FLKP	471	205	436	249
SPAM1-AFLK	470	206	435	250
SPAM1-DAFL	469	207	434	251
SPAM1-IDAF	468	208	433	252
SPAM1-CIDA	467	40	432	47
SPAM1-VCID	466	209	431	253
SPAM1-GVCI	465	200	430	254

b). rHuPH20.

Примером укороченной с С-конца формы SEQ ID NO: 1 является полипептид, который укорочен после аминокислоты 482 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. Такой полипептид может быть получен из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 1-482 (приведены в SEQ ID NO: 3). Пример такой нуклеиновой кислоты представлен в SEQ ID NO: 49. Посттрансляционная модификация удаляет 35 аминокислот сигнальной последовательности, в результате чего остаётся 447аминокислотная растворимая рекомбинантная человеческая PH20 (SEQ ID NO: 4). Так как белок производится в культуральной среде, есть гетерогенность в С-концевой последовательности, так что продукт, обозначенный rHuPH20, включает смесь молекул, которые могут включать в себя любой (любые) из SEQ ID NO: 4-9 в различном количестве. Как правило, rHuPH20 получают в клетках, таких как СНО (например, клетки СНО DG44), которые обеспечивают правильное N-гликозилирование для сохранения активности.

3. Гликозилирование деградирующих гиалуронан ферментов.

Гликозилирование, в том числе N- и О-гликозилирование, некоторых деградирующих гиалуронан ферментов, в том числе гиалуронидаз, может быть важно для их каталитической активности и стабильности. В то время как изменение типа гликана, модифицирующего гликопротеин, может иметь серьёзные последствия для антигенности белка, структурного фолдинга, растворимости и стабильности, большинство ферментов не требуют гликозилирования для оптимальной активности. Для некоторых гиалурони- 42 033472 даз удаление N-гликозилирования может привести к почти полной потере активности гиалуронидазы.

Таким образом, для таких гиалуронидаз присутствие N-связанных гликанов является критическим для образования активного фермента.

N-связанные олигосахариды делятся на несколько основных типов (олигоманнозы, сложные, гибридные, сульфатированные), каждый из которых имеет (Man)з-GlcNAc-GlcNAc-остов, связывающийся через амидный азот Asn-остатков, которые входят в -Asn-Xaa-Thr/Ser-последовательности (где Хаа не является Pro). Гликозилирование по -Asn-Xaa-Cys-сайту было показано для белка С коагуляции. В некоторых случаях деградирующий гиалуронан фермент, такой как гиалуронидаза, может содержать как N-, так и О-гликозидные связи. Например, PH20 имеет О-связанные олигосахариды, а также N-связанные олигосахариды. Есть семь потенциальных сайтов N-гликозилирования в позициях N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 человеческого PH20, приведённого в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные остатки N82, N166 и N254 заняты гликанами сложного типа, тогда как аминокислотные остатки N368 и N393 заняты гликанами высокоманнозного типа. Аминокислотный остаток N235 занят примерно на 80% высокоманнозными гликанами и на 20% гликанами сложного типа. Как отмечалось выше, Nгликозилирование по N490 не требуется для активности гиалуронидазы.

В некоторых примерах, деградирующие гиалуронан ферменты, используемые здесь, гликозилированы по одному или всем сайтам гликозилирования. Например, для человеческой PH20 или ее растворимой формы гликозилированы 2, 3, 4, 5 или 6 из сайтов N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166, N235, N254, N368, N393 из SEQ ID NO: 1. В некоторых примерах деградирующие гиалуронан ферменты гликозилированы по одному или нескольким нативным сайтам гликозилирования. Обычно растворимые формы PH20 получают с применением систем экспрессии белка, которые обеспечивают правильное N-гликозилирование, чтобы полипептид сохранял активность, так как гликозилирование важно для каталитической активности и стабильности гиалуронидаз. Такие клетки включают, например, клетки яичника китайского хомячка (СНО) (например, клетки DG44 СНО).

В других примерах деградирующие гиалуронан ферменты модифицируют по одному или нескольким не нативным сайтам гликозилирования, чтобы обеспечить гликозилирование полипептида по одному или нескольким дополнительным сайтам. В таких примерах связывание дополнительных углеводных фрагментов может улучшить фармакокинетические свойства молекулы, например увеличить время полувыведения и/или повысить активность.

В других примерах деградирующие гиалуронан ферменты, такие как PH20 или PH20 человека, используемые в способах, предусмотренных в настоящем документе, являются частично дегликозилированными (или частично N-гликозилированными полипептидами) (см., например, US 20100143457). Гликозидазы, или гликозид гидролазы, представляют собой ферменты, которые катализируют гидролиз гликозидной связи, чтобы образовать два меньших углевода. Основные виды N-гликанов позвоночных включают высокоманнозные гликаны, гибридные гликаны и сложные гликаны. Есть несколько гликозидаз, которые приводят только к частичному дегликозилированию белка; они включают EndoF1, которая расщепляет высокоманнозные и гибридные гликаны; EndoF2, которая расщепляет биантеннальные гликаны сложного типа; EndoF3, которая расщепляет биантеннальные и более разветвленные сложные гликаны, и EndoH, которая расщепляет высокоманнозные и гибридные гликаны. Например, обработка PH20 (например, рекомбинантной PH20, обозначаемой rHuPH20) одной или всеми указанными выше гликозидазами (например, EndoF1, EndoF2, EndoF3 и/или EndoH) приводит к частичному дегликозилированию. Эти частично дегликозилированные полипептиды PH20 могут проявлять гиалуронидазную ферментативную активность, которая сопоставима с полностью гликозилированными полипептидами. В отличие от этого обработка PH20 гликозидазой PNGазой F, которая расщепляет все N-гликаны, или туникамицином, ингибитором GlcNAc фосфотрансферазы (GPT), приводит к полному дегликозилированию всех Nгликанов и тем самым делает PH20 ферментативно неактивной. Таким образом, хотя все сайты Nгликозилирования (такие как, например, по аминокислотам N82, N166, N235, N254, N368 и N393 человеческой PH20, приведенной в SEQ ID NO: 1) могут быть гликозилированы, обработка одной или несколькими гликозидазами может сделать степень гликозилирования пониженной по сравнению с гиалуронидазой, которая не подвергалась обработке одной или несколькими гликозидазами.

Таким образом, частично дегликозилированные деградирующие гиалуронан ферменты, такие как частично дегликозилированные растворимые гиалуронидазы, могут быть получены путем гидролиза одной или несколькими гликозидазами, как правило, гликозидазами, который не удаляют все N-гликаны, но только частично дегликозилируют белок. Частично дегликозилированные деградирующие гиалуронан ферменты, в том числе частично дегликозилированные растворимые полипептиды PH20, могут иметь 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% от уровня гликозилирования полностью гликозилированного полипептида. В одном примере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 из сайтов N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166, N235, N254, N368 и N393 в SEQ ID NO: 1, частично дегликозилированы таким образом, что они больше не содержат высокоманнозных или сложных гликанов, а скорее содержат, по меньшей мере, фрагмент N-ацетилглюкозамина. В некоторых примерах 1, 2 или 3 из сайтов N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166 и N254 в SEQ ID NO: 1, являются дегликозилированными, то есть они не содержат углеводную группировку. В других примерах 3, 4, 5 или 6 из сайтов N- 43 033472 гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166, N235, N254, N368 и N393 в SEQ ID NO: 1 гликозилированы. Гликозилированные аминокислотные остатки минимально содержат фрагмент Nацетилглюкозамина. Как правило, частично дегликозилированные деградирующие гиалуронан ферменты, в том числе частично дегликозилированные растворимые полипептиды PH20, проявляют гиалуронидазную активность, которая составляет 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500, 1000% или более от активности гиалуронидазы, проявляемой полностью гликозилированным полипептидом.

4. Модификации деградирующих гиалуронан ферментов, улучшающие их фармакокинетические свойства.

Деградирующие гиалуронан ферменты могут быть модифицированы для улучшения их фармакокинетических свойств, например увеличения времени полужизни in vivo и/или активности. Модификация деградирующих гиалуронан ферментов для применения в предусмотренных в настоящем документе композициях или совместных композициях может включать в себя присоединение прямо или через линкер, ковалентно или другой стабильной связью, полимера, такого как декстран, полиэтиленгликоль (пегилирование (PEG)) или сиалильный фрагмент, или других подобных полимеров, таких как природные полимеры сахаров.

Пегилирование, как известно, повышает устойчивость к протеолизу, увеличивает период полужизни в плазме и снижает антигенность и иммуногенность. Ковалентное или другое стабильное присоединение (коньгирование) полимерных молекул, таких как фрагменты полиэтиленгликоля (PEG), к ферменту, разрушающему гиалуроновую кислоту, таким образом, может придать полезные свойства полученной композиции фермент-полимер. Такие свойства включают улучшенную биосовместимость, увеличенное время полужизни (и ферментативную активность) белка в крови, клетках и/или других тканях в субъекте, эффективное экранирование белка от протеаз и гидролиза, улучшение биораспределения, фармакокинетики и/или фармакодинамики и повышение растворимости в воде.

Примеры полимеров, которые могут быть конъюгированы с ферментом, разрушающим гиалуроновую кислоту, включают природные и синтетические гомополимеры, такие как полиолы (например, полиОН), полиамины (т.е. поли-NH₂) и поликарбоновые кислоты (т.е. поли -СООН), а также гетерополимеры, т.е. полимеры, содержащие одну или более различных соединяемых групп, например гидроксильную группу и аминогруппу. Примеры подходящих полимерных молекул включают полимерные молекулы, выбранные из таких веществ как полиалкиленоксиды (РАО), такие как полиалкиленгликоли (PAG), включая полиэтиленгликоли (PEG), метоксиполиэтиленгликоли (mPEG) и полипропиленгликоли, PEGглицидиловые эфиры (Epox-PEG), PEG-оксикарбонилимидазол (CDI-PEG), разветвленные полиэтиленгликоли (PEG), поливиниловый спирт (PVA), поликарбоксилаты, поливинилпирролидон, поли^,Ьаминокислоты, ангидрид полиэтилен-ко-малеиновой кислоты, ангидрид полистирол-ко-малеиновой кислоты, декстраны, в том числе карбоксиметилдекстраны, гепарин, гомологичный альбумин, целлюлоза, в том числе метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, карбоксиэтилцеллюлоза и гидроксипропилцеллюлоза, гидролизаты хитозана, крахмалы, такие как гидроксиэтил-крахмал и гидроксипропил-крахмал, гликоген, агарозы и их производные, гуаровая камедь, пуллулан, инулин, ксантановая камедь, каррагинан, пектин, гидролизаты альгиновой кислоты и биополимеры.

Как правило, полимеры представляют собой полиалкиленоксиды (РАО), такие как полиэтиленоксиды, такие как PEG, обычно mPEG, которые по сравнению с полисахаридами, такими как декстран, пуллулан и т.п., имеют не много реакционноспособных групп, образующих сшивки. Как правило, полимеры представляют собой нетоксичные полимерные молекулы, такие как (метокси)полиэтиленгликоль (mPEG), который может быть ковалентно конъюгирован с ферментом, разрушающим гиалуроновую кислоту (например, для присоединения к группам на поверхности белка) с применением относительно простых химических реакций.

Подходящие полимерные молекулы для присоединения к ферменту, разрушающему гиалуроновую кислоту, включают, но не ограничиваются ими, полиэтиленгликоль (PEG) и PEG-производные, такие как метоксиполиэтиленгликоли (mPEG), PEG-глицидиловые эфиры (Epox-PEG), PEG-оксикарбонилимидазол (CDI-PEG), разветвленные PEG и полиэтиленоксид (РЕО) (см., например, Roberts et al., Advanced Drag Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S (eds.) Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, Nature Reviews 2(3):214-221 (2003); и Tsubery, J. Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004). Полимерная молекула может иметь молекулярную массу, как правило, в диапазоне примерно от 3 до примерно 60 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимерная молекула, которая конъюгирована с белком, таким как rHuPH20, имеет молекулярную массу 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 или более 60 кДа.

Различные способы модификации полипептидов ковалентным присоединением (путём конъюгации) PEG или PEG-производных (т.е. пегилирование) известны в данной области (см., например, опубликованные заявки США №№ 20060104968 и 20040235734; патенты США №№ 5672662 и 6737505). Способы пегилирования включают, но не ограничиваются применением специализированных линкеров и соединяющих агентов (см., например, Roberts et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), присоеди

- 44 033472 нением множества фрагментов PEG к одному сайту конъюгации (например, с помощью применения разветвленных PEG; см., например, Guiotto et al., Bioorg. Med Chem. Lett. 12:177-180, 2002), сайтспецифическим пегилированием и/или монопегилированием (см., например, Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999) и сайт-специфическим ферментативным пегилированием (см., например, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002) (см. также, например, Lu and Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138; Lu and Felix (1993) Peptide Res. 6:142-6, 1993; Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:25364; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404; Brumeanu et al. (1995) J. Immunol. 154:3088-95; see also, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77 and Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). Способы и методики, описанные в данной области техники, позволяют получать белки, имеющие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более 10 PEG или производных PEG, присоединенных к одной молекуле белка (см., например, опубликованную заявку США № 20060104968).

Многочисленные реагенты для пегилирования были описаны в данной области. Такие реагенты включают, но не ограничиваются ими, активированный N-гидроксисукцинимидилом (NHS) PEG, сукцинимидил mPEG, mPEG2-N-гидроксисукцинимид, mPEG сукцинимидил α-метилбутаноат, mPEG сукцинимидилпропионат, mPEG сукцинимидилбутаноат, сукцинимидиловый эфир mPEG карбоксиметил 3гидроксибутановой кислоты, гомобифункциональный PEG-сукцинимидилпропионат, гомобифункциональный PEG-пропиональдегид, гомобифункциональный PEG-бутиральдегид, PEG-малеимид, PEGгидразид, паранитрофенил-карбонат PEG, mPEG-бензотриазол карбонат, пропиональдегид PEG, mPEG бутиральдегид, разветвленный mPEG2 бутиральдегид, mPEG ацетил, mPEG пиперидон, mPEG метилкетон, mPEG малеимид без линкера, mPEG-винилсульфон, mPEG-тиол, mPEG-ортопиридилтиоэфир, mPEG-ортопиридил дисульфид, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, винилсульфон PEG-NHS, акрилат PEGNHS, флуоресцеин PEG-NHS и биотин PEG-NHS (см., например, Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; US 5672662; US 5932462; US 6495659; US 6737505; US 4002531; US 4179337; US 5122614; US 5324844; US 5446090; US 5612460; US 5643575; US 5766581; US 5795569; US 5808096; US 5900461; US 5919455; US 5985263; US 5990237; US 6113906; US 6214966; US 6258351; US 6340742; US 6413507; US 6420339; US 6437025; US 6448369; US 6461802; US 6828401; US 6858736; US 2001/0021763; US 2001/0044526; US 2001/0046481; US 2002/0052430; US 2002/0072573; US 2002/0156047; US 2003/0114647; US 2003/0143596; US 2003/0158333; US 2003/0220447; US 2004/0013637; US 2004/0235734; US 2005/0114037; US 2005/0171328; US 2005/0209416; EP 01064951; EP 0822199; WO 01076640; WO 0002017; WO 0249673; WO 0500360; WO 9428024 и WO 0187925).

D. Стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента.

Здесь предусмотрены стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента, содержащие стабилизирующее вспомогательное вещество, а именно двухвалентный катион. Примеры двухвалентных катионов включают, но не ограничиваясь этим, лизил лизин (дилизин; Lys-Lys) или магний (например, MgCl₂) или их соли, производные, аналоги или миметики. В конкретных примерах стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента в качестве стабилизирующего вспомогательного вещества содержат Lys-Lys или его соли, производные, аналоги или миметики. В других примерах стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента в качестве стабилизирующего агента содержат MgCl₂ или его производные, аналоги или миметики. Деградирующие гиалуронан ферменты, содержащие двухвалентный катион, например, Lys-Lys или MgCl₂, стабильны при температурах выше или равных 37°С в течение по меньшей мере трех дней и обычно по меньшей мере шести дней, одной недели, двух недель, трех недель или четырех недель (одного месяца). Например, такие композиции стабильны при температурах выше или равных от 37 до 42°С, например по меньшей мере, или приблизительно, или примерно 40°С, в течение по меньшей мере одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, семи месяцев, восьми месяцев, девяти месяцев, десяти месяцев, одиннадцати месяцев, двенадцати месяцев или больше.

Существующие композиции деградирующих гиалуронан ферментов содержат человеческий сывороточный альбумин (HSA) в качестве стабилизатора. Например, рекомбинантная Hylenex® содержит 1,0 мг человеческого альбумина. Стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента, свободные от HSA, желательны по нескольким причинам. Во-первых, HSA представляет собой вещество, получаемое из крови, и, таким образом, часто не является чистым. Продукты деградации и загрязнители HSA могут препятствовать активности фермента. Помимо этого, HSA как таковой имеет проблемы со стабильностью, поскольку он может образовывать агрегаты при определенных условиях. Здесь обнаружено, что стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента, например PH20, свободные от HSA, могут быть созданы за счет включения двухвалентного катиона, например Lys-Lys.

Также, как обсуждалось в настоящем документе, большинство существующих композиций деградирующего гиалуронан фермента, например гиалуронидазы, такой как PH20, также содержат NaCl в качестве стабилизирующего агента. Присутствие NaCl в большом количестве между или примерно между 130 и 150 мМ NaCl или еще больше обычно необходимо для оптимальной активности и стабильности фермента. Например, коммерческая композиция PH20 Hylenex® содержит 145 мМ NaCl. Как показано

- 45 033472 здесь в примерах, двухвалентный катион Lys-Lys и MgCl₂ оказывает стабилизирующее воздействие на деградирующий гиалуронан фермент, например PH20, которое превышает эффект NaCl. Это является предпочтительным, поскольку здесь обнаружено, что NaCl не эффективно стабилизирует PH20 при инкубации при повышенных или увеличенных температурах больше чем 37°С (см., примеры 23 и 24). В противоположность этому, активность PH20 в композициях, содержащих двухвалентные катионы, такие как Lys-Lys, сохраняется при повышенных температурах, таким образом, что композиции обладают активность вплоть до 70% или больше, и, как правило, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 80, 85, 90% или большей активностью после инкубации в течение 4 недель при температурах выше или равных 37°С, например выше или равных от 37 до 42°С, например по меньшей мере, или приблизительно, или примерно 40°С в течение по меньшей мере одного месяца. Здесь в примерах композиций, содержащих двухвалентный катион в качестве стабилизатора, например, Lys-Lys, активность деградирующего гиалуронан фермента при повышенных температурах по меньшей мере, или примерно по меньшей мере от 38 до 42°С и в особенности при 40°С повышена по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или больше по сравнению с активностью деградирующего гиалуронан фермента, который не содержит двухвалентный катион (например, содержит NaCl в качестве стабилизирующего агента).

Здесь предусмотрены стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и количество двухвалентного катиона, такого как Lys-Lys или MgCl2, достаточное для создания композиции, стабильной при температурах выше или равных 37°С в течение по меньшей мере одного месяца. В конкретных примерах здесь предусмотрены стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента, содержащие терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и количество Lys-Lys, достаточное для создания композиции, стабильной при температурах выше или равных 37°С в течение по меньшей мере одного месяца. Например, такие композиции стабильны при температурах выше или равных от 37 до 42°С, например по меньшей мере, или приблизительно, или примерно 40°С в течение по меньшей мере одного месяца. Композиции, как правило, также содержат поверхностно-активное вещество, антиоксидант (например, метионин), имеют pH между или примерно между 6,5 и 7,8 и содержат буферный агент, который поддерживает диапазон pH. Необязательно композиции могут содержать одно или несколько стабилизирующих веществ, модификаторов тоничности, консервантов или вспомогательных веществ.

Как правило, соединения вводят в фармацевтические композиции с использованием методик и процедур, хорошо известных в области техники (см., например, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126). Фармацевтически приемлемые композиции готовят с учетом указаний регулирующих ведомств или других ведомств в соответствии с общепризнанной фармакопеей для применения на животных и на людях. Композиция должна соответствовать способу введения.

Стабильные композиции могут быть предусмотрены как фармацевтический препарат в жидкой форме в виде растворов, сиропов или суспензий. В жидкой форме фармацевтические препараты могут быть предусмотерны в виде концентрированного препарата для разбавления перед применением до терапевтически эффективной концентрации. Как правило, препараты предусмотрены в дозированной форме, не требующей разбавления перед применением, т.е. как композиции для непосредственного введения. Такие жидкие препараты могут быть изготовлены традиционными способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие вещества (например, сироп сорбита, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгаторы (например, лецитин или аравийская камедь); неводные носители (например, миндальное масло, жирные сложные эфиры или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). В другом примере фармацевтические препараты могут быть представлены в лиофилизированной форме для восстановления водой или другим подходящим носителем перед применением. Композиции могут быть изготовлены в виде однодозовых композиций или многодозовых композиций.

Объем предусмотренных здесь композиций может быть любым объемом, который подходит для предусмотренного контейнера. В некоторых примерах композиции предусмотрены во флаконе, шприце или любом другом подходящем контейнере. Например, предусмотренные здесь стабильные композиции имеют объем, составляющий или составляющий примерно от 0,1 до 500 мл, например от 0,1 до 100 мл, от 1 до 100 мл, от 0,1 до 50 мл, например по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или примерно или 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 мл или больше.

Ниже предусмотрено описание компонентов, предусмотренных в стабильных композициях деградирующего гиалуронан фермента по настоящему документу. Следующие стабильные композиции являются только примерами и создают основу, в которую могут быть внесены незначительные корректировки. Понятно, что небольшие изменения в концентрации различных вспомогательных веществ и других компонентов (например, ±15% от указанных концентраций) или небольшие изменения pH могут быть внесены при сохранении некоторого уровня стабильности или всей стабильности деградирующего гиалуронан фермента. Дальнейшие изменения также могут быть внесены при добавлении или удалении

- 46 033472 вспомогательных веществ. Например, может быть изменен тип стабилизирующего поверхностноактивного вещества.

1. Деградирующий гиалуронан фермент.

Количество фермента, разрушающего хиалуронан (деградирующего гиалуронан фермента), такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), в предусмотренных здесь стабильных композициях представляет собой количество для непосредственного введения, достаточное для достижения терапевтического эффекта. В одном из примеров количество представляет собой количество для непосредственного введения, достаточное для деградации гиалуроновой кислоты (HA) в подкожном пространстве под наружной поверхностью кожи человека. Например, количество деградирующего гиалуронан фермента в композиции представляет собой количество для непосредственного введения для увеличения дисперсии и абсорбции совместно инъецируемого или совместно вводимого терапевтического агента. В другом примере количество представляет собой количество для непосредственного введения, достаточное для деградации гиалуроновой кислоты (HA), которая связана с пораженной тканью или клеткой. Например, количество представляет собой количество для непосредственного введения, достаточное для деградации HA, которая связана с опухолевыми клетками. В таких примерах количество представляет собой количество для уменьшения или снижения давления межклеточной жидкости (IFP) или увеличения объема сосудов опухоли.

Например, количество функционально эквивалентно по меньшей мере или примерно по меньшей мере 30 ед./мл. Например, предусмотренные здесь композиции содержат деградирующий гиалуронан фермент, такой как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), в количестве, составляющем или составляющем примерно от 30 до 20,000 ед./мл, от 300 до 15,000 ед./мл, от 300 до 10,000 ед./мл, от 300 до 5,000 ед./мл, от 300 до 3000 ед./мл, от 300 до 2000 ед./мл, от 600 до 20,000 ед./мл, от 600 до 15,000 ед./мл, от 600 до 10,000 ед./мл, от 600 до 6000 ед./мл, от 600 до 4000 ед./мл, от 600 до 2000 ед./мл, от 600 до 1000 ед./мл, от 60 до 600 ед./мл или от 100 до 300 ед./мл, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 30, 35, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 12,000, 15,000 или 20,000 ед./мл. Например, предусмотренные здесь композиции содержат PH20 (например, rHuPH20) в количестве, которое составляет по меньшей мере от 100 до 300 ед./мл, например по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или примерно, или составляет 100, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 220, 240, 260, 280 или 300 ед./мл.

В предусмотренных здесь стабильных композициях стабильность деградирующего гиалуронан фермента, в том числе гиалуронидазы, такой как PH20 (например, rHuPH20), в композициях зависит от обнаружения и/или активности фермента при повышенных температурах выше или равных от 37 до 42°С, например по меньшей мере, или приблизительно, или примерно 37 или 40°С в течение по меньшей мере трех дней и, как правило, по меньшей мере одного месяца, как описано выше. Методы оценки этих параметров описаны в настоящем документе. Предусмотренные здесь композиции сохраняют обнаружение и/или активность гиалуронидазы на таком уровне, что композиции подходят для терапевтического применения, как описано здесь. В предусмотренных здесь стабильных композициях активность деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20, как правило, составляет по меньшей мере или примерно 50%, например по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше от начальной активности фермента в композиции до воздействия температур выше или равных от 37 до 42°С в течение по меньшей мере трех дней и, как правило, по меньшей мере одного месяца, как описано здесь. Например, активность деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20, как правило, составляет по меньшей мере или примерно 50%, например по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% от активности той же композиции фермента при хранении при 4°С в течение по меньшей мере одного месяца. Как правило, предусмотренные здесь композиции деградирующего гиалуронан фермента сохраняют по меньшей мере 70% от начальной активности фермента в течение по меньшей мере одного месяца при хранении или применении при температурах выше или равных от 37 до 42°С, например по меньшей мере, или приблизительно, или примерно 37 или 40°С. Таким образом, например, в растворе, составленном из 600 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, например rHuPH20, сохраняется по меньшей мере или примерно по меньшей мере 360, 365, 370, 375, 380, 390, 420, 480, 540, 546, 552, 558, 564, 570, 576, 582, 588, 594 ед./мл или больше активности при температурах выше или равных от 37 до 42°С, например по меньшей мере, или приблизительно, или примерно 37 или 40°С в течение по меньшей мере одного месяца. В других примерах стабильность можно оценить как функцию обнаружения фермента, например, с использованием RP-HPLC. В таких примерах в предусмотренных здесь композициях обнаружение фермента гиалуронидазы составляет или составляет примерно от 60 до 140%. Например, в предусмотренных здесь композициях обнаружение фермента гиалуронидазы составляет или составляет примерно 3-7 мкг/мл.

2. Двухвалентный катион.

Предусмотренные здесь стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента содержат количество двухвалентного катиона для сохранения по меньшей мере 50% и, как правило, по меньшей мере 70% от начальной ферментативной активности деградирующего гиалуронан фермента при темпера- 47 033472 турах между или приблизительно между 37 и 42°С, например по меньшей мере, или примерно, или приблизительно 37 или 40°С, в течение по меньшей мере трех дней и, как правило, по меньшей мере одного месяца (например, 4 недель), как описано в настоящем документе. Например, количество двухвалентного катиона представляет собой количество для сохранения по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше от начальной ферментативной активности деградирующего гиалуронан фермента в течение по меньшей мере трех дней и, как правило, в течение 4 недель при температурах между или приблизительно между 37 и 42°С, например по меньшей мере, или примерно, или приблизительно 40°С.

Например, предусмотренные здесь стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента могут содеражать количество Lys-Lys, его соли, производного, аналога или миметика для сохранения по меньшей мере 50% и, как правило, по меньшей мере 70% от начальной ферментативной активности деградирующего гиалуронан фермента при температурах между или приблизительно между 37 и 42°С, например по меньшей мере, или примерно, или приблизительно 37 или 40°С, в течение по меньшей мере трех дней и, как правило, по меньшей мере 4 недель. Такие предусмотренные здесь стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента (например, гиалуронидазы, например PH20) содержат между или примерно между 5 и 300 мМ Lys-Lys, например от 10 до 200 мМ, от 50 до 150 мМ или от 10 до 50 мМ. Например, предусмотренная здесь стабильная композиция деградирующего гиалуронан фермента (например, гиалуронидазы, например PH20) содержит по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 300 мМ или больше Lys-Lys.

В другом примере предусмотренные здесь стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента могут содержать количество MgCl2, его производного, аналога или миметика для сохранения по меньшей мере 50% и, как правило, по меньшей мере 70% от начальной ферментативной активности деградирующего гиалуронан фермента при температурах между или приблизительно между 37 и 42°С, например по меньшей мере, или примерно, или приблизительно 37 или 40°С, в течение по меньшей мере трех дней и, как правило, по меньшей мере 4 недель. Такие предусмотренные здесь стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента (например, гиалуронидазы, например PH20) содержат между или примерно между 5 и 300 мМ MgCl₂, например от 10 до 200 мМ, от 50 до 150 мМ или от 10 до 50 мМ. Например, предусмотренная здесь стабильная композиция деградирующего гиалуронан фермента (например, гиалуронидазы, например PH20) содержит по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 300 мМ или больше MgCl₂.

Как обсуждается ниже, композиции, содержащие двухвалентный катион (например, Lys-Lys), если необходимо, также могут содержать модификатор тоничности (например, NaCl).

3. pH и буфер.

Здесь предусмотрены стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), имеющие pH между или примерно между 6,5 и 7,8 или 6,8 и 7,8, например между или примерно между 6,5 и 7,5 или 7,0 и 7,6. Ссылка на pH в настоящем документе относится к измерению pH при комнатной температуре. Понятно, что pH может изменяться в процессе хранения с течением времени, но, как правило, будет сохраняться между или примерно между pH 6,5 и 7,8, например между или примерно между 6,8 и 7,8. Например, pH может меняться на ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 или больше. Таким образом, понятно, что ссылка на композицию, которая имеет pH примерно или по меньшей мере 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 или 7,6, включает совместные композиции, которые в готовом виде имеют pH, равный, или примерно равный, или по меньшей мере равный 6,5±0,2, 6,6±0,2, 6,7±0,2, 6,8±0,2, 6,9±0,2, 7,0±0,2, 7,1±0,2, 7,2±0,2, 7,3±0,2, 7,4±0,2, 7,5±0,2 или 7,6±0,2.

Если необходимо, pH может быть доведен с помощью подкислителей для снижения pH или подщелачивающих агентов для увеличения pH. Примеры подкислителей включают, но не ограничиваясь этим, уксусную кислоту, лимонную кислоту, серную кислоту, соляную кислоту, раствор одноосновного фосфата натрия и фосфорную кислоту. Примеры подщелачивающих агентов включают, но не ограничиваясь этим, раствор двухосновного фосфата натрия, карбонат натрия и гидроксид натрия.

Любой буфер может быть использован в предусмотренных здесь совместных композициях, если только он не оказывает отрицательного влияния на стабильность композиции и поддерживает требуемый диапазон pH. Примеры конкретных подходящих буферов включают Трис, сукцинатные, ацетатные, фосфатные буферы, гистидин, цитрат, аконитат, малат и карбонат. Специалисту в данной области техники, тем не менее, будет понятно, что предусмотренные здесь композиции не ограничены конкретными буферами, если только буфер обеспечивает приемлемый уровень стабильности pH или буферную емкость в указанном диапазоне. Как правило, буфер имеет адекватную буферную емкость в пределах примерно 1 единицы pH от его pK (Lachman et al. 1986). Пригодность буфера можно оценить, основываясь на опубликованных таблицах pK, или можно определить эмпирическим способами, хорошо известными в данной области техники. pH раствора может быть доведен до желаемого значения в пределах диапазона, как описано выше, например, с помощью любой приемлемой кислоты или основания.

Буферы, которые могут быть включены в предусмотренные здесь совместные композиции, вклю

- 48 033472 чают, но не ограничиваясь этим, Трис (трометамин), гистидиновый, фосфатный буфер, такой как двухосновный фосфат натрия, и цитратный буфер. Например, буфером может быть гистидин гидрохлоридный буфер (гистидин/HCl). Как правило, буферный агент присутствует здесь в количестве для поддержания pH совместной композиции в диапазоне между или примерно между 6,5 и 7,8, например между или примерно между 6,8 и 7,8, например между или примерно между 7,0 и 7,6. Такие буферные вещества могут присутствовать в композициях в концентрациях между или примерно между 1 и 100 мМ, например от 10 до 50 мМ или от 20 до 40 мМ, например или примерно 30 мМ. Например, такие буферные вещества могут присутствовать в совместных композициях в концентрации, равной или равной примерно, или по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 мМ или больше.

В некоторых примерах буферный агент не требуется.

4. Поверхностно-активные вещества.

Предусмотренные здесь стабильные композиции содержат одно или несколько поверхностноактивных веществ. Такие поверхностно-активные вещества ингибируют агрегацию деградирующего гиалуронан фермента, такого как, например, гиалуронидаза PH20 (например, rHuPH20), и сводят к минимуму потери за счёт абсорбции. Поверхностно-активные вещества обычно являются неионньми поверхностно-активными веществами. Поверхностно-активные вещества, которые могут быть включены в композиции по данному изобретению, включают, но не ограничиваются ими, частичные сложные эфиры жирных кислот и простые эфиры многоатомных спиртов, таких как глицерин или сорбит, полоксамеры и полисорбаты. Например, примеры поверхностно-активных веществ в совместных композициях по данному изобретению включают любое одно или более из следующих веществ: полоксамер 188 (Pluronics®, такие как PLURONIC® F68), Tetronics®, полисорбат 20, полисорбат 80, ПЭГ 400, ПЭГ 3000, Tween® (Твин) (например, Tween® 20 или Tween® 80), Тритон® Х-100, SPAN®, MYRJ®, BRIJ®, Cremophor®, полипропиленгликоли или полиэтиленгликоли. В некоторых примерах в настоящем документе совместные композиции содержат полоксамер 188, полисорбат 20, полисорбат 80, как правило, полоксамер 188 (Pluronic F68). Совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, как правило, содержат по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, например 1, 2 или 3 поверхностноактивных вещества.

В предусмотренных в настоящем документе композициях общее количество одного или более поверхностно-активного вещества в процентах массовой концентрации (мас./об.) в композиции может составлять, например, между или примерно между 0,005 и 1,0%, например между или примерно между 0,01 и 0,5%, например от 0,01 до 0,1% или от 0,01 до 0,02%. Как правило, совместные композиции содержат по меньшей мере 0,01% поверхностно-активного вещества, но менее 1,0%, например менее 0,5% или менее 0,1% поверхностно-активного вещества. Например, совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, могут содержать по меньшей мере или примерно 0,001, 0,005, 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,08% или 0,09% поверхностно-активного вещества. В конкретных примерах совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, содержат или содержат примерно от 0,01 до или примерно до 0,05% поверхностно-активного вещества.

В настоящем документе авторами обнаружено, что окисление фермента может увеличиваться с увеличением уровня поверхностно-активного вещества. Кроме того, поверхностно-активное вещество полоксамер 188 меньше способствует окислению, чем полисорбаты. Таким образом, совместные композиции обычно содержат полоксамер 188. Таким образом, хотя поверхностно-активные вещества могут стабилизировать деградирующий гиалуронан фермент, включение поверхностно-активных веществ в композиции, предусмотренные в настоящем документе, может привести при высоких концентрациях к окислению деградирующего гиалуронан фермента. Таким образом, в целом, в совместных композициях по настоящему документу применяют более низкие концентрации поверхностно-активного вещества, например, в процентах массовой концентрации (мас./об.) менее 1,0% и обычно между или примерно между 0,01 и 0,05%, например 0,01%. Кроме того, как указано здесь ниже, для снижения или предотвращения окисления в композиции могут быть включены антиоксиданты.

5. Антиоксидантный агент.

Предусмотренные здесь композиции также содержат антиоксиданты для снижения или предотвращения окисления, в особенности окисления деградирующего гиалуронан фермента. Например, в примерах здесь показано, что окисление может быть вызвано высокими концентрациями поверхностноактивного вещества. Примеры антиоксидантов включают, но не ограничиваются ими, цистеин, триптофан и метионин. В конкретных примерах антиокисдант представляет собой метионин. Предусмотренные здесь композиции могут включать антиоксидант в концентрации от или примерно от 5 до или примерно до 50 мМ, например от 5 до 40 мМ, от 5 до 20 мМ или от 10 до 20 мМ. Например, метионин может быть предусмотрен в композициях по настоящему документу в концентрации от или примерно от 5 до или примерно до 50 мМ, например от 5 до 40 мМ, от 5 до 20 мМ или от 10 до 20 мМ. Например, антиоксидант, например метионин, может быть включен в концентрации, которая составляет, или составляет примерно, или составляет по меньшей мере 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,

- 49 033472

27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 или 50 мМ. В некоторых примерах совместные композиции содержат от 10 до 20 мМ метионина, например, или примерно, или по меньшей мере 10 или 20 мМ метионина.

6. Модификатор тоничности.

Необязательно, предусмотренные здесь стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента могут содержать модификатор тоничности. В частности, модификатор тоничности необходим в композициях, содержащих более низкие концентрации двухвалентного катиона, такого как Lys-Lys, поскольку достаточная тоничность не достигается.

Например, модификатор тоничности включен в композиции по настоящему документу для получения раствора с желаемой осмолярностью. Предусмотренные здесь композиции имеют осмолярность между или примерно между 245 и 500 мОсм/кг. Например, осмолярность составляет, или составляет примерно, или составляет по меньшей мере 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 350, 400, 450 или 500 мОсм/кг. Как правило, модификатор тоничности в настоящем документе включен в композиции, содержащие двухвалентный катион, такой как Lys-Lys, в концентрации меньше 100 мМ, например меньше 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 мМ или меньше. Например, модификатор тоничности в настоящем документе включен в композиции, содержащие двухвалентный катион, такой как Lys-Lys, в концентрации между или примерно между 10 и 50 мМ, например примерно или приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мМ.

Модификаторы тоничности включают, но не ограничиваются ими, глицерин, NaCl, аминокислоты, многоатомные спирты, трегалозу и другие соли и/или сахара. Например, предусмотренные здесь композиции могут необязательно включать NaCl в качестве модификатора тоничности. NaCl может быть включен в концентрации между или примерно между 0 и 200 мМ, например, как правило, между 30 и 100 мМ, 50 и 160 мМ, например 50 и 120 мМ или 80 и 140 мМ. Как правило, концентрация NaCl меньше чем 150 мМ и, как правило, меньше чем 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 или меньше. Конкретное количество является функцией концентрации двухвалентного катиона, например LysLys. Например, чем выше концентрация Lys-Lys, тем ниже концентрация NaCl (или NaCl отсутствует). Конкретное количество может быть определено опытным путем, чтобы сохранить активность фермента и/или тоничность.

В другом примере в стабильные композиции необязательно включен глицерин (глицерол). Например, предусмотренные здесь композиции, как правило, содержат меньше чем 60 мМ глицерина, например меньше чем 55, меньше чем 50, меньше чем 45, меньше чем 40, меньше чем 35, меньше чем 30, меньше чем 25, меньше чем 20, меньше чем 15, 10 мМ или меньше. Количество глицерина, как правило, зависит от количества присутствующего двухвалентного катиона (например, Lys-Lys): чем больше в композиции присутствует двухвалентного катиона (например, Lys-Lys), тем меньше глицерина требуется для достижения желаемой осмолярности. Таким образом, в некоторых случаях, небольшое количество глицерина должно быть включено в композицию, или глицерин не должен быть включен в композицию.

7. Другие агенты и вспомогательные вещества.

Предусмотренные здесь стабильные композиции могут необязательно содержать один или несколько других агентов, носителей, вспомогательных веществ или консервантов. Например, примеры стабилизаторов, которые необязательно могут быть включены в предусмотренные здесь стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента, включают, но не ограничиваются ими, аминокислоты, производные аминокислот, амины, сахара, многоатомные спирты, соли и буферы, поверхностно-активные вещества и другие агенты. Например, в число типов стабилизаторов, которые необязательно могут содержаться в композициях по настоящему документу, входят аминокислотный стабилизатор или ингибитор гиалуронидазы (например, субстрат гиалуронидазы, такой как гиалуронан). Примеры аминокислотных стабилизаторов, производных аминокислот или аминов включают, но не ограничиваются ими, Lаргинин, глутамин, глицин, лизин, метионин, пролин, Lys-Lys, Gly-Gly, оксид триметиламина (ТМАО) или бетаин. Примеры сахаров или многоатомных спиртов включают, но не ограничиваются ими, глицерол, сорбитол, маннитол, инозитол, сахарозу или трегалозу. Примеры солей и буферов включают, но не ограничиваются ими, хлорид магния, сульфат натрия, Трис, например Трис (100 мМ) или бензоат натрия. Примеры поверхностно-активных веществ включают, но не ограничиваются ими, полоксамер 188 (например, Pluronic® F68), полисорбат 80 (PS80), полисорбат 20 (PS20). Другие стабилизаторы включают, но не ограничиваются ими, гиалуроновую кислоту (HA), человеческий сывороточный альбумин (HSA), фенилмасляную кислоту, таурохолевую кислоту, поливинилпиролидон (PVP) или цинк. В конкретных примерах в настоящем документе стабильные деградирующие гиалуронан ферменты не содержат HSA и являются композициями, свободными от HSA.

Для стабильных композиций, составленных для многократного введения, композиции также могут необязательно содержать такое количество консерванта (консервантов), которое при комбинировании с компонентами, приведенными выше, приводит к стабильной композиции. Если консерванты включены, они присутствуют в концентрации, удовлетворяющей противомикробным требованиям, например Фармакопее США (USP) и Европейской фармакопее (ЕР). В табл. 23, в примере 7Е ниже, приведены эти требования, в том числе минимальные противомикробные требования ЕР (ЕРА) и предпочтительные противомикробные требования ЕР (ЕРВ).

- 50 033472

Как правило, композиции, которые удовлетворяют противомикробным требованиям ЕР (ЕРА или ЕРВ), содержат больше консерванта, чем те композиции, которые составлены таким образом, что удовлетворяют только противомикробным требованиям USP. Обычно, если включены консервант (консерванты), предусмотренные в настоящем документе композиции содержат их в количестве, обладающем противомикробной активностью для уничтожения или ингибирования размножения микроорганизмов в образце композиции, оцененной в тесте эффективности противомикробного консерванта (АРЕТ), как описано в настоящем документе. Не ограничивающие примеры консервантов, которые могут быть включены в предусмотренные в настоящем документе композиции, включают, но не ограничиваются ими, фенол, метакрезол (м-крезол), метилпарабен, бензиловый спирт, тимеросал, хлорид бензалкония, 4-хлор1-бутанол, хлоргексидина дигидрохлорид, хлоргексидина диглюконат, L-фенилаланин, ЭДТА, бронопол (2-бром-2-нитропропан-1,3-диол), фенилртутьацетат, глицерол (глицерин), имидомочевина, хлоргексидин, дегидроацетат натрия, ортокрезол (о-крезол), паракрезол (п-крезол), хлоркрезол, цетримид, бензетония хлорид, этилпарабен, пропилпарабен или бутилпарабен и любую их комбинацию. В одном из примеров консервант в композиции содержит по меньшей мере один фенольный консервант. Например, композиция содержит фенол, м-крезол или фенол и м-крезол. При включении в предусмотренные в настоящем документе композиции общее количество одного или нескольких консервирующих агентов, выраженное в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) в композиции, может составлять, например, между или примерно между 0,1 и 0,4%, например от 0,1 до 0,3%, от 0,15 до 0,325%, от 0,15 до 0,25%, от 0,1 до 0,2%, от 0,2 до 0,3% или от 0,3 до 0,4% и обычно меньше, чем 0,4% (мас./об.) консерванта, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 0,1, 0,12, 0,125, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,175, 0,18, 0,19, 0,2, 0,25, 0,3, 0,325, 0,35%, но меньше чем 0,4% общего количества консерванта.

Необязательно композиции могут включать носители, такие как разбавитель, адъювант, наполнитель или среда, с которыми вводят композицию. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences E.W. Martin. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество соединения, обычно в очищенном виде или в частично очищенном виде, вместе с подходящим количеством носителя, чтобы обеспечить форму для правильного введения пациенту. Такие фармацевтические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода и масла, в том числе масла из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло и кунжутное масло. Вода является типичным носителем в случае, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов.

Например, фармацевтически приемлемые носители, используемые в парентеральных композициях, включают водные носители, неводные носители, противомикробные агенты, изотонические агенты, буферы, антиоксиданты, местные анестетики, суспендирующие и диспергирующие агенты, эмульгирующие агенты, секвестрирующие или хелатирующие агенты и другие фармацевтически приемлемые вещества. Примеры водных носителей включают хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, изотонический раствор декстрозы для инъекций, стерильную воду для инъекций, декстрозу и лактатный раствор Рингера для инъекций. Неводные парентеральные носители включают жирные масла растительного происхождения, хлопковое масло, кукурузное масло, кунжутное масло и арахисовое масло. К парентеральным композициям, упакованным в многодозовые контейнеры, могут быть добавлены противомикробные вещества в бактериостатических или фунгистатических концентрациях, которые включают фенолы или крезолы, производные ртути, бензиловый спирт, хлорбутанол, метиловый и пропиловый сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты, тимеросал, хлорид бензалкония и хлорид бензетония. Изотонические агенты включают хлорид натрия и глюкозу. Буферы включают фосфат и цитрат. Антиоксиданты включают бисульфат натрия. Местные анестетики включают гидрохлорид прокаина. Суспендирующие и диспергирующие агенты включают натрий карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и поливинилпирролидон. Эмульгирующие вещества включают полисорбат 80 (Tween 80). Секвестрирующие или хелатирующие агенты для ионов металлов включают ЭДТА. Фармацевтические носители также включают этиловый спирт, полиэтиленгликоль и пропиленгликоль для водорастворимых носителей и гидроксид натрия, соляную кислоту, лимонную кислоту или молочную кислоту для регулирования pH.

Композиции могут содержать наряду с активным ингредиентом: разбавитель, такой как лактоза, сахароза, дикальций фосфат, или карбоксиметилцеллюлоза; смазывающее вещество, такое как стеарат магния, стеарат кальция и тальк; и связующее вещество, такое как крахмал, природные камеди, такие как аравийская камедь, желатин, глюкоза, меласса, поливинилпирролидон, целлюлоза и ее производные, повидон, кросповидоны и другие подобные связующие вещества, известные специалистам в данной области.

Например, к совместной композиции может быть добавлен белок-наполнитель, и он может быть любым из множества фармацевтически приемлемых белков или пептидов. В общем, белок-наполнитель выбирают по его способности быть введенным млекопитающему, не вызывая иммунный ответ. Например, человеческий сывороточный альбумин хорошо подходит для применения в фармацевтических ком

- 51 033472 позициях, хотя, как правило, он не включен в стабильные композиции по настоящему документу. Другие известные фармацевтические вспомогательные вещества для белков включают, но не ограничиваются ими, крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рисовую муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду и этанол. Наполнитель включен в композицию в концентрации, достаточной для предотвращения адсорбции белка в емкости или флаконе. Концентрация наполнителя будет варьировать в зависимости от природы наполнителя и концентрации белка в совместной композиции.

Композиция, если желательно, также может содержать небольшие количества смачивающих или эмульгирующих веществ или pH буферных веществ, например ацетат, цитрат натрия, производные циклодекстрина, сорбитанмонолаурат, триэтаноламин ацетат натрия, триэтаноламин олеат и другие подобные агенты.

8. Примеры стабильных композиций деградирующего гиалуронан фермента.

В настоящем документе предусмотрены стабильные композиции деградирующего гиалуронан фермента, стабильные при температурах от 37 до 42°С, например выше или равных 37 или 40°С, в течение по меньшей мере трех дней и, как правило, по меньшей мере одного месяца.

В одном из примеров композиция содержит от 100 до 1000 ед./мл, например, от 100 до 500 ед./мл или от 100 до 300 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и, в частности, по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или примерно 155 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20); от или примерно от 5 до или примерно до 200 мМ, например от 10 до 50 мМ или от 5 до 20 мМ Lys-Lys (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 10, 20, 30, 40 или 50 мМ); от или примерно от 0 до или примерно до 300 мМ двухосновного фосфата натрия (например, между или примерно между 0 и 150 мМ или от 5 до 50 мМ двухосновного фосфата натрия, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40 или 50, 100 или 150 мМ); от 0 до или примерно до 50 мМ метионина (например, между или примерно между 5 и 20 мМ, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40 или 50 мМ метионина); и от или примерно от 0,01 до или примерно до 0,5% полоксамера 188, например от 0,01 до 0,05% (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 или 0,05% полисорбата 80). Композиции готовят с pH между или примерно между 6,5 и 7,6, например между или примерно между 6,5 и 7,2, или от 7,0 до или примерно до 7,6 (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере pH 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5 или 7,6). В следующих примерах NaCl включен в концентрации меньше чем 140 мМ. Например, NaCl включен в концентрации между или примерно между 50 и 150 мМ, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мМ.

В другом примере композиция содержит от 100 до 1000 ед./мл, например от 100 до 500 ед./мл или от 100 до 300 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и, в частности, по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или примерно 155 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20); от или примерно от 5 до или примерно до 200 мМ, например между или примерно между 50 и 150 мМ MgCl₂ (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 или 150 мМ); от или примерно от 0 до или примерно до 300 мМ гистидина гидрохлорида (например, между или примерно между 0 и 150 мМ или от 5 и 50 мМ гистидина гидрохлорида, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40 или 50, 100 или 150 мМ); от или примерно от 0 до или примерно до 50 мМ метионина (например, между или примерно между 5 и 20 мМ, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40 или 50 мМ метионина); и от или примерно от 0,01 до или примерно до 0,5% полоксамера 188, например от 0,01 до 0,05% (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 или 0,05% полисорбата 80). Композиции готовят с pH между или примерно между 6,5 и 7,6, например между или примерно между 6,5 и 7,2 или от 7,0 до или примерно до 7,6 (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере pH 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5 или 7,6).

E. Полипептиды инсулина.

В настоящем документе предусмотрены совместные композиции деградирующего гиалуронан фермента и инсулина. Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат быстродействующий инсулин, такой как регулярный инсулин или аналог инсулина (например, так называемый быстродействующий аналог или аналог быстрого действия, что является взаимозаменяемыми названиями в данном описании), который модифицирован (например, заменой аминокислот) для снижения самоассоциации инсулина, что приводит к более быстрой диссоциации гексамеров инсулина.

Инсулин представляет собой полипептид, состоящий из 51 аминокислотного остатка, с молекулярной массой 5808 Да. Он производится β-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы. Обычный человеческий инсулин транслируется как полипептид-предшественник, препроинсулин, из 110 аминокислот (SEQ ID NO: 101), содержащий сигнальный пептид из 24 аминокислот, направляющий препроинсулин в эндоплазматический ретикулум (ЭР); сигнальная последовательность отщепляется, в результате чего образуется проинсулин (SEQ ID NO: 102). Молекула проинсулина затем превращается в зрелый

- 52 033472 инсулин под действием протеолитических ферментов, известных как конвертазы прогормона (РС1 и РС2) и экзопротеаза карбоксипептидаза Е. Это приводит к удалению 4 основных аминокислотных остатков и оставшегося 31-аминокислотного С-пептида или соединяющей цепи (что соответствует аминокислотным остаткам с 57 по 87 препроинсулина, приведенного в SEQ ID NO: 101). Зрелый инсулин представляет собой 21-аминокислотную А-цепь (соответствующую аминокислотным остаткам 66-86 полипептида проинсулина, приведенного в SEQ ID NO: 102) и 30-аминокислотную В-цепь (что соответствует аминокислотным остаткам 1-30 полипептида проинсулина, приведенного в SEQ ID NO: 102), которые поперечно сшиты дисульфидными связями. Как правило, зрелый инсулин содержит три дисульфидных связи: одна - между положениями 7 А-цепи и 7 В-цепи, вторая между положениями 20 А-цепи и 19 Вцепи, и третья между положениями 6 и 11 А-цепи. Последовательность А-цепи зрелого инсулина представлена в SEQ ID NO: 103, а последовательность В-цепи в SEQ ID NO: 104.

Указание инсулина включает полипептиды препроинсулина, проинсулина и инсулина в одноцепочечной или двухцепочечной формах, их усеченные формы, которые имеют активность, и включает аллельные и видовые варианты, варианты, кодируемые вариантами сплайсинга, и другие варианты, такие как аналоги инсулина или другие производные формы, в том числе полипептиды, которые имеют идентичность последовательности с полипептидом-предшественником, приведенным в SEQ ID NO: 101, или его зрелой формой по меньшей мере 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более, пока такой инсулин связывается с человеческим инсулиновым рецептором, что инициирует сигнальный каскад, который приводит к усилению поглощения и хранения глюкозы и/или снижению эндогенной продукции глюкозы. Например, инсулины включают в себя видовые варианты инсулина. Они включают, но не ограничиваются ими, инсулины, полученные из крупного рогатого скота (представлены в SEQ ID NO: 133) и свиней (SEQ ID NO: 123). Бычий инсулин отличается от человеческого инсулина аминокислотами в 8 и 10 положениях А-цепи и 30 аминокислотой в В-цепи. Инсулин свиней отличается от человеческого инсулина только аминокислотой в 30 положении В-цепи, где, как и в случае последовательности бычьего инсулина, треонин замещён на аланин. Другие примеры видовых вариантов инсулина представлены в SEQ ID NO: 105-146.

Также в список вариантов инсулина входят аналоги инсулина, которые содержат одну или более модификаций аминокислот в сравнении с человеческим инсулином, представленным в SEQ ID NO: 103 и 104 (А- и В-цепи). Эти варианты включают быстродействующие или более длительно действующие аналоги инсулина (все они обозначены в настоящем документе как быстродействующие аналоги, хотя понятно, что для целей данного изобретения подходят быстродействующие аналоги и более длительно действующие аналоги). Примеры аналогов инсулина (А- и/или В-цепи), в том числе быстродействующие и более длительно действующие аналоги, приведены в SEQ ID NO: 147-165, 182-184. Например, аналоги инсулина включают, но не ограничиваются ими, глулизин (LysB3, GluB29; представлен в SEQ ID NO: 103 (А-цепь) и SEQ ID NO: 149 (В-цепь)), HMR-1 (153LysB3, IleB28; представлен в SEQ ID NO: 103 (Ацепь) и SEQ ID NO: 182 (В-цепь)), HMR-1423 (GlyA21, HisB31, HisB32; представлен в SEQ ID NO: 183 (А-цепь) и SEQ ID NO: 184 (В-цепь)), инсулин аспарт (AspB28; представлен в SEQ ID NO: 103 (А-цепь) и SEQ ID NO: 147 (В-цепь)) и инсулин лизпро (LysB28, РгоВ29; представлен в SEQ ID NO: 103 (А-цепь) и SEQ ID NO: 148 (В-цепь)). В каждом случае, описанном выше, номенклатура аналогов основана на описании аминокислотной замены в определенных положениях А- или В-цепи инсулина, пронумерованных от N-конца цепи, где оставшаяся часть последовательности является идентичной таковой в человеческом инсулине.

Поэтому регулярный инсулин, используемый в описанных здесь совместных композициях, представляет собой зрелый инсулин, который содержит последовательность аминокислот, указанных в SEQ ID NO: 103 и 104. Пример регулярного человеческого инсулина представляет собой рекомбинантный человеческий инсулин под названием Humulin®R (Хумулин). Регулярные инсулины также включают в себя видовые варианты зрелого инсулина, имеющего А- и В-цепи, например,зрелые формы согласно любой из SEQ ID NO: 105-146. Другие примеры аналогов инсулина, входящих в состав совместных композиций данного изобретения, включают, но не ограничиваются ими, инсулин с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 103 (А-цепь) и SEQ ID NO: 149 (В- цепь); инсулин с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 103 (А-цепь) и SEQ ID NO: 147 (В-цепь); или инсулин с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 103 (А-цепь) и SEQ ID NO: 148 (В-цепь).

Любые из вышеуказанных полипептидов инсулина включают такие, которые вырабатываются поджелудочной железой любых видов, например человека, а также включают инсулины, которые производятся синтетически или с помощью рекомбинантных методов. Например, как описано в другом разделе данного документа, инсулин может быть получен биосинтетически путем экспрессии синтетических генов А- и В-цепи инсулина, путём экспрессии полного проинсулина и его обработки с помощью соответствующих ферментативных и химических методов для создания зрелого инсулина или путем экспрессии А- и В-цепей, соединенных линкерным пептидом (см., например, DeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional).

Инсулины также включают мономерные и олигомерные формы, например гексамерные формы. Ин

- 53 033472 сулин может существовать в виде мономера, который циркулирует в плазме и также связывается со своим рецептором в мономерной форме. Инсулин, однако, имеет склонность к самоассоциации в димеры, а в присутствии ионов металлов, таких как Zn²⁺, может легко ассоциировать в структуры более высоких порядков, такие как гексамеры. Для ионов Zn²⁺ есть два симметричных участка связывания с высоким сродством, хотя также известно, что есть и другие участки связывания цинка с более низким сродством (см., например, DeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional). Самоассоциация важна для стабильности молекулы, предотвращения химической деградации и физической денатурации. Таким образом, в запасающих везикулах панкреатических β-клеток инсулин существует в виде гексамера. Однако считается, что после высвобождения во внеклеточное пространство гексамеры инсулина испытывают изменение pH до более нейтральных значений, и содержащие ион цинка гексамеры разбавляются, что дестабилизирует гексамер. Возможны и другие причины, способствующие дестабилизации гексамера инсулина в межклеточном пространстве. Инсулин, таким образом, присутствует в крови преимущественно в виде мономера. Для того чтобы использовать стабилизирующие эффекты, в большинство коммерческих препаратов инсулина включают ионы цинка в количествах, достаточных для обеспечения самоассоциации гексамеров. Гексамерная структура, однако, замедляет скорость абсорбции этих препаратов при подкожном введении.

Инсулин используется в качестве терапевтического средства для контроля гликемии, например, у пациентов с диабетом. Существуют различные типы композиций инсулина, которые различаются в зависимости от цели, для которой вводится инсулин: контролирующие уровень глюкозы при базальной терапии, для прандиальной терапии или их комбинации. Композиции инсулина могут быть представлены только как быстродействующие композиции, только как композиции базального действия (т.е. формы средней продолжительности действия и/или длительного действия) или как комбинации первых двух (см., например, табл. 4). Как правило, смеси содержат быстродействующий инсулин и инсулин средней продолжительности действия или инсулин длительного действия. Например, быстродействующие инсулины могут быть объединены с инсулином NPH (пример инсулина промежуточного действия, который описан ниже) в различных соотношениях, в том числе 10:90, 20:80, 30:70, 40:60 и 50:50. Такие смешанные препараты могут уменьшить количество ежедневных инсулиновых инъекций путём обеспечения одним препаратом базальных потребностей в инсулине и потребностей, связанных с приёмом пищи.

Препараты инсулина включают полипептид инсулина или его вариант (т.е. аналог), введенные в композицию определенным способом. В некоторых случаях в препарате присутствуют компоненты и вещества, которые придают различные свойства инсулину, такие как различная длительность действия. Например, большинство препаратов инсулина содержат в композиции ион металла, такого как цинк, который стабилизирует инсулин, способствуя самоассоциации молекулы. Самоассоциация в гексамерные формы может влиять на абсорбцию инсулина при введении. Кроме того, некоторые основные композиции инсулина длительного действия получают путем осаждения инсулина из ацетатного буфера (вместо фосфатного) путем добавления цинка. Крупные кристаллы инсулина с высоким содержанием цинка, которые были собраны и ресуспендированы в растворе хлорида натрия и ацетата натрия (pH 7,2-7,5), медленно абсорбируются после подкожной инъекции и оказывают длительное действие. Этот кристаллический препарат называется суспензией инсулин-цинк длительного действия (инсулин ультраленте). Другие препараты инсулина, содержащие цинк, включают, например, полумедленные инсулины (быстрые суспензии инсулин-цинк) и инсулины ленте (суспензии инсулин-цинк), которые, в основном, отличаются используемой концентрацией цинка. Препараты инсулина, содержащие цинк, также включают такие препараты, которые модифицированы протамином, такие как NPH-инсулин.

В другом примере осаждающий агент, такой как протамин, может быть добавлен к полипептиду инсулина для образования микрокристаллической суспензии. Обычно кристаллические инсулины имеют длительное действие в сравнении с инсулинами, которые не существуют в кристаллической форме. Протамин-цинк-инсулин при подкожном введении в виде водной суспензии медленно растворяется в месте введения, а инсулин абсорируется с замедленной скоростью. Протамин-цинк-инсулиновая суспензия в значительной степени была заменена суспензией инсулина изофан, известной также как NPH-инсулин. Это модифицированная протамин-цинк-инсулиновая суспензия, которая является кристаллической. Концентрации инсулина, протамина и цинка подобраны таким образом, что препарат имеет промежуточные начало и продолжительность действия относительно обычного инсулина и протамин-цинк-инсулиновой суспензии.

Кроме того, различия pH в препаратах также влияют на тип и свойства инсулина. Большинство инсулинов готовят при нейтральном pH. Одним из исключений является инсулин гларгин, который предусмотрен в виде коммерческой композиции при pH 4,0. В силу того, что к С-концу В-цепи добавлены два аргинина, изоэлектрическая точка инсулина гларгина сдвигается, делая его более растворимым при кислых значениях pH. В А-цепи есть дополнительная аминокислотная замена (N21G), которая предотвращает дезамидирование и димеризацию, возникающие за счёт чувствительного к кислоте аспарагина. Последовательности А- и В-цепей инсулина гларгина представлены в SEQ ID NO: 150 и SEQ ID NO: 151 соответственно. Поскольку при введении происходит воздействие физиологического pH, образуются микро- 54 033472 преципитаты, которые делают гларгин похожим на кристаллический инсулин длительного действия.

В табл. 4 ниже представлены различные типы инсулина, начало их действия и их применение.

Таблица 4

Типы инсулинов

Тип	Торговое название	Начало действия	Пик	Продолжительность	Применение
Быстродействующие: аналоги инсулина	Лизпро (например, Хумалог® (Humalog®); Аспарт (например, НовоЛог® (NovoLog®); Глулизин	5-15 минут	45-90 минут	3-4 часа	Контроль глюкозы после приёма пищи (постпрандиальный)
Быстродействующие: регулярный инсулин	Регулярный инсулин (например, Хумулин® R (Humulin® R); Новолин® R (Novolin® R); Велосулин® Хуман)	30 минут - 1 час	2-5 часа	5-8 часов	Контроль глюкозы после приёма пищи (постпрандиальный)
Средней продолжительности действия	Ленте® (например, Хумулин® L (Humulin® L), Новолин® L (Novolin® L); NPH (например, Хумулин® Н, Новолин® Н);	1-3 часа	6-12 часов	20-24 часа	Базальное пополнение инсулина
Длительного действия	Ультраленте (например, Хумулин® U (Humulin® U); гларгин; детемир (аналог)	4-6 часов	18-28 часов	28 часов	Базальное пополнение инсулина
Смеси	Хумулин® (Humulin®) 50/50; Хумулин® 70/30; Новолин® 70/30 (Novolin®); Хумалог® Микс (Humalog® Mix) 75/25	Различное	Различ -ный	Различная

Чаще всего используются быстродействующие инсулины, которые включают регулярный инсулин (т.е. природный инсулин или инсулин дикого типа, в том числе его аллельные и видовые варианты) и быстродействующие аналоги инсулина. В данном документе под инсулином понимается быстродействующий инсулин, если не указано иное.

Быстродействующие инсулины.

Быстродействующие инсулины, которые можно использовать в предусмотренных в настоящем документе совместных композициях, включающих деградирующий гиалуронан фермент, такой как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), включают регулярный инсулин, который является инсулином дикого типа или природным инсулином, и быстродействующие аналоги инсулина. В силу своей высокой скорости абсорбции по сравнению с инсулинами базального действия быстродействующие инсулины используются преимущественно для контроля инсулина после приема пищи. Примеры быстродействующих инсулинов приведены ниже в табл. 5. Быстродействующие инсулины также включают любые быстродействующие инсулины, известные в данной области, такие как любые препараты инсулина и приспособления, описанные в патенте США № 7279457 и в опубликованных патентных заявках США №№ 20070235365, 20080039368, 20080039365, 20070086952, 20070244467 и 20070191757, но не ограничиваясь ими. Любой быстродействующий инсулин может быть введен в совместную композицию с деградирующим гиалуронан ферментом, как описано в настоящем документе. Такая композиция в дополнение к ферменту, деградирующему гиалуроновую кислоту, может также дополнительно включать в себя смесь быстродействующего инсулина с инсулином средней длительности действия или инсулином длительного действия.

- 55 033472

Таблица 5

Быстродействующие инсулины

Название	Виды	А-цепь (SEQ ID NO)	В-цепь (SEQ ID NO)	Коммерческое название
Регулярный инсулин	Человеческий	103	104	Хумулин® P; Новолин® P; Велосулин® (Velosulin®)
Регулярный инсулин	Свиной	88-108 в SEQ ID N0:123	25-54 в SEQ ID N0:123	Илетин II® (Iletin II®;);
Инсулин Аспарт	Аналог человеческого инсулина	103	147	Новолог®
Инсулин Лизпро	Аналог человеческого инсулина	103	148	Хумалог®
Инсулин Глулизин	Аналог человеческого инсулина	103	149	Апидра® (Apidra®)

A. Регулярный инсулин.

Регулярные инсулины включают в себя природные полипептиды инсулина или полипептиды инсулина дикого типа. Они включают человеческий инсулин, а также бычий, свиной инсулин и инсулины других видов. Регулярные инсулины человека имеются в продаже как Хумулин® Р (Humulin® R), Новолин® Р (Novolin® R) и Велосулин® (Velosulin®). Свиной инсулин продавался как Илетин II® (Iletin II®). Как правило, регулярный инсулин сам по себе при введении подкожно начинает действовать через 30 мин. Максимальные уровни в плазме наблюдаются в течение 1-3 ч и длительность активности увеличивается с дозировкой. Время полувыведения из плазмы после подкожного введения составляет около 1,5 ч.

B. Быстродействующие аналоги (также называемые инсулином быстрого действия).

Быстродействующие аналоги инсулина, которые в данной области часто называют инсулинами быстрого действия, являются модифицированными формами инсулина, которые обычно содержат одну или несколько аминокислотных замен. Эти аналоги разработаны для снижения самоассоциации молекул инсулина с целью увеличения скорости абсорбции и более раннего начала действия по сравнению с регулярным инсулином. Как правило, такие аналоги вводят в композиции в присутствии цинка и, таким образом, они существуют в виде стабильных гексамеров с цинком. Из-за модификации, однако, они способны к более быстрой диссоциации гексамерной формы после подкожного введения по сравнению с регулярным инсулином.

i) . Инсулин лизпро.

Человеческий инсулин лизпро - это препарат полипептида инсулина, содержащего аминокислотные замены в положениях 28 и 29 В-цепи, так что Pro-Lys в этом положении В-цепи инсулина дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 104, изменены на Lys-Pro. Последовательность инсулина лизпро представлена в SEQ ID NO: 103 (А-цепь) и SEQ ID NO: 148 (В-цепь). Он продается под названием Хумалог® (Humalog®) (инсулин лизпро, из генноинженерной рекомбинантной ДНК). Результат такой инверсии двух аминокислот представляет собой полипептид со сниженной склонностью к самоассоциации, что обеспечивает более быстрое начало действия. В частности, инвертированная последовательность в Вцепи приводит к устранению двух гидрофобных взаимодействий и ослаблению водородных связей двух β-складчатых слоев, которые стабилизируют димер (см., например, DeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional). Полипептиды самоассоциируют и образуют гексамерные формы в препарате за счёт вспомогательных веществ, таких как противомикробные агенты (например, м-крезол) и цинк для стабилизации. Тем не менее, в связи с аминокислотной модификацией, инсулин лизпро действует быстрее, чем регулярный инсулин.

ii) . Инсулин аспарт.

Человеческий инсулин аспарт является препаратом полипептида инсулина, содержащего аминокислотную замену пролина на аспарагиновую кислоту в положении 28 В-цепи человеческого инсулина, представленного в SEQ ID NO: 104. Последовательность инсулина аспарт представлена в SEQ ID NO: 103 (А-цепь) и SEQ ID NO: 147 (В-цепь). Препарат продается под названием Новолог® (Novolog®) (инсулин аспарт [генноинженерного происхождения] для инъекций). Модификация инсулина аспарт добавляет отрицательно заряженную карбоксильную группу в боковой цепи для создания отталкивающего и дестабилизирующего заряда при межмономерных взаимодействиях. Кроме того, удаление пролина устраняет ключевое гидрофобное взаимодействие между мономерами (см., например, DeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw- 56 033472

Hill Professional). Этот аналог существует в основном в виде мономера и менее склонен к агрегации по сравнению с другими быстродействующихми аналогами, такими как лизпро. Как правило, инсулин аспарт и инсулин лизпро подобны в своих соответствующих фармакокинетических и фармакодинамических свойствах.

iii). Инсулин глулизин.

Человеческий инсулин глулизин представляет собой препарат полипептида инсулина, содержащего аминокислотную замену аспарагина на лизин в В-цепи в положении B3 и замену лизина на глутаминовую кислоту в положении В29 относительно последовательности В-цепи человеческого инсулина, представленной в SEQ ID NO: 104. Последовательность инсулина глулизина представлена в SEQ ID NO: 103 (А-цепь) и SEQ ID NO: 149 (В-цепь). Препарат продается под названием Апидра® (Apidra®) (инсулин глулизин [генноинженерного происхождения] для инъекций). Модификации делают молекулу полипептида менее склонной к самоассоциации по сравнению с человеческим инсулином. В отличие от других аналогов инсулина в коммерческих композициях полипептида отсутствует образующий гексамеры цинк (Becker et al. (2008) Clinical Pharmacokinetics, 47:7-20). Таким образом, инсулин глулизин имеет более высокую скорость начала действия, чем инсулин лизпро и инсулин аспарт.

F. Стабильные совместные композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента.

В настоящем документе предусмотрены стабильные совместные композиции (составы) инсулина, в частности, быстродействующих инсулинов, в том числе регулярного инсулина и аналогов инсулина быстрого действия (также называемых быстродействующими аналогами инсулина), и деградирующих гиалуронан ферментов, называемых также ферментами, разрушающими хиалуронан, таких как растворимые гиалуронидазы (например, rHuPH20). Примерами предусмотренных в настоящем документе композиций являются стабильные совместные композиции быстродействующего аналога инсулина и PH20 или его фрагмента, укороченного с С-конца, растворимого и активного (например, rHuPH20). Предусмотренные композиции, содержащие деградирующий гиалуронан фермент и быстродействующий инсулин, составлены таким образом, чтобы быть стабильными при различных температурах или в различных условиях. Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции являются стабильными между или примерно между 0 и 40°С или в различных стрессовых условиях (например, при перемешивании) в течение нескольких часов, дней, недель, месяцев или лет, как описано в настоящем документе. Таким образом, композиции подходят для многодозового применения или подходят для применения в других условиях, которые требуют повышенных температур или перемешивания. Например, совместные композиции подходят для многократного введения композиций (MDI), а также для непрерывного подкожного введения композиций (CSI). Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции составлены для подкожного, внутрибрюшинного, внутрикожного, внутримышечного или трансдермального введения. Примерами композиций являются композиции, составленные для подкожного введения.

Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции представляют собой многодозовые композиции. Таким образом, все предусмотренные в настоящем документе композиции содержат инсулин (например, быстродействующий инсулин, такой как быстродействующий аналог инсулина), деградирующий гиалуронан фермент (например, PH20), консервант и один или несколько других стабилизирующих вспомогательных веществ.

Как описано в настоящем документе и пояснено в примерах, обнаружено, что из-за противоположных требований для стабильности деградирующих гиалуронан ферментов, таких как гиалуронидаза, например, PH20 (например, rHuPH20), и быстродействующего инсулина, совместные композиции не могут быть получены простым смешиванием двух композиций. Например, правильные концентрации NaCl и pH являются ключевыми для стабильности совместных композиций инсулина и деградирующего гиалуронан фермента (например, rHuPH20 или другой растворимой гиалуронидазы и деградирующего гиалуронан фермента). Определение оптимальной концентрации NaCl и pH осложняется противоположнымы эффектами, которые эти параметры оказывают на инсулин и, например, деградирующий гиалуронан фермент rHuPH20. Растворимость инсулина максимальна при более высоком pH и более низких концентрациях NaCl. Эти условия, в то же время, являются неблагоприятными для rHuPH20, который теряет стабильность при более высоком pH и более низкой концентрации NaCl. Стабильность деградирующего гиалуронан фермента, например rHuPH20, можно повысить за счет увеличения концентрации NaCl и понижения pH. Но в то же время, такие условия оказывают отрицательное воздействие на растворимость инсулина и аналогов инсулина, которые выпадают в осадок при низком pH и высокой концентрации NaCl. Таким образом, одной из задач в настоящем документе является обеспечение оптимальной концентрации NaCl и pH для стабильных композиций инсулина и rHuPH20 (или других растворимых гиалуронидаз и деградирующих гиалуронан ферментов) или обеспечение стабильных совместных композиций, которые не содержат NaCl или содержат низкие концентрации NaCl.

Как описано в настоящем документе, разные стабильные композиции могут использоваться для многократного введения (MDI) или для непрерывного подкожного введения инсулина (CSII). Два способа введения имеют разные требования к стабильности. В частности, совместные композиции для CSII должны быть стабильны в условиях ускоренной деградации (или стрессовых условиях), например, при повышенных температурах и при перемешивании, в то время как совместные композиции для MDI, ко- 57 033472 торые можно хранить при охлаждении или при комнатной температуре в процессе применения, не должны быть стабильны при повышенных температурах и при перемешивании. Таким образом, как описано в настоящем документе, вспомогательные вещества или концентрации вспомогательных веществ, которые способствуют стабильности при каждом из этих условий хранения, необязательно являются одинаковыми. Например, дополнительные вспомогательные вещества или стабилизаторы или разные концентрации вспомогательных веществ или стабилизаторов требуются для поддержания стабильности при температуре или примерно при температуре 32-40°С или при перемешивании и для поддержания стабильности деградирующего гиалуронан фермента и/или инсулина при температуре или примерно при температуре 20-30°С или при температуре или примерно при температуре 2-8°С. Эти же стабилизаторы могут быть несовместимы со стабильностью композиций при более низких температурах.

Например, в настоящем документе обнаружено, что, тогда как инсулин, как правило, не стабилен при высоких концентрациях NaCl и низком pH при хранении или применении при низких температурах менее 32°С, такие условия способствуют растворимости инсулина при высоких температурах от 32 до 40°С в течение по меньшей мере 3 дней. Таким образом, условия высокой концентрации NaCl и низкого pH могут быть созданы в совместной композиции для применения в процессе CSII, представляющей собой терапию, требующую стабильности при более высоких температурах. В настоящем документе показано, что композиции, имеющие низкий pH (например, pH 6,8) и высокие концентрации NaCl (например, 200 мМ), стабильны при повышенных температурах, поэтому подходят для CSII в течение по меньшей мере 3 дней при 37°С. Низкий pH (например, pH 6,8) и высокие концентрации NaCl (например, 200 мМ) не подходят для сохранения стабильности при более низких температурах хранения, например при охлаждении или при комнатной температуре.

Также, стабилизатор гиалуронан (HA) представляет собой эффективный стабилизатор и сохраняет стабильность деградирующего гиалуронан фермента при повышенных температурах для применения в CSII, не оказывая при этом отрицательного воздействия на растворимость инсулина. В этом случае, в то время как гиалуронан способствует стабильности деградирующего гиалуронан фермента при повышенных температурах, растворимость инсулина при охлаждении снижается. Таким образом, присутствие HA в композициях MDI при долговременном хранении при более низких температурах может повлиять на растворимость инсулина.

В настоящем документе также обнаружено, что Lys-Lys является особенно хорошим стабилизатором деградирующего гиалуронан фермента, в частности, при повышенных температурах выше 37°С. В отличие от MgCl2, который также является особенно сильным стабилизатором деградирующего гиалуронан фермента при повышенных температурах, Lys-Lys может быть совместим с инсулинами, при этом сохраняя их растворимость. Например, более низкие концентрации Lys-Lys и присутствие одного или нескольких других стабилизаторов сохраняет активность деградирующего гиалуронан фермента и растворимость инсулина при условиях ускоренной деградации, таких как повышенные температуры. Поэтому, такие содержащие Lys-Lys совместные композици также могут подходить для применения для CSII.

Несмотря на то, что вспомогательные вещества или концентрации вспомогательных веществ для стабильных композиций для MDI или CSII необязательно одинаковы, предусмотренные в настоящем документе композиции MDI могут быть использованы для создания стабильных композиций CSII. Таким образом, в некоторых примерах совместные композиции MDI, стабильные при охлаждении или температуре окружающей среды и необязательно стабильные при повышенных температурах или при стрессе, разбавляют разбавителем, имеющим более низкий pH и более высокую концентрацию соли. При этом образуется композиция с более низким pH и более высокой концентрацией соли по сравнению с композицией MDI, которая в связи с этим стабильна при повышенных температурах и в стрессовых условиях (например, при перемешивании) и подходит для CSII. Как правило, такие совместные композиции CSII не хранят при охлаждении из-за того, что инсулин не растворяется в композициях с низким pH и высокой концентрацией соли.

Как правило, из соединений составляют фармацевтические композиции с использованием методик и процедур, хорошо известных в области техники (см., например, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126). Фармацевтически приемлемые композиции готовят с учетом указаний регулирующих ведомств или других ведомств в соответствии с общепризнанной фармакопеей для применения на животных и на людях. Композиция должна соответствовать способу введения.

Совместные композиции могут быть предусмотрены как фармацевтический препарат в жидкой форме в виде растворов, сиропов или суспензий. В жидкой форме фармацевтические препараты могут быть предусмотерны в виде концентрированного препарата для разбавления перед применением до терапевтически эффективной концентрации. Обычно препараты предусмотрены в дозированной форме, не требующей разбавления перед применением. Такие жидкие препараты могут быть изготовлены традиционными способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие вещества (например, сироп сорбита, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгаторы (например, лецитин или аравийская камедь); неводные носители (например, миндальное масло, жирные сложные эфиры или фракционированные растительные масла); и консерванты (например, ме- 58 033472 тил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). В другом примере фармацевтические препараты могут быть представлены в лиофилизированной форме для восстановления водой или другим подходящим носителем перед применением.

Объем предусмотренных в настоящем документе совместных композиций может представлять собой любой объем, подходящий для контейнера, в котором они предусмотрены. В некоторых примерах совместные композиции предусмотрены во флаконе, шприце, шприце-ручке, резервуаре помпы или в системе с обратной связью или в любом другом подходящем контейнере. Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции имеют объем между или примерно между 0,1 и 500 мл, например от 0,1 до 100 мл, от 1 до 100 мл, от 0,1 до 50 мл, например, по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или примерно, или 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 мл или больше.

Как описано в настоящем документе ниже, в некоторых примерах совместные композиции получают в виде концентрированных композиций инсулина и деградирующих гиалуронан ферментов, которые в дальнейшем разбавляют соответствующим разбавителем для применения. В таких случаях концентрированные совместные композиции могут быть специально составлены для долговременного хранения, например, при температурах от или примерно от 2°С до или примерно до 8°С. При разбавлении совместные композиции могут непосредственно использоваться для MDI. С другой стороны, поскольку требования к многодозовым композициям, используемым для MDI или для CSII терапии, могут быть разными, компоненты разбавителя могут быть выбраны таким образом, чтобы обеспечить стабильность разбавленной совместной композиции для применения совместной композиции при повышенных температурах или при перемешивании. Например, как обсуждается выше и далее ниже, разбавитель может содержать, например, необходимое количество или уровень компонентов или стабилизирующих агентов, совместимых со стабильностью совместной композиции при повышенных температурах или в стрессовых условиях (например, при перемешивании), которые являются характерными условиями для CSII терапии. Таким образом, при разбавлении совместной композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента разбавителем, новая разбавленная совместная композиция оказывается стабильной, например, при повышенных температурах, таких как по меньшей мере или примерно по меньшей мере от 32 до 40°С, например примерно при 37°С, или в других стрессовых условиях (например, при перемешивании), например, для применения в CSII терапии.

Ниже предусмотрено описание компонентов, предусмотренных в стабильных совместных композициях в настоящем документе. Конкретный баланс требований для наибольшей стабильности обоих белков, которые содержатся в предусмотренных в настоящем документе совместных композициях, делает возможным введение совместных композиций в виде композиций для многократного введения или с помощью системы CSII (например, введение с помощью помпы закрытого типа). Описание каждого компонента или условия, таких как вспомогательные вещества, стабилизаторы или pH, предусмотрено ниже.

1. Компоненты стабильных совместных композиций.

В настоящем документе предусмотрены стабильные совместные композиции, которые содержат терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20). Совместные композиции также содержат терапевтически эффективное количество быстродействующего инсулина, например аналог инсулина быстрого действия (например, быстродействующий). В примерах предусмотренных в настоящем документе совместных композиций совместные композиции дополнительно содержат NaCl в концентрации между или примерно между 50 и 200 мМ, например 80-140 мМ, pH в диапазоне между или примерно между 6,5 и 8,0, например между 6,5 и 7,8 или 6,8 и 7,8, например, между или примерно между 6.5 и 7,5 или 7,0 и 7,6, буферный агент, который поддерживает диапазон pH, эффективное против микроорганизмов количество консерванта или смеси консервантов и стабилизирующий агент в таком количестве, которое в течение хранения (температура и время) сохраняет по меньшей мере 50% активности деградирующего гиалуронан фермента и сохраняет по меньшей мере 90% чистоты, обнаружения и/или удельной активности инсулина. Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат от 0,01 до 0,5% поверхностно-активного вещества в качестве стабилизирующего агента. Совместные композиции могут необязательно содержать дополнительные стабилизирующие агенты или антиокислительный агент (антиоксидант). В некоторых примерах в настоящем документе совместные композиции стабильны в течение по меньшей мере 6 месяцев при температуре от или примерно 2°С до или примерно до 8°С и по меньшей мере 14 дней (т.е. 2 недель) при температуре от или примерно от 20°С до или примерно до 30°С. Такие совместные композиции могут использоваться для многократно введения (MDI). В других примерах предусмотренные в настоящем документе совместные композиции стабильны при условиях ускоренной деградации, например, при повышенных температурах выше или примерно выше 32°С, например от 35 до 40°С, в частности, выше или примерно выше 37 или 40°С и/или при перемешивании в течение по меньшей мере 3 ч и, как правило, по меньшей мере 3 дней. Такие совместные композиции могут использоваться для способов подкожной непрерывной инфузии (CSII).

Также в настоящем документе предусмотрены совместные композиции, которые не содержат NaCl или содержат меньшее количество NaCl, например меньше чем 140 мМ NaCl и, как правило, от 0 до 100 мМ NaCl, например от 0 до 50 мМ, от 10 до 40 мМ, от 20 до 30 мМ, например по меньшей мере, или

- 59 033472 примерно по меньшей мере, или 30 мМ NaCl. В таких примерах в настоящем документе обнаружено, что

Lys-Lys может быть включен в количестве, достаточном для стабилизации деградирующего гиалуронан фермента и инсулина, даже в отсутствие NaCl. Необязательно, NaCl может быть включен в такие композиции, например, в качестве модификатора тоничности. Это может быть необходимо, например, если концентрация Lys-Lys составляет 50 мМ Lys-Lys или меньше.

Таким образом, в некоторых примерах предусмотренных в настоящем документе совместных композиций совместные композиции содержат терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20). Совместные композиции также содержат терапевтически эффективное количество быстродействующего инсулина, например аналога инсулина быстрого действия (например, быстродействующего). В примерах предусмотренных в настоящем документе совместных композиций совместные композиции дополнительно содержат Lys-Lys в концентрации между или примерно между 50 и 120 мМ, например от 50 до 80 мМ, от 80 до 100 мМ или от 100 до 120 мМ, pH в диапазоне между или примерно между 6,5 и 8,0, например от 6,5 до 7,8 или от 6,8 до 7,8, например, между или примерно между 6,5 и 7,5 или от 7,0 до 7,6, буферный агент, который поддерживает диапазон pH, эффективное против микроорганизмов количество консерванта или смеси консервантов и стабилизирующий агент в таком количестве, которое в течение хранения (температура и время) сохраняет по меньшей мере 50% активности деградирующего гиалуронан фермента и сохраняет по меньшей мере 90% чистоты, обнаружения и/или удельной активности инсулина. Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат от 0,0005 до 1,0% (например, от 0,0005 до 0,005%) поверхностно-активного вещества в качестве стабилизирующего агента. Совместные композиции могут необязательно содержать дополнительные стабилизирующие агенты, модификаторы тоничности и антиокислительный агент и/или другие вспомогательные вещества. Например, совместные композиции содержат NaCl в концентрации меньше 140 мМ, например между или примерно между 0 и 100 мМ, например между или примерно между 0 и 50 мМ, 10 и 40 мМ или 20 и 30 мМ. В некоторых примерах в настоящем документе совместные композиции стабильны в течение по меньшей мере 6 месяцев при температуре от или примерно от 2°С до или примерно до 8°С и по меньшей мере 14 дней (т.е. 2 недели) при температуре от или примерно от 20°С до или примерно до 30°С. Такие композиции могут использоваться для многократного введения (MDI). В других примерах предусмотренные в настоящем документе совместные композиции стабильны при условиях ускоренной деградации, например при повышенных температурах, выше или примерно выше 32°С, например от 35 до 40°С, в частности, выше или примерно выше 37 или 40°С, и/или при перемешивании в течение по меньшей мере 3 ч и, как правило, по меньшей мере 3 дней. Такие совместные композиции могут использоваться для способов подкожной непрерывной инфузии (CSII).

а). Быстродействующий инсулин.

Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат терапевтически эффективное количество быстродействующего инсулина, такого как быстродействующий аналог инсулина. Инсулином может быть любой из быстродействующих инсулинов, описанных в разделе Е. Быстродействующий инсулин может быть регулярным инсулином. В конкретных примерах инсулин представляет собой быстродействующий инсулин, являющийся быстродействующим аналогом инсулина, например инсулин лизпро, инсулин аспарт или инсулин глулизин. Например, терапевтически эффективным количеством может быть количество между или примерно между 10 и 1000 ед./мл, 100 и 1000 ед./мл или 500 и 1000 ед./мл, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 или 1000 ед./мл. Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат быстродействующий инсулин, такой как быстродействующий аналог инсулина (например, инсулин лизпро, инсулин аспарт или инсулин глулизин), в количестве, которое составляет по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или составляет, или составляет примерно 100 ед./мл.

В предусмотренных в настоящем документе стабильных совместных композициях стабильность инсулина, в том числе аналогов инсулина, в композициях зависит от обнаружения, чистоты и/или активности инсулина при хранении при различных температурах (например, при 2-8°С, 20-30°С или при повышенных температурах, по меньшей мере или примерно от 32 до 40°С) и в течение разного времени (например, часов, дней, недель и месяцев) и в условиях применения (например, перемешивания), как описано в настоящем документе. Методы оценки этих параметров обсуждаются ниже. Предусмотренные в настоящем документе композиции сохраняют обнаружение, чистоту и/или активность инсулина на таком уровне, что композиции подходят для терапевтического применения, как описано в настоящем документе. Например, в предусмотренных в настоящем документе композициях чистота инсулина (например, оцениваемая с помощью RP-HPLC или другого аналогичного способа) с течением времени и при хранении или в условиях применения, как описано здесть, составляет по меньшей мере 85% от чистоты инсулина в композиции перед хранением или применением, например по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше. Обычно целевая приемлемая характеристика для чистоты инсулина (например, оцененной с помощью RP-HPLC) составляет по меньшей мере или примерно 90% чистоты или примерно или больше чем 90% чистоты. В других примерах чистоту инсулина можно оценить как функ- 60 033472 цию агрегации инсулина, например, с использованием неденатурирующей или денатурирующей эксклюзионной хроматографии (SEC). В таких примерах в предусмотренных в настоящем документе композициях с течением времени и при хранении или в условиях применения, как описано в настоящем документе, инсулин в композиции содержит меньше чем 2% высокомолекулярных (HMWt) форм инсулина, как определено по площади пика, например меньше чем 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0% или меньше. С течением времени (например, часов, дней, недель или месяца) и при хранении (например, при различных температурах и в течение разного времени) или в условиях применения (например, перемешивание), как описано в настоящем документе, инсулин в предусмотренных в настоящем документе композициях сохраняет больше чем или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше от его обнаружения или активности. Таким образом, в растворе, включающем 100 ед./мл инсулина, в течение часов, дней, недель или месяцев при хранении или применении при температурах 2-8°С, 20-30°С, или при повышенных температурах, по меньшей мере или примерно от 32 до 40°С, или в условиях перемешивания, как описано в настоящем документе, сохраняется по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 ед./мл инсулина.

b) . Деградирующий гиалуронан фермент.

Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат терапевтически эффективное количество деградирующего гиалуронан фермента, например, описанного в разделе С, например гиалуронидазы, такой как PH20 (например, rHuPH20). Количество деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20,) в предусмотренных в настоящем документе совместных композициях представляет собой количество, достаточное для создания сверхбыстродействующей композиции. Например, количество функционально эквивалентно по меньшей мере или примерно по меньшей мере 30 ед./мл. Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат деградирующий гиалуронан фермент, такой как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), в количестве между или примерно между 30 и 20,000 ед./мл, 300 и 15,000 ед./мл, 300 и 10,000 ед./мл, 300 и 5,000 ед./мл, 300 и 3000 ед./мл, 300 и 2000 ед./мл, 600 и 20,000 ед./мл, 600 и 15,000 ед./мл, 600 и 10,000 ед./мл, 600 и 6000 ед./мл, 600 и 4000 ед./мл, 600 и 2000 ед./мл, 600 и 1000 ед./мл, 60 и 600 ед./мл или 100 и 300 ед./мл, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 30, 35, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 12,000, 15,000 или 20,000 ед./мл. Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат PH20 (например, rHuPH20) в количестве, которое составляет по меньшей мере от 100 до 1000 ед./мл, например по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или примерно 600 ед./мл.

В предусмотренных в настоящем документе совместных композициях стабильность деградирующего гиалуронан фермента, в том числе гиалуронидазы, такой как PH20 (например, rHuPH20), в композициях является функцией обнаружения и/или активности фермента при хранении при различных температурах (например, 2-8°С, 20-30°С, или при повышенных температурах, по меньшей мере или примерно от 32 до 40°С), в течение времени (например, в течение часов, дней, недель или месяцев), или в условиях применения (например, перемешивание), как описано в настоящем документе. Методы оценки этих параметров обсуждаются ниже. Предусмотренные в настоящем документе композиции сохраняют обнаружение и/или активность гиалуронидазы на таком уровне, что композиции подходят для терапевтического применения, как описано в настоящем документе. В предусмотренных в настоящем документе стабильных совместных композициях активность деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20, как правило, составляет больше или примерно 50%, например по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше от активности фермента в композиции перед хранением или применением. Обычно для активности гиалуронидазы целевая приемлемая характеристика стабильности составляет по меньшей мере 62% от начальной активности фермента в течение часов, дней, недель или месяцев при хранении или применении при температурах 2-8°С, 20-30°С или при повышенных температурах, по меньшей мере или примерно от 32 до 40°С, или в условиях перемешивания, как описано в настоящем документе. Таким образом, например, в растворе с 600 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, например rHuPH20, с течением времени и при хранении или в условиях применения сохраняется по меньшей мере или примерно по меньшей мере 360, 365, 370, 375, 380, 390, 420, 480, 540, 546, 552, 558, 564, 570, 576, 582, 588, 594 ед./мл или больше активности. Например, в предусмотренных в настоящем документе стабильных совместных композициях с течением времени или при хранении или в условиях применения (например, при перемешивании) сохраняется по меньшей мере 375 ед./мл активности деградирующего гиалуронан фермента. В других примерах стабильность можно оценить как функцию обнаружения фермента, например, с использованием RP-HPLC. В таких примерах в предусмотренных в настоящем документе композициях обнаружение деградирующего гиалуронан фермента находится между или примерно между 60 и 140%. Например, в предусмотренных в настоящем документе композициях обнаружение фермента гиалуронидазы составляет или составляет примерно 3-7 мкг/мл.

c) . Консерванты.

Для применения в качестве композиций для многократного введения (многодозовых композиций)

- 61 033472 предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат консервант (консерванты). Как обсуждалось выше, консерванты могут оказывать негативное воздействие на растворимость инсулина и стабильность и активность ферментов, расщепляющих гиалуроновую кислоту, таких как PH20 (например, rHuPH20), в то же время стабилизируя гексамерные молекулы инсулина и являясь необходимыми в качестве противомикробного агента в многодозовых композициях. Таким образом, одной из целей настоящего изобретения является выявление типа и концентрации консерванта (консервантов), которые могут быть использованы в стабильных совместных композициях, включающих быстродействующие аналоги инсулина и деградирующий гиалуронан фермент, такой как растворимая гиалуронидаза (например, rHuPH20).

Один или несколько консервантов, присутствующих в совместной композиции, не должны существенно дестабилизировать деградирующий гиалуронан фермент, например гиалуронидазу, например PH20 (например, rHuPH20), так что он теряет свою активность при хранении (например, с течением времени и при различных температурах). Кроме того, эти консерванты должны присутствовать в концентрации, достаточной для стабилизации гексамеров инсулина, и оказывать необходимый противомикробный эффект, но не быть настолько концентрированными, чтобы уменьшить растворимость инсулина. Важно отметить, что консерванты должны присутствовать в концентрации, достаточной для удовлетворения противомикробных требований, например, Фармакопеи США (USP) и Европейской Фармакопеи (ЕР). В табл. 23 в примере 7Е ниже приведены данные требования, включая минимальные противомикробные требования Европейской Фармакопеи (ЕРА) и предпостительные противомикробные требования Европейской Фармакопеи (ЕРВ). Как правило, препараты, отвечающие противомикробньм требованиям ЕР (ЕРА или ЕРВ), содержат больше консерванта, чем те, которые приготовлены только в соответствии с противомикробными требованиями USP.

Таким образом, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат консервант (консерванты) в количестве, которое достаточно для противомикробной активности, уничтожения или ингибирования размножения микроорганизмов в образце композиции по результатам теста противомикробной эффективности консерванта (АРЕТ). Специалист в этой области знаком с тестами на противомикробную эффективность консерванта и стандартами, которые должны соответствовать USP и ЕРА или ЕРВ, с целью удовлетворения минимальным требованиям. В целом, тест на противомикробную эффективность консерванта включает заражение композиции, например совместной композиции, представленной здесь, установленным количеством культуры подходящих микроорганизмов, т.е. бактерий, дрожжей и грибов, хранение инокулированного препарата при заданной температуре, отбор проб в указанных интервалах времени и подсчет микроорганизмов в образце (см., Sutton and Porter, (2002) PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 56(11); 300-311; The United States Pharmacopeial Convention, Inc. (effective January 1, 2002), The United States Pharmacopeia 25^th Revision, Rockville, MD, Chapter <51> Antimicrobial Effectiveness Testing; and European Pharmacopoeia, Chapter 5.1.3, Efficacy of Antimicrobial Preservation). Микроорганизмы, используемые при анализе, обычно включают три штамма бактерий, а именно Е. coli (ATcC № 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC № 9027) и Staphylococcus aureus (ATCC № 6538), дрожжи (Candida Albicans ATCC № 10231) и грибы (Aspergillus Niger № ATCC 16404), которые добавляют таким образом, что композиция содержит 10⁵ или 10⁶ инокулированных колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизма на 1 мл композиции. Свойства консерванта композиции считаются адекватными, если в условиях испытания наблюдается значительное падение или отсутствие увеличения, как указано в табл. 6 ниже, количества микроорганизмов в инокулированной композиции в течение времени и при предписанной температуре. Критерии оценки приведены в отношении снижения десятичного логарифма количества жизнеспособных микроорганизмов по сравнению с исходным образцом или предыдущей временной точкой.

- 62 033472

Таблица 6

Требования USP и ЕР к тестированию противомикробной эффективности

USP	Критерии соответствия
Бактерии	Снижение не менее, чем на 1,0 порядок (log) от исходной расчетной величины на 7 день, снижение не менее 3,0 порядка от исходной величины на 14 день, и отсутствие роста с 14 до 28 дня. Отсутствие роста определяется как не более 0,51ogio превышение предыдущего измеренного значения.
Дрожжи или плесень	Отсутствие роста по сравнению с начальной расчетной величиной на 7, 14 и 28 день. Отсутствие роста определяется как не более 0,51ogio превышение предыдущего измеренного значения.
ЕРА	Критерии соответствия
Бактерии	Снижение на 2 порядка числа жизнеспособных микроорганизмов против значения, полученного для инокулята в точке 6 часов, снижение на 3 порядка числа жизнеспособных микроорганизмов против значения, полученного для инокулята в точке 24 часа и отсутствие обнаружения на 28 день.
Дрожжи или плесень	Снижение на 2 порядка числа жизнеспособных микроорганизмов против значения, полученного для посевного материала на 7 день, и отсутствие роста на 28 день. Отсутствие роста определяется как не более 0,51ogio превышение предыдущего измеренного значения.
ЕРВ	Критерии соответствия
Бактерии	Снижение на 1 порядок числа жизнеспособных микроорганизмов против значения, полученного для инокулята в точке 24 часа, снижение на 3 порядка числа жизнеспособных микроорганизмов против значения, полученного для инокулята на 7 день и отсутствие роста на 28 день. Отсутствие роста определяется как не более 0,51ogio превышение предыдущего измеренного значения.
Дрожжи или плесень	Снижение на 1 порядок числа жизнеспособных микроорганизмов против значения, полученного для инокулята на 7 день и отсутствие роста на 28 день. Отсутствие роста определяется как не более 0,51ogio превышение предыдущего измеренного значения.

В частности, композиция, например совместная композиция, готовится в виде аликвот по меньшей мере в 5 контейнерах, по одному для каждого из штаммов бактерий или грибов (Escherichia coli (ATCC № 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC № 9027), Staphylococcus aureus (ATCC № 6538), Candida albicans (ATCC № 10231) и Aspergillus niger (ATCC № 16404)). Каждый контейнер затем инокулируют одним из тестируемых организмов, чтобы в инокуляте оказалось 10⁵ или 10⁶ микроорганизмов на 1 мл композиции и инокулят составлял не более 1% от объема композиции. Инокулированные композиции выдерживают при температуре 20-25°С в течение 28 дней, а образцы отбирают через 6 ч, 24 ч, 7 дней, 14 дней и 28 дней, в зависимости от критериев, изложенных в табл. 5 выше. Число жизнеспособных микроорганизмов (КОЕ) в каждом образце определяется с помощью подсчета на чашках или фильтрации через мембрану. Наконец, КОЕ для каждого образца сравнивают с инокулятом или предыдущим образцом и определяют снижение количества микроорганизмов.

В соответствии со стандартами Фармакопеи США значение или уровень противомикробной активности консервантов в образцах, инокулированных микроорганизмами, вызывает, по меньшей мере, снижение на 1,0 порядок количества бактериальных организмов на 7 день после инокуляции, по меньшей мере, уменьшение на 3 порядка количества бактериальных организмов на 14 день после инокуляции и, по меньшей мере, отсутствие дальнейшего роста, то есть не более чем увеличение на 0,5log₁₀ количества бактериальных организмов с 14 по 28 день после инокуляции композиции микробным инокулятом. Для грибов в соответствии со стандартами USP значение или уровень противомикробной активности консервантов в пробах, инокулированных микроорганизмами, определяется, по меньшей мере, отсутствием роста по сравнению с их первоначальным количеством на 7, 14 и 28 дни после инокуляции композиции микробным инокулятом. Согласно ЕРВ или согласно минимальным стандартам ЕР значение или уровень противомикробной активности консервантов в пробах, инокулированных микробными организмами, определяется, по меньшей мере, снижением на 1,0 порядок количества бактериальных организмов в точке 24 ч после инокуляции, уменьшением по меньшей мере на 3 порядка количества бактериальных организмов на 7 день после инокуляции и, по меньшей мере, отсутствием дальнейшего роста, то есть увеличением не более чем на 0,5log₁₀ количества бактериальных организмов на 28 день после инокуляции композиции микробным инокулятом. Стандарты ЕРА требуют, по меньшей мере, уменьшения на 2 порядка количества бактериальных организмов в точке 6 ч после инокуляции, по меньшей мере, снижения на 3 порядка количества бактериальных организмов в точке 24 ч после инокуляции и отсутствие обнаружения микроорганизмов через 28 дней после инокуляции. Для грибных организмов в соответствии с ми

- 63 033472 нимальными стандартами ЕРВ значение или уровень противомикробной активности консервантов в пробах, инокулированных микроорганизмами, определяется снижением по меньшей мере на 1 порядок количества грибных организмов на 14 день после инокуляции и отсутствием роста грибных организмов на 28 день после инокуляции композиции; повышенные стандарты ЕРА требуют уменьшения на 2 порядка на 7 день после инокуляции и отсутствие роста грибных организмов на 28 день после инокуляции композиции.

Не ограничивающие примеры консервантов, которые могут быть включены в совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, фенол, метакрезол (м-крезол), метилпарабен, бензиновый спирт, тимеросал, хлорид бензалкония, 4-хлор-1-бутанол, хлоргексидин дигидрохлорид, хлоргексидин диглюконат, L-фенилаланин, ЭДТА, бронопол (2-бром-2нитропропан-1,3-диол), фенилртутьацетат, глицерол (глицерин), имидомочевину, хлоргексидин, дегидроацетат натрия, ортокрезол (о-крезол), паракрезол (п-крезол), хлоркрезол, цетримид, бензетоний хлорид, этилпарабен, пропилпарабен или бутилпарабен и любую их комбинацию. Например, совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, могут содержать один консервант. В других примерах совместные композиции содержат по меньшей мере два различных консерванта или по меньшей мере три различных консерванта. Например, совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, могут содержать два консерванта, такие как L-фенилаланин и м-крезол, L-фенилаланин и метилпарабен, L-фенилаланин и фенол, м-крезол и метилпарабен, фенол и метилпарабен, м-крезол и фенол или другие подобные комбинации. В одном примере консервант в совместной композиции содержит по меньшей мере один фенольный консервант. Например, совместная композиция содержит фенол, м-крезол или фенол и м-крезол.

В совместных композициях, предусмотренных в настоящем документе, общее количество одного или более консервантов в процентах массовой концентрации (мас./об.) в композиции может находиться, например, между или примерно между 0,1 и 0,4%, например от 0,1 до 0,3%, от 0,15 до 0,325%, от 0,15 до 0,25%, от 0,1 до 0,2%, от 0,2 до 0,3% или от 0,3 до 0,4%. Как правило, совместные композиции содержат менее 0,4% (мас./об.) консерванта. Например, совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, содержат по меньшей мере или примерно по меньшей мере 0,1, 0,12, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16 0,17, 0,175, 0,18, 0,19, 0,2, 0,25, 0,3, 0,325, 0,35, но менее 0,4% консерванта.

Примерами консервантов, применяемых в стабильных совместных композициях инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), являются фенол и м-крезол. В некоторых примерах процент массовой концентрации (мас./об.) фенола в совместной композиции превышает процент массовой концентрации (мас./об.) м-крезола. Это обусловлено, по меньшей мере частично, более существенным негативным эффектом м-крезола на стабильность деградирующего гиалуронан фермента (например, rHuPH20) в растворе, в особенности при повышенных температурах, по сравнению с фенолом (см., например, пример 7). Таким образом, в предусмотренных здесь стабильных совместных композициях отношение процентов массовой концентрации фенол:метакрезол составляет по меньшей мере или примерно 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1, 2:1, 2,1:1, 2,2:1, 2,3:1, 2,4:1, 2,5:1, 2,6:1, 2,7:1, 2,8:1, 2,9:1, 3:1 или более.

В некоторых примерах стабильные совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, содержат между или примерно между 0,1 и 0,25% фенола, а также между или примерно между 0,05 и 0,2% м-крезола, например между или примерно между 0,10 и 0,2% фенола и между или примерно между 0,6 и 0,18% м-крезола или между или примерно между 0,1 и 0,15% фенола и между или примерно между 0,8 и 0,15% м-крезола. Например, стабильные совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, содержат или содержат примерно 0,1% фенола и 0,075% м-крезола; 0,1% фенола и 0,15% м-крезола; 0,125% фенола и 0,075% м-крезола; 0,13% фенола и 0,075% м-крезола; 0,13% фенола и 0,08% м-крезола; 0,15% фенола и 0,175% м-крезола или 0,17% фенола и 0,13% м-крезола.

d). NaCl.

Примеры предусмотренных в настоящем документе стабильных совместных композиций инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), могут содержать NaCl в качестве стабилизирующего агента. В предусмотренных в настоящем документе совместных композициях, содержащих NaCl в качестве стабилизирующего агента, концентрация NaCl в совместных композициях может составлять или составлять примерно от 50 до 200 мМ, например между или примерно между 80 и 140 мМ, 80 и 120 мМ, 80 и 100 мМ, 100 и 140 мМ или 120 и 140 мМ. Например, в настоящем документе предусмотрены совместные композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, содержащие примерно, или по меньшей мере, или 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 мМ NaCl.

Кроме того, в настоящем документе обнаружено, что в то время как инсулины обычно не достаточно растворимы при высокой концентрации NaCl и в условиях низкого pH, при которых активность деградирующего гиалуронан фермента является оптимальной, NaCl в меньшей степени влияет на растворимость инсулина при условиях ускоренной деградации при повышенной температуре. Таким обрзом, совместные композиции, стабильные в условиях ускоренной деградации (например, при повышенной температуре или при перемешивании), таких, которые имеют место при CSII терапии, как правило, со- 64 033472 держат более высокую концентрацию NaCl, чем композиции, стабильные при температурах ниже 32°С.

Также понятно, что в предусмотренных в настоящем документе совместных композициях конкретный pH совместной композиции может зависеть от концентрации NaCl, и наоборот. Например, в совместных композициях, имеющих pH, равный или примерно равный 7,2, например 7,2±0,2 или ниже, совместные композиции, обычно, содержат соль в концентрации, составляющей или составляющей примерно от 100 до 140 мМ. В совместной композиции, имеющей pH, равный или равный примерно 7,3, например 7,3±0,2 или выше, совместные композиции обычно содержат соль в концентрации, составляющей или составляющей примерно от 50 до 100 мМ NaCl.

Также, как указано в примерах в настоящем документе, каждый инсулин и аналог инсулина имеет разные требования растворимости, на которую влияют уровень NaCl и pH композиции. Обычно для инсулина и растворимости инсулина предпочтительны высокий pH и низкая концентрация соли. Например, регулярный инсулин образует осадок за 1 неделю при высоких концентрациях NaCl выше 80 мМ, и при низком pH 7,0. Но регулярный инсулин не образует осадка в течение времени тестирования свыше 15 месяцев при концентрации NaCl, равной 80 мМ или меньше, и при высоком pH 7,6. Аналогично, аналоги инсулина лизпро и аспарт также обнаруживают влияние соли и pH на их растворимость, причем осадки образуются, обычно, при высоких концентрациях соли выше 80 мМ и низком pH, равном 7,2 или 7,0. В отличие от этого, при низких концентрациях соли, равных 80 мМ или ниже, и высоком pH, равном 7,4 или 7,6, инсулины обладают большей стабильностью и практически не образуют или не образуют осадков с течением времени. Инсулин глулизин является ниаболее растворимым. Таким образом, наименее растворимые инсулины переносят более низкие концентрации соли по сравнению с наиболее растворимыми инсулинами. Таким образом, вследствие разной относительной растворимости инсулинов, концентрация соли в предусмотренных в настоящем документе композициях может зависеть от типа инсулина в композиции, поскольку растворимость инсулина напрямую связана с устойчивостью к концентрации соли.

С учетом приведенного в настоящем документе описания специалист в данной области тезники может оценить опытным путем растворимость и стабильность инсулина и деградирующих гиалуронан ферментов по настоящему документу в зависимости от концентрации NaCl, конкретного инсулина и требуемых параметров стабильности конкретной композиции.

е). pH.

В настоящем документе предусмотрены стабильные совместные композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), которые имеют pH в диапазоне между или примерно между 6,5 и 8,0, например 6,5 и 7,8 или 6,8 и 7,8, например между или примерно между 6,5 и 7,5 или 7,0 и 7,6. Указание pH в настоящем документе основано на измерении pH при комнатной температуре. Понятно, что pH может изменяться в процессе хранения с течением времени, но, как правило, будет оставаться между или примерно между pH 6,5 и 8,0, например от или примерно от 6,8 до или примерно до 7,8. Например, pH может изменяться на ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 или больше. Таким образом, понятно, что ссылка на совместную композицию, имеющую pH, равный, равный примерно, или равный по меньшей мере pH 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 или 7,6, включает совместные композиции, которые в готовом виде имеют pH, равный, или равный примерно, или равный по меньшей мере 7,0±0,2, 7,1±0,2, 7,2±0,2, 7,3±0,2, 7,4±0,2, 7,5±0,2 или 7,6±0,2.

Поскольку как соль, так и pH представляют собой противоположные параметры, влияющие на стабильность инсулина и активность деградирующего гиалуронан фермента, их включение в совместные композиции соответствующим образом сбалансировано. Таким образом, например, обычно, в предусмотренных в настоящем документе композициях, чем ниже концентрация соли, тем выше pH. В другом примере предусмотренных в настоящем документе совместных композиций, чем выше концентрация соли, тем ниже pH. Специалист в данной области техники может опытным путем проверить значения pH и концентрации соли в совместных композициях для достижения желаемой стабильности и сохранения активности деградирующего гиалуронан фермента и растворимости инсулина, как описано в настоящем документе. Например, оптимальные значения pH и концентрации соли могут быть достигнуты с помощью методик приготовления композиций, известных специалистам в данной области и приведенных в примерах в настоящем документе. Например, оптимальные pH и концентрации соли можно определить путем оценки активности или обнаружения деградирующего гиалуронан фермента и растворимости, агрегации или обнаружения инсулина при различающихся условиях pH или концентрации соли с использованием различных способов, известных специалистам в данной области, например, как описано в разделе Н.2.

Например, как обсуждалось в настоящем документе, в настоящем документе было обнаружено, что в то время как инсулины обычно не достаточно растворимы при высокой концентрации соли и в условиях низкого pH, при которых активность деградирующего гиалуронан фермента является оптимальной, условия низкого pH в меньшей степени влияют на растворимость инсулина при условиях ускоренной деградации при повышенной температуре. Таким образом, совместные композиции, стабильные в условиях ускоренной деградации (например, при повышенной температуре или при перемешивании), такие,

- 65 033472 которые имеют место при CSII терапии, как правило, имеют более низкий pH, чем композиции, стабильные при температурах ниже 32°С.

Если необходимо, pH может быть доведен с помощью подкислителей для снижения pH или подщелачивающих агентов для увеличения pH. Примеры подкислителей включают, но не ограничиваются этим, уксусную кислоту, лимонную кислоту, серную кислоту, соляную кислоту, раствор одноосновного фосфата натрия и фосфорную кислоту. Примеры подщелачивающих агентов включают, но не ограничиваются ими, раствор двухосновного фосфата натрия, карбонат натрия и гидроксид натрия.

f) . Буфер.

Любой буфер может быть использован в совместных композициях, предусмотренных в настоящем документе, если он не оказывает неблагоприятного влияния на стабильность совместной композиции, а также поддерживает необходимый диапазон pH. Примеры особенно подходящих буферов включают Трис, сукцинат, ацетат, фосфатные буферы, цитрат, малат, аконитат и карбонат. Специалистам в данной области техники, однако, будет очевидно, что композиции, предусмотренные в настоящем документе, не ограничены конкретным буфером, в случае, если буфер обеспечивает приемлемый стабильный уровень pH, или буферную емкость, в указанном интервале. Как правило, буфер имеет достаточную буферную емкость в пределах около 1 единицы pH от его рК (Lachman et al. 1986). Пригодность буфера может быть оценена на основе опубликованных таблиц рК или может быть определена эмпирическими методами, хорошо известными в данной области. pH раствора можно регулировать до желаемой конечной точки в пределах диапазона, как описано выше, например, с применением любой приемлемой кислоты или основания.

Буферы, которые могут быть включены в совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, трис (трометамин), гистидин, фосфатные буферы, такие как двухосновный фосфат натрия, и цитратные буферы. Как правило, буферный агент присутствует в таком количестве, чтобы поддерживать диапазон pH совместной композиции между или примерно между 7,0 и 7,6. Такие буферные агенты могут присутствовать в совместных композициях в концентрации между или примерно между 1 и 100 мМ, например от 10 до 50 мМ или от 20 до 40 мМ, например примерно 30 мМ. Например, такие буферные агенты могут присутствовать в совместных композициях в концентрации или примерно в концентрации или, по меньшей мере, в концентрации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 мМ или более.

Примеры буферов в совместных композициях данного документа включают не связывающие металл буферы, такие как Трис, которые уменьшают количество осадка инсулина по сравнению со связывающими металл буферами, такими как фосфатные буферы. Включение Трис в качестве буфера в совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, имеет дополнительные преимущества. Например, pH раствора, который забуферен Трис, зависит от температуры, при которой находится раствор. Таким образом, когда совместную композицию инсулина и деградирующего гиалуронан фермента получают при комнатной температуре при pH 7,3, при охлаждении pH возрастает примерно до 7,6. Такой pH способствует растворению инсулина при такой температуре, при которой инсулин в противном случае, вероятно, будет нерастворимым. И, наоборот, при повышенных температурах pH композиции снижается примерно до pH 7,1, что повышает стабильность деградирующего гиалуронан фермента при температуре, при которой фермент, наоборот, может стать нестабильным. Таким образом, растворимость и стабильность инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), достигает максимума в совместных композициях, содержащих Трис в качестве буфера, по сравнению с другими буферами. Кроме того, поскольку Трис является положительным ионом, добавление NaCl в раствор в качестве противоиона не требуется. Это также полезно для общей стабильности совместной композиции, поскольку NaCl при высоких концентрациях снижает растворимость инсулина.

Как правило, Трис входит в совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, в концентрациях между или примерно между 10 и 50 мМ, таких как, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мМ. В конкретных примерах совместные композиции содержат или содержат примерно от 20 до 30 мМ Трис, например 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 мМ Трис. В конкретных примерах совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, содержат Трис в концентрации точно или примерно 30 мМ.

g) . Lys-Lys.

В примерах в настоящем документе совместные композиции содержат двухвалентный катион и, в частности, лизил-лизин (дилизин; Lys-Lys), или его соль, производное, аналог или миметик, достаточный для стабилизации деградирующего гиалуронан фермента в совместной композиции. Например, двухвалентный катион Lys-Lys оказывает меньшее воздействие на растворимость инсулина, чем MgCl2. Lys-Lys предусмотрен в количестве, которое при комбинировании с консервантами и другими стабилизаторами при соответствующем pH, как обсуждалось выше, приводит к стабильной совместной композиции, в которой сохраняется активность деградирующего гиалуронан фермента и воздействие на растворимость инсулина минимизировано, как описано в настоящем документе выше.

Например, Lys-Lys может быть включен в предусмотренные в настоящем документе совместные

- 66 033472 комозиции в количестве между или примерно между 50 и 120 мМ, например между или примерно между и 80 мМ, 80 и 100 мМ или 100 и 120 мМ. Например, Lys-Lys может быть включен в предусмотренные в настоящем документе совместные комозиции в количестве, которое составляет по меньшей мере, или составляет по меньшей мере, примерно, или составляет 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 или 120 мМ.

Как правило, чем выше концентрация Lys-Lys, тем выше стабильность совместной композиции, содержащей PH20 и инсулин или аналоги инсулина. Конкретное количество Lys-Lys в композиции, тем не менее, может зависеть от конкретного инсулина. Например, для достижения аналогичной стабильности в совместной композиции аналог инсулина глулизин требует наименьшее количество Lys-Lys (например, от 50 до 105 мМ), далее следуют аналоги инсулина аспарт и лизпро (например, от 80 до 100 мМ), регулярный инсулин требует наибольшего количества (например, от 100 до 120 мМ). Специалист в данной области с учетом описания, приведенного в настоящем документе, может оценить опытным путем растворимость и стабильность инсулина и деградирующего гиалуронан фермента по настоящему документу как функцию концентрации Lys-Lys, конкретного инсулина и требуемых параметров стабильности конкретной композиции.

В одном из примеров совместные композиции, содержащие регулярный инсулин, обычно содержат от 100 до 120 мМ Lys-Lys, например по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или 100, 105, 110, 115 или 120 мМ. В другом примере совместные композиции, содержащие инсулин аспарт или инсулин лизпро, содержат от 80 до 120 мМ Lys-Lys, например по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или 80, 85, 90, 95 или 100 мМ. В следующем примере совместные композиции, содержащие инсулин глулизин, содержат от 50 до 105 мМ Lys-Lys, например по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или 105 мМ.

Как правило, в примерах в настоящем документе, если совместные композиции содержат Lys-Lys, для поддержания стабильности компонентов не требуется добавлять NaCl в качестве стабилизатора. В некоторых случаях для поддержания тоничности требуются модификаторы тоничности. Например, если количество Lys-Lys в совместной композиции меньше чем 50 мМ/мл, то может потребоваться модификатор тоничности. Специалист в данной области может определить, следует ли включать модификатор тоничности в совместную композицию. Как обсуждалось ниже, примеры модификаторов тоничности включают, не ограничиваясь этим, глицерин, NaCl, аминокислоты, многоатомные спирты, трегалозу и другие соли и/или сахара. Таким образом, в некоторых примерах предусмотренные в настоящем документе стабильные совместные композиции, содержащие Lys-Lys, могут необязательно также содержать NaCl. В таких примерах концентрация NaCl обычно составляет меньше 140 мМ и, как правило, меньше чем 100, 90, 80, 70, 50, 40, 30, 20, 10 мМ или меньше. Конкретное количество модификатора тоничности может быть определено опытным путем, чтобы сохранить активность фермента и/или тоничность.

h). Примеры дополнительных вспомогательных веществ или стабилизаторов.

Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции могут дополнительно содержать другие компоненты, которые при комбинировании с консервантами, солью и стабилизаторами при соответствующем pH, как обсуждалось выше, приводят к стабильной совместной композиции. Другие компоненты включают, например, один или несколько модификаторов тоничности, один или несколько антиокислительных агентов, цинк или другой стабилизатор.

Например, стабильность деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), значительно снижена, если совместные композиции содержат низкую концентрацию NaCl, высокий pH, если присутствуют консерванты и они хранятся при повышенных температурах (например, от 20 до 30°С или выше). Аналогично, эти и другие параметры могут влиять на стабильность инсулина. Такой нестабильности можно в некоторой степени противодействовать путем добавления одного или нескольких стабилизаторов. Обычно предусмотренные в настоящем документе композиции содержат стабилизатор или стабилизаторы в таком количестве, которое в течение хранения (температура и время) сохраняет по меньшей мере 50% от начальной активности (например, 375 ед./мл) деградирующего гиалуронан фермента.

В число типов стабилизаторов, которые могут содержаться в предусмотренных в настоящем документе композициях, включены аминокислоты, производные аминокислот, амины, сахара, многоатомные спирты, соли и буферы, поверхностно-активное вещество и другие агенты. Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат по меньшей мере один стабилизатор. Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть или больше стабилизаторов. Таким образом, любое одно или несколько веществ из аминокислот, производных аминокислот, аминов, сахаров, многоатомных спиртов, солей или буферов, поверхностно-активных веществ и других агентов могут быть включены в совместные композиции в настоящем документе. Обычно совместные композиции в настоящем документе содержат, по меньшей мере, поверхностно-активное вещество и соответствующий буфер. Необязательно, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции могут содержать другие дополнительные стабилизаторы.

Примеры аминокислотных стабилизаторов, производных аминокислот или аминов включают, не ограничиваясь этим, L-аргинин, глутамин, глицин, лизин, метионин, пролин, Lys-Lys, Gly-Gly, оксид триметиламина (ТМАО) или бетаин. Примеры сахаров или многоатомных спиртов включают, не ограни- 67 033472 чиваясь этим, глицерол, сорбитол, маннитол, инозитол, сахарозу или трегалозу. Примеры солей или буферов включают, не ограничиваясь этим, хлорид магния, сульфат натрия, Трис, например Трис (100 мМ), или бензоат натрия. Примеры поверхностно-активных веществ включают, не ограничиваясь этим, полоксамер 188 (например, Pluronic® F68), полисорбат 80 (PS80), полисорбат 20 (PS20). Другие консерванты включают, не ограничиваясь этим, гиалуроновую кислоту (HA), человеческий сывороточный альбумин (HSA), фенилмасляную кислоту, таурохолевую кислоту, поливинилпиролидон (PVP) или цинк.

i) . Поверхностно-активное вещество.

В некоторых примерах предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат одно или несколько поверхностно-активных веществ. Такие поверхностно-активные вещества ингибируют агрегацию деградирующего гиалуронан фермента, такого как, например, гиалуронидаза PH20 (например, rHuPH20), и сводят к минимуму потери за счёт абсорбции. Поверхностно-активные вещества обычно являются неионными поверхностно-активными веществами. Поверхностно-активные вещества, которые могут быть включены в совместные композиции по данному изобретению, включают, но не ограничиваются ими, частичные сложные эфиры жирных кислот и простые эфиры многоатомных спиртов, таких как глицерин или сорбит, полоксамеры и полисорбаты. Например, примеры поверхностноактивных веществ в совместных композициях по данному изобретению включают любое одно или более из следующих веществ: полоксамер 188 (Pluronics®, такие как PLURONIC® F68), Tetronics®, полисорбат 20, полисорбат 80, ПЭГ 400, ПЭГ 3000, Tween® (например, Tween® 20 или Tween® 80), Тритон® Х100, SPAN®, MYRJ®, BRIJ®, Cremophor®, полипропиленгликоли или полиэтиленгликоли. В некоторых примерах в настоящем документе совместные композиции содержат полоксамер 188, полисорбат 20, полисорбат 80, как правило, полоксамер 188 (Pluronic F68). Совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, как правило, содержат по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, например 1, 2 или 3 поверхностно-активных вещества.

В совместных композициях по настоящему документу общее количество одного или более поверхностно-активного вещества в процентах массовой концентрации (мас./об.) в композиции может составлять, например, между или примерно между 0,005 и 1,0%, например между или примерно между 0,01 и 0,5%, например от 0,01 до 0,1% или от 0,01 до 0,02%. Как правило, совместные композиции содержат по меньшей мере 0,01% поверхностно-активного вещества, но менее 1,0%, например менее 0,5% или менее 0,1% поверхностно-активного вещества. Например, совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, могут содержать по меньшей мере или примерно 0,001, 0,005, 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,08 или 0,09% поверхностно-активного вещества. В конкретных примерах совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, содержат или содержат примерно от 0,01% до или примерно до 0,05% поверхностно-активного вещества.

Как показано в примерах в настоящем документе, на стабильность и ферментативную активность деградирующего гиалуронан фермента (например, rHuPH20) обычно не влияют разные поверхностноактивные вещества или концентрации поверхностно-активного вещества. Тем не менее, в настоящем документе обнаружено, что окисление фермента увеличивается с увеличением уровней поверхностноактивного вещества. Также поверхностно-активное вещество полоксамер 188 приводит к меньшему окислению, чем полисорбаты. В связи с этим совместные композиции в настоящем документе обычно содержат полоксамер 188. Таким образом, несмотря на то, что поверхностно-активные вещества способны стабилизировать деградирующий гиалуронан фермент, включение поверхностно-активных веществ в предусмотренные в настоящем документе совместные композиции может приводить к окислению деградирующего гиалуронан фермента при высоких концентрациях. Таким образом, обычно в настоящем документе в совместных композициях используются более низкие концентрации поверхностно-активного вещества, например, в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) меньше чем 1,0% и обычно между или примерно между 0,0005 и 0,1%, например между или примерно между 0,01 и 0,05%. Также, как предусмотрено в настоящем документе ниже, для снижения или предотвращения окисления, необязательно, в композиции может быть включен антиокислительный агент.

Примеры совместных композиций, предусмотренные в настоящем документе, содержат полоксамер 188. Полоксамер 188 имеет более высокую критическую концентрацию мицеллообразования (cmc). Таким образом, применение полоксамера 188 может уменьшить образование мицелл в композиции, что, в свою очередь, может привести к снижению эффективности консервантов. Таким образом, среди совместных композиций, предусмотренных в настоящем документе, есть композиции, которые содержат или содержат примерно 0,01 или 0,05% полоксамера 188.

В других примерах предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат полисорбат 20. Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат от 0,0005 до 0,1%, например от 0,0005 до 0,01%, например по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или 0,001% полисорбата 20.

ii) . Модификатор тоничности.

Например, для получения раствора с желаемой осмолярностью в предусмотренные в настоящем документе композиции могут быть включены модификаторы тоничности. Предусмотренные в настоящем

- 68 033472 документе совместные композиции имеют осмолярность между или примерно между 245 и 305 мОсм/кг.

Например, осмолярность равна или равна примерно 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295,

300 или 305 мОсм/кг. В некоторых примерах совместные композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), имеют осмолярность, равную или примерно равную 275 мОсм/кг.

Модификаторы тоничности включают, не ограничиваясь этим, глицерин, NaCl, аминокислоты, многоатомные спирты, трегалозу и другие соли и/или сахара. Например, в предусмотренные в настоящем документе композиции может быть включен NaCl в концентрации между или примерно между 0 и 200 мМ, например обычно между 30 и 100 мМ, 50 и 160 мМ, например между 50 и 120 мМ или между 80 и 140 мМ или между 50 и 200 мМ. Как правило, если используется модификатор тоничности, например, в совместных композициях, содержащих Lys-Lys, NaCl предусмотрен в концентрации меньше чем 140 мМ, и обычно меньше чем 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 мМ или меньше. Чтобы сохранить активность фермента, растворимость инсулина и/или тоничность, конкретное количество может быть установлено опытным путем.

iii) . Глицерин.

В других случаях в совместные композиции включен глицерин (глицерол). Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции, как правило, содержат меньше чем 60 мМ глицерина, например меньше чем 5 мМ, меньше чем 50 мМ, меньше чем 45 мМ, меньше чем 40 мМ, меньше чем 35 мМ, меньше чем 30 мМ, меньше чем 25 мМ, меньше чем 20 мМ, меньше чем 15 мМ, 10 мМ или меньше. Количество глицерина, как правило, зависит от количества присутствующего NaCl: чем больше присутствует NaCl в совместной композиции, тем меньше глицерина требуется для достижения желаемой осмолярности. Таким образом, например, в совместных композициях, содержащих более высокие концентрации NaCl, таких как композиции, составленные с инсулинами с более высокой относительной растворимостью (например, инсулин глулизин), присутствие глицерина не требуется, или глицерин требуется в небольшом количестве. В противоположность, в совместные композиции, содержащие более низкие концентрации NaCl, такие как композиции, составленные с инсулинами с более низкой относительной растворимостью (например, инсулин аспарт), может быть включен глицерин. Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции, которые также содержат инсулин аспарт, содержат глицерин в концентрации меньше чем 50 мМ, например от 20 до 50 мМ, например 50 или примерно 50 мМ. В совместных композициях, содержащих даже более низкую концентрацию NaCl, например, в тех, которые составлены с инсулинами с наименьшей относительной растворимостью (например, инсулин лизпро или регулярный инсулин), глицерин включен в концентрации, равной или примерно равной, например, от 40 до 60 мМ.

iv) . Антиоксиданты.

Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции для снижения или предотвращения окисления, в частности окисления деградирующего гиалуронан фермента, также содержат антиоксиданты. Например, в примерах в настоящем документе показано, что на окисление могут влиять высокие концентрации поверхностно-активного вещества или олигомеров гиалуронана. Примеры антиоксидантов включают, не ограничиваясь этим, цистеин, триптофан и метионин. В конкретных примерах антиоксидант представляет собой метионин. Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции, содержащие инсулин и деградирующий гиалуронан фермент, такой как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), могут включать антиоксидант в концентрации от или примерно от 5 мМ до или примерно до 50 мМ, например от 5 до 40 мМ, от 5 до 20 мМ или от 10 до 20 мМ. Например, метионин может быть предусмотрен в совместных композициях в настоящем документе в концентрации от или примерно от 5 мМ и до или примерно до 50 мМ, например от 5 до 40 мМ, от 5 до 20 мМ или от 10 до 20 мМ. Например, антиоксидант, например метионин, может быть включен в концентрации, равной или примерно равной 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 или 50 мМ. В некоторых примерах совместные композиции содержат от 10 до 20 мМ метионина, например точно или примерно 10 или 20 мМ метионина.

v) . Цинк.

В некоторых случаях в совместные композиции в качестве стабилизатора гексамеров инсулина включен цинк. Например, композиции, содержащие регулярный инсулин, инсулин лизпро или инсулин аспарт, как правило, содержат цинк, тогда как композиции, содержащие инсулин глулизин, цинк не содержат. Цинк может быть предусмотрен, например, в виде оксида цинка, ацетата цинка или хлорида цинка. Цинк может присутствовать в предусмотренной в настоящем документе композиции в количестве между или примерно между 0,001 и 0,1 мг на 100 единиц инсулина (мг/100 ед.), между 0,001 и 0,05 мг на 100 ед. или между 0,01 и 05 мг на 100 ед. Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции могут содержать цинк в количестве, равном или равном примерно 0,002 мг на 100 единиц инсулина (мг/100 ед.), 0,005, 0,01, 0,012, 0,014, 0,016, 0,017, 0,018, 0,02, 0,022, 0,024, 0,026, 0,028, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08 или 0,1 мг/100 ед.

vi) . Аминокислотный стабилизатор.

Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции также содержат аминокислот- 69 033472 ный стабилизатор, который вносит вклад в стабильность препарата. Стабилизатор может представлять собой неполярную и основную аминокислоту. Примеры неполярных и основных аминокислот включают, не ограничиваясь этим, аланин, гистидин, аргинин, лизин, орнитин, изолейцин, валин, метионин, глицин и пролин. Например, аминокислотный стабилизатор представляет собой глицин или пролин, как правило, глицин. Стабилизатор может представлять собой единственную аминокислоту или может представлять собой комбинацию 2 или большего числа аминокислот. Аминокислотные стабилизаторы могут быть природными аминокислотами, аналогами аминокислот, модифицированными аминокислотами и эквивалентами аминокислот. Как правило, аминокислота представляет собой L-аминокислоту. Например, в случае, если пролин используется в качестве стабилизатора, это, как правило, L-пролин. Также можно использовать эквивалентны аминокислот, например, аналоги пролина. Концентрация аминокислотного стабилизатора, например глицина, включенного в совместную композицию, варьирует в диапазоне от 0,1 до 1 М аминокислоты, как правило, от 0,1 до 0,75 М, обычно от 0,2 до 0,5 М, например по меньшей мере или примерно 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,6, 0,7, 0,75 М или больше. Аминокислота, например глицин, может быть использована в форме фармацевтически приемлемой соли, такой как гидрохлорид, гидробромид, сульфат, ацетат и т.п. Чистота аминокислоты, например глицина, должна быть равна по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 99,5% или больше.

vii). Ингибитор гиалуронидазы.

В некоторых примерах предусмотренных в настоящем документе совместных композиций стабильность деградирующего гиалуронан фермента и быстродействующего инсулина при температуре от или примерно от 20°С до или примерно до 30°С в течение по меньшей мере 14 дней (т.е. 2 недель), как описано в настоящем документе выше, может увеличиваться при включении в композицию ингибитора гиалуронидазы. Такой ингибитор обычно не подходит для композиций, хранящихся при 2-8°С, поскольку, как наблюдалось для гиалуронана (HA) в настоящем документе, он может вызывать агрегацию инсулина при более низких температурах. В некоторых примерах можно выбрать ингибитор гиалуронидазы, подходящий для применения при 2-8°С.

В частности, стабильные совместные композиции для стабилизации деградирующего гиалуронан фермента от эффекта фенольных консервантов содержат ингибитор гиалуронидазы. В конкретных примерах ингибитор гиалуронидазы является таковым, что вступает в реакцию ассоциации с инсулином или ферментом, расщепляющим гиалуроновую кислоту, и связывается не ковалентно и не образует ковалентные комплексы с инсулином или ферментом, расщепляющим гиалуроновую кислоту. Ингибитор гиалуронидазы предусмотрен, по меньшей мере, в его равновесной концентрации. Специалисту в данной области техники известны различные классы ингибиторов гиалуронидазы (см., например Girish et al. (2009) Current Medicinal Chemistry, 16:2261-2288 и ссылки, приведённые в этой статье). Специалисту в данной области известна равновесная концентрация ингибитора гиалуронидазы в реакции или предусмотренной здесь стабильной композиции, или он может определить ее с помощью стандартных методов в данной области. Выбор ингибитора гиалуронидазы будет зависеть от конкретного деградирующего гиалуронан фермента, используемого в композиции. Например, гиалуронан является примером ингибитора гиалуронидазы для применения в стабильных композициях по настоящему изобретению, когда деградирующий гиалуронан фермент представляет собой PH20.

Типичные ингибиторы гиалуронидазы для применения в качестве стабилизирующих агентов по настоящему документу включают, но не ограничиваются ими, белки, гликозаминогликаны (GAG), полисахариды, жирные кислоты, ланостаноиды, антибиотики, антинематодные вещества, синтетические органические соединения или биологически активные компоненты растительного происхождения. Например, такой компонент растительного происхождения для гиалуронидазы может быть биологически активным алкалоидом, антиоксидантом, полифенолом, флавоноидом, терпеноидом и противовоспалительным препаратом. Типичные ингибиторы гиалуронидазы включают, например, сывороточный ингибитор гиалуронидазы, гликопротеин Withania Somnifera (WSG), гепарин, гепаринсульфат, дерматансульфат, хитозан, Р-(1,4)-галактоолигосахариды, сульфатированную вербаскозу, сульфатированную плантеозу, пектин, поли-(стирол-4-сульфонат), декстрансульфат, альгинат натрия, полисахарид из Undaria pinnatiflda, конденсированный полимер миндальной кислоты, эйкозатриеновую кислоту, ацетэруковую кислоту, олеаноловую кислоту, аристолоховую кислоту, аймалин, резерпин, флавон, десметоксицентауредин, кверцетин, кемпферол, апигенин, силибин, лютеолин, лютеолин-7-глюкозид, флоретин, апиин, гесперидин, сульфированный гесперидин, каликозин-7-О-Р-О-глюкопиранозид, флавон-7-сульфат натрия, флавон-7фтор-4'-гидроксифлавон, 4'-хлор-4,6-диметоксихалкон, 5-7-гидроксифлавонсульфат натрия, мирицетин, рутин, морин, глицирризин, витамин С, D-изоаскорбиновую кислоту, 1,4-лактон D-caxapa, L-аскорбат-6гексадеканоат (Vcpal), 6-О-ацилированный витамин С, катехин, нордигидрогуаиариновую кислоту, куркумин, N-пропилгаллат, дубильную кислоту, эллаговую кислоту, галловую кислоту, флорофукофуроэкол, диэкол, 8,8'-биэкол, процианидин, госсипол, целекоксиб, нимесулид, дексаметазон, индометицин, фенопрофен, фенилбутазон, оксифенбутазон, салицилаты, кромогликат динатрия, ауротиомалат натрия, транзилит, траксанокс, ивермектин, линокомицин и спектиномицин, сульфаметоксазол и триметоприм, неомицинсульфат, 3а-ацетилполипореновую кислоту, (25S)-(+)-12α-гидрокси-3α-метилкарбоксиацетат- 70 033472

24-метилланоста-8,24(31)-диен-26-овую кислоту, ланостаноид, полипореновую кислоту с, PS53 (полимер гидрохинон-сульфоновой кислоты и формальдегида), полимер поли-(стирол-4-сульфонат), VERSA-TL 502, 1-тетрадекансульфоновую кислоту, конденсированный полимер миндальной кислоты (SAMMA), 1,3-диацетилбензимидазол-2-тион, N-моноацилированный бензимидазол-2-тион, Ν,Ν'-диацилированный бензимидазол-2-тион, производное алкил-2-фенилиндола, 3-пропаноилбензоксазол-2-тион, Nалкилированное производное индола, N-ацилированное производное индола, производное бензотиазола, N-замещенный индол-2- и 3-карбоксамид, галогенированные аналоги (хлор- и фтор-) N-замещенных индол-2- и 3-карбоксамида, 2-(4-гидроксифенил)-3-фенилиндол, индолкарбоксамиды, индолацетамиды, 3бензолил-1-метил-4-фенил-4-ииперидинол, производное бензоилфенилбензоата, производное Lаргинина, гуанидин HCl, L-NAME, HCN, линамарин, амигдалин, гедерагенин, аэсцин, цисхинокирезинол и 1,3-ди-п-гидроксифенил-4-пентен-1-он.

В некоторых примерах стабилизирующий агент, являющийся ингибитором гиалуронидазы, представляет собой полисахарид N-ацетилглюкозамина и глюкороновой кислоты. В другом примере стабилизирующий агент, являющийся ингибитором гиалуронидазы, представляет собой аминосахар с отрицательно заряженным сахаром. В другом примере стабилизирующий агент, являющийся ингибитором гиалуронидазы, представляет собой аминометилиндол или производное аскорбиновой кислоты.

Примеры предусмотренных в настоящем документе совместных композиций содержат стабилизирующий агент, представляющий собой гиалуронан (гиалуроновая кислота; НА). Гиалуроновая кислота (НА, также известная как гиалуронан и гиалуронат) представляет собой природный субстрат для деградирующих гиалуронан ферментов, таких как гиалуронидаза, например PH20, в том числе rHuPH20. HA представляет собой несульфатированный глюкозаминогликан, широко распространенный в соединительных, эпителиальных и нервных тканях. Это полимер, включающий вплоть до 25,000 дисахаридных единиц, в свою очередь состоящих из D-глюкуроновой кислоты и D-N-ацетилглюкозамина. Молекулярный вес HA находится в диапазоне примерно от 5 до 200,000 кДа. Катализируя гидролиз гиалуронана, rHuPH20 (и другие гуалуронидазы и деградирующие гиалуронан ферменты) снижает вязкость гиалуронана, тем самым увеличивая проницаемость ткани и увеличивая абсорбцию жидкостей, вводимых парентерально.

Как показано в настоящем документе, гиалуроновая кислота (HA) является эффективным стабилизатором деградирующих гиалуронан ферментов в присутствии других дестабилизирующих агентов и условий, таких как, например, низкая концентрация соли, высокий pH, присутствие консервантов и повышенные температуры. В частности, HA, по-видимому, снижает или нивелирует отрицательное воздействие, которое, как правило, оказывают на rHuPH20 и другие растворимые гиалуронидазы и деградирующие гиалуронан ферменты более высокий pH и/или повышенные температуры, в особенности, в присутствии фенольных консервантов. Например, как показано в исследованиях, описанных ниже (см., например, пример 10D и пример 15), стабильность rHuPH20 значительно увеличивается при включении олигомеров HA (4-16-меров) в совместные композиции с инсулином. При увеличении концентрации HA наблюдается увеличение стабилизирующих свойств. Например, спустя 1 неделю при 30°С при pH 7,1 с 1 мг/мл HA и 75 мМ NaCl, активность rHuPH20 в совместной композиции rHuPH20/инсулин снижается с 600 до 341 ед/мл (т.е. сохраняется 57% первоначальной активности). При повышении концентрации HA до 10 мг/мл, активность rHuPH20 снизилась только с 600 до 510 ед./мл (т.е. сохраняется 85% от первоначальной активности). Более того, HA снижает или нивелирует дестабилизирующее воздействие, которое оказывает на rHuPH20 высокий pH. Например, спустя 1 неделю при 30°С и pH 7,1 с 5,5 мг/мл HA и 100 мМ NaCl, сохраняется 68% от первоначального rHuPH20. Этот процент существенным образом не изменился при повышении pH до 7,5. Аналогичное положительное влияние HA на стабильность rHuPH20 наблюдалось при повышенных температурах (см, например, пример 15). Таким образом, в настоящем документе установлено, что HA может быть включен в композиции инсулина и rHuPH20 (или других гиалуронидаз и деградирующих гиалуронан ферментов) для того, чтобы эффективно стабилизировать rHuPH20.

Таким образом, в настоящем документе предусмотрены стабильные композиции, содержащие НА. В композициях в качестве стабилизатора можно использовать HA любого размера. В некоторых примерах HA представляет собой дисахарид, состоящий из D-глюкуроновой кислоты и D-Nацетилглюкозамина. В других примерах HA представляет собой олигосахарид, например тетрасахарид, состоящий из 2 повторяющихся дисахаридных единиц или, альтернативно, HA, используется в предусмотренных в настоящем документе совместных композициях, может содержать несколько повторяющихся дисахаридных единиц, например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или больше дисахаридных единиц. В другом примере используемая в предусмотренных в настоящем документе совместных композициях HA имеет молекулярный вес от или примерно от 5 кДа до или примерно до 5,000 кДа; от или примерно от 5 кДа до или примерно до 1,000 кДа; от или примерно от 5 кДа до или примерно до 500 кДа; или от или примерно от 5 кДа до или примерно до 200 кДа. В примерах олигосахариды HA для применения в совместных композициях в настоящем документе имеют молекулярный вес, равный или равный примерно 6,4, 74,0 или 234,4 кДа. Например, среди предусмотренных в настоящем документе композиций инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза

- 71 033472 (например, rHuPH20), есть такие, которые содержат HA, имеющую молекулярный вес, равный по меньшей мере или примерно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220,

240, 260, 280, 300, 350, 400, 450 или 500 кДа. В одном из примеров, молекулярный вес HA в совместной композиции меньше чем 10кДа.

В настоящем документе предусмотрены, следовательно, совместные композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), которые содержат олигосахарид НА. Совместные композиции содержат от 1 до 20 мг/мл HA, например по меньшей мере или примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мг/мл или больше НА. Примеры стабильных совместных композиций инсулина и rHuPH20 включают от или примерно от 8 мг/мл до или примерно до 12 мг/мл HA, например примерно 10 мг/мл или примерно 10 мг/мл. В некоторых примерах молярное соотношение HA к деградирующему гиалуронан ферменту составляет или составляет примерно 100,000:1, 95,000:1, 90,000:1, 85,000:1, 80,000:1, 75,000:1, 70,000:1, 65,000:1, 60,000:1, 55,000:1, 50,000:1, 45,000:1, 40,000:1, 35,000:1, 30,000:1, 25,000:1, 20,000:1, 15,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 1,000:1, 900:1, 800:1, 700:1, 600:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1 или 100:1 или меньше.

viii) . Никотиновое соединение.

В некоторых примерах в качестве стабилизирующего агента используется никотиновое соединение. Никотиновые соединения включают, не ограничиваясь этим, никотинамид, никотиновую кислоту, ниацин, ниацинамид, витамин B3 и/или их соли и/или их комбинации. В конкретных применениях стабилизирующий агент может включать никотиновое соединение и аминокислоту или аминокислоты (см, например, международную опубликованную заявку РСТ номер WO 2010149772). Например, аминокислотой может быть аргинин, глутаминовая кислота и/или их соли или их комбинации.

ix) . Другие вспомогательные вещества или агенты.

Дополнительно совместные композиции могут включать носители, такие как разбавитель, адъювант, наполнитель или среда, с которыми вводят совместную композицию. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences E.W. Martin. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество соединения, обычно в очищенном виде или в частично очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя с тем, чтобы обеспечить форму для правильного введения пациенту. Такие фармацевтические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода и масла, включая масла из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло и кунжутное масло. Вода является типичным носителем в случае, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов также могут быть использованы солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина.

Например, фармацевтически приемлемые носители, используемые в парентеральных композициях, включают водные носители, неводные носители, противомикробные агенты, изотонические агенты, буферы, антиоксиданты, местные анестетики, суспендирующие и диспергирующие агенты, эмульгирующие агенты, секвестрирующие или хелатирующие агенты и другие фармацевтически приемлемые вещества. Примеры водных носителей включают хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, изотонический раствор декстрозы для инъекций, стерильную воду для инъекций, декстрозу и лактатный раствор Рингера для инъекций. Неводные парентеральные носители включают жирные масла растительного происхождения, хлопковое масло, кукурузное масло, кунжутное масло и арахисовое масло. К парентеральным композициям, упакованным в многодозовые контейнеры, могут быть добавлены противомикробные средства в бактериостатических или фунгистатических концентрациях, которые включают фенолы или крезолы, производные ртути, бензиловый спирт, хлорбутанол, метиловый и пропиловый сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты, тимеросал, хлорид бензалкония и хлорид бензетония. Изотонические агенты включают хлорид натрия и глюкозу. Буферы включают фосфат и цитрат. Антиоксиданты включают бисульфат натрия. Местные анестетики включают гидрохлорид прокаина. Суспендирующие и диспергирующие агенты включают натрий карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и поливинилпирролидон. Эмульгаторы включают полисорбат 80 (Tween 80). Секвестрирующие или хелатирующие агенты для ионов металлов включают ЭДТА. Фармацевтические носители также включают этиловый спирт, полиэтиленгликоль и пропиленгликоль для водорастворимых носителей и гидроксид натрия, соляную кислоту, лимонную кислоту или молочную кислоту для регулирования pH.

Композиции могут содержать вместе с активным ингредиентом разбавитель, такой как лактоза, сахароза, дикальцийфосфат или карбоксиметилцеллюлоза; смазывающее вещество, такое как стеарат магния, стеарат кальция и тальк, и связующее вещество, такое как крахмал, природные камеди, такие как аравийская камедь, желатин, глюкоза, меласса, поливинилпирролидон, целлюлоза и их производные, повидон, кросповидоны и другие подобные связующие вещества, известные специалистам в данной области.

Например, к совместной композиции может быть добавлен белок-наполнитель, и он может быть любым из множества фармацевтически приемлемых белков или пептидов. В общем, белок-наполнитель выбирают по его способности быть введенным млекопитающему, не вызывая иммунный ответ. Например, для применения в фармацевтических композициях хорошо подходит человеческий сывороточный

- 72 033472 альбумин. Другие известные фармацевтические наполнители для белков включают, но не ограничиваются ими, крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рисовую муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду и этанол. Наполнитель включен в композицию в концентрации, достаточной, чтобы предотвратить адсорбцию белка в емкости или флаконе. Концентрация наполнителя будет варьировать в зависимости от природы наполнителя и концентрации белка в совместной композиции. Композиция, при желании, может также содержать небольшие количества смачивающих или эмульгирующих агентов или pH буферных агентов, например, ацетат, цитрат натрия, производные циклодекстрина, сорбитанмонолаурат, триэтаноламин ацетат натрия, триэтаноламин олеат и другие подобные агенты.

2. Примеры стабильных совместных композиций.

а). Примеры совместных композиций для многократного введения инъекцией (MDI).

В настоящем документе предусмотрены стабильные совместные композиции быстродействующего инсулина, такого как аналог инсулина быстрого действия (быстродействующий), и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), являющиеся стабильными в течение по меньшей мере 6 месяцев при температуре от или примерно от 2°С до или примерно до 8°С и по меньшей мере в течение 14 дней (т.е. 2 недель) при температуре от или примерно от 20°С до или примерно до 30°С. Примерами совместных композиций MDI являются композиции, которые стабильны в течение по меньшей мере или примерно 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60 или больше месяцев при температуре от или примерно от 2°С до или примерно до 8°С и по меньшей мере или примерно 14, 15, 20, 25, 28, 30, 35, 40, 45 или 50 или больше дней при температуре от или примерно от 20°С до или примерно до 30°С.

Например, предусмотренные в настоящем документе композиции стабильны при температуре или примерно при температуре 2-8°С в течение по меньшей мере одного года, например по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 месяцев или больше. В частности, предусмотренные в настоящем документе композиции стабильны при температуре или примерно при температуре 2-8°С в течение по меньшей мере 24 месяцев.

В других примерах предусмотренные в настоящем документе композиции стабильны в течение по меньшей мере одной недели при температуре или примерно при температуре 20-30°С, например, композиции стабильны в течение по меньшей мере одной недели при температуре или примерно при температуре 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30°С. Например, предусмотренные в настоящем документе композиции стабильны при температуре или примерно при температуре 20-30°С в течение, по меньшей мере, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней, 14 дней, 15 дней, 16 дней, 17 дней, 18 дней, 19 дней, 20 дней, 21 дня, 22 дней, 23 дней, 24 дней, 25 дней, 26 дней, 27 дней, 28 дней, 29 дней, одного месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев или больше. В частности, предусмотренные в настоящем документе композиции стабильны при температуре или примерно при температуре 20-30°С, например, при температуре или примерно при температуре 25°С или 30°С в течение, по меньшей мере, одного месяца.

В некоторых примерах предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат от 100 до 1000 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и, в частности, примерно или по меньшей мере 600 ед./мл; от 10 до 1000 ед./мл быстродействующего инсулина и, в частности, по меньшей мере или примерно 100 ед./мл; NaCl в концентрации между или примерно между 50 и 200 мМ; имеют pH в диапазоне между или примерно между 6,8 и 7,8, например между или примерно между 7,0 и 7,6; содержат буферный агент, который поддерживает pH в диапазоне между или примерно между 6,8 и 7,8 или 7,0 и 7,6; эффективное против микроорганизмов количество консерванта или смеси консервантов в количестве от 0,1 до 0,4% консерванта, выраженном в концентрции по массе (мас./об.); и стабилизирующий агент в количестве, при котором в течение хранения (температура и время) сохраняется по меньшей мере 50% от начальной активности деградирующего гиалуронан фермента, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 375 ед./мл активности деградирующего гиалуронан фермента. Что касается буферного агента, может использоваться любой буферный агент, который может быть включен в достаточном количестве для поддержания pH совместной композиции в диапазоне между или примерно между 6,8 и 7,8, например между или примерно между 7,0 и 7,6. Как правило, в предусмотренные в настоящем документе совместные композиции включен Трис в концентрации, составляющей или примерно составляющей от 10 до 50 мМ, например 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мМ. В конкретных примерах совместные композиции содержат или содержат примерно между 20 и 30 мМ Трис, например 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 мМ Трис. В конкретных примерах предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат Трис в концентрации, равной или примерно равной 30 мМ.

Например, примеры таких композиций содержат от 100 до 1000 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и, в частности, примерно или по меньшей мере 600 ед./мл; от 10 до 1000 ед./мл быстродействующего инсулина и, в частности, по меньшей мере или примерно 100 ед./мл; NaCl в концентрации между или примерно между 80-140 мМ; pH в диапазоне между или примерно между 7,0 и 7,6; буферный агент, который поддерживает pH в диа

- 73 033472 пазоне между или примерно между 7,0 и 7,6; от 0,1 до 0,4% консерванта, где количество выражено в концентрации по массе (масса/объем); и стабилизирующий агент в количестве, при котором в течение хранения (температура и время) сохраняется по меньшей мере 50% от начальной активности деградирющего гиалуронан фермента, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 375 ед./мл активности деградирующего гиалуронан фермента. Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат от 1 до 100 мМ буферного агента (например, Трис). Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат от 0,01 до 0,5% поверхностноактивного вещества. Примеры предусмотренных в настоящем документе совместных композиций также содержат меньше 60 мМ глицерина (глицерола) и от 5 мМ до или примерно до 50 мМ антиоксиданта.

Следующие стабильные композиции являются только примерами и создают основу, в которую могут быть внесены незначительные изменения. Понятно, что очень небольшие изменения в концентрации различных вспомогательных веществ и других компонентов (например, ± 15% от указанных концентраций) или небольшие изменения в pH могут быть внесены в композиции при сохранении некоторой, если не всей стабильности деградирующего гиалуронан фермента. Дальнейшие изменения также могут быть внесены при добавлении или удалении вспомогательных веществ. Например, может быть изменен тип стабилизирующего поверхностно-активного вещества. Например, примеры совместных композиций содержат от 100 до 1000 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и, в частности, по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или примерно 600 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20); от 10 до 1000 ед./мл быстродействующего инсулина и, в частности, по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или примерно 100 ед./мл быстродействующего инсулина; от или примерно от 10 до или примерно до 50 мМ Трис (например, между или примерно между 20 и 40 мМ Трис, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 20, 25 30, 35 или 40 мМ); от или примерно от 80 мМ до или примерно до 140 мМ NaCl (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 или 160 мМ NaCl); от или примерно от 5 мМ до или примерно до 50 мМ метионина (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40 или 50 мМ метионина); от или примерно от 0 мМ до или примерно до 50 мМ глицерина (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40 или 50 мМ глицерина); от или примерно от 0,01% до или примерно до 0,5% полоксамера 188, например от 0,01 до 0,05% (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 или 0,05% полоксамера 188); от или примерно от 0,1 до или примерно до 0,25% фенола (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 0,1, 0,12, 0,125, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16 или 0,17% фенола); и от или примерно от 0,05% до или примерно до 0,2% м-крезола (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 0,075, 0,08, 0,09, 0,1, 0,12, 0,13, 0,14%, 0,15%, 0,16% или 0,17% м-крезола). Композиции готовят с pH от или примерно от 7,0 до или примерно до 7,6 (например, по меньшей мере, или примерно, по меньшей мере, с pH 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5 или 7,6). В следующих примерах цинк включен в концентрации, равной или примерно равной 0,017 мг/100 ед., 0,018, 0,02, 0,022, 0,024 инсулина.

Как обсуждалось выше, концентрации различных компонентов композий могут быть увеличены или уменьшены в зависимости от конкретных свойств инсулина. Например, композиции инсулинов с более высокой относительной растворимостью, таких как инсулин аспарт, как правило, содержат более высокие концентрации NaCl и более низкую концентрацию глицерина по сравнению с композициями инсулинов с более низкой относительной растворимостью, таких как инсулин лизпро. В зависимости от концентрации NaCl для разных инсулинов может варьировать конкретный pH композиции.

Например, в число предусмотренных в настоящем документе стабильных совместных композиций включены стабильные совместные композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), которые содержат NaCl в концентрации между или примерно между 50 и 120 мМ, например между или примерно между 50 и 100 мМ, например, между или примерно между 50 и 90 мМ или между или примерно между 80 и 100 мМ. Такие совместные композиции включают композиции, которые содержат аналог инсулина инсулин лизпро. В других примерах предусмотренные в настоящем документе стабильные совместные композиции представляют собой стабильные совместные композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), содержащие NaCl в концентрации между или примерно между 80 и 160 мМ, например между или примерно между 100 и 140 мМ, например 120 мМ. Такие совместные композиции включают те, которые содержат инсулин аспарт. Например, в настоящем документе предусмотрены совместные композиции rHuPH20 и инсулина аспарт или инсулина лизпро, которые содержат или содержат примерно 80 или 100 мМ NaCl.

В другом примере в число предусмотренных в настоящем документе стабильных совместных композиций включены стабильные совместные композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), которые содержат между или примерно между 80 и 200 мМ, например между или примерно между 100 и 150 мМ, например между или примерно между 130 и 150, 120 и 140 или 110 мМ и 130 мМ. Такие совместные композиции включают композиции, которые содержат аналог инсулина глулизин. В некоторых примерах в совместных компо- 74 033472 зициях, содержащих, например, инсулин глулизин, концентрация соли (NaCl) составляет или составляет примерно 80, 90, 100, 110, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136,

137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 мМ. Например, в настоящем документе предусмотрены совместные композиции rHuPH20 и инсулина глулизина, которые содержат или содержат примерно 120 или 140 мМ NaCl.

В примерах совместных композиций в настоящем документе предусмотрены совместные композиции инсулина, такого как инсулина аспарт, и rHuPH20, которые имеют pH, равный или равный примерно 7,2, например 7,2±0,2. В других примерах совместные композиции инсулина, такого как инсулин лизпро, и rHuPH20 имеют pH, равный или равный примерно 7,4, например 7,4±0,2. В следующих примерах совместные композиции инсулина, такого как инсулин глулизин, и rHuPH20 имеют pH, равный или равный примерно 7,3 или 7,4, например 7,3±0,2 или 7,4±0,2.

Примерами предусмотренных в настоящем документе совместных композиций, содержащих деградирующий гиалуронан фермент, такой как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и инсулин лизпро, являются те, которые содержат от или примерно от 25 мМ до или примерно до 35 мМ Трис (например, 30 мМ или примерно30 мМ); от или примерно от 70 мМ до или примерно до 100 мМ NaCl (например, 80 мМ или 100 мМ NaCl или примерно80 мМ или 100 мМ NaCl); от или примерно от 10 мМ до или примерно до 30 мМ метионина (например, 10 мМ или 20 мМ метионина или примерно 10 мМ или 20 мМ метионина); от или примерно от 40 мМ до или примерно до 60 мМ глицерина (например, 50 мМ или примерно50 мМ глицерина); от или примерно от 0,005% до или примерно до 0,05% полоксамера 188 (например, 0,01% или примерно 0,01% полоксамера 188); от или примерно от 0,017 мг цинка/100 ед. инсулина до или примерно до 0,024 мг цинка/100 ед. инсулина (например, 0,017 мг цинка/100 ед. инсулина, 0,018 мг/100 ед., 0,02 мг/100 ед., 0,022 мг/100 ед. или 0,024 мг цинка/100 ед. инсулина); от или примерно от 0,08% до или примерно до 0,17% фенола (например, 0,1, 0,125 или 0,13% фенола); и от или примерно от 0,07% до или примерно до 0,17% м-крезола (например, 0,075, 0,08, 0,13 или 0,15% м-крезола). Например, совместные композиции могут содержать точно или примерно 0,1% фенола и 0,015% м-крезола; точно или примерно 0,125% фенола и 0,075% м-крезола; точно или примерно 0,13% фенола и 0,075% мкрезола; точно или примерно 0,13% фенола и 0,08% м-крезола; или точно или примерно 0,17% фенола и 0,13% м-крезола. Такие композиции инсулина лизпро и деградирующего гиалуронан фермента, такого как растворимая гиалуронидаза (например, rHuPH20), готовят с pH от или примерно от 7,0 до или примерно до 7,5 (как правило, с pH, равным или равным примерно pH 7,2).

Примерами предусмотренных в настоящем документе совместных композиций, содержащих деградирующий гиалуронан фермент, такой как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и инсулин аспарт, являются композиции, которые содержат от или примерно от 25 мМ до или примерно до 35 мМ Трис (например, 30 мМ или примерно30 мМ); от или примерно от 70 мМ до или примерно до 100 мМ NaCl (например, 80 мМ или 100 мМ или примерно 80 мМ или 100 мМ NaCl); от или примерно от 10 мМ до или примерно до 30 мМ метионина (например, 10 мМ или 20 мМ или примерно 10 мМ или 20 мМ метионина); от или примерно от 40 мМ до или примерно до 60 мМ глицерина (например, 50 мМ или примерно 50 мМ глицерина); от или примерно от 0,005% до или примерно до 0,05% полоксамера 188 (например, 0,01% или примерно 0,01% полоксамера 188); от или примерно от 0,017 мг цинка/100 ед. инсулина до или примерно до 0,024 мг цинка/100 ед. инсулина (например, 0,017 мг цинка/100 ед. инсулина, 0,018 мг/100 ед., 0,02 мг/100 ед., 0,022 мг/100 ед. или 0,024 мг цинка/100 ед. инсулина); от или примерно от 0,08% до или примерно до 0,17% фенола (например, 0,1, 0,125 или 0,13% фенола); и от или примерно от 0,07% до или примерно до 0,17% м-крезола (например, 0,075, 0,08, 0,13 или 0,15% м-крезола). Например, совместные композиции могут содержать точно или примерно 0,1% фенола и 0,015% м-крезола; точно или примерно 0,125% фенола и 0,075% м-крезола; точно или примерно 0,13% фенола и 0,075% мкрезола; точно или примерно 0,13% фенола и 0,08% м-крезола; или точно или примерно 0,17% фенола и 0,13% м-крезола. Такие композиции инсулина аспарт и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), готовят с pH от или примерно от 7,0 до или примерно до 7,6 (как правило, с pH, равным или равным примерно 7,4).

Примерами предусмотренных в настоящем документе совместных композиций, содержащих деградирующий гиалуронан фермент, такой как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и инсулин глулизин, являются те, которые содержат от или примерно от 25 мМ до или примерно до 35 мМ Трис (например, 30 мМ или примерно30 мМ); от или примерно от 100 мМ до или примерно до 150 мМ NaCl (например, 100 мМ или 140 мМ или примерно 100 мМ или 140 мМ NaCl); от или примерно от 10 мМ до или примерно до 30 мМ метионина (например, 10 мМ или 20 мМ или примерно 10 мМ или 20 мМ метионина); от или примерно от 40 мМ до или примерно до 60 мМ глицерина (например, 50 мМ или примерно 50 мМ глицерина); от или примерно от 0,005% до или примерно до 0,05% полоксамера 188 (например, 0,01% или примерно 0,01% полоксамера 188); от или примерно от 0,08% до или примерно до 0,17% фенола (например, 0,1, 0,125 или 0,13% фенола); и от или примерно от 0,07% до или примерно до 0,17% м-крезола (например, 0,075, 0,08, 0,13 или 0,15% м-крезола). Например, совместные композиции могут содержать точно или примерно 0,1% фенола и 0,015% м-крезола; точно или примерно 0,125% фе- 75 033472 нола и 0,075% м-крезола; точно или примерно 0,13% фенола и 0,075% м-крезола; точно или примерно

0,13% фенола и 0,08% м-крезола; или точно или примерно 0,17% фенола и 0,13% м-крезола. Такие композиции инсулина глулизин и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза (например, rHuPH20), готовят с pH от или примерно от 7,0 до или примерно до 7,6 (как правило, с pH, равным или равным примерно 7,4).

b). Примеры совместных композиций для непрерывной подкожной инфузии инсулина (CSII).

В настоящем документе предусмотрены стабильные совместные композиции, являющиеся стабильными в ускоренных или стрессовых условиях (условиях ускоренной деградации), таких как повышенные температуры, выше или примерно выше 32°С, например от 35 до 40°С, в частности выше или примерно 37 или 40°С и/или при перемешивании, в течение по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 12 ч, 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, по меньшей мере 5 дней, по меньшей мере 6 дней или по меньшей мере 7 дней и обычно по меньшей мере 3 ч или по меньшей мере 3 дней. Эти стабильные совместные композиции подходят для непрерывной подкожной инфузии инсулина (CSII).

Как обсуждалось выше, концентрация, количество или уровень компонентов, которые придают стабильность совместной композиции в настоящем документе в течение по меньшей мере 6 месяцев при температурах от или примерно от 2°С до или примерно до 8°С и по меньшей мере 14 дней (т.е. 2 недели) при температуре от или примерно от 20°С до или примерно до 30°С, обычно не являются достаточными для придания стабильности совместной композиции в стрессовых условиях, таких как повышенная температура. Обычно такие совместные композиции стабильны в стрессовых условиях (например, повышенная температура) в течение меньше 24 ч и обычно меньше 8 ч, что может существенно ограничить их применение для многодозового введения, при котором существуют такие условия. Например, терапия CSII связана с непрерывной инфузией композиций посредством помпы или другого устройства, которое находится снаружи и рядом с телом 24 ч в день в течение от 2 до 3 дней. Композицию или совместную композицию вводят с помощью иглы в стенку брюшной полости или в бедро, при этом введение можно контролировать посредством запрограммированной помпы таким образом, что композиция или совместная композиция инсулина вводится непрерывно. Поэтому совместные композиции, использующиеся для терапии CSII, подвергаются воздействию повышенной температуры тела, равной по меньшей мере или примерно 37°С или выше, и перемешиванию.

Например, деградирующий гиалуронан фермент в особенности нестабилен при повышенных температурах выше 32°С и обычно выше 37 или 40°С. Также в настоящем документе обнаружено, что несмотря на то, что инсулин кристаллизуется при температуре от 2 до 8°С и высоких концентрациях соли и низком pH, он не кристаллизуется при высоких концентрациях соли и низком pH при высоких температурах от 32 до 40°С. Соответственно, противоположные требования высокой концентрации соли и низкого pH, необходимые для деградирующих гиалуронан ферментов (например, PH20) для сохранения их стабильности при высоких температурах от 32 до 40°С, лучше совместимы при высоких температурах в течение по меньшей мере короткого периода времени, по меньшей мере 3 дней. Также те же самые высокая концентрация соли и низкий pH придают аналогичную стабильность композициям с разными аналогами инсулинов, несмотря на различия в относительной растворимости, влияющей на стабильность инсулина при более низких температурах.

Стабильные совместные композиции, которые являются стабильными в стрессовых условиях, например, имеющих место при CSII терапии, обычно содержат те же самые компоненты, что и другие совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе. Такие совместные композиции, тем не менее, отличаются тем, что совместные композиции, стабильные в стрессовых условиях, обычно содержат высокую концентрацию соли, низкий pH и/или в них присутствуют один или несколько других вспомогательных веществ, которые достаточно стабилизируют деградирующий гиалуронан фермент и/или инсулин, обычно в течение по меньшей мере 2-3 дней при повышенных температурах, выше или примерно выше 32°С, например от 35 до 40°С, в частности выше или примерно 37 или 40°С, и/или при перемешивании. Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции, стабильные в стрессовых условиях повышенных температур или перемешиания, обычно содержат ингибитор гиалуронидазы, такой как субстрат гиалуронидазы (например, гиалуронан) в качестве вспомогательного вещества.

В одном из примеров предусмотренные в настоящем документе совместные композиции, стабильные в стрессовых условиях при повышенных температурах или перемешивании, содержат более высокую концентрацию соли и более низкий pH по сравнению с совместными композициями, предусмотренными в настоящем документе выше в разделе E.1.a. Например, в настоящем документе предусмотрены совместные композиции, стабильные в стрессовых условиях (например, повышенная температура от 32 до 40°С или перемешивание) в течение по меньшей мере 3 дней или по меньшей мере 3 ч, которые содержат от 120 мМ NaCl до 200 мМ NaCl и имеют pH от 6,5 до 7,5. Как обсуждалось выше, тем не менее, растворимость инсулина, в особенности при охлаждении, уменьшается в условиях такого пониженного pH и повышенной концентрации соли. Таким образом, такие композиции, как правило, перед применением не хранят при охлаждении или при температурах окружающей среды.

В другом примере предусмотренные в настоящем документе совместные композиции, стабильные в

- 76 033472 стрессовых условиях повышенной температуры (например, от 32 до 40°С) в течение по меньшей мере 3 дней, или при перемешивании в течение по меньшей мере 3 ч, для стабилизации деградирующего гиалуронан фермента в совместной композиции содержат ингибитор гиалуронидазы. Любой из описанных выше ингибиторов гиалуронидазы может быть использован в настоящем документе в совместной композиции, стабильной в стрессовых условиях повышенных температур (например, от 32 до 40°С) в течение по меньшей мере 3 дней или при перемешивании в течение по меньшей мере 3 ч. В конкретных примерах ингибитор гиалуронидазы представляет собой субстрат гиалуронидазы, например гиалуронан.

Как показано в примерах с ингибитором гиалуронидазы гиалуронаном, присутствие ингибитора гиалуронидазы стабилизирует активность PH20, в особенности в присутствии консервантов, особенно при повышенных температурах, например, в стрессовых условиях температур от 32 до 40°С. Поскольку олигомеры HA представляют собой субстрат/продукт ферментативной реакции деградирующего гиалуронан фермента с гиалуронаном, олигомеры гиалуронана могут связываться с активным сайтом фермента и производить стабилизирующий эффект. Тем не менее, также обнаружено, что с течением времени в стрессовых условиях повышенных температур от 32 до 40°С, например больше 1 недели или 2 недель при 37°С, присутствие ингибитора гиалуронидазы, такого как HA, в совместной композиции может приводить к деградации инсулина, и тем самым образованию ковалентно связанных продуктов присоединения НА-аналог инсулина. Например, было показано с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC), что присутствие высоких концентраций HA в предусмотренной в настоящем документе совместной композиции вызывает деградацию инсулина Aspart® (Аспарт) спустя 1 неделю при 37°С и инсулина Glulisine® (глулизин) спустя 2 недели при 30°С. Анализ жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией (LC-MS) показал, что некоторые продукты деградации представляют собой ковалентно связанные продукты присоединения НА-аналог инсулина, образованные в реакции инсулина с восстанавливающим концом НА. Например, было определено, что один из пиков представляет собой продукт инсулина Aspart® и HA из 7 остатков сахара, тогда как другой пик представлял собой продукт инсулина Aspart® и HA из 2 остатков сахара.

Присутствие ингибитора гиалуронидазы, такого как HA, также может оказывать воздействие на преципитацию и изменение цвета совместной композиции. Таким образом, наряду с тем, что HA улучшает стабильность деградирующего гиалуронан фермента в стрессовых условиях повышенных температур от 32 до 40°С, он также может оказывать воздействие на деградацию инсулина, преципитацию и изменение цвета совместной композиции. В пределах компетенции специалиста в данной области находится проведение мониторинга этих условий в рамках желаемых параметров безопасности, фармакологических параметров и руководящих принципов. Обычно предусмотренные в настоящем документе стабильные совместные композиции, содержащие ингибитор гиалуронидазы, такой как HA, стабильны при повышенных температурах, например, в стрессовых условиях при температурах от 32 до 40°С в течение по меньшей мере 3 ч, но не более 7 дней из-за воздействия этих параметров.

В некоторых предусмотренных в настоящем документе примерах используется ингибитор гиалуронидазы, который не способен образовывать ковалентные комплексы с инсулином или деградирующим гиалуронан ферментами. Таким образом, в настоящем документе рассматриваются нековалентные ингибиторы, которые действуют через ассоциативное связывание. Например, в настоящем документе предусмотрены совместные композиции, содержащие HA с прореагировавшим восстанавливающим концом, так что он больше не может образовывать гликированные продукты присоединения с инсулином. Например, в некоторых примерах HA, использованный в предусмотренных в настоящем документе совместных композициях, был модифицирован путем восстановительного аминирования. Востановительное аминирование включает образование Шиффова основания между альдегидом и амином, которое далее восстанавливается с образованием более стабильного амина. Восстанавливающий конец сахара, т.е. HA, существует в виде равновесной смеси циклической формы полуацеталя и альдегидной формы с открытой цепью. При соответствующих условиях, известных специалисту в данной области техники, аминогруппа будет конденсироваться с альдегидом сахара с образованием иона имина, который может быть восстановлен до амина восстановителем, таким как цианоборгидрид натрия (см., например, Gildersleeve et al., (2008) Bioconjug Chem 19(7): 1485-1490). Полученный HA инертен по отношению к инсулину и не способен образовывать гликированные продукты присоединения с инсулином.

В частности, в настоящем документе предусмотрена стабильная совместная композиция, являющаяся стабильной в течение по меньшей мере 3 дней при температуре или примерно при температуре от 32 до 40°С и/или в течение по меньшей мере 3 ч при перемешивании, содержащая от 100 до 1000 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и, в частности, примерно, или по меньшей мере, или 600 ед./мл; от 10 до 1000 ед./мл быстродействующего инсулина, и, в частности, по меньшей мере, или примерно 100 ед/мл быстродействующего инсулина; NaCl в концентрации между или примерно между 120 и 200 мМ; pH в диапазоне между или примерно между 6,5 и 7,5; эффективное против микроорганизмов количество консерванта или смеси консервантов; и один или несколько дополнительных стабилизирующих агентов, таких как ингибитор гиалуронидазы, такой, который сохраняет по меньшей мере 50% начальной активности деградирующего гиалуронан

- 77 033472 фермента, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере сохраняется 375 ед./мл активности деградирующего гиалуронан фермента. Например, совместные композиции могут содержать HA в концентрации между или примерно между 1 и 20 мг/мл. Стабильные совместные композиции также могут содержать буферный агент для поддержания pH в диапазоне примерно pH 6,5 (например, Трис) в количестве, составляющем или составляющем примерно от 1 до 100 мМ; эффективное против микроорганизмов количество консерванта или смеси консервантов, например фенольного консерванта (например, фенол и/или м-крезол) в общем количестве, выраженном в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) в композиции, составляющем или составляющем примерно от 0,1 до 0,4%; поверхностноактивное вещество (например, полоксамер 188) в количестве, выраженном в% массовой концентрации (мас./об.), между или примерно между 0,005 и 1,0%; и необязательно дополнительный стабилизирующий агент.

Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции, стабильные в стрессовых условиях (например, повышенная температура от 32 до 40°С или перемешивание) в течение по меньшей мере 3 дней или 3 ч содержат от 120 до 200 мМ, например от 150 мМ NaCl до 200 мМ NaCl или от 160 мМ NaCl до 180 мМ NaCl, например 120 мМ или примерно 130, 140, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200 мМ NaCl. Также, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции, стабильные в стрессовых условиях (например, повышенная температура от 32 до 40°С или перемешивание) в течение по меньшей мере 3 дней или 3 ч, имеют pH от 6,5 до 7,5 или от 6,5 до 7,2, например pH равный или примерно равный 6,5±0,2, 6,6±0,2, 6,7±0,2, 6,8±0,2, 6,9±0,2, 7,0±0,2, 7,1±0,2, 7,2±0,2, 7,3±0,2, 7,4±0,2 или 7,5±0,2.

В примерах в настоящем документе предусмотренные в настоящем документе совместные композиции, стабильные в стрессовых условиях повышенных температур (например, от 32 до 40°С) или перемешивания в течение по меньшей мере 3 дней или 3 ч, содержат гиалуронан (гиалуроновую кислоту; НА), имеющий молекулярный вес от 5 до 5,000 кДа, от 5 до или примерно до 1,000 кДа, от 5 до или примерно до 200 кДа или от 5 до или примерно до 50 кДа. В частности, молекулярный вес HA меньше 10 кДа. HA может представлять собой олигосахарид, состоящий из дисахаридов, например 2-мер - 30-мер (от 2 до 30 остатков) или 4-мер - 16-мер. Совместные композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), содержат HA в концентрации между или примерно между 1 и 20 мг/мл, например по меньшей мере или примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мг/мл или больше НА. Примеры стабильных совместных композиций включают от или примерно от 8 мг/мл до или примерно до 12 мг/мл HA, например 10 мг/мл или примерно 10 мг/мл. В некоторых примерах молярное отношение HA к деградирующему гиалуронан ферменту составляет или составляет примерно 100,000:1, 95,000:1, 90,000:1, 85,000:1, 80,000:1, 75,000:1, 70,000:1, 65,000:1, 60,000:1, 55,000:1, 50,000:1, 45,000:1, 40,000:1, 35,000:1, 30,000:1, 25,000:1, 20,000:1, 15,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 1,000:1, 900:1, 800:1, 700:1, 600:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1 или 100:1 или меньше.

Поскольку совместные композиции, стабильные при повышенных температурах (например, от 32 и 40°С) или перемешивании, такие, которые подходят для композиций для CSII, имеют уменьшенный pH и увеличенную концентрацию соли по сравнению с совместными композициями, приведенными выше в разделе E.1.a, они могут быть изготовлены или получены из них. Это можно достигнуть, например, путем разбавления совместной композиции, такой как любая из предусмотренных в разделе E.1.a подходящих для MDI композиций, стабилизирующим разбавителем, имеющим низкий pH и высокую концентрацию соли. Например, разбавитель может представлять собой высококонцентрированный раствор NaCl с буфером и более низким pH и консервантами. Например, разбавитель может содержать от 10 до 50 мМ Трис или другого аналогичного буфера; от 120 до 200 мМ NaCl; от 0,1 до 0,4% консерванта. Разбавитель можно приготовить с pH в диапазоне между или примерно между 6,5 и 7,8. Таким образом, предусмотренные в настоящем документе стабильные совместные композиции, стабильные от 2 до 8°С или от 20 до 30°С, могут быть получены и смешаны с разбавителем для получения совместной композиции, стабильной в стрессовых условиях повышенных температур (например, от 32 и 40°С) в течение по меньшей мере 3 дней или при перемешивании в течение по меньшей мере 3 ч.

Например, любая из вышеприведенных в разделе E.1. совместных композиций для MDI может быть разбавлена стабилизирующим разбавителем, что приводит к получению композиции для CSII с более низкой концентрацией инсулина, pH в диапазоне от или примерно от 6,8 до или примерно до 7,0 (например, примерно 6,8, 6,9 или 7,0) и NaCl в концентрации от или примерно от 150 мМ до или примерно до 200 мМ.

В других примерах стабильная совместная композиция для MDI может быть предусмотрена в виде модифицированной высококонцентрированной композиции для MDI, содержащей более высокие концентрации инсулина и более высокие концентрации PH20 и более низкие концентрации NaCl (между или примерно между 80 и 150 мМ) и более низкую буферную емкость для обеспечения приемлемой тоничности и более низкого pH после смешивания со стабилизирующим вспомогательным разбавителем. Например, может быть предусмотрена более высокая концентрация инсулина, например от 120 до 500 единиц,

- 78 033472 например 150, 200 или 500 единиц (ед.) и может быть более высокая концентрация PH20 от 6 до 25 мкг/мл, например от 6 до 25, 6, 7,5, 10 или 25 мкг/мл. Путем разбавления модифицированной высококонцентрированной композиции для MDI стабилизирующим разбавителем можно получить композицию для

CSII с более низким pH (например, от 6,5 до 7,2) и увеличенным содержанием NaCl (от 140 до 200 мМ) по сравнению с любой совместной композицией для MDI, предусмотренной в разделе E.1.a выше.

В другом примере любую из композиций для MDI, предусмотренных в настоящем документе в разделе E.1.a, можно получить и хранить в лиофилизированной форме. Непосредственно перед применением в стрессовых условиях лиофилизированный продукт можно разбавить стабилизирующим разбавителем, имеющим более низкий pH (например, от 6,5 до 7,8) и содержащим увеличенное количество NaCl (от 120 мМ и 200 мМ), что приведет к образованию композиции для CSII с более низким pH (например, от 6,5 до 7,8) и увеличенным содержанием NaCl (от 120 мМ и 200 мМ) по сравнению с совместными композициями для MDI, предусмотренными в разделе E.1.a выше.

Как показано в примерах в настоящем документе, тем не менее, гиалуронан не подходит для применения в композициях, хранящихся при 2-8°С, поскольку он вызывает агрегацию инсулина при более низких температурах. Таким образом, в примерах выше, в тех случаях, где стабильные композиции для CSII получают путем разбавления композиции для MDI, и совместные композиции для MDI или модифицированные концентрированные совместные композиции MDI не содержат ингибитор гиалуронидазы, ингибитор гиалуронидазы может быть включен в стабилизирующий разбавитель, чтобы получить соответствующую концентрацию ингибитора гиалуронидазы для поддержания стабильности совместной композиции в стрессовых условиях повышенных температур (например, от 32 и 40°С) в течение по меньшей мере 3 дней или в стрессовых условиях перемешивания в течение по меньшей мере 3 ч.

с). Примеры совместных композиций с Lys-Lys.

В настоящем документе предусмотрены стабильные совместные композиции, содержащие терапевтически эффективое количество деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и терапевтически эффективое количество быстродействующего инсулина, такого как аналог инсулина быстрого действия (быстродействующий), и количество Lys-Lys для стабилизации совместной композиции. Как правило, совместные композиции являются многодозовыми композициями и также содержат эффективное против микроорганизмов количество одного или нескольких консервантов. Совместные композиции также могут содержать один или несколько других стабилизаторов или вспомогательных веществ. Такие совместные композиции стабильны в течение по меньшей мере 6 месяцев при температуре от или примерно от 2°С до или примерно до 8°С и по меньшей мере 14 дней (т.е. 2 недели) при температуре от или примерно от 20°С до или примерно до 30°С. В частности, такие совместные композиции стабильны при условиях ускоренной деградации, таких как повышенные температуры выше или примерно выше 32°С, например от 35 до 40°С, в частности, выше или примерно 37 или 40°С и/или в условиях перемешивания, в течение по меньшей мере 3 ч и обычно по меньшей мере 3 дней. Такие совместные композиции можно использовать для многократного введения (MDI) или для способов непрерывной подкожной инфузии инсулина (CSII).

Примеры стабильных композиций, содержащих Lys-Lys, описаны ниже. Следующие стабильные композиции являются только примерами и создают основу, в которую могут быть внесены незначительные изменения. Понятно, что очень небольшие изменения в концентрации различных вспомогательных веществ и других компонентов (например, ±15% от указанных концентраций) или небольшие изменения в pH могут быть внесены при сохранении некоторой, если не всей растворимости инсулина и стабильности деградирующего гиалуронан фермента. Дальнейшие изменения также могут быть внесены при добавлении или удалении вспомогательных веществ.

Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат от 100 до 1000 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и, в частности, примерно или по меньшей мере или 600 ед./мл; от 10 до 1000 ед./мл быстродействующего инсулина и, в частности, по меньшей мере или примерно 100 ед./мл быстродействующего инсулина; совместные композиции дополнительно содержат Lys-Lys в концентрации между или примерно между 50 и 120 мМ, например от 50 до 80 мМ, от 80 мМ и 100 мМ или от 100 мМ и 120 мМ, имеют pH между или примерно между 6,5 и 8,0, например 6,5 и 7,8 или 6,8 и 7,8, например, между или примерно между 6,5 и 7,5, 6,8 и 7,4 или 7,0 и 7,6, буферный агент, который поддерживает диапазон pH, эффективное против микроорганизмов количество консерванта или смеси консервантов и стабилизирующий агент в таком количестве, которое в течение хранения (температура и время) сохраняет по меньшей мере 50% активности деградирующего гиалуронан фермента и сохраняет 90% чистоты, обнаружения и/или удельной активности инсулина. Например, предусмотренные в настоящем документе совместные композиции содержат от 0,0005 до 1,0% (например, от 0,0005 до 0,005%) поверхностно-активного вещества в качестве стабилизирующего агента. Совместные композиции могут необязательно содержать дополнительные стабилизирующие агенты, модификаторы тоничности, антиоксидантный агент и/или другие вспомогательные вещества. Например, совместные композиции содержат NaCl в концентрации меньше 140 мМ, например, между или примерно между 0 и 100 мМ, например, между или примерно между 0 и 50 мМ, 10 и 40 мМ или 20 и 30 мМ.

- 79 033472

В одном из примеров композиция содержит от 100 до 1000 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и, в частности, по меньшей мере или примерно по меньшей мере или примерно 600 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20); от 10 до 1000 ед./мл инсулина глулизина и, в частности, по меньшей мере или примерно 100 ед./мл; от или примерно от 50 мМ до или примерно до 105 мМ Lys-Lys (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мМ); от 0 мМ до или примерно до 50 мМ метионина (например, между или примерно между 5 и 20 мМ, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40 или 50 мМ метионина); и от или примерно от 0,0005% до или примерно до 0,005% полисорбата 20, например от 0,001 до 0,005% (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 0,0005, 0,0001, 0,005 или 0,001% полисорбата 20); и консервант (консерванты), включающие фенол в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,01 и 0,25% и м-крезол в % мас./об. между или примерно между 0,05 и 0,2%. Композиции готовят с pH между или примерно между 6,8 и 7,4, (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере с pH 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 или 7,4). В следующих примерах включен NaCl в концентрации меньше 140 мМ. Например, NaCl включен в концентрации меньше 100 мМ, например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере от 0 до 100 мМ, например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90 мМ.

В другом примере композиция содержит от 100 до 1000 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20), и, в частности, по меньшей мере, или примерно по меньшей мере, или примерно 600 ед./мл деградирующего гиалуронан фермента, такого как гиалуронидаза, например PH20 (например, rHuPH20); от 10 до 1000 ед./мл инсулина лизпро или аспарт и, в частности, по меньшей мере или примерно 100 ед./мл; от или примерно от 80 мМ до или примерно до 100 мМ Lys-Lys (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 80, 85, 90, 95 или 100 мМ); от 0 мМ до или примерно до 50 мМ метионина (например, между или примерно между 5 и 20 мМ, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40 или 50 мМ метионина); от или примерно от 0,0005% до или примерно до 0,005% полисорбата 20, например, от 0,001 до 0,005% (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере 0,0005, 0,0001, 0,005 или 0,001% полисорбата 20); и консервант (консерванты), включающие фенол в процентном содержании массовой концентрации (мас./об.) между или примерно между 0,01 и 0,25% и м-крезол в % мас./об. между или примерно между 0,05 и 0,2%. Композиции готовят с pH между или примерно между 6,8 и 7,4 (например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере с pH 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 или 7,4). В следующих примерах включен NaCl в концентрации меньше 140 мМ. Например, NaCl включен в концентрации меньше 100 мМ, например, по меньшей мере или примерно по меньшей мере от 0 и 100 мМ, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90 мМ.

G. Дозировки и введение.

Предусмотренные в настоящем документе композиции, являющиеся стабильными композициями деградирующего гиалуронан фермента, могут быть составлены в виде фармацевтических композиций для однократного (одной дозой) или многократного введения (множеством доз). Совместные композиции деградирующего гиалуронан фермента и быстродействующего инсулина составлены в виде фармацевтических композиций для многократного введения. Композиции и совместные композиции могут быть составлены для введения любым подходящим способом, например, для парентерального введения, в том числе для подкожного, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутривенного и внутрикожного введения. Как правило, композиции или совместные композиции, предусмотренные в настоящем документе, вводят подкожно.

Терапевтически эффективные дозировки можно определить опытным путем, тестируя композиции или совместные композиции в известных системах in vitro и in vivo, и также они могут быть индивидуально подобраны для каждого субъекта с учетом таких факторов, как метаболизм, прием пищи и тяжесть заболевания. Концентрация деградирующего гиалуронан фермента и/или выбранного инсулина в композиции или совместной композиции зависит, например, от скоростей абсорбции, инактивации и выведения комплекса, физико-химических характеристик комплекса, схемы дозирования и вводимого количества, а также и от других факторов, известных специалистам в данной области техники. Например, в случае совместных композиций с инсулином понятно, что точная доза для лечения является функцией уровня глюкозы в крови у субъекта, и ее можно определить опытным путем с использованием известных алгоритмов или путем экстраполяции по данным тестирования in vivo или in vitro, предыдущего опыта субъекта, подсчета содержания углеводов в пищи и, соответственно, расчета прандиального повышения глюкозы в крови и последующей потребности в инсулине. Нужно отметить, что концентрации и размеры дозировок могут варьировать для каждого субъекта, подвергаемого лечению. Также следует понимать, что для любого конкретного субъекта с течением времени должен быть подобран специфичный режим дозирования в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональной оценкой лица, назначающего или наблюдающего за введением композиций, и что диапазон концентраций, приведенный в настоящем документе, является только примером и не ограничивает этот диапазон. Количество выбранного инсулина, которое должно быть введено для лечения диабетического состояния, можно определить

- 80 033472 по стандартным клиническим методикам. Кроме того, чтобы помочь идентифицировать оптимальные диапазоны дозировок, могут быть использованы in vitro анализы и модели на животных.

Таким образом, точная дозировка, которую можно определить опытным путем, может зависеть от конкретного деградирующего гиалуронан фермента и/или инсулина, содержащихся в композициях или совместных композициях, режима и схемы дозирования, способа введения, типа диабета, подвергающегося лечению, тяжести заболевания и субъекта, получающего лечение. Обычно, инсулин предусмотрен в количестве, которое обеспечивает гликемический контроль. Например, для достижения постпрандиального гликемического контроля, когда инсулин доставляется без деградирующего гиалуронан фермента, субъекту, как правило, вводят болюсную инъекцию от или примерно от 0,05 ед. быстродействующего инсулина на 1 кг веса тела (ед./кг) до 1,0 ед./кг за 30-5 мин перед приемом пищи. Понятно, что эта доза может быть увеличена или уменьшена при необходимости с учетом, например, метаболизма конкретного субъекта, содержания пищи и уровня глюкозы в крови. Кроме того, понятно, что время, в которое дооставляют инсулин для постпрандиального контроля, может быть изменено таким образом, чтобы инсулин поступал в момент приема пищи или после приема пищи.

Быстродействующий инсулин, как правило, вводят в дозах, составляющих от 0,05 до 0,25 ед./кг, например 0,10 ед./кг, хотя конкретные дозы варьируют. Благодаря улучшенным фармакокинетическим и фармакодинамическим свойствам инсулина в совместной композиции с деградирующими гиалуронан ферментами (такими как rHuPH20), предусмотренные совместные композиции можно вводить в более низких дозах по сравнению с быстродействующим инсулином, который вводят без деградирующего гиалуронан фермента. Степень, до которой может быть снижено количество быстродействующего инсулина путем введения его в виде совместной композиции с деградирующим гиалуронан ферментом, зависит, например, от типа диабета у пациента и типа инсулина, содержащегося в совместной композиции. Как правило, снижение количества быстродействующего инсулина, вводимого пациентам с диабетом 2 типа в виде совместной композиции с деградирующим гиалуронан ферментами, превышает снижение количества быстродействующего инсулина, вводимого пациентам с диабетом 1 типа в виде совместной композиции с деградирующим гиалуронан ферментом. Например, в случаях, когда для контроля постпрандиально уровня глюкозы пациенту с диабетом 1 типа и пациенту с диабетом 2 типа вводят 0,20 ед./кг быстродействующего инсулина, пациенту с диабетом 1 типа для достижения аналогичного или лучшего гликемического контроля можно ввести 0,15 ед./кг быстродействующего инсулина в совместной композиции с деградирующим гиалуронан ферментом, а пациенту с диабетом 2 типа для достижения аналогичного или лучшего гликемического контроля можно ввести 0,10 ед./кг быстродействующего инсулина в совместной композиции с деградирующим гиалуронан ферментом.

Примеры диапазонов дозировок для парентерального, например, для подкожного, введения инсулина с использованием предусмотренной в настоящем документе совместной композиции с деградирующим гиалуронан ферментом для контроля постпрандиального уровня глюкозы в крови составляют между или примерно между 0,05 и 0,50 ед./кг, например 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, 0,40, 0,50 или 1,0 ед./кг. Конкретная дозировка зависит от заболевания и индивидуума.

Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента также могут вводиться диабетическим субъектам для воздействия на гликемический контроль в течение дня и ночи, в добавление к постпрандиальному гликемическому контролю. Как правило, дозировки инсулина, вводимые для обеспечения непрерывного гликемического контроля, меньше чем требуемые для достижения постпрандиального кликемического контроля. Дозировки могут, тем не менее, быть увеличены или уменьшены с учетом уровня глюкозы в крови. Примеры диапазонов дозировок для парентерального, например, для подкожного, введения инсулина в виде совместной композиции с деградирующим гиалуронан ферментом для обеспечения непрерывного гликемического контроля, составляют между или примерно между 0,001 и 0,30 ед./кг, например 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, от 0,05 до 0,30 ед./кг, например 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, 0,40, 0,50 или 1,0 ед./кг. Конкретная дозировка зависит от заболевания, времени введения и индивидуума. Если необходимо, дозировку можно определить опытным путем.

Понятно, что точная дозировка и предолжительность лечения зависят от диабета, подвергаемого лечению, и могут быть определены опытным путем с использованием известных протоколов тестирования или путем экстраполяции по in vivo или in vitro данным. Нужно отметить, что размеры дозировок также могут варьировать в зависимости от тяжести диабета и других факторов, таких как метаболизм, прием пищи и вес тела субъекта для каждого субъекта, подвергаемого лечению. Также следует понимать, что для любого конкретного субъекта с течением времени должен быть подобран специфичный режим дозирования в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональной оценкой лица, назначающего или наблюдающего за введением композиций, и что диапазон концентраций, приведенный в настоящем документе, является только примером и не предназначен для ограничения объема или применения композиций и содержащих их комбинаций. Композиции можно вводить каждую минуту, каждые несколько минут, ежечасно, ежедневно, еженедельно, ежемесячно, ежегодно или единственный раз, в зависимости от субъекта и стадии диабета. Обычно режимы дозирования выбраны таким образом, чтобы

- 81 033472 ограничить токсичность и/или другие отрицательные эффекты, такие как избыток инсулина. Следует отметить, что в компетенции лечащего врача находится решение, как и когда прекратить, прервать или скорректировать терапию для снижения дозировки. С другой стороны, в компетенции лечащего врача находится решение, как и когда скорректировать лечение повышением уровня лекарства, если клиническая реакция не является адекватной (предотвращая токсичные побочные эффекты).

Способы введения

a) . Шприцы и флаконы.

Предусмотренные в настоящем документе композиции или совместные композиции могут быть введены субъекту парентерально одним или несколькими способами введения, включая, но не ограничиваясь этим, с помощью шприцов, флаконов или других контейнеров, подходящих для однодозовых или многодозовых композиций. Например, одноразовые шприцы, в том числе инсулиновые шприцы, могут быть использованы для введения дискретной инъекции, например, болюсной инъекции композиции. Шприцы, пригодные для введения предусмотренных в настоящем документе композиций, включают инсулиновые шприцы, которые могут быть предназначены для хранения препаратов инсулина со стандартными концентрациями, в том числе концентрациями препаратов инсулина, равными 100 ед./мл, и которые имеют маркировку в единицах инсулина для упрощения введения.

b) . Инсулиновая шприц-ручка.

Инсулиновая шприц-ручка представляет собой систему доставки, которую можно использовать для введения предусмотренных в настоящем документе совместных композиций. Инсулиновые шприц-ручки включают шприц-ручки, которые имеют сменные картриджы, наполненные композицией для введения и шприц-ручки, которые не имеют сменных картриджей. Шприц-ручки без сменных картриджей, как правило, утилизируют после опустошения картриджа. Шприц-ручки позволяют вводить инсулин с увеличением дозы, например, на половину единицы, одну единицу или две единицы, которая, как правило, измеряется с помощью круговой шкалы дозирования или другого механизма установления дозы (см, например, патенты США №№ 5947934, 6074372, 6110149, 6524280, 6582404). Совместные композиции далее доставляют посредством тонкой иглы, прикрепленной к шприц-ручке. Инсулиновые шприц-ручки хорошо известны в уровне технике и включают шприц-ручки, которые описаны в других документах, включая, но не ограничиваясь этим, шприц-ручки, которые описаны в патентах США №№ 5947934, 4973318, 5462535, 5599323, 5626566, 5984906, 6074372, 6110149, 6302869, 6379339 и 7241278. Другие аналогичные устройства дозирования, такие как, например, те, которые описаны в патентах США №№ 5947934, 6074372, 6110149 и 6379339, также могут использоваться для введения предусмотренных в настоящем документе композиций, либо совместной композиции инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, либо отдельно композиции инсулина и композиции деградирующего гиалуронан фермента. В других примерах инсулиновая шприц-ручка или аналогичное устройство также содержит датчик глюкозы или глюкометр, которые могут измерять уровень глюкозы в крови субъекта (см., например, WO 2003047426).

Инсулиновые шприц-ручки и аналогичные устройства, которые могут быть использованы или изменены для использования для доставки предусмотренных в настоящем документе совместных композиций, хорошо известны в области техники и включают, не ограничиваясь этим, устройства, которые продаются под торговьми марками Autopen® (Owen Mumford, Inc.), Disetronic Pen (Disetronic Medical Systems), Humalog® Pen (Eli Lilly and Company), Humalog® Mix 75/25 Pen (Eli Lilly and Company), Humulin® 70/30 Pen (Eli Lilly and Company), Humulin® N Pen (Eli Lilly and Company), Novolog® FlexPen (Novo Nordisk), NovoPen® 3 (Novo Nordisk), NovoPen® 4 (Novo Nordisk), NovoPen® Junior (Novo Nordisk), Novolog® Mix 70/30 FlexPen (Novo Nordisk), InDuo® (Novo Nordisk), Novolin® InnoLet® (Novo Nordisk), Innovo® (Novo Nordisk), OptiPen® (Sanofi-Aventis) OptiPen® Pro2 (Sanofi-Aventis), OptiSet® (SanofiAventis) и SoloSTAR® (Sanofi-Aventis).

c) . Инсулиновые помпы и другие устройства доставки инсулина.

Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции могут быть введены субъекту с диабетом с использованием устройства доставки инсулина, такого как инсулиновая помпа или другое аналогичное устройство непрерывной инфузии.

Устройства доставки инсулина, как правило, содержат по меньшей мере один одноразовый резервуар, содержащий композицию инсулина, помпу (в том числе любые элементы управления, программное обеспечение, модули обработки и/или батареи) и одноразовый инфузионный набор, включающий канюлю или иглу для подкожной инъекции и трубку, соединяющую канюлю или иглу с резервуаром с инсулином. Для применения с предусмотренными в настоящем документе стабильными совместными композициями устройство доставки инсулина может содержать резервуар, содержащий совместную композицию инсулина и деградирующего гиалуронан фермента. Совместные композиции можно вводить непрервыно и/или в болюсных инъекциях. Более того, пользователь устройства доставки инсулина имеет возможность влиять на профиль инсулина, формируя болюсы. Например, можно вводить стандартный болюс, который представляет собой инфузию, аналогичную дискретной инъекции, при которой вся доза вводится немедленно. Продленный болюс представляет собой медленную инфузию в течение времени, что позволяет избежать высокой начальной дозы и продлить действие композиции. Также с использова- 82 033472 нием инсулиновой помпы или другой системы непрерывной доставки можно вводить комбинацию болюсов, включающую как стандартный болюс, так и продленный болюс. Устройства доставки инсулина хорошо известны в области техники и описаны в других документах, включая, но не ограничиваясь этим, в патентах США №№ 6554798, 6641533, 6744350, 6852104, 6872200, 6936029, 6979326, 6999854, 7025743 и 7109878. Устройства доставки инсулина также могут быть подключены к глюкометру или датчику глюкозы и/или могут содержать средства для расчета рекомендованной дозы инсулина на основе уровня глюкозы в крови, содержания углеводов в пище и других входных данных. Более того, устройства доставки инсулина могут быть имплантируемыми или могут быть внешними по отношению к субъекту.

d). Инсулиновые помпы и другие системы непрерывной доставки.

Устройство доставки инсулина, используемое совместно с предусмотренными здесь совместными композициями, включает инсулиновую помпу или другое подобное устройство, способное проводить непрерывную подкожную инфузию инсулина. Устройства введения инсулина, в том числе устройства без обратной связи и с обратной связью, как правило, содержат по меньшей мере один одноразовый резервуар, содержащий препарат инсулина, помпу (включающую любые элементы управления, программное обеспечение, модули обработки и/или батареи) и одноразовый инфузионный набор, включающий канюлю или иглу для подкожных инъекций и трубку, соединяющую канюлю или иглу с резервуаром с инсулином. Устройства доставки с обратной связью дополнительно включают в себя глюкометр или датчик глюкозы. Для применения в предусмотренных здесь способах устройство доставки инсулина может содержать резервуар, содержащий сверхбыстродействующую совместную композицию инсулина, содержащую инсулин и деградирующий гиалуронан фермент.

Совместные композиции инсулина можно вводить непрерывно и/или в болюсных инъекциях. Пользователи устанавливают помпу, чтобы вводить устойчивый поток или инфузию базального количества композиции инсулина непрерывно в течение всего дня. Помпы также вводят дополнительные (болюсные) дозы композиции инсулина во время еды и в период, когда уровень сахара в крови слишком высок, что определяется на основе входных данных. Частый контроль глюкозы в крови имеет большое значение для определения дозировки инсулина и обеспечения соответствующей доставки инсулина. Это может быть достигнуто путем ручного мониторинга с помощью отдельного или включенного глюкометра. Кроме того, пользователь устройства инфузии инсулина имеет возможность влиять на профиль инсулина путем регулирования болюса. Например, может быть введен стандартный болюс, который представляет собой инфузию, похожую на дискретную инъекцию, при которой доза поступает сразу. Продленный болюс является медленной инфузией в течение времени, позволяющей избежать высокой начальной дозы и продлить действие композиции. Комбинацию болюсных доз, содержащую как стандартный болюс, так и продленный болюс, также можно вводить с помощью инсулиновой помпы или другой системы непрерывного введения.

Устройства для доставки инсулина хорошо известны в данной области и описаны в уровне техники, включая патенты США №№ 6554798, 6641533, 6744350, 6852104, 6872200, 6936029, 6979326, 6999854, 7025743 и 7109878, но не ограничиваясь ими. Устройства доставки инсулина также могут быть подключены к глюкометру или датчику глюкозы, например, в системе с обратной связью, и/или могут содержать средства для расчета рекомендуемой дозы инсулина, основанной на уровне глюкозы в крови, уровне углеводов, содержащихся в пище, или других входных данных. Дополнительно устройства доставки инсулина могут быть имплантированы или могут быть внешними по отношению к субъекту. Применение внешних помп для инфузии инсулина требует тщательного отбора индивидуумов, скрупулезного мониторинга, досконального обучения и долгосрочного постоянного наблюдения. Эта терапия, как правило, осуществляется многопрофильной группой специалистов в области здравоохранения с опытом такой терапии и опытом обучения лиц, проходящих лечение с использованием инсулиновой помпы.

i). Системы без обратной связи.

Системы без обратной связи могут быть использованы для совместных композиций, предусмотренных здесь. Системы без обратной связи обычно содержат по меньшей мере один одноразовый резервуар, содержащий препарат инсулина, помпу (включающую любые элементы управления, программное обеспечение, модули обработки и/или батареи) и одноразовый инфузионный набор, включающий канюлю или иглу для подкожных инъекций и трубку, соединяющую канюлю или иглу с резервуаром с инсулином. Системы без обратной связи вливают небольшие (базальные) дозы каждые несколько минут и большую (болюсную) дозу, которую пациент устанавливает вручную. Но система без обратной связи не содержит глюкометр или датчик глюкозы и поэтому не может реагировать на изменения уровня глюкозы в сыворотке пациента. Различные способы и устройства, используемые для измерения уровня глюкозы в крови, известны специалистам в данной области. Традиционный метод, используемый многими диабетиками для личного мониторинга их уровня глюкозы в крови, включает в себя периодический забор крови, нанесение этой крови на тест-полоски и определение уровня глюкозы в крови с помощью калориметрических, электрохимических или фотометрических методов детекции. Для непрерывного или автоматического контроля анализируемых веществ, таких как глюкоза, в потоке крови или тканевой жидкости были разработаны разнообразные устройства. Некоторые из этих устройств используют электрохимические датчики, которые непосредственно имплантированы в кровеносный сосуд или в подкожную ткань паци- 83 033472 ента. Примеры способов и устройств для контроля уровня глюкозы включают, но не ограничиваются способами и устройствами, которые описаны в патентах США №№ 5001054, 5009230, 5713353, 6560471,

6574490, 6892085, 6958809, 7299081, 7774145, 7826879, 7857760 и 7885699, включенных в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Системы доставки инсулина, такие как инсулиновые помпы, известны в данной области и могут быть использованы в системах без обратной связи. Примеры устройств для доставки инсулина без обратной связи (такие, как описано выше), включают, но не ограничиваются устройствами, которые описаны в патентах США №№ 4562751, 4678408, 4685903, 4373527, 4573994, 6554798, 6641533, 6744350, 6852104, 6872200, 6936029, 6979326, 6999854, 7109878, 7938797 и 7959598, включенных в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. Эти и подобные системы, легко идентифицируемые любым специалистом в данной области, могут быть использованы, чтобы доставить совместные композиции, предусмотренные в данном документе. Устройства доставки инсулина обычно содержат один или несколько резервуаров, которые, как правило, являются одноразовыми, содержащих препарат инсулина, например, совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, описанные здесь. В некоторых примерах совместные композиции доставляются с использованием инфузионной трубки и канюли или иглы. В других примерах инфузионное устройство прикреплено непосредственно к коже, и совместные композиции вытекают из инфузионного устройства через канюлю или иглу непосредственно в тело без использования трубки. В других примерах инфузионное устройство является внутренним для тела и для доставки совместных композиций необязательно может быть использована инфузионная трубка.

ii). Системы с обратной связью.

Системы с обратной связью, иногда называемые искусственной поджелудочной железой, представляют особый интерес при использовании совместных композиций, представленных здесь. Системы с обратной связью относятся к системам с интегрированным непрерывно работающим глюкометром, инсулиновой помпой или другой системой доставки и контроллером, который включает в себя математический алгоритм, постоянно вычисляющий необходимое для инфузии количество инсулина, чтобы осуществлять контроль гликемии, основанный на измерениях в реальном времени уровня глюкозы в крови. Такие системы в том случае, когда они оптимизированы, могут обеспечивать постоянный и очень надёжный контроль гликемии, соответствующий естественному ответу на инсулин и контролю гликемии, наблюдаемому у здорового субъекта без диабета. Чтобы быть эффективными, однако, системам с обратной связью необходимы надежный и точный непрерывно работающий глюкометр и доставка инсулина с очень высокой скоростью. Например, задержки абсорбции и активности инсулина, связанные с подкожным введением быстродействующих инсулинов, могут привести к большим отклонениям гликемии после приема пищи (Hovorka et al. (2006) Diabetic Med. 23:1-12). Задержка, вызванная абсорбцией инсулина, действием инсулина, кинетикой глюкозы в интерстициальной жидкости и временем транспорта в системах контроля ex-vivo, таких как системы, которые основаны на методе микродиализа, может, в целом, привести к временной задержке в 100 мин или более с момента введения инсулина до наибольшего обнаруженного эффекта снижения уровня глюкозы (Hovorka et al. (2006) Diabetic Med. 23:1-12). Таким образом, после однократного введения инсулин будет продолжать повышать свой измеряемый эффект в течение почти 2 ч. Это может осложнить эффективное снижение концентрации глюкозы с использованием системы с обратной связью после приема пищи. Во-первых, увеличение уровня глюкозы необходимо детектировать. Однако это обычно происходит только после задержки примерно в 10-40 мин. Такая система должна определять, что пища была переварена, и поставлять соответствующую дозу инсулина. Способность системы компенсировать впоследствии ошибочные дозы инсулина снижена из-за длительных задержек и невозможности удалять уже введённый инсулин. Такие проблемы могут быть преодолены, по меньшей мере частично, с использованием совместных композиций быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, например, таких, которые предусмотрены в настоящем документе, и которые способны проявлять повышенные скорость и степень абсорбции, что сопряжено с улучшением фармакодинамики (см., например, опубликованную заявку США № US 20090304665 и международную публикацию РСТ WO 2009134380). Совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента имеют пониженное t_max (т.е. достигают максимальной концентрации быстрее), чем быстродействующие инсулины сами по себе, и начинают контролировать уровень глюкозы в крови быстрее, чем быстродействующие инсулины сами по себе. Это увеличение скорости абсорбции и начала действия уменьшает задержку между действием инсулина и определением уровня глюкозы и получением данных о нем, что приводит, в результате, к более эффективной системе с обратной связью, которая может более точно контролировать уровень глюкозы в крови, снижая отклонения гликемии.

Системы с обратной связью хорошо известны в данной области и были описаны в других источниках, включая, но не ограничиваясь ими, в патентах США №№ 5279543, 5569186, 6558351, 6558345, 6589229, 6669663, 6740072, 7267665, 7354420 и 7850674, которые включены в настоящий документ посредством ссылки. Эти и подобные системы, которые легко идентифицировать любому специалисту в данной области, могут быть использованы для доставки совместных композиций, предусмотренных в

- 84 033472 данном документе. Системы с обратной связью включают в себя систему датчиков для измерения уровня глюкозы в крови, контроллер и систему доставки. Эта интегрированная система предназначена для моделирования работы β-клеток поджелудочной железы, таким образом, что она контролирует инфузионное устройство для доставки инсулина субъекту с профилем концентрации, схожим с тем, который бы поддерживался полностью функционирующими человеческими β-клетками в ответ на изменения концентрации глюкозы в крови организма. Таким образом, система имитирует естественный инсулиновый ответ организма на уровень глюкозы в крови и не только обеспечивает эффективное использование инсулина, но и регулирует другие функции организма, поскольку инсулин проявляет как метаболические, так и митогенные эффекты. Кроме того, контроль гликемии, обеспечиваемый системой с обратной связью, вообще не требует информации о количестве и времени приема пищи или других показателях. Система может быть основана только на измерении уровня глюкозы в крови в реальном времени. Датчик глюкозы генерирует сигналы, отражающие уровни глюкозы в крови организма, и обеспечивает проведение сигнала датчика к контроллеру. Контроллер принимает сигнал датчика и генерирует команды, которые передаются в системы доставки инсулина. Система доставки инсулина принимает команды и вводит инсулин в организм в ответ на команды.

Ниже приводятся описания примеров компонентов систем с обратной связью, которые могут использоваться для доставки представленных здесь совместных композиций быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента. Очевидно, что специалист в данной области может легко определить подходящие системы с обратной связью для использования таких совместных композиций. Такие системы были описаны в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, в патентах США №№ 5279543, 5569186, 6558351, 6558345, 6589229, 6669663, 6740072, 7267665 и 7354420. Отдельные компоненты систем также были описаны в данной области независимо и в контексте систем с обратной связью, используемых для достижения контроля гликемии. Подразумевается, что варианты, приведенные здесь, являются только примерами, и что другие системы с обратной связью или отдельные компоненты могут быть использованы для доставки совместных композиций, представленных в данном документе.

Системы с обратной связью содержат датчик глюкозы или устройство контроля, функционирующее непрерывно. Такие устройства могут содержать датчики игольчатого типа, которые вводятся под кожу и прикреплены к небольшому передатчику, который отправляет данные об уровнях глюкозы по беспроводной сети с помощью радиочастотной телеметрии к небольшому приемнику. В некоторых примерах осуществления датчик вводится через кожу субъекта с использованием установочной иглы, которую удаляют и выбрасывают после того, как датчик размещен в подкожной ткани. Установочная игла имеет заостренный наконечник и открытое отверстие для удержания датчика во время введения под кожу (см., например, патенты США №№ 5586553 и 5954643). Датчик, используемый в системе с обратной связью, может необязательно содержать три электрода, которые контактируют с интерстициальной жидкостью (ISF) в подкожной ткани. Эти три электрода включают рабочий электрод, электрод сравнения и считывающий электрод, которые используются, чтобы сформировать контур. Когда соответствующее напряжение подается через рабочий электрод и электрод сравнения, ISF создаёт сопротивление между этими электродами. Аналоговый электрический сигнал направляется от рабочего электрода через тело к считывающему электроду. Напряжение на рабочем электроде, как правило, заземляется, а напряжение на электроде сравнения может быть задано как V_SET, например, между 300 и 700 мВ. Наиболее заметной реакцией, стимулируемой разностью напряжений между электродами, является восстановление глюкозы, так как она в первую очередь вступает в реакцию с ферментом глюкозооксидазой (GOX), производящим глюконовую кислоту и пероксид водорода (Н₂О₂). Затем Н₂О₂ восстанавливается до воды (H₂O) и (O^-) на поверхности рабочего электрода. O^- притягивает положительный заряд от электрических компонентов датчика, тем самым отталкивая электрон и вызывая появление электрического тока. Это приводит к аналоговому электрическому сигналу, пропорциональному концентрации глюкозы в ISF, которая находится в контакте с электродами датчика (см., например, патент США № 7354420).

В некоторых вариантах осуществления для измерения уровня глюкозы в крови используется более одного датчика. Например, могут быть использованы избыточные датчики, и субъект может получать уведомления, когда датчик не срабатывает, через телеметрическое характеристическое устройство контроля с электронным передатчиком. Индикатор также может информировать субъекта о том, какие из датчиков по-прежнему функционируют и/или сколько датчиков функционирует на настоящий момент. В других примерах сигналы датчиков объединены через усреднение или другими средствами. Кроме того, могут быть использованы различные типы датчиков. Например, внутренний и внешний датчики глюкозы могут быть использованы для измерения уровня глюкозы в крови в одно и то же время.

Датчики глюкозы, которые могут быть использованы в системе с обратной связью, хорошо известны и могут быть легко идентифицированы и, необязательно, дополнительно модифицированы специалистом в данной области. Типичные внутренние датчики глюкозы включают, но не ограничиваются датчиками, которые описаны в патентах США №№ 5497772, 5660163, 5791344, 5569186, 6895265 и 7949382. Пример датчика глюкозы, в котором используется флуоресценция, описан в патенте США 6011984. Системы датчиков глюкозы также могут использовать другие технологии измерения, в том числе световые

- 85 033472 лучи, проводимость, потоковый отбор проб, микродиализ, микропорацию, ультразвуковой отбор проб, обратный ионофорез или другие методы (см., например, патенты США №№ 5433197 и 5945676, а также международную патентную заявку WO 199929230). В некоторых примерах только рабочий электрод расположен в подкожной клетчатке и контактирует с ISF, а считывающий электрод и электрод сравнения расположены вне организма и контактируют с кожей. Считывающий электрод и электрод сравнения могут быть расположены на поверхности корпуса устройства и могут находиться на коже в качестве части телеметрического характеристического устройства контроля. В других примерах считывающий электрод и электрод сравнения располагаются на коже с помощью других устройств, таких как подведённый к электродам провод и лента на коже с электродами, расположенными на её внутренней стороне. Кроме того, для избыточности системы в подкожную ткань может быть помещено более одного рабочего электрода. Интерстициальную жидкость также можно отбирать из организма субъекта и пропускать через внешний датчик, который не имплантирован в тело.

Контроллер принимает входной сигнал от датчика глюкозы. Такой контроллер предназначен для моделирования β-клеток поджелудочной железы и предоставления команд устройству доставки инсулина с целью введения необходимого количества инсулина для контроля гликемии. Контроллер использует программное обеспечение с алгоритмами вычисления необходимого количества инсулина, основанными на уровнях глюкозы, детектируемых глюкометром. Примеры алгоритмов включают алгоритмы, которые близко моделируют β-клетки, поскольку алгоритмы, предназначенные для минимизации отклонений глюкозы в организме и не учитывающие, сколько инсулина поставляется, могут привести к чрезмерному увеличению веса, гипертонии и атеросклерозу. Как правило, система предназначена для имитирования модели секреции инсулина in vivo и для регулирования этой модели в соответствии с in vivo адаптацией β-клеток, наблюдаемой у обычных здоровых людей. Алгоритмы контроля, применимые для систем с обратной связью, включают алгоритмы, используемые пропорционально-интегральнодифференциальным (PID) контроллером. Пропорциональные дифференциальные контроллеры и алгоритмы модели прогнозируемого контроля (МРС) также могут быть использованы в некоторых системах (Hovorka et al. (2006) Diabetic Med. 23:1-12). Примеры алгоритмов включают, но не ограничиваются описанными в Hovorka et al. (Diabetic Med. (2006) 23:1-12), Shimoda et al. (Front Med Biol Eng (1997) 8:197211), Shichiri et al. (Artif. Organs (1998) 22:32-42), Steil et al. (Diabetes Technol Ther (2003) 5: 953- 964), Kalatz et al. (Acta Diabetol. (1999) 36:215) и в патентах США №№ 5279543, 5569186, 6558351, 6558345, 6589229, 6740042, 6669663, 6740072, 7267665 и 7354420 и опубликованной заявке США 20070243567.

В одном варианте осуществления в системе с обратной связью используется PID-контроллер. PIDконтроллер непрерывно регулирует инфузию инсулина путем оценки отклонения глюкозы по трём позициям: отклонение от целевого значения глюкозы (пропорциональная компонента), площадь под кривой между измеряемым уровнем глюкозы и целевым уровнем (интегральная компонента) и изменение измеряемого уровня глюкозы (дифференциальная компонента). Как правило, реакция β-клеток in vivo на изменения уровня глюкозы характеризуется первой и второй фазами инсулинового ответа. Двухфазная инсулиновая реакция β-клеток может быть смоделирована с использованием пропорциональной, интегральной и дифференциальной (PID) компонент контроллера (см., например, патент США № 7,354,420).

Контроллер подаёт команды для введения необходимого количества инсулина. Системы доставки инсулина, такие как инсулиновые помпы, известны в данной области и могут быть использованы в системах с обратной связью. Примеры устройств доставки инсулина (подобные тем, что описаны выше), включают, но не ограничиваются описанными в патентах США №№ 4562751, 4678408, 4685903, 4373527, 4573994, 6554798, 6641533, 6744350, 6852104, 6872200, 6936029, 6979326, 6999854 и 7109878. Устройства доставки инсулина обычно содержат одну или несколько ёмкостей (резервуаров), которые, как правило, являются одноразовыми и содержат препарат инсулина, например, описанную здесь совместную композицию быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента. В некоторых примерах совместные композиции доставляются с использованием инфузионной трубки и канюли или иглы. В других вариантах осуществления инфузионное устройство прикрепляется непосредственно к коже, и совместные композиции доставляются из инфузионного устройства через канюлю или иглу непосредственно в тело без использования трубки. В других вариантах осуществления инфузионное устройство находится внутри тела и для доставки совместных композиций необязательно может быть использована инфузионная трубка. Системы с обратной связью могут также содержать дополнительные компоненты, включая, но не ограничиваясь ими, фильтры, калибраторы и передатчики.

Н. Способы получения нуклеиновых кислот, кодирующих инсулин или деградирующий гиалуронан фермент, и их полипептидов.

Полипептиды инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, раскрытые в данном документе, могут быть получены хорошо известными в данной области способами очистки белков и экспрессии рекомбинантного белка. Полипептиды могут быть также синтезированы химическим путем. Например, Аи В-цепи инсулина могут быть химически синтезированы, а затем сшиты с помощью дисульфидных связей за счёт, например, реакции восстановления и повторного окисления. Когда полипептиды получают рекомбинантными способами, может быть использован любой способ идентификации нуклеиновых ки

- 86 033472 слот, которые кодируют желаемые гены, известный специалистам в данной области техники. Любой метод, доступный в данной области, может быть использован для получения полноразмерной (т.е. охватывающей всю кодирующую область) кДНК или клона геномной ДНК, кодирующих гиалуронидазу, например, из клетки или ткани. Модифицированный инсулин или варианты инсулина или деградирующего гиалуронан фермента могут быть сконструированы из полипептида дикого типа, например, путем сайтнаправленного мутагенеза.

Полипептиды могут быть клонированы или выделены с применением любых доступных способов, известных в данной области для клонирования и выделения молекул нуклеиновых кислот. Такие способы включают ПЦР-амплификацию нуклеиновых кислот и скрининг библиотек, в том числе скрининг нуклеиновых кислот методом гибридизации, скрининг на основе антител и активности.

Для выделения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей нужный полипептид, могут быть использованы методы амплификации нуклеиновых кислот, включая, например, методы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Материал, содержащий нуклеиновую кислоту, может быть использован в качестве исходного материала, из которого может быть выделена желаемая нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид. Например, препараты ДНК и мРНК, клеточные экстракты, экстракты тканей, образцы жидкости (например, кровь, сыворотка, слюна) и образцы от здоровых и/или больных субъектов могут быть использованы в способах амплификации. Библиотеки нуклеиновых кислот также могут быть использованы в качестве источника исходного материала. Для амплификации интересующего полипептида могут быть разработаны праймеры. Например, праймеры могут быть сконструированы на основе экспрессируемых последовательностей, с которых синтезируется нужный полипептид. Праймеры могут быть разработаны на основе обратной транскрипции аминокислотной последовательности полипептида. Молекулы нуклеиновых кислот, полученные путем амплификации, могут быть секвенированы и проверены на наличие закодированного интересующего полипептида.

К молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, могут быть присоединены дополнительные нуклеотидные последовательности, в том числе линкерные последовательности, содержащие сайты рестрикции, с целью клонирования синтетического гена в вектор, например экспрессионный вектор или вектор, предназначенный для амплификации кодирующих белки последовательностей ДНК. Кроме того, дополнительные нуклеотидные последовательности, определяющие функциональные элементы ДНК, могут быть функционально связаны с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Примеры таких последовательностей включают, но не ограничиваются ими, промоторные последовательности, предназначенные для обеспечения внутриклеточной экспрессии белка, и секреторные последовательности, например гетерологичные сигнальные последовательности, предназначенные для обеспечения секреции белка. Такие последовательности известны специалистам в данной области. Дополнительные нуклеотидные последовательности, такие как последовательности азотистых оснований, определяющих связывающиеся с белками районы, также могут быть связаны с молекулами нуклеиновых кислот, кодирующих фермент. Такие области включают, но не ограничиваются ими, последовательности оснований, которые обеспечивают или кодируют белки, которые облегчают поглощение фермента конкретными целевыми клетками или иным образом изменяют фармакокинетику продукта синтетического гена. Например, ферменты могут быть связаны с ПЭГ фрагментами.

Кроме того, могут быть добавлены метки или другие фрагменты, например, для возможности обнаружения или аффинной очистки полипептида. Например, дополнительные последовательности нуклеотидных остатков, такие как последовательности оснований, обеспечивающие эпитопную метку или другой детектируемой маркер, также могут быть связаны с молекулами нуклеиновых кислот, кодирующих фермент. Примеры таких последовательностей включают последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие His-tag (например, 6xHis, НННННН; SEQ ID NO: 54) или Flag-Tag (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 55).

Идентифицированные и выделенные нуклеиновые кислоты затем могут быть вставлены в соответствующий вектор для клонирования. Может быть использовано большое количество систем векторов и хозяев, известных в данной области. Возможные векторы включают, но не ограничиваются ими, плазмиды или модифицированные вирусы, но векторная система должна быть совместима с используемой клеткой-хозяином. Такие векторы включают, но не ограничиваются ими, бактериофаги, такие как производные бактериофага лямбда, или плазмиды, такие как производные плазмиды pCMV4, pBR322 или pUC, или вектор Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). Другие экспрессионные векторы включают вектор экспрессии HZ24, являющийся примером в данном документе. Вставка в вектор для клонирования может, например, быть осуществлена путем лигирования фрагмента ДНК в вектор для клонирования, который имеет комплементарные липкие концы. Вставка может быть осуществлена с применением ТОРОвекторов для клонирования (Invitrogen, Carlsbad, СА). Если комплементарные сайты рестрикции, используемые для фрагмента ДНК, не присутствуют в векторе для клонирования, то концы молекул ДНК могут быть ферментативно модифицированы. Кроме того, любой интересующий сайт может быть получен путем лигирования нуклеотидных последовательностей (линкеров) на концах ДНК; и эти лигированные линкеры могут содержать определенные химически синтезированные олигонуклеотиды, кодирующие последовательности, распознаваемые эндонуклеазой рестрикции. В другом способе расщепленный эндо

- 87 033472 нуклеазой вектор и ген белка могут быть изменены с помощью гомополимерных хвостовых последовательностей. Рекомбинантные молекулы могут быть введены в клетки-хозяева посредством, например, трансформации, трансфекции, инфекции, электропорации и сонопорации, так что в клетки доставляется множество копий последовательности гена. Инсулин может быть получен с применением различных методов (см., например, Ladisch et al. (1992) Biotechnol. Prog. 8:469-478). В некоторых примерах нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид препроинсулина или проинсулина, встраивают в экспрессионный вектор. После экспрессии полипептид препроинсулина или проинсулина преобразуют в инсулин с помощью ферментативных или химических методов, которые расщепляют сигнальную последовательность и/или пептид С, в результате чего образуются А- и В- цепи, которые сшиваются дисульфидными связями, например, с помощью реакции окисления и последующего восстановления (см., например, Cousens et al., (1987) Gene 61:265-275, Chance et al., (1993) Diabetes Care 4:147-154). В другом примере осуществления нуклеиновую кислоту, кодирующую А- и В-цепи инсулина, вставляют в один или два экспрессионных вектора для совместной экспрессии в виде одного полипептида из одного экспрессионного вектора или экспрессии в виде двух полипептидов из одного или двух экспрессионных векторов. Таким образом, полипептиды А- и В-цепей могут быть экспрессированы по отдельности, а затем скомбинированы для получения инсулин, или могут быть совместно экспрессированы в отсутствие С-цепи. В случаях, когда А- и В-цепи коэкспрессированы в виде одного полипептида, нуклеиновая кислота, кодирующая субъединицы, также может кодировать линкер или спейсер между В- и А-цепями, например линкер или спейсер, описанный ниже. Нуклеиновая кислота, вставленная в экспрессионный вектор, может содержать, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую В-цепь инсулина, линкер, такой как, например, аланин-аланин-лизин, и А-цепь, что приводит к экспрессии, например, конструкции В-цепь инсулина-Ala-Ala-Lys-А-цепь инсулина.

В конкретных вариантах осуществления трансформация клеток-хозяев рекомбинантными молекулами ДНК, которые включают выделенный ген белка, кДНК или синтезированную последовательность ДНК, позволяет получать множество копий гена. Таким образом, ген может быть получен в больших количествах в растущих трансформантах, выделен в виде рекомбинантных молекул ДНК из трансформантов и, при необходимости, извлечён из выделенной рекомбинантной ДНК.

1. Векторы и клетки.

Для рекомбинантной экспрессии одного или более желаемых белков, таких как любой описанный здесь белок, нуклеиновая кислота, содержащая всю нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, или ее часть, может быть вставлена в соответствующий экспрессионный вектор, т.е. вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности белка. Необходимые сигналы транскрипции и трансляции также могут содержаться в нативном промоторе гена фермента и/или его фланкирующих участках.

Также предусмотрены векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент. Также предусмотрены клетки, содержащие векторы. Клетки включают эукариотические и прокариотические клетки, а векторы включают в себя любые подходящие векторы для применения в этих клетках.

Предусмотрены прокариотические и эукариотические клетки, в том числе эндотелиальные клетки, содержащие векторы. Такие клетки включают бактериальные клетки, дрожжевые клетки, клетки грибов, архей, растительные клетки, клетки насекомых и клетки животных. Такие клетки используют для получения белка путем выращивания вышеописанных клеток в условиях, при которых кодируемый белок экспрессируется в клетке, и затем выделяют из этих клеток экспрессированный белок. Например, для целей данного изобретения фермент может быть секретирован в среду.

Предусмотрены векторы, которые содержат последовательность нуклеотидов, которая кодирует растворимый полипептид гиалуронидазы, соединенный с нативной или гетерологичной сигнальной последовательностью, а также их множественные копии. Векторы могут быть выбраны для экспрессии белка фермента в клетке или экспрессии фермента в виде секретируемого белка.

Разнообразные системы вектор-хозяин могут быть использованы для экспрессии последовательности, кодирующей белок. Они включают, но не ограничиваются ими, системы клеток млекопитающих, инфицированных вирусом (например, вирусом коровьей оспы, аденовирусом и другими вирусами); системы клеток насекомых, инфицированных вирусом (например, бакуловирусом); микроорганизмы, такие как дрожжи, содержащие дрожжевые векторы, или бактерии, трансформированные ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК. Элементы экспрессионных векторов различаются по своей силе и специфичности. В зависимости от используемой системы вектор-хозяин может быть использован любой из ряда подходящих элементов транскрипции и трансляции.

Для конструирования экспрессионных векторов, содержащих химерный ген с соответствующими сигналами контроля транскрипции/трансляции и последовательностями, кодирующими белок, могут быть использованы любые известные специалистам в данной области способы вставки фрагментов ДНК в вектор. Эти способы могут включать способы получения рекомбинантной ДНК in vitro и синтетические подходы, и рекомбинацию in vivo (генетическая рекомбинация). Экспрессию последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белок или домены, производные, фрагменты или их гомологи, можно регулировать с помощью второй последовательности нуклеиновой кислоты таким образом, что гены или

- 88 033472 их фрагменты экспрессируются в хозяине, трансформированном рекомбинантной молекулой (молекулами) ДНК. Например, экспрессией белков можно управлять с помощью любого промотора/энхансера, известного в данной области. В конкретном варианте промотор не является нативным для гена интересующего белка. Промоторы, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, ранний промотор SV40 (Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), промотор, содержащейся в 3' длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)), промотор тимидинкиназы герпеса (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1441-1445 (1981)), регуляторные последовательности гена металлотионеина (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); прокариотические экспрессионные векторы содержат промотор β-лактамазы (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) или tac-промотор (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); см. также Useful Proteins from Recombinant Bacteria: in Scientific American 242:79-94 (1980); экспрессионные векторы растений содержат промотор нопалин-синтетазы (Herrara-Estrella et al., Nature 503:209-213 (1984)) или промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)) и промотор фотосинтетического фермента рибулозобисфосфаткарбоксилазы (Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)); промоторные элементы из дрожжей и других грибов включают промотор Gal4, промотор алкогольдегидрогеназы, промотор фосфоглицераткиназы, промотор щелочной фосфатазы, в трансгенных животных были использованы следующие участки контроля транскрипции животных, которые проявляют тканевую специфичность: регуляторный участок гена эластазы I, который активен в ацинарных клетках поджелудочной железы (Swift et al., Cell 35:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); регуляторный участок гена инсулина, который активен в β-клетках поджелудочной железы (Hanahan et al., Nature 375:115-122 (1985)), регуляторный участок гена иммуноглобулина, который активен в лимфоидных клетках (Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), контрольный участок вируса опухоли молочной железы мыши, который активен в яичке, молочной железе, лимфоидных и тучных клетках (Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)), участок контроля гена альбумина, который активен в печени (Pinkert et al., Genes and Devel 1:268-276 (1987)), регуляторный участок гена α-фетопротеина, который активен в печени (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)), участок контроля гена α-1 антитрипсина, который активен в печени (Kelsey et al., Genes and Devel 1:161-171 (1987)), регуляторный участок контроля гена βглобина, который активен в миелоидных клетках (Magram et al., Nature 375:338-340 (1985); Kollias et al., Cell. 46:89-94 (1986)), регуляторный участок контроля гена основного белка миелина, который активен в олигодендроцитах мозга (Readhead et al., Cell. 48:703-712 (1987)), участок контроля гена лёгких цепей миозина 2, который активен в скелетных мышцах (Shani, Nature 374:283-286 (1985)) и контрольный участок гена гонадотропного рилизинг-гормона, который активен в гонадотропных клетках гипоталамуса (Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)).

В конкретном варианте осуществления используется вектор, который содержит промотор, функционально связанный с нуклеиновыми кислотами, кодирующими интересующий белок или его домен, фрагмент, производное или гомолог, одну или несколько точек начала репликации и, необязательно, один или несколько селектируемых маркеров (например, ген устойчивости к антибиотику). Примеры плазмидных векторов для трансформации клеток E.coli включают, например, векторы экспрессии pQE (доступные в Qiagen, Valencia, CA, см. также опубликованную литературу Qiagen по описанию системы). pQE векторы имеют промотор фага Т5 (узнаваемый РНК-полимеразой Е. Coli) и удвоенный модуль репрессии lac-оператора, что обеспечивает жестко регулируемую экспрессию рекомбинантных белков в E.coli на высоком уровне, также векторы включают синтетический сайт связывания рибосомы (RBS II) для эффективной трансляции, кодирующую 6xHis-метку последовательность, t₀ и Т1 терминаторы транскрипции, ColE1 ориджин репликации и ген β-лактамазы для устойчивости к ампициллину. Векторы pQE позволяют размещать 6xHis-метку на N- или С-конце рекомбинантного белка. Такие плазмиды включают pQE 32, pQE 30 и pQE 31, которые имеют сайты множественного клонирования для всех трех рамок считывания и обеспечивают экспрессию N-терминально-6xHis-меченных белков. Другие примеры плазмидных векторов для трансформации клеток E.coli включают, например, векторы экспрессии рЕТ (см. патент США 4952496; доступны от Novagen, Madison, WI; см. также опубликованную литературу Novagen с описанием системы). Такие плазмиды включают рЕТ 11a, которая содержит промотор ТЗкю. Т7 терминатор, индуцируемый lac-оператор E.coli и ген lac-репрессора; рЕТ 12а-с, которая содержит Т7 промотор, терминатор Т7 и секреторный сигнал OmpT E.coli; и рЕТ 15b и рЕТ19Ь (Novagen, Madison, WI), которые содержат лидерную последовательность His-Tag™ для применения при очистке специфичной к His колонки и сайт расщепления тромбином, который обеспечивает расщепление после очистки на колонке, ТЗ-Рю промоторный участок и Т7 терминатор.

Примером вектора для экспрессии в клетках млекопитающих является вектор экспрессии HZ24. Экспрессионный вектор HZ24 был получен из векторной конструкции pCI (Promega). Он содержит участки ДНК, кодирующие ген β-лактамазы для устойчивости к антибиотику (AmpR), короткий Е1-ориджин репликации, немедленный-ранний энхансер/промотор цитомегаловируса (CMV) и поздний сигнал поли- 89 033472 аденилирования SV40 (SV40). Вектор экспрессии также имеет внутренний сайт посадки рибосомы (IRES) вируса ECMV (Clontech) и ген мышиной дигидрофолатредуктазы (DHFR).

2. Линкерные фрагменты.

В некоторых примерах инсулин получают путем получения полипептидов А- и В-цепей с линкером таким образом, что, например, С-конец В-цепи присоединен к N-концу А-цепи через короткий линкер. А- и В-цепи могут быть экспрессированы из одного полипептида, содержащего линкер, или могут быть экспрессированы отдельно и затем соединены с помощью линкера. Линкерный фрагмент выбирают в зависимости от желаемых свойств. Он должен быть достаточно длинным и достаточно гибким, чтобы позволить А- и В-цепям имитировать естественную конформацию инсулина.

Линкерами может быть любой фрагмент, подходящий к А- и В-цепям инсулина. Такие фрагменты включают, но не ограничиваются ими, пептидные соединения; аминокислотные и пептидные соединения, обычно содержащие от одной до примерно 60 аминокислот, химические линкеры, такие как гетеробифункциональные расщепляемые сшивающие агенты, фоторасщепляемые линкеры и кислоторасщепляемые линкеры.

Линкерные фрагменты могут быть пептидами. Пептид обычно имеет от примерно 2 до примерно 60 аминокислотных остатков, например от примерно 5 до примерно 40 или от примерно 10 до примерно 30 аминокислотных остатков. Пептидные линкеры могут быть закодированы нуклеиновой кислотой и включены в слитые белки при экспрессии в клетке-хозяине, такой как E.coli. В одном примере линкер аланин-аланин-лизин (AAK) (SEQ ID NO: 178) закодирован в нуклеиновой кислоте между кодирующими последовательностями В- и А-цепей инсулина, так что при экспрессии образуется полипептид В-цепь инсулина-AAK-A-цепь инсулина. Пептидные линкеры могут быть гибкими спейсерными аминокислотными последовательностями, такими, как те, которые известны в области исследований одноцепочечных антител. Примеры таких известных .mi iKcpi ibix участков включают, но не ограничиваются ими,

RPPPPC (SEQ ID N0:166) или SSPPPPC (SEQ ID N0:167),

GGGGS (SEQ ID N0:168), (GGGGS)_n (SEQ. ID N0:169), GKSSGSGSESKS (SEQ ID N0:170), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ. ID N0:171), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID N0:172), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID N0:173), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID N0:174), EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID N0:175), SRSSG (SEQ. ID N0:176) и SGSSC (SEQ ID N0:177).

Кроме того, пептидный линкерный фрагмент может представлять собой VM (SEQ ID NO: 179) или AM (SEQ ID NO: 180), или структуру, описываемую формулой AM(G2-4S)XAM, где X представляет собой целое число от 1 до 11 (SEQ ID NO: 181). Дополнительные связывающие фрагменты описаны, например, в Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883; Whitlow, M., et al. (1993) Protein Engineering 6:989-995; Newton et al. (1996) Biochemistry 35:545-553; A. J. Cumber et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:397401; Ladurner et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:330-337; и патенте США № 4894443.

В некоторых примерах пептидные линкеры кодируются нуклеиновой кислотой и вставляются между В- и А-цепями при экспрессии в клетке-хозяине, такой как E.coli или S.cerevisiae. В других примерах пептидный линкер синтезируют химическими методами. Это может быть выполнено отдельно по отношению к синтезу одной или обеих А- и В-цепей, после чего компоненты соединяются, например, с применением гетеробифункциональных линкеров. Кроме того, пептидный линкер может быть синтезирован на N- или С-конце одной из цепей инсулина, которая затем соединяется с другой цепью через пептидный линкер, например, гетеробифункциональный линкер.

Любой линкер, известный специалистам в данной области, может быть использован в данном документе для связывания А- и В-цепей инсулина. Линкеры и связи, которые подходят для химического связывания цепей, включают, но не ограничиваются ими, дисульфидные связи, тиоэфирные связи, блокированные (стерически затрудненные) дисульфидные связи и ковалентные связи между свободными реакционноспособными группами, такими как амино- и тиоловые группы. Эти связи образуются с участием гетеробифункциональных реагентов для получения реакционноспособных тиольных групп на одном или обоих полипептидах с последующим взаимодействием тиольных групп одного полипептида с реакционноспособными тиольными или аминогруппами другого полипептида, к которым могут быть присоединены активированные малеимидо- или тиольные группы. Другие линкеры включают кислоторасщепляемые линкеры, такие как бисмалеимидэтоксипропан, кислотолабильные конъюгаты трансферрина и дигидразид адипиновой кислоты, который способен расщепляться в более кислых внутриклеточных компартментах; кросс-линкеры, которые расщепляются под воздействием УФ или видимого света, и такие линкеры, как, например, различные домены, такие как CH1, CH2 и СН3 из константной области IgG1 человека (см. Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30:379-386). В некоторые вариантах осуществления может быть использовано несколько линкеров, чтобы применить интересующие свойства каждого линкера. Химические линкеры и пептидные линкеры можно вставлять с помощью ковалентного связывания линкера с А- и В-цепями инсулина. Гетеробифункциональные агенты, описанные ниже, могут быть использованы для осуществления такого ковалентного связывания. Пептидные линкеры также мо- 90 033472 гут быть связаны путём экспрессии ДНК, кодирующей линкер между А- и В-цепями.

Другие линкеры, которые можно использовать, чтобы соединить А- и В-цепи инсулина, включают ферментные субстраты, такие как субстраты катепсина В, катепсина D, трипсина, тромбина, субтилизина, фактора Ха и энтерокиназы; линкеры, которые увеличивают растворимость, гибкость и/или внутриклеточное расщепление, такие как (Gly_mSer)_n и (Ser_mGly)_n, в которых m является числом от 1 до 6, предпочтительно от 1 до 4, более предпочтительно от 2 до 4, а n является числом от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 4 (см., например, международную заявку РСТ WO 96/06641, в которой приведены примеры линкеров). В некоторых вариантах осуществления может быть использовано несколько линкеров, чтобы применить интересующие свойства каждого линкера.

3. Экспрессия.

Полипептиды инсулина и деградирующего гиалуронан фермента могут быть получены любым способом, известным специалистам в данной области, включая способы in vivo и in vitro. Интересующие белки могут быть экспрессированы в любом организме, подходящем для получения требуемого количества и формы белков, например, необходимых для введения и лечения. Экспрессионные организмы включают прокариотические и эукариотические организмы, такие как E.coli, дрожжи, растения, клетки насекомых, клетки млекопитающих, в том числе клеточные линии человека, и трансгенных животных. Экспрессионные организмы могут отличаться по уровню получения белков, а также типам посттрансляционных модификаций, которые присутствуют на экспрессированных белках. Выбор экспрессионного организма может быть сделан на основе этих и других факторов, таких как соображения нормативного регулирования и безопасности, себестоимости и необходимости и методов очистки.

Многие экспрессионные векторы доступны и известны специалистам в данной области и могут быть использованы для экспрессии белков. Выбор экспрессионного вектора будет зависеть от выбора хозяина системы экспрессии. В целом, экспрессионные векторы могут включать транскрипционные промоторы и, необязательно, энхансеры, сигналы трансляции, сигналы терминации транскрипции и трансляции. Экспрессионные векторы, используемые для стабильной трансформации, обычно имеют селективный маркер, который обеспечивает селекцию и поддержание трансформированных клеток. В некоторых случаях для амплификации числа копий вектора могут быть использованы ориджины репликации.

Растворимые полипептиды гиалуронидазы могут также быть использованы или экспрессированы в виде слитых белков. Например, слитый фермент может быть получен путём добавления дополнительного функционального участка. Примеры слитых белков-ферментов включают, но не ограничиваются ими, белки, слитые с сигнальными последовательностями, например, сигналами локализации, например, his6меткой или myc-меткой, или последовательностями для очистки, например, слитые с GST, и последовательностью для направления секреции белка и/или ассоциации с мембраной.

а). Прокариотические клетки.

Прокариоты, особенно Е. coli, обеспечивают систему для получения больших количеств белка. Трансформация Е. coli является простым и быстрым способом, хорошо известным специалистам в данной области. Экспрессионные векторы для Е. coli могут содержать индуцируемые промоторы, которые включают промоторы, которые являются удобными для индуцирования высоких уровней экспрессии белка и для экспрессии белков, которые проявляют некоторую токсичность для клеток-хозяев. Примеры индуцируемых промоторов включают lac-промотор, trp-промотор, гибридный tac-промотор, Т7 и SP6 РНК-промоторы и регулируемый температурой XPL-промотор.

Белки, такие как любой указанный здесь белок, могут быть экспрессированы в цитоплазме Е. coli. Цитоплазма является восстановительной средой, и для некоторых молекул это может стать причиной образования нерастворимых телец включения. Восстанавливающие агенты, такие как дитиотреитол и βмеркаптоэтанол, и денатурирующие агенты, такие как гуанидин-HCl и мочевина, могут быть использованы для восстановления растворимости белков. Альтернативный подход состоит в экспрессии белков в периплазматическом пространстве бактерий, которое является окислительной средой и содержит шаперонинподобные белки и дисульфидизомеразы, что может привести к образованию растворимого белка. Как правило, чтобы направить экспрессию белка в периплазму, с белком сливают лидерную последовательность. Лидерная последовательность затем удаляется сигнальными пептидазами внутри периплазмы. Примеры периплазматических лидерных последовательностей включают лидер pelB гена пектат-лиазы и лидер, полученный из гена щелочной фосфатазы. В некоторых случаях периплазматическая экспрессия приводит к утечке экспрессированного белка в культуральную среду. Секреция белков обеспечивает быструю и простую очистку от культурального супернатанта. Белки, которые не секретируются, могут быть получены из периплазмы после осмотического лизиса. Подобно цитоплазматической экспрессии в некоторых случаях белки могут стать нерастворимыми, и денатурирующие и восстанавливающие агенты могут быть использованы, чтобы способствовать растворению и ренатурации. Температура индукции и роста также может влиять на уровни экспрессии и растворимость, как правило, используется интервал температур между 25 и 37°С. Как правило, бактерии производят агликозилированные белки. Таким образом, если белки требуют гликозилирования для выполнения своей функции, гликозилирование может

- 91 033472 быть осуществлено in vitro после очистки из клеток-хозяев.

b) . Дрожжевые клетки.

Дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis и Pichia pastoris, являются хорошо известными экспрессионными организмами, которые могут быть использованы для получения белков, таких как любой из описанных здесь. Дрожжи можно трансформировать эписомальными реплицирующимися векторами или путем стабильной хромосомной интеграции методом гомологичной рекомбинации. Как правило, для регулирования экспрессии генов используют индуцируемые промоторы. Примеры таких промоторов включают GAL1, GAL7 и GAL5 и промоторы металлотионеина, такие как CUP1, АОХ1 или другие промоторы Pichia или других дрожжей. Экспрессионные векторы часто включают селектируемый маркер, такой как LEU2, TRP1, HIS3 и URA3 для отбора и поддержания трансформированной ДНК. Белки, экспрессируемые в дрожжах, часто являются растворимыми. Совместная экспрессия с шаперонинами, такими как Bip, и протеиндисульфидизомеразой, может улучшить уровни экспрессии и растворимость. Кроме того, белки, экспрессированные в дрожжах, могут быть направленно секретированы с помощью слияния с сигнальным секреторным пептидом, таким как секреторный сигнал дрожжевого фактора спаривания альфа Saccharomyces cerevisae, и слияния с поверхностными белками клетки дрожжей, такими как рецептор адгезии спаривания Aga2p или глюкоамилаза Arxula adeninivorans. Чтобы затем удалить слитые последовательности от экспрессированных полипептидов, когда они выходят из секреторного пути, может быть добавлен сайт расщепления протеазой, как, например, протеазой Kex-2. Дрожжи также способны к гликозилированию по Asn-X-Ser/Thr мотивам.

c) . Клетки насекомых.

Клетки насекомых, в частности система бакуловирусной экспрессии, полезны для экспрессии полипептидов, таких как полипептид гиалуронидазы. Клетки насекомых экспрессируют высокие уровни белка и способны к большинству посттрансляционных модификаций, используемых высшими эукариотами. Бакуловирусы имеют ограниченный круг хозяев, что повышает безопасность и снижает нормативные требования к эукариотической экспрессии. Типичные векторы экспрессии используют промотор для экспрессии высокого уровня белка, такой как промотор полиэдрина бакуловируса. Обычно используемые бакуловирусные системы включают бакуловирусы, такие как вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) и вирус ядерного полиэдроза Bombyx mori (BmNPV), и клеточные линии насекомых, такие как Sf9, полученные из Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) и Danaus plexippus (DpN1). Для высокого уровня экспрессии нуклеотидная последовательность экспрессируемой молекулы должна быть вставлена непосредственно после инициаторного кодона полиэдрина вируса. Сигналы секреции млекопитающих точно процессируются в клетках насекомых и могут быть использованы для секреции экспрессированного белка в культуральную среду. Кроме того, клеточные линии Pseudaletia unipuncta (A7S) и Danaus plexippus (DpN1) продуцируют белки с гликозилированием, аналогичным таковому в клеточных системах млекопитающих.

В качестве альтернативной системы экспрессии в клетках насекомых используются стабильно трансформированные клетки. Для экспрессии могут быть использованы клеточные линии, такие как Schneider 2 (S2), Kc (Drosophila melanogaster) и С7 (Aedes albopictus). Промотор металлотионеина дрозофилы может быть использован для того, чтобы обеспечивать высокие уровни экспрессии при индукции тяжелыми металлами кадмием или медью. Векторы экспрессии обычно поддерживают с помощью селективных маркеров, таких как неомицин и гигромицин.

d) . Клетки млекопитающих.

Системы экспрессии млекопитающих могут быть использованы для экспрессии белков, в том числе растворимых полипептидов гиалуронидазы. Экспрессионные конструкции могут быть доставлены в клетки млекопитающих путём вирусной инфекции, такой как аденовирусная инфекция, или путем прямого переноса ДНК, например с помощью липосом, фосфата кальция, DEAE-декстрана и физических способов, таких как электропорация и микроинъекция. Экспрессионные векторы для клеток млекопитающих, как правило, включают в себя сайт кэпирования мРНК, ТАТА-бокс, последовательность инициации трансляции (консенсусная последовательность Козака) и сигналы полиаденилирования. Чтобы обеспечить бицистронную экспрессию другого гена, например, селективного маркера, также могут быть добавлены IRES элементы. Такие векторы часто включают промоторы-энхансеры транскрипции для высокого уровня экспрессии, например промотор-энхансер SV40, промотор цитомегаловируса человека (CMV) и длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса (RSV). Эти промоторы-энхансеры активны во многих типах клеток. Тканеспецифичные и клеточно-специфичные промоторные и энхансерные участки также могут быть использованы для экспрессии. Примеры участков промотора/энхансера включают, но не ограничиваются ими, последовательности из генов, таких как гены эластазы I, инсулина, иммуноглобулина, вируса опухоли молочной железы мыши, альбумина, а-фетопротеина, а-1-антитрипсина, βглобина, основного белка миелина, легкой цепи миозина 2 и гена контроля рилизинг-фактора гонадотропного гормона. Для отбора и поддержания клеток с экспрессионной конструкцией могут быть использованы селективные маркеры. Примеры селективных маркерных генов включают, но не ограничиваются ими, гены гигромицин-В-фосфотрансферазы, аденозиндезаминазы, ксантин-гуанин- 92 033472 фосфорибозилтрансферазы, аминогликозид-фосфотрансферазы, дигидрофолатредуктазы (DHFR) и тимидинкиназы. Например, экспрессия может быть осуществлена в присутствии метотрексата для селекции только тех клеток, которые экспрессируют ген DHFR. Слияние с сигнальными молекулами клеточной поверхности, такими как TCR-ζ и FceRI-γ, может направить экспрессию белков в активном состоянии на поверхности клетки.

Многие клеточные линии подходят для экспрессии в клетках млекопитающих, в том числе клеточные линии мыши, крысы, человека, обезьяны, курицы и хомяка. Типичные клеточные линии включают, но не ограничиваются таковыми, СНО, HeLa, Balb/3T3, МТ2, мышиные NS0 (не секретирующие) и другие линии клеток, миеломные, гибридомные и гетерогибридомные клеточные линии, лимфоциты, фибробласты, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2В8 и HKB клетки. Доступны также клеточные линии, адаптированные к бессывороточной среде, что облегчает очистку секретируемых белков из клеточной культуральной среды. Примеры включают клетки CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat#l 1619-012) и бессывороточную клеточную линию EBNA-1 (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42). Также доступны клеточные линии, которые способны расти в специальных средах, оптимизированных для максимальной экспрессии. Например, DG44 СНО клетки приспособлены расти в суспензионной культуре в химически полученной среде без животных компонентов.

е). Растения.

Трансгенные растительные клетки и растения могут быть использованы для экспрессии белков, таких как любой из описанных здесь белков. Экспрессионные конструкции, как правило, вводят в растения с применением прямого переноса ДНК, например, бомбардировкой микрочастицами и ПЭГ опосредованной передачей в протопласты, и агробактериальной трансформацией. Экспрессионные векторы могут включать промотор и энхансер, элементы терминации транскрипции и элементы контроля трансляции. Экспрессионные векторы и способы трансформации, как правило, различаются для двудольных растений-хозяев, таких как Arabidopsis и табак, и для однодольных растений-хозяев, таких как кукуруза и рис. Примеры промоторов растений, используемых для экспрессии, включают промотор вируса мозаики цветной капусты, промотор нопалин-синтазы, промотор рибулозобисфосфаткарбоксилазы и промоторы убиквитина и UBQ3. Селективные маркеры, такие как гены гигромицина, фосфоманнозоизомеразы и неомицинфосфотрансферазы, часто используются для облегчения селекции и поддержания трансформированных клеток. Трансформированные растительные клетки можно поддерживать в культуре клеток, в виде агрегатов (каллусная ткань), и регенерировать в целые растения. Трансгенные растительные клетки могут также включать водоросли, разработанные для получения полипептида гиалуронидазы. Поскольку растения имеют типы гликозилирования, отличающиеся от таковых в клетках млекопитающих, это может повлиять на выбор получения белка в этих организмах.

4. Способы очистки.

Способ очистки полипептидов, в том числе полипептидов инсулина и деградирующего гиалуронан фермента или других белков из клеток-хозяев, будет зависеть от выбранных клеток-хозяев и систем экспрессии. В случае секретируемых молекул, белки, как правило, очищают от культуральной среды после удаления клеток. При внутриклеточной экспрессии клетки могут быть лизированы, а белки очищены из экстракта. Когда для экспрессии используют трансгенные организмы, такие как трансгенные растения и животные, то в качестве исходного материала, чтобы подготовить лизированный экстракт клеток, могут быть использованы ткани или органы. Кроме того, получение белка в трансгенных животных может включать получение полипептидов в молоке или яйцах, которые могут быть собраны и, если необходимо, белки могут быть извлечены и дополнительно очищены с применением стандартных методов в данной области.

Белки, такие как полипептиды инсулина или деградирующего гиалуронан фермента, могут быть очищены с применением стандартных методов очистки белков, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь, SDS-PAGE, фракционирование по размеру и гель-хроматографию, осаждение сульфатом аммония и ионообменную хроматографию, такую как анионообменную хроматографию. Для повышения эффективности очистки и чистоты препаратов также могут быть использованы аффинные способы очистки. Например, в аффинной очистке могут быть использованы антитела, рецепторы и другие молекулы, которые связываются с ферментом гиалуронидазой. Экспрессионные конструкции также могут быть сконструированы таким образом, чтобы добавить к белку аффинную метку, такую как myc-эпитоп, слияние с GST или His6, после чего белки могут быть аффинно очищены с помощью антител к myc, глутатионовой смолы и Ni-смолы соответственно. Чистота может быть оценена любым способом, известным в данной области, в том числе гель-электрофорезом, методами ВЭЖХ (HPLC), окрашиванием и спектрофотометрическими методами.

I. Методы оценки стабильности и активности.

Разные методы анализа могут быть использованы для оценки стабильности препаратов или совместных композиций, представленных здесь, в том числе совместных композиций, представленных здесь, содержащих быстродействующий инсулин и деградирующий гиалуронан фермент. С помощью таких анализов можно оценить стабильность и активность деградирующего гиалуронан фермента и/или стабильность, активность и растворимость быстродействующего инсулина в совместных композициях. Та- 93 033472 кие анализы могут быть использованы, например, для определения стабильности совместных композиций с течением времени при определённых температурах хранения и условиях, путем оценки активности, растворимости и стабильности (например, образования агрегатов и т.д.) перед хранением, а затем в различные моменты времени в процессе хранения. Анализы также могут быть использованы, чтобы внести незначительные коррективы в композиции, представленные здесь, с сохранением при этом стабильности обоих активных агентов.

1. Инсулин.

Стабильность и растворимость инсулина в совместных композициях, представленных здесь, можно оценить с использованием методов и анализов, хорошо известных в данной области техники. Например, стабильность и растворимость инсулина можно оценить визуально, с помощью кислотного осветления, оптической микроскопии, обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RPHPLC), биоанализа in vivo и гель-хроматографии (SEC) в денатурирующих и не денатурирующих условиях. В одном примере растворимость и стабильность инсулина определяется путем визуальной оценки, включая изменения цвета, прозрачности, наличие агрегатов или слипания и адгезии, или налипания вещества, на сосуд, содержащий совместные композиции, представленные в данном документе. Визуальные изменения подтверждаются кислотным осветлением, при котором отсутствие растворения после подкисления подтверждает наличие нерастворимого денатурированного инсулина в совместных композициях, представленных здесь. Визуальные изменения в совместных композициях инсулина, представленных здесь, также могут быть подтверждены с помощью оптической микроскопии и/или микрографии люминесцентной подсветкой. Кажущаяся растворимость быстродействующего инсулина в совместных композициях, представленных здесь, может быть оценена, например, с помощью RP-HPLC, что описано в примере 3. В методах, указанных в примере 3, кажущаяся растворимость определяется как процент обнаруживаемого инсулина после хранения в различных условиях и в течение различных временных интервалов. Процент обнаружения определяется в сравнении с эталонным образцом. Кроме того, с помощью RP-HPLC могут быть определены продукты деградации инсулина, такие как дезамидоинсулин. В одном примере стабильность инсулина в совместных композициях, предусмотренных в настоящем документе, оценивали путем определения образования агрегатов с помощью гель-хроматографии (см., например, пример 4). В этом примере SEC используется для определения присутствия высокомолекулярных белков, т.е. агрегатов.

Активность инсулина может быть оценена с использованием методов и анализов, хорошо известных в данной области. Например, способность инсулина, в том числе композиций и совместных композиций инсулина, действовать в качестве терапевтического агента, может быть оценена in vitro или in vivo. Например, для определения способности инсулина связываться с инсулиновым рецептором могут быть использованы анализы in vitro, хорошо известные в данной области. В одном примере выполняется анализ конкурентного связывания, в котором мембраны клеток плаценты человека, которые используют в качестве источника рецепторов инсулина, инкубируют с меченным радиоактивным изотопом человеческим инсулином совместно с немеченым аналогом инсулина или без него. Затем, чтобы определить способность аналога инсулина конкурировать за связывание и рассчитать относительное сродство аналога инсулина к инсулиновому рецептору плаценты, детектируют количество связанного меченого инсулина (см., например, Weiss et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:40018-40024). В таком анализе конкурентного связывания также могут быть использованы другие источники инсулиновых рецепторов, в том числе другие клетки, которые естественным путем или рекомбинантно экспрессируют рецептор инсулина (Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258).

Способность инсулина стимулировать абсорбцию глюкозы или обеспечивать любые другие его типичные метаболические эффекты может быть оценена in vitro. Для измерения стимулируемой инсулином абсорбции глюкозы адипоциты инкубируют с меченой глюкозой, например 2-дезокси-И-[2,6-3Н]глюкозой или D-[U-14C]-глюкозой совместно с инсулином или без него. Для определения количества потребляемой глюкозы в присутствии или в отсутствие инсулина измеряют включившуюся радиоактивную метку (Louveau et al., (2004) J. Endocrin. 181:271-280, Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258). При оценке активности аналога инсулина активность инсулина человека также может быть оценена и использована для сравнения. Также могут быть выполнены анализы in vitro для оценки продукции глюкозы в клетках H4IIE в присутствии инсулина (Wang et al., (2000) J. Biochem., 275:14717-14721, Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258).

Также для оценки терапевтической активности инсулина, в том числе композиций инсулина и совместных композиций, могут быть проведены исследования in vivo с использованием моделей больных диабетом или здоровых животных или человека в качестве субъекта исследования. Инсулин можно вводить животным с моделью диабета для оценки влияния на уровень глюкозы в крови, циркулирующих уровней инсулина и гемоглобина A1c (HbA1c), например форм гемоглобина A1c, которые появляются при повышенном уровне глюкозы в крови. Уровень HbA1c в пробе крови может быть оценен, например, с помощью HPLC, ELISA, RIA или другими методами иммуноанализа. Нормальные значения HbA1c для здоровых людей составляют примерно 4,0-6,2%. Американская Ассоциация Диабета рекомендует поддерживать это значение ниже 7% (или ниже 6% у определенных лиц) для пациентов с сахарным диабе- 94 033472 том, чтобы помочь предотвратить осложнения, вызываемые диабетом. Уровни инсулина могут быть измерены, например, с помощью ELISA или RIA. Уровни глюкозы, как правило, измеряют с помощью глюкометра или датчика глюкозы.

Модели диабета типа 1 на животных включают диабетическую мышь без ожирения (NOD) и крысу BioBreeding (BB) (Atkinson et al., (1999) Nature Med. 5:601-604). Модели диабета типа 2 на животных, включают, но не ограничиваются ими, ob/ob мышей и db/db мышей, имеющих мутации в гене лептина или рецептора лептина, соответственно, мышей KK, Nagoya-Shibata-Yasuda (NSY) мышей, диабетических тучных (ZDF) крыс Zucker и крыс Gato-Katazaki (GK) (Cefalu (2006) ILAR Journal 47:186-198). В других примерах для тестирования активности инсулина совместно с деградирующим гиалуронан ферментом или без него используют здоровых животных.

2. Деградирующие гиалуронан ферменты.

Активность деградирующего гиалуронан фермента можно оценить, используя методы, хорошо известные в данной области. Например, анализ USP XXII для гиалуронидазы косвенно определяет активность пугем измерения количества не деградированного гиалуронана, или гиалуроновой кислоты (HA), оставшегося через 30 мин при 37°С после добавления фермента к HA (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). Раствор эталонного стандарта гиалуронидазы (USP) или стандарта гиалуронидазы Национального формуляра (NF) может быть использован в анализе по определению активности (в единицах) любой гиалуронидазы. В одном примере активность измеряют с использованием микротурбидиметрического анализа. Данный метод основан на образовании нерастворимого осадка при связывании гиалуроновой кислоты с сывороточным альбумином. Активность измеряют путем инкубации с гиалуронидазой гиалуронана натрия (гиалуроновой кислоты) в течение заданного периода времени (например, 10 минут) с последующим осаждением не деградированного гиалуронана натрия при добавлении подкисленного сывороточного альбумина. Мутность полученного образца измеряют при 640 нм после дополнительного периода инкубации. Уменьшение мутности в результате действия гиалуронидазы на субстрат гиалуронан натрия является мерой ферментативной активности гиалуронидазы (см., например, пример 2).

В другом примере активность гиалуронидазы измеряют с помощью микротитровального теста, в котором после инкубации с гиалуронидазой определяется остаточное количество биотинилированной гиалуроновой кислоты (см., например, Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, опубликованная заявка США № 20050260186). Свободные карбоксильные группы в остатках глюкуроновой кислоты гиалуроновой кислоты биотинилируют, и биотинилированная гиалуроновая кислота как субстрат ковалентно связывается с планшетом для микротитрования. После инкубации с гиалуронидазой остаточное количество субстрата биотинилированной гиалуроновой кислоты детектируют с помощью авидинпероксидазной реакции и сравнивают со значением, полученным в реакции со стандартами гиалуронидазы известной активности. Другие анализы для определения активности гиалуронидазы также известны в данной области и могут быть использованы в методах данного документа (см., например, Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).

Также можно оценить способность деградирующего гиалуронан фермента действовать в качестве распространяющего или диффундирующего агента. Например, краситель трипановый синий может быть введен подкожно совместно с деградирующим гиалуронан ферментом или без него в бок с каждой стороны голой мыши. Затем, чтобы определить возможность применения деградирующего гиалуронан фермента в качестве распространяющего агента, измеряют, например, с помощью микроштангенциркуля, площадь кожи, в которой распространился краситель (опубликованная заявка США № 20060104968). Влияние совместного введения гиалуронидазы и другого агента, такого как инсулин, на фармакокинетические и фармакодинамические свойства этого агента также можно оценить in vivo с использованием модели на животных и/или на людях, например, при проведении клинического испытания. Функциональную активность деградирующего гиалуронан фермента, который не является гиалуронидазой, можно сравнить с активностью гиалуронидазы с использованием любого из этих методов. Это может быть сделано для того, чтобы определить функционально эквивалентное количество деградирующего гиалуронан фермента. Например, возможность использования деградирующего гиалуронан фермента в качестве распространяющего или диффундирующего агента может быть определена при введении его с трипановым синим под кожу на боку мыши; может быть определено количество фермента, необходимое для достижения такого же эффекта диффузии, как, например, при введении 100 единиц эталонного стандарта гиалуронидазы. Определяемое количество деградирующего гиалуронан фермента, следовательно, функционально эквивалентно 100 единицам гиалуронидазы.

Стабильность деградирующих гиалуронан ферментов в композициях, например, в совместных композициях, представленных здесь, также можно оценить с помощью других методов и анализов, известных в данной области. Например, стабильность может быть оценена путем определения активности гиалуронидазы, как описано выше и в примере 2, путём визуального контроля, как описано выше, с помощью определения процента обнаружения и чистоты белка с течением времени, что измеряется методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP- HPLC) (см., например, Пример 3), и путём определения кажущейся температуры плавления. Чистота белка, определяемая с помо- 95 033472 щью RP-HPLC, представляет собой процент основной формы деградирующего гиалуронан фермента в совместной композиции, например rHuPH20, в сравнении с другими присутствующими формами гиалуронидазы. Процент обнаружения - это относительное процентное содержание гиалуронидазы в совместной композиции с течением времени и при различных условиях хранения по сравнению с эталонным образцом. В одном случае температура плавления гиалуронидазы в совместных композициях, представленных здесь, определяется путем измерения гидродинамического радиуса частиц методом динамического рассеяния света (см., например, пример 7b). Увеличение размера частиц и снижение температуры плавления указывает на денатурацию и последующую агрегацию гиалуронидазы. Стабильность гиалуронидазы в совместных композициях, представленных здесь, может быть определена путем измерения окисления гиалуронидазы, такой как rHuPH20, путём RP-HPLC. Процент окисления является величиной, равной сумме площадей главного (ох-1) и минорного (ох-2) пиков (см., например, пример 10b). Другие способы, известные специалисту в данной области, которые могут быть использованы для определения стабильности гиалуронидазы в совместных композициях, представленных здесь, включают электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE), иммуноблоттинг, спектроскопию ядерного магнитного резонанса (NMR), масс-спектрометрию, круговой дихроизм (CD) и флуоресцентные методы на основе красителей.

J. Терапевтическое применение.

Совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, описанные здесь, могут быть использованы для лечения любого состояния, для которого используется быстродействующий инсулин. Совместные композиции могут вводиться подкожно для лечения какихлибо состояний, которые поддаются лечению инсулином. В этом разделе приведены примеры терапевтического применения быстродействующего инсулина. Терапевтическое применение, описанное ниже, представляет собой примеры и не ограничивает применение совместных композиций, описанных в данном документе. Терапевтическое применение включает, но не ограничивается лечением сахарного диабета 1 типа, сахарного диабета 2 типа, гестационного диабета и контролем гликемии у больных в критическом состоянии. Например, совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента можно вводить подкожно в виде дискретных доз, например, с помощью шприца или инсулиновой шприц-ручки до еды в качестве прандиальной инсулиновой терапии у пациентов с сахарным диабетом для контроля гликемии. Совместные композиции можно также вводить подкожно или интраперитонально с помощью инсулиновой помпы или системы с обратной связью для постоянного контроля уровня глюкозы в крови в течение дня и ночи и/или для контроля гликемических отклонений после приема пищи. Выявление таких заболеваний или состояний находится в компетенции лечащего врача.

Как обсуждалось выше, конкретные дозировки и схемы лечения, как правило, индивидуальны для каждого субъекта. Если необходимо, конкретный протокол дозирования и длительности лечения может быть определен эмпирически или экстраполирован. Например, в способах, предусмотренных в настоящем документе, для определения соответствующих доз предусмотренных в настоящем документе совместных композиций в качестве отправной точки можно использовать типичные дозы быстродействующего инсулина без деградирующего гиалуронан фермента. Уровни дозировки могут быть определены на основе различных факторов, таких как вес тела индивидуума, общее состояние здоровья, возраст, активность конкретного используемого соединения, пол, диета, метаболическая активность, концентрация глюкозы в крови, время введения, скорость выведения, комбинация лекарств, тяжесть и течение заболевания, предрасположенность пациента к болезни, а также решение лечащего врача. В частности, уровень глюкозы в крови, который измеряется глюкометром, может быть измерен и использован для определения количества инсулина и деградирующего гиалуронан фермента для введения и достижения контроля гликемии. В данной области известны алгоритмы, которые могут использоваться, чтобы определить дозу на основе скорости абсорбции и уровня абсорбции совместных композиций быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, предусмотренных в настоящем документе, а также на основании уровня глюкозы в крови. Дозы инсулина для гликемического контроля после приёма пищи (постпрандиального гликемического контроля) также могут быть рассчитаны или отрегулированы, например, путем определения содержания углеводов в еде (см., например, Bergenstal et al., (2008) Diabetes Care 31:1305-1310, Lowe et al., (2008) Diabetes Res. Clin. Pract. 80:439-443, Chiesa et al., (2005) Acta Biomed. 76:44-48).

1. Сахарный диабет.

Сахарный диабет (или диабет) характеризуется нарушениями метаболизма глюкозы. Уровень глюкозы в крови опосредован углеводами, всасываемыми в кишечнике и производимыми в печени. Повышение уровня глюкозы в крови стимулирует высвобождение инсулина. После приема пищи приток глюкозы может быть от 20 до 30 раз выше, чем уровень, опосредуемый продукцией глюкозы печенью, наблюдаемый между приемами пищи. Ранняя фаза высвобождения инсулина продолжительностью около 10 мин подавляет выработку глюкозы в печени и предшествует длительной (поздней) фазе высвобождения инсулина, которая длится два часа и более и охватывает приток углеводов во время приема пищи. Между приемами пищи низкий непрерывный уровень инсулина, базальный инсулин, охватывает текущие метаболические потребности, в частности регулирует выработку глюкозы в печени, а также утили

- 96 033472 зацию глюкозы в жировой, мышечной ткани и других целевых органах. У пациентов с сахарным диабетом наблюдается повышенный уровень глюкозы в крови (гипергликемия). Диабет можно разделить на две основные группы: диабет типа 1 и диабет типа 2. Диабет типа 1, или инсулинозависимый сахарный диабет (IDDM), характеризуется потерей продуцирующих инсулин β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, что приводит к дефициту инсулина. Основной причиной дефицита β-клеток являются Т-клеточные аутоиммунные заболевания. Сахарный диабет 2 типа, или инсулинонезависимый сахарный диабет (NIDDM), возникает у пациентов с нарушениями функции β-клеток. Такие пациенты имеют резистентность или пониженную чувствительность к инсулину в сочетании с пониженной секрецией инсулина. Диабет 2 типа может развиться совместно с диабетом типа 1. Кроме того, к диабету относится гестационный диабет. Пациентам с сахарным диабетом может быть введен инсулин, чтобы поддерживать базальный уровень инсулина и предотвращать гликемические отклонения, такие как после приема пищи.

a) . Диабет 1 типа.

Диабет 1 типа является Т-клеточным аутоиммунным заболеванием, характеризующимся инфильтрацией островков Лангерганса, эндокринных единиц поджелудочной железы, и уничтожением β-клеток, что приводит к дефициту выработки инсулина и гипергликемии. Диабет 1 типа чаще всего диагностируется у детей и молодых взрослых, но может быть диагностирован в любом возрасте. У пациентов с сахарным диабетом 1 типа может проявляться в дополнение к низкому уровню инсулина и высокому уровню глюкозы в крови, полиурия, полидипсия, полифагия, затуманенное зрение и усталость. Диагностирование может быть проведено путем обнаружения уровня глюкозы в плазме крови натощак на уровне или выше 126 мг/дл (7,0 ммоль/л), уровня глюкозы в плазме не ниже 200 мг/дл (11,1 ммоль/л) через два часа после 75 г пероральной нагрузки глюкозой, например, в тесте на толерантность к глюкозе и/или случайного уровня глюкозы в плазме на уровне или выше 200 мг/дл (11,1 ммоль/л).

Первичным лечением пациентов с сахарным диабетом 1 типа является введение инсулина в качестве заместительной терапии, которая обычно проводится в сочетании с мониторингом уровня глюкозы в крови. Без достаточной заместительной терапии может развиваться диабетический кетоацидоз, что может привести к коме или смерти. Пациентам могут быть введены подкожные инъекции быстродействующего инсулина, с применением, например, шприца или инсулиновой шприц-ручки, или инсулиновой помпы для поддержания надлежащего уровня глюкозы в крови в течение дня, а также для контроля уровня глюкозы после приема пищи. В некоторых случаях для доставки инсулина внутрибрюшинно может быть использована инсулиновая помпа, в том числе система с обратной связью. Таким образом, чтобы быстрее контролировать уровень глюкозы и инсулина в крови, пациентам с сахарным диабетом 1 типа можно вводить совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, описанного здесь, подкожно или внутрибрюшинно с помощью шприца, инсулиновой шприц-ручки или инсулиновой помпы (насоса) или любым другим способом, подходящим для доставки инсулина.

b) . Диабет 2 типа.

Диабет 2 типа связан с резистентностью к инсулину и, в некоторых группах населения, ещё и с инсулинопенией (потерей функции β-клеток). При диабете 2 типа 1 фаза высвобождения инсулина отсутствует, а 2 фаза высвобождения задерживается и является неадекватной. У пациентов с сахарным диабетом 2 типа резкий всплеск высвобождения инсулина, происходящий у здоровых людей во время еды, задерживается, является увеличенным по продолжительности и является недостаточным, в результате чего возникает гипергликемия. Пациентам с сахарным диабетом 2 типа может быть введен инсулин для контроля уровня глюкозы в крови (Mayfield et al. (2004) Am Fam Physican 70:489-500). Это может быть сделано в сочетании с другой терапией и режимами лечения, в том числе диетой, физическими упражнениями и другими антидиабетическими подходами (например, применением сульфонилмочевины, бигуанидов, меглитинидов, тиазолидиндионов и ингибиторов α-глюкозидазы). Таким образом, чтобы быстрее контролировать уровень глюкозы и инсулина в крови, пациентам с сахарным диабетом 2 типа могут быть введены совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, описанные здесь, подкожно или внутрибрюшинно через шприц, инсулиновую шприц-ручку или инсулиновый насос (помпу) или любым другим способом, подходящим для доставки инсулина.

c) . Гестационный диабет.

Беременные женщины, которые раньше никогда не имели диабет, но которые имеют высокий уровень глюкозы в крови во время беременности, имеют диагноз гестационный диабет. Этот тип диабета затрагивает примерно 1-14% всех беременных женщин в зависимости от изучаемой популяции (Carr et al. (1998) Clinical Diabetes 16). В то время как основная причина остается неизвестной, вполне вероятно, что гормоны, вырабатываемые во время беременности, снижают чувствительность беременной женщины к инсулину. Механизм резистентности к инсулину, вероятно, является пострецепторным дефектом, поскольку было показано нормальное связывание инсулина инсулин-чувствительными клетками. Поджелудочная железа вырабатывает в 1,5-2,5 раза больше инсулина, чтобы реагировать на возросшую резистентность к инсулину. У пациентов с нормальной функцией поджелудочной железы эти потребности

- 97 033472 восполняются. У пациентов с пограничными функциями поджелудочной железы секретируется незначительно большее количество инсулина и, следовательно, обеспечивается недостаточный уровень инсулина. Гестационный диабет, таким образом, проявляется тогда, когда есть задержка или недостаточная секреция инсулина в присутствии возрастающей периферической резистентности к инсулину.

Пациентам с гестационным диабетом можно вводить инсулин для контроля уровня глюкозы в крови. Таким образом, пациентам с гестационным диабетом для более быстрого контроля уровня глюкозы и инсулина в крови могут быть введены совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, описанные здесь, подкожно с помощью шприца, инсулиновой шприц-ручки, инсулиновой помпы или искусственной поджелудочной железы или любыми другими средствами.

2. Терапия инсулином для пациентов в критическом состоянии.

Гипергликемия и инсулинорезистентность часто встречаются в медицинской и/или хирургической практике у пациентов в критическом состоянии и связаны с ухудшением состояния и смертностью как у страдающих диабетом, так и у не страдающих диабетом пациентов и у больных с травматическими повреждениями, инсультом, гипоксическим повреждением мозга, острым инфарктом миокарда, после операций на сердце и другими критическими заболеваниями (McCowen et al. (2001) Crit. Clin. Care 17:107124). Пациентов в критическом состоянии с гипергликемией подвергали терапии инсулином для контроля уровня глюкозы в крови. Такая терапия может улучшить состояние и снизить смертность среди этой группы (Van den Berghe et al. (2006) N. Eng. J. Med. 354:449-461). Инсулин обычно вводят пациенту внутривенно, например, путем инъекции с помощью шприца практикующим врачом или путем инфузии с помощью инсулиновой помпы. В некоторых примерах для расчета дозы используют алгоритмы и программное обеспечение. Таким образом, пациентам в критическом состоянии с гипергликемией можно вводить совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, описанные здесь, для того чтобы контролировать уровень глюкозы в крови и тем самым облегчать гипергликемию и улучшать их состояние и снижать смертность.

K. Комбинированная терапия.

Любые совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, описанные здесь, могут быть введены в комбинации, перед, с перерывами или после других терапевтических агентов или процедур, включая, но не ограничиваясь ими, другие биопрепараты и низкомолекулярные соединения. Для любого заболевания или состояния, в том числе для всех примеров, которые приведены выше, для которых показан или был использован быстродействующий инсулин и для которых доступны другие агенты и способы лечения, указанные агенты и способы могут быть дополнительно использованы с совместными композициями настоящего изобретения. В зависимости от заболевания или состояния, подлежащего лечению, примеры других терапевтических агентов включают, но не ограничиваются ими, другие антидиабетические препараты, включая, но не ограничиваясь ими, сульфонилмочевины, бигуаниды, меглитиниды, тиазолидиндионы, ингибиторы α-глюкозидазы, пептидные аналоги, в том числе аналоги глюкагонподобного пептида (GLP), аналоги желудочного ингибирующего пептида (GIP) и ингибиторы DPP-4. В другом примере совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента по изобретению могут быть введены в комбинации совместно, до, с перерывами или после одного или нескольких других инсулинов, в том числе быстродействующего инсулина и инсулина базального действия.

L. Изделия и наборы.

Совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента, описанные в данном документе, могут быть упакованы как изделия, содержащие упаковочный материал, фармацевтическую композицию, которая эффективна в отношении контроля уровня глюкозы в крови, например, у больных сахарным диабетом или субъектов в критическом состоянии, и этикетку, которая указывает, что совместные композиции должны быть использованы для контроля уровня глюкозы в крови.

Изделия, представленные здесь, содержат упаковочные материалы. Упаковочные материалы для использования в качестве упаковки для фармацевтических продуктов хорошо известны специалистам в данной области. См., например, патенты США №№ 5323907, 5052558 и 5033252, каждый из которых полностью включен в настоящее описание. Примеры фармацевтических упаковочных материалов включают, но не ограничиваются ими, блистерные упаковки, бутылки, пробирки, ингаляторы, насосы, сумки, флаконы, шприцы, контейнеры, колбы и любой упаковочный материал, подходящий для выбранного препарата и предполагаемого способа введения и лечения.

Совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента также могут быть предоставлены в виде набора. Наборы могут включать в себя совместную композицию, описанную в данном документе, и элемент для введения. Наборы могут также включать в себя дополнительные фармацевтические композиции. В одном примере наборы могут включать в себя одну или несколько совместных композиций, представленных здесь, и одну или несколько других композиций инсулина, таких как, например, инсулин замедленного или промежуточного времени действия, в том числе кристаллические инсулины или любые их комбинации. Совместные композиции быстродействующего инсулина и деградирующего гиалуронан фермента могут быть доставлены с помощью устройства для введения, например шприца, инсулиновой шприц-ручки, насоса или резервуара, который встав- 98 033472 ляется в инсулиновую шприц-ручку, насос или другое устройство доставки. Набор может при необходимости включать инструкции по применению, включающие дозировки, режимы дозирования и инструкции по способам введения. Наборы могут также включать совместную композицию, описанную в данном документе, и элемент для диагностики. Например, такие наборы могут включать в себя датчик глюкозы или глюкометр.

М. Примеры.

Следующие примеры включены только как иллюстративный материал и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Пример 1. Исходный препарат инсулина и аналога инсулина.

A. Регулярный инсулин.

В случае регулярного инсулина порошок (Organon Insulin API, рекомбинантный человеческий инсулин SIHR 143) взвешивают и смешивают с соответствующим количеством воды до концентрации инсулина в растворе около 10-25 мг/мл. К смеси добавляют 1М HCl до конечной концентрации 20 мМ. Раствор осторожно перемешивают мешалкой до тех пор, пока инсулин полностью не растворится, и добавляют 250 мМ раствор Трис, pH 10,7 (Trizma, Cat. No. T6066, Sigma) до конечной концентрации 20 мМ. Затем доводят pH с помощью 1М NaOH и добавляют воду, так что получается препарат инсулина, описанный в каждом из отдельных примеров ниже. Этот инсулин содержит приблизительно 13 мкг/мл цинка.

B. Аналоги инсулина.

В случае аналогов инсулина (инсулина аспарт или инсулина лизпро) 12 флаконов (по 10 мл) с коммерческим продуктом (инсулин лизпро: Eli Lilly Хумалог® (инсулин лизпро) 100 ед/мл, Lot A572364; инсулин аспарт: Novo Nordisk, Новорапид® (инсулин аспарт), Lot XS60195; инсулин глулизин: Апидра® инсулин) объединяли и концентрировали с помощью колоночных концентраторов Amicon Ultracel-10 K (инсулин лизпро) или 3K (инсулин аспарт) до тех пор, пока конечная концентрация не стала примерно в 5 раз выше исходной концентрации. Аналоги инсулина осаждали добавлением 1М ацетата натрия, pH 5,3 и 30 мМ хлорида цинка (ZnCl₂, EMD, Cat. № ZX0065-1) в 1/10 объема раствора белка. Растворы помещали на лед на 30 мин, после чего центрифугировали при 5600 об/мин в течение 20 мин на центрифуге Avanti JE с качающимся бакетным ротором JS-5.3 (Beckman Coulter). Супернатант декантировали, а осадок повторно суспендировали и промывали раствором, содержащим 20 мМ ацетата натрия, 2 мМ хлорида цинка с pH 5,5. Ресуспендированный раствор центрифугировали, как описано выше. Стадию промывки повторяли в общей сложности 5 раз. Конечную промывку проводили раствором, содержащим 20 мМ ацетата натрия, pH 5,5, чтобы удалить хлорид цинка. Полученную массу белка растворяли в растворе, содержащем 20 мМ HCl. После полного растворения добавляли 250 мМ Трис, pH 10,7 до конечной концентрации 20 мМ. Затем доводили pH конечного раствора, так что получался препарат аналога инсулина, описанный в каждом из отдельных примеров ниже, и конечная концентрация белка составила около 1520 мг/мл. Аналог инсулина, полученный таким способом, обычно имеет выход около 90% с остаточной концентрацией консерванта в 100 раз меньшей, чем в исходном материале.

Пример 2. Определение активности гиалуронидазы rHuPH20.

Активность гиалуронидазы rHuPH20 (получена путём экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 36-482, и последующей секреции в клетках СНО; SEQ ID NO: 1) определяли методом турбидиметрического анализа. В первых двух тестах (А и В) активность гиалуронидазы rHuPH20 была измерена путем инкубирования растворимой rHuPH20 с гиалуронатом натрия (гиалуроновой кислотой) и последующим осаждением нерасщеплённого гиалуроната натрия при добавлении подкисленного сывороточного альбумина. В третьем тесте (С) активность гиалуронидазы rHuPH20 была определена по способности формировать нерастворимый осадок при связывании гиалуроновой кислоты (HA) с цетилпиридинхлоридом (СРС). Во всех тестах активность rHuPH20 составляла 600 ед./мл (5 мкг/мл), критерием приемлемости была ферментативная активность выше 375 ед./мл.

А. Микротурбидиметрический анализ.

В этом анализе активность гиалуронидазы rHuPH20 была измерена путем инкубации растворимой rHuPH20 с гиалуронатом натрия (солью гиалуроновой кислоты) в течение заданного периода времени (10 мин) с последующим осаждением нерасщеплённого гиалуроната натрия при добавлении подкисленного сывороточного альбумина. Мутность полученного образца измеряли при 640 нм после 30-минутной инкубации. Уменьшение мутности в результате ферментативной активности по отношению к гиалуронату натрия было мерой активности растворимой гиалуронидазы rHuPH20. Метод применяли с использованием калибровочной кривой, полученной путём разведений эталонного стандарта растворимой rHuPH20; измерения активности пробы были сделаны относительно этой калибровочной кривой. Разведения образца были подготовлены в растворе для разведения ферментов. Раствор для разведения фермента получали растворением 33,0±0,05 мг гидролизованного желатина в 25,0 мл 50 мМ реакционного буфера PIPES (140 мМ NaCl, 50 мМ PIPES, pH 5,5), 25,0 мл стерильной воды для инъекций (SWFI; Braun, номер продукта R5000-1), 0,2 мл 25% раствора человеческого сывороточного альбумина (US Biologicals) и встряхивания смеси в течение 30 с. Раствор готовили в течение 2 ч до применения и хранили на льду до

- 99 033472 применения. Образцы разбавляли примерно до 1-2 ед./мл. Как правило, однократное максимальное разбавление не превышало 1:100, и начальный объём образца для первого разбавления был не менее 20 мкл. Минимальные объемы проб, необходимые для выполнения анализа, составляли образцы в процессе анализа, фракции FPLC - 80 мкл; культуральные супернатанты - 1 мл; концентрированный материал - 80 мкл; очищенный или конечный материал - 80 мкл. Разведения были сделаны в трех повторностях в 96луночном планшете с низким связыванием белка, и по 30 мкл каждого разбавления было перенесено в черные планшеты Optilux с прозрачным дном (BD Biosciences).

С целью получения стандартной кривой растворы известной растворимой rHuPH20 с концентрацией 2,5 ед./мл готовили с применением раствора для разведения образцов и добавляли в планшет Optilux в трех повторностях. Разведения составляли 0, 0,25, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 и 2,5 ед./мл. Лунки без реагента, которые содержали по 60 мкл раствора для разведения фермента, использовали в качестве отрицательного контроля. Затем планшет закрывали и нагревали на нагревательном блоке в течение 5 мин при 37°С. Крышку снимали и встряхивали планшет в течение 10 с. После встряхивания планшет вновь помещали на нагревательный блок и в устройство MULTIDROP 384 Liquid Handling Device добавляли теплый 0,25 мг/мл раствор гиалуроната натрия (приготовлен растворением 100 мг гиалуроната натрия (LifeCore Biomedical) в 20,0 мл SWFI, полученную смесь осторожно перемешивали вращением и/или покачиванием при 2-8°С в течение 2-4 ч или до полного растворения). Реакционный планшет помещали в MULTIDROP 384 и инициировали реакцию нажатием пусковой клавиши, что приводило к добавлению 30 мкл гиалуроната натрия в каждую лунку. Планшет затем удаляли из MULTIDROP 384 и встряхивали в течение 10 с с открытой крышкой, а затем закрывали и переносили на нагревательный блок. Планшет инкубировали при 37°С в течение 10 мин.

MULTIDROP 384 подготавливали для прекращения реакции, помещая в неё рабочий раствор сыворотки и меняя установленный объём до 240 мкл (25 мл исходного раствора сыворотки [1 объем лошадиной сыворотки (Sigma) разводили 9 объемами 500 мМ ацетатного буферного раствора и доводили pH до 3,1 соляной кислотой] растворяли в 75 мл 500 мМ ацетатного буферного раствора). Планшет снимали с нагревательного блока и помещали в MULTIDROP 384 и добавляли по 240 мкл рабочего раствора сыворотки в каждую лунку. Планшет снимали и встряхивали в течение 10 с. Еще через 15 мин измеряли мутность образцов при 640 нм; активность гиалуронидазы (в ед./мл) каждого образца была определена путем сравнений со стандартной кривой.

Удельная активность (ед./мг) рассчитывалась путем деления активности гиалуронидазы (ед./мл) на концентрацию белка (мг/мл).

В. Турбидиметрический анализ для определения ферментативной активности rHuPH20.

Пробы разводили раствором для разведения фермента [66 мг гидролизованного желатина (Sigma#G0262) растворяли в 50 мл фосфатного буфера (25 мМ фосфата, pH 6,3, 140 мМ NaCl) и 50 мл деионизированной (DI) воды] до ожидаемой концентрации фермента от 0,3 до 1,5 ед./мл.

Каждую из двух стандартных пробирок с метками Standard 1, 2, 3, 4, 5 или 6 и двух тестовых пробирок для каждого анализируемого образца (обозначенные соответственно) помещали в нагревательный блок на 37°С. К пробиркам Standard в двух повторностях добавляли раствор для разведения фермента, объем которого приведен в следующей таблице. Ко всем стандартным и анализируемым образцам добавляли по 0,50 мл раствора субстрата HA [1,0 мл раствора гиалуроновой кислоты (ICN#362421) в деионизированной воде с концентрацией 5 мг/мл, 9 мл DI воды, 10 мл фосфатного буфера]. Затем в пробирки Standard в двух повторностях добавляли указанные в табл. 7 ниже объемы 1,5 ед./мл USP стандартного раствора гиалуронидазы (USP#31200) в растворе для разведения фермента. Когда все пробирки со стандартным раствором были заполнены, по 0,50 мл каждого образца помещали в каждую из двух тестовых пробирок. После 30-минутной инкубации при 37°С в стандартные пробирки добавляли по 4,0 мл рабочего раствора сыворотки {50 мл исходного раствора сыворотки [смешивали 1 объем лошадиной сыворотки (донорное стадо, проверена на культуре клеток, проверена на культуре гибридомы, происхождение США) и 9 объёмов 500 мМ ацетатного буфера с pH 3,1, оставляли при комнатной температуре в течение 18-24 ч, хранили при температуре 4°С] и 150 мл 500 мМ ацетатного буфера}, пробирки затем убирали из нагревательного блока, перемешивали и оставляли при комнатной температуре. Тестовые пробирки были обработаны таким же образом, так что все стандартные пробирки и тестовые пробирки были обработаны одинаково.

Раствор для отрицательного контроля получали смешиванием 0,5 мл раствора для разведения фермента, 0,25 мл DI воды, 0,25 мл фосфатного буфера и 4,0 мл рабочего раствора сыворотки. Раствор перемешивали и аликвоту переносили в одноразовую кювету. Этот образец использовали в качестве нулевого на спектрофотометре при 640 нм.

После 30-минутной инкубации при комнатной температуре аликвоту из каждой пробирки Standard переносили, в свою очередь, в одноразовую кювету и измеряли оптическую плотность при 640 нм. Эту процедуру повторяли для повторностей тестовых пробирок.

Линейная калибровочная кривая была получена при построении графика концентрации гиалуронидазы (ед./мл) против наблюдаемой оптической плотности. Для аппроксимации данных и для определения наклона, точки пересечения и коэффициента корреляции (R²) был использован линейный регрессионный

- 100 033472 анализ (за исключением данных для 0,0 ед./мл калибровочного стандарта). Уравнение регрессии стандартной кривой и наблюдаемую абсорбцию образца использовали для определения концентрации образца.

Таблица 7

Разведения для стандартов фермента

Стандарт	ед/мл	Раствор для разведения образца, мл	1,5 ед/мл USP гиалуронидазы, мл
1	0,0	0,50	0
2	0,3	0,40	0,10
3	0,6	0,30	0,20
4	0,9	0,20	0,30
5	1,2	0,10	0,40
6	1,5	0	0,50

С. Турбидиметрический анализ ферментативной активности rHuPH20.

Турбидиметрический метод для определения активности гиалуронидазы и концентрации фермента основан на формировании нерастворимого осадка, когда гиалуроновая кислота (HA) связывается с хлоридом цетилпиридиния (СРС). Активность определяли путем инкубации гиалуронидазы с гиалуроновой кислотой в течение установленного периода времени (30 мин) с последующим осаждением нерасщеплённого гиалуронана добавлением СРС. Мутность полученного образца измеряли при 640 нм, и уменьшение мутности в результате ферментативной активности для субстрата HA было мерой активности гиалуронидазы. В данном методе используется калибровочная кривая, полученная при анализе разведений эталонной rHuPH20, и измерения активности образца были сделаны по отношению к калибровочной кривой. Этот метод был предназначен для анализа активности rHuPH20 в растворах после разбавления до концентрации ~2 ед./мл. Количественный диапазон составлял от 0,3 до 3 ед./мл, хотя обычный оптимум концентраций для метода находится в диапазоне от 1 до 3 ед./мл.

Готовили свежий раствор для разбавления фермента, растворяя 100±10 мг гидролизата желатина (Sigma#G0262) в 75 мл реакционного буферного раствора (140 мМ NaCl, 50 мМ свободной кислоты PIPES (1,4-пиперазин-бис-(2-этаносульфоновая кислота)), pH 5,3) (Mallinckrodt#V249) и 74,4 мл стерильной воды для промывания (SWFI) с добавлением 0,6 мл 25% сывороточного альбумина (HSA). Пустой образец для спектрофотометрии получали, добавляя 1,0 мл раствора для разбавления фермента в тестовую пробирку и помещая ее в нагревательный блок, предварительно нагретый до 37°С. Разбавленный стандарт для сравнения готовили разбавлением 1:25 рабочего стандарта для сравнения rHuPH20 в трёх повторностях: 120 мкл рабочего стандарта для сравнения в 29,880 мл раствора для разведения фермента. Соответствующие разведения каждого образца были приготовлены в трех повторностях с получением раствора ~2 ед./мл.

Раствор для разведения фермента добавляли в трех повторностях в пробирки Standard в соответствии с табл. 8. Во все пробирки за исключением пустого образца вносили по 500 мкл 1,0 мг/мл раствора гиалуроната натрия (Lifecore, #81, со средней молекулярной массой 20-50 кДа) в SWFI; эти пробирки поместили в нагревательный блок при 37°С на 5 мин. В соответствующие стандартные пробирки добавляли разбавленный стандарт для сравнения, как указано в табл. 7, содержимое пробирок перемешивали и пробирки вновь помещали в нагревательный блок. По 500 мкл каждого образца вносили в соответствующие пробирки в трех повторностях. Через 30 мин после начала реакции в первой стандартной пробирке во все пробирки (в том числе в пустой образец) было добавлено по 4,0 мл раствора для остановки реакции (5,0 мг/мл хлорида цетилпиридиния (Sigma, Cat#C-5460), растворенного в SWFI и пропущенного через фильтр 0,22 мкм), содержимое пробирок затем перемешивали и оставляли при комнатной температуре.

На спектрофотометре устанавливали нулевое значение поглощения при фиксированной длине волны 640 нм. После 30 мин инкубации при комнатной температуре примерно 1 мл стандарта или анализируемого образца переносили в одноразовую кювету для определения оптической плотности при 640 нм. Полученные значения для стандартов сравнения и анализируемых образцов были обработаны с применением компьютерного программного обеспечения GRAPHPAD PRISM® (Hearne Scientific Software) с помощью функции экспоненциального распада, ограниченной значением 0 при полном распаде. Была определена стандартная кривая с наилучшим соответствием, она использовалась для расчета соответствующих концентраций образцов.

- 101 033472

Таблица 8

Разведения для стандартов фермента

Стандарт	ед/мл	Раствор для разведения фермента (мкл)	Разведённый стандарт для сравнения (мкл)
1	0,0	500	0
2	0,6	400	100
3	1,2	300	200
4	1,8	200	300
5	2,4	100	400
6	3,0	0	500

Пример 3. RP-HPLC.

В данном примере для определения кажущейся растворимости инсулина и его аналогов и процента чистоты rHuPH20 была использована обращенно-фазовая HPLC (RP-HPLC). Кажущаяся растворимость была измерена как процент обнаружения инсулина по сравнению с начальными композициями/условиями.

Эталонные стандарты.

Для регулярного инсулина в качестве стандарта использовали Хумулин® (инсулин регулярный, 100 ед.). Для инсулина лизпро растворяли один флакон USP лизпро в 1,72 мл 0,01н. HCl и получали эталонный стандарт с концентрацией 3,5 мг/мл USP лизпро (100 ед./мл). Для инсулина аспарт растворяли один флакон ЕР аспарт в 1,00 мл 0,01н. HCl, в результате чего получали эталонный стандарт с концентрацией 3,89 мг/мл ЕР аспарт. Для rHuPH20 были использованы три эталонных стандарта, каждый из которых содержит 2,5 мкг/мл, 5,0 мкг/мл или 7,5 мкг/мл rHuPH20, полученные путем разбавления образца rHuPH20 с концентрацией 50 мкг/мл (Lot HUB0701EB) соответствующим количеством разбавителя для образцов (20 мМ Трис, 130 мМ NaCl, 0,01% полоксамера 188, pH 7,3).

Стандарты консервантов.

Использовали три эталонных консерванта, каждый из которых содержит 0,05% м-крезола/фенола, 0,10% м-крезола/фенола или 0,15% м-крезола/фенола.

Подготовка образцов.

Пробы разводили, при необходимости, разбавителем для образцов таким образом, чтобы концентрация инсулина/аналога инсулина составила 100 ед./мл, а rHuPH20 - 5 мкг/мл. Образцы готовили, отбирая по 100 мкл из каждого флакона в каждый момент времени с последующим центрифугированием перед нанесением. Образцы хранили в автоматическом устройстве для отбора проб при 4°С до использования и считали стабильными в течение 3 дней после получения. Все образцы были проанализированы в двух повторностях.

В случае инсулина наносили по 20 мкл на каждый анализ HPLC. В случае rHuPH20 наносили по 100 мкл на каждый анализ HPLC. Параметры HPLC-колонки и метода приведены в табл. 9 ниже. Градиент HPLC приведён в табл. 10 ниже.

Таблица 9

Параметры HPLC-колонки и метода

Колонка	Phenomenex Jupiter С5 4,6 х 250 мм, 5 мкМ, ЗООА или Agilent Zorbax 300SB-C18 4,6 х 250 мм (Cat No. 880995-902)
Объём нанесения	20 мкл для инсулина и 100 мкл для rHuPH20
Пустой объём	10 мкл подвижной фазы В
Температура колонки	40°С± 1°С
Термостат для образцов	4°С ± 3°С
Длина волны детекции, λ	280 нм
Подвижная фаза А	0,1 % раствор трифторуксусной кислоты (TFA) в воде
Подвижная фаза В	0,1 % раствор TFA в ацетонитриле
Время анализа	39 минут
Хранение колонки	100 % ацетонитрил

- 102 033472

Таблица 10

Градиент HPLC

Время	Поток	% А	%В
0	1,0	72	28
3	ι,θ	72	28
20	1,0	65	35
29	1,0	15	85
29,1	1,0	0	100
34	1,0	0	100
34,1	1,0	72	28
39	1,0	72	28

A. Растворимость инсулина.

Для определения относительной растворимости интегрировали и объединяли друг с другом площади основного пика инсулина/аналога инсулина и пика дезамидоинсулина, рассчитывая процентное отношение к стандарту. Растворимость была выражена в виде процентного отношения к стандарту, где 100% соответствует 120 ед./мл. Данные были обработаны с использованием приложения Design-Expert® 7.0 (StatEase) и функции накопленные данные. Процент чистоты инсулина был представлен как процент основной формы инсулина относительно всех форм инсулина.

B. Процент чистоты и процент обнаружения rHuPH20.

Процент чистоты rHuPH20 был представлен как процент rHuPH20 относительно всех форм rHuPH20. Процент обнаружения rHuPH20 был представлен как процент относительно стандарта, где 100% соответствует 5 мкг/мл. Целевой показатель составляет 3-7 мкг/мл (60-140%).

Пример 4. Гель-хроматография.

В этом примере композиции инсулин/rHuPH20 анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной гель-хроматографии (эксклюзионной хроматографии) (SEC-HPLC) для определения относительных количеств белка с высокой молекулярной массой (HMWP), т.е. ковалентно связанных агрегатов инсулина и rHuPH20, присутствующих в образце. В случае денатурирующей SEC подвижной фазой был раствор L-аргинина и ледяной уксусной кислоты в ацетонитриле. В случае неденатурирующей SEC, которая была использована, как описано в примере 29, подвижной фазой являлся фосфатно-солевой буфер.

А. Денатурирующая SEC.

1. Эталонные стандарты.

Хумулин® R (регулярный инсулин, Lilly, концентрированный, NDC 0002-8501-01) или USP человеческий инсулин (USP Cat # I1F270) и rHuPH20 (lot HUA0703MA или HUB0701EB с удельной активностью 120000 ед./мг и 110000 е.д/мг соответственно) были использованы в качестве эталонных стандартов. Стандартные образцы, содержащие инсулин и rHuPH20, были приготовлены с концентрациями, аналогичными ожидаемым концентрациям проб, т.е. 100 ед./мл инсулина и 5 мкг/мл rHuPH20. Жидкие препараты разводили в 25 мМ Трис разбавителе, pH 7,3. Взвешенные количества USP человеческого инсулина разводили в Трис разбавителе, содержащем TFA (2 мкл TFA/мл Трис). Стандартные образцы хранили в пробирках для HPLC при 10°С до использования.

2. Подготовка образцов.

При необходимости образцы разводили в Трис разбавителе таким образом, чтобы концентрация инсулина составила 1-100 ед./мл, и концентрация rHuPH20 составила 1-1000 мкг/мл. Образцы хранили в пробирках для HPLC при 10°С до использования не более 3 дней.

3. Подготовка HPLC.

Подвижную фазу готовили смешиванием 650 мл 1,0 мг/мл L-аргинина, 150 мл ледяной уксусной кислоты и 200 мл ацетонитрила. Параметры HPLC-колонки и метода приведены в табл. 11 ниже. Пик rHuPH20 появляется примерно через 13,8 мин и пик инсулина появляется примерно через 20,2 мин.

- 103 033472

Таблица 11

Параметры HPLC-колонки и метода

Колонка	Waters Insulin HMWP, 300 мм х 7,8 мм (Cat # 201549)
Скорость потока	0,6 мл/мин
Объём нанесения	100 мкл
Пустой объём	100 мкл подвижной фазы, Трис, Трис TFA
Температура колонки	25°С± 1°С
Термостат для образцов	ю°с±з°с
Длина волны детекции, λ	280 нм
Время анализа	30 мин
Хранение колонки	20% этанол

В. Не денатурирующая SEC.

1. Эталонные стандарты.

Хумалог® 100 (инсулин лизпро, Eli Lilly, Cat # VL-1510), NovoLog® 100 (инсулин аспарт Novo Nordisk, Cat # 750111) и rHuPH20 (lot T09RD02 [удельная активность 122000 ед./мг], HUA0703MA [удельная активность 120000 ед./мг] или HUB0701EB [удельная активность 122000 ед./мг]) были использованы в качестве эталонных стандартов. Стандартные образцы, содержащие инсулин и rHuPH20, были приготовлены в концентрациях, аналогичных ожидаемым концентрациям проб, т.е. 100 ед./мл инсулина и 5 мкг/мл rHuPH20. Стандартные образцы хранили в пробирках для HPLC при 10°С до использования.

2. Подготовка образцов.

При необходимости образцы разводили разбавителем для образцов (20 мМ Трис, 130 мМ NaCl, 0,01% полоксамера 188, pH 7,3) таким образом, чтобы концентрация инсулина составила 1-100 ед./мл и концентрация rHuPH20 составила 1-20 мкг/мл. Образцы хранили в пробирках для HPLC при 10°С до использования не более 3 дней.

3. Подготовка HPLC.

0,5х фосфатно-солевой буфер (PBS) готовили разбавлением 10х PBS водой для HPLC. Параметры HPLC-колонки и метода приведены в табл. 12 ниже. Пик rHuPH20 появляется примерно через 13 мин, а пик инсулина появляется примерно через 18,6 мин.

Таблица 12

Параметры HPLC-колонки и метода

Колонка	Waters Insulin HMWP, 300 мм х 7,8 мм (Cat # 201549)
Скорость потока	0,5 мл/мин
Объём нанесения	30 мкл
Пустой объём	30 мкл подвижной фазы, разбавитель для образцов, 0,1 н НС1
Температура колонки	25°С± 1°С
Термостат для образцов	10°С±3°С
Длина волны детекции, λ	280 нм
Время анализа	30 мин
Хранение колонки	20% этанол

С. Процент чистоты инсулина.

Процент чистоты инсулина был выражен как процентное отношение основного пика инсулина ко всем пикам инсулина. Целевое значение составляет менее 2% белка с высокой молекулярной массой, т.е. агрегатов инсулина.

Пример 5. Методы определения осмолярности, мутности и pH.

В этом примере описаны методы, используемые для определения внешнего вида, осмотического давления, мутности и pH композиций инсулина/аналога инсулина и rHuPH20. Эти методы использовали в последующих примерах.

А. Внешний вид.

1. Визуальный анализ.

Внешний вид композиций инсулина/rHuPH20 определялся путём качественного визуального анализа раствора инсулина/rHuPH20 в стеклянной пробирке типа I. Оценку окраски и прозрачности раствора осуществляли в сравнении с таковыми для стерильной воды для промывки (SWFI) USP (или эквивалента). Водный раствор определялся как прозрачный, если его прозрачность была такой же, как и у SWFI. Водный раствор определялся как бесцветный, если он имел внешний вид SWFI. Пробирки анализировали при комнатной температуре и были приняты меры для предотвращения излишнего завихрения жидкости и/или появления пузырьков воздуха в растворах во время перемешивания и/или переворачивания. При необходимости пробирки протирали нелиняющими или безворсовыми салфетками и 70% этанолом перед анализом. Методика была следующей. Включали направленный источник света с лампой мощно

- 104 033472 стью 150 Вт и выше. Образцы готовили в ламинаре. Образцы, подлежащие анализу, аккуратно переворачивали для обеспечения однородности перед перенесением >0,5 мл в стеклянную пробирку типа I для тестирования с помощью асептической техники. Образец SWFI готовили таким же образом. Подготовленные пробирки с анализируемыми образцами и SWFI осторожно переворачивали, не допуская образования пузырьков воздуха, для обеспечения однородности. Цвет пробирок с анализируемыми образцами и SWFI визуально сравнивали на белом фоне с источником света, падающим под углом через дно пробирок. Раствор считали бесцветным, если он выглядел так же, как SWFI. Прозрачность пробирок с анализируемыми образцами и SWFI визуально сравнивали на черном фоне с источником света, падающим под углом через дно пробирок. Раствор считали прозрачным, если его прозрачность была такой же, как и у SWFI. Цвет, прозрачность и наличие и величина каких-либо видимых частиц и/или посторонних веществ фиксировали. Приемлемым являлся прозрачный бесцветный раствор.

2. Метод подсветки.

В этом методе степень прозрачности и окраски жидкостей была оценена для обеспечения (визуального) качества продукции относительно действующих требований внешнего вида. Проверку проводили в специально предназначенной для проверки камере с высокой интенсивностью света на белом и черном фоне. Жидкость являлась прозрачной, если её опалесценция не превышала таковую у стандартной суспензии I. Водный раствор являлся бесцветным, если он имел внешний вид воды или был не более интенсивно окрашен, чем указанный контрольный раствор (эталонный раствор В9).

Подготовка эталонных растворов.

Эталонные цветные растворы были получены путем смешивания разбавленной соляной кислоты и ЕР цветового стандарта В (стандартный раствор Брауна, Ricca Chemical, # 2880), как указано в табл. 13 ниже. Эталонные растворы B₉, B₈, B₇, B6 хранили в 2 мл пробирках, герметично закрытых пробкой и запечатанных. Растворы для сравнения готовили ежедневно. 2 мл SWFI было помещено в пробирку, закрытую пробкой и запечатанную, которая может храниться до 1 года.

Эталонные прозрачные растворы готовили следующим образом.

Первичную опалесцирующую суспензию получали путем смешивания 25 мл гексаметилентетрамина (2,5 г в 25 мл SWFI) и 25 мл сульфата гидразина (1 г в 100 мл SWFI) и давали раствору отстояться в течение 24 ч. Суспензию хранили до 2 месяцев в стеклянном сосуде. Стандартный или опалесцирующий раствор готовили путём разбавления 45 мкл первичного опалесцирующего раствора в 2955 мкл SWFI с последующим перемешиванием. Этот раствор стабилен в течение 3 месяцев. Эталонные суспензии I и II были получены путем смешивания стандартного или опалесцирующего раствора и SWFI, как указано в табл. 13 ниже. Эталонную суспензию хранили в 2 мл пробирках, герметично закрытых пробкой и запечатанных, готовили ежедневно.

Таблица 13

Эталонные растворы

Цвет	3,3 м НС1 (мкл)	ЕР Цветовой Стандарт В (мкл)
Эталонный раствор В9	2970	30
Эталонный раствор В8	2955	45
Эталонный раствор В7	2925	75
Эталонный раствор Вб	2850	150
Прозрачность	SWFI (мкл)	Стандарт опалесценции (мкл)
Эталонная суспензия I	2850	150
Эталонная суспензия II	2700	300

Образцы продукта были получены путём перемешивания раствора продукта с последующим перенесением в 2 мл пробирку в ламинаре класса 100. Пробирки закрывали пробкой и запечатывали. Камеру для визуального анализа подготавливали и проверяли интенсивность источника света, чтобы она составляла более 1750 Люкс. Образцы продукта сравнивали с эталонными растворами и суспензиями при визуальном анализе. Цвет сравнивали с SWFI и эталонными растворами B6, B₇, B₈ и В₉, смотрели горизонтально на белом фоне. Прозрачность сравнивали с эталонными суспензиями I и II, смотрели вертикально на черном фоне. Степень окраски и прозрачности и степени опалесценции были зафиксированы, что изложено в табл. 14 ниже.

- 105 033472

Таблица 14

Степень окрашивания, прозрачности и опалесценции

Степень окрашивания	Описание
Бесцветный	Образец продукта имеет цвет SWFI или не более интенсивно окрашен, чем эталонный раствор В9
Менее окрашен, чем Βχ, и более окрашен, чем Βχ+ι; X = 6, 7 или 8	Образец продукта менее окрашен, чем Βχ, но более окрашен, чем Β(χ+ΐ)
Окрашен как Βχ; X = 6, 7 или 8	Образец продукта окрашен, как Βχ, где X = 6, 7 или 8
Более окрашен, чем Вб	Образец продукта более окрашен, чем эталонный раствор Вб
Прозрачность и степень опалесценции	Описание
Прозрачный	Опалесценция образца продукта менее выражена, чем в эталонной суспензии I
Менее прозрачный, чем эталонная суспензия I, и более прозрачный, чем эталонная суспензия II	Прозрачность образца продукта является промежуточной относительно прозрачности двух эталонных суспензий (I и II).
Менее прозрачный, чем эталонная суспензия II	Прозрачность образца продукта меньше, чем таковая эталонной суспензии II

B. Осмотическая концентрация.

Осмотическую концентрацию (осмотическое давление) определяли путем измерения понижения точки замерзания. Метод предназначен для анализа водного раствора с осмотической концентрацией от 100 до 500 мОсм/кг воды. Осмометрия понижения температуры замерзания включает отбор образца анализируемого раствора в пробирку и размещение пробирки в холодильной камере осмометра. Образец переохлаждают (охлаждают ниже точки замерзания), а затем кристаллизуют (инициируют кристаллизацию) одним из ряда способов (т.е. путём механической вибрации ультразвуковых колебаний, теплового шока или путем добавления твердых кристаллических частиц). Температура образца возрастает из-за теплоты плавления, высвобождаемой в процессе замораживания до состояния равновесия; в этот момент только небольшая часть воды замерзает, после чего остальная вода продолжает замерзать, и температура начинает падать снова, в результате чего образуется плоская область, или плато, на кривой охлаждения. Температура на плато является точкой замерзания образца и может быть преобразована в единицы осмотического давления (осмотической концентрации); причём 1,0 Осмоль понижает точку замерзания воды на 1,858°С, где 1,0 Осмоль =1,0 моль осмотически активных частиц = Ф(п) (С), где

Ф = осмотический коэффициент;

n = число частиц в результате диссоциации каждой молекулы в растворе;

С = концентрация каждой молекулы в моль/кг воды.

Проверка калибровки (0-2000 мОсм/кг воды) была выполнена до каждого использования осмометра (MicroOsmette Freeze Point Osmometer, Model #5004, Precision Systems Inc.) со стандартами 500 и 200 мОсм/кг. После первого включения прибор прогревали в течение 10-15 мин для полного уравновешивания температуры. Образцы, зонд и проволоку для затравки протирали Kimwipe до каждого использования. Образцы для анализа были приготовлены путём отбора 50 мкл раствора инсулина/rHuPH20 в чистую сухую пробирку. Пробирку помещали в холодильную камеру и измеряли осмотическое давление в соответствии со стандартом действующей методики. Эту методику повторяли еще два раза в общей сложности, чтобы получить три независимых результата для образца инсулин/rHuPH20. Полученные данные для каждого анализа был записаны, и анализ считался действительным, если все три показания были в пределах ± 5 мОсм/кг. Определяли среднее значение для каждого образца. Осмолярность изменяется в зависимости от композиции, и приемлемые критерии перечислены ниже в каждом отдельном примере.

C. Мутность.

Мутность определяли путем измерения оптической плотности раствора инсулина/rHuPH20 при длине волны 350 нм. Когда свет проходит через раствор, его интенсивность ослабляется за счёт поглощения и эффекта светорассеяния. Для измерения эффекта светорассеяния за счёт белка в растворе была выбрана длина волны 350 нм, которая позволяет устранить поглощение света белком. Количество рассеянного света в значительной степени зависит от концентрации и размера молекул/частиц. OD350 чистого раствора, содержащего все компоненты, за исключением белка, вычитается для получения конечного значения. По 200 мкл образца из каждой анализируемой композиции инсулина/rHuPH20 было внесено в три соседние лунки 96-луночного плоскодонного микротитровального УФ-планшета. Для использования в качестве пустого образца в три соседние лунки микротитровального планшета было внесено по 200 мкл

- 106 033472 соответствующей смеси вспомогательных компонентов каждого образца (без белка). SWFI (200 мкл) была использована в качестве пустой лунки. OD350 каждого образца определяли в планшетном спектрофотометре UV-VIS SpectraMax 384plus (Molecule Devices). Каждое прочтение было записано, тройные значения были усреднены, и было учтено среднее поглощение соответствующего вспомогательного пустого образца, так что в результате были получены точные контрольные значения мутности.

D. pH.

pH измеряли, как описано в сборнике Фармакопеи США <791> (pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf24s0_c791.html). Критерии приемлемости варьировали в зависимости от композиции и приведены ниже для каждого отдельного примера. В целом, чтобы обеспечить растворимость инсулина и стабильность PH20, необходим жесткий контроль pH (т.е. ± 0,2). Тем не менее, в отсутствие консерванта растворимость инсулина не зависела от pH, поэтому диапазон этого критерия приемлемости широкий (т.е. pH от 7,0 до 7,8).

Пример 6. Стабильность rHuPH20 в коммерческих композициях инсулина и аналогов инсулина.

В этом примере стабильность rHuPH20 в коммерческих композициях инсулина и аналогов инсулина определяли путем измерения ферментативной активности rHuPH20 после хранения при температуре от 5 до 25°С. В целом, был приготовлен раствор с примерно 1500 ед./мл rHuPH20 в буфере, содержащем 10 мМ Hepes и 130 мМ NaCl, pH 7,0. Затем, чтобы получить смеси инсулина и rHuPH20 или аналога инсулина и rHuPH20 (10х разбавление препаратов инсулина, конечная концентрация rHuPH20 1350 ед./мл), к 3,6 мл раствора rHuPH20 добавляли 0,4 мл коммерческого Хумулина® (каждый мл содержит 100 ед. инсулина, 2,5 мг/мл м-крезола и 16 мл глицерина (Eli Lilly)) или Хумалога® (каждый мл содержит 100 ед. инсулина, 3,15 мг/мл м-крезола, 16 мг глицерина, 1,88 мг Na₂HPO₄, 0,0197 мг ионов цинка (оксид цинка), а также следовые количества фенола (Eli Lilly)). Эти растворы хранили при температуре от 5 до 25°С не более 1 недели. Ферментативную активность rHuPH20 измеряли в дни 0, 1, 2, 3 и 7, как описано в примере 2в выше. Результаты представлены в табл. 15 ниже. Как показано в табл. 15, снижение активности rHuPH20 на 50% наблюдалось в композиции Хумалог® и rHuPH20 (инсулин лизпро и rHuPH20) после её инкубации в течение 2 дней или дольше при 25°С. Значительной потери активности не наблюдалось в композиции Хумулин® и rHuPH20 при хранении при 25°С, по-видимому, из-за более низкого уровня консерванта в этом конкретном продукте и коэффициента разбавления.

Таблица 15

Ферментативная активность гНнРН20 в присутствии Хумулин® или Хумалог®

Образец	Ферментативная активность rHuPH20 (ед/мл)
0 день	1 день	2 день	3 день	7 день
Хумулин®-РН20, 5° С	1339	1383	1329	1430	1332
Хумулин®-РН20, 25°С	1318	1401	1325	1387	1308
Хумалог®-РН20, 5° С	1264	1202	1172	1239	1140
Хумалог®-РН20, 25° С	1305	966	740	763	248

Пример 7. Влияние консервантов на rHuPH20.

В этом примере различные стандартные консерванты инсулина и аналога инсулина были проанализированы в отношении их влияния на ферментативную активность и стабильность rHuPH20. Ферментативную активность rHuPH20 измеряли, как описано в примере 2 выше. В случае необходимости стабильность rHuPH20 определяли с помощью гель-хроматографии (SEC), как описано в примере 4 выше.

А. Ферментативная активность rHuPH20.

В этом примере стандартные консерванты инсулина и аналога инсулина фенол, м-крезол и метилпарабен были оценены по их влиянию на ферментативную активность rHuPH20 при различных концентрациях, температуре и времени. Каждый консервант был добавлен (до конечной концентрации, указанной в табл. 16 ниже) к образцу композиции инсулина/rHuPH20, содержащей 3,7 мг/мл инсулина (для получения концентрированного раствора использовался порошок Organon Insulin API [рекомбинантный инсулин человека SIHR 143], как описано в примере 1) и 20 мкг/мл rHuPH20 в 20 мМ Трис/HCl, pH 7,1 и 140 мМ NaCl. и образцы инкубировали при указанной температуре в течение заданного периода времени.

Результаты приведены в табл. 16 ниже; они определяют консервант и его концентрацию, время инкубации и температуру, а также ферментативную активность rHuPH20. Результаты зависят от температуры. Ферментативная активность rHuPH20 была значительно снижена после одной недели инкубации при 35°С, когда общий уровень консерванта был относительно высоким (>0,2%). В противоположность этому, при комнатной температуре (25°С) и более низких концентрациях консерванта rHuPH20 сохраняет свою относительную активность по меньшей мере в течение одного месяца. Как правило, с повышением уровня консерванта ферментативная активность rHuPH20 снижается. Кроме того, вероятно, что среди трех консервантов, м-крезол является наиболее вредным для rHuPH20, затем следуют фенол и метилпарабен.

- 107 033472

Таблица 16

Влияние различных консервантов и концентраций на активность rHuPH20 при повышении температуры

Консервант	Концентрация (%)	Ферментативная активность (ед/мл)
1 месяц, 25°С	1 неделя, 35°С	2 недели, 35°С
фенол	0,05	2103	2128	1996
фенол	0,1	1980	2094	1997
фенол	0,2	2128	1995	1822
фенол	0,4	1910	835	447
м-крезол	0,05	2103	2019	1955
м-крезол	0,1	2188	2147	2069
м-крезол	0,2	2013	466	185
м-крезол	0,4	<LOD	<LOD	<LOD
метилпарабен	0,05	2061	10582	10182
метилпарабен	0,1	1919	2085	1968
метилпарабен	0,2	2196	1927	1590
метилпарабен	0,31	2049	730	447
без консерванта	0,0	2006	1984	1994

LOD, уровень обнаружения;

¹метилпарабен не растворяется в концентрации 0,4%;

²эти значения оказались неожиданно низкими и рассматривались как выпадающие.

В. Кажущаяся температура плавления (Tm) rHuPH20.

В этом примере температуру плавления (Tm) rHuPH20 в присутствии и в отсутствие м-крезола, пропилпарабена или феноксиэтанола определяли путем измерения гидродинамического радиуса частиц, основываясь на явлении динамического светорассеяния. Размер частиц увеличивался предположительно из-за денатурации и последующего агрегирования rHuPH20 При повышении температуры белки денатурируют, что приводит к образованию агрегатов.

Таким образом, rHuPH20 (Lot HuB, концентрированный раствор с концентрацией 10 мг/мл) разбавляли до концентрации 1 мг/мл в 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5. Указанные консерванты вносили в образцы PH20 в виде 100% исходного раствора. Z-средний размер частиц определяли с помощью динамического светорассеяния с использованием Malvern Zeta Sizer Nano-ZS в зависимости от повышения температуры. В общей сложности было сделано по 3 измерения при каждой температуре в кварцевой кювете малого объёма (Helma, 3,00 мм). Начальная температура была равна 20°С, далее увеличивалась с шагом в 2°С до конечной температуры 66°С с 5-минутным периодом уравновешивания при каждой температуре. Интенсивность светорассеяния измеряли с помощью 173° детектора обратного рассеяния, и кумулятивное Zсреднее частиц рассчитывали с помощью программного обеспечения DTS (программное обеспечение для технологии дисперсии) с использованием преломления 1,45 для образцов белка и преломления 1,33 для воды в качестве диспергирующего агента. Точка перегиба на оси температур, при которой происходит значительное увеличение размера частиц, считается кажущейся Tm (температурой плавления), когда белок денатурировал и начинал агрегировать.

Результаты показаны в табл. 17 ниже, они определяют средний размер частиц при различных температурах в 5 различных композициях PH20, что отражено в табл. 17 ниже. Значения в табл. 17 являются средними для 3 измерений в каждой точке с шагом в 2°С после 5 мин уравновешивания. Результаты показывают, что Tm rHuPH20 понизилась с 40°С без консерванта до 26°С в присутствии 0,25% м-крезола. Аналогичная тенденция наблюдалась при использовании дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) для определения Tm rHuPH20 в присутствии м-крезола и без него, однако в этом случае Tm уменьшается только примерно на 2°С в присутствии 0,25% м-крезола.

- 108 033472

Таблица 17

Средний размер частиц rHuPH20 совместно с различными консервантами и без них при измерении путём динамического рассеяния света

Температура (°C)	rHuPH20	rHuPH20 + 0,25% мкрезола	rHuPH20 + 0,2% пропилпарабена	rHuPH20 + 1,0% феноксиэтанола	гНиРН20 + 0,5% феноскиэтанола
20	9,48	8,86	9,66	10,51	8,95
22	9,19	11,30	11,40	10,89	9,48
24	9,89	12,49	13,58	10,72	9,95
26	9,96	23,29	28,10	11,54	9,41
28	9,27	113,50	124,57	12,63	9,57
30	8,94	150,93	188,03	13,28	9,40
32	8,96	159,37	237,27	12,97	9,52
34	9,42	158,57	242,13	12,56	9,68
36	9,28	163,27	260,77	14,47	10,13
38	8,91	—	266,43	29,75	11,03
40	9,39	—	277,43	40,18	12,71
42	9,72	—	—	52,28	24,31
44	11,36	—	—	93,99	28,43
46	13,08	—	—	159,13	35,87
48	21,35	—	—	238,33	45,08
50	22,74	—	—	314,00	63,67
52	28,50	—	—	653,13	94,19
54	32,95	—	—	834,30	139,47
56	37,01	—	—	1060,73	——
Рассчитанная Тт	44°С	26°С	26°С	38°С	42°С

C. Аффинность связывания с rHuPH20.

Чтобы понять, как консерванты взаимодействуют с rHuPH20, был использован метод титрационной флуоресцентной спектроскопии для определения кажущейся аффинности связывания консервантов с rHuPH20. Это исследование проводили в Legacy BioDesign, LLC (Johnstown, CO).

Аналоги инсулина лизпро (USP эталонный стандарт, Cat. # 1342321) и аспарт (EU эталонный стандарт, Cat. # Y0000349) были получены в виде порошка и растворены в 857 мкл деионизированной воды (18 МОм) и 23 мкл 1М HCl. К каждому стандартному раствору добавляли 120 мкл 250 мМ Трис (pH 10,65), доводя pH до 7,4 и объем до 1 мл. Было приготовлено по 2,5 мл раствора каждого из стандартов с концентрацией 1 мг/мл, разбавленных 30 мМ Трис pH 7,4. Все растворы были прозрачными и бесцветными во время разведения, кроме стандарта USP инсулина лизпро, который был мутным при разбавлении, но становился прозрачным в течение часа после приготовления. Было приготовлено по два образца для инсулина аспарт и инсулина лизпро для эталонного стандарта и используемого материала. Спектры флуоресценции растворов инсулина с концентрацией 1 мг/мл были получены с помощью спектрофлуориметра Aviv Model ATF 105 и программного обеспечения Aviv 105, версия 1.3. В кварцевую кювету помещали 2,5 мл раствора для каждого измерения. Длина волны возбуждения флуоресценции составила 275 нм с полосой пропускания 4 нм. Спектры флуоресценции были получены в интервале длин волн 340280 нм с разрешением в 1 нм. Напряжение ФЭУ было установлена на значении 850 В, в то время как напряжение (QC) ФЭУ сравнения было установлено на значении 250 В.

Из полученных данных видно, что, несмотря на некоторое взаимодействие между консервантами и rHuPH20, три проверенных консерванта (м-крезол, фенол и бензиловый спирт) не изменяют структуру rHuPH20. Кажущиеся константы диссоциации (K_D) для взаимодействия rHuPH20 с консервантами составили от 40 до 3000 мкМ, при этом в большинстве случаев эти значения находились в диапазоне 50 до 100 мкМ. Эти данные также показали, что хотя rHuPH20 чувствителен к фенольным соединениям, очевидно, что это неспецифическое взаимодействие, и оно сильно зависит от температуры окружающей среды. Кроме того, неспецифическое взаимодействие дополнительно подтверждается тем фактом, что добавление структурно подобного соединения, фенилаланина, не защищало rHuPH20 от деградации при воздействии м-крезола или фенола (см. раздел Е ниже).

D. Другие распространенные консерванты.

Для того чтобы определить, является ли rHuPH20 чувствительным ко всем консервантам или только к типично используемым в продуктах инсулина консервантам, были протестированы различные другие коммерческие консерванты в отношении их воздействия на ферментативную активность и стабильность rHuPH20. Кроме того, для того чтобы понять, опосредуется ли отрицательное воздействие консер- 109 033472 вантов на активность rHuPH20 только фенольным кольцом, присутствующим в нескольких разрушающих консервантах, в качестве потенциального стабилизатора был добавлен фенилаланин. Было высказано предположение, что фенилаланин мог бы конкурировать с фенольными консервантами и обеспечивать стабилизирующий эффект.

В этих исследованиях в общей сложности 100 мкг/мл rHuPH20 было добавлено в исходные композиции, которые содержали 25 мМ Трис/HCl, pH 7,3, 140 мМ NaCl, 0,01% полисорбата 80 и выбранные консерванты в определённой концентрации.

Концентрация для каждого из консервантов был выбрана, главным образом, по данным литературы (см., например, Kibbe, А.Н., (2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd edition, Pharmaceutical Press; Powell et al., (1998) PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology) и на основании данных о концентрациях, которые присутствуют в существующих коммерческих продуктах. Результаты представлены в табл. 18-20 ниже. Результаты показали, что соли хлоргексидина и тимеросал не влияют на ферментативную активность rHuPH20. В противоположность этому добавление хлорида бензалкония или 4-хлор1-бутанола вызвало значительное снижение ферментативной активности rHuPH20 через 24 ч при 25°С. Добавление феноксиэтанола или м-крезола вызывает снижение активности rHuPH20 в зависимости от температуры. При 4°С активность rHuPH20 была примерно такой же, как в контрольном образце, который не содержал консервант, в то время как при 35°С активность rHuPH20 не обнаруживалась через 48 ч (см. табл. 20). Метилпарабен обычно мало влияет на ферментативную активность rHuPH20 при 25°С или в течение коротких периодов времени, например 24 ч при 35°С, но вся ферментативная активность была потеряна после инкубации при 35°С в течение 6 дней. Кроме того, метилпарабен является менее эффективным консервантом по сравнению с м-крезолом или фенолом. Добавление фенилаланина как в низкой (5 мМ), так и в высокой концентрации (50 мМ) не влияет на потерю или наличие активности rHuPH20 в присутствии фенольных консервантов м-крезола и метилпарабена.

Таблица 18 Активность гНиРН20 в присутствии р^личных консервантов при различных температурах хранения

Состав	t = 0	24 часа, 25°С	5 дней, 25°С
Хлорид бензалкония	11,740	10750	2710
4-хлор-1-бутанол	11,350	3500	1440
Хлоргексидин дигидрохлорид	7,720	8130	8750
Хлоргексидин диглюконат	9,590	9520	12310
Тимеросал	10,290	8990	8960
L-Фенилаланин	13,420	12100	11460
L-Фенилаланин/м-крезол	9,990	8390	13470
L-Фенилаланин/метилпарабен	10,780	10620	9390
Контроль без консерванта	12,200	12410	10620

Таблица 19 Активность гНиРН20 в присутствии различных консервантов при различных температурах хранения

Состав	t = 0	6 дней, 35°С
Хлорид бензалкония	11,740	<LOQ
4-хлор-1-бутанол	11,350	<LOQ
Хлоргексидин дигидрохлорид	7,720	11890
Хлоргексидин диглюконат	9,590	12270
Тимеросал	10,290	10070
L-Фенилаланин	13,420	10660
L-Фенилаланин/м-крезол	9,990	<LOQ
L-Фенилаланин/метилпарабен	10,780	<LOQ
Контроль без консерванта	12,200	11870

- 110 033472

Таблица 20

Активность rHuPH20 в присутствии р^личных консервантов при различных температурах хранения

Состав	48 часов,4°С	48 часов, 35°С
Хлорид бензалкония	14,700	<LOQ
4-хлор-1 -бутанол	12,090	13,110
Хлоргексидин дигидрохлорид	12,540	13,130
Хлоргексидин диглюконат	12,250	<LOQ
Тимеросал	10,480	10,690
L-Фенилаланин	10,950	<LOQ
L-Фенилаланин/м-крезол	10,380	12,660
L-Фенилаланин/метилпарабен	12,520	13,200
Контроль без консерванта

Потери ферментативной активности, связанные с добавлением консервантов и повышенной температурой, в основном, обусловлены образованием агрегатов rHuPH20. Как показано в табл. 21-22 ниже, при 35°С потери основного пика, обнаруживаемые с помощью гель-хроматографии, совпадают по времени с потерей ферментативной активности rHuPH20 (см. табл. 21-22). Кроме того, в образцах, содержащих м-крезол, при хранении при 35°С наблюдался значительный пик агрегатов. Обычные консерванты приводят к потере активности rHuPH20 при повышенных температурах и с течением времени. Наиболее подходящими консервантами являются, например, тимеросал и соли хлоргексидина.

Таблица 21

Влияние консервантов на стабильность rHuPH20, определяемое с помощью SEC

Консерванты и добавки	Концентрация/ Процентное содержание	% Основной пик rHuPH20 при не денатурирующей SEC
4°С, 1 день	35°С, 1 день
Хлорид бензалкония	0,01 %	99,64	<LOD
4-хлор-1 -бутанол	0,5 %	97,89	<LOD
Хлоргексидин дигидрохлорид	0,002 %	98,76	98,12
Хлоргексидин диглюконат	0,002 %	98,35	98,23
Тимеросал	0,01 %	98,59	98,31
L-Фенилаланин	5 мМ	98,27	98,86
L-Фенилаланин/м-крезол	5 мМ / 0,25 %	97,42	31,29
L-Фенилаланин/метилпарабен	5мМ/0,2%	98,36	39,94
Контроль без консерванта	0	98,33	98,85

LOD: Предел обнаружения.

Таблица 22

Влияние консервантов на стабильность rHuPH20, определяемое с помощью SEC

Консерванты и добавки	Концентрация/ Процентное содержание	% Основной пик rHuPH20 при не денатурирующей SEC
4°С	35°С,
Феноксиэтанол	1 %	99,81	8,51
Хлоргексидин диглюконат	0,002 %	99,77	98,30
L-Фенил аланин	50 мМ	100,00	99,80
L-Фенилаланин/м-крезол	50 мМ/0,25%	95,10	3,287
L-Фенилаланин/метилпарабен	50 мМ / 0,2 %	96,75	95,07
м-крезол	0,25	100,00	0,834
Метилпарабен	0,2	100,00	96,91
Контроль без консерванта	0	99,63	99,75

Б. Уровни консервантов и противомикробная эффективность.

В настоящее время различные регулирующие ведомства имеют разные фармакопейные критерии в отношении противомикробной эффективности фармацевтических продуктов, предназначенных для многократного введения. В табл. 23 приведены критерии для инъекционных препаратов, удовлетворяющие USP и ЕР критериям. Таким образом, с целью дальнейшей оценки влияния консервантов на rHuPH20 необходимо было определить минимальные концентрации консервантов, необходимых для удовлетворения различным критериям.

- 111 033472

Таблица 23

Требования USP и ЕР в отношении противомикробной эффективности

Требование		США	Европа
Временная точка	USP	ЕРВ (минимально)	ЕРА (предпочтительно)
Логарифм снижения количества бактерий*	6 ч			2
24 ч		1	3
7 дней	1,0	3	---
14 дней	3,0	....	—
28 дней	Без повышения	Без повышения	Без обнаружения
Логарифм снижения количества грибов*	7 дней	Без повышения		2
14 дней	Без повышения	1	—
28 дней	Без повышения	Без повышения	Без повышения

*Logio снижения количества организмов от начального измеренного инокулированного количества;

Без повышения: не более 0,5 log₁₀ единиц повышения в сравнении с ранее измеренным значением.

Несколько групп композиций, содержащих различные уровни консервантов с целевым количеством инсулина и rHuPH20, были подготовлены к тестированию на противомикробную эффективность. Испытания проводили в соответствии с руководством ЕР и USP в контрактной аналитической лаборатории (Quadrants Scientific, Inc., San Diego, CA). Композиции инсулина/гНиРН20 содержали 100 ед./мл инсулина (Organon Insulin API, рекомбинантный человеческий инсулин SIHR 143), 5 мкг/мл rHuPH20, 20 мМ Трис/HCl, pH 7,2, 150 мМ NaCl и 0,02% полоксамера 188. Инсулин готовили, как описано в примере 1 выше. Композиции, содержащие различные консерванты, были протестированы на противомикробную эффективность против Aspergillus niger, Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Staphylococcus aureus и Candida albicans. Испытания проводили при 1) добавлении первичного инокулята (по меньшей мере 10⁵ КОЕ/мл) каждого вида бактерий в образец и 2) измерении КОЕ/мл каждого типа бактерий через 6 ч, 1 день и 7 дней. Полученные исходные данные (КОЕ/мл) были переведены в единицы Log₁₀ снижения количества организмов от начального измеренного инокулированного количества. Композиции тестировали при температуре 37°С и каждый организм инкубировали отдельно с каждой композицией.

Результаты приведены в табл. 24, которая содержит информацию о процентном содержании консервантов и о том, является ли комбинация удовлетворяющей (Да) или не удовлетворяющей (Нет) противомикробным критериям эффективности ЕРА, ЕРВ и USP.

- 112 033472

Таблица 24

Тесты на противомикробную эффективность различных уровней и комбинаций консервантов

№	м-Крезол (%)	Метил-парабен (%)	Фенол (%)	Критерий противомикробной эффективности
ЕРА	ЕРВ	USP
1	—	—	0,15	Нет	Нет	Да
2	—	—	0,3	Нет	Нет	Да
3	0,1	—	—	Нет	Нет	Нет
4	0,15	—	—	Нет	Нет	Да
5	0,1	0,15	—	Нет	Нет	Да
6	0,1	0,1	—	Нет	Нет	Да
7	0,1	0,15	—	Нет	Нет	Да
8	0,15	0,1	—	Нет	Нет	Да
9	0,15	0,15	—	Нет	Да	Да
10	0,1	...	о,1	Нет	Нет	Да
11	0,1	—	0,15	Нет	Да	Да
12	0,15	—	0,1	Нет	Да	Да
13	0,15		0,15	Нет	Да	Да
14	0,1	0,15	—	Нет	Нет	Да
15	—	0,15	0,15	Нет	Нет	Да
16	—	0,15	0,2	Нет	Нет	Да
17	—	0,2	0,15	Нет	Нет	Да
18	—	0,2	0,2	Нет	Нет	Да
Хумалог®	0,315	—	—	Да*	Да*	Да*
Новолог®	0,172	—	0,15	Нет*	Да*	Да*

*Результат, полученный на основе значения 7 дней инкубации.

Для того чтобы определить подходящие уровни консервантов, которые удовлетворяют критериям противомикробной эффективности USP, было предпринято дальнейшее исследование комбинаций бензилового спирта, фенола и м-крезола. Основная композиция содержит 3,75 мг/мл инсулина (Organon Unsulin API, рекомбинантный человеческий инсулин SIHR 143, концентрированный раствор готовили тем же способом, который подробно описан в примере 1), 5 мкг/мл rHuPH20, 20 мМ Трис/HCl, pH 7,4, 140 мМ NaCl и 0,02% полоксамера 188. Результаты, представленные в табл. 25 ниже, определяют процентное содержание консервантов и устанавливают, является ли комбинация удовлетворяющей или не удовлетворяющей критериям противомикробной эффективности USP. За исключением композиции № 2 все комбинации удовлетворили критериям противомикробной эффективности USP.

Таблица 25

Тесты на противомикробную эффективность различных уровней и комбинаций консервантов

№	Бензиловый спирт (%)	Фенол (%)	м-Крезол (%)	Критерии противомикробной эффективности USP*
7 дней	14 дней	28 дней
1	0,25	0,1	—	Да	Да	Да
2	0,1	0,15	—	Нет	Да	Да
3	0,1	0,1	—	Да	Да	Да
4	0,05	0,2	—	Да	Да	Да
5	0,05	0,15	—	Да	Да	Да
6	0,05	0,1	—	Да	Да	Да
7	0,1	—	0,1	Да	Да	Да
8	0,05	—	о,1	Да	Да	Да
9	0,05	—	0,15	Да	Да	Да
10	0,5	—	—	Да	Да	Да
11	—	о,1	0,08	Да	Да	Да
12	—	0,1	0,06	Да	Да	Да
13	—	0,08	0,08	Да	Да	Да
14	—	0,06	0,1	Да	Да	Да
15	—	0,08	0,1	Да	Да	Да

Аналогичные эксперименты были проведены с другим процентным содержанием фенола и мкрезола в комбинациях. Результаты представлены в табл. 26.

- 113 033472

Таблица 26

Минимальные уровни консервантов, необходимые для удовлетворения требованиям USP и ЕРВ

Критерий

Снижение в единицах десятичного логарифма

Стандарт

24 часа

7 дней

14 дней

бактерии

бактерии

Грибы

Грибы

фенол %

м-крезол %

РА

ЕС

SA

РА

ЕС

SA

AN

СА

AN

СА

UPS

ЕРВ

0,10

0,15

>4,5

1,9

0,9

>4,5

>48,

>4,8

2,9

2,0

>4,2

>4,4

Да

Да

0,15

0,10

>4,1

0,7

0,3

>4,6

>4,7

>4,9

2,0

1,6

>3,8

>4,3

Да

Нет

0,175

0,10

>4,6

1,0

0,3

>4,6

>4,7

>4,8

2,5

1,8

>4,4

>4,3

Да

Нет

0,20

0,10

>4,5

2,0

0,7

>4,5

>4,7

>4,9

3,0

2,5

>4,4

>4,2

Да

Да

0,125

0,125

>4,6

1,1

0,4

>4,6

>4,8

>4,9

2,5

2,1

>4,3

>4,2

Да

Нет

0,15

0,125

>4,5

2,1

0,7

>4,5

>4,8

>4,8

2,9

2,8

>4,4

>4,4

Да

Да

0,175

0,125

>4,6

3,6

1,0

>4,6

>4,8

>4,6

3,5

2,6

>4,3

>4,4

Да

Да

0,125

0,15

>4,5

4,1

1,0

>4,5

>4,7

>4,7

3,8

4,0

>4,3

>4,6

Да

Да

PA: Pseudomonas aeruginosa;

EC: Escherichia coli;

SA: Staphylococcus aureus;

AN: Aspergillus niger; CA: Candida albicans.

Пример 8. Влияние комбинации консервантов, NaCl и pH на растворимость инсулина и ферментативную активность rHuPH20.

А. Влияние комбинации консервантов на ферментативную активность rHuPH20.

В этом примере комбинации консервантов для обычного инсулина и аналогов инсулина были протестированы на возможность их влияния на ферментативную активность rHuPH20 при различных концентрациях при температуре 30°С в течение 1 месяца. Каждый консервант был добавлен (до конечных концентраций, указанных в табл. 27 ниже) к композициям инсулина/rHuPH20, содержащим 100 ед./мл инсулина, 5 мкг/мл (600 ед./мл) rHuPH20, 20 мМ Трис/HCl, pH 7,2, 150 мМ NaCl и 0,02% полоксамера 188, образцы были протестированы в момент времени Т=0 и после 1 месяца инкубации при 30°С. Инсулин подготавливали, как описано в примере 1 выше, a rHuPh20 получали, как описано в примере 2.

Результаты представлены в табл. 27 ниже; в ней указаны консерванты, их концентрации и ферментативная активность rHuPH20 в момент времени Т=0 и после 1 месяца инкубации при 30°С. Результаты показывают, что инкубация композиций инсулина/rHuPH20 в течение 1 месяца при 30°С в присутствии одного или комбинации фенольных консервантов приводит к уменьшению ферментативной активности rHuPH20.

Таблица 27

Влияние комбинаций фенольных консервантов на активность rHuPH20

Композиция	Активность РН20 (ед/мл)
№	м-Крезол (%)	Мезил парабен (%)	Фенол (%)	Т=0	1 месяц, 30°С
1	...	—	0,15	629	564
2	—	—	0,3	579	490
3	0,1	—	—	621	549
4	0,15	—	—	601	538
5	0,1	0,15	—	569	474
6	0,1	0,1	—	351	404
7	0,1	0,15	—	557	481
8	0,15	0,1	—	545	418
9	0,15	0,15	—	530	256
10	ОД	—	о,1	585	526
11	0,1	—	0,15	578	487
12	0,15	—	0,1	550	390
13	0,15	—	0,15	553	262
14	о,1	0,15	—	544	465
15	—	0,15	0,15	546	484
16	...	0,15	0,2	545	392
17	—	0,2	0,15	533	407
18	—	0,2	0,2	513	215

В этом примере комбинации фенола и м-крезола были протестированы в отношении их воздействия

- 114 033472 на ферментативную активность rHuPH20 при различных концентрациях, температурах и временах инкубации. Каждый консервант был добавлен (в определённых концентрациях, указанных в табл. 28 ниже) к композициям инсулина/гНиРН20, содержащим 100 ед./мл инсулина, 5 мкг/мл (600 ед./мл) rHuPH20, 20 мМ Трис/HCl, pH 7,4, 50 мМ NaCl, 50 мл глицерина, 50 мМ метионина и 0,01% полоксамера 188.

Результаты представлены в табл. 28 ниже, где указаны консерванты, их концентрации и ферментативная активность rHuPH20 при различных периодах инкубации и температурах. Как было отмечено выше, температура хранения оказывает существенное влияние на ферментативную активность. Вне зависимости от консерванта инкубация образца при 30 или 37°С значительно снижала ферментативную активность по сравнению с инкубацией при 25°С. Кроме того, м-крезол сильнее снижал активность rHuPH20, чем фенол. При увеличении процентного содержания м-крезола ферментативная активность rHuPH20 снижается.

Таблица 28

Влияние комбинаций фенола и м-крезола на активность rHuPH20

Композиция	Фенол, %	м- крезол, %	Активность rHuPH20, ед/мл
25°С, 1 неделя	25°С, 2 недели	30°С, 1 неделя	30°С, 2 недели	37°C, 3 дня
F1	0,35	—	603	569	178	72	5
F2	0,2	0,1	574	493	114	29	13
F3	0,25	0,1	475	356	23	0,3	8
F4	0,175	0,15	462	342	10	0	26
F5	0,2	0,15	385	297	0	ND	10
F6	0,15	0,175	421	318	3	ND	22
F7	0,2	0,175	265	141	0	ND	15
F8	—	0,25	401	332	3	ND	18

ND - нет данных.

В. Влияние NaCl и pH на растворимость инсулина лизпро и ферментативную активность rHuPH20.

В этом примере было использовано полное факторное планирование исследования для определения влияния NaCl и pH на растворимость инсулина лизпро и ферментативную активность rHuPH20 в присутствии 0,15% м-крезола и 0,15% фенола. Четыре различных значения pH и 4 концентрации NaCl были проанализированы, в результате чего было получено 16 образцов.

Все значения за исключением pH и концентрации NaCl поддерживали постоянными: 120 ед./мл инсулина лизпро, 5 мкг/мл rHuPH20, 20 мМ Трис/HCl (Trizma, Sigma, Cat № T6066), 0,15% м-крезола, 0,15% фенола, 0,01% полоксамера 188 (полоксамер 188, Spectrum, Cat. № P1169) и 0,1 мМ ZnCl₂ (EMD, Cat. № ZX0065-1). Тестируемые значения pH были равны 7,0, 7,2, 7,4 и 7,6. Тестируемые концентрации NaCl были равны 50, 80, 110 и 140 мМ. Консервантами были фенол (Riedel-DH Haen, 16017, мультикаталог) и м-крезол (Fluka, Cat № 65996). Процент обнаружения инсулина лизпро измеряли в каждом образце после хранения при 2-8°С в течение 0, 0,25, 0,5, 1, 3, 5, 9 и 12 месяцев. Ферментативную активность rHuPH20 измеряли в каждом образце после хранения при 5°С в течение 2 недель, 1, 5, 9 и 12 месяцев, 25°С в течение 1 недели, 2 недель и 1 месяца, 30°С в течение 1 недели и 2 недель и 35°С в течение 1 недели.

Для приготовления 16 образцов были приготовлены 4 раствора с разной концентрацией NaCl. Инсулин лизпро готовили, как описано выше в примере 1, с конечным pH 7,6. Все остальные обычные компоненты были добавлены до их конечных концентраций. Затем pH каждого концентрированного раствора титровали 1н. или 0,1н. NaOH от 7,6 до 7,0 последовательно. Значение pH поддерживали на уровне ±0,02. Каждый раз, когда достигали соответствующее значение pH, 1 мл раствора отбирали и помещали в стеклянную пробирку типа 1 объёмом 2 мл. После того как все образцы были приготовлены, они хранились при температуре 2-8°С до проведения исследования. Обращенно-фазовую HPLC (RP-HPLC) проводили, как описано в примере 3 выше, со следующими изменениями. Градиент подвижной фазы начали со смеси 75% 0,1%-ной трифторуксусной кислоты (TFA) в воде (А) и 25% 0,1% TFA в ацетонитриле (В) с линейным градиентом до 68% А + 32% В в течение 16 мин, затем следовала фиксированная стадия в течение 4 мин с последующим линейным повышением до 100% В в течение 5 мин.

В табл. 29 ниже указана растворимость как доля в % оставшейся концентрации от исходной концентрации (120 ед./мл) после хранения при 2-8°С в течение 12 месяцев. В табл. 30-31 ниже приведена ферментативная активность rHuPH20 в различных временных точках при различных температурах. В табл. 32 ниже представлена доля обнаружения rHuPH20 в различных временных точках при различных температурах. Данные о растворимости инсулина лизпро и активности rHuPH20 приведены ниже.

Растворимость инсулина лизпро.

Как указано в табл. 29 ниже, инсулин лизпро стабилен при низких концентрациях соли и высоком pH. Например, при pH 7,6 инсулин лизпро был стабилен в течение по меньшей мере 12 месяцев при 50 и

- 115 033472 мМ NaCl, тогда как при 140 мМ NaCl он был стабилен в течение лишь 2 недель. Кроме того, при pH

7,0 инсулин лизпро был стабилен только при 50 мМ NaCl в течение 5 месяцев. Растворимость упала ниже 65% всего через 1 неделю при 80, 110 или 140 мМ NaCl.

Ферментативная активность rHuPH20.

Как показано в табл. 29-30 ниже, rHuPH20 стабилен при высоких концентрациях соли и низком значении pH. rHuPH20 стабилен при 5°С в течение 12 месяцев, хотя и имеет значительно более низкую активность в 50 мМ NaCl, чем в 140 мМ NaCl. При 25°С ферментативная активность rHuPH20 была значительно снижена при низких концентрациях соли всего после одной недели при pH 7,6 и после 2 недель при более низком pH. При 30°С rHuPH20 сохраняет необходимую ферментативную активность только при концентрации 140 мМ NaCl и pH 7,0. После одной недели при 35°С вне зависимости от концентрации соли ферментативная активность rHuPH20 не наблюдалась.

Таблица 29

Растворимость инсулина лизпро при 2-8°С

№ пробы	pH	NaCl	% обнаружения инсулина (месяцы)
0	0,25	0,5	1	3	5	9	12
F16	7,0	50	96,41	95,91	95,12	93,26	81,51	88,84	72,51	58,91
F12	7,0	80	96,36	64,78	40,76	35,90	33,47	32,72	29,34	26,22
F8	7,0	110	96,35	31,18	19,52	18,50	15,05	14,72	14,23	13,63
F4	7,0	140	95,78	21,70	15,04	13,80	11,11	11,14	11,13	10,08
F15	7,2	50	96,68	95,95	95,80	95,42	95,64	96,28	98,59	91,50
F11	7,2	80	96,50	96,06	95,81	86,34	60,90	61,48	50,74	47,02
F7	7,2	ПО	96,45	66,09	39,64	32,94	58,68	28,02	23,68	21,88
F3	7,2	140	95,82	37,37	25,12	23,62	19,03	17,15	15,99	15,90
F14	7,4	50	96,74	96,44	96,36	95,89	95,90	96,58	98,78	95,82
F10	7,4	80	96,34	96,51	96,49	96,64	96,05	96,25	98,62	95,61
F6	7,4	ПО	96,69	96,86	93,50	74,63	63,68	68,64	43,83	38,80
F2	7,4	140	95,73	83,13	50,31	39,27	37,45	34,80	27,30	24,01
F13	7,6	50	95,66	96,72	97,02	96,38	96,21	96,71	98,74	96,11
F9	7,6	80	95,48	95,96	96,22	96,34	95,43	96,17	96,91	92,06
F5	7,6	ПО	95,47	96,74	96,40	96,35	95,89	95,50	84,82	91,38
F1	7,6	140	95,73	95,53	94,46	87,46	64,62	67,99	46,20	41,61

Таблица 30

Влтание соли и pH на ферментативную активность rHuPH20 при 35^ОС, 30^оС и 25^ОС

№ пробы	NaCl (мМ)	pH	t = 0	Ферментативная активность (ед/мл)
35°С	30°С	25°С
1Н	1Н	2Н	1Н	2Н	1М
F1	140	7,6	588	.*	244	133	545	528	461
F2	140	7,4	593	15	322	238	557	494	496
F3	140	7,2	583	31	370	300	585	530	514
F4	140	7,0	576	84	418	387	579	507	513
F5	110	7,6	577	-	163	73	525	496	412
F6	ПО	7,4	574	-	256	159	541	489	449
F7	110	7,2	581	14	327	257	565	501	505
F8	110	7,0	580	49	376	304	576	512	512
F9	80	7,6	599	9	152	82	498	430	385
F10	80	7,4	574	-	91	17	451	401	290
F11	80	7,2	544	-	230	133	522	444	416
F12	80	7,0	549	-	283	199	518	448	435
F13	50	7,6	526	-	38	-	361	296	178
F14	50	7,4	535	-	47	5	426	329	265
F15	50	7,2	529	14	115	51	481	371	324
F16	50	7,0	522	-	172	87	507	405	339

Н = неделя,

М = месяц, * Ниже предела обнаружения.

- 116 033472

Таблица 31

Влияние соли и pH на ферментативную активность rHuPH20 при 5°С

№ пробы	NaCl (мМ)	pH	t = 0	Ферментативная активность (ед/мл)
2Н	1М	5М	9М	12М
F1	140	7,6	588	613	597	595	524	539
F2	140	7,4	593	572	594	586	542	551
F3	140	7,2	583	563	592	586	537	546
F4	140	7,0	576	569	586	582	555	559
F5	110	7,6	577	569	582	582	532	552
F6	110	7,4	574	655	592	618	560	580
F7	НО	7,2	581	574	581	593	553	553
F8	НО	7,0	580	564	588	615	551	576
F9	80	7,6	599	540	584	546	515	534
F10	80	7,4	574	613	557	565	510	488
F11	80	7,2	544	536	548	566	518	536
F12	80	7,0	549	536	548	575	514	520
F13	50	7,6	526	518	514	508	465	456
F14	50	7,4	535	521	525	527	466	473
F15	50	7,2	529	518	544	482	452	456
F16	50	7,0	522	574	543	494	437	438

Таблица 32

Влияние соли и pH на обнаружение rHuPH20, %

№ пробы	NaCl (мМ)	pH	Обнаружение rHuPH20, %
35°С, 1Н	30°С, 2 Н	25°С, 1 Н	5°С, 1 М	5°С, 9 М	5°С, 12 М
F1	140	7,6	41,90	52,70	70,78	101,78	94,05	76,91
F2	140	7,4	42,91	67,13	83,24	98,45	93,36	80,46
F3	140	7,2	49,99	68,94	89,84	102,18	102,07	75,42
F4	140	7,0	49,55	70,64	91,10	97,59	101,54	78,66
F5	110	7,6	37,50	53,04	82,95	96,95	92,45	81,42
F6	110	7,4	45,20	58,19	88,46	107,24	97,80	79,46
F7	НО	7,2	42,96	59,21	86,68	93,10	108,11	80,83
F8	НО	7,0	45,31	64,58	89,49	102,01	92,18	85,45
F9	80	7,6	42,91	56,60	73,76	90,92	92,18	78,13
F10	80	7,4	34,26	53,21	73,82	88,45	98,33	75,11
FH	80	7,2	38,33	59,21	82,78	87,93	95,23	78,77
F12	80	7,0	37,83	56,55	78,93	97,18	101,16	74,05
F13	50	7,6	34,87	49,07	42,13	87,93	83,47	69,38
F14	50	7,4	40,29	52,53	60,91	92,41	90,85	71,76
F15	50	7,2	39,56	52,47	69,92	87,76	91,54	73,41
F16	50	7,0	38,50	50,55	72,96	97,30	93,52	74,10

Н = неделя, М = месяц.

Пример 9. Влияние NaCl и pH на стабильность инсулина и ферментативную активность rHuPH20 при различных комбинациях консервантов.

В этом примере влияние NaCl и pH на стабильность инсулина (регулярного инсулина) и/или аналога инсулина (лизпро или аспарт) и ферментативную активность rHuPH20 было определено для различных условий хранения, в том числе для краткосрочного и долгосрочного хранения (7 дней, 5 месяцев или 9 месяцев) при 2-8°С и краткосрочного хранения (один месяц или менее) при повышенных температурах, в том числе 35°С, 30°С и 25°С.

Основные композиции приведены в разделах А-С ниже. В каждом отдельном исследовании pH и концентрации NaCl варьировались, в то время как другие компоненты композиций оставались постоянными. Для подготовки образцов инсулина/аналогов инсулина с заданными комбинациями консервантов было приготовлено 4 исходных раствора для инсулина и/или каждого из его аналогов. Исходные растворы инсулина и его аналогов готовили, как описано выше в примере 1, с окончательным pH 7,6. Каждый исходный раствор содержал необходимые концентрации консервантов и NaCl (50, 80, 110 или 140 мМ) и всех других стандартных компонентов, которые были добавлены до их конечных концентраций. pH каж- 117 033472 дого раствора затем титровали 1н. или 0,1н. NaOH с 7,6 до целевого значения pH последовательно. Значение pH поддерживали на уровне ±0,02. Каждый раз, когда необходимое значение pH достигалось, 1 мл раствора удаляли, фильтровали через 0,2-микронный фильтр PES и помещали в стеклянную пробирку типа 1 объёмом 2 мл. После приготовления всех образцов их хранили при температуре 2-8°С до проведения анализа.

А. Полное факторное исследование влияния NaCl и pH на растворимость инсулина/аналога инсулина при 2-8°С в течение 7 дней.

В этом примере полное факторное планирование исследования было использовано для определения влияния NaCl и pH на растворимость обычного инсулина и аналогов лизпро или аспарт в присутствии различных комбинаций консервантов. Другие компоненты препарата, за исключением pH, концентрации NaCl и консервантов, поддерживали постоянными: 120 ед./мл инсулина/аналога инсулина, 5 мкг/мл rHuPH20 (600 ед./мл), 20 мМ Трис/HCl (Trizma, Sigma, Cat № Т6066), 0,02% плюроник (Pluronic)® F68 (полоксамер 188, Spectrum, Cat № P1169) и 0,1 мМ ZnCl₂ (EMD, Cat № ZX0065-1). Было использовано три различных уровня комбинаций консервантов: 1) 0,15% м-крезола (Fluka, Cat № 65996) и 0,2% фенола (Riedel-DH Haen, 16017, мультикаталог); 2) 0,15% м-крезола и 0,15% фенола и 3) 0,15% м-крезола и 0,2% метилпарабена (Fluka, Cat № 85265). С каждой комбинацией консервантов был получен полный набор сочетаний из 6 уровней pH и 4 уровней концентраций NaCl (в общей сложности 24 образца). Значения pH в исследовании были 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4 и 7,6. Концентрации NaCl в исследовании были равны 50, 80, 110 и 140 мМ.

Была проведена обращено-фазовая HPLC (RP-HPLC), как описано в примере 3 выше, со следующими модификациями. Подвижная фаза состояла из 75% 0,1%-ной трифторуксусной кислоты (TFA) в воде (А) и 25% 0,1% TFA в ацетонитриле (В) с линейным градиентом до 68% А + 32% В в течение 16 мин, затем концентрации были постоянными в течение 4 мин с последующим линейным повышением до 100% В в течение 5 мин. Результаты показаны в табл. 33-35 ниже, где представлена растворимость, выраженная как доля в % от исходной концентрации (120 ед./мл), после хранения при 2-8°С в течение 7 дней. В табл. 33 приведены результаты для лизпро. В табл. 34 приведены результаты для регулярного инсулина. В табл. 35 приведены результаты для инсулина аспарт.

Все три молекулы инсулина/аналогов инсулина сходно реагировали на изменение pH и концентрации NaCl. При низком pH и высокой концентрации NaCl инсулин/аналоги инсулина образуют кристаллы и осадки, на что указывает уменьшение процентного содержания оставшегося инсулина/аналога инсулина. Эти результаты были подтверждены при визуальном анализе. Все три молекулы инсулина/аналогов инсулина были растворимы при всех комбинациях консервантов при pH>7,2 и 50 мМ NaCl, pH>7,4 и 80 мМ NaCl и при pH>7,6 и 110 мМ NaCl. Кроме того, все три молекулы инсулина/аналогов инсулина не были достаточно растворимыми (наблюдаемая концентрация <90 ед./мл или 75%) при pH>6,8 и 140 мМ NaCl и pH 6,6 и 80 или 110 мМ NaCl. Точные растворимости варьировали у инсулина/аналогов инсулина. В условиях анализа инсулин аспарт был наиболее растворимым, затем следовал инсулин лизпро и, наконец, регулярный инсулин, который был наименее растворимым. Наблюдались также различия в отношении к консерванту, причём инсулин аспарт и регулярный инсулин наиболее растворимы при 0,15% фенола и 0,15% м-крезола, а инсулин лизпро наиболее растворим при 0,15% м-крезола и 0,2% метилпарабена. Метилпарабен считается наилучшим консервантом, когда концентрация соли низкая, однако, при более высоких концентрациях соли никакой разницы между образцами, содержащими фенол или метилпарабен, не наблюдалось.

Регулярный инсулин не полностью растворяется при высоких (>110 мМ) концентрациях NaCl даже при высоком значении pH. В табл. 34 представлены значения низкой растворимости инсулина в более чем 50% вариантов условий анализа, где концентрация оказалась ниже 90% исходных значений всего через 7 дней при температуре 2-8°С. Снижение концентрации фенола и/или замена фенола на метилпарабен немного увеличивают растворимость. В этих экспериментах снижение растворимости при увеличении концентрации NaCl на 30 мМ, было сопоставимо со снижением при понижении pH на 0,2 единицы. Эти данные подтверждают тот факт, что высокие концентрации NaCl влияют на растворимость инсулина при хранении при 5°С, и, таким образом, композиции регулярного инсулина, вероятно, требуют снижения концентрации NaCl и/или увеличения pH в сравнении с аналогами инсулина.

- 118 033472

Таблица 33

Растворимость инсулина лизпро через 7 дней хранения при 2-8°С

0,2 % фенола + 0,15 % м-крезола
pH	Концентрация NaCl (мМ)
50	80	110	140
7,6	97,5	97,7	97,3	96,8
7,4	97,7	97,6	97,0	96,9
7,2	97,6	97,4	95,2	90,8
7,0	97,4	95,5	75,2	65,3
6,8	91,4	65,1	44,9	40,4
6,6	52,8	32,8	26,0	нет данных

0,15 % фенола + 0,15 % м-крезола
pH	Концентрация NaCl (мМ)
50	80	ПО	140
7,6	100,9	102,1	101,6	101,3
7,4	100,8	101,8	100,7	98,4
7,2	100,5	99,2	97,3	93,1
7,0	98,7	96,4	77,0	61,2
6,8	93,6	60,8	44,9	35,9
6,6	60,3	43,3	24,2	27,7
0,2 % метилпарабена + 0,15 % м-крезола
pH	Концентрация NaCl (мМ)
50	80	ПО	140
7,6	95,7	98,3	100,2	98,8
7,4	95,6	98,2	99,9	98,5
7,2	95,7	97,9	99,6	98,0
7,0	95,3	98,1	94,1	65,6
6,8	82,3	62,6	47,8	42,0
6,6	42,0	28,2	24,1	25,9

Таблица 34

Растворимость регулярною инсулина через 7 дней хранения при 2-8°С

0,2 % фенола + 0,15 % м-крезола
pH	Концентрация NaCl (мМ)
50	80	ПО	140
7,6	102,1	99,2	98,5	82,2
7,4	101,8	99,2	87,8	40,6
7,2	101,8	92,2	37,4	18,9
7,0	100,3	35,7	17,7	11,6
6,8	38,4	17,1	10,2	6,5
6,6	26,8	8,7	6,5	5,8
0,15 % фенола + 0,15 % м-крезола
рн	Концентрация NaCl (мМ
50	80	ПО	140
7,6	97,2	97,1	97,1	91,7
7,4	96,7	97,3	94,2	57,9
7,2	97,0	96,4	58,7	33,1
7,0	96,7	80,8	32,9	17,1
6,8	66,6	24,9	17,0	10,2
6,6	31,2	18,6	14,6	12,9

- 119 033472

0,2 % метилпарабена + 0,15 % м-крезола
pH	Концентрация NaCl (мМ)
50	80	ПО	140
7,6	98,1	97,9	97,0	95,4
7,4	98,1	97,7	94,6	59,1
7,2	98,0	90,6	47,1	32,9
7,0	86,9	46,6	23,0	15,9
6,8	34,1	19,0	11,4	10,2
6,6	15,3	9,0	7,4	5,8

Таблица 35 Растворимость инсулина Аспарт через 7 дней хранения при 2-8°С

0,2 % фенола + 0,15 % м-крезола
рн	Концентрация NaCl (мМ)
50	80	ПО	140
7,6	99,2	100,8	100,2	99,8
7,4	99,2	100,6	100,0	99,7
7,2	99,1	100,5	100,0	99,7
7,0	99,1	100,6	99,9	88,9
6,8	98,8	91,8	72,8	50,9
6,6	91,8	59,2	58,0	39,3
0,15 % фенола + 0,15 % м-крезола
рн	Концентрация NaCl (мМ)
50	80	ПО	140
7,6	100,1	99,7	99,4	101,1
7,4	100,0	99,6	99,5	101,1
7,2	99,1	99,2	99,2	101,1
7,0	99,7	99,3	99,3	100,2
6,8	99,8	97,9	97,5	60,5
6,6	97,9	86,3	54,4	38,3
0,2 % метилпарабена + 0,15 % м-крезола
pH	Концентрация NaCl (мМ)
50	80	ПО	140
7,6	99,3	100,6	99,8	99,8
7,4	99,1	100,5	99,6	99,6
7,2	99,0	100,2	99,5	101,6
7,0	98,7	100,2	96,3	67,9
6,8	97,2	84,1	54,2	32,2
6,6	57,7	32,1	21,1	14,7

В. Последующее исследование с пониженным уровнем м-крезола.

Растворимость инсулина далее оценивали в упрощенном последующем исследовании с пониженным уровнем м-крезола. Были использованы четыре комбинации концентраций консервантов: 1) 0,1% мкрезола и 0,15% фенола, 2) 0,1% м-крезола и 0,2% фенола, 3) 0,1% м-крезола и 0,15% метилпарабена и 4) 0,1% м-крезола и 0,2% метилпарабена. Были проанализированы два уровня pH (7,3 и 7,1) и две концентрации NaCl (120 и 100 мМ). Остальные компоненты композиций поддерживались на постоянном уровне: 120 ед./мл регулярного инсулина, 5 мкг/мл rHuPH20 (600 ед./мл), 20 мМ Трис/HCl (Trizma, Sigma, Cat № Т6066), 0,02% полоксамера 188 (полоксамер 188, Spectrum, № P1169) и 0,1 мМ ZnCl₂ (EMD, Cat № ZX0065-1). Композиции были приготовлены и проанализированы, как описано выше.

Результаты представлены в табл. 36 ниже. В целом, растворимость регулярного инсулина немного возрастает в присутствии меньших количеств м-крезола и, кроме того, при замене фенола метилпарабеном.

- 120 033472

Таблица 36

Растворимость регулярного инсулина при пониженном уровне м-крезола при 2-8°С

№ композиции	pH	NaCl (мМ)	м-крезол (%)	Фенол (%)	Метилпарабен (%)	Обнаружение инсулина
1 день	3 дня
1	7,3	120	0,1	0,15	—	84,15	52,13
2	7,3	120	0,1	0,2	—	72,75	40,78
3	7,3	120	0,1	—	0,15	92,88	92,68
4	7,3	120	0,1	—	0,2	94,76	94,80
5	7,1	100	0,1	0,15	—	72,60	38,87
6	7,1	100	0,1	0,2	—	64,86	32,69
7	7,1	100	0,1	—	0,15	93,87	91,99
8	7,1	100	0,1	—	0,2	92,32	90,59

С. Долгосрочное влияние pH и NaCl на стабильность rHuPH20 и инсулина.

В этом примере было использовано полное факторное планирование исследования для определения влияния pH и NaCl на растворимость регулярного инсулина и rHuPH20 с целью выявления условий, которые максимизируют растворимость инсулина при температуре 2-8°С и стабильность rHuPH20 при комнатной или более высокой температуре при высоком уровне консерванта. Уровень консерванта был установлен согласно критериям ЕР-А. Анализировали четыре значения концентрации NaCl и 4 значения pH, в результате чего было получено 16 образцов. В образцах оценивали стабильность как при краткосрочных условиях ускоренной деградации (высокая температура), так и при длительном хранении при температуре 2-8°С.

Инсулин (100 ед./мл, получен, как описано в примере 1 выше, pH 7,0) и 5 мкг/мл rHuPH20 были растворены в обычном буфере, содержащем 20 мМ Трис/HCl, 0,1 мМ ZnCl₂, 0,01% полоксамера 188, 0,15% м-крезола и 0,2% фенола. Растворимость определяли с помощью RP-HPLC, как описано в примере 3 выше. Растворимость была выражена как относительная процентная доля в сравнении со стандартом, где 100% составляют 100 ед./мл. Ферментативную активность rHuPH20 оценивали, как описано выше в примере 2. RP-HPLC использовали для контроля общего содержания и чистоты rHuPH20 (см. пример 3 выше). Данные были обработаны с помощью Design Expert 7.0 (StatEase). ANOVA и корреляционные анализы проводили с помощью программного обеспечения JMP 8,0.

Результаты представлены в табл. 37-42 ниже. В табл. 37-38 содержится информация о ферментативной активности rHuPH20, а в табл. 39 представлена процентная доля обнаружения rHuPH20. При краткосрочных условиях ускоренной деградации ферментативная активность rHuPH20 зависела от pH, NaCl и температуры хранения, как указано в табл. 37 ниже. После 1 недели хранения при 35°С никакой значимой активности rHuPH20 обнаружено не было. Ферментативная активность после хранения при 30°С была выше, чем при 35°С, но единственная композиция, которая сохранила активность >375 ед./мл, имела высокую концентрацию NaCl (140 мМ) и низкий pH (7,0). В целом, чем выше pH и ниже концентрация соли, тем ниже ферментативная активность. При температуре хранения 25°С влияние на ферментативную активность rHuPH20 было значительно снижено, хотя тенденция, наблюдаемая при 30°С, сохранялась, особенно для композиций, имеющих низкую концентрацию соли и высокое значение pH. В большинстве композиций сохранялась ферментативная активность выше заданного критерия 375 ед./мл через 4 недели. При 5°С не было существенных потерь в ферментативной активности rHuPH20 даже после хранения в течение 1 месяца. Этот эффект сохранился и после 9 месяцев хранения при температуре 2-8°С, что видно из табл. 38 ниже. Таким образом, rHuPH20 сохраняет ферментативную активность при хранении при 25°С или более низкой температуре, особенно при концентрации NaCl выше 80 мМ. Стабильность быстро снижается при температуре выше 25°С. RP-HPLC использовали для определения общего содержания rHuPH20 и его чистоты. Как показано в табл. 39 ниже, потеря ферментативной активности коррелирует с потерей содержания rHuPH20 (статистический анализ, р<0,001). Анализ чистоты rHuPH20 не выявил никаких существенных тенденций или различий в значениях чистоты как относительной площади пика для площади основного пика rHuPH20 (данные не приведены), и это говорит о том, что чистота сохраняется на соответствующем уровне и, следовательно, снижение активности возникает из-за снижения общего содержания. Снижение содержания, вероятно, связано с тем, что белок разворачивается при высоких концентрациях консервантов и температурах, что приводит к агрегации и преципитации rHuPH20.

В табл. 40-41 изложены данные о процентной доле основного пика инсулина и процентной доле обнаружения инсулина после длительного хранения при температуре 2-8°С. В табл. 38 процентная доля обнаружения инсулина является суммой основного пика инсулина и пика дезамидоинсулина. Как показано в табл. 40, процент основного пика инсулина оставался высоким (около 97%) и без существенных изменений, что свидетельствует о том, что потери связаны не с химической или физической деградацией

- 121 033472 инсулина, как, например, дезамидирование или агрегация. Визуальный анализ пробирок указанных смесей выявил в образцах крошечные блестящие гранулы или четкие кристаллические или кристаллоподобные частицы при некоторой мутности раствора. Данные в табл. 41 отражают содержание инсулина, оставшегося в растворе композиции в каждый момент времени. Обнаружение инсулина по сравнению с начальными условиями является показателем растворимости. Осаждение/кристаллизация инсулина изменяются в зависимости от выбранных анализируемых значений pH и концентрации NaCl. Как правило, когда pH низкий, а концентрация соли высокая (условия, являющиеся благоприятными для активности rHuPH20), инсулин образует кристаллы очень быстро и достигает состояния равновесия примерно за два месяца. При низкой концентрации соли и высоком pH кристаллизация происходит медленно, и большинство молекул инсулина остается в растворе в течение 9 месяцев. Статистический анализ данных (см. табл. 42 ниже) по обнаружению инсулина показывает, что величины pH, NaCl, время, pH*NaCl и NaCl*время оказывают существенное влияние на растворимость инсулина. Эти результаты говорят о том, что растворимость инсулина в течение длительных периодов времени зависит от высоких pH (выше 7,4) и низких концентраций NaCl (менее 80 мМ), которые являются, наоборот, неблагоприятными для поддержания ферментативной активности rHuPH20.

Таблица 37

Ферментативная активность rHuPH20

№	NaCl, мМ	pH	Т=0	Активность rHuPH20 (ед/мл)
35°С	30°С	25°С	5°С
1Н	1Н	2Н	1Н	2Н	1М	2Н	1М
1	140	7,6	588	—	244	133	545	528	461	613	597
2	140	7,4	593	15	322	238	557	494	496	572	594
3	140	7,2	583	31	370	300	585	530	514	563	592
4	140	7,0	576	84	418	387	579	507	513	569	586
5	110	7,6	577	—	163	73	525	496	412	569	582
6	110	7,4	574	—	256	159	541	489	449	655	592
7	110	7,2	581	14	327	257	565	501	505	574	581
8	110	7,0	580	49	376	304	576	512	512	564	588
9	80	7,6	599	9	152	82	498	430	385	540	584
10	80	7,4	574	—	91	17	451	401	290	613	557
11	80	7,2	544	—	230	133	522	444	416	536	548
12	80	7,0	549	—	283	199	518	448	435	536	548
13	50	7,6	526	—	38	—	361	296	178	518	514
14	50	7,4	535	—	47	5	426	329	265	521	525
15	50	7,2	529	14	115	51	481	371	324	518	544
16	50	7,0	522	—	172	87	507	405	339	574	543

— Ниже предела обнаружения

Таблица 38 Ферментативная активность rHuPH20 после длительного хранения при 2-8°С

5 месяцев
pH	Концентрация NaCl (мМ)
50	80	НО	140
7,6	508,0571	546,4209	581,6326	594,6197
7,4	526,6628	564,7769	618,3856	585,9813
7,2	481,6035	566,2521	593,2027	585,9948
7,0	494,4796	575,3274	615,3546	582,4274
9 месяцев
pH	Концентрация NaCl (мМ)
50	80	110	140
7,6	464,8964	515,3382	531,9202	523,5385
7,4	466,1871	509,9032	560,4847	542,4534
7,2	451,8324	518,0740	553,1847	536,7846
7,0	436,5115	513,9692	551,0218	554,6513

- 122 033472

Таблица 39

Процент обнаружения rHuPH20

№	NaCl, мМ	pH	% обнаружения rHuPH20*
35°С, 1Н	30°С, 2Н	25°С, 4Н	5°С,1М	5°С, 9М
1	140	7,6	41,90	52,70	70,78	101,78	94,05
2	140	7,4	42,91	67,13	83,24	98,45	93,36
3	140	7,2	49,99	68,94	89,84	102,18	102,07
4	140	7,0	49,55	70,64	91,10	97,59	101,54
5	110	7,6	37,50	53,04	82,95	96,95	92,45
6	110	7,4	45,20	58,19	88,46	107,24	97,80
7	110	7,2	42,96	59,21	86,68	93,10	108,11
8	ПО	7,0	45,31	64,58	89,49	102,01	92,18
9	80	7,6	42,91	56,60	73J6	90,92	92,18
10	80	7,4	34,26	53,21	73,82	88,45	98,33
11	80	7,2	38,33	59,21	8278	87,93	95,23
12	80	7,0	37,83	56,55	78,93	97,18	101,16
13	50	7,6	34,87	49,07	42,13	87,93	83,47
14	50	7,4	40,29	52,53	60,91	92,41	90,85
15	50	7,2	39,56	52,47	69.,92	87,76	91,54
16	50	7,0	38,50	50,55	72,96	97,30	93,52

* процент обнаружения равен общей величине площади пика в сравнении с известным эталоном.

Таблица 40 Процентная дода основного пика инсулина после длительного хранения 2-8°С

140 мМ NaCl
pH	Время (месяцы)
	0	0,25	0,5	1	3	5	9
7,6	97,64	97,61	97,41	97,51	97,35	97,56	97,07
7,4	97,64	97,57	97,33	97,23	97,38	97,73	96,10
7,2	97,56	97,37	96,98	96,62	96,60	98,04	95,49
7,0	97,65	97,15	97,05	96,39	96,16	97,97	95,17
110 мМ NaCl
рн	Время (месяцы)
	0	0,25	0,5	1	3	5	9
7,6	97,58	97,57	97,60	97,52	97,42	97,61	97,31
7,4	97,65	97,58	97,39	97,36	97,36	97,79	96,91
7,2	97,62	97,46	97,35	97,03	97,49	97,61	95,91
7,0	97,64	97,31	97,57	96,64	96,10	97,79	95,03

- 123 033472

80 мМ NaCl
pH	Время (месяцы)
	0	0,25	0,5	1	3	5	9
7,6	97,63	97,62	97,52	97,37	97,64	97,67	97,31
7,4	97,56	97,61	97,51	97,43	97,43	97,75	97,29
7,2	97,57	97,59	97,30	97,45	97,34	97,64	97,00
7,0	97,65	97,50	97,30	97,20	97,04	97,81	96,18
50 мМ NaCl
рн	Время (месяцы)
	0	0,25	0,5	1	3	5	9
7,6	97,65	97,58	97,33	97,44	97,35	97,66	97,34
7,4	97,58	97,54	97,48	97,47	97,45	97,74	97,27
7,2	97,64	97,59	97,56	97,46	97,47	97,75	97,27
7,0	97,64	97,59	97,50	97,44	97,24	97,73	97,20

Таблица 41

Процент обнаружения инсулина после длительного хранения при 2-8°С

140 мМ NaCl
рн	Время (месяцы)
	0	0,25	0,5	1	3	5	9
7,6	95,73	95,53	94,46	87,46	64,62	67,99	46,20
7,4	95,73	83,13	50,31	39,27	37,45	34,80	27,30
7,2	95,82	37,37	25,12	23,62	19,03	17,15	15,99
7,0	95,78	21,70	15,04	13,80	11,11	11,14	11,13
ПО мМ NaCl
pH	Время (месяцы)
	0	0,25	0,5	1	3	5	9
7,6	95,47	96,74	96,40	96,35	95,89	95,50	84,82
7,4	96,69	96,86	93,50	74,63	63,68	68,64	43,83
7,2	96,45	66,09	39,64	32,94	58,68	28,02	23,68
7,0	96,35	31,18	19,52	18,50	15,05	14,72	14,23
80 мМ NaCl
pH	Время (месяцы)
	0	0,25	0,5	1	3	5	9
7,6	95,48	95,96	96,22	96,34	95,43	96,17	96,91

- 124 033472

7,4	96,34	96,51	96,49	96,64	96,05	96,25	98,62
7,2	96,50	96,06	95,81	86,34	60,90	61,48	50,74
7,0	96,36	64,78	40,76	35,90	33,47	32,72	29,34
50 мМ NaCl
pH	Время (месяцы)
	0	0,25	0,5	1	3	5	9
7,6	95,66	96,72	97,02	96,38	96,21	96,71	98,74
7,4	96,74	96,44	96,36	95,89	95,90	96,58	98,78
7,2	96,68	95,95	95,80	95,42	95,64	96,28	98,59
7,0	96,41	95,91	95,12	93,26	81,51	88,84	72,51

Таблица 42

Статистический анализ

Дисперсионный анализ
Источник	DF (степени свободы)	Сумма квадратов	Среднее квадратичное	F-отношение
Модель	6	82776,03	13796,0	51,2972
Ошибка	105	28239,00	268,9	Prob > F (вероятность получения наблюдаемого Fотношения)
С. Total (исправленное среднее)	111	111015,02		<,0001*
Анализ значимости различия
Источник	Nparm (количество параметров)	DF (степени свободы)	Сумма квадратов	F-отношение	Prob > F
pH	1	1	30142,891	112,0792	<0,0001*
NaCl	1	1	35065,510	130,3828	<0,0001*
pH*NaCl	1	1	4786,627	17,7979	<0,0001*
Время	1	1	9068,524	33,7192	<0,0001*
рН*Время	1	1	752,462	2,7979	0,0974
МаС1*Время	1	1	2960,012	11,0061	0,0012*

* значимое

Пример 10. Разработка композиции аналога инсулина: скрининг стабилизаторов для композиции инсулина с rHuPH20.

Консерванты предотвращают потенциальное микробное загрязнение инсулина, которое может иметь место за счет многократного дозирования. Типичными консервантами являются м-крезол, фенол и парабены. Эти консерванты являются не только противомикробными препаратами, но и служат для стабилизации структуры инсулина высокого порядка. Было показано, что фенольные консерванты снижают стабильность rHuPH20 (см. пример 7). В этом примере анализировали различные стабилизаторы на их способность предотвращать деградацию rHuPH20 в присутствии фенольных консервантов, сохраняя при этом стабильность инсулина/аналога инсулина. Анализируемые стабилизаторы обычно являются фармацевтическими вспомогательными веществами, в том числе аминокислотами и их производными, солями и буферами, полиолами и другими соединениями. Стабильность определяли по ферментативной активности rHuPH20 и растворимости инсулина. Специфические стабилизирующие эффекты включали в себя предотвращение окисления и/или потери rHuPH20 в результате адсорбции и общий стабилизирующий эффект, который определяли по ферментативной активности rHuPH20.

А. Влияние различных поверхностно-активных веществ на ферментативную активность rHuPH20.

Несколько стандартных поверхностно-активных веществ, а именно полисорбат 80 (PS80), полисорбат 20 (PS20) и полоксамер 188 (Pluronic® F68), подвергали анализу на их способность сохранять композиции rHuPH20. Все композиции содержали 100 мкг/мл rHuPH20 (12000 ед.) и 150 мМ NaCl при pH 6,5. В композициях изменяли тип поверхностно-активного вещества и его концентрацию, и буфер (гистидин или фосфат). Композиции перемешивали при 35°С в течение 10 дней и измеряли ферментативную активность rHuPH20 в анализируемых композициях на 3 и 10 день. Ферментативную активность rHuPH20 определяли, как описано выше в примере 2. Стабильность rHuPH20 определяли путем измерения пика

- 125 033472 окисленного rHuPH20 с помощью RP-HPLC и с помощью гель-хроматографии (SEC) (см. примеры 3 и 4 выше).

Композиции и данные о ферментативной активности rHuPH20 приведены в табл. 43 ниже. ANOVA анализ окисления rHuPH20, которое определялось с помощью RP-HPLC, не выявляет значительной разницы в ферментативной активности в отношении типа ПАВ, его концентрации, буфера или времени перемешивания (F=0,6832, p=0,6397). Кроме того, результаты SEC не показали детектируемых различий в размерах основных пиков (данные не показаны).

Данные об окислении rHuPH20 представлены в табл. 44 ниже. Они показывают, что площадь пика окисления возрастает с увеличением уровня поверхностно-активного вещества и времени перемешивания. Полисорбат 20, как известно, имеет измеряемые значения пероксидной активности (см., например, Donbrow et al., (1978) J. Pharm Sci. 67(12):1676-1681, или Kibbe, A.H., ed. (2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients. 3rd Edition, American Pharmaceutical Association & Pharmaceutical Press: Washington, DC & London, UK). В этом исследовании использовали старый образец полисорбата 20, что привело к сильному окислению rHuPH20; напротив, полоксамер 188 проявил лишь следовую окислительную способность. Многофакторный анализ показал, что время перемешивания, а также тип ПАВ и его концентрация влияют на степень окисления rHuPH20 (см. табл. 45 ниже). Кроме того, значимыми были эффекты взаимодействия, в том числе, зависимости ПАВ - концентрация, ПАВ - время и концентрация - время.

На основании этих данных можно сделать вывод, что добавление поверхностно-активного вещества в композиции rHuPH20 может эффективно снизить потери rHuPH20, предположительно, за счёт предотвращения потерь в результате адсорбции и возможной денатурации на поверхности раздела газжидкость. Тем не менее, потенциальным недостатком добавления поверхностно-активного вещества является возможное увеличение окисления rHuPH20.

Таблица 43

Влияние PS80, PS20 и F68 на ферментативную активность rHuPH20

№	ПАВ, конц. (% масса/объём)	Буфер	Ферментативная активность (ед/мл)
Перемешивание 3 дня	Перемешивание 10 дней
1	PS80, 0,1 %	50 мМ гистидина	11,515	11,444
2	PS80, 0,01 %	50 мМ гистидина	10,370	10,358
3	PS80, 0,001 %	50 мМ гистидина	9,758	9,850
4	PS20, 0,1 %	50 мМ гистидина	9,993	7,990
5	PS20, 0,01 %	50 мМ гистидина	10,566	10,448
6	PS20, 0,001 %	50 мМ гистидина	8,644	8,488
7	F68, 0,1 %	50 мМ гистидина	10,460	9,580
8	F68, 0,01 %	50 мМ гистидина	10,537	10,064
9	F68, 0,001 %	50 мМ гистидина	9,148	8,811
10	PS80, 0,1 %	50 мМ фосфата	10,473	7,459
11	PS80, 0,01 %	50 мМ фосфата	10,590	10,919
12	PS80, 0,001 %	50 мМ фосфата	9,233	9,858

- 126 033472

13	PS20, 0,1 %	50 мМ фосфата	9,839	9,004
14	PS20, 0,01 %	50 мМ фосфата	10,659	11,241
15	PS20, 0,001 %	50 мМ фосфата	9,161	9,770
16	F68, 0,1 %	50 мМ фосфата	11,274	11,197
17	F68, 0,01 %	50 мМ фосфата	10,669	10,459
18	F68, 0,001 %	50 мМ фосфата	9,605	9,655

Таблица 44

Влияние PS80, PS20 и F68 на окисление rHuPH20

№	ПАВ, Конц. (% масса/объём)	Буфер	Пик окисления, %
Перемешивание 3 дня	Перемешивание 10 дней
1	PS80, 0,1 %	50 мМ гистидина	6,89	8,5
2	PS80, 0,01 %	50 мМ гистидина	4,35	4,89
3	PS80, 0,001 %	50 мМ гистидина	3,82	3,94
4	PS20, 0,1 %	50 мМ гистидина	44,13	74,39
5	PS20, 0,01 %	50 мМ гистидина	10,01	14,21
6	PS20, 0,001 %	50 мМ гистидина	4,56	4,91
7	F68, 0,1 %	50 мМ гистидина	4,52	17,63
8	F68, 0,01 %	50 мМ гистидина	3,83	5,38
9	F68, 0,001 %	50 мМ гистидина	3,79	4,31
10	PS80, 0,1 %	50 мМ фосфата	5,41	12,40
11	PS80, 0,01 %	50 мМ фосфата	3,83	5,01
12	PS80, 0,001 %	50 мм фосфата	3,41	4,62
13	PS20, 0,1 %	50 мМ фосфата	43,79	65,34
14	PS20, 0,01 %	50 мМ фосфата	10,32	12,48
15	PS20, 0,001 %	50 мМ фосфата	4,25	5,15
16	F68, 0,1 %	50 мМ фосфата	6,11	6,29
17	F68, 0,01 %	50 мМ фосфата	3,80	4,72
18	F68, 0,001 %	50 мМ фосфата	3,61	4,21

Таблица 45

Статистический анализ

Все параметры
R-квадрат	0,975911
R-квадрат скорректированный	0,959852
средняя квадратичная ошибка	3,423151
Среднее ответа	11,91222

- 127 033472

Наблюдения (или сумма весов) 36
Дисперсионный анализ
Источник	DF	Сумма квадратов	Среднее квадратичное	F отношение
Модель	14	9969,264	712,090	60,7691
Ошибка	21	246,077	11,718	Prob > F
исправленное среднее	35	10215,341		<0,0001*
Анализ значимости различия
Источник	Nparm (количество параметров)	DF (степени свободы)	Сумма квадратов	F отношение	Prob > F
ПАВ	2	2	909,4801	38,8071	<0,0001*
Буфер	1	1	0,1152	0,0098	0,9220
Конц.	1	1	741,1067	63,2454	<0,0001*
Время	1	1	214,5248	18,3074	0,0003*
ПАВ*буфер	2	2	20,3784	0,8695	0,4337
ПАВ*конц	2	2	3557,3392	151,7900	<0,0001*
ПАВ* время	2	2	114,0738	4,8675	0,0183*
Буфер*конц	1	1	14,8438	1,2668	0,2731
Буфер*время	1	1	10,4329	0,8903	0,3561
конц*время	1	1	248,4121	21,1993	0,0002*

* Значимое

В. Метионин.

1. Способность метионина предотвращать окисление rHuPH20.

rHuPH20 имеет два потенциальных сайта окисления: Met458 и Met35. Пик ox-1 соответствует Met458 и является основным пиком окисления при анализе с помощью RP-HPLC. Пик ox-2 соответствует двум окисленным метионинам. Окисление метионина может быть предотвращено путём добавления свободного метионина в качестве акцептора, который мог бы реагировать с потенциальными соединениями-окислителями.

а). Композиции rHuPH20.

В этом исследовании оценивали эффект от добавления свободного метионина на окисление rHuPH20 в присутствии полисорбата 20, полисорбата 80 и/или полоксамера 188. Каждая композиция содержала 5 мкг/мл rHuPH20, 0,02% соответствующего поверхностно-активного вещества, 50 мМ фосфатный буфер, pH 6,5, 150 мМ NaCl и метионин (от 0 до 50 мМ). Образцы инкубировали при 30°С в течение 72 ч и исследовали с помощью RP-HPLC, как описано в примере 3 выше. Результаты представлены в табл. 46 ниже. Статистический анализ приведен в табл. 47 ниже. Полученные данные свидетельствуют о том, что метионин предотвращает окисление rHuPH20 в концентрации 2 мМ.

Таблица 46 Влияние метионина на окисление rHuPH20

Метионин (мМ)	Пик окисления 1, %
Полоксамер 188	Полисорбат 20	Полисорбат 80
0	3,98	4,01	4,01
2	3,39	3,43	3,50
10	3,36	3,37	3,44
50	3,34	3,38	3,34

- 128 033472

Таблица 47

Статистический анализ

Все параметры
R-квадрат	0,993397
R-квадрат скорректированный	0,987894
средняя квадратичная ошибка	0,030551
Среднее ответа	3,545833
Наблюдения (или сумма весов)	12
Дисперсионный анализ
Источник	DF	Сумма квадратов	Среднее квадратичное	F отношение
Модель	5	0,84249167	0,168498	180,5339
Ошибка	6	0,00560000	0,000933	Prob > F
Исправленное среднее	И	0,84809167		<,0001*
Анализ значимости различия
Источник	Nparm	DF	Сумма квадратов	F отношение	Prob > F
ПАВ	2	2	0,00606667	3,2500	0,1106
Метионин	3	3	0,83642500	298,7232	<,0001*

* Значимое

b). Композиции гНиРН20/инсулина.

Метионин тестировали на его способность предотвращать окисление гНиРН20 в композициях гНиРН20/инсулина. Композиции содержали 100 ед./мл инсулина (Organon Insulin API, рекомбинантный человеческий инсулин SIHR 143, исходный раствор, приготовленный, как описано в примере 1), 5 мкг/мл rHuPH20, 20 мМ Трис/HCl, pH 7,4, 80 мМ NaCl, 0,03% полоксамера 188, 0,1% фенола и 0,1% м-крезола в присутствии или в отсутствие 40 мМ метионина. Препараты инкубировали при 30°С в течение 5 недель, чтобы затем оценить пик окисления rHuPH20. С помощью RP-HPLC было показано, что пик ox-1 был значительно меньше в композициях, содержащих метионин, чем в композициях, которые не содержат метионин.

2. Метионин как общий стабилизатор.

Метионин далее анализировали на его способность предотвращать потерю ферментативной активности rHuPH20 при более высоких температуре и содержании консерванта. Чтобы оценить влияние метионина на ферментативную активность rHuPH20 при разных концентрациях NaCl и pH, было проведено исследование с планом эксперимента (DOE), соответствующим методологии поверхности отклика (RSM). Основные композиции содержали 100 ед./мл инсулина (Organon Insulin API, рекомбинантный человеческий инсулин SIHR 143; исходный раствор получали, как описано в примере 1), 5 мкг/мл rHuPH20, 20 мМ Трис/HCl, 0,1% м-крезола, 0,1% фенола и 0,01% полоксамера 188. Диапазон концентраций метионина находился между 40 и 80 мМ, диапазон концентраций NaCl находился между 70 и 110 мМ и диапазон pH находился между 7,2 и 7,6. Композиции инкубировали при 30°С в течение 4 недель или при 35°С в течение 5 дней, после чего определяли ферментативную активность rHuPH20, как описано в примере 2 выше.

Полученные данные представлены в табл. 48 ниже. Статистический анализ данных представлен в табл. 49-50 ниже. Из этих данных видно, что концентрация NaCl оказывает существенное влияние на стабильность rHuPH20 как при 30°С, так и при 35°С. pH оказывает существенное влияние при 35°С. Метионин не проявил стабилизирующего действия в отношении rHuPH20 в диапазоне концентраций между 40 и 80 мМ. Последующие исследования показали, что результаты оказались одинаковыми в присутствии или в отсутствие метионина. В композиции с исходным rHuPH20 ферментативная активность упала с 650 ед./мл до 525 и 522 ед./мл при 1 и 20 мМ метионина, соответственно, после хранения при 30°С в течение одного месяца. Таким образом, метионин выступает в качестве антиоксиданта, но не усиливает общую стабильность rHuPH20 в присутствии консерванта и при повышенной температуре.

- 129 033472

Таблица 48

Влтание метионина, NaCl и pH на активность rHuPH20 в композициях инсулина-РН20

Метионин (мМ)	NaCl (мМ)	pH	Активность rHuPH20 (ед/мл)
30°С, 4 Н	35°С,5Д
40	по	7,4	559	462
60	по	7,2	558	518

60	90	7,4	551	432
40	90	7,2	539	459
60	90	7,4	530	418
80	110	7,4	556	475
40	70	7,4	456	303
40	90	7,6	508	349
60	ПО	7,6	552	430
60	70	7,6	444	258
60	90	7,4	522	415
60	90	7,4	525	426
60	70	7,2	455	414
80	90	7,6	467	326
80	90	7,2	503	428
80	70	7,4	452	341
60	90	7,4	500	401

Таблица 49

Активность НиРН20, измеренная после хранения при 30°С в течение 2 недель

Все параметры
R-квадрат	0,91826
R-квадрат скорректированный	0,813165
средняя квадратичная ошибка	17,88843
Среднее ответа	510,4541
Наблюдения (или сумма весов) Дисперсионный анализ		17	—
Источник	DF	Сумма квадратов	Среднее квадратичное	F отношение
Модель	9		25163,516	2795,95	8,7374
Ошибка	7			2239,972	320,00	Prob > F
исправленное среднее	16		27403,488		0,0046*
Анализ значимости различия
Источник	Nparm	DF	Сумма	F отношение	Prob > F
				квадратов
Метионин	1	1		884,795	2,7650	0,1403
NaCl	1	1		21696,424	67,8022	<,0001*
pH	1	1		882,210	2,7569	0,1408
Метионин*Метионин	1	1		349,423	1,0920	0,3308
Метионин *NaCl	1	1		0,936	0,0029	0,9584
NaCl*NaCl	1	1		487,419	1,5232	0,2570
Метионин *рН	1	1		6,812	0,0213	0,8881
NaCl*pH	1	1		7,784	0,0243	0,8805
рН*рН	1	1	674,368	2,1074	0,1899

* Значимое

- 130 033472

Таблица 50

Активность HuPH20, измеренная после хранения при 35°С в течение 5 дней

Все параметры
R-квадрат	0,970969
R-квадрат скорректированный	0,933643
средняя квадратичная ошибка	17,2642
Среднее ответа	403,3303
Наблюдения (или сумма весов)	17
Дисперсионный анализ
Источник	DF	Сумма квадратов	Среднее квадратичное	F отношение
Модель	9	69779,522	7753,28	26,0131
Ошибка	7	2086,367	298,05	Prob > F
исправленное среднее	16	71865,889		0,0001*
Анализ значимости различия
Источник	Nparm	DF	Сумма квадратов	F отношение	Prob > F
Метионин	1	1	1,347	0,0045	0,9483
NaCl	1	1	40555,093	136,0670	<,0001*
pH	1	1	25833,100	86,6730	<,0001*
Метионин*Метионин	1	1	1473,541	4,9439	0,0616
Метионин *NaCl	1	1	146,858	0,4927	0,5054
NaCl*NaCl	1	1	84,069	0,2821	0,6118
Метионин *рН	1	1	14,175	0,0476	0,8336
NaCl*pH	1	1	1176,764	3,9482	0,0873
рН*рН	1	1	345,281	1,1585	0,3175

*Значимое

С. Анализ потенциальных стабилизаторов для композиций гНиРН20/инсулина.

Различные соединения подвергали анализу на их способность действовать в качестве стабилизаторов для белков в композициях гНиРН20/инсулина. В число стабилизаторов были включены аминокислоты и их производные, амины, полиолы, соли и буферы и другие соединения (см. ниже табл. 51). Каждое соединение подвергали анализу, как правило, в двух концентрациях, для определения его влияния на ферментативную активность гНиРН20 и растворимость инсулина. Основная композиция обычно содержала 100 ед./мл инсулина/аналога инсулина, 5 мкг/мл гНиРН20, 20 мМ Трис/НС1, 0,15% м-крезола и 0,2% фенола, рН 7,3±0,1. Композиции, содержащие 100-140 мМ NaCl, были использованы в качестве эталонных композиций, и потенциальные стабилизаторы в них были полностью или частично заменены на NaCl. Ферментативную активность rHuPH20 в образцах, инкубированных при 30°С в течение приблизительно одной недели, измеряли, как описано выше в примере 2. Растворимость инсулина в образцах, хранившихся при 5°С, оценивали путем RP-HPLC (см. пример 3 выше).

Результаты приведены ниже в табл. 51. Определение было полуколичественным в сравнении с NaCl. Большинство тестируемых соединений не влияло на растворимость инсулина, в то время как некоторые приводили к снижению растворимости инсулина. Предыдущие данные (см. примеры 8-9) показали, что рН и соль являются условиями, которые потенциально могут влиять на заряд белка в растворе и растворимость инсулина. В текущем анализе молекулы или соединения, содержащие двухвалентные катионы (Mg²⁺ (хлорид магния) и SO4^2- (сульфат натрия) и Lys-Lys) приводили к сильному осаждению инсулина. Вероятно, механизм отталкивания зарядов может быть важным для предотвращения взаимодействий молекул инсулина друг с другом. Lys-Lys, хлорид магния и олигомеры гиалуроновой кислоты (НА, 4-16-меры) были охарактеризованы как молекулы, которые стабилизируют rHuPH20 сильнее, чем NaCl. В связи с тем, что Lys-Lys и хлорид магния снижают растворимость инсулина, они не считались подходящими стабилизаторами при высоких концентрациях. Снижение концентрации Lys-Lysa ослабляет его влияние на растворимость инсулина.

- 131 033472

Таблица 51

Результаты анализа стабилизаторов для гНиРН20/инсулина

Категория	Название вещества	Влияние на ферментативную активность гНиРН20	Влияние на растворимость инсулина
Аминокислота, производное аминокислоты	L-аргинин	Схожее действие с NaCl	Значительно снижает растворимость; вызывает сильное осаждение
Глутамин	Нет влияния	Нет влияния
Глицин	Нет влияния	Нет влияния
Лизин	Нет влияния	Нет влияния
Метионин	Нет влияния	Нет влияния
Пролин	Нет влияния	Нет влияния
Lys-Lys	Сильный стабилизатор	Снижает растворимость
Глицин-глицин	Нет влияния	Нет влияния
	Триметиламин оксид (ТМАО)	Нет влияния	Нет влияния
Бетаин	Нет влияния	Нет влияния
Полиолы	Глицерол	Нет влияния	Нет/незначительный эффект; может незначительно снижать образование кристаллов
Сорбитол	Нет влияния	Нет/незначительный эффект; может незначительно снижать образование кристаллов
Маннитол	Нет влияния	Нет/незначительный эффект; может незначительно снижать образование кристаллов
Инозитол	Нет влияния	Нет влияния
Сахароза	Нет влияния	Нет/незначительный эффект; может незначительно снижать образование кристаллов
Трегалоза	Нет влияния	Нет/незначительный эффект; может незначительно снижать образование кристаллов
Соли и буферы	Хлорид магния	эффективный стабилизатор	Осаждение
Сульфат натрия	Нет влияния	Усиливает осаждение в сравнении с NaCl
Трис (100 мМ)	Нет влияния	нет эффекта
Бензоат натрия	Нет влияния	Снижает осаждение в сравнении с NaCl
Другие	Олигомеры гиалуроновой кислоты (НА) (4-16-меры)	эффективный стабилизатор	Нет влияния
Человеческий сывороточный альбумин	Нет влияния	Нет влияния
Фенил-масляная кислота	Нет влияния	Нет влияния
Таурохолат	Нет влияния - может дестабилизировать	Нет влияния
PVP	Неясное влияние	Нет влияния

D. Влияние олигомеров HA на композиции гНиРН20/инсулина.

Олигомеры НА были дополнительно проанализированы на их способность стабилизировать композиции гНиРН20/инсулина. Олигомеры НА являются субстратом/продуктом ферментативной реакции гНиРН20 с гиалуроновой кислотой и поэтому, вероятно, могут связываться с активным центром фермента, тем самым оказывая стабилизирующее действие. Чтобы оценить влияние рН, концентрации NaCl и концентрации олигомеров НА на общую стабильность гНиРН20/инсулина, было проведено исследование с планом эксперимента (DOE), соответствующим методологии поверхности отклика (RSM).

Основная композиция содержала 3,75 мг/мл инсулина (Organon Insulin API, рекомбинантный человеческий инсулин SIHR 143, исходный раствор получали, как описано в примере 1), 5 мкг/мл rHuPH20, 15 мМ Трис/HCE 0,01% ZnCl₂, 0,01% полоксамера 188, 0,15% фенола и 0,15% м-крезола. В общей сложности было проанализировано 17 образцов с тремя различными значениями pH (7,1, 7,3 и 7,5), тремя концентрациями NaCl (50, 75 и 100 мМ) и тремя концентрациями олигомеров HA (1, 5,5 и 10 мг/мл). Активность фермента rHuPH20 измеряли в образцах, инкубированных при 30°С в течение 1 недели или в образцах, хранившихся при 2-8°С в течение 9 месяцев. Окисление rHuPH20 определяли методом RP- 132 033472

HPLC в образцах, хранившихся при 5°С в течение 9 месяцев. Содержание инсулина было определено с помощью RP-HPLC в образцах, хранившихся при температуре 2-8°С в течение 9 месяцев.

Композиции и результаты приведены в табл. 52 ниже. Содержание инсулина выражено как % обнаружения эталонного стандарта USP. Процент (%) площади пика окисления rHuPH20 является суммой ox1 (основного) и ox-2 (минорного) пиков. Статистический анализ представлен в табл. 53 ниже. Как показано в табл. 53, концентрации HA и NaCl имеют значительное влияние на ферментативную активность rHuPH20 при анализе после инкубации при 30°С в течение 1 недели. По мере увеличения концентрации NaCl и HA ферментативная активность rHuPH20 также увеличивается. В особенности это верно, когда концентрации обоих вспомогательных веществ были достаточно высокими, что указывает на существенное взаимодействие между этими двумя факторами (см. таблт 53, Р=0,0150).

Таблица 52 Влияние НА, pH и NaCl на ферментативную активность rHuPH20 и растворимость инсулина

№ измерения	pH	НА, мг/мл	NaCl, мМ	Ферментативная активность (ед/мл) 30°С, 1 неделя	Содержание инсулина	% площади пика окисления rHuPH20	Ферментативная активность (ед/мл) 2-8°С, 9 месяцев
1	7,5	1	75	254	92,08	27,09	574
2	7,1	1	75	341	52,38	26,43	576
3	7,3	10	50	267	91,58	75,03	515
4	7,3	1	50	173	92,08	29,00	562
5	7,3	1	100	136	45,33	30,64	531
6	7,1	5,5	100	407	21,99	55,72	521
7	7,3	5,5	75	273	89,07	58,19	523
8	7,3	5,5	75	296	85,73	55,63	506
9	7,3	5,5	75	257	87,99	58,29	504
10	7,1	5,5	50	363	82,41	55,54	524
11	7,5	10	75	389	91,16	70,57	495
12	7,3	5,5	75	357	87,63	58,61	505
13	7,3	10	100	537	43,57	72,43	521
14	7,1	10	75	510	38,06	72,09	494
15	7,3	5,5	75	391	86,17	56,13	510
16	7,5	5,5	50	313	91,68	52,36	489
17	7,5	5,5	100	424	89,91	53,63	478

Таблица 53

Статистический анализ DOE исследования влияния HA, pH, и NaCl на ферментативную активность rHuPH20 после инкубации при 30°С в течение 1 недели

Все параметры
R-квадрат	0,869567
R-квадрат скорректированный	0,768119
средняя квадратичная ошибка	51,19549
Среднее ответа	334,5882
Наблюдения (или сумма весов)	17
Дисперсионный анализ
Источник	DF	Сумма квадратов	Среднее квадратичное	F отношение
Модель	7	157261,32	22465,9	8,5716
Ошибка	9	23588,80	2621,0	Prob > F
исправленное среднее	16	180850,12		0,0023*
Анализ значимости различия
Источник	Nparm	DF	Сумма квадратов	F отношение	Prob > F
pH	1	1	7260,125	2,7700	0,1304
НА	1	1	79800,125	30,4467	0,0004*
NaCl	1	1	18818,000	7,1798	0,0252*
рН*рН	1	1	26012,463	9,9247	0,0117*
НА*НА	1	1	1667,411	0,6362	0,4456
HA*NaCl	1	1	23562,250	8,9899	0,0150*
NaCl*NaCl	1	1	1167,253	0,4454	0,5213

* Значимое

- 133 033472

Было отмечено, что практически во всех предыдущих исследованиях по оценке композиций инсулина/гНиРН20 в отсутствие HA повышение pH оказывает существенное отрицательное влияние на ферментативную активность гНиРН20, особенно в интервале pH от 6,0 до 8,0. В противоположность этому, в данном исследовании, когда НА был включен в композиции, pH, по-видимому, влияет незначительно или вообще не влияет на ферментативную активность гНиРН20. Таким образом, присутствие НА в композиции инсулина/гНиРН20 уменьшает или предотвращает негативное влияние, оказываемое высоким рН на ферментативную активность гНиРН20.

Для дополнительной оценки полезных свойств НА как стабилизатора в образцах, которые хранились при температуре 2-8°С в течение 9 месяцев, определяли содержание инсулина с помощью RPHPLC. Данные о содержании инсулина и статистический анализ результатов приведены в табл. 54 и 55 ниже. Результаты наглядно демонстрируют влияние pH и концентрации NaCl на растворимость инсулина (р<0,0001 для обоих факторов). При увеличении pH увеличивается и растворимость инсулина. С увеличением концентрации NaCl растворимость инсулина уменьшается. Влияние НА на растворимость/содержание инсулина было незначительным (р=0,2755). Таким образом, олигомеры HA могут быть вспомогательным веществом/стабилизатором для композиций гНиРН20/инсулина или гНиРН20/аналога инсулина.

Длительное хранение композиций, содержащих олигомеры НА, показало значительное усиление окисления rHuPH20 по сравнению с композициями, которые не содержали НА. Оказалось, что уровень окисления хорошо коррелируют с концентрацией HA, но не зависит от pH или концентрации NaCl (см. табл. 55 и 56 ниже). НА содержит глюкуроновую кислоту, которая может быть потенциальным донором кислорода, так что может быть нужен антиоксидант или акцептор кислорода в том случае, если HA является вспомогательным веществом в финальной композиции гHuPH20-инсулина. В этом исследовании некоторые из композиций были сильно окислены, но ферментативная активность оставалась приемлемой (см. табл. 55), что говорит о том, что окисленный rHuPH20 сохраняет значительную ферментативную активность. Многофакторный статистический анализ показал, что на ферментативную активность rHuPH20 в этих образцах после длительного хранения при низкой температуре существенно влияла HA (р=0,004, снижение ферментативной активности), но не из-за pH или NaCl (p=0,1715 и 0,4766 соответственно) (см. табл. 56 ниже).

Таблица 54 Влияние HA, pH и NaCl на содержание инсулина в образцах после хранения при 2-8°С в течение 9 месяцев

Все параметры
R-квадрат	0,978698
R-квадрат скорректированный	0,951309
Средняя квадратичная ошибка	5,231467
Среднее ответа	74,63647
Наблюдения (или сумма весов)	17
Дисперсионный анализ
Источник	DF	Сумма квадратов	Среднее квадратичное	F отношение
Модель	9	8801,6746	977,964	35,7335
Ошибка	7	191,5778	27,368	Prob > F
исправленное среднее	16	8993,2524		<,0001*
Оценка параметра
Параметр	Оценка	Стандартная ошибка	t отношение	РгоЬ>|1|(вероятность получения наблюдаемого tотношения)
постоянное слагаемое	-626,7315	67,81624	-9,24	<,0001*
pH	106,24375	9,248015	11,49	<,0001*
НА	-0,486111	0,411023	-1,18	0,2755
NaCl	-0,78475	0,073984	-10,61	<,0001*
(рН-7,3)*(рН-7,3)	-194,2562	63,73755	-3,05	0,0186*
(рН-7,3)*(НА-5,5)	3,7222222	2,906371	1,28	0,2411
(НА-5,5)*(НА-5,5)	-0,549519	0,125901	-4,36	0,0033*
(pH-7,3)*(NaCl-75)	2,9325	0,523147	5,61	0,0008*
(HA-5,5)*(NaCl-75)	-0,0028	0,023251	-0,12	0,9075
(NaCl-75)*(NaCl-75)	-0,01288	0,004079	-3,16	0,0160*

* Значимое

- 134 033472

Таблица 55

Влияние НА, pH и NaCl на окисление rHuPH20 при хранении при 2-8°С в течение 9 месяцев

Все параметры
R-квадрат	0,997321
R-квадрат скорректированный	0,993876
средняя квадратичная ошибка	1,253363
Среднее ответа	53,37529
Наблюдения (или сумма весов)	17
Дисперсионный анализ
Источник	DF	Сумма квадратов	Среднее квадратичное	F отношение
Модель	9	4093,6132	454,846	289,5415
Ошибка	7	10,9964	1,571	Prob > F
исправленное среднее	16	4104,6096		<,0001*
Оценка параметра
Параметр	Оценка	Стандартная ошибка	t отношение	Prob>|t|
постоянное слагаемое	58,118819	16,24751	3,58	0,0090*
pH	-3,83125	2,215653	-1,73	0,1274
НА	4,9155556	0,098473	49,92	<0,0001*
NaCl	0,00245	0,017725	0,14	0,8940
(рН-7,3)*(рН-7,3)	-72,34375	15,27033	-4,74	0,0021*
(рН-7,3)*(НА-5,5)	-0,605556	0,696313	-0,87	0,4133
(НА-5,5)*(НА-5,5)	-0,26821	0,030164	-8,89	<0,0001*
(pH-7,3)*(NaCl-75)	0,0545	0,125336	0,43	0,6768
(HA-5,5)*(NaCl-75)	-0,009422	0,005571	-1,69	0,1346
(NaCl-75)*(NaCl-75)	-0,000262	0,000977	-0,27	0,7964

* Значимое

Таблица 56 Влияние HA, pH и NaCl на ферментативную активность rHuPH20 при хранении при 2-8°С в течение 9 месяцев

Все параметры
R-квадрат	0,8159
R-квадрат скорректированный	0,5792
средняя квадратичная ошибка	18,33595
Среднее ответа	519,2941
Наблюдения (или сумма весов)	17
Дисперсионный анализ
Источник	DF	сумма квадратов	среднее квадратичное	F отношение
Модель	9	10430,079	1158,90	3,4470
Ошибка	7	2353,450	336,21	Prob > F
исправленное среднее	16	12783,529		0,0584
Оценка параметра
Параметр	Оценка	Стандартная ошибка	t отношение	Prob>|t|
постоянное слагаемое	917,96806	237,6915	3,86	0,0062*
pH	-49,375	32,41369	-1,52	0,1715
НА	-6,055556	1,440608	-4,20	0,0040*
NaCl	-0,195	0,25931	-0,75	0,4766
(рН-7,3)*(рН-7,3)	-51,25	223,3959	-0,23	0,8251
(рН-7,3)*(НА-5,5)	0,8333333	10,18664	0,08	0,9371
(НА-5,5)*(НА-5,5)	1,3432099	0,441276	3,04	0,0187*
(pH-7,3)*(NaCl-75)	-0,4	1,833595	-0,22	0,8335
(HA-5,5)*(NaCl-75)	0,0822222	0,081493	1,01	0,3466
(NaCl-75)*(NaCl-75)	-0,00728	0,014297	-0,51	0,6263

* Значимое

- 135 033472

Пример 11. Влияние концентрации соли, pH и концентрации буфера на rHuPH20 в присутствии метилпарабена.

В этом примере для определения оптимальных pH, концентрации соли (NaCl) и концентрации буфера (Hepes) для стабильности rHuPH20 при повышенных температурах в присутствии фенольного консерванта метилпарабена была использована схема эксперимента Бокса-Бенкена. Чтобы оценить влияние концентрации буфера, соли и pH на активность rHuPH20 в неблагоприятных условиях воздействия повышенной температуры и перемешивания, было проведено исследование с планом эксперимента (DOE), соответствующим методологии поверхности отклика (RSM). Определяемые параметры включали ферментативную активность и чистоту/содержание, которые измеряли методом обращенно-фазовой HPLC.

Исследование было основано на DOE программного пакета Design-Expert® 7.1. (StatEase, Minneapolis, MN). Диапазоны и центральные значения концентраций Hepes, NaCl и pH, использованные в эксперименте, приведены в табл. 57 ниже. Для проведения исследования в общей сложности было приготовлено 13 различных композиций с 5 повторами центральных значений концентрации на основе случайной последовательности, которую создает программное обеспечение. Каждый образец содержал 100 мкг/мл rHuPH20 (из раствора 10 мг/мл в буфере гистидин/HCl, pH 6,5, 130 мМ NaCl), 0,20% метилпарабена (Fluka, Cat. No 85265) и 0,025% пропилпарабена (American Custom Chemicals, San Diego, Cat. No. CHEM19713) и различные концентрации Hepes (Calbiochem, Cat No. 391338) и NaCl (EMD, SX0418 -1), pH указан в табл. 58 ниже. pH доводили с помощью 1,0н. NaOH или HCl. Растворы были разделены на аликвоты в 2 мл стеклянных пробирках 1 типа (Wheaton, Cat. No. 223683) с резиновыми пробками (Wheaton, Cat. No. 224100-072) и алюминиевыми колпачками, по 2 пробирки на композицию. Образцы помещали в инкубатор с температурой 35°С. Один набор пробирок подвергали перемешиванию с помощью шейкера Titer Plate (LabLine) при 600 об/мин в течение 3 дней (35 + ag) (35 + перемешивание). Другой набор пробирок инкубировали при 35°С в течение 5 дней без перемешивания. Образцы были проанализированы после инкубации.

Таблица 57

Диапазоны и центральные значения концентраций Hepes, NaCl и pH

Фактор	Центральное значение	Диапазон
Hepes	И мМ	2-20 мМ
NaCl	150 мМ	120-180 мМ
pH	7	6-8

Таблица 58

Планирование схемы эксперимента Бокса-Бенкена для RSM, включая ответы

		Фактор 1	Фактор 2	Фактор 3	Ответ 1	Ответ 2	Ответ 3	Ответ 4
STD	№ измерения	NaCl мМ	Hepes мМ	pH	энзиматическая активность (35+ag)	SEC (35 + ag)*	энзиматическая активность (35)	SEC (35)*
5	1	120	11	6	2119	38,91	7,474	95,54
15	2	150	11	7	6944	78,50	8,260	95,82
10	3	150	20	6	5744	70,96	8,784	94,94
1	4	120	2	7	5228	63,06	6,958	84,71
16	5	150	11	7	7023	80,69	8,022	93,95
7	6	120	11	8	2138	34,15	2,829	62,12
6	7	180	11	6	5864	70,36	8,704	93,53
8	8	180	11	8	5297	63,89	6,052	59,80
12	9	150	20	8	4554	55,72	5,378	74,59
13	10	150	11	7	5709	74,53	8,184	91,14
И	11	150	2	8	4031	42,09	4,392	61,61
4	12	180	20	7	6192	69,69	8,708	94,85
9	13	150	2	6	8178	81,28	9,642	91,32
17	14	150	И	7	7464	80,22	8,651	93,58
3	15	120	20	7	7101	71,51	8,681	89,31
2	16	180	2	7	7194	77,18	8,755	93,34
14	17	150	11	7	6482	74,79	8,721	93,51

*Процент основного пика на гель-хроматографии (SEC) относительно эталона.

Ферментативную активность определяли, как описано в Примере 2b выше. Гель-хроматография (SEC) была использована для оценки чистоты путем определения процентной доли основного пика относительно эталонного образца (см. Пример 4, выше). SEC проводили с использованием следующих условий: 1х фосфатно-солевой буфер (PBS), колонка Toso BioScience G2000 SWXL, скорость потока состави- 136 033472 ла 1 мл/мин. Данные были получены, как описано выше, и значения были зарегистрированы и внесены в таблицу параметров в соответствии с последовательностью образцов с помощью программного обеспечения DOE. Данные приведены в табл. 58 выше.

Для анализа данных исходные значения были обработаны следующим образом. Так, сначала данные были аппроксимированы квадратичной моделью. ANOVA проводили на основе квадратичной модели, но параметры, как правило, было необходимо преобразовывать, чтобы сделать модель наиболее соответствующей всем следующим критериям: уровень значимости модели Р<0,05, р-значение для отсутствии согласия данных с моделью (Р>0,1), адекватный уровень точности >4 и предсказанное значение Rквадрат в пределах 0,2 из скорректированного R-квадрат. Наконец, чтобы убедиться в удовлетворительности допущений ANOVA, были проверены анализ остатков и диагностические графики. В некоторых случаях данные было необходимо преобразовать, чтобы достичь соответствия этим критериям; в тех случаях, когда исходные данные были преобразованы с помощью соответствующего математического уравнения, далее следовал статистический анализ, который описан ранее. Использованные модели ANOVA для модели, используемой для каждого ответа, изложены в табл. 59 ниже, которая содержит ответ, уравнение, модели информацию о том, использовалось ли преобразование, тип преобразования, Рзначение модели и Р-значение отсутствия согласия данных с моделью.

Таблица 59

Тест ANOVA для каждой модели

	Модель*	Преобразование	Р-значение модели	Р-значение отсутствия согласия данных с моделью
Ответ 1, ферментативная активность (35 °C - AG)	Y=A+C+A2+C2	Нет	Значимое Р=0,009	Не значимое Р=0,091
Ответ 2, основной пик SEC (35°С - AG)	У=А-ьС+А2+С2	Логит- преобразование	эначимОс Р=0,0007	ТТ_____________ТП—Λ 1 ΛΛ пс значимое г—υ,ιυ^
Ответ 3, ферментативная активность (35°С - 5D)	Y=A+B+C+AB+ ВС+АС+А2+В2+ С2	Нет	Значимое Р=0,0002	Не значимое Р=0,076
Ответ 4, основной пик SEC (35°С - 5D)	Y-A+B+C+ А2+С2	Логитпреобразование	Значимое ΡΟ,ΟΟΟΙ	Не значимое Р=0,147

* А - NaCl; В - Hepes; С - pH.

A. Влияние pH, NaCl и концентрации буфера на rHuPH20 при повышенной температуре и перемешивании.

Модели ANOVA показывают, что при интенсивном перемешивании при 35°С концентрация буфера не влияет на ферментативную активность и содержание/чистоту rHuPH20 (см. табл. 59 выше, ответы 1 и 2, при которых уравнение модели не включает буфер). Было сделано предположение, что rHuPH20 наиболее стабилен при pH 6,5-7,3 и концентрации NaCl 145-180 мМ. Вне этих диапазонов согласно модели активность rHuPH20 должна снижаться, в частности, при pH 8,0 и при самой низкой концентрации соли (120 мМ). В этих условиях ускоренной деградации самая высокая измеренная активность rHuPH20 была около 8100 ед./мл (STD 9 в табл. 56 выше), что составляет около 65% от ожидаемой активности rHuPH20 (около 12000 ед./мл) в расчете на 100 мкг/мл фермента. Аналогичные результаты были получены для чистоты/содержания rHuPH20, определяемых методом SEC; потеря основного пика содержания для наиболее стабильной композиции около 20% в сравнении с ожидаемым значением.

Оптимальные диапазоны концентрации соли и pH для ферментативной активности rHuPH20 оказались немного уже, чем таковые для содержания/чистоты rHuPH20. Таким образом, ферментативная активность rHuPH20 более чувствительна к внешним условиям, и поэтому определение ферментативной активности rHuPH20 является лучшим методом для определения стабильности.

B. Влияние pH, NaCl и концентрации буфера на rHuPH20 при повышенной температуре без перемешивания.

Данные показывают, что при более мягких условиях (т.е. без перемешивания) наблюдались меньшее снижение ферментативной активности и меньшие потери основного пика. Например, показатели в наиболее стабильных образцах соответствуют потере активности на 20% (по сравнению с 35% в образцах, инкубированных при перемешивании) и потерям основного пика менее 5% (по сравнению с 20% в образцах, инкубированных при перемешивании). Кроме того, модели ANOVA показывают, что концентрация соли не имеет существенного влияния на активность фермента. Ферментативная активность rHuPH20 сохраняется при pH менее 6,5, если концентрация соли составляет по меньшей мере 130 мМ. Кроме того, наибольшая ферментативная активность наблюдается при pH менее 7.

Пример 12. Исследование стабильности композиций инсулина лизпро/rHuPH20 или инсулина аспарт/rHuPH20 с консервантами.

Таблицы данных за шесть месяцев.

- 137 033472

В этом примере оценивали стабильность различных композиций инсулина лизпро/гНиРН20 при трех условиях хранения: 5°С, 25°С и 30°С в течение длительного времени. Одна из композиций также была оценена при двух физических стрессовых условиях ускоренной деградации: несколько циклов замораживания/оттаивания и перемешивание при 25°С. В композициях варьировали pH и концентрации консервантов. Стабильность оценивали путем анализа общего внешнего вида и таких характеристик как ферментативная активность гНиРН20 и чистота гНиРН20 и аналога инсулина. Композиции инсулина лизпро/гНиРН20 приведены в табл. 60 ниже.

Таблица 60

Композиции инсулина лизпро/гНпРН20 или инсулина аспарт/гНпРН20

№	рн	Буфер	Модификатор тоничности	ПАВ	Консервант	Ферментативная активность (API)
1	7,2	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	100 мМ Метионина	0,01 % Полоксамера 188	0,125% фенола	0,075 % мкрезола	600 ед/мл гНиРН20	3,5 мг/мл Лизпро или Аспарт
2	7,4	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	100 мМ Метионина	0,01 % Полоксамера 188	0,125 % фенола	0,075 % мкрезола	600 ед/мл гНнРН20	3,5 мг/мл Лизпро или Аспарт
3	7,6	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	100 мМ Метионина	0,01 % Полоксамера 188	0,125 % фенола	0,075 % мкрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Лизпро или Аспарт
4	7,2	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	100 мМ Метионина	0,01 % Полоксамера 188	0,10 % фенола	0,075 % мкрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Лизпро или Аспарт
5	7,4	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	100 мМ Метионина	0,01 % Полоксамера 188	0,10 % фенола	0,075 % мкрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Лизпро или Аспарт
6	7,6	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	100 мМ Метионина	0,01 % Полоксамера 188	0,10 % фенола	0,075 % мкрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Лизпро или Аспарт
7	7,2	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	100 мМ Метионина	0,01 % Полоксамера 188	0,14 % фенола	0,085 % мкрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Лизпро или Аспарт
8	7,6	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	100 мМ Метионина	0,01 % Полоксамера 188	0,14 % фенола	0,085 % мкрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Лизпро или Аспарт

мл каждой композиции хранили в 2 мл стеклянной боросиликатной пробирке USP типа 1 с пробкой из хлорбутиловой резины и алюминиевой крышкой. Каждую композицию инкубировали отдельно при 5±3°С, 25±2°С и 30±3°С и определяли стабильность через 0, 0,5, 1, 2, 3 и 6 месяцев. Композиция № 2 была подвергнута перемешиванию (650 об/мин) при 25°С в течение 24 ч. Композиция № 2 был подвергнута 5 циклам замораживания/оттаивания путём чередования условий хранения: -30 °С в морозильной камере и комнатная температура на столе. Образец инкубировали в каждом из условий, по меньшей мере 2 ч на каждый цикл (т.е. 2 ч при -30°С в морозильной камере, затем перемещение и инкубация в течение 2 ч при комнатной температуре на столе считали 1 циклом).

Стабильность оценивали путем измерения pH, по внешнему виду, в том числе по осмоляльности, мутности при 350 нм и путём качественного наблюдения, по ферментативной активности гНиРН20, процентам чистоты и обнаружения rHuPH20 по данным RP-HPLC, процентам чистоты и обнаружения инсулина лизпро по данным RP-HPLC и проценту чистоты инсулина лизпро по данным не денатурирующей и денатурирующей SEC (см. примеры 2-5). Для осмоляльности приемлемые критерии стабильности составляли 275±30 мОсм/кг. Для внешнего вида приемлемыми критериями стабильности были прозрачность и бесцветность раствора. Для активности rHuPH20 приемлемым критерием стабильности была активность композиции >375 ед./мл (>75 ед./мкг). Для процента обнаружения rHuPH20 по данным RPHPLC целевым приемлемым значением считалось 3-7 мкг/мл (60-140%). Для чистоты инсулина по данным RP-HPLC целевым приемлемым значением считалось >90%. Для обнаружения инсулина по данным RP-HPLC целевым приемлемым значением считалось 90-100 ед./мл (90-110%). Для процента чистоты по данным не денатурирующей SEC целевым приемлемым значением считалась величина пика для формы инсулина с высокой молекулярной массой (HMWt) <2%. Для процента чистоты по данным денатурирующей SEC целевым приемлемым значением считалось считалась величина пика для формы инсулина с высокой молекулярной массой (HMWt) <2%.

Результаты приведены ниже. Было установлено, что композиции инсулина лизпро/гHuPH20, приведенные в табл. 60 под номерами 1, 2 и 3, содержали низкие концентрации инсулина лизпро при Т=0 (91,22%, 91,40% или 91,30% соответственно), тогда как другие препараты содержали примерно 100% белка.

1. Временная точка 3 месяца.

а). Инсулин лизпро.

- 138 033472

Все исследованные композиции были стабильны при 5±3°С во временной точке 3 месяца как в отношении rHuPH20, так и инсулина лизпро. Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах. Содержание инсулина лизпро было низким (около 91% обнаружения от целевого) для композиций № 1-3, но, вероятно, это связано с ошибкой при подготовке композиций, так как процент обнаружения был постоянным, как и ожидалось при 5°С.

При 25±2°С rHuPH20 во всех композициях был стабильным, за исключением композиции № 8, в которой активность упала ниже целевого значения для ферментативной активности rHuPH20 375 ед./мл за период с 2 до 3 месяца. Это не было неожиданным, так как композиция № 8 имела высокие pH и концентрацию консерванта, rHuPH20 более стабилен при низких pH и концентрации консерванта. Инсулин лизпро был в целом стабильным во всех композициях при 25°С во временной точке 3 месяца, но его чистота стала несколько снижаться по данным RP-HPLC после примерно 1 месяца.

При 30±3°С только композиции с самым низким pH (№ 1 и 4, pH 7,2) имели значение ферментативной активности rHuPH20 выше целевого (>375 ед./мл) через 1 месяц инкубации при 30°С. Композиция № 2 имела ферментативную активность выше целевого значения после 2 недель инкубации при 30°С, но через 1 месяц ферментативная активность была ниже 375 ед./мл. Инсулин лизпро в целом был стабилен в пределах целевого значения в течение 3 месяцев во всех композициях, инкубированных при 30°С, но снижение чистоты было несколько большим, чем при 25°С. Снижение чистоты сопровождалось снижением содержания при 30°С, но этого не наблюдалось при 25°С. После временной точки 3 месяца хранение при 30°С было завершено.

b). Инсулин аспарт.

Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах. Все исследованные композиции были стабильны при 5±3°С до временной точки 3 месяца как в отношении rHuPH20, так и инсулина аспарт.

Все композиции, хранящиеся при 25±2°С до 3 месяцев, соответствовалицелевым показателям для rHuPH20, за исключением композиции № 7, в которой активность rHuPH20 упала ниже целевого значения 375 ед./мл в период с 2 до 3 месяца. Это оказалось несколько неожиданным, так как композиции № 7 и 8 являлись идентичными, за исключением значений pH (7,2 и 7,6 соответственно), и в целом, rHuPH20 был более стабильным при более низком pH. Этот неожиданный результат, вероятно, связан с тем, что композиция № 7 изначально имела более низкие активность (500 ед./мл) и содержание (93,8%), чем целевые показатели (600 ед./мл и 100% соответственно), что дополнительно подтверждается приемлемыми значениями чистоты для композиций № 7 и 8. Инсулин аспарт был стабильным во всех композициях при 25°С до временной точки 3 месяца, но наблюдались некоторые тенденции к снижению чистоты и % обнаружения.

rHuPH20 был менее стабильным во всех композициях при 30±3°С по сравнению с хранением при 25°С. Композиции с самыми низкими pH (№ 1 и 4, pH 7,2) и концентрациями консерванта (№ 4 и 5, общий уровень консерванта 0,175%) также имели значения ферментативной активности rHuPH20 выше целевого значения после 1 месяца инкубации при 30°С. Композиция № 2 имела значение чуть ниже целевого значения после 1 месяца инкубации при 30°С, а композиция № 6 имела значение немного выше целевого значения для активности через 1 месяц, однако немного ниже через 2 недели. Композиции № 16 в целом оставались в рамках целевого значения для ферментативной активности rHuPH20 после 2 недель при 30°С. Инсулин аспарт был стабильным в пределах целевого значения в течение 3 месяцев во всех композициях при 30°С, но тенденции к снижению чистоты и % обнаружения были несколько больше, чем таковые при 25°С. Хранение при 30±3°С было завершено после временной точки 3 месяца.

2. Временная точка 6 месяцев.

a) . Инсулин лизпро.

Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах. Все исследованные композиции были стабильны при 5°С во временной точке 6 месяцев как в отношении rHuPH20, так и инсулина лизпро. Низкое содержание инсулина лизпро (около 91% обнаружения от требуемого) в композициях № 1-3 наблюдалось как и ранее, но процент обнаружения не менялся при 5°С.

При 25°С rHuPH20 продолжал быть стабильным (>375 ед./мл активности rHuPH20) в композициях №№ 1, 2, 4 и 5. Эти композиции имели более низкие значения pH (7,2 или 7,4) и требуемый USP уровень консерванта (№№ 1, 2: 0,125% фенола, 0,075% м-крезола) или немного более низкий уровень консерванта (№№ 4, 5: 0,1% фенола, 0,075% м-крезола). Все 8 композиций сохранили значения процента обнаружения rHuPH20 в пределах целевого значения через 6 месяцев, но было заметно снижение как чистоты rHuPH20, так и обнаружения по данным RP-HPLC. После 3 месяцев инкубации при 25°С для инсулина лизпро наблюдалось снижение чистоты по данным RP-HPLC, содержания по данным RP-HPLC и чистоты по данным не денатурирующей SEC, причем данные изменения становились более заметными через 6 месяцев. Чистота по данным денатурирующей SEC снижалась незначительно, все значения основных пиков были >99,4%, так что любая потеря в этой точке является очень небольшой.

b) . Инсулин аспарт.

- 139 033472

Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах. Все исследованные композиции были стабильными при 5±3°С во временной точке 6 месяцев как в отношении rHuPH20, так и инсулина аспарт.

rHuPH20 также имел ферментативную активность на уровне целевого значения активности (>375 ед./мл) в 4 композициях, хранившихся при 25±2°С (№№ 1, 2, 4 и 5) в течение 6 месяцев. Эти композиции имели наиболее низкие pH (7,2 или 7,4) и требуемый USP уровень консерванта (№№ 1, 2: 0,125% фенола, 0,075% м-крезола) или несколько более низкий уровень консерванта (№№ 4, 5: 0,1% фенола, 0,075% мкрезола). Все 8 композиций оставались в пределах значения: целевого значения процента обнаружения rHuPH20 через 6 месяцев, но было заметно некоторое снижение чистоты и обнаружения rHuPH20 по данным RP-HPLC. Тенденции к ухудшению показателей инсулина аспарт были отмечены после 3 месяцев инкубации при 25°С и стали более очевидными после 6 месяцев при анализе чистоты с помощью RPHPLC, содержания с помощью RP-HPLC и чистоты с помощью не денатурирующей SEC. Чистота по данным денатурирующей SEC лишь в небольшой степени имела тенденцию к снижению, при этом значения всех основных пиков по-прежнему были >99,5%, так что любая потеря в этой точке является очень небольшой.

3. Условия ускоренной деградации: перемешивание при 25°С и замораживание/оттаивание.

a) . Инсулин лизпро.

Композиция № 2 оказалась мутной после перемешивания при 25°С в течение 24 ч. Инсулин лизпро был стабильным при обоих условиях, хотя процент обнаружения снизился до примерно 75% после 5 циклов замораживания/оттаивания. В образце, подвергнутом перемешиванию при 25°С в течение 24 ч, были обнаружены значения активности rHuPH20, соответствующие целевому значению (>375 ед./мл). После 5 циклов замораживания/оттаивания rHuPH20 потеряла ферментативную активность.

b) . Инсулин аспарт.

Для композиции № 2 инсулина аспарт были получены результаты, аналогичные тем, что были получены для инсулина лизпро в условиях перемешивания или замораживания/оттаивания.

Пример 13. Исследование стабильности композиций инсулина лизпро/rHuPH20, инсулина аспарт/rHuPH20 или инсулина глулизин/rHuPH20 с различными консервантами.

Таблицы данных для периодов два или три месяца.

В этом примере стабильность различных композиций инсулина лизпро-rHuPH20, инсулина аспартrHuPH20 или инсулина глулизин-rHuPH20 была оценена при четырех различных условиях хранения: 5°С, 15°С, 25°С и 30°С в течение длительного времени. В композициях различались pH, концентрация соли и концентрация глицерина. Стабильность определяли путем оценки общего внешнего вида и ряда характеристик, таких как ферментативная активность rHuPH20 и чистота rHuPH20 и аналога инсулина. Это исследование было проведено с целью получения данных для 3 фазы клинической разработки с 3 уровнями консервантов: уровень консервантов, содержащийся в коммерческих препаратах инсулина (Новолог) или уровни консервантов, соответствующие ЕР-В (Европейская фармакопея) и USP (Фармакопея США).

Композиции инсулина лизпро/rHuPH20 приведены в табл. 61 ниже. Композиции инсулина аспарт/rHuPH20 приведены в табл. 62. Композиции инсулина глулизин/rHuPH20 приведены в табл. 63. Основная композиция содержала 3,5 мг/мл инсулина лизпро или аспарт, 600 ед./мл rHuPH20, 30 мМ Трис/HCl, 20 мМ метионина и 0,01% полоксамера 188. pH, концентрации NaCl и концентрации глицерина изменялись для трех основных концентраций консервантов.

Для композиций инсулина лизпро/rHuPH20 и инсулина аспарт/rHuPH20, приведенных в табл. 61 и 62, композиции А1-А4 имеют уровень консерванта, как в коммерческом препарате Новолог®: 0,15% фенола и 0,172% м-крезола; композиции В1-В5 имеют уровень консерванта, соответствующий ЕР-В: 0,1% фенола и 0,15% м-крезола; и композиция U1 имеет уровень консерванта, соответствующий USP: 0,125% фенола и 0,075% м-крезола.

Кроме того, для композиций инсулина глулизин/rHuPH20, приведенных в табл. 63, композиция 1 имеет уровень консерванта, как в коммерческом препарате Новолог®: 0,15% фенола и 0,172% м-крезола. Композиция 2 имеет уровень консерванта, соответствующий ЕР-В: 0,1% фенола и 0,15% м-крезола. Композиция 3 имеет уровень консерванта, соответствующий USP: 0,125% фенола и 0,075% м-крезола. Композиции 4-7 имеют уровень консерванта, как в коммерческом препарате Новолог®, и в них изменяется один или несколько параметров в сравнении с композицией 1. Различия в составах композиций указаны жирным шрифтом. Композиция 4 имеет более высокую концентрацию NaCl, а композиция 7 имеет другое поверхностно-активное вещество. Композиции 5 и 6 отличались от композиции 4 по концентрации метионина и pH.

- 140 033472

Таблица 61

Композиции инсулина лизпро/гНиРН20

№	pH	Буфер	Модификатор тоничности	ПАВ	Консерванты	АР!
А1	7,6	30 мМ Трис/НС1	100 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера!88	0,15% Фенола	0,172 %мКрезола	600 ед/мл гНиРН20	3,5 мг/мл Лизпро
А2	7,6	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,15 % Фенола	0,172 %м- Крезола	600 ед/мл гНиРН20	3,5 мг/мл Лизпро
АЗ	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % 0,15 % Полоксамера 188 \ Фенола	0,172 % мКрезола	600 ед/мл гНиРН20	3,5 мг/мл Лизпро
А4	7,6	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	20 мМ Метионина	70 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,15 % Фенола	0,172 %мКрезола	600 ед/мл гНиРН20	3,5 мг/мл Лизпро
В1	7,6	30 мМ Трис/НС1	100 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,1 % Фенола	0,15 %мКрезола	600 ед/мл гНиРН20	3,5 мг/мл Лизпро
В2	7,6	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,1 % Фенола	0,15 %мКрезола	600 ед/мл гНиРН20	3,5 мг/мл Лизпро
вз	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,1 % Фенола	0,15 %мКрезола	600 ед/мл гНиРН20	3,5 мг/мл Лизпро
В4	7,6	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	20 мМ Метионина	70 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,1 % Фенола	0,15 %мКрезола	600 ед/мл гНиРН20	3,5 мг/мл Лизпро
В5	7,2	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	20 мМ Метионина	70 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,1 % Фенола	0,15 %мКрезола	600 ед/мл гНиРН20	3,5 мг/мл Лизпро
U1	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,125% Фенола	0,075 % мКрезола	600 ед/мл гНиРН20	3,5 мг/мл Лизпро

Таблица 62

Композиции инсулина аспарт/гНиРН20

№	pH	Буфер	Модификатор тоничности	ПАВ	Консерванты	API
А1	7,4	30 мМ Трис/НС1	100 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,15 % Фенола	0,172 %мКрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Ас парта
А2	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,15% Фенола	0,172 %мКрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Аспарта
АЗ	7,2	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,15 % Фенола	0,172 % м- Крезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Аспарта
А4	7,6	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	20 мМ Метионина	70 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,15 % Фенола	0,172 % м- Крезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Аспарта
В1	7,4	30 мМ Трис/НС1	100 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,1 % Фенола	0,15 %мКрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Аспарта
В2	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,1 % Фенола	0,15 %м- Крезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Аспарта
ВЗ	7,2	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,1 % Фенола	0,15 %мКрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Аспарта
В4	7,6	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	20 мМ Метионина	70 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,1 % Фенола	0,15 %мКрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Аспарта
В5	7,2	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	20 мМ Метионина	70 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,1 % Фенола	0,15 %мКрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Аспарта
U1	7,2	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ Метионина	50 мМ Глицерина	0,01 % Полоксамера 188	0,125 % Фенола	0,075 % м- Крезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Аспарта

Таблица 63

Композиции инсулина глулизин/гНиРН20

№	pH	Буфер	Модификатор тоничности	ПАВ	Консерванты	API
1	7.3	20 мМ Трис/НС1	100 мМ NaCl	20 мМ Метионина	0,001 % Полисорбата 20	0.15% Фенола	0.172 %мКрезола	600 ед/мл rHuPH20	3.5 мг/мл Глулизина
2	7.3	20 мМ Трис/НС1	100 мМ NaCl	20 мМ Метионина	0.001 % Полисорбата 20	0.10% Фенола	0.150 %мКрезола	600 ед/мл rHuPH20	3.5 мг/мл Глулизина
3	7.3	20 мМ Трис/НС1	100 мМ NaCl	20 мМ Метионина	0.001 % Полисорбата 20	0.125 % Фенола	0.075 % мКрезола	600 ед/мл rHuPH20	3.5 мг/мл Глулизина
4	7,3	20 мМ Трис/НС1	140 мМ NaCl	20 мМ Метионина	0,001 % Полисорбата 20	0,15 % Фенола	0,172 %мКрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Глулизина
5	7,3	20 мМ Трис/НС1	140 мМ NaCl	ОмМ Метионина	0,001 % Полисорбата 20	0,15 % Фенола	0,172 %м- Крезола	600 ед/мл гНиРН20	3,5 мг/мл Глулизина
6	7,0	20 мМ Трис/НС1	140 мМ NaCl	20 мМ Метионина	0,001 % Полисорбата 20	0,15% Фенола	0,172 %м- Крезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Глулизина
7	7,3	20 мМ Трис/НС1	100 мМ NaCl	20 мМ Метионина	0,01 % Полоксамера 188	0,15% Фенола	0,172 %мКрезола	600 ед/мл rHuPH20	3,5 мг/мл Глулизина

- 141 033472 мл каждой композиции хранили и инкубировали при различных температурах, как описано в примере 12 выше, в 2 мл боросиликатных стеклянных пробирках типа 1 USP с пробкой из хлорбутиловой резины и алюминиевой крышкой. Измерения стабильности проводили в разное время: Т=0, 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 6 или 9 месяцев. Стабильность также оценивали путем измерения pH, определения внешнего вида, ферментативной активности rHuPH20, процента чистоты и обнаружения rHuPH20 с помощью RPHPLC, процента чистоты и обнаружения инсулина лизпро с помощью RP-HPLC и процента чистоты инсулина лизпро с помощью не денатурирующей и денатурирующий SEC (см. примеры 2-5 и 12). Критерии приемлемости стабильности или целевые значения для каждого определяемого параметра являлись теми же, что описаны в примере 12. Образцы оценивали на последующих временных точках, только если результаты были >30% от исходного уровня. Результаты приведены ниже.

1. Временная точка 1 месяц.

a) . Инсулин лизпро.

Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах. Все исследованные композиции были стабильны при 5±3°С до временной точки 1 месяц как в отношении rHuPH20, так и инсулина лизпро. Композиции, хранившиеся при 15±2°С, не анализировали во временной точке один месяц.

В большинстве композиций, хранившихся при 25±2°С, во временной точке 1 месяц rHuPH20 был стабильным, за исключением композиций А1, А2, А4 и В4. В композициях А1, А2 и В4 ферментативная активность rHuPH20 упала ниже целевого значения 375 ед./мл в условиях хранения при 25°С в период с 2 недели по 1 месяц, а в композиции А4 активность упала ниже целевого значения в период с 1 по 2 неделю. Эти композиции имели уровень консерванта, как в коммерческом препарате Новолог, или соответствующий ЕР-В уровень консерванта и высокий pH (pH 7,6), что отрицательно влияет на стабильность rHuPH20. Одна композиция с уровнем консервантов ЕР-В (В4) имела активность гиалуронидазы <375 ед./мл через 1 месяц хранения при 25°С при pH 7,6 и низкой концентрации хлорида натрия (50 мМ), которые в сочетании крайне неблагоприятны для rHuPH20. Другие композиции с уровнем консервантов ЕР-В и pH 7,6 и более высокими концентрациями хлорида натрия (80 мМ или 100 мМ) сохранили более высокую ферментативную активность rHuPH20, чем целевой уровень 375 ед./мл, после 1 месяца инкубации при температуре 25°С. Все другие композиции имели значительно более высокую активность, чем целевая активность после 1 месяца хранения при 25°С. Инсулин лизпро был стабильным во всех композициях при 25°С во временной точке 1 месяц, но его процент чистоты по данным RP-HPLC стал незначительно снижаться.

rHuPH20 был менее стабильным во всех композициях, хранившихся при 30±2°С, в сравнении с композициями, которые хранились при 25±2°С. Композиция с уровнем консервантов USP сохранила приемлемую активность rHuPH20 через 1 месяц инкубации при 30°С, но ни одна из композиций с уровнем консервантов, как в коммерческом препарате (А1-А4), или с уровнем консервантов, соответствующим ЕР-В (В1-В5), не сохранила активность выше целевого значения через 1 неделю хранения при 30°С. Инсулин лизпро был стабильным в соответствии с целевыми показателями в течение 1 месяца во всех композициях при 30°С, но его процент чистоты по данным RP-HPLC несколько снижался.

b) . Инсулин аспарт.

Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах. Все композиции были стабильными при 5±3°С во временной точке 1 месяц как в отношении rHuPH20, так и инсулина аспарт. Композиции, хранившиеся при 15±2°С, не анализировали во временной точке один месяц.

Во всех композициях, хранившихся при 25±2°С, во временной точке 1 месяц rHuPH20 был стабильным, за исключением композиций А4 и В4, в которых активность упала ниже целевого значения 375 ед./мл в период с 1 по 2 неделю и со 2 недели по 1 месяц соответственно. Эти композиции имели уровни консерванта, как в коммерческом препарате Новолог®, или уровни консерванта, соответствующие ЕР-В, содержали низкую концентрацию соли (50 мМ) и имели высокий pH (7,6), что отрицательно влияет на стабильность rHuPH20. Все другие композиции сохранили более высокую по сравнению с целевой активностью ферментативную активность после 1 месяца хранения при температуре 25°С. Инсулин аспарт был стабильным во всех композициях при 25°С во временной точке 1 месяц. Общее содержание инсулина аспарт было ниже ожидаемого, но значения согласовывались с временной точкой = 0.

rHuPH20 был менее стабильным во всех композициях, хранившихся при 30±2°С, в сравнении с композициями, которые хранились при 25±2°С. Композиция с уровнем консервантов USP сохранила приемлемую активность rHuPH20 через 1 месяц инкубации при 30°С. Некоторые из композиций с уровнем консервантов ЕР-В сохранили приемлемую активность rHuPH20 в течение 1 недели, но ни одна из композиций с уровнем консерванта, как в препарате Новолог®, не сохранила приемлемой активности через 1 неделю хранения при 30°С. Инсулин аспарт был стабильным в соответствии с целевыми показателями в течение 1 месяца во всех композициях при 30°С, но его процент чистоты по данным RP-HPLC несколько снижался.

- 142 033472

с). Инсулин глулизин.

Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах. Все композиции были стабильными при 5±3°С во временной точке 1 месяц как в отношении rHuPH20, так и инсулина аспарт. Композиции, хранившиеся при 15±2°С, не анализировали во временной точке один месяц.

Во всех композициях, хранившихся при 25±2°С, во временной точке 1 месяц rHuPH20 был стабильным. Наблюдалась некоторая тенденция к снижению активности и чистоты rHuPH20 по данным RPHPLC. Инсулин глулизин был стабильным во всех композициях при 25°С во временной точке 1 месяц, но также имел некоторую тенденцию к снижению процента чистоты и обнаружения.

rHuPH20 был менее стабильным во всех композициях, хранившихся при 30±2°С, в сравнении с композициями, которые хранились при 25±2°С. Четыре (4) из 7 анализируемых образцов не соответствовали целевому значению >375 ед./мл в отношении активности rHuPH20 после 1 недели инкубации при 30°С. Композиция 6 проявляла приемлемую активность только в течение 1 недели, композиция 2 проявила приемлемую активность только в течение 2 недель и композиция с уровнем консервантов USP (№ 3) проявила приемлемую активность rHuPH20 (532 ед./мл) после 1 месяца инкубации при 30°С. Инсулин глулизин был стабильным в соответствии с целевыми параметрами в течение 1 месяца во всех композициях при 30°С, но его процент чистоты и обнаружения по данным RP-HPLC был несколько снижен.

2. Временная точка 2 месяца.

a) . Инсулин лизпро.

Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах. Все исследованные композиции были стабильны при 5±3°С до временной точки 2 месяца как в отношении rHuPH20, так и инсулина лизпро.

Все анализируемые образцы были также стабильны при 15±2°С до временной точки 2 месяца как в отношении rHuPH20, так и инсулина лизпро. Могли наблюдаться некоторые очень небольшие тенденции к снижению ферментативной активности rHuPH20, но не наблюдалось никаких других тенденций к снижению стабильности.

В композициях с содержанием консервантов, как в коммерческом препарате (А1-А4), хранившихся при 25±2°С, во временной точке 2 месяца rHuPH20 был стабильным, однако композиция A3 имела хорошую активность в точке 1 месяц (436 ед./мл) и лишь немного ниже целевого значения >375 ед./мл во временной точке 2 месяца (361 ед./мл). Четыре (4) из 5 композиций ЕР-В (В1, В2, B3 и В5) имели активность выше целевого значения 375 ед./мл после 2 месяцев инкубации при 25°С и имели хорошие чистоту и обнаружение rHuPH20. Композиция USP (U1) также имела активность rHuPH20 выше целевого значения после 2 месяцев инкубации при температуре 25°С, значение активности составило 510 ед./мл, и соответствующие значения чистоты и обнаружения также были высокими. Инсулин лизпро был стабильным во всех композициях при 25°С во временной точке 2 месяца, но по-прежнему наблюдалась тенденция к снижению показателей, обнаруженная во временной точке 1 месяц.

Как было показано во временной точке 1 месяц, rHuPH20 был менее стабильным во всех композициях, хранившихся при 30±2°С, в сравнении с хранением композиций при 25±2°С, а во всех композициях А (уровень консервантов, как в коммерческом препарате) и В (уровень консервантов, соответствующий ЕР-В) активность rHuPH20 была ниже целевого значения на 2 месяц инкубации при 30°С. Композиция USP, однако, имела приемлемую активность rHuPH20 (375 ед./мл) на 2 месяц инкубации при температуре 30°С, хотя она была ниже целевого значения во временной точке 1 месяц (334 ед./мл). Это может быть связано с некоторой вариабельностью в анализе активности rHuPH20 или с изменениями в образце; тем не менее, по-прежнему наблюдалась общая тенденция к снижению стабильности при 30°С. Инсулин лизпро был стабильным на уровне целевого значения в течение 2 месяцев во всех композициях при 30°С, но наблюдалась определенная тенденция к снижению процента чистоты и обнаружения по данным RPHPLC, а также процента чистоты по данным не денатурирующей SEC.

b) . Инсулин аспарт.

Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах. Все композиции были стабильны при 5±3°С до временной точки 2 месяца как в отношении rHuPH20, так и инсулина аспарт. Все анализируемые образцы были также стабильны при 15±2°С до временной точки 2 месяца как в отношении rHuPH20, так и инсулина аспарт. Могло наблюдаться небольшое понижение ферментативной активности, чистоты и обнаружения rHuPH20.

В композициях 3 и 4 с содержанием консервантов, как в коммерческом препарате (А2, A3 и А4), хранившихся при 25±2°С, во временной точке 2 месяца rHuPH20 не был стабильным, однако композиция А1 имела приемлемую активность на 2 месяц (385 ед./мл), и анализируемый образец A3 имел активность лишь немного ниже целевого значения >375 ед./мл на 2 месяц (357 ед./мл). Три (3) из 5 композиций ЕР-В (B1, B2 и B3) по-прежнему имели значительно более высокую ферментативную активность rHuPH20, чем целевое значение >375 ед./мл после 2 месяцев инкубации при 25°С, и имели приемлемые, но нехарактерно низкие, по сравнению с ожидаемыми (как в аналогичных композициях) проценты чистоты и

- 143 033472 обнаружения rHuPH20. Композиция USP (U1) всё еще имела значительно более высокую активность rHuPH20, чем целевое значение, после 2 месяцев инкубации при температуре 25°С; значение активности составило 444 ед./мл с приемлемыми чистотой и обнаружением. Инсулин аспарт был стабильным во всех композициях, хранившихся при 25°С, во временной точке 2 месяца, но наблюдались незначительные тенденции к снижению чистоты по данным RP-HPLC и не денатурирующей SEC.

Как было показано в точке 1 месяц, rHuPH20 был менее стабильным во всех композициях, хранившихся при 30±2°С, в сравнении с таковыми при 25±2°С, а все композиции А и В имели ферментативную активность rHuPH20 значительно ниже целевого значения после 2 месяцев инкубации при 30°С. Композиция USP (U1) имела приемлемую активность rHuPH20 (382 ед./мл) после 2 месяцев инкубации при 30°С, а проценты чистоты и обнаружения композиции USP были немного ниже, чем предполагаемые на основе предыдущих результатов, описанных выше, но были в пределах допустимых значений. Инсулин аспарт был стабильным во всех композициях на уровне целевого значения в течение 2 месяцев инкубации при 30°С, но наблюдалась тенденция к снижению процента чистоты по данным RP-HPLC, а также по данным денатурирующей и не денатурирующей SEC. Низкие значения процентов обнаружения, наблюдаемые в предыдущие временные точки, больше не обнаруживались; значения для процентов обнаружения инсулина аспарт по данным RP-HPLC несколько выросли с 1 по 2 месяц при всех температурах (наиболее очевидны при 30°С).

с). Инсулин глулизин.

Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах. Все анализируемые композиции были стабильны в соответствии с целевыми показателями при 5±3°С до временной точки 2 месяца как в отношении rHuPH20, так и инсулина глулизин.

Все анализируемые образцы были также стабильны в пределах целевого значения при 15±2°С до временной точки 2 месяца как в отношении rHuPH20, так и инсулина глулизин. Данные, полученные во временной точке 2 месяца для активности и обнаружения rHuPH20, были, как правило, несколько ниже, но процент чистоты остался прежним, за исключением композиции № 5 (без добавления метионина), которая имела значительно более низкий процент чистоты на 2 месяц. Инсулин глулизин был также устойчив в пределах целевых показателей при 15°С во временной точке 2 месяца, обнаруживая лишь немного более низкие значения после 2 месяцев инкубации при температуре 15°С в отношении процента чистоты и обнаружения.

Активность rHuPH20 была значительно выше предварительных показателей (<375 ед./мл) в 3 из 7 композиций (№№ 2, 3 и 6), хранившихся при 25±2°С в течение 2 месяцев, и чуть выше необходимых показателей в композиции № 4. В целом, эти композиции содержали более низкие уровни консерванта (№ 2 и 3) или более высокие концентрации соли при низком pH (№ 6). Композиция № 4, в которой активность rHuPH20 была чуть выше необходимых показателей, имела самый высокий уровень консерванта и pH в исследовании, но также содержала более высокую концентрацию NaCl. Во всех композициях наблюдалась тенденция к снижению активности, чистоты и содержания rHuPH20. Инсулин глулизин был стабильным во всех композициях при 25°С во временной точке 2 месяца, но наблюдалась некоторая тенденция к снижению чистоты и процента обнаружения относительно параметров, измеренных во временной точке 1 месяц.

rHuPH20 был менее стабильным во всех композициях, хранившихся при 30±2°С, в сравнении с таковыми при 25±2°С. Только композиция с соответствующим USP уровнем консерванта (№ 3) проявила активность с целевыми параметрами >375 ед./мл через 2 месяца инкубации при 30°С. Композиция № 3 также обнаружила приемлемые чистоту и обнаружение rHuPH20 во временной точке 2 месяца. Инсулин глулизин был стабильным на уровне целевых показателей в течение 2 месяцев во всех композициях при 30°С, но была заметна четкая тенденция к снижению процентов чистоты и обнаружения по данным RPHPLC.

3. Временная точка 3 месяца.

а). Инсулин лизпро.

Все композиции были стабильными при 5±3°С во временной точке 3 месяца как в отношении rHuPH20, так и инсулина лизпро. Чистота RHuPH20 по данньм RP-HPLC была несколько ниже ожидаемого значения, но это, вероятно, является результатом нормальных вариаций анализа. Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах, за исключением композиции A3, в которой были обнаружены 2 красных инородных частицы.

Все композиции соответствовали всем целевым характеристикам при 15±2°С во временной точке 3 месяца как в отношении rHuPH20, так и инсулина лизпро. Чистота rHuPH20 по данным RP-HPLC также имела несколько более низкое значение, чем ожидалось, что, вероятно, как упоминалось ранее, является результатом нормальных вариаций анализа. Обнаружены некоторые незначительные тенденции к снижению активности rHuPH20 и чистоты инсулина лизпро по данным не денатурирующей SEC, но других очевидных тенденций к снижению обнаружено не было.

rHuPH20 не был стабильным в композициях (А1-А4) с концентрацией консервантов, как в коммерческих препаратах, при 25±2°С при хранении в течение 3 месяцев. Четыре (4) из 5 композиций ЕР-В (В1,

- 144 033472

В2, B3 и В5) по-прежнему имели ферментативную активность rHuPH20 выше целевого значения 375 ед./мл после 3 месяцев хранения при 25°С, проявляли тенденцию к снижению, но значения чистоты и обнаружения rHuPH20 оставались приемлемыми. Композиция USP (U1) по-прежнему имела активность rHuPH20 значительно выше целевого значения после 3 месяцев инкубации при 25°С; значение активности составило 522 ед./мл, значения чистоты и обнаружения были соответственно высокими. Инсулин лизпро был стабильным во всех композициях при 25°С во временной точке 3 месяца, но наблюдались очевидные тенденции к снижению чистоты инсулина лизпро по данным RP-HPLC и не денатурирующей SEC.

Как было указано ранее, rHuPH20 был менее стабильным во всех композициях, хранившихся при 30±2°С, в сравнении с таковыми при 25±2°С, и все композиции имели активность rHuPH20 ниже целевого значения после 3 месяцев инкубации при 30°С. Инсулин лизпро была стабильным в пределах целевого значения в течение 3 месяцев во всех композициях при 30°С, но обнаружились определенные тенденции к снижению процента чистоты по данным RP-HPLC, а также процентов чистоты по данным не денатурирующей SEC.

b). Инсулин аспарт.

Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах. Все исследованные композиции были стабильными при 5±3°С во временной точке 3 месяца как в отношении rHuPH20, так и инсулина аспарт. Все композиции соответствовали всем целевым показателям при 15±2°С во временной точке 3 месяца как в отношении rHuPH20, так и инсулина аспарт. Была обнаружена некоторая тенденция к снижению активности, чистоты и обнаружения rHuPH20. Чистота инсулина аспарт по данным не денатурирующей SEC была несколько ниже, чем во временной точке 2 месяца, но неясно, является ли это тенденцией или нормальной вариабельностью анализа.

rHuPH20 не был стабильным в композициях с уровнем консервантов, как в коммерческом препарате, но композиция А1 имела активность rHuPH20 лишь немного ниже целевого значения (<375 ед./мл) во временной точке 3 месяца (369 ед./мл). Три (3) из 5 композиций ЕР-В (B1, B2 и B3) по-прежнему имели активность значительно выше целевого значения 375 ед./мл после 3 месяцев инкубации при 25±2°С и имели приемлемые, но неожиданно низкие значения чистоты и обнаружения rHuPH20 по сравнению с отмеченными во временной точке 2 месяца. Композиция USP (U1) по-прежнему имела активность rHuPH20 значительно выше целевого значения после 3 месяцев инкубации при 25°С, значение активности составило 492 ед./мл, чистота и обнаружение были приемлемыми. Инсулин аспарт был стабильным во всех композициях при 25°С во временной точке 3 месяца, но были заметны явные тенденции к снижению чистоты по данным RP-HPLC и не денатурирующей SEC.

Как обсуждалось ранее, rHuPH20 был менее стабильным во всех композициях, хранившихся при 30±2°С, в сравнении с таковыми при 25±2°С. Все композиции А и В имели активность rHuPH20 ниже целевого значения через 1 месяц инкубации при 30°С. Активность композиции USP (U1) была лишь немного ниже предполагаемого значения >375 ед./мл через 3 месяца (371 ед./мл), но эта композиция имела низкие проценты чистоты и обнаружения rHuPH20 по данным RP-HPLC. Инсулин аспарт был стабильным в пределах целевого значения в течение 3 месяцев во всех композициях при 30°С по данным всех методов, кроме не денатурирующей SEC, которые показала очень небольшое снижение до приблизительно 97% основного пика во всех композициях.

4. Временная точка 6 месяцев.

a) . Инсулин лизпро.

Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах. Композиции, хранившиеся при 30±2°С, не оценивали во временной точке 6 месяцев.

Все композиции были стабильными при 5±3°С и 15±2°С во временной точке 6 месяцев как в отношении rHuPH20, так и инсулина лизпро. Была обнаружена некоторая тенденция к снижению активности и процентов обнаружения rHuPH20 во всех композициях. Композиция А4 был наименее стабильной при обеих температурах.

Только композиции B3 и U1 удовлетворяли требованиям к стабильности при температуре 25±2°С. Обе эти композиции имели pH 7.4 и концентрацию соли 80 мМ. Остальные композиции имели ферментативную активность rHuPH20 менее 375 ед./мл. Потеря активности совпала с потерей обнаружения rHuPH20. С помощью не денатурирующей SEC была показана небольшая тенденция к снижению процента чистоты инсулина лизпро.

b) . Инсулин аспарт.

Все композиции были прозрачными и бесцветными без частиц во всех временных точках и при всех температурах. Композиции, хранившиеся при 30±2°С, не были оценены во временной точке 6 месяцев.

Все композиции были стабильны при 5±3°С и 15±2°С во временной точке 6 месяцев как в отношении rHuPH20, так и инсулина аспарт. Была обнаружена некоторая тенденции к снижению активности и процента обнаружения rHuPH20 во всех композициях. Композиция А4 была наименее стабильной при обеих температурах.

Только композиция U1 удовлетворяла требованиям к стабильности при температуре 25±2°С. Ос- 145 033472 тальные композиции имели ферментативную активность rHuPH20 менее 375 ед./мл. Потеря активности совпала с потерей обнаружения rHuPH20. Методом не денатурирующей SEC была показана некоторая тенденция к снижению процентов чистоты инсулина аспарт.

5. Временная точка 9 месяцев.

a) . Инсулин лизпро.

Все композиции были прозрачными и бесцветными, без частиц во всех временных точках и температурах. Композиции при 25±2°С и 30±2°С не были оценены во временной точке 9 месяцев.

Все композиции были стабильны при 5±3°С и 15±2°С до временной точки 9 месяцев как для rHuPH20, так и для инсулина лизпро. Существовала некоторая незначительная тенденция к снижению активности rHuPH20 и процента обнаружения rHuPH20 для всех композиций. Как было видно в точке 6 месяцев, композиция А4 является наименее стабильной при обеих температурах.

b) . Инсулин аспарт.

Все композиции были прозрачными и бесцветными, без частиц во всех временных точках и температурах. Композиции при 25±2°С и 30±2°С не были оценены во временной точке 9 месяцев.

Все композиции были стабильны при 5±3°С и 15±2°С до временной точки 9 месяцев как для rHuPH20, так и для инсулина аспарт. Существовала некоторая незначительная тенденция к снижению активности rHuPH20 и процента обнаружения rHuPH20 для всех композиций. Как было видно в точке 6 месяцев, композиция А4 является наименее стабильной при обеих температурах.

Пример 14. Ускоренное исследование стабильности аспарт-rHuPH20 и лизпро-rHuPH20 к замораживанию/оттаиванию, перемешиванию и хранению при высокой температуре.

В этом примере стабильность различных композиций инсулина аспарт-rHuPH20 и инсулина лизпро-rHuPH20 оценивали при трех стрессовых физических условиях ускоренной деградации: несколько циклов замораживания/оттаивания; перемешивание при 25°С и термический стресс при 37°С. Стабильность оценивали путем измерения общего внешнего вида и характеристик, ферментативной активности rHuPH20 и чистоты rHuPH20 и аналога инсулина.

Композиции аналога инсулина/rHuPH20 приведены в табл. 64 ниже. Образец Humalog® (Хумалог) (инсулин лизпро, композиция 4) и образец NovoLog® (Новолог) (инсулин аспарт, композиция 8) были использованы в качестве контролей. Базовые композиции содержали 3,47 мг/мл инсулина лизпро или 3,5 мг/мл инсулина аспарт, 600 ед./мл rHuPH20, 30 мМ Трис/HCl и 0,01% полоксамера 188. Композиции 1 и 5 дополнительно содержали 50 мМ NaCl, 100 мМ метионина, 0,13% фенола и 0,075% м-крезола с pH 7,4. Композиции 2 и 6 (ЕР-В композиции) дополнительно содержали 80 мМ NaCl, 20 мМ метионина и 50 мМ глицерина с консервантом уровня ЕР-В: 0,15% фенола и 0,175% м-крезола. Композиции 3 и 7 (USP композиции) дополнительно содержали 80 мМ NaCl, 20 мМ метионина и 50 мМ глицерина с консервантом уровня USP: 0,13% фенола и 0,075% м-крезола.

Таблица 64

Композиции инсулина

№	рн	Буфер	Модификатор тоничности	Сурфактант	Консерванты	API
1	7,4	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	100 мМ метионина	...	0,01 % полоксамера 188	0,13% фенола	0,075 % м-крезола	600 Ед/мл гНиРН20	3.47 мг/мл Лизпро
2	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ метионина	50 мМ глицерина	0,01 % полоксамера 188	0,15 % фенола	0,175% м-крезола	600 Ед/мл гНиРН20	3.47 мг/мл Лизпро
3	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ метионина	50 мМ глицерина	0,01 % полоксамера 188	0,13 % фенола	0,075 % м-крезола	600 Ед/мл rHuPH20	3.47 мг/мл Лизпро
4	7,0- 7 8	...	...	...	...	...	...	0,315% «гт/мапАтто IVl-ItprVOlMlU	Humalog®
5	7,4	30 мМ Трис/НС1	50 мМ NaCl	100 мМ метионина	...	0,01 % полоксамера 188	0,13 % фенола	0,075 % м-крезола	600 Ед/мл rHuPH20	3.5 мг/мл Аспарт
6	7,2	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ метионина	50 мМ глицерина	0,01 % полоксамера 188	0,15 % фенола	0,175 % м-крезола	600 Ед/мл rHuPH20	3.5 мг/мл Аспарт
7	7,2	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ метионина	50 мМ глицерина	0,01 % полоксамера 188	0,13% фенола	0,075 % м-крезола	600 Ед/мл rHuPH20	3.5 мг/мл Аспарт
8	7,2- 7,6	...	...	...	...	...	0,15 % фенола	0,172% м-крезола	Novolog®

Каждую композицию подвергали воздействию следующих условий ускоренной деградации.

(1) Перемешивание при 25°С. Каждую композицию держали в инкубаторе, снабженном шейкером, при 25°С. Флаконы стояли прямо при встряхивании при 650 об/мин. Образцы на анализ отбирали после встряхивания в течение 6, 12 и 24 ч. Все образцы хранили при 2-8°С до анализа.

(2) Множественные циклы замораживания/оттаивания. Каждую композицию подвергали 5 циклам замораживания/оттаивания, чередуя условия хранения между -30°С в морозильнике и комнатной температурой на столе. Образцы оставляли при каждом условии по меньшей мере в течение 2 ч для каждого цикла (т.е. выдержать 2 ч при -30°С в морозильнике, убрать и поместить на поверхность стола при ком-

- 146 033472 натной температуре в течение 2 ч считалось за 1 цикл). Отбирали образцы через 1, 3 и 5 циклов и хранили при температуре 2-8°С до анализа.

(3) Температурный стресс. Каждую композицию держали при 37°С в инкубаторе. Образцы отбирали после 8, 24 и 48 ч и хранили при температуре 2-8°С до анализа.

Анализ проводили до и после того, как были применены условия стресса. Для всех композиций был проведен полный набор аналитических тестов, включая внешний вид, осмоляльность, pH, мутность, ферментативную активность гиалуронидазы, чистоту гиалуронидазы и чистоту инсулина, чистоту и содержание HWM (форм с высокой молекулярной массой) (см. примеры 2-5 и 12 выше для процедур тестирования). Критерии приемлемости стабильности или целевые показатели для каждого тестируемого параметра такие же, как описано в примере 12. Результаты приведены ниже.

1. Перемешивание при 25°С.

Композиции ЕР-В (№№ 2 и 6) и контрольные композиции (№№ 4 и 8) были прозрачными и бесцветными, без частиц во всех временных точках. Композиции UPS (№№ 3 и 7) были прозрачными и бесцветными после 6 ч перемешивания, но появился осадок через 12 ч. В композициях №№ 1 и 5 были осадки в точке 6 ч.

rHuPH20 была стабильной во всех композициях во всех временных точках и имела ферментативную активность >375 ед./мл. Процент обнаружения rHuPH20 незначительно снижался во всех последовательных временных точках, но все композиции поддерживали приемлемый уровень обнаружения. Инсулин аспарт и инсулин лизпро были стабильными во всех временных точках. Контроли NovoLog® (инсулин аспарт) и Humalog® (инсулин лизпро) были стабильны во всех временных точках.

2. Замораживание/оттаивание.

Все композиции были прозрачными и бесцветными, без частиц во всех временных точках. После 1 цикла замораживания/оттаивания ферментативная активность rHuPH20 сильно уменьшалась (высшая была для композиции № 3, которая имела активность 168 ед./мл), хотя процент чистоты остался >95% для всех композиций и временных точек. Процент обнаружения rHuPH20 был ниже приемлемых уровней для большинства композиций. Инсулин аспарт и инсулин лизпро были стабильными во всех временных точках. NovoLog® (инсулин аспарт) и Humalog® (инсулин лизпро) были стабильными во всех временных точках.

3. Температурный стресс при 37°С.

Все композиции были прозрачными и бесцветными, без частиц во всех временных точках. Композиции №№ 1, 3, 5 и 7 имели приемлемую ферментативную активность rHuPH20 (>375 ед./мл) после 8 ч при 37°С. Стабильность rHuPH20 снизилась во всех последующих временных точках для всех композиций, о чем свидетельствует снижение активности rHuPH20 (ниже 375 ед./мл) и уменьшение процента обнаружения. Инсулин аспарт и инсулин лизпро были стабильными во всех временных точках. Контроли NovoLog® (инсулин аспарт) и Humalog® (инсулин лизпро) были стабильными во всех временных точках.

Пример 15. Влияние олигомеров HA на стабильность композиции инсулин/rHuPH20.

В этом примере оценивали эффект добавления олигомеров HA на стабильность различных композиций инсулин/rHuPH20. Во-первых, были выполнены тесты для оценки стабильности при четырех условиях хранения: 5°С, 25°С, 30°С и 35°С в течение долгого времени. Во-вторых, был протестирован эффект олигомеров HA на стабильность rHuPH20 в присутствии различных консервантов. В-третьих, был оценен стабилизирующий эффект олигомеров HA различных размеров на композиции инсулин аспартrHuPH20.

А. Влияние олигомеров HA на стабильность при хранении.

Композиции содержали различные количества HA (10, 15 или 20 мг/мл). Дополнительно композиции содержали 15 мг/мл HA с различными pH и концентрациями глицерина и солей.

Композиции инсулин/rHuPH20 приведены в табл. 65 ниже. Основные композиции содержали 3,5 мг/мл инсулина, 600 ед./мл (5 мкг/мл) rHuPH20, 30 мМ Трис/HCl, 80 мМ NaCl, 20 мМ метионина и 0,01% полоксамера 188 (полоксамер 188) с 0,1% фенола и 0,15% м-крезола при pH 7,4. Композиции №№ 2-4 дополнительно содержали 10, 15 и 20 мг/мл олигомеров HA соответственно. Композиции №№ 1 и 6 дополнительно содержали 50 мМ глицерина, композиция № 6 также содержала 15 мг/мл олигомеров НА. Композиции №№ 5 и 7 отличались от композиции № 3 по pH и концентрации NaCl. Были оценены три дополнительных композиции (№№ 8-10), не содержащие метионин, каждая из которых содержала 3,5 мг/мл инсулина, 600 ед./мл rHuPH20, 15 мг/мл олигомеров HA, 30 мМ Трис/HCl, 80 мМ NaCl и 0,01% полоксамера 188 с 0,1% фенола и 0,15% м-крезола при pH 7,4. Композиция № 8 дополнительно содержала 20 мМ метионина, и композиция № 10 дополнительно содержала 50 мМ глицерина.

- 147 033472

Таблица 65

Композиции, содержащие 600 ед./мл rHuPH20 и 3,5 мг/мл инсулина

№	рн	Буфер	Модификатор тоничности	Стабилизатор	Консерванты
1	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	50 мМ глицерина		20 мМ метионина	0,01 %F68	0,1 % фенола	0,15 % мкрезола
2	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 MMNaCl		10 мг/мл НА	20 мМ метионина	0,01 % F68	0,1 % фенола	0,15 %мкрезола
3	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl		15 мг/мл НА	20 мМ метионина	0,01 % F68	0,1 % фенола	0,15 % мкрезола
4	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl		20 мг/мл НА	20 мМ метионина	0,01 %F68	0,1 % фенола	0,15 % мкрезола
5	7,2	30 мМ Трис/НС1	80 MMNaCl		15 мг/мл НА	20 мМ метионина	0,01 % F68	0,1 % фенола	0,15 %мкрезола
6	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 MMNaCl	50 мМ глицерина	15 мг/мл НА	20 мМ метионина	0,01 %F68	0,1 % фенола	0,15 % м- крезола
7	7,4	30 мМ Трис/НС1	100 мМ NaCl		15 мг/мл НА	20 мМ метионина	0,01 % F68	0,1 % фенола	0,15 %мкрезола
8	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl		15 мг/мл НА	20 мМ метионина	0,01 %F68	0,1 % фенола	0,15 %мкрезола
9	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 MMNaCl		15 мг/мл НА		0,01 %F68	0,1 % фенола	0,15 %мкрезола
10	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	50 мМ глицерина	15 мг/мл НА		0,01 %F68	0,1 % фенола	0,15 %мкрезола

мл каждой композиции хранили в 1 боросиликатной 2 мл стеклянной пробирке USP-типа с пробкой из хлорбутиловой резины и алюминиевой крышкой. Каждую композицию инкубировали по отдельности, при 5±3°С, 25±2°С, 30±2°С и 35±2°С, и измерения стабильности были записаны в момент времени Т = 0, 2, 5, 7 и 9 дней, 1 и 2 недели, 1 месяц и 2 месяца. Стабильность оценивали измерением pH, внешнего вида, осмоляльности, ферментативной активности rHuPH20, содержания rHuPH20 с помощью RPHPLC, содержания инсулина с помощью RP-HPLC и процента чистоты инсулина с помощью не денатурирующей SEC (см. примеры 2-5 и 12). Критерии приемлемости стабильности или целевого значения для каждого тестируемого параметра такие же, как описано в примере 12.

1. 5°С.

Все композиции, содержащие по крайней мере 15 мг/мл олигомеров HA, содержали видимые частицы только после 1 недели при 5°С. Композиции, содержащие только 10 мг/мл олигомеров HA или не содержащие олигомеров HA, были прозрачными, бесцветными и не содержали частиц после 2 недель при 5°С, но частицы наблюдались через 1 месяц. Все исследованные композиции были стабильны в отношении rHuPH20 при 5°С до 2 месяцев. Инсулин был нестабильным в композициях, содержащих 20 мг/мл олигомеров HA (№ 4), имеющих низкие значения pH (№ 5) и содержащих более высокий уровень соли (№ 7), после всего лишь 1 месяца при 5°С.

2. 25°С.

Композиции № 5 (низкие значения pH) и № 7 (высокое содержание соли) содержали частицы уже после 1 недели при 25°С. Остальные композиции были прозрачными и бесцветными и не содержали частиц. Все исследованные композиции были стабильны при 25°С во временных точках до 2 месяцев, как в отношении rHuPH20, так и в отношении инсулина.

3.30°С.

Композиции № 5 (низкие значения pH) и № 7 (высокое содержание соли) содержали частицы уже после 1 недели при 30°С. Остальные композиции были прозрачными и бесцветными и не содержали частиц. Все композиции, содержащие HA, были стабильны в отношении rHuPH20 в течение 1 месяца при 30°С. К 2-месячному моменту времени ферментативная активность rHuPH20 снизилась ниже приемлемого уровня в 375 ед./мл. Инсулин был стабилен во всех композициях через 1 месяц с четким снижением стабильности, наблюдаемым после 2 месяцев при температуре 25°С. Дополнительные олигомеры HA оказывали четкое положительное влияние на стабильность rHuPH20 при 25°С без влияния на стабильность инсулина.

Композиции №№ 8-10 были протестированы на окисление rHuPH20 в нулевой момент времени и после 3 дней при 25°С. Композиция № 10, содержащая 50 мМ глицерина, проявляла повышенное окисление уже после 3 дней при 25°С.

4. 35°С.

Композиции, содержащие олигомеры HA, были стабильны в отношении rHuPH20 в течение 2 дней при 35°С. На 5 день только композиции №№ 3 и 5, содержащие 15 мг/мл олигомеров HA, с различным pH были стабильны в отношении rHuPH20. Содержание rHuPH20 было низким во всех композициях уже

- 148 033472 после 2 дней при 35°С. Добавление олигомеров HA оказывало четкое положительное влияние на стабильность rHuPH20 при 35°С без влияния на стабильность инсулина.

В.Эффекты консервантов.

1. Консерванты USP.

В этом примере способность олигомеров HA стабилизировать композиции инсулин аспартrHuPH20 или инсулин лизпро-rl luPI 120. содержащие консерванты уровня USP. оценивали с помощью определения ферментативной активности rHuPH20. Были испытаны композиции F1-F7. Основные композиции содержали 3.5 мг/мл инсулина аспарт или инсулина лизпро. 600 ед./мл rHuPH20. 30 мМ Трис/HCl. pH 7.4. 5 мМ метионина. 0.01% полоксамера 188. 0.125% фенола и 0.075% м-крезола. Композиция F1 не содержала инсулин аспарт. Ферментативную активность rHuPH20 измеряли. как описано в примере 2В выше. Результаты представлены в табл. 66-67 ниже. Все композиции были стабильны при 5°С в течение 3 или 6 дней. Все композиции. содержащие HA. независимо от их pH и концентрации NaCl. имели более высокие ферментативные активности. чем те же композиции. которые не содержали НА. Как показано в табл. 66 ниже. композиция F4. содержащая 10 мг/мл HA. имела более высокую ферментативную активность rHuPH20 с течением времени при 37°С по сравнению с композициями F2 и F3. которые не содержали HA. но имели такой же или более низкий pH. Для композиции F5 (см. табл. 67 ниже). которая имела пониженную концентрацию NaCl. добавление в композицию 10 мг/мл (HA) ограничивало потерю активности rHuPH20 вследствие более низкой концентрации NaCl. которая дестабилизирует rHuPH20 (см.. например. F3).

Таблица 66

Ферментные активности для композиций инсулин аспарт-РН20

№ композиции	pH	NaCl, мМ	НА, мг/мл	Ферментативная активность rHuPHZO (Ед/мл)
5°С	37°С
бди	2 дн	4 дн	бди	8 дн	12 дн
F1	7,0	200	0	679	575	553	513	481	487
F2	7,0	140	0	674	512	454	394	400	346
F3	7,2	140	0	671	481	424	363	352	302
F4	7,2	140	10	667	542	491	442	431	371
F5	7,2	100	10	658	517	432	392	385	319

Таблица 67

Ферментные активности для композиций инсулин лизпро-РН20

№ композиции	рн	NaCl, мМ	НА, мг/мл	Активность (Ед/мл)
5°С	37°С
3 дн	3 дн	5 дн	7 дн
F1	7.2	140	0	641	248	141	98
F2	7.2	140	10	642	426	323	284
F3	7.2	120	10	650	431	363	288
F4	7.2	100	10	643	420	350	253
F5	7.2	80	10	659	419	349	229
F6	7.4	120	10	642	353	284	175
F7	7.4	100	10	643	345	264	158

2. Консерванты уровня ЕР-В.

В этом примере способность олигомеров HA стабилизировать композиции инсулин-rHuPH20 с консервантами уровня ЕР-В оценивали с помощью определения ферментативной активности rHuPH20. Основные композиции содержали 3.5 мг/мл инсулина. 600 ед./мл rHuPH20. 30 мМ Трис/HCl. pH 7.4. 20 мМ метионина. 0.01% полоксамера 188. 0.10% фенола и 0.15% м-крезола. Ферментативную активность rHuPH20 измеряли. как описано в примере 2В выше. Результаты представлены в табл. 68 ниже. При 35°С композиции. содержащие HA (F2-F6). имели более высокую ферментативную активность rHuPH20. чем композиция F1. которая не содержала НА. На 9-й день в F1 только оставалось около 10% ферментативной активности. тогда как композиции F2-F6. в зависимости от их pH. концентрации HA и NaCl. все еще имели примерно от 30 до 60% ферментативной активности rHuPH20. Аналогичные результаты были получены для этих композиций при инкубации при 30°С в течение более длительного срока изучения стабильности. Как показано в табл. 68 ниже. в конце 3 месяцев хранения при 30°С в композиции F1. которая не содержала HA. оставалось около 30% ферментативной активности rHuPH20; во всех других композициях. содержащих HA. в среднем. осталось немного более 50% от ферментативной активности rHuPH20.

При более низкой температуре rHuPH20 испытывала меньший тепловой стресс. что может объяснить меньшую разницу в отношении относительных изменений ферментной активности между композициями с HA и без него. Следует отметить. что при одинаковых значениях pH и условиях NaCl активность rHuPH20 не коррелирует с концентрациями HA. испытанными в этом исследовании. В связи с тем. что HA является субстратом для rHuPH20. механизм стабилизации. скорее всего. относится к специфическо- 149 033472 му эффекту фермент-субстратного связывания. Это взаимодействие, конечно, зависит от молярного соотношения между двумя молекулами. Для определенного соотношения субстрат-фермент достигается максимальное стабилизирующее действие, и при добавлении дополнительной HA не происходит улучшения активности. В этом примере около 10 мг/мл HA необходимо для стабилизации 5 мкг/мл rHuPH20.

Таблица 68

Ферментные активности для композиций инсулин-РН20

№ комп.	pH	NaCl, мМ	НА, мг/мл	Активность (Ед/мл)
5° С	35° С	30° С
0 дн	2 дн	5 дн	9 дн	1 мес	2 мес	3 мес
F1	7,4	80	0	592	254	170	64	358	239	194
F2	7,4	80	10	604	434	365	209	465	342	296
F3	7,4	80	15	559	444	380	269	463	348	288
F4	7,4	80	20	556	438	364	287	459	323	286
F5	7,2	80	15	559	471	397	326	504	365	312
F6	7,4	100	15	556	457	312	278	461	365	299

С. Влияние молекулярной массы HA на стабилизацию rHuPH20.

В этом примере стабилизирующий эффект олигомеров HA различных размеров оценивали на композициях инсулин аспарт-rl luPI 120 путем измерения ферментативной активности rHuPH20. Три композиции гиалуроната натрия с различными молекулярными весами были приобретены у Lifecore Biomedical (Миннесота, США): 6,4 кДа (Лот: GSP252-5-7), 74 кДа (Лот: GSP252-60-2) и 234,4 кДа (Лот: 002 799). 10 мг каждого образца HA добавляли к 1 мл композиции инсулина аспарт-PH20, которая содержала 100 ед./мл инсулина аспарт, 5 мкг/мл rHuPH20, 30 мМ Трис/HCl, pH 7,4, 80 мМ NaCl, 50 мМ глицерина, 20 мМ метионина, 0,01% полоксамера 188, 0,10% фенола и 0,15% м-крезола. Композиция, не содержавшая HA, также была включена в исследование в качестве контроля. Эти растворы инкубировали при 5°С и 37°С в течение 9 дней для оценки стабилизирующего эффекта различных размеров HA на ферментативную активность rHuPH20. Ферментативную активность rHuPH20 измеряли, как описано в примере 2В выше.

Результаты показаны в табл. 69 ниже. Композиция инсулин аспарт-rHuPH20, которая не содержала HA (F1), была ферментативно не активной после 3 дней инкубации при 37°С. В противоположность этому композиции F2-F4 сохраняли около 30-40% ферментативной активности rHuPH20. В общем, существует тенденция, что меньшие полимеры HA обеспечивают лучшую защиту, чем большие. Это может быть связано с размером самой HA или молярным отношением HA к rHuPH20.

Таблица 69

Влияние молекулярной массы НА на ферментативную активность rHuPH20

Композиция	Мол. вес НА, кДа	Активность (Ед/мл)
5°С	37°С
9 дн	3 дн	5 дн	7 дн	9 дн
F1	NA	600	34	2	-15	-16
F2	6.4	645	279	145	59	27
F3	74.0	585	211	94	30	10
F4	234.4	575	161	52	5	-6

Пример 16. Исследование стабильности композиций инсулина аспарт/rHuPH20.

В этом примере различные композиции инсулин-аспарт/rHuPH20 оценивали на стабильность при двух условиях хранения, 30°С и 37°С, и в условиях ускоренной деградации (перемешивание при 25°С в течение 9 дней). Тестируемые композиции инсулин/rHuPH20 приведены в табл. 70 ниже. Контрольная композиция (№ 7) содержала 3,5 мг/мл инсулина аспарт, 600 ед./мл (5 мкг/мл) rHuPH20, 30 мМ Трис/HCl, 80 мМ NaCl, 50 мМ глицерина, 20 мМ метионина и 0,01% полоксамера 188 (полоксамер 188) с 0,1% фенола и 0,15% м-крезола при pH 7,4. В композициях №№ 1-3 испытывали уровни консервантов 0,13% фенола и 0,12% м-крезола с 3 различными уровнями стабилизатора полоксамера 188. В композициях №№ 4-6 испытывали уровни консервантов 0,15% фенола и 0,12% м-крезола с 3 различными уровнями стабилизатора полоксамера 188. Композиции №№ 8 и 9 дополнительно содержали 10 мг/мл олигомеров HA, при этом в композиции № 8 был низкий уровень глицерина (20 мМ). Композиции №№ 10 и 11 содержали более низкий уровень метионина (5 мМ) и № 11 дополнительно содержала 10 мг/мл олигомеров НА.

- 150 033472

Таблица 70

Композиции, содержащие 600 ед./мл rHuPH20 и 3,5 мг/мл инсулина аспарт

№	pH	Буфер	Модификатор тоничности	Стабилизатор	Консерванты
1	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	50 мМ глицерина		20 мМ метионина	0,01 %F68	0,13 % фенола	0,12 %мкрезола
2	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	50 мМ глицерина		20 мМ метионина	0,05 % F68	0,13 % фенола	0,12 %мкрезола
3	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	50 мМ глицерина		20 мМ метионина	0,1 %F68	0,13 % фенола	0,12 %мкрезола
4	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	50 мМ глицерина		20 мМ метионина	0,01 %F68	0,15 % фенола	0,12 %мкрезола
5	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	50 мМ глицерина		20 мМ метионина	0,05 % F68	0,15% фенола	0,12 %мкрезола
6	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	50 мМ глицерина		20 мМ метионина	0,1 %F68	0,15% фенола	0,12 %мкрезола
7	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	50 мМ глицерина		20 мМ метионина	0,01 %F68	0,1 % фенола	0,15 %мкрезола
8	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	20 мМ глицерина	10 мг/мл НА	20 мМ метионина	0,01 % F68	0,1 % фенола	0,15 %м- крезола
9	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	50 мМ глицерина	10 мг/мл НА	20 мМ метионина	0,01 %F68	0,1 % фенола	0,15 %мкрезола
10	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	50 мМ глицерина		5 мМ метионина	0,01 %F68	0,1 % фенола	0,15 %мкрезола
И	7,4	30 мМ Трис/НС1	80 мМ NaCl	50 мМ глицерина	10 мг/мл НА	5 мМ метионина	0,01 %F68	0,1 % фенола	0,15 %мкрезола

мл каждой композиции хранили в боросиликатной 2 мл стеклянной пробирке USP типа 1 с пробкой из хлорбутиловой резины и алюминиевой крышкой. Каждую композицию инкубировали индивидуально при 30±2°С и 37±2°С, и измерения стабильности были проведены в момент времени t = 0, 2, 4, 7 и 9 дней, 2 недели, 1 месяц или 1,5 месяца. Для каждой композиции один набор флаконов подвергали перемешиванию с помощью шейкера Titer Plate (LabLine) при 600 об/мин в течение 9 дней при 25°С. NovoLog® (инсулин аспарт) был также подвергнут тем же условиям перемешивания в качестве контроля.

Стабильность оценивали измерением pH, внешнего вида, осмоляльности, ферментативной активности rHuPH20, содержания rHuPH20 с помощью RP-HPLC и содержания инсулина с помощью RP-HPLC (см. примеры 2-5 и 12). Критерии приемлемости стабильности или целевого значения для каждого тестируемого параметра такие же, как описано в примере 12.

1. 30°С.

Все композиции были прозрачными и бесцветными и не содержали частицы после 2 недель при 30°С. Все исследованные композиции были стабильны при 30°С до момента времени 2 недели и для rHuPH20, и для инсулина аспарт, с небольшой тенденцией к снижению стабильности, наблюдаемой для всех композиций с течением времени. Стабилизирующее действие на активность rHuPH20 наблюдалось для композиций, содержащих олигомеры HA (№№ 8, 9, 11), о чем свидетельствует более высокая ферментативная активность и содержание по сравнению с композициями, которые не содержали олигомеры НА. Кроме того, уменьшение концентрации как глицерина, так и метионина, не приводило к заметному влиянию на стабильность этих композиций (№№ 8, 9 и 11).

Сравнение концентраций консерванта показало, что уменьшение количества метакрезола и небольшое увеличение количества фенола является полезным для стабильности rHuPH20, но польза исключается, когда концентрация фенола высока. В противоположность этому изменения в концентрации консервантов оказывают незначительное влияние на стабильность инсулина аспарт, так как умеренное снижение содержания инсулина аспарт наблюдалось во всех композициях. Например, rHuPH20 была более стабильна в композициях, содержащих 0,13% фенола (№№ 1-3), чем в тех, которые содержали 0,15% фенола (№№ 4-6). Композиции, содержащие повышенные концентрации фенола и сниженные концентрации метакрезола (№№ 1-3), были более стабильными, чем контрольная композиция (№ 7), которая содержала меньшее количество фенола и более высокое количество метакрезола. В противоположность этому композиции №№ 4-6 были стабильными как контрольная композиция № 7.

2. 37°С.

Все композиции были прозрачными и бесцветными и не содержали частиц после 9 дней при 37°С. Стабилизирующее действие на активность rHuPH20 наблюдалось для композиций, содержащих олигомеры HA (№№ 8, 9 и 11), о чем свидетельствует более высокая ферментативная активность и содержание после 2 дней при 37°С по сравнению с композициями, которые не содержали олигомеры HA, хотя ни в

- 151 033472 одной из композиций не было приемлемого уровня ферментативной активности rHuPH20. Потеря ферментативной активности rHuPH20 была связана с потерей содержания rHuPH20. В противоположность этому для композиций, содержащих олигомеры HA, содержание инсулина аспарт показало тенденцию к снижению, что указывает на то, что инсулин аспарт не так стабилен при 37°С в присутствии олигомеров

НА.

Сходно с эффектом, наблюдаемым при 25°С, сравнение концентраций консерванта показало, что уменьшение количества метакрезола и небольшое увеличение количества фенола является полезным для стабильности rHuPH20, но польза исключается, когда концентрация фенола высока. В противоположность этому изменения в концентрации консервантов оказывают незначительное влияние на стабильность инсулина аспарт, так как умеренное снижение содержания инсулина наблюдалось во всех композициях.

3. Перемешивание при 25°С.

rHuPH20 и инсулин аспарт были стабильными во всех композициях после 24 или 48 ч при 25°С при перемешивании, хотя композиции, содержащие олигомеры HA (№№ 8, 9 и 11) были замутнены после 24

ч. Novolog® был стабильным после 24 ч при 25°С при перемешивании. Изменения в концентрациях консервантов не оказывали влияния на стабильность rHuPH20 или инсулина аспарт.

Пример 17. Композиции, содержащие олигомеры HA и ионы двухвалентных металлов (Mg²⁺).

В этом примере эффект уровней консервантов ЕР-В на ферментативную активность rHuPH20 оценивали при двух условиях хранения: 5°С в течение 5 дней и 37°С в течение 3-5 дней. Композиции содержали различные количества олигомеров HA и ионов двухвалентного металла (Mg²⁺).

Композиции rHuPH20 приведены в табл. 71 ниже. Основные композиции содержали 600 ед./мл rHuPH20, 30 мМ Трис/HCl, 200 мМ NaCl, 5 мМ метионина, 0,01% полоксамера 188 (полоксамер 188) с 0,100% фенола и 0,150% метакрезола при pH 6,8. Композиции 2 и 4 дополнительно содержали 10 мг/мл олигомеров HA, и композиции 3 и 5 содержали 20 мг/мл олигомеров НА. Композиции 2 и 3 дополнительно содержали 3 мМ Mg²⁺, и композиции 4 и 5 содержали 10 мМ Mg²⁺.

Таблица 71

Композиции, содержащие 600 ед./мл rHuPH20

№	рн	Буфер	Модификатор тоничности	Стабилизатор	Ион металла	Консерванты
1	6,8	30 мМ Трис/НС1	200 мМ NaCl	—	5 мМ метионина	0,01 % F68	—	0,100% фенола	0,150 %мкрезола
2	6,8	30 мМ Трис/НС1	200 мМ NaCl	10 мг/мл НА	5 мМ метионина	0,01 % F68	3 мМ Mg++	0,100% фенола	0,150 %мкрезола
3	6,8	30 мМ Трис/НС1	200 MMNaCl	20 мг/мл НА	5 мМ метионина	0,01 % F68	ЗмМ Mg++	0,100 % фенола	0,150 %мкрезола
4	6,8	30 мМ Трис/НС1	200 мМ NaCl	10 мг/мл НА	5 мМ метионина	0,01 % F68	10 мМ Mg++	0,100% фенола	0,150 %мкрезола
5	6,8	30 мМ Трис/НС1	200 MMNaCl	20 мг/мл НА	5 мМ метионина	0,01 % F68	10 мМ Mg++	0,100% фенола	0,150 %мкрезола

мл каждой композиции хранили в 2 мл пробирке из боросиликатного стекла USP типа 1 с пробкой из хлорбутиловой резины и алюминиевой крышкой. Каждую композицию инкубировали по отдельности при 5 и 37°С, и измерения стабильности проводили в момент времени t = 3, 4 и/или 5 дней. Стабильность оценивали измерением pH, внешнего вида, осмоляльности, ферментативной активности rHuPH20 и содержания rHuPH20 помощью RP-HPLC (см. примеры 2-3, 5 и 12). Критерии приемлемости стабильности или целевого значения для каждого тестируемого параметра такие же, как описано в примере 12.

Результаты показывают, что все композиции были прозрачными и бесцветными без каких-либо частиц. Осмоляльность имела тенденцию к увеличению с добавлением Mg²⁺. Ферментативная активность rHuPH20 и содержание были стабильными при 5°С во всех композициях. При 37°С ферментативная активность rHuPH20 снизилась на третьи сутки и после 4 дней составляла 375 ед./мл, что соответствовало целевому значению. Через 5 дней осталось около половины первоначальной ферментативной активности rHuPH20. Падение активности коррелировало с падением содержания rHuPH20.

Пример 18. Изучение композиций с консервантами USP при температуре 5°С или 37°С.

В этом примере эффект уровней консервантов USP на ферментативную активность rHuPH20 оценивали при двух условиях хранения: 5°С в течение 4 дней и 37°С в течение 2, 4, 6, 8 и 12 дней. Композиции содержали различные количества олигомеров HA и солей при разном pH. Композиции rHuPH20 приведены в табл. 72 ниже. Основные композиции содержали 600 ед./мл rHuPH20, 3,5 мг/мл инсулина аспарт, инсулина лизпро или регулярного инсулина, 30 мМ Трис/HCl, 5 мМ метионина, 0,01% полоксамера 188 (полоксамер 188) с 0,125% фенола и 0,075% м-крезола. Композиция 1 не содержала инсулин. Композиции 2-5 содержали инсулин аспарт, композиции 6-9 содержали регулярный инсулин, и композиции 10-13 содержали инсулин лизпро. Четыре основные композиции были подготовлены для каждого аналога ин- 152 033472 сулина. Композиции 2, 6 и 10 были такими же, как 3, 7 и 11 соответственно, но с другим pH (7,0 против

7,2). Композиции 3, 8 и 12 были такими же, как 4, 9 и 13 соответственно, но с другим содержанием NaCl.

Эти композиции дополнительно содержали 10 мг/мл олигомеров НА.

Таблица 72

Композиции

Стабилизатор

Консерванты rHuPH20

Инсулин pH

Буфер

Модификатор тоничности

мМ Трис/НС1 мМ

Трис/НС1 мМ Трис/НС1 мМ

Трис/НС1 мМ

Трис/НС1 мМ

Трис/НС1 мМ

Трис/НС1 мМ

Трис/НС1 мМ

Трис/НС1 мМ

Трис/НС1 мМ Трис/НС1

200 мМ NaCl

мМ метионина

0,01 % F68

140 мМ NaCl

мМ метионина

0,01 % F68

140 мМ NaCl

мМ метионина

0,01 %

F68

140 мМ NaCl

100 мМ NaCl

140 мМ NaCl

140 MMNaCl

140 мМ NaCl

100 MMNaCl

140 мМ NaCl

140 мМ NaCl мг/мл НА мМ метионина

0,01 %

F68 мг/мл НА мМ метионина

мМ метионина

мМ метионина мг/мл НА мМ метионина мг/мл НА мМ метионина

мМ метионина

мМ метионина

0,01 % F68

0,01 % F68

0,01 %

F68

0,01 %

F68

0,01 %

F68

0,01 % F68

0,01 %

F68

0,125% фенола 0,125 % фенола 0,125 % фенола

0,125% фенола 0,125% фенола 0,125 % фенола 0,125 % фенола 0,125 % фенола 0,125 % фенола 0,125 % фенола

0,125% фенола

0,075 % мкрезола

0,075 % мкрезола

0,075 % мкрезола

0,075 % мкрезола

0,075 % мкрезола

0,075 % мкрезола

0,075 % мкрезола

0,075 % мкрезола

0,075 % мкрезола

0,075 % мкрезола

0,075 % мкрезола

600

Ед/мл

600

Ед/мл

600

Ед/мл

600

Ед/мл

600

Ед/мл

600

Ед/мл

600

Ед/мл

600

Ед/мл

600

Ед/мл

600

Ед/мл

600

Ед/мл

мМ

Трис/НС1

мМ Трис/НС1

140 мМ NaCl

100 MMNaCl мг/мл НА мМ метионина

0,01 % F68

0,125% фенола

0,075 % мкрезола

600

Ед/мл мг/мл НА мМ метионина

0,01 %

F68

0,125% фенола

0,075 % мкрезола

600

Ед/мл

3,5 мг/мл

Аспарт

3,5 мг/мл

Аспарт

3,5 мг/мл

Аспарт

3,5 мг/мл

Аспарт

3,5 мг/мл инсулин

3,5 мг/мл инсулин

3,5 мг/мл инсулин

3,5 мг/мл инсулин

3,5 мг/мл Лизпро

3,5 мг/мл

Лизпро

3,5 мг/мл Лизпро

3,5 мг/мл

Лизпро мл каждой композиции хранили в боросиликатной 2 мл стеклянной пробирке USP типа 1 с пробкой из хлорбутиловой резины и алюминиевой крышкой. Каждую композицию инкубировали по отдельности при 5 и 37°С, и измерения стабильности проводили в момент времени t = 2, 4, 6, 8 и/или 12 дней. Стабильность оценивали измерением pH, внешнего вида, осмоляльности, ферментативной активности rHuPH20, содержания rHuPH20 с помощью RP-HPLC и содержания инсулина с помощью RP-HPLC (см. примеры 2-3, 5 и 12). Критерии приемлемости стабильности или целевого значения для каждого тестируемого параметра такие же, как описано в примере 12.

Результаты показывают, что композиция 1 и все композиции инсулина аспарт №№ 2-5) были прозрачными и бесцветными без каких-либо частиц после 12 дней как при 5°С, так и 37°С. Кристаллы наблюдались в композициях 6, 8-9 и 11-13 после 6 дней при 5°С, и кристаллы наблюдались в композиции 10 уже после 2 дней при 5°С.

Все композиции были стабильными после 4 дней при 5°С. Композиции инсулина лизпро (№№ 1013) были стабильны в течение 8 дней при 37°С, тогда как композиции инсулина (№№ 6-9) были стабильными в течение только 2 дней (за исключением № 7) при 37°С. Композиции инсулина аспарт (№№ 2-5) были стабильны в течение 4-6 дней при 37°С. Содержание rHuPH20 снизилось с течением времени для всех композиций при 37°С. Содержание инсулина снизилось с течением времени для всех композиций.

Пример 19. Тесты противомикробной эффективности различных уровней консервантов.

В этом примере несколько партий композиций, содержащих различные уровни консервантов, с целевым количеством инсулина и rHuPH20 были подготовлены для тестирования противомикробной эффективности. Тесты проводили в соответствии с руководством ЕР и USP в аналитической лаборатории, действующей по контракту (Quadrants Scientific, Inc., San Diego, CA и Lancaster Laboratories, Lancaster, PA). Композиции, содержащие различные консерванты, были испытаны на антимикробную эффективность против бактерий Pseudomonas aeruginosa, E. coli и Staphylococcus aureus и плесневых грибов Aspergillus niger и Candida albicans. Испытания проводили 1) добавлением начального инокулята (по крайней мере 10⁵ КОЕ/мл) каждой бактерии в образец и 2) измерением КОЕ/мл каждой бактерии и плесневых грибов через 24 ч, 7 дней и 14 дней. Необработанные данные (КОЕ/мл) были преобразованы единицы log10 снижения количества микроорганизмов от начального измеренного инокулята. Композиции испытывали при температуре 37°С.

- 153 033472

Все композиции содержали 100 ед./мл инсулина или аналога инсулина и 5 мкг/мл rHuPH20. Остальные компоненты варьировали среди композиций таким образом, чтобы можно было сравнить эффект различных компонентов. Результаты суммированы в табл. 73, в которой кратко приведены эффекты различных компонентов композиции на антимикробную эффективность. Нейтральный эффект указывает, что указанный компонент и концентрации не оказывают никакого влияния на антимикробную эффективность. Например, аналог инсулина, т.е. инсулин аспарт или инсулин лизпро, имеет нейтральный эффект на антимикробную эффективность при сравнении двух композиций, которые отличаются только по аналогу инсулина.

Концентрация NaCl имели либо нейтральный, либо отрицательный эффект на антимикробную эффективность в зависимости от композиции.

Таблица 73

Антимикробная эффективность

	Концентрация	Эффект
Инсулин vs аналог		Недостаточно данных
Аспарт vs Лизпро		Нейтральный
pH	(7.2 - 7.4)	Нейтральный
Метионин	(50- 100 мМ)	Нейтральный
	(20 - 50 мМ)	Недостаточно данных
NaCl	(50- 100 мМ)	Негативный
	(50 - 100 мМ)	Нейтральный
	(80- 100 мМ)	Нейтральный
F68	(0.01 - 0.03 %)	Нейтральный
	(0.01 - 0.03 %)	Слегка негативный
Глицерин	(0 - 50 мМ)	Недостаточно данных
Компания	(Quadrant или Lancaster)	Нейтральный

Пример 20. Создание клеточной линии, экспрессирующей растворимую rHuPH20.

Плазмиду HZ24 (представленную в SEQ ID NO: 52) использовали для трансфекции клеток яичника китайского хомячка (линия клеток СНО) (см., например, патенты США №№ 776429 и 7871607 и опубликованную заявку США 2006-0104968). Плазмидный вектор HZ24 для экспрессии растворимой rHuPH20 содержит каркас вектора pCI (Promega), ДНК, кодирующую аминокислоты 1-482 человеческой гиалуронидазы PH20 (SEQ ID NO: 49), внутренний сайт посадки рибосомы (IRES) из вируса ECMV (Clontech) и ген дигидрофолатредуктазы мыши (DHFR). Каркас вектора pCI также включает в себя ДНК, кодирующую ген β-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к антибиотику (AmpR), ориджин репликации f1, немедленно-ранний энхансер/промотор цитомегаловируса (CMV), химерный интрон и поздний сигнал полиаденилирования SV40. ДНК-конструкция, кодирующая растворимую rHuPH20, содержит сайт NheI и консенсусную последовательность Козака, затем последовательность, кодирующую метионин в аминокислотной позиции 1 природной 35-аминокислотной сигнальной последовательности человеческой PH20, а после последовательности ДНК, кодирующей тирозин, соответствующий аминокислоте в позиции 482 человеческой гиалуронидазы PH20, представленной в SEQ ID NO: 1, также включает стопкодон, а после него - сайт рестрикции BamHI. Таким образом, с конструкции PCI-PH20-IRES-DHFRSV40pa (HZ24) под действием промотора CMV синтезируется единственная мРНК, кодирующая аминокислоты 1-482 человеческой PH20 (представленной в SEQ ID NO: 3) и аминокислоты 1-186 мышиной дигидрофолатредуктазы (представленной в SEQ ID NO: 53), разделенные внутренним сайтом посадки рибосомы (IRES).

Нетрансфицированные клетки DG44 СНО, растущие в модифицированной CD-СНО среде GIBCO для DHFR(-) клеток, содержащей 4 мМ глутамина и 18 мл/л Plurionic F68/L (Gibco), высевали по 0,5x106 клеток/мл в перемешиваемую на шейкере колбу для подготовки к трансфекции. Клетки выращивали при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в увлажненном инкубаторе при встряхивании 120 об/мин. Экспоненциально растущие нетрансфицированные клетки DG44 СНО проверяли на жизнеспособность перед трансфекцией.

Шестьдесят миллионов жизнеспособных клеток из культуры не трансфицированных DG44 СНО клеток осаждали и ресуспендировали до плотности 2x107 клеток в 0,7 мл 2-кратного трансфекционного буфера (2xHeBS: 40 мМ HEPES, pH 7,0, 274 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1,4 мМ Na₂HPO₄, 12 мМ декстрозы). К каждой аликвоте ресуспендированных клеток было добавлено 0,09 мл (250 мкг) линеаризованной плазмиды HZ24 (рестрикция в течение ночи ферментом Cla I (New England Biolabs)), и суспензии клеток/ДНК были перенесены в кюветы для электропорации, 0,4 см ВТХ (Gentronics), при комнатной температуре. Отрицательный контроль электропорации представлял собой суспензию клеток без плазмид- 154 033472 ной ДНК, которую электропорировали разрядом конденсатора с параметрами 330 В и 960 мкФ или 350 В и 960 мкФ.

После электропорации клетки переносили из кюветы в 5 мл модифицированной CD-CHO среды для DHFR(-) клеток, содержащей 4 мМ глутамина и 18 мл/л Plurionic F68/L (Gibco), и культивировали в 6луночном планшете без селективного антибиотика в течение 2 дней при 37°С в 5% атмосфере СО₂ в увлажненном инкубаторе.

Через два дня после электропорации 0,5 мл культуральной среды удаляли из каждой лунки и проверяли ее на наличие активности гиалуронидазы с применением микротурбидиметрического метода, описанного в примере 2.

Таблица 74

Начальная активность гиалуронидазы, полученной в клетках DG44 СНО, трансфицированных HZ24, через 40 ч после трансфекции

	Разведение	Активность (ед/мл)
Трансфекция 1 330В	1:10	0,25
Трансфекция 2 350В	1:10	0,52
Отрицательный контроль	1:10	0,015

Клетки после трансфекции (350В) были отделены от культуральной среды, подсчитаны и разбавлены до 1х10⁴-2х10⁴ жизнеспособных клеток на мл. Аликвоту 0,1 мл клеточной суспензии переносили в каждую из лунок пяти 96-луночных круглодонных планшетов для культивирования клеток. В каждую лунку с клетками было добавлено 100 мкл среды CD-CHO (GIBCO), содержащей 4 мМ GlutaMAX™-1 (GIBCO™, Invitrogen Corporation) и не содержащей гипоксантина и тимидина (конечный объем 0,2 мл).

Идентифицировали десять клонов из 5 планшетов, культивированных без метотрексата.

Таблица 75

Активность гиалуронидазы в идентифицированных клонах

Планшет/лунка ID	Относительная активность гиалуронидазы
1СЗ	261
2С2	261
3D3	261
ЗЕ5	243
ЗС6	174
2G8	103
1В9	304
2D9	273
4D10	302

Шесть клонов HZ24 выращивали в культуре из одной клетки и переносили в перемешиваемые встряхиванием колбы в виде суспензий. Клоны 3D3, 3Е5, 2G8, 2D9, 1Е11 и 4D10 высевали в 96луночные круглодонные планшеты для культивирования клеток методом бесконечного разбавления, при котором клетки разводили в лунках планшета 1:2 сверху вниз и 1:3 слева направо, начиная с 5000 клеток в верхней левой лунке. Разбавленные клоны выращивали вместе с 500 нетрансфицированными DG44 СНО клетками на лунку, чтобы обеспечить наличие необходимых ростовых факторов для начальных дней в культуре. Для субклонирования было подготовлено десять планшетов, причём 5 планшетов содержали 50 нМ метотрексата и 5 планшетов были без метотрексата.

Клон 3D3 произвёл 24 видимых субклона (13 на планшете без метотрексата и 11 на планшете с 50 нМ метотрексата). Значительная активность гиалуронидазы была определена в супернатантах 8 из 24 субклонов (>50 ед./мл), и эти восемь субклонов выращивали в культуральных матрасах Т-25. Клоны, выделенные после обработки метотрексатом, выращивали в присутствии 50 нМ метспрексата. Клон 3D35M растили в присутствии 500 нМ метотрексата, что привело к образованию клонов, продуцирующих более 1000 ед./мл гиалуронидазы в перемешиваемых встряхиванием колбах (клон 3D35M, или Gen1 3D35M). Из клеток 3D35M затем был получен эталонный банк клеток (МСВ).

Пример 21. Получение клеток Gen2, содержащих растворимую человеческую PH20 (rHuPH20).

Клеточная линия Gen1 3D35M, описанная в примере 20, была адаптирована к более высоким уровням метотрексата, что привело к образованию клонов 2 поколения (Gen2). 3D35M клетки высевали из культуры, культивируемой в присутствии метотрексата, в среду CD-CHO, содержащую 4 мМ GlutaMAX1™ и 1,0 мкМ метотрексата. Клетки были адаптированы к более высокому уровню метотрексата путем выращивания их в течение 9 пассажей (46 дней) при 37°С, 7% CO₂ в увлажненном инкубаторе. Из выращенной популяции клеток были получены клоны путем предельного разведения культуры в 96- 155 033472 луночных планшетах, содержащих среду с 2,0 мкМ метотрексата. Примерно через 4 недели клоны идентифицировали, и клон 3Е10В был выбран для выращивания. Клетки 3Е10В выращивали в среде CDCHO, содержащей 4 мМ GlutaMAX-1™ и 2,0 мкМ метотрексата в течение 20 пассажей. Из клеточной линии 3Е10В был создан и заморожен эталонный банк клеток (МСВ), который можно использовать для последующих исследований.

Размножение клеточной линии продолжали, культивируя клетки 3E10В в среде CD-CHO, содержащей 4 мМ GlutaMAX-1™ и 4,0 мкМ метотрексата. После 12-го пассажа клетки были заморожены в пробирках как банк клеток для исследований (RCB). Одну пробирку из RCB оттаивали и культивировали в среде, содержащей 8,0 мкМ метотрексата. Через 5 дней концентрация метотрексата в среде была увеличена до 16,0 мкМ, а затем до 20,0 мкМ через 18 дней. Клетки после восьмого пассажа в среде, содержащей 20,0 мкМ метотрексата, были клонированы методом предельного разведения культуры в 96луночных планшетах со средой CD-CHO, содержащей 4 мМ GlutaMAX-1™ и 20,0 мкМ метотрексата. Клоны были идентифицированы 5-6 недель спустя, и клон 2В2 был выбран для выращивания в среде, содержащей 20,0 мкМ метотрексата. После 11-го пассажа клетки 2В2 были заморожены в пробирках как банк клеток для исследований (RCB).

Полученные клетки 2В2 являются дефицитными по дигидрофолатредуктазе (dhfr-) DG44 СНО клетками, которые экспрессируют растворимый рекомбинантный человеческий белок PH20 (rHuPH20). Растворимая PH20 присутствует в 2В2 клетках в количестве примерно 206 копий/клетка. Саузерн-блот анализ геномной ДНК клеток 2В2, обработанной эндонуклеазами рестрикции Spe I, Xba I и BamH I/Hind III, с применением rHuPH20-специфической пробы показал следующий профиль рестрикции: одна крупная гибридизованная полоса ~7,7 тысяч пар оснований и четыре меньших гибридизованных полосы (~13,9, ~6,6, ~5,7 и ~4,6 тысяч пар оснований) при обработке Spe I; одна крупная гибридизованная полоса ~5,0 тысяч пар оснований и две меньших гибридизованных полосы ( ~13,9 и ~6,5 тысяч пар оснований) при обработке Xba I; и единственная гибридизованная полоса ~1,4 тысяч пар оснований, наблюдаемая при обработке ДНК 2В2 эндонуклеазами рестрикции BamH I/Hind III. Анализ последовательности транскрипта мРНК показал, что полученные кДНК (SEQ ID NO: 56) были идентичны исходной последовательности (SEQ ID NO: 49) кроме одной пары оснований в положении 1131, которая оказалась тимидином (Т) вместо ожидаемого цитозина (С). Это мутация, которая не влияет на аминокислотную последовательность.

Пример 22.

а). Получение Gen2 растворимой rHuPH20 в 300 л биореакторе для культивирования клеток.

Пробирку HZ24-2B2 оттаивали и клетки выращивали, начиная с перемешиваемых встряхиванием колб до вращающейся колбы объёмом 36 л в среде CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) с добавлением 20 мкМ метотрексата и GlutaMAX-1™ (Invitrogen). Коротко, пробирку клеток оттаивали на водяной бане при 37°С, добавляли среду и клетки центрифугировали. Клетки ресуспендировали в 125 мл вращающейся колбе с 20 мл свежей среды и помещали на 37°С при 7% CO₂ в инкубатор. Клетки выращивали в 40 мл среды в 125 мл вращающейся колбе. Когда плотность клеток достигла более чем 1,5x106 клеток/мл, культуру поместили в 125 мл вращающуюся колбу с 100 мл культуральной среды. Колбу инкубировали при 37°С, 7% CO2. Когда плотность клеток достигла более чем 1,5x10⁶ клеток/мл, культуру перенесли в 250 мл вращающуюся колбу с 200 мл культуральной среды; колбу инкубировали при 37°С, 7% CO₂. Когда плотность клеток достигла более чем 1,5x106 клеток/мл, культуру перенесли в 1 л вращающуюся колбу с 800 мл культуральной среды и инкубировали при 37°С, 7% CO₂. Когда плотность клеток достигла более чем 1,5x106 клеток/мл, культуру перенесли в 6 л вращающуюся колбу с 5000 мл культуральной среды, клетки инкубировали при 37°С, 7% CO₂. Когда плотность клеток достигла более чем 1,5x106 клеток/мл, культуру перенесли в 36 л вращающуюся колбу с 32 л культуральной среды и инкубировали при 37°С, 7% CO2.

400 л реактор стерилизовали и добавляли 230 мл CD-CHO среды. Перед применением реактор был проверен на загрязнения. Примерно 30 л суспензии клеток переносили из вращающихся 36 л колб в 400 л биореактор (Braun) при плотности посевного материала 4,0x105 жизнеспособных клеток на 1 мл, общий объем 260 л. Были заданы параметры: температура 37°С; скорость мешалки 40-55 об/мин; давление в резервуаре 3 пси; циркуляция воздуха 0,5-1,5 л/мин; поток воздуха 3 л/мин. Реактор ежедневно проверяли на количество клеток, pH, состав среды, получение и накопление белка. Кроме того, во время работы реактора добавляли питательные вещества. Через 120 ч (5 дней) было добавлено 10,4 л питательной среды № 1 (4xCD-CHO + 33 г/л глюкозы + 160 мл/л Glutamax-1™ + 83 мл/л Yeastolate + 33 мг/л рекомбинантного человеческого инсулина). Через 168 ч (7 дней) было добавлено 10,8 л питательной среды № 2 (2xCD-CHO + 33 г/л глюкозы + 80 мл/л Glutamax-1™ + 167 мл/л Yeastolate + 0,92г/л бутирата натрия), а температура культуры была изменена до 36,5°С. Через 216 ч (9 дней) было добавлено 10,8 л питательной среды № 3 (1xCD-CHO + 50 г/л глюкозы + 50 мл/л Glutamax-1™ + 250 мл/л + Yeastolate 1,80 г/л бутирата натрия), а температура культуры была изменена до 36°С. Через 264 ч (11 дней) было добавлено 10,8 л питательной среды № 4 (1xCD-CHO + 33 г/л глюкоза + 33 мл/л Glutamax-1™ + 250 мл/л Yeastolate + 0,92 г/л бутирата натрия), а температура культуры была изменена до 35,5°С. Добавление питательной среды

- 156 033472 приводило к резкому повышению продукции растворимой rHuPH20 на заключительных этапах получения. Реактор использовали в течение 14 или 15 дней или до тех пор, пока жизнеспособность клеток не падала ниже 40%. Процесс привел к конечной производительности 17000 ед./мл с максимальной плотностью 12 миллионов клеток/мл. В период продукции белка культуру анализировали на наличие микоплазмы, биологического загрязнения, эндотоксинов и вирусов in vitro и in vivo; образцы были отобраны для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) и определения активности фермента.

Культуру прокачивали перистальтическим насосом параллельно через четыре модуля системы фильтрации Millistak (Millipore), каждый из которых содержит слой диатомовой земли фракции 4-8 мкм, и слой диатомовой земли фракции 1,4-1,1 мкм, после которых расположена целлюлозная мембрана, затем через единственный модуль второй системы фильтрации Millistak (Millipore), содержащей слой диатомовой земли фракции 0,4-0,11 мкм и слой диатомовой земли фракции <0,1 мкм, после которых расположена целлюлозная мембрана, а затем через последний 0,22 мкм фильтр в стерильный одноразовый гибкий мешок емкостью 350 л. В собранную культуральную жидкость добавляли ЭДТА до 10 мМ и Трис до 10 мМ, pH 7,5. Культуральная жидкость была сконцентрирована в 10 раз с помощью устройства тангенциальной проточной фильтрации (TFF), использующего четыре полиэфирсульфоновых (PES) фильтра Sartoslice TFF (Sartorius) с пределом исключения молекулярной массы (MWCO) 30 кДа, затем буфер 10х заменяли на 10 мМ Трис, 20 мМ Na₂SO₄, pH 7,5 и жидкость пропускали через фильтр на 0,22 мкм в 50 л стерильный мешок для хранения.

Концентрированную диафильтрованную жидкость подвергли обработке для инактивации вирусов. Перед инактивацией вирусов был приготовлен раствор, содержащий 10% Тритон Х-100 и 3% три-(нбутил)фосфата (TNBP). Концентрированную диафильтрованную жидкость обрабатывали 1% Тритон Х100, 0,3% TNBP в течение 1 ч в 36 л стеклянном реакционном сосуде непосредственно перед очисткой на колонке Q.

b). Очистка растворимой rHuPH20 Gen2.

Была подготовлена ионообменная колонка с Q-сефарозой (Pharmacia) (9 л смолы, Н=29 см, D=20 см). Образцы после промывания колонки были отобраны для определения pH, электропроводности и содержания эндотоксина (LAL-анализ). Колонку уравновешивали 5 объемами колонки 10 мМ Трис, 20 мМ Na₂SO₄, pH 7,5. После инактивации вирусов жидкость концентрировали, подвергали диафильтрации и загружали на колонку Q при скорости потока 100 см/ч. Колонку промывали 5 объемами колонки 10 мМ Трис, 20 мМ Na₂SO₄, pH 7,5 и 10 мМ Hepes, 50 мМ NaCl, pH 7,0. Белок элюировали 10 мМ Hepes, 400 мМ NaCl, pH 7,0 через конечный фильтр 0,22 мкм в стерильный мешок. Образец элюата проверяли на биологическое загрязнение, концентрацию белка и активность гиалуронидазы. В начале и в конце ионообменной хроматографии была определена абсорбция A280.

Затем проводили гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе (Pharmacia). Была подготовлена колонка (19-21 л смолы, Н=29 см, D=30 см) с фенил-сефарозой (PS). Образцы после промывания колонки собирали для определения pH, электропроводности и эндотоксина (LAL-анализ). Колонку уравновешивали 5 объемами колонки 5 мМ фосфата калия, 0,5 М сульфата аммония, 0,1 мМ CaCl2, pH 7,0. К элюату белка с колонки с Q-сефарозой были добавлены исходные растворы 2М сульфат аммония, 1 М фосфата калия и 1 М CaCl₂ для получения конечных концентраций 5 мМ, 0,5 М и 0,1 мМ соответственно. Белок наносили на колонку с PS при скорости потока 100 см/ч и жидкость на выходе собирали. Колонку промывали раствором, содержащим 5 мМ фосфата калия, 0,5М сульфата аммония и 0,1 мМ CaCl2, pH 7,0 при скорости 100 см/ч, и промывочный раствор также собирали. Вместе с жидкостью от промывания колонки всю прошедшую через колонку жидкость пропускали через конечный 0,22 мкм фильтр и собирали в стерильный мешок. Образцы отбирали для определения биологического загрязнения, концентрации белка и активности фермента.

Готовили колонку с аминофенилборонатом (ProMedics). Образцы после промывания колонки собирали и определяли pH, электропроводность и наличие эндотоксина (LAL-анализ). Колонку уравновешивали 5 объемами колонки раствора, содержащего 5 мМ фосфата калия, 0,5М сульфата аммония. Жидкость, прошедшую через PS и содержащую очищенный белок, наносили на колонку с аминофенилборонатном при скорости потока 100 см/ч. Колонку промывали раствором, содержащим 5 мМ фосфата калия, 0,5 М сульфат аммония, pH 7,0. Колонку промывали раствором, содержащим 20 мМ бицина, 0,5М сульфата аммония, pH 9,0. Колонку промывали раствором, содержащим 20 мМ бицина, 100 мМ хлорида натрия, pH 9,0. Белок элюировали 50 мМ Hepes, 100 мМ NaCl, pH 6,9 и пропускали через стерильный фильтр в стерильный мешок. Образцы элюата были проанализированы на биологическое загрязнение, концентрацию белка и активность фермента.

Была подготовлена колонка с гидроксиапатитом (НАР) (BioRad). Промывочную жидкость собирали и определяли pH, электропроводность и наличие эндотоксина (LAL-анализ). Колонку уравновешивали раствором, содержащим 5 мМ фосфата калия, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ CaCl2, pH 7,0. В жидкость, полученную после хроматографии на колонке с аминофенилборонатом, и содержащую очищенный белок, добавляли фосфат калия и CaCl₂ до конечных концентраций 5 мМ и 0,1 мМ, соответственно, и наносили на колонку с НАР при скорости потока 100 см/ч. Колонку промывали раствором, содержащим 5 мМ фосфата калия, pH 7, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ CaCl₂. Затем колонку промывали раствором, содержащим 10 мМ

- 157 033472 фосфат калия, pH 7, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ CaCl₂. Белок элюировали 70 мМ фосфата калия, pH 7,0 и элюат пропускали через 0,22 мкм стерильный фильтр в стерильный мешок. Образец элюата анализировали на биологическое загрязнение, концентрацию белка и активность фермента.

Затем очищенный на НАР белок пропускали через фильтр для удаления вирусных частиц. Сначала был подготовлен стерильный фильтр Viosart (Sartorius) промыванием 2 л раствора 70 мМ фосфата калия, pH 7,0. Перед применением буфер фильтровали и отбирали образцы для определения pH и проводимости. Очищенный на НАР белок пропускали с помощью перистальтического насоса через фильтр с размером пор 20 нМ для удаления вируса. Фильтрованный белок в 70 мМ фосфата калия, pH 7,0 пропускали через конечный 0,22 мкм фильтр в стерильный мешок. В образце, подвергнутом фильтрации для удаления вирусов, определяли концентрацию белка, активность фермента, концентрацию олигосахаридов, моносахаридов и сиаловой кислоты. Образец также тестировали на наличие примесей.

Белок в фильтрате затем концентрировали до 10 мг/мл с применением системы тангенциальной проточной фильтрации (TFF) Sartocon Slice (Sartorius), отсекающей частицы с молекулярной массой до 10 кДа (MWCO). Сначала фильтр был подготовлен промыванием раствором, содержащим 10 мМ гистидина, 130 мМ NaCl, pH 6,0, и в фильтрате были определены pH и проводимость. После концентрирования отбирали образец и определяли концентрацию белка и активность фермента. В образце концентрированного белка проводили 6х замену буфера до конечной концентрации 10 мМ гистидина, 130 мМ NaCl, pH 6,0. После замены буфера концентрированный белок пропускали через 0,22 мкм фильтр в 20 л стерильный мешок для хранения. Отбирали образец белка и определяли его концентрацию, ферментативную активность, концентрацию свободных сульфгидрильных групп, олигосахаридов и осмотическое давление.

Стерильную фильтрованную массу белка затем асептически дозировали по 20 мл в 30 мл стерильные флаконы Teflon (Nalgene). Флаконы затем быстро замораживали и хранили при -20±5°С.

Пример 23. Влияние лизил-лизина в качестве стабилизатора для rHuPH20.

Лизил-лизин (Lys-Lys или дилизин) тестировали на его способность стабилизировать rHuPH20 при повышенных температурах. Восемь композиций готовили, как описано в табл. 76 ниже. В качестве контроля был испытан Hylenex ™ (содержащий 167 ед./мл rHuPH20, 12,5 мМ Na₂PO₄, 145 мМ NaCl, 1 мг/мл HSA, 2,7 мМ CaCl₂, 0,1% ЭДТА, pH 7,4; обозначенный F1). Остальные композиции были приготовлены с содержанием 170 ед./мл rHuPH20, 0,01% Tween (Твин) 80 и различных наполнителей/стабилизаторов, как указано в табл. 76. Для каждой тестируемой композиции был добавлен Lys-Lys дигидрохлорид (HLys-Lys-OH HCl; RnD Chem № G-2675) в концентрации 50, 100 или 150 мМ. Поскольку Lys-Lys использовали в виде хлорида, осмоляльность варьировала между композициями, как показано в табл. 76 ниже.

Все композиции были залиты в 2 мл флаконы USP типа боросиликатного стекла с 13 мм 4432/50 серыми резиновыми пробками и закрыты алюминиевыми крышками. Флаконы инкубировали при трех различных температурах, 5°С, 25°С и 40°С до 3 месяцев. Образцы были испытаны в момент времени 0, 1 неделя, 2 неделя, 1 месяц, 2 месяца и 3 месяца, в зависимости от температуры (см. табл. 77-79). В каждой временной точке образцы вынимали из инкубатора и тестировали на активность гиалуронидазы, как описано в примере 2.

Таблица 76

Композиции

Комп.	РН20, ед/мл	NaCl, мМ	Na2PO4 мМ	LysLys-2 НС1мМ	TW80, %	Метионин мМ	рн	мОсм
F1 Hylenex™	167 Ед/мл РН20,12,5 мМ Na2PO4,145 мМ NaCl, 1 мг/мл HSA, 2,7 мМ СаС12, 0,1% ЭДТА pH 7,4	NA
F2	170	150	12,5	нет	0,01	10	7,0	316
F3	170	100	12,5	50	0,01	10	7,0	364
F4	170	50	12,5	100	0,01	10	7,0	419
F5	170	NA	NA	100	0,01	10	7,0	444
F6	170	NA	NA	150	0,01	10	6,5	446
F7	170	NA	NA	150	0,01	нет	7,0	449
F8	170	NA	NA	100	0,01	10	7,0	300

Результаты показаны в табл. 77-79 ниже, в которых приведена активность гиалуронидазы в ед./мл. Для образцов, хранящихся при 5°С или 25°С, наблюдалось небольшое снижение активности rHuPH20, но во всех образцах поддерживалась активность гиалуронидазы по меньшей мере 135 ед./мл (табл. 77 и 78). Кроме того, никаких существенных различий в активности гиалуронидазы не было обнаружено между композициями, содержащими Lys-Lys, и композициями, которые не содержали Lys-Lys. Для образцов, хранящихся при 40°С, во всех образцах уменьшилась ферментативная активность с течением времени. В композициях F1 и F2, которые не содержали Lys-Lys, наблюдалось самое большое снижение активности гиалуронидазы. Через 2 недели при 40°С активность композиций F1 и F2 была ниже 135 ед./мл. Композиции, содержащие Lys-Lys в любой концентрации, сохранили свою активность выше 135 ед./мл в течение по меньшей мере 1 месяца при 40°С.

- 158 033472

Таблица 77

Гиалуронидазная активность rHuPH20 (ед./мл) при 5°C

Композиция	Время инкубации, месяцы
0	1	2	3
F1	172	169	168	160
F2	170	162	162	150
F3	169	163	161	153
F4	165	158	158	152
F5	161	156	160	148
F6	170	163	164	157
F7	163	161	159	149
F8	177	174	169	161

Таблица 78

Гиалуронидазная активность rHuPH20 (ед./мл) при 25°С

Композиция	Время инкубации, месяцы
0	0,5	1	2	3
F1	172	176	168	157	161
F2	170	170	162	144	145
F3	169	162	162	151	152
F4	165	165	161	150	147
F5	161	161	162	160	159
F6	170	175	169	169	164
F7	163	159	155	152	156
F8	177	174	170	167	165

Таблица 79

Гиалуронидазная активность rHuPH20 (ед./мл) при 40°С

Композиция	Время инкубации, месяцы
0	0,25	0,5	1	2	3
F1	172	137	127	85	46	33
F2	170	133	114	98	63	53
F3	169	162	158	141	113	100
F4	165	160	155	138	110	96
F5	161	160	156	139	125	126
F6	170	167	162	158	141	137
F7	163	157	152	139	121	ИЗ
F8	177	171	170	149	117	128

Пример 24. Влияние низких концентраций лизил-лизина на стабильность rHuPH20.

Для изучения воздействия низких концентраций лизил-лизина и pH на активность rHuPH20 при повышенных температурах были протестированы различные композиции rHuPH20. Оценивали три различных концентрации Lys-Lys (10, 30 и 50 мМ) и три различных значения pH (6,5, 7,0 и 7,5), рассматривая в общей сложности 9 образцов. Тестируемые композиции приведены в табл. 80. В качестве контроля был испытан Hylenex ™ (описан в примере 23; F1). Все композиции от F2 до F10 были получены с целевыми значениями около 160 ед./мл rHuPH20, 10 мМ L-метионина (Spectrum № M1441), 0,01% полисорбата 80 (Baker № 4117-04) и различными количествами H-Lys-Lys-OH HCl (RnD Chem № G-2675) и NaCl (Baker № 3628). 1н. NaOH (EMD № SX0607H-6) использовали для доведения pH. Концентрацию NaCl доводили таким образом, чтобы во всех композициях было приблизительно одинаковое осмотическое давление (300 мОсм/кг). Все композиции были стерильно профильтрованы через фильтр 0,2 мкм.

Все композиции были залиты по 0,5 мл в 2 мл боросиликатные стеклянные флаконы USP типа с 13 мм 4432/50 серыми резиновыми пробками и закрыты алюминиевыми крышками. Флаконы инкубировали при 40°С в течение до 8 недель. Образцы были испытаны в момент времени 0 и 1, 2, 3, 4 и 8 недель. В каждой временной точке образцы вынимали из инкубаторов и тестировали на активность гиалуронидазы, как описано в примере 2.

- 159 033472

Таблица 80

Композиции

Композиция	Lys-Lys, мМ	Met, мМ |NaCl, мМ	PS80, %	pH	Осмоляльность, мОсм/кг
F1 Hylenex™	167 Ед/мл РН20,12,5 мМ Na2PO4, 145 мМ NaCl, 1 мг/мл HSA, 2,7 мМ СаС12, 0,1% ЭДТА pH 7,4	7,40	ND
F2	50	10	97	0,01	7,01	302
F3	30	10	117	0,01	7,51	305
F4	50	10	99	0,01	6,54	304
F5	10	10	147	0,01	6,52	305
F6	50	10	91	0,01	7,52	306
F7	10	10	145	0,01	7,52	309
F8	30	10	121	0,01	6,54	306
F9	10	10	147	0,01	7,01	310
F10	30	10	122	0,01	7,02	304

Результаты приведены в табл. 81 ниже, которая показывает активность гиалуронидазы в ед./мл и соотношение активности по сравнению с временной точкой 0. Композиции F2-F9, все содержащие LysLys, показали улучшенную стабильность rHuPH20 по сравнению с контрольной композицией F1 независимо от pH. Никаких существенных различий не наблюдалось среди образцов, содержащих 10, 30 или 50 мм Lys-Lys, что указывает на то, что добавление 10 мМ Lys-Lys достаточно для повышения стабильности rHuPH20 при 40°С. В композициях с более высокими значениями pH (7,5) ферментативная активность снизилась по сравнению со всеми образцами с более низкими значениями pH (6,5 или 7,0). Например, для образцов с pH 6,5 или 7,0 активность гиалуронидазы после 4 недель инкубации при 40°С оставалась выше 80% от исходной активности, тогда как у образцов, имеющих pH 7,5, сохранялось только около 70% начальной активности. Через 4 недели для контрольного образца rHuPH20 (F1) оставалось менее 50% от активности rHuPH20.

Таблица 81

Активность гиалуронидазы при 40°С

Композиция	Активность (Ед/млЬ)	Соотношение активностей (Τχ/Το)
0	1 нед	2 нед	3 нед	4 нед	8 нед	1 нед	2 нед	3 нед	4 нед	8 нед
Fl Hylenex	169	127	105	84	73	43	0,75	0,62	0,50	0,43	0,25
F2	149	141	141	133	132	114	0,95	0,95	0,89	0,89	0,76
F3	146	123	128	ПО	ИЗ	84	0,84	0,87	0,75	0,77	0,58
F4	152	148	152	143	139	118	0,97	1,00	0,94	0,91	0,78
F5	159	151	148	141	140	107	0,95	0,93	0,89	0,88	0,67
F6	148	133	130	114	111	82	0,90	0,87	0,76	0,75	0,55
F7	156	130	129	110	101	87	0,84	0,83	0,71	0,95	0,56
F8	156	141	144	137	132	107	0,90	0,92	0,88	0,85	0,68
F9	155	140	136	134	127	109	0,91	0,88	0,86	0,82	0,70
F10	153	146	141	137	135	112	0,95	0,92	0,90	0,88	0,73

Пример 25. Влияние лизил-лизина на активность rHuPH20 и стабильность инсулина в совместных композициях rHuPH20/инсулин.

Лизил-лизин оценивали по его способности к стабилизации композиций, содержащих как rHuPH20, так и аналог инсулина. Композиции приведены в табл. 82 ниже. Все композиции содержали 600 ед./мл rHuPH20, 3,5 мг/мл инсулина глулизина, 30 мМ Трис HCl, 5 мМ метионина, 0,001% полисорбата 20, pH 7,2, и 0,1% фенола и 0,15% м-крезола в качестве консервантов (уровни консервантов ЕР-В). Композиции F5, F1, F2 и F3 содержали 50 мМ NaCl и 0 мМ, 20 мМ, 40 мМ и 80 мМ Lys-Lys соответственно. Композиция F4 содержала более высокую концентрацию NaCl (140 мМ) и не содержала Lys-Lys. Осмоляльность композиций F3 и F4 была скорректирована с помощью NaCl, чтобы быть примерно одинаковой.

Аликвоту каждой композиции объемом в 1,0 мл помещали в 2 мл флакон USP типа I из боросиликатного стекла с 13 мм 4432/50 серой резиновой пробкой и закрывали алюминиевой крышкой. Флаконы инкубировали при 5°С и 37°С. Пробы отбирали в дни 3 и 6 и тестировали на ферментативную активность гиалуронидазы, pH, осмоляльность и внешний вид, как описано в примерах 2 и 3.

- 160 033472

Таблица 82

Композиции, содержащие 600 ед./мл rHuPH20 и 3,5 мг/мл глулизина

Комп.	pH	Буфер	Модификатор тоничности	Стабилизаторы	Консерванты
Трис/Cl, мМ	NaCl, мМ	Метионин, мМ	PS20, %	Lys-Lys, мМ	Фенол, %	м-Крезол, %
F1	7,2	30	50	5	0,001	20	0,100	0,150
F2	7,2	30	50	5	0,001	40	0,100	0,150
F3	7,2	30	50	5	0,001	80	0,100	0,150
F4	7,2	30	140	5	0,001	0	0,100	0,150
F5	7,2	30	50	5	0,001	0	0,100	0,150

Добавление лизил-лизина не влияло на внешний вид: все композиции были прозрачными и бесцветными без видимых частиц, что указывало на стабильность инсулина. Активность гиалуронидазы для испытанных композиций, как экстраполировано из стандартной кривой, приведена в табл. 83 ниже. Во всех композициях активность гиалуронидазы сохраняется после инкубации в течение 6 дней при 5°С. Только композиция F3, которая содержала 80 мМ Lys-Lys, сохранила некоторую ферментативную активность гиалуронидазы после 3 дней при 37°С. После 6 дней при 37°С, F3 потеряла большую часть ферментативной активности гиалуронидазы. Когда осмоляльность точно контролировалась и была примерно сопоставима, как в композициях F3 и F4, Lys-Lys был лучшим стабилизатором для rHuPH20 по сравнению с NaCl, о чем свидетельствует повышенная активность гиалуронидазы.

Таблица 83 Ферментативная активность гиалуронидазы (ед./мл) и осмоляльность

Композиция	Осомоляльность, (мОсм)	5°С	37°С	37°С
бди	3 дн	бди
F1	238	556	13	-18
F2	288	589	63	1
F3	396	563	165	79
F4	347	582	70	9
F5	182	541	5	-4

Пример 26. Сравнение влияния лизил-лизина и NaCl на стабильность rHuPH20 в совместных композициях rHuPH20/инсулин.

Совместные композиции инсулина и rHuPH20 были испытаны для изучения эффектов лизил-лизина и NaCl на стабильность rHuPH20. Тестируемые композиции были созданы с равной ионной силой, но одна композиция содержала лизил-лизин и NaCl, а другая композиция содержала только NaCl. В частности, были созданы три набора композиций инсулина глулизина и rHuPH20, имеющие разные уровни ионной силы. Композиции приведены в табл. 84 ниже. Все композиции содержали 600 ед./мл rHuPH20, 3,5 мг/мл инсулина глулизина, 30 мМ Трис HCl, 5 мМ метионина, 0,001% полисорбата 20, pH 7,2, и 0,1% фенола и 0,15% м-крезола в качестве консервантов (уровни консервантов ЕР-В). Композиции F1, F3 и F5 содержали лизил-лизин и NaCl, как указано в табл. 84 ниже. Композиции F2, F4 и F6 содержали только NaCl. Композиции были испытаны на их фактический pH и осмоляльность.

Аликвоту каждой композиции объемом в 1,0 мл помещали в 2 мл флакон USP типа I из боросиликатного стекла с 13 мм 4432/50 серой резиновой пробкой и закрывали алюминиевой крышкой. Флаконы инкубировали при 5°С до 30°С в течение до 4 недель. Пробы отбирали на 6-й день и через 2 и 4 недели и испытывали на ферментативную активность гиалуронидазы, как описано в примере 2.

Таблица 84

Композиции, содержащие 600 ед./мл rHuPH20 и 3,5 мг/мл глулизина

Композиция	рн	Буфер	Модификатор тоничности	Стабилизаторы	Консерванты
Трис/С1 мМ	NaCl, мМ	Метионин мМ	PS20 %	Lys-Lys мМ	Фенол %	м-Крезол %
F1	7,2	30	40	5	0,001	20	0,100	0,150
F2	7,2	30	60	5	0,001	нет	0,100	0,150
F3	7,2	30	80	5	0,001	40	0,100	0,150
F4	7,2	30	120	5	0,001	нет	0,100	0,150
F5	7,2	30	160	5	0,001	80	0,100	0,150
F6	7,2	30	240	5	0,001	нет	0,100	0,150

Результаты показаны в табл. 85 ниже, где приведена ферментативная активность гиалуронидазы (ед./мл) в испытанные временные точки, а также % активности гиалуронидазы по сравнению с активностью, проявленной в Т0 (% от Т0).

Многофакторный анализ ферментативной активности rHuPH20 в зависимости от времени инкуба

- 161 033472 ции, концентрации лизил-лизина и ионной силы проводили на основе относительной активности по сравнению Т0 с помощью программы JMP v. 8.02 (SAS Institutes). Композиции, имеющие более высокую ионную силу (F5 и F6), сохранили более высокую ферментативную активность гиалуронидазы, чем композиции, имеющие более низкую ионную силу (F1 и F2) (р <0,001). Кроме того, композиции, содержащие лизил-лизин, имели значительно более высокую активность, чем не содержащие лизил-лизин (р = 0,04). Скорость снижения ферментативной активности гиалуронидазы обратно коррелировала с ионной силой, что указывает на то, что большая ионная сила может существенно снизить скорость деградации. Для растворов с одинаковой ионной силой (например, F5 и F6) не наблюдалось значимой разницы после двух недель, однако после 4 недель при 30°С в ферментативной активности гиалуронидазы наблюдалось значительное различие: F5, содержащая лизил-лизин, сохраняла 91% активности, a F6, которая не содержала лизил-лизин, имела только 75% остаточной активности. Та же тенденция наблюдалась для композиций с более низкой ионной силой: композиции, содержавшие лизил-лизин, сохраняли повышенную активность по сравнению с теми, которые не содержали лизил-лизина.

Таблица 85 рН, осмоляльность и ферментативная активность rHuPH20 при 30°С

Комп.	pH	Осмоляльность (мОсм)	Активность rHuPH20, Ед/мл (% от ТО)
ТО	6 дн	2 нед	4 нед
F1	7,17	204	567(100%)	505 (89%)	405 (71%)	288 (51%)
F2	7,22	210	523 (100%)	416 (80%)	334 (64%)	222 (42%)
F3	7,23	321	543 (100%)	517(95%)	481 (88%)	400 (73%)
F4	7,20	312	528 (100%)	471 (89%)	438 (83%)	332 (63%)
F5	7,22	542	525 (100%)	522 (99%)	496 (94%)	476 (91%)
F6	7,19	531	511 (100%)	533 (104%)	498 (97%)	382 (75%)

Пример 27. Влияние лизил-лизина в качестве буфера и влияние температуры на изменения pH совместных композиций rHuPH20/инсулин.

Лизил-лизин оценивали по его способности выступать в качестве буфера в совместных композициях, содержащих rHuPH20 и инсулин, заменив Трис на лизил-лизин. Протестированные композиции приведены в табл. 86 ниже. Все созданные композиции содержали 600 ед./мл rHuPH20, 3,5 мг/мл инсулина глулизина, 5 мМ метионина, 0,001% полисорбата 20, pH 7,2, и 0,1% фенола и 0,15% м-крезола в качестве консервантов (уровни консервантов ЕР-В). Каждая композиция содержала 30, 50, 80 или 105 мМ лизиллизина (Biopeptide, G-2675, Лот № 1037762). Ни одна композиция не содержала Трис HCl. NaCl был добавлен до окончательной осмоляльности в 380±30 мОсм.

Аликвоту каждой композиции объемом в 1,0 мл помещали в 2 мл флакон USP типа I из боросиликатного стекла с 13 мм 4432/50 серой резиновой пробкой и закрывали алюминиевой крышкой. Флаконы инкубировали при 5°С и 37°С. Пробы отбирали в дни 1, 4 и 6 и тестировали на ферментативную активность гиалуронидазы, pH и осмоляльность, как описано в примерах 2 и 3. Каждую композицию испытывали также для оценки способности лизил-лизина действовать в качестве буфера в диапазоне целевого pH от pH 6,5 до 8,0 построением кривой титрования pH в зависимости от количества титранта (1н. NaOH; EMD, Cat SX0607H-6, Лот НС067239), который был добавлен.

Таблица 86

Композиции, содержащие 600 ед./мл rHuPH20 и 3,5 мг/мл глулизина

Композиция	рн	Модификатор тоничности	Стабилизаторы	Консерванты
NaCl, мМ	Метионин, мМ	PS20, %	Lys-Lys, мМ	Фенол, %	м-Крезол %
F1	7,2	0	5	0,001	105	0,100	0,150
F2	7,2	40	5	0,001	80	0,100	0,150
F3	7,2	85	5	0,001	50	0,100	0,150
F4	7,2	115	5	0,001	30	0,100	0,150

Результаты показаны в табл. 87, где приведены осмоляльность и ферментативная активность гиалуронидазы. Как показано в предыдущих примерах, Lys-Lys стабилизировал rHuPH20 в композициях, так как гиалуронидазная активность была меньше снижена при более высоких концентрациях Lys-Lys. Кроме того, лизил-лизину удалось стабилизировать rHuPH20 больше, чем NaCl, при том же уровне ионной силы.

- 162 033472

Таблица 87

Осмоляльность и активность гиалуронидазы

Композиция	Осмоляльность (мОсм)	Активность rHuPHlO, Ед/мл
ТО	1 дн	4 дн	6 дн
F1	373	507	408	263	134
F2	382	550	411	218	85
F3	410	535	403	213	81
F4	368	582	421	170	54

В табл. 88 ниже приведены значения pH при различных температурах и влияние температуры на pH. Титрование лизил-лизина с помощью NaOH показало, что лизил-лизин может служить буфером при pH в интервале от 6,5 до 8,0, особенно при более высоких концентрациях (например, 80 или 105 мМ). Как показано в табл. 88, температурный эффект (dpH/dT) или отношение изменения pH к изменению температуры остается постоянным при -0,033 ед./°С, что немного выше, чем известно для Трис (-0,028 ед./°С). Идеальный буфер имеет больший температурный эффект, так как при более низких температурах хранения (например, 2-8°С) инсулин выгоднее хранить при более высоком pH, тогда как при более высоких температурах rHuPH20 выгодно хранить при более низком pH. Таким образом, показано, что в композициях, содержащих как инсулин, так и rHuPH20, лизил-лизин одновременно является оптимальным буфером и стабилизатором.

Таблица 88

Влияние температуры на pH

Композиция	Измеренный pH при температуре	Температурный эффект
0°С	22°С	37°С	dpH/dT (Ед/°С)
F1	7.93	7.20	6.72	-0.033
F2	7.93	7.26	6.71	-0.033
F3	7.96	7.26	6.73	-0.033
F4	7.94	7.23	6.72	-0.033

Пример 28. Стабильность rHuPH20 в совместных композициях с инсулином, содержащих лизиллизин, с течением времени при 5°С, 30°С и 37°С.

Лизил-лизин тестировали на его способность стабилизировать совместные композиции аналога инсулина и rHuPH20, содержащие уровни консервантов USP. Композиции приведены в табл. 89 ниже. Каждая композиция содержала 600 ед./мл rHuPH20, 3,5 мг/мл аналога инсулина (либо инсулина глулизин, либо инсулина аспарт), 5 мМ метионина, 0,001% поверхностно-активного вещества (либо полоксамера 188, либо полисорбата 20) и уровни консервантов согласно USP (0,125% фенола и 0,075% м-крезола). Для каждого аналога инсулина две композиции имели pH 7,0 и две композиции имели pH 7,2. Кроме того, при каждом pH одна композиция содержала всего 100 мМ лизил-лизина, тогда как другая композиция содержала 30 мМ NaCl и 80 мМ лизил-лизина. Для сравнения с инсулином аспарт была подготовлена композиция F9, содержащая 30 мМ Трис/HCl.

Аликвоту каждой композиции объемом в 1,0 мл помещали в 2 мл флакон USP типа I из боросиликатного стекла с 13 мм 4432/50 серой резиновой пробкой и закрывали алюминиевой крышкой. Флаконы инкубировали при 5°С, 30°С и 37°С в течение до 4 недель. Пробы отбирали, как указано в табл. 90 и 91, и испытывали на ферментативную активность rHuPH20, как описано в примере 2. Результаты показаны в табл. 90 и 91 ниже, где приведена ферментативная активность гиалуронидазы в ед./мл.

Таблица 89

Композиции, содержащие 600 ед./мл rHuPH20 и 3,5 мг/мл аналога инсулина

		Буфер	Модификатор тоничности	Стабилизаторы	Поверхностноактивное вещество	Консерванты	АП
Комп.	рн	Трис/ С1 мМ	NaCl мМ	Метионин мМ	Lys-Lys мМ	F68 %	PS20 %	Фенол %	м-Крезол %	Аналог инсулина
F1	7,0	0	0	5	100		0,001	0,125	0,075	Глулизин
F2	7,0	0	30	5	80		0,001	0,125	0,075	Глулизин
F3	7,2	0	0	5	100		0,001	0,125	0,075	Глулизин
F4	7,2	0	30	5	80		0,001	0,125	0,075	Глулизин
F5	7,0	0	0	5	100	0,01		0,125	0,075	Аспарт
F6	7,0	0	30	5	80	0,01		0,125	0,075	Аспарт
F7	7,2	0	0	5	100	0,01		0,125	0,075	Аспарт
F8	7,2	0	30	5	80	0,01		0,125	0,075	Аспарт
F9	7,2	30	100	5	0	0,01		0,125	0,075	Аспарт

*F68 = полоксамер 188 (Pluronic® F68); PS20 = полисорбат 20.

- 163 033472

1. Совместные композиции гНиРН20-инсулин глулизин.

Как показано в табл. 90 для композиций гНиРН20-инсулин глулизин, активность гиалуронидазы оставалась постоянной для всех композиций при 5°С и 30°С. При 37°С уменьшение активности гиалуронидазы наблюдалось с течением времени для всех композиций. За период времени испытания композиции были определены как стабильные, так как ни в одной из композиций не было активности гиалуронидазы ниже 375 ед./мл.

Таблица 90

Активность гиалуронидазы (композиции гНиРН20-глулизин)

Композиция	5°С	30°С	37°С
ТО	4 нед	2 мес	3 мес	2 нед	4 нед	3 ди	6 дн
F1	783	710	740	743	713	790	708	647
F2	811	770	776	745	741	834	726	678
F3	730	689	718	681	689	752	645	545
F4	688	655	718	646	665	676	581	491

2. Совместные композиции гНиРН20-инсулин аспарт.

Как показано в табл. 91 для композиций гНиРН20-инсулина аспарт, все композиции были стабильны в течение до 3 месяцев при 5°С. При 30°С все композиции, содержащие лизил-лизин, были стабильны в течение до 4 недель, в то время как композиция F9 (не содержащая Lys-Lys) показала потерю активности гиалуронидазы. При 37°С во всех композициях уменьшилась активность гиалуронидазы с течением времени, темпы снижения зависели от композиции. Например, после 6 дней при 37°С, композиция F5 (с 100 мМ Lys-Lys и pH 7,0) имела более высокую активность, чем F8 (композиция, имеющая 80 мМ LysLys и pH 7,2). В эту временную точку и при этой температуре композиция F9, которая не содержала лизил-лизин, потеряла почти всю активность гиалуронидазы.

Таблица 91

Активность гиалуронидазы (композиции гНиРН20-аспарт)

Композиция	5°С	30°С	37°С
ТО	4 нед	2 мес	3 мес	2 нед	4 нед	3 дн	6 дн
F5	741	661	762	775	677	726	622	505
F6	749	676	795	672	687	739	600	495
F7	712	625	726	635	601	656	544	413
F8	703	608	729	621	605	638	499	292
F9	806	695	851	713	582	448	279	65

Пример 29. Влияние человеческого сывороточного альбумина (HSA) или лизил-лизина на стабильность rHuPH20 при перемешивании и тепловом стрессе.

Композиции гНиРН20 были испытаны на стабильность при условиях ускоренной деградации, в том числе при перемешивании и тепловом стрессе. Композиции приведены в табл. 92 ниже. Каждая композиция содержала 160 ед./мл rHuPH20, 12,5 мМ фосфата натрия, pH 7,0, и 145 мМ NaCl. Каждая композиция дополнительно содержала один или более компонент, выбранный из человеческого сывороточного альбумина (HSA), CaCl₂, ЭДТА, полисорбата 80, метионина и лизил-лизина, как указано в табл. 92 ниже.

Аликвоту каждой композиции объемом в 1,5 мл помещали в 2 мл флакон USP типа I из боросиликатного стекла с 13 мм 4432/50 серой резиновой пробкой и закрывали алюминиевой крышкой. Флаконы, содержавшие видимые частицы, были исключены из исследования. Композиции были испытаны как при перемешивании, так и при тепловом стрессе. Для изучения перемешивания 2 образца из каждой композиции инкубировали при 25°С и перемешивали при 650 об/мин в течение 72 ч. Для исследования теплового стресса 4 образца каждой композиции инкубировали при 40°С в течение до 4 недель, образцы отбирали каждую неделю.

- 164 033472

Таблица 92

Композиции rHuPH20

Композиция	РН20 Ед/мл	Буфер, pH	NaCl мМ	HSA мг/мл	СаС12 мМ	ЭДТА %	PS80 %	Met мМ	Lys-Lys мМ
F1	160	12,5 мМ NaPO4, 7,0	145	1	2,7	0,1	0	0	0
F2	160	12,5 мМ NaPO4, 7,0	145	1	0	0	0	0	0
F3	160	12,5 мМ NaPO4, 7,0	145	1	0	0	0,02	0	0
F4	160	12,5 мМ NaPO4, 7,0	145	0	0	0	0,02	10	0
F5	160	12,5 мМ NaPO4, 7,0	145	0	0	0	0,04	10	0
F6	160	12,5 мМ NaPO4, 7,0	145	0	0	0	0,06	10	0
F7	160	12,5 мМ NaPO4, 7,0	145	0	0	0	0,02	10	10

Все образцы были испытаны на активность гиалуронидазы, как описано в примере 2. Наличие нерастворимых и растворимых частиц было протестировано с использованием Micro-Flow Imaging (MFI). Для этого каждую композицию rHuPH20 или контрольный образец измеряли с помощью прибора MicroFlow Imaging модели 4200 (Brightwell Technologies, Inc, Ottawa, Canada). Перед каждым запуском пустой буфер фильтровали через 0,22-микронный фильтр и пропускали через систему, чтобы обеспечить чистый фон и оптимизировать освещение. Чтобы уравновесить систему, по меньшей мере 2 мл образца отбирали перед анализом. 1 мл пробы исследовали при скорости потока 170 мкл/мин с использованием перистальтического насоса. Было установлено 5х увеличение для обнаружения частиц в пределах от 1 до 100 мкм с анализом глубины поля 100 мкм. Частицы были подсчитаны, данные были автоматически записаны прибором и был сформирован отчёт в формате количество частиц/мл. Буфер или композиции, содержащие rHuPH20, но не подвергшиеся перемешиванию, использовали в качестве контроля. Эксклюзионную хроматографию также проводили, как описано в примере 4. Результаты показаны в табл. 93-95 ниже.

1. Активность гиалуронидазы.

В табл. 93 представлены активность гиалуронидазы в ед./мл и % от активности по сравнению с временной точкой 0 (Т0). Результаты показывают, что через 8 дней при 40°С в композициях, которые не содержали HSA (F4, F5 и F6), снизилась активность гиалуронидазы по сравнению с композициями F1, F2 и F3, которые содержали HSA. В композиции F7, содержавшей Lys-Lys, сохранялся высокий уровень активности гиалуронидазы после 15 дней при 40°С.

После стресса перемешиванием композиции, содержащие по меньшей мере 0,04% полисорбата 80 и 10 мМ метионина, сохранили такую же активность гиалуронидазы, как и композиция, содержащая LysLys. Композиции F1-F4 показали небольшое снижение активности гиалуронидазы. В целом, композиция F7 (содержащая Lys-Lys) показала наибольшее сохранение ферментативной активности rHuPH20 как в испытаниях теплового стресса, так и в испытаниях перемешиванием.

Таблица 93

Активность гиалуронидазы при перемешивании и тепловом стрессе

Композиция	Время 0	Перемешивание 25°С,72 ч Ед/мл (% t0)	40°С, 8 дней Ед/мл (% tO)	40° С, 15 дней Ед/мл (% t0)
F1	155	146 (94)	149 (96)	139 (90)
F2	154	144 (94)	150 (97)	134 (87)
F3	153	142 (93)	153 (100)	132 (86)
F4	155	148 (96)	122 (79)	100 (65)
F5	153	158 (103)	110(72)	105 (69)
F6	153	157(103)	117 (76)	107 (70)
F7	151	153(101)	147 (97)	147 (97)

2. Наличие агрегированного белка или нерастворимых агрегатов.

В табл. 94 представлены подсчеты для твердых частиц (нерастворимых агрегатов) в виде количества частиц/мл для каждого диапазона размеров в микронах. Например, среди диапазонов размеров в микронах, которые были протестированы с использованием MFI, были частицы (р) с размером больше чем 5 мкм, но меньше 10 мкм (5 <р<10), 10 <р<25, 25 <р<50 и р >50. Были созданы контрольные композиции для F1 и F4, которые не содержали rHuPH20, и контрольные композиции для F2, F4 и F6, которые представляли собой те же композиции, которые не перемешивали.

Наличие или отсутствие HSA не влияло на контрольные не перемешиваемые пробы, в каждой из

- 165 033472 которых было приблизительно одинаковое количество частиц. После перемешивания композиции, содержавшие HSA, но не содержавшие полисорбат 80 (F1 и F2), имели значительно больше частиц, чем все другие композиции, в том числе F3, которая отличалась от F2 только добавлением полисорбата 80. Добавление большего количества полисорбата 80 (F5 и F6 по сравнению с F4) не имело значительного эффекта в снижении образования агрегатов. В композиции F7, содержавшей Lys-Lys, было самое маленькое количество нерастворимых агрегатов после перемешивания.

Таблица 94

Подсчет твердых частиц с помощью измерений MFI (число частиц/мл)

	Перемешивание	Контроль (не перемешанные образцы)	Буфер (без rHuPH20)
5<р <10	10<р <25	25<р <50	Р >50	5<Р <10	10<р <25	25<р <50	Р >50	5<Р <10	10<р <25	25<р <50	Р >50
1	9770	5385	1090	248	—	...	—	—	403	58	7	0
2	10858	6930	795	139	1257	397	15	0		—	—	—
3	2895	382	39	10	—	—	—	—	—	—	—	—
4	2380	267	27	7	1356	167	0	3	31	8.0	0	0
5	2313	211	5	0	...	—	—	...	—	...	—	...
6	2610	432	41	8	1667	150	6	0	...	—	—	...
7	1299	129	5	0	—	...	—	—	—	—	...	—

р - размер частиц (микроны).

3. Эксклюзионная хроматография.

Растворимые агрегаты также были измерены с помощью эксклюзионной хроматографии. В табл. 95 представлены растворимые агрегаты (агрегаты с высокой молекулярной массой) в mAu* мин (тысячные единиц абсорбции* мин) и в процентах от общей площади пика. Композиции от F4 до F7 содержали слишком мало белка, чтобы быть обнаруженными с помощью эксклюзионной хроматографии. Композиции F1-F3, содержавшие HSA, показали низкие уровни агрегатов с высокой молекулярной массой после перемешивания при 25°С. Добавление полисорбата 80 уменьшало общее количество агрегатов (F3 по сравнению с F1 или F2).

Таблица 95

Растворимые агрегаты, измеренные с помощью эксклюзионной хроматографии в mAu * мин (% от общей площади пика)

Комп.	Контроль	Перемешивание
5° С, То	72 часов при 650 об/мин (25°С)
	Основной	HMW	Основной	HMW
F1	4066 (97,9)	86(2,1)	4020 (97,1)	120 (2,9)
F2	4023 (98,0)	81 (2,0)	3913 (97,3)	108 (2,7)
F3	3970 (98,0)	82 (2,0)	3950 (98,0)	79 (2,0)
F4	20	ND	19	ND
F5	21	ND	19	ND
F6	22	ND	21	ND
Fs7	21	ND	20	ND

HMW = высокий молекулярный вес.

Поскольку модификации будут очевидны специалистам в данной области, предполагается, что это изобретение ограничено только объемом прилагаемой формулы изобретения.

- 166 033472

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ГАЛОЗИМ Инк.

Янг, Цунг Хорнг

Лэбарри, Майкл Джеймс

Вогн, Дэниел Эдвард

Кэстер, Кристофер Л.

Николь, Франсуа

Ким, Донгхьюн <120> СТАБИЛЬНЫЕ СОСТАВЫ НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТА, РАЗРУШАЮЩЕГО ХИАЛУРОНАН <130> 33320-3085PC <140> Еще не установлено <141> этим документом <150> US 61/520,962 <151> 2011-06-17 <160> 273 <170> FastSEQ для Windows Версия 4.0 <210> 1 <211> 509 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> предшественник человеческой PH20 <400> 1

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

- 167 033472

225

Val Glu

Thr Ala

Ala Ala

Ser Lys

290

Arg Ile 305

Leu Val

Val Ile

Leu Leu

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val Arg

Phe Tyr

Val Lys

450

Ile Asp

465

Phe Tyr

Ser Ile

Ile Lys

Leu Tyr

260

Thr Leu

275

Ile Pro

Val Phe

Tyr Thr

Trp Gly

340

Asp Asn

355

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Ala Phe

Asn Ala

Leu Phe

500

230 Arg Asn 245

Pro Ser

Tyr Val

Asp Ala

Thr Asp

310

Phe Gly

325

Thr Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ala

405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Leu Lys

470

Ser Pro

485

Leu Ile

Asp Asp

Ile Tyr

Arg Asn

280 Lys Ser 295

Gln Val

Glu Thr

Ser Ile

Glu Thr

360 Met Cys 375

Asn Trp

Ile Gln

Leu Glu

Ser Thr

440

Val Asp

455

Pro Pro

Ser Thr

Ile Ser

Leu Ser

250

Leu Asn

265

Arg Val

Pro Leu

Leu Lys

Val Ala

330

Met Arg

345

Ile Leu

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

Met Glu

Leu Ser

490

Ser Val

505

235

Trp Leu

Thr Gln

Arg Glu

Pro Val

300

Phe Leu

315

Leu Gly

Ser Met

Asn Pro

Val Leu

380

Ser Asp

395

Lys Gly

Glu Gln

Cys Lys

Ile Ala

460

Thr Glu

475

Ala Thr

Ala Ser

Trp Asn

Gln Ser

270

Ala Ile

285

Phe Ala

Ser Gln

Ala Ser

Lys Ser

350

Tyr Ile 365

Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Glu Lys 445 Asp Gly

Glu Pro

Met Phe

Leu

240

Glu Ser 255

Pro Val

Arg Val

Tyr Thr

Asp Glu

320 Gly Ile 335

Cys Leu

Ile Asn

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr 415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys

Gln Ile

480

Ile Val

495 <210> 2 <211> 474 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый PH20 <400> 2

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

- 168 033472

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

Tyr

Asn

435

440

445

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

Val

Ser

Ile

Leu

450

455

460

Phe

Leu

Ile

Ile

Ser

Ser

Val

Ala

Ser

Leu

465

470

<210> 3 <211> 482 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> предшественник растворимой rHuPH20 <400> 3

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

- 169 033472

Ile Asn

Gly Tyr

Gly Ile

Lys Asp

130 Ile Asp 145

Lys Asp

Val Gln

Glu Lys

Leu Leu

210 Tyr Asn 225

Val Glu

Thr Ala

Ala Ala

Ser Lys

290

Arg Ile 305

Leu Val

Val Ile

Leu Leu

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val Arg

Phe Tyr

Val Lys

450

Ile Asp

465

Phe Tyr

Ala Thr

Tyr Pro

100

Pro Gln

115

Ile Thr

Trp Glu

Val Tyr

Leu Ser

180

Ala Gly

195

Arg Pro

His His

Ile Lys

Leu Tyr

260

Thr Leu

275

Ile Pro

Val Phe

Tyr Thr

Trp Gly

340

Asp Asn

355

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Ala Phe

Gly Gln 85

Tyr Ile

Lys Ile

Phe Tyr

Glu Trp

150 Lys Asn 165

Leu Thr

Lys Asp

Asn His

Tyr Lys

230 Arg Asn 245

Pro Ser

Tyr Val

Asp Ala

Thr Asp

310

Phe Gly

325

Thr Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ala

405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Leu Lys

470

Gly Val

Asp Ser

Ser Leu

120

Met Pro

135

Arg Pro

Arg Ser

Glu Ala

Phe Leu

200 Leu Trp 215

Lys Pro

Asp Asp

Ile Tyr

Arg Asn

280 Lys Ser 295

Gln Val

Glu Thr

Ser Ile

Glu Thr

360 Met Cys 375

Asn Trp

Ile Gln

Leu Glu

Ser Thr

440

Val Asp

455

Pro Pro

Thr Ile

Ile Thr

105

Gln Asp

Val Asp

Thr Trp

Ile Glu

170

Thr Glu

185

Val Glu

Gly Tyr

Gly Tyr

Leu Ser

250

Leu Asn

265

Arg Val

Pro Leu

Leu Lys

Val Ala

330

Met Arg

345

Ile Leu

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

Met Glu

Phe Tyr

Gly Val

His Leu

Asn Leu

140 Ala Arg 155

Leu Val

Lys Ala

Thr Ile

Tyr Leu

220 Asn Gly 235

Trp Leu

Thr Gln

Arg Glu

Pro Val

300

Phe Leu 315

Leu Gly

Ser Met

Asn Pro

Val Leu

380 Ser Asp 395 Lys Gly

Glu Gln

Cys Lys

Ile Ala

460

Thr Glu

475

Val Asp

Thr Val

110 Asp Lys 125

Gly Met

Asn Trp

Gln Gln

Lys Gln

190 Lys Leu 205

Phe Pro

Ser Cys

Trp Asn

Gln Ser

270

Ala Ile

285

Phe Ala

Ser Gln

Ala Ser

Lys Ser

350

Tyr Ile 365

Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Glu Lys 445 Asp Gly

Glu Pro

Arg Leu

Asn Gly

Ala Lys

Ala Val

Lys Pro

160

Gln Asn

175

Glu Phe

Gly Lys

Asp Cys

Phe Asn

240

Glu Ser

255

Pro Val

Arg Val

Tyr Thr

Asp Glu

320

Gly Ile

335

Cys Leu

Ile Asn

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr

415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys

Gln Ile

480 <210> 4 <211> 447 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> растворимый rHuPH20 1-447

- 170 033472 <400> 4

Leu Asn 1

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

Tyr

435

440

445

<210> 5 <211> 446 <212> Белок <213> Homo sapiens

- 171 033472 <220>

<223> растворимый rHuPH20 1-446 <400> 5

Leu Asn 1

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

435

440

445

- 172 033472 <210> 6 <211> 445 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> растворимый rHuPH20 1-445 <400> 6

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

- 173 033472

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro

Gln Ile

435

440

445 <210> 7 <211> 444 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> растворимый rHuPH20 1-444 <400> 7

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

- 174 033472

Ser Cys

Tyr

Ser Thr 405

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu 410

Lys

Ala

Asp

Val

Lys 415

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

435

440

<210> 8 <211> 443 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> растворимый rHuPH20 1-443 <400> 8

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

- 175 033472

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Thr Asp

Phe Leu

Ala Val

420

Lys Pro

435

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Pro Met

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Glu Thr

440

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ala Asp

425

Glu Glu

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Gly Val

Pro

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Arg Gly

Tyr Cys

400

Lys Asp

415

Asp Ala <210> 9 <211> 442 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> растворимый rHuPH20 1-442 <400> 9

Leu 1

Asn

Phe

Arg Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

- 176 033472

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Phe Leu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Lys Pro

435

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Pro Met

Gln Val

Ser Ser

360 Glu Lys 375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Glu Thr

440

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ala Asp

425

Glu Glu

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Gly Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400

Lys Asp

415

Asp Ala <210> 10 <211> 450 <212> Белок <213> Bos taurus <220>

<223> гиалуронидаза <400> 10

Met 1

Arg

Pro

Phe

Ser 5

Leu

Glu

Val

Ser

Leu 10

His

Leu

Pro

Trp

Ala 15

Met

Ala

Ala

His

Leu

Leu

Pro

Val

Cys

Thr

Leu

Phe

Leu

Asn

Leu

Leu

Ser

20

25

30

Met

Thr

Gln

Gly

Ser

Arg

Asp

Pro

Val

Val

Pro

Asn

Gln

Pro

Phe

Thr

35

40

45

Thr

Ile

Trp

Asn

Ala

Asn

Thr

Glu

Trp

Cys

Met

Lys

Lys

His

Gly

Val

50

55

60

Asp

Val

Asp

Ile

Ser

Ile

Phe

Asp

Val

Val

Thr

Asn

Pro

Gly

Gln

Thr

65

70

75

80

Phe

Arg

Gly

Pro

Asn

Met

Thr

Ile

Phe

Tyr

Ser

Ser

Gln

Leu

Gly

Thr

85

90

95

Tyr

Pro

Tyr

Tyr

Thr

Ser

Ala

Gly

Glu

Pro

Val

Phe

Gly

Gly

Leu

Pro

100

105

110

Gln

Asn

Ala

Ser

Leu

Asn

Ala

His

Leu

Ala

Arg

Thr

Phe

Gln

Asp

Ile

115

120

125

Leu

Ala

Ala

Met

Pro

Glu

Pro

Arg

Phe

Ser

Gly

Leu

Ala

Val

Ile

Asp

130

135

140

Trp

Glu

Ala

Trp

Arg

Pro

Arg

Trp

Ala

Phe

Asn

Trp

Asp

Thr

Lys

Asp

145

150

155

160

Ile

Tyr

Arg

Gln

Arg

Ser

Arg

Ala

Leu

Val

Gln

Lys

Gln

His

Pro

Asp

165

170

175

Trp

Leu

Ala

Pro

Arg

Val

Glu

Ala

Ala

Ala

Gln

Asp

Gln

Phe

Glu

Gly

180

185

190

Ala

Ala

Glu

Glu

Trp

Met

Ala

Gly

Thr

Leu

Lys

Leu

Gly

Gln

Ala

Leu

195

200

205

Arg

Pro

Gln

Gly

Leu

Trp

Gly

Phe

Tyr

Asn

Phe

Pro

Glu

Cys

Tyr

Asn

210

215

220

Tyr

Asp

Phe

Lys

Ser

Pro

Asn

Tyr

Thr

Gly

Arg

Cys

Pro

Leu

Asn

Ile

225

230

235

240

Cys

Ala

Gln

Asn

Asp

Gln

Leu

Gly

Trp

Leu

Trp

Gly

Gln

Ser

Arg

Ala

245

250

255

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Pro

Ala

Ala

Leu

Glu

Gly

Thr

Lys

Lys

260

265

270

Thr

Gln

Met

Phe

Val

Gln

His

Arg

Val

Ala

Glu

Ala

Phe

Arg

Val

Ala

275

280

285

Ala

Gly

Ala

Gly

Asp

Pro

Lys

Leu

Pro

Val

Leu

Pro

Tyr

Met

Gln

Leu

- 177 033472

290

Phe Tyr

305

Ser Leu

Val Ser

Glu Tyr

Gly Ala

370

Ala Arg

385

Ser Phe

Gly Ala

Cys Arg

Met Trp

450

Asp Met

Gly Glu

Trp Leu

340 Val Asp 355

Arg Leu

Arg Pro

Ser Ile

Leu Ser

420 Cys Tyr 435

Thr Asn

310

Ser Ala

325

Ser Thr

Thr Thr

Cys Ser

Ser Tyr

390

Lys Pro

405

Leu Glu

Arg Gly

295

His Phe

Ala Gln

Ser Thr

Leu Gly

360

Gln Val

375

Pro Lys

Thr Pro

Asp Arg

Trp Arg

440

Leu Pro

Gly Ala

Lys

345

Pro

330

Glu

Ser

Leu Cys

Ala

315

Ala

Ser

Ile

300

Glu

Gly

Cys

Leu

Ala Arg Leu

395

Gly Gly Gly

410

Leu Arg Met

425

Gly Thr Arg

Ser Gly

380

Ile

Pro

Ala

Cys

Glu Leu

Val Val

Gln Ala

350

Asn Val

365

His Gly

Leu Asn

Leu Thr

Val Glu

430

Glu Gln

445

Glu His

320

Leu Trp

335

Ile Lys

Thr Ser

Arg Cys

Ser Thr

400

Leu Gln

415

Phe Glu

Trp Gly <210> 11 <211> 553 <212> Белок <213> Bos taurus <220>

<223> PH20 <400> 11

Met

Arg

Met

Leu

Arg

Arg

His

His

Ile

Ser

Phe

Arg

Ser

Phe

Ala

Gly

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Thr

Pro

Gln

Ala

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Leu

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Ala

Leu

Asp

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Leu

Ile

Ser

Asn

Thr

Ser

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Val

Glu

Arg

Cys

Val

Asn

Arg

Arg

50

55

60

Phe

Gln

Leu

Pro

Pro

Asp

Leu

Arg

Leu

Phe

Ser

Val

Lys

Gly

Ser

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ser

Ala

Thr

Gly

Gln

Phe

Ile

Thr

Leu

Phe

Tyr

Ala

Asp

Arg

85

90

95

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Pro

His

Ile

Asp

Glu

Lys

Thr

Gly

Lys

Thr

Val

Phe

100

105

110

Gly

Gly

Ile

Pro

Gln

Leu

Gly

Asn

Leu

Lys

Ser

His

Met

Glu

Lys

Ala

115

120

125

Lys

Asn

Asp

Ile

Ala

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Asn

Asp

Ser

Val

Gly

Leu

Ala

130

135

140

Val

Ile

Asp

Trp

Glu

Asn

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

145

150

155

160

Pro

Lys

Asp

Val

Tyr

Arg

Asp

Glu

Ser

Val

Glu

Leu

Val

Leu

Gln

Lys

165

170

175

Asn

Pro

Gln

Leu

Ser

Phe

Pro

Glu

Ala

Ser

Lys

Ile

Ala

Lys

Val

Asp

180

185

190

Phe

Glu

Thr

Ala

Gly

Lys

Ser

Phe

Met

Gln

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Gly

195

200

205

Lys

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

210

215

220

Cys

Tyr

Asn

His

Asn

His

Asn

Gln

Pro

Thr

Tyr

Asn

Gly

Asn

Cys

Pro

225

230

235

240

Asp

Val

Glu

Lys

Arg

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Glu

Trp

Leu

Trp

Lys

Glu

- 178 033472

245

250

255

Ser

Thr

Ala

Leu

Phe

Pro

Ser

Val

Tyr

Leu

Asn

Ile

Arg

Leu

Lys

Ser

260

265

270

Thr

Gln

Asn

Ala

Ala

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Gln

Glu

Ala

Ile

275

280

285

Arg

Leu

Ser

Lys

Ile

Ala

Ser

Val

Glu

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Val

290

295

300

Tyr

Ala

Arg

Pro

Val

Phe

Thr

Asp

Gly

Ser

Ser

Thr

Tyr

Leu

Ser

Gln

305

310

315

320

Gly

Asp

Leu

Val

Asn

Ser

Val

Gly

Glu

Ile

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Ser

325

330

335

Gly

Ile

Ile

Met

Trp

Gly

Ser

Leu

Asn

Leu

Ser

Leu

Ser

Met

Gln

Ser

340

345

350

Cys

Met

Asn

Leu

Gly

Thr

Tyr

Leu

Asn

Thr

Thr

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

355

360

365

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

His

370

375

380

Asn

Glu

Gly

Val

Cys

Thr

Arg

Lys

His

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

385

390

395

400

His

Leu

Asn

Pro

Met

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Thr

Gly

Glu

Gly

Gly

Lys

405

410

415

Tyr

Thr

Val

Pro

Gly

Thr

Val

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Gln

Lys

Phe

Ser

420

425

430

Asp

Thr

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ala

Asn

Ile

His

Cys

Lys

Lys

Arg

435

440

445

Val

Asp

Ile

Lys

Asn

Val

His

Ser

Val

Asn

Val

Cys

Met

Ala

Glu

Asp

450

455

460

Ile

Cys

Ile

Asp

Ser

Pro

Val

Lys

Leu

Gln

Pro

Ser

Asp

His

Ser

Ser

465

470

475

480

Ser

Gln

Glu

Ala

Ser

Thr

Thr

Thr

Phe

Ser

Ser

Ile

Ser

Pro

Ser

Thr

485

490

495

Thr

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Pro

Cys

Thr

Pro

Glu

Lys

His

Ser

Pro

Glu

500

505

510

Cys

Leu

Lys

Val

Arg

Cys

Ser

Glu

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Thr

Gln

Lys

515

520

525

Ala

Cys

Gln

Ser

Val

Lys

Leu

Lys

Asn

Ile

Ser

Tyr

Gln

Ser

Pro

Ile

530

535

540

Gln

Asn

Ile

Lys

Asn

Gln

Thr

Thr

Tyr

545

550

<210> 12 <211> 331 <212> Белок <213> Vespula vulgaris <220>

<223> гиалуронидаза A <400> 12

Ser

Glu

Arg

Pro

Lys

Arg

Val

Phe

Asn

Ile

Tyr

Trp

Asn

Val

Pro

Thr

1

5

10

15

Phe

Met

Cys

His

Gln

Tyr

Asp

Leu

Tyr

Phe

Asp

Glu

Val

Thr

Asn

Phe

20

25

30

Asn

Ile

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

Asp

Asp

Phe

Gln

Gly

Asp

Lys

Ile

Ala

35

40

45

Ile

Phe

Tyr

Asp

Pro

Gly

Glu

Phe

Pro

Ala

Leu

Leu

Ser

Leu

Lys

Asp

50

55

60

Gly

Lys

Tyr

Lys

Lys

Arg

Asn

Gly

Gly

Val

Pro

Gln

Glu

Gly

Asn

Ile

65

70

75

80

Thr

Ile

His

Leu

Gln

Lys

Phe

Ile

Glu

Asn

Leu

Asp

Lys

Ile

Tyr

Pro

85

90

95

Asn

Arg

Asn

Phe

Ser

Gly

Ile

Gly

Val

Ile

Asp

Phe

Glu

Arg

Trp

Arg

- 179 033472

Pro Ile

Ser Ile

130

Ile Glu

145

Met Glu

Trp Gly

Leu Val

Ser Trp

210 Arg Gln 225 Val Lys

Val Leu

Leu Thr

Gly Gly

290

Leu Ser

305

Pro Ile

100 Phe Arg 115

Asp Leu

Leu Glu

Glu Thr

Tyr Tyr

180

Pro Glu 195

Leu Phe

Glu Leu

Glu Ala

Ser Tyr

260

Glu Thr 275

Asp Gly

Lys Cys

Ala Ile

Gln Asn

Val Arg

Ala Ser

150

Leu Lys

165

Gly Tyr

Cys Asp

Asn Asn

Thr Pro

230

Val Arg 245

Trp Trp

Asp Val

Ile Ile

Lys Arg

310

Asn Val

325

Trp Gly

120

Asn Glu

135

Lys Arg

Leu Ala

Pro Tyr

Val Thr

200

Gln Asn

215

Asp Gln

Ile Ser

Tyr Val

Lys Lys

280

Ile Trp

295

Leu Gln

Thr Glu

105

Asn Met

His Pro

Phe Glu

Lys Lys

170 Cys Phe 185

Ala Met

Val Leu

Arg Ile

Asn Asn

250 Tyr Gln 265

Thr Phe

Gly Ser

Asp Tyr

Ala Val

330

Lys Ile

Thr Trp

140

Lys Tyr

155

Thr Arg

Asn Met

His Glu

Leu Pro

220

Gly Leu

235

Leu Lys

Asp Glu

Gln Glu

Ser Ser

300

Leu Leu

315

Asn

110 His Lys 125

Asn Lys

Ala Arg

Lys Gln

Ser Pro

190 Asn Asp 205

Ser Val

Val Gln

His Ser

Thr Asn

270

Ile Val

285

Asp Val

Thr Val

Asn Phe

Lys Met

Phe Phe

160 Ala Asp 175

Asn Asn

Lys Met

Tyr Val

Gly Arg

240 Pro Lys 255

Thr Phe

Ile Asn

Asn Ser

Leu Gly

320 <210> 13 <211> 340 <212> Белок <213> Vespula vulgaris <220>

<223> гиалуронидаза B <400> 13

Asp

Arg

Thr

Ile

Trp

Pro

Lys

Lys

Gly

Phe

Ser

Ile

Tyr

Trp

Asn

Ile

1

5

10

15

Pro

Thr

His

Phe

Cys

His

Asn

Phe

Gly

Val

Tyr

Phe

Lys

Glu

Leu

Lys

20

25

30

Gln

Phe

Asn

Ile

Lys

Tyr

Asn

Ser

Met

Asn

Asn

Phe

Arg

Gly

Glu

Thr

35

40

45

Ile

Ser

Leu

Phe

Tyr

Asp

Pro

Gly

Asn

Phe

Pro

Ser

Met

Val

Leu

Leu

50

55

60

Lys

Asn

Gly

Thr

Tyr

Glu

Ile

Arg

Asn

Glu

Gly

Val

Pro

Gln

Lys

Gly

65

70

75

80

Asn

Leu

Thr

Ile

His

Leu

Glu

Gln

Phe

Thr

Lys

Glu

Leu

Asp

Glu

Ile

85

90

95

Tyr

Pro

Lys

Lys

Ile

Ala

Gly

Gly

Ile

Gly

Val

Ile

His

Phe

His

Asn

100

105

110

Trp

Arg

Pro

Ile

Phe

Arg

Arg

Asn

Val

Asp

Asn

Leu

Lys

Ile

Asn

Lys

115

120

125

Asp

Ile

Ser

Ile

Asp

Leu

Val

Arg

Lys

Glu

His

Pro

Lys

Trp

Asp

Lys

130

135

140

Ser

Met

Ile

Glu

Lys

Glu

Ala

Ser

Asn

Arg

Phe

Glu

Thr

Ser

Ala

Lys

145

150

155

160

Ile

Phe

Met

Glu

Lys

Thr

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys

Glu

Ile

Arg

Lys

Lys

165

170

175

Thr

Glu

Trp

Gly

Tyr

His

Gly

Tyr

Pro

His

Cys

Leu

Ser

Gly

Ser

Thr

- 180 033472

Asp Lys

Lys Met

210

Tyr Leu 225

Glu Arg

Pro Lys

Ile Phe

Thr Asn

290 Thr Asp 305 Leu Gly

Pro Leu

180

Pro Ser

195

Ser Trp

Lys Asn

Leu Lys

Val Leu

260

Leu Thr 275

Gly Ala

Arg Lys

Pro Ile

Asn Phe

340

Phe Asp

Leu Phe

Val Leu

230

Glu Ala

245

Pro Tyr

Glu Ala

Asp Gly

Arg Cys

310

Ala Phe

325

Cys Asp

200

Asn Asn

215

Lys Pro

Ile Arg

Trp Trp

Asp Val

280

Ile Ile

295

Glu Lys

Lys Val

185

Ala Leu

Gln Asn

Asp Glu

Ile Ser

250 Tyr Thr 265

Lys Asn

Ile Trp

Leu Lys

Thr Lys

330

Ser Met

Val Leu

220

Lys Ile

235

Lys Asn

Tyr Gln

Thr Phe

Gly Val

300

Glu Tyr

315

Ala Val

190

Ser Glu

205

Leu Pro

His Leu

Phe Lys

Asp Lys

270

Lys Glu

285

Ser Tyr

Leu Met

Lys Glu

Asn Asp

Ser Ile

Val Gln

240

His Leu

255

Glu Ser

Ile Leu

Glu Leu

Lys Ile

320

Asn Thr

335 <210> 14 <211> 382 <212> Белок <213> Apis mellifera <220>

<223> гиалуронидаза <400> 14

Met 1

Ser

Arg

Pro

Leu 5

Val

Ile

Thr

Glu

Gly 10

Met

Met

Ile

Gly Val 15

Leu

Leu

Met

Leu

Ala

Pro

Ile

Asn

Ala

Leu

Leu

Leu

Gly

Phe

Val

Gln

Ser

20

25

30

Thr

Pro

Asp

Asn

Asn

Lys

Thr

Val

Arg

Glu

Phe

Asn

Val

Tyr

Trp

Asn

35

40

45

Val

Pro

Thr

Phe

Met

Cys

His

Lys

Tyr

Gly

Leu

Arg

Phe

Glu

Glu

Val

50

55

60

Ser

Glu

Lys

Tyr

Gly

Ile

Leu

Gln

Asn

Trp

Met

Asp

Lys

Phe

Arg

Gly

65

70

75

80

Glu

Glu

Ile

Ala

Ile

Leu

Tyr

Asp

Pro

Gly

Met

Phe

Pro

Ala

Leu

Leu

85

90

95

Lys

Asp

Pro

Asn

Gly

Asn

Val

Val

Ala

Arg

Asn

Gly

Gly

Val

Pro

Gln

100

105

110

Leu

Gly

Asn

Leu

Thr

Lys

His

Leu

Gln

Val

Phe

Arg

Asp

His

Leu

Ile

115

120

125

Asn

Gln

Ile

Pro

Asp

Lys

Ser

Phe

Pro

Gly

Val

Gly

Val

Ile

Asp

Phe

130

135

140

Glu

Ser

Trp

Arg

Pro

Ile

Phe

Arg

Gln

Asn

Trp

Ala

Ser

Leu

Gln

Pro

145

150

155

160

Tyr

Lys

Lys

Leu

Ser

Val

Glu

Val

Val

Arg

Arg

Glu

His

Pro

Phe

Trp

165

170

175

Asp

Asp

Gln

Arg

Val

Glu

Gln

Glu

Ala

Lys

Arg

Arg

Phe

Glu

Lys

Tyr

180

185

190

Gly

Gln

Leu

Phe

Met

Glu

Glu

Thr

Leu

Lys

Ala

Ala

Lys

Arg

Met

Arg

195

200

205

Pro

Ala

Ala

Asn

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Ala

Tyr

Pro

Tyr

Cys

Tyr

Asn

Leu

210

215

220

Thr

Pro

Asn

Gln

Pro

Ser

Ala

Gln

Cys

Glu

Ala

Thr

Thr

Met

Gln

Glu

225

230

235

240

Asn

Asp

Lys

Met

Ser

Trp

Leu

Phe

Glu

Ser

Glu

Asp

Val

Leu

Leu

Pro

- 181 033472

245

250

255

Ser

Val

Tyr

Leu

Arg

Trp

Asn

Leu

Thr

Ser

Gly

Glu

Arg

Val

Gly

Leu

260

265

270

Val

Gly

Gly

Arg

Val

Lys

Glu

Ala

Leu

Arg

Ile

Ala

Arg

Gln

Met

Thr

275

280

285

Thr

Ser

Arg

Lys

Lys

Val

Leu

Pro

Tyr

Tyr

Trp

Tyr

Lys

Tyr

Gln

Asp

290

295

300

Arg

Arg

Asp

Thr

Asp

Leu

Ser

Arg

Ala

Asp

Leu

Glu

Ala

Thr

Leu

Arg

305

310

315

320

Lys

Ile

Thr

Asp

Leu

Gly

Ala

Asp

Gly

Phe

Ile

Ile

Trp

Gly

Ser

Ser

325

330

335

Asp

Asp

Ile

Asn

Thr

Lys

Ala

Lys

Cys

Leu

Gln

Phe

Arg

Glu

Tyr

Leu

340

345

350

Asn

Asn

Glu

Leu

Gly

Pro

Ala

Val

Lys

Arg

Ile

Ala

Leu

Asn

Asn

Asn

355

360

365

Ala

Asn

Asp

Arg

Leu

Thr

Val

Asp

Val

Ser

Val

Asp

Gln

Val

370

375

380

<210> 15 <211> 331 <212> Белок <213> Dolichovespula maculata <220>

<223> гиалуронидаза <400> 15

Ser

Glu

Arg

Pro

Lys

Arg

Val

Phe

Asn

Ile

Tyr

Trp

Asn

Val

Pro

Thr

1

5

10

15

Phe

Met

Cys

His

Gln

Tyr

Gly

Leu

Tyr

Phe

Asp

Glu

Val

Thr

Asn

Phe

20

25

30

Asn

Ile

Lys

His

Asn

Ser

Lys

Asp

Asp

Phe

Gln

Gly

Asp

Lys

Ile

Ser

35

40

45

Ile

Phe

Tyr

Asp

Pro

Gly

Glu

Phe

Pro

Ala

Leu

Leu

Pro

Leu

Lys

Glu

50

55

60

Gly

Asn

Tyr

Lys

Ile

Arg

Asn

Gly

Gly

Val

Pro

Gln

Glu

Gly

Asn

Ile

65

70

75

80

Thr

Ile

His

Leu

Gln

Arg

Phe

Ile

Glu

Asn

Leu

Asp

Lys

Thr

Tyr

Pro

85

90

95

Asn

Arg

Asn

Phe

Asn

Gly

Ile

Gly

Val

Ile

Asp

Phe

Glu

Arg

Trp

Arg

100

105

110

Pro

Ile

Phe

Arg

Gln

Asn

Trp

Gly

Asn

Met

Met

Ile

His

Lys

Lys

Phe

115

120

125

Ser

Ile

Asp

Leu

Val

Arg

Asn

Glu

His

Pro

Phe

Trp

Asp

Lys

Lys

Met

130

135

140

Ile

Glu

Leu

Glu

Ala

Ser

Lys

Arg

Phe

Glu

Lys

Tyr

Ala

Arg

Leu

Phe

145

150

155

160

Met

Glu

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys

Lys

Thr

Arg

Lys

Gln

Ala

Asp

165

170

175

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Gly

Tyr

Pro

Tyr

Cys

Phe

Asn

Met

Ser

Pro

Asn

Asn

180

185

190

Leu

Val

Pro

Asp

Cys

Asp

Ala

Thr

Ala

Met

Leu

Glu

Asn

Asp

Lys

Met

195

200

205

Ser

Trp

Leu

Phe

Asn

Asn

Gln

Asn

Val

Leu

Leu

Pro

Ser

Val

Tyr

Ile

210

215

220

Arg

His

Glu

Leu

Thr

Pro

Asp

Gln

Arg

Val

Gly

Leu

Val

Gln

Gly

Arg

225

230

235

240

Val

Lys

Glu

Ala

Val

Arg

Ile

Ser

Asn

Asn

Leu

Lys

His

Ser

Pro

Lys

245

250

255

Val

Leu

Ser

Tyr

Trp

Trp

Tyr

Val

Tyr

Gln

Asp

Asp

Thr

Asn

Thr

Phe

260

265

270

Leu

Thr

Glu

Thr

Asp

Val

Lys

Lys

Thr

Phe

Gln

Glu

Ile

Ala

Ile

Asn

- 182 033472

275

280

285

Gly

Gly

Asp

Gly

Ile

Ile

Ile

Trp

Gly

Ser

Ser

Ser

Asp

Val

290

295

300

Leu

Ser

Lys

Cys

Lys

Arg

Leu

Arg

Glu

Tyr

Leu

Leu

Thr

Val

305

310

315

Pro

Ile

Thr

Val

Asn

Val

Thr

Glu

Thr

Val

Asn

325

330

Asn Ser

Leu Gly

320 <210> 16 <211> 367 <212> Белок <213> Polistes annularis <220>

<223> гиалуронидаза <400> 16

Tyr

Val

Ser

Leu

Ser

Pro

Asp

Ser

Val

Phe

Asn

Ile

Ile

Thr

Asp

Asp

1

5

10

15

Ile

Ser

His

Gln

Ile

Leu

Ser

Arg

Ser

Asn

Cys

Glu

Arg

Ser

Lys

Arg

20

25

30

Pro

Lys

Arg

Val

Phe

Ser

Ile

Tyr

Trp

Asn

Val

Pro

Thr

Phe

Met

Cys

35

40

45

His

Gln

Tyr

Gly

Met

Asn

Phe

Asp

Glu

Val

Thr

Asp

Phe

Asn

Ile

Lys

50

55

60

His

Asn

Ser

Lys

Asp

Asn

Phe

Arg

Gly

Glu

Thr

Ile

Ser

Ile

Tyr

Tyr

65

70

75

80

Asp

Pro

Gly

Lys

Phe

Pro

Ala

Leu

Met

Pro

Leu

Lys

Asn

Gly

Asn

Tyr

85

90

95

Glu

Glu

Arg

Asn

Gly

Gly

Val

Pro

Gln

Arg

Gly

Asn

Ile

Thr

Ile

His

100

105

110

Leu

Gln

Gln

Phe

Asn

Glu

Asp

Leu

Asp

Lys

Met

Thr

Pro

Asp

Lys

Asn

115

120

125

Phe

Gly

Gly

Ile

Gly

Val

Ile

Asp

Phe

Glu

Arg

Trp

Lys

Pro

Ile

Phe

130

135

140

Arg

Gln

Asn

Trp

Gly

Asn

Thr

Glu

Ile

His

Lys

Lys

Tyr

Ser

Ile

Glu

145

150

155

160

Leu

Val

Arg

Lys

Glu

His

Pro

Lys

Trp

Ser

Glu

Ser

Met

Ile

Glu

Ala

165

170

175

Glu

Ala

Thr

Lys

Lys

Phe

Glu

Lys

Tyr

Ala

Arg

Tyr

Phe

Met

Glu

Glu

180

185

190

Thr

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys

Lys

Thr

Arg

Lys

Arg

Ala

Lys

Trp

Gly

Tyr

195

200

205

Tyr

Gly

Phe

Pro

Tyr

Cys

Tyr

Asn

Val

Thr

Pro

Asn

Asn

Pro

Gly

Pro

210

215

220

Asp

Cys

Asp

Ala

Lys

Ala

Thr

Ile

Glu

Asn

Asp

Arg

Leu

Ser

Trp

Met

225

230

235

240

Tyr

Asn

Asn

Gln

Glu

Ile

Leu

Phe

Pro

Ser

Val

Tyr

Val

Arg

His

Glu

245

250

255

Gln

Lys

Pro

Glu

Glu

Arg

Val

Tyr

Leu

Val

Gln

Gly

Arg

Ile

Lys

Glu

260

265

270

Ala

Val

Arg

Ile

Ser

Asn

Asn

Leu

Glu

His

Ser

Pro

Ser

Val

Leu

Ala

275

280

285

Tyr

Trp

Trp

Tyr

Val

Tyr

Gln

Asp

Lys

Met

Asp

Ile

Tyr

Leu

Ser

Glu

290

295

300

Thr

Asp

Val

Glu

Lys

Thr

Phe

Gln

Glu

Ile

Val

Thr

Asn

Gly

Gly

Asp

305

310

315

320

Gly

Ile

Ile

Ile

Trp

Gly

Ser

Ser

Ser

Asp

Val

Asn

Ser

Leu

Ser

Lys

325

330

335

Cys

Lys

Arg

Leu

Arg

Glu

Tyr

Leu

Leu

Asn

Thr

Leu

Gly

Pro

Phe

Ala

340

345

350

Val

Asn

Val

Thr

Glu

Thr

Val

Asn

Gly

Arg

Ser

Ser

Leu

Asn

Phe

- 183 033472

355

360

365 <210> 17 <211> 462 <212> Белок <213> Mus musculus <220>

<223> гиалуронидаза <400> 17

Met

Leu

Gly

Leu

Thr

Gln

His

Ala

Gln

Lys

Val

Trp

Arg

Met

Lys

Pro

1

5

10

15

Phe

Ser

Pro

Glu

Val

Ser

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Ala

Thr

Ala

Gly

His

20

25

30

Leu

Leu

Arg

Ile

Ser

Thr

Leu

Phe

Leu

Thr

Leu

Leu

Glu

Leu

Ala

Gln

35

40

45

Val

Cys

Arg

Gly

Ser

Val

Val

Ser

Asn

Arg

Pro

Phe

Ile

Thr

Val

Trp

50

55

60

Asn

Gly

Asp

Thr

His

Trp

Cys

Leu

Thr

Glu

Tyr

Gly

Val

Asp

Val

Asp

65

70

75

80

Val

Ser

Val

Phe

Asp

Val

Val

Ala

Asn

Lys

Glu

Gln

Ser

Phe

Gln

Gly

85

90

95

Ser

Asn

Met

Thr

Ile

Phe

Tyr

Arg

Glu

Glu

Leu

Gly

Thr

Tyr

Pro

Tyr

100

105

110

Tyr

Thr

Pro

Thr

Gly

Glu

Pro

Val

Phe

Gly

Gly

Leu

Pro

Gln

Asn

Ala

115

120

125

Ser

Leu

Val

Thr

His

Leu

Ala

His

Thr

Phe

Gln

Asp

Ile

Lys

Ala

Ala

130

135

140

Met

Pro

Glu

Pro

Asp

Phe

Ser

Gly

Leu

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

Glu

Ala

145

150

155

160

Trp

Arg

Pro

Arg

Trp

Ala

Phe

Asn

Trp

Asp

Ser

Lys

Asp

Ile

Tyr

Arg

165

170

175

Gln

Arg

Ser

Met

Glu

Leu

Val

Gln

Ala

Glu

His

Pro

Asp

Trp

Pro

Glu

180

185

190

Thr

Leu

Val

Glu

Ala

Ala

Ala

Lys

Asn

Gln

Phe

Gln

Glu

Ala

Ala

Glu

195

200

205

Ala

Trp

Met

Ala

Gly

Thr

Leu

Gln

Leu

Gly

Gln

Val

Leu

Arg

Pro

Arg

210

215

220

Gly

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Gly

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

Asn

Asp

Phe

225

230

235

240

Leu

Ser

Leu

Asn

Tyr

Thr

Gly

Gln

Cys

Pro

Val

Phe

Val

Arg

Asp

Gln

245

250

255

Asn

Asp

Gln

Leu

Gly

Trp

Leu

Trp

Asn

Gln

Ser

Tyr

Ala

Leu

Tyr

Pro

260

265

270

Ser

Ile

Tyr

Leu

Pro

Ala

Ala

Leu

Met

Gly

Thr

Gly

Lys

Ser

Gln

Met

275

280

285

Tyr

Val

Arg

His

Arg

Val

Gln

Glu

Ala

Leu

Arg

Val

Ala

Ile

Val

Ser

290

295

300

Arg

Asp

Pro

His

Val

Pro

Val

Met

Pro

Tyr

Val

Gln

Ile

Phe

Tyr

Glu

305

310

315

320

Met

Thr

Asp

Tyr

Leu

Leu

Pro

Leu

Glu

Glu

Leu

Glu

His

Ser

Leu

Gly

325

330

335

Glu

Ser

Ala

Ala

Gln

Gly

Val

Ala

Gly

Ala

Val

Leu

Trp

Leu

Ser

Ser

340

345

350

Asp

Lys

Thr

Ser

Thr

Lys

Glu

Ser

Cys

Gln

Ala

Ile

Lys

Ala

Tyr

Met

355

360

365

Asp

Ser

Thr

Leu

Gly

Pro

Phe

Ile

Val

Asn

Val

Thr

Ser

Ala

Ala

Leu

370

375

380

Leu

Cys

Ser

Glu

Ala

Leu

Cys

Ser

Gly

His

Gly

Arg

Cys

Val

Arg

His

385

390

395

400

Pro

Ser

Tyr

Pro

Glu

Ala

Leu

Leu

Thr

Leu

Asn

Pro

Ala

Ser

Phe

Ser

- 184 033472

				405
Ile	Glu	Leu	Thr	His	Asp	Gly	Arg	Pro
			420					425
Ser	Leu	Lys	Asp	Arg	Ala	Gln	Met	Ala
		435					440
Tyr	Arg	Gly	Trp	Arg	Gly	Lys	Trp	Cys
	450					455

410

Pro

Met

Asp

415

Ser	Leu	Lys	Gly 430	Thr
Lys	Phe	Arg 445	Cys	Arg
Lys	Arg 460	Gly	Met

Leu

Cys <210> 18 <211> 473 <212> Белок <213> Mus musculus <220>

<223> гиалуронидаза 2 <400> 18

Met 1

Arg

Ala

Gly

Leu 5

Gly

Pro

Ile

Ile

Thr 10

Leu

Ala

Leu

Val

Leu 15

Glu

Val

Ala

Trp

Ala

Gly

Glu

Leu

Lys

Pro

Thr

Ala

Pro

Pro

Ile

Phe

Thr

20

25

30

Gly

Arg

Pro

Phe

Val

Val

Ala

Trp

Asn

Val

Pro

Thr

Gln

Glu

Cys

Ala

35

40

45

Pro

Arg

His

Lys

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Arg

Ala

Phe

Asp

Val

Lys

Ala

50

55

60

Thr

Pro

Asn

Glu

Gly

Phe

Phe

Asn

Gln

Asn

Ile

Thr

Thr

Phe

Tyr

Tyr

65

70

75

80

Asp

Arg

Leu

Gly

Leu

Tyr

Pro

Arg

Phe

Asp

Ala

Ala

Gly

Thr

Ser

Val

85

90

95

His

Gly

Gly

Val

Pro

Gln

Asn

Gly

Ser

Leu

Cys

Ala

His

Leu

Pro

Met

100

105

110

Leu

Lys

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Tyr

Ile

Gln

Thr

Gln

Glu

Pro

Gly

Gly

115

120

125

Leu

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Val

Trp

Val

Arg

Asn

130

135

140

Trp

Gln

Glu

Lys

Asp

Val

Tyr

Arg

Gln

Ser

Ser

Arg

Gln

Leu

Val

Ala

145

150

155

160

Ser

Arg

His

Pro

Asp

Trp

Pro

Ser

Asp

Arg

Val

Met

Lys

Gln

Ala

Gln

165

170

175

Tyr

Glu

Phe

Glu

Phe

Ala

Ala

Arg

Gln

Phe

Met

Leu

Asn

Thr

Leu

Arg

180

185

190

Tyr

Val

Lys

Ala

Val

Arg

Pro

Gln

His

Leu

Trp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Phe

195

200

205

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

Asp

Tyr

Val

Gln

Asn

Trp

Glu

Ser

Tyr

Thr

210

215

220

Gly

Arg

Cys

Pro

Asp

Val

Glu

Val

Ala

Arg

Asn

Asp

Gln

Leu

Ala

Trp

225

230

235

240

Leu

Trp

Ala

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

Phe

Pro

Ser

Val

Tyr

Leu

Asp

Glu

245

250

255

Thr

Leu

Ala

Ser

Ser

Val

His

Ser

Arg

Asn

Phe

Val

Ser

Phe

Arg

Val

260

265

270

Arg

Glu

Ala

Leu

Arg

Val

Ala

His

Thr

His

His

Ala

Asn

His

Ala

Leu

275

280

285

Pro

Val

Tyr

Val

Phe

Thr

Arg

Pro

Thr

Tyr

Thr

Arg

Gly

Leu

Thr

Gly

290

295

300

Leu

Ser

Gln

Val

Asp

Leu

Ile

Ser

Thr

Ile

Gly

Glu

Ser

Ala

Ala

Leu

305

310

315

320

Gly

Ser

Ala

Gly

Val

Ile

Phe

Trp

Gly

Asp

Ser

Glu

Asp

Ala

Ser

Ser

325

330

335

Met

Glu

Thr

Cys

Gln

Tyr

Leu

Lys

Asn

Tyr

Leu

Thr

Gln

Leu

Leu

Val

340

345

350

Pro

Tyr

Ile

Val

Asn

Val

Ser

Trp

Ala

Thr

Gln

Tyr

Cys

Ser

Trp

Thr

- 185 033472

Gln Cys

370

Thr Phe

385

Thr Pro

Asp Leu

Trp Gly

Ala Ser

450

Val Ala

465

355

His Gly

Leu His

Ser Glu

Asn Tyr

420 Gly Glu 435

Arg Ala

Val Ala

His Gly

Leu Asn

390

Pro Gln

405

Leu Gln

Gln Cys

Trp Ala

Leu Thr

470

360 Arg Cys 375

Ala Ser

Leu Arg

Lys His

Gln Arg

440

Gly Ser

455

Trp Thr

Val Arg

Ser Phe

Pro Glu

410 Phe Arg 425

Asn Tyr

His Leu

Leu

Arg Asn

380

Arg Leu

395

Gly Gln

Cys Gln

Lys Gly

Thr Ser

460

365

Pro Ser

Val Pro

Leu Ser

Cys Tyr

430

Ala Ala

445

Leu Leu

Ala Asn

Gly His

400

Glu Ala

415

Leu Gly

Gly Asn

Gly Leu <210> 19 <211> 412 <212> Белок <213> Mus musculus <220>

<223> гиалуринидаза 3 <400> 19

Met 1

Ile

Met

His

Leu 5

Gly

Leu Met

Met

Val 10

Val

Gly

Leu

Thr

Leu 15

Cys

Leu

Met

His

Gly

Gln

Ala

Leu

Leu

Gln

Val

Pro

Glu

His

Pro

Phe

Ser

20

25

30

Val

Val

Trp

Asn

Val

Pro

Ser

Ala

Arg

Cys

Lys

Ala

His

Phe

Gly

Val

35

40

45

His

Leu

Pro

Leu

Asp

Ala

Leu

Gly

Ile

Val

Ala

Asn

His

Gly

Gln

His

50

55

60

Phe

His

Gly

Gln

Asn

Ile

Ser

Ile

Phe

Tyr

Lys

Asn

Gln

Phe

Gly

Leu

65

70

75

80

Tyr

Pro

Tyr

Phe

Gly

Pro

Arg

Gly

Thr

Ala

His

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

85

90

95

Gln

Ala

Val

Ser

Leu

Asp

His

His

Leu

Ala

Arg

Ala

Ala

His

Gln

Ile

100

105

110

Leu

His

Ser

Leu

Gly

Ser

Ser

Phe

Ala

Gly

Leu

Ala

Val

Leu

Asp

Trp

115

120

125

Glu

Glu

Trp

Tyr

Pro

Leu

Trp

Ala

Gly

Asn

Trp

Gly

Pro

His

Arg

Gln

130

135

140

Val

Tyr

Leu

Ala

Ala

Ser

Trp

Val

Trp

Thr

Gln

Gln

Met

Phe

Pro

Gly

145

150

155

160

Leu

Asp

Pro

Gln

Glu

Gln

Leu

His

Lys

Ala

His

Thr

Ser

Phe

Glu

Gln

165

170

175

Ala

Ala

Arg

Ala

Leu

Met

Glu

Tyr

Thr

Leu

Gln

Leu

Gly

Arg

Thr

Leu

180

185

190

Arg

Pro

Ser

Gly

Leu

Trp

Gly

Phe

Tyr

Arg

Tyr

Pro

Ala

Cys

Gly

Asn

195

200

205

Gly

Trp

His

Lys

Met

Ala

Ser

Asn

Tyr

Thr

Gly

His

Cys

His

Ala

Ala

210

215

220

Ile

Thr

Thr

Gln

Asn

Thr

Gln

Leu

Arg

Trp

Leu

Trp

Ala

Ala

Ser

Ser

225

230

235

240

Ala

Leu

Phe

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Pro

Pro

Arg

Leu

Pro

Leu

Ala

Tyr

245

250

255

Arg

Gln

Ala

Phe

Val

Arg

His

Arg

Leu

Glu

Glu

Ala

Phe

Arg

Val

Ala

260

265

270

Leu

Leu

Glu

His

Ser

His

Pro

Leu

Pro

Val

Leu

Ala

Tyr

Ser

Arg

Leu

275

280

285

- 186 033472

Thr His

290

Thr Ile

305

Gly Asp

Asp Tyr

Ala Asp

Ala Arg

370

Asp Asp

385

Gly Trp

Arg Ser

Gly Val

Leu Ser

Leu Val

340

Met Ala

355

Lys Asp

Ser Leu

Ala Gly

Ser Gly

Ser Ala

310

Phe Ser

325

Gly Thr

Cys Ser

Pro Gly

Gly Ala

390

Pro Thr

405

Arg Phe

295

Ala Leu

Ser Ser

Leu Gly

His Gln

360

Gln Met

375

Trp Asn

Cys Leu

Leu Ser

Gly Thr

Glu Glu

330 Pro Tyr 345

Arg Cys

Glu Ala

Ser Phe

Glu Pro

410

Leu Asp

300 Ala Gly 315

Lys Cys

Val Ile

His Gly

Phe Leu

380 Arg Cys 395

Lys Pro

Asp Leu

Val Val

Trp Arg

Asn Val

350

His Gly

365

His Leu

His Cys

Met Gln

Leu Trp

320

Leu His

335

Thr Lys

Arg Cys

Gln Pro

Tyr Ser

400 <210> 20 <211> 435 <212> Белок <213> Sus scrofa <220>

<223> гиалауронидаза <400> 20

Met 1

Ala

Ala

His

Leu 5

Leu

Pro

Ile

Cys

Thr 10

Leu

Phe

Leu

Asn

Leu 15

Leu

Ser

Val

Ala

Gln

Gly

Ser

Arg

Asp

Pro

Val

Val

Leu

Asn

Arg

Pro

Phe

20

25

30

Thr

Thr

Ile

Trp

Asn

Ala

Asn

Thr

Gln

Trp

Cys

Leu

Lys

Arg

His

Gly

35

40

45

Val

Asp

Val

Asp

Val

Ser

Val

Phe

Glu

Val

Val

Val

Asn

Pro

Gly

Gln

50

55

60

Thr

Phe

Arg

Gly

Pro

Asn

Met

Thr

Ile

Phe

Tyr

Ser

Ser

Gln

Leu

Gly

65

70

75

80

Thr

Tyr

Pro

Tyr

Tyr

Thr

Ser

Ala

Gly

Glu

Pro

Val

Phe

Gly

Gly

Leu

85

90

95

Pro

Gln

Asn

Ala

Ser

Leu

Asp

Val

His

Leu

Asn

Arg

Thr

Phe

Lys

Asp

100

105

110

Ile

Leu

Ala

Ala

Met

Pro

Glu

Ser

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Ala

Val

Ile

115

120

125

Asp

Trp

Glu

Ala

Trp

Arg

Pro

Arg

Trp

Ala

Phe

Asn

Trp

Asp

Ala

Lys

130

135

140

Asp

Ile

Tyr

Arg

Gln

Arg

Ser

Arg

Ala

Leu

Val

Gln

Lys

Gln

His

Pro

145

150

155

160

Asp

Trp

Pro

Ala

Pro

Trp

Val

Glu

Ala

Ala

Ala

Gln

Asp

Gln

Phe

Gln

165

170

175

Glu

Ala

Ala

Gln

Thr

Trp

Met

Ala

Gly

Thr

Leu

Lys

Leu

Gly

Gln

Thr

180

185

190

Leu

Arg

Pro

His

Gly

Leu

Trp

Gly

Phe

Tyr

Gly

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

195

200

205

Asn

Tyr

Asp

Phe

Gln

Ser

Ser

Asn

Tyr

Thr

Gly

Gln

Cys

Pro

Pro

Gly

210

215

220

Val

Ser

Ala

Gln

Asn

Asp

Gln

Leu

Gly

Trp

Leu

Trp

Gly

Gln

Ser

Arg

225

230

235

240

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

Gly

Thr

Asn

245

250

255

Lys

Thr

Gln

Leu

Tyr

Val

Gln

His

Arg

Val

Asn

Glu

Ala

Phe

Arg

Val

260

265

270

Ala

Ala

Ala

Ala

Gly

Asp

Pro

Asn

Leu

Pro

Val

Leu

Pro

Tyr

Ala

Gln

275

280

285

- 187 033472

Ile Phe

290

His Ser

305

Trp Val

Lys Glu

Ser Gly

Cys Val

370

Ser Ser

385

Gln Gly

Gln Cys

Gly Thr

His Asp

Leu Gly

Ser Trp

Tyr Val

340

Ala Leu

355

Arg Arg

Phe Ser

Ala Leu

Arg Cys

420

Arg

435

Met Thr

Glu Ser

310

Glu Asn

325

Asp Thr

Leu Cys

Pro Ser

Ile Lys

390

Ser Leu

405

Tyr Pro

Asn Arg

295

Ala Ala

Thr Arg

Thr Leu

Ser Gln

360

His Thr

375

Pro Thr

Lys Asp

Gly Trp

Leu Leu

Gln Gly

Thr Lys

330

Gly Pro

345

Ala Val

Glu Ala

Pro Gly

Arg Val

410 Arg Gly 425

Ser Arg

300

Ala Ala

315

Glu Ser

Phe Ile

Cys Ser

Leu Pro

380

Gly Gly

395

Gln Met

Thr Trp

Glu Glu

Gly Val

Cys Gln

Leu Asn

350 Gly His 365

Ile Leu

Pro Leu

Ala Glu

Cys Glu

430

Leu Glu

Val Leu

320

Ser Ile

335

Val Thr

Gly Arg

Asn Pro

Thr Leu

400

Glu Phe

415

Gln Gln <210> 21 <211> 419 <212> Белок <213> Sus scrofa <220>

<223> гиалуронидаза 3 <400> 21

Met 1

Thr Met

Gln

Leu Gly 5

Leu Ala

Leu

Val 10

Leu Gly

Val

Ala

Met 15

Cys

Leu

Gly

Cys

Gly

Gln

Pro

Leu

Leu

Arg

Ala

Pro

Glu

Arg

Pro

Phe

Cys

20

25

30

Val

Leu

Trp

Asn

Val

Pro

Ser

Ala

Arg

Cys

Lys

Ala

Arg

Phe

Gly

Val

35

40

45

His

Leu

Pro

Leu

Glu

Ala

Leu

Gly

Ile

Thr

Ala

Asn

His

Gly

Gln

Arg

50

55

60

Phe

His

Gly

Gln

Asn

Ile

Thr

Ile

Phe

Tyr

Lys

Ser

Gln

Leu

Gly

Leu

65

70

75

80

Tyr

Pro

Tyr

Phe

Gly

Pro

Arg

Gly

Thr

Ala

His

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

85

90

95

Gln

Ala

Val

Ser

Leu

Asp

His

His

Leu

Ala

Arg

Ala

Ala

Tyr

Gln

Ile

100

105

110

His

Arg

Ser

Leu

Arg

Pro

Gly

Phe

Thr

Gly

Leu

Ala

Val

Leu

Asp

Trp

115

120

125

Glu

Glu

Trp

Cys

Pro

Leu

Trp

Ala

Gly

Asn

Trp

Gly

Arg

Arg

Gln

Ala

130

135

140

Tyr

Gln

Ala

Ala

Ser

Cys

Ala

Trp

Ala

Gln

Arg

Val

Tyr

Pro

Asn

Leu

145

150

155

160

Asp

Pro

Gln

Glu

Gln

Leu

Cys

Lys

Ala

Arg

Ala

Gly

Phe

Glu

Glu

Ala

165

170

175

Ala

Arg

Ala

Leu

Met

Glu

Asp

Thr

Leu

Arg

Leu

Gly

Arg

Met

Leu

Arg

180

185

190

Pro

His

Gly

Leu

Trp

Gly

Phe

Tyr

His

Tyr

Pro

Ala

Cys

Gly

Asn

Gly

195

200

205

Trp

His

Gly

Thr

Ala

Ser

Asn

Tyr

Thr

Gly

His

Cys

His

Ala

Ala

Ala

210

215

220

Leu

Ala

Arg

Asn

Thr

Gln

Leu

Tyr

Trp

Leu

Trp

Ala

Ala

Ser

Ser

Ala

225

230

235

240

Leu

Phe

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Pro

Pro

Gly

Leu

Pro

Pro

Ala

Tyr

His

245

250

255

- 188 033472

Gln Ala

Val Gly

His Arg

290

Ile Gly 305

Asp Leu

Tyr Leu

Ala Met

Trp Gln

370

Gly Ser 385

Trp Ala

Glu Ala

Phe Val

260

His Pro

275

Asn Ser

Val Ser

Ser Phe

Val Gly

340 Ala Cys 355

Asp Pro

Pro Gly

Gly Pro

Thr

Arg Tyr

His Pro

Gly Arg

Ala Ala

310

Ser Ser

325

Thr Leu

Ser His

Gly Gln

Ala Trp

390

Thr Cys

405

Arg Leu

Leu Pro

280

Phe Leu

295

Leu Gly

Ser Glu

Gly Pro

Gln Arg

360

Leu Lys

375

Glu Ser

Gln Glu

Glu Glu 265

Val Leu

Ser Gln

Ala Ser

Glu Glu

330 Tyr Val 345

Cys His

Val Phe

Phe Ser

Pro Arg

410

Ala Phe

Ala Tyr

Asp Glu

300 Gly Val 315

Cys Trp

Ile Asn

Gly His

Leu His

380

Cys Arg

395

Pro Glu

Arg Val

270 Ala Arg 285

Leu Val

Val Leu

His Leu

Val Thr

350

Gly Arg

365

Leu His

Cys Tyr

Leu Gly

Ala Leu

Leu Thr

Gln Thr

Trp Gly

320

Arg Gly

335

Arg Ala

Cys Ala

Pro Gly

Trp Gly

400

Pro Glu

415 <210> 22 <211> 449 <212> Белок <213> Rattus norvegicus <220>

<223> гиалуронидаза 1 <400> 22

Met 1

Lys

Pro

Phe

Ser 5

Pro

Glu

Val

Ser

Pro 10

Asp

Pro

Cys

Pro

Ala 15

Thr

Ala

Ala

His

Leu

Leu

Arg

Thr

Tyr

Thr

Leu

Phe

Leu

Thr

Leu

Leu

Glu

20

25

30

Leu

Ala

Gln

Gly

Cys

Arg

Gly

Ser

Met

Val

Ser

Asn

Arg

Pro

Phe

Ile

35

40

45

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Asp

Thr

His

Trp

Cys

Leu

Lys

Asp

His

Gly

Val

50

55

60

Asp

Val

Asp

Val

Ser

Val

Phe

Asp

Val

Val

Ala

Asn

Lys

Glu

Gln

Asn

65

70

75

80

Phe

Gln

Gly

Pro

Asn

Met

Thr

Ile

Phe

Tyr

Arg

Glu

Glu

Leu

Gly

Thr

85

90

95

Tyr

Pro

Tyr

Tyr

Thr

Pro

Thr

Gly

Glu

Pro

Val

Phe

Gly

Gly

Leu

Pro

100

105

110

Gln

Asn

Ala

Ser

Leu

Val

Thr

His

Leu

Ala

His

Ala

Phe

Gln

Asp

Ile

115

120

125

Lys

Ala

Ala

Met

Pro

Glu

Pro

Asp

Phe

Ser

Gly

Leu

Ala

Val

Ile

Asp

130

135

140

Trp

Glu

Ala

Trp

Arg

Pro

Arg

Trp

Ala

Phe

Asn

Trp

Asp

Ser

Lys

Asp

145

150

155

160

Ile

Tyr

Gln

Gln

Arg

Ser

Met

Glu

Leu

Val

Arg

Ala

Glu

His

Pro

Asp

165

170

175

Trp

Pro

Glu

Thr

Leu

Val

Glu

Ala

Glu

Ala

Gln

Gly

Gln

Phe

Gln

Glu

180

185

190

Ala

Ala

Glu

Ala

Trp

Met

Ala

Gly

Thr

Leu

Gln

Leu

Gly

Gln

Val

Leu

195

200

205

Arg

Pro

Arg

Gly

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Gly

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

210

215

220

Tyr

Asp

Phe

Leu

Ser

Pro

Asn

Tyr

Thr

Gly

Gln

Cys

Ser

Leu

Ser

Ile

225

230

235

240

His

Asp

Gln

Asn

Asp

Gln

Leu

Gly

Trp

Leu

Trp

Asn

Gln

Ser

Tyr

Ala

- 189 033472

Leu Tyr

Ser Gln

Leu Val

290

Phe Tyr

305

Ser Leu

Ile Ser

Ala Tyr

Ala Ala

370 Val Arg 385

Ser Phe

Gly Thr

Cys Arg

Met

Pro Ser

260

Met Tyr

275

Ser Arg

Glu Lys

Gly Glu

Ser Glu

340

Met Asp

355

Leu Leu

His Pro

Ser Ile

Leu Ser

420

Cys Tyr

435

245

Ile Tyr

Val Arg

Asp Pro

Thr Asp

310

Ser Ala 325

Lys Thr

Ser Thr

Cys Ser

Ser Tyr

390

Glu Pro

405

Leu Lys

Arg Gly

Leu Pro

Tyr Arg

280

His Val

295

Tyr Leu

Ala Gln

Ser Thr

Leu Gly

360

Glu Ala

375

Pro Glu

Thr His

Asp Arg

Trp Ser

440

250

Ala Ala 265

Val Gln

Pro Ile

Leu Pro

Gly Ala

330

Lys Glu

345

Pro Phe

Leu Cys

Ala Leu

Asp Gly

410

Ala Gln

425

Gly Glu

Leu Met

Glu Ala

Met Pro

300

Leu Glu

315

Ala Gly

Ser Cys

Ile Leu

Ser Gly

380

Leu Thr

395

Arg Pro

Met Ala

Trp Cys

Gly Thr

270

Phe Arg 285

Tyr Val

Glu Leu

Ala Val

Gln Ala

350

Asn Val 365

Arg Gly

Leu Ser

Leu Ser

Met Lys

430 Lys Lys 445

255

Gly Lys

Leu Ala

Gln Ile

Glu His

320

Leu Trp

335

Ile Lys

Thr Ser

Arg Cys

Pro Ala

400

Leu Lys

415

Phe Lys

Gln Asp <210> 23 <211> 473 <212> Белок <213> Rattus norvegicus <220>

<223> гиалуронидаза 2 <400> 23

Met 1

Arg

Ala

Gly Leu 5

Gly

Pro

Ile

Ile

Thr 10

Leu

Ala

Leu

Val

Leu 15

Glu

Val

Ala

Trp

Ala

Ser

Glu

Leu

Lys

Pro

Thr

Ala

Pro

Pro

Ile

Phe

Thr

20

25

30

Gly

Arg

Pro

Phe

Val

Val

Ala

Trp

Asn

Val

Pro

Thr

Gln

Glu

Cys

Ala

35

40

45

Pro

Arg

His

Lys

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Arg

Ala

Phe

Asp

Val

Glu

Ala

50

55

60

Thr

Pro

Asn

Glu

Gly

Phe

Phe

Asn

Gln

Asn

Ile

Thr

Thr

Phe

Tyr

Tyr

65

70

75

80

Asp

Arg

Leu

Gly

Leu

Tyr

Pro

Arg

Phe

Asp

Ala

Ala

Gly

Met

Ser

Val

85

90

95

His

Gly

Gly

Val

Pro

Gln

Asn

Gly

Ser

Leu

Cys

Ala

His

Leu

Pro

Met

100

105

110

Leu

Lys

Glu

Ala

Val

Glu

Arg

Tyr

Ile

Gln

Thr

Gln

Glu

Pro

Ala

Gly

115

120

125

Leu

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Val

Trp

Val

Arg

Asn

130

135

140

Trp

Gln

Glu

Lys

Asp

Val

Tyr

Arg

Gln

Ser

Ser

Arg

Gln

Leu

Val

Ala

145

150

155

160

Ser

Arg

His

Pro

Asp

Trp

Pro

Ser

Asp

Arg

Ile

Val

Lys

Gln

Ala

Gln

165

170

175

Tyr

Glu

Phe

Glu

Phe

Ala

Ala

Arg

Gln

Phe

Met

Leu

Asn

Thr

Leu

Arg

180

185

190

Tyr

Val

Lys

Ala

Val

Arg

Pro

Gln

His

Leu

Trp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Phe

195

200

205

- 190 033472

Pro Asp

210 Gly Arg 225

Leu Trp

Thr Leu

Gln Glu

Pro Val

290

Leu Asn 305

Gly Ser

Met Glu

Pro Tyr

Gln Cys

370

Thr Phe 385

Thr Pro

Asp Leu

Trp Gly

Ala Ser

450

Val Ala

465

Cys Tyr

Cys Pro

Ala Glu

Ala Ser

260

Ala Leu

275

Tyr Val

Gln Met

Ala Gly

Asn Cys

340

Ile Val

355

His Gly

Leu His

Ser Glu

Ser Tyr

420

Gly Glu

435

Arg Ala

Met Thr

Asn His

Asp Val

230

Asn Thr

245

Ser Lys

Arg Val

Phe Thr

Asp Leu

310

Val Ile

325

Gln Asn

Asn Val

His Gly

Leu Ser

390

Pro Gln

405

Leu Gln

Gln Cys

Trp Ala

Leu Thr

470

Asp Tyr

215

Glu Val

Ala Leu

His Ser

Ala His

280

Arg Pro

295

Ile Ser

Phe Trp

Leu Lys

Ser Trp

360

Arg Cys

375

Pro Ser

Leu Arg

Met His

Gln Trp

440

Gly Ala

455

Trp Thr

Val Gln

Ala Gln

Phe Pro

250 Arg Asn 265

Thr His

Thr Tyr

Thr Ile

Gly Asp

330 Lys Tyr 345

Ala Thr

Val Arg

Ser Phe

Pro Glu

410 Phe Arg 425

Asn His

His Leu

Leu

Asn Trp

220 Asn Asp 235

Ser Val

Phe Val

His Ala

Thr Arg

300

Gly Glu

315

Ser Val

Leu Thr

Gln Tyr

Arg Asn

380

Arg Leu 395

Gly Glu

Cys His

Lys Arg

Ala Ser

460

Asp Ser

Gln Leu

Tyr Leu

Ser Phe

270

Asn His

285

Arg Leu

Ser Ala

Tyr Ala

Gln Thr

350

Cys Ser

365

Pro Ser

Val Pro

Leu Ser

Cys Tyr

430

Ala Ala

445

Leu Leu

Tyr Thr

Ala Trp

240

Asp Lys

255

Arg Val

Ala Leu

Thr Glu

Ala Leu

320

Ser Ser

335

Leu Val

Trp Thr

Ala Ser

Gly Arg

400

Glu Asp

415

Leu Gly

Gly Asp

Gly Leu <210> 24 <211> 412 <212> Белок <213> Rattus norvegicus <220>

<223> гиалуронидаза 3 <400> 24

Met 1

Ile

Thr

Gln

Leu 5

Gly

Leu

Thr

Leu Val 10

Val

Gly

Leu

Thr

Leu 15

Cys

Leu

Val

His

Val

Gln

Ala

Leu

Leu

Gln

Val

Pro

Glu

Phe

Pro

Phe

Ser

20

25

30

Val

Leu

Trp

Asn

Val

Pro

Ser

Ala

Arg

Cys

Lys

Thr

Arg

Phe

Gly

Val

35

40

45

His

Leu

Pro

Leu

Asp

Ala

Leu

Gly

Ile

Ile

Ala

Asn

His

Gly

Gln

Arg

50

55

60

Phe

His

Gly

Gln

Asn

Ile

Thr

Ile

Phe

Tyr

Lys

Asn

Gln

Phe

Gly

Leu

65

70

75

80

Tyr

Pro

Tyr

Phe

Gly

Pro

Arg

Gly

Thr

Ala

His

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

85

90

95

Gln

Ala

Val

Ser

Leu

Asp

His

His

Leu

Ala

Gln

Ala

Ala

His

Gln

Ile

100

105

110

Leu

His

Asn

Leu

Gly

Ser

Ser

Phe

Ala

Gly

Leu

Ala

Val

Leu

Asp

Trp

115

120

125

Glu

Glu

Trp

Tyr

Pro

Leu

Trp

Ala

Gly

Asn

Trp

Gly

Thr

His

Arg

Gln

130

135

140

- 191 033472

Val Tyr

145

Leu Asn

Ala Ala

Arg Pro

Gly Trp

210

Ile Ile

225

Ala Leu

His Gln

Leu Thr

Thr His

290

Thr Ile

305

Gly Asp

Asp Tyr

Ala Ala

Ser Trp

370

Asp Asp

385

Gly Trp

Gln Ala

Pro Gln

Arg Ala

180 His Gly 195

His Asn

Thr Arg

Phe Pro

Thr Phe

260 Gly His 275

Arg Ser

Gly Val

Leu Ser

Leu Val

340

Thr Ala

355

Lys Asp

Asn Leu

Ser Gly

Ala Ser

150

Glu Gln

165

Leu Met

Leu Trp

Met Ala

Asn Thr

230

Ser Ile

245

Val Arg

Ala His

Ser Gly

Ser Ala

310

Val Ser

325

Gly Thr

Cys Ser

Pro Gly

Gly Ala

390

Pro Thr

405

Trp Ala

Leu His

Glu His

Gly Phe

200

Ser Asn

215

Gln Leu

Tyr Leu

His Arg

Pro Leu

280

Arg Phe 295

Ala Leu

Ser Ser

Leu Gly

His Gln

360

Gln Met

375

Trp Lys

Cys Leu

Trp Ala

Lys Ala

170

Thr Leu

185

Tyr Arg

Tyr Thr

Arg Trp

Pro Pro

250

Leu Glu

265

Pro Val

Leu Ser

Gly Ala

Glu Glu

330

Pro Tyr

345

Arg Cys

Glu Ala

Ser Phe

Glu Pro

410

Gln Gln

155

Gln Thr

Arg Leu

Tyr Pro

Gly His

220 Leu Trp 235

Arg Leu

Glu Ala

Leu Ala

Leu Asp

300

Ala Gly

315

Glu Cys

Val Ile

His Gly

Phe Leu

380 Arg Cys 395

Lys Pro

Met Phe

Gly Phe

Gly Gln

190 Val Cys 205

Cys His

Ala Ala

Pro Pro

Phe Arg

270

Tyr Val

285

Asp Leu

Val Val

Trp Arg

Asn Val

350

His Gly

365

His Leu

Arg Cys

Pro Asp

160

Glu Gln

175

Met Leu

Gly Asn

Pro Ala

Ser Ser

240 Ala Tyr 255

Val Ala

Arg Leu

Met Gln

Leu Trp

320

Leu His 335

Thr Lys

Arg Cys

Gln Pro

Tyr Leu

400 <210> 25 <211> 545 <212> Белок <213> Oryctolagus cuniculus <220>

<223> PH20 <400> 25

Met Gly Val Leu 1

Leu Ser Gly Val

Cys Leu Thr Ala

Phe Leu Trp Ala

Gly Glu Pro Leu

Lys Asn Lys Thr

Gly Tyr Tyr Pro

100

Arg Ile Pro Gln

115

Gln Glu Ile Leu

Lys Phe Lys His

Phe Gln Ile Val

Asn Phe Arg Ala

Trp Asn Ala Pro

Asp Met Ser Leu

Gly Gln Gly Ile

Tyr Ile Asp Pro

Leu Gly Pro Leu

120

Tyr Tyr Met Pro

Ile Phe Phe Gly

Phe Ile Phe Leu

Pro Pro Val Ile

Thr Glu Phe Cys

Phe Ser Leu Phe

Thr Ile Phe Tyr

His Thr Gly Ala

105

Gln Gln His Leu

Lys Asp Asn Val

Ser Ala Val Glu

Leu Ile Pro Cys

Pro Asn Val Pro

Leu Gly Lys Ser

Gly Ser Pro Arg

Val Asp Arg Leu

Ile Val His Gly

110

Thr Lys Leu Arg

125

Gly Leu Ala Val

- 192 033472

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Leu

Pro

Thr

Trp

Leu

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Ile

Tyr

Arg

Ile

Lys

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Lys

Ser

Gln

His

165

170

175

Pro

Gln

Tyr

Asn

His

Ser

Tyr

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Arg

Asp

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Met

Glu

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Gly

Arg

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Asp

Lys

Pro

Asn

Leu

Tyr

Lys

Gly

Ser

Cys

Phe

225

230

235

240

Asp

Ile

Glu

Lys

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Lys

Glu

245

250

255

Ser

Thr

Ala

Leu

Phe

Pro

Ser

Val

Tyr

Leu

Thr

Ser

Arg

Ala

Arg

Ser

260

265

270

Ala

Thr

Ala

Leu

Ser

Lys

Leu

Tyr

Val

Val

Arg

Asn

Arg

Val

His

Glu

275

280

285

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Asp

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Asn

290

295

300

Phe

Val

Tyr

Thr

Arg

Leu

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Ile

Phe

Gln

Phe

Leu

305

310

315

320

Ser

His

His

Asp

Leu

Val

Tyr

Thr

Ile

Gly

Glu

Ile

Val

Ala

Leu

Gly

325

330

335

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Val

Trp

Gly

Ser

Gln

Ser

Leu

Ala

Arg

Ser

Met

340

345

350

Lys

Ser

Cys

Leu

His

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Lys

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

355

360

365

Tyr

Leu

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Asn

Gln

Val

Leu

370

375

380

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

Thr

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Pro

Asn

Asp

385

390

395

400

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Gly

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Gly

Ser

Asn

405

410

415

Gly

Thr

Tyr

Lys

Val

Asp

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Thr

Asp

Leu

Glu

Gln

420

425

430

Phe

Ser

Lys

Asn

Phe

Gln

Cys

Ser

Cys

Tyr

Thr

Asn

Leu

Asn

Cys

Lys

435

440

445

Glu

Arg

Thr

Asp

Met

Asn

Asn

Val

Arg

Thr

Val

Asn

Val

Cys

Ala

Val

450

455

460

Glu

Asn

Val

Cys

Ile

Asp

Thr

Asn

Val

Gly

Pro

Gln

Ala

Val

Thr

Tyr

465

470

475

480

Ala

Pro

Lys

Glu

Lys

Lys

Asp

Val

Ala

His

Ile

Leu

Ser

Asn

Thr

Thr

485

490

495

Ser

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Thr

Met

Ser

Leu

Pro

Phe

Pro

Arg

Lys

His

500

505

510

Val

Ser

Gly

Cys

Leu

Leu

Val

Leu

Cys

Met

Tyr

Ser

Gln

Tyr

Leu

Asn

515

520

525

Ile

Cys

Tyr

Arg

Leu

Val

Ala

Ile

Gly

Ile

Gln

His

Gly

Tyr

Tyr

Leu

530

535

540

Lys

545

<210>	26
<211>	476
<212>	Белок
<213>	Ovis aries
<220>
<223>	гиалуронидаза 2

- 193 033472 <400> 26

Met Trp Thr Gly

Val Ala Trp Ala

Gly Arg Pro Phe

Pro Arg His Lys

Val Gln Ala Ser

Phe Tyr Arg Asp

Arg Ser Val His

100

Leu Glu Met Leu

115

Pro Ala Gly Leu

130

Val Arg Asn Trp

145

Leu Val Ala Ser

Glu Ala Gln Tyr

180

Thr Leu Arg Phe

195

Tyr Leu Phe Pro

210

Thr Tyr Thr Gly

225

Leu Ser Trp Leu

Leu Glu Glu Thr

260

Phe Arg Val Gln

275

His Ala Leu Pro

290

Leu Thr Gly Leu

305

Ala Ala Leu Gly

Thr Thr Ser Asn

340

Ser Leu Val Pro

355

Ser Trp Ala Gln

370

Asn Ala His Thr

385

Pro Ser His Ala

Ser Trp Ala Asp

420

Tyr Leu Gly Trp

435

Ala Gly Gly Ala

450

Leu Ala Val Ala

465

Leu Gly Pro Ala

Thr Glu Leu Lys

Val Val Ala Trp

Met Pro Leu Asp

Pro Asn Glu Gly

Arg Leu Gly Met

Gly Gly Val Pro

Lys Gly His Val

120

Ala Val Ile Asp

135

Gln Asp Lys Asp

150

His His Pro Asp

165

Glu Phe Glu Phe

Val Lys Ala Phe

200

Asp Cys Tyr Asn

215

Arg Cys Pro Asp

230

Trp Ala Glu Ser

245

Leu Ala Ser Ser

Glu Ala Leu Arg

280

Val Tyr Val Phe

295

Ser Glu Met Asp

310

Ala Ala Gly Val

325

Glu Thr Cys Arg

Tyr Val Val Asn

360

Cys His Gly His

375

Phe Leu His Leu

390

Pro Asp Glu Pro

405

Arg Asn His Leu

Gly Gly Glu Gln

440

Ser Gly Ala Trp

455

Val Leu Ala Phe

470

Val Thr Leu Ala

Pro Thr Ala Pro

Asp Val Pro Thr

Pro Lys Asp Met

Phe Val Asn Gln

Tyr Pro His Phe

Gln Asn Gly Ser

105

Glu His Tyr Ile

Trp Glu Asp Trp

140

Val Tyr Arg Arg

155

Trp Pro Pro Glu

170

Ala Ala Arg Gln

185

Arg Pro Arg His

His Asp Tyr Val

220 Val Glu Val Ser

235

Thr Ala Leu Phe

250

Thr His Gly Arg

265

Val Ala Asp Val

Thr Arg Pro Thr

300

Leu Ile Ser Thr

315

Ile Leu Trp Gly

330

Arg Leu Lys Asp

345

Val Ser Trp Ala

Gly Arg Cys Val

380

Ser Ala Ser Ser

395

Arg Leu Arg Pro

410

Gln Thr His Phe

425

Cys Gln Trp Asp

Ala Gly Ser His

460

Thr Trp Thr Ser

475

Leu Val Leu Val

Pro Ile Phe Thr

Gln Asp Cys Gly

Lys Ala Phe Asp

Asn Ile Thr Ile

Asn Ser Val Gly

Leu Trp Val His

110

Arg Thr Gln Glu

125

Arg Pro Val Trp

Leu Ser Arg Gln

160

Arg Ile Val Lys

175

Phe Met Leu Glu

190

Leu Trp Gly Phe

205

Gln Asn Trp Glu

Arg Asn Asp Gln

240

Pro Ser Val Tyr

255

Asn Phe Val Ser

270

His His Ala Asn

285

Tyr Ser Arg Gly

Ile Gly Glu Ser

320

Asp Ala Gly Phe

335

Tyr Leu Thr Arg

350

Ala Gln Tyr Cys

365

Arg Arg Asp Pro

Phe Arg Leu Val

400

Glu Gly Glu Leu

415

Arg Cys Gln Cys

430

Arg Arg Arg Ala

445

Leu Thr Gly Leu

- 194 033472 <210> 27 <211> 114 <212> Белок <213> Ovis aries <220>

<223> PH20 частичная последовательность <400> 27

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Leu

Ser

Lys

Ile

1

5

10

15

Ala

Ser

Val

Glu

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Val

Tyr

His

Arg

Pro

Val

20

25

30

Phe

Thr

Asp

Gly

Ser

Ser

Thr

Tyr

Leu

Ser

Gln

Gly

Asp

Leu

Val

Asn

35

40

45

Ser

Val

Gly

Glu

Ile

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Ile

Met

Trp

50

55

60

Gly

Ser

Leu

Asn

Leu

Ser

Leu

Thr

Met

Gln

Ser

Cys

Met

Asn

Leu

Gly

65

70

75

80

Asn

Tyr

Leu

Asn

Thr

Thr

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

85

90

95

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

100

105

110

Ile

Arg

<210> 28 <211> 414 <212> Белок <213> Pongo pygmaeus <220>

<223> гиалуронидаза 3 <400> 28

Met

Thr

Thr

Arg

Leu

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Leu

Gly

Val

Ala

Leu

Cys

1

5

10

15

Leu

Gly

Cys

Gly

Gln

Pro

Leu

Pro

Gln

Val

Pro

Glu

Arg

Pro

Phe

Ser

20

25

30

Val

Leu

Trp

Asn

Val

Pro

Ser

Ala

His

Cys

Lys

Ser

Arg

Phe

Gly

Val

35

40

45

His

Leu

Pro

Leu

Asn

Ala

Leu

Gly

Ile

Ile

Ala

Asn

Arg

Gly

Gln

His

50

55

60

Phe

His

Gly

Gln

Asn

Met

Thr

Ile

Phe

Tyr

Lys

Asn

Gln

Leu

Gly

Leu

65

70

75

80

Tyr

Pro

Tyr

Phe

Gly

Pro

Lys

Gly

Thr

Ala

His

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

85

90

95

Gln

Ala

Leu

Pro

Leu

Asp

Arg

His

Leu

Ala

Leu

Ala

Ala

Tyr

Gln

Ile

100

105

110

His

His

Ser

Leu

Arg

Pro

Gly

Phe

Ala

Gly

Pro

Ala

Val

Leu

Asp

Trp

115

120

125

Glu

Glu

Trp

Cys

Pro

Leu

Trp

Ala

Gly

Asn

Trp

Gly

Arg

Arg

Arg

Ala

130

135

140

Tyr

Gln

Ala

Ala

Ser

Trp

Ala

Trp

Ala

Gln

Gln

Val

Phe

Pro

Asp

Leu

145

150

155

160

Asp

Pro

Gln

Glu

Gln

Leu

Tyr

Lys

Ala

Tyr

Thr

Gly

Phe

Glu

Gln

Ala

165

170

175

Ala

Arg

Ala

Leu

Met

Glu

Asp

Thr

Leu

Arg

Val

Ala

Gln

Ala

Leu

Arg

180

185

190

Pro

His

Gly

Leu

Trp

Gly

Phe

Tyr

His

Tyr

Pro

Ala

Cys

Gly

Asn

Gly

195

200

205

Trp

His

Ser

Met

Ala

Ser

Asn

Tyr

Thr

Gly

Arg

Cys

His

Ala

Ala

Thr

210

215

220

- 195 033472

Leu Ala 225

Leu Phe

Gln Ala

Val Gly

Ser Gly

290

Ser Ala 305

Leu Ser

Asp Thr

Cys Ser

Pro Gly

370

Gly Asp

385

Pro Thr

Arg Asn

Pro Ser

Phe Val

260

His Leu

275

Arg Phe

Ala Leu

Ser Ser

Leu Gly

340

His Gln

355

Gln Met

Trp Lys

Cys Gln

Thr Gln

230 Ile Tyr 245 Arg His

Pro Val

Leu Ser

Gly Ala

310

Glu Glu 325

Pro Tyr

Arg Cys

Glu Ala

Ser Phe

390

Glu Pro

405

Leu His

Leu Pro

Arg Leu

Leu Ala

280

Gln Asp 295

Ala Gly

Glu Cys

Gly Ile

His Gly

360

Phe Leu 375

Ser Cys

Arg Leu

Trp Leu

Pro Arg

250

Glu Glu

265

Tyr Val

Asp Leu

Val Val

Trp His

330 Asn Val 345 His Gly

His Leu

His Cys

Gly Pro

410

Trp Ala

235

Leu Pro

Ala Phe

Arg Leu

Val Gln

300

Leu Trp

315

Leu His

Thr Arg

Arg Cys

Trp Pro

380

Tyr Trp

395

Lys Glu

Ala Ser

Pro Ala

Arg Val

270

Thr His

285

Thr Ile

Gly Asp

Asp Tyr

Ala Ala

350 Ala Arg 365 Asp Gly

Gly Trp

Ala Val

Ser Ala

240

His His

255

Ala Leu

Arg Arg

Gly Val

Leu Ser

320

Leu Val

335

Met Ala

Arg Asp

Ser Leu

Ala Gly

400 <210> 29 <211> 510 <212> Белок <213> Macaca fascicularis <220>

<223> PH20 <400> 29

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Ile

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asn

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Thr

Leu

Met

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Val

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Leu

Thr

Thr

Gly

Val

Thr

Val

His

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Val

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ser

Lys

115

120

125

Gln

Asp

Ile

Leu

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Pro

Gln

Ala

Thr

Asp

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Met

Leu

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Arg

195

200

205

Ser

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

- 196 033472

Tyr Asn His

225

Val Glu Ile

Thr Ala Leu

Val Ala Thr

275

Ser Lys Ile

290

Arg Leu Val

305

Leu Val Ser

Val Ile Trp

Leu Leu Asp

355

Val Thr Leu

370

Gly Val Cys

385

Asn Pro Asp

Val His Gly

Phe Tyr Cys

435

Val Lys Asp

450

Ile Asp Ala

465

Ile Phe Tyr

Val Asn Ile

His

Tyr

Arg 230

Lys

Pro

Gly

Tyr Asn 235

Gly

Ser

Cys

Phe

Asp 240

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Val

Val

260

265

270

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

280

285

Pro

Asp

Ala

Lys

Asn

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Val

Tyr

Ala

295

300

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Arg

Glu

Glu

310

315

320

Thr

Leu

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Gly

Ser

Leu

Ser

Ile

Thr

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Thr

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

360

365

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

375

380

Ile

Arg

Lys

Asp

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

390

395

400

Asn

Phe

Asp

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Lys

Pro

Thr

Val

Glu

Asp

Leu

Glu

Glu

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Ser

Cys

Tyr

Thr

Asn

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

440

445

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

455

460

Ser

Leu

Lys

Pro

Pro

Val

Glu

Thr

Glu

Gly

Ser

Pro

Pro

470

475

480

Asn

Thr

Ser

Ser

Ser

Thr

Val

Ser

Thr

Thr

Met

Phe

Ile

485

490

495

Leu

Phe

Leu

Ile

Ile

Ser

Ser

Val

Ala

Ser

Leu

500

505

510

<210> 30 <211> 529 <212> Белок <213> Cavia <220>

<223> PH20 <400> 30

Met Gly Ala

Cys Ser Gly

Cys Leu Ala

Leu Trp Val

Gln Pro Leu

Asn Ile Thr

Tyr Tyr Pro

Leu Pro Gln

115 porcellus

Phe

Thr 5

Phe

Lys

His

Ser

Phe 10

Phe

Gly

Ser

Phe

Val 15

Glu

Val

Leu

Gln

Thr

Val

Phe

Ile

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Asp

Lys

Arg

Ala

Pro

Pro

Leu

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

Leu

40

45

Trp

Asn

Ala

Pro

Thr

Glu

Phe

Cys

Ile

Gly

Gly

Thr

Asn

55

60

Asp

Met

Ser

Phe

Phe

Ser

Ile

Val

Gly

Thr

Pro

Arg

Lys

70

75

80

Gly

Gln

Ser

Ile

Thr

Leu

Tyr

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

85

90

95

Tyr

Ile

Asp

Pro

His

Thr

Gly

Ala

Ile

Val

His

Gly

Gly

100

105

110

Leu

Met

Asn

Leu

Gln

Gln

His

Leu

Arg

Lys

Ser

Arg

Gln

120

125

- 197 033472

Asp Ile

130

Asp Trp

145

Asp Ile

Gln Tyr

Arg Thr

Leu Arg

210

Asn Thr

225

Glu Leu

Ala Leu

Asn Gly

Ser Lys

290

Arg Leu

305

Leu Val

Ile Ile

Gly Leu

Val Thr

370

Gly Ile

385

Asn Ala

Val His

Phe His

Val His

450

Ile Asp

465

Pro Ile

Thr Ser

Trp Cys

Leu

Leu Phe

Glu Glu

Tyr Arg

Asn His

180 Gly Lys 195

Pro Ser

His Phe

Gln Arg

Tyr Pro

260

Ala Leu

275

Leu Met

Val Phe

His Ser

Trp Gly

340

Glu Asn

355

Leu Ala

Cys Thr

Thr Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asn Val

Ala Val

Thr Asp

Ser Ala

500

Leu Phe

515

Tyr Met

Trp Arg

150 Asn Lys 165

Ser Tyr

Ala Phe

Ser Leu

Thr Lys

230

Asn Asn

245

Ser Val

Tyr Val

Asp Asp

Thr Asp

310

Val Gly

325

Ser Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Asp

405

Pro Ser

Cys Tyr

Arg Ser

Leu Asn

470 Asp Thr 485

Pro Pro

Leu Leu

Pro Thr

135

Pro Thr

Ser Ile

Ala Val

Met Leu

200

Trp Gly

215

Pro Asn

Asp Leu

Tyr Leu

Arg Asn

280 Lys Asn 295

Gln Thr

Glu Ile

Ser Leu

Lys Gly

360 Met Cys 375

Asp Trp

Ile Glu

Leu Glu

Thr Asn

440

Val Asn

455

Phe Pro

Ser Gln

Ser Ser

Ser Ile

520

Asp Ser

Trp Thr

Glu Leu

170

Ala Val

185

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asp

Gln Trp

250

Thr Ser 265

Arg Val

Pro Leu

Thr Thr

Val Pro

330

Thr Arg

345

Thr Leu

Gly Gln

Asn Thr

Leu Gln

410

Asp Leu

425

Val Ala

Val Cys

Ser Leu

Asn Gln

490

His Ile

505

Phe Ser

Val Gly

140 Arg Asn 155

Val Lys

Ala Lys

Leu Lys

Leu Phe

220 Gly His 235

Leu Trp

Arg Val

His Glu

Pro Ile

300

Phe Leu

315

Leu Gly

Ser Leu

Leu Pro

Val Leu

380

Asn Thr 395

Gln Asn

Gln Glu

Cys Lys

Thr Ala

460 Asp Asp 475

Asp Ser

Leu Pro

Gln His

Leu Ala

Trp Arg

Ser Gln

Arg Asp

190

Leu Gly

205

Pro Asp

Cys Pro

Asn Asp

Arg Ser

270

Ser Ile 285

Tyr Val

Glu Leu

Val Ser

Val Ser

350 Tyr Leu 365

Cys Lys

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Asp Arg 445

Asn Asn

Asp Asp

Ile Ser

Lys Asp

510 Trp Lys 525

Val Ile

Pro Lys

160

His Pro

175

Phe Glu

Lys Ser

Cys Tyr

Pro Ile

240

Ser Thr

255

Ser Gln

Arg Val

Tyr Ile

Asp Asp

320 Gly Ile 335

Cys Ile

Ile Asn

Asn Gln

His Leu

400

Phe Val

415

Lys Asn

Leu Asp

Ile Cys

Glu Pro

480 Asp Ile 495

Leu Ser

Tyr Leu <210> 31 <211> 512 <212> Белок <213> Rattus norvegicus <220>

<223> PH20 <400> 31

Met Gly Glu Leu Gln Phe Lys Trp Leu

Phe Trp Arg Ser Phe Ala Glu

- 198 033472

Ser Gly

Ser Leu

Phe Val

Thr Glu

Lys Thr

Gly Asn

Ile Pro

Asp Val

130

Asp Trp 145

Asp Ile

Ala Ile

Gly Ala

Ile Arg

210

Asn Asn 225

Glu Lys

Gly Leu

Lys Ala

Ser Lys

290

Arg Leu 305

Leu Val

Ile Ile

Ile Leu

Val Thr

370

Gly Met 385

Asp Pro

Val Leu

Phe Lys

Met Arg

450

Ile Lys

465

Lys Gly

Pro His

Gly Thr

Thr Val

Trp Val

Pro Ile

Ala Ile

Tyr Pro

100 Gln Lys 115 Glu Arg

Glu Glu

Tyr Arg

Asn Ile

180

Ala Lys

195

Pro Lys

Lys Phe

Lys Arg

Tyr Pro

260

Thr Leu 275

Val Ser

Val Phe

Asn Thr

Trp Asp

340

Arg Gln

355

Leu Ala

Cys Ser

Ser Ser

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Ser Ile

Ala Thr

Leu Leu

Asp Ile

500

Phe Gln

Asp Tyr

Trp Asn

Asp Leu

Gly Gln

His Ile

Gly Asp

Tyr Ile

Trp Arg

150 Asn Lys 165

Thr Glu

Glu Phe

His Leu

Gln Val

230 Asn Asp 245

Ser Val

Tyr Val

Asp Glu

Thr Asp

310 Ile Gly 325

Ala Met

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ser 405

Pro Glu

Cys Phe

Gln Asp

Leu Gly

470

Leu Met

485

Phe Val

Thr Val

Arg Ala

Val Pro

Ser Phe

Pro Val

Asp Ala

Leu Thr

120

Pro Thr

135

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

Met Glu

200

Trp Gly

215

Asp Asn

Asp Leu

Tyr Leu

Arg Tyr

280

Ser Asn

295

His Val

Glu Ile

Ser Leu

Lys Thr

360 Met Cys 375

Thr Glu

Ile Asn

Val Lys

Ser Lys

440

Val Asn

455

Pro Asn

Thr Thr

Phe Pro

Leu Ile 25

Thr Pro

Thr Glu

Phe Ser

Thr Leu

Gln Gln

105

Thr His

Asp Lys

Trp Met

Glu Leu

170

Val Arg 185

Gly Thr

Phe Tyr

Tyr Asp

Asp Trp

250

Lys Lys 265

Arg Val

Pro Val

Ser Glu

Val Ala

330

Ala Gln

345

Thr Leu

Ser Gln

Ser Ser

Val Thr

410 Asp Leu 425

Met Thr

Val Cys

Ser Ala

Leu Ala

490 Trp Lys 505

Phe Leu

Val Leu

Ala Cys

Leu Ile 75

Phe Tyr

Thr Glu

Leu Val

Leu Gly

140 Arg Asn 155

Val Gln

Ala Lys

Leu Lys

Leu Phe

220

Gly Gln

235

Leu Trp

Asp Leu

Leu Glu

Pro Ile

300

Tyr Leu 315

Gln Gly

Arg Ser

Asn Pro

Thr Leu

380

Asp Ala 395

Glu Ala

Glu Tyr

Cys Glu

Met Gly

460

Phe His

475

His Ile

Met Leu

Phe Ile

Ser Asp

Val Glu

Gly Ser

Val Asp

His His

110 Lys Ala 125

Leu Ala

Trp Thr

Ala Ala

Ala Gln

190 Leu Gly 205

Pro Asp

Cys Pro

Lys Glu

Lys Ser

270

Ser Ile 285

Phe Val

Leu Glu

Thr Ser

Ala Gly

350 Tyr Ile 365

Cys Lys

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430

Glu Thr 445

Asp Asn

Leu Leu

Leu His

Val Ser

510

Pro Tyr

Thr Thr

Asn Val

Pro Arg

Arg Leu

Gly Gly

Lys Glu

Ile Ile

Pro Lys

160 Asp Pro 175

Phe Glu

Lys His

Cys Tyr

Asp Val

240

Ser Thr 255

Ser Arg

Arg Val

Tyr Ile

Asp Asp

320 Gly Ile 335

Cys Pro

Val Asn

Glu Lys

His Leu

400

Tyr Glu

415

Glu His

Ser Asp

Val Cys

Pro Gly

480

His Leu

495

Thr Pro

- 199 033472 <210> 32 <211> 512 <212> Белок <213> Mus musculus <220>

<223> PH20 <400> 32

Met Gly 1

Ser Gly

Ser Leu

Phe Leu

Asn Asp 65 Lys Thr

Gly Leu

Ile Pro

Asp Ile

130 Asp Trp 145

Asp Asn

Gly Leu

Glu Ala

Leu Arg

210

Asn Asn 225

Glu Lys

Gly Leu

Gln Ala

Ser Lys

290

Arg Leu 305

Leu Val

Ile Ile

Ile Leu

Val Thr

370 Gly Met 385

Asn Pro

Glu Leu

Gly Thr

Thr Val 35

Trp Ile

Pro Ile

Ala Thr

Tyr Pro

100 Gln Arg 115

Glu His

Glu Glu

Tyr Arg

Ser Ile

180 Gly Arg 195

Pro Asn

Lys Phe

Lys Arg

Tyr Pro

260

Thr Leu 275

Val Gly

Val Phe

Asn Thr

Trp Asp

340

His Lys

355

Leu Ala

Cys Ser

Ser His

Arg Phe

Phe Gln

Asp Tyr

Trp Asn

Asp Leu

Gly Gln

His Ile

Gly Asp

Tyr Ile

Trp Arg

150 Asn Lys 165

Thr Glu

Lys Phe

Gln Leu

Gln Asp

230 Asn Asp 245

Ser Val

Tyr Val

Asn Ala

Thr Asp

310

Ile Gly

325

Ala Met

Tyr Met

Ala Lys

Arg Arg

390 Phe Asp

Lys His

Thr Val

Arg Ala

Val Pro

Ser Phe

Pro Val

Asp Ala

Tyr Gln

120 Pro Asp 135

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

Met Glu

200

Trp Gly

215

Pro Lys

Asn Leu

Tyr Leu

Arg Tyr

280 Ser Asp 295 Arg Thr

Glu Ile

Ser Leu

Gln Thr

360 Met Cys 375

Lys Glu

Ile Met

Leu Phe

Leu Ile 25

Ala Pro

Thr Glu

Phe Ser

Thr Leu

Asn Gln

105

Ala His

Asp Lys

Trp Leu

Glu Leu

170 Gln Lys 185 Gly Thr

Tyr Tyr

Tyr Asp

Lys Trp

250

Lys Lys

265

Arg Val

Pro Val

Ser Glu

Val Ala

330

Ala Gln

345

Thr Leu

Ser Gln

Ser Ser

Leu Thr

Trp Gly

Phe Leu

Ile Leu

Arg Cys

Leu Ile 75

Phe Tyr

Ala Glu

Leu Arg

Leu Gly

140 Arg Asn 155

Val Gln

Ala Ile

Leu His

Leu Phe

220

Gly Gln

235

Leu Trp

Asp Leu

Val Glu

Pro Ile

300

Tyr Leu 315

Leu Gly

Arg Ala

Asn Pro

Thr Leu

380 Asp Val 395

Glu Thr

Ser Phe

Leu Ile

Ser Asn

Val Gly

Gly Ser

Val Asp

His Tyr

110

Lys Ala 125

Leu Ala

Trp Lys

Ser Thr

Gln Gln

190 Leu Gly 205

Pro Asp

Cys Pro

Lys Ala

Lys Ser

270

Ala Ile

285

Phe Val

Leu Glu

Thr Ser

Ala Gly

350 Tyr Ile 365

Cys Asn

Tyr Leu

Gly Lys

Val Glu

Pro Cys

Thr Thr

Asn Val

Pro Arg

Arg Leu

Gly Gly

Lys Thr

Ile Ile

Pro Lys

160

Asn Pro

175

Phe Glu

Lys Phe

Cys Tyr

Ala Val

240

Ser Thr

255

Asn Arg

Arg Val

Tyr Ile

Asp Asp

320 Gly Ile 335

Cys Pro

Val Asn

Glu Lys

His Leu

400

Tyr Glu

- 200 033472

Val Leu

Phe Lys

Val Lys

450

Ile Lys

465

Lys Ser

Pro Gln

Gly Asn

420

Cys Ser

435

Asn Val

Ala Lys

Leu Leu

Asp Ile

500

405

Pro Arg

Cys Phe

Gln Asp

Val Glu

470

Phe Met

485

Phe Val

Val Gly

Ser Arg

440

Val Asn

455

Pro Asn

Thr Thr

Phe Pro

410 Asp Leu 425

Met Thr

Val Cys

Pro Ala

Leu Gly

490 Arg Lys 505

Glu Tyr

Cys Lys

Val Gly

460

Phe Tyr

475

His Val

Thr Leu

Phe Ser

430

Glu Thr

445

Asp Asn

Leu Leu

Leu Tyr

Val Ser

510

415

Glu His

Ser Asp

Val Cys

Pro Gly

480

His Leu

495

Thr Pro <210> 33 <211> 807 <212> Белок <213> Staphylococcus aureus <220>

<223> гиалуронидаза <400> 33

Met

Thr

Tyr

Arg

Ile

Lys

Lys

Trp

Gln

Lys

Leu

Ser

Thr

Ile

Thr

Leu

1

5

10

15

Leu

Met

Ala

Gly

Val

Ile

Thr

Leu

Asn

Gly

Gly

Glu

Phe

Arg

Ser

Val

20

25

30

Asp

Lys

His

Gln

Ile

Ala

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Val

Gln

Thr

Pro

Asp

35

40

45

Tyr

Glu

Lys

Leu

Arg

Asn

Thr

Trp

Leu

Asp

Val

Asn

Tyr

Gly

Tyr

Asp

50

55

60

Lys

Tyr

Asp

Glu

Asn

Asn

Pro

Asp

Met

Lys

Lys

Lys

Phe

Asp

Ala

Thr

65

70

75

80

Glu

Lys

Glu

Ala

Thr

Asn

Leu

Leu

Lys

Glu

Met

Lys

Thr

Glu

Ser

Gly

85

90

95

Arg

Lys

Tyr

Leu

Trp

Ser

Gly

Ala

Glu

Thr

Leu

Glu

Thr

Asn

Ser

Ser

100

105

110

His

Met

Thr

Arg

Thr

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

Lys

Ile

Ala

Glu

Ala

Met

115

120

125

Arg

Asn

Pro

Lys

Thr

Thr

Leu

Asn

Thr

Asp

Glu

Asn

Lys

Lys

Lys

Val

130

135

140

Lys

Asp

Ala

Leu

Glu

Trp

Leu

His

Lys

Asn

Ala

Tyr

Gly

Lys

Glu

Pro

145

150

155

160

Asp

Lys

Lys

Val

Lys

Glu

Leu

Ser

Glu

Asn

Phe

Thr

Lys

Thr

Thr

Gly

165

170

175

Lys

Asn

Thr

Asn

Leu

Asn

Trp

Trp

Asp

Tyr

Glu

Ile

Gly

Thr

Pro

Lys

180

185

190

Ser

Leu

Thr

Asn

Thr

Leu

Ile

Leu

Leu

Asn

Asp

Gln

Phe

Ser

Asn

Glu

195

200

205

Glu

Lys

Lys

Lys

Phe

Thr

Ala

Pro

Ile

Lys

Thr

Phe

Ala

Pro

Asp

Ser

210

215

220

Asp

Lys

Ile

Leu

Ser

Ser

Val

Gly

Lys

Ala

Glu

Leu

Ala

Lys

Gly

Gly

225

230

235

240

Asn

Leu

Val

Asp

Ile

Ser

Lys

Val

Lys

Leu

Leu

Glu

Cys

Ile

Ile

Glu

245

250

255

Glu

Asp

Lys

Asp

Met

Met

Lys

Lys

Ser

Ile

Asp

Ser

Phe

Asn

Lys

Val

260

265

270

Phe

Thr

Tyr

Val

Gln

Asp

Ser

Ala

Thr

Gly

Lys

Glu

Arg

Asn

Gly

Phe

275

280

285

Tyr

Lys

Asp

Gly

Ser

Tyr

Ile

Asp

His

Gln

Asp

Val

Pro

Tyr

Thr

Gly

290

295

300

Ala

Tyr

Gly

Val

Val

Leu

Leu

Glu

Gly

Ile

Ser

Gln

Met

Met

Pro

Met

- 201 033472

305

Ile Lys Glu Thr Pro

325

Lys Ser Trp Ile Asp

340

Met Met Asp Leu Ser

355

Ser His Ser Ala Ser

370

Asp Ala Met Asp Asp

385

Ser Ser Val Glu Ser

405

Ser Tyr Ser Asp Ile

420

Ile Ser Lys Asn Gly

435

Asp Arg Val Thr Tyr

450

Ser Met Thr Ser Lys

465

Asn Leu Lys Gly Trp

485

Ser Asp Val Lys His

500

Lys Arg Leu Ser Gly

515

Thr Asp Asp Lys Lys

530

Asp Asp Gln His Ala

545

Thr Leu Thr Ala Lys

565

Phe Leu Gly Thr Gly

580

Thr Thr Ile Glu Asn

595

Asp Lys Gln Thr Thr

610

Leu Glu Ser Thr Asp

625

Lys Pro Lys Ile Thr

645

Glu Ile Asn Lys Ser

660

Glu Val Thr Gln Lys

675

Leu Tyr Pro Gly Leu

690

Val Thr Val Val Lys

705

Glu Ser Val Trp Ala

725

Asp Ile Asn Asn Thr

740

Leu Lys Lys Lys Asp

755

Glu Ser Thr Asn Ser

770

Gly Tyr Ser Ile Thr

785

Val His Phe Glu Leu

805

310

Phe Asn Asp Lys Thr

330

Asp Gly Phe Met Pro

345

Arg Gly Arg Ala Ile

360

Ala Thr Val Met Lys

375

Ser Thr Lys Ala Lys

390

Asp Ser Ser Tyr Lys

410

Asp Lys Met Lys Ser

425

Leu Thr Gln Gln Leu

440

His Asn Lys Asp Leu

455

Asn Val Ala Arg Tyr

470

His Thr Gly Ala Gly

490

Tyr His Asp Asn Phe

505

Thr Thr Thr Leu Asp

520

Ser Ser Lys Thr Phe

535

Ser Ile Gly Met Asp

550

Lys Ser Tyr Phe Ile

570 Ile Lys Ser Thr Asp

585

Arg Lys Ala Asn Gly

600

Asn Ser Asp Asn Gln

615

Thr Lys Lys Asn Ile

630

Val Lys Lys Glu Ser

650 Gln Lys Asp Thr Gln

665

His Ser Asn Ser Asp

680

Ser Lys Asp Val Phe

695

Gln Glu Asp Asp Phe

710

Gly Val Asn Tyr Ser

730 Lys Val Glu Val Lys

745

Asp Asn Thr Tyr Glu

760

Ala Ser Asp Ile Glu

775

Asn Lys Asn Thr Ser

790

Thr Lys

315

Gln Asn Asp Thr Thr

335

Leu Ile Tyr Lys Gly

350

Ser Arg Glu Asn Glu

365

Ser Leu Leu Arg Leu

380

Tyr Lys Lys Ile Val

395

Gln Asn Asp Tyr Leu

415 Leu Met Thr Asp Asn 430

Lys Ile Tyr Asn Asp

445

Asp Phe Ala Phe Gly

460

Glu Ser Ile Asn Gly

475

Met Ser Tyr Leu Tyr

495 Trp Val Thr Ala Asp 510

Asn Glu Ile Leu Lys

525

Val Gly Gly Thr Lys

540

Phe Glu Asn Gln Asp

555

Leu Asn Asp Lys Ile

575

Ser Ser Lys Asn Pro

590

Tyr Thr Leu Tyr Thr

605

Glu Asn Asn Ser Val

620

Gly Tyr His Phe Leu

635

His Thr Gly Lys Trp

655 Lys Thr Asp Glu Tyr

670

Asn Lys Tyr Gly Tyr

685

Lys Thr Lys Lys Asp

700

His Val Val Lys Asp

715

Asn Ser Thr Gln Thr

735 Ala Lys Gly Met Phe 750

Cys Ser Phe Tyr Asn

765

Ser Lys Ile Ser Met

780

Thr Ser Asn Glu Ser

795

320

Leu

Glu

Thr

Ser

Lys

400

Asn

Ser

Met

Leu

Glu

480

Asn

Met

Asp

Val

Lys

560

Val

Val

Asp

Phe

Asn

640

Lys

Tyr

Val

Glu

Asn

720

Phe

Ile

Pro

Thr

Gly

800

- 202 033472 <210> 34 <211> 371 <212> Белок <213> Streptococcus pyogenes bacteriophage H4489A <220>

<223> гиалуронидаза <400> 34

Met

Thr

Glu

Asn

Ile

Pro

Leu

Arg

Val

Gln

Phe

Lys

Arg

Met

Ser

Ala

1

5

10

15

Asp

Glu

Trp

Ala

Arg

Ser

Asp

Val

Ile

Leu

Leu

Glu

Gly

Glu

Ile

Gly

20

25

30

Phe

Glu

Thr

Asp

Thr

Gly

Phe

Ala

Lys

Phe

Gly

Asp

Gly

Gln

Asn

Thr

35

40

45

Phe

Ser

Lys

Leu

Lys

Tyr

Leu

Thr

Gly

Pro

Lys

Gly

Pro

Lys

Gly

Asp

50

55

60

Thr

Gly

Leu

Gln

Gly

Lys

Thr

Gly

Gly

Thr

Gly

Pro

Arg

Gly

Pro

Ala

65

70

75

80

Gly

Lys

Pro

Gly

Thr

Thr

Asp

Tyr

Asp

Gln

Leu

Gln

Asn

Lys

Pro

Asp

85

90

95

Leu

Gly

Ala

Phe

Ala

Gln

Lys

Glu

Glu

Thr

Asn

Ser

Lys

Ile

Thr

Lys

100

105

110

Leu

Glu

Ser

Ser

Lys

Ala

Asp

Lys

Ser

Ala

Val

Tyr

Ser

Lys

Ala

Glu

115

120

125

Ser

Lys

Ile

Glu

Leu

Asp

Lys

Lys

Leu

Ser

Leu

Thr

Gly

Gly

Ile

Val

130

135

140

Thr

Gly

Gln

Leu

Gln

Phe

Lys

Pro

Asn

Lys

Ser

Gly

Ile

Lys

Pro

Ser

145

150

155

160

Ser

Ser

Val

Gly

Gly

Ala

Ile

Asn

Ile

Asp

Met

Ser

Lys

Ser

Glu

Gly

165

170

175

Ala

Ala

Met

Val

Met

Tyr

Thr

Asn

Lys

Asp

Thr

Thr

Asp

Gly

Pro

Leu

180

185

190

Met

Ile

Leu

Arg

Ser

Asp

Lys

Asp

Thr

Phe

Asp

Gln

Ser

Ala

Gln

Phe

195

200

205

Val

Asp

Tyr

Ser

Gly

Lys

Thr

Asn

Ala

Val

Asn

Ile

Val

Met

Arg

Gln

210

215

220

Pro

Ser

Ala

Pro

Asn

Phe

Ser

Ser

Ala

Leu

Asn

Ile

Thr

Ser

Ala

Asn

225

230

235

240

Glu

Gly

Gly

Ser

Ala

Met

Gln

Ile

Arg

Gly

Val

Glu

Lys

Ala

Leu

Gly

245

250

255

Thr

Leu

Lys

Ile

Thr

His

Glu

Asn

Pro

Asn

Val

Glu

Ala

Lys

Tyr

Asp

260

265

270

Glu

Asn

Ala

Ala

Ala

Leu

Ser

Ile

Asp

Ile

Val

Lys

Lys

Gln

Lys

Gly

275

280

285

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Ala

Gln

Gly

Ile

Tyr

Ile

Asn

Ser

Thr

Ser

Gly

290

295

300

Thr

Ala

Gly

Lys

Met

Leu

Arg

Ile

Arg

Asn

Lys

Asn

Glu

Asp

Lys

Phe

305

310

315

320

Tyr

Val

Gly

Pro

Asp

Gly

Gly

Phe

His

Ser

Gly

Ala

Asn

Ser

Thr

Val

325

330

335

Ala

Gly

Asn

Leu

Thr

Val

Lys

Asp

Pro

Thr

Ser

Gly

Lys

His

Ala

Ala

340

345

350

Thr

Lys

Asp

Tyr

Val

Asp

Glu

Lys

Ile

Ala

Glu

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile

355

360

365

Leu

Lys

Lys

370

<210> 35 <211> 1628

- 203 033472 <212> Белок <213> Clostridium perfringens <220>

<223> гиалуронидаза <400> 35

Met 1

Asn

Lys

Asn

Ile 5

Arg

Lys

Ile

Ile

Thr 10

Ser

Thr

Val

Leu

Ala 15

Ala

Met

Thr

Ile

Ser

Val

Leu

Pro

Ser

Asn

Leu

Val

Val

Phe

Ala

Thr

Asp

20

25

30

Gly

Ile

Thr

Glu

Asn

Phe

Tyr

Glu

Ile

Tyr

Pro

Lys

Pro

Gln

Glu

Ile

35

40

45

Ser

Tyr

Ser

Gly

Gly

Glu

Phe

Gln

Ile

Ser

Asp

Glu

Ile

Asn

Ile

Val

50

55

60

Tyr

Asp

Asp

Gly

Ile

Asp

Thr

Tyr

Thr

Lys

Lys

Arg

Val

Asp

Glu

Val

65

70

75

80

Leu

Glu

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ala

Thr

Val

Ser

Asn

Glu

Ile

Val

Pro

85

90

95

Gly

Lys

Thr

Asn

Phe

Leu

Val

Gly

Ile

Asn

Glu

Ser

Gly

Gly

Val

Val

100

105

110

Asp

Asn

Tyr

Phe

Asn

Lys

Asn

Ile

Pro

His

Asp

Glu

Ser

Phe

Phe

Asp

115

120

125

Glu

Lys

Met

Asp

Ala

Asn

Ile

Val

Ser

Val

Lys

Asp

Gly

Val

Ile

Gly

130

135

140

Val

Ile

Gly

Glu

Asp

Thr

Asp

Ser

Ala

Phe

Tyr

Gly

Val

Thr

Thr

Leu

145

150

155

160

Lys

His

Val

Phe

Asn

Gln

Leu

Glu

Glu

Gly

Asn

Lys

Ile

Gln

Ser

Phe

165

170

175

Arg

Ala

Asp

Asp

Tyr

Ala

Glu

Val

Ala

His

Arg

Gly

Phe

Ile

Glu

Gly

180

185

190

Tyr

Tyr

Gly

Asn

Pro

Trp

Ser

Asn

Glu

Asp

Arg

Ala

Glu

Leu

Met

Lys

195

200

205

Phe

Gly

Gly

Asp

Tyr

Lys

Leu

Asn

Gln

Tyr

Val

Phe

Ala

Pro

Lys

Asp

210

215

220

Asp

Pro

Tyr

His

Asn

Ser

Lys

Trp

Arg

Asp

Leu

Tyr

Pro

Glu

Glu

Lys

225

230

235

240

Leu

Ser

Glu

Ile

Lys

Lys

Leu

Ala

Gln

Val

Gly

Asn

Glu

Thr

Lys

Asn

245

250

255

Arg

Tyr

Val

Tyr

Ala

Leu

His

Pro

Phe

Met

Asn

Asn

Pro

Val

Arg

Phe

260

265

270

Asp

Thr

Glu

Glu

Asn

Tyr

Gln

Asn

Asp

Leu

Gly

Val

Ile

Lys

Ala

Lys

275

280

285

Phe

Thr

Gln

Leu

Leu

Glu

Asn

Asp

Val

Arg

Gln

Phe

Ala

Ile

Leu

Ala

290

295

300

Asp

Asp

Ala

Ser

Ala

Pro

Ala

Gln

Gly

Ala

Ser

Met

Tyr

Val

Lys

Leu

305

310

315

320

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Arg

Trp

Leu

Glu

Glu

Gln

Gln

Ser

Thr

Tyr

Pro

325

330

335

Asp

Leu

Lys

Thr

Asp

Leu

Met

Phe

Cys

Pro

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asn

340

345

350

Gly

Ser

Ser

Ala

Gln

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Lys

Ala

Glu

Asp

Asn

Val

355

360

365

Ser

Ile

Val

Met

Thr

Gly

Gly

Arg

Ile

Trp

Gly

Glu

Val

Asp

Glu

Asn

370

375

380

Phe

Ala

Asn

Asn

Phe

Met

Asn

Asn

Ile

Ser

Thr

Glu

Gly

His

Pro

Gly

385

390

395

400

Arg

Ala

Pro

Phe

Phe

Trp

Ile

Asn

Trp

Pro

Cys

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys

405

410

415

Gln

His

Leu

Ile

Met

Gly

Gly

Asn

Asp

Thr

Phe

Leu

His

Pro

Gly

Val

420

425

430

Asp

Pro

Ser

Lys

Ile

Asp

Gly

Ile

Val

Leu

Asn

Pro

Met

Gln

Gln

Ala

435

440

445

- 204 033472

Glu Ala

450 Ile Trp 465

Lys Tyr

Leu Arg

Val Arg

Phe Lys

530

Glu Leu 545

Lys Asn

Leu Asn

Ser Ala

Tyr Ser

610

His Tyr 625

Val Pro

Ser Ile

Gln Asp

Ser Thr

690 Tyr Val 705

Phe Leu

Lys Ile

Gly Val

Leu Lys

770

Thr Trp

785

Asn Ser

Gln Val

Thr Gly

Glu Phe

850 Arg Phe 865

Lys Phe

Lys Glu

Glu Ser

Met Glu

930 Ser Asp

Asn Lys

Asp Asn

Met Asp

Glu Ile

500

Pro Leu

515

Gln Lys

Ile Ala

Asn Pro

Cys Trp

580

Ile Ala 595

Glu Ala

Val Asp

Phe Ile

Val Asp

660

Ala Pro

675

Glu Leu

Gly Val

Met Gly

Gln Tyr

740

Glu Tyr

755

Val Arg

Leu Gly

Gly Val

Tyr Glu

820

Val Trp

835

Ile Gly

Val Ile

Lys Leu

Tyr Asp

900

Phe Glu

915

Asn Ile

Glu Leu

Ser Ala

Lys Glu

470

His Gly

485

Ser Lys

Gln Glu

Tyr Asp

Glu Phe

550 Gly Asn 565

Glu Asp

Ile Glu

Gln Gly

His Thr

630

Lys Ser 645

Pro Asn

Thr Gly

Val Tyr

Lys Tyr

710

Ala Asn 725

Thr Val

Thr Met

Gly Val

Val Arg

790

Glu Phe 805

Gly Asn

Tyr Lys

Leu Asp

Gly Lys

870

Glu Tyr 885

Lys Thr

Thr Pro

Asn Lys

Glu Asn

Leu Phe

455

Glu Ala

Thr Ala

His Met

Ser Val

520

Ser Gly

535

Thr Asn

Glu Arg

Thr Met

Glu Gly

600

Ala Phe 615

Glu Tyr

Met Gly

Arg Ile

Asn Pro

680 Lys Asn 695

Ser Asn

Ser Asn

Asp Gly

Pro Gly

760 Arg Leu 775

Asp Ile

Asn Pro

Glu Ala

Thr Leu

840

Leu Gly 855

Asn Gly

Ser Leu

Gly Ala

Ile Ser

920 Trp Leu 935 Ala Gly

Ala Ile

Asp Glu

Glu Glu

490

Ile Asn

505

Glu Leu

Ala Ser

Leu Gln

Thr Arg

570 Asp Ala 585

Asp Asp

Glu Lys

Ala Glu

Gln Asn

650

Ile Ala 665

Asp Asn

Pro Asn

Pro Ile

Pro Asn

730

Arg Glu 745

Ala Ile

Ile Ala

Asn Val

Ser Leu

810

Asn Leu 825

Asn Gly

Lys Glu

Gly Gly

Asp Asn

890

Pro Ala 905

Ala Lys

Thr Phe

Asn Lys

Ala Asp

460 Asn Trp 475

Thr Asn

Gln Asn

Ala Pro

Ile Lys

540 Lys Ala 555 Asp Gln

Ala Ile

Glu Ala

Ser Lys

620

Val Gly 635

Leu Ser

Thr Tyr

Ile Phe

Arg Ile

700

Thr Leu 715

Asp Thr

Trp Ile

Lys Val

Thr Glu

780 Asn Lys 795

Ile Arg

Leu Asp

Asp Thr

Ile Lys

860

Ser Ser 875

Glu Ser

Gly Lys

Tyr Ile

Ser Glu

940

Glu Asn

Tyr Ala

Asn Asp

Ser Ser

Met Asp

510 Lys Leu 525 Glu Asp

Ala Asp

Ile Ile

Gly Tyr

590

Ala Trp

605

Thr Tyr

Val Gln

Val Val

Ile Ser

670 Asp Asn 685

Asp Val

Asn Asn

Met Gln

Asp Leu

750

Glu Asn 765

Ala Arg

Lys Glu

Ser Glu

Gly Asp

830

Ser Leu 845

Leu Asp

Asp Lys

Trp Thr

Asp Val

910 Arg Leu 925

Phe Ala

Val Tyr

Trp Asn

Ser Phe

480

Leu Ala 495

Gly Arg

Glu Ala

Ala Leu

Tyr Tyr

560

Tyr Trp 575

Leu Lys

Ala Asn

Gly Phe

His Ile

640 Ile Gly 655

Asn Arg

Asn Ala

Gly Thr

Val Glu

720

Lys Ala 735

Glu Glu

Leu Asp

Glu Asn

Asp Ser

800 Ser Trp 815

Asp Asn

Ala Gly

Gly Ile

Trp Asn

880

Thr Ile 895

Ile Glu

Thr Asn

Ile Ile

Thr Asn

- 205 033472

955960

Ala Lys Glu Asp Val Thr Lys Leu

970975

Asn His Gly Glu Tyr Ile Gly Val

985990

Ser Asn Ile Asn Leu Glu Ile Ser

1005

Ser Ser Met Asn Gly Val Glu Trp 1020

Leu Glu Asp Gly Arg Tyr Val Arg

10351040

Val Asn Phe Asn Leu Thr Lys Phe

10501055

Glu Pro Ser Leu Val Asp Ala Tyr 10651070

Ala Val Asp Gly Asp Leu Lys Thr

1085

Ser Thr Gly Asp Thr Ile Val Tyr 1100

Asp Asn Leu Lys Tyr Val Val Leu

11151120

Asp Gly Lys Ile Gln Leu Ser Leu

11301135

Ile Thr Ile Gly Asp Gly Val Glu

11451150

Thr Pro Leu Lys Asn Gly Tyr Lys

1165

Val Pro Ile Asp Ser Ala Tyr Val 1180

Ala Arg Tyr Val Arg Ile Leu Phe

11951200

Thr Val Ile Asn Glu Leu Met Ile 12101215

Val Asn Asp Pro Thr Tyr Ile Ser 12251230

Ala Pro Ser Asn Leu Arg Asp Gly

1245

Asn Thr Asn Asn Gly Glu Ile Ser 1260

Ser Glu Lys Thr Asp Val Arg Lys

12751280

Ser Ile Ser Asn Ala Lys Val Met

12901295

Asn Val Thr Asp Gln Trp Val Gln

13051310

Asn Glu Phe Ile Asn Arg Asp Tyr

1325

Glu Trp Thr Asp Val Ala Pro Asn

1340

Gln Glu Phe Glu Phe Pro Val Asn

13551360

Glu Leu Ile Asn Leu Ser Gly Asp

13701375

Thr Leu Lys Glu Ala Leu Asn Glu 13851390

Asn Ser Ser Gln Lys Lys Ile Asp

1405

Ala Glu Glu Arg Leu Asp Leu Arg 1420

Lys Val Leu Thr Leu Gly Asn Ser

1435 1440

Glu Ser Trp Ala Leu Phe Ser Glu

1450 1455

945 950

Thr Glu Leu Asp Leu Leu Ser Leu

965

Ile Pro Thr Asp Asp Ile Ser Leu 980

Lys Leu Asn Arg Ile Lys Asp Leu

9951000

Asn Asp Thr Gly Leu Lys Leu Gln

10101015

Thr Glu Ile Thr Asp Lys Asn Thr 10251030

Leu Ile Asn Thr Ser Asn Glu Ala

1045

Glu Val Asn Ser Asn Glu Val Tyr 1060

Val Gly Asp Asp Gly Ala Lys Lys

10751080

Arg Val Lys Phe Leu Gly Ala Pro

10901095

Asp Leu Gly Gln Glu Ile Leu Val 11051110

Asp Thr Glu Val Asp His Val Arg

1125

Asp Gly Glu Thr Trp Thr Asp Ala 1140

Asn Gly Val Asp Asp Met Phe Ser

11551160

His Gly Asn Gln Ser Gly Gly Ile

11701175

Glu Gly Asp Asn Leu Asn Gln Lys 11851190

Thr Ala Pro Tyr Arg His Arg Trp

1205

Asn Asn Gly Glu Tyr Ile Ser Thr 1220

Asn Pro Ile Glu Glu Arg Gly Phe

12351240

Asn Leu Thr Thr Ser Tyr Lys Pro

12501255

Glu Gly Ser Ile Thr Tyr Arg Leu 12651270

Val Thr Ile Val Gln Ser Gly Ser

1285

Ala Arg Val Gly Asp Gly Ser Glu 1300

Leu Gly Thr Leu Ser Asn Ser Leu

13151320

Asn Asn Ile Tyr Glu Ile Lys Ile

13301335

Ile Tyr Glu Ile Ile Thr Leu Asn 13451350

Asp Ser Leu Lys Ala Lys Tyr Asp

1365

Glu Tyr Thr Leu Ser Ser Phe Glu 1380

Ala Lys Ser Ile Leu Asp Asp Ser

13951400

Lys Ala Leu Glu Lys Leu Asn Lys

14101415

Ala Thr Asp Phe Glu Asp Phe Asn 14251430

Leu Val Glu Glu Glu Tyr Thr Ala

1445

- 206 033472

Val	Leu	Glu Ala Ala 1460	Asn	Glu Ala Asn Lys 1465	Asn	Lys	Ala	Asp 1470	Tyr	Thr
Gln	Asp	Gln Ile Asn	Gln	Ile Val Ile Asp	Leu	Asp	Ala	Ser	Ile	Lys
		1475		1480			1485
Ala	Leu	Val Lys Glu	Thr	Pro Glu Val Asp	Lys	Thr	Asn	Leu	Gly	Glu
	1490		1495		1500
Leu	Ile	Asn Gln Gly	Lys	Ser Leu Leu Asp	Glu	Ser	Val	Glu	Gly	Phe
1505		1510	1515			1520
Asn	Val	Gly Glu Tyr	His	Lys Gly Ala Lys	Asp	Gly	Leu	Thr	Val	Glu
		1525	1530				1535
Ile	Asn	Lys Ala Glu	Glu	Val Phe Asn Lys	Glu	Asp	Ala	Thr	Glu	Glu
		1540		1545				1550
Glu	Ile	Asn Leu Ala	Lys	Glu Ser Leu Glu	Gly	Ala	Ile	Ala	Arg	Phe
		1555		1560			1565
Asn	Ser	Leu Leu Ile	Glu	Glu Ser Thr Gly	Asp	Phe	Asn	Gly	Asn	Gly
	1570		1575		1580
Lys	Ile	Asp Ile Gly	Asp	Leu Ala Met Val	Ser	Lys	Asn	Ile	Gly	Ser
1585		1590	1595			1600
Thr	Thr	Asn Thr Ser	Leu	Asp Leu Asn Lys	Asp	Gly	Ser	Ile	Asp	Glu
		1605	1610				1615
Tyr	Glu	Ile Ser Phe	Ile	Asn His Arg Ile	Leu	Asn
		1620		1625

<210> 36 <211> 435 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> гиалуронидаза-1 [предшественник] <400> 36

Met 1

Ala

Ala

His

Leu 5

Leu

Pro

Ile

Cys

Ala 10

Leu

Phe

Leu

Thr

Leu 15

Leu

Asp

Met

Ala

Gln

Gly

Phe

Arg

Gly

Pro

Leu

Leu

Pro

Asn

Arg

Pro

Phe

20

25

30

Thr

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Asn

Thr

Gln

Trp

Cys

Leu

Glu

Arg

His

Gly

35

40

45

Val

Asp

Val

Asp

Val

Ser

Val

Phe

Asp

Val

Val

Ala

Asn

Pro

Gly

Gln

50

55

60

Thr

Phe

Arg

Gly

Pro

Asp

Met

Thr

Ile

Phe

Tyr

Ser

Ser

Gln

Leu

Gly

65

70

75

80

Thr

Tyr

Pro

Tyr

Tyr

Thr

Pro

Thr

Gly

Glu

Pro

Val

Phe

Gly

Gly

Leu

85

90

95

Pro

Gln

Asn

Ala

Ser

Leu

Ile

Ala

His

Leu

Ala

Arg

Thr

Phe

Gln

Asp

100

105

110

Ile

Leu

Ala

Ala

Ile

Pro

Ala

Pro

Asp

Phe

Ser

Gly

Leu

Ala

Val

Ile

115

120

125

Asp

Trp

Glu

Ala

Trp

Arg

Pro

Arg

Trp

Ala

Phe

Asn

Trp

Asp

Thr

Lys

130

135

140

Asp

Ile

Tyr

Arg

Gln

Arg

Ser

Arg

Ala

Leu

Val

Gln

Ala

Gln

His

Pro

145

150

155

160

Asp

Trp

Pro

Ala

Pro

Gln

Val

Glu

Ala

Val

Ala

Gln

Asp

Gln

Phe

Gln

165

170

175

Gly

Ala

Ala

Arg

Ala

Trp

Met

Ala

Gly

Thr

Leu

Gln

Leu

Gly

Arg

Ala

180

185

190

Leu

Arg

Pro

Arg

Gly

Leu

Trp

Gly

Phe

Tyr

Gly

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

195

200

205

Asn

Tyr

Asp

Phe

Leu

Ser

Pro

Asn

Tyr

Thr

Gly

Gln

Cys

Pro

Ser

Gly

210

215

220

Ile

Arg

Ala

Gln

Asn

Asp

Gln

Leu

Gly

Trp

Leu

Trp

Gly

Gln

Ser

Arg

225

230

235

240

- 207 033472

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser 245

Ile

Tyr

Met

Pro

Ala 250

Val

Leu

Glu Gly

Thr 255

Gly

Lys

Ser

Gln

Met

Tyr

Val

Gln

His

Arg

Val

Ala

Glu

Ala

Phe

Arg

Val

260

265

270

Ala

Val

Ala

Ala

Gly

Asp

Pro

Asn

Leu

Pro

Val

Leu

Pro

Tyr

Val

Gln

275

280

285

Ile

Phe

Tyr

Asp

Thr

Thr

Asn

His

Phe

Leu

Pro

Leu

Asp

Glu

Leu

Glu

290

295

300

His

Ser

Leu

Gly

Glu

Ser

Ala

Ala

Gln

Gly

Ala

Ala

Gly

Val

Val

Leu

305

310

315

320

Trp

Val

Ser

Trp

Glu

Asn

Thr

Arg

Thr

Lys

Glu

Ser

Cys

Gln

Ala

Ile

325

330

335

Lys

Glu

Tyr

Met

Asp

Thr

Thr

Leu

Gly

Pro

Phe

Ile

Leu

Asn

Val

Thr

340

345

350

Ser

Gly

Ala

Leu

Leu

Cys

Ser

Gln

Ala

Leu

Cys

Ser

Gly

His

Gly

Arg

355

360

365

Cys

Val

Arg

Arg

Thr

Ser

His

Pro

Lys

Ala

Leu

Leu

Leu

Leu

Asn

Pro

370

375

380

Ala

Ser

Phe

Ser

Ile

Gln

Leu

Thr

Pro

Gly

Gly

Gly

Pro

Leu

Ser

Leu

385

390

395

400

Arg

Gly

Ala

Leu

Ser

Leu

Glu

Asp

Gln

Ala

Gln

Met

Ala

Val

Glu

Phe

405

410

415

Lys

Cys

Arg

Cys

Tyr

Pro

Gly

Trp

Gln

Ala

Pro

Trp

Cys

Glu

Arg

Lys

420

425

430

Ser

Met

Trp

435

<210> 37 <211> 473 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> гиалуронидаза-2 [предшественник] <400> 37

Met 1

Arg

Ala

Gly

Pro 5

Gly

Pro

Thr Val

Thr 10

Leu

Ala

Leu

Val

Leu 15

Ala

Val

Ala

Trp

Ala

Met

Glu

Leu

Lys

Pro

Thr

Ala

Pro

Pro

Ile

Phe

Thr

20

25

30

Gly

Arg

Pro

Phe

Val

Val

Ala

Trp

Asp

Val

Pro

Thr

Gln

Asp

Cys

Gly

35

40

45

Pro

Arg

Leu

Lys

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Asn

Ala

Phe

Asp

Val

Gln

Ala

50

55

60

Ser

Pro

Asn

Glu

Gly

Phe

Val

Asn

Gln

Asn

Ile

Thr

Ile

Phe

Tyr

Arg

65

70

75

80

Asp

Arg

Leu

Gly

Leu

Tyr

Pro

Arg

Phe

Asp

Ser

Ala

Gly

Arg

Ser

Val

85

90

95

His

Gly

Gly

Val

Pro

Gln

Asn

Val

Ser

Leu

Trp

Ala

His

Arg

Lys

Met

100

105

110

Leu

Gln

Lys

Arg

Val

Glu

His

Tyr

Ile

Arg

Thr

Gln

Glu

Ser

Ala

Gly

115

120

125

Leu

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

Glu

Asp

Trp

Arg

Pro

Val

Trp

Val

Arg

Asn

130

135

140

Trp

Gln

Asp

Lys

Asp

Val

Tyr

Arg

Arg

Leu

Ser

Arg

Gln

Leu

Val

Ala

145

150

155

160

Ser

Arg

His

Pro

Asp

Trp

Pro

Pro

Asp

Arg

Ile

Val

Lys

Gln

Ala

Gln

165

170

175

Tyr

Glu

Phe

Glu

Phe

Ala

Ala

Gln

Gln

Phe

Met

Leu

Glu

Thr

Leu

Arg

180

185

190

Tyr

Val

Lys

Ala

Val

Arg

Pro

Arg

His

Leu

Trp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Phe

195

200

205

- 208 033472

Pro Asp Cys Tyr Asn

210

Gly Arg Cys Pro Asp

225

Leu Trp Ala Glu Ser

245

Thr Leu Ala Ser Ser

260

Gln Glu Ala Leu Arg

275

Pro Val Tyr Val Phe

290

Leu Ser Glu Met Asp

305

Gly Ala Ala Gly Val

325

Thr Glu Thr Cys Gln

340

Pro Tyr Val Val Asn

355

Gln Cys His Gly His

370

Thr Phe Leu His Leu

385

Ala Pro Gly Glu Pro

405

Asp Ile Asp His Leu

420

Trp Ser Gly Glu Gln

435

Ala Ser Glu Ala Trp

450

Ala Ala Leu Ala Phe

465

His	Asp 215	Tyr	Val	Gln	Asn	Trp 220	Glu	Ser	Tyr	Thr
Val	Glu	Val	Ala	Arg	Asn	Asp	Gln	Leu	Ala	Trp
230					235					240
Thr	Ala	Leu	Phe	Pro	Ser	Val	Tyr	Leu	Asp	Glu
				250					255
Arg	His	Gly	Arg	Asn	Phe	Val	Ser	Phe	Arg	Val
			265					270
Val	Ala	Arg	Thr	His	His	Ala	Asn	His	Ala	Leu
		280					285
Thr	Arg	Pro	Thr	Tyr	Ser	Arg	Arg	Leu	Thr	Gly
	295					300
Leu	Ile	Ser	Thr	Ile	Gly	Glu	Ser	Ala	Ala	Leu
310					315					320
Ile	Leu	Trp	Gly	Asp	Ala	Gly	Tyr	Thr	Thr	Ser
				330					335
Tyr	Leu	Lys	Asp	Tyr	Leu	Thr	Arg	Leu	Leu	Val
			345					350
Val	Ser	Trp	Ala	Thr	Gln	Tyr	Cys	Ser	Arg	Ala
		360					365
Gly	Arg	Cys	Val	Arg	Arg	Asn	Pro	Ser	Ala	Ser
	375					380
Ser	Thr	Asn	Ser	Phe	Arg	Leu	Val	Pro	Gly	His
390					395					400
Gln	Leu	Arg	Pro	Val	Gly	Glu	Leu	Ser	Trp	Ala
				410					415
Gln	Thr	His	Phe	Arg	Cys	Gln	Cys	Tyr	Leu	Gly
			425					430
Cys	Gln	Trp	Asp	His	Arg	Gln	Ala	Ala	Gly	Gly
		440					445
Ala	Gly	Ser	His	Leu	Thr	Ser	Leu	Leu	Ala	Leu
	455					460
Thr	Trp	Thr	Leu
470

<210> 38 <211> 417 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> гиалуронидаза <400> 38

Met Thr Thr Gln Leu

5

Leu Gly Cys Gly Gln

Val Leu Trp Asn Val

His Leu Pro Leu Asn

Phe His Gly Gln Asn

Tyr Pro Tyr Phe Gly 85

Gln Ala Leu Pro Leu

100

His His Ser Leu Arg

115

Glu Glu Trp Cys Pro

130 [предшественник]

Gly Pro Ala Leu Val 10

Pro Leu Pro Gln Val

Pro Ser Ala His Cys

Ala Leu Gly Ile Ile

Met Thr Ile Phe Tyr

Pro Arg Gly Thr Ala 90

Asp Arg His Leu Ala

105

Pro Gly Phe Ala Gly

120

Leu Trp Ala Gly Asn

135

Leu Gly Val Ala Leu Cys 15

Pro Glu Arg Pro Phe Ser 30

Glu Ala Arg Phe Gly Val

Ala Asn Arg Gly Gln His 60

Lys Asn Gln Leu Gly Leu

80

His Asn Gly Gly Ile Pro 95

Leu Ala Ala Tyr Gln Ile 110

Pro Ala Val Leu Asp Trp

125

Trp Gly Arg Arg Arg Ala

140

- 209 033472

Tyr

Gln

Ala

Ala

Ser

Trp

Ala

Trp

Ala

Gln

Gln

Val

Phe

Pro

Asp

145

150

155

Asp

Pro

Gln

Glu

Gln

Leu

Tyr

Lys

Ala

Tyr

Thr

Gly

Phe

Glu

Gln

165

170

175

Ala

Arg

Ala

Leu

Met

Glu

Asp

Thr

Leu

Arg

Val

Ala

Gln

Ala

Leu

180

185

190

Pro

His

Gly

Leu

Trp

Gly

Phe

Tyr

His

Tyr

Pro

Ala

Cys

Gly

Asn

195

200

205

Trp

His

Ser

Met

Ala

Ser

Asn

Tyr

Thr

Gly

Arg

Cys

His

Ala

Ala

210

215

220

Leu

Ala

Arg

Asn

Thr

Gln

Leu

His

Trp

Leu

Trp

Ala

Ala

Ser

Ser

225

230

235

Leu

Phe

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Pro

Pro

Arg

Leu

Pro

Pro

Ala

His

245

250

255

Gln

Ala

Phe

Val

Arg

His

Arg

Leu

Glu

Glu

Ala

Phe

Arg

Val

Ala

260

265

270

Val

Gly

His

Arg

His

Pro

Leu

Pro

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Arg

Leu

275

280

285

His

Arg

Arg

Ser

Gly

Arg

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Asp

Leu

Val

Gln

290

295

300

Ile

Gly

Val

Ser

Ala

Ala

Leu

Gly

Ala

Ala

Gly

Val

Val

Leu

Trp

305

310

315

Asp

Leu

Ser

Leu

Ser

Ser

Ser

Glu

Glu

Glu

Cys

Trp

His

Leu

His

325

330

335

Tyr

Leu

Val

Asp

Thr

Leu

Gly

Pro

Tyr

Val

Ile

Asn

Val

Thr

Arg

340

345

350

Ala

Met

Ala

Cys

Ser

His

Gln

Arg

Cys

His

Gly

His

Gly

Arg

Cys

355

360

365

Arg

Arg

Asp

Pro

Gly

Gln

Met

Glu

Ala

Phe

Leu

His

Leu

Trp

Pro

370

375

380

Gly

Ser

Leu

Gly

Asp

Trp

Lys

Ser

Phe

Ser

Cys

His

Cys

Tyr

Trp

385

390

395

Trp

Ala

Gly

Pro

Thr

Cys

Gln

Glu

Pro

Arg

Pro

Gly

Pro

Lys

Glu

405

410

415

Val

Leu

160

Ala

Arg

Gly

Thr

Ala

240

His

Leu

Thr

Ser

Gly

320

Asp

Ala

Ala

Asp

Gly

400

Ala <210> 39 <211> 481 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> гиалуронидаза-4 <400> 39

Met

Lys

Val

Leu

Ser

Glu

Gly

Gln

Leu

Lys

Leu

Cys

Val

Val

Gln

1

5

10

15

Val

His

Leu

Thr

Ser

Trp

Leu

Leu

Ile

Phe

Phe

Ile

Leu

Lys

Ser

20

25

30

Ser

Cys

Leu

Lys

Pro

Ala

Arg

Leu

Pro

Ile

Tyr

Gln

Arg

Lys

Pro

35

40

45

Ile

Ala

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Thr

Asp

Gln

Cys

Leu

Ile

Lys

Tyr

50

55

60

Leu

Arg

Leu

Asn

Leu

Lys

Met

Phe

Pro

Val

Ile

Gly

Ser

Pro

Leu

65

70

75

Lys

Ala

Arg

Gly

Gln

Asn

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asn

Arg

Leu

85

90

95

Tyr

Tyr

Pro

Trp

Tyr

Thr

Ser

Gln

Gly

Val

Pro

Ile

Asn

Gly

Gly

100

105

110

Pro

Gln

Asn

Ile

Ser

Leu

Gln

Val

His

Leu

Glu

Lys

Ala

Asp

Gln

115

120

125

Ile

Asn

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Ala

Glu

Asp

Phe

Ser

Gly

Leu

Ala

Val

Pro

Ile

Phe

Asn

Ala

Gly

Leu

Asp

Ile

- 210 033472

130

Asp Trp

145

Asp Val

Asn Val

Glu Ser

Ser Arg

210

Asn Tyr

225

Glu Val

Ala Leu

Asn Ile

Ser Thr

290

Arg Leu

305

Leu Val

Val Ile

Lys Val

Val Thr

370

Gly Arg

385

Asn Pro

Val Lys

Phe Ser

Ile Lys

450

Leu Met

465

Leu

Glu Tyr

Tyr Arg

Ser Ala

180 Ala Lys 195

Pro Lys

Asn Val

Leu Arg

Tyr Pro

260

Leu Arg 275

Met Thr

Gly Tyr

Ser Thr

Trp Gly

340

Lys Gln

355

Arg Ala

Cys Ile

Ala Ser

Gly Lys

420

Cys His

435

Thr Ala

Thr Leu

Trp Arg

150 Gln Lys 165

Thr Asp

Ala Phe

Gly Leu

Tyr Ala

230

Asn Asn

245

Ser Ile

Phe Ser

Ser His

Arg Asp

310

Ile Gly

325

Asp Met

Phe Val

Ala Glu

Arg Lys

390

Tyr His

405

Ala Ser

Cys Tyr

Asp Gly

Cys Leu

470

135

Pro Gln

Ser Arg

Ile Glu

Met Lys

200

Trp Gly

215

Pro Asn

Glu Leu

Gly Val

Lys Phe

280 Asp Tyr 295

Glu Pro

Glu Ser

Asn Leu

Ser Ser

360 Val Cys 375

Met Trp

Ile Glu

Asp Thr

Gln Gly

440

Cys Ser

455

Leu Leu

Trp Ala

Lys Leu

170

Tyr Leu

185

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Ser

Ser Trp

250

Trp Lys

265

Arg Val

Ala Leu

Leu Phe

Ala Ala

330

Thr Ala

345

Asp Leu

Ser Leu

Asn Ala

Ala Ser

410

Asp Leu

425

Tyr Glu

Gly Val

Leu Ala

140 Arg Asn 155

Ile Ser

Ala Lys

Ile Lys

Leu Tyr

220

Gly Ser 235

Leu Trp

Ser Leu

His Glu

Pro Val

300

Phe Leu 315

Leu Gly

Ser Lys

Gly Ser

His Leu

380

Pro Ser 395

Glu Asp

Ala Val

Gly Ala

Ser Pro

460 Ser Tyr 475

Trp Asn

Asp Met

Val Thr

190 Leu Gly 205

Pro Asp

Cys Pro

Asn Ser

Gly Asp

270

Ser Met

285

Phe Val

Ser Lys

Ala Ala

Ala Asn

350 Tyr Ile 365

Cys Arg

Tyr Leu

Gly Glu

Met Ala

430 Asp Cys 445

Ser Pro

Arg Ser

Ser Lys

160 Gly Lys 175

Phe Glu

Ile Lys

Cys His

Glu Asp

240

Ser Ala 255

Ser Glu

Arg Ile

Tyr Thr

Gln Asp

320 Gly Ile 335 Cys Thr

Ala Asn

Asn Asn

His Leu

400

Phe Thr 415

Asp Thr

Arg Glu

Gly Ser

Ile Gln

480 <210> 40 <211> 467 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> sHuPH20 предшественник 1-467 <400> 40

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

- 211 033472

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

465

<210> 41 <211> 477 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> sHuPH20 предшественник 1-477 <400> 41

- 212 033472

Met Gly

Ser Ser

Cys Leu

Phe Leu

Asp Glu

Ile Asn

Gly Tyr

Gly Ile

Lys Asp

130

Ile Asp

145

Lys Asp

Val Gln

Glu Lys

Leu Leu

210 Tyr Asn 225

Val Glu

Thr Ala

Ala Ala

Ser Lys

290

Arg Ile 305

Leu Val

Val Ile

Leu Leu

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val Arg

Phe Tyr

Val Lys

450

Ile Asp

465

Val Leu

Gly Val

Thr Leu

Trp Ala

Pro Leu

Ala Thr

Tyr Pro

100

Pro Gln

115

Ile Thr

Trp Glu

Val Tyr

Leu Ser

180

Ala Gly

195

Arg Pro

His His

Ile Lys

Leu Tyr

260

Thr Leu

275

Ile Pro

Val Phe

Tyr Thr

Trp Gly

340

Asp Asn

355

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Ala Phe

Lys Phe

Ser Gln

Asn Phe

Trp Asn

Asp Met

Gly Gln

Tyr Ile

Lys Ile

Phe Tyr

Glu Trp

150 Lys Asn 165

Leu Thr

Lys Asp

Asn His

Tyr Lys

230 Arg Asn 245

Pro Ser

Tyr Val

Asp Ala

Thr Asp

310

Phe Gly

325

Thr Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ala

405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Leu Lys

470

Lys His

Ile Val

Arg Ala

Ala Pro

Ser Leu

Gly Val

Asp Ser

Ser Leu

120

Met Pro

135

Arg Pro

Arg Ser

Glu Ala

Phe Leu

200 Leu Trp 215

Lys Pro

Asp Asp

Ile Tyr

Arg Asn

280 Lys Ser 295

Gln Val

Glu Thr

Ser Ile

Glu Thr

360 Met Cys 375

Asn Trp

Ile Gln

Leu Glu

Ser Thr

440

Val Asp

455

Pro Pro

Ile Phe

Phe Thr

Pro Pro

Ser Glu

Phe Ser

Thr Ile

Ile Thr

105

Gln Asp

Val Asp

Thr Trp

Ile Glu

170

Thr Glu

185

Val Glu

Gly Tyr

Gly Tyr

Leu Ser

250

Leu Asn

265

Arg Val

Pro Leu

Leu Lys

Val Ala

330

Met Arg

345

Ile Leu

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

Met Glu

Phe Arg

Phe Leu

Val Ile

Phe Cys

Phe Ile

Phe Tyr

Gly Val

His Leu

Asn Leu

140 Ala Arg 155

Leu Val

Lys Ala

Thr Ile

Tyr Leu

220 Asn Gly 235

Trp Leu

Thr Gln

Arg Glu

Pro Val

300

Phe Leu 315

Leu Gly

Ser Met

Asn Pro

Val Leu

380

Ser Asp 395

Lys Gly

Glu Gln

Cys Lys

Ile Ala

460

Thr Glu

475

Ser Phe

Leu Ile

Pro Asn

Leu Gly

Gly Ser

Val Asp

Thr Val

110 Asp Lys 125

Gly Met

Asn Trp

Gln Gln

Lys Gln

190

Lys Leu 205

Phe Pro

Ser Cys

Trp Asn

Gln Ser

270

Ala Ile

285

Phe Ala

Ser Gln

Ala Ser

Lys Ser

350 Tyr Ile 365 Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Glu Lys 445 Asp Gly

Glu

Val Lys

Pro Cys

Val Pro

Lys Phe

Pro Arg

Arg Leu

Asn Gly

Ala Lys

Ala Val

Lys Pro

160

Gln Asn

175

Glu Phe

Gly Lys

Asp Cys

Phe Asn

240

Glu Ser

255

Pro Val

Arg Val

Tyr Thr

Asp Glu

320

Gly Ile

335

Cys Leu

Ile Asn

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr

415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys <210> 42

- 213 033472 <211> 478 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> sHuPH20 предшественник 1-478 <400> 42

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

- 214 033472

Phe

Tyr

Cys 435

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr 440

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu 445

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

465

470

475

<210> 43 <211> 479 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> sHuPH20 предшественник 1-479 <400> 43

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

- 215 033472

Val

Thr 370

Leu Ala

Ala

Lys

Met 375

Cys

Ser

Gln

Val

Leu 380

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

465

470

475

<210> 44 <211> 480 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> sHuPH20 предшественник 1-480 <400> 44

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

- 216 033472

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

<210> 45 <211> 481 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> sHuPH20 предшественник 1-481 <400> 45

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

- 217 033472

Val

Glu

Ile

Lys

Arg 245

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser 250

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu 255

Ser

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

<210> 46 <211> 483 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> sHuPH20 предшественник 1-483 <400> 46

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

- 218 033472

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

<210> 47 <211> 432 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> sHuPH20 Зрелый 36-467 <400> 47

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro Asn 10

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

- 219 033472

Thr Phe

Glu Glu

Tyr Lys

130

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290 Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Tyr Met

100

Trp Arg

115

Asn Arg

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Pro Val

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Asp Asn

Trp Ala

120

Glu Leu 135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360 Glu Lys 375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Leu Gly

105

Arg Asn

Val Gln

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe 185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410 Ala Asp 425

Met Ala

Trp Lys

Gln Gln

140

Gln Glu

155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro

235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu 395

Lys Ala

Gly Val

Val Ile

110 Pro Lys 125

Asn Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Asp Trp

Asp Val

Gln Leu

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415

Asp Ala <210> 48 <211> 448 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> sHuPH20 Зрелый 36-483 <400> 48

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro Val

Ile

Pro Asn 10

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

- 220 033472

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu 85

Gln

Asp

His

Leu

Asp 90

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp 95

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

Tyr

Asn

435

440

445

<210> 49 <211> 1446 <212> ДНК <213> Homo sapiens <220>

<223> ДНК, кодирующая растворимый rHuPH20 предшественник <400> 49 atgggagtgc taaaattcaa tcccagatag ttttcacctt cctcctgtta ttccaaatgt cttggaaaat ttgatgagcc ataaacgcca ccgggcaagg tacatagatt caatcacagg gcacatcttt ttcagaagct ccttctgatt ccatgttgct gcctttcctc tgggcctgga actagatatg agcctcttct tgttacaata ttttatgttg agtaactgtg aatggaggaa ttgttaaatc aagtggagta 60 tgactctgaa tttcagagca 120 atgccccaag tgaattttgt 180 ctttcatagg aagcccccga 240 atagacttgg ctactatcct 300 tcccccagaa gatttcctta 360

- 221 033472 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gtagagacta taaaattggg aaaattactt tttccggatt gttacaacca tcactataag gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa tttgcatata cccgcatagt ttttactgat cttgtgtata catttggcga aactgttgct accctcagta taatgcgaag tatgaaatct atactgaatc cttacataat caacgtcaca tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aacccagata attttgctat tcaacttgag ccgacacttg aagacctgga gcaattttct ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa ttctac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780 cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt 1140 aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 1446 <210> 50 <211> 509 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> PH20 вариант P48A <400> 50

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Ala

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

- 222 033472

Ala Ala

Thr 275

Leu

Tyr Val

Arg

Asn Arg 280

Val

Arg

Glu Ala 285

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

Val

485

490

495

Ser

Ile

Leu

Phe

Leu

Ile

Ile

Ser

Ser

Val

Ala

Ser

Leu

500

505

<210> 51 <211> 509 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> предшественник PH20 вариант L499W <400> 51

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

- 223 033472

Val

Gln

Leu

Ser 180

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr 185

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln 190

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

Val

485

490

495

Ser

Ile

Trp

Phe

Leu

Ile

Ile

Ser

Ser

Val

Ala

Ser

Leu

500

505

<210> 52 <211> 6630 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HZ24 вектор <400> 52 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt600

- 224 033472 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt actgggcttg tcgagacaga gaagactctt tgacatccac tttgcctttc tctccacagg aggctagagt acttaatacg actcactata catctttttc agaagctttg ttaaatcaag tctgattcca tgttgcttga ctctgaattt tttcctctgg gcctggaatg ccccaagtga agatatgagc ctcttctctt tcataggaag tacaatattt tatgttgata gacttggcta aactgtgaat ggaggaatcc cccagaagat gaaagacatt acattttata tgccagtaga agaatggaga cccacttggg caagaaactg tattgaattg gttcagcaac aaaatgtaca aaaacaagaa tttgaaaagg cagggaagga attacttcgg ccaaatcact tgtggggtta ctataagaaa cccggttaca atggaagttg tctcagctgg ttgtggaatg aaagcactgc gcagtctcct gtagctgcta cactctatgt ttccaaaata cctgatgcaa aaagtccact tactgatcaa gttttgaaat tcctttctca tgttgctctg ggtgcttctg gaattgtaat gaaatcttgc ttgctcctag acaattacat cgtcacacta gcagccaaaa tgtgtagcca aaggaaaaac tggaattcaa gtgactatct acttgagaaa ggtggaaagt tcacagtacg attttctgaa aaattttatt gcagctgtta tgtaaaagac actgatgctg ttgatgtgtg tctaaaacct cccatggaga cagaagaacc cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga ctgccatcat ggttcgacca ttgaactgca gcaagaacgg agacctaccc tggcctccgc tgaccacaac ctcttcagtg gaaggtaaac ggttctccat tcctgagaag aatcgacctt gagaactcaa agaaccacca cgaggagctc taagacttat tgaacaaccg gaattggcaa gcagttctgt ttaccaggaa gccatgaatc ggatcatgca ggaatttgaa agtgacacgt aacttctccc agaataccca ggcgtcctct ataagtttga agtctacgag aagaaagact gcggccgctt cgagcagaca tgataagata aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga cattataagc tgcaataaac aagttaacaa tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag cgataaggat ccgggctggc gtaatagcga gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gggctccctt tagggttccg atttagtgct tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780 agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840 tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900 gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac 960 tgtccactcc cagttcaatt acagctctta 1020 ggctagcatg ggagtgctaa aattcaagca 1080 tggagtatcc cagatagttt tcaccttcct 1140 cagagcacct cctgttattc caaatgtgcc 1200 attttgtctt ggaaaatttg atgagccact 1260 cccccgaata aacgccaccg ggcaaggtgt 1320 ctatccttac atagattcaa tcacaggagt 1380 ttccttacaa gaccatctgg acaaagctaa 1440 caatttggga atggctgtta ttgactggga 1500 gaaacctaaa gatgtttaca agaataggtc 1560 acttagtctc acagaggcca ctgagaaagc 1620 tttcctggta gagactataa aattgggaaa 1680 ttatcttttt ccggattgtt acaaccatca 1740 cttcaatgta gaaataaaaa gaaatgatga 1800 tctttaccca tccatttatt tgaacactca 1860 gcgcaatcga gttcgggaag ccatcagagt 1920 tccggttttt gcatataccc gcatagtttt 1980 agatgaactt gtgtatacat ttggcgaaac 2040 atggggaacc ctcagtataa tgcgaagtat 2100 ggagactata ctgaatcctt acataatcaa 2160 agtgctttgc caggagcaag gagtgtgtat 2220 tcacctcaac ccagataatt ttgctattca 2280 tggaaaaccg acacttgaag acctggagca 2340 tagcaccttg agttgtaagg agaaagctga 2400 tattgctgat ggtgtctgta tagatgcttt 2460 tcaaattttc tactgaggat ccatagctaa 2520 actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 2580 atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 2640 attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 2700 gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 2760 cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 2820 acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 2880 gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 2940 cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 3000 ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 3060 tgataagctt gccacaaccc acagcggccg 3120 tcgtcgccgt gtcccaaaat atggggattg 3180 tcaggaacga gttcaagtac ttccaaagaa 3240 agaatctggt gattatgggt aggaaaacct 3300 taaaggacag aattaatata gttctcagta 3360 attttcttgc caaaagtttg gatgatgcct 3420 gtaaagtaga catggtttgg atagtcggag 3480 aaccaggcca cctcagactc tttgtgacaa 3540 ttttcccaga aattgatttg gggaaatata 3600 ctgaggtcca ggaggaaaaa ggcatcaagt 3660 aaacgcgtgg tacctctaga gtcgacccgg 3720 cattgatgag tttggacaaa ccacaactag 3780 aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac 3840 caacaattgc attcatttta tgtttcaggt 3900 caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat 3960 agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 4020 ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 4080 cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 4140 gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 4200 ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 4260 ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 4320 ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 4380

- 225 033472 atctcggtct attcttttga tttataaggg aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg attctcagaa tgacttggtt gagtactcac tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc atatacttta gattgattta aaacttcatt tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag caactctttt tccgaaggta actggcttca tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg tggactcaag acgatagtta ccggataagg gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg ggccttttgc tcacatggct cgacagatct attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 4440 aattttaaca aaatattaac gcttacaatt 4500 tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca 4560 agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 4620 tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 4680 tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 4740 aggttaatgt catgataata atggtttctt 4800 tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 4860 gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4920 atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 4980 cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 5040 tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 5100 caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 5160 ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 5220 cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 5280 taaccatgag tgataacact gcggccaact 5340 agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 5400 cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 5460 caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 5520 taatagactg gatggaggcg gataaagttg 5580 ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 5640 cagcactggg gccagatggt aagccctccc 5700 aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 5760 attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 5820 tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 5880 aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5940 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 6000 cggtggtttg tttgccggat caagagctac 6060 gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 6120 agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 6180 ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 6240 cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 6300 acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 6360 gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 6420 ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 6480 agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 6540 cggccttttt acggttcctg gccttttgct 6600 6630 <210> 53 <211> 186 <212> Белок <213> Mus musculus <220>

<223> дигидрофолат редуктаза <400> 53

Val 1

Arg

Pro

Leu

Asn Cys 5

Ile Val

Ala

Val 10

Ser

Gln

Asn

Met

Gly 15

Ile

Gly

Lys

Asn

Gly

Asp

Leu

Pro

Trp

Pro

Pro

Leu

Arg

Asn

Glu

Phe

Lys

20

25

30

Tyr

Phe

Gln

Arg

Met

Thr

Thr

Thr

Ser

Ser

Val

Glu

Gly

Lys

Gln

Asn

35

40

45

Leu

Val

Ile

Met

Gly

Arg

Lys

Thr

Trp

Phe

Ser

Ile

Pro

Glu

Lys

Asn

50

55

60

Arg

Pro

Leu

Lys

Asp

Arg

Ile

Asn

Ile

Val

Leu

Ser

Arg

Glu

Leu

Lys

65

70

75

80

Glu

Pro

Pro

Arg

Gly

Ala

His

Phe

Leu

Ala

Lys

Ser

Leu

Asp

Asp

Ala

85

90

95

Leu

Arg

Leu

Ile

Glu

Gln

Pro

Glu

Leu

Ala

Ser

Lys

Val

Asp

Met

Val

100

105

110

- 226 033472

Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gln Glu Ala Met Asn Gln Pro

115

120

125

Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Glu Phe Glu Ser

130

135

140

Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro

145

150

155

160

Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys

165 170

Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp

180 185

175 <210> 54 <211> 6 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> His tag <400> 54

His His His His His His

5 <210> 55 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Flag tag <400> 55

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

5 <210> 56 <211> 1449 <212> ДНК <213> Homo sapiens <220>

<223> последовательность Gen2 м-РНК <400> 56 atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta60 tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca120 cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt180 cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga240 ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac780 ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa960

- 227 033472 cttgtgtata accctcagta atactgaatc tgccaggagc aacccagata ccgacacttg ttgagttgta gatggtgtct ttctactga catttggcga taatgcgaag cttacataat aaggagtgtg attttgctat aagacctgga aggagaaagc gtatagatgc aactgttgct tatgaaatct caacgtcaca tataaggaaa tcaacttgag gcaattttct tgatgtaaaa ttttctaaaa ctgggtgctt tgcttgctcc ctagcagcca aactggaatt aaaggtggaa gaaaaatttt gacactgatg cctcccatgg ctggaattgt tagacaatta aaatgtgtag caagtgacta agttcacagt attgcagctg ctgttgatgt agacagaaga aatatgggga catggagact tcaagtgctt tcttcacctc acgtggaaaa ttatagcacc gtgtattgct acctcaaatt

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1449 <210> 57 <211> 17 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> С-концевой пептид, отщепленный от растворимой rHuPH20 aa 431-447 <400> 57

Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe
1 Tyr	5	10	15

<210> 58 <211> 16 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> С-концевой пептид отщепленный от растворимой rHuPH20 aa

431-446 <400> 58

Asp Ala Phe Lys Leu Pro

Pro Met Glu

Thr Glu Glu Pro

Gln Ile

Phe <210> 59 <211> 15 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> С-концевой пептид отщепленный от растворимой rHuPH20 aa 431-445 <400> 59

Asp Ala Phe Lys Leu Pro

5

Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile <210> 60 <211> 14 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> С-концевой пептид отщепленный от растворимой rHuPH20 aa

- 228 033472

431-444 <400> 60

Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln

5 10 <210> 61 <211> 13 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> С-концевой пептид отщепленный от растворимой rHuPH20 aa 431-443 <400> 61

Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro

5 10 <210> 62 <211> 12 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> С-концевой пептид отщепленный от растворимой rHuPH20 aa

431-442 <400> 62

Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu 1 5 10 <210> 63 <211> 520 <212> Белок <213> Ovis aries <400> 63

Leu 1

Asp

Phe

Pro

Ala 5

Pro

Pro

Leu

Ile

Ser 10

Asn

Thr

Ser

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ala

Glu

Arg

Cys

Val

Lys

Ile

Phe

Lys

Leu

Pro

20

25

30

Pro

Asp

Leu

Arg

Leu

Phe

Ser

Val

Lys

Gly

Ser

Pro

Gln

Lys

Ser

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Phe

Ile

Thr

Leu

Phe

Tyr

Ala

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

His

Ile

Asp

Glu

Lys

Thr

Gly

Asn

Thr

Val

Tyr

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Leu

Gly

Asn

Leu

Lys

Asn

His

Leu

Glu

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Ala

Tyr

Tyr

Ile

Pro

Asn

Asp

Ser

Val

Gly

Leu

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Asn

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Arg

Asp

Glu

Ser

Val

Glu

Leu

Val

Leu

Gln

Lys

Asn

Pro

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Phe

Pro

Glu

Ala

Ser

Lys

Ile

Ala

Lys

Val

Asp

Phe

Glu

Thr

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Ser

Phe

Met

Gln

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

- 229 033472

Pro Asn

Asn Tyr

Arg Arg

210

Phe Pro 225

Ala Phe

Ile Ala

Val Phe

Asn Ser

290

Trp Gly 305

Gly Asn

Ala Ala

Thr Arg

Met Asn

370

Gly Lys

385

Cys Ser

Asn Val

Gly Pro

Ala Ser

450

Thr Val 465

Lys Val

Gln Gly

Gln Asn

His Leu

180

Asn Gln

195

Asn Asp

Ser Val

Tyr Val

Ser Val

260 Thr Asp 275 Val Gly

Ser Leu

Tyr Asn

Lys Met

340

Lys Gln

355

Phe Ala

Val Thr

Cys Tyr

His Ser

420

Val Lys

435

Thr Thr

Val Ser

Arg Cys

Val Lys

500 Ile Lys 515

Trp Gly

Pro Thr

Asp Leu

Tyr Leu

230

Arg Asn

245

Glu Ser

Gly Ser

Glu Ile

Asn Leu

310

Thr Thr

325

Cys Ser

Trp Asn

Ile Gln

Leu Glu

390

Ala Asn

405

Val Asn

Leu Gln

Thr Val

Pro Cys

470

Leu Glu

485

Trp Lys

Asn Gln

Tyr Tyr

Tyr Asn

200

Asp Trp 215

Asn Ile

Arg Val

Pro Leu

Ser Thr

280

Val Ala 295

Ser Leu

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360 Thr Gly 375

Asp Leu

Ile Asn

Val Cys

Pro Ser

440

Ser Ser 455

Thr Pro

Ala Ile

Asn Thr

Thr Thr

520

Leu Phe

185

Gly Asn

Leu Trp

Lys Leu

Gln Glu

250

Pro Val

265

Tyr Leu

Leu Gly

Thr Met

Pro Tyr

330

Leu Cys

345

Asp Tyr

Lys Gly

Gln Thr

Cys Lys

410

Met Ala

425

Asp His

Ile Ser

Glu Lys

Ala Asn

490

Ser Ser

505

Pro Asp

Cys Ser

Lys Glu

220

Lys Ser

235

Ala Ile

Phe Val

Ser Gln

Ala Ser

300

Gln Ser

315

Ile Ile

His Asp

Leu His

Gly Lys

380

Phe Ser

395

Lys Arg

Glu Asp

Ser Ser

Pro Ser

460

Gln Ser

475

Val Thr

Gln Ser

Cys Tyr

190

Asp Leu 205

Ser Thr

Thr Pro

Arg Leu

Tyr His

270

Gly Asp

285

Gly Ile

Cys Met

Asn Val

Glu Gly

350

Leu Asn 365

Tyr Thr

Asp Lys

Val Asp

Ile Cys

430

Ser Gln

445

Thr Thr

Pro Glu

Gln Thr

Gln Ser

510

Asn His

Glu Lys

Ala Leu

Lys Ala

240 Ser Lys 255

Arg Pro

Leu Val

Ile Met

Asn Leu

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Ile

Val Pro

Phe Tyr

400

Ile Lys

415

Ile Glu

Asn Glu

Ala Thr

Cys Leu

480 Gly Cys 495

Ser Ile <210> 64 <211> 474 <212> Белок <213> Bos taurus <220>

<223> PH20 <400> 64

Met

Gly

Met

Phe

Arg

Arg

His

His

Ile

Ser

Phe

Arg

Ser

Phe

Ala

Gly

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Thr

Pro

Gln

Ala

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Leu

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Ala

Leu

Asp

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Leu

Ile

Ser

Asn

Thr

Ser

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Val

Glu

Arg

Cys

Val

Asn

Arg

Arg

50

55

60

- 230 033472

Phe Gln Leu Pro Pro

Gln Lys Ser Ala Thr

Leu Gly Tyr Tyr Pro

100

Gly Gly Ile Pro Gln

115

Lys Asn Asp Ile Ala

130

Val Ile Asp Trp Glu

145

Pro Lys Asp Val Tyr

165

Asn Pro Gln Leu Ser

180

Phe Glu Thr Ala Gly

195

Lys Leu Leu Arg Pro

210

Cys Tyr Asn His Asn

225

Asp Val Glu Lys Arg

245

Ser Thr Ala Leu Phe

260

Thr Gln Asn Ala Ala

275

Arg Leu Ser Lys Ile

290

Tyr Ala Arg Pro Val

305

Gly Asp Leu Val Asn

325

Gly Ile Ile Met Trp

340

Cys Met Asn Leu Gly

355

Ile Asn Val Thr Leu

370

Asp Gly Gly Val Cys

385

His Leu Asn Pro Met

405

Tyr Thr Val Pro Gly

420

Asp Thr Phe Tyr Cys

435

Val Asp Ile Lys Asn

450

Val Cys Ile Asp Ala

465

Asp	Leu	Arg	Leu	Phe	Ser	Val	Lys	Gly	Ser	Pro
70					75					80
Gly	Gln	Phe	Ile	Thr	Leu	Phe	Tyr	Ala	Asp	Arg
				90					95
His	Ile	Asp	Glu	Lys	Thr	Gly	Lys	Thr	Val	Phe
			105					110
Leu	Gly	Asn	Leu	Lys	Ser	His	Leu	Glu	Lys	Ala
		120					125
Tyr	Tyr	Ile	Pro	Asn	Asp	Ser	Val	Gly	Leu	Ala
	135					140
Asn	Trp	Arg	Pro	Thr	Trp	Ala	Arg	Asn	Trp	Lys
150					155					160
Arg	Asp	Glu	Ser	Val	Glu	Leu	Val	Leu	Gln	Lys
				170					175
Phe	Pro	Glu	Ala	Ser	Lys	Ile	Ala	Lys	Val	Asp
			185					190
Lys	Ser	Phe	Met	Gln	Glu	Thr	Leu	Lys	Leu	Gly
		200					205
Asn	His	Leu	Trp	Gly	Tyr	Tyr	Leu	Phe	Pro	Asp
	215					220
His	Asn	Gln	Pro	Thr	Tyr	Asn	Gly	Asn	Cys	Pro
230					235					240
Arg	Asn	Asp	Asp	Leu	Glu	Trp	Leu	Trp	Lys	Glu
				250					255
Pro	Ser	Val	Tyr	Leu	Asn	Ile	Arg	Leu	Lys	Ser
			265					270
Leu	Tyr	Val	Arg	Asn	Arg	Val	Gln	Glu	Ala	Ile
		280					285
Ala	Ser	Val	Glu	Ser	Pro	Leu	Pro	Val	Phe	Val
	295					300
Phe	Thr	Asp	Gly	Ser	Ser	Thr	Tyr	Leu	Ser	Gln
310					315					320
Ser	Val	Gly	Glu	Ile	Val	Ser	Leu	Gly	Ala	Ser
				330					335
Gly	Ser	Leu	Asn	Leu	Ser	Leu	Ser	Val	Gln	Ser
			345					350
Thr	Tyr	Leu	Asn	Thr	Thr	Leu	Asn	Pro	Tyr	Ile
		360					365
Ala	Ala	Lys	Met	Cys	Ser	Gln	Val	Leu	Cys	His
	375					380
Thr	Arg	Lys	His	Trp	Asn	Ser	Ser	Asp	Tyr	Leu
390					395					400
Asn	Phe	Ala	Ile	Gln	Thr	Gly	Glu	Gly	Gly	Lys
				410					415
Thr	Leu	Thr	Leu	Glu	Asp	Leu	Gln	Lys	Phe	Ser
			425					430
Ser	Cys	Tyr	Ser	Asn	Leu	Ser	Cys	Lys	Lys	Arg
		440					445
Val	His	Ser	Val	Asp	Val	Cys	Met	Ala	Glu	Asp
	455					460
Phe	Leu	Lys	Pro	Pro
470

<210> 65 <211> 517 <212> Белок <213> Ovis aries <400> 65

Asp Phe Arg Ala Pro

5

Trp Asn Ala Pro Ala

Pro	Leu	Ile	Ser	Asn 10	Thr	Ser	Phe	Leu	Trp 15	Ala
Glu	Arg	Cys	Ile	Lys	Ile	Phe	Lys	Leu	Pro	Pro

- 231 033472

Asp Leu

Gly Gln

His Ile

Leu Gly

Tyr Tyr

Asn Trp

Arg Asp

130

Phe Pro

145

Lys Ser

Asn His

Tyr Asn

Arg Asn

210

Pro Ser 225

Phe Tyr

Ala Ser

Phe Thr

Ser Val

290 Gly Ser 305

Asn Tyr

Ala Ala

Thr Arg

Asn Phe

370

Lys Val

385

Ser Cys

Val His

Pro Val

Ser Thr

450

Val Ser 465

Arg Cys

Val Lys

Asn Gln

Arg Leu 35

Phe Ile

Asp Glu

Asn Leu

Ile Pro

100 Arg Pro 115

Glu Ser

Glu Ala

Phe Met

Leu Trp

180

Gln Pro 195

Asp Asp

Val Tyr

Val Arg

Val Glu

260

Asp Gly 275

Gly Glu

Leu Asn

Leu Asn

Lys Met

340

Lys Gln

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ala

Ser Val

420

Lys Leu

435

Thr Thr

Pro Cys

Leu Glu

Trp Lys

500

Thr Thr

515

Phe Ser

Thr Leu

Lys Thr

Lys Asn

Asn Asp

Thr Trp

Val Glu

Ser Lys

150

Gln Glu

165

Gly Tyr

Thr Tyr

Leu Asp

Leu Asn

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Ser Ser

Ile Val

Leu Ser

310

Thr Thr

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Thr

Glu Asp

390

Asn Ile

405

Asn Val

Gln Pro

Val Ser

Thr Pro

470

Ala Ile

485

Asn Thr

Tyr

Val Lys

Phe Tyr

Gly Asn

His Leu

Ser Val

Ala Arg

120

Leu Val

135

Ile Ala

Thr Leu

Tyr Leu

Asn Gly

200

Trp Leu

215

Ile Lys

Val Gln

Leu Pro

Thr Tyr

280

Ala Leu

295

Leu Thr

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360 Gly Lys 375

Leu Gln

Asn Cys

Cys Met

Ser Asp

440

Ser Ile

455

Glu Lys

Ala Asn

Ser Ser

Gly Ser

Ala Asp

Thr Val

Glu Lys

Gly Leu

105

Asn Trp

Leu Gln

Lys Val

Lys Leu

170

Phe Pro

185

Asn Cys

Trp Lys

Leu Lys

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Gln

Pro Tyr

330

Leu Cys

345

Asp Tyr

Gly Gly

Thr Phe

Lys Lys

410

Ala Glu

425

His Ser

Ser Pro

Gln Ser

Val Thr

490

Gln Ser

505

Pro Gln

Arg Leu

Tyr Gly

Ala Lys

Ala Val

Lys Pro

Lys Asn

140

Asp Phe

155

Gly Lys

Asp Cys

Ser Asp

Glu Ser

220

Ser Thr 235

Ile Arg

Val Tyr

Gln Gly

Ser Gly

300 Ser Cys 315

Ile Ile

His Asp

Leu His

Lys Tyr

380 Ser Asp 395 Arg Val

Asp Ile

Ser Ser

Ser Thr

460

Pro Glu 475

Gln Thr

Ser Ile

Lys Ser

Gly Tyr

Gly Ile

Lys Asp

Ile Asp

110

Lys Asp

125

Pro Gln

Glu Thr

Leu Leu

Tyr Asn

190

Leu Glu

205

Thr Ala

Pro Lys

Leu Ser

His Arg

270

Asp Leu

285

Ile Ile

Met Asn

Asn Val

Glu Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Ile

Cys Ile

430

Gln Asn

445

Thr Ala

Cys Leu

Gly Cys

Gln Asn

510

Ala Thr

Tyr Pro

Pro Gln

Ile Ala

Trp Glu

Val Tyr

Leu Ser

Ala Gly

160 Arg Pro 175

His Asn

Lys Arg

Leu Phe

Ala Ala

240

Lys Ile

255

Pro Val

Val Asn

Met Trp

Leu Gly

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Met

Pro Gly

Tyr Cys

400

Lys Asn

415

Glu Gly

Glu Ala

Thr Thr

Lys Val

480 Gln Gly 495

Ile Lys

- 232 033472 <210> 66 <211> 1620 <212> ДНК <213> Ovis aries <400> 66 ttttccgtgt tggttggctc tggacttcag cctctgggcc tggaatgccc cagctgaacg tctgagactc ttctctgtaa aaggaagccc attattttat gctgatagac ttggctacta tgtatatgga ggaattcccc agttgggaaa agacattgcc tattacatac caaatgacag ctggaggcct acctgggcaa gaaactggaa tgagttggtt ctgcaaaaaa atccacaact agtggatttt gagacagcag gaaagagttt acttcggcca aatcacttat ggggttatta taaccagcct acttacaatg gaaattgctc cgactggttg tggaaggaaa gcactgccct aaaatctact ccaaaagctg ccttctatgt gtctaaaata gcgagtgttg aaagtccact tactgatggg tcttcaacat acctttctca cgttgctcta ggtgcctctg ggattataat gcaatcttgc atgaacctag gcaattactt cgtcacccta gcagccaaaa tgtgcagcca aaggaaacaa tggaattcaa gcgactatct aactgggaaa ggtggaaaat acacagtacc gttttctgat aaattttatt gcagttgtta tataaaaaat gttcatagtg ttaatgtatg tgtgaagtta caacccagtg atcattcctc cagcagtatc tcaccctcta ctacagccac gtcccctgag tgcctcaaag tcaggtgttt gtgtcaaggt gttaaatgga agaacacttc tcaaacaacc tattaaaata taaattcagt agcaccccct ctcatttcaa acacttcttt 60 ttgtattaaa atctttaaac tacctccaga 120 ccaaaaaagt gctacgggac aatttattac 180 tcctcatata gatgaaaaaa caggcaacac 240 cttaaaaaat catttggaaa aagccaaaaa 300 cgtgggcttg gcggtcattg actgggaaaa 360 acctaaagat gtttacaggg atgagtctgt 420 cagtttccca gaggcttcca agattgcaaa 480 catgcaagag actttaaaac tgggaaaatt 540 tctttttcct gattgttaca atcataatta 600 tgatttagaa aaaaggagaa atgatgatct 660 tttcccttct gtttatttga atatcaagtt 720 tcgtaatcgt gtccaggaag ccattcggtt 780 tcccgttttt gtatatcacc gtccagtttt 840 gggtgacctt gtgaattcgg ttggtgagat 900 gtggggcagt ctcaatctaa gcctaactat 960 gaacactaca ctgaatcctt acataatcaa 1020 agtgctttgc cacgatgaag gagtgtgtac 1080 tcacctgaac ccaatgaatt ttgctattca 1140 tgggaaagtc acacttgaag acctgcaaac 1200 tgccaacatc aactgtaaga agagagttga 1260 tatggcagaa gacatttgta tagagggccc 1320 tagccagaat gaggcatcta ctaccaccgt 1380 cacagtatct ccatgtactc ctgagaaaca 1440 ggaagccatc gccaacgtca cccaaacggg 1500 cagtcagtca agtattcaaa atattaaaaa 1560 gcttataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 <210> 67 <211> 793 <212> Белок <213> Arthrobacter sp. (штамм FB24) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 67

Met

Thr

Arg

Glu

Phe

Ser

Arg

Arg

Thr

Ala

Leu

Lys

Gly

Ala

Ala

Leu

1

5

10

15

Ser

Gly

Leu

Leu

Leu

Ala

Met

Val

His

Gly

Pro

Ala

His

Ala

Ala

Ala

20

25

30

Thr

Ala

Asn

Ala

Thr

Leu

Thr

Pro

Ala

Asp

Phe

Ala

Gly

Leu

Arg

Gln

35

40

45

Arg

Trp

Val

Asp

Gln

Ile

Thr

Gly

Arg

Lys

Val

Leu

Val

Ala

Gly

Asp

50

55

60

Asn

Asp

Phe

Val

Thr

Ala

Leu

Ala

Ala

Leu

Asp

Lys

Lys

Ala

Arg

Thr

65

70

75

80

Ala

Ile

Asp

Leu

Leu

Glu

Arg

Ser

Ala

Gly

Arg

Leu

Thr

Val

Phe

Ser

85

90

95

Asp

Leu

Ser

Leu

Ala

Lys

Asp

Thr

Asp

Leu

Val

Thr

Thr

His

Thr

Arg

100

105

110

Leu

Ala

Thr

Met

Ala

Thr

Ala

Trp

Ala

Thr

Pro

Gly

Ser

Glu

His

Phe

115

120

125

Ala

Asp

Ala

Gly

Leu

Leu

Ala

Ala

Ile

Arg

Ala

Gly

Leu

Ala

Asp

Ala

- 233 033472

130

Asn Ser Leu Cys Tyr

145

Ser Trp Glu Ile Gly

165

Leu His Ala Glu Leu

180

Ile Asp His Phe Val

195

Gly Lys Ile Thr Ser

210

Val Thr Ile Arg Ser

225

Ala Val Ala Gly Leu

245

Gly Phe Phe Thr Asp

260

Thr Gly Ser Tyr Gly

275

Ala Leu Leu Gly Gly

290

Ile Leu Phe Lys Thr

305

Gly Ala Met Ala Asp

325

Asn Thr Gly Phe Asp

340

Leu Ala Arg Ala Val

355

Cys Leu Ala Trp Ile

370

Ala Gly Val Gly Arg

385

Leu Thr Glu Thr Asp

405

Asp Arg Thr Met His

420

Ala Ser Ser Arg Ile

435

Arg Gly Tyr His Thr

450

Leu Gly Gln Tyr Asp

465

Leu Pro Gly Ile Thr

485

Gly Glu Trp Gly Ala

500

Ala Tyr Gly Asp Val

515

Gly Thr Gly Leu Thr

530

Ile Val Cys Leu Gly

545

Glu Thr Val Val Asp

565

Gly Thr Ala Ala Gly

580

Leu Thr Val Asp Arg

595

Val Leu Asp Ala Ala

610

Ser Trp Ser Glu Val

625

135

Asn Ala Ser Lys Glu

150

Thr Pro Lys Ala Leu

170

Thr Ala Ala Glu Arg

185

Pro Asp Pro Trp Gln

200

Val Gly Ala Asn Arg

215

Leu Val Asp Glu Asp

230

Ser Glu Val Trp Gln

250

Gly Ser Phe Ile Gln

265

Val Val Leu Leu Thr

280

Thr Gly Ala Glu Val

295

Val Glu Gly Ser Phe

310

Ser Val Arg Gly Arg

330

Leu Gly Ala Ser Thr

345

Asp Pro Val Thr Ala

360

Asn Gln Asn Arg Lys

375

Thr Ala Leu Val Lys

390

Leu Pro Gly Gly His

410

His Ser Gln Gly Trp

425

Ala Trp Tyr Glu Cys

440

Gly Ser Gly Met Thr

455

Asp Ala Phe Trp Ala

470

Val Asp Thr Ser Ser

490

Ala Thr Pro Ala Asn

505

Ala Ala Val Gly Gln

520

Ala Arg Lys Ser Trp

535

Ala Asp Ile Arg Thr

550

His Arg Asn Leu His

570

Thr Val Ala Ala Thr

585

Trp Val His Leu Glu

600

Pro Leu Gln Val Leu

615

Asn Val Lys Gly Ser

630

140

Glu Gln Gly Asn Trp

155

Ala Asp Thr Met Val

175

Ala Ala Tyr Cys Ala

190

Gln Phe Pro Pro Lys

205

Val Asp Leu Cys Gln

220

Ala Glu Lys Leu Thr

235

Tyr Val Ser Ala Gly

255

His Ser Thr Thr Pro

270

Gly Leu Ser Lys Leu

285

Ser Asp Pro Ser Arg

300

Ala Pro Phe Met Val

315

Ser Ile Ser Arg Glu

335

Ile Glu Ser Ile Leu

350

Arg Arg Trp Arg Ser

365

Ala Pro Ile Leu Ala

380

Glu Leu Leu Ala Met

395

Tyr Leu Phe Pro Ala

415

Thr Leu Ser Thr Ala

430

Gly Asn Gly Glu Asn

445

Tyr Val Tyr Asp Gly

460

Thr Ala Asn His Cys

475

Leu Pro Asp Lys Val

495

Glu Trp Thr Gly Ser

510

His Leu Ile Gly Pro

525

Phe Val Ser Lys Asp

540

Gly Ser Gly Ser Arg

555

Ala Gly Phe Asn Ala

575

Pro Gly His Pro Glu

590

Gly Phe Gly Gly Tyr

605

Arg Glu Gln Arg Glu

620

Ala Ala Arg Gln Thr

635

Trp

160

Leu

Ala

Arg

Ala

His

240

Asn

Tyr

Phe

Asp

Ala

320

Ser

Leu

Leu

Asp

Gly

400

Met

Met

Asn

Asp

Arg

480

Glu

Thr

Gly

Val

Ile

560

Met

Val

Val

Gly

Arg

640

- 234 033472

Asn Tyr

Ser Tyr

Ser Leu

Ala Gln

690

Trp Arg

705

Val Val

Pro Thr

Phe Phe

Asp Gly

770

Thr Lys

785

Ala Thr

Ala Tyr

660 Ser Gly 675

Ala Val

Pro Gly

Val Lys

Gln Asn

740 Arg Ile 755

Phe Thr

Gln Ile

Leu Tyr

645

Leu Val

Gln Ser

Lys Phe

Thr Val

710

Glu Val

725

Ala Ser

Ile Glu

Val Leu

Glu Leu

790

Phe Asp

Ala Pro

Phe His

680

Lys Lys

695

Gly Asp

Gly Asp

Thr Leu

Gly Gln

760

Glu Val

775

Ser Ala

His Gly

650

Gly Ala

665

Thr Val

Glu Lys

Leu Ala

Arg Leu

730

Thr Leu 745

Gly Ala

Asp Ile

Glu

His Glu

Ser Ala

Leu Arg

Thr Thr

700

Leu Ser

715

Ser Ile

Arg Leu

Ser Leu

Ala Asn

780

Pro Glu

Ser Met

670

Asn Asp

685

Ala Ala

Gly Pro

Ala Val

Lys Thr

750

Ser His

765

His Ala

Ala Ala

655

Thr Ser

Glu Val

Thr Phe

Ala Cys

720

Ser Asp

735

Lys Arg

Gly Ala

Gly Arg <210> 68 <211> 557 <212> Белок <213> Bdellovibrio bacteriovorus <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 68

Met 1

Thr

Lys

Phe

Phe 5

Phe

Leu

Leu

Thr

Leu 10

Ile

Ser

Ala

Thr

Ala 15

Phe

Ala

Gln

Ser

Glu

Pro

Asp

Trp

Thr

Ala

Gly

Val

Pro

Val

Pro

Pro

Gly

20

25

30

Gly

Arg

Ser

Asn

Ile

Tyr

Ser

Trp

Asn

Asp

Phe

Asp

Phe

Gln

Ala

Thr

35

40

45

Leu

Asn

Lys

Gly

Lys

Ile

His

Ala

Gln

Val

Tyr

Pro

Val

Thr

Val

Thr

50

55

60

Gly

Met

Leu

Pro

Pro

Tyr

Glu

Pro

Val

Arg

Arg

Leu

Ile

Glu

Glu

Lys

65

70

75

80

Asn

Ser

Asn

Pro

Leu

Arg

Lys

Trp

Ile

Gln

Ser

Leu

Met

Lys

Gly

Leu

85

90

95

Ser

Gly

Phe

Arg

Ser

Phe

Glu

Asp

Val

Leu

Lys

Asn

Leu

Gly

Leu

His

100

105

110

Lys

Tyr

Pro

Leu

Glu

Asn

Glu

Arg

Gly

Val

Tyr

Ala

Val

Pro

Tyr

Pro

115

120

125

Asn

Glu

Ile

Arg

Pro

Asp

Thr

Leu

Met

Gly

Phe

Gly

Leu

Ile

Glu

Arg

130

135

140

Asn

Gly

Ala

Glu

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Cys

Ala

Ala

Cys

His

Ser

Ser

145

150

155

160

Asn

Leu

Phe

Gly

Lys

Thr

Val

Leu

Gly

Met

Thr

Asn

Arg

Phe

Pro

Arg

165

170

175

Ala

Asn

Glu

Phe

Phe

Ile

Lys

Ala

Lys

Lys

Val

Met

Pro

Leu

Met

Asp

180

185

190

Pro

His

Ile

Phe

Gln

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ala

Thr

Asp

Ala

Glu

Thr

Ala

195

200

205

Leu

Leu

Val

Glu

Ser

Lys

Glu

Arg

Leu

Lys

Ser

Val

Ala

Leu

Lys

Gln

210

215

220

Pro

Ile

Ala

Leu

Gly

Leu

Asp

Thr

Ser

Leu

Ala

Gln

Val

Ser

Leu

Ser

225

230

235

240

Leu

Asn

Arg

Arg

Ala

Lys

Asp

Gly

Tyr

Ala

Asn

Tyr

Ser

Asp

Lys

Ala

245

250

255

- 235 033472

Ala Arg

Ser Lys

Ser Asp

290

Trp Asn

305

Leu Ala

Ala Ser

Asp Leu

Ala Lys

370

Leu Val

385

Lys Glu

Gln Gly

Lys Asn

Leu Val

450

Pro Asn

465

Tyr Tyr

Cys Gly

Arg Glu

His Asp

530

Glu Asp

545

Ser Pro

260

Pro Ala 275

Gly Ser

Glu Ile

Asp Asn

Glu Ala

340 Gly Arg 355

Cys His

Leu Ser

Lys Thr

Met Lys

420 Gly Ile 435

Gly Ile

Leu Cys

Ser Gly

Gly Tyr

500

His Leu 515

Glu Gly

Lys Tyr

Arg Ala

Val Trp

Val Leu

Gly Arg

310

Asp His

325

Pro His

Ala Lys

Gly His

Ala Ala

390

Pro Val

405

Ser Leu

Val Ile

Trp Ala

Val Leu

470

Glu Ala

485

Pro Ile

Tyr Asp

Ile Phe

Asn Leu

550

Asp Ala

Trp Asn

280

Ser Gly 295

Gly Ala

Ile Ile

Ile Thr

Ala Gly

360

Tyr Glu 375

Glu Arg

Val Asn

Glu Gln

Lys Ala

440

Arg Trp

455

Leu Thr

Leu Asn

Gly Asp

Thr Arg

520 Ile Lys 535

Ile Gln

Tyr Leu 265

Val Lys

Asn Pro

Asp Leu

Lys Glu

330

Asp Phe

345

Glu Gln

Lys Ala

Leu Lys

Val Gly

410

Leu Asn 425

Gln Glu

Pro Tyr

Pro Ala

Lys Asp

490

Lys Thr 505

Asn Pro

Asp Gly

Phe Leu

Asp Asn

Tyr Lys

Ile Phe

300

His Glu

315

Leu Thr

Tyr Pro

Ile Phe

Trp Asn

380

Thr Val

395

Thr Asp

Asp Leu

Gly Tyr

Met His

460

Lys Lys

475

Thr Asp

Pro Lys

Gly Met

Lys Glu

540 Gln Thr 555

Lys Pro

270 Asn Arg 285

Thr Asn

Leu Glu

Thr Ala

Ala Glu

350

Lys Asn

365

Leu Pro

Glu Val

Pro Phe

Glu Ile

430

Val Pro

445

Asn Asn

Arg Pro

Tyr Asp

Ala Trp

510

Gly Asn

525

Ile Leu

Leu

Ala Asp

Trp Leu

Leu Ile

Gln Trp

320

Val Phe

335

Lys Ile

Thr Cys

Gln Ala

Arg Tyr

400

Arg Arg

415

Ser Lys

Pro Pro

Ser Ile

Ser Ile

480

Phe Ser

495

Lys Thr

Met Gly

Ser Ala <210> 69 <211> 813 <212> Белок <213> Propionibacterium acnes <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 69

Met 1

Phe

Gly

Thr

Pro 5

Ser

Arg

Arg

Thr

Phe 10

Leu

Thr

Ala

Ser

Ala 15

Leu

Ser

Ala

Met

Ala

Leu

Ala

Ala

Ser

Pro

Thr

Val

Thr

Asp

Ala

Ile

Ala

20

25

30

Ala

Pro

Gly

Pro

Asp

Ser

Trp

Ser

Ala

Leu

Cys

Glu

Arg

Trp

Ile

Asp

35

40

45

Ile

Ile

Thr

Gly

Arg

Arg

Ala

Ala

Arg

Thr

Ser

Asp

Pro

Arg

Ala

Arg

50

55

60

Ala

Ile

Ile

Ala

Lys

Thr

Asp

Arg

Lys

Val

Ala

Glu

Ile

Leu

Thr

Asp

65

70

75

80

Leu

Val

Ser

Gly

Ser

Ser

Arg

Gln

Thr

Val

Leu

Ile

Ser

Ala

Asp

Leu

85

90

95

Arg

Lys

Glu

Gln

Ser

Pro

Phe

Ile

Thr

Lys

Thr

Ala

Arg

Ala

Ile

Glu

100

105

110

- 236 033472

Ser Met

Pro Glu

130

Leu Arg

145

Glu Asp

Asp Val

His Phe

Thr Ala

210

Asp Leu

225

Lys Arg

Thr Thr

Ser His

Leu Ala

290

Glu Ser

305

Pro Val

Ile Ser

Arg Ala

Gln Trp

370

His Leu

385

Ala Ala

Ala Ser

Val Ser

Glu Asn

450

Leu Pro

465

Asp Tyr

Arg Ala

Ser Gly

Thr Ser

530

Lys Asp

545

Arg Ala

Lys Leu

Asn Pro

Thr Asp

Ala Cys

115

Ile Leu

Tyr Asn

Gly Ala

Leu Pro

180

Ile Pro

195

Asn Pro

Thr Arg

Leu Arg

Glu Gly

260

Ile Pro

275

Met Leu

Ala Arg

Met Tyr

Arg Ile

340

Met Leu

355

Arg Gly

Ser Glu

Lys Ala

Met Asp

420

Asn Cys

435

Glu Trp

Gly Asp

Ser Ala

Val Gly

500

Gly Leu

515

Gln Asp

Ala Met

Ile Thr

Leu Val

580

Arg Trp

595

Thr Asp

Ala Trp

Ser Ala

Pro Ser

150

Ser Arg

165

Pro Glu

Asp Pro

Val Gln

Ala Val

230

His Ala

245

Asp Gly

Tyr Thr

Phe Pro

Lys Ala

310 Asn Gly 325

Asn Glu

Met Met

Ile Val

Pro Ser

390 Arg Pro 405

Arg Leu

Ser Asp

Ala Ser

Met Gly

470

Pro Thr

485

Ala Ser

Ala Ser

Ser Ala

Val Glu

550

Val Val

565

Asp Gly

Ala His

Leu Ser

Ala Thr

120 Cys Ile 135

Gln Asp

Ala Val

Val Met

Trp Phe

200

Pro Val

215

Met Cys

Val Asp

Phe Arg

Gly Gly

280

Leu Val

295

Phe His

Gln Ile

Ser Ala

Ala Asp

360

His Gly

375

Thr Leu

Val Pro

Val His

Arg Ile

440

Arg Thr 455

Gln Tyr

Gly Thr

Trp Ala

Gly Ser

520 Leu Lys 535

Leu Thr

Glu His

Asn Arg

Leu Asp

600 Ala Asp

Pro Gly

Glu Gly

Glu Tyr

Ala Asp

170

Ser Ala 185

Gln Gln

Val Ser

Arg Ser

Gly Leu

250 Ala Asp 265 Tyr Gly

Ser Gly

Asp Gln

Leu Asp

330

Ala Met

345

Ala Leu

Trp Met

Val Asp

Glu Ser

410 Arg Thr 425

Ala Trp

Ser Gln

Glu Asp

Thr Val

490 Ala Lys 505

Trp Ser

Ala Arg

Thr Asp

Arg Lys

570

Val Ser 585

Gly Val

Val Ala

Ser Ser

Leu Arg

140

Gly Asn

155

Val Met

Ala Ala

Pro Ala

Thr Gly

220

Ile Ala 235

Pro Asp

Gly Gly

Asp Val

Met Arg

300

Val Glu

315

Asp Val

His Gly

Pro Thr

Ala Arg

380

Ile Ser 395

Ser Thr

Ala Asp

Tyr Glu

Gly Met

460

Gly Tyr 475

Asp Ser

Thr Pro

Ala Ala

Arg Leu

540

Val Thr 555

Val Ala

Ser Ala

Gly Gly

Thr Arg

Tyr His

125

Asp Phe

Trp Trp

Cys Ile

Ala Gly

190

Ser Val

205

Ala Asn

Thr Gly

Ala Trp

Phe Ile

270

Leu Phe

285

Phe Asp

Arg Gly

Arg Gly

Ile Ser

350

His Arg

365

Asn Thr

Leu Phe

Pro Ser

Trp Leu

430

Tyr Gly

445

Arg Tyr

Trp Ala

Thr Pro

Thr Asn

510

Ala Ser 525

Trp Val

Thr Asp

Ser Ser

Thr Ser

590 Tyr Val 605

Lys Gly

Lys Asp

Cys Arg

Asp Trp

160

Leu His

175

Ile Asp

Lys Pro

Arg Met

Asp Glu

240

Arg Val

255

Gln His

Ser Gly

Ile Val

Phe Ile

320 Arg Ser 335

Ile Ala

Ala Glu

Phe Asp

Asp Ala

400

Tyr Phe

415

Ile Thr

Asn Gly

Leu Leu

Thr Val

480

Leu Lys

495

Glu Trp

His Ile

Gly Leu

Ala Ser

560

Ser Thr

575

Phe Gln

Phe Ala

Thr Trp

- 237 033472

610 Ile Asp 625 Glu Arg

Ala Trp

Ala Thr

Thr Val

690

Thr Val 705

Val Ala

Gln Met

Thr Val

Val Asp

770

Ala Gly

785

Thr Gln

Val Asn

Ala Tyr

Ala Leu

660

Arg Pro

675

Gln Ala

Val Thr

Val Asn

Glu Val

740

Thr Ile

755

Val Ser

Leu Gly

Thr Pro

Pro Ser

630

Ala Ser

645

Leu Pro

Gly Val

Val Arg

Thr Leu

710

Arg Pro

725

Val Ile

Glu Gly

Cys Glu

Gly Gln

790 Ser Gly 805

615

Arg Lys

Leu His

Thr Ala

Glu Pro

680

Ser Ala

695

Ala Phe

Ala Leu

Val Glu

Ser Trp

760

Asn Ala

775

Ser Val

Gly Gly

Val Lys

Val Thr

650

Ser Arg

665

Phe Thr

Gly Ala

Trp Lys

Val Gln

730

Pro Thr

745

Lys Val

Ala Gly

Arg Val

Arg His

810

620

Gly Ala

635

His His

Ser His

Val Leu

Leu Leu

700

Pro Ala

715

Thr Arg

Gln Lys

Lys Thr

Thr Leu

780

Thr Leu

795

Asp Arg

Asp Glu

Asp Arg

Thr Met

670

Arg Asn 685

Thr Lys

Thr Cys

Glu Ser

Arg Gly

750 Ala Asp 765

His Val

Ala Arg

Ala

Val Ile

640

Pro Val

655

Ala Leu

Asp Ala

Asp Pro

Gly Gly

720

Ala Asn

735

Ser Leu

Ser His

Asp Thr

Gln Val

800 <210> 70 <211> 1072 <212> Белок <213> Streptococcus agalactiae <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 70

Met

Glu

Ile

Lys

Lys

Lys

Tyr

Arg

Ile

Met

Leu

Tyr

Ser

Ala

Leu

Ile

1

5

10

15

Leu

Gly

Thr

Ile

Leu

Val

Asn

Asn

Ser

Tyr

Gln

Ala

Lys

Ala

Glu

Glu

20

25

30

Leu

Thr

Lys

Thr

Thr

Ser

Thr

Ser

Gln

Ile

Arg

Asp

Thr

Gln

Thr

Asn

35

40

45

Asn

Ile

Glu

Val

Leu

Gln

Thr

Glu

Ser

Thr

Thr

Val

Lys

Glu

Thr

Ser

50

55

60

Thr

Thr

Thr

Thr

Gln

Gln

Asp

Leu

Ser

Asn

Pro

Thr

Ala

Ser

Thr

Ala

65

70

75

80

Thr

Ala

Thr

Ala

Thr

His

Ser

Thr

Met

Lys

Gln

Val

Val

Asp

Asn

Gln

85

90

95

Thr

Gln

Asn

Lys

Glu

Leu

Val

Lys

Asn

Gly

Asp

Phe

Asn

Gln

Thr

Asn

100

105

110

Pro

Val

Ser

Gly

Ser

Trp

Ser

His

Thr

Ser

Ala

Arg

Glu

Trp

Ser

Ala

115

120

125

Trp

Ile

Asp

Lys

Glu

Asn

Thr

Ala

Asp

Lys

Ser

Pro

Ile

Ile

Gln

Arg

130

135

140

Thr

Glu

Gln

Gly

Gln

Val

Ser

Leu

Ser

Ser

Asp

Lys

Gly

Phe

Arg

Gly

145

150

155

160

Ala

Val

Thr

Gln

Lys

Val

Asn

Ile

Asp

Pro

Thr

Lys

Lys

Tyr

Glu

Val

165

170

175

Lys

Phe

Asp

Ile

Glu

Thr

Ser

Asn

Lys

Ala

Gly

Gln

Ala

Phe

Leu

Arg

180

185

190

Ile

Met

Glu

Lys

Lys

Asp

Asn

Asn

Thr

Arg

Leu

Trp

Leu

Ser

Glu

Met

195

200

205

Thr

Ser

Gly

Thr

Thr

Asn

Lys

His

Thr

Leu

Thr

Lys

Ile

Tyr

Asn

Pro

- 238 033472

210

Lys Leu Asn Val Ser

225

Thr Gly Ser Ala Thr

245

Lys Asp Ser Glu His

260

Val Asn Thr Ala Leu

275

Gln Tyr Thr Leu Thr

290

Leu Tyr Pro Asn Ala

305

Ser Gly Lys Ile Ile

325

Glu Asp Lys Phe Thr

340

Gly Asn His Val Tyr

355

Gln Lys Leu Asp Glu

370

Asp Ser Asn His Thr

385

Ser Ala Gln Leu Thr

405

Gln Ile Thr Asn Pro

420

Arg Thr Val Lys Glu

435

Val Asn Lys Asp Ile

450

Gly Val Pro Arg Ser

465

Phe Thr Asp Ala Glu

485

Val Pro Asp Ala Gly

500

Ala Leu Gly Gly Asn

515

Gly Leu Leu Arg Lys

530

Leu Lys Asn Leu Phe

545

Asp Gly Ser Tyr Ile

565

Gly Asn Val Leu Ile

580

Glu Thr Asp Tyr Lys

595

Trp Ile Asn Gln Ser

610

Asp Met Ser Arg Gly

625

Ala Ala Ala Val Glu

645

Ser Asn Glu Glu Arg

660

Ile Thr Ser Asn Lys

675

Ser Asp Ile Ala Asn

690

Thr Lys Pro Leu Lys

705

215

Glu Val Thr Leu Glu

230

Phe Asp Asn Ile Ser

250

Pro Gln Pro Val Thr

265

Asn Lys Asn Tyr Val

280

Asn Pro Ser Leu Gly

295

Thr Gly Ser Thr Thr

310

Lys Glu Val Pro Leu

330

Lys Leu Leu Asp Lys

345

Asp Thr Asn Asp Ser

360

Thr Asn Ala Lys Asn

375

Phe Leu Trp Lys Asp

390

Ala Thr Tyr Arg Arg

410

His Ser Thr Ile Tyr

425

Ser Leu Ala Trp Leu

440

Glu Gly Ser Ala Asn

455

Ile Thr Ala Thr Leu

470

Ile Lys Thr Tyr Thr

490

Tyr Phe Arg Lys Thr

505

Leu Val Asp Met Gly

520

Asp Asn Thr Ile Ile

535

Thr Thr Ala Thr Lys

550

Asp His Thr Asn Val

570

Asp Gly Leu Thr Gln

585

Ile Ser Asn Gln Glu

600

Phe Leu Pro Leu Ile

615

Arg Ser Ile Ser Arg

630

Val Leu Arg Gly Phe

650

Asn Leu Asp Leu Lys

665

Phe Tyr Asn Val Phe

680

Met Asn Lys Met Leu

695

Ser Asn Leu Ser Thr

710

220

Leu Tyr Tyr Glu Lys

235

Met Lys Ala Lys Gly

255

Thr Gln Ile Glu Glu

270

Phe Asn Lys Ala Asp

285

Lys Ile Val Gly Gly

300

Val Lys Ile Ser Asp

315

Ser Val Thr Ala Ser

335

Trp Asn Asp Val Thr

350

Asn Met Gln Lys Ile

365

Ile Lys Thr Ile Lys

380

Leu Asp Asn Leu Asn

395

Leu Glu Asp Leu Ala

415

Lys Asn Glu Lys Ala

430

His Gln Asn Phe Tyr

445

Trp Trp Asp Phe Glu

460

Ala Leu Met Asn Asn

475

Asp Pro Ile Glu His

495

Leu Asp Asn Pro Phe

510

Arg Val Lys Ile Ile

525

Glu Lys Thr Ser His

540

Ala Glu Gly Phe Tyr

555

Ala Tyr Thr Gly Ala

575

Leu Leu Pro Ile Ile

590

Leu Asp Met Val Tyr

605

Val Lys Gly Glu Leu

620

Glu Ala Ala Ser Ser

635

Leu Arg Leu Ala Asn

655

Ser Thr Ile Lys Thr

670

Asn Asn Leu Lys Ser

685

Asn Asp Ser Thr Val

700

Phe Asn Ser Met Asp

715

Gly

240

Pro

Ser

Tyr

Ile

Lys

320

Thr

Ile

Asn

Leu

Asn

400

Lys

Ile

Asn

Ile

Tyr

480

Phe

Lys

Glu

Ser

Ala

560

Tyr

Gln

Lys

Met

His

640

Met

Ile

Tyr

Ala

Arg

720

- 239 033472

Leu

Ala

Tyr

Tyr

Asn 725

Ala

Glu

Lys

Asp

Phe 730

Gly

Phe

Ala

Leu

Ser 735

Leu

His

Ser

Lys

Arg

Thr

Leu

Asn

Tyr

Glu

Gly

Met

Asn

Asp

Glu

Asn

Thr

740

745

750

Arg

Gly

Trp

Tyr

Thr

Gly

Asp

Gly

Met

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Ser

Asp

755

760

765

Gln

Ser

His

Tyr

Ser

Asn

His

Phe

Trp

Pro

Thr

Val

Asn

Pro

Tyr

Lys

770

775

780

Met

Ala

Gly

Thr

Thr

Glu

Lys

Asp

Ala

Lys

Arg

Glu

Asp

Thr

Thr

Lys

785

790

795

800

Glu

Phe

Met

Ser

Lys

His

Ser

Lys

Asp

Ala

Lys

Glu

Lys

Thr

Gly

Gln

805

810

815

Val

Thr

Gly

Thr

Ser

Asp

Phe

Val

Gly

Ser

Val

Lys

Leu

Asn

Asp

His

820

825

830

Phe

Ala

Leu

Ala

Ala

Met

Asp

Phe

Thr

Asn

Trp

Asp

Arg

Thr

Leu

Thr

835

840

845

Ala

Gln

Lys

Gly

Trp

Val

Ile

Leu

Asn

Asp

Lys

Ile

Val

Phe

Leu

Gly

850

855

860

Ser

Asn

Ile

Lys

Asn

Thr

Asn

Gly

Ile

Gly

Asn

Val

Ser

Thr

Thr

Ile

865

870

875

880

Asp

Gln

Arg

Lys

Asp

Asp

Ser

Lys

Thr

Pro

Tyr

Thr

Thr

Tyr

Val

Asn

885

890

895

Gly

Lys

Thr

Ile

Asp

Leu

Lys

Gln

Ala

Ser

Ser

Gln

Gln

Phe

Thr

Asp

900

905

910

Thr

Lys

Ser

Val

Phe

Leu

Glu

Ser

Lys

Glu

Pro

Gly

Arg

Asn

Ile

Gly

915

920

925

Tyr

Ile

Phe

Phe

Lys

Asn

Ser

Thr

Ile

Asp

Ile

Glu

Arg

Lys

Glu

Gln

930

935

940

Thr

Gly

Thr

Trp

Asn

Ser

Ile

Asn

Arg

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

Ile

945

950

955

960

Val

Ser

Asn

Pro

Phe

Ile

Thr

Ile

Ser

Gln

Lys

His

Asp

Asn

Lys

Gly

965

970

975

Asp

Ser

Tyr

Gly

Tyr

Met

Met

Val

Pro

Asn

Ile

Asp

Arg

Thr

Ser

Phe

980

985

990

Asp

Lys

Leu

Ala

Asn

Ser

Lys

Glu

Val

Glu

Leu

Leu

Glu

Asn

Ser

Ser

995

1000

1005

Lys

Gln

Gln

Val

Ile

Tyr

Asp

Lys

Asn

Ser

Gln

Thr

Trp

Ala

Val

Ile

1010

1015

1020

Lys

His

Asp

Asn

Gln

Glu

Ser

Leu

Ile

Asn

Asn

Gln

Phe

Lys

Met

Asn

1025

1030

1035

1040

Lys

Ala

Gly

Leu

Tyr

Leu

Val

Gln

Lys

Val

Gly

Asn

Asp

Tyr

Gln

Asn

1045

1050

1055

Val

Tyr

Tyr

Gln

Pro

Gln

Thr

Met

Thr

Lys

Thr

Asp

Gln

Leu

Ala

Ile

1060

1065

1070

<210> 71 <211> 1072 <212> Белок <213> Streptococcus agalactiae 18RS21 <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 71

Met

Glu

Ile

Lys

Lys

Lys

His

Arg

Ile

Met

Leu

Tyr

Ser

Ala

Leu

Ile

1

5

10

15

Leu

Gly

Thr

Ile

Leu

Val

Asn

Asn

Ser

Tyr

Gln

Ala

Lys

Ala

Glu

Glu

20

25

30

Leu

Thr

Lys

Thr

Thr

Ser

Thr

Ser

Gln

Ile

Arg

Asp

Thr

Gln

Thr

Asn

35

40

45

Asn

Ile

Glu

Val

Leu

Gln

Thr

Glu

Ser

Thr

Thr

Val

Lys

Glu

Thr

Ser

50

55

60

- 240 033472

Thr

Thr

Thr

Thr

Gln

Gln

Asp

Leu

Ser

Asn

Pro

Thr

Ala

Ser

Thr

Ala

65

70

75

80

Thr

Ala

Thr

Ala

Thr

His

Ser

Thr

Met

Lys

Gln

Val

Val

Asp

Asn

Gln

85

90

95

Thr

Gln

Asn

Lys

Glu

Leu

Val

Lys

Asn

Gly

Asp

Phe

Asn

Gln

Thr

Asn

100

105

110

Pro

Val

Ser

Gly

Ser

Trp

Ser

His

Thr

Ser

Ala

Arg

Glu

Trp

Ser

Ala

115

120

125

Trp

Ile

Asp

Lys

Glu

Asn

Thr

Ala

Asp

Lys

Ser

Pro

Ile

Ile

Gln

Arg

130

135

140

Thr

Glu

Gln

Gly

Gln

Val

Ser

Leu

Ser

Ser

Asp

Lys

Gly

Phe

Arg

Gly

145

150

155

160

Ala

Val

Thr

Gln

Lys

Val

Asn

Ile

Asp

Pro

Thr

Lys

Lys

Tyr

Glu

Val

165

170

175

Lys

Phe

Asp

Ile

Glu

Thr

Ser

Asn

Lys

Ala

Gly

Gln

Ala

Phe

Leu

Arg

180

185

190

Ile

Met

Glu

Lys

Lys

Asp

Asn

Asn

Thr

Arg

Leu

Trp

Leu

Ser

Glu

Met

195

200

205

Thr

Ser

Gly

Thr

Thr

Asn

Lys

His

Thr

Leu

Thr

Lys

Ile

Tyr

Asn

Pro

210

215

220

Lys

Leu

Asn

Val

Ser

Glu

Val

Thr

Leu

Glu

Leu

Tyr

Tyr

Glu

Lys

Gly

225

230

235

240

Thr

Gly

Ser

Ala

Thr

Phe

Asp

Asn

Ile

Ser

Met

Lys

Ala

Lys

Gly

Pro

245

250

255

Lys

Asp

Ser

Glu

His

Pro

Gln

Pro

Val

Thr

Thr

Gln

Ile

Glu

Glu

Ser

260

265

270

Val

Asn

Thr

Ala

Leu

Asn

Lys

Asn

Tyr

Val

Phe

Asn

Lys

Ala

Asp

Tyr

275

280

285

Gln

Tyr

Thr

Leu

Thr

Asn

Pro

Ser

Leu

Gly

Lys

Ile

Val

Gly

Gly

Ile

290

295

300

Leu

Tyr

Pro

Asn

Ala

Thr

Gly

Ser

Thr

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Asp

Lys

305

310

315

320

Ser

Gly

Lys

Ile

Ile

Lys

Glu

Val

Pro

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Ser

Thr

325

330

335

Glu

Asp

Lys

Phe

Thr

Lys

Leu

Leu

Asp

Lys

Trp

Asn

Asp

Val

Thr

Ile

340

345

350

Gly

Asn

His

Val

Tyr

Asp

Thr

Asn

Asp

Ser

Asn

Met

Gln

Lys

Ile

Asn

355

360

365

Gln

Lys

Leu

Asp

Glu

Thr

Asn

Ala

Lys

Asn

Ile

Lys

Thr

Ile

Lys

Leu

370

375

380

Asp

Ser

Asn

His

Thr

Phe

Leu

Trp

Lys

Asp

Leu

Asp

Asn

Leu

Asn

Asn

385

390

395

400

Ser

Ala

Gln

Leu

Thr

Ala

Thr

Tyr

Arg

Arg

Leu

Glu

Asp

Leu

Ala

Lys

405

410

415

Gln

Ile

Thr

Asn

Pro

His

Ser

Thr

Ile

Tyr

Lys

Asn

Glu

Lys

Ala

Ile

420

425

430

Arg

Thr

Val

Lys

Glu

Ser

Leu

Ala

Trp

Leu

His

Gln

Asn

Phe

Tyr

Asn

435

440

445

Val

Asn

Lys

Asp

Ile

Glu

Gly

Ser

Ala

Asn

Trp

Trp

Asp

Phe

Glu

Ile

450

455

460

Gly

Val

Pro

Arg

Ser

Ile

Thr

Ala

Thr

Leu

Ala

Leu

Met

Asn

Asn

Tyr

465

470

475

480

Phe

Thr

Asp

Ala

Glu

Ile

Lys

Thr

Tyr

Thr

Asp

Pro

Ile

Glu

His

Phe

485

490

495

Val

Pro

Asp

Ala

Gly

Tyr

Phe

Arg

Lys

Thr

Leu

Asp

Asn

Pro

Phe

Lys

500

505

510

Ala

Leu

Gly

Gly

Asn

Leu

Val

Asp

Met

Gly

Arg

Val

Lys

Ile

Ile

Glu

515

520

525

Gly

Leu

Leu

Arg

Lys

Asp

Asn

Thr

Ile

Ile

Glu

Lys

Thr

Ser

His

Ser

530

535

540

Leu

Lys

Asn

Leu

Phe

Thr

Thr

Ala

Thr

Lys

Ala

Glu

Gly

Phe

Tyr

Ala

545

550

555

560

Asp

Gly

Ser

Tyr

Ile

Asp

His

Thr

Asn

Val

Ala

Tyr

Thr

Gly

Ala

Tyr

- 241 033472

565

Leu Ile Asp Gly Leu Thr

580 585

Tyr Lys Ile Ser Asn Gln

600

Gln Ser Phe Leu Pro Leu

615

Arg Gly Arg Ser Ile Ser

630

Val Glu Val Leu Arg Gly

645

Glu Arg Asn Leu Asp Leu

660 665

Asn Lys Phe Tyr Asn Val

680

Ala Asn Met Asn Lys Met

695

Leu Lys Ser Asn Leu Ser

710

Tyr Asn Ala Glu Lys Asp

725

Arg Thr Leu Asn Tyr Glu

740 745

Tyr Thr Gly Asp Gly Met

760

Tyr Ser Asn His Phe Trp

775

Thr Thr Glu Lys Asp Ala

790

Ser Lys His Ser Lys Asp

805

Thr Ser Asp Phe Val Gly

820 825

Ala Ala Met Asp Phe Thr

840

Gly Trp Val Ile Leu Asn

855

Lys Asn Thr Asn Gly Ile

870

Lys Asp Asp Ser Lys Thr

885

Ile Asp Leu Lys Gln Ala

900 905

Val Phe Leu Glu Ser Lys

920

Phe Lys Asn Ser Thr Ile

935

Trp Asn Ser Ile Asn Arg

950

Pro Phe Ile Thr Ile Ser

965

Gly Tyr Met Met Val Pro

980 985

Ala Asn Ser Lys Glu Val

1000

Val Ile Tyr Asp Lys Asn

1015

Asn Gln Glu Ser Leu Ile

1030

Leu Tyr Leu Val Gln Lys

1045

Gln Pro Gln Thr Met Thr

1060 1065

Gly Asn Val

Glu Thr Asp

595

Trp Ile Asn

610

Asp Met Ser

625

Ala Ala Ala

Ser Asn Glu

Ile Thr Ser

675

Ser Asp Ile

690

Thr Lys Pro

705

Leu Ala Tyr

His Ser Lys

Arg Gly Trp

755

Gln Ser His

770

Met Ala Gly

785

Glu Phe Met

Val Thr Gly

Phe Ala Leu

835

Ala Gln Lys

850

Ser Asn Ile

865

Asp Gln Arg

Gly Lys Thr

Thr Lys Ser

915

Tyr Ile Phe

930

Thr Gly Thr

945

Val Ser Asn

Asp Ser Tyr

Asp Lys Leu

995

Lys Gln Gln

1010

Lys His Asp

1025

Lys Ala Gly

Val Tyr Tyr

570 575

Gln Leu Leu Pro Ile Ile Gln

590

Glu Leu Asp Met Val Tyr Lys

605

Ile Val Lys Gly Glu Leu Met

620

Arg Glu Ala Ala Ser Ser His

635 640

Phe Leu Arg Leu Ala Asn Met 650 655

Ile Ser Thr Ile Lys Thr Ile

670

Phe Asn Asn Leu Lys Ser Tyr

685

Leu Asn Asp Ser Thr Val Ala

700

Thr Phe Asn Ser Met Asp Arg

715 720

Phe Gly Phe Ala Leu Ser Leu 730 735

Gly Met Asn Asp Glu Asn Thr

750

Phe Tyr Leu Tyr Asn Ser Asp

765

Pro Thr Val Asn Pro Tyr Lys

780

Lys Arg Glu Asp Thr Thr Lys

795 800

Ala Lys Glu Lys Thr Gly Gln 810 815

Ser Val Lys Leu Asn Asp His

830

Asn Trp Asp Arg Thr Leu Thr

845

Asp Lys Ile Val Phe Leu Gly

860

Gly Asn Val Ser Thr Thr Ile

875 880

Pro Tyr Thr Thr Tyr Val Asn 890 895

Ser Ser Gln Gln Phe Thr Asp

910

Glu Pro Gly Arg Asn Ile Gly

925

Asp Ile Glu Arg Lys Glu Gln

940

Thr Ser Lys Asn Thr Ser Ile

955 960

Gln Lys His Asp Asn Lys Gly 970 975

Asn Ile Asp Arg Thr Ser Phe

990

Glu Leu Leu Glu Asn Ser Ser 1005

Ser Gln Thr Trp Ala Val Ile 1020

Asn Asn Gln Phe Lys Met Asn

1035 1040

Val Gly Asn Asp Tyr Gln Asn 1050 1055

Lys Thr Asp Gln Leu Ala Ile

1070

- 242 033472 <210> 72 <211> 1081 <212> Белок <213> Streptococcus agalactiae серотип Ia <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 72

Met

Glu

Ile

Lys

Lys

Lys

His

Arg

Ile

Met

Leu

Tyr

Ser

Ala

Leu

Ile

1

5

10

15

Leu

Gly

Thr

Ile

Leu

Val

Asn

Asn

Ser

Tyr

Gln

Ala

Lys

Ala

Glu

Glu

20

25

30

Phe

Thr

Lys

Thr

Thr

Ser

Thr

Ser

Gln

Ile

Arg

Asp

Thr

Gln

Thr

Asn

35

40

45

Asn

Val

Glu

Val

Pro

Gln

Thr

Glu

Ser

Thr

Thr

Val

Lys

Gly

Thr

Ser

50

55

60

Thr

Thr

Thr

Thr

Gln

Gln

Asp

Leu

Ser

Asn

Ser

Thr

Ala

Ser

Thr

Ala

65

70

75

80

Thr

Ala

Thr

Ala

Thr

His

Ser

Thr

Met

Lys

Gln

Val

Val

Asp

Asn

Gln

85

90

95

Thr

Gln

Asn

Lys

Glu

Leu

Val

Lys

Asn

Gly

Asp

Phe

Lys

Glu

Lys

Ile

100

105

110

Ile

Asp

Lys

Lys

Ile

Asp

Lys

Lys

Ser

Gln

Trp

Thr

Asn

Leu

Tyr

Gly

115

120

125

Ala

Lys

Asp

Trp

Asn

Thr

Tyr

Ile

Asp

Gln

Thr

Lys

Ser

Val

Asn

Lys

130

135

140

Ser

Pro

Ile

Ile

Gln

Arg

Thr

Glu

Gln

Gly

Gln

Val

Ser

Leu

Ser

Ser

145

150

155

160

Asp

Lys

Gly

Phe

Arg

Gly

Ala

Val

Thr

Gln

Lys

Val

Asn

Ile

Asp

Pro

165

170

175

Thr

Lys

Lys

Tyr

Glu

Val

Lys

Phe

Asp

Ile

Glu

Thr

Ser

Asn

Lys

Val

180

185

190

Gly

Gln

Ala

Phe

Leu

Arg

Ile

Met

Lys

Lys

Lys

Asp

Lys

Asn

Thr

Arg

195

200

205

Leu

Trp

Leu

Ser

Glu

Met

Thr

Ser

Gly

Thr

Thr

Asn

Lys

His

Thr

Leu

210

215

220

Thr

Lys

Ile

Tyr

Asn

Pro

Lys

Leu

Asn

Val

Ser

Glu

Val

Thr

Leu

Glu

225

230

235

240

Leu

Tyr

Tyr

Glu

Lys

Gly

Thr

Gly

Ser

Val

Thr

Phe

Asp

Asn

Ile

Ser

245

250

255

Met

Lys

Ala

Lys

Gly

Pro

Lys

Asp

Ser

Glu

His

Pro

Gln

Pro

Val

Thr

260

265

270

Thr

Gln

Ile

Glu

Glu

Ser

Val

Asn

Thr

Ala

Leu

Asn

Lys

Asn

Tyr

Val

275

280

285

Phe

Asn

Lys

Ala

Asp

Tyr

Gln

Tyr

Thr

Leu

Thr

Asn

Pro

Ser

Leu

Gly

290

295

300

Lys

Ile

Val

Gly

Gly

Ile

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ala

Thr

Gly

Ser

Thr

Thr

305

310

315

320

Val

Lys

Ile

Ser

Asp

Lys

Ser

Gly

Lys

Ile

Ile

Lys

Glu

Val

Pro

Leu

325

330

335

Ser

Val

Thr

Ala

Ser

Thr

Glu

Asp

Asn

Phe

Thr

Lys

Leu

Leu

Asp

Lys

340

345

350

Trp

Asn

Asp

Val

Thr

Ile

Gly

Asn

His

Val

Tyr

Asp

Thr

Asn

Asp

Ser

355

360

365

Asn

Met

Gln

Lys

Leu

Asn

Gln

Lys

Leu

Asp

Glu

Thr

Asn

Ala

Lys

Asn

370

375

380

Ile

Lys

Asp

Ile

Lys

Leu

Asp

Ser

Asn

Arg

Thr

Phe

Leu

Trp

Glu

Asp

385

390

395

400

Leu

Lys

Gly

Leu

Asn

Asn

Ser

Ala

Gln

Leu

Thr

Ala

Thr

Tyr

Arg

Arg

405

410

415

- 243 033472

Leu Glu

Lys Asn

His Gln

450 Trp Trp 465

Ala Leu

Asp Pro

Leu Val

Arg Val

530 Lys Lys 545

Ala Glu

Ala Tyr

Leu Leu

Leu Asp

610

Val Lys 625

Glu Ala

Leu Arg

Ser Thr

Asn Asn

690 Asn Asp 705

Phe Asn

Gly Phe

Met Asn

Tyr Leu

770

Thr Val

785

Arg Glu

Lys Asn

Val Gly

Phe Thr

850

Leu Asn

865

Gly Val

Lys Thr

Gln Ala

Asp Leu

420

Glu Lys

435

Asn Phe

Asp Phe

Met Asn

Ile Glu

500

Asn Pro 515

Lys Ile

Thr Ser

Gly Phe

Thr Gly

580

Pro Ile 595

Met Val

Gly Glu

Ala Ser

Leu Ala

660 Ile Lys 675

Leu Lys

Ser Thr

Ser Met

Ala Leu

740

Asp Glu 755

Tyr Asn

Asn Pro

Asp Thr

Ser Lys

820

Ser Val 835

Asn Trp

Asp Lys

Gly Asn

Pro Tyr

900

Ser Ser

Ala Lys

Ala Ile

Tyr Asn

Glu Ile

470 Asn Tyr 485

His Phe

Phe Lys

Ile Glu

His Ser

550 Tyr Ala 565 Ala Tyr

Ile Gln

Tyr Lys

Leu Met

630

Ser His 645

Asn Met

Thr Ile

Ser Tyr

Val Ala

710 Asp Arg 725

Ser Leu

Asn Thr

Ser Asp

Tyr Lys

790

Ile Lys

805

Val Met

Lys Leu

Asp Arg

Ile Val

870

Val Ser 885

Thr Thr

Gln Gln

Gln Ile

Arg Thr

440

Val Asn

455

Gly Val

Phe Thr

Val Pro

Ala Leu

520

Gly Leu 535

Leu Lys

Asp Gly

Gly Asn

Glu Thr

600

Trp Ile

615

Asp Met

Ala Ala

Ser Asn

Ile Thr

680 Ser Asp 695

Thr Lys

Leu Ala

His Ser

Arg Gly

760

Gln Ser 775

Met Ala

Lys Leu

Thr Gly

Asn Asp

840

Thr Leu 855

Phe Leu

Thr Thr

Tyr Val

Phe Thr

Thr Asn

425

Val Lys

Lys Asp

Pro Arg

Asp Ala

490 Asp Ala 505 Gly Gly

Leu Arg

Asn Leu

Ser Tyr

570

Val Leu 585

Asp Tyr

Asn Gln

Ser Arg

Ala Val

650

Glu Glu

665

Ser Asn

Ile Ala

Pro Leu

Tyr Tyr

730 Lys Arg 745

Trp Tyr

His Tyr

Gly Thr

Met Asn

810

Gln Val

825

His Phe

Thr Ala

Gly Ser

Ile Asp

890 Asn Gly 905

Asp Thr

Pro His

Glu Ser

Ile Glu

460

Ser Ile 475

Glu Ile

Gly Tyr

Asn Leu

Lys Asp

540

Phe Thr

555

Ile Asp

Ile Asp

Lys Ile

Ser Phe

620

Gly Arg 635

Glu Val

Arg Asn

Lys Phe

Asn Met

700

Lys Ser 715

Asn Ala

Thr Leu

Thr Gly

Ser Asn

780

Thr Glu 795

Arg Tyr

Thr Gly

Ala Leu

Gln Lys

860

Asn Ile

875

Gln Arg

Lys Thr

Lys Ser

Ser Thr

430

Leu Ala 445

Gly Ser

Thr Ala

Lys Thr

Phe Arg

510 Val Asp 525

Asn Thr

Thr Ala

His Thr

Gly Leu

590

Ser Asn

605

Leu Pro

Ser Ile

Leu Arg

Leu Asp

670 Tyr Asn 685

Asn Lys

Asn Leu

Glu Lys

Asn Tyr

750 Asp Gly 765

His Phe

Lys Asp

Asp Lys

Thr Ser

830

Ala Ala 845

Gly Trp

Lys Asn

Lys Asp

Val Asp

910 Val Phe

Ile Tyr

Trp Leu

Ala Asn

Thr Leu

480

Tyr Thr 495

Lys Thr

Met Gly

Ile Ile

Thr Lys

560

Asn Val 575

Thr Gln

Gln Glu

Leu Ile

Ser Arg

640

Gly Phe

655

Leu Lys

Val Phe

Leu Leu

Ser Thr

720 Asp Phe 735 Glu Gly

Met Phe

Trp Pro

Thr Gly

800

Thr Asn 815

Asp Phe

Met Asp

Val Ile

Thr Asn

880

Asp Ser 895

Leu Lys

Leu Glu

- 244 033472

915

920

925

Ser

Lys

Glu

Pro

Gly

Arg

Asn

Ile

Gly

Tyr

Ile

Phe

Phe

Lys

Asn

Ser

930

935

940

Thr

Ile

Asp

Ile

Glu

Arg

Lys

Glu

Gln

Thr

Gly

Thr

Trp

Asn

Ser

Ile

945

950

955

960

Asn

Arg

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

Ile

Val

Ser

Asn

Pro

Phe

Ile

Thr

965

970

975

Ile

Ser

Gln

Lys

His

Asp

Asn

Lys

Gly

Asp

Ser

Tyr

Gly

Tyr

Met

Met

980

985

990

Val

Pro

Asn

Ile

Asp

Arg

Thr

Ser

Phe

Asp

Lys

Leu

Ala

Asn

Ser

Lys

995

1000

1005

Glu

Val

Glu

Leu

Leu

Glu

Asn

Ser

Ser

Lys

Gln

Gln

Val

Ile

Tyr

Asp

1010

1015

1020

Lys

Asn

Ser

Gln

Thr

Trp

Ala

Val

Ile

Lys

His

Asp

Asn

Gln

Glu

Ser

1025

1030

1035

1040

Leu

Ile

Asn

Asn

Gln

Phe

Lys

Met

Asn

Lys

Ala

Gly

Leu

Tyr

Leu

Val

1045

1050

1055

Gln

Lys

Val

Gly

Asn

Asp

Tyr

Gln

Asn

Val

Tyr

Tyr

Gln

Pro

Gln

Thr

1060

1065

1070

Met

Thr

Lys

Thr

Asp

Gln

Leu

Ala

Ile

1075

1080

<210> 73 <211> 984 <212> Белок <213> Streptococcus agalactiae серотип III <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 73

Met 1

Lys

Gln Val

Val 5

Asp

Asn

Gln

Thr Gln Asn 10

Lys

Glu

Leu

Val 15

Lys

Asn

Gly

Asp

Phe

Asn

Gln

Thr

Asn

Pro

Val

Ser

Gly

Ser

Trp

Ser

His

20

25

30

Thr

Ser

Ala

Arg

Glu

Trp

Ser

Ala

Trp

Ile

Asp

Lys

Glu

Asn

Thr

Ala

35

40

45

Asp

Lys

Ser

Pro

Ile

Ile

Gln

Arg

Thr

Glu

Gln

Gly

Gln

Val

Ser

Leu

50

55

60

Ser

Ser

Asp

Lys

Gly

Phe

Arg

Gly

Ala

Val

Thr

Gln

Lys

Val

Asn

Ile

65

70

75

80

Asp

Pro

Thr

Lys

Lys

Tyr

Glu

Val

Lys

Phe

Asp

Ile

Glu

Thr

Ser

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Gly

Gln

Ala

Phe

Leu

Arg

Ile

Met

Glu

Lys

Lys

Asp

Asn

Asn

100

105

110

Thr

Arg

Leu

Trp

Leu

Ser

Glu

Met

Thr

Ser

Gly

Thr

Thr

Asn

Lys

His

115

120

125

Thr

Leu

Thr

Lys

Ile

Tyr

Asn

Pro

Lys

Leu

Asn

Val

Ser

Glu

Val

Thr

130

135

140

Leu

Glu

Leu

Tyr

Tyr

Glu

Lys

Gly

Thr

Gly

Ser

Ala

Thr

Phe

Asp

Asn

145

150

155

160

Ile

Ser

Met

Lys

Ala

Lys

Gly

Pro

Lys

Asp

Ser

Glu

His

Pro

Gln

Pro

165

170

175

Val

Thr

Thr

Gln

Ile

Glu

Glu

Ser

Val

Asn

Thr

Ala

Leu

Asn

Lys

Asn

180

185

190

Tyr

Val

Phe

Asn

Lys

Ala

Asp

Tyr

Gln

Tyr

Thr

Leu

Thr

Asn

Pro

Ser

195

200

205

Leu

Gly

Lys

Ile

Val

Gly

Gly

Ile

Leu

Tyr

Pro

Asn

Ala

Thr

Gly

Ser

210

215

220

Thr

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Asp

Lys

Ser

Gly

Lys

Ile

Ile

Lys

Glu

Val

225

230

235

240

Pro

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Ser

Thr

Glu

Asp

Lys

Phe

Thr

Lys

Leu

Leu

- 245 033472

245

Asp Lys Trp Asn Asp

260

Asp Ser Asn Met Gln

275

Lys Asn Ile Lys Thr

290

Lys Asp Leu Asp Asn

305

Arg Arg Leu Glu Asp

325

Ile Tyr Lys Asn Glu

340

Trp Leu His Gln Asn

355

Ala Asn Trp Trp Asp

370

Thr Leu Ala Leu Met

385

Tyr Thr Asp Pro Ile

405 Lys Thr Leu Asp Asn 420

Met Gly Arg Val Lys

435

Ile Ile Glu Lys Thr

450

Thr Lys Ala Glu Gly

465

Asn Val Ala Tyr Thr

485

Thr Gln Leu Leu Pro

500

Gln Glu Leu Asp Met

515

Leu Ile Val Lys Gly

530

Ser Arg Glu Ala Ala

545

Gly Phe Leu Arg Leu

565

Leu Lys Ser Thr Ile

580

Val Phe Asn Asn Leu

595

Met Leu Asn Asp Ser

610

Ser Thr Phe Asn Ser

625

Asp Phe Gly Phe Ala

645

Glu Gly Met Asn Asp

660

Met Phe Tyr Leu Tyr

675

Trp Pro Thr Val Asn

690

Ala Lys Arg Glu Asp

705

Asp Ala Lys Glu Lys

725

Gly Ser Val Lys Leu

740

250 Val Thr Ile Gly Asn

265

Lys Ile Asn Gln Lys

280

Ile Lys Leu Asp Ser

295

Leu Asn Asn Ser Ala

310

Leu Ala Lys Gln Ile

330

Lys Ala Ile Arg Thr

345

Phe Tyr Asn Val Asn

360

Phe Glu Ile Gly Val

375

Asn Asn Tyr Phe Thr

390

Glu His Phe Val Pro

410

Pro Phe Lys Ala Leu

425

Ile Ile Glu Gly Leu

440

Ser His Ser Leu Lys

455

Phe Tyr Ala Asp Gly

470

Gly Ala Tyr Gly Asn

490

Ile Ile Gln Glu Thr

505

Val Tyr Lys Trp Ile

520

Glu Leu Met Asp Met

535

Ser Ser His Ala Ala

550

Ala Asn Met Ser Asn

570

Lys Thr Ile Ile Thr

585

Lys Ser Tyr Ser Asp

600

Thr Val Ala Thr Lys

615

Met Asp Arg Leu Ala

630

Leu Ser Leu His Ser

650

Glu Asn Thr Arg Asp

665

Asn Ser Asp Gln Ser

680

Pro Tyr Lys Met Ala

695

Thr Thr Lys Glu Phe

710

Thr Gly Gln Val Thr

730

Asn Asp His Phe Ala

745

255 His Val Tyr Asp Thr

270

Leu Asp Glu Thr Asn

285

Asn His Thr Phe Leu

300

Gln Leu Thr Ala Thr

315

Thr Asn Pro His Ser

335

Val Lys Glu Ser Leu

350

Lys Asp Ile Glu Gly

365

Pro Arg Ser Ile Thr

380

Asp Ala Glu Ile Lys

395

Asp Ala Gly Tyr Phe

415

Gly Gly Asn Leu Val

430

Leu Arg Lys Asp Asn

445

Asn Leu Phe Thr Thr

460

Ser Tyr Ile Asp His

475

Val Leu Ile Asp Gly

495

Asp Tyr Lys Ile Ser

510

Asn Gln Ser Phe Leu

525

Ser Arg Gly Arg Ser

540

Ala Val Glu Val Leu

555

Glu Glu Arg Asn Leu

575

Ser Asn Lys Phe Tyr

590

Ile Ala Asn Met Asn

605

Pro Leu Lys Ser Asn

620

Tyr Tyr Asn Ala Glu

635

Lys Arg Thr Leu Asn

655

Trp Tyr Thr Gly Asp

670

His Tyr Ser Asn His

685

Gly Thr Thr Glu Lys

700

Met Ser Lys His Ser

715

Gly Thr Ser Asp Phe

735

Leu Ala Ala Met Asp

750

Asn

Ala

Trp

Tyr

320

Thr

Ala

Ser

Ala

Thr

400

Arg

Asp

Thr

Ala

Thr

480

Leu

Asn

Pro

Ile

Arg

560

Asp

Asn

Lys

Leu

Lys

640

Tyr

Gly

Phe

Asp

Lys

720

Val

Phe

- 246 033472

Thr Asn Trp Asp Arg

Thr

Leu

Thr 760

Ala Gln

Lys

Gly

Trp 765

Val

Ile

Leu

755

Asn

Asp

Lys

Ile

Val

Phe

Leu

Gly

Ser

Asn

Ile

Lys

Asn

Thr

Asn

Gly

770

775

780

Ile

Gly

Asn

Val

Ser

Thr

Thr

Ile

Asp

Gln

Arg

Lys

Asp

Asp

Ser

Lys

785

790

795

800

Thr

Pro

Tyr

Thr

Thr

Tyr

Val

Asn

Gly

Lys

Thr

Ile

Asp

Leu

Lys

Gln

805

810

815

Ala

Ser

Ser

Gln

Gln

Phe

Thr

Asp

Thr

Lys

Ser

Val

Phe

Leu

Glu

Ser

820

825

830

Lys

Glu

Pro

Gly

Arg

Asn

Ile

Gly

Tyr

Ile

Phe

Phe

Lys

Asn

Ser

Thr

835

840

845

Ile

Asp

Ile

Glu

Arg

Lys

Glu

Gln

Thr

Gly

Thr

Trp

Asn

Ser

Ile

Asn

850

855

860

Arg

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

Ile

Val

Ser

Asn

Pro

Phe

Ile

Thr

Ile

865

870

875

880

Ser

Gln

Lys

His

Asp

Asn

Lys

Gly

Asp

Ser

Tyr

Gly

Tyr

Met

Met

Val

885

890

895

Pro

Asn

Ile

Asp

Arg

Thr

Ser

Phe

Asp

Lys

Leu

Ala

Asn

Ser

Lys

Glu

900

905

910

Val

Glu

Leu

Leu

Glu

Asn

Ser

Ser

Lys

Gln

Gln

Val

Ile

Tyr

Asp

Lys

915

920

925

Asn

Ser

Gln

Thr

Trp

Ala

Val

Ile

Lys

His

Asp

Asn

Gln

Glu

Ser

Leu

930

935

940

Ile

Asn

Asn

Gln

Phe

Lys

Met

Asn

Lys

Ala

Gly

Leu

Tyr

Leu

Val

Gln

945

950

955

960

Lys

Val

Gly

Asn

Asp

Tyr

Gln

Asn

Val

Tyr

Tyr

Gln

Pro

Gln

Thr

Met

965

970

975

Thr

Lys

Thr

Asp

Gln

Leu

Ala

Ile

980

<210> 74 <211> 807 <212> Белок <213> Staphylococcus aureus (штамм COL) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 74

Met

Thr

Tyr

Arg

Ile

Lys

Lys

Trp

Gln

Lys

Leu

Ser

Thr

Ile

Thr

Leu

1

5

10

15

Leu

Met

Ala

Gly

Val

Ile

Thr

Leu

Asn

Gly

Gly

Glu

Phe

Arg

Ser

Val

20

25

30

Asp

Lys

His

Gln

Ile

Ala

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Val

Gln

Thr

Pro

Asp

35

40

45

Tyr

Glu

Lys

Leu

Arg

Asn

Thr

Trp

Leu

Asp

Val

Asn

Tyr

Gly

Tyr

Asp

50

55

60

Lys

Tyr

Asp

Glu

Asn

Asn

Pro

Asp

Met

Lys

Lys

Lys

Phe

Asp

Ala

Thr

65

70

75

80

Glu

Lys

Glu

Ala

Thr

Asn

Leu

Leu

Lys

Glu

Met

Lys

Thr

Glu

Ser

Gly

85

90

95

Arg

Lys

Tyr

Leu

Trp

Ser

Gly

Ala

Glu

Thr

Leu

Glu

Thr

Asn

Ser

Ser

100

105

110

His

Met

Thr

Arg

Thr

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

Lys

Ile

Ala

Glu

Ala

Met

115

120

125

Arg

Asn

Pro

Lys

Thr

Thr

Leu

Asn

Thr

Asp

Glu

Asn

Lys

Lys

Lys

Val

130

135

140

Lys

Asp

Ala

Leu

Glu

Trp

Leu

His

Lys

Asn

Ala

Tyr

Gly

Lys

Glu

Pro

145

150

155

160

Asp

Lys

Lys

Val

Lys

Glu

Leu

Ser

Glu

Asn

Phe

Thr

Lys

Thr

Thr

Gly

165

170

175

- 247 033472

Lys Asn

Ser Leu

Glu Lys

210

Asp Lys 225

Asn Leu

Glu Asp

Phe Thr

Tyr Lys

290 Ala Tyr 305 Ile Lys

Lys Ser

Met Met

Ser His

370

Asp Ala 385

Ser Ser

Ser Tyr

Ile Ser

Asp Arg

450

Ser Met 465

Asn Leu

Ser Asp

Lys Arg

Thr Asp

530 Asp Asp 545

Thr Leu

Phe Leu

Thr Thr

Asp Lys

610

Leu Glu

625

Lys Pro

Glu Ile

Glu Val

Thr Asn

180

Thr Asn

195

Lys Lys

Ile Leu

Val Asp

Lys Asp

260

Tyr Val 275

Asp Gly

Gly Val

Glu Thr

Trp Ile

340

Asp Leu

355

Ser Ala

Met Asp

Val Glu

Ser Asp

420

Lys Asn

435

Val Thr

Thr Ser

Lys Gly

Val Lys

500

Leu Ser

515

Asp Lys

Gln His

Thr Ala

Gly Thr

580

Ile Glu 595

Gln Thr

Ser Thr

Lys Ile

Asn Lys

660

Thr Gln

Leu Asn

Thr Leu

Phe Thr

Ser Ser

230

Ile Ser

245

Met Met

Gln Asp

Ser Tyr

Val Leu

310

Pro Phe

325

Asp Asp

Ser Arg

Ser Ala

Asp Ser

390 Ser Asp 405

Ile Asp

Gly Leu

Tyr His

Lys Asn

470

Trp His

485

His Tyr

Gly Thr

Lys Ser

Ala Ser

550 Lys Lys 565 Gly Ile

Asn Arg

Thr Asn

Asp Thr

630

Thr Val

645

Ser Gln

Lys His

Trp Trp

Ile Leu

200

Ala Pro

215

Val Gly

Lys Val

Lys Lys

Ser Ala

280

Ile Asp

295

Leu Glu

Asn Asp

Gly Phe

Gly Arg

360

Thr Val

375

Thr Lys

Ser Ser

Lys Met

Thr Gln

440 Asn Lys 455

Val Ala

Thr Gly

His Asp

Thr Thr

520

Ser Lys

535

Ile Gly

Ser Tyr

Lys Ser

Lys Ala

600

Ser Asp

615

Lys Lys

Lys Lys

Lys Asp

Ser Asn

Asp Tyr

185

Leu Asn

Ile Lys

Lys Ala

Lys Leu

250

Ser Ile

265

Thr Gly

His Gln

Gly Ile

Lys Thr

330

Met Pro

345

Ala Ile

Met Lys

Ala Lys

Tyr Lys

410

Lys Ser

425

Gln Leu

Asp Leu

Arg Tyr

Ala Gly

490

Asn Phe

505

Leu Asp

Thr Phe

Met Asp

Phe Ile

570 Thr Asp 585 Asn Gly

Asn Gln

Asn Ile

Glu Ser

650

Thr Gln

665

Ser Asp

Glu Ile

Asp Gln

Thr Phe

220

Glu Leu

235

Leu Glu

Asp Ser

Lys Glu

Asp Val

300

Ser Gln

315

Gln Asn

Leu Ile

Ser Arg

Ser Leu

380

Tyr Lys 395

Gln Asn

Leu Met

Lys Ile

Asp Phe

460

Glu Ser 475

Met Ser

Trp Val

Asn Glu

Val Gly

540

Phe Glu

555

Leu Asn

Ser Ser

Tyr Thr

Glu Asn

620

Gly Tyr 635

His Thr

Lys Thr

Asn Lys

Gly Thr

190

Phe Ser

205

Ala Pro

Ala Lys

Cys Ile

Phe Asn

270

Arg Asn

285

Pro Tyr

Met Met

Asp Thr

Tyr Lys

350

Glu Asn

365

Leu Arg

Lys Ile

Asp Tyr

Thr Asp

430

Tyr Asn

445

Ala Phe

Ile Asn

Tyr Leu

Thr Ala

510

Ile Leu

525

Gly Thr

Asn Gln

Asp Lys

Lys Asn

590

Leu Tyr

605

Asn Ser

His Phe

Gly Lys

Asp Glu

670

Tyr Gly

Pro Lys

Asn Glu

Asp Ser

Gly Gly

240

Ile Glu

255

Lys Val

Gly Phe

Thr Gly

Pro Met

320

Thr Leu

335

Gly Glu

Glu Thr

Leu Ser

Val Lys

400

Leu Asn

415

Asn Ser

Asp Met

Gly Leu

Gly Glu

480

Tyr Asn

495

Asp Met

Lys Asp

Lys Val

Asp Lys

560

Ile Val

575

Pro Val

Thr Asp

Val Phe

Leu Asn

640

Trp Lys

655

Tyr Tyr

Tyr Val

- 248 033472

Leu Tyr

690

Val Thr

705

Glu Ser

Asp Ile

Leu Lys

Glu Ser

770

Gly Tyr

785

Val His

675

Pro Gly

Val Val

Val Trp

Asn Asn

740

Lys Lys

755

Thr Asn

Ser Ile

Phe Glu

Leu Ser

Lys Gln

710

Ala Gly

725

Thr Lys

Asp Asp

Ser Ala

Thr Asn

790

Leu Thr

805

680 Lys Asp 695

Glu Asp

Val Asn

Val Glu

Asn Thr

760

Ser Asp

775

Lys Asn

Lys

Val Phe

Asp Phe

Tyr Ser

730 Val Lys 745 Tyr Glu

Ile Glu

Thr Ser

Lys Thr

700

His Val

715

Asn Ser

Ala Lys

Cys Ser

Ser Lys

780

Thr Ser

795

685

Lys Lys

Val Lys

Thr Gln

Gly Met

750

Phe Tyr

765

Ile Ser

Asn Glu

Asp Glu

Asp Asn

720

Thr Phe

735

Phe Ile

Asn Pro

Met Thr

Ser Gly

800 <210> 75 <211> 420 <212> Белок <213> Staphylococcus aureus (штамм MRSA252) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 75

Met

Thr

Tyr

Arg

Met

Lys

Lys

Trp

Gln

Lys

Leu

Ser

Thr

Ile

Thr

Leu

1

5

10

15

Leu

Met

Ala

Gly

Val

Ile

Thr

Leu

Asn

Gly

Gly

Glu

Phe

Arg

Ser

Ile

20

25

30

Asp

Lys

His

Gln

Ile

Ala

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Val

Gln

Thr

Thr

Asp

35

40

45

Tyr

Glu

Lys

Leu

Arg

Asn

Ile

Trp

Leu

Asp

Val

Asn

Tyr

Gly

Tyr

Asp

50

55

60

Lys

Tyr

Asp

Glu

Asn

Asn

Pro

Asp

Met

Lys

Lys

Lys

Phe

Glu

Ala

Thr

65

70

75

80

Glu

Asn

Glu

Ala

Glu

Lys

Leu

Leu

Lys

Glu

Met

Lys

Thr

Glu

Ser

Asp

85

90

95

Arg

Lys

Tyr

Leu

Trp

Glu

Ser

Ser

Lys

Asp

Leu

Asp

Thr

Lys

Ser

Ala

100

105

110

Asp

Met

Thr

Arg

Thr

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

Lys

Ile

Ser

Glu

Ala

Met

115

120

125

Lys

His

Lys

Asn

Thr

Lys

Leu

Lys

Thr

Asp

Glu

Asn

Lys

Thr

Lys

Val

130

135

140

Lys

Asp

Ala

Leu

Glu

Trp

Leu

His

Lys

Asn

Ala

Tyr

Gly

Lys

Glu

Pro

145

150

155

160

Asp

Lys

Lys

Val

Ala

Asp

Leu

Thr

Ser

Asn

Phe

Lys

Asn

Lys

Thr

Ser

165

170

175

Arg

Asn

Thr

Asn

Leu

Asn

Trp

Trp

Asp

Tyr

Glu

Ile

Gly

Thr

Pro

Arg

180

185

190

Ala

Leu

Thr

Asn

Thr

Leu

Ile

Leu

Leu

Gln

Glu

Asp

Phe

Thr

Asp

Glu

195

200

205

Glu

Lys

Lys

Lys

Tyr

Thr

Ala

Pro

Ile

Lys

Thr

Phe

Ala

Pro

Asp

Ser

210

215

220

Asp

Lys

Ile

Leu

Ser

Ser

Val

Gly

Lys

Ser

Glu

Pro

Ala

Lys

Gly

Gly

225

230

235

240

Asn

Leu

Val

Asp

Ile

Ser

Lys

Val

Lys

Leu

Leu

Glu

Ser

Ile

Ile

Glu

245

250

255

Glu

Asp

Lys

Asp

Met

Met

Lys

Lys

Ser

Ile

Asp

Ser

Phe

Asn

Thr

Val

260

265

270

Phe

Thr

Tyr

Ala

Gln

Asn

Ser

Ala

Thr

Gly

Lys

Glu

Arg

Asn

Gly

Phe

- 249 033472

275

280

285

Tyr

Lys

Asp

Gly

Ser

Tyr

Ile

Asp

His

Gln

Asp

Val

Pro

Tyr

Thr

Gly

290

295

300

Ala

Tyr

Gly

Val

Val

Leu

Leu

Glu

Gly

Ile

Ser

Gln

Met

Met

Pro

Met

305

310

315

320

Ile

Lys

Glu

Thr

Pro

Phe

Asn

Asp

Ser

Asn

Gln

Asn

Asp

Thr

Thr

Leu

325

330

335

Lys

Ser

Trp

Ile

Asp

Asp

Gly

Phe

Met

Pro

Leu

Ile

Tyr

Lys

Gly

Glu

340

345

350

Met

Met

Asp

Leu

Ser

Arg

Gly

Arg

Ala

Ile

Ser

Arg

Glu

Asn

Glu

Thr

355

360

365

Ser

His

Ser

Ala

Ser

Ala

Thr

Val

Met

Lys

Ser

Leu

Leu

Arg

Leu

Ser

370

375

380

Asp

Thr

Met

Asp

Lys

Ser

Thr

Lys

Ala

Lys

Tyr

Lys

Lys

Ile

Val

Lys

385

390

395

400

Thr

Ser

Val

Glu

Ser

Asp

Ser

Ser

Tyr

Lys

Gln

Thr

Asp

Tyr

Leu

Ser

405

410

415

Ser

Tyr

Ser

Asp

420

<210> 76 <211> 806 <212> Белок <213> Staphylococcus aureus (штамм MRSA252) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 76

Met

Thr

Asn

Lys

Met

Lys

Lys

Trp

Gln

Lys

Leu

Ser

Thr

Ile

Thr

Leu

1

5

10

15

Leu

Met

Thr

Gly

Val

Ile

Ala

Leu

Asn

Asn

Gly

Glu

Phe

Arg

Asn

Val

20

25

30

Asp

Lys

His

Gln

Ile

Ala

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Val

Gln

Thr

Pro

Asp

35

40

45

Tyr

Glu

Lys

Leu

Lys

Lys

Thr

Trp

Leu

Asp

Val

Asn

Tyr

Gly

Tyr

Asp

50

55

60

Gln

Tyr

Asp

Glu

Asn

Asn

Gln

Asp

Met

Lys

Lys

Lys

Phe

Asp

Ala

Lys

65

70

75

80

Glu

Lys

Glu

Ala

Lys

Lys

Leu

Leu

Asp

Asp

Met

Lys

Thr

Asp

Thr

Asn

85

90

95

Arg

Thr

Tyr

Leu

Trp

Ser

Gly

Ala

Glu

Asn

Leu

Glu

Thr

Asn

Ser

Ser

100

105

110

His

Met

Thr

Lys

Thr

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

Lys

Ile

Ala

Glu

Ser

Met

115

120

125

Gln

His

Lys

Asn

Thr

Val

Leu

Lys

Thr

Val

Glu

Asn

Lys

Leu

Lys

Ile

130

135

140

Lys

Glu

Ala

Leu

Asp

Trp

Met

His

Lys

Asn

Val

Tyr

Gly

Lys

Asn

Pro

145

150

155

160

Ser

Gln

Lys

Val

Glu

Asp

Leu

Thr

Lys

Asn

Arg

Lys

Gly

Gln

Thr

Thr

165

170

175

Pro

Lys

Asn

Asn

Ser

Leu

Asn

Trp

Trp

Asp

Tyr

Glu

Ile

Gly

Thr

Pro

180

185

190

Arg

Ala

Leu

Thr

Asn

Thr

Leu

Leu

Leu

Met

Asp

Asp

Met

Leu

Thr

Lys

195

200

205

Asp

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Ser

Lys

Pro

Ile

Ser

Thr

Tyr

Ala

Pro

Ser

210

215

220

Ser

Asp

Lys

Ile

Leu

Ser

Ser

Val

Gly

Glu

Ser

Glu

Asp

Ala

Lys

Gly

225

230

235

240

Gly

Asn

Leu

Val

Asp

Ile

Ser

Lys

Val

Lys

Leu

Leu

Glu

Ser

Val

Ile

245

250

255

Glu

Glu

Asp

Val

Asp

Met

Leu

Lys

Lys

Ser

Ile

Asp

Ser

Phe

Asn

Lys

- 250 033472

Val Phe

Phe Tyr

290

Gly Ala 305

Met Ile

Ser Asn

Met Met

Ser His

370

Asp Thr 385

Thr Ser

Ser Tyr

Ile Ser

Asp Arg

450

Ser Met 465

Asn Leu

Ser Asp

Thr Cys

Thr Lys

530

Tyr Ala 545

Ala Lys

Thr Gly

Glu Asn

Ile Thr

610

Glu Ser

625

Pro Lys

Ile Asn

Val Thr

Tyr Pro

690

Ser Ile 705

Gly Val

Ile Asn

Lys Lys

260 Thr Tyr 275

Lys Asp

Tyr Gly

Lys Glu

Trp Ile

340

Asp Leu

355

Thr Ala

Met Asp

Val Asn

Ser Asp

420

Lys Asn

435

Val Thr

Thr Ser

Lys Gly

Val Lys

500

Leu Pro

515

Asn Asp

Ser Ile

Lys Ser

Ile Lys

580

Arg Lys 595

Thr Ser

Asn Asp

Ile Thr

Lys Ser

660

Gln Thr 675

Gly Leu

Val Lys

Phe Ala

Gly Ile

740 Lys Asp 755

Val Gln

Gly Ser

Val Val

310

Ser Pro 325

Asp Glu

Ser Arg

Ser Ala

Asp Ser

390 Ser Asp 405

Ile Ala

Asp Leu

Tyr His

Lys Asn

470

Trp His

485

His Tyr

Gly Thr

Lys Ser

Gly Met

550

Tyr Phe

565

Ser Thr

Ala Asn

Asp Val

Thr Lys

630

Val Lys 645

Gln Lys

His Asn

Ser Lys

Gln Asp

710

Gly Val

725

Thr Val

Asp Lys

Asp Ser

280

Tyr Ile

295

Leu Leu

Phe Lys

Gly Phe

Gly Arg

360

Thr Val 375

Thr Lys

Ser Ser

Lys Met

Thr Gln

440 Asn Lys 455

Ile Ala

Thr Gly

Arg Asp

Thr Thr

520

Phe Val

535

Asp Phe

Ile Leu

Asp Ser

Gly Tyr

600

Asn Ala

615

Lys Asn

Lys Glu

Lys Asp

Thr Ser

680

Ser Asp 695

Glu Asp

Asn Tyr

Glu Leu

Ala Tyr

760

265

Ala Thr

Asp His

Glu Gly

Thr Thr

330

Met Pro 345

Ala Ile

Met Lys

Thr Arg

Tyr Asn

410 Lys Lys 425

Gln Leu

Asp Leu

Arg Tyr

Ala Gly

490

Asn Phe 505

Leu Asn

Gly Gly

Glu Asn

Asn Asp

570

Ser Lys 585

Lys Leu

Gln Glu

Ile Gly

Ser His

650 Asp Lys 665

Asp Ser

Phe Lys

Phe His

Ser Asp

730

Lys Glu

745

Lys Cys

Gly Lys

Gln Asp

300

Ile Ser 315

Gln Asp

Leu Ile

Ser Arg

Ser Leu

380

Tyr Lys

395

Gln Asn

Leu Met

Lys Ile

Asp Phe

460

Glu Asn

475

Met Ser

Trp Ala

Asp Met

Thr Lys

540

Gln Asp

555

Lys Ile

Asn Pro

Phe Lys

Thr His

620 Tyr His 635 Thr Gly

Lys Asp

Lys Tyr

Ser Lys

700

Val Ile

715

Asn Thr

Lys Gly

Ser Phe

270 Gly Arg 285

Val Pro

Gln Met

Asn Ala

Tyr Lys

350

Glu Asn

365

Leu Arg

Gln Ile

Asn Tyr

Asn Asp

430

Tyr Asn

445

Ala Phe

Ile Asn

Tyr Leu

Thr Ala

510

Pro Ser 525

Leu Asn

Lys Thr

Val Phe

Val Thr

590

Asp Asp 605

Ser Val

Phe Leu

Lys Trp

Glu Tyr

670

Ala Tyr

685

Asn Asn

Lys Asp

Lys Ser

Met Phe

750 Tyr Asn 765

Asn Gly

Tyr Thr

Met Pro

320

Thr Leu 335

Gly Glu

Glu Thr

Leu Asn

Val Lys

400

Leu Asn

415

Ser Thr

Asp Met

Gly Leu

Gly Glu

480 Tyr Asn 495

Asp Met

Thr Asn

Asn Lys

Leu Thr

560

Leu Gly

575

Ser Val

Ile Glu

Phe Leu

Asp Lys

640

Ser Glu

655

Tyr Glu

Val Leu

Asn Val

Asn Asp

720 Phe Asp 735

Val Ile

Pro Glu

- 251 033472

Thr	Thr 770	Asn	Thr	Ala	Ser	Asn 775	Ile
Tyr	Thr	Ile	Thr	Asn	Lys	Ser	Val
785					790
Asn	Phe	Glu	Leu	Thr	Lys
				805

Glu	Ser	Lys	Ile 780	Phe	Ile
Ile	Asn	Ser 795	Asn	Asp	Ala

Lys Gly

Gly Val

800 <210> 77 <211> 815 <212> Белок <213> Staphylococcus aureus (штамм MSSA476) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 77

Met

Thr

Tyr

Arg

Ile

Lys

Lys

Trp

Gln

Lys

Leu

Ser

Thr

Ile

Thr

Leu

1

5

10

15

Leu

Met

Ala

Gly

Val

Ile

Thr

Leu

Asn

Gly

Gly

Glu

Phe

Arg

Ser

Ile

20

25

30

Asp

Lys

Tyr

Gln

Ile

Ala

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Val

Gln

Thr

Pro

Asp

35

40

45

Tyr

Glu

Lys

Leu

Arg

Asn

Thr

Trp

Leu

Asp

Val

Asn

Tyr

Gly

Tyr

Asp

50

55

60

Lys

Tyr

Asp

Glu

Lys

Asn

Asp

Ala

Met

Lys

Lys

Lys

Phe

Glu

Ala

Thr

65

70

75

80

Glu

Asn

Glu

Ala

Lys

Lys

Leu

Leu

Ser

Glu

Met

Lys

Thr

Glu

Ser

Asp

85

90

95

Arg

Lys

Tyr

Leu

Trp

Glu

Asn

Ser

Lys

Asp

Leu

Asp

Thr

Lys

Ser

Ala

100

105

110

Asp

Met

Thr

Arg

Thr

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

Lys

Ile

Ala

Glu

Ala

Met

115

120

125

Lys

His

Lys

Asp

Thr

Lys

Leu

Lys

Ile

Asp

Glu

Asn

Lys

Lys

Lys

Val

130

135

140

Lys

Asp

Ala

Leu

Glu

Trp

Leu

His

Lys

Asn

Ala

Tyr

Gly

Lys

Glu

Pro

145

150

155

160

Asp

Lys

Lys

Val

Ala

Asp

Leu

Thr

Ser

Asn

Phe

Lys

Asn

Lys

Thr

Ser

165

170

175

Arg

Asn

Thr

Asn

Leu

Asn

Trp

Trp

Asp

Tyr

Glu

Ile

Gly

Thr

Pro

Arg

180

185

190

Ala

Leu

Thr

Asn

Thr

Leu

Ile

Leu

Leu

Asn

Asp

Gln

Phe

Ser

Asn

Asp

195

200

205

Glu

Lys

Lys

Lys

Tyr

Thr

Ala

Pro

Ile

Lys

Thr

Phe

Ala

Pro

Glu

Ser

210

215

220

Asp

Lys

Ile

Leu

Ser

Ser

Val

Gly

Gln

Pro

Glu

Gln

Ala

Lys

Gly

Gly

225

230

235

240

Asn

Leu

Val

Asp

Ile

Ala

Lys

Val

Lys

Leu

Leu

Glu

Ser

Ile

Ile

Glu

245

250

255

Glu

Asp

Lys

Asp

Ile

Thr

Lys

Asn

Ser

Ile

Asp

Ala

Phe

Asn

Lys

Val

260

265

270

Phe

Thr

Tyr

Val

Gln

Ser

Asn

Ala

Thr

Gly

Lys

Glu

Arg

Asn

Gly

Phe

275

280

285

Tyr

Lys

Asp

Gly

Ser

Tyr

Ile

Asp

His

Gln

Asp

Val

Pro

Tyr

Thr

Gly

290

295

300

Ala

Tyr

Gly

Val

Val

Leu

Leu

Glu

Gly

Ile

Ser

Gln

Met

Met

Pro

Met

305

310

315

320

Ile

Lys

Glu

Thr

Pro

Phe

Asn

Asp

Lys

Thr

Gln

Asn

Asp

Thr

Thr

Leu

325

330

335

Lys

Ser

Trp

Ile

Asp

Asp

Gly

Phe

Met

Pro

Leu

Ile

Tyr

Lys

Gly

Glu

340

345

350

Met

Met

Asp

Leu

Ser

Arg

Gly

Arg

Ala

Ile

Ser

Arg

Glu

Asn

Glu

Thr

355

360

365

- 252 033472

Ser

His 370

Thr

Ala

Ser

Ala

Thr 375

Val

Met

Lys

Ser

Leu 380

Leu

Arg

Leu

Ser

Asp

Ala

Met

Asp

Asp

Ser

Thr

Lys

Ala

Lys

Tyr

Lys

Gln

Ile

Val

Lys

385

390

395

400

Thr

Ser

Val

Lys

Ser

Asp

Ser

Ser

Tyr

Gly

Gln

Asn

Asp

Thr

Leu

Ser

405

410

415

Ser

Tyr

Ser

Asp

Ile

Ser

Lys

Met

Lys

Ser

Leu

Met

Glu

Asp

Ser

Thr

420

425

430

Ile

Ser

Thr

Asn

Gly

Leu

Thr

Gln

Gln

Leu

Lys

Ile

Tyr

Asn

Asp

Met

435

440

445

Asp

Arg

Val

Thr

Tyr

His

Asn

Lys

Asp

Leu

Asp

Phe

Ala

Phe

Gly

Leu

450

455

460

Ser

Met

Thr

Ser

Lys

Asn

Val

Ala

Arg

Tyr

Glu

Ser

Ile

Asn

Gly

Glu

465

470

475

480

Asn

Leu

Lys

Gly

Trp

His

Thr

Gly

Ala

Gly

Met

Ser

Tyr

Leu

Tyr

Asn

485

490

495

Ser

Asp

Val

Lys

His

Tyr

Arg

Asp

Asn

Phe

Trp

Ala

Thr

Ala

Asp

Met

500

505

510

Lys

Arg

Leu

Ala

Gly

Thr

Thr

Thr

Leu

Glu

Asn

Glu

Glu

Pro

Lys

Gly

515

520

525

Thr

Asp

Val

Lys

Lys

Ser

Ser

Lys

Thr

Phe

Val

Gly

Gly

Thr

Lys

Phe

530

535

540

Asp

Asp

Gln

His

Ala

Ser

Ile

Gly

Met

Asp

Phe

Glu

Asn

Gln

Asp

Lys

545

550

555

560

Thr

Leu

Thr

Ala

Lys

Lys

Ser

Tyr

Phe

Ile

Leu

Asn

Asp

Lys

Ile

Val

565

570

575

Phe

Leu

Gly

Thr

Gly

Ile

Lys

Ser

Thr

Asp

Ser

Ser

Lys

Asn

Pro

Val

580

585

590

Thr

Thr

Ile

Glu

Asn

Arg

Lys

Ala

Asn

Gly

Tyr

Thr

Leu

Tyr

Thr

Asp

595

600

605

Asp

Lys

Gln

Thr

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Gln

Gly

Thr

Asn

Ser

Val

Phe

610

615

620

Leu

Glu

Ser

Thr

Asn

Lys

Pro

Lys

Asn

Asn

Ile

Gly

Tyr

His

Phe

Leu

625

630

635

640

Asn

Glu

Ser

Lys

Ile

Thr

Val

Lys

Lys

Glu

Ser

His

Thr

Gly

Lys

Trp

645

650

655

Ser

Asp

Ile

Asn

Lys

Ser

Gln

Lys

Gln

Asp

Ser

Lys

Thr

Asn

Gln

Tyr

660

665

670

Tyr

Glu

Val

Thr

Gln

Lys

His

Ser

Asn

Thr

Asp

Ser

Lys

Tyr

Ala

Tyr

675

680

685

Val

Leu

Tyr

Pro

Gly

Leu

Ser

Lys

Asp

Asp

Phe

Asn

Thr

Lys

Lys

Asp

690

695

700

Lys

Val

Thr

Val

Val

Lys

Gln

Asp

Asp

Asp

Phe

His

Val

Val

Lys

Asp

705

710

715

720

Asn

Glu

Ser

Val

Trp

Ala

Gly

Val

Asn

Tyr

Ser

Asp

Ser

Thr

Gln

Thr

725

730

735

Phe

Ile

Ile

Asn

Asn

Thr

Lys

Val

Glu

Val

Lys

Ala

Lys

Gly

Met

Phe

740

745

750

Ile

Leu

Lys

Lys

Lys

Asp

Asp

Lys

Thr

Tyr

Glu

Cys

Ser

Phe

Tyr

Asn

755

760

765

Pro

Glu

Ser

Thr

Asn

Thr

Ala

Ser

Asp

Ile

Glu

Ser

Lys

Ile

Ser

Met

770

775

780

Thr

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

Asn

Lys

Asn

Thr

Ser

Thr

Ser

Asn

Glu

Ser

785

790

795

800

Gly

Val

Arg

Phe

Glu

Leu

Gln

Gln

Thr

Leu

Asn

Lys

Asp

Asp

Asn

805

810

815

<210> 78 <211> 807 <212> Белок <213> Staphylococcus aureus (штамм NCTC 8325)

- 253 033472 <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 78

Met

Thr

Tyr

Arg

Ile

Lys

Lys

Trp

Gln

Lys

Leu

Ser

Thr

Ile

Thr

Leu

1

5

10

15

Leu

Met

Ala

Gly

Val

Ile

Thr

Leu

Asn

Gly

Gly

Glu

Phe

Arg

Ser

Val

20

25

30

Asp

Lys

His

Gln

Ile

Ala

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Val

Gln

Thr

Pro

Asp

35

40

45

Tyr

Glu

Lys

Leu

Arg

Asn

Thr

Trp

Leu

Asp

Val

Asn

Tyr

Gly

Tyr

Asp

50

55

60

Lys

Tyr

Asp

Glu

Asn

Asn

Pro

Asp

Met

Lys

Lys

Lys

Phe

Asp

Ala

Thr

65

70

75

80

Glu

Lys

Glu

Ala

Thr

Asn

Leu

Leu

Lys

Glu

Met

Lys

Thr

Glu

Ser

Gly

85

90

95

Arg

Lys

Tyr

Leu

Trp

Ser

Gly

Ala

Glu

Thr

Leu

Glu

Thr

Asn

Ser

Ser

100

105

110

His

Met

Thr

Arg

Thr

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

Lys

Ile

Ala

Glu

Ala

Met

115

120

125

Arg

Asn

Pro

Lys

Thr

Thr

Leu

Asn

Thr

Asp

Glu

Asn

Lys

Lys

Lys

Val

130

135

140

Lys

Asp

Ala

Leu

Glu

Trp

Leu

His

Lys

Asn

Ala

Tyr

Gly

Lys

Glu

Pro

145

150

155

160

Asp

Lys

Lys

Val

Lys

Glu

Leu

Ser

Glu

Asn

Phe

Thr

Lys

Thr

Thr

Gly

165

170

175

Lys

Asn

Thr

Asn

Leu

Asn

Trp

Trp

Asp

Tyr

Glu

Ile

Gly

Thr

Pro

Lys

180

185

190

Ser

Leu

Thr

Asn

Thr

Leu

Ile

Leu

Leu

Asn

Asp

Gln

Phe

Ser

Asn

Glu

195

200

205

Glu

Lys

Lys

Lys

Phe

Thr

Ala

Pro

Ile

Lys

Thr

Phe

Ala

Pro

Asp

Ser

210

215

220

Asp

Lys

Ile

Leu

Ser

Ser

Val

Gly

Lys

Ala

Glu

Leu

Ala

Lys

Gly

Gly

225

230

235

240

Asn

Leu

Val

Asp

Ile

Ser

Lys

Val

Lys

Leu

Leu

Glu

Cys

Ile

Ile

Glu

245

250

255

Glu

Asp

Lys

Asp

Met

Met

Lys

Lys

Ser

Ile

Asp

Ser

Phe

Asn

Lys

Val

260

265

270

Phe

Thr

Tyr

Val

Gln

Asp

Ser

Ala

Thr

Gly

Lys

Glu

Arg

Asn

Gly

Phe

275

280

285

Tyr

Lys

Asp

Gly

Ser

Tyr

Ile

Asp

His

Gln

Asp

Val

Pro

Tyr

Thr

Gly

290

295

300

Ala

Tyr

Gly

Val

Val

Leu

Leu

Glu

Gly

Ile

Ser

Gln

Met

Met

Pro

Met

305

310

315

320

Ile

Lys

Glu

Thr

Pro

Phe

Asn

Asp

Lys

Thr

Gln

Asn

Asp

Thr

Thr

Leu

325

330

335

Lys

Ser

Trp

Ile

Asp

Asp

Gly

Phe

Met

Pro

Leu

Ile

Tyr

Lys

Gly

Glu

340

345

350

Met

Met

Asp

Leu

Ser

Arg

Gly

Arg

Ala

Ile

Ser

Arg

Glu

Asn

Glu

Thr

355

360

365

Ser

His

Ser

Ala

Ser

Ala

Thr

Val

Met

Lys

Ser

Leu

Leu

Arg

Leu

Ser

370

375

380

Asp

Ala

Met

Asp

Asp

Ser

Thr

Lys

Ala

Lys

Tyr

Lys

Lys

Ile

Val

Lys

385

390

395

400

Ser

Ser

Val

Glu

Ser

Asp

Ser

Ser

Tyr

Lys

Gln

Asn

Asp

Tyr

Leu

Asn

405

410

415

Ser

Tyr

Ser

Asp

Ile

Asp

Lys

Met

Lys

Ser

Leu

Met

Thr

Asp

Asn

Ser

420

425

430

Ile

Ser

Lys

Asn

Gly

Leu

Thr

Gln

Gln

Leu

Lys

Ile

Tyr

Asn

Asp

Met

435

440

445

Asp

Arg

Val

Thr

Tyr

His

Asn

Lys

Asp

Leu

Asp

Phe

Ala

Phe

Gly

Leu

450

455

460

Ser

Met

Thr

Ser

Lys

Asn

Val

Ala

Arg

Tyr

Glu

Ser

Ile

Asn

Gly

Glu

- 254 033472

465

470

475

480

Asn

Leu

Lys

Gly

Trp

His

Thr

Gly

Ala

Gly

Met

Ser

Tyr

Leu

Tyr

Asn

485

490

495

Ser

Asp

Val

Lys

His

Tyr

His

Asp

Asn

Phe

Trp

Val

Thr

Ala

Asp

Met

500

505

510

Lys

Arg

Leu

Ser

Gly

Thr

Thr

Thr

Leu

Asp

Asn

Glu

Ile

Leu

Lys

Asp

515

520

525

Thr

Asp

Asp

Lys

Lys

Ser

Ser

Lys

Thr

Phe

Val

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

530

535

540

Asp

Asp

Gln

His

Ala

Ser

Ile

Gly

Met

Asp

Phe

Glu

Asn

Gln

Asp

Lys

545

550

555

560

Thr

Leu

Thr

Ala

Lys

Lys

Ser

Tyr

Phe

Ile

Leu

Asn

Asp

Lys

Ile

Val

565

570

575

Phe

Leu

Gly

Thr

Gly

Ile

Lys

Ser

Thr

Asp

Ser

Ser

Lys

Asn

Pro

Val

580

585

590

Thr

Thr

Ile

Glu

Asn

Arg

Lys

Ala

Asn

Gly

Tyr

Thr

Leu

Tyr

Thr

Asp

595

600

605

Asp

Lys

Gln

Thr

Thr

Asn

Ser

Asp

Asn

Gln

Glu

Asn

Asn

Ser

Val

Phe

610

615

620

Leu

Glu

Ser

Thr

Asp

Thr

Lys

Lys

Asn

Ile

Gly

Tyr

His

Phe

Leu

Asn

625

630

635

640

Lys

Pro

Lys

Ile

Thr

Val

Lys

Lys

Glu

Ser

His

Thr

Gly

Lys

Trp

Lys

645

650

655

Glu

Ile

Asn

Lys

Ser

Gln

Lys

Asp

Thr

Gln

Lys

Thr

Asp

Glu

Tyr

Tyr

660

665

670

Glu

Val

Thr

Gln

Lys

His

Ser

Asn

Ser

Asp

Asn

Lys

Tyr

Gly

Tyr

Val

675

680

685

Leu

Tyr

Pro

Gly

Leu

Ser

Lys

Asp

Val

Phe

Lys

Thr

Lys

Lys

Asp

Glu

690

695

700

Val

Thr

Val

Val

Lys

Gln

Glu

Asp

Asp

Phe

His

Val

Val

Lys

Asp

Asn

705

710

715

720

Glu

Ser

Val

Trp

Ala

Gly

Val

Asn

Tyr

Ser

Asn

Ser

Thr

Gln

Thr

Phe

725

730

735

Asp

Ile

Asn

Asn

Thr

Lys

Val

Glu

Val

Lys

Ala

Lys

Gly

Met

Phe

Ile

740

745

750

Leu

Lys

Lys

Lys

Asp

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Cys

Ser

Phe

Tyr

Asn

Pro

755

760

765

Glu

Ser

Thr

Asn

Ser

Ala

Ser

Asp

Ile

Glu

Ser

Lys

Ile

Ser

Met

Thr

770

775

780

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

Asn

Lys

Asn

Thr

Ser

Thr

Ser

Asn

Glu

Ser

Gly

785

790

795

800

Val

His

Phe

Glu

Leu

Thr

Lys

805

<210> 79 <211> 809 <212> Белок <213> Staphylococcus aureus (штамм bovine RF122) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 79

Met

Thr

Tyr

Arg

Met

Lys

Lys

Trp

Gln

Lys

Leu

Ser

Thr

Ile

Thr

Leu

1

5

10

15

Leu

Met

Ala

Gly

Gly

Ile

Thr

Phe

Asn

Asp

Ser

Glu

Phe

Arg

Ser

Val

20

25

30

Asp

Lys

His

Gln

Ile

Ala

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Val

Gln

Thr

Pro

Asn

35

40

45

Tyr

Glu

Lys

Leu

Lys

Asn

Thr

Trp

Leu

Asp

Val

Asn

Tyr

Gly

Tyr

Asp

50

55

60

Lys

Tyr

Asp

Glu

Ser

Asn

Pro

Asp

Met

Lys

Lys

Lys

Phe

Glu

Ala

Thr

- 255 033472

Glu Lys

Arg Lys

Asp Met

Lys His

130 Lys Asp 145

Gly Lys

Gln Lys

Arg Ala

Glu Glu

210

Ser Asp 225

Gly Asn

Glu Glu

Val Phe

Phe Tyr

290

Gly Ala 305

Met Ile

Leu Thr

Glu Met

Thr Ser

370 Ser Asp 385

Lys Asn

Ser Ser

Thr Ile

Met Asp

450

Leu Ser 465

Glu Asn

Asn Ser

Met Lys

Gly Thr

530

Phe Asp

545

Lys Thr

Glu Ala

Tyr Leu

100

Thr Arg

115

Pro Lys

Ala Leu

Lys Val

Asn Thr

180

Leu Thr 195

Lys Lys

Glu Ile

Leu Val

Asp Lys

260

Thr Tyr 275

Lys Asp

Tyr Gly

Lys Glu

Ser Trp

340 Met Asp 355

His Ser

Ala Met

Ser Val

Tyr Ser

420

Ser Thr 435

Arg Val

Met Thr

Leu Lys

Asp Val

500

Arg Leu 515

Asp Val

Asp Gln

Leu Thr

Arg Lys 85

Trp Glu

Thr Tyr

Thr Thr

Glu Trp

150

Ala Asp

165

Asn Leu

Asn Thr

Lys Tyr

Leu Ser

230 Asp Ile 245

Asp Met

Val Gln

Gly Ser

Val Val

310

Thr Pro 325

Ile Asp

Leu Ser

Ala Ser

Asp Glu

390 Lys Ser 405 Asp Ile

Asn Gly

Thr Tyr

Ser Lys

470

Gly Trp

485

Arg His

Ala Asp

Lys Lys

His Ala

550 Ala Lys 565

Leu Leu

Asn Ser

Arg Asn

120 Leu Lys 135

Leu His

Leu Lys

Asn Trp

Leu Ile

200

Thr Ala

215

Ser Val

Ser Lys

Met Lys

Asp Ser

280

Tyr Ile

295

Leu Leu

Phe Asn

Asp Gly

Arg Gly

360

Ala Thr 375

Ser Thr

Asp Ser

Asp Lys

Leu Thr

440

His Asn

455

Asn Val

His Thr

Tyr Arg

Thr Thr

520

Ser Ser

535

Ser Ile

Lys Ser

Ser Glu

Lys Asp

105

Ile Glu

Asn Asp

Lys Asn

Thr Asn

170

Trp Asp

185

Leu Leu

Pro Ile

Gly Lys

Val Lys

250

Asn Ser

265

Ala Thr

Asp His

Glu Gly

Asp Lys

330

Phe Met

345

Arg Ala

Val Met

Lys Ala

Ser Tyr

410

Met Lys

425

Gln Gln

Lys Asp

Ala Arg

Gly Ala

490 Asp Asn 505

Thr Leu

Lys Thr

Gly Met

Tyr Phe

570

Met Lys

Leu Asp

Lys Ile

Glu Asn

140 Ala Tyr 155

Phe Ser

Tyr Glu

Lys Glu

Lys Thr

220

Ala Glu 235

Leu Leu

Ile Asp

Asp Lys

Lys Asp

300

Ile Ser

315

Thr Gln

Pro Leu

Ile Ser

Lys Ser

380

Lys Tyr 395

Gly Gln

Ser Leu

Leu Lys

Leu Asp

460

Tyr Glu

475

Gly Met

Phe Trp

Glu Asn

Phe Val

540 Asp Phe 555

Ile Leu

Thr Glu

Thr Lys

110

Ala Glu

125

Lys Lys

Gly Lys

Lys Ser

Ile Gly

190 Asp Phe 205

Phe Ala

Pro Ala

Glu Ser

Ser Phe

270

Glu Arg

285

Val Pro

Gln Met

Asn Asn

Ile Tyr

350 Arg Glu 365

Leu Leu

Lys Gln

Asn Asp

Met Thr

430

Ile Tyr

445

Phe Ala

Asn Ile

Ser Tyr

Ala Thr

510

Glu Glu

525

Gly Gly

Glu Asn

Asn Asp

Ser Asp 95

Ser Ala

Ala Met

Lys Val

Glu Pro

160

Ala Pro

175

Thr Pro

Thr Asp

Pro Lys

Lys Gly

240

Ile Ile

255

Asn Lys

Asn Gly

Tyr Thr

Met Pro

320

Thr Thr

335

Lys Gly

Asn Glu

Arg Leu

Ile Val

400

Thr Leu

415

Asp Ser

Asn Ala

Phe Gly

Asn Gly

480

Leu Tyr

495

Ala Asp

Pro Lys

Thr Lys

Gln Asp

560 Lys Ile 575

- 256 033472

Val

Phe

Leu

Gly 580

Thr

Gly

Ile

Lys

Thr 585

Thr

Asp

Ser

Ser

Lys 590

Asn

Pro

Val

Thr

Thr

Ile

Glu

Asn

Arg

Lys

Ala

His

Gly

Tyr

Thr

Leu

Tyr

Thr

595

600

605

Asp

Asp

Lys

Gln

Thr

Thr

Asn

Ser

Asn

Asn

Gln

Glu

Thr

Asn

Ser

Val

610

615

620

Phe

Leu

Glu

Ser

Thr

Asn

Ser

Thr

Gln

Asn

Asn

Ile

Gly

Tyr

His

Phe

625

630

635

640

Leu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ile

Thr

Val

Lys

Lys

Glu

Ser

His

Thr

Gly

Lys

645

650

655

Trp

Ser

Asp

Ile

Asn

Lys

Ser

Gln

Lys

Asp

Thr

Gln

Lys

Thr

Asp

Glu

660

665

670

Tyr

Tyr

Glu

Val

Thr

Gln

Lys

His

Ser

Asn

Thr

Asp

Asp

Lys

Tyr

Ala

675

680

685

Tyr

Val

Leu

Tyr

Pro

Gly

Ile

Thr

Lys

Asp

Asn

Phe

Lys

Ser

Lys

Ala

690

695

700

Ser

Gln

Val

Thr

Val

Val

Lys

Gln

Asp

Asp

Asp

Phe

His

Val

Val

Lys

705

710

715

720

Asp

Asn

Glu

Ser

Val

Trp

Ala

Gly

Val

Asn

Tyr

Ser

Asp

Ser

Thr

Gln

725

730

735

Thr

Phe

Asp

Ile

Asn

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Val

Lys

Ala

Lys

Gly

Met

740

745

750

Phe

Ile

Leu

Lys

Lys

Lys

Asp

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Cys

Ser

Phe

Tyr

755

760

765

Asn

Pro

Glu

Ser

Thr

Asn

Ser

Ala

Ser

Asp

Ile

Glu

Ser

Lys

Ile

Ser

770

775

780

Met

Thr

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

Asn

Lys

Asn

Thr

Ser

Asn

Thr

Asn

Glu

785

790

795

800

Ser

Gly

Val

Arg

Phe

Glu

Leu

Thr

Lys

805

<210> 80 <211> 807 <212> Белок <213> Staphylococcus aureus (штамм bovine RF122) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 80

Met

Thr

Tyr

Lys

Met

Lys

Lys

Trp

Gln

Lys

Leu

Ser

Thr

Ile

Thr

Leu

1

5

10

15

Leu

Met

Ala

Gly

Val

Ile

Thr

Leu

Asn

Asn

Gly

Glu

Phe

Arg

Asn

Val

20

25

30

Asp

Lys

His

Gln

Ile

Ala

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Val

Gln

Thr

Pro

Asp

35

40

45

Tyr

Glu

Lys

Leu

Lys

Lys

Thr

Trp

Leu

Asp

Val

Asn

Tyr

Gly

Asn

Asp

50

55

60

Gln

Tyr

Asp

Glu

Asn

Asn

Gln

Asp

Met

Lys

Lys

Lys

Phe

Asp

Ala

Lys

65

70

75

80

Glu

Asn

Glu

Ala

Lys

Lys

Leu

Leu

Glu

Asp

Met

Lys

Thr

Asp

Thr

Asn

85

90

95

Arg

Thr

Tyr

Leu

Trp

Ser

Gly

Ala

Glu

Asn

Leu

Glu

Thr

Asn

Ser

Ser

100

105

110

His

Met

Thr

Lys

Thr

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

Lys

Ile

Ala

Glu

Ala

Met

115

120

125

Arg

His

Lys

Asn

Thr

Ser

Leu

Lys

Thr

Asp

Glu

Asn

Lys

Leu

Lys

Ile

130

135

140

Lys

Asp

Ala

Ile

Lys

Trp

Leu

His

His

Asn

Val

Tyr

Gly

Lys

Asp

Pro

145

150

155

160

Asp

Lys

Lys

Val

Ala

Asp

Leu

Thr

Thr

Asn

Arg

Lys

Glu

Lys

Asp

Ser

165

170

175

- 257 033472

Ser Lys

Pro Arg

Lys Asp

210

Ser Ser 225

Gly Gly

Ile Glu

Lys Val

Gly Phe

290

Thr Gly

305

Pro Met

Leu Ser

Glu Met

Thr Ser

370

Ser Asp

385

Lys Thr

Asn Ser

Thr Ile

Met Asp

450

Leu Ser 465

Glu Asn

Asn Ser

Met Thr

Asn Thr

530 Lys Tyr 545

Thr Ala

Gly Thr

Val Glu

Glu Ile

610

Leu Glu

625

Lys Pro

Glu Ile

Glu Val

Lys Asn

180

Ala Leu

195

Glu Met

Tyr Lys

Asn Leu

Glu Asp

260

Phe Thr

275

Tyr Lys

Ala Tyr

Ile Lys

Asn Trp

340

Met Asp

355

His Thr

Thr Met

Ser Val

Tyr Ser

420

Ser Lys

435

Arg Val

Met Thr

Leu Lys

Asp Val

500

Arg Leu

515

Lys Asn

Ala Ser

Lys Lys

Gly Ile

580

Asn Arg

595

Thr Thr

Ser Asn

Lys Ile

Asn Lys

660

Thr Gln

Asn Ser

Thr Asn

Lys Asn

Ile Leu

230 Val Asp 245

Val Asp

Tyr Val

Asp Gly

Gly Val

310

Glu Ser 325

Ile Asp

Leu Ser

Ala Ser

Asp Glu

390 Lys Ser 405 Asp Ile

Asn Asp

Thr Tyr

Ser Lys

470 Gly Trp 485

Lys His

Pro Gly

Asp Lys

Ile Gly

550 Ser Tyr 565

Lys Ser

Lys Ala

Ser Asp

Asp Thr

630

Thr Val

645

Ser Gln

Thr His

Leu Asn

Thr Leu

200

Tyr Ser

215

Ser Ser

Ile Ala

Met Met

Gln Asp

280

Ser Tyr

295

Val Leu

Pro Phe

Glu Gly

Arg Gly

360

Ala Thr 375

Ser Thr

Asp Ser

Asp Lys

Leu Thr

440

His Asn

455

Asn Ile

His Thr

Tyr Arg

Thr Thr

520

Ser Phe

535

Met Asp

Phe Ile

Thr Asp

Asn Gly

600

Val Asn

615

Lys Lys

Lys Lys

Lys Thr

Asn Thr

Trp Trp

185

Leu Leu

Lys Pro

Val Gly

Lys Val

250

Lys Lys

265

Ser Ala

Ile Asp

Leu Glu

Lys His

330

Phe Met

345

Arg Ala

Val Met

Lys Thr

Ser Tyr

410

Met Lys

425

Gln Gln

Lys Glu

Ala Arg

Gly Ala

490 Asp Asn 505

Thr Leu

Val Gly

Phe Glu

Leu Asn

570

Ser Ser

585

Tyr Lys

Ala Gln

Asn Ile

Glu Ser

650 Asp Asp 665 Ser Asp

Asp Tyr

Met Asp

Ile Ser

220

Glu Ser

235

Lys Phe

Ser Ile

Thr Gly

His Gln

300

Gly Ile

315

Thr Gln

Pro Leu

Ile Ser

Lys Ser

380

Lys Tyr

395

Asp Ser

Lys Leu

Leu Lys

Leu Asp

460

Tyr Glu

475

Gly Met

Phe Trp

Asn Asp

Gly Thr

540

Asn Gln

555

Asp Lys

Lys Asn

Leu Phe

Glu Thr

620

Gly Tyr

635

His Thr

Lys Lys

Ser Lys

Glu Ile

190

Asn Met 205

Ile Tyr

Glu Asp

Leu Glu

Asp Ser

270

Lys Ala 285

Asp Val

Ser Gln

Asp Lys

Ile Tyr

350

Arg Glu

365

Leu Leu

Lys Gln

Asn Asp

Met Asn

430

Ile Tyr

445

Phe Ala

Asn Ile

Ser Tyr

Ala Thr

510

Met Pro 525

Lys Leu

Asp Lys

Ile Val

Pro Val

590 Lys Gly 605

His Ser

His Phe

Gly Lys

Asp Glu

670 Tyr Ala

Gly Thr

Leu Thr

Ser Pro

Ala Lys

240

Ser Val

255

Phe Asn

Arg Asn

Pro Tyr

Met Met

320

Ala Thr

335

Lys Gly

Asn Glu

Arg Leu

Ile Val

400

Thr Leu

415

Asp Ser

Asn Asp

Phe Gly

Asn Gly

480

Leu Tyr 495

Ala Asp

Ser Thr

Asn Asn

Thr Leu

560

Phe Ile

575

Thr Ser

Asp Ile

Val Phe

Leu Asp

640

Trp Ser

655

Tyr Tyr

Tyr Val

- 258 033472

675

Leu Tyr Pro Gly Leu

690

Val Ser Ile Val Lys

705

Asp Gly Val Phe Ala

725

Asp Ile Asn Gly Thr

740

Ile Lys Lys Lys Asp

755

Thr Ser Thr Asn Ser

770

Gly Tyr Thr Ile Thr

785

Ile His Phe Glu Leu

805

680

Ser Lys Ser Asp Phe

695

Gln Asp Glu Asp Phe

710

Gly Val Asn Tyr Ser

730 Ile Val Glu Leu Lys

745

Asp Asn Thr Tyr Glu

760

Thr Ser Asn Lys Glu

775

Asn Gln Ser Val Ser

790

Thr Lys

685

Lys Ser Lys Asn Asn Asn

700

His Val Ile Lys Asp Asn

715 720

Asp Ser Thr Lys Ser Phe

735

Glu Lys Gly Met Phe Val

750

Cys Ser Phe Tyr Asn Pro

765

Ser Lys Ile Ser Val Thr

780

Asn Phe Lys Glu Ser Asp

795 800 <210> 81 <211> 807 <212> Белок <213> Staphylococcus aureus (штамм USA300) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 81

Met

Thr

Tyr

Arg

Ile

Lys

Lys

Trp

Gln

Lys

Leu

Ser

Thr

Ile

Thr

Leu

1

5

10

15

Leu

Met

Ala

Gly

Val

Ile

Thr

Leu

Asn

Gly

Gly

Glu

Phe

Arg

Ser

Val

20

25

30

Asp

Lys

His

Gln

Ile

Ala

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Val

Gln

Thr

Pro

Asp

35

40

45

Tyr

Glu

Lys

Leu

Arg

Asn

Thr

Trp

Leu

Asp

Val

Asn

Tyr

Gly

Tyr

Asp

50

55

60

Lys

Tyr

Asp

Glu

Asn

Asn

Pro

Asp

Met

Lys

Lys

Lys

Phe

Asp

Ala

Thr

65

70

75

80

Glu

Lys

Glu

Ala

Thr

Asn

Leu

Leu

Lys

Glu

Met

Lys

Thr

Glu

Ser

Gly

85

90

95

Arg

Lys

Tyr

Leu

Trp

Ser

Gly

Ala

Glu

Thr

Leu

Glu

Thr

Asn

Ser

Ser

100

105

110

His

Met

Thr

Arg

Thr

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

Lys

Ile

Ala

Glu

Ala

Met

115

120

125

Arg

Asn

Pro

Lys

Thr

Thr

Leu

Asn

Thr

Asp

Glu

Asn

Lys

Lys

Lys

Val

130

135

140

Lys

Asp

Ala

Leu

Glu

Trp

Leu

His

Lys

Asn

Ala

Tyr

Gly

Lys

Glu

Pro

145

150

155

160

Asp

Lys

Lys

Val

Lys

Glu

Leu

Ser

Glu

Asn

Phe

Thr

Lys

Thr

Thr

Gly

165

170

175

Lys

Asn

Thr

Asn

Leu

Asn

Trp

Trp

Asp

Tyr

Glu

Ile

Gly

Thr

Pro

Lys

180

185

190

Ser

Leu

Thr

Asn

Thr

Leu

Ile

Leu

Leu

Asn

Asp

Gln

Phe

Ser

Asn

Glu

195

200

205

Glu

Lys

Lys

Lys

Phe

Thr

Ala

Pro

Ile

Lys

Thr

Phe

Ala

Pro

Asp

Ser

210

215

220

Asp

Lys

Ile

Leu

Ser

Ser

Val

Gly

Lys

Ala

Glu

Leu

Ala

Lys

Gly

Gly

225

230

235

240

Asn

Leu

Val

Asp

Ile

Ser

Lys

Val

Lys

Leu

Leu

Glu

Cys

Ile

Ile

Glu

245

250

255

Glu

Asp

Lys

Asp

Met

Met

Lys

Lys

Ser

Ile

Asp

Ser

Phe

Asn

Lys

Val

260

265

270

Phe

Thr

Tyr

Val

Gln

Asp

Ser

Ala

Thr

Gly

Lys

Glu

Arg

Asn

Gly

Phe

- 259 033472

Tyr Lys

290 Ala Tyr 305 Ile Lys

Lys Ser

Met Met

Ser His

370

Asp Ala

385

Ser Ser

Ser Tyr

Ile Ser

Asp Arg

450

Ser Met

465

Asn Leu

Ser Asp

Lys Arg

Thr Asp

530

Asp Asp

545

Thr Leu

Phe Leu

Thr Thr

Asp Lys

610

Leu Glu

625

Lys Pro

Glu Ile

Glu Val

Leu Tyr

690

Val Thr

705

Glu Ser

Asp Ile

Leu Lys

Glu Ser

770

275

Asp Gly

Gly Val

Glu Thr

Trp Ile

340

Asp Leu

355

Ser Ala

Met Asp

Val Glu

Ser Asp

420

Lys Asn

435

Val Thr

Thr Ser

Lys Gly

Val Lys

500

Leu Ser

515

Asp Lys

Gln His

Thr Ala

Gly Thr

580

Ile Glu 595

Gln Thr

Ser Thr

Lys Ile

Asn Lys

660

Thr Gln

675

Pro Gly

Val Val

Val Trp

Asn Asn

740 Lys Lys 755

Thr Asn

Ser Tyr

Val Leu

310

Pro Phe

325

Asp Asp

Ser Arg

Ser Ala

Asp Ser

390 Ser Asp 405

Ile Asp

Gly Leu

Tyr His

Lys Asn

470

Trp His

485

His Tyr

Gly Thr

Lys Ser

Ala Ser

550 Lys Lys 565 Gly Ile

Asn Arg

Thr Asn

Asp Thr

630

Thr Val

645

Ser Gln

Lys His

Leu Ser

Lys Gln

710 Ala Gly 725

Thr Lys

Asp Asp

Ser Ala

280 Ile Asp 295

Leu Glu

Asn Asp

Gly Phe

Gly Arg

360

Thr Val 375

Thr Lys

Ser Ser

Lys Met

Thr Gln

440 Asn Lys 455

Val Ala

Thr Gly

His Asp

Thr Thr

520

Ser Lys

535

Ile Gly

Ser Tyr

Lys Ser

Lys Ala

600

Ser Asp

615

Lys Lys

Lys Lys

Lys Asp

Ser Asn

680 Lys Asp 695

Glu Asp

Val Asn

Val Glu

Asn Thr

760 Ser Asp 775

His Gln

Gly Ile

Lys Thr

330

Met Pro

345

Ala Ile

Met Lys

Ala Lys

Tyr Lys

410

Lys Ser

425

Gln Leu

Asp Leu

Arg Tyr

Ala Gly

490

Asn Phe

505

Leu Asp

Thr Phe

Met Asp

Phe Ile

570 Thr Asp 585 Asn Gly

Asn Gln

Asn Ile

Glu Ser

650

Thr Gln

665

Ser Asp

Val Phe

Asp Phe

Tyr Ser

730

Val Lys

745

Tyr Glu

Ile Glu

Asp Val

300

Ser Gln

315

Gln Asn

Leu Ile

Ser Arg

Ser Leu

380

Tyr Lys 395

Gln Asn

Leu Met

Lys Ile

Asp Phe

460

Glu Ser 475

Met Ser

Trp Val

Asn Glu

Val Gly

540

Phe Glu

555

Leu Asn

Ser Ser

Tyr Thr

Glu Asn

620

Gly Tyr 635

His Thr

Lys Thr

Asn Lys

Lys Thr

700

His Val

715

Asn Ser

Ala Lys

Cys Ser

Ser Lys

780

285

Pro Tyr

Met Met

Asp Thr

Tyr Lys

350

Glu Asn

365

Leu Arg

Lys Ile

Asp Tyr

Thr Asp

430

Tyr Asn

445

Ala Phe

Ile Asn

Tyr Leu

Thr Ala

510

Ile Leu 525

Gly Thr

Asn Gln

Asp Lys

Lys Asn

590

Leu Tyr 605

Asn Ser

His Phe

Gly Lys

Asp Glu

670 Tyr Gly 685

Lys Lys

Val Lys

Thr Gln

Gly Met

750

Phe Tyr

765

Ile Ser

Thr Gly

Pro Met

320

Thr Leu

335

Gly Glu

Glu Thr

Leu Ser

Val Lys

400

Leu Asn

415

Asn Ser

Asp Met

Gly Leu

Gly Glu

480 Tyr Asn 495 Asp Met

Lys Asp

Lys Val

Asp Lys

560

Ile Val

575

Pro Val

Thr Asp

Val Phe

Leu Asn

640

Trp Lys

655

Tyr Tyr

Tyr Val

Asp Glu

Asp Asn

720

Thr Phe

735

Phe Ile

Asn Pro

Met Thr

- 260 033472

Gly	Tyr	Ser	Ile Thr	Asn	Lys Asn Thr	Ser Thr
785					790		795
Val	His	Phe	Glu	Leu 805	Thr	Lys

Ser Asn Glu

Ser Gly

800 <210> 82 <211> 1066 <212> Белок <213> Streptococcus pneumoniae <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 82

Met 1

Gln

Thr

Lys

Thr 5

Lys

Lys

Leu

Ile

Val 10

Ser

Leu

Ser

Ser

Leu 15

Val

Leu

Ser

Gly

Phe

Leu

Leu

Asn

His

Tyr

Met

Thr

Ile

Gly

Ala

Glu

Glu

20

25

30

Thr

Thr

Thr

Asn

Thr

Ile

Gln

Gln

Ser

Gln

Lys

Glu

Val

Gln

Tyr

Gln

35

40

45

Gln

Arg

Asp

Thr

Lys

Asn

Leu

Val

Glu

Asn

Gly

Asp

Phe

Gly

Gln

Thr

50

55

60

Glu

Asp

Gly

Ser

Ser

Pro

Trp

Thr

Gly

Ser

Lys

Ala

Gln

Gly

Trp

Ser

65

70

75

80

Ala

Trp

Val

Asp

Gln

Lys

Asn

Ser

Ala

Asp

Ala

Ser

Thr

Arg

Val

Ile

85

90

95

Glu

Ala

Lys

Asp

Gly

Ala

Ile

Thr

Ile

Ser

Ser

His

Glu

Lys

Leu

Arg

100

105

110

Ala

Ala

Leu

His

Arg

Met

Val

Pro

Ile

Glu

Ala

Lys

Lys

Lys

Tyr

Lys

115

120

125

Leu

Arg

Phe

Lys

Ile

Lys

Thr

Asp

Asn

Lys

Ile

Gly

Ile

Ala

Lys

Val

130

135

140

Arg

Ile

Ile

Glu

Glu

Ser

Gly

Lys

Asp

Lys

Arg

Leu

Trp

Asn

Ser

Ala

145

150

155

160

Thr

Thr

Ser

Gly

Thr

Lys

Asp

Trp

Gln

Thr

Ile

Glu

Ala

Asp

Tyr

Ser

165

170

175

Pro

Thr

Leu

Asp

Val

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Glu

Leu

Phe

Tyr

Glu

Thr

180

185

190

Gly

Thr

Gly

Thr

Val

Ser

Phe

Lys

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

Glu

Val

Ala

195

200

205

Asp

Gln

Leu

Ser

Glu

Asp

Ser

Gln

Thr

Asp

Lys

Gln

Leu

Glu

Glu

Lys

210

215

220

Ile

Asp

Leu

Pro

Ile

Gly

Lys

Lys

His

Val

Phe

Ser

Leu

Ala

Asp

Tyr

225

230

235

240

Thr

Tyr

Lys

Val

Glu

Asn

Pro

Asp

Val

Ala

Ser

Val

Lys

Asn

Gly

Ile

245

250

255

Leu

Glu

Pro

Leu

Lys

Glu

Gly

Thr

Thr

Asn

Val

Ile

Val

Ser

Lys

Asp

260

265

270

Gly

Lys

Glu

Val

Lys

Lys

Ile

Pro

Leu

Lys

Ile

Leu

Ala

Ser

Val

Lys

275

280

285

Asp

Ala

Tyr

Thr

Asp

Arg

Leu

Asp

Asp

Trp

Asn

Gly

Ile

Ile

Ala

Gly

290

295

300

Asn

Gln

Tyr

Tyr

Asp

Ser

Lys

Asn

Glu

Gln

Met

Ala

Lys

Leu

Asn

Gln

305

310

315

320

Glu

Leu

Glu

Gly

Lys

Val

Ala

Asp

Ser

Leu

Ser

Ser

Ile

Ser

Ser

Gln

325

330

335

Ala

Asp

Arg

Thr

Tyr

Leu

Trp

Glu

Lys

Phe

Ser

Asn

Tyr

Lys

Thr

Ser

340

345

350

Ala

Asn

Leu

Thr

Ala

Thr

Tyr

Arg

Lys

Leu

Glu

Glu

Met

Ala

Lys

Gln

355

360

365

Val

Thr

Asn

Pro

Ser

Ser

Arg

Tyr

Tyr

Gln

Asp

Glu

Thr

Val

Val

Arg

370

375

380

- 261 033472

Thr Val 385

Glu Lys

Arg Ala

Glu Glu

Pro Glu

450 Gly Asn 465

Arg Lys

Val Phe

Tyr Ile

Leu Ile

530

Asn Pro

545

Lys Ser

Arg Gly

Val Glu

Glu Thr

610

Asp Ser 625

Ser Leu

Arg Pro

Tyr Asn

Arg Thr

690

Tyr Thr 705

Tyr Ser

Thr Thr

Leu Pro

Thr Ala

770

Lys Ser

785

Ile Gln

Lys Leu

Ala Ser

Phe Leu

850

Lys Lys

865

Lys Asp

Arg Asp

Ser Ile

Ile Asn

420

Ile Lys

435

His Phe

Leu Val

Asp Asp

Lys Leu

500

Asp His

515

Asp Gly

Ile Asp

Phe Ala

Arg Ser

580

Val Leu 595

Lys Gln

Tyr Tyr

Met Gln

Ser Tyr

660

Ala Glu

675

Leu Asn

Ser Asp

Asp Gly

Glu Thr

740

Ser Ala 755

Thr Met

Trp Phe

Asn Thr

Glu Ser

820

Leu Thr 835

Glu Ser

Ser Ser

Ile Asn

Ser Met

390 Val Gly 405

Asn Thr

Lys Tyr

Arg Lys

Asp Met

470

Gln Glu 485

Val Asp

Thr Asn

Leu Ser

Lys Asp

550

Pro Leu

565

Ile Ser

Arg Gly

Cys Leu

Asp Val

630

Ser Leu

645

Leu Ser

Lys Gly

Tyr Glu

Gly Met

710

Tyr Trp

725

Asp Ala

Phe Val

Asp Phe

Met Leu

790

Ser Thr

805

Gly Asn

Glu Gln

Phe Asp

Ile Ser

870 Glu Gly

Glu Trp

Asn Trp

Leu Ser

Thr Asp

440

Thr Thr

455

Gly Arg

Ile Ser

Gln Gly

Val Ala

520

Gln Leu

535

Lys Met

Leu Val

Arg Ala

Ile His

600

Gln Ser

615

Phe Lys

Leu Ser

Ala Phe

Phe Gly

680

His Met

695

Phe Tyr

Pro Thr

Lys Arg

Gly Thr

760

Thr Asn

775

Lys Asp

Asp Thr

Pro Tyr

Glu Lys

840

Ser Lys

855

Met Ser

Gln Ser

Met His

Trp Asp

410

Leu Met 425

Val Ile

Asp Asn

Val Lys

Ser Thr

490

Glu Gly 505

Tyr Thr

Leu Pro

Gln Thr

Asn Gly

570

Asn Ser 585

Arg Ile

Leu Val

Asn Leu

Asp Ala

650 Asn Lys 665 Phe Gly

Asn Lys

Leu Tyr

Val Asn

730 Ala Asp 745

Ser Lys

Trp Asn

Lys Ile

Ala Ala

810 Lys Val 825

Asp Tyr

Lys Asn

Lys Ala

Asp Lys

Lys His

395

Tyr Glu

Lys Glu

Glu Lys

Pro Phe

460

Val Ile

475

Ile Arg

Phe Tyr

Gly Ala

Val Ile

540

Met Tyr 555

Glu Leu

Glu Gly

Ala Asp

Lys Thr

620

Lys Thr 635

Gly Val

Met Asp

Leu Ser

Glu Asn

700 Asn Gly 715

Pro Tyr

Ser Asp

Leu Asp

Gln Thr

780

Ala Phe 795

Thr Thr

Tyr Val

Pro Glu

Ile Gly

860

Leu Gln

875

Glu Val

Val Tyr

Ile Gly

Tyr Phe

430

Phe Val

445

Lys Ala

Ala Gly

Ser Ile

Gln Asp

510

Tyr Gly

525

Gln Lys

His Trp

Met Asp

His Val

590

Met Ser

605

Ile Val

Tyr Lys

Ala Ser

Lys Thr

670

Leu Phe

685

Lys Arg

Asp Leu

Lys Met

Thr Gly

750

Asp Ala

765

Leu Thr

Leu Gly

Ile Asp

Asn Asp

830

Thr Gln

845

Tyr Phe

Lys Gly

Glu Asn

Asn Ser

400

Thr Pro

415

Ser Asp

Pro Asp

Leu Gly

Leu Leu

480

Glu Gln

495

Gly Ser

Asn Val

Thr Lys

Ile Asp

560

Met Ser 575

Ala Ala

Glu Gly

Gln Ser

Asp Ile

640

Val Pro 655

Ala Met

Ser Ser

Gly Trp

Ser His

720

Pro Gly

735

Lys Val

Asn Ala

Ala His

Ser Asn

800

Gln Arg

815

Lys Glu

Ser Val

Phe Phe

Ala Trp

880

Glu Phe

- 262 033472

885

890

895

Leu

Thr

Ile

Ser

Gln

Ala

His

Lys

Gln

Asn

Arg

Asp

Ser

Tyr

Gly

Tyr

900

905

910

Met

Leu

Ile

Pro

Asn

Val

Asp

Arg

Ala

Thr

Phe

Asn

Gln

Met

Ile

Lys

915

920

925

Glu

Leu

Glu

Ser

Ser

Leu

Ile

Glu

Asn

Asn

Glu

Thr

Leu

Gln

Ser

Val

930

935

940

Tyr

Asp

Ala

Lys

Gln

Gly

Val

Trp

Gly

Ile

Val

Lys

Tyr

Asp

Asp

Ser

945

950

955

960

Val

Ser

Thr

Ile

Ser

Asn

Gln

Phe

Gln

Val

Leu

Lys

Arg

Gly

Val

Tyr

965

970

975

Thr

Ile

Arg

Lys

Glu

Gly

Asp

Glu

Tyr

Lys

Ile

Ala

Tyr

Tyr

Asn

Pro

980

985

990

Glu

Thr

Gln

Glu

Ser

Ala

Pro

Asp

Gln

Glu

Val

Phe

Lys

Lys

Leu

Glu

995

1000

1005

Gln

Ala

Ala

Gln

Pro

Gln

Val

Gln

Asn

Ser

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Ser

1010

1015

1020

Glu

Glu

Glu

Lys

Asn

His

Ser

Asp

Gln

Lys

Asn

Leu

Pro

Gln

Thr

Gly

1025

1030

1035

1040

Glu

Gly

Gln

Ser

Ile

Leu

Ala

Ser

Leu

Gly

Phe

Leu

Leu

Leu

Gly Ala

1045

1050

1055

Phe

Tyr

Leu

Phe

Arg

Arg

Gly

Lys

Asn

Asn

1060 1065 <210> 83 <211> 1078 <212> Белок <213> Streptococcus pneumoniae (штамм ATCC BAA-255/R6) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 83

Met

Ile

Leu

Gln

Tyr

Val

Tyr

Trp

Ser

Val

Tyr

Met

Gln

Thr

Lys

Thr

1

5

10

15

Lys

Lys

Leu

Ile

Val

Ser

Leu

Ser

Ser

Leu

Val

Leu

Ser

Gly

Phe

Leu

20

25

30

Leu

Asn

His

Tyr

Met

Thr

Val

Gly

Ala

Glu

Glu

Thr

Thr

Thr

Asn

Thr

35

40

45

Ile

Gln

Gln

Ser

Gln

Lys

Glu

Val

Gln

Tyr

Gln

Gln

Arg

Asp

Thr

Lys

50

55

60

Asn

Leu

Val

Glu

Asn

Gly

Asp

Phe

Gly

Gln

Thr

Glu

Asp

Gly

Ser

Ser

65

70

75

80

Pro

Trp

Thr

Gly

Ser

Lys

Ala

Gln

Gly

Trp

Ser

Ala

Trp

Val

Asp

Gln

85

90

95

Lys

Asn

Ser

Ser

Ala

Asp

Ala

Ser

Thr

Arg

Val

Ile

Glu

Ala

Lys

Asp

100

105

110

Gly

Ala

Ile

Thr

Ile

Ser

Ser

Pro

Glu

Lys

Leu

Arg

Ala

Ala

Val

His

115

120

125

Arg

Met

Val

Pro

Ile

Glu

Ala

Lys

Lys

Lys

Tyr

Lys

Leu

Arg

Phe

Lys

130

135

140

Ile

Lys

Thr

Asp

Asn

Lys

Val

Gly

Ile

Ala

Lys

Val

Arg

Ile

Ile

Glu

145

150

155

160

Glu

Ser

Gly

Lys

Asp

Lys

Arg

Leu

Trp

Asn

Ser

Ala

Thr

Thr

Ser

Gly

165

170

175

Thr

Lys

Asp

Trp

Gln

Thr

Ile

Glu

Ala

Asp

Tyr

Ser

Pro

Thr

Leu

Asp

180

185

190

Val

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Glu

Leu

Phe

Tyr

Glu

Thr

Gly

Thr

Gly

Thr

195

200

205

Val

Ser

Phe

Lys

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

Glu

Val

Ala

Asp

Gln

Pro

Ser

210

215

220

Glu

Asp

Ser

Gln

Thr

Asp

Lys

Gln

Leu

Glu

Glu

Lys

Ile

Asp

Leu

Pro

- 263 033472

225

Ile Gly Lys Lys His

245 Glu Asn Pro Asp Val

260

Lys Glu Gly Thr Thr

275

Lys Lys Ile Pro Leu

290

Asp Arg Leu Asp Asp

305

Asp Ser Lys Asn Glu

325 Lys Val Ala Asp Ser

340

Tyr Leu Trp Glu Lys

355

Ala Thr Tyr Arg Lys

370

Ser Ser Arg Tyr Tyr

385

Ser Met Glu Trp Met

405

Val Gly Asn Trp Trp

420

Asn Thr Leu Ser Leu

435

Lys Tyr Thr Asp Val

450

Arg Lys Thr Thr Asp

465

Asp Met Gly Arg Val

485

Gln Glu Ile Ser Ser

500

Val Asp Gln Gly Glu

515

Thr Asn Val Ala Tyr

530

Leu Ser Gln Leu Leu

545

Lys Asp Lys Met Gln

565

Pro Leu Leu Val Asn

580

Ile Ser Arg Ala Asn

595

Arg Gly Ile His Arg

610

Arg Leu Gln Ser Leu

625

Asp Val Phe Lys Asn

645

Ser Leu Leu Ser Asp

660

Leu Ser Ala Phe Asn

675

Lys Gly Phe Gly Phe

690

Tyr Glu His Met Asn

705

Gly Met Phe Tyr Leu

725

230

Val Phe Ser Leu Ala

250

Ala Ser Val Lys Asn

265

Asn Val Ile Val Ser

280

Lys Ile Leu Ala Ser

295

Trp Asn Gly Ile Ile

310

Gln Met Ala Lys Leu

330

Leu Ser Ser Ile Ser

345

Phe Ser Asn Tyr Lys

360

Leu Glu Glu Met Ala

375

Gln Asp Glu Thr Val

390

His Lys His Val Tyr

410

Asp Tyr Glu Ile Gly

425

Met Lys Glu Tyr Phe

440

Ile Glu Lys Phe Val

455

Asn Pro Phe Lys Ala

470

Lys Val Ile Ala Gly

490

Thr Ile Arg Ser Ile

505

Gly Phe Tyr Gln Asp

520

Thr Gly Ala Tyr Gly

535

Pro Val Ile Gln Lys

550

Thr Met Tyr His Trp

570

Gly Glu Leu Met Asp

585

Ser Glu Gly His Val

600

Ile Ala Asp Met Ser

615

Val Lys Thr Ile Val

630

Leu Lys Thr Tyr Lys

650

Ala Gly Val Ala Ser

665

Lys Met Asp Lys Thr

680

Gly Leu Ser Leu Phe

695

Lys Glu Asn Lys Arg

710

Tyr Asn Gly Asp Leu

730

235

Asp Tyr Thr Tyr Lys

255 Gly Ile Leu Glu Pro

270

Lys Asp Gly Lys Glu

285

Val Lys Asp Thr Tyr

300

Ala Gly Asn Gln Tyr

315

Asn Gln Glu Leu Glu

335 Ser Gln Ala Asp Arg 350

Thr Ser Ala Asn Leu

365

Lys Gln Val Thr Asn

380

Val Arg Thr Val Arg

395

Asn Ser Glu Lys Ser

415

Thr Pro Arg Ala Ile

430

Ser Asp Glu Glu Ile

445

Pro Asp Pro Glu His

460

Leu Gly Gly Asn Leu

475

Leu Leu Arg Lys Asp

495 Glu Gln Val Phe Lys

510

Gly Ser Tyr Ile Asp

525

Asn Val Leu Ile Asp

540

Thr Lys Asn Pro Ile

555

Ile Asp Lys Ser Phe

575 Met Ser Arg Gly Arg

590

Ala Ala Val Glu Val

605

Glu Gly Glu Thr Lys

620

Gln Ser Asp Ser Tyr

635

Asp Ile Ser Leu Met

655 Val Pro Arg Thr Ser

670

Ala Met Tyr Asn Ala

685

Ser Ser Arg Thr Leu

700

Gly Trp Tyr Thr Ser

715

Ser His Tyr Ser Asp

735

240

Val

Leu

Val

Thr

Tyr

320

Gly

Ile

Thr

Pro

Asp

400

Ile

Asn

Lys

Phe

Val

480

Asp

Leu

His

Gly

Asp

560

Ala

Ser

Leu

Gln

Tyr

640

Gln

Tyr

Glu

Asn

Asp

720

Gly

- 264 033472

Tyr

Trp

Pro

Thr 740

Val

Asn

Pro

Tyr

Lys 745

Met

Pro

Gly

Thr

Thr 750

Glu

Thr

Asp

Ala

Lys

Arg

Ala

Asp

Ser

Asp

Thr

Gly

Lys

Val

Leu

Pro

Ser

Ala

755

760

765

Phe

Val

Gly

Thr

Ser

Lys

Leu

Asp

Asp

Ala

Asn

Ala

Thr

Ala

Thr

Met

770

775

780

Asp

Phe

Thr

Asn

Trp

Asn

Gln

Thr

Leu

Thr

Ala

His

Lys

Ser

Trp

Phe

785

790

795

800

Met

Leu

Lys

Asp

Lys

Ile

Ala

Phe

Leu

Gly

Ser

Asn

Ile

Gln

Asn

Thr

805

810

815

Ser

Thr

Asp

Thr

Ala

Ala

Thr

Thr

Ile

Asp

Gln

Arg

Lys

Leu

Glu

Ser

820

825

830

Ser

Asn

Pro

Tyr

Lys

Val

Tyr

Val

Asn

Asp

Lys

Glu

Ala

Ser

Leu

Thr

835

840

845

Glu

Gln

Glu

Lys

Asp

Tyr

Pro

Glu

Thr

Gln

Ser

Val

Phe

Leu

Glu

Ser

850

855

860

Ser

Asp

Ser

Lys

Lys

Asn

Ile

Gly

Tyr

Phe

Phe

Phe

Lys

Lys

Ser

Ser

865

870

875

880

Ile

Ser

Met

Ser

Lys

Ala

Leu

Gln

Lys

Gly

Ala

Trp

Lys

Asp

Ile

Asn

885

890

895

Glu

Gly

Gln

Ser

Asp

Lys

Glu

Val

Glu

Asn

Glu

Phe

Leu

Thr

Ile

Ser

900

905

910

Gln

Ala

His

Lys

Gln

Asn

Gly

Asp

Ser

Tyr

Gly

Tyr

Met

Leu

Ile

Pro

915

920

925

Asn

Val

Asp

Arg

Ala

Thr

Phe

Asn

Gln

Met

Ile

Lys

Glu

Leu

Glu

Ser

930

935

940

Ser

Leu

Ile

Glu

Asn

Asn

Glu

Thr

Leu

Gln

Ser

Val

Tyr

Asp

Ala

Lys

945

950

955

960

Gln

Gly

Val

Trp

Gly

Ile

Val

Lys

Tyr

Asp

Asp

Ser

Val

Ser

Thr

Ile

965

970

975

Ser

Asn

Gln

Phe

Gln

Val

Leu

Lys

Arg

Gly

Val

Tyr

Thr

Ile

Arg

Lys

980

985

990

Glu

Gly

Asp

Glu

Tyr

Lys

Ile

Ala

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Glu

Thr

Gln

Glu

995

1000

1005

Ser

Ala

Pro

Asp

Gln

Glu

Val

Phe

Lys

Lys

Leu

Glu

Gln

Ala

Ala

Gln

1010

1015

1020

Pro

Gln

Val

Gln

Asn

Ser

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Ser

Glu

Glu

Glu

Lys

1025

1030

1035

1040

Asn

His

Ser

Asp

Gln

Lys

Asn

Leu

Pro

Gln

Thr

Gly

Glu

Gly

Gln

Ser

1045

1050

1055

Ile

Leu

Ala

Ser

Leu

Gly

Phe

Leu

Leu

Leu

Gly Ala

Phe

Tyr

Leu

Phe

1060

1065

1070

Arg

Arg

Gly

Lys

Asn

Asn

1075

<210> 84 <211> 1067 <212> Белок <213> Streptococcus pneumoniae серотип 2 (штамм D39/NCTC 7466) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 84

Met 1

Gln

Thr

Lys

Thr 5

Lys

Lys

Leu

Ile

Val 10

Ser

Leu

Ser

Ser

Leu 15

Val

Leu

Ser

Gly

Phe

Leu

Leu

Asn

His

Tyr

Met

Thr

Val

Gly

Ala

Glu

Glu

20

25

30

Thr

Thr

Thr

Asn

Thr

Ile

Gln

Gln

Ser

Gln

Lys

Glu

Val

Gln

Tyr

Gln

35

40

45

Gln

Arg

Asp

Thr

Lys

Asn

Leu

Val

Glu

Asn

Gly

Asp

Phe

Gly

Gln

Thr

50

55

60

- 265 033472

Glu Asp

Ala Trp

Ile Glu

Arg Ala

Lys Leu

130

Val Arg 145

Ala Thr

Ser Pro

Thr Gly

Ala Asp

210

Lys Ile

225

Tyr Thr

Ile Leu

Asp Gly

Lys Asp

290

Gly Asn 305

Gln Glu

Gln Ala

Ser Ala

Gln Val

370 Arg Thr 385

Ser Glu

Pro Arg

Asp Glu

Asp Pro

450 Gly Gly 465

Leu Arg

Gln Val

Ser Tyr

Val Leu

530 Lys Asn 545

Asp Lys

Gly Ser

Val Asp

Ala Lys

100

Ala Val

115

Arg Phe

Ile Ile

Thr Ser

Thr Leu

180

Thr Gly

195

Gln Pro

Asp Leu

Tyr Lys

Glu Pro

260

Lys Glu 275

Thr Tyr

Gln Tyr

Leu Glu

Asp Arg

340

Asn Leu

355

Thr Asn

Val Arg

Lys Ser

Ala Ile

420

Glu Ile 435

Glu His

Asn Leu

Lys Asp

Phe Lys

500

Ile Asp

515

Ile Asp

Pro Ile

Ser Phe

Ser Pro

Gln Lys

Asp Gly

His Arg

Lys Ile

Glu Glu

150

Gly Thr 165

Asp Val

Thr Val

Ser Glu

Pro Ile

230

Val Glu 245

Leu Lys

Val Lys

Thr Asp

Tyr Asp

310 Gly Lys 325

Ile Tyr

Thr Ala

Pro Ser

Asp Ser

390

Ile Val

405

Asn Asn

Lys Lys

Phe Arg

Val Asp

470

Asp Gln

485

Leu Val

His Thr

Gly Leu

Asp Lys

550

Ala Pro

Trp Thr

Asn Ser

Ala Ile

Met Val

120

Lys Thr

135

Ser Gly

Lys Asp

Asp Lys

Ser Phe

200 Asp Ser 215

Gly Lys

Asn Pro

Glu Gly

Lys Ile

280 Arg Leu 295

Ser Lys

Val Ala

Leu Trp

Thr Tyr

360 Ser Arg 375

Met Glu

Gly Asn

Thr Leu

Tyr Thr

440

Lys Thr

455

Met Gly

Glu Ile

Asp Gln

Asn Val

520

Ser Gln

535

Asp Lys

Leu Leu

Gly Ser

Ser Ala

Thr Ile

105

Pro Ile

Asp Asn

Lys Asp

Trp Gln

170 Ile Lys 185

Lys Asp

Gln Thr

Lys His

Asp Val

250

Thr Thr 265

Pro Leu

Asp Asp

Asn Glu

Asp Ser

330

Glu Lys

345

Arg Lys

Tyr Tyr

Trp Met

Trp Trp

410

Ser Leu 425

Asp Val

Thr Asp

Arg Val

Ser Ser

490 Gly Glu 505 Ala Tyr

Leu Leu

Met Gln

Val Asn

Lys Ala 75

Asp Ala

Ser Ser

Glu Ala

Lys Val

140 Lys Arg 155

Thr Ile

Leu Glu

Ile Glu

Asp Lys

220

Val Phe 235

Ala Ser

Asn Val

Lys Ile

Trp Asn

300

Gln Met

315

Leu Ser

Phe Ser

Leu Glu

Gln Asp

380

His Lys

395

Asp Tyr

Met Lys

Ile Glu

Asn Pro

460 Lys Val 475

Thr Ile

Gly Phe

Thr Gly

Pro Val

540

Thr Met

555

Gly Glu

Gln Gly

Ser Thr

Pro Glu

110 Lys Lys 125

Gly Ile

Leu Trp

Glu Ala

Leu Phe

190

Leu Val

205

Gln Leu

Ser Leu

Val Lys

Ile Val

270

Leu Ala 285

Gly Ile

Ala Lys

Ser Ile

Asn Tyr

350

Glu Met

365

Glu Thr

His Val

Glu Ile

Glu Tyr

430

Lys Phe

445

Phe Lys

Ile Ala

Arg Ser

Tyr Gln

510

Ala Tyr

525

Ile Gln

Tyr His

Leu Met

Trp Ser

Arg Val

Lys Leu

Lys Tyr

Ala Lys

Asn Ser

160 Asp Tyr 175

Tyr Glu

Glu Val

Glu Glu

Ala Asp

240 Asn Gly 255

Ser Lys

Ser Val

Ile Ala

Leu Asn

320

Ser Ser 335

Lys Thr

Ala Lys

Val Val

Tyr Asn

400

Gly Thr

415

Phe Ser

Val Pro

Ala Leu

Gly Leu

480

Ile Glu 495

Asp Gly

Gly Asn

Lys Thr

Trp Ile

560 Asp Met

- 266 033472

Ser Arg Gly

Ala Val Glu

595

Gly Glu Thr

610

Ser Asp Ser

625

Ile Ser Leu

Pro Arg Thr

Met Tyr Asn

675

Ser Arg Thr

690

Trp Tyr Thr

705

His Tyr Ser Gly Thr Thr Val Leu Pro

755

Ala Thr Ala

770

His Lys Ser

785

Asn Ile Gln

Arg Lys Leu

Glu Ala Ser

835

Val Phe Leu

850

Phe Lys Lys

865

Trp Lys Asp

Phe Leu Thr

Tyr Met Leu

915

Lys Glu Leu

930

Val Tyr Asp

945

Ser Val Ser

Tyr Thr Ile

Pro Glu Thr

995

Glu Gln Ala

1010

Ser Glu Glu

1025

Gly Glu Gly

Ala Phe Tyr

565

Arg Ser Ile Ser

580

Val Leu Arg Gly

Lys Gln Arg Leu

615

Tyr Tyr Asp Val

630

Met Gln Ser Leu

645

Ser Tyr Leu Ser

660

Ala Glu Lys Gly

Leu Asn Tyr Glu

695

Ser Asp Gly Met

710

Asp Gly Tyr Trp

725

Glu Thr Asp Ala

740

Ser Ala Phe Val

Thr Met Asp Phe

775

Trp Phe Met Leu

790

Asn Thr Ser Thr

805

Glu Ser Ser Asn

820

Leu Thr Glu Gln

Glu Ser Ser Asp

855

Ser Ser Ile Ser

870

Ile Asn Glu Gly

885

Ile Ser Gln Ala

900

Ile Pro Asn Val

Glu Ser Ser Leu

935

Ala Lys Gln Gly

950

Thr Ile Ser Asn

965

Arg Lys Glu Gly

980

Gln Glu Ser Ala

Ala Gln Pro Gln

1015

Glu Lys Asn His

1030

Gln Ser Ile Leu

1045

Leu Phe Arg Arg

1060

570

Arg Ala Asn Ser Glu

585

Ile His Arg Ile Ala

600

Gln Ser Leu Val Lys

620

Phe Lys Asn Leu Lys 635

Leu Ser Asp Ala Gly

650

Ala Phe Asn Lys Met

665

Phe Gly Phe Gly Leu

680

His Met Asn Lys Glu

700

Phe Tyr Leu Tyr Asn 715

Pro Thr Val Asn Pro

730

Lys Arg Ala Asp Ser 745

Gly Thr Ser Lys Leu

760

Thr Asn Trp Asn Gln

780

Lys Asp Lys Ile Ala 795

Asp Thr Ala Ala Thr

810

Pro Tyr Lys Val Tyr

825

Glu Lys Asp Tyr Pro

840

Ser Lys Lys Asn Ile

860

Met Ser Lys Ala Leu 875

Gln Ser Asp Lys Glu

890

His Lys Gln Asn Gly

905

Asp Arg Ala Thr Phe

920

Ile Glu Asn Asn Glu 940 Val Trp Gly Ile Val 955

Gln Phe Gln Val Leu

970

Asp Glu Tyr Lys Ile

985

Pro Asp Gln Glu Val 1000

Val Gln Asn Ser Lys

Ser Asp Gln

Ala Ser Leu 1050

Gly Lys Asn 1065

1020

Lys Asn Leu 1035

Gly Phe Leu

Asn

575

Gly His Val Ala

590

Asp Met Ser Glu

605

Thr Ile Val Gln

Thr Tyr Lys Asp

640

Val Ala Ser Val

655

Asp Lys Thr Ala

670

Ser Leu Phe Ser

685

Asn Lys Arg Gly

Gly Asp Leu Ser

720

Tyr Lys Met Pro

735

Asp Thr Gly Lys

750

Asp Asp Ala Asn

765

Thr Leu Thr Ala

Phe Leu Gly Ser

800

Thr Ile Asp Gln

815

Val Asn Asp Lys

830

Glu Thr Gln Ser

845

Gly Tyr Phe Phe

Gln Lys Gly Ala

880

Val Glu Asn Glu

895

Asp Ser Tyr Gly

910

Asn Gln Met Ile

925

Thr Leu Gln Ser

Lys Tyr Asp Asp

960

Lys Arg Gly Val

975

Ala Tyr Tyr Asn

990

Phe Lys Lys Leu 1005

Glu Lys Glu Lys

Pro Gln Thr

1040

Leu Leu Gly

1055

- 267 033472 <210> 85 <211> 805 <212> Белок <213> Streptococcus pyogenes серотип M1 <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 85

Met

Asn

Thr

Tyr

Phe

Cys

Thr

His

His

Lys

Gln

Leu

Leu

Leu

Tyr

Ser

1

5

10

15

Asn

Leu

Phe

Leu

Ser

Phe

Ala

Met

Met

Gly

Gln

Gly

Thr

Ala

Ile

Tyr

20

25

30

Ala

Asp

Thr

Leu

Thr

Ser

Asn

Ser

Glu

Pro

Asn

Asn

Thr

Tyr

Phe

Gln

35

40

45

Thr

Gln

Thr

Leu

Thr

Thr

Thr

Asp

Ser

Glu

Lys

Lys

Val

Val

Gln

Pro

50

55

60

Gln

Gln

Lys

Asp

Tyr

Tyr

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Gln

Trp

Asn

Ser

Ile

65

70

75

80

Ile

Ala

Gly

Asn

Asp

Ala

Tyr

Asp

Lys

Thr

Asn

Pro

Asp

Met

Val

Thr

85

90

95

Phe

His

Asn

Lys

Ala

Glu

Lys

Asp

Ala

Gln

Asn

Ile

Ile

Lys

Ser

Tyr

100

105

110

Gln

Gly

Pro

Asp

His

Glu

Asn

Arg

Thr

Tyr

Leu

Trp

Glu

His

Ala

Lys

115

120

125

Asp

Tyr

Ser

Ala

Ser

Ala

Asn

Ile

Thr

Lys

Thr

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

130

135

140

Lys

Ile

Ala

Lys

Gln

Ile

Thr

Asn

Pro

Glu

Ser

Cys

Tyr

Tyr

Gln

Asp

145

150

155

160

Ser

Lys

Ala

Ile

Ala

Ile

Val

Lys

Asp

Gly

Met

Ala

Phe

Met

Tyr

Glu

165

170

175

His

Ala

Tyr

Asn

Leu

Asp

Arg

Glu

Asn

His

Gln

Thr

Thr

Gly

Lys

Glu

180

185

190

Asn

Lys

Glu

Asn

Trp

Trp

Val

Tyr

Glu

Ile

Gly

Thr

Pro

Arg

Ala

Ile

195

200

205

Asn

Asn

Thr

Leu

Ser

Leu

Met

Tyr

Pro

Tyr

Phe

Thr

Gln

Glu

Glu

Ile

210

215

220

Leu

Lys

Tyr

Thr

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Phe

Val

Pro

Asp

Pro

Thr

Arg

225

230

235

240

Phe

Arg

Val

Arg

Ala

Ala

Asn

Phe

Ser

Pro

Phe

Glu

Ala

Asn

Ser

Gly

245

250

255

Asn

Leu

Ile

Asp

Met

Gly

Arg

Val

Lys

Leu

Ile

Ser

Gly

Ile

Leu

Arg

260

265

270

Lys

Asp

Asp

Leu

Glu

Ile

Ser

Asp

Thr

Ile

Lys

Ala

Ile

Glu

Lys

Val

275

280

285

Phe

Thr

Leu

Val

Asp

Glu

Gly

Asn

Gly

Phe

Tyr

Gln

Asp

Gly

Ser

Leu

290

295

300

Ile

Asp

His

Val

Val

Thr

Asn

Ala

Gln

Ser

Pro

Leu

Tyr

Lys

Lys

Gly

305

310

315

320

Ile

Ala

Tyr

Thr

Gly

Ala

Tyr

Gly

Asn

Val

Leu

Ile

Asp

Gly

Leu

Ser

325

330

335

Gln

Leu

Ile

Pro

Ile

Ile

Gln

Lys

Thr

Lys

Ser

Pro

Ile

Lys

Ala

Asp

340

345

350

Lys

Met

Ala

Thr

Ile

Tyr

His

Trp

Ile

Asn

His

Ser

Phe

Phe

Pro

Ile

355

360

365

Ile

Val

Arg

Gly

Glu

Met

Met

Asp

Met

Thr

Arg

Gly

Arg

Ser

Ile

Ser

370

375

380

Arg

Phe

Asn

Ala

Gln

Ser

His

Val

Ala

Gly

Ile

Glu

Ala

Leu

Arg

Ala

385

390

395

400

Ile

Leu

Arg

Ile

Ala

Asp

Met

Ser

Glu

Glu

Pro

His

Arg

Leu

Ala

Leu

405

410

415

- 268 033472

Lys

Thr

Arg

Ile 420

Lys

Thr

Leu Val

Thr 425

Gln

Gly

Asn

Ala

Phe 430

Tyr

Asn

Val

Tyr

Asp

Asn

Leu

Lys

Thr

Tyr

His

Asp

Ile

Lys

Leu

Met

Lys

Glu

435

440

445

Leu

Leu

Ser

Asp

Thr

Ser

Val

Pro

Val

Gln

Lys

Leu

Asp

Ser

Tyr

Val

450

455

460

Ala

Ser

Phe

Asn

Ser

Met

Asp

Lys

Leu

Ala

Leu

Tyr

Asn

Asn

Lys

His

465

470

475

480

Asp

Phe

Ala

Phe

Gly

Leu

Ser

Met

Phe

Ser

Asn

Arg

Thr

Gln

Asn

Tyr

485

490

495

Glu

Ala

Met

Asn

Asn

Glu

Asn

Leu

His

Gly

Trp

Phe

Thr

Ser

Asp

Gly

500

505

510

Met

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asn

Asp

Leu

Gly

His

Tyr

Ser

Glu

Asn

Tyr

515

520

525

Trp

Ala

Thr

Val

Asn

Pro

Tyr

Arg

Leu

Pro

Gly

Thr

Thr

Glu

Thr

Glu

530

535

540

Gln

Lys

Pro

Leu

Glu

Gly

Thr

Pro

Glu

Asn

Ile

Lys

Thr

Asn

Tyr

Gln

545

550

555

560

Gln

Val

Gly

Met

Thr

Gly

Leu

Ser

Asp

Asp

Ala

Phe

Val

Ala

Ser

Lys

565

570

575

Lys

Leu

Asn

Asn

Thr

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

Met

Thr

Phe

Thr

Asn

Trp

580

585

590

Asn

Lys

Ser

Leu

Thr

Leu

Asn

Lys

Gly

Trp

Phe

Ile

Leu

Gly

Asn

Lys

595

600

605

Ile

Ile

Phe

Val

Gly

Ser

Asn

Ile

Lys

Asn

Gln

Ser

Ser

His

Lys

Ala

610

615

620

Tyr

Thr

Thr

Ile

Glu

Gln

Arg

Lys

Glu

Asn

Gln

Lys

Tyr

Pro

Tyr

Cys

625

630

635

640

Ser

Tyr

Val

Asn

Asn

Gln

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Asn

Gln

Leu

Val

Asp

645

650

655

Phe

Thr

Asn

Thr

Lys

Ser

Ile

Phe

Leu

Glu

Ser

Asp

Asp

Pro

Ala

Gln

660

665

670

Asn

Ile

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Phe

Lys

Pro

Thr

Thr

Leu

Ser

Ile

Ser

Lys

675

680

685

Ala

Leu

Gln

Thr

Gly

Lys

Trp

Gln

Asn

Ile

Lys

Ala

Asp

Asp

Lys

Ser

690

695

700

Pro

Glu

Ala

Ile

Lys

Glu

Val

Ser

Asn

Thr

Phe

Ile

Thr

Ile

Met

Gln

705

710

715

720

Asn

His

Thr

Gln

Asp

Gly

Asp

Arg

Tyr

Ala

Tyr

Met

Met

Leu

Pro

Asn

725

730

735

Met

Thr

Arg

Gln

Glu

Phe

Glu

Thr

Tyr

Ile

Ser

Lys

Leu

Asp

Ile

Asp

740

745

750

Leu

Leu

Glu

Asn

Asn

Asp

Lys

Leu

Ala

Ala

Val

Tyr

Asp

His

Asp

Ser

755

760

765

Gln

Gln

Met

His

Val

Ile

His

Tyr

Gly

Lys

Lys

Ala

Thr

Met

Phe

Ser

770

775

780

Asn

His

Asn

Leu

Ser

His

Gln

Gly

Phe

Tyr

Ser

Phe

Pro

His

Pro

Val

785

790

795

800

Arg

Gln

Asn

Gln

Gln

805

<210> 86 <211> 780 <212> Белок <213> Streptococcus pyogenes серотип M2 (штамм MGAS10270) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 86

Met Val Tyr Phe Tyr Leu Val Asn Gln Ser Thr Phe Ile Ile Ser Phe

5 10 15

- 269 033472

Leu Tyr Trp Arg Asn Val Ser Val Asn Thr Tyr Phe Cys Thr His His

2530

Lys Gln Leu Leu Leu Tyr Ser Asn Leu Phe Leu Ser Phe Ala Met Ile

4045

Gly Gln Gly Thr Ala Ile Tyr Ala Asp Thr Leu Thr Ser Asn Ser Glu

5560

Pro Asn Asn Thr Tyr Phe Gln Thr Gln Thr Leu Thr Thr Thr AspSer

70 7580

Glu Lys Lys Val Val Gln Pro Gln Gln Lys Asp Tyr Tyr Thr GluLeu

9095

Leu Asp Gln Trp Asn Ser Ile Ile Ala Gly Asn Asp Ala Tyr Asp Lys

100 105110

Thr Asn Pro Asp Met Val Thr Phe His Asn Lys Ala Glu Lys Asp Ala

115 120125

Gln Asn

130 Tyr Leu 145

Lys Thr

Glu Ser

Gly Met

His Gln

210

Ile Gly

225

Tyr Phe

Phe Val

Pro Phe

Leu Ile

290

Ile Lys 305

Phe Tyr

Ser Pro

Val Leu

Lys Ser

370

Asn His 385

Thr Arg

Gly Ile

Glu Pro

Gln Gly

450

Asp Ile 465

Gln Lys

Ala Leu

Ile Ile

Trp Glu

Tyr Arg

Cys Tyr

180

Ala Phe 195

Thr Thr

Thr Pro

Thr Gln

Pro Asp

260

Glu Ala 275

Ser Gly

Ala Ile

Gln Asp

Leu Tyr

340

Ile Asp

355

Pro Ile

Ser Phe

Gly Arg

Glu Ala

420

His Arg

435

Asn Ala

Lys Leu

Leu Asp

Tyr Asn

500

Lys Ser

His Ala

150

Asn Ile

165

Tyr Gln

Met Tyr

Gly Lys

Arg Ala

230

Glu Glu

245

Pro Thr

Asn Ser

Ile Leu

Glu Lys

310 Gly Ser 325

Lys Lys

Gly Leu

Glu Ala

Phe Pro

390

Ser Ile

405

Leu Arg

Leu Glu

Phe Tyr

Met Lys

470 Ser Tyr 485 Asn Lys

Tyr Gln

135

Lys Asp

Glu Lys

Asp Ser

Glu His

200

Glu Asn

215

Ile Asn

Ile Leu

Arg Phe

Gly Asn

280 Arg Lys 295

Val Phe

Leu Ile

Gly Ile

Ser Gln

360 Asp Lys 375

Ile Ile

Ser Arg

Ala Ile

Leu Lys

440

Asn Val

455

Glu Leu

Val Ala

His Asp

Gly Pro

Tyr Ser

Ile Ala

170 Lys Ala 185 Ala Tyr

Lys Glu

Asn Thr

Lys Tyr

250

Arg Val

265

Leu Ile

Asp Asp

Thr Leu

Asp His

330

Ala Tyr

345

Leu Ile

Met Ala

Val Arg

Phe Asn

410 Leu Arg 425

Thr Arg

Tyr Asp

Leu Ser

Ser Phe

490

Phe Ala

505

Asp His

140

Ala Ser

155

Lys Gln

Ile Ala

Asn Leu

Asn Trp

220

Leu Ser 235

Thr Ala

Arg Ala

Asp Met

Leu Glu

300 Val Asp 315

Val Val

Thr Gly

Pro Ile

Thr Ile

380

Gly Glu 395

Ala Gln

Ile Ala

Ile Lys

Asn Leu

460 Asp Thr 475

Asn Ser

Phe Gly

Glu Asn

Thr Asn

Ile Thr

Ile Val

190 Asn Arg 205 Trp Val

Leu Met

Pro Ile

Ala Asn

270 Gly Arg 285

Ile Ser

Glu Gly

Thr Asn

Ala Tyr

350

Ile Gln

365

Tyr His

Met Met

Ser His

Asp Met

430

Thr Leu

445

Lys Thr

Ser Val

Met Asp

Leu Ser

510

Arg Thr

Ile Thr

160

Asn Pro

175

Lys Asp

Glu Asn

Tyr Glu

Tyr Pro

240

Glu Lys

255

Phe Ser

Val Lys

Asp Thr

Asn Gly

320

Thr Gln

335

Gly Asn

Lys Thr

Trp Ile

Asp Met

400

Val Ala

415

Ser Glu

Val Thr

Tyr His

Pro Val

480

Lys Leu

495

Met Phe

- 270 033472

Ser Asn Arg

Thr

Gln

Asn Tyr

Glu Ala Met 520

Asn

Asn

Glu 525

Asn

Leu

His

515

Gly

Trp

Phe

Thr

Ser

Asp

Gly

Met

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asn

Asp

Leu

530

535

540

Gly

His

Tyr

Ser

Glu

Asn

Tyr

Trp

Ala

Thr

Val

Asn

Pro

Tyr

Arg

Leu

545

550

555

560

Pro

Gly

Thr

Thr

Glu

Thr

Glu

Gln

Lys

Pro

Leu

Glu

Gly

Thr

Pro

Glu

565

570

575

Asn

Ile

Lys

Thr

Asn

Tyr

Gln

Gln

Val

Gly

Met

Thr

Ser

Leu

Ser

Asp

580

585

590

Asp

Ala

Phe

Val

Ala

Ser

Lys

Lys

Leu

Asn

Asn

Thr

Ser

Ala

Leu

Ala

595

600

605

Ala

Met

Thr

Phe

Thr

Asn

Trp

Asn

Lys

Ser

Leu

Thr

Leu

Asn

Lys

Gly

610

615

620

Trp

Phe

Ile

Leu

Gly

Asn

Lys

Ile

Ile

Phe

Val

Gly

Ser

Asn

Ile

Lys

625

630

635

640

Asn

Gln

Ser

Ser

His

Lys

Ala

Tyr

Thr

Thr

Ile

Glu

Gln

Arg

Lys

Glu

645

650

655

Asn

Gln

Lys

His

Pro

Tyr

Cys

Ser

Tyr

Val

Asn

Asn

Gln

Pro

Val

Asp

660

665

670

Leu

Asn

Asn

Gln

Leu

Val

Asp

Phe

Thr

Asn

Thr

Lys

Ser

Ile

Phe

Leu

675

680

685

Glu

Ser

Asp

Asp

Pro

Ala

Gln

Asn

Ile

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Phe

Lys

Pro

690

695

700

Arg

Thr

Leu

Ser

Ile

Ser

Lys

Ala

Leu

Gln

Thr

Gly

Lys

Trp

Gln

Asn

705

710

715

720

Ile

Lys

Ala

Asp

Asp

Lys

Ser

Pro

Glu

Ala

Ile

Lys

Glu

Val

Ser

Asn

725

730

735

Thr

Phe

Ile

Thr

Ile

Met

Gln

Asn

His

Thr

Gln

Glu

Gly

Asp

Arg

Tyr

740

745

750

Ala

Tyr

Met

Met

Leu

Pro

Asn

Met

Thr

Arg

Gln

Glu

Phe

Glu

Thr

Tyr

755

760

765

Ile

Ser

Lys

Leu

Asp

Ile

Asp

Leu

Leu

Glu

Asn

Asn

770

775

780

<210> 87 <211> 868 <212> Белок <213> Streptococcus pyogenes серотип M4 (штамм MGAS10750) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 87

Met

Asn

Thr

Tyr

Phe

Cys

Thr

His

His

Lys

Gln

Leu

Leu

Leu

Tyr

Ser

1

5

10

15

Asn

Leu

Phe

Leu

Ser

Phe

Ala

Met

Met

Gly

Gln

Gly

Thr

Ala

Ile

Tyr

20

25

30

Ala

Asp

Thr

Leu

Thr

Ser

Asn

Ser

Lys

Pro

Asn

Asn

Thr

Tyr

Phe

Gln

35

40

45

Thr

Gln

Thr

Leu

Thr

Thr

Thr

Asp

Ser

Glu

Lys

Lys

Val

Val

Gln

Pro

50

55

60

Gln

Gln

Lys

Asp

Tyr

Tyr

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Gln

Trp

Asn

Ser

Ile

65

70

75

80

Ile

Ala

Gly

Asn

Asp

Ala

Tyr

Asp

Lys

Thr

Asn

Pro

Asp

Met

Val

Thr

85

90

95

Phe

His

Asn

Lys

Ala

Glu

Lys

Asp

Ala

Gln

Asn

Ile

Ile

Lys

Ser

Tyr

100

105

110

Gln

Glu

Pro

Asp

His

Glu

Asn

Arg

Thr

Tyr

Leu

Trp

Glu

His

Ala

Lys

115

120

125

Asp

Tyr

Ser

Ala

Ser

Ala

Asn

Ile

Thr

Lys

Thr

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

130

135

140

- 271 033472

Lys Ile

145

Ser Lys

His Ala

Asn Lys

Asn Asn

210 Leu Lys 225

Phe Arg

Asn Leu

Lys Asp

Phe Thr

290

Ile Asp 305

Ile Ala

Gln Leu

Lys Met

Ile Val

370 Arg Phe 385

Ile Leu

Lys Thr

Val Tyr

Leu Leu

450

Ala Ser 465

Asp Phe

Glu Ala

Met Phe

Trp Ala

530

Gln Lys

545

Gln Val

Lys Leu

Asn Lys

Ile Ile

610

Tyr Thr

625

Ser Tyr

Ala Lys

Ala Ile

Tyr Asn

180

Glu Asn 195

Thr Leu

Tyr Thr

Val Arg

Ile Asp

260

Asp Leu

275

Leu Val

His Val

Tyr Thr

Ile Pro

340

Ala Thr

355

Arg Gly

Asn Ala

Arg Ile

Arg Ile

420

Asp Asn

435

Ser Asp

Phe Asn

Ala Phe

Met Asn

500

Tyr Leu

515

Thr Val

Pro Leu

Gly Met

Asn Asn

580

Ser Leu

595

Phe Val

Thr Ile

Val Asn

Gln Ile

150

Ala Ile

165

Leu Asp

Trp Trp

Ser Leu

Ala Pro

230

Ala Ala 245

Met Gly

Glu Ile

Asp Glu

Val Thr

310 Gly Ala 325

Ile Ile

Ile Tyr

Glu Met

Gln Ser

390 Ala Asp 405

Lys Thr

Leu Lys

Thr Ser

Ser Met

470

Gly Leu 485

Asn Glu

Tyr Asn

Asn Pro

Glu Gly

550

Thr Ser 565

Thr Ser

Thr Leu

Gly Ser

Glu Gln

630

Asn Gln

Thr Asn

Val Lys

Arg Glu

Asp Tyr

200

Met Tyr 215

Ile Glu

Asn Phe

Arg Val

Ser Asp

280

Gly Asn 295

Asn Ala

Tyr Gly

Gln Lys

His Trp

360 Met Asp 375

His Val

Met Ser

Leu Val

Thr Tyr

440

Val Pro

455

Asp Lys

Ser Met

Asn Leu

Asn Asp

520

Tyr Arg 535

Thr Pro

Leu Ser

Ala Leu

Asn Lys

600

Asn Ile

615

Arg Lys

Pro Val

Pro Glu

Asp Gly

170

Asn His

185

Glu Ile

Pro Tyr

Lys Phe

Pro Pro

250

Lys Leu

265

Thr Ile

Gly Phe

Gln Ser

Asn Val

330

Thr Lys

345

Ile Asn

Met Thr

Ala Gly

Glu Glu

410

Thr Gln

425

His Asp

Val Gln

Leu Ala

Phe Ser

490

His Gly

505

Leu Gly

Leu Pro

Glu Asn

Asp Asp

570

Ala Ala

585

Gly Trp

Lys Asn

Glu Asn

Asp Leu

Ser Cys

155

Met Ala

Gln Thr

Gly Thr

Phe Thr

220

Val Pro

235

Phe Glu

Ile Ser

Lys Ala

Tyr Gln

300

Pro Leu

315

Leu Ile

Ser Pro

His Ser

Arg Gly

380

Ile Glu

395

Pro His

Gly Asn

Ile Lys

Lys Leu

460

Leu Tyr

475

Asn Arg

Trp Phe

His Tyr

Gly Thr

540 Ile Lys 555

Ala Phe

Met Thr

Phe Ile

Gln Ser

620

Gln Lys

635

Asn Asn

Tyr Tyr

Phe Met

Thr Gly

190

Pro Arg

205

Gln Glu

Asp Pro

Ala Asn

Gly Ile

270

Ile Glu 285

Asp Gly

Tyr Lys

Asp Gly

Ile Glu

350

Phe Phe

365

Arg Ser

Ala Leu

Arg Leu

Val Phe

430

Leu Met

445

Asp Ser

Asn Asn

Thr Gln

Thr Ser

510

Ser Glu 525

Thr Glu

Thr Asn

Val Ala

Phe Thr

590

Leu Gly

605

Ser His

His Pro

Gln Leu

Gln Asp

160 Tyr Glu 175

Lys Glu

Ala Ile

Glu Ile

Thr Arg

240

Ser Gly

255

Leu Arg

Lys Val

Ser Leu

Lys Gly

320

Leu Ser 335

Ala Asp

Pro Ile

Ile Ser

Arg Ala

400

Ala Leu

415

Tyr Asn

Lys Glu

Tyr Val

Lys His

480 Asn Tyr 495

Asp Gly

Asn Tyr

Thr Glu

Tyr Gln

560 Ser Lys 575

Asn Trp

Asn Lys

Lys Ala

Tyr Cys

640 Val Asp

- 272 033472

645

650

655

Phe

Thr

Asn

Thr

Lys

Ser

Ile

Phe

Leu

Glu

Ser

Asp

Asp

Pro

Ala

Gln

660

665

670

Asn

Ile

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Phe

Lys

Pro

Thr

Thr

Leu

Ser

Ile

Ser

Lys

675

680

685

Ala

Leu

Gln

Thr

Gly

Lys

Trp

Gln

Asn

Ile

Lys

Ala

Asp

Asp

Lys

Ser

690

695

700

Pro

Glu

Ala

Ile

Lys

Glu

Val

Ser

Asn

Thr

Phe

Ile

Thr

Ile

Met

Gln

705

710

715

720

Asn

His

Thr

Gln

Asp

Gly

Asp

Arg

Tyr

Ala

Tyr

Met

Met

Leu

Pro

Asn

725

730

735

Met

Thr

Arg

Gln

Glu

Phe

Glu

Thr

Tyr

Ile

Ser

Lys

Leu

Asp

Ile

Asp

740

745

750

Leu

Leu

Glu

Asn

Asn

Asp

Lys

Leu

Ala

Ala

Val

Tyr

Asp

His

Asp

Ser

755

760

765

Gln

Gln

Met

His

Val

Ile

His

Tyr

Glu

Lys

Lys

Ala

Thr

Thr

Phe

Ser

770

775

780

Asn

His

Asn

Leu

Ser

His

Gln

Gly

Phe

Tyr

Ser

Phe

Pro

His

Pro

Val

785

790

795

800

Lys

Gln

Asn

Gln

Gln

Gln

Lys

Leu

Ala

His

Gln

Gly

Ile

Ala

Ala

Lys

805

810

815

Asn

Asn

Ala

Leu

Asn

Ser

His

Lys

Ile

Pro

His

Lys

Arg

Gln

Arg

Arg

820

825

830

Leu

Pro

Arg

Thr

Gly

Tyr

Gln

Ser

Ser

Ser

Leu

Glu

Phe

Leu

Gly

Gly

835

840

845

Ala

Leu

Val

Ala

Ser

Phe

Asn

His

Ile

Thr

Lys

Pro

Phe

Arg

Lys

Lys

850

855

860

Asp

Leu

Arg

Ile

865

<210> 88 <211> 828 <212> Белок <213> Streptococcus pyogenes серотип M6 <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 88

Met 1

Val

Tyr

Phe

Tyr 5

Leu

Val

Asp

Gln

Phe 10

Thr

Phe

Ile

Ile

Ser 15

Phe

Leu

Tyr

Trp

Arg

Asn

Leu

Ser

Val

Asn

Thr

Tyr

Phe

Cys

Thr

His

His

20

25

30

Lys

Gln

Leu

Leu

Leu

Tyr

Ser

Asn

Leu

Phe

Leu

Ser

Phe

Ala

Met

Met

35

40

45

Gly

Gln

Gly

Thr

Ala

Ile

Tyr

Ala

Asp

Thr

Leu

Thr

Ser

Asn

Ser

Glu

50

55

60

Pro

Asn

Asn

Thr

Tyr

Phe

Gln

Thr

Gln

Thr

Leu

Thr

Thr

Thr

Asp

Ser

65

70

75

80

Glu

Lys

Lys

Val

Val

Gln

Pro

Gln

Gln

Lys

Asp

Tyr

Tyr

Thr

Glu

Leu

85

90

95

Leu

Asp

Gln

Trp

Asn

Ser

Ile

Ile

Ala

Gly

Asn

Asp

Ala

Tyr

Asp

Lys

100

105

110

Thr

Asn

Pro

Asp

Met

Val

Thr

Phe

His

Asn

Lys

Ala

Glu

Lys

Asp

Ala

115

120

125

Gln

Asn

Ile

Ile

Lys

Ser

Tyr

Gln

Gly

Pro

Asp

His

Glu

Asn

Arg

Thr

130

135

140

Tyr

Leu

Trp

Glu

His

Ala

Lys

Asp

Tyr

Ser

Ala

Ser

Thr

Asn

Ile

Thr

145

150

155

160

Lys

Thr

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

Lys

Ile

Ala

Lys

Gln

Ile

Thr

Asn

Pro

165

170

175

- 273 033472

Glu

Ser

Cys

Tyr 180

Tyr

Gln

Asp

Ser

Lys 185

Ala

Ile

Ala

Ile

Val 190

Lys

Asp

Gly

Met

Ala

Phe

Met

Tyr

Glu

His

Ala

Tyr

Asn

Leu

Asp

Arg

Glu

Asn

195

200

205

His

Gln

Thr

Thr

Gly

Lys

Glu

Asn

Lys

Glu

Asn

Trp

Trp

Val

Tyr

Glu

210

215

220

Ile

Gly

Thr

Pro

Arg

Ala

Ile

Asn

Asn

Thr

Leu

Ser

Leu

Met

Tyr

Pro

225

230

235

240

Tyr

Phe

Thr

Gln

Glu

Glu

Ile

Leu

Lys

Tyr

Thr

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

245

250

255

Phe

Val

Pro

Asp

Pro

Thr

Arg

Phe

Arg

Val

Arg

Ala

Ala

Asn

Phe

Ser

260

265

270

Pro

Phe

Glu

Ala

Asn

Ser

Gly

Asn

Leu

Ile

Asp

Met

Gly

Arg

Val

Lys

275

280

285

Leu

Ile

Ser

Gly

Ile

Leu

Arg

Lys

Asp

Asp

Leu

Glu

Ile

Ser

Asp

Thr

290

295

300

Ile

Lys

Ala

Ile

Glu

Lys

Val

Phe

Thr

Leu

Val

Asp

Glu

Gly

Asn

Gly

305

310

315

320

Phe

Tyr

Gln

Asp

Gly

Ser

Leu

Ile

Asp

His

Val

Val

Thr

Asn

Ala

Gln

325

330

335

Ser

Pro

Leu

Tyr

Lys

Lys

Gly

Ile

Ala

Tyr

Thr

Gly

Ala

Tyr

Gly

Asn

340

345

350

Val

Leu

Ile

Asp

Gly

Leu

Ser

Gln

Leu

Ile

Pro

Ile

Ile

Gln

Lys

Thr

355

360

365

Lys

Ser

Pro

Ile

Glu

Ala

Asp

Lys

Met

Ala

Thr

Ile

Tyr

His

Trp

Ile

370

375

380

Asn

His

Ser

Phe

Phe

Pro

Ile

Ile

Val

Arg

Gly

Glu

Met

Met

Asp

Met

385

390

395

400

Thr

Arg

Gly

Arg

Ser

Ile

Ser

Arg

Phe

Asn

Ala

Gln

Ser

His

Val

Ala

405

410

415

Gly

Ile

Glu

Ala

Leu

Arg

Ala

Ile

Leu

Arg

Ile

Ala

Asp

Met

Ser

Glu

420

425

430

Glu

Pro

His

Arg

Leu

Ala

Leu

Lys

Thr

Arg

Ile

Lys

Thr

Leu

Val

Thr

435

440

445

Gln

Gly

Asn

Ala

Phe

Tyr

Asn

Val

Tyr

Asp

Asn

Leu

Lys

Thr

Tyr

His

450

455

460

Asp

Ile

Lys

Leu

Met

Lys

Glu

Leu

Leu

Ser

Asp

Thr

Phe

Val

Pro

Val

465

470

475

480

Gln

Lys

Leu

Asp

Ser

Tyr

Val

Ala

Ser

Phe

Asn

Ser

Met

Asp

Lys

Leu

485

490

495

Ala

Leu

Tyr

Asn

Asn

Lys

His

Asp

Phe

Ala

Phe

Gly

Leu

Ser

Met

Phe

500

505

510

Ser

Asn

Arg

Thr

Gln

Asn

Tyr

Glu

Ala

Met

Asn

Asn

Glu

Asn

Leu

His

515

520

525

Gly

Trp

Phe

Thr

Ser

Asp

Gly

Met

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asn

Asp

Leu

530

535

540

Gly

His

Tyr

Ser

Glu

Asn

Tyr

Trp

Ala

Thr

Val

Asn

Pro

Tyr

Arg

Leu

545

550

555

560

Pro

Gly

Thr

Thr

Glu

Thr

Glu

Gln

Lys

Pro

Leu

Glu

Gly

Thr

Pro

Glu

565

570

575

Asn

Ile

Lys

Thr

Asp

Tyr

Gln

Gln

Val

Gly

Met

Thr

Ser

Leu

Ser

Asp

580

585

590

Asp

Ala

Phe

Val

Ala

Ser

Lys

Lys

Leu

Asn

Asn

Thr

Ser

Ala

Leu

Ala

595

600

605

Ala

Met

Thr

Phe

Thr

Asn

Trp

Asn

Lys

Ser

Leu

Thr

Leu

Asn

Lys

Gly

610

615

620

Trp

Phe

Ile

Leu

Gly

Asn

Lys

Ile

Ile

Phe

Val

Gly

Ser

Asn

Ile

Lys

625

630

635

640

Asn

Gln

Ser

Ser

His

Lys

Ala

Tyr

Thr

Thr

Ile

Glu

Gln

Arg

Lys

Glu

645

650

655

Asn

Gln

Lys

His

Pro

Tyr

Cys

Ser

Tyr

Val

Asn

Asn

Gln

Pro

Val

Asp

660

665

670

Leu

Asn

Asn

Gln

Leu

Val

Asp

Phe

Thr

Asn

Thr

Lys

Ser

Ile

Phe

Leu

- 274 033472

675

680

685

Glu

Ser

Asp

Asp

Pro

Ala

Gln

Asn

Ile

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Phe

Lys

Pro

690

695

700

Thr

Thr

Leu

Ser

Ile

Ser

Lys

Ala

Leu

Gln

Thr

Gly

Lys

Trp

Gln

Asn

705

710

715

720

Ile

Lys

Ala

Asp

Asp

Lys

Ser

Pro

Glu

Ala

Ile

Lys

Glu

Val

Ser

Asn

725

730

735

Thr

Phe

Ile

Thr

Ile

Met

Gln

Asn

His

Thr

Gln

Asp

Gly

Asp

Arg

Tyr

740

745

750

Ala

Tyr

Met

Met

Leu

Pro

Asn

Met

Thr

Arg

Gln

Glu

Phe

Glu

Thr

Tyr

755

760

765

Ile

Ser

Lys

Leu

Asp

Ile

Asp

Leu

Leu

Glu

Asn

Asn

Asp

Lys

Leu

Ala

770

775

780

Ala

Val

Tyr

Asp

His

Asp

Ser

Gln

Gln

Met

His

Val

Ile

His

Tyr

Glu

785

790

795

800

Lys

Lys

Ala

Thr

Met

Phe

Ser

Asn

His

Asn

Leu

Ser

His

Gln

Gly

Phe

805

810

815

Tyr

Ser

Phe

Pro

His

Pro

Val

Lys

Gln

Asn

Gln

Gln

820

825

<210> 89 <211> 556 <212> Белок <213> Streptococcus pyogenes серотип M12 (штамм MGAS2096) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 89

Met

Val

Tyr

Phe

Tyr

Leu

Val

Asn

Gln

Ser

Thr

Phe

Ile

Ile

Ser

Phe

1

5

10

15

Leu

Tyr

Trp

Arg

Asn

Leu

Ser

Val

Asn

Thr

Tyr

Phe

Cys

Thr

His

His

20

25

30

Lys

Gln

Leu

Leu

Leu

Tyr

Ser

Asn

Leu

Phe

Leu

Ser

Phe

Ala

Met

Met

35

40

45

Gly

Gln

Gly

Thr

Ala

Ile

Tyr

Ala

Asp

Thr

Leu

Thr

Ser

Asn

Ser

Glu

50

55

60

Pro

Asn

Asn

Thr

Tyr

Phe

Gln

Thr

Gln

Thr

Leu

Thr

Thr

Thr

Asp

Ser

65

70

75

80

Glu

Lys

Lys

Val

Val

Gln

Pro

Gln

Gln

Lys

Asp

Tyr

Tyr

Thr

Glu

Leu

85

90

95

Leu

Asp

Gln

Trp

Asn

Ser

Ile

Ile

Ala

Gly

Asn

Asp

Ala

Tyr

Asp

Lys

100

105

110

Thr

Asn

Pro

Asp

Met

Val

Thr

Phe

His

Asn

Lys

Ala

Glu

Lys

Asp

Ala

115

120

125

Gln

Asn

Ile

Ile

Lys

Ser

Tyr

Gln

Gly

Pro

Asp

His

Glu

Asn

Arg

Thr

130

135

140

Tyr

Leu

Gly

Asn

Met

Gln

Arg

Ile

Ile

Pro

Leu

Leu

Leu

Ile

Ser

Arg

145

150

155

160

Lys

Leu

Thr

Ala

Ile

Leu

Lys

Lys

Ile

Ser

Lys

Met

Lys

Ser

Leu

Met

165

170

175

Glu

Asp

Ser

Thr

Ile

Ser

Thr

Asn

Gly

Leu

Thr

Gln

Gln

Leu

Lys

Ile

180

185

190

Tyr

Asn

Asp

Met

Asp

Arg

Val

Thr

Tyr

His

Asn

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

195

200

205

Ala

Phe

Gly

Leu

Ser

Met

Thr

Ser

Lys

Asn

Val

Ala

Arg

Tyr

Glu

Ser

210

215

220

Ile

Asn

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Gly

Trp

His

Thr

Gly

Ala

Gly

Met

Ser

225

230

235

240

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Ser

Asp

Val

Lys

His

Tyr

Arg

Asp

Asn

Phe

Trp

Ala

245

250

255

Thr

Ala

Asp

Met

Lys

Arg

Leu

Ala

Gly

Thr

Thr

Thr

Leu

Asp

Asn

Glu

- 275 033472

Glu Gly Asn 305 Asp	Pro Thr 290 Gln Lys	Lys 275 Lys Asp Ile
Lys	Asn	Pro
Leu	Tyr	Lys 355
Asn	Ser 370	Leu
Tyr 385	His	Phe
Thr	Gly	Lys
Thr	Asp	Glu
Lys	Tyr	Ala 435
Ser	Lys 450	Ala
Val 465	Val	Lys
Ser	Ala	Lys
Lys	Gly	Met
Ser	Phe	Tyr 515
Lys	Ile 530	Ser
Ser 545	Asn	Glu

260

265

270

Ser

Thr

Asp

Val

Lys

Lys

Ser

Ser

Lys

Thr

Phe

Val

Gly

280

285

Phe

Asp

Asp

Gln

His

Ala

Ser

Ile

Gly

Met

Asp

Phe

Glu

295

300

Lys

Thr

Leu

Thr

Ala

Lys

Lys

Ser

Tyr

Phe

Ile

Leu

Asn

310

315

320

Val

Phe

Leu

Gly

Thr

Gly

Ile

Lys

Ser

Thr

Asp

Ser

Ser

325

330

335

Val

Thr

Thr

Ile

Glu

Asn

Arg

Lys

Ala

Asn

Asp

Tyr

Lys

340

345

350

Asp

Asp

Thr

Gln

Thr

Thr

Asn

Ser

Asp

Asn

Gln

Glu

Thr

360

365

Phe

Leu

Glu

Ser

Thr

Asn

Ser

Thr

Gln

Asn

Asn

Ile

Gly

375

380

Leu

Asn

Glu

Ser

Lys

Ile

Thr

Val

Lys

Lys

Glu

Ser

His

390

395

400

Trp

Ser

Asp

Ile

Asn

Lys

Ser

Gln

Lys

Asp

Ile

Gln

Lys

405

410

415

Tyr

Tyr

Glu

Val

Thr

Gln

Lys

His

Ser

Asn

Thr

Asp

Ser

420

425

430

Tyr

Val

Leu

Tyr

Pro

Gly

Leu

Ser

Lys

Asp

Val

Phe

Lys

440

445

Ser

Lys

Val

Thr

Val

Val

Lys

Gln

Glu

Asp

Asp

Phe

His

455

460

Asp

Asn

Glu

Ser

Val

Trp

Ala

Gly

Ile

Asn

Tyr

Ser

Asp

470

475

480

Thr

Phe

Glu

Ile

Asn

Asn

Thr

Lys

Val

Glu

Val

Lys

Ala

485

490

495

Phe

Ile

Leu

Thr

Lys

Lys

Asp

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Cys

500

505

510

Asn

Pro

Glu

Ser

Thr

Asn

Ser

Val

Ser

Asp

Ile

Glu

Ser

520

525

Met

Thr

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ile

Asn

Lys

Asn

Thr

Ser

Thr

535

540

Ser

Gly

Val

Arg

Phe

Glu

Leu

Thr

Lys

550

555

<210> 90 <211> 635 <212> Белок <213> Streptococcus pyogenes серотип M12 (штамм MGAS2096) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 90

Met 1

Ala

Phe Met

Tyr Glu 5

His

Ala

Tyr Asn Leu 10

Asn Arg

Glu

Asn 15

His

Gln

Thr

Thr

Gly

Lys

Glu

Asn

Lys

Glu

Asn

Trp

Trp

Val

Tyr

Glu

Ile

20

25

30

Gly

Thr

Pro

Arg

Ala

Ile

Asn

Asn

Thr

Leu

Ser

Leu

Met

Tyr

Pro

Tyr

35

40

45

Phe

Thr

Gln

Glu

Glu

Ile

Leu

Lys

Tyr

Thr

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Val

Pro

Asp

Pro

Thr

Arg

Phe

Arg

Val

Arg

Ala

Ala

Asn

Phe

Ser

Pro

65

70

75

80

Phe

Glu

Ala

Ser

Ser

Gly

Asn

Leu

Ile

Asp

Met

Gly

Arg

Val

Lys

Leu

85

90

95

Ile

Ser

Gly

Ile

Leu

Arg

Lys

Asp

Asp

Leu

Glu

Ile

Ser

Asp

Thr

Ile

100

105

110

Lys

Ala

Ile

Glu

Lys

Val

Phe

Thr

Leu

Val

Asp

Glu

Gly

Asn

Gly

Phe

- 276 033472

Tyr Gln

130

Pro Leu 145

Leu Ile

Ser Pro

His Ser

Arg Gly

210

Ile Glu 225

Pro His

Gly Asn

Ile Lys

Lys Leu

290 Leu Tyr 305

Asn Arg

Trp Phe

His Tyr

Gly Thr

370 Ile Lys 385

Ala Phe

Met Thr

Phe Ile

Gln Ser

450

Gln Lys 465

Asn Asn

Ser Asp

Thr Leu

Lys Ala

530

Phe Ile 545

Tyr Met

Ser Lys

Val Tyr

Lys Ala

610

115

Asp Gly

Tyr Lys

Asp Gly

Ile Glu

180

Phe Phe

195

Arg Ser

Ala Leu

Arg Leu

Ala Phe

260

Leu Met

275

Asp Ser

Asn Asn

Thr Gln

Thr Ser

340

Ser Glu

355

Thr Glu

Thr Asn

Val Ala

Phe Thr

420

Leu Gly

435

Ser His

His Pro

Gln Leu

Asp Pro

500

Ser Ile

515

Asp Asp

Thr Ile

Met Leu

Leu Asp

580

Asp His

595

Thr Met

Ser Leu

Lys Gly

150

Leu Ser

165

Ala Asp

Pro Ile

Ile Ser

Arg Ala

230

Ala Leu

245

Tyr Asn

Lys Glu

Tyr Val

Lys His

310

Asn Tyr

325

Asp Gly

Asn Tyr

Thr Glu

Tyr Gln

390 Ser Lys 405

Asn Trp

Asn Lys

Lys Ala

Tyr Cys

470

Val Asp

485

Ala Gln

Ser Lys

Lys Ser

Met Gln

550

Pro Asn

565

Ile Asp

Asp Ser

Phe Ser

120 Ile Asp 135

Ile Ala

Gln Leu

Lys Met

Ile Val

200 Arg Phe 215

Ile Leu

Lys Thr

Val Tyr

Leu Leu

280

Ala Ser 295

Asp Phe

Glu Ala

Met Phe

Trp Ala

360

Gln Lys

375

Gln Val

Lys Leu

Asn Lys

Ile Ile

440

Tyr Thr

455

Ser Tyr

Phe Thr

Asn Ile

Ala Leu

520

Pro Glu

535

Asn His

Met Thr

Leu Leu

Gln Gln

600

Asn His

615

His Val

Tyr Thr

Ile Pro

170

Ala Thr 185

Arg Gly

Asn Ala

Arg Ile

Arg Ile

250 Asp Asn 265

Ser Asp

Phe Asn

Ala Phe

Met Asn

330 Tyr Leu 345

Thr Val

Pro Leu

Gly Met

Asn Asn

410

Ser Leu 425

Phe Val

Thr Ile

Val Asn

Asn Thr

490

Gly Tyr 505

Gln Thr

Ala Ile

Thr Gln

Arg Gln

570

Glu Asn

585

Met His

Asn Leu

Val Thr

140 Gly Ala 155

Ile Ile

Ile Tyr

Glu Met

Gln Ser

220 Ala Asp 235

Lys Thr

Leu Lys

Thr Ser

Ser Met

300

Gly Leu 315

Asn Glu

Tyr Asn

Asn Pro

Glu Gly

380

Thr Ser 395

Thr Ser

Thr Leu

Gly Ser

Glu Gln

460

Asn Gln 475

Lys Ser

Tyr Phe

Gly Lys

Lys Glu

540

Asp Gly

555

Glu Phe

Asn Asp

Val Ile

Ser His

620

125

Asn Ala

Tyr Gly

Gln Lys

His Trp

190 Met Asp 205

His Val

Met Ser

Leu Val

Thr Tyr

270

Val Pro 285

Asp Lys

Ser Met

Asn Leu

Asn Asp

350

Tyr Arg 365

Thr Pro

Leu Ser

Ala Leu

Asn Lys

430

Asn Ile

445

Arg Lys

Pro Val

Ile Phe

Phe Lys

510

Trp Gln

525

Val Ser

Asp Arg

Glu Thr

Lys Leu

590

His Tyr

605

Gln Gly

Gln Ser

Asn Val

160 Thr Lys 175

Ile Asn

Met Thr

Ala Gly

Glu Glu

240

Thr Gln

255

His Asp

Val Gln

Leu Ala

Phe Ser

320

His Gly

335

Leu Gly

Leu Pro

Glu Asn

Asp Asp

400

Ala Ala 415

Gly Trp

Lys Asn

Glu Asn

Asp Leu

480

Leu Glu 495

Pro Thr

Asn Ile

Asn Thr

Tyr Ala

560 Tyr Ile 575

Ala Ala

Glu Lys

Phe Tyr

- 277 033472

Ser Phe Pro His Pro Val Lys Gln Asn Gln Gln

625 630 635 <210> 91 <211> 828 <212> Белок <213> Streptococcus pyogenes серотип M12 (штамм MGAS9429) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 91

Met

Val

Tyr

Phe

Tyr

Leu

Val

Asn

Gln

Ser

Thr

Phe

Ile

Ile

Ser

Phe

1

5

10

15

Leu

Tyr

Trp

Arg

Asn

Leu

Ser

Val

Asn

Thr

Tyr

Phe

Cys

Thr

His

His

20

25

30

Lys

Gln

Leu

Leu

Leu

Tyr

Ser

Asn

Leu

Phe

Leu

Ser

Phe

Ala

Met

Met

35

40

45

Gly

Gln

Gly

Thr

Ala

Ile

Tyr

Ala

Asp

Thr

Leu

Thr

Ser

Asn

Ser

Glu

50

55

60

Pro

Asn

Asn

Thr

Tyr

Phe

Gln

Thr

Gln

Thr

Leu

Thr

Thr

Thr

Asp

Ser

65

70

75

80

Glu

Lys

Lys

Val

Val

Gln

Pro

Gln

Gln

Lys

Asp

Tyr

Tyr

Thr

Glu

Leu

85

90

95

Leu

Asp

Gln

Trp

Asn

Ser

Ile

Ile

Ala

Gly

Asn

Asp

Ala

Tyr

Val

Lys

100

105

110

Thr

Asn

Pro

Asp

Met

Val

Thr

Phe

His

Asn

Lys

Ala

Glu

Lys

Asp

Ala

115

120

125

Gln

Asn

Ile

Ile

Lys

Ser

Tyr

Gln

Gly

Pro

Asp

His

Glu

Asn

Arg

Thr

130

135

140

Tyr

Leu

Trp

Glu

His

Ala

Lys

Asp

Tyr

Ser

Ala

Ser

Thr

Asn

Ile

Thr

145

150

155

160

Lys

Thr

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

Lys

Ile

Ala

Lys

Gln

Ile

Thr

Asn

Pro

165

170

175

Glu

Ser

Cys

Tyr

Tyr

Gln

Asp

Ser

Lys

Ala

Ile

Ala

Ile

Val

Lys

Asp

180

185

190

Gly

Met

Ala

Phe

Met

Tyr

Glu

His

Ala

Tyr

Asn

Leu

Asn

Arg

Glu

Asn

195

200

205

His

Gln

Thr

Thr

Gly

Lys

Glu

Asn

Lys

Glu

Asn

Trp

Trp

Val

Tyr

Glu

210

215

220

Ile

Gly

Thr

Pro

Arg

Ala

Ile

Asn

Asn

Thr

Leu

Ser

Leu

Met

Tyr

Pro

225

230

235

240

Tyr

Phe

Thr

Gln

Glu

Glu

Ile

Leu

Lys

Tyr

Thr

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

245

250

255

Phe

Val

Pro

Asp

Pro

Thr

Arg

Phe

Arg

Val

Arg

Ala

Ala

Asn

Phe

Ser

260

265

270

Pro

Phe

Glu

Ala

Ser

Ser

Gly

Asn

Leu

Ile

Asp

Met

Gly

Arg

Val

Lys

275

280

285

Leu

Ile

Ser

Gly

Ile

Leu

Arg

Lys

Asp

Asp

Leu

Glu

Ile

Ser

Asp

Thr

290

295

300

Ile

Lys

Ala

Ile

Glu

Lys

Val

Phe

Thr

Leu

Val

Asp

Glu

Gly

Asn

Gly

305

310

315

320

Phe

Tyr

Gln

Asp

Gly

Ser

Leu

Ile

Asp

His

Val

Val

Thr

Asn

Ala

Gln

325

330

335

Ser

Pro

Leu

Tyr

Lys

Lys

Gly

Ile

Ala

Tyr

Thr

Gly

Ala

Tyr

Gly

Asn

340

345

350

Val

Leu

Ile

Asp

Gly

Leu

Ser

Gln

Leu

Ile

Pro

Ile

Ile

Gln

Lys

Thr

355

360

365

Lys

Ser

Pro

Ile

Glu

Ala

Asp

Lys

Met

Ala

Thr

Ile

Tyr

His

Trp

Ile

370

375

380

Asn

His

Ser

Phe

Phe

Pro

Ile

Ile

Val

Arg

Gly

Glu

Met

Met

Asp

Met

385

390

395

400

- 278 033472

Thr Arg

Gly

Arg

Ser 405

Ile

Ser

Arg

Phe Asn 410

Ala

Gln

Ser

His

Val 415

Ala

Gly

Ile

Glu

Ala

Leu

Arg

Ala

Ile

Leu

Arg

Ile

Ala

Asp

Met

Ser

Glu

420

425

430

Glu

Pro

His

Arg

Leu

Ala

Leu

Lys

Thr

Arg

Ile

Lys

Thr

Leu

Val

Thr

435

440

445

Gln

Gly

Asn

Ala

Phe

Tyr

Asn

Val

Tyr

Asp

Asn

Leu

Lys

Thr

Tyr

His

450

455

460

Asp

Ile

Lys

Leu

Met

Lys

Glu

Leu

Leu

Ser

Asp

Thr

Ser

Val

Pro

Val

465

470

475

480

Gln

Lys

Leu

Asp

Ser

Tyr

Val

Ala

Ser

Phe

Asn

Ser

Met

Asp

Lys

Leu

485

490

495

Ala

Leu

Tyr

Asn

Asn

Lys

His

Asp

Phe

Ala

Phe

Gly

Leu

Ser

Met

Phe

500

505

510

Ser

Asn

Arg

Thr

Gln

Asn

Tyr

Glu

Ala

Met

Asn

Asn

Glu

Asn

Leu

His

515

520

525

Gly

Trp

Phe

Thr

Ser

Asp

Gly

Met

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asn

Asp

Leu

530

535

540

Gly

His

Tyr

Ser

Glu

Asn

Tyr

Trp

Ala

Thr

Val

Asn

Pro

Tyr

Arg

Leu

545

550

555

560

Pro

Gly

Thr

Thr

Glu

Thr

Glu

Gln

Lys

Pro

Leu

Glu

Gly

Thr

Pro

Glu

565

570

575

Asn

Ile

Lys

Thr

Asn

Tyr

Gln

Gln

Val

Gly

Met

Thr

Ser

Leu

Ser

Asp

580

585

590

Asp

Ala

Phe

Val

Ala

Ser

Lys

Lys

Leu

Asn

Asn

Thr

Ser

Ala

Leu

Ala

595

600

605

Ala

Met

Thr

Phe

Thr

Asn

Trp

Asn

Lys

Ser

Leu

Thr

Leu

Asn

Lys

Gly

610

615

620

Trp

Phe

Ile

Leu

Gly

Asn

Lys

Ile

Ile

Phe

Val

Gly

Ser

Asn

Ile

Lys

625

630

635

640

Asn

Gln

Ser

Ser

His

Lys

Ala

Tyr

Thr

Thr

Ile

Glu

Gln

Arg

Lys

Glu

645

650

655

Asn

Gln

Lys

His

Pro

Tyr

Cys

Ser

Tyr

Val

Asn

Asn

Gln

Pro

Val

Asp

660

665

670

Leu

Asn

Asn

Gln

Leu

Val

Asp

Phe

Thr

Asn

Thr

Lys

Ser

Ile

Phe

Leu

675

680

685

Glu

Ser

Asp

Asp

Pro

Ala

Gln

Asn

Ile

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Phe

Lys

Pro

690

695

700

Thr

Thr

Leu

Ser

Ile

Ser

Lys

Ala

Leu

Gln

Thr

Gly

Lys

Trp

Gln

Asn

705

710

715

720

Ile

Lys

Ala

Asp

Asp

Lys

Ser

Pro

Glu

Ala

Ile

Lys

Glu

Val

Ser

Asn

725

730

735

Thr

Phe

Ile

Thr

Ile

Met

Gln

Asn

His

Thr

Gln

Asp

Gly

Asp

Arg

Tyr

740

745

750

Ala

Tyr

Met

Met

Leu

Pro

Asn

Met

Thr

Arg

Gln

Glu

Phe

Glu

Thr

Tyr

755

760

765

Ile

Ser

Lys

Leu

Asp

Ile

Asp

Leu

Leu

Glu

Asn

Asn

Asp

Lys

Leu

Ala

770

775

780

Ala

Val

Tyr

Asp

His

Asp

Ser

Gln

Gln

Met

His

Val

Ile

His

Tyr

Glu

785

790

795

800

Lys

Lys

Ala

Thr

Met

Phe

Ser

Asn

His

Asn

Leu

Ser

His

Gln

Gly

Phe

805

810

815

Tyr

Ser

Phe

Pro

His

Pro

Val

Lys

Gln

Asn

Gln

Gln

820

825

<210> 92 <211> 828 <212> Белок <213> Streptococcus pyogenes серотип M28 <223> гиалуронан лиаза <220>

- 279 033472 <400> 92

Met Val Tyr Phe

Leu Tyr Arg Arg

Lys Gln Leu Leu

Gly Gln Gly Thr

Pro Asn Asn Thr

Glu Lys Lys Val

Leu Asp Gln Trp

100

Thr Asn Pro Asp

115

Gln Asn Ile Ile

130

Tyr Leu Trp Glu

145

Lys Thr Tyr Arg

Glu Ser Cys Tyr

180

Gly Met Ala Phe

195

His Gln Thr Thr

210

Ile Gly Thr Pro

225

Tyr Phe Thr Gln

Phe Val Pro Asp

260

Pro Phe Glu Ala

275

Leu Ile Ser Gly

290

Ile Lys Ala Ile

305

Phe Tyr Gln Asp

Ser Pro Leu Tyr

340

Val Leu Ile Asp

355

Lys Ser Ser Ile

370

Asn His Ser Phe

385

Thr Arg Gly Arg

Gly Ile Glu Ala

420

Glu Pro His Arg

435

Gln Gly Asn Ala

450

Asp Ile Lys Leu

465

Gln Lys Leu Asp

Tyr Leu Val Asn

Asn Leu Ser Val

Leu Tyr Ser Asn

Ala Ile Tyr Ala

Tyr Phe Gln Thr

Val Gln Pro Gln

Asn Ser Ile Ile

Met Val Thr Phe

120

Lys Ser Tyr Gln

135

His Ala Lys Asp

150

Asn Ile Glu Lys

165

Tyr Gln Asp Ser

Met Tyr Glu His

200

Gly Lys Glu Asn

215

Arg Ala Ile Asn

230

Glu Glu Ile Leu

245

Pro Thr Arg Phe

Asn Ser Gly Asn

280

Ile Leu Arg Lys

295

Glu Lys Val Phe

310

Gly Ser Leu Ile

325

Lys Lys Gly Ile

Gly Leu Ser Gln

360

Glu Ala Asp Lys

375

Phe Pro Ile Ile

390

Ser Ile Ser Arg

405

Leu Arg Ala Ile

Leu Ala Leu Lys

440

Phe Tyr Asn Val

455

Met Lys Glu Leu

470

Ser Tyr Val Ala

Gln Phe Thr Phe

Asn Thr Tyr Phe

Leu Phe Leu Ser

Asp Thr Leu Thr

Gln Met Leu Thr

Gln Lys Asp Tyr

Ala Gly Asn Asp

105

His Asn Lys Ala

Gly Pro Asp His

140

Tyr Ser Ala Ser

155

Ile Ala Lys Gln

170

Lys Ala Ile Ala

185

Ala Tyr Asn Leu

Lys Glu Asn Trp

220

Asn Thr Leu Ser

235

Lys Tyr Thr Ala

250

Arg Val Arg Ala

265

Leu Ile Asp Met

Asp Asp Leu Glu

300

Thr Leu Val Asp

315

Asp His Val Val

330

Ala Tyr Thr Gly

345

Leu Ile Pro Ile

Met Ala Thr Ile

380

Val Arg Gly Glu

395

Phe Asn Ala Gln

410

Leu Arg Ile Ala

425

Thr Arg Ile Lys

Tyr Asp Asn Leu

460

Leu Ser Asp Thr

475

Ser Phe Asn Ser

Ile Ile Ser Phe

Cys Thr His His

Phe Ala Met Met

Ser Asn Ser Glu

Thr Thr Asp Ser

Tyr Thr Glu Leu

Ala Tyr Asp Lys

110

Glu Lys Asp Ala

125

Glu Asn Arg Thr

Ala Asn Ile Thr

160

Ile Thr Asn Pro

175

Ile Val Lys Asp

190

Asp Arg Glu Asn

205

Trp Val Tyr Glu

Leu Met Tyr Pro

240

Pro Ile Glu Lys

255

Ala Asn Phe Ser

270

Gly Arg Val Lys

285

Ile Ser Asp Thr

Glu Gly Asn Gly

320

Thr Asn Ala Gln

335

Ala Tyr Gly Asn

350

Ile Gln Lys Thr

365

Tyr His Trp Ile

Met Met Asp Met

400

Ser His Val Ala

415

Asp Met Ser Glu

430

Thr Leu Val Thr

445

Lys Thr Tyr His

Ser Val Pro Val

480

Met Asp Lys Leu

- 280 033472

Ala Leu

Ser Asn

Gly Trp

530 Gly His 545

Pro Gly

Asn Ile

Asp Ala

Ala Met

610 Trp Phe 625

Asn Gln

Asn Gln

Leu Asn

Glu Ser

690

Thr Thr 705

Ile Lys

Thr Phe

Ala Tyr

Ile Ser

770

Ala Val

785

Lys Lys

Tyr Ser

Tyr Asn

500 Arg Thr 515

Phe Thr

Tyr Ser

Thr Thr

Lys Thr

580

Phe Val

595

Thr Phe

Ile Leu

Ser Ser

Lys His

660

Asn Gln 675

Asp Asp

Leu Ser

Ala Asp

Ile Thr

740

Met Met

755

Lys Leu

Tyr Asp

Ala Thr

Phe Pro

820

485

Asn Lys

Gln Asn

Ser Asp

Glu Asn

550

Glu Thr

565

Asn Tyr

Ala Ser

Thr Asn

Gly Asn

630

His Lys

645

Pro Tyr

Leu Val

Ser Ala

Ile Ser

710 Asp Lys 725

Ile Met

Leu Pro

Asp Ile

His Asp

790

Met Phe

805

His Pro

His Asp

Tyr Glu

520

Gly Met

535

Tyr Trp

Glu Gln

Gln Gln

Lys Lys

600

Trp Asn

615

Lys Ile

Ala Tyr

His Ala

Asp Phe

680

Gln Asn 695

Lys Ala

Ser Pro

Gln Asn

Asn Met

760

Asp Leu 775

Ser Gln

Ser Asn

Val Lys

490

Phe Ala 505

Ala Met

Phe Tyr

Ala Thr

Lys Pro

570

Val Gly

585

Leu Asn

Lys Ser

Ile Phe

Thr Thr

650 Tyr Val 665

Thr Asn

Ile Gly

Leu Gln

Glu Ala

730

His Thr 745

Thr Arg

Leu Glu

Gln Met

His Asn

810

Gln Asn

825

Phe Gly

Asn Asn

Leu Tyr

540

Val Asn 555

Leu Glu

Met Thr

Asn Thr

Leu Thr

620

Val Gly

635

Ile Glu

Asn Asn

Thr Lys

Tyr Tyr

700

Thr Gly

715

Ile Lys

Gln Asp

Gln Glu

Asn Asn

780

His Val

795

Leu Ser

Gln Gln

Leu Ser

510

Glu Asn

525

Asn Asn

Pro Tyr

Gly Thr

Ser Leu

590

Ser Ala

605

Leu Asn

Ser Asn

Gln Arg

Gln Pro

670

Ser Ile

685

Phe Phe

Lys Trp

Glu Val

Gly Asp

750

Phe Glu

765

Asp Lys

Ile His

His Gln

495

Met Phe

Leu His

Asp Leu

Arg Leu

560

Pro Glu 575

Ser Asp

Leu Ala

Lys Gly

Ile Lys

640

Lys Glu 655

Val Asp

Phe Leu

Lys Pro

Gln Asn

720

Ser Asn 735

Arg Tyr

Thr Tyr

Leu Ala

Tyr Glu

800 Gly Phe 815 <210> 93 <211> 522 <212> Белок <213> Streptococcus suis <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 93

Met

Gly

Phe

Phe

Ile

Ser

Gln

Ser

Lys

Gln

His

Tyr

Gly

Ile

Arg

Lys

1

5

10

15

Tyr

Lys

Val

Gly

Val

Cys

Ser

Ala

Leu

Ile

Ala

Leu

Ser

Ile

Leu

Gly

20

25

30

Thr

Arg

Val

Ala

Ala

Asn

Gln

Leu

Pro

Ser

Thr

Glu

Thr

Ala

Ser

Pro

35

40

45

Gln

Ser

Ser

Gln

Leu

Val

Glu

Thr

Thr

Pro

Glu

Thr

Thr

Glu

Ala

Val

50

55

60

Asn

Leu

Thr

Thr

Glu

Ala

Val

Met

Thr

Ser

Glu

Val

Ser

Ser

Glu

Val

- 281 033472

Ser Pro

Thr Leu

Asn Leu

Asn Trp

130

Asn Val

145

His Ile

Asp Val

Lys Asp

Ala Glu

210

Lys Asn

225

Pro Glu

Gly Gln

Thr Pro

Gly Gln

290

Asp Leu

305

Asn Met

Asp Lys

Gln Ala

Leu Ala

370

Leu Gly

385

Glu Pro

Lys Ser

Gln Val

Ile Asp

450

Asn Glu

465

Thr Pro

Ser Gln

Pro Asp

Val Thr

Ala Ser

100

Val Ala

115

Ala Asp

Lys Lys

Ser Ser

Asp Pro

180

Leu Lys

195

Gly Lys

Gly Ser

Thr Arg

Ala Trp

260

Glu Thr 275

Ile Ser

Thr Tyr

Ile Arg

Asp Thr

340

Thr Val

355

Asn Lys

Arg Leu

Thr Asn

Ser His

420

Val Glu

435

Leu Val

Asn Lys

Arg Ala

Glu Glu

500

Pro Thr

515

Ser Thr 85

Pro Gln

Asn Gly

Pro Ala

Glu Asn

150

Thr Ala

165

Asn Lys

Gly Ser

Asp Leu

Gln Ala

230

Lys Leu

245

Leu Asp

Pro Glu

Leu Ala

Arg Ile

310

Pro Leu

325

Lys Leu

Phe Asp

Arg Tyr

Asp Ala

390

Gln Gly

405

Leu Thr

Asn Pro

Arg Lys

Ser Ile

470

Val Val

485

Ile Leu

Thr Ile

Glu Thr

Ala Val

Glu Phe

120

Ala Thr

135

Gly Gln

Ser Tyr

Arg Tyr

Gly Val

200

Ser Pro

215

Glu His

Lys Val

Asn Ile

Pro Ser

280

Ser Asn

295

Ala Asp

Ala Ala

Ser Ser

Thr Leu

360

Gln Ser

375

Gly Val

Lys Thr

Thr Val

Asp Ser

440

Gly Met

455

Asp Gly

Asn Thr

Thr Tyr

Ser Val

520

Gln Pro

Gln Ala

105

Ala Ser

Asn Trp

Val Arg

Arg Val

170

Leu Phe 185

Arg Val

Gln Glu

Ile Glu

Glu Leu

250

Ser Leu

265

Leu Glu

Lys Val

Ala Ala

Gly Lys

330

Phe Glu

345

Arg Asn

Asn Asp

Ala Ser

Ile Phe

410 Tyr Arg 425 Ala Tyr

Asn Trp

Asn Trp

Leu Ile

490 Thr Lys 505

Lys His

Ser Ser

Thr Lys

Thr Thr

Glu Thr

140 Ile Asp 155

Ala Val

Ser Tyr

Arg Leu

Phe Ala

220

Gln Ile

235

Phe Phe

Val Glu

Leu Val

Tyr Leu

300

Val Ala 315

Thr Gln

Leu Thr

Asn Trp

Thr Gln

380

Ser Leu 395

Asn Asp

Arg Leu

Tyr His

Leu Tyr

460 Trp Asp 475

Tyr Met

Pro Ile

Thr Ala

Glu Glu

110

Ala Ala

125

Trp Ile

Glu Gly

His Gln

Asn Val

190

Arg Ser

205

Tyr Thr

Leu Thr

Glu Asn

Tyr Val

270

Gln Pro

285

Pro Val

Ile Val

Val Asp

Val Thr

350

Glu Asp

365

Met Lys

Lys Lys

Ile Asp

Glu Gln

430

Asp Arg

445

Thr Asn

Tyr Glu

His Pro

Ser Lys

510

Ala Glu

Glu Lys

Ser Gly

Pro Ala

Arg Leu

160

Thr Val

175

Glu Thr

Leu Thr

Pro Tyr

Val Ser

240

Ser Val

255

Glu Lys

Glu Thr

Arg Pro

Glu Lys

320

Val Tyr

335

Glu His

Ile Ser

Ala Phe

Trp Val

400

Phe Ser

415

Met Ala

Ser Leu

Val Tyr

Ile Gly

480

Tyr Phe

495

Phe Val <210> 94 <211> 1164 <212> Белок <213> Streptococcus suis

- 282 033472 <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 94

Met

Gly

Phe

Phe

Ile

Ser

Gln

Ser

Lys

Gln

His

Tyr

Gly

Ile

Arg

Lys

1

5

10

15

Tyr

Lys

Val

Gly

Val

Cys

Ser

Ala

Leu

Ile

Ala

Leu

Ser

Ile

Leu

Gly

20

25

30

Thr

Arg

Val

Ala

Ala

Asn

Gln

Leu

Pro

Ser

Thr

Glu

Thr

Ala

Ser

Pro

35

40

45

Gln

Ser

Ser

Gln

Leu

Val

Glu

Thr

Thr

Pro

Glu

Thr

Thr

Glu

Ala

Val

50

55

60

Met

Thr

Ser

Glu

Val

Ser

Ser

Glu

Val

Ser

Pro

Val

Thr

Ser

Thr

Glu

65

70

75

80

Thr

Gln

Pro

Ser

Ser

Thr

Thr

Ala

Glu

Thr

Leu

Ala

Ser

Pro

Gln

Ala

85

90

95

Val

Gln

Ala

Thr

Lys

Glu

Glu

Lys

Asn

Leu

Val

Ala

Asn

Gly

Glu

Phe

100

105

110

Ile

Ser

Thr

Thr

Ala

Pro

Ser

Gly

Asn

Trp

Lys

Glu

Leu

Ala

Ala

Thr

115

120

125

Asn

Trp

Glu

Thr

Trp

Ile

Pro

Ala

Asn

Val

Lys

Lys

Glu

Asn

Gly

Gln

130

135

140

Val

Arg

Ile

Asp

Glu

Gly

Arg

Leu

His

Ile

Ser

Ser

Thr

Ala

Ser

Tyr

145

150

155

160

Arg

Val

Ala

Val

His

Gln

Thr

Val

Asp

Val

Asp

Pro

Asn

Lys

Arg

Tyr

165

170

175

Leu

Phe

Ser

Tyr

Asp

Val

Glu

Thr

Lys

Asp

Leu

Lys

Gly

Ser

Gly

Val

180

185

190

Arg

Val

Arg

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Ala

Glu

Gly

Lys

Asp

Leu

Ser

Pro

195

200

205

Gln

Glu

Phe

Ala

Tyr

Thr

Pro

Tyr

Lys

Asn

Gly

Ser

Gln

Ala

Glu

His

210

215

220

Ile

Glu

Gln

Ile

Leu

Thr

Val

Ser

Pro

Glu

Thr

Arg

Lys

Leu

Lys

Val

225

230

235

240

Glu

Leu

Phe

Phe

Glu

Asn

Ser

Val

Gly

Gln

Ala

Trp

Leu

Asp

Asn

Ile

245

250

255

Ser

Leu

Val

Glu

Tyr

Val

Glu

Lys

Thr

Pro

Glu

Thr

Pro

Glu

Gln

Ser

260

265

270

Pro

Glu

Leu

Val

Gln

Pro

Glu

Thr

Gly

Gln

Ile

Ser

Leu

Ala

Ser

Asn

275

280

285

Lys

Val

Tyr

Leu

Pro

Val

Arg

Pro

Asp

Leu

Thr

Tyr

Arg

Ile

Ala

Asp

290

295

300

Ala

Ala

Val

Ala

Thr

Val

Glu

Lys

Asn

Met

Ile

Arg

Pro

Leu

Ala

Ala

305

310

315

320

Gly

Lys

Thr

Gln

Val

Asp

Val

Tyr

Asp

Lys

Asp

Thr

Lys

Leu

Ser

Ser

325

330

335

Phe

Glu

Leu

Ile

Val

Thr

Glu

His

Gln

Ala

Thr

Val

Phe

Asp

Thr

Leu

340

345

350

Arg

Asn

Asn

Trp

Glu

Asp

Ile

Ser

Leu

Ala

Asn

Lys

Arg

Tyr

Gln

Ser

355

360

365

Asn

Asp

Ala

Gln

Met

Lys

Ala

Phe

Leu

Gly

Arg

Leu

Asp

Ala

Gly

Val

370

375

380

Ala

Ser

Ser

Leu

Glu

Lys

Trp

Val

Glu

Pro

Thr

Glu

Gln

Ser

Lys

Thr

385

390

395

400

Ile

Phe

Asn

Asp

Ile

Asp

Phe

Ser

Lys

Ser

Ser

His

Leu

Thr

Thr

Val

405

410

415

Tyr

Arg

Arg

Leu

Glu

Gln

Met

Ala

Gln

Val

Val

Glu

Asn

Pro

Asp

Ser

420

425

430

Ala

Tyr

Tyr

His

Asp

Arg

Ser

Leu

Ile

Asp

Leu

Val

Arg

Lys

Gly

Met

435

440

445

Asn

Trp

Leu

Tyr

Ala

Asn

Val

Tyr

Asn

Glu

Asn

Lys

Ser

Ile

Asp

Gly

450

455

460

- 283 033472

Asn Trp 465

Leu Ile

Thr Lys

Thr Leu

Ser Lys

530 Val Arg 545 Lys Gly

Val Ala

Gln Leu

Gln Thr

610

Leu Val

625

Arg Ala

Leu Val

Leu Ser

Tyr Arg

690

Leu Ala 705

Ala Phe

Phe Thr

Asp Met

Val Tyr

770

Ala Thr 785

Lys Arg

Gly Ala

Asn Asn

Gly Asn

850 Gln Gly 865

Lys Tyr

Val Val

Asn Gln

Lys Leu

930 Ser Lys 945

Ala Gln

Trp Asp

Tyr Met

Pro Ile

500

Thr Asn

515

Val Ala

Ala Gly

Glu Gly

Tyr Thr

580

Leu Pro

595

Asn Ile

Arg Gly

Thr Gly

Arg Ile

660

Phe Val

675

Ser Leu

Asp Asn

Asn Asn

Phe Ala

740

Asn Asn

755

Leu Tyr

Val Asp

Glu Asp

Ser Gln

820

Trp Asn

835

Lys Ile

Ala Glu

Ser Tyr

Thr Asp

900

Ser Ile

915

Asp Gln

Glu Glu

Thr Ser

Tyr Glu

470

His Pro

485

Ser Lys

Pro Val

Ile Leu

Ala Gln

550 Phe Tyr 565 Gly Ala

Val Ile

Leu Tyr

Glu Leu

630

Glu Ser

645

Ala Glu

Lys Ala

Lys Ser

Gln Ile

710

Met Asp

725

Leu Ser

Glu Asn

Asn Asp

Pro Tyr

790

Gly Ser

805

Leu Gly

Asn Ser

Val Phe

Thr Thr

870 Tyr Ile 885

Lys Thr

Gly Tyr

Arg Thr

Val Ser

950

Ser Asn

Ile Gly

Tyr Phe

Phe Val

Pro Ala

520 Glu Gly 535

Gly Leu

Arg Asp

Tyr Gly

Gln Pro

600

Glu Trp

615

Met Asp

His Val

Ser Ala

Gln Leu

680

Tyr Lys

695

Pro Ala

Lys Phe

Met Tyr

Arg Lys

760

Asp Leu 775

Arg Leu

Gly Glu

Asn Arg

Leu Thr

840

Leu Gly

855

Ile Glu

Asn Gly

Gln Ser

Val Phe

920

Gly Lys

935

Asn Ser

Tyr Ala

Thr Ser

Ser Gln

490 Pro Asp 505 Val Gly

Ala Leu

Thr Thr

Gly Ser

570

Asn Val

585

Thr Glu

Ile Glu

Met Thr

Gln Ala

650

Gln Pro

665

Thr Ser

Asp Ile

Glu Val

Val Tyr

730

Ser Ser 745

Gly Trp

Ser His

Pro Gly

Val Thr

810

Leu Ala 825

Ala Arg

Thr Asp

Asn Arg

Gln Pro

890

Phe Tyr

905

Leu Asn

Trp Ser

Phe Val

Tyr Val

Arg Ala

475

Glu Glu

Pro Thr

Gly Asn

Arg Glu

540

Ile Met

555

Phe Ile

Leu Ile

Phe Ala

Lys Ala

620

Arg Gly

635

Met Glu

Glu Gln

Asp Thr

Asp Leu

700

Asp Lys

715

Arg Ser

Arg Thr

Tyr Thr

Tyr Ser

780

Thr Thr 795

Leu Ala

Thr Ile

Lys Ala

Ile Gln

860

Lys Leu

875

Val Asp

Met Thr

Gln Leu

Asp Ile

940

Ser Leu

955

Leu Val

Val Val

Ile Leu

Thr Ile

510

Gln Thr

525

Asp Ala

Lys Phe

Asp His

Glu Gly

590

Leu Lys

605

Phe Met

Arg Ser

Ile Leu

Lys Thr

670

Phe Tyr

685

Val Asn

Asp Tyr

Ala Gln

Gln Asn

750

Ala Asp 765

Asn His

Thr Thr

Ser Asp

Ala Met

830

Trp Ile

845

His Gln

Leu Thr

Leu Ser

Asn Gly

910

Pro Thr 925

Asn Tyr

Trp His

Pro Asn

Asn Thr

480 Thr Tyr 495

Arg Lys

Asp Leu

Asp Arg

Val Asp

560

Thr Asn

575

Phe Ser

Glu Glu

Pro Ile

Ile Ser

640 Arg Ser 655

Lys Leu

Asp Ser

Lys Leu

Ile Ala

720

Glu Gly 735

Tyr Glu

Gly Met

Tyr Trp

Lys Asp

800

Phe Val 815

Asp Phe

Val Leu

Ser Ala

Gly Glu

880 Lys Glu 895

Lys Asp

His Ala

Asn Gln

Glu His

960

Gln Ser

- 284 033472

	965	970	975
Met Glu	Lys Val Asn Gln	Ala Ala Ala Ser Val	Lys Leu Leu His Gln
	980	985	990
Asp Arg	Asp Leu Gln Val	Val Tyr Asp Gln Glu	Gln Asn Val Trp Gly
	995	1000	1005
Val Val	Lys Tyr Thr Asp	Thr Ala Tyr Lys Leu	Thr Asp Asp Ile Thr
1010	1015	1020
Leu Thr	Asp Ala Gly Leu	Tyr Thr Ile Gln Lys	Val Glu Gly Gly Tyr
1025	1030	I 1035	i 1040
Arg Ile	Ala Phe Tyr Asn	Pro Ser Thr Arg Thr	Val Lys Asn Gly Ile
	1045	1050	1055
Glu Leu	Thr Lys Ala Gly	Ser Ser Leu Thr Val	Glu Met Glu Pro Thr
	1060	1065	1070
Ala Ala	Tyr Pro Ser Thr	Val Trp Lys Val Thr	Met Pro Glu Gly Ser
	1075	1080	1085
Asp Lys	Gln Thr Gly Ser	Val Glu Lys Thr Glu	Lys Glu Glu Lys Gln
1090	1095	1100
Leu Lys	Glu Asn Gln Pro	Ser Ser Glu Val Lys	Gln Val Val His His
1105	1110	I 1115	i 1120
Ala Ala	Glu Lys Thr Lys	Pro Ser Lys Pro Arg	Leu Pro Gln Thr Gly
	1125	1130	1135
Glu Glu	Ala Ser Leu Gly	Leu Gly Phe Leu Gly	Leu Leu Thr Leu Gly
	1140	1145	1150
Ala Val	Val Asp Phe Lys	Cys Arg Arg Ser His	Ser
	1155	1160

<210> 95 <211> 1164 <212> Белок <213> Streptococcus suis <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 95

Met

Gly

Phe

Phe

Ile

Ser

Gln

Ser

Lys

Gln

His

Tyr

Gly

Ile

Arg

Lys

1

5

10

15

Tyr

Lys

Val

Gly

Val

Cys

Ser

Ala

Leu

Ile

Ala

Leu

Ser

Ile

Leu

Gly

20

25

30

Thr

Arg

Val

Ala

Ala

Asn

Gln

Leu

Pro

Ser

Thr

Glu

Thr

Ala

Ser

Pro

35

40

45

Gln

Ser

Ser

Gln

Leu

Val

Glu

Thr

Thr

Pro

Glu

Thr

Thr

Glu

Ala

Val

50

55

60

Met

Thr

Ser

Glu

Val

Ser

Ser

Glu

Val

Ser

Pro

Val

Thr

Ser

Thr

Glu

65

70

75

80

Thr

Gln

Pro

Ser

Ser

Thr

Thr

Ala

Glu

Thr

Leu

Ala

Ser

Pro

Gln

Ala

85

90

95

Val

Gln

Ala

Thr

Lys

Glu

Glu

Lys

Asn

Leu

Val

Ala

Asn

Gly

Glu

Phe

100

105

110

Ile

Ser

Thr

Thr

Ala

Pro

Ser

Gly

Asn

Trp

Lys

Glu

Leu

Ala

Ala

Thr

115

120

125

Asn

Trp

Glu

Thr

Trp

Ile

Pro

Ala

Asn

Val

Lys

Lys

Glu

Asn

Gly

Gln

130

135

140

Val

Arg

Ile

Asp

Glu

Gly

Arg

Leu

His

Ile

Ser

Ser

Thr

Ala

Ser

Tyr

145

150

155

160

Arg

Val

Ala

Val

His

Gln

Thr

Val

Asp

Val

Asp

Pro

Asn

Lys

Arg

Tyr

165

170

175

Leu

Phe

Ser

Tyr

Asp

Val

Glu

Thr

Lys

Asp

Leu

Lys

Gly

Ser

Gly

Val

180

185

190

Arg

Val

Arg

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Ala

Glu

Gly

Lys

Asp

Leu

Ser

Pro

195

200

205

Gln

Glu

Phe

Ala

Tyr

Thr

Pro

Tyr

Lys

Asn

Gly

Ser

Gln

Ala

Glu

His

- 285 033472

210

Ile Glu Gln Ile Leu

225

Glu Leu Phe Phe Glu

245

Ser Leu Val Glu Tyr

260

Pro Glu Leu Val Gln

275

Lys Val Tyr Leu Pro

290

Ala Ala Val Ala Thr

305

Gly Lys Thr Gln Val

325

Phe Glu Leu Ile Val

340

Arg Asn Asn Trp Glu

355

Asn Asp Ala Gln Met

370

Ala Ser Ser Leu Glu

385

Ile Phe Asn Asp Ile

405

Tyr Arg Arg Leu Glu

420

Ala Tyr Tyr His Asp

435

Asn Trp Leu Tyr Thr

450

Asn Trp Trp Asp Tyr

465

Leu Ile Tyr Met His

485

Thr Lys Pro Ile Ser

500

Thr Leu Thr Asn Pro

515

Ser Lys Val Ala Ile

530

Val Arg Ala Gly Ala

545

Lys Gly Glu Gly Phe

565

Val Ala Tyr Thr Gly

580

Gln Leu Leu Pro Val

595

Gln Thr Asn Ile Leu

610

Leu Val Arg Gly Glu

625

Arg Ala Thr Gly Glu

645

Leu Val Arg Ile Ala

660

Leu Ser Phe Val Lys

675

Tyr Arg Ser Leu Lys

690

Leu Ala Asp Asn Gln

705

215

Thr Val Ser Pro Glu

230

Asn Ser Val Gly Gln

250 Val Glu Lys Thr Pro

265

Pro Glu Thr Gly Gln

280

Val Arg Pro Asp Leu

295

Val Glu Lys Asn Met

310

Asp Val Tyr Asp Lys

330

Thr Glu His Gln Ala

345

Asp Ile Ser Leu Ala

360

Lys Ala Phe Leu Gly

375

Lys Trp Val Glu Pro

390

Asp Phe Ser Lys Ser

410

Gln Met Ala Gln Val

425

Arg Ser Leu Ile Asp

440

Asn Val Tyr Asn Glu

455

Glu Ile Gly Thr Pro

470

Pro Tyr Phe Ser Gln

490 Lys Phe Val Pro Asp

505

Val Pro Ala Val Gly

520

Leu Glu Gly Ala Leu

535

Gln Gly Leu Thr Thr

550

Tyr Arg Asp Gly Ser

570 Ala Tyr Gly Asn Val

585

Ile Gln Pro Thr Glu

600

Tyr Glu Trp Ile Glu

615

Leu Met Asp Met Thr

630

Ser His Val Gln Ala

650

Glu Ser Ala Gln Pro

665

Ala Gln Leu Thr Ser

680

Ser Tyr Lys Asp Ile

695

Ile Pro Ala Glu Val

710

220

Thr Arg Lys Leu Lys

235

Ala Trp Leu Asp Asn

255

Glu Thr Pro Glu Gln

270

Ile Ser Leu Ala Ser

285

Thr Tyr Arg Ile Ala

300

Ile Arg Pro Leu Ala

315

Asp Thr Lys Leu Ser

335 Thr Val Phe Asp Thr 350

Asn Lys Arg Tyr Gln

365

Arg Leu Asp Ala Gly

380

Thr Glu Gln Ser Lys

395

Ser His Leu Thr Thr

415 Val Glu Asn Pro Asp 430

Leu Val Arg Lys Gly

445

Asn Lys Ser Ile Asp

460

Arg Ala Val Val Asn

475

Glu Glu Ile Leu Thr

495 Pro Thr Thr Ile Arg 510

Gly Asn Gln Thr Asp

525

Arg Glu Asp Ala Asp

540

Ile Met Lys Phe Val

555

Phe Ile Asp His Thr

575

Leu Ile Glu Gly Phe

590

Phe Ala Leu Lys Glu

605

Lys Ala Phe Met Pro

620

Arg Gly Arg Ser Ile

635

Met Glu Ile Leu Arg

655

Glu Gln Lys Thr Lys

670

Asp Thr Phe Tyr Asp

685

Asp Leu Val Asn Lys

700

Asp Lys Asp Tyr Ile

715

Val

240

Ile

Ser

Asn

Asp

Ala

320

Ser

Leu

Ser

Val

Thr

400

Val

Ser

Met

Gly

Thr

480

Tyr

Lys

Leu

Arg

Asp

560

Asn

Ser

Glu

Ile

Ser

640

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

720

- 286 033472

Ala	Phe	Asn	Asn Met 725	Asp	Lys	Phe	Val	Tyr Arg 730	Ser Ala	Gln	Glu Gly
735
Phe	Thr	Phe	Ala Leu 740	Ser	Met	Tyr	Ser 745	Ser Arg	Thr Gln	Asn 750	Tyr Glu
Asp	Met	Asn 755	Asn Glu	Asn	Arg	Lys 760	Gly	Trp Tyr	Thr Ala 765	Asp	Gly Met
Val	Tyr 770	Leu	Tyr Asn	Asp	Asp 775	Leu	Ser	His Tyr	Ser Asn 780	His	Tyr Trp
Ala 785	Thr	Val	Asp Pro	Tyr 790	Arg	Leu	Pro	Gly Thr 795	Thr Thr	Thr	Lys Asp 800
Lys	Arg	Glu	Asp Gly 805	Ser	Gly	Glu	Val	Thr Leu 810	Ala Ser	Asp	Phe Val 815
Gly	Ala	Ser	Gln Leu 820	Gly	Asn	Arg	Leu 825	Ala Thr	Ile Ala	Met 830	Asp Phe
Asn	Asn	Trp 835	Asn Asn	Ser	Leu	Thr 840	Ala	Arg Lys	Ala Trp 845	Ile	Val Leu
Gly	Asn 850	Lys	Ile Val	Phe	Leu 855	Gly	Thr	Asp Ile	Gln His 860	Gln	Ser Ala
Gln 865	Gly	Ala	Glu Thr	Thr 870	Ile	Glu	Asn	Arg Lys 875	Leu Leu	Thr	Gly Glu 880
Lys	Tyr	Ser	Tyr Tyr 885	Ile	Asn	Gly	Gln	Pro Val 890	Asp Leu	Ser	Lys Glu 895
Val	Val	Thr	Asp Lys 900	Thr	Gln	Ser	Phe 905	Tyr Met	Thr Asn	Gly 910	Lys Asp
Asn	Gln	Ser 915	Ile Gly	Tyr	Val	Phe 920	Leu	Asn Gln	Leu Pro 925	Thr	His Ala
Lys	Leu 930	Asp	Gln Arg	Thr	Gly 935	Lys	Trp	Ser Asp	Ile Asn 940	Tyr	Asn Gln
Ser 945	Lys	Glu	Glu Val	Ser 950	Asn	Ser	Phe	Val Ser 955	Leu Trp	His	Glu His 960
Ala	Gln	Thr	Ser Ser 965	Asn	Tyr	Ala	Tyr	Val Leu 970	Val Pro	Asn	Gln Ser 975
Met	Glu	Lys	Val Asn 980	Gln	Ala	Ala	Ala 985	Ser Val	Lys Leu	Leu 990	His Gln
Asp	Arg	Asp 995	Leu Gln	Val	Val	Tyr 1000	Asp )	Gln Glu	Gln Asn Val 1005	Trp Gly
Val	Val 1010	Lys )	Tyr Thr	Asp	Thr Ala 1015	Tyr	Lys Leu	Thr Asp 1020	Asp	Ile Thr
Leu Thr 1025	Asp	Ala Gly	Leu 1030	Tyr )	Thr	Ile	Gln Lys Val Glu 1035	Gly	Gly Tyr 1040
Arg	Ile	Ala	Phe Tyr Asn 1045	Pro	Ser	Thr	Arg Thr 1050	Val Lys	Asn	Gly Ile 1055
Glu	Leu	Thr	Lys Ala 1060	Gly	Ser	Ser	Leu Thr Val 1065	Glu Met	Glu 1070	Pro Thr )
Ala	Ala	Tyr Pro Ser 1075	Thr	Val	Trp 1080	Lys )	Val Thr	Met Pro Glu 1085	Gly Ser
Asp	Lys 1090	Gln )	Thr Gly	Ser	Val Glu 1095	Lys	Thr Glu	Lys Glu 1100	Glu	Lys Gln
Leu Lys 1105	Glu	Asn Gln	Pro 1110	Ser )	Ser	Glu	Val Lys Gln Val 1115	Val	His His 1120
Ala	Ala	Glu	Lys Thr Lys 1125	Pro	Ser	Lys	Pro Arg 1130	Leu Pro	Gln	Thr Gly 1135
Glu Ala	Glu Val	Ala Ser Leu 1140 Val Asp Phe 1155	Gly Lys	Leu Cys	Gly Arg 1160	Phe Leu Gly 1145 Arg Ser His )	Leu Leu Ser	Thr 1150	Leu Gly )

<210> 96 <211> 802 <212> Белок <213> Vibrio fischeri (штамм ATCC 700601 / ES114)

- 287 033472 <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 96

Met

Tyr

Met

Ile

Lys

Lys

His

Arg

Leu

Asn

Thr

Ile

Ala

Leu

Ser

Met

1

5

10

15

Leu

Phe

Leu

Phe

Thr

Gly

Asn

Ala

Tyr

Ala

Ala

Lys

Asn

Thr

Gln

Thr

20

25

30

Pro

Gln

Tyr

Leu

Pro

Ser

Asp

Phe

Glu

Gln

Val

Arg

Glu

Asn

Trp

Ala

35

40

45

Glu

Asn

Tyr

Leu

Gly

Asp

Pro

Ala

Ile

Thr

Phe

Asp

Gln

Thr

Leu

Lys

50

55

60

Asn

Met

Val

Thr

Ser

Thr

Asn

Ser

Ser

Ala

Gln

Lys

His

Trp

Asp

Ser

65

70

75

80

Met

Thr

Pro

Gln

Pro

Asn

Ala

Ser

Gly

Ile

Trp

Asp

Asp

Leu

Pro

Leu

85

90

95

Ile

Asp

Lys

Asp

Thr

Thr

Leu

Gly

Pro

Asn

Ile

Arg

Asn

Ser

Tyr

Gln

100

105

110

Arg

Leu

Phe

Thr

Met

Ala

Lys

Ala

Tyr

Arg

Leu

Arg

Asp

Gly

Asn

Leu

115

120

125

Glu

Asn

Asn

Gln

Leu

Met

Leu

Asn

Asp

Ile

Met

Thr

Ala

Met

Asn

Tyr

130

135

140

Ile

Asn

Gln

Asn

Phe

Tyr

Phe

Val

Asn

Gln

Leu

Glu

Tyr

Gly

Asn

Trp

145

150

155

160

Trp

Gln

Trp

Glu

Leu

Ala

Ile

Pro

Lys

Asp

Ile

His

Asn

Ile

Leu

Val

165

170

175

Leu

Leu

Phe

Asp

Asp

Ile

Lys

Asp

Asn

Tyr

Gln

Thr

Ile

Ile

Thr

Asn

180

185

190

His

Leu

Asn

Ala

Thr

Arg

Tyr

Phe

Thr

Pro

Asp

Pro

Thr

His

Leu

Gly

195

200

205

Val

Ser

Pro

Gly

Ala

Ala

Glu

Ser

Thr

Asn

Pro

Asn

Tyr

Arg

Glu

Ser

210

215

220

Thr

Gly

Gly

Asn

Arg

Thr

Asp

Asn

Ala

Gln

Val

Val

Leu

Ile

Arg

Gly

225

230

235

240

Met

Leu

Glu

Asn

Asn

Ser

Glu

Glu

Ile

Ser

Gln

Ala

Ile

Ala

Ala

Leu

245

250

255

Pro

Ala

Val

Ile

Glu

Tyr

Val

Ser

Glu

Gly

Asp

Gly

Tyr

Tyr

Thr

Asp

260

265

270

Gly

Ser

Phe

Leu

Gln

His

Ser

Asp

Ile

Ala

Tyr

Asn

Gly

Thr

Tyr

Gly

275

280

285

Asn

Val

Leu

Leu

Gly

Gly

Leu

Gly

Ile

Gln

Met

Asn

Ala

Val

Ala

Gly

290

295

300

Ser

Pro

Trp

Ser

Met

Asp

Asn

Gln

Thr

Ile

Ser

Asn

Val

Tyr

Asn

Ile

305

310

315

320

Ile

Asn

Gln

Ser

Tyr

Glu

Pro

Leu

Leu

Tyr

Lys

Gly

Ala

Met

Met

Asp

325

330

335

Met

Val

Asn

Gly

Arg

Ser

Ile

Ser

Arg

Ser

Ala

Glu

Gln

Asn

His

Asp

340

345

350

Val

Gly

Leu

Asn

Ile

Val

Asn

Ser

Met

Leu

Phe

Tyr

Thr

Asn

Gly

Pro

355

360

365

Asp

Ser

Asp

Lys

Asn

Lys

Gln

Leu

Ser

Ser

Leu

Ile

Lys

Thr

Gln

Ile

370

375

380

Thr

Asp

Asp

Thr

Tyr

Gln

Asn

Phe

Phe

Asp

Lys

Ile

Tyr

Tyr

Val

Ser

385

390

395

400

Thr

Tyr

Gln

Ala

Ala

Gln

His

Ile

Val

Asn

Asp

Pro

Thr

Val

Ser

Leu

405

410

415

Lys

Asp

Pro

Leu

Ile

Gly

Asn

Phe

Ser

Tyr

Pro

Ser

Met

Asp

Arg

Ile

420

425

430

Val

His

Arg

Arg

Thr

Asp

Trp

Ala

Phe

Ala

Leu

Ala

Met

His

Ser

Tyr

435

440

445

Arg

Ile

Gly

Asn

Tyr

Glu

Cys

Met

Asn

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Gly

Trp

450

455

460

Phe

Thr

Gly

Asp

Gly

Met

Ile

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asp

Gln

Leu

Asp

His

- 288 033472

465

470

475

Tyr

Thr

Gly

Tyr

Trp

Pro

Thr

Val

Asn

Ala

Ser

Arg

Met

Pro

Gly

485

490

495

Thr

Val

Asp

Ser

Gln

Ile

Met

Ala

Asp

Cys

Ser

Gly

Glu

Arg

Val

500

505

510

Gly

Asn

Val

Asn

Thr

Asn

Met

Gln

Trp

Val

Gly

Ser

Thr

Ser

Leu

515

520

525

Asn

Tyr

Gly

Ile

Ala

Gly

Met

Gln

Phe

Tyr

Asn

Trp

Ser

Asp

Thr

530

535

540

Ser

Ala

Tyr

Lys

Ser

Trp

Phe

Met

Phe

Asp

Asn

Glu

Val

Val

Met

545

550

555

Gly

Ser

Asn

Ile

Lys

Asp

Gln

Ser

Asn

Ala

Asn

Asn

Ile

Thr

Thr

565

570

575

Glu

Asn

Arg

Lys

Arg

Leu

Ala

Glu

Thr

Lys

Leu

Phe

Ile

Asp

Gly

580

585

590

Glu

Gln

Ala

Ala

Leu

Pro

Tyr

Gln

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr

Phe

Ser

595

600

605

Arg

Asn

Lys

Thr

Leu

Ala

Asn

Ser

Asp

Leu

Ser

Tyr

Val

Met

Leu

610

615

620

Pro

Lys

Thr

Ile

Ser

Ile

Ser

Gln

Asn

Asp

Val

Asp

Gly

Asn

Trp

625

630

635

Asp

Ile

Gly

Asn

Ser

Lys

Gly

Asp

Val

Ser

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gln

645

650

655

Thr

Leu

Thr

Gln

Val

Asp

Gln

Ala

Asp

Tyr

Gln

Tyr

Ala

Leu

Leu

660

665

670

Asn

Gln

Asn

Asn

Asp

Thr

Val

Gln

Asn

Tyr

Ala

Gln

His

Pro

Asp

675

680

685

Thr

Val

Leu

Arg

Gln

Asp

Glu

Gln

Ala

His

Ala

Val

Gln

Glu

Asn

690

695

700

Leu

Asn

Ile

Ile

Ala

Ala

Asn

Asn

Trp

Lys

Asn

Asn

Pro

Val

Asn

705

710

715

Thr

Asp

Thr

Ile

Thr

Leu

Asn

Ser

Met

Met

Gly

Phe

Met

Ile

Lys

725

730

735

Glu

Ser

Ser

Asn

Thr

Phe

Thr

Val

Ala

Val

Ser

Glu

Pro

Ile

Gln

740

745

750

Ile

Asp

Ser

Val

Asn

Phe

Thr

Phe

Asp

Lys

Gln

Gly

Ile

Val

Ile

755

760

765

Glu

Asp

Ile

Glu

Asn

Arg

Val

Val

Leu

Asn

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

770

775

780

Asn

Thr

Ser

Gly

Leu

Gln

Gly

Gln

Ser

Tyr

Ser

Phe

Gln

Val

Thr

785

790

795

Gln

Asp

480

Thr

Gly

Asn

Leu

Leu

560

Ile

Thr

Ile

Thr

Ser

640

Ala

Pro

Val

Thr

Ile

720

Glu

Thr

Lys

Ile

Ile

800 <210> 97 <211> 517 <212> Белок <213> Synechococcus sp. (штамм RCC307) <220>

<223> гиалуронан лиаза <400> 97

Met

Gly

Ala

Pro

Ala

Ile

Pro

Lys

Val

Pro

Arg

Ser

Pro

Ser

Lys

1

5

10

15

Glu

His

Thr

Thr

Arg

Pro

Asn

Ser

Gly

Glu

Ser

Glu

Val

Val

Arg

20

25

30

Ala

Glu

Glu

Leu

Phe

Glu

Gln

Thr

Leu

Val

Asn

Val

Arg

Gly

Gln

35

40

45

Ala

Gly

Ala

Val

Ala

Ala

Leu

Glu

Ser

Ser

Val

His

Asp

Ser

Glu

50

55

60

Asn

Tyr

Gly

Glu

Ile

Phe

Leu

Arg

Asp

Asn

Val

Pro

Val

Met

Val

Ser

Gln

Leu

Leu

Tyr

- 289 033472

Leu Leu

Cys Leu

Thr Ser

Arg Ser

130

Val Leu

145

Thr Ser

Leu Gln

Ala Phe

Val Glu

210

Ser Leu

225

Leu Glu

Asn His

Pro Thr

Gln Pro

290

Gly Gly

305

Phe Tyr

Gly Pro

His Leu

Gln Asp

370

Trp Ser

385

Ala Ala

Leu Leu

Gln Leu

Pro Thr

450

Thr Ile

465

Gln Asp

Ser Phe

Phe Leu

Leu Arg

Glu Leu

100

Phe Val

115

Ile Gly

Cys Trp

Pro Lys

Pro Ser

180

Met Ile

195

Val Leu

Val Glu

Leu Thr

Tyr Trp

260

Glu Gln

275

Glu Val

Tyr Leu

Ser Leu

Gln Gln

340

Met Ala

355

Glu Trp

Tyr His

Ala Val

Leu Gly

420 Asn Gln 435 Gly Thr

Val Gly

Val Lys

Gln Asp

500 Lys Asn 515

Gly Arg 85

Gln Ser

Glu Glu

Arg Ile

Met Tyr

150

Val Gln

165

Phe Tyr

Asp Arg

Leu Phe

Gly Gly

230

Arg Thr 245

Val Thr

Tyr Gly

Ile Pro

Ile Gly

310 Gly Asn 325

Leu Ala

Glu Met

Ile Thr

Asn Gly

390

Leu Met 405

Gln Thr

Leu Pro

Trp Val

Phe Leu

470

Leu Leu 485

Gln His

Tyr

Phe Glu

Arg Ser

Asp Asp

120

Thr Ser

135

Val Arg

Arg Ala

Glu Pro

Pro Met

200 Gly Cys 215

Gly His

Trp Met

Ser Lys

Asp Tyr

280

His Trp

295

Asn Met

Ala Leu

Leu Phe

Pro Met

360

Asn Thr

375

Gly His

His Gln

Arg Thr

Arg Gln

440

Gly Gln

455

Leu Leu

Asp Leu

Glu Lys

Ile Val

Tyr Arg

105

Lys Ile

Val Asp

Ala Ser

Val Gln

170

Pro Val

185

Asp Val

Leu Lys

Gly Gly

Arg Asp

250

Thr Met

265

Gln Ser

Leu Gln

Arg Thr

Gly Ser

330

Arg Leu

345

Arg Ile

Gly Met

Trp Pro

Arg Leu

410

Met Leu 425

Gln Trp

Gln Ala

His His

Asp Asp

490

Ser Ser

505

Arg His

Thr Arg

Leu Ala

Ala Ser

140

Gly Asp

155

Leu Leu

Leu Phe

Trp Gly

Ser Cys

220

Pro Leu

235

Leu Arg

Gln Val

Arg Asn

Glu Trp

300 Gly Arg 315

Leu Phe

Val Ile

Cys His

Asp Pro

380

Ser Leu 395

Tyr Pro

Glu Glu

Ala Glu

Arg Ile

460

Leu Met 475

Val Gly

Thr Asp

Phe Leu

Gly Val

110 Asp Tyr 125

Leu Trp

Thr Ser

Leu Asp

Val Pro

190

Ala Pro

205

Cys Gln

Ile Gln

Val Tyr

Leu Arg

270

Glu Phe

285

Leu Asp

Pro Asp

Gly Leu

His Asn

350

Pro Pro

365

Lys Asn

Leu Trp

Asn Asp

Cys Tyr

430

Tyr Phe

445

Asn Gln

Arg Lys

Pro Leu

Glu Arg

510

Asp Leu

Phe Pro

Gly Gln

Trp Pro

Tyr Gly

160

Leu Val

175

Asp Cys

Leu Glu

Leu Met

Gln Arg

240

Leu Leu

255

Arg Arg

Asn Val

Asp Arg

Phe Arg

320

Leu Thr

335

Arg Gln

Met Asp

Trp Pro

Pro Met

400

Asp Leu

415

Trp Gln

Asp Gly

Thr Trp

Ala Pro

480

Arg Leu

495

Lys Ser <210> 98 <211> 1021 <212> Белок <213> Proteus vulgaris

- 290 033472 <220>

<223> chondroitin-sulfate-ABC endolyase <400> 98

Met 1

Pro

Ile

Phe Arg 5

Phe

Thr

Ala

Leu

Ala 10

Met

Thr

Leu

Gly

Leu 15

Leu

Ser

Ala

Pro

Tyr

Asn

Ala

Met

Ala

Ala

Thr

Ser

Asn

Pro

Ala

Phe

Asp

20

25

30

Pro

Lys

Asn

Leu

Met

Gln

Ser

Glu

Ile

Tyr

His

Phe

Ala

Gln

Asn

Asn

35

40

45

Pro

Leu

Ala

Asp

Phe

Ser

Ser

Asp

Lys

Asn

Ser

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser

50

55

60

Asp

Lys

Arg

Ser

Ile

Met

Gly

Asn

Gln

Ser

Leu

Leu

Trp

Lys

Trp

Lys

65

70

75

80

Gly

Gly

Ser

Ser

Phe

Thr

Leu

His

Lys

Lys

Leu

Ile

Val

Pro

Thr

Asp

85

90

95

Lys

Glu

Ala

Ser

Lys

Ala

Trp

Gly

Arg

Ser

Ser

Thr

Pro

Val

Phe

Ser

100

105

110

Phe

Trp

Leu

Tyr

Asn

Glu

Lys

Pro

Ile

Asp

Gly

Tyr

Leu

Thr

Ile

Asp

115

120

125

Phe

Gly

Glu

Lys

Leu

Ile

Ser

Thr

Ser

Glu

Ala

Gln

Ala

Gly

Phe

Lys

130

135

140

Val

Lys

Leu

Asp

Phe

Thr

Gly

Trp

Arg

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Leu

Asn

145

150

155

160

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Arg

Glu

Met

Thr

Leu

Asn

Ala

Thr

Asn

Thr

Ser

165

170

175

Ser

Asp

Gly

Thr

Gln

Asp

Ser

Ile

Gly

Arg

Ser

Leu

Gly

Ala

Lys

Val

180

185

190

Asp

Ser

Ile

Arg

Phe

Lys

Ala

Pro

Ser

Asn

Val

Ser

Gln

Gly

Glu

Ile

195

200

205

Tyr

Ile

Asp

Arg

Ile

Met

Phe

Ser

Val

Asp

Asp

Ala

Arg

Tyr

Gln

Trp

210

215

220

Ser

Asp

Tyr

Gln

Val

Lys

Thr

Arg

Leu

Ser

Glu

Pro

Glu

Ile

Gln

Phe

225

230

235

240

His

Asn

Val

Lys

Pro

Gln

Leu

Pro

Val

Thr

Pro

Glu

Asn

Leu

Ala

Ala

245

250

255

Ile

Asp

Leu

Ile

Arg

Gln

Arg

Leu

Ile

Asn

Glu

Phe

Val

Gly

Gly

Glu

260

265

270

Lys

Glu

Thr

Asn

Leu

Ala

Leu

Glu

Glu

Asn

Ile

Ser

Lys

Leu

Lys

Ser

275

280

285

Asp

Phe

Asp

Ala

Leu

Asn

Ile

His

Thr

Leu

Ala

Asn

Gly

Gly

Thr

Gln

290

295

300

Gly

Arg

His

Leu

Ile

Thr

Asp

Lys

Gln

Ile

Ile

Ile

Tyr

Gln

Pro

Glu

305

310

315

320

Asn

Leu

Asn

Ser

Gln

Asp

Lys

Gln

Leu

Phe

Asp

Asn

Tyr

Val

Ile

Leu

325

330

335

Gly

Asn

Tyr

Thr

Thr

Leu

Met

Phe

Asn

Ile

Ser

Arg

Ala

Tyr

Val

Leu

340

345

350

Glu

Lys

Asp

Pro

Thr

Gln

Lys

Ala

Gln

Leu

Lys

Gln

Met

Tyr

Leu

Leu

355

360

365

Met

Thr

Lys

His

Leu

Leu

Asp

Gln

Gly

Phe

Val

Lys

Gly

Ser

Ala

Leu

370

375

380

Val

Thr

Thr

His

His

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ser

Arg

Trp

Trp

Tyr

Ile

Ser

385

390

395

400

Thr

Leu

Leu

Met

Ser

Asp

Ala

Leu

Lys

Glu

Ala

Asn

Leu

Gln

Thr

Gln

405

410

415

Val

Tyr

Asp

Ser

Leu

Leu

Trp

Tyr

Ser

Arg

Glu

Phe

Lys

Ser

Ser

Phe

420

425

430

Asp

Met

Lys

Val

Ser

Ala

Asp

Ser

Ser

Asp

Leu

Asp

Tyr

Phe

Asn

Thr

435

440

445

Leu

Ser

Arg

Gln

His

Leu

Ala

Leu

Leu

Leu

Leu

Glu

Pro

Asp

Asp

Gln

450

455

460

- 291 033472

Lys

Arg

Ile

Asn

Leu

Val

Asn

Thr

Phe

Ser

His

Tyr

Ile

Thr

Gly

Ala

465

470

475

480

Leu

Thr

Gln

Val

Pro

Pro

Gly

Gly

Lys

Asp

Gly

Leu

Arg

Pro

Asp

Gly

485

490

495

Thr

Ala

Trp

Arg

His

Glu

Gly

Asn

Tyr

Pro

Gly

Tyr

Ser

Phe

Pro

Ala

500

505

510

Phe

Lys

Asn

Ala

Ser

Gln

Leu

Ile

Tyr

Leu

Leu

Arg

Asp

Thr

Pro

Phe

515

520

525

Ser

Val

Gly

Glu

Ser

Gly

Trp

Asn

Asn

Leu

Lys

Lys

Ala

Met

Val

Ser

530

535

540

Ala

Trp

Ile

Tyr

Ser

Asn

Pro

Glu

Val

Gly

Leu

Pro

Leu

Ala

Gly

Arg

545

550

555

560

His

Pro

Phe

Asn

Ser

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Val

Ala

Gln

Gly

Tyr

Tyr

565

570

575

Trp

Leu

Ala

Met

Ser

Ala

Lys

Ser

Ser

Pro

Asp

Lys

Thr

Leu

Ala

Ser

580

585

590

Ile

Tyr

Leu

Ala

Ile

Ser

Asp

Lys

Thr

Gln

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Ile

595

600

605

Phe

Gly

Glu

Thr

Ile

Thr

Pro

Ala

Ser

Leu

Pro

Gln

Gly

Phe

Tyr

Ala

610

615

620

Phe

Asn

Gly

Gly

Ala

Phe

Gly

Ile

His

Arg

Trp

Gln

Asp

Lys

Met

Val

625

630

635

640

Thr

Leu

Lys

Ala

Tyr

Asn

Thr

Asn

Val

Trp

Ser

Ser

Glu

Ile

Tyr

Asn

645

650

655

Lys

Asp

Asn

Arg

Tyr

Gly

Arg

Tyr

Gln

Ser

His

Gly

Val

Ala

Gln

Ile

660

665

670

Val

Ser

Asn

Gly

Ser

Gln

Leu

Ser

Gln

Gly

Tyr

Gln

Gln

Glu

Gly

Trp

675

680

685

Asp

Trp

Asn

Arg

Met

Glu

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile

His

Leu

Pro

Leu

Lys

690

695

700

Asp

Leu

Asp

Ser

Pro

Lys

Pro

His

Thr

Leu

Met

Gln

Arg

Gly

Glu

Arg

705

710

715

720

Gly

Phe

Ser

Gly

Thr

Ser

Ser

Leu

Glu

Gly

Gln

Tyr

Gly

Met

Met

Ala

725

730

735

Phe

Asn

Leu

Ile

Tyr

Pro

Ala

Asn

Leu

Glu

Arg

Phe

Asp

Pro

Asn

Phe

740

745

750

Thr

Ala

Lys

Lys

Ser

Val

Leu

Ala

Ala

Asp

Asn

His

Leu

Ile

Phe

Ile

755

760

765

Gly

Ser

Asn

Ile

Asn

Ser

Ser

Asp

Lys

Asn

Lys

Asn

Val

Glu

Thr

Thr

770

775

780

Leu

Phe

Gln

His

Ala

Ile

Thr

Pro

Thr

Leu

Asn

Thr

Leu

Trp

Ile

Asn

785

790

795

800

Gly

Gln

Lys

Ile

Glu

Asn

Met

Pro

Tyr

Gln

Thr

Thr

Leu

Gln

Gln

Gly

805

810

815

Asp

Trp

Leu

Ile

Asp

Ser

Asn

Gly

Asn

Gly

Tyr

Leu

Ile

Thr

Gln

Ala

820

825

830

Glu

Lys

Val

Asn

Val

Ser

Arg

Gln

His

Gln

Val

Ser

Ala

Glu

Asn

Lys

835

840

845

Asn

Arg

Gln

Pro

Thr

Glu

Gly

Asn

Phe

Ser

Ser

Ala

Trp

Ile

Asp

His

850

855

860

Ser

Thr

Arg

Pro

Lys

Asp

Ala

Ser

Tyr

Glu

Tyr

Met

Val

Phe

Leu

Asp

865

870

875

880

Ala

Thr

Pro

Glu

Lys

Met

Gly

Glu

Met

Ala

Gln

Lys

Phe

Arg

Glu

Asn

885

890

895

Asn

Gly

Leu

Tyr

Gln

Val

Leu

Arg

Lys

Asp

Lys

Asp

Val

His

Ile

Ile

900

905

910

Leu

Asp

Lys

Leu

Ser

Asn

Val

Thr

Gly

Tyr

Ala

Phe

Tyr

Gln

Pro

Ala

915

920

925

Ser

Ile

Glu

Asp

Lys

Trp

Ile

Lys

Lys

Val

Asn

Lys

Pro

Ala

Ile

Val

930

935

940

Met

Thr

His

Arg

Gln

Lys

Asp

Thr

Leu

Ile

Val

Ser

Ala

Val

Thr

Pro

945

950

955

960

Asp

Leu

Asn

Met

Thr

Arg

Gln

Lys

Ala

Ala

Thr

Pro

Val

Thr

Ile

Asn

- 292 033472

965

970

975

Val

Thr

Ile

Asn

Gly

Lys

Trp

Gln

Ser

Ala

Asp

Lys

Asn

Ser

Glu

Val

980

985

990

Lys

Tyr

Gln

Val

Ser

Gly

Asp

Asn

Thr

Glu

Leu

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

995

1000

1005

Phe

Gly

Ile

Pro

Gln

Glu

Ile

Lys

Leu

Ser

Pro

Leu

Pro

1010

1015

1020

<210> 99 <211> 700 <212> Белок <213> Pedobacter heparinus <220>

<223> chondroitin AC lyase <400> 99

Met 1

Lys

Lys

Leu

Phe 5

Val

Thr

Cys

Ile

Val 10

Phe

Phe

Ser

Ile

Leu 15

Ser

Pro

Ala

Leu

Leu

Ile

Ala

Gln

Gln

Thr

Gly

Thr

Ala

Glu

Leu

Ile

Met

20

25

30

Lys

Arg

Val

Met

Leu

Asp

Leu

Lys

Lys

Pro

Leu

Arg

Asn

Met

Asp

Lys

35

40

45

Val

Ala

Glu

Lys

Asn

Leu

Asn

Thr

Leu

Gln

Pro

Asp

Gly

Ser

Trp

Lys

50

55

60

Asp

Val

Pro

Tyr

Lys

Asp

Asp

Ala

Met

Thr

Asn

Trp

Leu

Pro

Asn

Asn

65

70

75

80

His

Leu

Leu

Gln

Leu

Glu

Thr

Ile

Ile

Gln

Ala

Tyr

Ile

Glu

Lys

Asp

85

90

95

Ser

His

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Asp

Lys

Val

Phe

Asp

Gln

Ile

Ser

Lys

Ala

100

105

110

Phe

Lys

Tyr

Trp

Tyr

Asp

Ser

Asp

Pro

Lys

Ser

Arg

Asn

Trp

Trp

His

115

120

125

Asn

Glu

Ile

Ala

Thr

Pro

Gln

Ala

Leu

Gly

Glu

Met

Leu

Ile

Leu

Met

130

135

140

Arg

Tyr

Gly

Lys

Lys

Pro

Leu

Asp

Glu

Ala

Leu

Val

His

Lys

Leu

Thr

145

150

155

160

Glu

Arg

Met

Lys

Arg

Gly

Glu

Pro

Glu

Lys

Lys

Thr

Gly

Ala

Asn

Lys

165

170

175

Thr

Asp

Ile

Ala

Leu

His

Tyr

Phe

Tyr

Arg

Ala

Leu

Leu

Thr

Ser

Asp

180

185

190

Glu

Ala

Leu

Leu

Ser

Phe

Ala

Val

Lys

Glu

Leu

Phe

Tyr

Pro

Val

Gln

195

200

205

Phe

Val

His

Tyr

Glu

Glu

Gly

Leu

Gln

Tyr

Asp

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Gln

210

215

220

His

Gly

Pro

Gln

Leu

Gln

Ile

Ser

Ser

Tyr

Gly

Ala

Val

Phe

Ile

Thr

225

230

235

240

Gly

Val

Leu

Lys

Leu

Ala

Asn

Tyr

Val

Arg

Asp

Thr

Pro

Tyr

Ala

Leu

245

250

255

Ser

Thr

Glu

Lys

Leu

Ala

Ile

Phe

Ser

Lys

Tyr

Tyr

Arg

Asp

Ser

Tyr

260

265

270

Leu

Lys

Ala

Ile

Arg

Gly

Ser

Tyr

Met

Asp

Phe

Asn

Val

Glu

Gly

Arg

275

280

285

Gly

Val

Ser

Arg

Pro

Asp

Ile

Leu

Asn

Lys

Lys

Ala

Glu

Lys

Lys

Arg

290

295

300

Leu

Leu

Val

Ala

Lys

Met

Ile

Asp

Leu

Lys

His

Thr

Glu

Glu

Trp

Ala

305

310

315

320

Asp

Ala

Ile

Ala

Arg

Thr

Asp

Ser

Thr

Val

Ala

Ala

Gly

Tyr

Lys

Ile

325

330

335

Glu

Pro

Tyr

His

His

Gln

Phe

Trp

Asn

Gly

Asp

Tyr

Val

Gln

His

Leu

340

345

350

Arg

Pro

Ala

Tyr

Ser

Phe

Asn

Val

Arg

Met

Val

Ser

Lys

Arg

Thr

Arg

- 293 033472

355

360

365

Arg

Ser

Glu

Ser

Gly

Asn

Lys

Glu

Asn

Leu

Leu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Ser

370

375

380

Asp

Gly

Ala

Thr

Asn

Ile

Gln

Leu

Arg

Gly

Pro

Glu

Tyr

Tyr

Asn

Ile

385

390

395

400

Met

Pro

Val

Trp

Glu

Trp

Asp

Lys

Ile

Pro

Gly

Ile

Thr

Ser

Arg

Asp

405

410

415

Tyr

Leu

Thr

Asp

Arg

Pro

Leu

Thr

Lys

Leu

Trp

Gly

Glu

Gln

Gly

Ser

420

425

430

Asn

Asp

Phe

Ala

Gly

Gly

Val

Ser

Asp

Gly

Val

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ala

435

440

445

Tyr

Ala

Leu

Asp

Tyr

Asp

Ser

Leu

Gln

Ala

Lys

Lys

Ala

Trp

Phe

Phe

450

455

460

Phe

Asp

Lys

Glu

Ile

Val

Cys

Leu

Gly

Ala

Gly

Ile

Asn

Ser

Asn

Ala

465

470

475

480

Pro

Glu

Asn

Ile

Thr

Thr

Thr

Leu

Asn

Gln

Ser

Trp

Leu

Asn

Gly

Pro

485

490

495

Val

Ile

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Thr

Gly

Arg

Gly

Lys

Ile

Thr

Thr

Phe

500

505

510

Lys

Ala

Gln

Gly

Gln

Phe

Trp

Leu

Leu

His

Asp

Ala

Ile

Gly

Tyr

Tyr

515

520

525

Phe

Pro

Glu

Gly

Ala

Asn

Leu

Ser

Leu

Ser

Thr

Gln

Ser

Gln

Lys

Gly

530

535

540

Asn

Trp

Phe

His

Ile

Asn

Asn

Ser

His

Ser

Lys

Asp

Glu

Val

Ser

Gly

545

550

555

560

Asp

Val

Phe

Lys

Leu

Trp

Ile

Asn

His

Gly

Ala

Arg

Pro

Glu

Asn

Ala

565

570

575

Gln

Tyr

Ala

Tyr

Ile

Val

Leu

Pro

Gly

Ile

Asn

Lys

Pro

Glu

Glu

Ile

580

585

590

Lys

Lys

Tyr

Asn

Gly

Thr

Ala

Pro

Lys

Val

Leu

Ala

Asn

Thr

Asn

Gln

595

600

605

Leu

Gln

Ala

Val

Tyr

His

Gln

Gln

Leu

Asp

Met

Val

Gln

Ala

Ile

Phe

610

615

620

Tyr

Thr

Ala

Gly

Lys

Leu

Ser

Val

Ala

Gly

Ile

Glu

Ile

Glu

Thr

Asp

625

630

635

640

Lys

Pro

Cys

Ala

Val

Leu

Ile

Lys

His

Ile

Asn

Gly

Lys

Gln

Val

Ile

645

650

655

Trp

Ala

Ala

Asp

Pro

Leu

Gln

Lys

Glu

Lys

Thr

Ala

Val

Leu

Ser

Ile

660

665

670

Arg

Asp

Leu

Lys

Thr

Gly

Lys

Thr

Asn

Arg

Val

Lys

Ile

Asp

Phe

Pro

675

680

685

Gln

Gln

Glu

Phe

Ala

Gly

Ala

Thr

Val

Glu

Leu

Lys

690

695

700

<210> 100 <211> 844 <212> Белок <213> Victivallis vadensis ATCC BAA-548 <220>

<223> chondroitin AC lyase <400> 100

Met

His

Arg

Lys

Ile

Val

Phe

Pro

Leu

Phe

Val

Leu

Leu

Phe

Thr

Ala

1

5

10

15

Phe

Ala

Ala

Phe

Ala

Ala

Ser

Gln

Pro

Gln

Trp

Lys

Trp

Arg

Gln

Ser

20

25

30

Lys

Tyr

Cys

Arg

Ile

Thr

Glu

His

Ala

Gly

Lys

Lys

Leu

Leu

Thr

Val

35

40

45

Ala

Ile

Pro

Ala

Asp

Ala

Pro

Glu

Ile

Ser

Arg

Arg

Asn

Thr

Ala

Asp

50

55

60

Thr

Pro

Val

Gly

Leu

Thr

Cys

Phe

Glu

Gly

Gln

Pro

Ile

Glu

Phe

Ser

- 294 033472

Ile Arg

Gly Ile

Trp Thr

Arg Phe

130

Leu Gly

145

Leu Gln

Pro Glu

Gly Leu

Leu Glu

210 Ala Arg 225

Phe Glu

Asp Pro

Glu Arg

Pro Lys

290 Asp Gly 305

Phe Leu

Ile Phe

Ala Ala

Lys Thr

370

Gln His

385

Ala Asn

Leu Ser

Phe Gln

Arg Gln

450

Asn Ala 465

Tyr Asp

Gly Asn

Thr Trp

Glu Asp

530 Gly Ala 545 Ala Cys

Leu Arg

Lys Phe

100

Gln Ala

115

Ser Glu

Leu Gln

Ile Arg

Gln Ile

180

Pro Ala

195

Arg Gln

Asn Arg

Leu Ala

Ala Ala

260

Gln Pro

275

Ile Leu

Pro Arg

Ser Arg

Cys Arg

340

Ala Val

355

Ala Trp

Gly Pro

Ile Ala

Pro Glu

420 Trp Val 435 Leu Gly

Phe Ala

Ala Ala

Arg His

500

Tyr Ala

515

Asp Thr

Cys Leu

Trp Asp

Asn Ser 85

Gln Leu

Glu Ile

Arg Ile

Gly Ser

150

Pro Leu 165

Arg Glu

Gln Gln

Asn Gly

Ser Ile

230

Leu Ala 245

Gly Glu

Gln Asn

Gly Asn

Arg Arg

310

Tyr Thr

325

Ala Leu

Leu Ser

Ser Phe

Gln Ile

390

Tyr Trp

405

Gln Trp

Leu Trp

Arg Asn

Gln Leu

470

Leu Arg

485

Phe Trp

Ser Val

Asn Trp

Val Met

550 Trp Thr 565

Gly Ile

Tyr Phe

Pro His

120

Pro Ala

135

Ser Gly

Asp Pro

Cys Glu

Pro Pro

200

Asp Gly

215

Trp Pro

Arg Ala

Ala Val

Gly Asn

280

Ile Leu

295

Ala Ala

Gly Asn

Leu Glu

Glu Glu

360

Gly Gly

375

Gln Phe

Ser Asn

Arg Ile

Arg Gly

440

Ala Ala

455

Arg Asn

Arg Asn

Asn Ser

Arg Met

520

Asp Asn

535

Arg Ser

Arg Leu

Ser Arg

Arg Asp

105

Glu Pro

Asp Ala

Asn Val

Glu Leu

170

Leu Ile

185

Pro Gly

Thr Phe

Ala Ala

Thr Pro

250

Arg Lys

265

Trp Trp

Leu Leu

Leu Asn

Asn Arg

330

Arg Asn

345

Ile Arg

Ile Arg

Gly Asn

Ile Leu

410

Met Arg

425

Arg Met

Glu Thr

Ala Asp

Arg Asp

490

Asp Tyr

505

Asn Ser

Ala Leu

Gly Arg

Pro Gly

570

Pro Asp

Gly Asn

Phe Pro

Thr Ser

140

Glu Phe

155

Ser Pro

Glu Ser

Pro Glu

Arg Asp

220 Arg His 235

Gly His

Ala Val

Trp Asn

Ser Pro

300 Val Cys 315

Val Phe

Leu Pro

Phe Ala

Ala Asp

380 Tyr Gly 395 Lys Glu

His Leu

Asp Leu

Lys Gly

460 Pro Gly 475 Gly Glu

Met Val

Val Arg

Gly Arg

540

Glu Tyr

555

Thr Thr

Asn Leu

Gly Thr

110 Trp Arg 125 Gly Thr

Asp Leu

Val Pro

Arg Leu

190 Val Lys 205

Leu Asp

Leu Lys

Ala Leu

Ala Trp

270

Asp Met 285

Glu Leu

Arg Gln

Ile Ala

Val Met

350

Pro Ala 365

Gly Cys

Gly Glu

Thr His

Thr Phe

430

Leu Ala 445

Glu Arg

Asp Arg

Asn Thr

His Arg

510 Val Arg 525 Tyr Phe

Glu Asn

Leu Pro

His Asn 95

Glu Arg

Arg Phe

Leu Arg

Asp Ser

160

Pro Thr 175

Arg Ala

Lys Leu

Tyr Ser

Arg Thr

240 Tyr Arg 255

Trp Ala

Tyr Val

Phe Pro

Ala Cys

320

Ala Asn

335

Asp Arg

Glu His

Tyr His

Phe Leu

400 Trp Glu 415 Asn Gly

Cys Gly

Thr Leu

Ala Pro

480

Leu Thr 495

Arg Pro

Pro Ile

Ser Asp

Ile Thr

560 Lys Thr 575

- 295 033472

Pro

Val

Tyr Thr 580

Gly Glu

Asp Ala

Arg Arg 585

Phe

Gly Leu Lys 590

Ile

Gly

Gly

Gly

Asp

Leu

Pro

Arg

Trp

Thr

His

Ser

Arg

Asn

Trp

Arg

Gln

Leu

595

600

605

Gly

Glu

Thr

Gly

Phe

Val

Gly

Gly

Val

Thr

Asp

Gly

Glu

Arg

Gly

Ala

610

615

620

Ala

Val

Tyr

Thr

Gln

Asp

Leu

Asp

Gly

Val

Arg

Ala

Arg

Lys

Ala

Trp

625

630

635

640

Phe

Phe

Asp

Arg

Asp

Ala

Ile

Tyr

Cys

Leu

Gly

Ser

Gly

Ile

Thr

Ser

645

650

655

Thr

Ser

Pro

Tyr

Glu

Val

Ala

Thr

Thr

Val

Asn

Ser

Cys

Leu

Arg

Asn

660

665

670

Gly

Glu

Ile

Gln

Gln

Gly

Asp

Gly

Trp

Phe

Arg

His

Asp

Gly

Ile

Gly

675

680

685

Tyr

Arg

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Leu

Thr

Ala

Gly

Pro

Arg

Thr

Gly

Asp

690

695

700

Trp

Arg

Tyr

Val

Glu

Gly

Gly

Leu

Thr

Arg

Pro

Val

Pro

Glu

Thr

Lys

705

710

715

720

Glu

Leu

Phe

Thr

Leu

Thr

Val

Glu

His

Gly

Val

Lys

Pro

Arg

Asn

Ala

725

730

735

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Ile

Leu

Pro

Gly

Ala

Thr

Pro

Glu

Glu

Thr

Ala

740

745

750

Gly

Thr

Pro

Pro

Gly

Arg

Val

Leu

Arg

Asn

Thr

Pro

Glu

Cys

Gln

Ala

755

760

765

Val

Glu

Phe

Ala

Asp

Gly

Val

Arg

Ala

Ala

Ile

Phe

Tyr

Glu

Pro

Gly

770

775

780

Arg

Leu

Asp

Asp

Phe

Glu

Thr

Asp

Thr

Pro

Gly

Val

Phe

Leu

Ile

Gly

785

790

795

800

Lys

Gly

Thr

Val

His

Ala

Ala

Asp

Pro

Thr

Gly

Arg

His

Ser

Ser

Phe

805

810

815

Thr

Leu

Lys

Leu

Asn

Gly

Val

Ser

Arg

Lys

Val

Pro

Leu

Pro

Ala

Gly

820

825

830

Glu

Phe

Ala

Gly

Gln

Ser

Val

Lys

Ile

Val

Leu

Lys

835

840

<210> 101 <211> 110 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Preproinsulin <220>

<221> SIGNAL <222> (1)...(24) <223> Signal sequence <220>

<221> CHAIN <222> (25)...(54) <223> Insulin B Chain <220>

<221> PROPEP <222> (57)...(87) <223> Insulin C peptide <220>

<221> CHAIN <222> (90)...(110) <223> Insulin A chain

- 296 033472 <400> 101

Leu

Pro

Met Ala

Trp Gly

Ser His

Phe Tyr

Gln Val

Ala Leu

Thr Ser

Trp

Asp

Leu Val

Thr Pro

Glu Leu

Glu Gly

Ile Cys

100

Met Arg

Pro Ala

Glu Ala

Lys Thr

Gly Gly

Ser Leu

Ser Leu

Leu Leu

Ala Ala

Leu Tyr

Arg Arg

Gly Pro

Gln Lys

Tyr Gln

Pro Leu

Phe Val

Leu Val

Glu Ala

Gly Ala

Arg Gly

Leu Glu

105

Leu Ala

Asn Gln

Cys Gly

Glu Asp

Gly Ser

Ile Val

Asn Tyr

Leu Leu

His Leu

Glu Arg

Leu Gln

Leu Gln

Glu Gln

Cys Asn

110

Ala Leu

Cys Gly

Gly Phe

Val Gly

Pro Leu

Cys Cys <210> 102 <211> 86 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Proinsulin <220>

<221> CHAIN <222> (66)...(86) <223> Insulin B Chain <220>

<221> PROPEP <222> (33)...(63) <223> Insulin C peptide <220>

<221> CHAIN <222> (1)...(30) <223> Insulin A chain <400> 102

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

1

5

10

15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Arg

20

25

30

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gln

Val

Gly

Gln

Val

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

35

40

45

Gly

Ala

Gly

Ser

Leu

Gln

Pro

Leu

Ala

Leu

Glu

Gly

Ser

Leu

Gln

Lys

50

55

60

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

65

70

75

80

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

85

<210>

<211>

<212>

<213>

103

Белок

Homo sapiens <220>

<223>

Insulin A chain

- 297 033472 <400> 103

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser 1 5

Glu Asn Tyr Cys Asn

Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

15 <210> 104 <211> 30 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Insulin B chain <400> 104

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu Tyr

1

5

10

15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

20

25

30

<210> 105 <211> 110 <212> Белок <213> Gorilla gorilla <220>

<223> Preproinsulin <220>

<221> CHAIN <222> (66)...(86) <223> Insulin B Chain <220>

<221> CHAIN <222> (1)...(30) <223> Insulin A chain <400> 105

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Trp

Gly

Pro

Asp

Pro

Ala

Ala

Ala

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Arg

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gln

Val

Gly

50

55

60

Gln

Val

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Ser

Leu

Gln

Pro

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Gly

Ser

Leu

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 106 <211> 110 <212> Белок <213> Pongo pygmaeus <220>

- 298 033472 <223> Preproinsulin <400> 106

Met Ala

Trp Gly

Ser His

Phe Tyr

Gln Val

Ala Leu

Thr Ser

Leu Trp

Pro Asp

Leu Val

Thr Pro

Glu Leu

Glu Gly

Ile Cys

100

Met Arg

Pro Ala

Glu Ala

Lys Thr

Gly Gly

Ser Leu

Ser Leu

Leu Leu

Gln Ala

Leu Tyr

Arg Arg

Gly Pro

Gln Lys

Tyr Gln

Pro Leu

Phe Val

Leu Val

Glu Ala

Gly Ala

Arg Gly

Leu Glu

105

Leu Ala

Asn Gln

Cys Gly

Glu Asp

Gly Ser

Ile Val

Asn Tyr

Leu Leu

His Leu

Glu Arg

Leu Gln

Leu Gln

Glu Gln

Cys Asn

110

Ala Leu

Cys Gly

Gly Phe

Val Gly

Pro Leu

Cys Cys <210> 107 <211> 110 <212> Белок <213> Pan troglodytes <220>

<223> Preproinsulin <400> 107

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Val

Leu

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Trp

Gly

Pro

Asp

Pro

Ala

Ser

Ala

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Arg

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gln

Val

Gly

50

55

60

Gln

Val

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Ser

Leu

Gln

Pro

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Gly

Ser

Leu

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 108 <211> 110 <212> Белок <213> Macaca fascicularis <220>

<223> Preproinsulin <400> 108

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Trp

Gly

Pro

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Arg

Glu

Ala

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Gly

50

55

60

Gln

Val

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Ser

Leu

Gln

Pro

Leu

65

70

75

80

- 299 033472

Cys

Ala

Leu Glu

Gly

Ser 85

Leu Gln Lys

Arg

Gly 90

Ile

Val

Glu

Gln

Cys 95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 109 <211> 110 <212> Белок <213> Cercopithecus aethiops <220>

<223> Preproinsulin <400> 109

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Trp

Gly

Pro

Asp

Pro

Val

Pro

Ala

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Arg

Glu

Ala

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Gly

50

55

60

Gln

Val

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Ser

Leu

Gln

Pro

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Gly

Ser

Leu

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 110 <211> 110 <212> Белок <213> Canis familiaris <220>

<223> Preproinsulin <400> 110

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Trp

Ala

Pro

Ala

Pro

Thr

Arg

Ala

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Leu

Gln

Val

Arg

50

55

60

Asp

Val

Glu

Leu

Ala

Gly

Ala

Pro

Gly

Glu

Gly

Gly

Leu

Gln

Pro

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Gly

Ala

Leu

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 111 <211> 110 <212> Белок <213> Spermophilus tridecemlineatus <220>

<223> Preproinsulin

- 300 033472 <400> 111

Met Ala Leu Trp 1

Leu Gly Pro Asp

Ser His Leu Val

Phe Tyr Thr Pro

Gln Val Glu Leu

Ala Leu Glu Met

Thr Ser Ile Cys

100

Thr Arg Leu Leu

Pro Ala Gln Ala

Glu Ala Leu Tyr

Lys Ser Arg Arg

Gly Gly Gly Pro

Ala Leu Gln Lys

Ser Leu Tyr Gln

Pro Leu Leu Ala

Phe Val Asn Gln

Leu Val Cys Gly

Glu Val Glu Glu

Gly Ala Gly Leu

Arg Gly Ile Val

Leu Glu Asn Tyr

105

Leu Leu Ala Leu

His Leu Cys Gly

Glu Arg Gly Phe

Gln Gln Gly Gly

Pro Gln Pro Leu

Glu Gln Cys Cys

Cys Asn

110 <210> 112 <211> 110 <212> Белок <213> Volemys kikuchii <220>

<223> Preproinsulin <400> 112

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Val

Leu

1

5

10

15

Trp

Glu

Pro

Asn

Pro

Ala

Gln

Ala

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Arg

Arg

Gly

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Ala

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Asp

Leu

Gln

Thr

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Gln

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 113 <211> 108 <212> Белок <213> Aotus trivirgatus <220>

<223> Preproinsulin <400> 113

Met 1

Ala

Leu

Trp

Met 5

His

Leu

Leu

Pro

Leu 10

Leu

Ala

Leu

Leu

Ala 15

Leu

Trp

Gly

Pro

Glu

Pro

Ala

Pro

Ala

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Pro

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Ala

Pro

Lys

Thr

Arg

Arg

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gln

Val

Gly

50

55

60

Gln

Val

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Ser

Ile

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Leu

65

70

75

80

Glu

Gly

Pro

Met

Gln

Lys

Arg

Gly

Val

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

Thr

Ser

- 301 033472

90

Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Gln Asn Tyr Cys Asn

100 105 <210> 114 <211> 110 <212> Белок <213> Apodemus semotus <220>

<223> Preproinsulin 1 <400> 114

Met

Ala

Leu

Cys

Val

Arg

Phe

Leu

Ser

Leu

Leu

Ile

Leu

Leu

Ile

Leu

1

5

10

15

Trp

Glu

Pro

Asn

Pro

Ala

Gln

Ala

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Pro

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Glu

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Gly

Ala

Pro

Gly

Thr

Gly

Asp

Leu

Glu

Thr

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Arg

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 115 <211> 110 <212> Белок <213> Apodemus semotus <220>

<223> Preproinsulin 2 <400> 115

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Phe

Leu

Pro

Leu

Leu

Val

Leu

Leu

Phe

Leu

1

5

10

15

Trp

Glu

Pro

Asn

Pro

Ala

Gln

Ala

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Met

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Ala

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Asp

Leu

Gln

Thr

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Arg

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 116 <211> 110 <212> Белок <213> Cricetulus longicaudatus <220>

<223> Preproinsulin

- 302 033472 <400> 116

Met Thr Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Thr Leu Leu Val Leu 1 5 10 15

Trp Glu Pro Asn Pro Ala Gln Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly

25 30

Ser His

Phe Tyr

Gln Leu

Ala Leu

Thr Ser

Leu Val

Thr Pro

Glu Leu

Glu Val

Ile Cys

100

Glu Ala

Lys Ser

Gly Gly

Ala Gln

Ser Leu

Leu Tyr

Arg Arg

Gly Pro

Gln Lys

Tyr Gln

Leu Val

Gly Val

Gly Ala

Arg Gly

Leu Glu

105

Cys Gly

Glu Asp

Asp Asp

Ile Val

Asn Tyr

Glu Arg

Pro Gln

Leu Gln

Asp Gln

Cys Asn

110

Gly Phe

Val Ala

Thr Leu

Cys Cys <210> 117 <211> 110 <212> Белок <213> Rattus norvegicus <220>

<223> Preproinsulin 1 <400> 117

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Phe

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Val

Leu

1

5

10

15

Trp

Glu

Pro

Lys

Pro

Ala

Gln

Ala

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Pro

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Pro

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Glu

Ala

Gly

Asp

Leu

Gln

Thr

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Arg

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 118 <211> 110 <212> Белок <213> Rattus norvegicus <220>

<223> Preproinsulin 2 <400> 118

Met

Ala

Leu

Trp

Ile

Arg

Phe

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Ile

Leu

1

5

10

15

Trp

Glu

Pro

Arg

Pro

Ala

Gln

Ala

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Met

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Ala

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Asp

Leu

Gln

Thr

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Arg

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

- 303 033472

90 95

Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

100 105 110 <210> 119 <211> 110 <212> Белок <213> Rattus losea <220>

<223> Preproinsulin 1 <400> 119

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Phe

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Val

Val

1

5

10

15

Trp

Glu

Pro

Lys

Pro

Ala

Gln

Ala

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Pro

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Pro

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Gly

Ser

Pro

Glu

Ala

Gly

Asp

Leu

Gln

Thr

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Arg

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 120 <211> 110 <212> Белок <213> Rattus losea <220>

<223> Preproinsulin 2 <400> 120

Met

Ala

Leu

Trp

Ile

Arg

Phe

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Val

Leu

1

5

10

15

Trp

Glu

Pro

Arg

Pro

Ala

Gln

Ala

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Val

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Ala

50

55

60

Gln

Gln

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Asp

Leu

Gln

Thr

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Arg

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 121 <211> 110 <212> Белок <213> Niviventer coxingi <220>

<223> Preproinsulin 1

- 304 033472 <400> 121

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Phe

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Val

Leu

1

5

10

15

Trp

Glu

Pro

Asn

Pro

Ala

Gln

Ala

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Pro

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Ala

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Glu

Gly

Pro

Glu

Ala

Gly

Asp

Leu

Gln

Thr

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Arg

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 122 <211> 110 <212> Белок <213> Niviventer coxingi <220>

<223> Preproinsulin 2 <400> 122

Met

Ala

Leu

Trp

Ile

Arg

Phe

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Val

Leu

1

5

10

15

Trp

Glu

Pro

His

Pro

Ala

Gln

Ala

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Met

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Pro

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Thr

Gly

Asp

Leu

Gln

Thr

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Arg

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 123 <211> 108 <212> Белок <213> Sus scrofa <220>

<223> Preproinsulin <400> 123

Met

Ala

Leu

Trp

Thr

Arg

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Trp

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Gln

Ala

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Glu

Ala

Glu

Asn

Pro

Gln

Ala

Gly

50

55

60

Ala

Val

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Leu

Gly

Gly

Leu

Gln

Ala

Leu

Ala

Leu

65

70

75

80

Glu

Gly

Pro

Pro

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

Thr

Ser

85

90

95

- 305 033472

Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

100 105 <210> 124 <211> 110 <212> Белок <213> Meriones unguiculatus <220>

<223> Preproinsulin <400> 124

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Phe

Leu

Ile

Leu

1

5

10

15

Trp

Glu

Pro

Thr

Pro

Ala

His

Ala

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Phe

Arg

Arg

Gly

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Met

Pro

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Gly

Ser

Pro

Gly

Ala

Gly

Asp

Leu

Gln

Ala

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Arg

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Gly

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 125 <211> 110 <212> Белок <213> Oryctolagus cuniculus <220>

<223> Preproinsulin <400> 125

Met

Ala

Ser

Leu

Ala

Ala

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Val

Leu

1

5

10

15

Cys

Arg

Leu

Asp

Pro

Ala

Gln

Ala

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Glu

Leu

Gln

Val

Gly

50

55

60

Gln

Ala

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Gly

Leu

Gln

Pro

Ser

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Leu

Ala

Leu

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> <211> <212>	126 108 Белок
<213>	Mus musculus

<220> <223>

Preproinsulin 1

- 306 033472 <400> 126

Met

Ala

Leu

Leu

Val

His

Phe

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Trp

Glu

Pro

Lys

Pro

Thr

Gln

Ala

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Pro

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Glu

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Gly

Ser

Pro

Gly

Asp

Leu

Gln

Thr

Leu

Ala

Leu

65

70

75

80

Glu

Val

Ala

Arg

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

Thr

Ser

85

90

95

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

<210> 127 <211> 110 <212> Белок <213> Mus musculus <220>

<223> Preproinsulin 2 <400> 127

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Phe

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Phe

Leu

1

5

10

15

Trp

Glu

Ser

His

Pro

Thr

Gln

Ala

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Met

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Ala

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Asp

Leu

Gln

Thr

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Gln

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 128 <211> 110 <212> Белок <213> Mus spretus <220>

<223> Preproinsulin 2 <400> 128

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Phe

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Phe

Leu

1

5

10

15

Trp

Glu

Ser

His

Pro

Thr

Gln

Ala

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Met

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Ala

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Asp

Leu

Gln

Thr

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Gln

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

85

90

95

- 307 033472

Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

100 105 110 <210> 129 <211> 108 <212> Белок <213> Mus caroli <220>

<223> Preproinsulin 1 <400> 129

Met 1

Ala

Leu

Leu

Val 5

Arg

Phe

Leu

Pro

Leu 10

Leu

Ala

Leu

Leu

Ala 15

Leu

Trp

Glu

Pro

Lys

Pro

Thr

Gln

Ala

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Pro

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Ser

Pro

Lys

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Glu

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Gly

Ser

Pro

Gly

Asp

Leu

Gln

Thr

Leu

Ala

Leu

65

70

75

80

Glu

Val

Ala

Arg

Glu

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

Thr

Ser

85

90

95

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

<210> 130 <211> 110 <212> Белок <213> Mus caroli <220>

<223> Preproinsulin 2 <400> 130

Met

Ala

Leu

Trp

Met

Arg

Phe

Leu

Pro

Leu

Val

Ala

Leu

Leu

Phe

Leu

1

5

10

15

Trp

Glu

Ser

His

Pro

Thr

Gln

Ala

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Met

Ser

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Ala

50

55

60

Gln

Leu

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Asp

Leu

Gln

Thr

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Gln

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210>	131
<211>	110
<212>	Белок
<213>	Psammomys obesus
<220>
<223>	Preproinsulin
<400>	131

- 308 033472

Met Ala

Trp Glu

Ser His

Phe Tyr

Gln Leu

Ala Leu

Thr Gly

Leu Trp

Pro Ser

Leu Val

Thr Pro

Glu Leu

Glu Val

Ile Cys

100

Met Arg

Pro Ala

Glu Ala

Lys Phe

Gly Gly

Ala Arg

Ser Leu

Leu Leu

His Ala

Leu Tyr

Arg Arg

Ser Pro

Gln Lys

Tyr Gln

Pro Leu

Phe Val

Leu Val

Gly Val

Gly Ala

Arg Gly

Leu Glu

105

Leu Ala

Asn Gln

Cys Gly

Asp Asp

Gly Asp

Ile Val

Asn Tyr

Phe Leu

His Leu

Glu Arg

Pro Gln

Leu Arg

Glu Gln

Cys Asn

110

Ile Leu

Cys Gly

Gly Phe

Met Pro

Ala Leu

Cys Cys <210> 132 <211> 110 <212> Белок <213> Felis silvestris catus <220>

<223> Preproinsulin <400> 132

Met

Ala

Pro

Trp

Thr

Arg

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Ser

Leu

1

5

10

15

Trp

Ile

Pro

Ala

Pro

Thr

Arg

Ala

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gln

Gly

Lys

50

55

60

Asp

Ala

Glu

Leu

Gly

Glu

Ala

Pro

Gly

Ala

Gly

Gly

Leu

Gln

Pro

Ser

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Ala

Pro

Leu

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Ala

Ser

Val

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

His

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 133 <211> 105 <212> Белок <213> Bos taurus <220>

<223> Preproinsulin <400> 133

Met 1

Ala

Leu

Trp

Thr 5

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu 10

Leu

Ala

Leu

Leu

Ala 15

Leu

Trp

Pro

Pro

Pro

Pro

Ala

Arg

Ala

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Gly

Pro

Gln

Val

Gly

50

55

60

Ala

Leu

Glu

Leu

Ala

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Gly

Leu

Glu

Gly

Pro

65

70

75

80

Pro

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

Ala

Ser

Val

Cys

Ser

85

90

95

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

- 309 033472

100

105 <210> 134 <211> 105 <212> Белок <213> Ovis aries <220>

<223> Preproinsulin <400> 134

Met

Ala

Leu

Trp

Thr

Arg

Leu

Val

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Trp

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

His

Ala

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Glu

Val

Glu

Gly

Pro

Gln

Val

Gly

50

55

60

Ala

Leu

Glu

Leu

Ala

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Gly

Leu

Glu

Gly

Pro

65

70

75

80

Pro

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

Ala

Gly

Val

Cys

Ser

85

90

95

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

<210> 135 <211> 110 <212> Белок <213> Cavia porcellus <220>

<223> Preproinsulin <400> 135

Met 1

Ala

Leu

Trp

Met 5

His

Leu

Leu

Thr

Val 10

Leu

Ala

Leu

Leu

Ala 15

Leu

Trp

Gly

Pro

Asn

Thr

Gly

Gln

Ala

Phe

Val

Ser

Arg

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

Asn

Leu

Val

Glu

Thr

Leu

Tyr

Ser

Val

Cys

Gln

Asp

Asp

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Ile

Pro

Lys

Asp

Arg

Arg

Glu

Leu

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Glu

50

55

60

Gln

Thr

Glu

Leu

Gly

Met

Gly

Leu

Gly

Ala

Gly

Gly

Leu

Gln

Pro

Leu

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Met

Ala

Leu

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

85

90

95

Thr

Gly

Thr

Cys

Thr

Arg

His

Gln

Leu

Gln

Ser

Tyr

Cys

Asn

100

105

110

<210> 136 <211> 86 <212> Белок <213> Equus caballus <220>

<223> Proinsulin <220>

<221> UNSURE

- 310 033472 <222> 31

<223>	Xaa=Basic	residue	assumed	by	homology
<220>
<221>	UNSURE
<222>	32
<223>	Xaa=Basic	residue	assumed	by	homology
<220>
<221>	UNSURE
<222>	64
<223>	Xaa=Basic	residue	assumed	by	homology
<220>
<221>	UNSURE
<222>	65
<223>	Xaa=Basic	residue	assumed	by	homology

<400> 136

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

1

5

10

15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

Xaa

Xaa

20

25

30

Glu

Ala

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Gly

Glu

Val

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

35

40

45

Gly

Leu

Gly

Gly

Leu

Gln

Pro

Leu

Ala

Leu

Ala

Gly

Pro

Gln

Gln

Xaa

50

55

60

Xaa

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

Thr

Gly

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

65

70

75

80

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

85

<210> 137 <211> 109 <212> Белок <213> Octodon degus <220>

<223> Preproinsulin <400> 137

Met 1

Ala

Pro

Trp

Met 5

His

Leu

Leu

Thr

Val 10

Leu

Ala

Leu

Leu

Ala 15

Leu

Trp

Gly

Pro

Asn

Ser

Val

Gln

Ala

Tyr

Ser

Ser

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

Asn

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Met

Thr

Cys

Gly

Arg

Ser

Gly

Phe

35

40

45

Tyr

Arg

Pro

His

Asp

Arg

Arg

Glu

Leu

Glu

Asp

Leu

Gln

Val

Glu

Gln

50

55

60

Ala

Glu

Leu

Gly

Leu

Glu

Ala

Gly

Gly

Leu

Gln

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

65

70

75

80

Met

Ile

Leu

Gln

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

Asn

Asn

Ile

85

90

95

Cys

Thr

Phe

Asn

Gln

Leu

Gln

Asn

Tyr

Cys

Asn

Val

Pro

100

105

<210> 138 <211> 86 <212> Белок <213> Chinchilla brevicaudata

- 311 033472 <220>

<223> Proinsulin <220>

<221> UNSURE <222> 31

<223>	Xaa=Basic	residue	assumed	by	homology
<220>
<221>	UNSURE
<222>	32
<223>	Xaa=Basic	residue	assumed	by	homology
<220>
<221>	UNSURE
<222>	64
<223>	Xaa=Basic	residue	assumed	by	homology
<220>
<221>	UNSURE
<222>	65
<223>	Xaa=Basic	residue	assumed	by	homology

<400> 138

Phe

Val

Asn

Lys

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Asp

Ala

Leu

Tyr

1

5

10

15

Leu

Val

Cys

Gly

Asp

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Met

Ala

Xaa

Xaa

20

25

30

Glu

Leu

Glu

Asp

Pro

Gln

Val

Gly

Gln

Ala

Asp

Pro

Gly

Val

Val

Pro

35

40

45

Glu

Ala

Gly

Arg

Leu

Gln

Pro

Leu

Ala

Leu

Glu

Met

Thr

Leu

Gln

Xaa

50

55

60

Xaa

Gly

Ile

Val

Asp

Gln

Cys

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Thr

Leu

Tyr

Gln

65

70

75

80

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

85

<210> 139 <211> 107 <212> Белок <213> Gallus gallus <220>

<223> Preproinsulin <400> 139

Met

Ala

Leu

Trp

Ile

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Val

Phe

1

5

10

15

Ser

Gly

Pro

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ala

Ala

Ala

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

20

25

30

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

35

40

45

Phe

Tyr

Ser

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Asp

Val

Glu

Gln

Pro

Leu

Val

Ser

50

55

60

Ser

Pro

Leu

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

Val

Leu

Pro

Phe

Gln

Gln

Glu

Glu

65

70

75

80

Tyr

Glu

Lys

Val

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

His

Asn

Thr

85

90

95

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

- 312 033472 <210> 140 <211> 103 <212> Белок <213> Selasphorus rufus <220>

<223> Proinsulin <400> 140

Ile

Gln

Ser

Leu

Pro

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Ala

Leu

Ser

Gly

Pro

Gly

1

5

10

15

Thr

Ser

His

Ala

Ala

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

20

25

30

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Ser

Pro

35

40

45

Lys

Ala

Arg

Arg

Asp

Ala

Glu

His

Pro

Leu

Val

Asn

Gly

Pro

Leu

His

50

55

60

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Leu

Pro

Phe

Gln

Gln

Glu

Glu

Phe

Glu

Lys

Val

65

70

75

80

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

His

Asn

Thr

Cys

Ser

Leu

Tyr

85

90

95

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

<210> 141 <211> 106 <212> Белок <213> Xenopus laevis <220>

<223> Preproinsulin 1 <400> 141

Met 1

Ala

Leu

Trp

Met 5

Gln

Cys

Leu

Pro

Leu 10

Val

Leu

Val

Leu

Phe 15

Phe

Ser

Thr

Pro

Asn

Thr

Glu

Ala

Leu

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

20

25

30

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Asp

Arg

Gly

Phe

Phe

35

40

45

Tyr

Tyr

Pro

Lys

Val

Lys

Arg

Asp

Met

Glu

Gln

Ala

Leu

Val

Ser

Gly

50

55

60

Pro

Gln

Asp

Asn

Glu

Leu

Asp

Gly

Met

Gln

Leu

Gln

Pro

Gln

Glu

Tyr

65

70

75

80

Gln

Lys

Met

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

His

Ser

Thr

Cys

85

90

95

Ser

Leu

Phe

Gln

Leu

Glu

Ser

Tyr

Cys

Asn

100

105

<210> 142 <211> 106 <212> Белок <213> Xenopus laevis <220>

<223> Preproinsulin 2 <400> 142

Met Ala Leu Trp Met Gln Cys Leu Pro

5

Ser Thr Pro Asn Thr Glu Ala Leu Ala

Leu Val Leu Val Leu Leu Phe

15

Asn Gln His Leu Cys Gly Ser

- 313 033472

20

25

30

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Asp

Arg

Gly

Phe

Phe

35

40

45

Tyr

Tyr

Pro

Lys

Ile

Lys

Arg

Asp

Ile

Glu

Gln

Ala

Gln

Val

Asn

Gly

50

55

60

Pro

Gln

Asp

Asn

Glu

Leu

Asp

Gly

Met

Gln

Phe

Gln

Pro

Gln

Glu

Tyr

65

70

75

80

Gln

Lys

Met

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

His

Ser

Thr

Cys

85

90

95

Ser

Leu

Phe

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

<210> 143 <211> 106 <212> Белок <213> Xenopus tropicalis <220>

<223> Preproinsulin <400> 143

Met 1

Ala

Leu

Trp

Met 5

Gln

Cys

Leu

Pro

Leu 10

Val

Leu

Val

Leu

Leu 15

Phe

Ser

Thr

Pro

Asn

Thr

Glu

Ala

Leu

Ala

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

20

25

30

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Asp

Arg

Gly

Phe

Phe

35

40

45

Tyr

Tyr

Pro

Lys

Ile

Lys

Arg

Asp

Ile

Glu

Gln

Ala

Met

Val

Asn

Gly

50

55

60

Pro

Gln

Asp

Asn

Glu

Leu

Asp

Gly

Met

Gln

Leu

Gln

Pro

Gln

Glu

Tyr

65

70

75

80

Gln

Lys

Met

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

His

Ser

Thr

Cys

85

90

95

Ser

Leu

Phe

Gln

Leu

Glu

Ser

Tyr

Cys

Asn

100

105

<210> 144 <211> 106 <212> Белок <213> Rana pipiens <220>

<223> Preproinsulin <400> 144

Met

Ala

Leu

Trp

Ile

Gln

Cys

Leu

His

Ile

Ala

Val

Leu

Leu

Ser

Leu

1

5

10

15

Phe

Thr

Pro

Thr

Leu

Lys

Thr

Phe

Asp

Asn

Gln

Tyr

Leu

Cys

Gly

Ser

20

25

30

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Met

Val

Cys

Gly

Asp

Arg

Gly

Phe

Phe

35

40

45

Tyr

Ser

Pro

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Leu

Glu

Gln

Pro

Leu

Val

Asn

Gly

50

55

60

Leu

Gln

Gly

Ser

Glu

Leu

Asp

Glu

Met

Gln

Val

Gln

Ser

Gln

Ala

Phe

65

70

75

80

Gln

Lys

Arg

Lys

Pro

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

His

Asn

Thr

Cys

85

90

95

Ser

Leu

Tyr

Asp

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

105

- 314 033472 <210> 145 <211> 81 <212> Белок <213> Anas platyrhynchos <220>

<223> Preproinsulin <220>

<221> UNSURE <222> 31 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220>

<221> UNSURE <222> 32 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220>

<221> UNSURE <222> 59 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220>

<221> UNSURE <222> 60 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <400> 145

Ala 1

Ala

Asn

Gln

His 5

Leu

Cys

Gly

Ser

His 10

Leu

Val

Glu

Ala

Leu 15

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Ser

Pro

Lys

Thr

Xaa

Xaa

20

25

30

Asp

Val

Glu

Gln

Pro

Leu

Val

Asn

Gly

Pro

Leu

His

Gly

Glu

Val

Gly

35

40

45

Glu

Leu

Pro

Phe

Gln

His

Glu

Glu

Tyr

Gln

Xaa

Xaa

Gly

Ile

Val

Glu

50

55

60

Gln

Cys

Cys

Glu

Asn

Pro

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

65

70

75

80

Asn

<210> 146 <211> 51 <212> Белок <213> Capra hircus <220>

<223> Preproinsulin <400> 146

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

1

5

10

15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

Gly

Ile

20

25

30

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

Ala

Gly

Val

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

35

40

45

Tyr Cys Asn <210> 147

- 315 033472 <211> 30 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Aspart insulin <220>

<223> Insulin B chain analog <400> 147

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu Tyr

1

5

10

15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Asp

Lys

Thr

20

25

30

<210> 148 <211> 30 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Lispro insulin <220>

<223> Insulin B chain analog <400> 148

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu Tyr

1

5

10

15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Lys

Pro

Thr

20

25

30

<210> 149 <211> 30 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Glulisine insulin <220>

<223> Insulin B chain analog <400> 149

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu Tyr

1

5

10

15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Glu

Thr

20

25

30

<210>

<211>

<212>

<213>

150

Белок

Homo sapiens <220>

<223>

Glargine insulin <220>

<223> Insulin A chain analog

- 316 033472 <400> 150

Gly Ile Val Glu

Glu Asn Tyr Cys

Gln Cys Cys Thr 5

Gly

Ser Ile Cys Ser

Leu Tyr Gln Leu <210> 151 <211> 32 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Glargine insulin <220>

<223> Insulin B chain analog <400> 151

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

1

5

10

15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Arg

20

25

30

<210> 152 <211> 53 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Detemir insulin <220>

<223> Proinsulin analog <220>

<221> CHAIN <222> (33)...(53) <223> A Chain <220>

<221> CHAIN <222> (1)...(29) <223> B chain <400> 152

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

1

5

10

15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

Ala

Lys

20

25

30

Gly

Ile

Val

Glu

Gln

Cys

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

35

40

45

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

<210> 153 <211> 30 <212> Белок <213> Homo sapiens

- 317 033472 <220>

<223> Insulin B chain analog <220>

<221> вариант <222> 28 <223> Xaa=Pro, Lys, Leu, Val or Ala <220>

<221> вариант <222> 29 <223> Xaa=Lys or Pro <400> 153

Phe 1

Val

Asn

Gln

His 5

Leu

Cys

Gly

Ser

His 10

Leu

Val

Glu

Ala

Leu Tyr 15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Xaa

Xaa

Thr

20

25

30

<210> 154 <211> 27 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Insulin B	chain analog	(des 28-30)
<400> 154
Phe Val	Asn	Gln	His	Leu	Cys	Gly	Ser	His	Leu Val	Glu Ala Leu Tyr
1			5					10		15
Leu Val	Cys	Gly	Glu	Arg	Gly	Phe	Phe	Tyr	Thr
		20					25

<210> 155 <211> 29 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Insulin B chain analog (des 27) <400> 155

Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu Ala

Leu Tyr

1

5

10

15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Pro

Lys

Thr

20

25

<210> 156 <211> 21 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Insulin A chain analog <220>

<221> вариант <222> 21 <223> Xaa=Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, Thr or Ser

- 318 033472 <400> 156

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Xaa <210> 157 <211> 31 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Insulin B chain analog <220>

<221> вариант <222> 1 <223> Xaa=Phe, Asp or none <220>

<221> вариант <222> 2 <223> Xaa=Val or none <220>

<221> вариант <222> 3 <223> Xaa=Asn or Asp <220>

<221> вариант <222> 9 <223> Xaa=Ser or Asp <220>

<221> вариант <222> 10 <223> Xaa=His or Asp <220>

<221> вариант <222> 28 <223> Xaa=any amino acid <220>

<221> вариант <222> 29 <223> Xaa=L-Pro, D-Pro, D-hydroxypro, L-hydroxypro, L-(N-methyllysine), D-Lysine, L-(N-methyl arginine) or D-arginine <220>

<221> вариант <222> 30 <223> Xaa=Ala or Thr <220>

<221> вариант <222> 31 <223> Xaa=Arg, Arg-Arg, Lys, Lys-Lys, Arg-Lys, Lys-Arg or none <400> 157

Xaa Xaa Asn Gln His Leu Cys Gly Xaa Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr

- 319 033472

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe

25

Tyr Thr Xaa Xaa Xaa Xaa <210> 158 <211> 21 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Insulin A chain analog <220>

<221> вариант <222> 8 <223> Xaa=His, Phe, Gly, Gln, Glu, Ser, Asn, Asp, or Pro <220>

<221> вариант <222> 9

<223>	Xaa=Gly,	Asp,	Glu,	Thr,	His,	Gln,	Asn,	Ala or Pro
<220>
<221>	вариант
<222>	10
<223>	Xaa=Leu,	Pro,	Val,	His,	Ala,	Glu,	Asp,	Thr, Gln or Asn
<220>
<221>	вариант
<222>	13
<223>	Xaa=Pro,	Val,	Arg,	His,	Ala,	Glu,	Asp,	Thr, Gly, Gln or Asn

<220>

<221> вариант <222> 21 <223> Xaa=Asp or Glu

<400> 158
Gly Ile Val	Glu	Gln Cys	Cys Xaa Xaa Xaa Cys	Ser Xaa Tyr Gln Leu
1		5	10	15
Glu Asn Tyr	Cys	Xaa
	20

<210>	159
<211>	30
<212>	Белок
<213>	Homo sapiens
<220>
<223>	Insulin B chain analog
<220>
<221>	вариант
<222>	1
<223>	Xaa=Phe, Glu,	Asp,	Thr or Ser
<220>
<221>	вариант
<222>	2
<223>	Xaa=Val, Arg,	His,	Ala, Glu, Asp

Thr

Pro, Gly, Gln, Ser or Asn

- 320 033472 <220>

<221> вариант <222> 5

<223>	Xaa=His,	Ala,	Glu,	Aps,	Thr,	Ser,	Gln,	or	Asn
<220>
<221>	вариант
<222>	9
<223>	Xaa=Ser,	Leu,	Asp,	Pro,	Glu,	Ile,	Val,	His	, Thr, Gln, Asn, Met, Tyr
Trp or Phe
<220>
<221>	вариант
<222>	10
<223>	Xaa=His,	Asn,	Leu,	Asp,	Arg,	Glu,	Ser,	Thr	, Ile or Gln

<220>

<221> вариант <222> 12

<223>	Xaa=Val,	Asn,	His,	Ile	or Tyr
<220>
<221>	вариант
<222>	14
<223>	Xaa=Ala,	Glu,	Asp,	, Asn	, Gln, Ser, Thr	, Gly
<220>
<221>	вариант
<222>	16
<223>	Xaa=Tyr,	Asp,	Glu,	Gln,	Asn, Ser, Thr,	His or	Arg
<220>
<221>	вариант
<222>	17
<223>	Xaa=Leu,	Ser,	Thr,	Asn,	Gln, Glu, Asp	or His
<220>
<221>	вариант
<222>	18
<223>	Xaa=Val,	Ser,	Thr,	Asn,	Gln or His
<220>
<221>	вариант
<222>	20
<223>	Xaa=Gly,	Gln,	Ser,	Thr,	Asn, Asp, Glu,	His or	Arg
<220>
<221>	вариант
<222>	26
<223>	Xaa=Tyr,	Ala,	Asp,	His	or Glu

<220>

<221> вариант <222> 27 <223> Xaa=Thr, Asp, His or Glu <220>

<221> вариант <222> 28 <223> Xaa=Pro, Asp or Glu

- 321 033472 <400> 159

Xaa Xaa Asn Gln

Xaa Xaa Cys Xaa

Xaa Leu Cys Gly

Glu Arg Gly Phe

Xaa Xaa Leu Xaa

Phe Xaa Xaa Xaa

Glu Xaa Leu Xaa

Lys Thr <210> 160 <211> 21 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Insulin A chain analog <220>

<221> вариант <222> 21 <223> Xaa=Asn, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Cys, Tyr, Asp or Glu

Thr,

<400> 160
Gly Ile Val	Glu	Gln Cys Cys	Thr Ser Ile Cys	Ser Leu Tyr Gln Leu
1		5	10	15
Glu Asn Tyr	Cys	Xaa
	20

<210> 161 <211> 30 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Insulin B chain analog <220>

<221> вариант <222> 1 <223> Xaa=Phe or none <220>

<221> вариант <222> 29 <223> Xaa=Ly, Ala, Thr or Ser <220>

<221> вариант <222> 30 <223> Xaa=Thr, Arg, Lys, Hyl, Orn or Cit <400> 161

Xaa 1

Val

Asn

Gln

His 5

Leu

Cys

Gly

Ser

His 10

Leu

Val

Glu

Ala

Leu Tyr 15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Xaa

Xaa

20

25

30

<210> 162 <211> 21 <212> Белок <213> Homo sapiens

- 322 033472 <220>

<223> Insulin A chain analog <220>

<221> вариант <222> 21

<223> Xaa=Asn,	Gly,	Ala, Val, Leu,	Ile,	Pro, Phe, Trp, Met,	Ser, Thr
Cys, Tyr, Asp,	Glu,	His or Gln
<400> 162
Gly Ile Val	Glu	Gln	Cys Cys Thr Ser	Ile	Cys Ser Leu Tyr Gln	Leu
1		5		10	15
Glu Asn Tyr	Cys	Xaa
	20

<210> 163 <211> 30 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Insulin B chain analog <220>

<221> вариант <222> 1 <223> Xaa=Phe or none <220>

<221> вариант <222> 3 <223> Xaa=Asn, Cys, Tyr, Asp,	Gly, Glu,	Ala, His	Val, Leu, or Gln	Ile,	Pro,	Phe, Trp,	Met,	Ser,	Thr
<220> <221> вариант <222> 30
<223> Xaa=Asn,	Gly,	Ala,	Val, Leu,	Ile,	Pro,	Phe, Trp,	Met,	Ser,	Thr
Cys, Tyr, Asp,	Glu,	His	or Gln
<400> 163
Xaa Val Xaa Gln His	Leu	Cys Gly	Ser	His	Leu	Val Glu Ala	Leu	Tyr
1	5				10			15
Leu Val Cys Gly Glu	Arg	Gly Phe	Phe	Tyr	Thr	Pro Lys Xaa
20				25			30

<210>	164
<211>	21
<212>	Белок
<213>	Homo sapiens
<220>
<223>	Insulin	A	chain analog
<220>
<221>	вариант
<222>	8
<223>	Xaa=Ala	or	Thr
<220>
<221>	вариант

- 323 033472 <222> 10 <223> Xaa=Val or Ile <220>

<221> вариант <222> 21 <223> Xaa=Asn, Asp, Gly, Ser, Thr or Ala

164 <400>

Gly Ile Val

Glu Asn Tyr

Glu Gln Cys Cys Xaa

Cys Xaa

Ser

Xaa

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gln Leu <210> 165 <211> 30 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Insulin B chain analog <220>

<221> вариант <222> 1 <223> Xaa=Phe or none <220>

<221> вариант <222> 1 <223> Xaa=Thr or none <400> 165

Xaa 1

Val

Asn

Gln

His 5

Leu

Cys

Gly

Ser

His 10

Leu

Val

Glu

Ala

Leu Tyr 15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Xaa

20

25

30

<210> 166 <211> 6 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 166

Arg Pro Pro Pro Pro Cys

5 <210> 167 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 167

Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys

- 324 033472 <210> 168 <211> 5 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 168

Gly Gly Gly Gly Ser

5 <210> 169 <211> 5 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <220>

<221> REPEAT <222> (1)...(5) <223> Repeating linker peptide <400> 169

Gly Gly Gly Gly Ser

5 <210> 170 <211> 12 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 170

Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser

5 10 <210> 171 <211> 14 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 171

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly

5 10 <210> 172 <211> 18 <212> Белок

- 325 033472 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 172

Gly	Ser Thr	Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser
1 Lys	Gly	5	10	15

Thr <210> 173 <211> 14 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 173

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly

5 10 <210> 174 <211> 18 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 174

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15

Lys Gly

Thr <210> 175 <211> 14 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 175

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe

5 10 <210> 176 <211> 5 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 176

Ser Arg Ser Ser Gly

- 326 033472 <210> 177 <211> 5 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 177

Ser Gly Ser Ser Cys

5 <210> 178 <211> 3 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 178

Ala Ala Lys <210> 179 <211> 2 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 179

Val Met <210> 180 <211> 2 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence <400> 180

Ala Met <210> 181 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Linker Peptide Sequence

- 327 033472 <220>

<221> REPEAT <222> (3)...(5) <223> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 repeats <220>

<221> вариант <222> 4 <223> Xaa=Gly, Gly-Gly or Gly-Gly-Gly <400> 181

Ala Met Gly Xaa Ser Ala Met

5

210> 182 <211> 30 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HMR-1 153 B-chain <400> 182

Phe

Val

Lys

Gln

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu Tyr

1

5

10

15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Ile

Lys

Thr

20

25

30

<210> 183 <211> 21 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HMR-1 1423 A-chain <400> 183

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Gly <210> 184 <211> 32 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HMR-1 1423 B-chain <400> 184

Phe 1

Val

Asn

Gln

His 5

Leu

Cys

Gly

Ser

His 10

Leu

Val

Glu Ala

Leu 15

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

His

His

20

25

30

<210> 185 <211> 510 <212> Белок <213> Pan troglodytes

- 328 033472 <220>

<223> Chimpanzee PH20 <400> 185

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Val

Thr

Gly

Gln

Asp

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Gln

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Val

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

- 329 033472

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Ser

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

Asp

485

490

495

Leu

Cys

Asp

Leu

Tyr

Leu

Val

Pro

Thr

Ser

Tyr

Leu

Ile

Leu

500

505

510

<210> 186 <211> 512 <212> Белок <213> Macaca mulatta <220>

<223> Rhesus Monkey PH20 <400> 186

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Ile

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asn

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Thr

Leu

Met

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ile

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Leu

Thr

Thr

Gly

Val

Thr

Val

His

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Val

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ser

Lys

115

120

125

Gln

Asp

Ile

Leu

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Pro

Gln

Ala

Thr

Asp

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Met

Leu

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Arg

195

200

205

Ser

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Arg

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asp

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Val

Val

260

265

270

Val

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Asn

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Val

Tyr

Ala

290

295

300

Arg

Leu

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Arg

Glu

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Ser

Thr

Leu

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Ser

Leu

Ser

Ile

Thr

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Thr

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

- 330 033472

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val His

Phe Tyr

Val Lys

450

Ile Asp

465

Ile Phe

Trp Arg

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Ala Ser

Tyr Asn

Leu Glu

500

Ala Lys

Arg Lys

390 Phe Asp 405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Leu Lys

470

Thr Ser

485

Val Trp

Met Cys

375

Asp Trp

Ile Arg

Val Glu

Thr Asn

440

Val Asp

455

Pro Pro

Ser Ser

Asp Gln

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

Val Glu

Thr Val

490

Gly Ile

505

Val Leu

380

Ser Asp

395

Lys Gly

Glu Glu

Cys Lys

Ile Ala

460

Thr Glu

475

Ser Thr

Ser Arg

Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Glu Lys 445 Asp Gly

Gly Ser

Thr Met

Ile Gly

510

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr

415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys

Pro Pro

480

Phe Ile

495

Phe Phe <210> 187 <211> 505 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-505 <400> 187

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

- 331 033472

Ala Ala

Thr 275

Leu

Tyr Val

Arg

Asn Arg 280

Val

Arg

Glu Ala 285

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

Val

485

490

495

Ser

Ile

Leu

Phe

Leu

Ile

Ile

Ser

Ser

500

505

<210> 188 <211> 503 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-503 <400> 188

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

- 332 033472

Val

Gln

Leu

Ser 180

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr 185

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln 190

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

Val

485

490

495

Ser

Ile

Leu

Phe

Leu

Ile

Ile

500

<210> 189 <211> 501 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-501 <400> 189

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

- 333 033472

Ile Asn

Ala

Thr

Gly 85

Gln

Gly

Val

Thr

Ile 90

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg 95

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

Val

485

490

495

Ser

Ile

Leu

Phe

Leu

500

<210> 190 <211> 499 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-499

- 334 033472 <400> 190

Met Gly Val Leu 1

Ser Ser Gly Val

Cys Leu Thr Leu

Phe Leu Trp Ala

Asp Glu Pro Leu

Ile Asn Ala Thr

Gly Tyr Tyr Pro

100

Gly Ile Pro Gln

115

Lys Asp Ile Thr

130

Ile Asp Trp Glu

145

Lys Asp Val Tyr

Val Gln Leu Ser

180

Glu Lys Ala Gly

195

Leu Leu Arg Pro

210

Tyr Asn His His

225

Val Glu Ile Lys

Thr Ala Leu Tyr

260

Ala Ala Thr Leu

275

Ser Lys Ile Pro

290

Arg Ile Val Phe

305

Leu Val Tyr Thr

Val Ile Trp Gly

340

Leu Leu Asp Asn

355

Val Thr Leu Ala

370

Gly Val Cys Ile

385

Asn Pro Asp Asn

Val Arg Gly Lys

420

Phe Tyr Cys Ser

435

Val Lys Asp Thr

450

Ile Asp Ala Phe

465

Phe Tyr Asn Ala

Lys Phe Lys His

Ser Gln Ile Val

Asn Phe Arg Ala

Trp Asn Ala Pro

Asp Met Ser Leu

Gly Gln Gly Val

Tyr Ile Asp Ser

Lys Ile Ser Leu

120

Phe Tyr Met Pro

135

Glu Trp Arg Pro

150

Lys Asn Arg Ser

165

Leu Thr Glu Ala

Lys Asp Phe Leu

200

Asn His Leu Trp

215

Tyr Lys Lys Pro

230

Arg Asn Asp Asp

245

Pro Ser Ile Tyr

Tyr Val Arg Asn

280

Asp Ala Lys Ser

295

Thr Asp Gln Val

310

Phe Gly Glu Thr

325

Thr Leu Ser Ile

Tyr Met Glu Thr

360

Ala Lys Met Cys

375

Arg Lys Asn Trp

390

Phe Ala Ile Gln

405

Pro Thr Leu Glu

Cys Tyr Ser Thr

440

Asp Ala Val Asp

455

Leu Lys Pro Pro

470

Ser Pro Ser Thr

Ile Phe Phe Arg

Phe Thr Phe Leu

Pro Pro Val Ile

Ser Glu Phe Cys

Phe Ser Phe Ile

Thr Ile Phe Tyr

Ile Thr Gly Val

105

Gln Asp His Leu

Val Asp Asn Leu

140

Thr Trp Ala Arg

155

Ile Glu Leu Val

170

Thr Glu Lys Ala

185

Val Glu Thr Ile

Gly Tyr Tyr Leu

220

Gly Tyr Asn Gly

235

Leu Ser Trp Leu

250

Leu Asn Thr Gln

265

Arg Val Arg Glu

Pro Leu Pro Val

300

Leu Lys Phe Leu

315

Val Ala Leu Gly

330

Met Arg Ser Met

345

Ile Leu Asn Pro

Ser Gln Val Leu

380

Asn Ser Ser Asp

395

Leu Glu Lys Gly

410

Asp Leu Glu Gln

425

Leu Ser Cys Lys

Val Cys Ile Ala

460

Met Glu Thr Glu

475

Leu Ser Ala Thr

Ser Phe Val Lys

Leu Ile Pro Cys

Pro Asn Val Pro

Leu Gly Lys Phe

Gly Ser Pro Arg

Val Asp Arg Leu

Thr Val Asn Gly

110

Asp Lys Ala Lys

125

Gly Met Ala Val

Asn Trp Lys Pro

160 Gln Gln Gln Asn

175

Lys Gln Glu Phe

190

Lys Leu Gly Lys

205

Phe Pro Asp Cys

Ser Cys Phe Asn

240

Trp Asn Glu Ser

255

Gln Ser Pro Val

270

Ala Ile Arg Val

285

Phe Ala Tyr Thr

Ser Gln Asp Glu

320

Ala Ser Gly Ile

335

Lys Ser Cys Leu

350

Tyr Ile Ile Asn

365

Cys Gln Glu Gln

Tyr Leu His Leu

400

Gly Lys Phe Thr

415

Phe Ser Glu Lys

430

Glu Lys Ala Asp

445

Asp Gly Val Cys

Glu Pro Gln Ile

480

Met Phe Ile Val

- 335 033472

485

Ser Ile Leu

490

495 <210> 191 <211> 497 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-497 <400> 191

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

- 336 033472

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe 405

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu 410

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe 415

Thr

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

Val

485

490

495

Ser

<210> 192 <211> 495 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-495 <400> 192

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

- 337 033472

305

310

315

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

325

330

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

340

345

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

385

390

395

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

405

410

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

420

425

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

465

470

475

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

485

490

320

Ser	Gly	Ile
	335
Ser	Cys	Leu
350
Ile	Ile	Asn
Gln	Glu	Gln
Leu	His	Leu
		400
Lys	Phe	Thr
	415
Ser	Glu	Lys
430
Lys	Ala	Asp
Gly	Val	Cys
Pro	Gln	Ile
		480
Phe	Ile
	495

<210> 193 <211> 493 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-493 <400> 193

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

- 338 033472

Tyr Asn 225

Val Glu

Thr Ala

Ala Ala

Ser Lys

290

Arg Ile 305

Leu Val

Val Ile

Leu Leu

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val Arg

Phe Tyr

Val Lys

450

Ile Asp

465

Phe Tyr

His His

Ile Lys

Leu Tyr

260

Thr Leu

275

Ile Pro

Val Phe

Tyr Thr

Trp Gly

340

Asp Asn

355

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Ala Phe

Asn Ala

Tyr Lys

230 Arg Asn 245

Pro Ser

Tyr Val

Asp Ala

Thr Asp

310

Phe Gly

325

Thr Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ala 405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Leu Lys

470

Ser Pro

485

Lys Pro

Asp Asp

Ile Tyr

Arg Asn

280 Lys Ser 295

Gln Val

Glu Thr

Ser Ile

Glu Thr

360 Met Cys 375

Asn Trp

Ile Gln

Leu Glu

Ser Thr

440 Val Asp 455

Pro Pro

Ser Thr

Gly Tyr

Leu Ser

250

Leu Asn

265

Arg Val

Pro Leu

Leu Lys

Val Ala

330

Met Arg

345

Ile Leu

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

Met Glu

Leu Ser

490

Asn Gly

235

Trp Leu

Thr Gln

Arg Glu

Pro Val

300

Phe Leu

315

Leu Gly

Ser Met

Asn Pro

Val Leu

380

Ser Asp

395

Lys Gly

Glu Gln

Cys Lys

Ile Ala

460

Thr Glu

475

Ala Thr

Ser Cys

Trp Asn

Gln Ser

270

Ala Ile

285

Phe Ala

Ser Gln

Ala Ser

Lys Ser

350

Tyr Ile 365

Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Glu Lys 445 Asp Gly

Glu Pro

Met

Phe Asn

240

Glu Ser 255

Pro Val

Arg Val

Tyr Thr

Asp Glu

320 Gly Ile 335

Cys Leu

Ile Asn

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr 415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys

Gln Ile

480 <210> 194 <211> 491 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-491 <400> 194

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

- 339 033472

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

485

490

<210> 195 <211> 489 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-489 <400> 195

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

- 340 033472

Asp Glu

Ile Asn

Gly Tyr

Gly Ile

Lys Asp

130

Ile Asp

145

Lys Asp

Val Gln

Glu Lys

Leu Leu

210 Tyr Asn 225

Val Glu

Thr Ala

Ala Ala

Ser Lys

290

Arg Ile 305

Leu Val

Val Ile

Leu Leu

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val Arg

Phe Tyr

Val Lys

450

Ile Asp

465

Phe Tyr

Pro Leu

Ala Thr

Tyr Pro

100

Pro Gln

115

Ile Thr

Trp Glu

Val Tyr

Leu Ser

180

Ala Gly

195

Arg Pro

His His

Ile Lys

Leu Tyr

260

Thr Leu

275

Ile Pro

Val Phe

Tyr Thr

Trp Gly

340

Asp Asn

355

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Ala Phe

Asn Ala

Asp Met

Gly Gln 85

Tyr Ile

Lys Ile

Phe Tyr

Glu Trp

150 Lys Asn 165

Leu Thr

Lys Asp

Asn His

Tyr Lys

230 Arg Asn 245

Pro Ser

Tyr Val

Asp Ala

Thr Asp

310

Phe Gly

325

Thr Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ala

405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Leu Lys

470

Ser Pro

485

Ser Leu

Gly Val

Asp Ser

Ser Leu

120

Met Pro

135

Arg Pro

Arg Ser

Glu Ala

Phe Leu

200 Leu Trp 215

Lys Pro

Asp Asp

Ile Tyr

Arg Asn

280 Lys Ser 295

Gln Val

Glu Thr

Ser Ile

Glu Thr

360 Met Cys 375

Asn Trp

Ile Gln

Leu Glu

Ser Thr

440 Val Asp 455

Pro Pro

Ser Thr

Phe Ser

Thr Ile

Ile Thr

105

Gln Asp

Val Asp

Thr Trp

Ile Glu

170

Thr Glu

185

Val Glu

Gly Tyr

Gly Tyr

Leu Ser

250

Leu Asn

265

Arg Val

Pro Leu

Leu Lys

Val Ala

330

Met Arg

345

Ile Leu

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

Met Glu

Leu

Phe Ile 75

Phe Tyr

Gly Val

His Leu

Asn Leu

140 Ala Arg 155

Leu Val

Lys Ala

Thr Ile

Tyr Leu

220 Asn Gly 235

Trp Leu

Thr Gln

Arg Glu

Pro Val

300

Phe Leu 315

Leu Gly

Ser Met

Asn Pro

Val Leu

380 Ser Asp 395 Lys Gly

Glu Gln

Cys Lys

Ile Ala

460

Thr Glu

475

Gly Ser

Val Asp

Thr Val

110

Asp Lys

125

Gly Met

Asn Trp

Gln Gln

Lys Gln

190

Lys Leu

205

Phe Pro

Ser Cys

Trp Asn

Gln Ser

270

Ala Ile

285

Phe Ala

Ser Gln

Ala Ser

Lys Ser

350

Tyr Ile

365

Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430

Glu Lys

445

Asp Gly

Glu Pro

Pro Arg

Arg Leu

Asn Gly

Ala Lys

Ala Val

Lys Pro

160

Gln Asn

175

Glu Phe

Gly Lys

Asp Cys

Phe Asn

240

Glu Ser

255

Pro Val

Arg Val

Tyr Thr

Asp Glu

320

Gly Ile

335

Cys Leu

Ile Asn

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr

415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys

Gln Ile

480 <210> 196 <211> 490 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-490

- 341 033472 <400> 196

Met Gly Val Leu 1

Ser Ser Gly Val

Cys Leu Thr Leu

Phe Leu Trp Ala

Asp Glu Pro Leu

Ile Asn Ala Thr

Gly Tyr Tyr Pro

100

Gly Ile Pro Gln

115

Lys Asp Ile Thr

130

Ile Asp Trp Glu

145

Lys Asp Val Tyr

Val Gln Leu Ser

180

Glu Lys Ala Gly

195

Leu Leu Arg Pro

210

Tyr Asn His His

225

Val Glu Ile Lys

Thr Ala Leu Tyr

260

Ala Ala Thr Leu

275

Ser Lys Ile Pro

290

Arg Ile Val Phe

305

Leu Val Tyr Thr

Val Ile Trp Gly

340

Leu Leu Asp Asn

355

Val Thr Leu Ala

370

Gly Val Cys Ile

385

Asn Pro Asp Asn

Val Arg Gly Lys

420

Phe Tyr Cys Ser

435

Val Lys Asp Thr

450

Ile Asp Ala Phe

465

Phe Tyr Asn Ala

Lys Phe Lys His

Ser Gln Ile Val

Asn Phe Arg Ala

Trp Asn Ala Pro

Asp Met Ser Leu

Gly Gln Gly Val

Tyr Ile Asp Ser

Lys Ile Ser Leu

120

Phe Tyr Met Pro

135

Glu Trp Arg Pro

150

Lys Asn Arg Ser

165

Leu Thr Glu Ala

Lys Asp Phe Leu

200

Asn His Leu Trp

215

Tyr Lys Lys Pro

230

Arg Asn Asp Asp

245

Pro Ser Ile Tyr

Tyr Val Arg Asn

280

Asp Ala Lys Ser

295

Thr Asp Gln Val

310

Phe Gly Glu Thr

325

Thr Leu Ser Ile

Tyr Met Glu Thr

360

Ala Lys Met Cys

375

Arg Lys Asn Trp

390

Phe Ala Ile Gln

405

Pro Thr Leu Glu

Cys Tyr Ser Thr

440

Asp Ala Val Asp

455

Leu Lys Pro Pro

470

Ser Pro Ser Thr

Ile Phe Phe Arg

Phe Thr Phe Leu

Pro Pro Val Ile

Ser Glu Phe Cys

Phe Ser Phe Ile

Thr Ile Phe Tyr

Ile Thr Gly Val

105

Gln Asp His Leu

Val Asp Asn Leu

140

Thr Trp Ala Arg

155

Ile Glu Leu Val

170

Thr Glu Lys Ala

185

Val Glu Thr Ile

Gly Tyr Tyr Leu

220

Gly Tyr Asn Gly

235

Leu Ser Trp Leu

250

Leu Asn Thr Gln

265

Arg Val Arg Glu

Pro Leu Pro Val

300

Leu Lys Phe Leu

315

Val Ala Leu Gly

330

Met Arg Ser Met

345

Ile Leu Asn Pro

Ser Gln Val Leu

380

Asn Ser Ser Asp

395

Leu Glu Lys Gly

410

Asp Leu Glu Gln

425

Leu Ser Cys Lys

Val Cys Ile Ala

460

Met Glu Thr Glu

475

Leu Ser

Ser Phe Val Lys

Leu Ile Pro Cys

Pro Asn Val Pro

Leu Gly Lys Phe

Gly Ser Pro Arg

Val Asp Arg Leu

Thr Val Asn Gly

110

Asp Lys Ala Lys

125

Gly Met Ala Val

Asn Trp Lys Pro

160 Gln Gln Gln Asn

175

Lys Gln Glu Phe

190

Lys Leu Gly Lys

205

Phe Pro Asp Cys

Ser Cys Phe Asn

240

Trp Asn Glu Ser

255

Gln Ser Pro Val

270

Ala Ile Arg Val

285

Phe Ala Tyr Thr

Ser Gln Asp Glu

320

Ala Ser Gly Ile

335

Lys Ser Cys Leu

350

Tyr Ile Ile Asn

365

Cys Gln Glu Gln

Tyr Leu His Leu

400

Gly Lys Phe Thr

415

Phe Ser Glu Lys

430

Glu Lys Ala Asp

445

Asp Gly Val Cys

Glu Pro Gln Ile

480

- 342 033472

485

490 <210> 197 <211> 487 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-487 <400> 197

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

- 343 033472

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

485 <210> 198 <211> 485 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-485 <400> 198

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

- 344 033472

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

485

<210> 199 <211> 484 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-484 <400> 199

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

- 345 033472

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

<210> 200 <211> 476 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-476 <400> 200

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

- 346 033472

Val

Gln Leu

Ser 180

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr 185

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln 190

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

465

470

475

<210> 201 <211> 475 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-475 <400> 201

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

- 347 033472

Gly Ile

Lys Asp

130 Ile Asp 145

Lys Asp

Val Gln

Glu Lys

Leu Leu

210 Tyr Asn 225

Val Glu

Thr Ala

Ala Ala

Ser Lys

290

Arg Ile 305

Leu Val

Val Ile

Leu Leu

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val Arg

Phe Tyr

Val Lys

450

Ile Asp

465

Pro Gln

115

Ile Thr

Trp Glu

Val Tyr

Leu Ser

180

Ala Gly

195

Arg Pro

His His

Ile Lys

Leu Tyr

260

Thr Leu

275

Ile Pro

Val Phe

Tyr Thr

Trp Gly

340

Asp Asn

355

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Ala Phe

Lys Ile

Phe Tyr

Glu Trp

150 Lys Asn 165

Leu Thr

Lys Asp

Asn His

Tyr Lys

230 Arg Asn 245

Pro Ser

Tyr Val

Asp Ala

Thr Asp

310

Phe Gly

325

Thr Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ala

405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Leu Lys

470

Ser Leu

120

Met Pro

135

Arg Pro

Arg Ser

Glu Ala

Phe Leu

200 Leu Trp 215

Lys Pro

Asp Asp

Ile Tyr

Arg Asn

280 Lys Ser 295

Gln Val

Glu Thr

Ser Ile

Glu Thr

360 Met Cys 375

Asn Trp

Ile Gln

Leu Glu

Ser Thr

440

Val Asp

455

Pro Pro

Gln Asp

Val Asp

Thr Trp

Ile Glu

170

Thr Glu

185

Val Glu

Gly Tyr

Gly Tyr

Leu Ser

250

Leu Asn

265

Arg Val

Pro Leu

Leu Lys

Val Ala

330

Met Arg

345

Ile Leu

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

Met Glu

His Leu

Asn Leu

140 Ala Arg 155

Leu Val

Lys Ala

Thr Ile

Tyr Leu

220 Asn Gly 235

Trp Leu

Thr Gln

Arg Glu

Pro Val

300

Phe Leu 315

Leu Gly

Ser Met

Asn Pro

Val Leu

380 Ser Asp 395 Lys Gly

Glu Gln

Cys Lys

Ile Ala

460

Thr

475

Asp Lys 125

Gly Met

Asn Trp

Gln Gln

Lys Gln

190 Lys Leu 205

Phe Pro

Ser Cys

Trp Asn

Gln Ser

270

Ala Ile

285

Phe Ala

Ser Gln

Ala Ser

Lys Ser

350

Tyr Ile 365

Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Glu Lys 445 Asp Gly

Ala Lys

Ala Val

Lys Pro

160

Gln Asn

175

Glu Phe

Gly Lys

Asp Cys

Phe Asn

240

Glu Ser

255

Pro Val

Arg Val

Tyr Thr

Asp Glu

320

Gly Ile

335

Cys Leu

Ile Asn

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr

415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys <210> 202 <211> 474 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-474 <400> 202

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

- 348 033472

Phe Leu

Asp Glu 65

Ile Asn

Gly Tyr

Gly Ile

Lys Asp

130

Ile Asp

145

Lys Asp

Val Gln

Glu Lys

Leu Leu

210 Tyr Asn 225

Val Glu

Thr Ala

Ala Ala

Ser Lys

290

Arg Ile 305

Leu Val

Val Ile

Leu Leu

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val Arg

Phe Tyr

Val Lys

450

Ile Asp

465

Trp Ala

Pro Leu

Ala Thr

Tyr Pro

100

Pro Gln

115

Ile Thr

Trp Glu

Val Tyr

Leu Ser

180

Ala Gly

195

Arg Pro

His His

Ile Lys

Leu Tyr

260

Thr Leu

275

Ile Pro

Val Phe

Tyr Thr

Trp Gly

340

Asp Asn

355

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Ala Phe

Trp Asn

Asp Met

Gly Gln

Tyr Ile

Lys Ile

Phe Tyr

Glu Trp

150 Lys Asn 165

Leu Thr

Lys Asp

Asn His

Tyr Lys

230 Arg Asn 245

Pro Ser

Tyr Val

Asp Ala

Thr Asp

310

Phe Gly

325

Thr Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ala 405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Leu Lys

470

Ala Pro

Ser Leu

Gly Val

Asp Ser

Ser Leu

120

Met Pro

135

Arg Pro

Arg Ser

Glu Ala

Phe Leu

200 Leu Trp 215

Lys Pro

Asp Asp

Ile Tyr

Arg Asn

280 Lys Ser 295

Gln Val

Glu Thr

Ser Ile

Glu Thr

360 Met Cys 375

Asn Trp

Ile Gln

Leu Glu

Ser Thr

440 Val Asp 455

Pro Pro

Ser Glu

Phe Ser

Thr Ile

Ile Thr

105

Gln Asp

Val Asp

Thr Trp

Ile Glu

170

Thr Glu

185

Val Glu

Gly Tyr

Gly Tyr

Leu Ser

250

Leu Asn

265

Arg Val

Pro Leu

Leu Lys

Val Ala

330

Met Arg

345

Ile Leu

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

Met Glu

Phe Cys

Phe Ile 75

Phe Tyr

Gly Val

His Leu

Asn Leu

140 Ala Arg 155

Leu Val

Lys Ala

Thr Ile

Tyr Leu

220 Asn Gly 235

Trp Leu

Thr Gln

Arg Glu

Pro Val

300

Phe Leu 315

Leu Gly

Ser Met

Asn Pro

Val Leu

380 Ser Asp 395 Lys Gly

Glu Gln

Cys Lys

Ile Ala

460

Leu Gly

Gly Ser

Val Asp

Thr Val

110 Asp Lys 125

Gly Met

Asn Trp

Gln Gln

Lys Gln

190 Lys Leu 205

Phe Pro

Ser Cys

Trp Asn

Gln Ser

270

Ala Ile

285

Phe Ala

Ser Gln

Ala Ser

Lys Ser

350 Tyr Ile 365 Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Glu Lys 445 Asp Gly

Lys Phe

Pro Arg

Arg Leu

Asn Gly

Ala Lys

Ala Val

Lys Pro

160

Gln Asn

175

Glu Phe

Gly Lys

Asp Cys

Phe Asn

240

Glu Ser

255

Pro Val

Arg Val

Tyr Thr

Asp Glu

320 Gly Ile 335

Cys Leu

Ile Asn

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr

415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys <210> 203 <211> 473 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-473

- 349 033472 <400> 203

Met Gly Val Leu 1

Ser Ser Gly Val

Cys Leu Thr Leu

Phe Leu Trp Ala

Asp Glu Pro Leu

Ile Asn Ala Thr

Gly Tyr Tyr Pro

100

Gly Ile Pro Gln

115

Lys Asp Ile Thr

130

Ile Asp Trp Glu

145

Lys Asp Val Tyr

Val Gln Leu Ser

180

Glu Lys Ala Gly

195

Leu Leu Arg Pro

210

Tyr Asn His His

225

Val Glu Ile Lys

Thr Ala Leu Tyr

260

Ala Ala Thr Leu

275

Ser Lys Ile Pro

290

Arg Ile Val Phe

305

Leu Val Tyr Thr

Val Ile Trp Gly

340

Leu Leu Asp Asn

355

Val Thr Leu Ala

370

Gly Val Cys Ile

385

Asn Pro Asp Asn

Val Arg Gly Lys

420

Phe Tyr Cys Ser

435

Val Lys Asp Thr

450

Ile Asp Ala Phe

465

Lys Phe Lys His

Ser Gln Ile Val

Asn Phe Arg Ala

Trp Asn Ala Pro

Asp Met Ser Leu

Gly Gln Gly Val

Tyr Ile Asp Ser

Lys Ile Ser Leu

120

Phe Tyr Met Pro

135

Glu Trp Arg Pro

150

Lys Asn Arg Ser

165

Leu Thr Glu Ala

Lys Asp Phe Leu

200

Asn His Leu Trp

215

Tyr Lys Lys Pro

230

Arg Asn Asp Asp

245

Pro Ser Ile Tyr

Tyr Val Arg Asn

280

Asp Ala Lys Ser

295

Thr Asp Gln Val

310

Phe Gly Glu Thr

325

Thr Leu Ser Ile

Tyr Met Glu Thr

360

Ala Lys Met Cys

375

Arg Lys Asn Trp

390

Phe Ala Ile Gln

405

Pro Thr Leu Glu

Cys Tyr Ser Thr

440

Asp Ala Val Asp

455

Leu Lys Pro Pro

470

Ile Phe Phe Arg

Phe Thr Phe Leu

Pro Pro Val Ile

Ser Glu Phe Cys

Phe Ser Phe Ile

Thr Ile Phe Tyr

Ile Thr Gly Val

105

Gln Asp His Leu

Val Asp Asn Leu

140

Thr Trp Ala Arg

155

Ile Glu Leu Val

170

Thr Glu Lys Ala

185

Val Glu Thr Ile

Gly Tyr Tyr Leu

220

Gly Tyr Asn Gly

235

Leu Ser Trp Leu

250

Leu Asn Thr Gln

265

Arg Val Arg Glu

Pro Leu Pro Val

300

Leu Lys Phe Leu

315

Val Ala Leu Gly

330

Met Arg Ser Met

345

Ile Leu Asn Pro

Ser Gln Val Leu

380

Asn Ser Ser Asp

395

Leu Glu Lys Gly

410

Asp Leu Glu Gln

425

Leu Ser Cys Lys

Val Cys Ile Ala

460

Met

Ser Phe Val Lys

Leu Ile Pro Cys

Pro Asn Val Pro

Leu Gly Lys Phe

Gly Ser Pro Arg

Val Asp Arg Leu

Thr Val Asn Gly

110

Asp Lys Ala Lys

125

Gly Met Ala Val

Asn Trp Lys Pro

160 Gln Gln Gln Asn

175

Lys Gln Glu Phe

190

Lys Leu Gly Lys

205

Phe Pro Asp Cys

Ser Cys Phe Asn

240

Trp Asn Glu Ser

255

Gln Ser Pro Val

270

Ala Ile Arg Val

285

Phe Ala Tyr Thr

Ser Gln Asp Glu

320

Ala Ser Gly Ile

335

Lys Ser Cys Leu

350

Tyr Ile Ile Asn

365

Cys Gln Glu Gln

Tyr Leu His Leu

400

Gly Lys Phe Thr

415

Phe Ser Glu Lys

430

Glu Lys Ala Asp

445

Asp Gly Val Cys

- 350 033472 <210> 204 <211> 472 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-472 <400> 204

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

- 351 033472

420

Phe Tyr Cys Ser Cys

435

Val Lys Asp Thr Asp

450

Ile Asp Ala Phe Leu

465

425

Tyr Ser Thr Leu Ser

440

Ala Val Asp Val Cys

455

Lys Pro Pro

470

430

Cys Lys Glu Lys Ala Asp

445

Ile Ala Asp Gly Val Cys

460 <210> 205 <211> 471 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-471 <400> 205

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

- 352 033472

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

385

390

395

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

465

470

Gln

Leu

400

Thr

Lys

Asp

Cys <210> 206 <211> 470 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-470 <400> 206

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

- 353 033472

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

465

470

<210> 207 <211> 469 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-469 <400> 207

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

- 354 033472

225

Val	Glu	Ile	Lys	Arg 245
Thr	Ala	Leu	Tyr 260	Pro
Ala	Ala	Thr 275	Leu	Tyr
Ser	Lys 290	Ile	Pro	Asp
Arg 305	Ile	Val	Phe	Thr
Leu	Val	Tyr	Thr	Phe 325
Val	Ile	Trp	Gly 340	Thr
Leu	Leu	Asp 355	Asn	Tyr
Val	Thr 370	Leu	Ala	Ala
Gly 385	Val	Cys	Ile	Arg
Asn	Pro	Asp	Asn	Phe 405
Val	Arg	Gly	Lys 420	Pro
Phe	Tyr	Cys 435	Ser	Cys
Val	Lys 450	Asp	Thr	Asp
Ile	Asp	Ala	Phe	Leu

465

230					235					240
Asn	Asp	Asp	Leu	Ser	Trp	Leu	Trp	Asn	Glu	Ser
				250					255
Ser	Ile	Tyr	Leu	Asn	Thr	Gln	Gln	Ser	Pro	Val
			265					270
Val	Arg	Asn	Arg	Val	Arg	Glu	Ala	Ile	Arg	Val
		280					285
Ala	Lys	Ser	Pro	Leu	Pro	Val	Phe	Ala	Tyr	Thr
	295					300
Asp	Gln	Val	Leu	Lys	Phe	Leu	Ser	Gln	Asp	Glu
310					315					320
Gly	Glu	Thr	Val	Ala	Leu	Gly	Ala	Ser	Gly	Ile
				330					335
Leu	Ser	Ile	Met	Arg	Ser	Met	Lys	Ser	Cys	Leu
			345					350
Met	Glu	Thr	Ile	Leu	Asn	Pro	Tyr	Ile	Ile	Asn
		360					365
Lys	Met	Cys	Ser	Gln	Val	Leu	Cys	Gln	Glu	Gln
	375					380
Lys	Asn	Trp	Asn	Ser	Ser	Asp	Tyr	Leu	His	Leu
390					395					400
Ala	Ile	Gln	Leu	Glu	Lys	Gly	Gly	Lys	Phe	Thr
				410					415
Thr	Leu	Glu	Asp	Leu	Glu	Gln	Phe	Ser	Glu	Lys
			425					430
Tyr	Ser	Thr	Leu	Ser	Cys	Lys	Glu	Lys	Ala	Asp
		440					445
Ala	Val	Asp	Val	Cys	Ile	Ala	Asp	Gly	Val	Cys
	455					460

<210> 208 <211> 468 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-468 <400> 208

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

- 355 033472

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

465

<210> 209 <211> 466 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-466 <400> 209

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

- 356 033472

Gly Ile

Lys Asp

130

Ile Asp

145

Lys Asp

Val Gln

Glu Lys

Leu Leu

210 Tyr Asn 225

Val Glu

Thr Ala

Ala Ala

Ser Lys

290

Arg Ile 305

Leu Val

Val Ile

Leu Leu

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val Arg

Phe Tyr

Val Lys

450

Ile Asp

465

100

Pro Gln

115

Ile Thr

Trp Glu

Val Tyr

Leu Ser

180

Ala Gly

195

Arg Pro

His His

Ile Lys

Leu Tyr

260

Thr Leu

275

Ile Pro

Val Phe

Tyr Thr

Trp Gly

340

Asp Asn

355

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Lys Ile

Phe Tyr

Glu Trp

150 Lys Asn 165

Leu Thr

Lys Asp

Asn His

Tyr Lys

230 Arg Asn 245

Pro Ser

Tyr Val

Asp Ala

Thr Asp

310

Phe Gly

325

Thr Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ala

405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Ser Leu

120

Met Pro

135

Arg Pro

Arg Ser

Glu Ala

Phe Leu

200

Leu Trp

215

Lys Pro

Asp Asp

Ile Tyr

Arg Asn

280

Lys Ser

295

Gln Val

Glu Thr

Ser Ile

Glu Thr

360

Met Cys

375

Asn Trp

Ile Gln

Leu Glu

Ser Thr

440

Val Asp

455

105

Gln Asp

Val Asp

Thr Trp

Ile Glu

170

Thr Glu

185

Val Glu

Gly Tyr

Gly Tyr

Leu Ser

250

Leu Asn

265

Arg Val

Pro Leu

Leu Lys

Val Ala

330

Met Arg

345

Ile Leu

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

His Leu

Asn Leu

140 Ala Arg 155

Leu Val

Lys Ala

Thr Ile

Tyr Leu

220 Asn Gly 235

Trp Leu

Thr Gln

Arg Glu

Pro Val

300

Phe Leu 315

Leu Gly

Ser Met

Asn Pro

Val Leu

380 Ser Asp 395 Lys Gly

Glu Gln

Cys Lys

Ile Ala

460

110 Asp Lys 125

Gly Met

Asn Trp

Gln Gln

Lys Gln

190 Lys Leu 205

Phe Pro

Ser Cys

Trp Asn

Gln Ser

270

Ala Ile

285

Phe Ala

Ser Gln

Ala Ser

Lys Ser

350

Tyr Ile 365

Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Glu Lys 445 Asp Gly

Ala Lys

Ala Val

Lys Pro

160

Gln Asn

175

Glu Phe

Gly Lys

Asp Cys

Phe Asn

240

Glu Ser

255

Pro Val

Arg Val

Tyr Thr

Asp Glu

320

Gly Ile

335

Cys Leu

Ile Asn

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr

415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys <210> 210 <211> 465 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-465 <400> 210

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

- 357 033472

Phe Leu

Asp Glu 65 Ile Asn

Gly Tyr

Gly Ile

Lys Asp

130

Ile Asp

145

Lys Asp

Val Gln

Glu Lys

Leu Leu

210 Tyr Asn 225

Val Glu

Thr Ala

Ala Ala

Ser Lys

290

Arg Ile 305

Leu Val

Val Ile

Leu Leu

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val Arg

Phe Tyr

Val Lys

450

Trp Ala

Pro Leu

Ala Thr

Tyr Pro

100

Pro Gln

115

Ile Thr

Trp Glu

Val Tyr

Leu Ser

180

Ala Gly

195

Arg Pro

His His

Ile Lys

Leu Tyr

260

Thr Leu

275

Ile Pro

Val Phe

Tyr Thr

Trp Gly

340

Asp Asn

355

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Trp Asn

Asp Met

Gly Gln

Tyr Ile

Lys Ile

Phe Tyr

Glu Trp

150 Lys Asn 165

Leu Thr

Lys Asp

Asn His

Tyr Lys

230 Arg Asn 245

Pro Ser

Tyr Val

Asp Ala

Thr Asp

310

Phe Gly

325

Thr Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ala

405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Ala Pro

Ser Leu

Gly Val

Asp Ser

Ser Leu

120

Met Pro

135

Arg Pro

Arg Ser

Glu Ala

Phe Leu

200

Leu Trp

215

Lys Pro

Asp Asp

Ile Tyr

Arg Asn

280

Lys Ser

295

Gln Val

Glu Thr

Ser Ile

Glu Thr

360

Met Cys

375

Asn Trp

Ile Gln

Leu Glu

Ser Thr

440

Val Asp

455

Ser Glu

Phe Ser

Thr Ile

Ile Thr

105

Gln Asp

Val Asp

Thr Trp

Ile Glu

170

Thr Glu

185

Val Glu

Gly Tyr

Gly Tyr

Leu Ser

250

Leu Asn

265

Arg Val

Pro Leu

Leu Lys

Val Ala

330

Met Arg

345

Ile Leu

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

Phe Cys

Phe Ile

Phe Tyr

Gly Val

His Leu

Asn Leu

140 Ala Arg 155

Leu Val

Lys Ala

Thr Ile

Tyr Leu

220 Asn Gly 235

Trp Leu

Thr Gln

Arg Glu

Pro Val

300

Phe Leu 315

Leu Gly

Ser Met

Asn Pro

Val Leu

380

Ser Asp 395

Lys Gly

Glu Gln

Cys Lys

Ile Ala

460

Leu Gly

Gly Ser

Val Asp

Thr Val

110 Asp Lys 125

Gly Met

Asn Trp

Gln Gln

Lys Gln

190

Lys Leu 205

Phe Pro

Ser Cys

Trp Asn

Gln Ser

270

Ala Ile

285

Phe Ala

Ser Gln

Ala Ser

Lys Ser

350 Tyr Ile 365 Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Glu Lys 445 Asp Gly

Lys Phe

Pro Arg

Arg Leu

Asn Gly

Ala Lys

Ala Val

Lys Pro

160

Gln Asn

175

Glu Phe

Gly Lys

Asp Cys

Phe Asn

240

Glu Ser

255

Pro Val

Arg Val

Tyr Thr

Asp Glu

320

Gly Ile

335

Cys Leu

Ile Asn

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr

415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys

Ile

465 <210> 211 <211> 464 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

- 358 033472 <223> HuPH20 предшественник 1-464 <400> 211

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

- 359 033472 <210> 212 <211> 462 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-462 <400> 212

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

- 360 033472

Phe

Tyr

Cys 435

Ser Cys

Tyr

Ser Thr 440

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu 445

Lys Ala Asp

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

450

455

460

<210> 213 <211> 460 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-460 <400> 213

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

- 361 033472

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

450

455

460

<210> 214 <211> 458 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-458 <400> 214

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

- 362 033472

Val

Ile

Trp

Gly 340

Thr

Leu

Ser

Ile

Met 345

Arg

Ser

Met

Lys

Ser 350

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

450

455

<210> 215 <211> 456 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-456 <400> 215

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

- 363 033472

Ser

Lys 290

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys 295

Ser

Pro

Leu

Pro

Val 300

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

450

455

<210> 216 <211> 454 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-454 <400> 216

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

- 364 033472

Val

Glu

Ile

Lys

Arg 245

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser 250

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu 255

Ser

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

450

<210> 217 <211> 452 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-452 <400> 217

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

- 365 033472

Glu

Lys

Ala 195

Gly Lys

Asp

Phe

Leu 200

Val

Glu

Thr

Ile

Lys 205

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

450

<210> 218 <211> 450 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-450 <400> 218

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

- 366 033472

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

450

<210> 219 <211> 508 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-508 <400> 219

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

- 367 033472

Gly Tyr

Gly Ile

Lys Asp

130

Ile Asp

145

Lys Asp

Val Gln

Glu Lys

Leu Leu

210 Tyr Asn 225

Val Glu

Thr Ala

Ala Ala

Ser Lys

290

Arg Ile 305

Leu Val

Val Ile

Leu Leu

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val Arg

Phe Tyr

Val Lys

450

Ile Asp

465

Phe Tyr

Ser Ile

Tyr Pro

100

Pro Gln

115

Ile Thr

Trp Glu

Val Tyr

Leu Ser

180

Ala Gly

195

Arg Pro

His His

Ile Lys

Leu Tyr

260

Thr Leu

275

Ile Pro

Val Phe

Tyr Thr

Trp Gly

340

Asp Asn

355

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Ala Phe

Asn Ala

Leu Phe

500

Tyr Ile

Lys Ile

Phe Tyr

Glu Trp

150 Lys Asn 165

Leu Thr

Lys Asp

Asn His

Tyr Lys

230 Arg Asn 245

Pro Ser

Tyr Val

Asp Ala

Thr Asp

310

Phe Gly

325

Thr Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ala

405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Leu Lys

470

Ser Pro

485

Leu Ile

Asp Ser

Ser Leu

120

Met Pro

135

Arg Pro

Arg Ser

Glu Ala

Phe Leu

200 Leu Trp 215

Lys Pro

Asp Asp

Ile Tyr

Arg Asn

280 Lys Ser 295

Gln Val

Glu Thr

Ser Ile

Glu Thr

360 Met Cys 375

Asn Trp

Ile Gln

Leu Glu

Ser Thr

440 Val Asp 455

Pro Pro

Ser Thr

Ile Ser

Ile Thr

105

Gln Asp

Val Asp

Thr Trp

Ile Glu

170

Thr Glu

185

Val Glu

Gly Tyr

Gly Tyr

Leu Ser

250

Leu Asn

265

Arg Val

Pro Leu

Leu Lys

Val Ala

330

Met Arg

345

Ile Leu

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

Met Glu

Leu Ser

490

Ser Val

505

Gly Val

His Leu

Asn Leu

140 Ala Arg 155

Leu Val

Lys Ala

Thr Ile

Tyr Leu

220 Asn Gly 235

Trp Leu

Thr Gln

Arg Glu

Pro Val

300

Phe Leu 315

Leu Gly

Ser Met

Asn Pro

Val Leu

380 Ser Asp 395 Lys Gly

Glu Gln

Cys Lys

Ile Ala

460

Thr Glu 475

Ala Thr

Ala Ser

Thr Val

110 Asp Lys 125

Gly Met

Asn Trp

Gln Gln

Lys Gln

190 Lys Leu 205

Phe Pro

Ser Cys

Trp Asn

Gln Ser

270

Ala Ile

285

Phe Ala

Ser Gln

Ala Ser

Lys Ser

350

Tyr Ile 365

Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Glu Lys 445

Asp Gly

Glu Pro

Met Phe

Asn Gly

Ala Lys

Ala Val

Lys Pro

160

Gln Asn

175

Glu Phe

Gly Lys

Asp Cys

Phe Asn

240

Glu Ser

255

Pro Val

Arg Val

Tyr Thr

Asp Glu

320

Gly Ile

335

Cys Leu

Ile Asn

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr

415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys

Gln Ile

480

Ile Val

495 <210> 220 <211> 506 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-506 <400> 220

- 368 033472

Met Gly

Ser Ser

Cys Leu

Phe Leu

Asp Glu

Ile Asn

Gly Tyr

Gly Ile

Lys Asp

130

Ile Asp

145

Lys Asp

Val Gln

Glu Lys

Leu Leu

210 Tyr Asn 225

Val Glu

Thr Ala

Ala Ala

Ser Lys

290

Arg Ile 305

Leu Val

Val Ile

Leu Leu

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val Arg

Phe Tyr

Val Lys

450

Ile Asp

465

Phe Tyr

Ser Ile

Val Leu

Gly Val

Thr Leu

Trp Ala

Pro Leu

Ala Thr

Tyr Pro

100

Pro Gln

115

Ile Thr

Trp Glu

Val Tyr

Leu Ser

180

Ala Gly

195

Arg Pro

His His

Ile Lys

Leu Tyr

260

Thr Leu

275

Ile Pro

Val Phe

Tyr Thr

Trp Gly

340

Asp Asn

355

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Ala Phe

Asn Ala

Leu Phe

Lys Phe

Ser Gln

Asn Phe

Trp Asn

Asp Met

Gly Gln

Tyr Ile

Lys Ile

Phe Tyr

Glu Trp

150 Lys Asn 165

Leu Thr

Lys Asp

Asn His

Tyr Lys

230 Arg Asn 245

Pro Ser

Tyr Val

Asp Ala

Thr Asp

310

Phe Gly

325

Thr Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ala

405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Leu Lys

470

Ser Pro

485

Leu Ile

Lys His

Ile Val

Arg Ala

Ala Pro

Ser Leu

Gly Val

Asp Ser

Ser Leu

120

Met Pro

135

Arg Pro

Arg Ser

Glu Ala

Phe Leu

200 Leu Trp 215

Lys Pro

Asp Asp

Ile Tyr

Arg Asn

280 Lys Ser 295

Gln Val

Glu Thr

Ser Ile

Glu Thr

360 Met Cys 375

Asn Trp

Ile Gln

Leu Glu

Ser Thr

440

Val Asp

455

Pro Pro

Ser Thr

Ile Ser

Ile Phe

Phe Thr

Pro Pro

Ser Glu

Phe Ser

Thr Ile

Ile Thr

105

Gln Asp

Val Asp

Thr Trp

Ile Glu

170

Thr Glu

185

Val Glu

Gly Tyr

Gly Tyr

Leu Ser

250

Leu Asn

265

Arg Val

Pro Leu

Leu Lys

Val Ala

330

Met Arg

345

Ile Leu

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

Met Glu

Leu Ser

490

Ser Val

Phe Arg

Phe Leu

Val Ile

Phe Cys

Phe Ile

Phe Tyr

Gly Val

His Leu

Asn Leu

140 Ala Arg 155

Leu Val

Lys Ala

Thr Ile

Tyr Leu

220 Asn Gly 235

Trp Leu

Thr Gln

Arg Glu

Pro Val

300

Phe Leu 315

Leu Gly

Ser Met

Asn Pro

Val Leu

380

Ser Asp 395

Lys Gly

Glu Gln

Cys Lys

Ile Ala

460

Thr Glu

475

Ala Thr

Ser Phe

Leu Ile

Pro Asn

Leu Gly

Gly Ser

Val Asp

Thr Val

110 Asp Lys 125

Gly Met

Asn Trp

Gln Gln

Lys Gln

190

Lys Leu 205

Phe Pro

Ser Cys

Trp Asn

Gln Ser

270

Ala Ile

285

Phe Ala

Ser Gln

Ala Ser

Lys Ser

350 Tyr Ile 365 Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Glu Lys 445 Asp Gly

Glu Pro

Met Phe

Val Lys

Pro Cys

Val Pro

Lys Phe

Pro Arg

Arg Leu

Asn Gly

Ala Lys

Ala Val

Lys Pro

160

Gln Asn

175

Glu Phe

Gly Lys

Asp Cys

Phe Asn

240

Glu Ser

255

Pro Val

Arg Val

Tyr Thr

Asp Glu

320

Gly Ile

335

Cys Leu

Ile Asn

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr

415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys

Gln Ile

480

Ile Val

495

- 369 033472

500

505 <210> 221 <211> 504 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-504 <400> 221

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

- 370 033472

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

Val

485

490

495

Ser

Ile

Leu

Phe

Leu

Ile

Ile

Ser

500

<210> 222 <211> 502 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-502 <400> 222

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

- 371 033472

305

310

315

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

385

390

395

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

465

470

475

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

485

490

495

Ser

Ile

Leu

Phe

Leu

Ile

500

320

Ile

Leu

Asn

Gln

Leu

400

Thr

Lys

Asp

Cys

Ile

480

Val <210> 223 <211> 500 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-500 <400> 223

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

65

70

75

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

145

150

155

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Lys

Cys

Pro

Phe

Arg

Leu

Gly

Lys

Val

Pro

160

Asn

Phe

Lys

Cys

- 372 033472

210

Tyr Asn His His Tyr

225

Val Glu Ile Lys Arg

245 Thr Ala Leu Tyr Pro

260

Ala Ala Thr Leu Tyr

275

Ser Lys Ile Pro Asp

290

Arg Ile Val Phe Thr

305

Leu Val Tyr Thr Phe

325 Val Ile Trp Gly Thr 340

Leu Leu Asp Asn Tyr

355

Val Thr Leu Ala Ala

370

Gly Val Cys Ile Arg

385

Asn Pro Asp Asn Phe

405 Val Arg Gly Lys Pro

420

Phe Tyr Cys Ser Cys

435

Val Lys Asp Thr Asp

450

Ile Asp Ala Phe Leu

465

Phe Tyr Asn Ala Ser

485 Ser Ile Leu Phe

500

215

Lys Lys Pro Gly Tyr

230

Asn Asp Asp Leu Ser

250

Ser Ile Tyr Leu Asn

265

Val Arg Asn Arg Val

280

Ala Lys Ser Pro Leu

295

Asp Gln Val Leu Lys

310

Gly Glu Thr Val Ala

330

Leu Ser Ile Met Arg

345

Met Glu Thr Ile Leu

360

Lys Met Cys Ser Gln

375

Lys Asn Trp Asn Ser

390

Ala Ile Gln Leu Glu

410

Thr Leu Glu Asp Leu

425

Tyr Ser Thr Leu Ser

440

Ala Val Asp Val Cys

455

Lys Pro Pro Met Glu

470

Pro Ser Thr Leu Ser

490

220

Asn Gly Ser Cys Phe

235

Trp Leu Trp Asn Glu

255

Thr Gln Gln Ser Pro

270

Arg Glu Ala Ile Arg

285

Pro Val Phe Ala Tyr

300

Phe Leu Ser Gln Asp

315

Leu Gly Ala Ser Gly

335

Ser Met Lys Ser Cys

350

Asn Pro Tyr Ile Ile

365

Val Leu Cys Gln Glu

380

Ser Asp Tyr Leu His

395

Lys Gly Gly Lys Phe

415

Glu Gln Phe Ser Glu

430

Cys Lys Glu Lys Ala

445

Ile Ala Asp Gly Val

460

Thr Glu Glu Pro Gln

475

Ala Thr Met Phe Ile

495

Asn

240

Ser

Val

Val

Thr

Glu

320

Ile

Leu Asn Gln Leu

400

Thr

Lys

Asp

Cys

Ile

480

Val <210> 224 <211> 498 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-498 <400> 224

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

65

70

75

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Cys

Pro

Phe

Arg

Leu

Gly

Lys

- 373 033472

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

Val

485

490

495

Ser

Ile

<210> 225 <211> 496 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-496 <400> 225

Met

Gly Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

- 374 033472

Cys Leu

Phe Leu

Asp Glu

Ile Asn

Gly Tyr

Gly Ile

Lys Asp

130 Ile Asp 145

Lys Asp

Val Gln

Glu Lys

Leu Leu

210 Tyr Asn 225

Val Glu

Thr Ala

Ala Ala

Ser Lys

290

Arg Ile 305

Leu Val

Val Ile

Leu Leu

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val Arg

Phe Tyr

Val Lys

450

Ile Asp

465

Phe Tyr

Thr Leu

Trp Ala

Pro Leu

Ala Thr

Tyr Pro

100

Pro Gln

115

Ile Thr

Trp Glu

Val Tyr

Leu Ser

180

Ala Gly

195

Arg Pro

His His

Ile Lys

Leu Tyr

260

Thr Leu

275

Ile Pro

Val Phe

Tyr Thr

Trp Gly

340

Asp Asn

355

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Ala Phe

Asn Ala

Asn Phe

Trp Asn

Asp Met

Gly Gln

Tyr Ile

Lys Ile

Phe Tyr

Glu Trp

150 Lys Asn 165

Leu Thr

Lys Asp

Asn His

Tyr Lys

230 Arg Asn 245

Pro Ser

Tyr Val

Asp Ala

Thr Asp

310

Phe Gly

325

Thr Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ala

405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Leu Lys

470

Ser Pro

485

Arg Ala

Ala Pro

Ser Leu

Gly Val

Asp Ser

Ser Leu

120

Met Pro

135

Arg Pro

Arg Ser

Glu Ala

Phe Leu

200 Leu Trp 215

Lys Pro

Asp Asp

Ile Tyr

Arg Asn

280 Lys Ser 295

Gln Val

Glu Thr

Ser Ile

Glu Thr

360 Met Cys 375

Asn Trp

Ile Gln

Leu Glu

Ser Thr

440 Val Asp 455

Pro Pro

Ser Thr

Pro Pro

Ser Glu

Phe Ser

Thr Ile

Ile Thr

105

Gln Asp

Val Asp

Thr Trp

Ile Glu

170

Thr Glu

185

Val Glu

Gly Tyr

Gly Tyr

Leu Ser

250

Leu Asn

265

Arg Val

Pro Leu

Leu Lys

Val Ala

330

Met Arg

345

Ile Leu

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

Met Glu

Leu Ser

490

Val Ile

Phe Cys

Phe Ile

Phe Tyr

Gly Val

His Leu

Asn Leu

140 Ala Arg 155

Leu Val

Lys Ala

Thr Ile

Tyr Leu

220 Asn Gly 235

Trp Leu

Thr Gln

Arg Glu

Pro Val

300

Phe Leu 315

Leu Gly

Ser Met

Asn Pro

Val Leu

380 Ser Asp 395 Lys Gly

Glu Gln

Cys Lys

Ile Ala

460

Thr Glu

475

Ala Thr

Pro Asn

Leu Gly

Gly Ser

Val Asp

Thr Val

110 Asp Lys 125

Gly Met

Asn Trp

Gln Gln

Lys Gln

190 Lys Leu 205

Phe Pro

Ser Cys

Trp Asn

Gln Ser

270

Ala Ile

285

Phe Ala

Ser Gln

Ala Ser

Lys Ser

350

Tyr Ile 365

Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Glu Lys 445 Asp Gly

Glu Pro

Met Phe

Val Pro

Lys Phe

Pro Arg

Arg Leu

Asn Gly

Ala Lys

Ala Val

Lys Pro

160

Gln Asn

175

Glu Phe

Gly Lys

Asp Cys

Phe Asn

240

Glu Ser

255

Pro Val

Arg Val

Tyr Thr

Asp Glu

320 Gly Ile 335

Cys Leu

Ile Asn

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr

415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys

Gln Ile

480

Ile Val

495 <210> 226 <211> 494 <212> Белок

- 375 033472 <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-494 <400> 226

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

- 376 033472

	450
Ile	Asp	Ala	Phe	Leu	Lys
465					470
Phe	Tyr	Asn	Ala	Ser	Pro
				485

455					460
Pro	Pro	Met	Glu	Thr	Glu	Glu	Pro Gln	Ile
				475				480
Ser	Thr	Leu	Ser	Ala	Thr	Met	Phe
			490

<210> 227 <211> 492 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-492 <400> 227

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

- 377 033472

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

485

490

<210> 228 <211> 488 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-488 <400> 228

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

210

215

220

Tyr

Asn

His

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

225

230

235

240

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

260

265

270

Ala

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

275

280

285

Ser

Lys

Ile

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

- 378 033472

290

295

300

Arg

Ile

Val

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

305

310

315

320

Leu

Val

Tyr

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

325

330

335

Val

Ile

Trp

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

340

345

350

Leu

Leu

Asp

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

355

360

365

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

370

375

380

Gly

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

385

390

395

400

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

405

410

415

Val

Arg

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

420

425

430

Phe

Tyr

Cys

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

435

440

445

Val

Lys

Asp

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

450

455

460

Ile

Asp

Ala

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

465

470

475

480

Phe

Tyr

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

485

<210> 229 <211> 486 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> HuPH20 предшественник 1-486 <400> 229

Met

Gly

Val

Leu

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Phe

Phe

Arg

Ser

Phe

Val

Lys

1

5

10

15

Ser

Ser

Gly

Val

Ser

Gln

Ile

Val

Phe

Thr

Phe

Leu

Leu

Ile

Pro

Cys

20

25

30

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Phe

Arg

Ala

Pro

Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Asp

Glu

Pro

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

65

70

75

80

Ile

Asn

Ala

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

85

90

95

Gly

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Ile

Pro

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

115

120

125

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

130

135

140

Ile

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

145

150

155

160

Lys

Asp

Val

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

165

170

175

Val

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

180

185

190

Glu

Lys

Ala

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

195

200

205

Leu

Leu

Arg

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

- 379 033472

210 Tyr Asn 225

Val Glu

Thr Ala

Ala Ala

Ser Lys

290

Arg Ile 305

Leu Val

Val Ile

Leu Leu

Val Thr

370 Gly Val 385

Asn Pro

Val Arg

Phe Tyr

Val Lys

450

Ile Asp

465

Phe Tyr

His His

Ile Lys

Leu Tyr

260

Thr Leu

275

Ile Pro

Val Phe

Tyr Thr

Trp Gly

340

Asp Asn

355

Leu Ala

Cys Ile

Asp Asn

Gly Lys

420

Cys Ser

435

Asp Thr

Ala Phe

Asn Ala

Tyr Lys

230 Arg Asn 245

Pro Ser

Tyr Val

Asp Ala

Thr Asp

310

Phe Gly

325

Thr Leu

Tyr Met

Ala Lys

Arg Lys

390

Phe Ala 405

Pro Thr

Cys Tyr

Asp Ala

Leu Lys

470

Ser Pro

485

215

Lys Pro

Asp Asp

Ile Tyr

Arg Asn

280 Lys Ser 295

Gln Val

Glu Thr

Ser Ile

Glu Thr

360 Met Cys 375

Asn Trp

Ile Gln

Leu Glu

Ser Thr

440 Val Asp 455

Pro Pro

Gly Tyr

Leu Ser

250

Leu Asn

265

Arg Val

Pro Leu

Leu Lys

Val Ala

330

Met Arg

345

Ile Leu

Ser Gln

Asn Ser

Leu Glu

410

Asp Leu

425

Leu Ser

Val Cys

Met Glu

220 Asn Gly 235 Trp Leu

Thr Gln

Arg Glu

Pro Val

300

Phe Leu

315

Leu Gly

Ser Met

Asn Pro

Val Leu

380

Ser Asp

395

Lys Gly

Glu Gln

Cys Lys

Ile Ala

460

Thr Glu

475

Ser Cys

Trp Asn

Gln Ser

270

Ala Ile

285

Phe Ala

Ser Gln

Ala Ser

Lys Ser

350

Tyr Ile 365

Cys Gln

Tyr Leu

Gly Lys

Phe Ser

430 Glu Lys 445

Asp Gly

Glu Pro

Phe Asn

240

Glu Ser 255

Pro Val

Arg Val

Tyr Thr

Asp Glu

320 Gly Ile 335

Cys Leu

Ile Asn

Glu Gln

His Leu

400

Phe Thr 415

Glu Lys

Ala Asp

Val Cys

Gln Ile

480 <210> 230 <211> 472 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-507 <400> 230

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

- 380 033472

130

Ser Leu 145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro 225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290

Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro 385

Ser Cys

Thr Asp

Phe Leu

Ala Ser

450

Phe Leu

465

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Lys Pro

435

Pro Ser

Ile Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Pro Met

Thr Leu

Ser Ser

470

135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360 Glu Lys 375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Glu Thr

440

Ser Ala

455

Val Ala

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe 185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ala Asp 425

Glu Glu

Thr Met

140

Gln Glu 155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro

235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu 395

Lys Ala

Gly Val

Pro Gln

Phe Ile

460

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Ile Phe

445

Val Ser

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415

Asp Ala

Tyr Asn

Ile Leu <210> 231 <211> 470 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-505 <400> 231

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

- 381 033472

Gln Lys

Thr Phe

Glu Glu

Tyr Lys

130

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290 Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Phe Leu

Ala Ser

450 Phe Leu 465

Ile Ser

Tyr Met

100

Trp Arg

115

Asn Arg

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Lys Pro

435

Pro Ser

Ile Ile

Leu Gln

Pro Val

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Pro Met

Thr Leu

Ser Ser

470

Asp His

Asp Asn

Trp Ala

120

Glu Leu 135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Glu Thr

440

Ser Ala

455

Leu Asp

Leu Gly

105

Arg Asn

Val Gln

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe 185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe 265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ala Asp

425

Glu Glu

Thr Met

Lys Ala

Met Ala

Trp Lys

Gln Gln

140

Gln Glu 155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro 235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300 Ser Cys 315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu 395

Lys Ala

Gly Val

Pro Gln

Phe Ile

460

Lys Lys

Val Ile

110 Pro Lys 125

Asn Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu 285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Ile Phe

445

Val Ser

Asp Ile 95

Asp Trp

Asp Val

Gln Leu

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415

Asp Ala

Tyr Asn

Ile Leu <210> 232 <211> 468 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-503 <400> 232

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val

Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp

- 382 033472

Ala Trp

Leu Asp

Thr Gly

Pro Tyr

Gln Lys

Thr Phe

Glu Glu

Tyr Lys

130

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290 Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Phe Leu

Ala Ser

450

Phe Leu

Asn Ala

Met Ser

Gln Gly

Ile Asp

Ile Ser

Tyr Met

100 Trp Arg 115

Asn Arg

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180 Lys Lys 195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln 275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Lys Pro

435

Pro Ser

Ile Ile

Pro Ser

Leu Phe

Val Thr

Ser Ile

Leu Gln

Pro Val

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230 Asn Arg 245 Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Pro Met

Thr Leu

Glu Phe

Ser Phe

Ile Phe

Thr Gly

Asp His

Asp Asn

Trp Ala

120

Glu Leu 135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Glu Thr

440

Ser Ala

455

Cys Leu 25

Ile Gly

Tyr Val

Val Thr

Leu Asp

Leu Gly

105

Arg Asn

Val Gln

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe

185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ala Asp

425

Glu Glu

Thr Met

Gly Lys

Ser Pro

Asp Arg

Val Asn 75

Lys Ala

Met Ala

Trp Lys

Gln Gln

140

Gln Glu

155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro 235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu 395

Lys Ala

Gly Val

Pro Gln

Phe Ile

460

Phe Asp

Arg Ile

Leu Gly

Gly Gly

Lys Lys

Val Ile

110 Pro Lys 125

Asn Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Ile Phe

445

Val Ser

Glu Pro

Asn Ala

Tyr Tyr

Ile Pro

Asp Ile

Asp Trp

Asp Val

Gln Leu

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400

Lys Asp 415

Asp Ala

Tyr Asn

Ile Leu

465 <210> 233 <211> 466

- 383 033472 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-501 <400> 233

Leu Asn 1

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

Tyr

Asn

435

440

445

- 384 033472

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe

450 455

Phe Leu

465

Ile Val Ser Ile Leu

460 <210> 234 <211> 464 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-499 <400> 234

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

- 385 033472

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

Tyr

Asn

435

440

445

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

Val

Ser

Ile

Leu

450

455

460

<210> 235 <211> 462 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> esHuPH20 36-497 <400> 235

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

- 386 033472

Ala

Ala

Lys

Met 340

Cys

Ser

Gln Val

Leu 345

Cys

Gln

Glu Gln

Gly 350

Val

Cys

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

Tyr

Asn

435

440

445

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

Val

Ser

450

455

460

<210> 236 <211> 460 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> esHuPH20 36-495 <400> 236

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro Asn 10

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

- 387 033472

Thr Phe

290

Gly Thr

305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Phe Leu

Ala Ser

450

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Lys Pro

435

Pro Ser

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Pro Met

Thr Leu

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Glu Thr

440

Ser Ala

455

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ala Asp 425

Glu Glu

Thr Met

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile Gln Glu Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Gly Val

Pro Gln

Phe Ile

460

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Ile Phe

445

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu

335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400

Lys Asp

415

Asp Ala

Tyr Asn <210> 237 <211> 458 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> esHuPH20 36-493 <400> 237

Leu Asn 1

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

- 388 033472

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290

Gly Thr

305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Phe Leu

Ala Ser

450

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Lys Pro

435

Pro Ser

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Pro Met

Thr Leu

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Glu Thr

440

Ser Ala

455

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ala Asp

425

Glu Glu

Thr Met

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile Gln Glu Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Gly Val

Pro Gln

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu 285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Ile Phe

445

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu

335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400

Lys Asp

415

Asp Ala

Tyr Asn <210> 238 <211> 456 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> esHuPH20 36-491 <400> 238

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

- 389 033472

His Tyr Lys Lys Pro

195

Lys Arg Asn Asp Asp

210

Tyr Pro Ser Ile Tyr

225

Leu Tyr Val Arg Asn

245

Pro Asp Ala Lys Ser

260

Phe Thr Asp Gln Val

275

Thr Phe Gly Glu Thr

290

Gly Thr Leu Ser Ile

305

Asn Tyr Met Glu Thr

325 Ala Ala Lys Met Cys

340

Ile Arg Lys Asn Trp

355

Asn Phe Ala Ile Gln

370

Lys Pro Thr Leu Glu

385

Ser Cys Tyr Ser Thr

405

Thr Asp Ala Val Asp

420

Phe Leu Lys Pro Pro

435

Ala Ser Pro Ser Thr

450

Gly	Tyr	Asn Gly 200	Ser	Cys	Phe	Asn 205	Val	Glu	Ile
Leu	Ser	Trp	Leu	Trp	Asn	Glu	Ser	Thr	Ala	Leu
	215					220
Leu	Asn	Thr	Gln	Gln	Ser	Pro	Val	Ala	Ala	Thr
230					235					240
Arg	Val	Arg	Glu	Ala	Ile	Arg	Val	Ser	Lys	Ile
				250					255
Pro	Leu	Pro	Val	Phe	Ala	Tyr	Thr	Arg	Ile	Val
			265					270
Leu	Lys	Phe	Leu	Ser	Gln	Asp	Glu	Leu	Val	Tyr
		280					285
Val	Ala	Leu	Gly	Ala	Ser	Gly	Ile	Val	Ile	Trp
	295					300
Met	Arg	Ser	Met	Lys	Ser	Cys	Leu	Leu	Leu	Asp
310					315					320
Ile	Leu	Asn	Pro	Tyr	Ile	Ile	Asn	Val	Thr	Leu
				330					335
Ser	Gln	Val	Leu	Cys	Gln	Glu	Gln	Gly	Val	Cys
			345					350
Asn	Ser	Ser	Asp	Tyr	Leu	His	Leu	Asn	Pro	Asp
		360					365
Leu	Glu	Lys	Gly	Gly	Lys	Phe	Thr	Val	Arg	Gly
	375					380
Asp	Leu	Glu	Gln	Phe	Ser	Glu	Lys	Phe	Tyr	Cys
390					395					400
Leu	Ser	Cys	Lys	Glu	Lys	Ala	Asp	Val	Lys	Asp
				410					415
Val	Cys	Ile	Ala	Asp	Gly	Val	Cys	Ile	Asp	Ala
			425					430
Met	Glu	Thr	Glu	Glu	Pro	Gln	Ile	Phe	Tyr	Asn
		440					445
Leu	Ser	Ala
	455

<210> 239 <211> 454 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 <400> 239

Leu Asn Phe Arg Ala 1 5

Ala Trp Asn Ala Pro

Leu Asp Met Ser Leu

Thr Gly Gln Gly Val

Pro Tyr Ile Asp Ser

Gln Lys Ile Ser Leu

Thr Phe Tyr Met Pro

100

Glu Glu Trp Arg Pro

115

Tyr Lys Asn Arg Ser

130

36-489

Pro Pro Val Ile Pro Asn 10

Ser Glu Phe Cys Leu Gly

Phe Ser Phe Ile Gly Ser

Thr Ile Phe Tyr Val Asp

Ile Thr Gly Val Thr Val

75

Gln Asp His Leu Asp Lys

Val Asp Asn Leu Gly Met

105

Thr Trp Ala Arg Asn Trp

120

Ile Glu Leu Val Gln Gln

135

Val Pro Phe Leu Trp

Lys Phe Asp Glu Pro

Pro Arg Ile Asn Ala

Arg Leu Gly Tyr Tyr

Asn Gly Gly Ile Pro

Ala Lys Lys Asp Ile

Ala Val Ile Asp Trp

110

Lys Pro Lys Asp Val

125

Gln Asn Val Gln Leu

140

- 390 033472

Ser Leu Thr Glu Ala

145

Gly Lys Asp Phe Leu

165 Pro Asn His Leu Trp

180

His Tyr Lys Lys Pro

195

Lys Arg Asn Asp Asp

210

Tyr Pro Ser Ile Tyr

225

Leu Tyr Val Arg Asn

245

Pro Asp Ala Lys Ser

260

Phe Thr Asp Gln Val

275

Thr Phe Gly Glu Thr

290

Gly Thr Leu Ser Ile

305

Asn Tyr Met Glu Thr

325 Ala Ala Lys Met Cys

340

Ile Arg Lys Asn Trp

355

Asn Phe Ala Ile Gln

370

Lys Pro Thr Leu Glu

385

Ser Cys Tyr Ser Thr

405

Thr Asp Ala Val Asp

420

Phe Leu Lys Pro Pro

435

Ala Ser Pro Ser Thr

450

Thr Glu Lys Ala Lys

150

Val Glu Thr Ile Lys

170 Gly Tyr Tyr Leu Phe

185

Gly Tyr Asn Gly Ser

200

Leu Ser Trp Leu Trp

215

Leu Asn Thr Gln Gln

230

Arg Val Arg Glu Ala

250

Pro Leu Pro Val Phe

265

Leu Lys Phe Leu Ser

280

Val Ala Leu Gly Ala

295

Met Arg Ser Met Lys

310

Ile Leu Asn Pro Tyr

330 Ser Gln Val Leu Cys

345

Asn Ser Ser Asp Tyr

360

Leu Glu Lys Gly Gly

375

Asp Leu Glu Gln Phe

390

Leu Ser Cys Lys Glu

410 Val Cys Ile Ala Asp

425

Met Glu Thr Glu Glu

440

Leu

Gln Glu Phe Glu Lys

155

Leu Gly Lys Leu Leu

175

Pro Asp Cys Tyr Asn

190

Cys Phe Asn Val Glu

205

Asn Glu Ser Thr Ala

220

Ser Pro Val Ala Ala

235

Ile Arg Val Ser Lys

255

Ala Tyr Thr Arg Ile

270

Gln Asp Glu Leu Val

285

Ser Gly Ile Val Ile

300

Ser Cys Leu Leu Leu

315

Ile Ile Asn Val Thr

335

Gln Glu Gln Gly Val

350

Leu His Leu Asn Pro

365

Lys Phe Thr Val Arg

380

Ser Glu Lys Phe Tyr

395

Lys Ala Asp Val Lys

415

Gly Val Cys Ile Asp

430

Pro Gln Ile Phe Tyr

445

Ala

160

Arg

His

Ile

Leu

Thr

240

Ile

Val

Tyr

Trp

Asp

320

Leu

Cys

Asp

Gly

Cys

400

Asp

Ala

Asn <210> 240 <211> 455 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-490 <400> 240

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

65

70

75

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

85

90

95

Trp

Pro

Ala

Tyr

Pro

Ile

- 391 033472

Thr

Phe

Tyr Met 100

Pro Val

Asp Asn Leu 105

Gly

Met

Ala

Val

Ile 110

Asp

Trp

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

Tyr

Asn

435

440

445

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

450

455

<210> 241 <211> 452 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-487 <400> 241

Leu Asn 1

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

- 392 033472

Thr Gly Gln Gly Val

Pro Tyr Ile Asp Ser

Gln Lys Ile Ser Leu

Thr Phe Tyr Met Pro

100

Glu Glu Trp Arg Pro

115

Tyr Lys Asn Arg Ser

130

Ser Leu Thr Glu Ala

145

Gly Lys Asp Phe Leu

165

Pro Asn His Leu Trp

180

His Tyr Lys Lys Pro

195

Lys Arg Asn Asp Asp

210

Tyr Pro Ser Ile Tyr

225

Leu Tyr Val Arg Asn

245

Pro Asp Ala Lys Ser

260

Phe Thr Asp Gln Val

275

Thr Phe Gly Glu Thr

290

Gly Thr Leu Ser Ile

305

Asn Tyr Met Glu Thr

325

Ala Ala Lys Met Cys

340

Ile Arg Lys Asn Trp

355

Asn Phe Ala Ile Gln

370

Lys Pro Thr Leu Glu

385

Ser Cys Tyr Ser Thr

405

Thr Asp Ala Val Asp

420

Phe Leu Lys Pro Pro

435

Ala Ser Pro Ser

450

Thr Ile Phe Tyr Val

Ile Thr Gly Val Thr

Gln Asp His Leu Asp

Val Asp Asn Leu Gly

105

Thr Trp Ala Arg Asn

120

Ile Glu Leu Val Gln

135

Thr Glu Lys Ala Lys

150

Val Glu Thr Ile Lys

170

Gly Tyr Tyr Leu Phe

185

Gly Tyr Asn Gly Ser

200

Leu Ser Trp Leu Trp

215

Leu Asn Thr Gln Gln

230

Arg Val Arg Glu Ala

250

Pro Leu Pro Val Phe

265

Leu Lys Phe Leu Ser

280

Val Ala Leu Gly Ala

295

Met Arg Ser Met Lys

310

Ile Leu Asn Pro Tyr

330

Ser Gln Val Leu Cys

345

Asn Ser Ser Asp Tyr

360

Leu Glu Lys Gly Gly

375

Asp Leu Glu Gln Phe

390

Leu Ser Cys Lys Glu

410

Val Cys Ile Ala Asp

425

Met Glu Thr Glu Glu

440

Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr

Val Asn Gly Gly Ile Pro

80

Lys Ala Lys Lys Asp Ile

Met Ala Val Ile Asp Trp

110

Trp Lys Pro Lys Asp Val

125

Gln Gln Asn Val Gln Leu

140

Gln Glu Phe Glu Lys Ala

155 160

Leu Gly Lys Leu Leu Arg

175

Pro Asp Cys Tyr Asn His

190

Cys Phe Asn Val Glu Ile

205

Asn Glu Ser Thr Ala Leu

220

Ser Pro Val Ala Ala Thr

235 240

Ile Arg Val Ser Lys Ile

255

Ala Tyr Thr Arg Ile Val

270

Gln Asp Glu Leu Val Tyr

285

Ser Gly Ile Val Ile Trp

300

Ser Cys Leu Leu Leu Asp

315 320

Ile Ile Asn Val Thr Leu

335

Gln Glu Gln Gly Val Cys

350

Leu His Leu Asn Pro Asp

365

Lys Phe Thr Val Arg Gly

380

Ser Glu Lys Phe Tyr Cys

395 400

Lys Ala Asp Val Lys Asp

415

Gly Val Cys Ile Asp Ala

430

Pro Gln Ile Phe Tyr Asn

445 <210> 242 <211> 450 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 <400> 242

36-485

- 393 033472

Leu Asn 1

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

Tyr

Asn

435

440

445

Ala

Ser

450

<210> 243 <211> 449 <212> Белок

- 394 033472 <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-484 <400> 243

Leu Asn 1

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

Tyr

Asn

435

440

445

Ala

- 395 033472 <210> 244 <211> 441 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-476 <400> 244

Leu Asn 1

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

- 396 033472

Thr Asp Ala Val	Asp	Val	Cys	Ile	Ala Asp Gly Val 425	Cys Ile Asp Ala 430
	420
Phe	Leu	Lys	Pro	Pro	Met	Glu	Thr	Glu
		435					440

<210> 245 <211> 440 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-475 <400> 245

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

- 397 033472

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

435

440

<210> 246 <211> 439 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-474 <400> 246

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

- 398 033472

Ile Arg

Lys 355

Asn Trp Asn

Ser

Ser 360

Asp

Tyr

Leu His

Leu 365

Asn

Pro

Asp

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

435

<210> 247 <211> 438 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-473 <400> 247

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro Asn 10

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

- 399 033472

Asn Tyr

Met

Glu

Thr 325

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr 330

Ile

Ile

Asn

Val

Thr 335

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

435

<210> 248 <211> 437 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-472 <400> 248

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro Asn 10

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

- 400 033472

Thr Phe

290

Gly Thr

305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Phe Leu

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Lys Pro

435

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Pro

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410 Ala Asp 425

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile Gln Glu Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Gly Val

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu

335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400

Lys Asp

415

Asp Ala <210> 249 <211> 436 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-471 <400> 249

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

- 401 033472

Pro Asp

Ala

Lys 260

Ser

Pro

Leu

Pro

Val 265

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg 270

Ile

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

305

310

315

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

385

390

395

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

435

Val

Tyr

Trp

Asp

320

Leu

Cys

Asp

Gly

Cys

400

Asp

Ala <210> 250 <211> 435 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-470 <400> 250

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

- 402 033472

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

225

230

235

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

305

310

315

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

385

390

395

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

420

425

430

Phe

Leu

Lys

435

Thr

240

Ile

Val

Tyr

Trp

Asp

320

Leu

Cys

Asp

Gly

Cys

400

Asp

Ala <210> 251 <211> 434 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-469 <400> 251

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

- 403 033472

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290

Gly Thr

305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Phe Leu

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410 Ala Asp 425

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro

235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile Gln Glu Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Gly Val

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415

Asp Ala <210> 252 <211> 433 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-468 <400> 252

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro Val

Ile

Pro Asn 10

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

- 404 033472

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro 225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290

Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro 385

Ser Cys

Thr Asp

Phe

His Leu

180 Lys Lys 195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln 275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

170

Leu Phe 185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410 Ala Asp 425

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro

235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Gly Val

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400

Lys Asp

415

Asp Ala <210> 253 <211> 431 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-466 <400> 253

Leu 1

Asn

Phe

Arg Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

- 405 033472

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro 225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290

Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro 385

Ser Cys

Thr Asp

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe

185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410 Ala Asp 425

Gln Glu

155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro

235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu 395

Lys Ala

Gly Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415 Asp <210> 254 <211> 430 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-465 <400> 254

Leu Asn 1

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

- 406 033472

Tyr Lys

130

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290 Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Asn Arg

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180 Lys Lys 195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260 Asp Gln 275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Ser Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Glu Leu

135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Val Gln

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe 185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410 Ala Asp 425

Gln Gln

140

Gln Glu

155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro 235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu 395

Lys Ala

Gly Val

Asn Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Gln Leu

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415 <210> 255 <211> 429 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-464 <400> 255

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

- 407 033472

Glu Glu

Tyr Lys

130

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290 Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Trp Arg

115

Asn Arg

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Trp Ala

120

Glu Leu 135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Arg Asn

Val Gln

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe 185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe 265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410 Ala Asp 425

Trp Lys

Gln Gln

140

Gln Glu

155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro

235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile Gln Glu Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Gly Val

Pro Lys

125

Asn Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys

Asp Val

Gln Leu

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415 <210> 256 <211> 427 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-462 <400> 256

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro Asn 10

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

- 408 033472

Thr Phe

Glu Glu

Tyr Lys

130

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290 Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Tyr Met

100

Trp Arg

115

Asn Arg

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Pro Val

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Asp Asn

Trp Ala

120

Glu Leu 135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360 Glu Lys 375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Leu Gly

105

Arg Asn

Val Gln

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe 185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410 Ala Asp 425

Met Ala

Trp Lys

Gln Gln

140

Gln Glu

155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro

235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu 395

Lys Ala

Gly

Val Ile

110 Pro Lys 125

Asn Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Asp Trp

Asp Val

Gln Leu

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415 <210> 257 <211> 425 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-460 <400> 257

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro Val

Ile

Pro Asn 10

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

- 409 033472

Gln Lys

Thr Phe

Glu Glu

Tyr Lys

130

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro 225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290

Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro 385

Ser Cys

Thr Asp

Ile Ser

Tyr Met

100

Trp Arg

115

Asn Arg

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Leu Gln

Pro Val

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Asp His

Asp Asn

Trp Ala

120

Glu Leu 135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Leu Asp

Leu Gly

105

Arg Asn

Val Gln

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe 185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ala

425

Lys Ala

Met Ala

Trp Lys

Gln Gln

140

Gln Glu

155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro

235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Lys Lys

Val Ile

110 Pro Lys 125

Asn Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Asp Ile

Asp Trp

Asp Val

Gln Leu

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415 <210> 258 <211> 423 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-458 <400> 258

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

- 410 033472

Pro Tyr 65

Gln Lys

Thr Phe

Glu Glu

Tyr Lys

130

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290 Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Ile Asp

Ile Ser

Tyr Met

100

Trp Arg

115

Asn Arg

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Ser Ile

Leu Gln

Pro Val

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Thr Gly

Asp His

Asp Asn

Trp Ala

120

Glu Leu 135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys

Val Thr

Leu Asp

Leu Gly

105

Arg Asn

Val Gln

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe

185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Val Asn 75

Lys Ala

Met Ala

Trp Lys

Gln Gln

140

Gln Glu

155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro

235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Gly Gly

Lys Lys

Val Ile

110 Pro Lys 125

Asn Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu 285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Ile Pro

Asp Ile 95

Asp Trp

Asp Val

Gln Leu

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415 <210> 259 <211> 421 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-456 <400> 259

Leu Asn 1

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

- 411 033472

Thr Gly

Gln

Gly Val

Thr

Ile 55

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg 60

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

420

<210> 260 <211> 419 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-454 <400> 260

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

- 412 033472

Leu Asp

Thr Gly

Pro Tyr

Gln Lys

Thr Phe

Glu Glu

Tyr Lys

130

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290 Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Met Ser

Gln Gly

Ile Asp

Ile Ser

Tyr Met

100

Trp Arg

115

Asn Arg

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala

Leu Phe

Val Thr

Ser Ile

Leu Gln

Pro Val

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230 Asn Arg 245 Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Ser Phe

Ile Phe

Thr Gly

Asp His

Asp Asn

Trp Ala

120

Glu Leu 135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Ile Gly

Tyr Val

Val Thr

Leu Asp

Leu Gly

105

Arg Asn

Val Gln

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe

185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ser Pro

Asp Arg

Val Asn 75

Lys Ala

Met Ala

Trp Lys

Gln Gln

140

Gln Glu 155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro 235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300 Ser Cys 315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Arg Ile

Leu Gly

Gly Gly

Lys Lys

Val Ile

110 Pro Lys 125

Asn Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Asn Ala

Tyr Tyr

Ile Pro

Asp Ile

Asp Trp

Asp Val

Gln Leu

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415 <210> 261 <211> 417 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-452

261 <400>

Leu Asn Phe Arg Ala

5

Pro Pro

Val

Ile

Pro

Asn

Val

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys

Pro Phe Leu Trp

Phe Asp Glu Pro

- 413 033472

Leu Asp

Thr Gly

Pro Tyr 65

Gln Lys

Thr Phe

Glu Glu

Tyr Lys

130

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290 Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr

Met Ser

Gln Gly

Ile Asp

Ile Ser

Tyr Met

100

Trp Arg

115

Asn Arg

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Leu Phe

Val Thr

Ser Ile

Leu Gln

Pro Val

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Ser Phe

Ile Phe

Thr Gly

Asp His

Asp Asn

Trp Ala

120

Glu Leu 135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Ile Gly

Tyr Val

Val Thr

Leu Asp

Leu Gly

105

Arg Asn

Val Gln

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe

185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ser Pro

Asp Arg

Val Asn 75

Lys Ala

Met Ala

Trp Lys

Gln Gln

140

Gln Glu

155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro

235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Arg Ile 45 Leu Gly

Gly Gly

Lys Lys

Val Ile

110 Pro Lys 125

Asn Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu 285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Asn Ala

Tyr Tyr

Ile Pro

Asp Ile

Asp Trp

Asp Val

Gln Leu

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415 <210> 262 <211> 415 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-450 <400> 262

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val

Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp

- 414 033472

Ala Trp

Leu Asp

Thr Gly

Pro Tyr

Gln Lys

Thr Phe

Glu Glu

Tyr Lys

130

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290 Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Asn Ala

Met Ser

Gln Gly

Ile Asp

Ile Ser

Tyr Met

100 Trp Arg 115

Asn Arg

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180 Lys Lys 195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln 275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Pro Ser

Leu Phe

Val Thr

Ser Ile

Leu Gln

Pro Val

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230 Asn Arg 245 Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Glu Phe

Ser Phe

Ile Phe

Thr Gly

Asp His

Asp Asn

Trp Ala

120

Glu Leu 135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Leu 25

Ile Gly

Tyr Val

Val Thr

Leu Asp

Leu Gly

105

Arg Asn

Val Gln

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe

185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Gly Lys

Ser Pro

Asp Arg

Val Asn 75

Lys Ala

Met Ala

Trp Lys

Gln Gln

140

Gln Glu

155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro 235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Phe Asp

Arg Ile

Leu Gly

Gly Gly

Lys Lys

Val Ile

110 Pro Lys 125

Asn Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Glu Pro

Asn Ala

Tyr Tyr

Ile Pro

Asp Ile

Asp Trp

Asp Val

Gln Leu

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400

Lys

415 <210> 263 <211> 473 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-508 <400> 263

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val

Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp

- 415 033472

Ala Trp

Leu Asp

Thr Gly

Pro Tyr

Gln Lys

Thr Phe

Glu Glu

Tyr Lys

130

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290 Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Phe Leu

Ala Ser

450

Phe Leu

465

Asn Ala

Met Ser

Gln Gly

Ile Asp

Ile Ser

Tyr Met

100 Trp Arg 115

Asn Arg

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180 Lys Lys 195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln 275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Lys Pro

435

Pro Ser

Ile Ile

Pro Ser

Leu Phe

Val Thr

Ser Ile

Leu Gln

Pro Val

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230 Asn Arg 245 Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Pro Met

Thr Leu

Ser Ser

470

Glu Phe

Ser Phe

Ile Phe

Thr Gly

Asp His

Asp Asn

Trp Ala

120

Glu Leu 135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Glu Thr

440

Ser Ala

455

Val Ala

Cys Leu 25

Ile Gly

Tyr Val

Val Thr

Leu Asp

Leu Gly

105

Arg Asn

Val Gln

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe

185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ala Asp

425

Glu Glu

Thr Met

Ser

Gly Lys

Ser Pro

Asp Arg

Val Asn 75

Lys Ala

Met Ala

Trp Lys

Gln Gln

140

Gln Glu

155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro 235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu 395

Lys Ala

Gly Val

Pro Gln

Phe Ile

460

Phe Asp

Arg Ile

Leu Gly

Gly Gly

Lys Lys

Val Ile

110 Pro Lys 125

Asn Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Ile Phe

445

Val Ser

Glu Pro

Asn Ala

Tyr Tyr

Ile Pro

Asp Ile

Asp Trp

Asp Val

Gln Leu

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400

Lys Asp 415

Asp Ala

Tyr Asn

Ile Leu <210> 264 <211> 471

- 416 033472 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-506 <400> 264

Leu Asn 1

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

Tyr

Asn

435

440

445

- 417 033472

Ala	Ser Pro 450	Ser Thr	Leu	Ser Ala Thr Met 455	Phe Ile Val Ser Ile Leu 460
Phe	Leu	Ile	Ile	Ser	Ser	Val
465					470

<210> 265 <211> 469 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-504 <400> 265

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

- 418 033472

Lys Pro Thr Leu Glu

385

Ser Cys Tyr Ser Thr

405

Thr Asp Ala Val Asp

420

Phe Leu Lys Pro Pro

435

Ala Ser Pro Ser Thr

450

Phe Leu Ile Ile Ser

465

Asp Leu Glu Gln Phe

390

Leu Ser Cys Lys Glu

410

Val Cys Ile Ala Asp

425

Met Glu Thr Glu Glu

440

Leu Ser Ala Thr Met

455

Ser Glu Lys Phe Tyr Cys

395 400

Lys Ala Asp Val Lys Asp

415

Gly Val Cys Ile Asp Ala

430

Pro Gln Ile Phe Tyr Asn

445

Phe Ile Val Ser Ile Leu

460 <210> 266 <211> 467 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-502 <400> 266

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro Asn 10

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

- 419 033472

Asn

Tyr Met

Glu

Thr 325

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr 330

Ile

Ile

Asn

Val

Thr 335

Leu

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

Tyr

Asn

435

440

445

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Met

Phe

Ile

Val

Ser

Ile

Leu

450

455

460

Phe

Leu

Ile

465

<210> 267 <211> 465 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-500 <400> 267

Leu 1

Asn

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

- 420 033472

Pro Asp Ala Lys Ser

260

Phe Thr Asp Gln Val

275

Thr Phe Gly Glu Thr

290

Gly Thr Leu Ser Ile

305

Asn Tyr Met Glu Thr

325 Ala Ala Lys Met Cys

340

Ile Arg Lys Asn Trp

355

Asn Phe Ala Ile Gln

370

Lys Pro Thr Leu Glu

385

Ser Cys Tyr Ser Thr

405

Thr Asp Ala Val Asp

420

Phe Leu Lys Pro Pro

435

Ala Ser Pro Ser Thr

450

Phe

465

Pro	Leu	Pro	Val 265	Phe	Ala	Tyr	Thr	Arg 270	Ile	Val
Leu	Lys	Phe	Leu	Ser	Gln	Asp	Glu	Leu	Val	Tyr
		280					285
Val	Ala	Leu	Gly	Ala	Ser	Gly	Ile	Val	Ile	Trp
	295					300
Met	Arg	Ser	Met	Lys	Ser	Cys	Leu	Leu	Leu	Asp
310					315					320
Ile	Leu	Asn	Pro	Tyr	Ile	Ile	Asn	Val	Thr	Leu
				330					335
Ser	Gln	Val	Leu	Cys	Gln	Glu	Gln	Gly	Val	Cys
			345					350
Asn	Ser	Ser	Asp	Tyr	Leu	His	Leu	Asn	Pro	Asp
		360					365
Leu	Glu	Lys	Gly	Gly	Lys	Phe	Thr	Val	Arg	Gly
	375					380
Asp	Leu	Glu	Gln	Phe	Ser	Glu	Lys	Phe	Tyr	Cys
390					395					400
Leu	Ser	Cys	Lys	Glu	Lys	Ala	Asp	Val	Lys	Asp
				410					415
Val	Cys	Ile	Ala	Asp	Gly	Val	Cys	Ile	Asp	Ala
			425					430
Met	Glu	Thr	Glu	Glu	Pro	Gln	Ile	Phe	Tyr	Asn
		440					445
Leu	Ser	Ala	Thr	Met	Phe	Ile	Val	Ser	Ile	Leu
	455					460

<210> 268 <211> 463 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 <400> 268

Leu Asn Phe Arg Ala 1 5

Ala Trp Asn Ala Pro

Leu Asp Met Ser Leu

Thr Gly Gln Gly Val

Pro Tyr Ile Asp Ser

Gln Lys Ile Ser Leu

Thr Phe Tyr Met Pro

100

Glu Glu Trp Arg Pro

115

Tyr Lys Asn Arg Ser

130

Ser Leu Thr Glu Ala

145

Gly Lys Asp Phe Leu

165

Pro Asn His Leu Trp

180

36-498

Pro Pro Val Ile Pro Asn 10

Ser Glu Phe Cys Leu Gly

Phe Ser Phe Ile Gly Ser

Thr Ile Phe Tyr Val Asp

Ile Thr Gly Val Thr Val

75

Gln Asp His Leu Asp Lys

Val Asp Asn Leu Gly Met

105

Thr Trp Ala Arg Asn Trp

120

Ile Glu Leu Val Gln Gln

135

Thr Glu Lys Ala Lys Gln

150 155

Val Glu Thr Ile Lys Leu

170

Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro

185

Val Pro Phe Leu Trp

Lys Phe Asp Glu Pro

Pro Arg Ile Asn Ala

Arg Leu Gly Tyr Tyr

Asn Gly Gly Ile Pro

Ala Lys Lys Asp Ile

Ala Val Ile Asp Trp

110

Lys Pro Lys Asp Val

125

Gln Asn Val Gln Leu

140

Glu Phe Glu Lys Ala

160

Gly Lys Leu Leu Arg

175

Asp Cys Tyr Asn His

190

- 421 033472

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290

Gly Thr

305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Phe Leu

Ala Ser

450

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Lys Pro

435

Pro Ser

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Pro Met

Thr Leu

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Glu Thr

440

Ser Ala

455

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ala Asp

425

Glu Glu

Thr Met

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro

235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile Gln Glu Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu

395

Lys Ala

Gly Val

Pro Gln

Phe Ile

460

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Ile Phe

445

Val Ser

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415

Asp Ala

Tyr Asn

Ile <210> 269 <211> 461 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> esHuPH20 36-496 <400> 269

Leu 1

Asn

Phe

Arg Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

- 422 033472

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro 225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290

Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro 385

Ser Cys

Thr Asp

Phe Leu

Ala Ser

450

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Lys Pro

435

Pro Ser

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Pro Met

Thr Leu

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360

Glu Lys

375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Glu Thr

440

Ser Ala

455

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe

185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ala Asp

425

Glu Glu

Thr Met

Gln Glu

155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro

235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu 395

Lys Ala

Gly Val

Pro Gln

Phe Ile

460

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Ile Phe

445

Val

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415

Asp Ala

Tyr Asn <210> 270 <211> 459 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> esHuPH20 36-494 <400> 270

Leu 1

Asn

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro Asn 10

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

- 423 033472

Thr Phe

Glu Glu

Tyr Lys

130

Ser Leu

145

Gly Lys

Pro Asn

His Tyr

Lys Arg

210

Tyr Pro

225

Leu Tyr

Pro Asp

Phe Thr

Thr Phe

290 Gly Thr 305

Asn Tyr

Ala Ala

Ile Arg

Asn Phe

370

Lys Pro

385

Ser Cys

Thr Asp

Phe Leu

Ala Ser

450

Tyr Met

100

Trp Arg

115

Asn Arg

Thr Glu

Asp Phe

His Leu

180

Lys Lys

195

Asn Asp

Ser Ile

Val Arg

Ala Lys

260

Asp Gln

275

Gly Glu

Leu Ser

Met Glu

Lys Met

340

Lys Asn

355

Ala Ile

Thr Leu

Tyr Ser

Ala Val

420

Lys Pro

435

Pro Ser

Pro Val

Pro Thr

Ser Ile

Ala Thr

150

Leu Val

165

Trp Gly

Pro Gly

Asp Leu

Tyr Leu

230

Asn Arg

245

Ser Pro

Val Leu

Thr Val

Ile Met

310

Thr Ile

325

Cys Ser

Trp Asn

Gln Leu

Glu Asp

390

Thr Leu

405

Asp Val

Pro Met

Thr Leu

Asp Asn

Trp Ala

120

Glu Leu 135

Glu Lys

Glu Thr

Tyr Tyr

Tyr Asn

200 Ser Trp 215

Asn Thr

Val Arg

Leu Pro

Lys Phe

280

Ala Leu 295

Arg Ser

Leu Asn

Gln Val

Ser Ser

360 Glu Lys 375

Leu Glu

Ser Cys

Cys Ile

Glu Thr

440

Ser Ala

455

Leu Gly

105

Arg Asn

Val Gln

Ala Lys

Ile Lys

170

Leu Phe 185

Gly Ser

Leu Trp

Gln Gln

Glu Ala

250

Val Phe

265

Leu Ser

Gly Ala

Met Lys

Pro Tyr

330 Leu Cys 345

Asp Tyr

Gly Gly

Gln Phe

Lys Glu

410

Ala Asp 425

Glu Glu

Thr Met

Met Ala

Trp Lys

Gln Gln

140

Gln Glu

155

Leu Gly

Pro Asp

Cys Phe

Asn Glu

220

Ser Pro

235

Ile Arg

Ala Tyr

Gln Asp

Ser Gly

300

Ser Cys

315

Ile Ile

Gln Glu

Leu His

Lys Phe

380

Ser Glu 395

Lys Ala

Gly Val

Pro Gln

Phe

Val Ile

110 Pro Lys 125

Asn Val

Phe Glu

Lys Leu

Cys Tyr

190

Asn Val

205

Ser Thr

Val Ala

Val Ser

Thr Arg

270

Glu Leu

285

Ile Val

Leu Leu

Asn Val

Gln Gly

350

Leu Asn

365

Thr Val

Lys Phe

Asp Val

Cys Ile

430

Ile Phe

445

Asp Trp

Asp Val

Gln Leu

Lys Ala

160 Leu Arg 175

Asn His

Glu Ile

Ala Leu

Ala Thr

240

Lys Ile

255

Ile Val

Val Tyr

Ile Trp

Leu Asp

320

Thr Leu 335

Val Cys

Pro Asp

Arg Gly

Tyr Cys

400 Lys Asp 415

Asp Ala

Tyr Asn <210> 271 <211> 457 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> esHuPH20 36-492 <400> 271

Leu Asn 1

Phe

Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

- 424 033472

Thr Gly Gln Gly Val

Pro Tyr Ile Asp Ser

Gln Lys Ile Ser Leu

Thr Phe Tyr Met Pro

100

Glu Glu Trp Arg Pro

115

Tyr Lys Asn Arg Ser

130

Ser Leu Thr Glu Ala

145

Gly Lys Asp Phe Leu

165

Pro Asn His Leu Trp

180

His Tyr Lys Lys Pro

195

Lys Arg Asn Asp Asp

210

Tyr Pro Ser Ile Tyr

225

Leu Tyr Val Arg Asn

245

Pro Asp Ala Lys Ser

260

Phe Thr Asp Gln Val

275

Thr Phe Gly Glu Thr

290

Gly Thr Leu Ser Ile

305

Asn Tyr Met Glu Thr

325

Ala Ala Lys Met Cys

340

Ile Arg Lys Asn Trp

355

Asn Phe Ala Ile Gln

370

Lys Pro Thr Leu Glu

385

Ser Cys Tyr Ser Thr

405

Thr Asp Ala Val Asp

420

Phe Leu Lys Pro Pro

435

Ala Ser Pro Ser Thr

450

Thr	Ile 55	Phe	Tyr	Val	Asp	Arg 60	Leu	Gly	Tyr	Tyr
Ile	Thr	Gly	Val	Thr	Val	Asn	Gly	Gly	Ile	Pro
70					75					80
Gln	Asp	His	Leu	Asp	Lys	Ala	Lys	Lys	Asp	Ile
				90					95
Val	Asp	Asn	Leu	Gly	Met	Ala	Val	Ile	Asp	Trp
			105					110
Thr	Trp	Ala	Arg	Asn	Trp	Lys	Pro	Lys	Asp	Val
		120					125
Ile	Glu	Leu	Val	Gln	Gln	Gln	Asn	Val	Gln	Leu
	135					140
Thr	Glu	Lys	Ala	Lys	Gln	Glu	Phe	Glu	Lys	Ala
150					155					160
Val	Glu	Thr	Ile	Lys	Leu	Gly	Lys	Leu	Leu	Arg
				170					175
Gly	Tyr	Tyr	Leu	Phe	Pro	Asp	Cys	Tyr	Asn	His
			185					190
Gly	Tyr	Asn	Gly	Ser	Cys	Phe	Asn	Val	Glu	Ile
		200					205
Leu	Ser	Trp	Leu	Trp	Asn	Glu	Ser	Thr	Ala	Leu
	215					220
Leu	Asn	Thr	Gln	Gln	Ser	Pro	Val	Ala	Ala	Thr
230					235					240
Arg	Val	Arg	Glu	Ala	Ile	Arg	Val	Ser	Lys	Ile
				250					255
Pro	Leu	Pro	Val	Phe	Ala	Tyr	Thr	Arg	Ile	Val
			265					270
Leu	Lys	Phe	Leu	Ser	Gln	Asp	Glu	Leu	Val	Tyr
		280					285
Val	Ala	Leu	Gly	Ala	Ser	Gly	Ile	Val	Ile	Trp
	295					300
Met	Arg	Ser	Met	Lys	Ser	Cys	Leu	Leu	Leu	Asp
310					315					320
Ile	Leu	Asn	Pro	Tyr	Ile	Ile	Asn	Val	Thr	Leu
				330					335
Ser	Gln	Val	Leu	Cys	Gln	Glu	Gln	Gly	Val	Cys
			345					350
Asn	Ser	Ser	Asp	Tyr	Leu	His	Leu	Asn	Pro	Asp
		360					365
Leu	Glu	Lys	Gly	Gly	Lys	Phe	Thr	Val	Arg	Gly
	375					380
Asp	Leu	Glu	Gln	Phe	Ser	Glu	Lys	Phe	Tyr	Cys
390					395					400
Leu	Ser	Cys	Lys	Glu	Lys	Ala	Asp	Val	Lys	Asp
				410					415
Val	Cys	Ile	Ala	Asp	Gly	Val	Cys	Ile	Asp	Ala
			425					430
Met	Glu	Thr	Glu	Glu	Pro	Gln	Ile	Phe	Tyr	Asn
		440					445
Leu	Ser	Ala	Thr
	455

<210> 272 <211> 453 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>

<223> Зрелый HuPH20 <400> 272

36-488

- 425 033472

Leu Asn 1

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

Tyr

Asn

435

440

445

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

450

<210> 273 <211> 451 <212> Белок <213> Homo sapiens

- 426 033472 <220>

<223> Зрелый HuPH20 36-486 <400> 273

Leu Asn 1

Phe Arg

Ala 5

Pro

Pro

Val

Ile

Pro 10

Asn

Val

Pro

Phe

Leu 15

Trp

Ala

Trp

Asn

Ala

Pro

Ser

Glu

Phe

Cys

Leu

Gly

Lys

Phe

Asp

Glu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Phe

Ser

Phe

Ile

Gly

Ser

Pro

Arg

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Gly

Gln

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Tyr

Val

Asp

Arg

Leu

Gly

Tyr

Tyr

50

55

60

Pro

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Gly

Ile

Pro

65

70

75

80

Gln

Lys

Ile

Ser

Leu

Gln

Asp

His

Leu

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

Asp

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Tyr

Met

Pro

Val

Asp

Asn

Leu

Gly

Met

Ala

Val

Ile

Asp

Trp

100

105

110

Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Trp

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

115

120

125

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Gln

Gln

Gln

Asn

Val

Gln

Leu

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Glu

Lys

Ala

Lys

Gln

Glu

Phe

Glu

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Lys

Asp

Phe

Leu

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Asn

His

Leu

Trp

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Pro

Asp

Cys

Tyr

Asn

His

180

185

190

His

Tyr

Lys

Lys

Pro

Gly

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Glu

Ile

195

200

205

Lys

Arg

Asn

Asp

Asp

Leu

Ser

Trp

Leu

Trp

Asn

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

210

215

220

Tyr

Pro

Ser

Ile

Tyr

Leu

Asn

Thr

Gln

Gln

Ser

Pro

Val

Ala

Ala

Thr

225

230

235

240

Leu

Tyr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Ile

Arg

Val

Ser

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Asp

Ala

Lys

Ser

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ile

Val

260

265

270

Phe

Thr

Asp

Gln

Val

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Gln

Asp

Glu

Leu

Val

Tyr

275

280

285

Thr

Phe

Gly

Glu

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Ile

Val

Ile

Trp

290

295

300

Gly

Thr

Leu

Ser

Ile

Met

Arg

Ser

Met

Lys

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Asp

305

310

315

320

Asn

Tyr

Met

Glu

Thr

Ile

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Leu

325

330

335

Ala

Ala

Lys

Met

Cys

Ser

Gln

Val

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Gly

Val

Cys

340

345

350

Ile

Arg

Lys

Asn

Trp

Asn

Ser

Ser

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Asn

Pro

Asp

355

360

365

Asn

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Lys

Phe

Thr

Val

Arg

Gly

370

375

380

Lys

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Gln

Phe

Ser

Glu

Lys

Phe

Tyr

Cys

385

390

395

400

Ser

Cys

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Glu

Lys

Ala

Asp

Val

Lys

Asp

405

410

415

Thr

Asp

Ala

Val

Asp

Val

Cys

Ile

Ala

Asp

Gly

Val

Cys

Ile

Asp

Ala

420

425

430

Phe

Leu

Lys

Pro

Pro

Met

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro

Gln

Ile

Phe

Tyr

Asn

435

440

445

Ala

Ser

Pro

450

- 427 -

Claims (40)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Композиция для стабилизации гиалуронидазы PH20, содержащая растворимый полипептид PH20 и лизил лизин (Lys-Lys) в количестве, достаточном, чтобы сделать растворимый полипептид PH20 стабильным, за счет чего растворимый полипептид PH20 в составе заявленной композиции обладает повышенной гиалуронидазной активностью при инкубации при температуре от 37 до 42°С включительно по сравнению с идентичной композицией, но не содержащей Lys-Lys.
2. 2. Композиция по п.1, в которой концентрация Lys-Lys составляет между 5 и 120 мМ, 10 и 100 мМ, 5 и 50 мМ, 10 и 50 мМ, 30 и 110 мМ, 30 и 80 мМ, 50 и 100 мМ или 100 и 120 мМ.
3. 3. Композиция по п.1, в которой концентрация Lys-Lys составляет от 5 до 300 мМ.
4. 4. Композиция по п.1 или 3, в которой концентрация Lys-Lys составляет от 50 до 150 мМ, включая граничные значения.
5. 5. Композиция по любому из пп.1-4, в которой концентрация растворимого полипептида PH20 составляет по меньшей мере 10 ед./мл.
6. 6. Композиция по любому из пп.1-5, в которой концентрация растворимого полипептида PH20 составляет между 10 и 5000 ед./мл, включая граничные значения.
7. 7. Композиция по любому из пп.1-6, в которой композиция дополнительно включает стабилизирующий агент, выбранный из аминокислоты, производного аминокислоты, амина, сахара, полиола, соли и поверхностно-активного вещества.
8. 8. Композиция по п.7, в которой стабилизирующий агент представляет собой поверхностноактивное вещество, и количество поверхностно-активного вещества в виде % массовой концентрации (мас./об.) в композиции составляет между 0,0005 и 1,0%, 0,0005 и 0,005%, 0,001 и 0,01%, 0,01 и 0,5%, 0,01 и 0,1%, 0,01 и 0,05% или 0,01 и 0,02%, включая граничные значения.
9. 9. Композиция по п.7 или 8, в которой поверхностно-активное вещество выбрано из полипропиленгликоля, полиэтиленгликоля, глицерина, сорбитола, полоксамера и полисорбата.
10. 10. Композиция по п.7 или 8, в которой поверхностно-активное вещество выбрано из полоксамера 188, полисорбата 20 и полисорбата 80.
11. 11. Композиция по любому из пп.1-10, в которой композиция включает антиоксидант или модификатор тоничности.
12. 12. Композиция по любому из пп.1-11, содержащая достаточное количество буферного агента для поддержания диапазона pH между 6,5 и 8,0, 6,8 и 7,8, 7,0 и 7,6, 6,5 и 7,2 или 6,8 и 7,4, включая граничные значения, где буферный агент выбран из Трис, гистидина, фосфата и цитрата.
13. 13. Композиция по любому из пп.1-12, в которой растворимый полипептид PH20 активен при нейтральном pH.
14. 14. Композиция по п.13, в которой растворимый полипептид PH20 укорочен с С-конца.
15. 15. Композиция по п.13 или 14, в которой растворимый полипептид PH20 выбран из овечьей PH20, бычьей PH20 и растворимой человеческой PH20, где у растворимой человеческой PH20 отсутствует вся последовательность присоединения гликозилфосфатидилинозитольного (GPI) якоря или ее часть.
16. 16. Композиция по любому из пп.1-15, в которой полипептид PH20 имеет последовательность аминокислот, приведенную в любой из SEQ ID NO: 4-9, 47-48, 234-254 и 267-273, или последовательность аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 91% или большую идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO: 4-9, 47-48, 234-254 и 267-273.
17. 17. Композиция по любому из пп.14-16, в которой укороченный с С-конца PH20 включает последовательность аминокислот, приведенную в любой из SEQ ID NO: 4-9.
18. 18. Композиция по любому из пп.1-4 и 7-17, в которой количество растворимого полипептида PH20 составляет между 10 и 20,000 ед./мл, 50 и 15,000 ед./мл, 50 и 10,000 ед./мл, 50 и 5000 ед./мл, 50 и 4000 ед./мл, 100 и 10000 ед./мл, 100 и 5000 ед./мл, 100 и 2000 ед./мл, 300 и 5000 ед./мл, 300 и 2000 ед./мл, 600 и 5000 ед./мл, 600 и 2000 ед./мл, 100 и 1000 ед./мл, 200 и 800 ед./мл, 100 и 500 ед./мл или 150 и 300 ед./мл, включая граничные значения, или количество растворимого полипептида PH20 составляет или составляет по меньшей мере 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000, 15000 или 20000 ед./мл.
19. 19. Композиция по любому из пп.1-18, в которой pH композиции составляет между 6,5 и 7,2;

    и композиция включает растворимый полипептид PH20 в количестве, которое составляет между 100 и 500 ед./мл, включая граничные значения;

    Lys-Lys в концентрации, которая составляет между 5 и 30 мМ, включая граничные значения;

    NaCl в концентрации менее 140 мМ;

    поверхностно-активное вещество, которое представляет собой полисорбат 80, в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,01 и 0,05%, включая граничные значения;

    - 428 033472 метионин в концентрации, которая составляет между 5 и 20 мМ, включая граничные значения; и натрия фосфат в концентрации, которая составляет между 5 и 50 мМ, включая граничные значения.
20. 20. Композиция по любому из пп.1-19, дополнительно содержащая быстродействующий инсулин.
21. 21. Композиция по п.20, в которой концентрация Lys-Lys составляет между 30 и 120 мМ, 50 и 105 мМ или 80 и 100 мМ, включая граничные значения.
22. 22. Композиция по п.20 или 21, в которой быстродействующий инсулин представляет собой регулярный инсулин или быстродействующий аналог инсулина.
23. 23. Композиция по п.22, в которой быстродействующий инсулин представляет собой регулярный инсулин, и регулярный инсулин представляет собой человеческий инсулин или свиной инсулин.
24. 24. Композиция по п.22, в которой быстродействующий инсулин представляет собой аналог инсулина и аналог инсулина выбран из инсулина аспарт, инсулина лизпро и инсулина глулизин.
25. 25. Композиция по п.24, в которой аналог инсулина выбран из инсулина, имеющего А-цепь с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 103, и В-цепь с последовательностью аминокислот, приведенной в любой из SEQ ID NO: 147-149.
26. 26. Композиция по любому из пп.20-25, в которой количество быстродействующего инсулина составляет между 10 и 1000 ед./мл, 20 и 500 ед./мл, 50 и 300 ед./мл или 200 и 800 ед./мл, включая граничные значения.
27. 27. Композиция по любому из пп.1-26, которая предназначена для введения одной дозой или предназначена для введения множеством доз.
28. 28. Композиция по п.27, которая предназначена для введения множеством доз и включает эффективное против микроорганизмов количество консерванта или смеси консервантов.
29. 29. Композиция по любому из пп.1-28, в которой pH композиции составляет между 6,8 и 7,4;

    и композиция включает

    PH20 в количестве между 100 и 1000 ед./мл, включая граничные значения;

    быстродействующий аналог инсулина, который представляет собой инсулин глулизин в количестве между 10 и 1000 ед./мл, включая граничные значения;

    Lys-Lys в концентрации между 50 и 105 мМ, включая граничные значения;

    NaCl в концентрации менее 100 мМ;

    поверхностно-активное вещество, которое представляет собой полисорбат 20, в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,0005 и 0,005%, включая граничные значения;

    метионин в концентрации между 5 и 20 мМ, включая граничные значения; и консервант (консерванты), который включает фенол в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,1 и 0,25% и м-крезол в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,05 и 0,2%.
30. 30. Композиция по любому из пп.1-28, в которой pH композиции составляет между 6,8 и 7,4;

    и композиция включает

    PH20 в количестве между 100 и 1000 ед./мл, включая граничные значения;

    быстродействующий аналог инсулина, который представляет собой инсулин аспарт или инсулин лизпро в количестве между 10 и 1000 ед./мл, включая граничные значения;

    Lys-Lys в концентрации между 80 и 100 мМ, включая граничные значения;

    NaCl в концентрации менее 30 мМ;

    поверхностно-активное вещество, которое представляет собой полисорбат 20, в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,0005 и 0,005%, включая граничные значения;

    метионин в концентрации между 5 и 20 мМ, включая граничные значения; и консервант (консерванты), который включает фенол в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,1 и 0,25% и м-крезол в процентной массовой концентрации (мас./об.) между 0,05 и 0,2%.
31. 31. Шприц или флакон, содержащие стабильную композицию по любому из пп.1-30.
32. 32. Система с обратной связью, содержащая стабильную композицию по любому из пп.20-30 и одно или более из датчика глюкозы, системы доставки для доставки композиции и программного обеспечения для соединения функций доставки и мониторинга, что позволяет доставлять композицию для осуществления гликемического контроля.
33. 33. Инсулиновая помпа, содержащая стабильную композицию по любому из пп.20-30.
34. 34. Инсулиновая шприц-ручка, содержащая стабильную композицию по любому из пп.20-30.
35. 35. Способ лечения диабета, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества стабильной композиции по любому из пп.20-30.
36. 36. Способ по п.35, в котором диабет выбран из сахарного диабета 1 типа, сахарного диабета 2 типа и гестационного диабета.
37. 37. Способ контроля уровня глюкозы в крови у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества стабильной композиции по любому из пп.20-30.

    - 429 033472
38. 38. Применение стабильной композиции по любому из пп.20-30 для лечения диабета или для контроля уровня глюкозы в крови у субъекта.
39. 39. Применение стабильной композиции по любому из пп.20-30 для производства лекарственного средства для лечения диабета или для контроля уровня глюкозы в крови у субъекта.
40. 40. Применение по п.38 или 39, где диабет выбран из сахарного диабета 1 типа, сахарного диабета 2 типа и гестационного диабета.