PT2300046E

PT2300046E - Composições de insulina de acção super-rápida

Info

Publication number: PT2300046E
Application number: PT97391833T
Authority: PT
Inventors: Gregory I Frost; Igor Bilinsky; Daniel Vaughn; Barry Sugarman
Original assignee: Halozyme Inc
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2015-04-08
Also published as: US9034323B2; PE20141384A1; US20090304665A1; MX348276B; RS53945B1; DK2300046T3; US8318154B2; WO2009134380A2; HK1150967A1; KR101516464B1; UY31789A1; ZA201007403B; KR20140093759A; US8568713B2; SI2300046T1; EP2705850B1; US20140135682A1; EA201001698A1; JP2011523940A; AR072250A1

Description

DESCRIÇÃO "Composições de insulina de acção super-rápida"

CAMPO DO INVENTO São proporcionadas combinações, composições e kits contendo uma composição de insulina de acção rápida e uma composição de enzima de degradação de hialuronano formuladas para administração parentérica. Estes produtos podem ser utilizados em métodos de tratamento de doenças ou condições tratáveis com insulina. São também proporcionados métodos para administração de insulina e de uma enzima de degradação de hialuronano.

ANTECEDENTES A diabetes resulta em hiperglicemia crónica devido à incapacidade do pâncreas para produzir quantidades adequadas de insulina ou devido à incapacidade das células para sintetizar e libertar apropriadamente a insulina. A hiperglicemia pode também ser experimentada por pacientes criticamente doentes, resultando em mortalidade e morbilidade aumentadas. A insulina tem sido administrada como um agente terapêutico para tratar pacientes com diabetes, incluindo, por exemplo, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 e diabetes gestacional, de modo a mimetizar a resposta endógena de insulina que ocorre em indivíduos normais. A insulina tem também sido administrada a pacientes criticamente doentes com hiperglicemia para controlar os níveis de glicose no sangue.

Tipicamente, insulinas de acção rápida são administrados a estes indivíduos em resposta a hiperglicemia ou em antecipação de hiperglicemia, tal como após o consumo de uma refeição, o que pode resultar em controlo glicémico. No entanto, as formas de insulinas de acção rápida actuais têm um atraso na absorção e acção, e por conseguinte não se aproximam da acção rápida da insulina endógena. Assim, estas formulações não actuam de modo suficiente rápido para parar a produção de glicose hepática que ocorre logo após esta primeira fase de liberação de insulina. Devido ao atraso na acção farmacológica, as preparações de insulina de acção rápida devem ser administradas antes das refeições de modo a conseguir o controlo glicémico desejado. Além disso, as doses que têm de ser administradas conduzem a uma duração prolongada da acção o que contribui para hipoglicemia e, em muitos casos, obesidade. Deste modo, existe uma necessidade de composições de insulina alternativas que mimetizem mais eficazmente a resposta de insulina endógena quando administradas a um sujeito, conduzindo a um controlo glicémico mais eficaz e a uma redução nos efeitos secundários negativos da terapia de insulina, tais como o ganho de peso.

Bonito, A. ((1954) "Effect of hyaluronidase administration on glycemic curves due to insulin in normal and diabetic subjects." Minerva Medica, Edizioni Minerva Medica, 45(31): 1068-1073,) descreve a injecção subcutânea de preparações de insulina não humana nativa e de hialuronidase de testículo de boi a pacientes normais e diabéticos. É mostrado que a hialuronidase aumenta a velocidade de absorção de insulina e aumenta o tempo do seu efeito.

Riet Correra et ai. ((1962) " Potent ialization of the action of insulins by hyaluronidase." Annales d'Endacrinologie 23:23-28) descreve a administração intravenosa de insulina regular (extraída de tecido animal) e hialuronidase e o seu efeito nos níveis de glicose no sangue em cães e conclui que a combinação de hialuronidase com insulina aumenta a acção hiperglicémica de insulina.

SUMÁRIO O presente invento proporciona uma composição de insulina de acção super-rápida, compreendendo: uma concentração terapeuticamente eficaz de um análogo de insulina de acção rápida para manter os níveis normais de glicose no sangue, onde: o análogo de insulina de acção rápida é insulina glulisina ou insulina aspártico; os níveis de glicose no sangue são níveis de glicose no sangue prandiais; e uma concentração de uma enzima de degradação de hialuronano suficiente para tornar a composição uma composição de insulina de acção super-rápida após administração, onde a composição de insulina de acção super-rápida tem um inicio de acção que mimetiza mais aproximadamente a libertação de insulina pós-prandial endógena de um sujeito não diabético; e a composição de insulina de acção super-rápida é formulada para uma via de administração seleccionada entre administração subcutânea, intramuscular, intradérmica e intraperitoneal. São proporcionadas composições de insulina de acção super-rápida que podem actuar mais rapidamente e/ou aumentar a exposição sistémica durante um período de tempo pré-seleccionado em comparação com composições de acção rápida. Assim, são proporcionadas composições de insulina de acção super-rápida. As composições contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma insulina de acção rápida e uma quantidade de uma enzima de degradação de hialuronano para tornar a composição de acção super-rápida. As composições são formuladas para administração parentérica, tal como administração subcutânea, intradérmica ou intramuscular. A dosagem de insulina (quantidade administrada) pode ser determinada pela quantidade suficiente para conseguir controlo glicémico, o que pode ser determinado empiricamente, tal como por desafio de glicose. Tipicamente, um objectivo no tratamento é administrar a quantidade mais baixa possível de insulina para conseguir controlo glicémico e reduzir o número de eventos hiperglicémicos e/ou hipoglicémicos. As doses de insulina mais baixas utilizadas nas composições de insulina de acção super-rápida podem reduzir o risco de ganho de peso e obesidade em sujeitos diabéticos. As composições podem ser proporcionadas em qualquer recipiente adequado ou veículo, tal como num frasco para injectáveis estéril, seringa, cartucho, caneta de insulina, bomba de insulina ou num sistema de reservatório em circuito fechado. São aqui descritas composições de insulina de acção super-rápida contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma insulina de acção rápida para controlar os níveis de glicose no sangue e uma quantidade de uma enzima de degradação de hialuronano suficiente para tornar a composição uma composição de insulina de acção super-rápida. São também descritos métodos para preparar composições de insulina de acção super-rápida, tais como quaisquer composições de insulina de acção super- rápida aqui descritas, por selecção de uma insulina de acção rápida e combinação desta com uma quantidade suficiente de enzima de degradação de hialuronano para tornar a composição uma composição de insulina de acção super-rápida. Em alguns exemplos das composições e métodos de preparação das composições, a quantidade terapeuticamente eficaz de insulina de acção rápida é de ou de cerca de 10 U/mL até ou até cerca de 500 U/ml de insulina, e a quantidade suficiente de uma enzima de degradação de hialuronano para tornar a composição uma composição de insulina de acção super-rápida é funcionalmente equivalente a pelo menos ou cerca de 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL ou 25 U de actividade de hialuronidase/mL. Em alguns exemplos, a quantidade suficiente de uma enzima de degradação de hialuronano para tornar a composição uma composição de insulina de acção super-rápida é funcionalmente equivalente a pelo menos ou cerca de 30 ou 35 unidades de actividade de hialuronidase/mL. Por exemplo, a quantidade de insulina de acção rápida nas composições pode ser de ou cerca de 10 U/mL, 20 U/mL, 30 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/ml ou 500 U/mL, e a quantidade de enzima de degradação de hialuronano nas composições pode ser funcionalmente equivalente a ou a cerca de 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35 U/mL, 37,5 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/ml, 2000 U/mL, 3000 U/mL ou 5000 U/mL. O volume da composição pode ser, por exemplo, de ou cerca de 1 mL, 3 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL ou 50 mL. Em alguns exemplos, a composição é formulada para entrega por um sistema em circuito fechado, uma caneta de insulina ou uma bomba de insulina, e pode ser formulada para administração de dose única ou administração de dose múltipla. A quantidade terapeuticamente eficaz da insulina de acção rápida pode ser menos do que a quantidade terapeuticamente eficaz de insulina de acção rápida requerida para conseguir o mesmo efeito terapêutico na ausência da enzima de degradação de hialuronano. A quantidade de enzima de degradação de hialuronano é suficiente para conseguir uma exposição sistémica a insulina que é pelo menos ou cerca de 30% mais elevada durante os primeiros 3, 6, 9,12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 ou 60 minutos após administração parentérica do que a exposição sistémica durante o mesmo período de tempo após administração parentérica da mesma insulina de acção rápida sem uma enzima de degradação de hialuronano e/ou é suficiente para conseguir um metabolismo de glicose sistémico (por vezes aqui designado como eliminação de glicose) que é pelo menos ou cerca de 30% mais elevado durante os primeiros 30, 45, 60, 90, 120 ou 180 minutos após administração do que o metabolismo de glicose sistémico durante o mesmo período após administração parentérica da mesma insulina de acção rápida sem uma enzima de degradação de hialuronano. Em todas as composições aqui proporcionadas e métodos aqui proporcionados, as quantidades de cada componente podem variar dependendo do sujeito a quem as composições são administradas e/ou da insulina de acção rápida particular (ou sua mistura) que é proporcionada. Se necessário, as quantidades pode ser determinadas empiricamente. São descritas composições de insulina que contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma insulina de acção rápida e uma quantidade de uma enzima de degradação de hialuronano. A quantidade de enzima de degradação de hialuronano é suficiente para conseguir uma exposição sistémica a insulina que é pelo menos ou cerca de 30% mais elevada durante os primeiros 30 a 40 minutos após administração do que a exposição sistémica durante o mesmo período após administração parentérica da mesma insulina de acção rápida na ausência da enzima de degradação de hialuronano. A quantidade de enzima de degradação de hialuronano pode ser suficiente tal que a composição de insulina de acção super-rápida resultante resulte num aumento do nível de glicose no sangue após os primeiros 30, 45, 60, 90, 120 ou 180 minutos após administração parentérica que é pelo menos ou cerca de 20% a 30% mais baixo do que o aumento nos níveis de glicose no sangue durante o mesmo período de tempo após administração parentérica da mesma insulina de acção rápida sem uma enzima de degradação de hialuronano. O aumento do nível de glicose no sangue pode ser pelo menos ou cerca de 30%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou 80% menos do que o aumento do nível de glicose no sangue após administração parentérica da insulina de acção rápida sem uma enzima de degradação de hialuronano. São também descritas composições de insulina de acção super-rápida que contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma insulina de acção rápida e uma quantidade de enzima de degradação de hialuronano que é suficiente para conseguir um metabolismo de glicose sistémico que é pelo menos ou cerca de 30% mais elevado do que eliminação de glicose sistémica (i.e. metabolismo) durante os primeiros 60 minutos após administração parentérica da mesma insulina de acção rápida sem uma enzima de degradação de hialuronano.

Nas composições de insulina de acção super-rápida aqui proporcionadas, quantidades exemplificativas de insulina (i.e., a quantidade que a composição proporciona para uma única dosagem) são de ou cerca de 0,05 Unidades, 0,06 Unidades, 0,07 Unidades, 0,08 Unidades, 0,09 Unidades, 0,1 Unidades, 0,2 Unidades, 0,3 Unidades, 0,4 Unidades, 0,5 Unidades, 0,6 Unidades, 0,7 Unidades, 0,8 Unidades, 0,9 Unidades, 1 Unidade, 2 Unidades, 5 Unidades, 10 Unidades, 15 Unidades, 20 Unidades, 25 Unidades, 30 Unidades, 35 Unidades, 40 Unidades ou 50 Unidades. Quantidades exemplificativas de enzima de degradação de hialuronano incluem uma quantidade funcionalmente equivalente a ou a cerca de 0,3 Unidades, 0,5 Unidades, 1 Unidade, 3 Unidades, 5 Unidades, 10 Unidades, 20 Unidades, 30 Unidades, 40 Unidades, 50 Unidades, 100 Unidades, 150 Unidades, 200 Unidades, 250 Unidades, 300 Unidades, 350 Unidades, 400 Unidades, 450 Unidades, 500 Unidades, 600 Unidades, 700 Unidades, 800 Unidades, 900 Unidades, 1000 Unidades, 2000 Unidades, 3000 Unidades, 4000 Unidades ou mais de actividade de hialuronidase.

As composições de insulina de acção super-rápida aqui descritas podem conseguir uma exposição sistémica prandial (e.g. 0-4 horas pós-administração) a insulina que é pelo menos ou cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 140%, 160%, 180%, 200%, 300% ou 400% mais elevada do que a exposição sistémica após administração parentérica de insulina na ausência da enzima de degradação de hialuronano. As composições de insulina de acção super-rápida aqui descritas podem conseguir um metabolismo de glicose sistémico (i.e., uma quantificação da remoção de glicose do sangue expressa quer como uma velocidade (quantidade/tempo) quer como a quantidade total durante um período de tempo predeterminado) que é pelo menos ou cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 140%, 160%, 180%, 200%, 250%, 300%, 350% ou 400% mais elevado do que o metabolismo de glicose do sangue após administração parentérica de insulina sem uma enzima de degradação de hialuronano.

As composições de insulina de acção super-rápida aqui proporcionadas incluem opcionalmente um agente quelante, tal como, mas não limitado a ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) ou etilenodiaminotetra-acetato. O agente quelante pode ser proporcionado como um complexo com um metal a ou a cerca de concentrações equimolares com o mesmo, tal como o complexo de agente quelante cálcio-EDTA. A concentração de cálcio EDTA é ou é cerca de 0,02 mM, 0,04 mM, 0,06 mM, 0,08 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM ou 20 mM.

As presentes composições de insulina de acção super-rápida geralmente incluem zinco. A concentração de zinco tipicamente é ou é cerca de 0,002 miligramas por 100 unidades de insulina (mg/100 U), 0,005 mg/100 U, 0,01 mg/100 U, 0,012 mg/100 U, 0,014 mg/100 U, 0,016 mg/100 U, 0,017 mg/100 U, 0,018 mg/100 U, 0,02 mg/100 U, 0,022 mg/100 U, 0,024 mg/100 U, 0,026 mg/100 U, 0,28 mg/100 U, 0,03 mg/100 U, 0,04 mg/100 U, 0,05 mg/100 U, 0,06 mg/100 U, 0,07 mg/100 U, 0,08 mg/100 U ou 0,1 mg/100 U. Em geral, as insulinas de acção rápida são formuladas com zinco; a quantidade aqui utilizada pode ser uma quantidade que mantém a mesma concentração de zinco quando combinada com a enzima de degradação de hialuronano. Composições exemplificativas podem conter cálcio-EDTA e zinco em proporções molares de ou cerca de 0,5:1, 1:1, 1,5:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 300:1 ou 1000:1, tais como cerca de 0,010-0,50 mg de zinco, tal como 0,017 mg de zinco por 100 U de insulina humana, e 0,1 a 50 mM de cálcio-EDTA. Outras composições exemplificativas de insulina de acção super-rápida contêm zinco numa proporção molar de cerca de 1:3 em relação à insulina de acção rápida e cálcio EDTA numa proporção molar de cerca de 1:3 a 10:1 em relação à insulina de acção rápida.

As composições de insulina de acção super-rápida incluem também opcionalmente um modificador de tonicidade, tal como, mas não limitado a, um aminoácido, um poliálcool, tal como glicerol, e/ou um sal, tal como, cloreto de sódio. A osmolaridade da composição pode ser ou é cerca de 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg ou 400 mOsm/kg. O pH é adequado para administração parentérica, tal como cerca de ou 5,5 a 8.5, particularmente, 6 a 8, tal como cerca de ou 6, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 ou 8. As composições podem incluir opcionalmente um estabilizador para a insulina de acção rápida, um estabilizador para a enzima de degradação de hialuronano ou ambos. Estabilizadores incluem, mas não estão limitados a, um detergente, um poliálcool, um metal, um sal, um co-solvente e/ou uma proteína. Exemplificativos destes estabilizadores são albumina de soro e/ou polissorbato, numa concentração suficiente para conseguir maior estabilidade da composição e/ou de um componente. A albumina de soro pode ser incluída numa concentração de ou cerca de 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL ou 1 mg/mL. O polissorbato pode ser incluído, por exemplo, numa concentração de ou cerca de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% ou 0,1%. Outros ingredientes opcionais incluem, por exemplo, um, consumidor de oxigénio, tal como ácido ascórbico, ascorbato, ácido cítrico, citrato, metionina, que pode estar numa concentração de 1 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM, 10 mM ou 2 0 mM, e/ou albumina e/ou um conservante, tal como um composto que contém um anel aromático, por exemplo, m-cresol ou fenol. A insulina de acção rápida pode ser, por exemplo, monomérica ou multimérica, tal como dimérica ou hexamérica. A insulina é um análogo de insulina. Exemplificativo de análogos de insulina é um análogo de insulina seleccionado entre uma insulina com uma cadeia A contendo ou possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:103 e uma cadeia B contendo ou possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer das SEQ ID NOS :147-149. Em algumas composições de insulina de acção super-rápida exemplificativas, a insulina de acção rápida é uma insulina humana de acção rápida. Adicionalmente, as composições de insulina de acção super-rápida podem conter misturas de insulinas. As misturas podem ser insulinas de acção rápida, ou misturas de uma insulina de acção rápida e também de insulina (s) de acção mais lenta, tais como uma insulina de acção basal.

Enzimas de degradação de hialuronano contidas nas composições aqui proporcionadas incluem, por exemplo, hialuronidases, tais como hialuronidases de animal, incluindo humano, particularmente suas formas solúveis. Enzimas de degradação de hialuronano exemplificativas são as hialuronidases, particularmente hialuronidases solúveis, tais como uma PH20, ou uma sua forma truncada. A PH20 pode ser, por exemplo, uma PH20 ovina, bovina ou humana truncada. Incluem-se aquelas que contêm ou possuem uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer das SEQ ID NOS :1-39 e 67-96 e suas formas truncadas ou variantes alélicas, variantes de espécie ou outras suas variantes. A PH20 humana truncada, particularmente formas truncadas solúveis, inclui qualquer um entre os polipéptidos possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer das SEQ ID NOS :4-9, ou suas variantes alélicas e outras variantes. Variantes das hialuronidases possuem tipicamente pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade de sequência com qualquer das SEQ ID NOS: 1-39 e 67-96, particularmente com formas solúveis, e mantêm actividade de hialuronidase. A hialuronidase solúvel pode ser a composição que é rHuPH20. A enzima de degradação de hialuronano pode ser uma condroitinase, tal como, mas não limitada a, condroitina ABC liase, condroitina AC liase e condroitina C liase. Condroitinases exemplificativas possuem ou contêm uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer das SEQ ID NOS :98-100, ou suas formas truncadas ou variantes alélicas, variantes de espécie e outras suas variantes. As variantes possuem tipicamente 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade de sequência com um polipéptido apresentado em qualquer das SEQ ID NOS. 98-100 ou com uma condroitinase do tipo selvagem.

As composições de insulina de acção super-rápida aqui proporcionadas podem ser formuladas para administração de dosagem múltipla, ou para administração de dose única. Quantidades terapeuticamente eficazes exemplificativas de insulina dependem da insulina na composição e do sujeito a quem a composição é administrada. Estas quantidades de dosagem única incluem, por exemplo, ou cerca de 0,05 Unidades, 0,06 Unidades, 0,07 Unidades, 0,08 Unidades, 0,09 Unidades, 0,1 Unidades, 0,2 Unidades, 0,3 Unidades, 0,4 Unidades, 0,5 Unidades, 0,6 Unidades, 0,7 Unidades, 0,8 Unidades, 0,9 Unidades, 1 Unidade, 2 Unidades, 5 Unidades, 10 Unidades, 15 Unidades, 20 Unidades, 25 Unidades, 30 Unidades, 35 Unidades, 40 Unidades, 50 Unidades ou 100 Unidades. Nestas composições, a quantidade de enzima de degradação de hialuronano pode ser ou é funcionalmente equivalente a ou a cerca de 0,3 Unidades, 0,5 Unidades, 1 Unidade, 2 Unidades, 3 Unidades, 4 Unidades, 5 Unidades, 10 Unidades, 20 Unidades, 30 Unidades, 40 Unidades, 50 Unidades, 100 Unidades, 150 Unidades, 200 Unidades, 250 Unidades, 300 Unidades, 350 Unidades, 400 Unidades, 450 Unidades, 500 Unidades, 600 Unidades, 700 Unidades, 800 Unidades, 900 Unidades ou 1000 Unidades de actividade de hialuronidase.

As composições de insulina de acção super-rápida podem ser formuladas para entrega por uma bomba. São proporcionados sistemas em circuito fechado para controlar os niveis de glicose no sangue. Os sistemas são quaisquer dos conhecidos dos peritos na especialidade, mas modificados para conterem a insulina de acção rápida e a enzima de degradação de hialuronano como aqui descrito e doseamento adequado ou programação para entregarem dosagens terapêuticas de insulina de acção rápida e de uma enzima de degradação de hialuronano para produzir uma composição de insulina de acção super-rápida. Os sistemas em circuito fechado podem incluir um reservatório contendo uma insulina de acção rápida e uma enzima de degradação de hialuronano, onde a enzima de degradação de hialuronano está presente numa quantidade suficiente para tornar a combinação resultante uma composição de insulina de acção super-rápida. Noutra concretização é proporcionado um sistema em circuito fechado para controlar os niveis de glicose no sangue que contém um reservatório contendo uma insulina de acção rápida e um segundo reservatório contendo uma enzima de degradação de hialuronano.

Os sistemas em circuito fechado podem incluir opcionalmente um ou mais de um sensor de glicose, um sistema de entrega para entregar a enzima de degradação de hialuronano e a insulina de acção rápida e software programado para integrar as funções de bombagem e monitorização, pelo que a enzima de degradação de hialuronano e a insulina de acção rápida são entregues para conseguir um controlo glicémico que mimetiza o controlo glicémico num sujeito não diabético. Os sistemas em circuito fechado podem também conter, num reservatório separado ou misturada com a insulina de acção rápida e/ou hialuronano, uma insulina de acção mais lenta, tal como uma insulina basal. 0 sistema pode também incluir qualquer dos ingredientes opcionais assinalados acima. A insulina de acção rápida e a enzima de degradação de hialuronano podem incluir quaisquer das acima descritas.

No sistema em circuito fechado, o reservatório contendo a insulina de acção rápida pode conter um número suficiente de unidades para manter controlo glicémico durante pelo menos metade de um dia, um dia ou mais e pode conter ou cerca de 0,1 Unidades, 0,2 Unidades, 0,3 Unidades, 0,4 Unidades, 0,5 Unidades, 0,6 Unidades, 0,7 Unidades, 0,8 Unidades, 0,9 Unidades, 1 Unidade, 2 Unidades, 5 Unidades, 10 Unidades, 15 Unidades, 20 Unidades, 25 Unidades, 30 Unidades, 35 Unidades, 40 Unidades, 50 Unidades, 100 Unidades, 200 Unidades, 300 Unidades, 400 Unidades, 500 Unidades, 600 Unidades, 700 Unidades, 800 Unidades, 900 Unidades, 1000 Unidades, 2000 Unidades, 5000 Unidades, 6000 Unidades, 7000 Unidades ou mais de insulina. O sistema em circuito fechado pode entregar quaisquer quantidades desejadas ou incrementos de dose de insulina e/ou enzima de degradação de hialuronano, tais como ou cerca de 0,05 Unidades, 0,1 Unidades, 0,2 Unidades, 0,3 Unidades, 0,4 Unidades, 0,5 Unidades, 0,6 Unidades, 0,7 Unidades, 0,8 Unidades, 0,9 Unidades, 1 Unidade, 2 Unidades, 5 Unidades, 10 Unidades, 15 Unidades, 20 Unidades, 25 Unidades, 30 Unidades, 35 Unidades, 40 Unidades, 50 Unidades ou mais de insulina por incremento. O reservatório contendo a enzima de degradação de hialuronano pode conter uma quantidade de enzima de degradação de hialuronano que é funcionalmente equivalente a ou a cerca de 1 Unidade, 5 Unidades, 10 Unidades, 20 Unidades, 30 Unidades, 40 Unidades, 50 Unidades, 100 Unidades, 150 Unidades, 200 Unidades, 250 Unidades, 300 Unidades, 350 Unidades, 400 Unidades, 450 Unidades, 500 Unidades, 600 Unidades, 700 Unidades, 800 Unidades, 900 Unidades, 1000 Unidades, 2000 Unidades, 3000 Unidades, 4000 Unidades, 5000 Unidades, 6000 Unidades, 7000 Unidades, 8000 Unidades, 9000 Unidades, 10000 Unidades, 20000 Unidades ou mais de actividade de hialuronidase, e pode entregar enzima de degradação de hialuronano em incrementos de dose individual de uma quantidade de enzima de degradação de hialuronano que é funcionalmente equivalente a ou a cerca de, por exemplo, 0,3 Unidades, 0,5 Unidades, 1 Unidade, 2 Unidades, 3 Unidades, 5 Unidades, 10 Unidades, 20 Unidades, 30 Unidades, 40 Unidades, 50 Unidades, 100 Unidades, 150 Unidades ou mais de actividade de hialuronidase. São também descritas combinações contendo uma primeira composição contendo de ou de cerca de 10 U até ou até cerca de 500 U de insulina, e uma segunda composição contendo uma quantidade suficiente de enzima de degradação de hialuronano que, quando administrada com a insulina, torna a insulina de acção rápida uma insulina de acção super-rápida. A quantidade suficiente de enzima de degradação de hialuronano é funcionalmente equivalente a pelo menos ou cerca de 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL ou 25 U de actividade de hialuronidase/mL. Em alguns exemplos, a quantidade suficiente de enzima de degradação de hialuronano é funcionalmente equivalente a pelo menos ou cerca de 35 U de actividade de hialuronidase/mL. Por exemplo, a quantidade de enzima de degradação de hialuronano na segunda composição pode ser funcionalmente equivalente a ou a cerca de 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35 U/mL, 37,5 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/ml, 2000 U/mL, 3000 U/mL ou 5000 U/mL. Em alguns exemplos, a quantidade de insulina de acção rápida na primeira composição é ou é cerca de 10 U/mL, 20 U/mL, 30 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/ml ou 500 U/mL. São também descritas combinações de uma primeira composição contendo uma enzima de degradação de hialuronano e uma segunda composição contendo uma insulina de acção rápida. As composições são formuladas para administração parentérica. Em alguns casos, a quantidade de enzima de degradação de hialuronano é suficiente se misturada com a segunda composição para tornar a composição resultante uma composição de insulina de acção super-rápida. Noutros casos, a quantidade da enzima de degradação de hialuronano é suficiente se administrada antes da administração da primeira composição para tornar a composição de insulina de acção rápida uma composição de insulina de acção super-rápida.

Nas combinações aqui descritas, as insulinas de acção rápida e as enzimas de degradação de hialuronano e outros componentes são como descrito acima para as composições. São também descritos kits contendo as combinações. A composição de insulina pode ser formulada para administrar uma dosagem prandial para uma única refeição, tal como, mas não limitada a, cerca de 0,001 U/kg, 0,005 U/kg, 0,01, U/kg, 0,02 U/kg, 0,03 U/kg, 0,04 U/kg, 0,05 U/kg, 0,06 U/kg, 0,07 U/kg, 0,08 U/kg, 0,09 U/kg, 0,10 U/kg, 0,11 U/kg, 0,12 U/kg, 0,13 U/kg, 0,14 U/kg, 0,15 U/kg, 0,20U/kg, 0,25 U/kg, 0,30 U/kg, 0,40 U/kg, 0,50 U/kg, 1 U/kg, 1,5 U/kg ou 2 U/kg. A quantidade de enzima de degradação de hialuronano é formulada para administrar ao sujeito uma dosagem prandial para uma única refeição e, por exemplo, é ou é cerca de 0,3 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 3 U, 4 U, 5 U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2000 U, 3000 U, 4000 U, 5000 U ou mais. As composições na combinação podem ser formuladas para administração subcutânea. São descritos métodos nos quais são administradas as composições de insulina de acção super-rápida e combinações aqui proporcionadas. Tipicamente esta administração é administração parentérica, tal como intravenosa, subcutânea ou através de qualquer via adequada. Em qualquer dos métodos aqui descritos, a insulina de acção rápida e a enzima de degradação de hialuronano podem ser administradas separadamente, intermitentemente ou em conjunto, em composições separadas ou co-formuladas. São também descritos métodos para controlar os niveis de glucose num sujeito por administração de qualquer das composições de insulina de acção super-rápida ou combinações aqui proporcionadas. Em alguns casos, as composições ou combinações são administradas como uma dosagem prandial, incluindo tal como administradas menos de ou cerca de 20, 10, 5 minutos antes de uma refeição, até menos do que ou cerca de 10 minutos após uma refeição ou com a refeição. São também descritos métodos que envolvem instruir um paciente para administrar uma composição de insulina de acção rápida menos de ou cerca de 20, 10, 5 minutos antes de uma refeição, até menos do que ou cerca de 30 minutos após uma refeição, onde a insulina de acção rápida é co-administrada com uma quantidade suficiente de enzima de degradação de hialuronano para tornar a composição de insulina de acção rápida uma composição de acção super-rápida. A insulina de acção rápida e a enzima de degradação de hialuronano podem ser co-formuladas ou fornecidas separadamente para co-administração. Nestes métodos, o paciente pode ser instruído para administrar a composição de insulina de acção rápida no momento ou próximo do momento de ingestão de uma refeição. Em alguns exemplos, as instruções são escritas. Noutros exemplos, as instruções são orais. São descritos métodos para controlar os níveis de glicose no sangue num sujeito, por administração a um sujeito de uma enzima de degradação de hialuronano e de uma insulina de acção rápida, onde a enzima de degradação de hialuronano e a insulina de acção rápida são administradas em quantidades suficientes para a) obter um aumento máximo em concentração de insulina no sangue que é pelo menos ou cerca de 20% a 30% mais elevado do que o aumento máximo em concentração de insulina no sangue obtido após administração da insulina de acção rápida do mesmo modo na ausência de uma enzima de degradação de hialuronano; e/ou b) reduzir a quantidade de tempo que demora a atingir a concentração máxima de insulina no sangue para não mais do que 80% do tempo que demora a atingir a concentração máxima de insulina no sangue quando a insulina de acção rápida é administrada do mesmo modo na ausência de uma enzima de degradação de hialuronano; e/ou c) aumentar a concentração de insulina 15 minutos após a administração em pelo menos ou cerca de 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 pmol/L.

Em virtude dos métodos, o aumento máximo em concentração de insulina no sangue é pelo menos ou cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 140%, 160%, 180%, 200%, 250%, 300%, 350% ou 400% mais elevado do que o aumento máximo em concentração de insulina na ausência da enzima de degradação de hialuronano. O tempo que demora a atingir a concentração máxima de insulina no sangue pode ser reduzido não mais do que 80% do tempo que demora a atingir a concentração máxima de insulina no sangue na ausência da enzima de degradação de hialuronano. Por exemplo, a concentração de insulina após administração de uma dose de 20 U de insulina 15 minutos após administração pode ser aumentada em pelo menos ou cerca de 60 pmol/L, 80 pmol/L, 100 pmol/L, 120 pmol/L, 140 pmol/L, 160 pmol/L, 180 pmol/L ou 200 pmol/L.

Os sujeitos diabéticos podem ter diabetes quer Tipo 1 quer Tipo 2, e a quantidade de insulina de acção rápida administrada ao sujeito é reduzida em comparação com quando a insulina de acção rápida é administrada do mesmo modo na ausência de uma enzima de degradação de hialuronano. Por exemplo, a quantidade de insulina de acção rápida administrada a um sujeito diabético Tipo 1 pode ser reduzida em pelo menos ou cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou mais, e a quantidade de insulina de acção rápida administrada a um sujeito diabético Tipo 2 pode ser reduzida em pelo menos ou cerca de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais . São também descritos métodos para controlo ou prevenção do ganho de peso e/ou obesidade num sujeito diabético, tal como o ganho de peso associado a terapia de insulina prandial.

Tipicamente, isto é conseguido por administração de uma enzima de degradação de hialuronano e de uma insulina de acção rápida numa dose que é menos do que a dose de uma insulina de acção rápida quando administrada na ausência de uma enzima de degradação de hialuronano. Os sujeitos diabéticos podem estar obesos ou em risco de obesidade, e podem ter diabetes Tipo 1, diabetes Tipo 2, diabetes gestacional ou outra diabetes. Sujeitos diabéticos exemplificativos são sujeitos diabéticos Tipo 2. Num exemplo, o controlo ou prevenção da obesidade num sujeito diabético é conseguido por administração a um sujeito diabético obeso ou a um sujeito diabético em risco de obesidade de uma dosagem terapeuticamente eficaz de uma insulina de acção rápida em combinação com enzima de degradação de hialuronano. A composição pode ser administrada no momento ou próximo do momento da refeição, e a) a quantidade de enzima de degradação de hialuronano é suficiente para tornar a insulina de acção rápida administrada uma insulina de acção super-rápida; e b) a dosagem de insulina de acção rápida consegue substancialmente o mesmo grau de eliminação de glicose prandial nos primeiros 40 minutos após administração que uma dosagem mais elevada da mesma insulina de acção rápida administrada do mesmo modo na ausência da enzima de degradação de hialuronano. A dosagem da insulina de acção rápida na composição de insulina de acção super-rápida, em comparação com a dose mais elevada de insulina de acção rápida, tem uma tendência reduzida para causar hipoglicemia pós-prandial e obesidade. Os sujeitos diabéticos podem ter diabetes Tipo 2, e a quantidade de insulina de acção rápida administrada ao sujeito pode ser reduzida em comparação com quando a insulina de acção rápida é administrada do mesmo modo na ausência de uma enzima de degradação de hialuronano. Por exemplo, a quantidade de insulina de acção rápida administrada a um sujeito diabético Tipo 2 pode ser reduzida em pelo menos ou cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais. São também descritos métodos para reduzir ou prevenir o ganho de peso associado a terapia de insulina prandial administrando subcutaneamente, a um sujeito diabético em risco de ganho de peso por terapia de insulina prandial, no momento ou próximo do momento da refeição, uma composição de insulina contendo uma insulina de acção rápida e uma enzima de degradação de hialuronano, tal que a quantidade de insulina de acção rápida administrada para tratar a hiperglicemia pós-prandial no sujeito é reduzida em comparação com a quantidade da mesma insulina de acção rápida requerida para tratar a hiperglicemia quando administrada do mesmo modo na ausência da enzima de degradação de hialuronano. A quantidade reduzida de insulina de acção rápida torna a composição contendo a enzima de degradação de hialuronano menos provável de causar ganho de peso no sujeito. Por exemplo, pode-se administrar a um sujeito diabético Tipo 2 uma composição de insulina como descrita acima contendo uma quantidade de insulina de acção rápida que é pelo menos ou cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% menos do que a quantidade da mesma insulina de acção rápida requerida para tratar a hiperglicemia quando administrada do mesmo modo na ausência da enzima de degradação de hialuronano. Em alguns casos, a composição de insulina é administrada num regime crónico de terapia de insulina prandial. São aqui descritos métodos para reduzir ou prevenir o ganho de peso num sujeito diabético administrando a um sujeito diabético em risco de ganho de peso por terapia de insulina prandial, um programa de terapia de insulina prandial subcutânea durante um período de pelo menos trinta dias. As dosagens de insulina prandial administradas no programa da terapia contêm uma combinação de uma insulina de acção rápida e de uma enzima de degradação de hialuronano. A quantidade de enzima de degradação de hialuronano em cada dosagem é suficiente para tornar a insulina de acção rápida uma composição de insulina de acção super-rápida, e a quantidade de insulina de acção rápida contida na dosagem para tratar a hiperglicemia pós-prandial do sujeito é mais baixa do que uma quantidade da mesma insulina de acção rápida requerida para tratar a hiperglicemia na ausência da enzima de degradação de hialuronano. Um tal programa de terapia de insulina prandial pode resultar em menos ganho de peso do que um programa de terapia similar utilizando dosagens mais elevadas de insulina de acção rápida na ausência de enzima de degradação de hialuronano. São também descritos métodos para controlo dos níveis de glicose num sujeito por administração ao sujeito de uma dosagem prandial de composição de insulina de acção super-rápida, onde: a) a composição de insulina de acção super-rápida compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma insulina de acção rápida e de uma enzima de degradação de hialuronano; b) a insulina de acção rápida é uma insulina regular; c) a dosagem é administrada, ou recomendada para administração prandial ou pré-prandial, mais próximo do momento da refeição do que a mesma dosagem ou uma dosagem mais elevada da mesma insulina regular de acção rápida administrada pela mesma via de administração na ausência de uma enzima de degradação de hialuronano; e d) a dosagem da composição de insulina de acção super-rápida tem pelo menos o mesmo efeito terapêutico que a insulina regular de acção rápida sem a enzima de degradação de hialuronano. A composição de insulina de acção super-rápida, por exemplo, é administrada, ou recomendada para administração, menos do que ou cerca de 20 minutos antes de uma refeição, até menos do que ou cerca de 10 ou 20 minutos após uma refeição. Tipicamente, a dosagem da insulina de acção rápida na composição de insulina de acção super-rápida é menor do que ou igual à dosagem da insulina de acção rápida administrada pela mesma via na ausência da enzima de degradação de hialuronano.

Na prática de qualquer dos métodos aqui descritos, as composições podem ser administrada através de qualquer via adequada e utilizando qualquer dispositivo ou recipiente adequado, tal como através de uma seringa, caneta de insulina, bomba de insulina ou sistema em circuito fechado. As composições ou combinações podem conter qualquer das insulinas de acção rápida e enzimas de degradação de hialuronano descritas acima, com qualquer dos reagentes adicionais como descrito acima. A quantidade de insulina na composição administrada ao sujeito pode ser uma dosagem prandial para uma única refeição e é ou é cerca de 0,001 U/kg, 0,005 U/kg, 0,01 U/kg, 0,02 U/kg, 0,05 U/kg a 0,30 U/kg, tal como 0,05 U/kg, 0,06 U/kg, 0,07 U/kg, 0,08 U/kg, 0,09 U/kg, 0,10 U/kg, 0,11 U/kg, 0,12 U/kg, 0,13 U/kg, 0,14 U/kg, 0,15 U/kg, 0,20U/kg, 0,25 U/kg, 0,30 U/kg, 0,40 U/kg, 0,50 U/kg, 1,0 U/kg, 1,5 U/kg ou 2 U/kg. A quantidade de enzima de degradação de hialuronano administrada ao sujeito é para co-administração (separadamente, intermitentemente ou em conjunto em composições separadas ou co-formulada) com uma dosagem prandial de insulina de acção rápida para uma única refeição. A quantidade de enzima de degradação de hialuronano pode ser ou é cerca de 0,3 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 5 U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2000 U, 3000 U, 4000 Unidades, 5000 U ou mais. São descritos artigos de fabricação contendo material de embalagem e quaisquer das composições de insulina de acção super-rápida ou combinações dentro do material de embalagem com instruções opcionais para administração a um sujeito diabético.

As insulinas de acção rápida, insulinas, enzimas de degradação de hialuronano e outros componentes incluem aqueles como acima descrito.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 ilustra os perfis farmacocinéticos do análogo de insulina de acção rápida, insulina Humalog®, e da insulina regular de acção rápida, insulina Humulin® R, quando administradas subcutaneamente com ou sem co-administração de rHuPH20. A concentração de insulina no plasma para vários pontos temporais foi determinada por radioimunoensaio (RIA) após administração a sujeitos saudáveis normais utilizando um procedimento de Clamp Hiperinsulinémico-Euglicémico. A Figura 2 ilustra os perfis farmacodinâmicos do análogo de insulina de acção rápida, insulina Humalog®, e da insulina regular de acção rápida, insulina Humulin® R, quando administradas subcutaneamente com ou sem co-administração de rHuPH20 utilizando um procedimento de Clamp Hiperinsulinémico-

Euglicémico. Determinou-se a taxa de perfusão de glicose que era requerida para manter niveis de glicose no sangue entre 90-110 mg/dL após a administração de insulina a sujeitos saudáveis normais.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Esboço A. Definições B. Insulina de acção "super-rápida" 1. Visão global de insulina, diabetes e terapias existentes de insulina de acção rápida 2. Farmacodinâmica e farmacocinética de uma composição de insulina de acção super-rápida C. Polipéptidos de insulina e formulações D. Enzimas de degradação de hialuronano 1. Hialuronidases a. Hialuronidases de tipo mamífero b. Hialuronidases bacterianas c. Hialuronidases a partir de sanguessugas, outros parasitas e crustáceos 2. Outras enzimas de degradação de hialuronano 3. Enzimas solúveis de degradação de hialuronano a. PH20 humana solúvel b. PH20 humana recombinante (rHuPH20) solúvel 4. Glicosilação de enzimas de degradação de hialuronano 5. Modificações de enzimas de degradação de hialuronano para melhorar as suas propriedades farmacocinéticas E. Métodos de produção de ácidos nucleicos codificando uma hialuronidase solúvel e seus polipéptidos 1. Vectores e células 2. Porções de ligador 3. Expressão a. Células procarióticas b. Células de levedura c. Células de insecto d. Células de mamífero e. Plantas 4. Técnicas de purificação F. Preparação, formulação e administração de polipéptidos de insulina e hialuronidase solúvel 1. Formulações Pós liofilizados 2. Dosagem e administração Modo de administração a. Seringas b. Caneta de insulina c. Bombas de insulina e outros dispositivos de entrega de insulina d. Sistema em circuito fechado G. Métodos de ensaio de actividade, biodisponibilidade e farmacocinética 1. Farmacocinética, farmacodinâmica e tolerância 2. Actividade biológica a. Insulina b. Enzimas de degradação de hialuronano H. Utilizações terapêuticas 1. Diabetes Mellitus a. Diabetes tipo 1 b. Diabetes tipo 2 c. Diabetes gestacional 2. Terapias de insulina para pacientes criticamente doentes I. Terapias de combinação J. Artigos de fabricação e kits K. Exemplos

A. DEFINIÇÕES A não ser que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como é habitualmente entendido por um perito na especialidade à qual o invento pertence. Na eventualidade de existir uma pluralidade de definições para termos aqui apresentados, prevalecerão as desta secção. Onde é feita referência a um URL ou a um outro tal identificador ou endereço, é entendido que estes identificadores podem mudar e que a informação particular na internet pode surgir e desaparecer, mas informação equivalente pode ser encontrada por pesquisa na internet. A referência à mesma evidencia a disponibilidade e disseminação pública desta informação.

Como aqui utilizado, "insulina" refere-se a uma hormona, precursor ou um seu análogo sintético ou recombinante que actua para aumentar a absorção e armazenamento de glicose e/ou diminuir a produção de glicose endógena. Uma insulina humana exemplificativa é traduzida como um polipéptido precursor de 110 aminoácidos, pré-pró-insulina (SEQ ID NO:101), contendo um péptido de sinal de 24 aminoácidos que conduz a proteína para o retículo endoplasmático (ER) onde a sequência de sinal é clivada, resultando em pró-insulina (SEQ ID NO:102). A pró-insulina é processada adicionalmente para libertar o péptido C ou de cadeia de ligação de 31 aminoácidos (correspondente aos resíduos de aminoácido 57 a 87 do polipéptido de pré-pró-insulina apresentado na SEQ ID NO: 101, e aos resíduos de aminoácido 33 a 63 do polipéptido pró-insulina apresentado na SEQ ID NO:102). A insulina resultante contém uma cadeia A de 21 aminoácidos (correspondente aos resíduos aminoácido 90 a 110 do polipéptido pré-pró-insulina apresentado na SEQ ID NO: 101, e aos resíduos de aminoácido 66 a 86 do polipéptido pró-insulina apresentado na SEQ ID NO:102) e uma cadeia B de 30 aminoácidos (correspondente aos resíduos aminoácido 25 a 54 do polipéptido pré-pró-insulina apresentado na SEQ ID NO:101, e aos resíduos de aminoácido 1 a 30 do polipéptido pró-insulina apresentado na SEQ ID NO:102) que estão reticuladas por ligações dissulfureto. Uma insulina humana apropriadamente reticulada contém três pontes de dissulfureto: uma entre a posição 7 da cadeia A e a posição 7 da cadeia B, uma segunda entre a posição 20 da cadeia A e a posição 19 da cadeia B, e uma terceira entre as posições 6 e 11 da cadeia A. A referência a insulina inclui pré-pró-insulina, pró-insulina e polipéptidos de insulina em formas de cadeia única ou de duas cadeias, suas formas truncadas que possuem actividade, e inclui variantes alélicas e variantes de espécie, variantes codificadas por variantes de montagem (splice), e outras variantes, tais como análogos de insulina, incluindo polipéptidos que possuem pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência em relação ao polipéptido precursor apresentado na SEQ ID NO:101 ou a sua forma madura. Análogos de insulina exemplificativos incluem aqueles apresentados nas SEQ ID NOS :147-149, 152, e aqueles contendo uma cadeia A apresentada nas SEQ ID NOS:150, 156, 158, 160, 162 e 164 e/ou uma cadeia B apresentada nas SEQ ID NOS:151, 153-155, 157, 159, 161, 163 e 165.

Polipéptidos de insulina exemplificativos são os de origem mamífera, incluindo humana. Sequências de aminoácido exemplificativas de insulina de origem humana são apresentadas nas SEQ ID NOS: 101-104. Análogos de insulina exemplificativos incluem aqueles apresentados nas SEQ ID NOS :147-149, 152, e aqueles contendo uma cadeia A apresentados nas SEQ ID NOS:150, 156, 158, 160, 162 e 164 e/ou uma cadeia B apresentados nas SEQ ID NOS: 151, 153-155, 157, 159, 161, 163 e 165. Polipéptidos de insulina incluem também quaisquer uns de origem não humana incluindo, mas não limitados a, quaisquer dos polipéptidos de precursor de insulina apresentados nas SEQ ID NOS:105-146. A referência a uma insulina inclui insulinas monoméricas e multiméricas, incluindo insulinas hexaméricas, bem como insulinas humanizadas.

Como aqui utilizado, "insulina de acção rápida" refere-se a qualquer insulina ou composição de insulina de acção rápida para administração aguda a um sujeito diabético em resposta a uma condição hiperglicémica real, percepcionada ou antecipada no sujeito resultante no momento, ou no período de cerca de quatro horas após, administração da insulina de acção rápida (tal como uma condição hiperglicémica prandial resultante, ou que se antecipa resultar, do consumo de uma refeição), pelo que a insulina de acção rápida é capaz de prevenir, controlar ou melhorar a condição hiperglicémica aguda. Tipicamente uma composição de insulina de acção rápida exibe níveis de insulina de pico às ou cerca de não mais do que quatro horas após administração subcutânea a um sujeito. Composições de insulina de acção rápida incluem insulinas recombinantes e insulinas isoladas (também referidas como insulinas "regulares") tais como insulina vendida como Humulin® R, insulinas porcinas e insulinas bovinas, bem como análogos de insulina concebidos para serem de acção rápida em virtude de modificações de aminoácidos. Preparações de insulina regular exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, insulinas regulares humanas, tais como as vendidas com as marcas comerciais Humulin® R, Novolin® R e Velosulin®, Insulina Humana, USP, e Injecção de Insulina Humana, USP, bem como formulações ácidas de insulina, tais como, por exemplo, Insulina Toronto, Insulina Old e Insulina Clear, e insulinas regulares de porco, tais como Iletin II® (insulina porcina). Análogos de insulina de acção rápida exemplificativos incluem, por exemplo, insulina lispro (e.g. insulina Humalog®) , insulina aspártico (e.g. insulina NovoLog®) e insulina glulisina (e.g. insulina Apidra®) e a composição de insulina de acção rápida vendida como VIAject® e VIAtab® (ver, e.g., Patente dos E.U.A. N.2 7279457) . Embora o termo "insulina de acção rápida" não abranja "insulinas de acção basal" as composições de insulina de acção super-rápida aqui descritas podem incluir opcionalmente, para além de uma insulina de acção rápida, uma ou mais insulinas de acção basal.

Como aqui utilizado, uma insulina humana refere-se a uma insulina que é sintética ou produzida de modo recombinante com base no polipéptido humano, incluindo variantes alélicas e seus análogos.

Como aqui utilizado, insulinas humanas de acção rápida ou composições de insulina humana de acção rápida incluem qualquer insulina humana ou composição de uma insulina humana que é de acção rápida, mas exclui insulinas não humanas, tais como insulina regular de porco.

Como aqui utilizados, os termos "insulinas de acção basal" ou "insulinas basais" referem-se a insulinas administradas para manter um nível de insulina basal como parte de um regime de tratamento global para tratar uma condição crónica tal como diabetes. Tipicamente, uma insulina de acção basal é formulada para manter um nível de insulina aproximadamente de estado estacionário pela libertação controlada de insulina quando administrada periodicamente (e.g. uma ou duas vezes ao dia) . Insulinas de acção basal incluem insulinas cristalinas (e.g. NPH e Lente®, insulina protamina, insulina surfen), análogos de insulina basal (insulina glargina, HOE 901, NovoSol Basal) e outras formulações químicas de insulina (e.g. goma-arábica, lecitina ou suspensões oleosas) que retardam a velocidade de absorção de insulina regular. Como aqui utilizadas, as insulinas de acção basal podem incluir insulinas que são tipicamente entendidas como de acção longa (tipicamente atingindo uma concentração de pico relativamente baixa, ao mesmo tempo possuindo uma duração de acção máxima durante cerca de 20-30 horas) ou de acção intermédia (tipicamente originando concentrações de insulina de pico a cerca de 4-12 horas após administração).

Como aqui utilizado, "composição de insulina de acção super-rápida" refere-se a uma composição de insulina contendo uma insulina de acção rápida e uma enzima de degradação de hialuronano (tal como uma hialuronidase solúvel incluindo, mas não limitada a, preparações de rHuPH20), tal que a composição de insulina, durante os primeiros quarenta minutos após administração parentérica a um sujeito, proporciona uma exposição a insulina sistémica cumulativa no sujeito que é maior do que exposição a insulina sistémica cumulativa proporcionada ao sujeito durante o mesmo período após administração da mesma dosagem da mesma insulina de acção rápida, pela mesma via, na ausência da enzima de degradação de hialuronano. A composição de insulina de acção super-rápida como aqui descrito pode incluir opcionalmente uma insulina de acção basal.

Como aqui utilizados, os termos "condição hiperglicémica" ou "hiperglicemia" referem-se a uma elevação indesejada da glicose no sangue.

Como aqui utilizados, os termos "condição hipoglicémica" ou "hipoglicemia" referem-se a uma queda indesejada da glicose no sangue.

Como aqui utilizados, "eliminação de glicose sistémica" ou "metabolismo de glicose sistémico" refere-se à remoção de glicose do sangue e pode ser expressa quer como uma velocidade (quantidade/tempo) quer como uma quantidade (quantidade durante um período de tempo). A eliminação de glicose sistémica pode ser determinada utilizando qualquer método adequado conhecido na especialidade. Por exemplo, a eliminação de glicose sistémica pode ser medida utilizando o procedimento de Clamp Hiperinsulinémico-Euglicémico sob condições de jejum, tal como aqui exemplificado e descrito, onde a quantidade ou taxa de glicose perfundida intravenosamente para manter níveis constantes de glicose no sangue, tal como, por exemplo, 90-110 mg/dL, é equivalente à eliminação de glicose sistémica. A diferença na eliminação de glicose sistémica conseguida por diferentes composições de insulina, tal como a diferença na eliminação de glicose sistémica conseguida por administração de uma composição de insulina de acção super-rápida versus a conseguida por uma insulina de acção rápida, pode por conseguinte ser determinada utilizando tais procedimentos. A diferença na eliminação de glicose sistémica entre insulinas comparadas pode também ser determinada por medição da actividade relativa de abaixamento da glicose das insulinas comparadas para um dado ponto temporal após o teste de desafio de glicose. Por exemplo, um teste de desafio de glicose (tal como, por exemplo, um teste de tolerância a 75 g de glicose oral ou uma formulação de refeição de teste normalizada, bem conhecidos dos peritos na especialidade) pode ser utilizado para comparar diferentes preparações de insulina. Nestes testes de desafio, uma quantidade de glicose ou outro carboidrato é administrada a um sujeito, imediatamente seguida por uma administração parentérica não intravenosa da composição de insulina. Os niveis de glicose no sangue (i.e., concentração de glicose no sangue do sujeito) são depois medidos a um tempo predeterminado para determinar o efeito de abaixamento no sangue da insulina. Nestas comparações de desafio oral entre várias preparações de insulina, o tempo decorrido após o qual os niveis de glicose no sangue são medidos tem de ser adequado para permitir a absorção sistémica da glicose. Os estudos acima descritos para determinar a eliminação de glicose sistémica podem ser realizados utilizando modelos animais e/ou sujeitos humanos.

Como aqui utilizado, controlo glicémico ou "controlo dos niveis de glicose no sangue" refere-se à manutenção de concentrações de glicose no sangue a um nivel desejado, tipicamente entre 70-130 mg/dL ou 90-110 mg/dL.

Como aqui utilizado, "exposição a insulina sistémica cumulativa" ou "exposição cumulativa sistémica a insulina" refere-se à quantidade de insulina que foi absorvida para o sangue após administração parentérica da insulina. A exposição cumulativa sistémica a insulina pode ser determinada calculando a área sob a curva para um período de tempo específico, onde a curva é gerada representando graficamente a concentração de insulina no sangue, soro ou plasma em função do tempo.

Como aqui utilizado, um sistema em circuito fechado é um sistema integrado para proporcionar controlo glicémico contínuo. Sistemas em circuito fechado contêm um mecanismo para medir a glicose no sangue, um mecanismo para entregar uma ou mais composições, incluindo uma composição de insulina, e um mecanismo para determinar a quantidade de insulina que é necessária entregar para conseguir controlo glicémico. Tipicamente, por conseguinte, sistemas em circuito fechado contêm um sensor de glicose, um dispositivo de entrega de insulina, tal como uma bomba de insulina, e um controlador que recebe informação do sensor de glicose e fornece comandos ao dispositivo de entrega de insulina. Os comandos podem ser gerados por software no controlador. 0 software inclui tipicamente um algoritmo para determinar a quantidade de insulina que é necessário entregar para conseguir controlo glicémico, com base nos níveis de glicose no sangue detectados pelo sensor de glicose ou antecipados pelo utilizador.

Como aqui utilizado, regime de doseamento refere-se à quantidade de insulina administrada e à frequência de administração. 0 regime de doseamento é uma função da doença ou condição a ser tratada, e assim pode variar.

Como aqui utilizado, uma enzima de degradação de hialuronano refere-se a uma enzima que catalisa a clivagem de um polímero de hialuronano (também referido como ácido hialurónico ou HA) em fragmentos de peso molecular mais pequeno. Enzimas de degradação de hialuronano exemplificativas são as hialuronidases e em particular as condroitinases e liases que têm a capacidade para despolimerizar o hialuronano. Condroitinases exemplificativas que são enzimas de degradação de hialuronano incluem, mas não estão limitadas a, condroitina ABC liase (também conhecida como condroitinase ABC) , condroitina AC liase (também conhecida como condroitina-sulfato-liase ou condroitina-sulfato-eliminase) e condroitina C liase. A condroitina ABC liase compreende duas enzimas, condroitina-sulfato-ABC-endoliase (EC 4.2.2.20) e condroitina-sulfato-ABC-exoliase (EC 4.2.2.21). Condroitina-sulfato-ABC-endoliases e condroitina-sulfato-ABC-exoliases exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, as de Proteus vulgaris e Flavobacterium heparinum (a condroitina-sulf ato-ABC-endoliase de Proteus vulgaris é apresentada na SEQ ID NO: 98; Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46). Enzimas condroitinase AC exemplificativas a partir de bactérias incluem, mas não estão limitadas a, as de Flavobacterium heparinum Victivallis vadensis, apresentada na SEQ ID NO:99 e Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1) :29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5) :387-444) . Enzimas condroitinase C exemplificativas a partir de bactérias incluem, mas não estão limitadas a, as Streptococcus e Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133).

Como aqui utilizado, hialuronidase refere-se a uma classe de enzimas de degradação de hialuronano. Hialuronidases incluem hialuronidases bacterianas (EC 4.2.2.1 ou EC 4.2.99.1), hialuronidases de sanguessugas, outros parasitas, e crustáceos (EC 3.2.1.36), e hialuronidases do tipo mamifero (EC 3.2.1.35). As hialuronidases incluem qualquer uma de origem não humana incluindo, mas não limitadas a, murina, canina, felina, leporina, aviária, bovina, ovina, porcina, equina, piscina, ranina, bacteriana, e qualquer uma de sanguessugas, outros parasitas, e crustáceos. Hialuronidases não humanas exemplificativas incluem, hialuronidases de vacas (SEQ ID NOS:10, 11, 64 e BH55 (Patentes dos E.U.A. N.os 5747027 e 5827721), vespa amarela (yellow jacket wasp) (SEQ ID NOS:12 e 13), abelha de mel (SEQ ID NO:14), vespão (white-face hornet (SEQ ID NO:15), vespa do papel (paper wasp) (SEQ ID NO:16), ratinho (SEQ ID NOS:17-19, 32), porco (SEQ ID NOS:20-21), rato (SEQ ID NOS :22-24, 31), coelho (SEQ ID NO:25), ovelha (SEQ ID NOS:26, 27, 63 e 65), orangotango (SEQ ID NO:28), macaco cinomolgo (SEQ ID NO:29), porquinho-da-india (SEQ ID NO:30), Arthrobacter sp. (estirpe FB24) (SEQ ID NO:67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO:68), Propionibacterium acnes (SEQ ID NO:69), Streptococcus agalactiae ((SEQ ID NO:70); 18RS21 (SEQ ID NO: 71) ; serotipo la (SEQ ID NO:72); serotipo III (SEQ ID NO:73), Staphylococcus aureus (estirpe COL) (SEQ ID NO:74); estirpe MRSA252 (SEQ ID NOS:75 e 76); estirpe MSSA476 (SEQ ID NO:77); estirpe NCTC 8325 (SEQ ID NO:78); estirpe bovina RF122 (SEQ ID NOS:7 9 e 80); estirpe USA300 (SEQ ID NO:81), Streptococcus pneumoniae ((SEQ ID NO:82); estirpe ATCC BAA-255 /R6 (SEQ ID NO:83); serotipo 2, estirpe D39 /NCTC 7466 (SEQ ID NO:84), Streptococcus pyogenes (serotipo Ml) (SEQ ID NO:85); serotipo M2, estirpe MGAS10270 (SEQ ID NO:86); serotipo M4, estirpe MGAS10750 (SEQ ID NO:87); serotipo M6 (SEQ ID NO:88); serotipo M12, estirpe MGAS2096 (SEQ ID NOS:89 e 90); serotipo M12, estirpe MGAS9429 (SEQ ID NO:91); serotipo M28 (SEQ ID NO:92); Streptococcus suis (SEQ ID NOS:93-95); Vibrio fischeri (estirpe ATCC 700601/ ES114 (SEQ ID NO:96)), e a enzima hialuronidase de Streptomyces hyaluronolyticus, que é especifica para ácido hialurónico e não cliva condroitina ou condroitina-sulfato (Ohya, T. e Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607). Hialuronidases incluem também as de origem humana. Hialuronidases humanas exemplificativas incluem HYAL1 (SEQ ID NO:36), HYAL2 (SEQ ID NO:37), HYAL3 (SEQ ID NO:38) , HYAL4 (SEQ ID NO:39) e PH20 (SEQ ID NO:1) . Entre as hialuronidases incluem-se também hialuronidases solúveis, incluindo, PH20 ovina e bovina, PH20 humana solúvel e rHuPH20 solúvel. Exemplos de hialuronidases solúveis de bovino ou ovino disponíveis comercialmente incluem Vitrase® (hialuronidase ovina) e Amphadase® (hialuronidase bovina). A referência a enzimas de degradação de hialuronano inclui polipéptidos precursores de enzima de degradação de hialuronano e polipéptidos maduros de enzima de degradação de hialuronano (tais como aqueles nos quais uma sequência de sinal foi removida), suas formas truncadas que têm actividade, e incluem variantes alélicas e variantes de espécie, variantes codificadas por variantes de montagem (splice), e outras variantes, incluindo polipéptidos que possuem pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência em relação aos polipéptidos precursores apresentados nas SEQ ID NOS: 1 e 10-48, 63-65, 67-100, ou a sua forma madura. Por exemplo, a referência a enzima de degradação de hialuronano inclui também as variantes de polipéptido precursor de PH20 humana apresentadas nas SEQ ID NOS :50-51. Enzimas de degradação de hialuronano incluem também aquelas que contêm modificações químicas ou pós-tradução e aquelas que não contêm modificações químicas ou pós-tradução. Estas modificações incluem, mas não estão limitadas a, peguilação, albuminação, glicosilação, farnesilação, carboxilação, hidroxilação, fosforilação, e outras modificações de polipéptido conhecidas na especialidade.

Como aqui utilizado, uma hialuronidase solúvel refere-se a um polipéptido caracterizado pela sua solubilidade sob condições fisiológicas. Hialuronidases solúveis podem-se distinguir, por exemplo, pela sua repartição na fase aquosa de uma solução de Triton X-114 aquecida a 37°C (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7). Hialuronidases ancoradas à membrana, tais como as ancoradas a lípido, repartir-se-ão na fase rica em detergente, mas repartir-se-ão na fase pobre em detergente ou aquosa após tratamento com Fosfolipase-C. Entre as hialuronidases solúveis incluem-se hialuronidases ancoradas à membrana nas quais uma ou mais regiões associadas à ancoragem da hialuronidase à membrana foram removidas ou modificadas, onde a forma solúvel mantém actividade de hialuronidase. Hialuronidases solúveis incluem hialuronidases solúveis recombinantes e aquelas contidas em ou purificadas a partir de origens naturais, tais como, por exemplo, extractos de testículo de ovinos ou bovinos. A PH20 humana solúvel é exemplificativa destas hialuronidases solúveis. Outras hialuronidases solúveis incluem PH20 ovina (SEQ ID NOS :27, 63, 65) e bovina (SEQ ID NOS:ll, 64).

Como aqui utilizados, PH20 humana solúvel ou sHuPH20 incluem polipéptidos maduros desprovidos da totalidade ou de uma porção do local de ligação de glicosilfosfatidilinositol (GPI) no terminal C tal que, após expressão, os polipéptidos são solúveis. Polipéptidos sHuPH20 exemplificativos incluem polipéptidos maduros possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS :4-9 e 47-48. Os precursores de polipéptido para estes polipéptidos de sHuPH20 exemplificativos incluem uma sequência de sinal. Exemplificativos dos precursores são aqueles apresentados nas SEQ ID NOS:3 e 40-46, cada um dos quais contém uma sequência de sinal de 35 aminoácidos nas posições de aminoácido 1-35. Polipéptidos de HuPH20 solúvel incluem também os degradados durante ou após os métodos de produção e purificação aqui descritos.

Como aqui utilizado, PH20 humana recombinante solúvel (rHuPH20) refere-se a uma forma solúvel de PH20 humana que é exprimida de modo recombinante em células de ovário de hamster chinês (CHO) . A rHuPH20 solúvel é codificada por ácido nucleico que inclui a sequência de sinal e é apresentado na SEQ ID NO :49. São também incluídas moléculas de ADN que são suas variantes alélicas e outras variantes solúveis. 0 ácido nucleico codificando rHuPH20 solúvel é expresso em células CHO que seqreqam o polipéptido maduro. Conforme produzido no meio de cultura, existe heterogeneidade no terminal C pelo que o produto inclui uma mistura de espécies que pode incluir qualquer uma ou mais das SEQ ID NOS: 4-9 em abundância variada. São também incluídas variantes alélicas correspondentes e outras variantes, incluindo aquelas correspondendo aos polipéptidos precursores de PH20 humana apresentados nas SEQ ID NOS:50-51. Outras variantes podem ter 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com qualquer das SEQ ID NOS :4-9 e 47-48 desde que mantenham a actividade de hialuronidase e sejam solúveis.

Como aqui utilizado, actividade refere-se a uma actividade ou actividades funcionais de um polipéptido ou sua porção associadas a uma proteína a todo o comprimento (completa). Actividades funcionais incluem, mas não estão limitadas a, actividade biológica, actividade catalítica ou enzimática, antigenicidade (capacidade para se ligar ou competir com um polipéptido pela ligação a um anticorpo anti-polipéptido), imunogenicidade, capacidade para formar multímeros e a capacidade para se ligar especificamente a um receptor ou ligando para o polipéptido.

Como aqui utilizada, actividade de hialuronidase refere-se à capacidade para catalisar enzimaticamente a clivagem de ácido hialurónico. O ensaio XXII da Farmacopeia dos E.U.A. (USP) para a hialuronidase determina a actividade de hialuronidase indirectamente por medição da quantidade de substrato de ácido hialurónico de peso molecular mais elevado, ou hialuronano, (HA), que permanece após se deixar a enzima reagir com o HA durante 30 min a 37°C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). Uma solução padrão de referência pode ser utilizada num ensaio para avaliar a actividade relativa, em unidades, de qualquer hialuronidase. São conhecidos na especialidade e são aqui descritos ensaios in vitro para determinar a actividade de hialuronidase de hialuronidases, tais como rHuPH20 solúvel. Ensaios exemplificativos incluem o ensaio de microtur- bidimetria descrito abaixo (ver e.g. Exemplo 3) que mede a clivagem de ácido hialurónico por hialuronidase indirectamente por detecção do precipitado insolúvel formado quando o ácido hialurónico não clivado se liga a albumina de soro. Podem ser utilizados padrões de referência, por exemplo, para gerar uma curva de calibração para determinar a actividade em Unidades da hialuronidase que está a ser testada.

Como aqui utilizado, "quantidade funcionalmente equivalente" ou suas variações gramaticais, na referência a uma enzima de degradação de hialuronano, refere-se à quantidade de enzima de degradação de hialuronano que consegue o mesmo efeito que uma quantidade (tal como um número conhecido de Unidades de actividade de hialuronidase) de uma enzima de referência, tal como uma hialuronidase. Por exemplo, a actividade de qualquer enzima de degradação de hialuronano pode ser comparada com a actividade de rHuPH20 para determinar a quantidade funcionalmente equivalente de uma enzima de degradação de hialuronano que conseguiria o mesmo efeito que uma quantidade conhecida de rHuPH20. Por exemplo, a capacidade de uma enzima de degradação de hialuronano para actuar como um agente de espalhamento ou difusão pode ser avaliada injectando a mesma na pele lateral de ratinhos com azul de tripano (ver e.g. Publicação da Patente dos E.U.A. No. 20050260186), e pode-se determinar a quantidade de enzima de degradação de hialuronano requerida para conseguir a mesma quantidade difusão que, por exemplo, 100 unidades de um Padrão de Referência de Hialuronidase. A quantidade de enzima de degradação de hialuronano requerida é, por conseguinte, funcionalmente equivalente a 100 unidades. Noutro exemplo, a capacidade de uma enzima de degradação de hialuronano para aumentar o nivel e a velocidade de absorção de uma insulina co-administrada pode ser avaliada em sujeitos humanos, tal como descrito abaixo no Exemplo 1, e pode-se determinar a quantidade de enzima de degradação de hialuronano requerida para conseguir o mesmo aumento no nivel e na velocidade de absorção de insulina que, por exemplo, a quantidade administrada de rHuPH20 (tal como por avaliação da concentração máxima de insulina no sangue (Cmax) , do tempo requerido para conseguir a concentração máxima de insulina no sangue (tmax) e da exposição a insulina sistémica cumulativa durante um dado período de tempo (AUC)).

Como aqui utilizado, os resíduos de -aminoácidos de ocorrência natural são os resíduos daqueles 20 -aminoácidos encontrados na natureza que são incorporados na proteína pelo reconhecimento específico da molécula de ARNt carregada com o seu codão de ARNm cognato em humanos.

Como aqui utilizado, ácidos nucleicos incluem ADN, ARN e seus análogos, incluindo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) e suas misturas. Os ácidos nucleicos podem ser de cadeia simples ou dupla. Quando se faz referência a sondas ou iniciadores, que estão opcionalmente marcados, tal como com um marcador detectável, tal como um marcador fluorescente ou radioactivo, são contempladas moléculas de cadeia simples. Estas moléculas têm tipicamente um comprimento tal que o seu alvo é estatisticamente único ou de número de cópias baixo (tipicamente menos do que 5, geralmente menos do que 3) para sondar ou iniciar uma biblioteca. Geralmente uma sonda ou iniciador contém pelo menos 14, 16 ou 30 nucleótidos contíguos de sequência complementar ou idêntica a um gene de interesse. Sondas e iniciadores podem ter 10, 20, 30, 50, 100 ou mais ácidos nucleicos de comprimento.

Como aqui utilizado, um péptido refere-se a um polipéptido que tem dois ou mais do que dois aminoácidos de comprimento e menos do que ou 40 aminoácidos de comprimento.

Como aqui utilizado, os aminoácidos que ocorrem nas várias sequências de aminoácidos aqui proporcionadas são identificados de acordo com as suas abreviaturas conhecidas três letras ou de uma letra (Tabela 1) . Os nucleótidos que ocorrem nos vários fragmentos de ácido nucleico são designados pelas designações padrão de uma única letra habitualmente utilizadas na especialidade.

Como aqui utilizado, um "aminoácido" é um composto orgânico contendo um grupo amino e um grupo ácido carboxílico.

Um polipéptido contém dois ou mais aminoácidos. Para os presentes propósitos, aminoácidos incluem os vinte aminoácidos de ocorrência natural, aminoácidos não naturais e análogos de aminoácido (i.e., aminoácidos onde o carbono possui uma cadeia lateral).

Como aqui utilizado, "resíduo de aminoácido" refere-se a um aminoácido formado por digestão química (hidrólise) de um polipéptido nas suas ligações peptídicas. Presume-se que os resíduos de aminoácido aqui descritos estão na forma isomérica "L" . Resíduos na forma isomérica "D", que são assim designados, podem ser utilizados em substituição de qualquer resíduo de L-aminoácido desde que a propriedade funcional desejada seja mantida pelo polipéptido. NH2 refere-se ao grupo amino livre presente no terminal amino de um polipéptido. COOH refere-se ao grupo carboxi livre presente no terminal carboxilo de um polipéptido. Em conformidade com nomenclatura padrão de polipéptidos descrita em J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968), e adoptada na 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, as abreviações para resíduos de aminoácido são apresentadas na Tabela 1:

É de notar que todas as sequências de resíduos de aminoácido aqui representadas por fórmulas têm uma orientação da esquerda para a direita no sentido convencional do terminal amino para o terminal carboxilo. Além disso, a frase "resíduo de aminoácido" está amplamente definida para incluir os aminoácidos listados na Tabela de Correspondência (Tabela 1) e aminoácidos modificados e não usuais, tais como os referidos em 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e aqui incorporados por referência. Adicionalmente, será de notar que um traço no início ou no fim de uma sequência de resíduos de aminoácido indica uma ligação peptídica a uma sequência adicional de um ou mais resíduos de aminoácido, a um grupo amino terminal tal como NH2 ou a um grupo carboxilo terminal tal como COOH.

Como aqui utilizado, "aminoácidos de ocorrência natural" referem-se aos 20 L-aminoácidos que ocorrem em polipéptidos.

Como aqui utilizado, "aminoácido não natural" refere-se a um composto orgânico que possui uma estrutura similar a um aminoácido natural mas que foi modificado estruturalmente para mimetizar a estrutura e reactividade de um aminoácido natural. Aminoácidos não de ocorrência natural incluem assim, por exemplo, outros aminoácidos ou análogos de aminoácidos que não os 20 aminoácidos de ocorrência natural e incluem, mas não estão limitadas a, os estereoisómeros D de aminoácidos. São aqui descritos aminoácidos não naturais exemplificativos e são conhecidos dos peritos na especialidade.

Como aqui utilizado, um constructo de ADN é uma molécula de ADN linear ou circular, de cadeia simples ou dupla, que contém segmentos de ADN combinados e justapostos de um modo não encontrado na natureza. Existem constructos de ADN como resultado de manipulação humana, e incluem clones e outras cópias de moléculas manipuladas.

Como aqui utilizado, um segmento de ADN é uma porção de uma molécula de ADN maior possuindo atributos especificados. Por exemplo, um segmento de ADN codificando um polipéptido especificado é uma porção de uma molécula de ADN mais comprida, tal como um plasmideo ou fragmento de plasmideo, que, quando lido no sentido 5' para 3', codifica a sequência de aminoácidos do polipéptido especificado.

Como aqui utilizado, o termo polinucleótido significa um polímero de cadeia simples ou dupla de bases de desoxirribonucleótidos ou de ribonucleótido lidas da extremidade 5' para a 3'. Os polinucleótidos incluem ARN e ADN, e podem ser isolados a partir de fontes naturais, sintetizados in vitro, ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. 0 comprimento de uma molécula de polinucleótido é aqui indicado em termos de nucleótidos (abreviado "nt") ou pares de bases (abreviado "pb") . 0 termo nucleótidos é utilizado para moléculas de cadeia simples e dupla onde o contexto o permita. Quando o termo é aplicado a moléculas de cadeia dupla é utilizado para denotar o comprimento global e será entendido como sendo equivalente ao termo pares de bases. Será reconhecido pelos peritos na especialidade que as duas cadeias de um polinucleótido de cadeia dupla podem diferir ligeiramente em comprimento e que as suas extremidades podem estar desencontradas; assim a totalidade dos nucleótidos numa molécula de polinucleótido de cadeia dupla podem não estar emparelhados. Em geral, estas extremidades não emparelhadas não excederão 20 nucleótidos de comprimento.

Como aqui utilizado, "similaridade" entre duas proteínas ou ácidos nucleicos refere-se ao relacionamento entre a sequência de aminoácidos das proteínas ou as sequências de nucleótidos dos ácidos nucleicos. A similaridade pode ser baseada no grau de identidade e/ou homologia de sequências de resíduos e dos resíduos aí contidos. Métodos para avaliar o grau de similaridade entre proteínas ou ácidos nucleicos são conhecidos dos peritos na especialidade. Por exemplo, num método para avaliar a similaridade de sequência, duas sequências de aminoácidos ou nucleótidos são alinhadas de um modo que resulta num nível máximo de identidade entre as sequências. "Identidade" refere-se à extensão na qual as sequências de aminoácidos ou nucleótidos são invariantes. 0 alinhamento de sequências de aminoácidos, e em certa medida de sequências de nucleótidos, pode também ter em consideração diferenças conservativas e/ou substituições frequentes em aminoácidos (ou nucleótidos). Diferenças conservativas são aquelas que preservam as propriedades físico-químicas dos resíduos envolvidos. Os alinhamentos podem ser globais (alinhamento das sequências comparadas ao longo de todo o comprimento das sequências e incluindo todos os resíduos) ou locais (o alinhamento de uma porção das sequências que inclui apenas a região ou regiões mais similares). "Identidade" per se tem um significado reconhecido na especialidade e pode ser calculada utilizando técnicas publicadas. (Ver, e.g.: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Embora existam vários métodos para medir a identidade entre dois polinucleótidos ou polipéptidos, o termo "identidade" é bem conhecido dos peritos na especialidade (Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988)).

Como aqui utilizado, homólogo (no que se refere a sequências de ácido nucleico e/ou aminoácidos) significa cerca de maior ou igual a 25% de homologia de sequência, tipicamente maior ou igual a 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de homologia de sequência; a percentagem exacta pode ser especificada se necessário. Para os presentes propósitos os termos "homologia" e "identidade" são muitas vezes utilizados intermutavelmente, a não ser que indicado de outro modo. Em geral, para determinação da percentagem de homologia ou identidade, as sequências são alinhadas de modo a obter a correspondência de ordem mais elevada (ver, e.g. ; Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed. , Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J. Applied Math. 48:1073) . Por homologia de sequência, o número de aminoácidos conservado é determinado por programas de algoritmos de alinhamento padrão, e podem ser utilizados com penalidades para lacunas por defeito estabelecidas por cada fornecedor. Moléculas substancialmente homólogas de ácido nucleico hibridizar-se-ão tipicamente a estringência moderada ou a estringência elevada ao longo de todo o comprimento do ácido nucleico de interesse. São também contempladas moléculas de ácido nucleico que contêm codões degenerados em vez de codões na molécula de ácido nucleico de hibridização.

Se quaisquer duas moléculas possuem sequências de nucleótidos ou sequências de aminoácidos que são pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% "idênticas" ou "homólogas" pode ser determinado utilizando algoritmos de computador conhecidos tais como o programa "FASTA", utilizando por exemplo, os parâmetros por defeito como em Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444 (outros programas incluem o pacote de programas GCG (Devereux, J., et ai., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al. , J. Molec. Biol. 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, e Carillo et al. (1988) SIAM J. Applied Math. 48:1073) . Por exemplo, a função BLAST da base de dados do National Center for Biotechnology Information pode ser utilizada para determinar a identidade. Outros programas disponíveis comercialmente ou publicamente incluem, o programa "MegAlign" da DNASTAR (Madison, WI) e o programa "Gap" do Genetics Computer Group da Universidade de Wisconsin (UWG) (Madison WI) . A percentagem de homologia ou identidade de proteínas e/ou moléculas de ácido nucleico pode ser determinada, por exemplo, por comparação da informação de sequência utilizando um programa de computador GAP (e.g., Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, conforme revisto por Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482) . Resumidamente, o programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (i.e., nucleótidos ou aminoácidos), que são similares, a dividir pelo número total de símbolos na mais curta das duas sequências. Parâmetros por defeito para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et ai. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, como descrita por Schwartz e Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358 (1979); (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna; e (3) nenhuma penalidade para lacunas na extremidade.

Deste modo, como aqui utilizado, o termo "identidade" ou "homologia" representa uma comparação entre um polipéptido ou polinucleótido de teste e um de referência. Como aqui utilizado, o termo pelo menos "90% idêntico a" refere-se a percentagens de identidade de 90 a 99,99 em relação à sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos do polipéptido de referência. Identidade a um nível de 90% ou mais é indicativa do facto de, para efeitos de exemplificação, se compararem um polipéptido de teste e um polipéptido de referência de 100 aminoácidos. Não mais de 10% (i.e., 10 em 100) dos aminoácidos no polipéptido de teste diferem dos do polipéptido de referência. Podem ser feitas comparações similares entre polinucleótidos de teste e de referência. Estas diferenças podem ser representadas como mutações pontuais distribuídas aleatoriamente ao longo de todo o comprimento de um polipéptido ou podem ser agrupadas em uma ou mais localizações de comprimento variado até ao máximo permissível, e.g. diferença de aminoácidos de 10/100 (aproximadamente 90% de identidade). As diferenças são definidas como substituições, inserções ou deleções de ácido nucleico ou aminoácidos. Ao nível de homologias ou identidades acima de cerca de 85-90%, o resultado deverá ser independente do programa e dos parâmetros de lacuna utilizados; estes níveis identidade elevados podem ser avaliados prontamente, muitas vezes por alinhamento manual sem recurso a um software.

Como aqui utilizado, uma sequência alinhada refere-se à utilização de homologia (similaridade e/ou identidade) para alinhar posições correspondentes numa sequência de nucleótidos ou aminoácidos. Tipicamente, alinham-se duas ou mais sequências que estão relacionadas por 50% ou mais de identidade. Um conjunto alinhado de sequências refere-se a 2 ou mais sequências que estão alinhadas em posições correspondentes e pode incluir o alinhamento de sequências derivadas de ARN, tais como EST e outros ADNc, alinhadas com uma sequência de ADN genómico.

Como aqui utilizado, "iniciador" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que pode actuar como um ponto de iniciação de síntese de ADN conduzida por molde sob condições apropriadas (e.g., na presença de quatro nucleósido-trifosfatos diferentes e de um agente de polimerização, tal como ADN-polimerase, ARN-polimerase ou transcriptase reversa) num tampão apropriado e a uma temperatura adequada. Será reconhecido que certas moléculas de ácido nucleico podem servir como uma "sonda" e como um "iniciador." Um iniciador, porém, possui um grupo hidroxilo 3' para extensão. Um iniciador pode ser utilizado numa variedade de métodos, incluindo, por exemplo, reacção em cadeia da polimerase (PCR), transcriptase reversa (RT)-PCR, PCR de ARN, LCR, PCR multiplex, PCR "panhandle", PCR de captura, PCR de expressão, RACE 3' e 5', PCR in situ, PCR mediada por ligação e outros protocolos de amplificação.

Como aqui utilizado, "par iniciador" refere-se a um conjunto de iniciadores que inclui um iniciador 5' (a montante) que se hibridiza com a extremidade 5' de uma sequência a ser amplificada (e.g. por PCR) e um iniciador 3' (a jusante) que se hibridiza com o complemento da extremidade 3' da sequência a ser amplificada.

Como aqui utilizado, "hibridiza-se especificamente" refere-se a hibridização (annealing) , por emparelhamento de bases complementares, de uma molécula de ácido nucleico (e.g. um oligonucleótido) com uma molécula de ácido nucleico alvo. Os peritos na especialidade estão familiarizados com parâmetros in vitro e in vivo que afectam a hibridização especifica, tais como o comprimento e a composição da molécula particular. Parâmetros particularmente relevantes para hibridização in vitro incluem adicionalmente a temperatura de hibridização (annealing) e lavagem, a composição do tampão e a concentração de sal. Condições de lavagem exemplificativas para remoção de moléculas não ligadas de ácido nucleico especificamente a estringência elevada são 0,1 x SSPE, 0,1% de SDS, 65°C, e a estringência média são 0,2 x SSPE, 0,1% de SDS, 50°C. Condições de estringência equivalentes são conhecidas na especialidade. A pessoa competente pode facilmente ajustar estes parâmetros para conseguir hibridização especifica de uma molécula de ácido nucleico a uma molécula apropriada de ácido nucleico alvo para uma aplicação particular. Complementar, quando se refere a duas sequências de nucleótidos, significa que as duas sequências de nucleótidos são capazes de se hibridizarem, tipicamente com menos de 25%, 15% ou 5% de desemparelhamentos entre nucleótidos opostos. Se necessário, a percentagem de complementaridade será especificada. Tipicamente as duas moléculas são seleccionadas tal que estas se hibridizarão sob condições de estringência elevada.

Como aqui utilizado, substancialmente idêntico a um produto significa suficientemente similar tal que a propriedade de interesse está suficientemente inalterada tal que o produto substancialmente idêntico pode ser utilizado em vez do produto.

Como aqui utilizados, é também entendido que os termos "substancialmente idêntico" ou "similar" variam com o contexto conforme entendido pelos peritos na especialidade relevante.

Como aqui utilizado, uma variante alélica ou variação alélica referencia quaisquer de duas ou mais formas alternativas de gene ocupando o mesmo locus cromossómico. Uma variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo fenotipico dentro de populações.

Mutações génicas podem ser silenciosas (numa alteração no polipéptido codificado) ou podem codificar polipéptidos possuindo uma sequência de aminoácidos alterada. 0 termo "variante alélica" é também aqui utilizado para denotar uma proteína codificada por uma variante alélica de um gene. Tipicamente a forma de referência do gene codifica uma forma do tipo selvagem e/ou uma forma predominante de um polipéptido a partir de uma população ou um único membro de referência de uma espécie. Tipicamente, variantes alélicas, que incluem variantes entre espécies e dentro da mesma espécie, possuem tipicamente pelo menos 80%, 90% ou maior identidade de aminoácidos com uma forma predominante e/ou do tipo selvagem da mesma espécie; o grau de identidade depende do gene e de se a comparação é inter-espécies ou intra-espécie. Geralmente, variantes alélicas intra-espécie possuem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade ou mais elevada com uma forma predominante e/ou do tipo selvagem, incluindo 96%, 97%, 98%, 99% ou identidade mais elevada com uma forma predominante e/ou do tipo selvagem de um polipéptido. A referência aqui a uma variante alélica refere-se geralmente a variações em proteínas entre membros da mesma espécie.

Como aqui utilizado, "alelo", que é aqui utilizado intermutavelmente com "variante alélica" refere-se a formas alternativas de um gene ou suas porções. Os alelos ocupam o mesmo locus ou posição sobre cromossomas homólogos. Quando um sujeito possui dois alelos idênticos de um gene, diz-se que o sujeito é homozigótico para esse gene ou alelo. Quando um sujeito possui dois alelos diferentes de um gene, diz-se que o sujeito é heterozigótico para esse gene. Alelos de um gene específico podem diferir um do outro num único nucleótido ou em vários nucleótidos, e podem incluir modificações tais como substituições, deleções e inserções de nucleótidos. Um alelo de um gene pode também ser uma forma de um gene contendo uma mutação.

Como aqui utilizado, variantes de espécie referem-se a variantes em polipéptidos entre espécies diferentes, incluindo espécies diferentes de mamífero, tais como ratinho e humano.

Como aqui utilizado, uma variante de montagem (splice) refere-se a uma variante produzida por processamento diferencial de um transcrito primário de ADN genómico que resulta em mais do que um tipo de ARNm.

Como aqui utilizado, modificação é em referência a modificação de uma sequência de aminoácidos de um polipéptido ou de uma sequência de nucleótidos numa molécula de ácido nucleico e inclui deleções, inserções e substituições de aminoácidos e nucleótidos, respectivamente. Métodos de modificação de um polipéptido são rotina para os peritos na especialidade, tais como por utilização de metodologias de ADN recombinante.

Como aqui utilizado, o termo promotor significa uma porção de um gene contendo sequências de ADN que proporcionam a ligação de ARN-polimerase e a iniciação da transcrição. Sequências de promotor são encontradas habitualmente, mas nem sempre, na região não codificante 5' de genes.

Como aqui utilizado, polipéptido ou proteína, isolados ou purificados, ou uma sua porção biologicamente activa, estão substancialmente isentos de material celular ou de outras proteínas contaminantes da célula ou tecido a partir dos quais a proteína é obtida, ou substancialmente isentos de precursores químicos ou de outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. Pode-se determinar se as preparações estão substancialmente isentas se estas parecerem isentas de impurezas facilmente detectáveis como determinado por métodos de análise padrão, tais como cromatografia de camada fina (TLC), electroforese em gel e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), utilizados pelos peritos na especialidade para avaliar esta pureza, ou suficientemente puras tal que a purificação adicional não irá alterar detectavelmente as propriedades físicas e químicas, tais como as propriedades enzimáticas e biológicas, da substância. Métodos para purificação dos compostos para produzir compostos substancialmente quimicamente puros são conhecidos dos peritos na especialidade. Um composto substancialmente quimicamente puro, porém, pode ser uma mistura de estereoisómeros. Nestes casos, a purificação adicional poderá aumentar a actividade específica do composto. 0 termo substancialmente isento de material celular inclui preparações de proteínas nas quais a proteína está separada de componentes celulares das células a partir das quais é isolada ou produzida de modo recombinante. Numa concretização, o termo substancialmente isento de material celular inclui preparações de proteínas enzimáticas possuindo menos do que cerca de 30% (em peso seco) de proteínas não enzimáticas (também aqui referidas como uma proteína contaminante), geralmente menos do que cerca de 20% de proteínas não enzimáticas ou 10% de proteínas não enzimáticas ou menos do que cerca de 5% de proteínas não enzimáticas. Quando a proteína enzimática é produzida de modo recombinante, esta está também substancialmente isenta de meio de cultura, i.e., o meio de cultura representa menos do que ou cerca de 20%, 10% ou 5% do volume da preparação de proteína enzimática.

Como aqui utilizado, o termo substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtos químicos inclui preparações de proteínas enzimáticas nas quais a proteína está separada de precursores químicos ou outros produtos químicos que estão envolvidos na síntese da proteína. O termo inclui preparações de proteínas enzimáticas possuindo menos do que cerca de 30% (em peso seco), 20%, 10%, 5% ou menos de precursores químicos ou produtos químicos ou componentes não enzimáticos.

Como aqui utilizado, sintético, com referência a, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico sintética ou um gene sintético ou um péptido sintético refere-se a uma molécula de ácido nucleico ou a uma molécula de polipéptido que é produzida por métodos recombinantes e/ou por métodos de síntese química.

Como aqui utilizado, produção por meios recombinantes por utilização de métodos de ADN recombinante significa a utilização dos métodos bem conhecidos de biologia molecular para exprimir proteínas codificadas por ADN clonado.

Como aqui utilizado, vector (ou plasmídeo) refere-se a elementos discretos que são utilizados para introduzir um ácido nucleico heterólogo no interior de células para a sua expressão ou replicação. Os vectores permanecem tipicamente epissómicos, mas podem ser desenhados para efectuar a integração de um gene ou de uma sua porção num cromossoma do genoma. São também contemplados vectores que são cromossomas artificiais, tais como cromossomas artificiais de levedura e cromossomas artificiais de mamífero. A selecção e utilização destes veículos são bem conhecidas dos peritos na especialidade.

Como aqui utilizado, um vector de expressão inclui vectores capazes de exprimirem ADN que está ligado operativamente a sequências reguladoras, tais como regiões de promotor, que são capazes de efectuar a expressão destes fragmentos de ADN. Estes segmentos adicionais podem incluir sequências de promotor e terminador, e podem incluir opcionalmente uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores seleccionáveis, um intensificador, um sinal de poliadenilação, e outros. Os vectores de expressão são geralmente derivados de ADN de plasmídeo ou virai, ou podem conter elementos de ambos. Assim, um vector de expressão refere-se a um constructo de ADN ou ARN recombinante, tal como a plasmídeo, um fago, vírus recombinante ou outro vector que, após introdução numa célula hospedeira apropriada, resulta em expressão do ADN clonado. Vectores de expressão apropriados são bem conhecidas dos peritos na especialidade e incluem aqueles que são replicáveis em células eucarióticas e/ou células procarióticas e aqueles que permanecem epissómicos ou aqueles que se integram no genoma da célula hospedeira.

Como aqui utilizado, vector inclui também "vectores de vírus" ou "vectores virais". Vectores virais são vírus transformados por engenharia que estão ligados operativamente a genes exógenos para transferir (como veículos ou vaivéns) os genes exógenos para o interior das células.

Como aqui utilizado, ligado operavelmente ou operativamente quando se referem segmentos de ADN significa que os segmentos estão dispostos tal que funcionam concertadamente para os seus propósitos pretendidos, e.g., a transcrição inicia-se a jusante do promotor e a montante de quaisquer sequências transcritas. 0 promotor é usualmente o domínio ao qual a maquinaria de transcrição se liga para iniciar a transcrição e prossegue através do segmento de codificação até ao terminador.

Como aqui utilizado, o termo avaliação pretende incluir determinação quantitativa e qualitativa no sentido de obter um valor absoluto para a actividade de uma protease, ou um seu domínio, presente na amostra, e também de obter um índice, razão, percentagem, visual ou outro valor indicativo do nível da actividade. A avaliação pode ser directa ou indirecta e não é necessário que as espécies químicas realmente detectadas sejam o próprio produto de proteólise mas podem ser, por exemplo, um seu derivado ou alguma outra substância. Por exemplo, detecção de um produto de clivagem de uma proteína de complemento, tal como por SDS-PAGE e coloração de proteína com Azul de Coomasie.

Como aqui utilizado, actividade biológica refere-se às actividades in vivo de um composto ou respostas fisiológicas que resultam da administração in vivo de um composto, composição ou outra mistura. Actividade biológica, deste modo, abrange efeitos terapêuticos e actividade farmacêutica destes compostos, composições e misturas. Actividades biológicas podem ser observadas em sistemas in vitro desenhados para testar ou utilizar estas actividades. Assim, para os presentes propósitos uma actividade biológica de uma protease é a sua actividade catalítica na qual um polipéptido é hidrolisado.

Como aqui utilizado, quando se referem duas sequências de ácidos nucleicos, equivalente significa que as duas sequências em questão codificam a mesma sequência de aminoácidos ou proteínas equivalentes. Quando se utiliza equivalente com referência a duas proteínas ou péptidos, isto significa que as duas proteínas ou péptidos possuem substancialmente a mesma sequência de aminoácidos apenas com substituições de aminoácidos que não alteram substancialmente a actividade ou função da proteína ou péptido. Quando equivalente se refere uma propriedade, a propriedade não necessita de estar presente na mesma extensão (e.g., dois péptidos podem exibir velocidades diferentes do mesmo tipo de actividade enzimática), mas as actividades são usualmente substancialmente as mesmas.

Como aqui utilizados, "modular" e "modulação" ou "alterar" referem-se a uma modificação de uma actividade de uma molécula, tal como uma proteína. Actividades exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, actividades biológicas, tais como transdução de sinal. Modulação pode incluir um aumento na actividade (i.e., regulação ascendente ou actividade agonista), uma diminuição na actividade (i.e., regulação descendente ou inibição) ou qualquer outra alteração numa actividade (tal como uma alteração em periodicidade, frequência, duração, cinética ou outro parâmetro). Modulação pode ser dependente do contexto e tipicamente modulação é comparada a um estado designado, por exemplo, à proteína do tipo selvagem, à proteína num estado constitutivo ou à proteína conforme expressa num tipo de célula ou condição designada.

Como aqui utilizado, uma composição refere-se a qualquer mistura. Pode ser uma solução, suspensão, líquido, pó, pasta, aquosa, não aquosa ou qualquer sua combinação.

Como aqui utilizado, uma combinação refere-se a qualquer associação entre ou dentre dois ou mais itens. A combinação pode ser dois ou mais itens distintos, tais como duas composições ou duas colecções, pode ser uma sua mistura, tal como uma mistura única dos dois ou mais itens, ou qualquer sua variação. Os elementos de uma combinação estão geralmente funcionalmente associados ou relacionados.

Como aqui utilizados, "doença ou perturbação" referem-se a uma condição patológica num organismo resultante de uma causa ou condição incluindo, mas não limitadas a, infecções, condições adquiridas, condições genéticas, e caracterizadas por sintomas identificáveis. Doenças e perturbações aqui de interesse são as que envolvem componentes da ECM.

Como aqui utilizado, "tratamento" de um sujeito com uma doença ou condição significa que os sintomas do sujeito são parcialmente ou totalmente aliviados, ou permanecem estáticos após o tratamento. Deste modo tratamento abrange profilaxia, terapia e/ou cura. Profilaxia refere-se à prevenção de uma doença potencial e/ou a prevenção do agravamento de sintomas ou progressão de uma doença. 0 tratamento abrange também qualquer utilização farmacêutica de uma composição de insulina de acção super-rápida aqui proporcionada.

Como aqui utilizado, um agente farmaceuticamente eficaz, inclui qualquer agente terapêutico ou agentes bioactivos, incluindo, mas não limitados a, por exemplo, anestésicos, vasoconstritores, agentes dispersantes, fármacos terapêuticos convencionais, incluindo fármacos de moléculas pequenas e proteínas terapêuticas.

Como aqui utilizado, tratamento significa qualquer modo em que sintomas de uma condição, perturbação ou doença, ou outra indicação, são amenizados ou de outro modo alterados beneficamente.

Como aqui utilizado, um efeito terapêutico significa um efeito resultante do tratamento de um sujeito que altera, tipicamente melhora ou ameniza os sintomas de uma doença ou condição ou que cura uma doença ou condição. A quantidade terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade de uma composição, molécula ou composto que resulta num efeito terapêutico após administração a um sujeito.

Como aqui utilizado, o termo "sujeito" refere-se a um animal, incluindo um mamífero, tal como um ser humano.

Como aqui utilizado, um paciente refere-se a um sujeito humano exibindo sintomas de uma doença ou perturbação.

Como aqui utilizado, amenização dos sintomas de uma doença ou perturbação particular por um tratamento, tal como por administração de uma composição farmacêutica ou outro agente terapêutico, refere-se a qualquer diminuição, seja permanente ou temporária, duradoura ou transitória, dos sintomas que podem ser atribuídos ou associados à administração da composição ou agente terapêutico.

Como aqui utilizados, prevenção ou profilaxia referem-se a métodos nos quais o risco de desenvolver doença ou condição é reduzido.

Como aqui utilizado, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "dose terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de um agente, composto, material ou composição contendo um composto que é pelo menos suficiente para produzir um efeito terapêutico. Deste modo, é a quantidade necessária para prevenir, curar, amenizar, deter ou deter parcialmente um sintoma de uma doença ou perturbação.

Como aqui utilizado, uma dosagem de insulina terapeuticamente eficaz é uma quantidade de insulina requerida ou suficiente para conseguir controlo glicémico. Esta quantidade pode ser determinada empiricamente, tal como por desafio de glicose ou de refeição. As composições aqui proporcionadas contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz ou concentração de insulina tal que são administradas dosagens terapeuticamente eficazes.

Como aqui utilizada, forma de dose unitária refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas para sujeitos humanos e animais e embaladas individualmente como é conhecido na especialidade.

Como aqui utilizado, uma formulação de dosagem única refere-se a uma formulação para administração directa.

Como aqui utilizado, um "artigo de fabricação" é um produto que é produzido e vendido. Como utilizado ao longo deste pedido de patente, o termo pretende abranger uma composição de insulina de acção rápida e uma composição de enzima de degradação de hialuronano contidas no mesmo ou em artigos de embalagem separados.

Como aqui utilizado, fluido refere-se a qualquer composição que pode fluir. Fluidos abrangem assim composições que estão na forma de semi-sólidos, pastas, soluções, misturas aquosas, géis, loções, cremes e outras destas composições.

Como aqui utilizado, um "kit" refere-se a uma combinação de composições aqui proporcionadas e a outro item para um propósito incluindo, mas não limitado a, reconstituição, activação, instrumentos/dispositivos para entrega, administração, diagnóstico e avaliação de uma actividade ou propriedade biológica. Kits incluem opcionalmente instruções para utilização.

Como aqui utilizado, um extracto ou lisado celular referem-se a uma preparação ou fracção que é preparada a partir de uma célula lisada ou rompida.

Como aqui utilizado, animal inclui qualquer animal, tal como, mas não limitado a primatas incluindo humanos, gorilas e macacos; roedores, tais como ratinhos e ratos; galináceos, tais como frangos; ruminantes, tais como cabras, vacas, veado, ovelha; ovino, tais como porcos e outros animais. Animais não humanos excluem humanos como o animal contemplado. As enzimas aqui proporcionadas são de qualquer origem, animal, planta, procariótica e fúngica. Muitas enzimas são de origem animal, incluindo origem mamífera.

Como aqui utilizado, um controlo refere-se a uma amostra que é substancialmente idêntica à amostra de teste, excepto que não é tratada com um parâmetro de teste, ou, se é uma amostra de plasma, esta pode ser de um voluntário normal não afectado com a condição de interesse. Um controlo pode também ser um controlo interno.

Como aqui utilizadas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem as referências plurais a não ser que o contexto claramente indique de outro modo. Assim, por exemplo, referência a um composto, compreendendo "um domínio extracelular" inclui compostos com um ou com uma pluralidade de domínios extracelulares.

Como aqui utilizados, intervalos e quantidades podem ser expressos como "cerca de" um valor particular ou intervalo. Cerca de inclui também a quantidade exacta. Assim "cerca de 5 bases" significa "cerca de 5 bases" e também "5 bases".

Como aqui utilizado, "opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circunstância subsequentemente descritos ocorre ou não ocorre, e que a descrição inclui situações onde o referido evento ou circunstância ocorre e situações onde este não ocorre. Por exemplo, um grupo opcionalmente substituído significa que o grupo está não substituído ou está substituído.

Como aqui utilizadas, as abreviações para quaisquer grupos protectores, aminoácidos e outros compostos, estão, a não ser que indicado de outro modo, de acordo com as suas abreviações reconhecidas, de utilização comum, ou da IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (ver, (1972) Biochemistry 11:1726). B. COMPOSIÇÕES DE INSULINA DE ACÇÃO "SUPER-RÁPIDA" São aqui proporcionadas composições de insulina de acção super-rápida. As composições de insulina de acção super-rápida são obtidas por combinação, antes, ou no momento de administração, de uma insulina de acção rápida e de uma enzima de degradação de hialuronano. São também descritos métodos e utilizações da composição de insulina de acção super-rápida para tratar as mesmas doenças e condições para as quais as insulinas de acção rápida têm até agora sido indicadas, por exemplo, diabetes mellitus para o controlo de hiperglicemia e outras doenças e condições. Insulinas de acção rápida (por exemplo insulina lispro Humalog® e insulina Humulin® R) não mimetizam adequadamente o pico de insulina endógena da primeira fase de libertação de insulina prandial. Constata-se agora que por combinação de uma insulina de acção rápida com uma enzima de degradação de hialuronano, os métodos, composições e combinações aqui descritos proporcionam uma composição de insulina de acção super-rápida que mimetiza mais aproximadamente uma libertação endógena de insulina pós-prandial (i.e., natural) de um sujeito não diabético. 1. Visão global de insulina, diabetes e terapias existentes de insulina de acção rápida A insulina é uma hormona de polipéptido de ocorrência natural segregada pelo pâncreas. A insulina é requerida pelas células do corpo para eficazmente assimilar e utilizar a glicose a partir do sangue. A glicose é o substrato de energia predominante para realizar funções celulares. Para além de ser o modulador principal da homeostasia de carboidratos, a insulina tem efeitos no metabolismo das gorduras. Pode alterar a capacidade do figado e do tecido adiposo, entre outras, para libertar reservas de gordura. A insulina tem vários efeitos farmacodinâmicos através do corpo incluindo, mas não limitados a, aumento na síntese de lípidos, redução na quebra de lípidos, aumento na síntese de proteínas, regulação de enzimas chave e processos no metabolismo de glicose (incluindo estimulação da absorção de glicose, estimulação da oxidação de glicose, síntese de glicogénio aumentada e quebra de glicogénio reduzida).

Ainda que a insulina seja segregada basalmente, usualmente na gama de 0,5 a 1,0 unidades por hora, os seus níveis são aumentados após uma refeição. Após uma refeição, o pâncreas segrega um bólus de insulina em resposta a um aumento da glicose. A insulina estimula a absorção de glicose pelas células, e dá sinal ao fígado para reduzir a produção de glicose; isto resulta num retorno da glicose no sangue para os níveis normais. Em adultos normais, existem duas fases de libertação de insulina em resposta a uma refeição. A fase precoce é um pico de libertação de insulina que ocorre dentro de 2-15 minutos da ingestão de alimentos. A libertação de fase tardia prolonga-se cerca de 2 horas. A fase precoce é responsável por parar a produção de glicose hepática, reduzindo por isso os níveis de glicose no sangue e sensibilizando ou sinalizando os tecidos periféricos para aumentar a absorção de glicose. No músculo, grandes quantidades de glicose são armazenadas como glicogénio. Algum do glicogénio é quebrado em lactato, que circula para o fígado e pode ser convertido de volta em glicose e armazenado como glicogénio. Entre refeições o fígado quebra estas reservas de glicogénio para fornecer glicose ao cérebro e a outros tecidos. A diabetes resulta em hiperglicemia crónica devido à incapacidade ou capacidade reduzida do pâncreas para produzir quantidades adequadas de insulina ou devido à incapacidade ou capacidade reduzida das células para sintetizar e/ou libertar a insulina requerida. Nos diabéticos, a eficácia da primeira fase de resposta acima descrita está diminuída ou ausente, conduzindo a elevados níveis de glicose pós-prandial. Por exemplo, a área sob a curva (AUC) da glicose no sangue durante as primeiras quatro horas pós-prandiais (i.e. primeiras quatro horas após ingestão de alimentos), é 2,5 a 3,0 vezes mais elevada em diabéticos do que em não diabéticos. As excursões de glicose pós-prandial contribuem para hiperglicemia global e para níveis elevados de HbAlc, e estas excursões são os principais contribuintes para as elevações de HbAlc observadas em estádios iniciais de diabetes Tipo 2.

Muitos pacientes diabéticos requerem tratamento com insulina quando o pâncreas produz quantidades inadequadas de insulina, ou não pode utilizar a insulina que produz, para manter um controlo glicémico adequado. A insulina tem sido administrada como um agente terapêutico para tratar pacientes com diabetes, incluindo, por exemplo, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 e diabetes gestacional, de modo a mimetizar a resposta de insulina endógena que ocorre em indivíduos normais. Tem também sido administrada insulina a pacientes criticamente doentes com hiperglicemia para controlar os níveis de glicose no sangue. São utilizadas diferentes fontes de insulinas dependendo da necessidade do paciente. As preparações comerciais de insulina podem ser classificadas dependendo da sua duração de actividade (ver e.g., DeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. Em Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (págs. 481-500) McGraw-Hill Professional). Por exemplo, a insulina é proporcionada em formulações de acção rápida, e também como formulações de acção intermédia ou lenta, as últimas duas classificações sendo aqui referidas como insulinas de acção basal. As formas de acção rápida têm um início de acção rápido, tipicamente exibindo níveis de insulina de pico em 2-3 horas ou menos, e não mais do que quatro horas. Deste modo, formas de insulina de acção rápida são utilizadas na regulação da glicose prandial. Outras formas de insulina incluem acção intermédia, que atingem uma concentração de pico de insulina a aproximadamente 4-12 horas após administração subcutânea, e insulinas de acção lenta que atingem um pico relativamente modesto e têm uma duração de acção máxima de 20-30 horas. As formas de acção intermédia e lenta são frequentemente compostas de preparações de insulina amorfa e/ou cristalina, e são utilizadas predominantemente em terapias basais. O objectivo da administração prandial de composições de insulina de acção rápida é atingir um nível estável de glicose no sangue ao longo do tempo por administração parentérica da insulina de acção rápida antes, durante ou logo após o momento da refeição. Deste modo, os níveis de insulina no sangue são temporariamente elevados para (a) parar a produção de glicose hepática e (b) aumentar a absorção de glicose; mantendo assim o controlo glicémico durante a elevação na glicose no sangue associada à digestão da refeição.

Insulina humana recombinante (e.g., insulina Humulin® R) é utilizada para auto-administração por injecção antes do momento da refeição. Infelizmente, a insulina humana recombinante tem de ser doseada por injecção aproximadamente meia hora ou mais antes do momento da refeição de modo a assegurar que um aumento da glicose no sangue não ocorre sem oposição por níveis de insulina exógena. Uma das razões para a absorção lenta de insulina humana recombinante é porque a insulina forma complexos hexaméricos na presença de iões zinco tanto in vivo como in vitro. Estes complexos hexaméricos contendo zinco são mais estáveis do que a insulina monomérica desprovida de zinco. Após injecção subcutânea, estes hexâmeros de insulina têm de se dissociar em dímeros mais pequenos ou monómeros antes de poderem ser absorvidos através de leitos capilares e passarem para a circulação sistémica. A dissociação de hexâmeros em dímeros e monómeros é dependente da concentração, ocorrendo apenas a concentrações mais baixas à medida que a insulina se difunde a partir do local de injecção. Assim, existe um depósito de insulina local no sítio de injecção após administração de insulina subcutânea, proporcionando uma concentração inicial elevada de insulina hexamérica no local de injecção que não pode ser absorvida até a concentração de insulina diminuir (Soeborg et ai., (2009) Eur. J. Pharm. Sei. 36:78-90) . À medida que a insulina se difunde lentamente a partir do local de injecção, a concentração de insulina diminui à medida que a distância desde o local de injecção aumenta, resultando em dissociação dos hexâmeros e absorção dos monómeros e dímeros de insulina. Assim, ainda que a dispersão de complexos de insulina hexaméricos ocorra naturalmente no corpo, isto pode demorar algum tempo a ocorrer, retardando a disponibilidade sistémica de insulina. Adicionalmente, por causa desta absorção dependente da concentração, concentrações de insulina mais elevadas e doses mais elevadas são absorvidas mais lentamente (Soeborg et ai., (2009) Eur. J. Pharm. Sei. 36:78-90).

Uma vez que a insulina em forma monomérica é absorvida mais rapidamente, enquanto insulinas no estado hexamérico são mais estáveis, têm sido desenvolvidas formas análogas de insulina de acção rápida que exibem uma dissociação mais rápida da forma hexamérica para monomérica após administração subcutânea. Estas insulinas estão modificadas, tal como por alteração de aminoácidos, para aumentar a velocidade de dissociação, conferindo por isso uma actividade farmacodinâmica mais rápida após injecção. Como descrito na Secção C, formas análogas de insulina de acção rápida incluem mas não estão limitadas a, insulina glulisina, insulina aspártico, e insulina lispro.

Formas de insulinas de acção rápida, incluindo análogos de acção rápida, têm um atraso na absorção e na acção, e deste modo não se aproximam da insulina endógena que tem uma fase precoce que ocorre cerca de 10 minutos após a ingestão de alimentos. Assim, estas formulações não actuam rapidamente o suficiente para parar a produção de glicose hepática que ocorre pouco tempo após esta primeira fase de libertação de insulina. Por esta razão, mesmo as preparações de análogo de insulina de acção rápida têm de ser dadas antes das refeições de modo a conseguir qualquer hipótese de controlo glicémico desejado. Ainda que seja mais fácil estimar o momento da ingestão de alimentos em 15 minutos do que em 30-60 minutos requeridos para a insulina regular, existe um risco de um paciente poder comer demasiado cedo ou demasiado tarde para proporcionar um melhor controlo da glicose no sangue.

Adicionalmente, um dos principais efeitos secundários do tratamento com qualquer terapia de insulina, incluindo terapias de insulina de acção rápida, é a hipoglicemia. A hipoglicemia é definida como glicose baixa no sangue e está associada a uma variedade de morbilidades que podem variar desde a fome até sintomas mais incómodos tais como tremores, suores, confusão ou tudo até convulsões, coma e morte. A hipoglicemia pode ocorrer devido a não comer o suficiente, falhar refeições, fazer mais exercício do que habitual ou tomar demasiada insulina ou utilizar uma preparação de insulina prandial que tem uma duração de exposição e uma acção inapropriadamente longa. Por exemplo, uma vez que muitas terapias de insulina de acção rápida têm de ser dadas antes de uma refeição, existe um risco de um paciente poder renunciar ou falhar a refeição, conduzindo a hipoglicemia.

Adicionalmente, após administração de uma insulina de acção rápida, os niveis de insulina no soro e a acção de insulina (medida, por exemplo, como a taxa de perfusão de glicose (GIR)) permanecem tipicamente elevados após a carga de glicose prandial diminuir, ameaçando a hipoglicemia. Tentativas para melhor controlar as cargas de glicose de pico por aumento da dose de insulina aumentam adicionalmente este perigo. Também, porque a hipoglicemia pós-prandial é um resultado comum da terapia de insulina, isto origina ou requer muitas vezes que os pacientes comam entre refeições. Isto contribui para o ganho de peso e para a obesidade frequentemente associada a terapias de insulina. 2. Farmacodinâmica e farmacocinética de uma composição de insulina de acção super-rápida

Constatou-se aqui que a combinação de uma insulina de acção rápida e de uma enzima de degradação de hialuronano resulta numa absorção aumentada da insulina de acção rápida, resultando numa elevação mais rápida da concentração de insulina no sangue (i.e. velocidade de absorção mais rápida) e acção farmacológica. Assim, a combinação de uma insulina de acção rápida e de uma enzima de degradação de hialuronano resulta numa composição de insulina de acção super-rápida capaz de efectuar uma elevação rápida da glicose no sangue após administração bólus parentérica (i.e., não intravenosa) (tal como por exemplo administração parentérica através de vias de administração subcutânea (SC), intramuscular (IM), intraperitoneal (IP) ou intradérmica (ID).

Apesar de não se estar vinculado a uma qualquer teoria, a combinação de uma insulina de acção rápida e de uma enzima de degradação de hialuronano pode resultar em absorção aumentada da insulina de acção rápida, em comparação com quando a insulina é administrada sozinha, devido a uma alteração no mecanismo de dispersão após administração subcutânea. Tipicamente, a presença de hialuronano de peso molecular elevado proporciona uma barreira ao fluxo de fluido em massa após injecção subcutânea de insulina sozinha. Assim, como descrito acima, a insulina é dispersa a partir do local de injecção por mecanismos mediados por difusão. À medida que a insulina se dispersa a partir do local de injecção, a concentração diminui, facilitando a dissociação de hexâmeros de insulina em monómeros e dimeros, que são pequenos o suficiente para serem absorvidos através de leitos capilares. Assim, para ser absorvida após injecção subcutânea, a insulina tem primeiro que ser dispersa a partir do local de injecção para criar as concentrações de insulina suficientemente baixas para facilitar a dissociação e, consequentemente, a absorção. No entanto, quando a insulina é co-administrada com uma enzima de degradação de hialuronano, tal como, por exemplo, uma hialuronidase solúvel, o hialuronano é degradado pela enzima de degradação de hialuronano, possibilitando o fluxo de fluido em massa, que é rapidamente dispersa proporcional ao gradiente de pressão (ou condutividade hidráulica). À pressão fisiológica, por exemplo, uma hialuronidase solúvel tal como rHuPH20 gera um aumento aproximado de 20 vezes na condutância hidráulica. Assim, quando co-administrada com uma enzima de degradação de hialuronano, a insulina é rapidamente dispersa de um modo mediado por convexão após degradação da barreira de hialuronano. Esta absorção rápida de insulina quando co-administrada subcutaneamente com enzima de degradação de hialuronano pode resultar em propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas melhoradas da insulina em comparação com quando a insulina é administrada sozinha.

Por exemplo, como aqui proporcionado, a composição de insulina de acção super-rápida é absorvida mais rapidamente como demonstrado por uma redução de tmax, Cmax aumentada e exposição a insulina sistémica cumulativa que é especialmente pronunciada durante os primeiros 40 minutos. Este perfil farmacocinético melhorado é reflectido num tempo de inicio e numa duração do efeito de insulina mais curtos. Isto pode ser exemplificado por medidas farmacodinâmicas, tais como por velocidades de perfusão de glicose em experiências de clamp euglicémico tal como está descrito no Exemplo 1. Assim, uma composição de insulina de acção super-rápida é mais rapidamente absorvida do que a insulina de acção rápida correspondente. Interessantemente, como apresentado nas Figuras 1 e 2, as composições de insulina de acção super-rápida contendo uma enzima de degradação de hialuronano exibem uma absorção acelerada tanto de insulinas regulares de acção rápida como de análogos de insulina de acção rápida resultando e perfis farmacodinâmicos (PD) e farmacocinéticos (PK) similares, ainda que o análogo de insulina de acção rápida seja substancialmente mais rápido do que insulina regular de acção rápida sem a enzima de degradação de hialuronano. Assim, composições de insulina de acção super-rápida exibem perfis farmacodinâmicos (PD) e farmacocinéticos (PK) similares, independentemente de ser incluído na composição um análogo de insulina de acção rápida ou uma insulina regular de acção rápida. Esta similaridade é particularmente surpreendente nos primeiros 40 a 60 minutos após administração (ver e.g., Figuras 1 e 2) . Deste modo, uma vantagem adicional da composição de insulina de acção super-rápida é uma capacidade para conseguir perfis farmacocinéticos e farmacodinâmicos comparáveis nos primeiros 40 a 60 minutos após administração, sem ter em consideração se a insulina de acção rápida é uma insulina regular de acção rápida (e.g., insulina Humulin® R) ou um análogo de acção rápida (tal como insulina lispro Humalog®, insulina aspártico Novalog® ou insulina glulisina Apidra®) . Em alguns casos, tal como quando a insulina de acção rápida na composição de insulina de acção super-rápida é um análogo de insulina de acção rápida, em vez de uma insulina regular, a absorção da insulina de acção rápida quando administrada com a enzima de degradação de hialuronano (i.e. como uma composição de insulina de acção super-rápida) é mais rápida do que a mais rápida das insulinas de acção rápida sozinha. Isto pode-se manifestar em si mesmo, por exemplo, como tmax diminuído e exposição aumentada a insulina sistémica cumulativa, particularmente durante os primeiros 40 minutos. A farmacocinética da composição de insulina de acção super-rápida difere da insulina de acção rápida correspondente em vários aspectos importantes. Primeiro, o perfil de concentração de insulina no sangue em função do tempo sofre um desvio para um perfil de concentrações mais elevadas em momentos mais precoces (ver por exemplo, Figura 1) . Esta velocidade de aparecimento de insulina na circulação sistémica é descrita como uma velocidade de absorção, para se distinguir da velocidade de remoção da circulação sistémica, que é descrita como a velocidade de eliminação. Composições de insulina de acção super-rápida têm uma velocidade de absorção mais elevada, resultando em maior exposição precoce, do que a insulina de acção rápida correspondente. Além disso, porque a enzima de degradação de hialuronano está a actuar transientemente e localmente no local de administração, a velocidade de eliminação da composição de insulina de acção super-rápida e a sua potência uma vez na circulação não são materialmente diferentes da insulina de acção rápida correspondente. Aumentado a velocidade de absorção ao mesmo tempo mantendo a mesma velocidade de eliminação, a concentração máxima de insulina no sangue (Cmax) é também aumentada para uma composição de insulina de acção super-rápida em relação à insulina de acção rápida correspondente. Assim, a mesma quantidade total de insulina disponível sistemicamente é distribuída de modo diferente em função do tempo para uma composição de insulina de acção super-rápida em relação à insulina de acção rápida correspondente, tal que, após administração parentérica de uma composição de insulina de acção super-rápida, uma fracção maior da exposição a insulina sistémica cumulativa ocorre nos pontos temporais mais precoces e uma fracção menor da exposição a insulina sistémica cumulativa ocorre nos pontos temporais mais tardios, em comparação com uma insulina que é meramente de acção rápida. Este desvio na velocidade de absorção possibilita à composição de insulina de acção super-rápida mimetizar mais aproximadamente a resposta de insulina endógena do corpo ao pico nos níveis de glicose no sangue que ocorre após consumo de uma refeição.

Um segundo parâmetro farmacocinético independente, a fracção da dose administrada que alcança a circulação sistémica, também difere da composição de insulina de acção super-rápida em relação à insulina de acção rápida correspondente. Para certas insulinas de acção rápida, a maior parte da dose administrada está biodisponível sistemicamente, e por conseguinte apenas pode existir um pequeno aumento incremental para a composição de acção super-rápida correspondente. No entanto, para outras insulinas de acção rápida, tais como insulina regular (por exemplo insulina Humulin® R) , o aumento em biodisponibilidade pode ser significativo. A biodisponibilidade relativa de uma composição de insulina de acção super-rápida como aqui descrita em relação à sua insulina de acção rápida correspondente é descrita pela razão dos valores de exposição sistémica total (AUCo-infinito) das duas composições após administrações parentéricas não IV idênticas.

Um outro aspecto importante das composições de insulina de acção super-rápida diz respeito à capacidade para conseguir a melhoria em parâmetros farmacodinâmicos medem a resposta fisiológica à insulina disponível sistemicamente. Porque as composições de insulina de acção super-rápida aqui descritas têm a mesma potência farmacológica após atingirem a circulação sistémica que a insulina de acção rápida correspondente, os perfis farmacocinéticos melhorados oferecidos pelas composições de insulina de acção super-rápida (como discutido acima) resultam em mudanças benéficas nos parâmetros farmacodinâmicos que medem a resposta fisiológica à insulina disponível sistemicamente. Por exemplo, a velocidade de perfusão de glicose (GIR) medida quando se administra insulina a sujeitos num procedimento de clamp euglicémico representa um parâmetro farmacodinâmico uma vez que mede a velocidade de administração de glicose intravenosa em função do tempo requerida para manter uma concentração alvo estacionária de glicose no sangue. Em virtude da vantagem farmacocinética de uma velocidade de absorção mais elevada conseguida por uma composição de insulina de acção super-rápida comparada com a insulina de acção rápida correspondente, a composição de insulina de acção super-rápida é capaz de desviar o perfil de GIR (uma medida da resposta fisiológica à insulina) no sentido de velocidades de perfusão mais elevadas (i.e., resposta fisiológica mais elevada) em tempos mais precoces. Para aquelas composições de insulina de acção super-rápida onde existe também um aumento significativo na biodisponibilidade sistémica relativa, pode-se observar um aumento adicional na resposta de GIR, ainda que a GIR total seja uma função tanto da distribuição dos níveis de insulina em função do tempo como da dose sistémica administrada.

As farmacocinéticas e farmacodinâmicas oferecidas pelas composições de insulina de acção super-rápida aqui descritas conduzem a um número de utilizações importantes. Em primeiro lugar, ao desviar as respostas PK e PD para tempos mais precoces, pode ser produzida uma resposta de insulina mais natural para a composição de acção super-rápida para controlar os níveis de glicose pós-prandial do que é possível com composição de insulina de acção rápida correspondente sozinha. A resposta de insulina natural do corpo inclui não só (a) uma descarga natural de insulina nos primeiros 10-15 minutos sinalizando a paragem da libertação de glicose hepática e proporcionando concentrações mínimas de glicose no sangue entre refeições; mas também (b) uma exposição total a insulina durante cerca de 2 horas, que é ajustada à composição de carboidrato da refeição por ajustamento da libertação de insulina para a circulação sistémica em função dos níveis de glicose através de uma interacção complexa de respostas hormonais, incluindo respostas de células beta a níveis de metabolitos sistémicos (predominantemente glicose) e hormonas de incretina que potenciam a secreção de insulina quando o tracto intestinal sente a presença de materiais nutrientes. Por se ter uma maior fracção de exposição a insulina disponível sistemicamente a ocorrer durante os primeiros 10-15 minutos, a composição de insulina de acção super-rápida é melhor capaz de sinalizar a paragem da libertação de glicose hepática (similar à resposta de insulina prandial endógena do corpo) em comparação com a composição de insulina de acção rápida correspondente. Além disso, as composições de insulina de acção super-rápida aqui descritas são também melhor capazes de mimetizar o controlo natural de glicose pós-prandial, por se ter uma maior fracção de exposição a insulina disponível sistemicamente durante os primeiros 2 horas e uma redução correspondente na exposição a insulina após 2 horas. Níveis de insulina elevados que ocorrem mais de 2 horas após administração podem resultar num metabolismo de glicose aumentado quando a absorção de glicose pós-prandial está completa, uma situação que conduz a níveis baixos de glicose no sangue ou hipoglicemia. Adicionalmente, porque as composições de insulina de acção super-rápida têm um início de acção similar ao da resposta de insulina natural, estas composições podem ser administradas no momento da refeição, enquanto muitas composições de insulina de acção rápida (por exemplo, insulina Humulin® R) são administradas 30-60 minutos antes de uma refeição, o que introduz um risco de hipoglicemia se o sujeito se atrasar ou falhar a refeição pretendida. Assim, através da combinação de exposição a insulina aumentada durante os primeiros 15 minutos, e exposição a insulina diminuída após 2 horas, as composições de insulina de acção super-rápida são melhor capazes de controlar os níveis de glicose pós-prandial do que as composições de insulina de acção rápida correspondentes.

Insulinas de acção rápida são administradas tipicamente numa vasta gama de doses como determinado pelo médico ou outro prestador qualificado de cuidados de saúde dependendo de muitos factores incluindo os níveis de glicose reais, o sujeito, o tipo de diabetes e a composição da refeição. Tipicamente, estas doses de insulina de acção rápida podem estar na gama de 0,05 Unidades/kg a 2 Unidades/kg. Devido à sua farmacocinética e farmacodinâmica, as composições de insulina de acção super-rápida podem ser administradas com doses mais baixas em comparação com a insulina de acção rápida administrada na ausência de uma enzima de degradação de hialuronano. O grau em que a quantidade de uma insulina de acção rápida pode ser diminuída, por administração da mesma como uma composição de insulina de acção super-rápida, varia dependendo, por exemplo, do tipo de diabetes que o paciente tem. Tipicamente, a redução na quantidade de insulina de acção rápida administrada a pacientes diabéticos Tipo 2, quando administrada como uma composição de insulina de acção super-rápida, é maior do que a redução na quantidade de insulina de acção rápida administrada a pacientes diabéticos Tipo 1, quando administrada como uma composição de insulina de acção super-rápida. Por exemplo, em situações onde a um paciente diabético Tipo 1 e a um paciente diabético Tipo 2 são administrados a cada um 0,20 U/kg de insulina de acção rápida para controlar os níveis de glicose pós-prandial, ao paciente diabético Tipo 1 podem ser administrados 0,15 U/kg de insulina de acção rápida numa composição de insulina de acção super-rápida para conseguir o mesmo ou melhor controlo glicémico, e ao paciente diabético Tipo 2 podem ser administrados 0,10 U/kg de insulina de acção rápida numa composição de insulina de acção super-rápida para conseguir o mesmo ou melhor controlo glicémico. Assim, em alguns exemplos, é aqui contemplado que a quantidade de uma insulina de acção rápida que é administrada a um paciente diabético Tipo 2 para conseguir controlo glicémico pode ser reduzida em, por exemplo, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ou mais quando administrada com uma enzima de degradação de hialuronano como uma composição de insulina de acção super-rápida em comparação com a quantidade requerida para controlo glicémico quando administrada sem uma enzima de degradação de hialuronano, e a quantidade de uma insulina de acção rápida que é administrada a um paciente diabético Tipo 1 para conseguir controlo glicémico pode ser reduzida em, por exemplo, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou mais quando administrada com uma enzima de degradação de hialuronano como uma composição de insulina de acção super-rápida em comparação com a quantidade requerida para controlo glicémico quando administrada sem uma enzima de degradação de hialuronano.

Sem querer estar vinculado por uma qualquer teoria, a maior redução na dose de insulina de acção rápida para pacientes diabéticos Tipo 2 em comparação com pacientes diabéticos Tipo 1, quando a insulina é administrada com uma enzima de degradação de hialuronano como uma composição de insulina de acção super-rápida, é um reflexo dos diferentes perfis glicémicos pós-prandiais de pacientes Tipo 1 e Tipo 2, e da capacidade da insulina de acção super-rápida para mimetizar mais aproximadamente a libertação de insulina de primeira fase natural em sujeitos saudáveis. A diabetes Tipo 2 desenvolve-se como resultado de uma função de célula comprometida, resistência à insulina e/ou secreção de insulina comprometida. Estes pacientes carecem da libertação de insulina de fase precoce que ocorre em minutos após um desafio de glicose, tal como uma refeição, mas ainda libertam lentamente insulina ao longo do tempo. Em contraste, pacientes diabéticos Tipo 1 não produzem qualquer insulina e assim carecem de libertação de insulina da primeira e da segunda fase, a última das quais é mantida em sujeitos saudáveis até o controlo glicémico ser conseguido. Assim, porque os diabéticos Tipo 2 geralmente apenas requerem terapia de insulina principalmente para tratar a hiperglicemia pós-prandial, um problema a ser ultrapassado em terapia de insulina prandial nestes diabéticos é a ocorrência de hipoglicemia. A hipoglicemia pode resultar se a própria secreção de insulina retardada e/ou basal do sujeito estiver associada ao efeito de diminuição de glicose de qualquer insulina exógena em excesso que permanece após o pico prandial ter sido aliviado. Ao longo do tempo, ocorrências repetidas destes episódios hipoglicémicos pós-prandiais podem contribuir para ganho de peso e obesidade. A farmacocinética e farmacodinâmica das insulinas de acção rápida são tais que a dose que é necessária para conseguir uma concentração de insulina apropriada no sangue, de modo suficientemente rápido para diminuir os niveis de glicose imediatamente após a digestão de uma refeição (i.e. uma dose que cobre a libertação de insulina fase precoce natural), é uma que resulta em excesso de insulina a circular no sangue após digestão e diminuição dos niveis de glicose pós-prandial. Deste modo, pacientes diabéticos Tipo 2 recebem doses de insulina que cobrem mais do que apenas a fase precoce de libertação de insulina. As composições de insulina de acção super-rápida aqui proporcionadas mimetizam mais aproximadamente a resposta de insulina endógena. Assim, a diabéticos Tipo 2 pode-se administrar uma composição de insulina de acção super-rápida numa dose que apenas cobre a primeira fase de libertação de insulina, enquanto a diabéticos Tipo 1 pode ser administrada uma composição de insulina de acção super-rápida numa dose que cobre todas as fases de libertação de insulina.

Assim, outra utilização das composições de insulina de acção super-rápida aqui proporcionadas é reduzir os efeitos secundários de ganho de peso e obesidade associados a terapia insulina de acção rápida. A magnitude deste efeito secundário é cerca de ou é proporcional à dose de insulina administrada. Como descrito acima, composições de insulina de acção super-rápida podem proporcionar controlo glicémico equivalente a partir de doses mais baixas de insulina de acção rápida do que as composições de acção rápida correspondentes, por exemplo, através de uma combinação da maior biodisponibilidade e da maior fracção de exposição a insulina sistémica cumulativa durante as primeiras 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5 ou 2 horas após administração. Ainda que pacientes diabéticos Tipo 1 e Tipo 2 possam experimentar ganho de peso como resultado de terapia de insulina, pacientes com diabetes Tipo 2 estão em risco particular de ganho de peso, conduzindo a obesidade. Diabéticos Tipo 2 carecem de libertação de insulina de primeira fase, mas ainda libertam lentamente insulina ao longo do tempo. Como resultado, nos estádios precoces da doença, os niveis de insulina endógena de diabéticos Tipo 2 são demasiado baixos no inicio de uma refeição e demasiado elevados após digestão da refeição. Na ausência da libertação de insulina de primeira fase, o figado não recebe o sinal para parar de produzir glicose. O figado continua a produzir glicose num momento quando o corpo começa a produzir nova glicose através da digestão da refeição, resultando em hiperglicemia. Entre duas e três horas após uma refeição, a glicose no sangue de um diabético não tratado torna-se tão elevada que o pâncreas recebe um sinal para segregar uma grande quantidade de insulina. Num paciente com diabetes Tipo 2 precoce, o pâncreas pode ainda responder e segregar esta grande quantidade de insulina. Isto ocorre no momento quando a digestão está quase terminada e os niveis de glicose no sangue deverão começar a cair. Esta grande quantidade de insulina tem dois efeitos prejudiciais. Em primeiro lugar, coloca uma exigência indevida a um pâncreas já comprometido, o que pode conduzir à sua deterioração mais rápida e eventualmente tornam o pâncreas incapaz de produzir insulina. Em segundo lugar, demasiada insulina após digestão pode contribuir para o ganho de peso, o que pode exacerbar adicionalmente o estado da doença. Quando a pacientes com diabetes Tipo 2 se administra uma insulina de acção rápida para controlar a hiperglicemia pós-prandial, como descrito acima, um excesso de insulina pode permanecer após a digestão. Assim, pacientes diabéticos Tipo 2 que recebem terapia de insulina podem ter demasiada insulina após digestão, o que pode conduzir a hipoglicemia e a ganho de peso resultante. A administração das composições de insulina de acção super-rápida aqui proporcionadas para controlar a hiperglicemia pós-prandial reduz o risco de ganho de peso e a obesidade em pacientes diabéticos. As composições de insulina de acção super-rápida podem conter as doses mais baixas de insulina de acção rápida.

Para conseguir controlo glicémico, a insulina de acção rápida em composições de insulina de acção super-rápida poderá ser administrada com 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% do nivel que a insulina de acção rápida teria de ser administrada se a enzima de degradação de hialuronano não estivesse presente. Assim, por exemplo, a quantidade de insulina de acção rápida administrada numa composição de acção super-rápida é tipicamente, ou é cerca de, 0,05 U/kg, 0,06 U/kg, 0,07 U/kg, 0,08 U/kg, 0,09 U/kg, 1,0 U/kg, 1,1 U/kg, 1,2 U/kg, 1,3 U/kg, 1,4 U/kg, 1,5 U/kg, 1,6 U/kg, 1,7 U/kg, 1,8 U/kg, 1,9 U/kg ou 2,0 U/kg. Em virtude de doses mais baixas, a duração de acção destas insulinas pode ser diminuída para minimizar o potencial de hipoglicemia tardia que ocorre devido à concentração elevada de insulina no plasma que se prolonga durante várias horas. Assim, é de esperar que um inicio de acção mais rápido da composição de insulina de acção super-rápida, que mimetiza mais rapidamente o pico de insulina endóqena da libertação de insulina prandial de primeira fase, proporcione beneficio clinico no que se refere a um melhor controlo glicémico e menos ganho de peso em pacientes com diabetes mellitus.

Adicionalmente, por proporcionar uma velocidade de absorção aumentada, composições de insulina de acção super-rápida como aqui descritas podem proporcionar um ciclo de retroalimentação mais curto, entre o efeito da insulina administrada e o efeito nos níveis de glicose observados, do que as composições de insulina de acção rápida correspondentes, e por conseguinte são melhor capazes de mimetizar a regulação natural de níveis de glicose pós-prandial. Assim, a farmacocinética modificada de uma composição de insulina de acção super-rápida beneficia também o desempenho da "bomba de insulina" existente e a tecnologia de monitorização contínua da glicose (GCM). Encurtando o tempo entre uma injecção bólus de insulina pós-prandial e uma resposta glicémica sistémica, o controlo mais apertado dos níveis de glicose a partir de injecções subcutâneas repetidas mais pequenas de insulina com GCM poderá "fechar o ciclo" numa bomba de insulina/dispositivo de monitorização de glicose (i.e. sistema em circuito fechado ou pâncreas artificial).

As composições de insulina de acção super-rápida, sejam estas proporcionadas como uma única mistura, ou como preparações separadas, de insulina de acção rápida e de enzima de degradação de hialuronano, podem conter ingredientes adicionais para proporcionar propriedades físicas ou químicas desejadas. Por exemplo, uma solução injectável pode conter um ou mais modificadores de tonicidade para proporcionar uma solução aproximadamente isotónica, e um solvente aquoso titulado até pH neutro com um ácido ou base e possivelmente com um componente de tamponamento de pH. Formulações de insulina de acção rápida incluem muitas vezes Zn e um conservante antimicrobiano fenólico tal como m-cresol para as estabilizar estruturalmente num estado hexamérico mais estável. Quelantes de metal, tais como EDTA, podem ser utilizados para ajustar a velocidade de dissociação destes hexâmeros, e outros metais divalentes tais como cálcio podem estar presentes para tamponar a capacidade de quelação. Enzimas de degradação de hialuronano requerem muitas vezes componentes adicionais para proporcionar estabilidade fisica e química, incluindo mas não limitados a surfactantes, consumidores de oxigénio, sais, aminoácidos e poliálcoois.

Composições de insulina de acção super-rápida podem ser apresentadas como um kit de dois recipientes separados, um contendo uma composição de insulina de acção rápida e o outro contendo composição de enzima de degradação de hialuronano, para co-administração sequencial (por qualquer ordem) ou concorrente; ou como um kit contendo um único recipiente contendo uma mistura de uma composição de insulina de acção rápida e de uma composição de enzima de degradação de hialuronano. Se a insulina de acção rápida e a enzima de degradação de hialuronano são co-administradas, a referida co-administração pode ser sequencial por qualquer ordem (por exemplo a enzima de degradação de hialuronano é administrada antes da insulina de acção rápida pelo que a enzima de degradação de hialuronano degrada o hialuronano no local de injecção antes da administração da insulina de acção rápida); ou a co-administração da insulina de acção rápida e da enzima de degradação de hialuronano pode ser concorrente. As composições de insulina de acção rápida e de enzima de degradação de hialuronano podem ser formuladas (em conjunto ou separadamente) como um sólido para injecção após reconstituição com um diluente apropriado, como soluções injectáveis, ou como suspensões injectáveis.

As secções seguintes descrevem insulinas de acção rápida e enzimas solúveis de degradação de hialuronano exemplificativas utilizadas nas composições de insulina de acção super-rápida aqui descritas, métodos de preparação das mesmas, e utilização das mesmas para tratar doenças e condições para as quais se utilizam insulinas de acção rápida correntes.

C. POLIPÉPTIDOS DE INSULINA E FORMULAÇÕES A insulina é um polipéptido composto de 51 resíduos de aminoácido que tem 5808 daltons de peso molecular. É produzida nas células beta dos ilhéus de Langerhans no pâncreas. Uma insulina humana exemplificativa é traduzida como um polipéptido precursor de 110 aminoácidos, pré-pró-insulina (SEQ ID NO:101), contendo um péptido de sinal de 24 aminoácidos para ER, a sequência de sinal é clivada, resultando em pró-insulina (SEQ ID NO:102). A molécula de pró-insulina é subsequentemente convertida numa insulina madura por acções de enzimas proteoliticas, conhecidas como convertases de pró-hormona (PCI e PC2), e por acções da exoprotease carboxipeptidase E. Isto resulta na remoção de 4 resíduos de aminoácido básicos e no péptido C ou cadeia de ligação de 31 aminoácidos (correspondente aos resíduos aminoácido 57 a 87 do polipéptido pré-pró-insulina apresentado na SEQ ID NO:101). A insulina resultante contém uma cadeia A de 21 aminoácidos (correspondente aos resíduos aminoácido 90 a 110 do polipéptido pró-insulina apresentado na SEQ ID NO:102) e uma cadeia B de 30 aminoácidos (correspondente aos resíduos aminoácido 1 a 30 do polipéptido pró-insulina apresentado na SEQ ID NO:102), que estão reticuladas por ligações dissulfureto. Tipicamente, a insulina madura contém três pontes de dissulfureto: uma entre a posição 7 da cadeia A e a posição 7 da cadeia B, uma segunda entre a posição 20 da cadeia A e a posição 19 da cadeia B, e uma terceira entre as posições 6 e 11 da cadeia A. A sequência da cadeia A de uma insulina madura é apresentado na SEQ ID NO: 103 e a sequência da cadeia B é apresentada na SEQ ID NO:104.

Referência a insulina inclui polipéptidos pré-pró-insulina, pró-insulina e insulina em formas de cadeia simples ou de duas cadeias, suas formas truncadas que têm actividade, e inclui variantes alélicas e de espécie, variantes codificadas por variantes de splice e outras variantes, tais como análogos de insulina ou outras formas derivatizadas, incluindo polipéptidos que possuem pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência em relação ao polipéptido precursor apresentado na SEQ ID NO:101 ou a sua forma madura, desde que a insulina se ligue ao receptor de insulina humana para iniciar uma cascata de sinalização que resulta num aumento de absorção e armazenamento de glicose e/ou numa diminuição da produção de glicose endógena. Por exemplo, insulinas incluem variantes de espécie de insulina. Estas incluem, mas não estão limitadas a, insulinas derivadas de bovino (apresentada na SEQ ID NO:133) e porcino (SEQ ID NO:123) . A insulina bovina difere da insulina humana nos aminoácidos 8 e 10 da cadeia A, e no aminoácido 30 da cadeia B. A insulina porcina difere apenas da insulina humana no aminoácido 30 na cadeia B onde, tal como na sequência bovina, existe uma substituição de alanina em vez de treonina. Outras variantes de espécie exemplificativas de insulina são apresentadas em qualquer das SEQ ID NOS: 105-146. Entre as variantes de insulina são também incluídos análogos de insulina que contêm uma ou mais modificações de aminoácido em comparação com uma insulina humana apresentada nas SEQ ID NO: 103 e 104 (cadeias A e B) . Análogos de insulina exemplificativos (cadeias A e B), incluindo formas de análogo de acção rápida e de acção mais longa, são apresentadas na SEQ ID NOS:147-165, 182-184). Por exemplo, análogos de insulina incluem, mas não estão limitados a, glulisina (LysB3, GluB29; apresentada na SEQ ID NO:103 (cadeia A) e SEQ ID NO:149 (cadeia B) ) , HMR-1 153 (LysB3, IleB28; apresentada na SEQ ID NO:103 (cadeia A) e SEQ ID NO:182 (cadeia B) ) , HMR-1423 (GlyA21, HisB31, HisB32; apresentada na SEQ ID NO:183 (cadeia A) e SEQ ID NO:184 (cadeia B)), insulina aspártico (AspB28; apresentada na SEQ ID NO:103 (cadeia A) e SEQ ID NO:147 (cadeia B) ) , e insulina lispro (LysB28, ProB29; apresentada na SEQ ID NO:103 (cadeia A) e SEQ ID NO:148 (cadeia B)). Em cada caso acima, a nomenclatura dos análogos é baseada numa descrição da substituição de aminoácido nas posições específicas na cadeia A ou na cadeia B de insulina, numeradas a partir do terminal N da cadeia, nos quais o restante da sequência é o da insulina humana natural.

Qualquer dos polipéptidos de insulina acima incluem aqueles que são produzidos pelo pâncreas a partir de qualquer espécie, tal como um humano, e incluem também insulinas que são produzidas sinteticamente ou utilizando técnicas recombinantes. Por exemplo, como aqui descrito noutro local, a insulina pode ser produzida biossinteticamente por expressão de genes sintéticos para as cadeias A e B de insulina, por expressão da pró-insulina completa e exposição da mesma aos métodos enzimáticos e químicos apropriados para gerar uma insulina madura, ou por expressão das cadeias A e B ligadas por um péptido ligador (ver e.g., DeFelippis et ai. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. Em Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (págs. 481-500) McGraw-Hill Professional) .

As insulinas incluem também formas monoméricas e oligoméricas, tais como formas hexaméricas. A insulina pode existir como um monómero uma vez que este circula no plasma, e também se liga ao seu receptor enquanto numa forma monomérica. A insulina, porém, tem uma propensão para se associar em dímeros e, na presença de iões de metal tais como Zn2+, pode prontamente associar-se em estruturas de ordem mais elevada tais como hexâmeros. Existem dois locais de ligação simétricos de elevada afinidade para Zn2+, ainda que tenham também sido noticiados outros locais de ligação de zinco mais fracos (ver e.g., DeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetis. Em Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (págs. 481-500) McGraw-Hill Professional). A auto-associação é importante para a estabilidade da molécula para prevenir a degradação química e a desnaturação física. Assim, em vesículas de armazenamento em células pancreáticas beta, a insulina existe como um hexâmero. Após libertação para o espaço extracelular, porém, crê-se que os hexâmeros de insulina podem experimentar uma alteração em pH para condições mais neutras e os hexâmeros contendo iões zinco são diluídos, o que desestabiliza o hexâmero. Podem existir outras razões contribuindo para a desestabilização do hexâmero de insulina no espaço extracelular. A insulina é assim predominantemente encontrada no sangue como um monómero. Para tirar vantagem dos efeitos de estabilização, muitas formulações comerciais de insulina contêm iões zinco em quantidades suficientes para promover a auto-associação em hexâmeros. A estrutura hexamérica, contudo, retarda a velocidade de absorção destas formulações após administração subcutânea.

Como discutido na Secção B, a insulina é utilizada como um agente terapêutico para controlo glicémico, tal como em pacientes diabéticos. Existem vários tipos de formulações de insulina, dependendo de se a insulina está a ser administrada para controlar a glicose para terapia basal, para terapia prandial ou para uma sua combinação. As formulações de insulina podem ser proporcionadas apenas como formulações de acção rápida, apenas como formulações de acção basal (i.e., formas de acção intermédia e/ou acção lenta), ou as suas misturas (ver e.g., Tabela 2) . Tipicamente, as misturas contêm uma insulina de acção rápida e uma insulina de acção intermédia ou lenta. Por exemplo, insulinas de acção rápida podem ser combinadas com uma insulina NPH (uma insulina de acção intermédia exemplificativa como descrito abaixo) em várias proporções de mistura incluindo 10:90, 20:80, 30:70, 40:60 e 50:50. Estas preparações pré-misturadas podem reduzir o número de injecções de insulina diárias proporcionando convenientemente ambas as exigências de insulina relacionadas com a refeição e basal numa única formulação. Deste modo, as formulações de composição de insulina de acção super-rápida aqui descritas incluem aquelas que opcionalmente podem proporcionar uma insulina de acção basal.

Geralmente, qualquer preparação de insulina inclui um polipéptido de insulina ou uma sua variante (i.e. análogo), e difere apenas nas outras substâncias que constituem a formulação. Assim, é a especificidade da formulação que pode influenciar a duração de acção dos diferentes tipos de insulina. Exemplos de substâncias incluídas em preparações de insulina incluem, mas não estão limitadas a, agentes de estabilização tais como zinco, tampão de pH, um modificador de tonicidade tal como glicerina; um agente conservante/antimicrobiano tal como m-cresol; e protamina ou outro agente de precipitação ou libertação controlada. Além disso, como aqui proporcionado, podem também ser preparadas preparações de insulina contendo cálcio e um quelante de metal tal como EDTA ou EGTA. Qualquer uma ou mais das substâncias acima podem ser adicionadas a um polipéptido de insulina, tal como numa composição de insulina de acção super-rápida. Os componentes específicos adicionados, e as suas quantidades, influenciam o tipo de insulina, a sua duração de acção, a sua absorção e biodisponibilidade e, deste modo, a sua aplicação.

Por exemplo, muitas preparações de insulina contêm na formulação um ião de metal, tal como zinco, o que estabiliza a insulina por promover a auto-associação da molécula. A auto-associação em formas hexaméricas pode afectar a absorção de insulina após administração. Deste modo, a proporção destes agentes estabilizantes, e a adição de EDTA ou EGTA a insulina, permite modulação e controlo adicionais da absorção e biodisponibilidade de insulina, por exemplo, influenciando a prevalência da estrutura de ordem mais elevada presente no polipéptido. Geralmente, preparações de insulina regular que são de acção rápida contêm zinco numa quantidade que é ou é cerca de 0,01-0,04 mg/100 Unidades. Estudos químicos têm revelado que a solubilidade de insulina é grandemente determinada pelo teor em zinco e pela natureza do tampão no qual este está suspenso. Assim, algumas formulações de insulina basal de acção mais lenta são preparadas por precipitação de insulina a partir de um tampão de acetato (em vez de fosfato) pela adição de zinco. Cristais grandes de insulina com elevado teor em zinco, quando recolhidos e de novo suspensos numa solução de acetato de sódio-cloreto de sódio (pH 7,2 a 7,5), são lentamente absorvidos após injecção subcutânea e exercem uma acção de longa duração. Esta preparação de cristais é denominada suspensão de insulina-zinco prolongada (insulina ultralenta). Outras preparações de insulina contendo zinco incluem, por exemplo, insulinas semilentas (suspensões de insulina-zinco prontas), insulinas lentas (suspensões de insulina-zinco), que diferem predominantemente na concentração de zinco utilizada. Preparações de insulina contendo zinco incluem também aquelas que são modificadas por protamina, tais como insulina NPH.

Noutro exemplo, um agente de precipitação, tal como protamina, pode ser adicionado a um polipéptido de insulina para gerar uma suspensão microcristalina. Tipicamente, as insulinas cristalinas têm uma duração de acção prolongada em comparação com insulinas que não existem em forma cristalina. Uma insulina de protamina-zinco, quando injectada subcutaneamente numa suspensão aquosa, dissolve-se apenas lentamente no local de deposição, e a insulina é absorvida a uma velocidade retardada. A insulina de protamina-zinco em suspensão tem sido grandemente substituída por suspensão de insulina-isofano, também conhecida como insulina NPH. É uma insulina de protamina-zinco em suspensão modificada que é cristalina. As concentrações de insulina, protamina e zinco são assim estabelecidas tal que a preparação tenha um início e uma duração de acção intermédia entre as de insulina regular e de insulina de protamina-zinco em suspensão.

Adicionalmente, diferenças de pH nas preparações também influenciam o tipo e as propriedades da insulina. As preparações de insulina regular originais eram preparadas a um pH de 2,8 a 3,5, porque de outro modo formariam partículas para gamas de pH mais elevado. Preparações de insulina altamente purificadas, porém, podem ser preparadas numa gama de valores de pH. Também, o tamponamento da preparação de insulina permite à insulina ser preparada numa solução numa gama de pH mais larga. Tipicamente, uma insulina que é preparada a pH neutro tem uma estabilidade mais elevada do que as preparadas a pH ácido. Assim, muitas insulinas são formuladas a pH neutro. Uma excepção é a insulina glargina, que é proporcionada como uma formulação comercial a pH 4,0. Em virtude da adição de duas argininas ao terminal C da cadeia B, o ponto isoeléctrico da insulina glargina é desviado tornando esta mais solúvel a um pH ácido. Uma alteração de aminoácido adicional existe na cadeia A (N21G) para prevenir a desamidação e dimerização resultantes de uma asparagina sensível a ácido. A sequência da cadeia A de insulina glargina é apresentada na SEQ ID NO:150 e a da cadeia B é apresentada na SEQ ID NO:151. Dado que a exposição a pH fisiológico ocorre após administração, formam-se microprecipitados, que tornam a glargina similar a uma insulina cristalina, de acção lenta. A Tabela 2 abaixo resume os tipos de insulina, o seu início de acção e a sua aplicação.

As insulinas mais habitualmente utilizadas são insulinas de acção rápida, que incluem insulina regular (i.e. insulina nativa ou do tipo selvagem, incluindo suas variantes alélicas e de espécie) e análogos de insulina de acção rápida. Para os presentes propósitos, a referência a insulina é uma insulina de acção rápida, a não ser que especificamente assinalado de outro modo.

Insulina de acção rápida São aqui proporcionadas composições de insulina de acção super-rápida que contêm uma insulina de acção rápida e uma enzima de degradação de hialuronano solúvel. Geralmente, estas composições de insulina de acção super-rápida são absorvidas após administração subcutânea e são detectáveis e têm um inicio de acção no sangue em 30 minutos ou menos. Insulinas de acção rápida que podem ser utilizadas para obter uma composição de insulina de acção super-rápida como aqui descrito incluem insulina regular, que é a insulina do tipo selvagem ou nativa. Insulinas de acção rápida incluem também análogos de insulina. Em virtude da sua velocidade de absorção rápida em comparação com insulinas de acção basal, as insulinas de acção rápida são utilizadas predominantemente para fins de controlo pós-prandial. Insulinas de acção rápida exemplificativas são apresentadas na Tabela 3 abaixo. Insulinas de acção rápida incluem também quaisquer das conhecidas na especialidade, tais como, mas não limitadas a, quaisquer preparações de insulina e dispositivos revelados na Patente dos E.U.A. 7279457 e Publicações de Patente dos E.U.A. 20070235365, 20080039368, 20080039365, 20070086952, 20070244467 e 20070191757. Qualquer insulina de acção rápida pode ser tornada de acção super-rápida por co-formulação e/ou co-administração com uma enzima de degradação de hialuronano. Uma formulação de composição de insulina de acção super-rápida pode também incluir adicionalmente uma mistura de uma insulina de acção rápida com uma insulina de acção intermédia ou lenta, para além de uma enzima de degradação de hialuronano.

a. Insulina regular

Insulinas regulares incluem formulações que incluem o polipéptido de insulina nativa ou do tipo selvagem. Estas incluem insulina humana, bem como insulinas de bovino, porcino e outras espécies. Estas insulinas podem ser preparadas a um pH ácido (e.g., 2,5-3,5) ou podem ser preparadas a um pH neutro (e.g., 7,0-7,8). Insulinas regulares incluem também aquelas que contêm zinco. Tipicamente, o teor em zinco em preparações de insulina regular varia desde ou cerca de 0,01-0,04 mg/100 Unidades. Insulinas humanas regulares são comercializadas como Humulin® R, Novolin® R e Velosulin®. A insulina porcina foi comercializada como Iletin II®. Geralmente, a insulina regular tem um inicio de acção de 30 minutos após administração subcutânea. Niveis máximos no plasma são observados em 1-3 horas e a duração de intensidade aumenta com a dosagem. A meia-vida no plasma após administração subcutânea é cerca de 1,5 horas. b. Análogos de acção rápida

Análogos de insulina de acção rápida são formas modificadas de insulina que tipicamente contêm uma ou mais alterações de aminoácido. Os análogos são desenhados para reduzir a auto-associação da molécula de insulina para o propósito de aumentar a velocidade de absorção e o início de acção em comparação com insulina regular. Geralmente, estes análogos são formulados na presença de zinco, e assim existem como hexâmeros de zinco estáveis. Devido à modificação, porém, têm uma dissociação mais rápida a partir do estado hexamérico após administração subcutânea em comparação com a insulina regular. i. Insulina lispro A insulina lispro humana é uma formulação de polipéptido de insulina contendo alterações de aminoácido na posição 28 e 29 da cadeia B tal que a Pro-Lys nesta posição na cadeia B de insulina do tipo selvagem apresentada na SEQ ID NO:104 está invertida para Lys-Pro. A sequência de insulina lispro é apresentada na SEQ ID NO: 103 (cadeia A) e na SEQ ID NO: 148 (cadeia B). É comercializada com o nome Humalog®. O resultado da inversão destes dois aminoácidos é um polipéptido com uma propensão diminuída para se auto-associar, o que permite um início de acção mais rápido. Especificamente, a inversão de sequência na cadeia B resulta na eliminação de duas interacções hidrofóbicas e no enfraquecimento de duas ligações de hidrogénio da folha pregueada beta que estabilizam o dímero (ver e.g., DeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and

Pharmacokinetics. Em Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (págs. 481-500) McGraw-Hill Professional). O polipéptido auto-associa-se e forma hexâmeros como um resultado de excipientes fornecidos na formulação, tais como agentes antimicrobianos (e.g. m-cresol) e zinco para estabilização. Apesar disso, devido à modificação de aminoácidos, a insulina lispro actua mais rapidamente do que a insulina regular. ii. Insulina aspártico A insulina aspártico humana é uma formulação de polipéptido de insulina contendo uma substituição de aminoácido na posição 28 da cadeia B de insulina humana apresentada na SEQ ID NO: 104 de uma prolina para um ácido aspártico. A sequência de insulina aspártico é apresentada na SEQ ID NO: 10 3 (cadeia A) e na SEQ ID NO:147 (cadeia B) . É comercializada com o nome Novolog®. A modificação em insulina aspártico confere um grupo carboxilo de cadeia lateral carregado negativamente para criar repulsão de carga e destabilizar a interacção monómero-monómero. Adicionalmente, a remoção da prolina elimina uma interacção hidrofóbica chave entre monómeros (ver e.g., DeFelippis et al. (2002) Insulin

Chemistry and Pharmacokinetics. Em Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (págs. 481-500) McGraw-Hill Professional). O análogo existe grandemente como um monómero, e é menos propenso a agregar-se em comparação com outros análogos de acção rápida tais como lispro. Geralmente, a insulina aspártico e a insulina lispro são similares nas suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas. iii. Insulina glulisina A insulina glulisina humana é uma formulação de polipéptido de insulina contendo uma substituição de aminoácido na cadeia B na posição B3 de asparagina para lisina e no aminoácido B29 de lisina para ácido glutâmico em comparação com a sequência da cadeia B de insulina humana apresentada na SEQ ID NO:104. A sequência de insulina glulisina é apresentada na SEQ ID NO:103 (cadeia A) e na SEQ ID NO:149 (cadeia B) . É comercializada com o nome Apidra®. As modificações tornam a molécula de polipéptido menos propensa a auto-associação em comparação como a insulina humana. Ao contrário de outros análogos de insulina, o polipéptido é formulado comercialmente na ausência do zinco promotor de hexâmero (Becker et al. (2008) Clinical Pharmacokinetics, 47:7-20). Por isso, a insulina glulisina tem uma velocidade de inicio mais rápida do que a insulina lispro e a insulina aspártico. D. Enzimas de degradação de hialuronano São aqui proporcionadas composições de insulina de acção super-rápida e combinações resultantes da combinação de uma insulina de acção rápida e de uma enzima de degradação de hialuronano (ácido hialurónico), e métodos de utilização destas composições e combinações para o tratamento de doenças e condições mediadas por insulina. Enzimas de degradação de hialuronano incluem qualquer enzima que degrada hialuronano. Enzimas de degradação de hialuronano exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, hialuronidases e condroitinases e liases particulares que têm a capacidade para clivar hialuronano. Onde os métodos e utilizações aqui proporcionados descrevem a utilização de uma hialuronidase com insulina pode-se, por conseguinte, utilizar qualquer enzima de degradação de hialuronano. Enzimas de degradação de hialuronano exemplificativas nas composições, combinações e métodos aqui proporcionados são enzimas de degradação de hialuronano solúveis. Em virtude da capacidade de enzimas de degradação de hialuronano, tais como hialuronidase, para quebrar o ácido hialurónico na matriz extracelular, estas enzimas facilitam a administração de agente terapêuticos. Por exemplo, são aumentadas a absorção e a dispersão de agentes terapêuticos, que são co-administrados com uma enzima de degradação de hialuronano tal como por administração subcutânea. 0 hialuronano, também chamado ácido hialurónico ou hialuronato, é um glicosaminoglicano não sulfatado que está amplamente distribuído através de tecidos conjuntivos, epiteliais e neurais. 0 hialuronano é um componente essencial da matriz extracelular e um constituinte principal da barreira intersticial. Por catalisarem a hidrólise de hialuronano, as enzimas de degradação de hialuronano baixam a viscosidade de hialuronano, aumentando por esse motivo a permeabilidade do tecido e aumentando a velocidade de absorção de fluidos administrados parentericamente. Como tal, enzimas de degradação de hialuronano, tais como hialuronidases, têm sido utilizadas, por exemplo, como agentes de espalhamento ou dispersão em conjunto com outros agentes, fármacos de proteínas para intensificar a sua dispersão e entrega.

As enzimas de degradação de hialuronano actuam para degradar o hialuronano por clivagem de polímeros de hialuronano, que são compostos de unidades de dissacárido repetitivas, ácido D-glucurónico (GlcA) e N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc), ligados em conjunto através de ligações glicosídicas alternantes -1 4 e -1 3. As cadeias hialuronano podem atingir cerca de 25000 repetições de dissacárido ou mais de comprimento e os polímeros de hialuronano podem variar em tamanho desde cerca de 5000 a 20000000 Da in vivo. Por conseguinte, enzimas de degradação de hialuronano para as utilizações e métodos proporcionados incluem qualquer enzima possuindo a capacidade para catalisar a clivagem de uma cadeia ou polímero de dissacárido de hialuronano. Em alguns exemplos a enzima de degradação de hialuronano cliva a ligação glicosídica -1 4 na cadeia ou polímero de hialuronano. Noutros exemplos, a enzima de degradação de hialuronano catalisa a clivagem da ligação glicosídica -1 3 na cadeia ou polímero de hialuronano.

Como descrito abaixo, existem enzimas de degradação de hialuronano em forma ligada a membrana ou solúvel. Para os presentes propósitos, são proporcionadas enzimas de degradação de hialuronano solúveis para utilização aqui nos métodos, utilizações, composições ou combinações. Assim, onde enzimas de degradação de hialuronano incluem uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) e/ou de outro modo estão ancoradas à membrana ou são insolúveis, as enzimas de degradação de hialuronano são aqui proporcionadas na forma solúvel. Assim, enzimas de degradação de hialuronano incluem variantes truncadas, e.g. truncadas para remover a totalidade ou uma porção de uma âncora de GPI. Enzimas de degradação de hialuronano aqui proporcionadas incluem também variantes alélicas ou de espécie, ou outras variantes, de uma enzima de degradação de hialuronano solúvel. Por exemplo, enzimas de degradação de hialuronano podem conter uma ou mais variações na sua sequência primária, tais como substituições, adições e/ou deleções de aminoácido. Uma variante de uma enzima de degradação de hialuronano geralmente exibe pelo menos ou cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência em comparação com a enzima de degradação de hialuronano não contendo a variação. Pode ser incluída qualquer variação na enzima de degradação de hialuronano para os presentes propósitos desde que a enzima mantenha a actividade de hialuronidase, tal como pelo menos ou cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais da actividade de uma enzima de degradação de hialuronano não contendo a variação (conforme medida por ensaios in vitro e/ou in vivo bem conhecidos na especialidade e aqui descritos). 1. Hialuronidases

As hialuronidases são membros de uma grande familia de enzimas de degradação de hialuronano. Existem três classes gerais de hialuronidases: hialuronidases do tipo mamífero, hialuronidases bacterianas e hialuronidases de sanguessugas, outros parasitas e crustáceos. Estas enzimas podem ser utilizadas nas composições e métodos proporcionados. a. Hialuronidases tipo mamifero

As hialuronidases do tipo mamífero (EC 3.2.1.35) são endo--iV-acet il-hexosaminidases que hidrolisam a ligação glicosídica -1 4 de hialuronano em vários comprimentos de oligossacárido tais como tetrassacáridos e hexassacáridos. Estas enzimas têm ambas as actividades hidrolítica e de transglicosidase, e podem degradar hialuronano e condroitina-sulfatos (CS), geralmente C4-S e C6-S. As hialuronidases deste tipo incluem, mas não estão limitadas a, hialuronidases de vacas (bovino) (SEQ ID NOS: 10, 11 e 64 e BH55 (Patentes dos

E.U.A. N.os 5747027 e 5827721)), ovelha (ovis aries) (SEQ ID NO: 26, 27, 63 e 65), vespa amarela (yellow jacket wasp) (SEQ ID NOS: 12 e 13), abelha de mel (SEQ ID NO:14), vespão (white-face hornet) (SEQ ID NO:15), vespa de papel (paper wasp) (SEQ ID NO :16), ratinho (SEQ ID NOS:17-19, 31), porco (SEQ ID NOS :20-21) , rato (SEQ ID NOS:22-24, 30), coelho (SEQ ID NO:25) , orangotango (SEQ ID NO:28), macaco cinomolgo (SEQ ID NO:29), porquinho-da-índia (SEQ ID NO:32), e hialuronidases humanas. Hialuronidases exemplificativas nas composições e métodos aqui proporcionados são hialuronidases solúveis.

As hialuronidases de mamífero podem ser adicionalmente subdivididas naquelas que são activas neutras, predominantemente encontradas em extractos de testículo, e activas ácidas, predominantemente encontradas em órgãos tais como o fígado. Hialuronidases activas neutras exemplificativas incluem PH20, incluindo mas não limitada a, PH20 derivada de espécies diferentes tais como ovino (SEQ ID NO:27), bovino (SEQ ID NO:11) e humano (SEQ ID NO:l). A PH20 humana (também conhecida como SPAM1 ou proteína de superfície de espermatozóide PH20) está geralmente ligada à membrana plasmática através de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Está naturalmente envolvida na adesão espermatozóide-óvulo e auxilia na penetração pelo espermatozóide da camada de células do cumulus por digestão de ácido hialurónico.

Para além da PH20 humana (também denominada SPAM1), cinco genes tipo hialuronidase foram identificados no genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 e HYALP1. 0 HYALP1 é um pseudogene, e o HYAL3 (SEQ ID NO:38) não mostrou possuir actividade de enzima em relação a quaisquer substratos conhecidos. A HYAL4 (polipéptido precursor apresentado na SEQ ID NO:39) é uma condroitinase e exibe pouca actividade em relação a hialuronano. 0 HYAL1 (polipéptido precursor apresentado na SEQ ID NO:36) é a enzima activa ácida prototípica e a PH20 (polipéptido precursor apresentado na SEQ ID N0:1) é a enzima activa neutra prototípica. Hialuronidases activas ácidas, tais como HYAL1 e HYAL2 (polipéptido precursor apresentado na SEQ ID NO:37) carecem geralmente de actividade catalítica a pH neutro (i.e. pH 7). Por exemplo, a HYAL1 tem pouca actividade catalítica in vitro acima de pH 4,5 (Frost et ai. (1997) Anal. Biochem. 251:263-269) . A HYAL2 é uma enzima activa ácida com uma actividade específica in vitro muito baixa. As enzimas tipo hialuronidase podem também ser caracterizadas por aquelas que estão geralmente ligadas às membranas plasmáticas através de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) tais como HYAL2 humana e PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova, et ai. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(8):4580-5), e aquelas que são geralmente solúveis tais como a HYAL1 humana (Frost et ai. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(1):10-5). PH20 A PH20, tal como outras hialuronidases de mamífero, é uma endo- -N-acetil-hexosaminidase que hidrolisa a ligação glicosídica -1 4 de ácido hialurónico em vários comprimentos de oligossacárido tais como tetrassacáridos e hexassacáridos. Possuem ambas as actividades hidrolítica e de transglicosidase e podem degradar ácido hialurónico e condroitina-sulfatos, tais como C4-S e C6-S. A PH20 Está naturalmente envolvida na adesão espermatozóide-óvulo e auxilia na penetração pelo espermatozóide da camada de células do cumulus por digestão de ácido hialurónico. A PH20 está localizada sobre a superfície do espermatozóide, e no acrossoma derivado de lisossoma, onde está ligada à membrana acrossómica interna. A PH20 de membrana plasmática tem actividade de hialuronidase apenas a pH neutro, enquanto a PH20 de membrana acrossómica interna tem actividade a ambos os pH neutro e ácido. Para além de ser uma hialuronidase, a PH20 parece ser também um receptor para sinalização celular induzida por HA, e um receptor para a zona pelúcida envolvendo o oócito.

Proteínas PH20 exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, polipéptidos PH20 de humano (polipéptido precursor apresentado na SEQ ID N0:1, polipéptido maduro apresentado na SEQ ID NO: 2), chimpanzé (SEQ ID NO:185), macaco Rhesus (SEQ ID NO:186), bovino (SEQ ID NOS: 11 e 64), coelho (SEQ ID NO: 25), PH20 de ovino (SEQ ID NOS: 27, 63 e 65), macaco cinomolgo (SEQ ID NO: 29), porquinho-da-índia (SEQ ID NO: 30), rato (SEQ ID NO: 31) e ratinho (SEQ ID NO: 32). A PH20 bovina é um polipéptido precursor de 553 aminoácidos (SEQ ID NO:11). O alinhamento de PH20 bovina com a PH20 humana mostra apenas uma fraca homologia, com a existência de múltiplas lacunas desde o aminoácido 470 até ao terminal carboxilo respectivo devido à ausência de uma âncora de GPI no polipéptido de bovino (ver e.g., Frost G.I. (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427-440). De facto, âncoras de GPI claras não estão previstas em PH20 de muitas outras espécies para além dos humanos. Assim, polipéptidos de PH20 produzidos a partir de ovino e bovino existem naturalmente como formas solúveis. Ainda que a PH20 bovina exista muito livremente ligada à membrana plasmática, não está ancorada através de uma âncora sensível a fosfolipase (Lalancette et al. (2001) Biol. Reprod. 65(2):628-36). Esta característica única da hialuronidase bovina tem permitido a utilização da enzima hialuronidase de testículo de bovino solúvel como um extracto para utilização clínica (Wydase®, Hyalase®) . O transcrito de ARNm de PH20 humana é traduzido normalmente para gerar um polipéptido precursor de 509 aminoácidos (SEQ ID NO:l, e replicado abaixo) contendo uma sequência de sinal de 35 aminoácidos no terminal N (posições de resíduo de aminoácido 1-35) e uma sequência de sinal de ligação a âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) de 19 aminoácido no terminal C (posições de resíduo de aminoácido 491-509) . Por conseguinte a PH20 madura é um polipéptido de 474 aminoácido apresentado na SEQ ID NO:2. Após transporte do polipéptido precursor para o ER e remoção do péptido de sinal, o péptido de sinal de ligação a GPI C-terminal é clivado para facilitar a ligação covalente de uma âncora de GPI ao aminoácido C-terminal acabado de formar na posição de aminoácido correspondente à posição 490 do polipéptido precursor apresentado na SEQ ID NO:l. Assim, é produzido um polipéptido maduro ancorado a GPI de 474 aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2.

Sequência de aminoácidos do polipéptido precursor PH20 humano (SEQ ID NO:l; 509 aminoácidos):

MG VLiKF KHIFFR S FVKS S GVSQI VJjTFLIiI P CCIiTIjN FRA P PVI PNVPFIiWAWNAPSEFC LGXFDE PLD MSIíFSFIGS PRINATGQGVTl FYVDRLGYY PY ID S1TGVTVKGGIP Q Kl S LQDHIjDKAKKD itfym p vd NLGMAVIDWEEWRFTOARBWKPKDVYKWRSIELVQCXJNVQLSLTEATEKAXQEFEKAGKDFLVETIKLG KIjLRPNHLWGYYLFPDCYXWHYKKPGYWGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATI. YVRNRVREAIRVSKX PDAKS PIJPVFAYTRIVFTDQVhKFLSODEIiVYTFGETVALGASGI VIWGTLSIM RÊMKSCLLLDWyMETIlíNPYIXWVTIAAKMCSQVLCQECGVCIRKNWKSSDYLHENPDKFAIQLEKGGK FTVRG KPTLEDLEQFSEKFYCS CYSTLS CKEKAD VXDTOAVD VCIADGVCIDAFEKPFME TEE P QIFYN AS PSTLSATMFIVSILFLIISSVASL A PH20 humana exibe actividade de hialuronidase a ambos os pH neutro e ácido. Num aspecto, a PH20 humana é a hialuronidase activa neutra prototípica que está geralmente fixada à membrana plasmática através de uma âncora de GPI. Noutro aspecto, a PH20 é exprimida sobre a membrana acrossómica interior onde tem actividade de hialuronidase a ambos os pH neutro e ácido. Parece que a PH20 contém dois centros catalíticos em regiões distintas do polipéptido: as regiões Péptido 1 e Péptido 3 (Cherr et al. , (2001) Matrix Biology 20:515-525). Evidência sugere que a região Péptido 1 de PH20, que corresponde às posições de aminoácido 107-137 do polipéptido maduro apresentado na SEQ ID NO: 2 e às posições 142-172 do polipéptido precursor apresentado na SEQ ID NO:l, é requerida para actividade enzimática a pH neutro. Os aminoácidos nas posições 111 e 113 (correspondentes ao polipéptido PH20 maduro apresentado na SEQ ID NO:2) nesta região parecem ser importantes para a actividade, uma vez que a mutagénese por substituição de aminoácido resulta em polipéptidos PH20 com 3% de actividade de hialuronidase ou actividade de hialuronidase não detectável, respectivamente, em comparação com a do tipo selvagem PH20 (Arming et ai., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814). A região Péptido 3, que corresponde às posições de aminoácido 242-262 do polipéptido maduro apresentado na SEQ ID NO:2, e às posições 277-297 do polipéptido precursor apresentado na SEQ ID NO: 1, parece ser importante para a actividade enzimática a pH ácido. Dentro desta região, aminoácidos nas posições 249 e 252 do polipéptido PH20 maduro parecem ser essenciais para a actividade, e a mutagénese de qualquer uma resulta num polipéptido essencialmente desprovido de actividade (Arming et al. , (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814) .

Para além dos locais catalíticos, a PH20 contém também um local de ligação de hialuronano. Evidência experimental sugere que este local está localizado na região Péptido 2, que corresponde às posições de aminoácido 205-235 do polipéptido precursor apresentado na SEQ ID NO: 1 e às posições 170-200 do polipéptido maduro apresentado na SEQ ID NO:2. Esta região está altamente conservada entre hialuronidases e é similar ao motivo de ligação de heparina. A mutação do resíduo arginina na posição 176 (correspondente ao polipéptido PH20 maduro apresentado na SEQ ID NO:2) para uma glicina resulta num polipéptido com apenas cerca de 1% da actividade de hialuronidase do polipéptido do tipo selvagem (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).

Existem sete locais de glicosilação potenciais ligados a N em PH20 humana em N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 do polipéptido exemplificado na SEQ ID NO: 1. Porque os aminoácidos 36 a 464 da SEQ ID NO:1 parecem conter o domínio de hialuronidase PH20 humano minimamente activo, o local de glicosilação N490 ligado a N não é requerido para actividade apropriada de hialuronidase. Existem seis ligações de dissulfureto na PH20 humana. Duas ligações de dissulfureto são formadas entre os resíduos cisteína C60 e C351 entre C224 e C238 do polipéptido exemplificado na SEQ ID NO: 1 (correspondente aos resíduos C25 e C316, e C189 e C203 do polipéptido maduro apresentado na SEQ ID NO: 2, respectivamente). Quatro ligações adicionais de dissulfureto são formadas entre os resíduos cisteína C376 e C387; entre C381 e C435; entre C437 e C443; e entre C458 e C464 do polipéptido exemplificado na SEQ ID NO: 1 (correspondentes aos resíduos C341 e C352; entre C346 e C400; entre C402 e C408; e entre C423 e C429 do polipéptido maduro apresentado na SEQ ID N0:2, respectivamente). b. Hialuronidases bacterianas

As hialuronidases bacterianas (EC 4.2.2.1 ou EC 4.2.99.1) degradam hialuronano e, em várias extensões, condroitina-sulfatos e dermatano-sulfatos. As liases de hialuronano isoladas a partir de bactérias diferem de hialuronidases (a partir de outras fontes, e.g., hialuronoglucosaminidases, EC 3.2.1.35) pelo seu modo de acção. São endo- -N-acetil-hexosaminidases que catalisam uma reacção de eliminação, em vez da hidrólise, do elemento de ligação -D-glicosídico entre resíduos N-acetil-beta-D-glucosamina e ácido D-glucurónico no hialuronano, produzindo tetra- e hexassacáridos de 3 — (4 — desoxi- -D-gluc-4-enuronosil)-N-acetil-D-glucosamina, e produtos finais de dissacárido. A reacção resulta na formação de oligossacáridos com resíduos de ácido hexurónico insaturados nas suas extremidades não redutoras.

Hialuronidases exemplificativas a partir de bactérias para utilização nas composições, combinações e métodos aqui proporcionados incluem, mas não estão limitadas a, enzimas de degradação de hialuronano em microrganismos, incluindo estirpes de Arthrobacter, Bdellovibrio, Clostridium, Micrococcus, Streptococcus, Peptococcus, Propionibacterium, Bacteroides e Streptomyces. Exemplos particulares destas enzimas incluem, mas não estão limitadas a Arthrobacter sp. (estirpe FB24) (SEQ ID NO:67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO:68), Propionibacterium acnes (SEQ ID NO:69), Streptococcus agalactiae ((SEQ ID NO:70); 18RS21 (SEQ ID NO: 71) ; serotipo Ia (SEQ ID NO:72); serotipo III (SEQ ID NO:73), Staphylococcus aureus (estirpe COL) (SEQ ID NO:74); estirpe MRSA252 (SEQ ID NOS:75 e 76); estirpe MSSA476 (SEQ ID NO:77); estirpe NCTC 8325 (SEQ ID NO:78); estirpe bovina RF122 (SEQ ID NOS:7 9 e 80); estirpe USA300 (SEQ ID NO:81), Streptococcus pneumoniae ((SEQ ID NO:82); estirpe ATCC BAA-255 / R6 (SEQ ID NO:83); serotipo 2, estirpe D39 / NCTC 7466 (SEQ ID NO:84), Streptococcus pyogenes (serotipo Ml) (SEQ ID NO:85); serotipo M2, estirpe MGAS10270 (SEQ ID NO:86); serotipo M4, estirpe MGAS10750 (SEQ ID NO:87); serotipo M6 (SEQ ID NO:88); serotipo M12, estirpe MGAS2096 (SEQ ID NOS:89 e 90); serotipo M12, estirpe MGAS9429 (SEQ ID NO:91); serotipo M28 (SEQ ID NO:92); Streptococcus suis (SEQ ID NOS:93-95); Vibrio fischeri (estirpe ATCC 700601/ ES114 (SEQ ID NO:96)), e a hialuronidase enzima Streptomyces hyaluronolyticus, que é especifica para ácido hialurónico e não cliva condroitina ou condroitina-sulfato (Ohya, T. e Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607). c. Hialuronidases a partir de sanguessugas, outros parasitas e crustáceos

Hialuronidases a partir de sanguessugas, outros parasitas e crustáceos (EC 3.2.1.36) são endo- -glucuronidases que geram produtos finais de tetra- e hexassacárido. Estas enzimas catalisam a hidrólise de elementos de ligação 1 3 entre resíduos -D-glucuronato e N-acetil-D-glucosamina no hialuronato. Hialuronidases exemplificativas a partir de sanguessugas incluem, mas não estão limitadas a, hialuronidase de Hirudinidae (e.g., Hirudo medicinalis), Erpobdellidae (e.g., Nephelopsis obscura e Erpobdella punctata), Glossiphoniidae (e.g., Desserobdella picta, Helobdella stagnalis, Glossiphonia complanata, Placobdella ornata e Theromyzon sp.) e Haemopidae (Haemopis marmorata) (Hovingh et ai. (1999) Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 124(3):319-26). Uma hialuronidase exemplificativa a partir de bactérias que tem o mesmo mecanismo de acção que a hialuronidase de sanguessuga é a das cianobactérias, Synechococcus sp. (estirpe RCC307, SEQ ID NO:97). 2. Outras enzimas de degradação de hialuronano

Para além da família hialuronidase, podem ser utilizadas outras enzimas de degradação de hialuronano em conjunto com a insulina de acção rápida nas composições e métodos proporcionados. Por exemplo, podem ser utilizadas enzimas, incluindo condroitinases e liases particulares, que têm uma capacidade para clivar hialuronano. Condroitinases exemplificativas que podem degradar hialuronano incluem, mas não estão limitadas a, condroitina ABC liase (também conhecida como condroitinase ABC), condroitina AC liase (também conhecida como condroitina-sulfato-liase ou condroitina-sulfato-eliminase) e condroitina C liase. Para produção e purificação destas enzimas para utilização nas composições e métodos, são proporcionados métodos conhecidos na especialidade (e.g., Patente dos E.U.A. N.2 6054569; Yamagata, et al. (1968) J. Biol. Chem. 243 (7) : 1523-1535; Yang et al. (1985) J. Biol. Chem. 160(30):1849-1857).

Condroitina ABC liase contém duas enzimas, condroitina-sulf ato-ABC-endoliase (EC 4.2.2.20) e condroitina-sulfato-ABC-exoliase (EC 4.2.2.21) (Hamai et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(14):9123-30), que degradam uma variedade de glicosaminoglicanos do tipo condroitina-sulfato e dermatano-sulfato. Condroitina-sulfato, condroitina-sulfato- proteoglicano e dermatano-sulfato são os substratos preferidos para condroitina-sulfato-ABC-endoliase, mas a enzima também pode actuar sobre hialuronano a uma velocidade mais baixa. A condroitina-sulfato-ABC-endoliase degrada uma variedade de glicosaminoglicanos do tipo condroitina-sulfato e dermatano-sulfato, produzindo uma mistura de oligossacáridos insaturados 4 de diferentes tamanhos que são por último degradados em tetra e dissacáridos insaturados 4. A condroitinaulfato-ABC-exoliase tem a mesma especificidade de substrato mas remove resíduos dissacárido das extremidades não redutoras tanto dos condroitina-sulfatos poliméricos como dos seus fragmentos de oligossacárido produzidos por condroitina-sulfato-ABC-endoliase (Hamai, A. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:9123-9130). Condroitina-sulfato-ABC-endoliases e condroitina-sulf ato-ABC-exoliases exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, aquelas de Proteus vulgaris e Flavobacterium heparinum (a condroitina-sulfato-ABC-endoliase de Proteus vulgaris é apresentada na SEQ ID NO: 98 (Sato et al. (1994)

Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1) :39-46) .

Condroitina AC liase (EC 4.2.2.5) é activa sobre condroitina-sulfatos A e C, condroitina e ácido hialurónico, mas não é activa sobre sulfato de dermatano (condroitina- sulfato B). Enzimas condroitinase AC exemplificativas a partir de bactérias incluem, mas não estão limitadas a, as de Flavobacterium heparinum a Victivallis vadensis, apresentadas nas SEQ ID NOS: 99 e 100, respectivamente, e de Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1) : 2 9 — 35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5) :387-444) . A condroitinase C cliva condroitina-sulfato C produzindo tetrassacárido mais urn dissacárido-6-sulfato insaturado (delta Di-6S). Cliva também o ácido hialurónico produzindo dissacárido não sulfatado insaturado (delta Di-OS). Enzimas condroitinase C exemplificativas a partir de bactérias incluem, mas não estão limitadas a, as de Streptococcus e Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133) 3. Enzimas solúveis de degradação de hialuronano

Nas presentes composições e métodos são proporcionadas enzimas de degradação de hialuronano solúveis, incluindo hialuronidases solúveis. Enzimas de degradação de hialuronano solúveis incluem guaisguer enzimas de degradação de hialuronano que existem em forma solúvel, incluindo, mas não limitadas a, hialuronidases solúveis, incluindo hialuronidases solúveis não humanas, incluindo hialuronidases solúveis de animais não humanos, hialuronidases bacterianas solúveis e hialuronidases humanas, Hyall, PH20 bovina e PH20 ovina, suas variantes alélicas e outras suas variantes. Por exemplo, entre enzimas de degradação de hialuronano solúveis incluem-se quaisquer enzimas de degradação de hialuronano que foram modificadas para serem solúveis, incluindo quaisquer das descritas no Pedido de Patente Provisório dos E.U.A. N.2 de Série 61/201384. Por exemplo, enzimas de degradação de hialuronano que contêm uma âncora de GPI podem ser tornadas solúveis por truncagem e remoção da totalidade ou de uma porção da âncora de GPI. Num exemplo, a hialuronidase PH20 humana, que está normalmente ancorada à membrana através de uma âncora de GPI, pode ser tornada solúvel por truncagem e remoção da totalidade ou de uma porção da âncora de GPI no terminal C.

Enzimas de degradação de hialuronano solúveis incluem também hialuronidases activas neutras e activas ácidas. Dependendo de factores, tais como, mas não limitados a, o nivel desejado de actividade da enzima após administração e/ou o local de administração, podem ser seleccionadas hialuronidases activas neutras e activas ácidas. Num particular exemplo, a enzima de degradação de hialuronano para utilização nas presentes composições, combinações e métodos é uma hialuronidase activa neutra solúvel.

Uma hialuronidase solúvel exemplificativa é a PH20 a partir de qualquer espécie, tal como qualquer das apresentadas em qualquer das SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31, 63-65 e 185-186, ou suas formas truncadas desprovidas da totalidade ou de uma porção da âncora GPI C-terminal, desde que a hialuronidase seja solúvel e mantenha actividade de hialuronidase. Entre as hialuronidases solúveis incluem-se também variantes alélicas ou outras variantes de quaisquer das SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30 31, 63-65 e 185-186, ou suas formas truncadas. Variantes alélicas e outras variantes são conhecidas de um perito na especialidade, e incluem polipéptidos possuindo 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou mais identidade de sequência em relação a qualquer das SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30 31, 63-65 e 185-186, ou suas formas truncadas. Variantes de aminoácido incluem mutações conservativas e não conservativas. É entendido que resíduos que são importantes ou de outro modo requeridos para a actividade de uma hialuronidase, tais como quaisquer dos descritos acima ou conhecidos dos peritos da especialidade, são geralmente invariantes. Estes incluem, por exemplo, os resíduos do centro activo. Assim, por exemplo, os resíduos de aminoácido 111, 113 e 176 (correspondentes aos resíduos no polipéptido PH20 maduro apresentado na SEQ ID NO:2) de um polipéptido PH20 humano, ou sua forma solúvel, são geralmente invariantes e não são alterados. Outros resíduos que conferem glicosilação e formação de ligações de dissulfureto requeridos para dobragem apropriada podem também ser invariantes.

Em alguns casos, a enzima de degradação de hialuronano solúvel está normalmente ancorada por GPI (tal como, por exemplo, PH20 humana) e é tornada solúvel por truncagem no terminal C. Esta truncagem pode remover a totalidade da sequência de sinal de ligação da âncora de GPI, ou pode remover apenas alguma da sequência de sinal de ligação da âncora de GPI. 0 polipéptido resultante, porém, é solúvel. Em casos onde a enzima de degradação de hialuronano solúvel mantém uma porção da sequência de sinal de ligação da âncora de GPI, podem ser mantidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais resíduos de aminoácido na sequência de sinal de ligação da âncora de GPI, desde que o polipéptido seja solúvel. Polipéptidos contendo um ou mais aminoácidos da âncora GPI são denominados enzimas de degradação de hialuronano solúveis prolongadas. Um perito na especialidade pode determinar se um polipéptido está ancorado por GPI utilizando métodos bem conhecidos na especialidade. Estes métodos incluem, mas não estão limitadas a, utilização de algoritmos conhecidos para prever a presença e localização da sequência de sinal de ligação da âncora de GPI e do centro , e realizar áhises de solubilidade antes ou após digestão com fosfolipase C (PI-PLC) ou D (PI-PLD) especificas de fosfatidilinositol.

Enzimas de degradação de hialuronano solúveis prolongadas podem ser produzidas efectuando truncagens C-terminais a qualquer enzima de degradação de hialuronano naturalmente ancorada por GPI tal que o polipéptido resultante é solúvel e contém um ou mais resíduos de aminoácido a partir da sequência de sinal de ligação da âncora de GPI. Enzimas de degradação de hialuronano solúveis prolongadas exemplificativas que estão truncadas C terminalmente mas retêm uma porção da sequência de sinal de ligação da âncora de GPI incluem, mas não estão limitadas a, polipéptidos PH20 solúveis prolongados (esPH20) de origem primata, tais como, por exemplo, polipéptidos esPH20 de humano e chimpanzé. Por exemplo, os polipéptidos esPH20 podem ser produzidos por truncagem C-terminal de qualquer dos polipéptidos precursores ou maduros apresentados nas SEQ ID N0S:1, 2 ou 185, ou suas variações alélicas ou outras, incluindo seus fragmentos activos, onde o polipéptido resultante é solúvel e mantém um ou mais resíduos de aminoácido a partir da sequência de sinal de ligação da âncora de GPI. Variantes alélicas e outras variantes são conhecidas de um perito na especialidade, e incluem polipéptidos possuindo 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% ou mais identidade de sequência com qualquer das SEQ ID NOS: 1 ou 2. Os polipéptidos esPH20 aqui proporcionados podem estar truncados terminalmente por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos em comparação com o polipéptido do tipo selvagem, tal como um polipéptido com uma sequência apresentada nas SEQ ID NOS: 1, 2 ou 185, desde que o polipéptido esPH20 resultante seja solúvel e mantenha 1 ou mais resíduos de aminoácido a partir da sequência de sinal de ligação da âncora de GPI.

Tipicamente, para utilização nas presentes composições, combinações e métodos, utiliza-se uma enzima de degradação de hialuronano humana solúvel, tal como uma PH20 humana solúvel. Ainda que possam ser utilizadas enzimas de degradação de hialuronano, tais como PH20, a partir de outras espécies animais, estas preparações são potencialmente imunogénicas, uma vez que são proteínas animais. Por exemplo, uma proporção significativa de pacientes demonstra sensibilização prévia derivada de alimentos ingeridos, e uma vez que estas são proteínas animais, todos os pacientes têm um risco de sensibilização subsequente. Assim, preparações não humanas podem não ser adequadas para utilização crónica. Se são desejadas preparações não humanas, é aqui contemplado que estes polipéptidos podem ser preparados para terem imunogenicidade reduzida. Estas modificações estão ao nível de um perito na especialidade e podem incluir, por exemplo, remoção e/ou substituição de um ou mais epítopos antigénicos na molécula.

Enzimas de degradação de hialuronano, incluindo hialuronidases (e.g., PH20), utilizadas nos presentes métodos podem ser produzidas de modo recombinante ou podem ser purificadas ou purificadas parcialmente a partir de fontes naturais, tais como, por exemplo, a partir de extractos de testículo. Métodos para produção de proteínas recombinantes, incluindo enzimas de degradação de hialuronano recombinantes, são aqui proporcionadas noutro local e são bem conhecidas na especialidade. a. PH20 humana solúvel

Uma hialuronidase solúvel exemplificativa é a PH20 humana solúvel. Formas solúveis de PH20 humana recombinante têm sido produzidas e podem ser utilizadas nas composições, combinações e métodos aqui descritas. A produção destas formas solúveis de PH20 é descrita nos Pedidos de Patente Publicados dos E.U.A. N.°s US20040268425, US20050260186 e US20060104968, e nos Exemplos, abaixo. Por exemplo, polipéptidos PH20 solúveis, incluem polipéptidos variantes truncados C-terminalmente que incluem uma sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:l, ou possuem pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98% de identidade de sequência em relação a uma sequência de aminoácidos incluída na SEQ ID NO:l, mantêm actividade de hialuronidase e são solúveis. Entre estes polipéptidos incluem-se polipéptidos PH20 solúveis que estão desprovidos completamente da totalidade ou de uma porção da sequência de sinal de ligação da âncora de GPI. São também incluídos polipéptidos PH20 prolongados solúveis (esPH20) que contêm pelo menos um aminoácido da âncora de GPI.

Assim, em vez de terem uma âncora de GPI ligada de modo covalente ao terminal C da proteína no ER e estarem ancorados à pequena folha extracelular da membrana plasmática, estes polipéptidos são segregados e são solúveis. Polipéptidos PH20 truncados C-terminalmente podem estar truncados C-terminalmente por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 5, 60 ou mais aminoácidos em comparação com o polipéptido do tipo selvagem a todo o comprimento, um polipéptido do tipo selvagem a todo o comprimento com uma sequência apresentada na SEQ ID NOS:1 ou 2, ou suas variantes alélicas ou de espécie ou outras variantes.

Polipéptidos PH20 humanos truncados C-terminalmente exemplificativos aqui proporcionados incluem quaisquer uns possuindo truncagens C-terminais para gerar polipéptidos contendo do aminoácido 1 ao aminoácido 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, ou posições correspondentes numa sua variante alélica ou de espécie. Quando expressa em células de mamífero, a sequência de sinal N-terminal de 35 aminoácidos é clivada durante o processamento, e a forma madura da proteína é segregada. Assim, polipéptidos PH20 solúveis truncados C-terminalmente maduros podem conter os aminoácidos 36 a 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 ou posições correspondentes numa sua variante alélica ou de espécie. A Tabela 4 proporciona exemplos não limitantes de polipéptidos PH20 truncados C-terminalmente exemplificativos, incluindo polipéptidos PH20 solúveis truncados C-terminalmente. Na Tabela 4 abaixo, são proporcionados o comprimento (em aminoácidos) dos polipéptidos precursores e maduros, e o identificador da sequência (SEQ ID NO) na qual são apresentadas as sequências de aminoácido exemplificativas dos polipéptidos precursores e maduros das proteínas PH20 truncadas C-terminalmente. Na Tabela 4 é também incluído para comparação o polipéptido PH20 do tipo selvagem.

Formas solúveis incluem, mas não estão limitadas a, quaisquer formas possuindo truncagens C-terminais para gerar polipéptidos contendo do aminoácido 1 ao aminoácido 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 e 483 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:1. Quando em células de mamífero, a sequência de sinal N-terminal de 35 aminoácidos é clivada durante o processamento, e a forma madura da proteína é segregada. Assim, os polipéptidos solúveis maduros contêm os aminoácidos 36 a 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 e 483 da SEQ ID NO:l. Mutantes de deleção terminados na posição de aminoácido 477 a 483 (correspondentes ao polipéptido precursor apresentado na SEQ ID NO:l) exibem actividade de hialuronidase segregada mais elevada do que a forma ancorada por GPI a todo o comprimento. Assim, hialuronidases solúveis exemplificativas são polipéptidos PH20 humanos solúveis que têm 442, 443, 444, 445, 446 ou 447 aminoácidos de comprimento, tais como os apresentados em quaisquer das SEQ ID NOS: 4-9, ou suas variantes alélicas ou de espécie, ou outras variantes.

Geralmente formas de PH20 solúveis são produzidas utilizando sistemas de expressão de proteína que facilitam a N-glicosilação correcta para assegurar que o polipéptido mantém actividade, dado que a glicosilação é importante para a actividade catalítica e estabilidade de hialuronidases. Estas células incluem, por exemplo células de ovário de hamster chinês (CHO) (e.g. células CHO DG44). b. rHuPH20

Formas solúveis recombinantes de PH20 humana têm sido têm sido geradas e podem ser utilizadas nas composições e métodos aqui proporcionados. A geração destas formas solúveis de PH20 humana recombinante é descrita nos Pedidos de Patente Publicados dos E.U.A. N.°s US20040268425, US20050260186 e US20060104968, e nos Exemplos 2-6, abaixo. Exemplificativos destes polipéptidos são aqueles gerados a partir de uma molécula de ácido nucleico codificando os aminoácidos 1-482 (apresentada na SEQ ID NO: 3) . Uma tal molécula de ácido nucleico exemplificativa é apresentada na SEQ ID NO:49. 0 processamento pós-tradução remove a sequência de sinal de 35 aminoácidos, deixando uma PH20 humana recombinante solúvel de 447 aminoácidos (SEQ ID NO:4). Conforme produzida no meio de cultura existe heterogeneidade no terminal C tal que o produto, designado rHuPH20, inclui uma mistura de espécies que podem incluir qualquer uma ou mais das SEQ ID NOS. 4-9 em abundância variada. Tipicamente, a rHuPH20 é produzida em células que facilitam a N-glicosilação correcta para manter a actividade, tais como células CHO (e.g. células CHO DG44). 4. Glicosilação de enzimas de degradação de hialuronano A glicosilação, incluindo glicosilação ligada a N e a 0, de algumas enzimas de degradação de hialuronano, incluindo hialuronidases, pode ser importante para a sua actividade catalítica e estabilidade. Enquanto a alteração do tipo de glicano modificando uma glicoproteína pode ter efeitos dramáticos sobre a antigenicidade, dobragem estrutural, solubilidade e estabilidade de uma proteína, não se pensa que a maioria das enzimas necessite glicosilação para uma actividade enzimática óptima. Para algumas hialuronidases, a remoção da glicosilação ligada a N pode resultar em inactivação quase completa da actividade de hialuronidase. Assim, para estas hialuronidases, a presença de glicanos ligados a N é crítica para gerar uma enzima activa.

Oligossacáridos ligados a N caem em vários tipos principais (oligomanose, complexo, híbrido, sulfatado), todos os quais possuem núcleos (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc ligados através do azoto de amida de resíduos Asn que caem dentro de sequências

Asn-Xaa-Thr/Ser (onde Xaa não é Pro). A glicosilação num local Asn-Xaa-Cys tem sido reportada para proteína C de coagulação. Em alguns casos, uma enzima de degradação de hialuronano, tal como uma hialuronidase, pode conter ambos os elementos de ligação N-glicosídico e O-glicosídico. Por exemplo, a PH20 possui oligossacáridos ligados a 0 bem como oligossacáridos ligados a N. Existem sete locais potenciais de glicosilação ligada a N em N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 de PH20 humana exemplificada na SEQ ID NO: 1. Como notado acima, a glicosilação ligada a N em N490 não é requerida para actividade de hialuronidase.

Em alguns exemplos, as enzimas de degradação de hialuronano para utilização nas composições e/ou métodos proporcionados estão glicosiladas em um ou na totalidade dos locais de glicosilação. Por exemplo, para PH20 humana, ou uma sua forma solúvel, estão glicosilados 2, 3, 4, 5 ou 6 dos locais de N-glicosilação correspondentes aos aminoácidos N82, NI 6 6, N235, N254, N368 e N393 da SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos as enzimas de degradação de hialuronano estão glicosiladas em um ou mais ou mais locais de glicosilação nativos. Noutros exemplos, as enzimas de degradação de hialuronano estão modificadas em um ou mais locais de glicosilação não nativos para conferir glicosilação ao polipéptido em um ou mais locais adicionais. Nestes exemplos, a ligação de porções adicionais de açúcar pode melhorar as propriedades farmacocinéticas da molécula, tais como meia-vida melhorada e/ou actividade melhorada.

Noutros exemplos, as enzimas de degradação de hialuronano para utilização nas composições e/ou métodos aqui proporcionados são parcialmente desglicosiladas (ou polipéptidos parcialmente N-glicosilados). Por exemplo, polipéptidos PH20 solúveis parcialmente desglicosilados que mantêm a totalidade ou uma parte da actividade de hialuronidase de uma hialuronidase totalmente glicosilada podem ser utilizados nas composições e/ou métodos aqui proporcionados. Hialuronidases parcialmente desglicosiladas exemplificativas incluem formas solúveis de polipéptidos PH20 parcialmente desglicosilados de quaisquer espécies, tais como qualquer dos apresentados em qualquer das SEQ ID NOS: 1,2, 11, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 63, 65, 185 e 186, ou suas variantes alélicas, variantes truncadas, ou outras variantes. Estas variantes são conhecidas de um perito na especialidade, e incluem polipéptidos possuindo 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% ou mais identidade de sequência em relação a qualquer das SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 63, 65, 185 e 186, ou suas formas truncadas. As hialuronidases parcialmente desglicosiladas aqui proporcionadas incluem também hialuronidases parcialmente desglicosiladas híbridas, de fusão e quiméricas, e conjugados de hialuronidase parcialmente desglicosilada.

As glicosidases, ou glicósido-hidrolases, são enzimas que catalisam a hidrólise do elemento de ligação glicosídico para gerar dois açúcares mais pequenos. Os principais tipos de N-glicanos em vertebrados incluem glicanos de elevada manose, glicanos híbridos e glicanos complexos. Existem várias glicosidases que resultam em desglicosilação de proteína apenas parcial, incluindo: EndoFl, que cliva glicanos de tipo manose elevada e híbrido; EndoF2, que cliva glicanos de tipo complexo biantenário; EndoF3, que cliva glicanos complexos biantenários e mais ramificados; e EndoH, que cliva glicanos de tipo manose elevada e híbrido. O tratamento de uma enzima de degradação de hialuronano, tal como uma hialuronidase solúvel, tal como uma PH20 solúvel, com uma ou mais destas glicosidases pode resultar em desglicosilação apenas parcial e, por conseguinte, retenção de actividade de hialuronidase.

Enzimas de degradação de hialuronano parcialmente desglicosiladas, tais como hialuronidases solúveis parcialmente desglicosiladas, podem ser produzidas por digestão com uma ou mais glicosidases, geralmente uma glicosidase que não remove a totalidade dos N-glicanos mas apenas desglicosila parcialmente a proteína. Por exemplo, o tratamento de PH20 (e.g. uma PH20 recombinante designada rHuPH20) com uma ou a totalidade das glicosidases acima (e.g. EndoFl, EndoF2 e/ou EndoF3) resulta em desglicosilação parcial. Estes polipéptidos PH20 parcialmente desglicosilados podem exibir actividade enzimática hialuronidase que é comparável à dos polipéptidos totalmente glicosilados. Em contraste, o tratamento de PH20 com PNGaseF, uma glicosidase que cliva todos os N-glicanos, resulta na remoção completa de todos os N-glicanos e desse modo torna a PH20 enzimaticamente inactiva. Assim, ainda que todos os locais de glicosilação ligada a N (tais como, por exemplo, aqueles nos aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 e N393 de PH20 a, exemplificada na SEQ ID NO: 1) possam estar glicosilados, o tratamento com uma ou mais glicosidases pode tornar a extensão de glicosilação reduzida em comparação com uma hialuronidase que não é digerida com uma ou mais glicosidases.

As enzimas de degradação de hialuronano parcialmente desglicosiladas, incluindo polipéptidos PH20 solúveis parcialmente desglicosilados, podem ter 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% do nivel de glicosilação de um polipéptido totalmente glicosilado. Tipicamente, as enzimas de degradação de hialuronano parcialmente desglicosiladas, incluindo polipéptidos PH20 solúveis parcialmente desglicosilados, exibem actividade de hialuronidase que é 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% ou mais da actividade de hialuronidase exibida pelo polipéptido totalmente glicosilado. 5. Modificações de enzimas de degradação de hialuronano para melhorar as suas propriedades farmacocinéticas

As enzimas de degradação de hialuronano podem ser modificadas para melhorar as suas propriedades farmacocinéticas, tal como aumento da sua meia-vida in vivo e/ou actividades. A modificação de enzimas de degradação de hialuronano para utilização nas composições e/ou métodos aqui proporcionados pode incluir a fixação, directamente ou indirectamente através de um ligador, tal como covalentemente ou por outro elemento de ligação estável, de um polímero, tal como dextrano, um polietilenoglicol (peguilação (PEG)) ou uma porção sialilo, ou outros polímeros, tais como polímeros naturais ou de açúcar. A peguilação de agentes terapêuticos é conhecida por aumentar a resistência a proteólise, aumentar a meia-vida no plasma, e diminuir a antigenicidade e imunogenicidade. A fixação covalente ou outra estável (conjugação) de moléculas poliméricas, tais como uma porção polietilenoglicol (PEG), à enzima de degradação de hialuronano pode assim conferir propriedades benéficas à composição de enzima-polímero resultante. Estas propriedades incluem biocompatibilidade melhorada, extensão da meia-vida (e da actividade enzimática) da proteína no sangue, células e/ou noutros tecidos num sujeito, blindagem eficaz da proteína em relação a proteases e hidrólise, biodistribuição melhorada, farmacocinética e/ou farmacodinâmica melhoradas, e solubilidade em água aumentada.

Polímeros exemplificativos que podem ser conjugados com a enzima de degradação de hialuronano, incluem homopolímeros naturais e sintéticos, tais como polióis (i.e. poli-OH), poliaminas (i.e. poli-NH2) e poli(ácidos carboxílicos) (i.e. poli-COOH), e heteropolímeros adicionais i.e. polímeros compreendendo um ou mais grupos de acoplamento diferentes e.g. um grupo hidroxilo e grupos amina. Exemplos de moléculas poliméricas adequadas incluem moléculas poliméricas seleccionadas entre poli(óxidos de alquileno) (PAO), tais como polialquilenoglicóis (PAG), incluindo polietilenoglicóis (PEG), metoxipolietilenoglicóis (mPEG) e polipropilenoglicóis, PEG-glicidiléteres (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazole (CDI-PEG) polietilenoglicóis ramificados (PEGs), poli(álcool vinílico) (PVA), policarboxilatos, polivinilpirrolidona, poli-D,L-aminoácidos, polietileno-co-anidrido de ácido maleico, poliestireno-co-anidrido de ácido maleico, dextranos incluindo carboximetil-dextranos, heparina, albumina homóloga, celuloses, incluindo metilcelulose, carboximetilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, carboxietilcelulose e hidroxipropilcelulose, hidrolisados de quitosano, amidos tais como hidroxietil-amidos e hidroxipropil-amidos, glicogénio, agaroses e seus derivados, goma guar, pululano, inulina, goma de xantano, carragenano, pectina, hidrolisados de ácido algínico e biopolímeros.

Tipicamente, os polímeros são poli(óxidos de alquileno) (PAO) , tais como poli (óxidos de etileno) , tais como PEG, tipicamente mPEG, que, em comparação com polissacáridos tais como dextrano, pululano e outros, têm poucos grupos reactivos capazes de reticulação. Tipicamente, os polímeros são moléculas poliméricas não tóxicas tais como (m)polietilenoglicol (mPEG) que podem ser conjugadas covalentemente com a enzima de degradação de hialuronano (e.g., a grupos de fixação sobre a superfície da proteína) utilizando uma química relativamente simples.

Moléculas poliméricas adequadas para fixação à enzima de degradação de hialuronano incluem, mas não estão limitadas a, poliet ilenoglicol (PEG) e derivados de PEG tais como metoxipolietilenoglicóis (mPEG), PEG-glicidiléteres (Epox-PEG) , PEG-oxicarbonil-imidazole (CDI-PEG), PEGs ramificados, e poli (óxido de etileno) (PEO) (ver e.g. Roberts et ai., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S. (eds.) "Poly (ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, Nature Reviews 2:215 et seq. (2003); e Tsubery, J. Biol. Chem. 279(37):38118-24, 2004). A molécula polimérica pode ter urn peso molecular variando tipicamente de cerca de 3 kDa a cerca de 60 kDa. Em algumas concretizações a molécula polimérica que é conjugada a uma proteína, tal como rHuPH20, tem um peso molecular de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais do que 60 kDa. São conhecidos na especialidade vários métodos para modificação de polipéptidos por fixação de modo covalente (conjugação) de um PEG ou derivado de PEG (i.e. "PEGilação") (ver e.g., US2006/0104968, US 5672662, US 6737505 e US2004/0235734). Técnicas de PEGilação incluem, mas não estão limitadas a, ligadores especializados e químicas de acoplamento (ver e.g., Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), fixação de múltiplas porções de PEG a um único local de conjugação (tal como através da utilização de PEGs ramificados; ver e.g., Veronese et al. , Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), PEGilação e/ou mono-PEGilação específicas (ver e.g., Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999), e PEGilação enzimática dirigida (ver e.g., Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002) (ver, também, por exemplo, Lu e Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138; Lu e Felix (1993) Peptide Res. 6:142-6, 1993; Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404; Brumeanu et al. (1995) J. Immunol. 154:3088-95; ver também, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77 e Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). Métodos e técnicas descritas na especialidade podem produzir proteínas possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10 PEG ou derivados de PEG fixados a uma única molécula de proteína (ver e.g., US2006/0104968). Têm sido descritos na especialidade numerosos reagentes para PEGilação. Estes reagentes incluem, mas não estão limitados a, PEG activado com N-hidroxi-sucinimidilo (NHS), sucinimidil-mPEG, mPEG2-N-hidroxi-sucinimida, alfa-metilbutanoato de mPEG-sucinimidilo, propionato de mPEG-sucinimidilo, butanoato de mPEG-sucinimidilo, éster de sucinimidilo de ácido mPEG-carboximetil-3-hidroxibutanóico, propionato de PEG-sucinimidilo homobifuncional, PEG-propionaldeído homobifuncional, PEG-butiraldeído homobifuncional, PEG-maleimida, PEG-hidrazida, p-nitrofenil-carbonato-PEG, mPEG-benzotriazole-carbonato, propionaldeído-PEG, mPEG-butiraldeído, mPEG2 ramificado-butiraldeído, mPEG-acetilo, mPEG-piperidona, mPEG-metilcetona, mPEG "sem ligador" maleimida, mPEG-vinilsulfona, mPEG-tiol, mPEG-ortopiridiltioéster, mPEG-ortopiridildissulfureto, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilsulfona-PEG-NHS, acrilato-PEG-NHS, fluoresceína-PEG-NHS e biotina-PEG-NHS (ver e.g., Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; US 5672662; US 5932462; US 6495659; US 6737505; US 4002531; US 4179337; US 5122614; US 5183550; US 5324844; US 5446090; US 5612460; US 5643575; US 5766581; US 5795569; US 5808096; US 5900461; US 5919455; US 5985263; US 5990237; US 6113906; US 6214966; US 6258351; US 6340742; US 6413507; US 6420339; US 6437025; US 6448369; US 6461802; US 6828401; US 6858736; US2001/0021763; US2001/0044526; US2001/0046481; US2002/0052430; US2002/0072573; US2002/0156047; US2003/0114647; US2003/0143596; US2003/0158333; US2003/0220447; US2004/0013637; US2004/0235734; US2005/000360; US2005/0114037; US2005/0171328; US2005/0209416; EP01064951; EP0822199; W000176640; W00002017; WO0249673; WO9428024; e WO0187 925) .

Num exemplo, a enzima de degradação de hialuronano para utilização nos métodos, composições e combinações proporcionados é uma hialuronidase solúvel que é PEGilada. Num exemplo particular, a hialuronidase solúvel é uma hialuronidase PH20 PEGilada. Noutro exemplo particular, a hialuronidase solúvel é rHuPH20 PEGilada, tal como a descrita no Exemplo 10. E. Métodos de produção de ácidos nucleicos codificando uma insulina ou enzima de degradação de hialuronano e seus polipéptidos

Polipéptidos de uma insulina e de uma enzima de degradação de hialuronano aqui apresentados podem ser obtidos por métodos bem conhecidos na especialidade para purificação de proteína e expressão de proteína recombinante. Os polipéptidos também podem ser sintetizados quimicamente. Por exemplo, a cadeia A e a cadeia B de insulina podem ser sintetizados quimicamente e depois reticulados por ligações de dissulfureto através, por exemplo, de uma reacção de redução-reoxidação. Quando os polipéptidos são produzidos por meios recombinantes, pode-se utilizar qualquer método conhecido dos peritos na especialidade para identificação de ácidos nucleicos que codificam genes desejados. Pode ser utilizado qualquer método disponível na especialidade para obter um ADNc a todo o comprimento (i.e., abrangendo toda a região de codificação) ou um clone de ADN genómico codificando uma hialuronidase, tal como a partir de uma fonte de célula ou tecido. Insulinas ou enzimas de degradação de hialuronano modificadas ou variantes podem ser produzidas por engenharia a partir de um polipéptido do tipo selvagem, tal como mutagénese dirigida.

Os polipéptidos podem ser clonados ou isolados utilizando quaisquer métodos disponíveis conhecidos na especialidade para clonagem e isolamento de moléculas de ácido nucleico. Estes métodos incluem amplificação de ácidos nucleicos por PCR e rastreio de bibliotecas, incluindo rastreio de hibridização de ácido nucleico, rastreio baseado em anticorpo e rastreio baseado em actividade. Métodos para amplificação de ácidos nucleicos podem ser utilizados para isolar moléculas de ácido nucleico codificando um polipéptido desejado, incluindo por exemplo, métodos de reacção em cadeia da polimerase (PCR). Um material contendo ácido nucleico pode ser utilizado como um material de partida a partir do qual pode ser isolada uma molécula de ácido nucleico codificando o polipéptido desejado. Por exemplo, preparações de ADN e ARNm, extractos de células, extractos de tecido, amostras de fluido (e.g. sangue, soro, saliva), amostras de sujeitos saudáveis e/ou doentes podem ser utilizados em métodos de amplificação. Podem também ser utilizadas bibliotecas de ácido nucleico como fonte de material de partida. Podem ser desenhados iniciadores para amplificar polipéptidos desejados. Por exemplo, podem ser desenhados iniciadores com base nas sequências expressas a partir das quais é gerado um polipéptido desejado. Podem ser desenhados iniciadores com base na retrotradução de uma sequência de aminoácidos de polipéptido. Moléculas de ácido nucleico, geradas por amplificação, podem ser sequenciadas e confirmadas para codificar um polipéptido desejado.

Sequências de nucleótido adicionais podem ser unidas a uma molécula de ácido nucleico codificando polipéptido, incluindo sequências de ligador contendo sítios de endonuclease de restrição para o propósito de clonagem do gene sintético num vector, por exemplo, um vector de expressão de proteína ou um vector desenhado para a amplificação das sequências ADN codificando a proteína central. Além disso, elementos de ADN funcional especificando sequências de nucleótido adicionais podem ser ligados operativamente a uma molécula de ácido nucleico codificando polipéptido. Exemplos destas sequências incluem, mas não estão limitadas a, sequências de promotor, desenhadas para facilitar a expressão de proteína intracelular, e sequências de secreção, por exemplo sequências de sinal heterólogas, desenhadas para facilitar a secreção de proteína. Estas sequências são conhecidos dos peritos na especialidade. Sequências de resíduos de nucleótidos adicionais, tais como sequências de bases especificando regiões de ligação de proteína, podem também ser ligadas às moléculas de ácido nucleico codificando enzima. Estas regiões incluem, mas não estão limitadas a, sequências de resíduos que facilitam ou codificam proteínas que facilitam a absorção de uma enzima por células alvo específicas, ou de outro modo alteram a farmacocinética de um produto de um gene sintético. Por exemplo, enzimas podem ser ligadas a porções de PEG.

Além disso, podem ser adicionados marcadores ou outras porções, por exemplo, para auxiliar na detecção ou purificação por afinidade do polipéptido. Por exemplo, sequências de resíduos de nucleótido adicionais, tais como sequências de bases especificando um epítopo marcador ou outro marcador detectável, podem também ser liqadas a moléculas de ácido nucleico codificando a enzima. Exemplificativas destas sequências incluem sequências ácido nucleico codificando um marcador de His (e.g., 6xHis, HHHHHH; SEQ ID NO:54) ou o marcador Flag (DYKDDDDK; SEQ ID NO :55).

Os ácidos nucleicos identificados e isolados podem depois ser inseridos num vector de clonagem apropriado. Pode-se utilizar um grande número de sistemas de vector-hospedeiro conhecidos na especialidade. Vectores possíveis incluem, mas não estão limitadas a, plasmídeos ou vírus modificados, mas o sistema de vector tem de ser compatível com a célula hospedeira utilizada. Estes vectores incluem, mas não estão limitados a, bacteriófagos tais como derivados lambda, ou plasmídeos tais como pCMV4, pBR322 ou derivados de plasmídeo pUC ou o vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) . Outros vectores de expressão incluem o vector de expressão HZ24 aqui exemplificado. A inserção num vector de clonagem pode ser realizada, por exemplo, por ligação do fragmento de ADN num vector de clonagem que tem terminais coesivos complementares. A inserção pode ser efectuada utilizando vectores de clonagem TOPO (INVITROGEN, Carlsbad, CA) . Se os sítios de restrição complementares utilizados para fragmentar o ADN não estão presentes no vector de clonagem, as extremidades das moléculas de ADN podem ser modificadas enzimaticamente. Alternativamente, qualquer sítio desejado pode ser produzido por ligação de sequências de nucleótidos (ligadores) nos terminais de ADN; estes ligadores ligados podem conter oligonucleótidos específicos sintetizados quimicamente codificando sequências de reconhecimento de endonuclease de restrição. Num método alternativo, o vector clivado e o gene de proteína podem ser modificados por colocação de cauda homopolimérica. As moléculas recombinantes podem ser introduzidas em células hospedeiras, por exemplo, através de transformação, transfecção, infecção, electroporação e sonoporação, tal que são geradas muitas cópias da sequência génica.

Pode-se produzir insulina utilizando uma variedade de técnicas (ver e.g. Ladisch et al. (1992) Biotechnol. Prog. 8:469-478). Em alguns exemplos, ácido nucleico codificando um polipéptido de pré-pró-insulina ou pró-insulina é inserido num vector de expressão. Após expressão, o polipéptido pré-pró-insulina ou pró-insulina é convertido em insulina por métodos enzimáticos ou químicos que clivam a sequência de sinal e/ou o péptido C, resultando nas cadeias A e B que são reticuladas por ligações de dissulfureto, por exemplo, através de uma reacção de redução-reoxidação (ver e.g. Cousens et al., (1987) Gene 61:265-275, Chance et al., (1993) Diabetes Care 4:147-154) . Noutro exemplo, os ácidos nucleicos codificando a cadeia A e a cadeia B de uma insulina são inseridos em um ou dois vectores de expressão para co-expressão como um único polipéptido a partir de um vector de expressão ou expressão como dois polipéptidos a partir de um ou dois vectores de expressão. Assim, os polipéptidos das cadeias A e B podem ser expressos separadamente e depois combinados para gerar uma insulina, ou podem ser co-expressas, na ausência de uma cadeia C. Em casos onde as cadeias A e B são co-expressas como um único polipéptido, o ácido nucleico codificando as subunidades pode também codificar um ligador ou espaçador entre a cadeia B e a cadeia A, tal como um ligador ou espaçador descrito abaixo. 0 ácido nucleico inserido no vector de expressão pode conter, por exemplo, ácido nucleico codificando a cadeia B de insulina, um ligador, tal como por exemplo, um ligador de alanina-alanina-lisina, e a cadeia A, resultando na expressão, por exemplo, de "cadeia B de insulina-Ala-Ala-Lys-cadeia A de insulina".

Em concretizações específicas, a transformação de células hospedeiras com moléculas de ADN recombinante que incorporam o gene de proteína isolada, ADNc ou uma sequência ADN sintetizada, possibilita a geração de múltiplas cópias do gene. Assim, o gene pode ser obtido em grandes quantidades por cultura dos transformantes, isolamento das moléculas de ADN recombinante a partir dos transformantes e, quando necessário, recuperação do gene inserido a partir do ADN recombinante isolado. 1. Vectores e células

Para expressão recombinante de uma ou mais das proteínas desejadas, tais como quaisquer das aqui descritas, o ácido nucleico contendo a totalidade ou uma porção da sequência de nucleótidos codificando a proteína pode ser inserido num vector de expressão apropriado, i.e., um vector que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência de codificação de proteína inseridos. Os sinais de transcrição e translação necessários podem também ser fornecidos pelo promotor nativo para genes de enzima, e/ou suas regiões de flanqueamento. São também proporcionados vectores que contêm um ácido nucleico codificando a enzima. São também proporcionadas células contendo os vectores. As células incluem células eucarióticas e procarióticas, e os vectores são quaisquer adequados para utilização nas mesmas. São proporcionadas células procarióticas e eucarióticas, incluindo células endoteliais, contendo os vectores. Estas células incluem células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Archea, células de planta, células de insecto e células de animal. As células são utilizadas para produzir uma sua proteína cultivando as células acima descritas sob condições nas quais a proteína codificada é expressa pelas células, e recuperação da proteína expressa. Para os presentes propósitos, por exemplo, a enzima pode ser segregada para o meio. São proporcionados vectores que contêm uma sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido de hialuronidase solúvel acoplado à sequência de sinal nativa ou heteróloga, bem como suas múltiplas cópias. Os vectores podem ser seleccionados para expressão da proteína enzimática na célula ou tal que a proteína enzimática seja expressa como uma proteína segregada.

Pode-se utilizar uma variedade de sistemas de hospedeiro-vector para exprimir a sequência de codificação de proteína. Estes incluem mas não estão limitados a sistemas de células de mamífero infetadas com vírus (e.g. vírus vacínia, adenovirus e outros vírus); sistemas de células de insecto infectas com vírus (e.g. baculovírus); microrganismos tais como levedura contendo vectores de levedura; ou bactérias transformadas com bacteriófago, ADN, ADN de plasmídeo ou ADN de cosmídeo. Os elementos de expressão de vectores variam nas suas forças e especificidades. Dependendo do sistema de hospedeiro-vector utilizado, pode-se utilizar qualquer um de um número de elementos de transcrição e tradução.

Podem-se utilizar quaisquer métodos conhecidos dos peritos na especialidade para a inserção de fragmentos de ADN num vector para construir vectores de expressão contendo um gene quimérico contendo sinais de controlo de transcrição/tradução apropriados e sequências de codificação de proteína. Estes métodos podem incluir técnicas de síntese e de ADN recombinante in vitro e recombinantes in vivo (recombinação genética). A expressão de sequências de ácido nucleico codificando proteína, ou seus domínios, derivados, fragmentos ou homólogos, pode ser regulada por uma segunda sequência de ácido nucleico tal que os genes ou seus fragmentos são expressos num hospedeiro transformado com a(s) molécula (s) de ADN recombinante. Por exemplo, a expressão das proteínas pode ser controlada por qualquer promotor/intensificador conhecido na especialidade. Numa concretização específica, o promotor não é nativo para os genes para uma proteína desejada. Promotores que podem ser utilizados incluem mas não estão limitados ao promotor precoce de SV40 (Bernoist e Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), o promotor contido na repetição de terminal longo 3' de vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto et ai. Cell 22:787-797 (1980)), o promotor de timidina-quinase de herpes ('Wagner et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:1441-1445 (1981)), as sequências reguladoras do gene de metalotioneína (Brinster et ai., Nature 296:39-42 (1982)); vectores expressão procarióticos tais como o promotor de -lactamase (Jay et ai., (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:5543) ou o promotor tac (DeBoer et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:21-25 (1983)); ver também "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": em Scientific American 242:79-94 (1980)); vectores de expressão de planta contendo o promotor de nopalina-sintetase (Herrara-Estrella et ai., Nature 303:209-213 (1984)) ou o promotor de ARN 35S de vírus do mosaico de couve-flor (Garder et ai., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), e o promotor da enzima fotossintética ribulose-bisfosfato-carboxilase (Herrera-Estrella et al. , Nature 310:115-120 (1984)); elementos de promotor a partir de levedura e outros fungos tais como ο promotor Gal4, o promotor de álcool-desidrogenase, o promotor de fosfoglicerol-quinase, o promotor de fosfatase alcalina, e as regiões de controlo de transcrição de animal seguintes que exibem especificidade de tecido e que têm sido utilizadas em animais transgénicos: região de controlo do gene de elastase I que é activa em células acinares pancreáticas (Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); região de controlo do gene de insulina que é activa em células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)), região de controlo do gene de imunoglobulina que é activa em células linfóides (Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), região de controlo do virus de tumor mamário de ratinho que é activa em células testiculares, células da mama, células linfóides e mastócitos (Leder et al., Cell 45:485-495 (1986) ), região de controlo do gene de albumina que é activa no fígado (Pinckert et al. , Genes and Devei. 1:268-276 (1987)), região de controlo do gene de alfa-fetoproteína que é activa no fígado (Krumlauf et al. , Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)), região de controlo do gene de antitripsina alfa-1 que é activa no fígado (Kelsey et al., Genes and Devei. 1: 161-171 (1987)), região de controlo do gene de beta-globina que é activa em células mielóides (Magram et al. , Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al. , Cell 46:89-94 (1986)), região de controlo do gene da proteína básica mielina que é activa em células de oligodendrócitos do cérebro (Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987) ), região de controlo do gene da cadeia leve 2 de miosina que é activa no músculo esquelético (Shani, Nature 314:283-286 (1985)), região de controlo do gene da hormona de libertação gonadotrófica que é activa em gonadotrófos do hipotálamo (Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)).

Numa concretização específica, é utilizado um vector que contém um promotor ligado operavelmente a ácidos nucleicos codificando uma proteína desejada, ou um seu domínio, fragmento, derivado ou homólogo, uma ou mais origens de replicação e, opcionalmente, um ou mais marcadores seleccionáveis (e.g., um gene de resistência a antibiótico). Vectores de plasmídeo exemplificativos para transformação de células de E. coli, incluem, por exemplo, os vectores de expressão pQE (disponíveis na Qiagen, Valencia, CA; ver também a literatura publicada pela Qiagen descrevendo o sistema). Os vectores pQE possuem um promotor T5 de fago (reconhecido por ARN-polimerase de E. coli) e um módulo de repressão de operador lac duplo para proporcionar expressão de nível elevado, fortemente regulada, de proteínas recombinantes em E. coli, um local de ligação ribossómica sintético (RBS II) para tradução eficiente, uma sequência de codificação de marcador 6xHis, terminadores de transcrição to e Tl, origem de replicação ColEl e um gene de beta-lactamase para conferir resistência à ampicilina. Os vectores pQE possibilitam a colocação de um marcador 6xHis quer no terminal N quer no terminal C da proteína recombinante. Estes plasmídeos incluem pQE 32, pQE 30 e pQE 31 que proporcionam locais de clonagem múltiplos para todas as três molduras de leitura e proporcionam a expressão de proteínas marcadas com 6xHis N-terminalmente. Outros vectores de plasmídeo exemplificativos para transformação de células de E. coli, incluem, por exemplo, os vectores de expressão pET (ver, Patente dos E.U.A. 4952496; disponível na NOVAGEN, Madison, WI; ver também literatura publicada pela Novagen descrevendo o sistema). Estes plasmídeos incluem pET 11a, que contém o promotor T71ac, o terminador T7, o operador lac induzível de E. coli, e o gene de repressor de lac; pET 12a-c, que contém o promotor T7, o terminador T7, e o sinal de secreção ompT de E. coli; e pET15b e pET19b (NOVAGEN, Madison, WI), que contêm uma sequência líder His-Tag™ para utilização em purificação com uma coluna de His e um sítio de clivagem de trombina que permite a clivagem após purificação sobre a coluna, a região de promotor T7-lac e o terminador T7.

Um vector exemplificativo para expressão em células de mamífero é o vector de expressão HZ24. O vector de expressão HZ24 foi obtido a partir da cadeia central do vector pCI (Promega). Contém ADN codificando o gene de resistência de beta-lactamase (AmpR), uma origem de replicação Fl, uma região de intensificador/promotor imediato-precoce de citomegalovírus (CMV), e um sinal de poliadenilação tardio de SV40 (SV40). O vector de expressão possui também um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) do vírus ECMV (Clontech) e o gene de di-hidrofolato-redutase (DHFR) de ratinho. 2. Porções de ligador

Em alguns exemplos, a insulina é preparada gerando os polipéptidos de cadeia A e cadeia B com um ligador, tal gue, por exemplo, o terminal C da cadeia B está unido ao terminal N da cadeia A por um ligador curto. A cadeia A e a cadeia B podem ser expressas a partir de um único polipéptido contendo um ligador, ou podem ser expressas separadamente e depois unidas por um ligador. A porção de ligador é seleccionada dependendo das propriedades desejadas. A porção de ligador deverá ser longa o suficiente e flexível o suficiente para permitir à cadeia A e à cadeia B mimetizarem a conformação natural da insulina. Os ligadores podem ser gualguer porção adeguada para a cadeia A e para a cadeia B de insulina. Estas porções incluem, mas não estão limitadas a, elementos de ligação peptídica; elementos de ligação de aminoácido e péptido, tipicamente contendo entre um e cerca de 60 aminoácidos; ligadores guímicos, tais como ligadores cruzados cliváveis heterobifuncionais, ligadores fotocliváveis e ligadores cliváveis por ácido.

As porções de ligador podem ser péptidos. O péptido tipicamente tem de cerca de 2 a cerca de 60 resíduos de aminoácido, por exemplo de cerca de 5 a cerca de 40, ou de cerca de 10 a cerca de 30 resíduos de aminoácido. Os ligadores peptídicos podem convenientemente ser codificados por ácido nucleico e incorporados em proteínas de fusão após expressão numa célula hospedeira, tal como E. coli. Num exemplo, um ligador de alanina-alanina-lisina (AAK) (SEQ ID NO:178) está codificado num ácido nucleico entre o ácido nucleico codificando a cadeia B de insulina e o ácido nucleico codificando a cadeia A, tal gue por expressão, é produzido um polipéptido "cadeia B de insulina-AAK-cadeia A de insulina". Os ligadores de péptido podem ser uma sequência de aminoácido de espaçador flexível, tal como os conhecidos na investigação de anticorpo de cadeia simples. Exemplos destas porções de ligador conhecidas incluem, mas não estão limitadas a, RPPPPC (SEQ ID NO: 166) ou SSPPPPC (SEQ ID NO:167), GGGGS (SEQ ID NO:168), (GGGGS)n (SEQ. ID NO:169), GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO :17 0) , GSTSGSGKSSEGKG (SEQ. ID NO:171), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO :172), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO:173), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:174), EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO :175) , SRSSG (SEQ. ID NO:176) e SGSSC (SEQ ID NO:177).

Alternativamente, a porção de ligador de péptido pode ser VM (SEQ ID NO: 179) ou AM (SEQ ID NO: 180), ou pode ter a estrutura descrita pela fórmula: AM(G2 a 4S)XAM onde X é um inteiro de 1 a 11 (SEQ ID NO: 181) . Porções de ligação adicionais são descritas, por exemplo, em Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:587 9-58 83; Whitlow, M., et al. (1993) Protein Engineering 6:989-995; Newton et al. (1996) Biochemistry 35:545-553; A. J. Cumber et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:397-401; Ladurner et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:330-337; e Patente dos E.U.A. N.2 4894443.

Em alguns exemplos, ligadores de péptido são codificados por ácido nucleico e incorporados entre a cadeia B e a cadeia A após expressão numa célula hospedeira, tal como E. coli ou S. cerevisiae. Noutros exemplos, um ligador de péptido é sintetizado por métodos químicos. Isto pode ser realizado num protocolo separado para a síntese de uma ou mais das cadeias A e B, após o que os componentes são unidos, tal como através da utilização de ligadores heterobifuncionais. Alternativamente, um péptido ligador pode ser sintetizado no terminal N ou C de uma das cadeias de insulina, que é depois ligada à outra cadeia através do ligador de péptido, tal como com um ligador heterobifuncional.

Pode ser aqui utilizado qualquer ligador conhecido dos peritos na especialidade para ligar a cadeia A e a cadeia B de insulina. Ligadores e elementos de ligação que são adequados para ligarem quimicamente as cadeias incluem, mas não estão limitados a, ligações de dissulfureto, ligações de tioéter, ligações de dissulfureto impedidas e ligações covalentes entre grupos reactivos livres, tais como grupos amina e tiol. Estas ligações são produzidas utilizando reagentes heterobifuncionais para produzir grupos tiol reactivos sobre um ou ambos os polipéptidos e depois fazendo reagir os grupos tiol sobre um polipéptido com grupos tiol ou grupos amina reactivos aos quais grupos maleimido ou grupos tiol reactivos podem ser fixados. Outros ligadores incluem, ligadores cliváveis por ácido, tais como bismaleimidoetoxipropano, conjugados de transferrina lábeis a ácido e di-hidrazida de ácido adípico, que serão clivados em compartimentos celulares mais ácidos; ligadores cruzados que serão clivados por exposição a UV ou luz visível e ligadores tais como os vários domínios, tais como CHI, CH2 e CH3, a partir da região constante de IgGl humana (ver, Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30:379-386) . Em algumas concretizações, podem ser incluídos vários ligadores de modo a tirar partido de propriedades desejadas de cada ligador. Ligadores químicos e ligadores de péptido podem ser inseridos acoplando de modo covalente o ligador à cadeia A e à cadeia B de insulina. Os agentes heterobifuncionais, descritos abaixo, podem ser utilizados para efectuar este acoplamento covalente. Ligadores de péptido podem também ser ligados por expressão de ADN codificando o ligador entre e cadeia B e a cadeia A.

Outros ligadores que podem ser utilizados para unir a cadeia A e a cadeia B de insulina incluem: substratos de enzima, tais como substrato de catepsina B, substrato de catepsina D, substrato de tripsina, substrato de trombina, substrato de subtilisina, substrato de Factor Xa, e substrato de enteroquinase; ligadores que aumentam a solubilidade, a flexibilidade e/ou a facilidade de clivagem intracelular incluem ligadores tais como (glymser)n e (sermgly)n, nos quais m é 1 a 6, preferivelmente 1 a 4, mais preferivelmente 2 a 4, e n é 1 a 30, preferivelmente 1 a 10, mais preferivelmente 1 a 4 (ver, e.g., Pedido de Patente Internacional PCT N.2 WO96/06641, que proporciona ligadores exemplificativos). Em algumas concretizações, podem ser incluídos vários ligadores de modo a tirar partido de propriedades desejadas de cada ligador. 3. Expressão

Polipéptidos de insulina e enzima de degradação de hialuronano podem ser produzidos por qualquer método conhecido dos peritos na especialidade incluindo métodos in vivo e in vitro. Proteínas desejadas podem ser expressas em qualquer organismo adequado para produzir as quantidades e formas requeridas das proteínas, tal como necessário, por exemplo, para administração e tratamento. Hospedeiros de expressão incluem organismos de procariotas e eucariotas tais como E. coli, levedura, plantas, células de insecto, células de mamífero, incluindo linhas de células de humano e animais transgénicos. Os hospedeiros de expressão podem diferir nos seus níveis de produção de proteína bem como nos tipos de modificações pós-tradução que estão presentes nas proteínas expressas. A escolha do hospedeiro de expressão pode ser feita com base nestes e noutros factores, tais como considerações regulamentares e de segurança, custos de produção e a necessidade e métodos para purificação.

Muitos vectores de expressão estão disponíveis e são conhecidos dos peritos na especialidade e podem ser utilizados para expressão de proteínas. A escolha do vector de expressão será influenciada pela escolha do sistema de expressão de hospedeiro. Em geral, vectores de expressão podem incluir promotores de transcrição e opcionalmente intensificadores, sinais de tradução, e sinais de terminação de transcrição e de tradução. Vectores de expressão que são utilizados para transformação estável possuem tipicamente um marcador seleccionável que permite a selecção e manutenção das células transformadas. Em alguns casos, pode-se utilizar uma origem de replicação para amplificar o número de cópias do vector.

Polipéptidos de hialuronidase solúvel podem também ser utilizados ou expressos como fusões de proteína. Por exemplo, uma fusão de enzima pode ser gerada para acrescentar funcionalidade adicional a uma enzima. Exemplos de proteínas de fusão de enzima incluem, mas não estão limitados a, fusões de uma sequência de sinal, um marcador tal como para localização, e.g. uma marcador his6 ou um marcador myc, ou um marcador para purificação, por exemplo, uma fusão GST, e uma sequência para dirigir a secreção de proteína e/ou a associação à membrana. a. Células procarióticas

Procariotas, especialmente E. coli, proporcionam um sistema para produzir grandes quantidades de proteínas. A transformação de E. coli é uma técnica simples e rápida bem conhecida dos peritos na especialidade. Vectores de expressão para E. coli podem conter promotores induzíveis, e estes promotores são úteis para induzir niveis elevados de expressão de proteína e para exprimir proteínas que exibem alguma toxicidade para as células hospedeiras. Exemplos de promotores induzíveis incluem o promotor lac, o promotor trp, o promotor tac híbrido, os promotores de ARN T7 e SP6 e o promotor PL regulado por temperatura.

Proteínas, tais como quaisquer das aqui proporcionadas, podem ser expressas no ambiente citoplásmico de E. coli. 0 citoplasma é um ambiente redutor e para algumas moléculas, isto pode resultar na formação de corpos de inclusão insolúveis. Agentes redutores tais como ditiotreitol e mercaptoetanol e desnaturantes, tais como guanidina-HCl e ureia podem ser utilizados para re-solubilizar as proteínas. Uma abordagem alternativa é a expressão de proteínas no espaço periplásmico de bactérias que proporciona um ambiente oxidante e isomerases de dissulfureto e semelhantes a chaperonina e pode conduzir à produção de proteína solúvel. Tipicamente, uma sequência líder é fundida com a proteína a ser expressa que dirige a proteína para o periplasma. A sequência líder é depois removida por peptidases de sinal no interior do periplasma. Exemplos de sequências líder de direccionamento periplásmico incluem a sequência líder pelB do gene de pectato-liase e a sequência líder derivada do gene de fosfatase alcalina. Em alguns casos, a expressão periplásmica permite a fuga da proteína expressa para o meio de cultura. A secreção de proteínas permite a purificação rápida e simples a partir do sobrenadante de cultura. Proteínas que não são segregadas podem ser obtidas a partir do periplasma por lise osmótica. Similar à expressão citoplásmica, em alguns casos as proteínas podem-se tornar insolúveis e podem-se utilizar agentes desnaturantes e redutores para facilitar a solubilização e a redobragem. A temperatura de indução e crescimento podem também influenciar os níveis de expressão e a solubilidade, e tipicamente usam-se temperaturas entre 25°C e 37°C. Tipicamente, as bactérias produzem proteínas não glicosiladas. Assim, se as proteínas requerem glicosilação para funcionar, a glicosilação pode ser acrescentada in vitro após purificação a partir das células hospedeiras. b. Células de levedura

Leveduras tais como Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolitica, Kluyveromyces lactis e Pichia pastoris são hospedeiros de expressão de levedura bem conhecidos que podem ser utilizados para produção de proteínas, tais como quaisquer das aqui descritas. A levedura pode ser transformada com vectores replicantes epissómicos ou por integração cromossómica estável por recombinação homóloga. Tipicamente, utilizam-se promotores induzíveis para regular a expressão génica. Exemplos destes promotores incluem GAL1, GAL7 e GAL5 e promotores de metalotioneína, tais como CUP1, A0X1 ou outro promotor de Pichia ou de outra levedura. Vectores de expressão incluem frequentemente um marcador seleccionável tal como LEU2, TRP1, HIS3 e URA3 para selecção e manutenção do ADN transformado. As proteínas expressas em levedura são muitas vezes solúveis. A co-expressão com chaperoninas tais como Bip e proteína-dissulfureto-isomerase pode melhorar os níveis de expressão e a solubilidade. Adicionalmente, proteínas expressas em levedura podem ser dirigidas para secreção utilizando fusões de péptido de sinal de secreção tais como o sinal de secreção de factor alfa tipo compatível de levedura a partir de Saccharomyces cerevisae e fusões com proteínas de superfície de célula de levedura tais como o receptor de adesão compatível Aga2p ou a glucoamilase de Arxula adeninivorans. Um sítio de clivagem por protease tal como para a protease Kex-2, pode ser introduzido por engenharia para remover as sequências fundidas dos polipéptidos expressos à medida que estes saem dos percursos de secreção. A levedura também é susceptível de glicosilação nos motivos Asn-X-Ser/Thr. c. Células de insecto Células de insecto, particularmente utilizando expressão de baculovírus, são úteis para exprimir polipéptidos tais como polipéptidos de hialuronidase. As células de insecto exprimem níveis elevados de proteína e são capazes da maioria das modificações pós-tradução utilizadas por eucariotas superiores. 0 baculovírus tem uma gama de hospedeiros restrita o que melhora a segurança e reduz as preocupações regulamentares da expressão eucariótica. Vectores de expressão típicos utilizam um promotor para expressão de nível elevado tal como o promotor poliedrina de baculovírus. Sistemas de baculovírus habitualmente utilizados incluem os baculovírus tais como vírus de poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) e o vírus de poliedrose nuclear de Bombyx mori (BmNPV) e uma linha de células de insecto tal como Sf9 derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpNl). Para expressão de nível elevado, a sequência de nucleótidos da molécula a ser expressa é fundida imediatamente a jusante do codão de iniciação de poliedrina do vírus. Sinais de secreção de mamífero são processados com exactidão em células de insecto e podem ser utilizados para segregar a proteína expressa no meio de cultura. Além disso, as linhas de células de Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpNl) produzem proteínas com padrões de glicosilação similares aos sistemas de células de mamífero.

Um sistema de expressão alternativo em células de insecto é a utilização de células transformadas de modo estável. Linhas de células tais como as células Schneider 2 (S 2) e Kc (Drosophila melanogaster) e as células C7 (Aedes albopictus) podem ser utilizadas para expressão. 0 promotor de metalotioneína de Drosophila pode ser utilizado para induzir níveis elevados de expressão na presença de indução de metal pesado com cádmio ou cobre. Os vectores de expressão são tipicamente mantidos pela utilização de marcadores seleccionáveis tais como neomicina e higromicina. d. Células de mamifero

Podem-se utilizar sistemas de expressão de mamífero para exprimir proteínas incluindo polipéptidos de hialuronidase solúvel. Constructos de expressão podem ser transferidos para células de mamífero por infecção virai tal como adenovirus ou por transferência de ADN directa tal como com lipossomas, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano e por meios físicos tais como electroporação e micro-injecção. Vectores de expressão para células de mamífero incluem tipicamente um sítio de tampa de ARNm, uma caixa TATA, uma sequência de iniciação da tradução (sequência de consenso Kozak) e elementos de poliadenilação. Podem também ser adicionados elementos IRES para permitir a expressão bis-cistrónica com outro gene, tal como um marcador seleccionável. Estes vectores incluem muitas vezes promotores intensificadores de transcrição para expressão de nivel elevado, por exemplo o promotor intensificador SV40, o promotor de citomegalovirus (CMV) de humano e o promotor da repetição de terminal longo de virus do sarcoma de Rous (RSV) . Estes promotores intensificadores são activos em muitos tipos de células. Promotores de tipo tecido e celular e regiões de intensificador podem ser utilizados para expressão. Regiões de promotor/intensificador exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, aguelas de genes tais como elastase I, insulina, imunoglobulina, virus de tumor mamário de ratinho, albumina, alfa-fetoproteina, antitripsina-alfa 1, beta- globina, proteína básica mielina, cadeia leve 2 de miosina, e controlo do gene de hormona de libertação gonadotrófica. Podem ser utilizados marcadores seleccionáveis para seleccionar e manter células com o constructo de expressão. Exemplos de genes de marcador seleccionável incluem, mas não estão limitados a, higromicina-B-fosfotransferase, adenosina-desaminase, xantina-guanina-fosforribosil-transferase, aminoglicósido-fosfotransferase, di-hidrofolato-redutase (DHFR) e timidina-guinase. Por exemplo, a expressão pode ser realizada na presença de metotrexato para seleccionar apenas aguelas células gue exprimem o gene de DHFR. A fusão com moléculas de sinalização da superfície celular tais como TCR- e Efèl-pode dirigir a expressão das proteínas num estado activo sobre a superfície celular.

Estão disponíveis muitos tipos de células para expressão de mamífero incluindo células de ratinho, rato, humano, macaco, galinha e hamster. Linhas de células exemplificativas incluem mas não estão limitadas a CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NSO de ratinho (não secretora) e outras linhas de células de mieloma, linhas de células de hibridoma e hetero-hibridoma, linfócitos, fibroblastos, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8 e células HKB. Estão também disponíveis linhas de células adaptadas para meios isentos de soro o gue facilita a purificação de proteínas segregadas a partir dos meios de cultura de células. Exemplos incluem células CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat # 11619-012) e a linha de células EBNA-1 isenta de soro (Pham et ai., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.) . Estão também disponíveis linhas de células adaptadas para crescerem em meios especiais optimizados para expressão máxima. Por exemplo, as células CHO DG44 estão adaptadas para crescerem em cultura de suspensão num meio isento de produtos animais, definido quimicamente. e. Plantas Células de plantas e plantas transgénicas podem ser utilizadas para exprimir proteínas tais como quaisquer das aqui descritas. Constructos de expressão são tipicamente transferidos para plantas utilizando transferência de ADN directa tal como bombardeamento de microprojécteis e transferência mediada por PEG em protoplastos, e com transformação mediada por Agrobacterium. Os vectores de expressão podem incluir sequências de promotor e intensificador, elementos de terminação de transcrição e elementos de controlo de tradução. Vectores de expressão e técnicas de transformação estão usualmente divididas entre hospedeiros de dicotiledónea, tais como Arabidopsis e tabaco, e hospedeiros de monocotiledónea, tais como milho e arroz. Exemplos de promotores de planta utilizados para expressão incluem o promotor de vírus do mosaico de couve-flor, o promotor de nopalina-sintase, o promotor de ribose-bisfosfato-carboxilase e os promotores de ubiquitina e UBQ3. Utilizam-se muitas vezes marcadores seleccionáveis tais como higromicina, fosfomanose-isomerase e neomicina-fosfotransferase para facilitar a selecção e manutenção de células transformadas. Células de plantas transformadas podem ser mantidas em cultura como células, agregados (tecido caloso) ou regeneradas em plantas inteiras. Células de plantas transgénicas podem também incluir algas transformadas por engenharia para produzir polipéptidos hialuronidase. Porque as plantas têm padrões de glicosilação diferentes dos das células de mamífero, isto pode influenciar a escolha da proteína produzida nestes hospedeiros. 4. Técnicas e purificação 0 método para purificação de polipéptidos, incluindo polipéptidos de insulina e enzima de degradação de hialuronano ou outras proteínas, a partir de células hospedeiras dependerá das células hospedeiras e sistemas de expressão escolhidos. Para moléculas segregadas, as proteínas são geralmente purificadas a partir dos meios de cultura após remoção das células. Para expressão intracelular, as células podem ser lisadas e as proteínas purificadas a partir do extracto. Quando se utilizam para expressão organismos transgénicos tais como plantas e animais transgénicos, tecidos ou órgãos podem ser utilizados como material de partida para produzir um extracto de células lisadas. Adicionalmente, a produção de animais transgénicos pode incluir a produção de polipéptidos em leite ou ovos gue podem ser colhidos e, se necessário, as proteínas podem ser extraídas e adicionalmente purificadas utilizando métodos padrão na especialidade.

Proteínas, tais como polipéptidos de insulina ou polipéptidos de enzima de degradação de hialuronano, podem ser purificadas utilizando técnicas padrão de purificação de proteínas conhecidas na especialidade incluindo, mas não limitadas a, SDS-PAGE, cromatografia de fraccionamento de tamanhos e exclusão de tamanhos, precipitação com sulfato de amónio e cromatografia de permuta iónica, tal como permuta aniónica. Podem-se também utilizar técnicas de purificação por afinidade para melhorar a eficiência e pureza das preparações. Por exemplo, podem-se utilizar anticorpos, receptores e outras moléculas gue se ligam a enzimas de hialuronidase em purificação por afinidade. Os constructos de expressão podem também ser transformados por engenharia para adicionar um marcador de afinidade a uma proteína tal como um epítopo myc, fusão GST ou His6 e purificados por afinidade com anticorpo de myc, resina de glutationa e resina de Ni, respectivamente. A pureza pode ser avaliada por gualguer método conhecido na especialidade incluindo electroforese em gel, métodos de HPLC ortogonal, coloração e técnicas espectrofotométricas. F. Preparação, formulação e administração de polipéptidos de insulina e enzima de degradação de hialuronano

Composições farmacêuticas de insulina de acção rápida e enzimas de degradação de hialuronano são aqui proporcionadas para administração. Enzimas de degradação de hialuronano são co-formuladas ou co-administradas com formulações farmacêuticas de insulina de acção rápida para melhorar a entrega de insulina de acção rápida ao sangue por aumento da velocidade de absorção e aumento da biodisponibilidade de insulina. A velocidade de absorção e a biodisponibilidade aumentadas podem ser conseguidas, por exemplo, por despolimerização reversível de hialuronano pela enzima de degradação de hialuronano, o que temporariamente (tipicamente durante um período de menos de 24 horas) aumenta a condutividade hidráulica do espaço subcutâneo. Assim, podem-se utilizar enzimas de degradação de hialuronano para conseguir concentrações da insulina mais elevadas e/ou conseguidas mais rapidamente após administração parentérica, tal como, por exemplo, subcutânea, em comparação com métodos convencionais de administração subcutânea, para proporcionar, por exemplo, uma resposta mais potente e/ou mais rápida para uma dada dose. A co-administração de uma enzima de degradação de hialuronano com uma insulina de acção rápida, por conseguinte, pode tornar a insulina de acção rápida uma insulina de acção super-rápida. As enzimas de degradação de hialuronano também podem ser utilizadas para conseguir controlo glicémico com uma dose mais baixa de insulina administrada. A capacidade de enzimas de degradação de hialuronano para melhorar o fluxo de fluido em massa no local e próximo do local de injecção ou perfusão pode também melhorar outros aspectos da entrega farmacológica associada. Por exemplo, o aumento no fluxo de fluido em massa pode ajudar a permitir que o volume de fluido injectado seja mais prontamente disperso a partir do local de injecção (reduzindo potencialmente a dor ou outras consequências adversas da injecção). Isto é particularmente importante para perfusões subcutâneas para permitir que sejam administradas doses mais elevadas.

Assim, em virtude da velocidade de absorção aumentada, insulinas de acção rápida administradas parentericamente podem tornar-se insulinas de acção super-rápida quando administradas com uma enzima de degradação de hialuronano. As vantagens em relação à administração de insulina sem uma enzima de degradação de hialuronano é que enzima de degradação de hialuronano/insulina co-administradas ou co-formuladas podem resultar em regimes de doseamento mais favoráveis, por exemplo, doses de insulina mais baixas e/ou a utilização de sistemas em circuito fechado mais eficazes, e efeitos terapêuticos melhorados, por exemplo, controlo glicémico mais eficiente e/ou excesso de insulina reduzido. Por exemplo, por diminuição da dose, efeitos secundários associados a insulina em excesso na circulação, tal como observado com doses de insulina mais elevadas, podem ser reduzidos. Estes efeitos secundários incluem, mas não estão limitadas a, hipoglicemia e obesidade.

As composições podem ser formuladas em forma liofilizada ou liquida. Quando as composições são proporcionadas em forma liofilizada estas podem ser reconstituídas imediatamente antes da utilização por uma solução apropriada, por exemplo, uma solução salina estéril ou água para injecção estéril. As composições podem ser proporcionadas em conjunto ou separadamente. Por exemplo, a insulina de acção rápida e a enzima de degradação de hialuronano podem ser co-formuladas numa única composição, ou podem ser proporcionadas como composições separadas. Quando proporcionadas como composições separadas, a enzima de degradação de hialuronano e a insulina podem ser embaladas para administração em conjunto, sequencialmente ou intermitentemente. As combinações podem ser embaladas como um kit. 1. Formulações

Os compostos podem ser formuladas em quaisquer preparações farmacêuticas adequadas para administração parentérica tais como soluções, suspensões, formulações de libertação sustida, ou pós. Tipicamente, os compostos são formulados em composições farmacêuticas utilizando técnicas e procedimentos bem conhecidos na especialidade (ver e.g., Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Quarta Edição, 1985, 126). Composições farmaceuticamente aceitáveis são preparadas à luz das aprovações de uma agência reguladora ou outra agência, preparadas de acordo com uma farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em animais e em humanos. A formulação deverá ser adequada ao modo de administração.

Composições farmacêuticas podem incluir transportadores tais como um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com os quais uma enzima de degradação de hialuronano e insulina são administrados. Exemplos de transportadores farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Estas composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, geralmente em forma purificada ou forma parcialmente purificada, em conjunto com uma quantidade adequada de transportador de modo a proporcionar a forma para administração apropriada ao paciente. Estes transportadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como áqua e óleos, incluindo os de origem no petróleo, animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral e óleo de sésamo. A água é um transportador típico quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Soluções salinas e aquosas de dextrose e soluções de glicerol podem também ser utilizadas como transportadores líquidos, particularmente para soluções injectáveis. As composições podem conter em conjunto com um ingrediente activo: um agente de volume tal como lactose, sacarose, fosfato de dicálcio ou carboximetilcelulose; um lubrificante, tal como estearato de magnésio, estearato de cálcio e talco; e um ligante tal como amido, gomas naturais, tais como goma-arábica, gelatina, glicose, melaços, polivinilpirrolidina, celuloses e seus derivados, povidona, crospovidonas e outros destes ligandos conhecidos dos peritos na especialidade. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, glicerina, talco, cloreto de sódio, leite magro em pó, glicerol, propilenoglicol, água e etanol. Se desejado, uma composição pode também conter quantidades menores de agentes molhantes ou emulsionantes, ou agentes de tamponamento de pH, por exemplo, acetato, citrato de sódio, glicerina, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitano, trietanolamina-acetato de sódio, trietanolamina-oleato, e outros destes agentes.

Compostos farmacêuticos terapeuticamente activos e seus derivados são tipicamente formulados e administrados em formas de dosagem unitária ou formas de dosagem múltipla. Cada dose unitária contém uma quantidade predeterminada de composto terapeuticamente activo suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o transportador, veículo ou diluente farmacêutico requerido. Exemplos de formas de dose unitária incluem ampolas e seringas e comprimidos ou cápsulas embalados individualmente. Formas de dose unitária podem ser administradas em fracções ou seus múltiplos. Uma forma de dose múltipla é uma pluralidade de formas de dosagem unitárias idênticas embaladas num único recipiente para serem administradas em forma de dose unitária segregada. Exemplos de formas de dose múltipla incluem frascos de injectáveis, cartuchos, frascos de comprimidos ou cápsulas ou frascos de litro ou garrafões. Assim, uma forma de dose múltipla é um múltiplo de doses unitárias que não estão segregadas na embalagem. Geralmente, podem ser preparadas formas de dosagem ou composições contendo ingrediente activo na gama de 0,005% a 100% com o restante constituído de um transportador não tóxico.

Composições aqui proporcionadas são tipicamente formuladas para administração por via subcutânea, ainda que sejam comtempladas outras vias de administração, tais como qualquer via conhecida dos peritos na especialidade incluindo administração intramuscular, intraperitoneal, intravenosas, intradérmica, intralesão, injecção intraperitoneal, epidural, vaginal, rectal, local, ótica, transdérmica ou qualquer outra via. Formulações adequadas para estas vias são conhecidas de um perito na especialidade. A administração pode ser local, tópica ou sistémica dependendo do local de tratamento. A administração local a uma área necessitada de tratamento pode ser, por exemplo, mas não limitada a, perfusão local durante a cirurgia, aplicação tópica, e.g., em conjunto com uma cobertura de ferida após cirurgia, por injecção, por meio de um cateter, por meio de um supositório, ou por meio de um implante. As composições podem também ser administradas com outros agentes biologicamente activos, sequencialmente, intermitentemente ou na mesma composição. A via mais adequada num qualquer caso depende de uma variedade de factores, tais como a natureza da doença, a tolerância do sujeito a uma via de administração particular, a gravidade da doença, e a composição particular que é utilizada. Tipicamente, as composições aqui proporcionadas são administradas parentericamente. Em alguns exemplos, enzimas de degradação de hialuronano são administradas tal que estas atingem o interstício de pele ou tecidos, degradando por isso o espaço intersticial para entrega de insulina subsequente. Assim, em alguns exemplos, é contemplada a administração sob a pele, tal como por métodos de administração subcutânea. Assim, num exemplo, a administração local pode ser conseguida por injecção, tal como a partir de uma seringa ou caneta de insulina ou outro artigo fabricado contendo um dispositivo de injecção tal como uma agulha. Noutro exemplo, a administração local pode ser conseguida por perfusão, o que pode ser facilitado pela utilização de uma bomba ou outro dispositivo similar. São também contemplados outros modos de administração. As composições farmacêuticas podem ser formuladas em formas de dosagem apropriadas para cada via de administração. É aqui contemplada a administração subcutânea, geralmente caracterizada por injecção ou perfusão. Os injectáveis podem ser preparados em formas convencionais, como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injecção, ou como emulsões. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou etanol. As composições farmacêuticas podem conter outras quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes de tamponamento do pH, estabilizadores, melhoradores de solubilidade, e outros destes agentes, tais como por exemplo, acetato de sódio, fosfato de sódio, monolaurato de sorbitano, trietanolamina-oleato e ciclodextrinas. Em alguns exemplos, são incluídos nas composições zinco, cálcio, albumina de soro, EDTA, cloreto de cálcio e/ou conservantes fenólicos. A percentagem de composto activo contida nestas composições depende grandemente da sua natureza específica, bem como da actividade do composto e das necessidades do sujeito.

Os injectáveis estão concebidos para administração local e sistémica. Para os presentes propósitos, é desejada a administração local para administração directa ao interstício afectado. Preparações para administração parentérica incluem soluções estéreis prontas para injecção, produtos solúveis secos estéreis, tais como pós liofilizados, prontos para serem combinados com um solvente imediatamente antes da utilização, incluindo comprimidos hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injecção, produtos insolúveis secos estéreis prontos para serem combinados com um veículo imediatamente antes da utilização e emulsões estéreis. As soluções podem ser quer aquosas quer não aquosas. Se administradas intravenosamente, transportadores adequados incluem solução salina fisiológica ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), e soluções contendo agentes espessantes e solubilizantes, tais como glicose, polietilenoglicol e polipropilenoglicol e suas misturas.

Transportadores farmaceuticamente aceitáveis utilizados em preparações parentéricas incluem veículos aquosos, veículos não aquosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, tampões, antioxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e dispersantes, agentes emulsionantes, agentes sequestrantes ou agentes quelantes e outras substâncias farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de veículos aquosos incluem injecção de cloreto de sódio, injecção de Ringer, injecção de dextrose isotónica, injecção de água estéril, injecção de Ringer de dextrose e lactato. Veículos parentéricos não aquosos incluem óleos fixos de origem vegetal, óleo de algodão, óleo de milho, óleo de sésamo e óleo de amendoim. Podem-se adicionar agentes antimicrobianos, em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas, a preparações parentéricas embaladas em recipientes de múltiplas doses, que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres de metilo e propilo de ácido p-hidroxibenzóico, timerosal, cloreto de benzalcónio e cloreto de benzetónio. Agentes isotónicos incluem cloreto de sódio e dextrose. Tampões incluem fosfato e citrato. Antioxidantes incluem bissulfato de sódio. Anestésicos locais incluem cloridrato de procaína. Agentes de suspensão e dispersantes incluem carboximetilcelulose sódica, hidroxipropilmetilcelulose e polivinilpirrolidona. Agentes emulsionantes incluem polissorbato 80 (TWEEN 80). Um agente sequestrante ou quelante de iões de metal inclui EDTA. Transportadores farmacêuticos incluem também álcool etílico, polietilenoglicol e propilenoglicol para veículos miscíveis com água e hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido láctico para ajustamento do pH. A concentração do composto farmaceuticamente activo é ajustada tal que uma injecção ou perfusão proporcione uma quantidade eficaz para produzir o efeito farmacológico desejado, tal como controlo glicémico. A dose exacta depende da idade, peso e condição do paciente ou animal como é conhecido na especialidade. As preparações parentéricas de dose unitária podem ser embaladas, por exemplo, numa ampola, num cartucho, num frasco de injectáveis ou numa seringa com uma agulha. 0 volume de solução liquida ou preparação de pó reconstituída, contendo o composto farmaceuticamente activo, é uma função da doença a ser tratada e do artigo fabricado particular escolhido para embalagem. Todas as preparações para administração parentérica têm de ser estéreis, como é conhecido e praticado na especialidade.

Num exemplo, a preparação farmacêutica pode estar na forma liquida, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões. Se proporcionadas em forma liquida, as preparações farmacêuticas podem ser proporcionadas como uma preparação concentrada a ser diluída até uma concentração terapeuticamente eficaz antes da utilização. Estas preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (e.g., xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras alimentares hidrogenadas); agentes emulsionantes (e.g., lecitina ou goma-arábica); veículos não aquosos (e.g., óleo de amêndoa, ésteres oleosos ou óleos vegetais fraccionados); e conservantes (e.g., p-hidroxibenzoatos de metilo ou propilo ou ácido sórbico). Noutro exemplo, as preparações farmacêuticas podem ser apresentadas em forma liofilizada para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes da utilização.

As composições de insulina de acção rápida e enzima de degradação de hialuronano podem ser co-formuladas como uma única composição, ou podem ser proporcionadas como duas composições separadas. Quando fornecidas como duas composições, as composições podem ser misturadas antes da administração para serem co-administradas, ou podem ser mantidas separadas e depois co-administradas em conjunto, sequencialmente ou intermitentemente. Em alguns exemplos, a insulina de acção rápida e a enzima de degradação de hialuronano são co-formuladas como composições de insulina de acção super-rápida. Como descrito abaixo, as composições podem ser formuladas para dosagem única ou múltipla, onde as dosagens podem ser fornecidas como uma proporção da quantidade de uma enzima de degradação de hialuronano para insulina administrada. Por exemplo, uma enzima de degradação de hialuronano pode ser administrada a 1 U de hialuronidase/1 U de insulina (1:1) até 50:1 ou mais, por exemplo, de ou cerca de 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1 ou mais. Noutros exemplos, são administradas proporções mais baixas de enzima de degradação de hialuronano para insulina, incluindo, por exemplo, 1 U de hialuronidase/2 U insulina (1:2), 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15 ou 1:20. A insulina de acção rápida pode estar presente nas composições co-formuladas ou separadas em concentrações de ou cerca de 10 U/mL, 20 U/mL, 30 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/ml ou 500 U/mL. Tipicamente, a quantidade de enzima de degradação de hialuronano nas composições co-formuladas ou separadas é funcionalmente equivalente a ou a pelo menos 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL ou 25 U/mL da actividade de hialuronidase. Em alguns exemplos, a quantidade de enzima de degradação de hialuronano nas composições co-formuladas ou separadas é funcionalmente equivalente a ou a pelo menos 30 ou 35 U/mL da actividade de hialuronidase, tal como 30 U/mL, 35 U/mL, 37,5 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/ml, 2000 U/mL, 3000 U/mL ou 5000 U/mL da actividade de hialuronidase.

As composições de insulina de acção super-rápida aqui proporcionadas podem conter um ou mais tampões de pH (tais como, por exemplo, histidina, fosfato, Tris ou outros tampões) , ou um tampão ácido (tal como acetato, citrato, piruvato, Gly-HC1, sucinato, lactato, maleato ou outros tampões), um agente modificador de tonicidade (tal como, por exemplo, um aminoácido, poliálcool, glicerol, NaCl, trealose, outros sais e/ou açúcares), um estabilizador (tal como benzoato de sódio para estabilizar a insulina), um agente quelante, tal como ácido etilenodiaminotetra-acético, etilenodiaminotetra-acetato ou cálcio-EDTA, um consumidor de oxigénio, tal como metionina, ácido ascórbico/ascorbato, ácido citrico/citrato, ou albumina, e/ou um conservante, tal como um conservante contendo um anel aromático (e.g. fenol ou cresol) . Conservantes exemplificativos que são úteis nas composições aqui proporcionadas incluem, mas não estão limitados a, m-cresol, fenol e parabeno ou qualquer sua combinação. Em alguns exemplos, adiciona-se m-cresol a ou aproximadamente 0,05% a 0,2%, tal como 0,1% a 0,15% (e.g. a ou cerca de 0,1%, 0,11%, 0,12%, 0,13%, 0,14% ou 0,15%). Concentrações adequadas de fenol ou parabeno incluem 0,05-0,25%, tais como 0,1% a 0,2% (e.g. a ou cerca de 0,1%, 0,12%, 0,13%, 0,14%, 0,15%, 0,16%, 0,17%, 0,18%, 0,19% e 0,2%) . Tipicamente, NaCl ou outro sal são proporcionados nas composições contendo uma enzima de degradação de hialuronano. Concentrações exemplificativas de NaCl incluem 50 mM a 200 mM, tal como 50 mM a 150 mM, incluindo 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM e 150 mM de NaCl. Em alguns exemplos, para manter a estabilidade das composições aqui proporcionadas, à medida que a concentração de sal na composição é aumentada, assim também é o pH. Também pode ser incluído glicerol como um modificador de tonicidade e/ou para aumentar a viscosidade das composições.

Estabilizadores exemplificativos que são úteis para composições contendo uma enzima de degradação de hialuronano incluem detergentes ou surfactantes, tais como polissorbatos e proteínas tais como albumina de soro humano. Em alguns exemplos, incluem-se nas composições um ou mais surfactantes (e.g. tais como Pluronic F68), tal como a ou cerca de 0,001% a 0,1%, tipicamente a ou cerca de 0,005% a 0,03% (e.g. 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,01%, 0,012%, 0,014%, 0,016%, 0,018%, 0,02% ou 0,03%). Concentrações exemplificativas de albumina de soro que são úteis nas presentes composições incluem 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL ou 1 mg/mL, mas podem ser mais ou menos. Podem também estar presentes nas composições polissorbatos, por exemplo, a concentrações de ou cerca de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 00,007%, 0,008%, 0,009%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% ou 0,1%. Estabilizadores exemplificativos que são úteis para composições contendo uma insulina incluem zinco e m-cresol. Por exemplo, o zinco pode funcionar para estabilizar o hexâmero de insulina. O zinco pode ser proporcionado, por exemplo, como óxido de zinco, acetato de zinco ou cloreto de zinco. O zinco pode ser presente na composição aqui proporcionada entre ou a cerca de 0,001 a 0,1 mg por 100 unidades de insulina, tal como 0,002 miligramas por 100 unidades de insulina (mg/100 U), 0,005 mg/100 U, 0,01 mg/100 U, 0,012 mg/100 U, 0,014 mg/100 U, 0,016 mg/100 U, 0,017 mg/100 U, 0,018 mg/100 U, 0,02 mg/100 U, 0,022 mg/100 U, 0,024 mg/100 U, 0,026 mg/100 U, 0,28 mg/100 U, 0,03 mg/100 U, 0,04 mg/100 U, 0,05 mg/100 U, 0,06 mg/100 U, 0,07 mg/100 U, 0,08 mg/100 U ou 0,1 mg/100 U. Num exemplo, o zinco está presente com 0,017 mg por 100 U de insulina. Pode também estar presente um agente de quelante de metal, tal cálcio-EDTA (CaEDTA), tal como por exemplo, a concentrações de entre aproximadamente 0,02 mM a 20 mM, tal como 0,02 mM, 0,04 mM, 0,06 mM, 0,08 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM ou mais. Em alguns exemplos, quando estão presentes tanto um agente quelante como zinco numa composição aqui proporcionada, o agente quelante está presente em quantidades aproximadamente iguais (i.e. razão molar de 0,6 a 1,4) ou num excesso molar para zinco, tal como por exemplo, numa proporção de ou cerca de 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1 ou mais de agente quelante:zinco. Pode-se também incluir cloreto de cálcio nas composições a, por exemplo, entre cerca de 0,2 mM a 20 mM.

Em alguns casos, qualquer um ou mais dos componentes acima descritos estão presentes apenas na composição de insulina de acção rápida ou na composição de degradação de hialuronano, até as duas composições serem ou co-formuladas ou entregues ao sujeito como um composição de insulina de acção super-rápida. Por exemplo, a composição de insulina de acção rápida pode conter zinco a entre ou cerca de 0,001 a 0,1 mg por 100 unidades de insulina, tal como 0,002 miligramas por 100 unidades de insulina (mg/100 U) , 0,005 mg/100 U, 0,01 mg/100 U, 0,012 mg/100 U, 0,014 mg/100 U, 0,016 mg/100 U, 0,017 mg/100 U, 0,018 mg/100 U, 0,02 mg/100 U, 0,022 mg/100 U, 0,024 mg/100 U, 0,026 mg/100 U, 0,28 mg/100 U, 0,03 mg/100 U, 0,04 mg/100 U, 0,05 mg/100 U, 0,06 mg/100 U, 0,07 mg/100 U, 0,08 mg/100 U ou 0,1 mg/100 U e nenhum agente quelante, tal como EDTA, enquanto a composição de degradação de hialuronano pode conter um agente quelante, tal como EDTA, a ou cerca de 0,02 mM a 20 mM, tal como 0,02 mM, 0,04 mM, 0,06 mM, 0,08 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM ou mais e nenhum zinco. Assim, é apenas quando as duas composições são misturadas, tal como quando estão a ser co-formuladas ou co-administradas, que a composição contendo insulina contém também EDTA, e a composição contendo uma enzima de degradação de hialuronano contém também zinco. Em alguns casos, a composição de insulina de acção rápida e a composição de enzima de degradação de hialuronano iniciais contêm quantidades suficientes de zinco ou agente quelante, respectivamente, tal que quando misturadas para co-formulação ou co-administração, o agente quelante está presente em quantidades aproximadamente equimolares (i.e. razão molar 0,6 a 1,4) ou num excesso molar para zinco, tal como por exemplo, numa proporção de ou cerca de 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1 ou mais de agente quelante:zinco. O pH e a osmolaridade das composições podem ser ajustados por um perito na especialidade para optimizar as condições para a actividade desejada e estabilidade da composição. Por exemplo, como notado acima, em alguns casos, se a concentração de sal é aumentada, o pH também podem ser aumentado para manter a estabilidade da composição. Além disso, um perito na especialidade pode alterar o pH para aumentar a solubilidade da insulina de acção rápida particular utilizada nas insulinas de acção super-rápida aqui proporcionadas. Em alguns exemplos, as composições aqui proporcionadas que contêm uma ou ambas de uma insulina de acção rápida e uma enzima de degradação de hialuronano têm uma osmolaridade de ou cerca de 100 mOsm/kg, 120 mOsm/kg, 140 mOsm/kg, 160 mOsm/kg, 180 mOsm/kg, 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 420 mOsm/kg, 440 mOsm/kg, 460 mOsm/kg, 500 ou mais mOsm/kg, e um pH de ou cerca de 6, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 ou 8. Em alguns exemplos, o pH é de ou de cerca de 6,5 até ou até cerca de 7,5, tal como 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5. Métodos de administração podem ser utilizados para diminuir a exposição de compostos seleccionados a processos degradativos, tais como degradação proteolítica e intervenção imunológica através de respostas antigénicas e imunogénicas. Exemplos destes métodos incluem administração local no local de tratamento. Tem sido reportado que a peguilação de agentes terapêuticos aumenta a resistência a proteólise, aumenta a meia-vida no plasma e diminui a antigenicidade e a imunogenicidade. Exemplos de metodologias de peguilação são conhecidas na especialidade (ver por exemplo, Lu e Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu e Felix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993; Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46: 253-64, 1995; Benhar et al., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al. , J Immunol., 154: 3088-95, 1995; ver também, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10) :1261-77 e Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2) :3S-8S) . A peguilação pode também ser utilizada na entrega de moléculas de ácido nucleico in vivo. Por exemplo, a peguilação de adenovirus pode aumentar a estabilidade e a transferência de genes (ver, e.g., Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20(9): 1444-51). Pós liofilizados São aqui de interesse os pós liofilizados, que podem ser reconstituídos para administração como soluções, emulsões e outras misturas. Podem também ser reconstituídos e formulados como sólidos ou géis. O pó liofilizado estéril é preparado por dissolução de um composto activo numa solução tampão. A solução tampão pode conter um excipiente que melhora a estabilidade ou outro componente farmacológico do pó ou solução reconstituída, preparada a partir do pó. A filtração estéril subsequente da solução seguida por liofilização sob condições padrão conhecida dos peritos na especialidade proporcionam a formulação desejada. Resumidamente, o pó liofilizado é preparado por dissolução de um excipiente, tal como dextrose, sorbitol, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glicose, sacarose ou outro agente adequado, num tampão adequado, tal como citrato, Tris, histidina, fosfato de sódio ou potássio ou outro destes tampões conhecido dos peritos na especialidade. Depois, adiciona-se uma enzima seleccionada à mistura resultante, e agita-se até se dissolver. A mistura é submetida a filtração estéril ou tratada para remover particulados e assegurar a esterilidade, e repartida em porções em frascos para injectáveis para liofilização. Cada frasco para injectáveis conterá uma única dosagem ou múltiplas dosagens do composto. O pó liofilizado pode ser armazenado sob condições apropriadas, tal como a cerca de 4°C até à temperatura ambiente. A reconstituição deste pó liofilizado com uma solução tampão proporciona uma formulação para utilização em administração parentérica. 2. Dosagem e administração A enzima de degradação de hialuronano aqui proporcionada pode ser formulada como composições farmacêuticas para administração de dosagem única ou de dosagem múltipla. Por exemplo, as composições aqui proporcionadas podem conter enzima de degradação de hialuronano a 1 U de hialuronidase/1 U de insulina (1:1) até 50:1 ou mais, por exemplo, a ou cerca de 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1 ou mais. Noutros exemplos, são fornecidas nas composições proporções mais baixas de enzima de degradação de hialuronano para insulina, incluindo, por exemplo, 1 U de hialuronidase/2 U de insulina (1:2), 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15 ou 1:20. A enzima de degradação de hialuronano seleccionada é incluída numa quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos secundários indesejáveis no paciente tratado. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente por ensaio dos polipéptidos em sistemas conhecidos in vitro e in vivo, tal como utilizando os ensaios aqui proporcionados ou conhecidos na especialidade (ver e.g., Taliani et ai. (1996) Anal. Biochem., 240: 60-67; Filocamo et al. (1997) J. Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al. (1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Buffard et al. (1995) Virology, 209:52-59; Bianchi et al. (1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake et al. (1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler et al. (1998) Biochem., 37:8899-8905; D'Souza et al. (1995) J. Gen. Virol., 76:1729-1736; Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem., 247:242-246; ver também e.g., Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol. 7 0:7219-7223; Mizutani et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227:822-826; Lu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei (USA), 93:1412-1417; Hahm et al., (1996) Virology, 226:318-326; Ito et al. (1996) J. Gen. Virol., 77:1043-1054; Mizutani et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:906-911; Cho et al. (1997) J. Virol. Meth. 65:201- 207) e depois extrapoladas a partir dai para dosagens para humanos.

Dosagens terapeuticamente eficazes para as composições de insulina de acção super-rápida contendo uma insulina de acção rápida e uma enzima de degradação de hialuronano podem ser determinadas com base, por exemplo, em dados farmacocinéticos (PK) e em dados farmacodinâmicos (PD), tal como descrito abaixo e no Exemplo 1, e nas doses terapêuticas conhecidas da insulina de acção rápida quando entregues sem uma enzima de degradação de hialuronano. Alterações da concentração de insulina no sangue ou plasma ou soro com o tempo proporcionam informação in vivo sobre (1) absorção para administração parentérica; (2) distribuição, e (3) eliminação de insulina. Um modelo farmacocinético define estas alterações fisiológicas na concentração de insulina em função do tempo (isto é, jdX) ) (*) e caracteriza-as matematicamente utilizando velocidades e volumes. Os parâmetros do modelo assim obtidos para a insulina permanecerão relativamente constantes até ocorrer uma perturbação. Um modelo PK bem conhecido para a insulina pode proporcionar previsões de exposição razoáveis (o que está intimamente relacionado com a eficiência e segurança do fármaco que resulta da farmacologia exagerada). Decisões clinicas sobre selecção da dose e programa de dosagem podem ser facilitados e justificados utilizando modelação PK e simulações. Um modelo farmacodinâmico serve um propósito similar para previsão do resultado clinico.

Tipicamente, uma dose terapeuticamente eficaz de uma enzima de degradação de hialuronano é de ou cerca de 0,3 Unidades (U) a 5000 U de uma enzima de degradação de hialuronano. Por exemplo, uma enzima de degradação de hialuronano pode ser administrada subcutaneamente a ou a cerca de 0,3 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 3 U, 5 U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2000 U, 3000 U, 4000 Unidades, 5000 U ou mais. Em alguns exemplos, as dosagens podem fornecidas como uma proporção da quantidade de uma enzima de degradação de hialuronano para insulina administrada. Por exemplo, uma enzima de degradação de hialuronano pode ser administrada a 1 U de hialuronidase/1 U de insulina (1:1) até 50:1 ou mais, por exemplo, a ou cerca de 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1 ou mais. Noutros exemplos, são administradas proporções mais baixas de enzima de degradação de hialuronano para insulina, incluindo, por exemplo, 1 U de hialuronidase/2 U de insulina (1:2), 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15 ou 1:20. Tipicamente, volumes de injecções ou perfusões de enzima de degradação de hialuronano aqui contempladas são de ou cerca de 0,01 mL, 0,05 mL, 0,1 mL, 0,2 mL, 0,3 mL, 0,4 mL, 0,5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 ml, 10 ml ou mais. A enzima de degradação de hialuronano pode ser proporcionada como uma solução de reserva a ou cerca de 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ml, 500 U/mL, 600 U/mL, 800 U/mL ou 1000 U/mL, ou pode ser proporcionada numa forma mais concentrada, por exemplo a ou cerca de 2000 U/ml, 3000 Unidades/ml, 4000 U/ml, 5000 U/ml, 8000 U/ml, 10000 U/mL ou 20000 U/mL para utilização directamente ou para diluição até à concentração eficaz antes do uso. A enzima de degradação de hialuronano pode proporcionada como uma formulação liquida ou liofilizada.

As preparações de insulina aqui proporcionadas podem ser formuladas como composições farmacêuticas para utilização de dose única ou múltipla. Por exemplo, em alguns casos, as preparações de insulina são formuladas para administração de dose única numa quantidade suficiente para proporcionar controlo glicémico pós-prandial. Noutros exemplos, as preparações de insulina são formuladas para administração de dose múltipla ou em frascos para injectáveis para múltiplas utilizações, tal como para utilização numa caneta de insulina, bomba de insulina ou outro dispositivo de entrega continua de insulina, ou sistema em circuito fechado. As preparações de insulina podem ser proporcionadas em forma liofilizada ou liquida como aqui descrito noutro local. A insulina pode ser proporcionada numa dose terapeuticamente eficaz. Doses terapeuticamente eficazes podem ser determinadas empiricamente por ensaio dos compostos in vitro e in vivo em sistemas conhecidos, tais como os ensaios aqui proporcionados, e podem também ser individualizadas para cada sujeito com base em factores tais como metabolismo, ingestão de alimentos e gravidade da doença. A concentração de uma insulina seleccionada na composição depende, por exemplo, das velocidades de absorção, inactivação e excreção do complexo, das caracteristicas fisico-quimicas do complexo, do programa de dosagem e da quantidade administrada, bem como de outros factores conhecidos dos peritos na especialidade. Por exemplo, é entendido que a dosagem exacta de tratamento é função dos niveis de glicose no sangue num sujeito, e pode ser determinada empiricamente utilizando algoritmos conhecidos ou por extrapolação a partir de dados de ensaios in vivo ou in vitro, experiência passada do sujeito, contagem de carboidratos para determinar o teor em carboidrato numa refeição e, por conseguinte, o aumento estimado de glicose prandial no sangue e requisito subsequente de insulina. É de notar que as concentrações e valores de dosagem podem variar com cada sujeito tratado. Deve ser ainda entendido que, para qualquer sujeito particular, os regimes de dosagem específicos deverão ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e com o julgamento profissional da pessoa que está a administrar ou a supervisionar a administração das formulações, e que os intervalos de concentração aqui apresentados são apenas exemplificativos e não pretendem limitar o seu âmbito. A quantidade de uma preparação de insulina seleccionada a ser administrada para o tratamento de uma condição diabética pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Adicionalmente, podem ser utilizados ensaios in vitro e modelos animais para ajudar a identificar os intervalos de dosagem óptimos.

Deste modo, a dosagem exacta, que pode ser determinada empiricamente, pode depender da preparação insulina particular, do regime e programa de doseamento com enzima de degradação de hialuronano, da via de administração, do tipo de diabetes a ser tratada, da gravidade da doença e do sujeito que está a ser tratado. Geralmente, a insulina é proporcionada numa quantidade que consegue o controlo glicémico. Por exemplo, para conseguir o controlo glicémico pós-prandial, administra-se tipicamente a sujeitos diabéticos uma injecção bólus de ou cerca de 0,05 U de insulina de acção rápida por kg de peso corporal (U/kg) até 1,0 U/kg 30 minutos a 5 minutos antes de uma refeição, quando a insulina é entregue sem uma enzima de degradação de hialuronano. É entendido que esta dose pode ser aumentada ou diminuída conforme apropriado com base, por exemplo, no metabolismo de um sujeito particular, no conteúdo da refeição, e nos níveis de glicose no sangue. É ainda entendido que o momento em que a insulina é entregue para controlo glicémico pós-prandial pode ser alterado para estar mais próximo ou mais afastado do momento de ingestão de uma refeição, e, em alguns casos, pode ser alterado tal que a insulina seja entregue no momento da refeição ou após a refeição. Por conseguinte pode-se administrar a um sujeito uma composição de insulina de acção super-rápida aqui proporcionada por administração de uma insulina, tal como uma insulina de acção rápida, em combinação com uma enzima de degradação de hialuronano, numa dose mais baixa do que a que é administrada quando a insulina é administrada sozinha e/ou num momento mais próximo da ingestão de uma refeição em comparação com o momento em que a dose de insulina sozinha é tipicamente administrada.

Insulinas de acção rápida são tipicamente administradas a doses de entre 0,05 Unidades/kg a 0,25 Unidades/kg, tais como, por exemplo, 0,10 Unidades/kg, ainda que a dose particular varie. Composições de insulina de acção super-rápida podem ser administradas com doses mais baixas em comparação com a insulina de acção rápida administrada na ausência de uma enzima de degradação de hialuronano. Como aqui descrito noutro local, o grau em que a quantidade de uma insulina de acção rápida pode ser diminuído por administração da mesma como uma composição de insulina de acção super-rápida varia dependendo, por exemplo, do tipo de diabetes que o paciente tem. Tipicamente, a redução na quantidade de insulina de acção rápida administrada a pacientes diabéticos Tipo 2 quando administrada como uma composição de insulina de acção super-rápida é maior do que a redução na quantidade de insulina de acção rápida administrada a pacientes diabéticos Tipo 1 quando administrada como uma composição de insulina de acção super-rápida. Por exemplo, em situações onde são administrados a um paciente diabético Tipo 1 e a um paciente diabético Tipo 2 0,20 U/kg de insulina de acção rápida para controlar os níveis de glicose pós-prandial, ao paciente diabético Tipo 1 podem ser administrados 0,15 U/kg de insulina de acção rápida numa composição de insulina de acção super-rápida para conseguir o mesmo ou melhor controlo glicémico, e ao paciente diabético Tipo 2 podem ser administrados 0,10 U/kg de insulina de acção rápida numa composição de insulina de acção super-rápida para conseguir o mesmo ou melhor controlo glicémico. Assim, em alguns exemplos, é aqui contemplado que a quantidade de uma insulina de acção rápida que é administrada com uma enzima de degradação de hialuronano como uma insulina de acção super-rápida a um paciente diabético Tipo 2 para conseguir controlo glicémico pode ser reduzida em, por exemplo, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ou mais em comparação com a quantidade requerida para controlo glicémico quando administrada sem uma enzima de degradação de hialuronano, e a quantidade de uma insulina de acção rápida que é administrada com uma enzima de degradação de hialuronano como uma composição de insulina de acção super-rápida a um paciente diabético Tipo 1 para conseguir controlo glicémico pode ser reduzida em, por exemplo, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou mais em comparação com a quantidade requerida para controlo glicémico quando administrada sem uma enzima de degradação de hialuronano.

Intervalos de dosagem exemplificativos para administração parentérica, tal como subcutânea, de insulina utilizando os métodos e composições aqui proporcionados para controlar os niveis de glicose pós-prandial no sangue são de ou cerca de 0,05 U/kg a 0,50 U/kg, tal como 0,05 U/kg, 0,06 U/kg, 0,07 U/kg, 0,08 U/kg, 0,09 U/kg, 0,10 U/kg, 0,11 U/kg, 0,12 U/kg, 0,13 U/kg, 0,14 U/kg, 0,15 U/kg, 0,20U/kg, 0,25 U/kg, 0,30 U/kg, 0,40 U/kg, 0,50 U/kg ou 1,0 U/kg. A dosagem particular e a sua formulação dependem da doença e do indivíduo. Se necessário a dosagem pode ser determinada empiricamente. Para conseguir estas dosagens, os volumes de preparações de insulina administrados subcutaneamente para controlar os níveis de glicose pós-prandial podem ser de ou cerca de 10 pL, 20 pL, 30 pL, 40 pL, 50 pL, 75 pL, 100 pL, 150 pL, 200 pL, 250 pL, 300 pL, 400 pL, 500 pL, 600 pL, 700 pL, 800 pL, 900 pL, 1000 pL ou mais. Por exemplo, uma formulação de insulina de 100 U/mL para as indicações aqui descritas pode ser administrada subcutaneamente a um sujeito de 7 0 kg num volume de 35 pL a 350 pL para conseguir uma dosagem de 0,05 U/kg a 0,50 U/kg de insulina. As composições e métodos aqui proporcionados podem também ser administrados a sujeitos diabéticos para efectuar o controlo glicémico ao longo do dia e noite, para além do controlo glicémico pós-prandial. Tipicamente, as dosagens de insulina administradas para proporcionar controlo glicémico continuo são mais baixas do que as requeridas para conseguir controlo glicémico pós-prandial. No entanto, as dosagens podem ser aumentadas ou diminuídas com base nos níveis de glicose no sangue. Intervalos de dosagem exemplificativos para administração parentérica, tal como subcutânea, de insulina utilizando os métodos e composições aqui proporcionados para proporcionar controlo glicémico contínuo são de ou cerca de 0,001 U/kg a 0,30 U/kg, tal como 0,001 U/kg, 0,005 U/kg, 0,01 U/kg, 0,02 U/kg, 0,05 U/kg a 0,30 U/kg, tal como 0,05 U/kg, 0,06 U/kg, 0,07 U/kg, 0,08 U/kg, 0,09 U/kg, 0,10 U/kg, 0,11 U/kg, 0,12 U/kg, 0,13 U/kg, 0,14 U/kg, 0,15 U/kg, 0,20U/kg, 0,25 U/kg, 0,30 U/kg, 0,40 U/kg, 0,50 U/kg ou 1,0 U/kg. A dosagem particular e a sua formulação dependem da doença, do momento de administração, e do indivíduo. Se necessário a dosagem podem ser determinada empiricamente. A dosagem para um indivíduo é tipicamente titulada de modo descendente até à dosagem mínima requerida para conseguir um efeito terapêutico, tal como a dosagem mínima requerida para conseguir controlo glicémico. A quantidade de insulina suficiente para conseguir controlo glicémico pode ser determinada empiricamente, tal como por desafio de glicose. A enzima de degradação de hialuronano pode ser administrada antes, subsequentemente, intermitentemente ou simultaneamente à preparação de insulina. Geralmente, a enzima de degradação de hialuronano é administrada antes ou simultaneamente com a administração da preparação de insulina para permitir à enzima de degradação de hialuronano degradar o ácido hialurónico no espaço intersticial. Num exemplo, a composição insulina e a composição de enzima de degradação de hialuronano estão co-formuladas e, por conseguinte, são administradas simultaneamente. Noutro exemplo, a composição de enzima de degradação de hialuronano é administrada antes da composição de insulina, tal como 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos ou mais antes da administração da preparação de insulina. Em alguns exemplos, a hialuronidase é administrada em conjunto com a preparação de insulina. Como será reconhecido pelos peritos na especialidade, a proximidade desejada da co-administração pode ser prontamente optimizada testando os efeitos da administração dos agentes em vários momentos em modelos adequados, tal como em modelos animais adequados. A preparação de insulina e a preparação de enzima de degradação de hialuronano podem ambas ser administradas de uma só vez, ou podem ser divididas em várias doses mais pequenas para serem administradas a certos intervalos de tempo. Preparações de insulina seleccionadas podem ser administradas em uma ou mais doses durante um período de tratamento por exemplo durante vários minutos, horas, dias, semanas ou meses. Em alguns casos, é útil a administração contínua. É entendido que a dosagem exacta e o programa de administração dependem da indicação e da tolerância do paciente.

Deve também ser entendido que a dosagem exacta e a duração do tratamento são uma função da diabetes que está a ser tratada e podem ser determinados empiricamente utilizando protocolos de ensaio conhecidos ou por extrapolação a partir de dados de testes in vivo ou in vitro. É também de notar que as concentrações e valores de dosagem podem também variar com a gravidade da diabetes e com outros factores, tais como metabolismo, ingestão de alimentos e peso corporal do sujeito. Deve ainda ser entendido que os regimes de dosagem específicos para qualquer sujeito particular deverão ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade do indivíduo e o julgamento profissional da pessoa que está a administrar ou a supervisionar a administração das composições, e que os intervalos de concentração aqui apresentados são apenas exemplificativos e não pretendem limitar o âmbito ou a utilização de composições e combinações contendo as mesmas. As composições podem ser administradas a cada minuto, a cada vários minutos, a cada hora, diariamente, semanalmente, mensalmente, anualmente ou uma vez, dependendo do sujeito e do estado diabético. Geralmente, os regimes de dosagem são escolhidos para limitar a toxicidade e/ou outros efeitos negativos, tais como insulina em excesso. Será de notar que o médico assistente saberá como e quando terminar, interromper ou ajustar a terapia para uma dosagem mais baixa. Inversamente, o médico assistente saberá também como e quando ajustar o tratamento para níveis mais elevados se a resposta clínica não for adequada (evitando efeitos secundários tóxicos) .

Modo de administração a. Seringas

As composições aqui proporcionadas podem ser administradas parentericamente a um sujeito utilizando um ou mais de vários modos de administração, incluindo, mas não limitados a, serinqas, canetas de insulina, bombas de insulina, ou no contexto de um sistema em circuito fechado ou qualquer sua combinação. Por exemplo, seringas de uma só utilização, incluindo seringas de insulina, podem ser utilizadas para administrar injecções de bólus discretos das composições. As composições podem ser administradas utilizando a mesma seringa, tal como quando as preparações de insulina e enzima de degradação de hialuronano estão co-formuladas, ou podem ser administradas sequencialmente utilizando diferentes seringas. Seringas úteis para administração das composições aqui proporcionadas incluem seringas de insulina, que podem ser concebidas para conterem concentrações padrão de preparações de insulina, incluindo concentrações de preparações de insulina de 100 U/ml, e têm inscrições em unidades de insulina para facilidade de administração. Noutros exemplos, utiliza-se qualquer um ou mais de uma seringa de insulina ou bomba de insulina ou dispositivo similar para administrar uma ou ambas da preparação de insulina e da preparação de enzima de degradação de hialuronano. b. Caneta de insulina

Uma caneta de insulina é um sistema de entrega que pode ser utilizado para administrar as composições aqui proporcionadas. Canetas de insulina incluem aquelas com cartuchos substituíveis cheios com a composição a ser administrada e aquelas com cartuchos não substituíveis. Canetas de insulina com cartuchos não substituíveis são tipicamente descartadas quando o cartucho foi esvaziado. As canetas de insulina possibilitam o doseamento, por exemplo, com incrementos de meia unidade, uma unidade ou duas unidades, que são geralmente medidas utilizando um regulador de doseamento ou outro mecanismo para ajustar a dose (ver e.g. Patentes dos E.U.A. N.os 5947934, 6074372, 6110149, 6524280, 6582404). A composição é depois entregue através de uma fina agulha fixada à caneta. Canetas de insulina são bem conhecidas na especialidade e incluem aquelas descritas noutros locais, incluindo, mas não limitadas a, as descritas nas Patentes dos E.U.A. N.os 5947934, 4973318, 5462535, 5599323, 5626566, 5984906, 6074372, 6110149, 6302869, 6379339 e 7241278) . Outros dispositivos de doseamento similares, tais como, por exemplo, os descritos nas Patentes dos E.U.A. N.os 5947394, 6074372, 6110149 e 6379339, podem também ser utilizados para administrar as composições aqui proporcionadas, quer como uma co-formulação de insulina e de enzima de degradação de hialuronano ou separadamente como uma composição de insulina e uma composição de enzima de degradação de hialuronano. Em alguns exemplos, a caneta de insulina ou dispositivo similar contém também um sensor ou detector que pode medir o nivel de glicose no sangue do sujeito (ver e.g. W02003047426).

Canetas de insulina e dispositivos de entrega similares que podem ser utilizados, ou modificados para serem utilizados, para entregar as composições de insulina aqui proporcionadas são bem conhecidos na especialidade e incluem, mas não estão limitados a, aqueles comercializados com as marcas comerciais Autopen® (Owen Mumford, Inc.), Disetronic Pen (Disetronic Medicai Systems), Humalog® Pen (Eli Lilly and Company), Humalog® Mix 75/25 Pen (Eli Lilly and Company), Humulin® 70/30 Pen (Eli Lilly and Company) , Humulin® N Pen (Eli Lilly and Company), Novolog® FlexPen (Novo Nordisk), NovoPen® 3 (Novo Nordisk), NovoPen® 4 (Novo Nordisk), NovoPen® Junior (Novo Nordisk), Novolog® Mix 70/30 FlexPen (Novo Nordisk), InDuo® (Novo Nordisk), Novolin® InnoLet® (Novo Nordisk), Innovo® (Novo Nordisk), OptiPen® (Sanofi-Aventis) OptiPen® Pro2 (Sanofi-Aventis), OptiSet® (Sanofi-Aventis) e SoloSTAR® (Sanofi-Aventis). c. Bombas de insulina e outros dispositivos de entrega de insulina

As composições aqui proporcionadas podem ser administradas a um sujeito diabético utilizando um dispositivo de entrega de insulina, tal como uma bomba de insulina ou outro dispositivo de perfusão continua similar. Dispositivos de entrega de insulina contêm tipicamente pelo menos um reservatório descartável contendo uma composição de insulina, uma bomba (incluindo quaisquer controlos, software, módulos de processamento e/ou baterias) e um conjunto de perfusão descartável, incluindo uma cânula ou agulha para injecção subcutânea e um tubo ligando a cânula ou agulha ao reservatório de insulina. Para utilização com uma composição de insulina de acção super-rápida, o dispositivo de entrega de insulina pode conter um reservatório contendo composições co-formuladas de insulina e enzima de degradação de hialuronano, ou pode conter um ou mais reservatórios, tal que as composições de insulina de acção rápida e enzima de degradação de hialuronano estão contidas no mesmo ou em reservatórios separados. Nestes casos, o dispositivo de entrega de insulina pode entregar cada composição simultaneamente ou subsequentemente uma à outra. Assim, estes dispositivos podem ser utilizados para administrar as composições de insulina de acção super-rápida aqui proporcionadas. As composições podem ser administradas continuamente ou em injecções bólus. Adicionalmente, um utilizador do dispositivo de entrega de insulina tem a capacidade para influenciar o perfil da insulina modelando o bólus. Por exemplo, pode-se administrar um bólus padrão, que é uma perfusão similar a uma injecção discreta na medida em que a totalidade da dose é bombeada imediatamente. Um bólus prolongado é uma perfusão lenta ao longo do tempo que evita uma dose inicial elevada e prolonga a acção da composição. Um bólus de combinação contendo tanto um bólus padrão, como um bólus prolongado pode também ser administrado utilizando uma bomba de insulina ou outro sistema de entrega continua. Dispositivos de entrega de insulina são conhecidos na especialidade e descritos noutro local, incluindo, mas não limitados a, as Patentes dos E.U.A. N.os 6554798, 6641533, 6744350, 6852104, 6872200, 6936029, 6979326, 6999854, 7025713 e 7109878. Os dispositivos de entrega de insulina podem também estar ligados a um detector ou sensor de glicose, e/ou podem conter meios para calcular a dose de insulina recomendada com base nos niveis de glicose no sangue, no teor em carboidrato de uma refeição, ou noutros dados. Adicionalmente, os dispositivos de entrega de insulina podem ser implantáveis ou podem ser externos ao sujeito. d. Sistemas em circuito fechado

Os sistemas em circuito fechado, por vezes referidos como um pâncreas artificial, são de interesse particular para utilização com as composições e métodos aqui proporcionados. Sistemas em circuito fechado referem-se a sistemas com um detector de glicose continuo integrado, uma bomba de insulina ou outro sistema de entrega e um controlador que inclui um algoritmo matemático que constantemente calcula a perfusão de insulina requerida para controlo glicémico com base em medições em tempo real dos niveis de glicose no sangue. Quando optimizados, estes sistemas podem facilitar o controlo glicémico constante e muito apertado, similar à resposta de insulina e ao controlo glicémico naturais observados num sujeito não diabético saudável. Para serem eficazes, porém, os sistemas em circuito fechado requerem não só uma monitorização de glicose continua exacta e fiável, mas também a entrega de uma insulina com uma acção muito rápida. Por exemplo, atrasos na absorção de insulina e na acção associada à entrega subcutânea de insulinas de acção rápida podem conduzir a grandes excursões glicémicas pós-prandiais (Hovorka et al. (2006) Diabetic Med. 23:1-12). O atraso por causa da absorção de insulina, da acção de insulina, da cinética de glicose intersticial, e do tempo de transporte para sistemas de monitorização baseados ex vivo, tais como os baseados na técnica de microdiálise, pode resultar num desfasamento global de 100 minutos ou mais, desde o momento da entrega de insulina até ao pico do seu efeito de diminuição de glicose detectável (Hovorka et al. (2006) Diabetic Med. 23:1-12). Assim, uma vez administrada, a insulina continuará a aumentar o seu efeito mensurável durante quase 2 horas. Isto pode complicar a diminuição eficaz da concentração de glicose após ingestão da refeição utilizando um sistema em circuito fechado. Em primeiro lugar, tem de ser detectado um aumento de glicose. No entanto, isto acontece tipicamente apenas após um desfasamento aproximado de 10-40 minutos. O sistema tem de determinar que uma refeição foi digerida e administrar uma dose de insulina apropriada. A capacidade do sistema para compensar subsequentemente uma dose de insulina "mal calculada" está comprometida por longos atrasos e pela incapacidade para "retirar" insulina após esta ser administrada. Estes problemas podem ser ultrapassados, pelo menos em parte, pela utilização de uma composição de insulina de acção super-rápida, tal como as aqui proporcionadas, que exibem uma velocidade e um nivel de absorção aumentados e uma melhoria associada na farmacodinâmica (como descrito no Exemplo 1, abaixo). As composições de insulina de acção super-rápida aqui proporcionadas têm um tmax reduzido (i.e. atingem a concentração máxima mais depressa) em relação às insulinas de acção rápida, e começam a controlar os niveis de glicose no sangue mais rapidamente do que as insulinas de acção rápida. Esta velocidade de absorvância aumentada e o inicio de acção reduzem o desfasamento entre a acção da insulina e a monitorização da glicose e entrada da informação, resultando num sistema em circuito fechado mais eficaz que pode controlar de modo mais apertado os niveis de glicose no sangue, reduzindo as excursões glicémicas.

Sistemas em circuito fechado são bem conhecidos na especialidade e têm sido descritos noutros locais, incluindo, mas não limitados a, Patentes dos E.U.A. N.os 5279543, 5569186, 6558351, 6558345, 6589229, 6669663, 6740072, 7267665 e 7354420. Estes sistemas e similares, facilmente identificáveis por um perito na especialidade, podem ser utilizados para entregar as composições de insulina de acção super-rápida aqui proporcionadas. Os sistemas em circuito fechado incluem um sistema de sensor para medir os niveis de glicose no sangue, um controlador e um sistema de entrega. Este sistema integrado está concebido para modelar uma célula beta pancreática (célula ) , tal que este controla um dispositivo de perfã® para entregar insulina a um sujeito com um perfil de concentração similar ao que seria criado por células plenamente funcionais em resposta a alterações nas concentrações de glicose no sangue no corpo. Assim, o sistema simula a resposta de insulina natural do corpo a niveis de glicose no sangue e não apenas faz um uso eficiente da insulina, mas também responde por outras funções corporais, uma vez que a insulina tem efeitos tanto metabólicos como mitogénicos. Para além disso, o controlo glicémico conseguido utilizando um sistema em circuito fechado é conseguido sem requerer qualquer informação acerca do tamanho e momento de uma refeição, ou de outros factores. O sistema pode basear-se somente em medições da glicose no sangue em tempo real. O sensor de glicose gera um sinal de sensor representativo dos niveis de glicose no sangue no corpo, e fornece o sinal do sensor ao controlador. 0 controlador recebe o sinal do sensor e gera comandos que são comunicados ao sistema de entrega de insulina. 0 sistema de entrega de insulina recebe os comandos e perfunde insulina para o corpo em resposta aos comandos. Apresentam-se abaixo descrições de componentes exemplificativos de sistemas em circuito fechado que podem ser utilizados para entregar as composições de insulina de acção super-rápida aqui proporcionadas. E entendido que um perito na especialidade pode prontamente identificar sistemas em circuito fechado adequados para serem aqui utilizados. Estes sistemas têm sido descritos na especialidade incluindo mas não limitados àqueles descritos nas Patentes dos E.U.A. N.os 5279543, 5569186, 6558351, 6558345, 6589229, 6669663, 6740072, 7267665 e 7354420. Os componentes individuais dos sistemas têm também sido descritos na especialidade, individualmente e no contexto de um sistema em circuito fechado para utilização em conseguir o controlo glicémico. É entendido que os exemplos aqui proporcionados são apenas exemplificativos, e que podem ser utilizados outros sistemas em circuito fechado ou componentes individuais para entregar as composições de insulina de acção super-rápida aqui proporcionadas.

Os sistemas em circuito fechado contêm um sensor ou detector de glicose que funciona continuamente. Estes dispositivos podem conter sensores do tipo agulha que são inseridos sob a pele e estão ligados a um pequeno transmissor que comunica os dados de glicose sem fios por telemetria de radiofrequência a um pequeno receptor. Em alguns exemplos, o sensor é inserido através da pele do sujeito utilizando uma agulha de inserção, que é de imediato removida e rejeitada assim que o sensor é posicionado no tecido subcutâneo. A agulha de inserção têm uma ponta aguçada e uma ranhura aberta para segurar o sensor durante a inserção na pele (ver e.g. Patentes dos E.U.A. N.os 5586553 e 5954643) . O sensor utilizado no sistema em circuito fechado pode opcionalmente conter três eléctrodos que ficam expostos ao fluido intersticial (ISF) no tecido subcutâneo. Os três eléctrodos incluem um eléctrodo de trabalho, um eléctrodo de referência e um contra-eléctrodo que são utilizados para formar um circuito. Quando uma voltagem apropriada é fornecida através do eléctrodo de trabalho e do eléctrodo de referência, o ISF proporciona impedância entre os eléctrodos. Um sinal de corrente análogo flui a partir do eléctrodo de trabalho através do corpo e para o contra-eléctrodo. A voltagem no eléctrodo de trabalho é geralmente mantida para a terra, e a voltagem no eléctrodo de referência pode mantida com uma voltagem aplicada Vset, tal como, por exemplo, entre 300 e 700 mV. A reacção mais proeminente estimulada pela diferença de voltagem entre os eléctrodos é a redução de glicose uma vez que esta reage primeiro com a enzima glicose-oxidase (GOX) para gerar ácido glucónico e peróxido de hidrogénio (H2O2) . Depois ο H2O2 é reduzido para (H2O) e (Cr) na superfície do eléctrodo de trabalho. O 0~ retira uma carga positiva dos componentes eléctricos do sensor, repelindo assim um electrão e originando um fluxo de corrente eléctrica. Isto resulta no sinal de corrente análogo que é proporcional à concentração de glicose no ISF que está em contacto com os eléctrodos do sensor (ver e.g. Patente dos E.U.A. N.2 7354420) .

Em alguns exemplos, é utilizado mais do que um sensor para medir a glicose no sangue. Por exemplo, podem ser utilizados sensores redundantes e o sujeito pode ser notificado quando um sensor falha pela electrónica do transmissor do detector da caracteristica sujeita a telemetria. Um mostrador pode também informar o sujeito de quais os sensores que ainda estão a funcionar e/ou qual o número de sensores que ainda estão a funcionar. Noutros exemplos, os sinais de sensor são combinados por ponderação ou outros meios. Adicionalmente, podem ser utilizados diferentes tipos de sensores. Por exemplo, podem ser utilizados um sensor interno de glicose e um sensor externo de glicose para medir ao mesmo tempo a glicose no sangue.

Sensores de glicose que podem ser utilizados num sistema em circuito fechado que entrega as composições de insulina de acção super-rápida aqui proporcionadas são bem conhecidos e podem ser prontamente identificados e, opcionalmente, adicionalmente modificados, por um perito na especialidade. Sensores internos de glicose exemplificativos incluem, mas não estão limitadas a, os descritos nas Patentes dos E.U.A. N.os 5497772, 5660163, 5791344, 5569186, 6895265. Um sensor de glicose exemplificativo que utiliza fluorescência é o descrito na Patente dos E.U.A. N.2 6011984. Os sistemas de sensor de glicose podem também utilizar outras tecnologias de sensor, incluindo feixes de luz, condutividade, amostragem por jacto, microdiálise, microporação, amostragem por ultra-sons, iontoforese reversa, ou outros métodos (e.g. Patentes dos E.U.A. N.os 5433197 e 5945676, e Publicação do Pedido de Patente Internacional WO199929230) . Em alguns exemplos, apenas o eléctrodo de trabalho está localizado no tecido subcutâneo e em contacto com o ISF, e o contra-eléctrodo e o eléctrodo de referência estão localizados externamente ao corpo e em contacto com a pele. 0 contra-eléctrodo e o eléctrodo de referência podem estar localizados na superfície do invólucro de um detector e podem ser mantidos junto à pele como parte de um detector da caracteristica sujeita a telemetria. Em exemplos adicionais, o contra-eléctrodo e o eléctrodo de referência são mantidos junto à pele utilizando outros dispositivos, tais como ligando um fio condutor aos eléctrodos e fixando os eléctrodos à pele, incorporando os eléctrodos sobre o lado inferior de um mostrador tocando a pele. Ainda adicionalmente, podem ser colocados no tecido subcutâneo mais do que um eléctrodo de trabalho para redundância. Pode também colher-se fluido intersticial a partir do corpo de um sujeito e fazer-se fluir sobre um sensor externo que não está implantado no corpo. 0 controlador recebe informação a partir do sensor de glicose. 0 controlador está concebido para modelar uma célula beta pancreática (célula ) e fornecer comandos ao dispositivo de entrega de insulina para perfundir a quantidade requerida de insulina para controlo glicémico. 0 controlador utiliza software com algoritmos para calcular a quantidade requerida de insulina com base nos niveis de glicose detectados pelo sensor de glicose. Algoritmos exemplificativos incluem aqueles que modelam aproximadamente as células , uma vez que algoritmos que estão concebidos para minimizar excursões de glicose no corpo, sem ter em consideração quanta insulina é entregue, podem causar ganho de peso excessivo, hipertensão, e aterosclerose. Tipicamente, o sistema pretende emular o padrão de secreção de insulina in vivo e ajustar este padrão de modo consistente com a adaptação a células in vivo experimentada por indivíduos saudáveis normais. Algoritmos de controlo úteis para sistemas em circuito fechado incluem aqueles utilizados por um controlador proporcional-integral-derivativo (PID) . Controladores proporcionais derivativos e algoritmos de modelo de controlo preditivo (MCP) podem também ser utilizados em alguns sistemas (Hovorka et al. (2006)

Diabetic Med. 23:1-12). Algoritmos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, os descritos em Hovorka et al. (Diabetic Med. (2006) 23:1-12), Shimoda et al., (Front. Med.

Biol. Eng. (1997) 8:197-211), Shichiri et al. (Artif. Organs (1998) 22:32-42), Steil et al. (Diabetes Technol. Ther. (2003) 5: 953-964), Kaletz et al., (Acta Diabetol. (1999) 36:215) e Patentes dos E.U.A. N.os 5279543, 5569186, 6558351, 6558345, 6589229, 6740042, 6669663, 6740072, 7267665, 7354420 e

Publicação de patente dos E.U.A. 20070243567.

Num exemplo, um controlador PID é utilizado no sistema em circuito fechado. Um controlador PID ajusta continuamente a perfusão de insulina avaliando as excursões de glicose de três pontos de vista: o afastamento em relação à glicose alvo (o componente proporcional), a área sob a curva entre glicose ambiente e alvo (o componente integral), e a variação na glicose ambiente (o componente derivativo). Geralmente, a resposta de célula in vivo a alterações na glicose é caracterizada por respostas de insulina de "primeira" e de "segunda". A resposta de insulina bifásica de uma célula pode ser modelada utilizando componentes de um controlador proporcional, mais integral, mais derivativo (PID) (ver e.g. Patente dos E.U.A. N.2 7354420). O controlador gera comandos para a entrega de insulina desejada. Sistemas de entrega de insulina, tais como bombas de insulina, são conhecidos na especialidade e podem ser utilizados nos sistemas em circuito fechado. Dispositivos de entrega de insulina exemplificativos (tais como os descritos acima) incluem, mas não estão limitadas a, os descritos nas Patentes dos E.U.A. N.os. 4562751, 467840, 4685903, 4373527, 4573994, 6554798, 6641533, 6744350, 6852104, 6872200, 6936029, 6979326, 6999854, 7025713 e 7109878. Os dispositivos de entrega de insulina contêm tipicamente um ou mais reservatórios, que são geralmente descartáveis, contendo uma preparação de insulina, tal como uma composição de insulina de acção super-rápida aqui descrita. Os reservatórios podem conter mais do que uma insulina, tal como, por exemplo, uma insulina de acção basal e uma insulina de acção rápida, quer co-formuladas e contidas num único reservatório quer contidas separadamente em dois ou mais reservatórios. Para utilização com uma composição de insulina de acção super-rápida, o dispositivo de entrega insulina pode conter um reservatório contendo uma composição de insulina de acção rápida e de enzima de degradação de hialuronano co-formuladas, ou pode conter dois ou mais reservatórios, tal que as composições de insulina de acção rápida e de enzima de degradação de hialuronano estão contidas separadamente em reservatórios separados. Nestes casos, o dispositivo de entrega de insulina pode entregar cada composição simultaneamente ou subsequentemente uma à outra. Em alguns exemplos, as composições são entregues utilizando um tubo de perfusão e uma cânula ou agulha. Noutros exemplos, o dispositivo de perfusão é fixado directamente à pele a as composições fluem a partir do dispositivo de perfusão, através de uma cânula ou agulha directamente para o corpo sem a utilização de um tubo. Em exemplos adicionais, o dispositivo de perfusão é interno ao corpo e opcionalmente pode-se utilizar um tubo de perfusão para entregar as composições. Sistemas em circuito fechado podem também conter componentes adicionais, incluindo, mas não limitados a, filtros, calibradores e transmissores. G. Métodos de avaliação de actividade, farmacocinética e Farmacodinâmica

Podem-se utilizar ensaios para as actividades in vitro e in vivo de insulina sozinha ou em combinação com uma enzima de degradação de hialuronano. Entre estes ensaios incluem aqueles que avaliam as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas de insulina administrada subcutaneamente ou intraperitonealmente, incluindo biodisponibilidade e tolerância. A actividade biológica tando da insulina como de uma enzima de degradação de hialuronano podem também ser avaliadas utilizando ensaios bem conhecidos na especialidade. Estes ensaios podem ser utilizados, por exemplo, para determinar as dosagens apropriadas de uma insulina, tal como uma insulina de acção rápida, e de uma enzima de degradação de hialuronano, e a frequência de doseamento, para tratamento. 1. Farmacocinética, farmacodinâmica e tolerância

Estudos de farmacocinética (PK), farmacodinâmica (PD) e tolerância, tais como os descritos no Exemplo 1, abaixo, podem ser realizados utilizando modelos animais, incluindo modelos de porco tais como os descritos nos Exemplos 11 e 12, ou podem ser realizados durante estudos clínicos com pacientes. Modelos animais incluem, mas não estão limitadas a, ratinhos, ratos, coelhos, cães, porquinhos-da-índia e modelos de primatas não humanos, tais como macacos cinomolgos ou macacos rhesus. Em alguns casos, são realizados estudos farmacocinéticos e de tolerância utilizando animais ou sujeitos humanos saudáveis. Noutros exemplos, os estudos são realizados utilizando modelos animais de diabetes, tais como os descritos abaixo, ou em sujeitos humanos diabéticos. Procedimentos exemplificativos úteis para realizar estes estudos incluem técnicas de clamp de glicose (Brehm et al. (2007) em Clin. Diabetes Res: Methods and Techniques. Ed Michael Rosen, págs. 43-76, Exemplo 1) . No procedimento de clamp euglicémico hiperinsulinémico, insulina exógena é perfundida para criar concentrações de insulina no plasma hiperinsulinémicas, enquanto a concentração de glicose no plasma é mantida constante ao nível euglicémico através de uma perfusão de glicose exógena variável. A velocidade de perfusão de glicose (GIR) requerida para manter níveis de glicose constantes durante o período de hiperinsulinemia proporciona uma medida do efeito da insulina perfundida no metabolismo da glicose. A GIR é um reflexo da quantidade de glicose que está a ser utilizada pelo corpo (i.e. mais glicose exógena necessita de ser perfundida para manter níveis normais de glicose no sangue i.e. entre 90-110 mg/dL, quando o corpo está a utilizar mais glicose), e, por conseguinte, da actividade da insulina administrada (i.e. a actividade de insulina aumentada resulta em produção de glicose endógena reduzida e utilização de glicose no sangue aumentada, resultando num declínio global da glicose no sangue). Assim, um tal procedimento, para além de ser utilizado para avaliar a secreção de insulina e a resistência à insulina num sujeito, pode também ser utilizado para avaliar com segurança as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas de uma insulina, tal como uma insulina co-administrada com uma enzima de degradação de hialuronano. A farmacocinética de insulina administrada subcutaneamente ou intraperitonealmente pode ser avaliada medindo o perfil de tempo-concentração da insulina e calculando parâmetros tais como a concentração de insulina no soro máxima (pico) (Cmax) , o tempo de pico (i.e. quando a concentração máxima de insulina no soro ocorre; tmax) , e a área sob a curva (i.e. a área sob a curva gerada representando graficamente o tempo em função da concentração de insulina no sangue; AUC), para um dado intervalo de tempo após administração. A biodisponibilidade absoluta de insulina administrada subcutaneamente é determinada comparando a área sob a curva de insulina após entrega subcutânea (AUCsc) com a AUC de insulina após entrega intravenosa (AUC±V) · A biodisponibilidade absoluta (F) pode ser calculada utilizando a fórmula: F = [([AUC]sc x dosesc) / ([AUC] iv x doseiv) ] x 100. A biodisponibilidade relativa (Frei) de dois tratamentos através da mesma via de administração, tal como, por exemplo, uma insulina com ou sem co-administração com uma enzima de degradação de hialuronano, pode também ser calculada, tal como no Exemplo 1. Por exemplo, a biodisponibilidade relativa (Frei) de insulina lispro Humalog® administrada subcutaneamente co-administrada com rHuPH20 e insulina lispro Humalog® administrada subcutaneamente sozinha pode ser calculada {[AUC (insulina lispro Humalog®/rHuPH20)] / [AUC (insulina lispro Humalog® sozinha]} χ 100, onde cada dose de insulina lispro Humalog® é a mesma, e a AUC é calculada durante o mesmo intervalo de tempo. A concentração de insulina no plasma após administração subcutânea pode ser medida utilizando qualquer método conhecido na especialidade adequado para avaliar concentrações de insulina em amostras de sangue. Métodos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, ELISA e RIA.

As propriedades farmacodinâmicas de insulina administrada subcutaneamente ou intraperitonealmente podem ser avaliadas por medição de parâmetros tais como a velocidade de perfusão de glicose (GIR) (mg/kg/min), o tempo até ao efeito máximo (tGIRmax) (minutos) ; o tempo até ao efeito semi-máximo tardio (tGIR5o% tardio) (minutos) ; o tempo até ao efeito semi-máximo precoce (tGIRso% precoce) (minutos) ; o efeito metabólico máximo (GIRmax) (mg/kg/minuto) ; AUC-GIRo-eo mm (g/kg) ; AUC-GIR0-120 mm (g/kg) ; AUC-GIRo-iso mm (g/kg) ; AUC-GIR0-240 mm (g/kg) ; AUC-GIRo-300 mm (g/kg) ; e a AUC-GIR0-360 mm (g/kg) .

Nos estudos farmacocinéticos pode-se administrar uma gama de doses e diferentes frequências de doseamento para avaliar o efeito de aumentar ou diminuir as concentrações de insulina e/ou de uma enzima de degradação de hialuronano na dose. As propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas de insulina administrada subcutaneamente ou intraperitonealmente, tais como a biodisponibilidade, podem também ser avaliadas com ou sem co-administração de uma enzima de degradação de hialuronano. Por exemplo, pode ser administrada insulina subcutaneamente a animais ou sujeitos humanos sozinha ou em combinação com uma enzima de degradação de hialuronano durante um procedimento de clamp euglicémico hiperinsulinémico. Podem depois colher-se amostras de sangue para vários pontos temporais e determina-se a quantidade de insulina no soro, tal como por radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). A velocidade de perfusão de glicose ao longo do procedimento pode também ser calculada. As propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas de insulina administrada subcutaneamente, administrada com ou sem uma enzima de degradação de hialuronano, podem depois ser determinadas para avaliar o efeito da co-administração com uma enzima de degradação de hialuronano sobre tais propriedades de qualquer insulina.

Estudos para avaliar a segurança e a tolerância são também conhecidos na especialidade e podem ser aqui utilizados. Após administração subcutânea de insulina, com ou sem co-administração de uma enzima de degradação de hialuronano, pode-se monitorizar o desenvolvimento de quaisquer reacções adversas. Reacções adversas podem incluir, mas não estão limitadas a, reacções no local de injecção, tais como edema ou inchaço, dor de cabeça, febre, fatiga, arrepios, rubor, tonturas, urticária, sibilância ou aperto no peito, náusea, vómito, rigidez, dor nas costas, dor no peito, cãibras musculares, crises ou convulsões, alterações na pressão sanguínea e respostas de hipersensibilidade anafiláctica ou severa. Tipicamente, nos estudos de segurança e tolerância são administradas uma gama de doses e diferentes frequências de doseamento para avaliar o efeito de se aumentarem ou diminuírem as concentrações de insulina e/ou de uma enzima de degradação de hialuronano na dose. 2. Actividade biológica a. Insulina A capacidade de uma insulina, tal como um análogo de insulina, para actuar como um agente terapêutico pode ser avaliada in vitro ou in vivo. Por exemplo, podem ser realizados ensaios in vitro bem conhecidos na especialidade para avaliar a capacidade de uma insulina para se ligar ao receptor de insulina. Num exemplo, é realizado um ensaio de ligação competitivo no qual se preparam membranas de células placentárias humanas como fonte de receptores de insulina e incubam-se com insulina humana radiomarcada com ou sem o análogo de insulina não marcado. A quantidade de insulina radiomarcada ligada é depois detectada para determinar a capacidade do análogo de insulina para competir pela ligação e calcula-se a afinidade relativa do análogo de insulina pelo receptor de insulina placentário (ver e.g. Weiss et ai., (2001) J. Biol. Chem. 276:40018-40024). Outras fontes de receptores de insulina, incluindo outras células que naturalmente ou de modo recombinante exprimem o receptor de insulina, podem também ser utilizadas nestes ensaios de ligação competitivos (Duttaroy et ai., (2005) Diabetes 54:251-258). A capacidade de insulina para estimular a absorção de glicose ou efectuar quaisquer outros dos seus resultados metabólicos típicos pode ser avaliada in vitro. Para medir a absorção de glicose estimulada por insulina, incubam-se adipócitos com glicose marcada, tal como 2-desoxi-D-[2,63-H]glicose ou D-[U-14C]glicose com ou sem insulina. A radioactividade incorporada é depois medida para determinar a quantidade de absorção de glicose na presença ou ausência de insulina (Louveau et al.r (2004) J. Endocrin. 181:271-280, Duttaroy et ai., (2005) Diabetes 54:251-258) . Quando se avalia a actividade de um análogo de insulina, a actividade de insulina humana pode também ser avaliada e utilizada para comparação. Podem também ser realizados ensaios in vitro para avaliar a produção de glicose em células H4IIE na presença de insulina (Wang et ai., (2000) J. Biochem., 275:14717-14721, Duttaroy et ai., (2005) Diabetes 54:251-258).

Podem também ser realizados estudos in vivo utilizando modelos animais ou sujeitos humanos diabéticos ou saudáveis para avaliar a actividade terapêutica de insulina. Pode-se administrar insulina a modelos animais de diabetes para avaliar os efeitos nos níveis de glicose no sangue, nos níveis de insulina na circulação e na hemoglobina Alc (HbAlc), por exemplo. A hemoglobina Alc forma-se quando a glicose se liga à hemoglobina, o que ocorre quando os níveis de glicose no sangue estão elevados. Os níveis de HbAlc numa amostra de sangue podem ser avaliados, por exemplo, por HPLC, ELISA, RIA ou outros imunoensaios. Valores de HbAlc normais para sujeitos saudáveis são aproximadamente 4,0-6,2 por cento. A American Diabetes Association recomenda que deva estar abaixo de 7% (ou baixo de 6% em certas pessoas) para pacientes com diabetes para ajudar a prevenir as complicações da diabetes. Os níveis de insulina podem ser medidos, por exemplo, por ELISA ou RIA. Tipicamente os níveis de glicose são medidos utilizando um sensor ou analisador de glicose.

Modelos animais para diabetes tipo I incluem o ratinho diabético não obeso (NOD) e o rato BioBreeding (BB) (Atkinson et ai., (1999) Nature Med. 5:601-604) . Modelos animais para diabetes tipo 2 incluem, mas não estão limitadas a, ratinhos ob/ob e ratinhos db/db, que possuem mutações no gene de leptina ou no receptor de leptina, respectivamente, ratinhos KK, ratinhos Nagoya-Shibata-Yasuda (NSY), ratos gordos diabéticos Zucker (ZDF) e ratos Gato-Katazaki (GK) (Cefalu (2006) ILAR Journal 47:186-198). Noutros exemplos, utilizam-se animais saudáveis para testar a actividade de uma insulina, com ou sem uma enzima de degradação de hialuronano. b. Enzimas de degradação de hialuronano A actividade de uma enzima de degradação de hialuronano pode ser avaliada utilizando métodos bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, o ensaio USP XXII para hialuronidase determina a actividade indirectamente por medição da quantidade de substrato de ácido hialurónico (HA), ou hialuronano, não degradado que permanece após se deixar reagir a enzima com o HA durante 30 min a 37°C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD) . Um Padrão de Referência de Hialuronidase (USP) ou uma solução de Hialuronidase Padrão do National Formulary (NF) podem ser utilizadas num ensaio para avaliar a actividade, em unidades, de qualquer hialuronidase. Num exemplo, a actividade é medida utilizando um ensaio de microturbidimetria. Este é baseado na formação de um precipitado insolúvel quando o ácido hialurónico se liga à albumina de soro. A actividade é medida por incubação de hialuronidase com hialuronato de sódio (ácido hialurónico) durante um período de tempo determinado (e.g. 10 minutos) e depois precipitação do hialuronato de sódio não digerido com a adição de albumina de soro acidificada. A turbidez da amostra resultante é medida a 640 nm após um período de desenvolvimento adicional. A diminuição em turbidez resultante da actividade de hialuronidase sobre o substrato de hialuronato de sódio é uma medida da actividade enzimática de hialuronidase. Noutro exemplo, a actividade de hialuronidase é medida utilizando um ensaio de microtitulação no qual ácido hialurónico biotinilado residual é medido após incubação com hialuronidase (ver e.g. Frost e Stem (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, Publicação de Patente dos E.U.A. N.2 20050260186). Os grupos carboxilo livres nos resíduos ácido glucurónico do ácido hialurónico são biotinilados, e o substrato de ácido hialurónico biotinilado é acoplado de modo covalente a uma placa de microtitulação. Após incubação com hialuronidase, o substrato de ácido hialurónico biotinilado residual é detectado utilizando uma reacção de avidina-peroxidase, e comparado com o obtido após reacção com padrões de hialuronidase de actividade conhecida. Outros ensaios para medir a actividade de hialuronidase são também conhecidos na especialidade e podem ser utilizados nos presentes métodos (ver e.g. Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al. , (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).

Pode-se também avaliar a capacidade de uma enzima de degradação de hialuronano para actuar como um agente de espalhamento ou difusão. Por exemplo, pigmento azul de tripano pode ser injectado subcutaneamente com ou sem uma enzima de degradação de hialuronano na pele lateral de cada lado de ratinhos nus. A área pigmentada é depois medida, tal como com um micrómetro, para determinar a capacidade da enzima de degradação de hialuronano para actuar como um agente de espalhamento (Patente dos E.U.A. N.2 20060104968) . O efeito da co-administração de hialuronidase com outro agente, tal como uma insulina, nas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas desse agente pode também ser avaliado in vivo utilizando um modelo animal e/ou sujeitos humanos, tal como no ambiente de um ensaio clínico, como descrito acima e demonstrado no Exemplo 1, abaixo. A actividade funcional de uma enzima de degradação de hialuronano que não é uma hialuronidase pode ser comparada com a de uma hialuronidase utilizando qualquer destes ensaios. Isto pode ser realizado para determinar qual é a quantidade funcionalmente equivalente de uma enzima de degradação de hialuronano. Por exemplo, a capacidade de uma enzima de degradação de hialuronano para actuar como um agente de espalhamento ou difusão pode ser avaliada por injecção da mesma na pele lateral de ratinhos com azul de tripano, e pode-se determinar a quantidade requerida para conseguir a mesma quantidade de difusão tal como, por exemplo, 100 unidades de um Padrão de Referência de Hialuronidase. A quantidade de enzima de degradação de hialuronano requerida é, por isso, funcionalmente equivalente a 100 unidades de hialuronidase. H. Utilizações terapêuticas

Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para tratamento de qualquer condição para a qual uma insulina de acção rápida é utilizada. A insulina pode ser administrada subcutaneamente, em combinação com uma enzima de degradação de hialuronano, para tratar qualquer condição que seja susceptível de tratamento com insulina. Tipicamente, uma enzima de degradação de hialuronano é co-administrada com uma insulina de acção rápida. Esta secção proporciona utilizações terapêuticas exemplificativas de insulina de acção rápida. As utilizações terapêuticas descritas abaixo são exemplificativas e não limitam as aplicações dos métodos aqui descritos. Utilizações terapêuticas incluem, mas não estão limitadas a, tratamento para diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2, diabetes gestacional e para controlo glicémico em pacientes criticamente doentes. Por exemplo, a insulina de acção rápida pode ser administrada em combinação com uma enzima de degradação de hialuronano subcutaneamente em doses discretas, tal como através de uma seringa ou caneta de insulina, antes de uma refeição como terapia de insulina prandial em sujeitos com diabetes para conseguir controlo glicémico. A insulina de acção rápida pode também ser administrada subcutaneamente ou intraperitonealmente em combinação com uma enzima de degradação de hialuronano utilizando uma bomba de insulina ou no contexto de um sistema em circuito fechado para controlar continuamente os níveis de glicose no sangue ao longo do dia e da noite e/ou para controlar excursões glicémicas pós-prandiais. Está dentro das competências do médico assistente identificar estas doenças ou condições.

Como discutido acima, dosagens e protocolos de tratamento particulares são tipicamente individualizados para cada sujeito. Se necessário, uma dosagem e duração e protocolo de tratamento podem ser determinados empiricamente ou extrapolados. Por exemplo, doses exemplificativas de insulina de acção rápida sem uma enzima de degradação de hialuronano podem ser utilizadas como ponto de partida para determinar as dosagens apropriadas para os métodos aqui proporcionados. Os níveis de dosagem podem ser determinados com base numa variedade de factores, tais como o peso corporal do indivíduo, estado de saúde geral, idade, a actividade do composto específico utilizado, sexo, dieta, actividade metabólica, concentrações de glicose no sangue, tempo de administração, velocidade de excreção, combinação de fármacos, a gravidade e curso da doença, e a propensão do paciente para a doença e o julgamento do médico assistente. Em particular, os níveis de glicose no sangue, tal como medidos por um sensor de glicose no sangue, podem ser medidos e utilizados para determinar a quantidade de insulina e de uma enzima de degradação de hialuronano a serem administradas para conseguir controlo glicémico. São conhecidos na especialidade algoritmos que podem ser utilizados para determinar uma dose com base na velocidade de absorção e no nível de absorção das composições de acção super-rápida aqui proporcionadas, e são também baseados nos níveis de glicose no sangue. As dosagens de insulina para controlo glicémico pós-prandial podem também ser calculadas ou ajustadas, por exemplo, por determinação do teor em carboidratos de uma refeição (Bergenstal et ai., (2008) Diabetes Care, Lowe et al., (2008) Diabetes Res. Clin. Pract., Chiesa et al., (2005) Acta Biomed. 76:44-48). 1. Diabetes mellltus A diabetes mellitus (ou diabetes) é caracterizada por um metabolismo de glicose comprometido. A glicose no sangue é derivada de carboidratos absorvidos no intestino e produzidos no fígado. Níveis crescentes de glicose no sangue estimulam a libertação de insulina. 0 influxo de glicose pós-prandial pode ser 20 a 30 vezes mais elevado do gue a produção de glicose hepática observada entre refeições. A libertação de insulina de fase precoce, com a duração de 10 minutos ou próximo disso, suprime a produção de glicose hepática e precede uma fase de libertação mais longa (tardia) , gue dura duas horas ou mais horas ou mais e cobre o influxo de carboidratos no momento da refeição. Entre refeições, um nível de insulina contínuo baixo, insulina basal, cobre as necessidades metabólicas em curso, em particular para regular a produção de glicose hepática bem como a utilização de glicose pelo tecido adipose, tecido muscular e outros locais alvo. Pacientes com diabetes apresentam-se com níveis elevados de glicose no sangue (hiperglicemia). A diabetes pode ser classificada em dois grupos principais: a diabetes Tipo 1 e a diabetes Tipo 2. A diabetes Tipo 1, ou diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM), é caracterizada por uma perda das células produtoras

de insulina dos ilhéus de Langerhans no pâncreas, conduzindo a uma deficiência de insulina. A causa primária da deficiência de células é a autoimunidade mediada por células T. A diabetes Tipo 2, ou diabetes mellitus não dependente de insulina (NIDDM), ocorre em pacientes com uma função de células comprometida. Estes pacientes têm resistência à insulina ou sensibilidade à insulina reduzida, combinada com secreção de insulina reduzida. A diabetes Tipo 2 pode eventualmente evoluir para diabetes Tipo 1. Na diabetes está também incluída a diabetes gestacional. Podem-se administrar insulina a pacientes com diabetes tanto para manter os níveis de insulina basal como para prevenir as excursões glicémicas, tal como após uma refeição. a. Diabetes Tipo 1 A diabetes Tipo 1 é uma doença autoimune dependente de células T caracterizada por infiltração dos ilhéus de Langerhans, a unidade endócrina do pâncreas, e destruição de células , conduzindo a uma deficiênaina produção de insulina e a hiperglicemia. A diabetes Tipo 1 é muito habitualmente diagnosticada em crianças e jovens adultos mas pode ser diagnosticada em qualquer idade. Pacientes com diabetes Tipo 1, para além de níveis baixos de insulina e níveis elevados de glicose no sangue, podem apresentar-se com poliúria, polidipsia, polifagia, visão turvada e fadiga. Os pacientes podem ser diagnosticados por se apresentarem com níveis de glicose no plasma em jejum de ou acima de 126 mg/dL (7,0 mmol/1), níveis de glicose no plasma de ou acima de 200 mg/dL (11,1 mmol/1) duas horas após uma carga de glicose oral de 75 g, tal como num teste de tolerância de glicose, e/ou níveis de glicose no plasma aleatórios de ou acima de 200 mg/dL (11,1 mmol/1). O tratamento primário para pacientes com diabetes Tipo 1 é a administração de insulina como terapia de substituição, que é tipicamente realizada em conjunto com monitorização da glicose no sangue. Sem substituição de insulina suficiente, pode-se desenvolver cetoacidose diabética, que pode resultar em coma ou morte. Podem-se administrar aos pacientes injecções subcutâneas de insulina de acção rápida utilizando, por exemplo, uma seringa ou caneta de insulina, ou uma bomba de insulina para manter níveis apropriados de glicose no sangue ao longo do dia e também para controlar os níveis de glicose pós-prandial. Em alguns casos, uma bomba de insulina, incluindo no contexto de um sistema em circuito fechado, pode ser utilizada para entregar insulina intraperitonealmente. Assim, pode-se administrar a composição de insulina de acção super-rápida aqui descrita a pacientes com diabetes tipo 1, subcutaneamente ou intraperitonealmente, através de seringa, caneta de insulina ou bomba de insulina, ou quaisquer outros meios para entrega de insulina, utilizando os métodos aqui descritos para mais rapidamente controlar os níveis de insulina e glicose no sangue. b. Diabetes Tipo 2 A diabetes Tipo 2 está associada a resistência à insulina e, em algumas populações, também a insulinopenia (perda da função de células ) . Em diabetes Tipo 2, a libertação de insulina de fase 1 está absente, e a libertação de fase 2 está retardada e é inadequada. 0 pico acentuado de libertação de insulina que ocorre em sujeitos saudáveis durante e após uma refeição é retardado, prolongado e insuficiente em quantidade em pacientes com diabetes Tipo 2, resultando em hiperglicemia. Pode-se administrar insulina a pacientes com diabetes Tipo 2 para controlar os níveis de glicose no sangue (Mayfield et al. (2004) Am. Fam. Physican 70:489-500) . Isto pode ser realizado em combinação com outros tratamentos e regimes de tratamento, incluindo dieta, exercício e outras terapias antidiabéticas (e.g. sulfonilureias, biguanidas, meglitinidas, tiazolidinadionas e inibidores de alfa-glucosidase). Assim, podem-se administrar a pacientes com diabetes Tipo 2 as composições de insulina de acção super-rápida aqui descritas subcutaneamente ou intraperitonealmente através de seringa, caneta de insulina ou bomba de insulina, ou quaisquer outros meios úteis para entrega de insulina, utilizando os métodos aqui descritos para mais rapidamente controlar níveis de insulina e glicose no sangue. Como aqui descrito noutro local, a administração de composições de insulina de acção super-rápida a pacientes diabéticos Tipo 2, para além de conseguir melhor controlo glicémico em comparação com a insulina de acção rápida correspondente, pode reduzir o risco de ganho de peso e obesidade que está muitas vezes associado à terapia de insulina em pacientes diabéticos Tipo 2. c. Diabetes gestacional

Mulheres grávidas que nunca antes tiveram diabetes mas que têm níveis elevados de glicose no sangue durante a gravidez são diagnosticadas com diabetes gestacional. Este tipo de diabetes afecta aproximadamente 1-14% de todas as mulheres grávidas, dependendo da população estudada (Carr et al.r (1998) Clinicai Diabetes 16) . Embora a causa subjacente permaneça desconhecida, parece provável que hormonas produzidas durante a gravidez reduzam a sensibilidade da mulher grávida à insulina. O mecanismo de resistência à insulina é provavelmente um defeito pós-receptor, dado que tem sido demonstrada a ligação de insulina normal por células sensíveis à insulina. O pâncreas liberta 1,5-2,5 vezes mais insulina de modo a responder ao aumento resultante na resistência à insulina. Pacientes com função pancreática normal são capazes de satisfazer estas necessidades. Pacientes com função pancreática no limite da normal têm dificuldade em aumentar a secreção de insulina e consequentemente produzem níveis de insulina inadequados. A diabetes gestacional resulta assim quando existe secreção de insulina retardada ou insuficiente na presença de resistência crescente à insulina.

Pode-se administrar insulina a pacientes com diabetes gestacional para controlar o nível de glicose no sangue. Assim, podem-se administrar as composições de insulina de acção super-rápida aqui descritas a pacientes com diabetes gestacional subcutaneamente através de seringa, caneta de insulina, bomba de insulina ou pâncreas artificial, ou quaisquer outros meios, utilizando os métodos aqui descritos para mais rapidamente controlar níveis de insulina e glicose no sangue. 2. Terapia para pacientes criticamente doentes

Hiperglicemia e resistência à insulina ocorrem frequentemente em pacientes criticamente doentes, medicamente e/ou cirurgicamente, e tal tem sido associado a morbilidade e mortalidade aumentadas em pacientes tanto diabéticos como não diabéticos e em pacientes com lesão traumática, acidente vascular cerebral, lesão cerebral anóxica, enfarte agudo do miocárdio, pós-cirurgia cardíaca, e outras causas de doença crítica (McCowen et al. (2001) Crit. Clin. Care 17:107-124). Pacientes criticamente doentes com hiperglicemia têm sido tratados com insulina para controlar os níveis de glicose no sangue. Este tratamento pode reduzir a morbilidade e a mortalidade entre este grupo (Van den Berghe et al. (2006) N. Eng. J. Med. 354:449-461). A insulina é tipicamente administrada intravenosamente ao paciente, tal como por injecção com uma seringa por um médico ou por perfusão utilizando uma bomba de insulina. Em alguns exemplos, algoritmos e software são utilizados para calcular a dose. Assim, pode-se administrar uma composição de insulina de acção super-rápida aqui descrita a pacientes criticamente doentes com hiperglicemia para controlar os níveis de glicose no sangue, aliviando deste modo a hiperglicemia e reduzindo a morbilidade e a mortalidade. I. Terapias de combinação

Qualquer das composições de insulina de acção super-rápida aqui descritas pode ser administrada em combinação com, antes de, intermitentemente com, ou subsequentemente a, outros agentes ou procedimentos terapêuticos incluindo, mas não limitados a, outros agentes biológicos e compostos de moléculas pequenas. Para qualquer doença ou condição, incluindo todas as acima exemplificadas, para as quais está indicada ou tem sido utilizada uma insulina de acção rápida e para as quais estão disponíveis outros agentes e tratamentos, as composições de insulina de acção super-rápida podem ser utilizadas em combinação com os mesmos. Dependendo da doença ou condição a ser tratada, combinações exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, combinação com fármacos antidiabéticos, incluindo, mas não limitados a, sulfonilureias, biguanidas, meglitinidas, tiazolidinadionas, inibidores de alfa- glucosidase, análogos de péptido, incluindo análogos de péptido semelhante a glucagon (GLP) e análogos de péptido inibidor gástrico (GIP) e inibidores DPP-4. Noutro exemplo, as composições de insulina de acção super-rápida aqui descritas podem ser administradas em combinação com, antes de, intermitentemente com, ou subsequentemente a, com uma ou mais outras insulinas, incluindo insulina de acção rápida, e insulinas de acção basal. J. Artigos de fabricação e kits

Compostos farmacêuticos das composições de insulina de acção super-rápida, composições de insulina e/ou de enzima de degradação de hialuronano, aqui proporcionadas podem ser embalados como artigos de fabricação contendo material de embalagem, uma composição farmacêutica que é eficaz para controlar os níveis de glicose no sangue, tal como em sujeitos diabéticos ou em estado crítico, e um rótulo que indica que as composições de insulina de acção super-rápida, composições de insulina e/ou de enzima de degradação de hialuronano, são para serem utilizadas para controlar os níveis de glicose no sangue.

Os artigos de fabricação aqui descritos contêm materiais de embalagem. Materiais de embalagem para utilização na embalagem de produtos farmacêuticos são bem conhecidas dos peritos na especialidade. Ver, por exemplo, Patentes dos E.U.A. N.os 5323907, 5052558 e 5033352. Exemplos de materiais de embalagem farmacêuticos incluem, mas não estão limitados a, embalagens de blister, frascos, tubos, inaladores, bombas, sacos, frascos para injectáveis, recipientes, seringas, frascos, e qualquer material de embalagem adequado para uma formulação seleccionada e modo de administração e tratamento pretendidos. Está contemplada uma ampla variedade de formulações dos compostos e composições aqui proporcionados bem como uma variedade de tratamentos para qualquer doença ou perturbação hemostática.

Composições de insulina de acção super-rápida, composições de insulina e/ou de enzima de degradação de hialuronano podem também ser proporcionadas como kits. Os kits podem incluir uma composição farmacêutica aqui descrita e um item para administração. Os kits podem também incluir composições farmacêuticas adicionais. Num exemplo, os kits podem incluir uma ou mais das composições de insulina de acção super-rápida, composições de insulina e/ou de enzima de degradação de hialuronano aqui proporcionadas e uma ou mais outras composições de insulina, tais como por exemplo, insulinas de acção lenta ou de acção intermédia, incluindo insulinas cristalinas, ou qualquer sua combinação. As composições de insulina de acção super-rápida, composições de insulina e/ou de enzima de degradação de hialuronano e/ou outras composições farmacêuticas podem ser fornecidas com um dispositivo para administração, tal como uma seringa, uma caneta de insulina, uma bomba, ou um reservatório que é inserido numa caneta de insulina, uma bomba ou outro dispositivo de entrega. Opcionalmente, o kit pode incluir instruções para aplicação incluindo dosagens, regimes de doseamento e instruções para modos de administração. Os kits podem também incluir uma composição farmacêutica aqui descrita e um item para diagnóstico. Por exemplo, estes kits podem incluir um detector ou sensor de glicose.

Os kits por exemplo podem também conter uma variedade de composições de insulina de acção rápida, ou outra composição de insulina, incluindo uma ou mais insulinas de acção basal, proporcionadas em recipientes separados e em dosagens variadas, que modo a que é oferecida ao utilizador a oportunidade para seleccionar uma dada dosagem de insulina, tal como uma dosagem prandial, para as circunstâncias especificas envolvendo uma ocorrência real ou antecipada de hiperglicemia.

K. EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são incluídos apenas para fins ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito do invento.

Exemplo 1 A co-administração de PH20 humana recombinante (rHuPH20) e insulina de acção rápida facilita farmacocinética e farmacodinâmica melhoradas A insulina, incluindo análogos de insulina, é administrada a sujeitos com diabetes mellitus para o controlo de hiperglicemia. Num esforço para replicar mais eficazmente libertação de insulina prandial fisiológica normal observada em sujeitos saudáveis, foram realizados estudos clínicos para determinar se a co-administração de PH20 humana recombinante (rHuPH20) podia aumentar a velocidade de absorção precoce e a quantidade de absorção da insulina de acção rápida administrada. A absorção aumentada poderia resultar em a insulina de acção rápida ter ainda uma acção mais rápida e, deste modo, mimetizar mais aproximadamente o perfil de concentração de insulina endógena em função do tempo observado em sujeitos saudáveis. Isto poderia proporcionar um benefício clínico no que se refere a um melhor controlo glicémico e ganho de peso reduzido em sujeitos com diabetes mellitus. Os estudos clínicos foram desenhados para avaliar a segurança, a tolerância, a farmacocinética (PK) e a farmacodinâmica (PD) de insulina Humulin® R e insulina lispro Humalog® (ambas sendo insulinas de acção rápida como aqui descrito) administradas subcutaneamente quer sozinhas quer em combinação com rHuPH20.

Exemplo la

Farmacocinética e farmacodinâmica de insulina lispro Humalog® ou insulina Humulin® R com ou sem co-administração de rHuPH20 em sujeitos saudáveis (não diabéticos)

Foi realizado um estudo randomizado, de dupla ocultação, cruzado, em duas etapas, de 2 braços sequenciais, para avaliar a administração subcutânea de 20 unidades (U) de insulina lispro Humalog® ou insulina Humulin® R com ou sem co-administração de rHuPH20. Foram arrolados no estudo vinte e cinco sujeitos do sexo masculino adultos saudáveis. Na etapa 1, 12 sujeitos receberam uma injecção subcutânea de insulina lispro Humalog® e rHuPH20 e uma injecção subcutânea separada de insulina lispro Humalog® sozinha. As injecções foram usualmente separadas por 7 dias, com metade dos sujeitos recebendo insulina lispro Humalog® e rHuPH20 primeiro, seguindo-se insulina lispro Humalog® sozinha, e metade dos sujeitos recebendo insulina lispro Humalog® sozinha primeiro, e depois insulina lispro Humalog® e rHuPH20. Na etapa 2, 13 sujeitos receberam uma injecção subcutânea de insulina Humulin® R e rHuPH20 e uma injecção subcutânea separada de insulina Humulin® R sozinha. As injecções foram usualmente separadas por 7 dias, com aproximadamente metade dos sujeitos recebendo primeiro Humulin® R e rHuPH20 seguindo-se insulina Humulin® R sozinha, e metade dos sujeitos recebendo insulina Humulin® R sozinha primeiro e depois insulina Humulin® R e rHuPH20.

Aproximadamente 14 horas antes de cada injecção, cada um dos sujeitos recebeu um jantar baseado num plano de refeição de 2000 calorias da American Diabetes Association com 60 g de carboidratos. Foi também proporcionado um lanche de 30 g de carboidrato. Aproximadamente 6 horas após o jantar, os sujeitos iniciaram o jejum (excepto água) durante pelo menos 8 horas antes de iniciarem um procedimento de Clamp Hiperinsulinémico-Euglicémico por um período de 8 horas. Colheram-se amostras de sangue pré-tratamento e mediram-se os sinais vitais e o peso antes dos sujeitos serem injectados com insulina lispro Humalog®, insulina lispro Humalog®/rHuPH20, insulina Humulin® R ou insulina Humulin® R/rHuPH20 2 horas após o procedimento de Clamp Hiperinsulinémico-Euglicémico ser iniciado. Colheram-se amostras de sangue a intervalos determinados, como descrito abaixo, e quantificaram-se os niveis de glicose e insulina durante um período de 6 horas. A. Doseamento

Como descrito acima, a 12 sujeitos administraram-se 20 U de insulina lispro Humalog® e 300 U de rHuPH20 em 220 pL, e 20 U de insulina lispro Humalog® em 200 pL subcutaneamente no quadrante abdominal esquerdo inferior na primeira etapa do estudo. A dose de insulina lispro Humalog®/rHuPH20 foi preparada descongelando primeiro rHuPH20 (1 mg/mL, equivalente a cerca de 120 000 U/mL em HEPES 10 mM/NaCl 130 mM a pH 7,0.) à temperatura ambiente durante uma hora e aspirando assepticamente 0,153 cc (equivalentes a 18 360 U) de rHuPH20 para uma seringa de insulina de 0,3 cc de capacidade. Os 0,153 cc de rHuPH20 foram depois transferidos lentamente para um frasco de injectáveis contendo 1,17 mL de 150 U/mL HYLENEX (rHuPH20). A partir deste frasco de injectáveis, foram aspirados 1,1 mL e transferidos para um frasco de injectáveis contendo cerca de 10,2 mL de insulina lispro Humalog® 100 U/mL aspirada a partir do frasco de injectáveis. Duzentos e vinte microlitros da mistura de insulina lispro Humalog®/rHuPH20 foram depois aspirados utilizando uma seringa de insulina de 0,3 cc de capacidade e utilizados no prazo de 4 horas para administração subcutânea a um único sujeito.

Assim, a mistura de insulina lispro Humalog®/rHuPH20 que foi entregue eram 220 pL e continha 300 U de rHuPH20 (2,5 pg), 20 U de insulina lispro Humalog®, 0,02 mg de albumina de soro humana (da formulação Hylenex, funciona para estabilizar a rHuPH20 contra perdas de adsorção e pode também ter propriedades de estabilização em relação à insulina e/ou actuar como um eliminador de oxidação); 3 mg de glicerina (da formulação de insulina lispro Humalog®, presente como um tampão de pH, estabilizador de insulina e/ou modificador de tonicidade); 0,6 mg de m-cresol (da formulação de insulina lispro Humalog®, conservante contra o crescimento microbiano presente a concentrações elevadas para estabiliza a conformação do hexâmero de insulina); 0,004 mg de zinco (da formulação de insulina lispro Humalog® utilizados para estabiliza a conformação hexâmero insulina); 0,18 mg de NaCl (da formulação Hylenex e rHuPH20 API, como um modificador de tonicidade); 0,4 de fosfato de sódio dibásico (da formulação Hylenex, como um tampão de pH) ; 0,017 mg de EDTA, dissódico (da formulação Hylenex como um quelante de metal com o potencial para ligar iões Zn2+ e Ca2+) ; 0, 006 mg de cloreto de cálcio (a partir da formulação Hylenex, forma um complexo com EDTA e pode melhorar o conforto da injecção subcutânea); 0,006 mg de HEPES (da formulação de rHuPH20 API, como tampão de pH); água (como o solvente) e NaOH e/ou HC1 para ajustamento do pH.

Na etapa 2, como descrito acima, administraram-se a 13 sujeitos tanto 20 U de insulina Humulin® R e 240 U de rHuPH20 em 200 pL como 20 U de insulina Humulin® R em 200 pL subcutaneamente no quadrante abdominal esquerdo inferior. A dose de insulina Humulin® R/rHuPH20 foi preparada aspirando primeiro 0,3 cc (150 U) a partir de um frasco de injectáveis de insulina Humulin® R utilizando uma seringa de insulina de 0,3 cc de capacidade e transferindo isto para um frasco de injectáveis contendo 1,2 mL de rHuPH20 1500 U/mL (formulada como uma composição 10X de HYLENEX). Agitou-se ligeiramente a mistura e removeram-se 0,3 cc de ar do frasco de injectáveis antes de se aspirarem 200 pL (contendo 20 U de insulina Humulin® R e 240 U de rHuPH20) utilizando uma seringa de insulina de 0,3 cc de capacidade. Estes foram utilizados no prazo de 4 horas para administração subcutânea a um único sujeito. A dose de 20 U de insulina Humulin® R em 200 pL foi preparada utilizando subcutaneamente uma única seringa.

Assim, a mistura de insulina Humulin® R/rHuPH20 que foi entregue eram 200 pL e continha 240 U USP de rHuPH20 (2 pg), 20 U de insulina Humulin® R, 0,16 mg de albumina de soro humana (da formulação de HYLENEX 10X, funcionam para estabilizar a rHuPH20 contra perdas de adsorção e também potencialmente para proporcionar propriedade de estabilização em relação à insulina e/ou actuar como um eliminador de oxidação); 3 mg de glicerina (da formulação Humulin® R, actuando como um tampão de pH, estabilizador de insulina e/ou modificador de tonicidade); 0,4 mg de m-cresol (da formulação de Humulin® R, actuando como um conservante contra o crescimento microbiano presente em concentrações elevadas para estabilizar a conformação de hexâmero de insulina); 0,34 mg de zinco (da formulação de Humulin® R, actuando para estabilizar a conformação de hexâmero de insulina); 1,36 mg de NaCl (da formulação de Hylenex 10X e rHuPH20 API, actuando como um modificador de isotonicidade); 0,224 de fosfato de sódio dibásico (da formulação de Hylenex 10X, para tampão de pH buffer); 0,161 mg de EDTA, dissódico (da formulação de Hylenex 10X, como quelante de metal com o potencial para ligar iões Zn2+ e Ca2+) ; 0, 048 mg de cloreto de cálcio (da formulação de Hylenex 10X, que formas um complexo com EDTA e pode melhorar o conforto da injecção subcutânea); água (como o solvente) e NaOH e/ou HC1 para ajustamento de pH. B. Procedimento de Clamp Hiperinsulinémico-Euglicémico O efeito da co-administração de rHuPH20 na farmacocinética de farmacodinâmica de insulina lispro Humalog® ou insulina Humulin® R administradas subcutaneamente foi avaliado colhendo amostras de sangue para medir os níveis de insulina (i.e. insulina lispro Humalog® ou insulina Humulin® R) e de glicose. Utilizou-se um procedimento de Clamp Hiperinsulinémico-Euglicémico para manter os níveis de glicose no plasma entre 90-110 mg/dL tal que as preparações de insulina pudessem ser administradas sem causar hipoglicemia. O procedimento consistiu de obter o peso e altura do sujeito e medir os sinais vitais inicialmente após repouso numa posição de sentado durante 5 minutos. Ambos os braços foram colocados em tapetes de aquecimento para dilatar as veias e foram depois inseridos cateteres IV. Um cateter foi colocado na veia antecubital de um braço para perfusão de dextrose a 20% através de duas torneiras separadas. O outro cateter intraarterial foi colocado no outro braço para colheita de amostras de sangue arterializado para medições de glicose. O tapete de aquecimento pode ser removido do local de perfusão de glicose, mas o local do cateter retrogrado foi mantido a 65°C. Obteve-se uma amostra de sangue inicial para medir a glicose de linha de base 30 minutos antes da injecção das preparações de insulina. Colheu-se sangue 10 minutos e 1 minuto antes das injecções de insulina lispro Humalog®, insulina lispro Humalog®/rHuPH20, insulina Humulin® R ou insulina Humulin® R/rHuPH20, depois a cada 3 minutos durante os primeiros 60 minutos, a cada 15 minutos desde os 60 minutos até às 3 horas, e depois a cada hora até às 6 horas. Os níveis de glicose de cada um dos sujeitos foram analisados ao longo do procedimento utilizando um Glucose Analyzer YSI 2300 (YSI Inc.) e a velocidade de perfusão de glicose (GIR) foi ajustada conforme necessário para manter a glicose no plasma entre 90-110 mg/dL. Os níveis de insulina no sangue foram analisados utilizando um ensaio de radioimunossorvente (RIA) que quantifica os niveis de insulina lispro Humalog® e insulina Humulin® R (Millipore BioPharma Services Division, St. Charles MO). C. Efeito da co-administração de rHuPH20 na farmacocinética da insulina de acção rápida

Foram medidos vários parâmetros para determinar o efeito da co-administração de rHuPH20 na farmacocinética da composição de insulina de acção rápida, insulina lispro Humalog® e insulina Humulin® R. Estes incluíram a concentração de insulina máxima medida durante o intervalo de doseamento seleccionado (Cmax) ; o tempo até à Cmax (tmax) ; e a área sob as curvas de concentração vs. tempo (AUC), que foi avaliada para vários intervalos de tempo. 1. Efeito da co-administração de rHuPH20 e insulina Humalog® na farmacocinética de insulina A concentração de insulina para cada intervalo de tempo após administração de insulina lispro Humalog® ou insulina lispro Humalog®/rHuPH20 foi avaliada por RIA, e é apresentada nas Tabelas 5 e 6, respectivamente. É também apresentada a AUC para os diferentes intervalos de tempo (0 minutos a x minutos; e.g. AUCo-3 minutos, AUCo-6 minutos, AUC0-9 minutos, etc.) , bem como a biodisponibilidade relativa (Frei) , que é calculada como a [AUCo- x (insulina Humulin® R + rHuPH20)] / [AUCo-x (insulina Humulin® R sozinha]*100. É também apresentado o declive incremental, que é determinado calculando a alteração na média geométrica dos níveis de insulina durante um intervalo de tempo, bem como a alteração média de declive, que é uma média amortecida de três valores do declive incremental.

Na Tabela 7 apresentam-se a Cmax (pmol/L) , o tmax (minutos) , e a AUCo-36o (min*pmol/L) para insulina lispro Humalog® e insulina lispro Humalog®co-administrada com rHuPH20. Na Tabela 8 apresentam-se as AUC para os diferentes intervalos de tempo.

Os resultados mostram que sujeitos que receberam a dose de insulina lispro Humalog®/rHuPH20 tiveram maior exposição o insulina lispro Humalog® nos intervalos de tempo precoces do que os doseados com insulina lispro Humalog® sozinha. A Tabela 9 proporciona um resumo de parâmetros PK específicos para cada sequência de doseamento (e.g., PK para insulina lispro Humalog®/rHuPH20 administrada em primeiro lugar (1) ou em segundo (2) e ambos (total)), e um resumo estatístico demonstrando que a sequência de doseamento não teve efeito na farmacocinética observada. A análise estatística determinou o palor p da diferença na PK observada utilizando os diferentes grupos de tratamento (i.e. insulina lispro Humalog® sozinha versus insulina lispro Humalog®/rHuPH20) , e a diferença na PK observada utilizando as diferentes sequências de doseamento (i.e. insulina lispro Humalog® sozinha primeiro e depois a insulina lispro Humalog®/rHuPH20, versus insulina lispro Humalog®/rHuPH20 primeiro e depois insulina lispro Humalog® sozinha). É também proporcionado na Tabela a biodisponibilidade relativa (Frei) que é calculada como a [AUCo-360 (insulina Humalog®/rHuPH20) ] / [AUCo-360 (insulina Humalog® sozinha] * 100.

Para a PK de insulina PK, tmax mediano foi reduzido em 54% com a co-administração de rHuPH20, de 105 para 48 min (p = 0, 0006), um efeito observado em todos os 12 sujeitos. A Cmax média aumentou 87% de 697 pmol/L quando se administraram aos sujeitos apenas insulina lispro Humalog® para 1300 pmol/L (p = 0,0003) com co-administração de rHuPH20. A AUCo-360min aumentou 11% de 134 867 para 149 523 min*pmol/L, enquanto para intervalos de tempo mais cedo as diferenças foram mais pronunciados (i.e. AUCo-30min e AUCo-60min aumentaram 155% e 140%, respectivamente). A variabilidade inter-sujeitos (SD/Média) em tmax melhorou de 34% quando os sujeitos receberam insulina lispro Humalog® sozinha para 17% quando os sujeitos receberam insulina lispro Humalog® em combinação com rHuPH20. Este exemplo demonstra que a insulina lispro Humalog®, por co-administração com uma enzima de degradação de hialuronano (rHuPH20), foi tornada uma insulina de acção super-rápida como aqui descrito.

2. Efeito da co-administração de rHuPH20 e de insulina Humulin® R na farmacocinética de insulina

Na etapa 2, os pacientes receberam quer a dose de insulina Humulin® R/rHuPH20 em primeiro lugar e a dose de insulina Humulin® R sozinha em segundo, quer a dose de insulina Humulin® R sozinha em primeiro lugar e depois a dose de insulina Humulin® R rHuPH20 usualmente 7 dias mais tarde. Nas Tabelas 10 e 11 apresentam-se, respectivamente, as concentrações de insulina para cada ponto temporal após administração de insulina Humulin® R ou de insulina Humulin® R co-administrada com rHuPH20. É também apresentada a AUC para os diferentes intervalos de tempo (i.e. AUC para 0 a x minutos (AUC(o-x)); e.g. AUC 0-3 minutos r AUC 0-6 minutos r AUCo—9 minutos, etc.) (Tabelas 10, 11 e 12), bem como a biodisponibilidade relativa (Frei) , que é calculada como a [AUCo-x (insulina Humulin® R/rHuPH20)] / [AUCo-x (insulina Humulin® R sozinha]*100. É também apresentado o declive incremental, que é determinado calculando a alteração na média geométrica dos níveis de insulina durante um intervalo de tempo, bem como a alteração média de declive, que é uma média amortecida de cinco valores do declive incremental.

3. Comparação da farmacocinética de insulina Humalog® e insulina Humulin® R com ou sem co-administração de rHuPH20

Compararam-se as farmacocinéticas de insulina lispro Humalog® e insulina Humulin® R com ou sem co-administração de rHuPH20. A Figura 1 apresenta um gráfico das concentrações médias geométricas insulina (para todos os sujeitos para cada composição) para cada intervalo de tempo. Tanto para Humalog® como para Humulin® R, as curvas de concentração-tempo foram desviadas de modo ascendente (concentrações de insulina mais elevadas) e para a esquerda (tempos mais rápidos). Por exemplo a concentração de insulina média geométrica máxima (Cmax) quase que duplicou (de 697 para 1200 pmol/L) para Humalog® e mais do que duplicou (de 433 para 967 pmol/L) para Humulin® R na presença de rHuPH20 em relação ao controlo. Similarmente, o tempo mediando para atingir esta concentração máxima (tmax) foi reduzido para Humalog® (de 105 para 48 minutos) e para Humulin® R (de 165 para 60 minutos) na presença de rHuPH20 em relação ao controlo. Este desvio para concentrações mais elevadas para pontos temporais mais precoces é consistente com uma velocidade de absorção aumentada e uma velocidade de eliminação constante. Assim, a co-administração de rHuPH20 aumentou a velocidade de absorção tanto de insulina lispro Humalog®, um análogo de insulina de acção rápida, como de insulina Humulin® R, uma insulina regular de acção rápida. A resposta de insulina prandial natural inclui um bólus imediato que ocorre durante os primeiros 10-15 minutos após ingestão de alimentos. Esta elevação rápida nos niveis de insulina proporciona um sinal fisiológico importante que resulta na paragem da libertação de glicose hepática para a circulação sistémica. Por conseguinte, a elevação na concentração de insulina em 15 minutos é um parâmetro particularmente importante. Os dados apresentados acima demonstram que as concentrações médias geométricas de insulina lispro 15 minutos após administração de Humalog® estão aumentadas 70% desde os seus niveis pré-administração (de 65 para 112 pmol/L) sem rHuPH20, mas após co-administração com rHuPH20, a concentração mais do que quadruplicou (de 64 para 264 pmol/L). Ainda mais acentuadamente, a concentração de média geométrica insulina aumenta apenas ligeiramente (de 62 para 74 pmol/L) para Humulin® R administrada sem rHuPH20, mas outra vez mais do que quadruplicou (de 53 para 251 pmol/L) quando co-administrada com rHuPH20. Assim, a co-administração com rHuPH20 proporciona uma elevação rápida nas concentrações de insulina que representa melhor a resposta de insulina prandial fisiológica precoce em indivíduos saudáveis. A resposta prandial natural continua durante aproximadamente 2 horas e proporciona controlo glicémico para os carboidratos no momento da refeição, e deste modo a exposição a insulina sistémica cumulativa durante as primeiras aproximadamente 2 horas é outro parâmetro particularmente importante. De acordo com os dados aqui proporcionados, a área cumulativa sob a curva de insulina média geométrica para as primeiras duas horas (AUC0-120) foi aumentada para Humalog® (de 50 000 para 87 000 min*pmol/L) e para Humulin® R (de 30 000 para 77 000 min*pmol/L) de presença de rHuPH20 em relação ao controlo. Similarmente, a resposta prandial natural está efectivamente completa em cerca de 4 horas após uma refeição, e a exposição a insulina em momentos pós-prandiais tardios pode conduzir a excursões hipoglicémicas. As exposições correspondentes desde as 4 até às últimas observações às 6 horas (AUC240-360) foram reduzidas para Humalog® (de 31 000 para 20 000 min*pmol/L) e para Humulin® R (de 35 000 para 20 000 min*pmol/L) na presença de rHuPH20 em relação ao controlo. Assim, a co-administração com rHuPH20 aumentou a exposição a insulina desejável em 175 e 256% e diminuiu a exposição a insulina indesejável em 67 e 58%, respectivamente para a co-administração com rHuPH20 em relação ao controlo. A variabilidade inter-pacientes na farmacocinética da administração de insulina requer que os médicos introduzam a terapia de insulina nos pacientes com níveis subterapêuticos e progressivamente aumentem a dose para evitar a sobredosagem de um paciente e o risco de um evento hipoglicémico. A variabilidade em farmacocinética pode ser expressa como o coeficiente de variação (CV; definido como o desvio padrão/média tipicamente expresso em percentagem) para parâmetros chave. 0 CV da concentração máxima (Cmax) comparada entre sujeitos foi reduzido para Humalog® (de 48% para 35%) e para Humulin® R (de 34% para 26%) na presença de rHuPH20 em relação ao controlo. 0 CV do tempo até à concentração máxima (t max) foi reduzido para Humalog® (de 48% para 35%) e para Humulin® R (de 32% para 28%) na presença de rHuPH20 em relação ao controlo. Os resultados anteriores demonstram que o CV da alteração em concentração de insulina durante os primeiros 15 minutos pós-administração foi reduzido para Humalog® (de 147% para 141%) e para Humulin® R (de 165% para 40%) na presença de rHuPH20 em relação ao controlo. O CV da exposição a insulina cumulativa durante as primeiras 2 horas (AUC0-120) foi reduzido para Humalog® (de 41% para 22%) e para Humulin® R (de 34% para 26%) na presença de rHuPH20 em relação ao controlo. Assim variabilidade inter-pacientes da farmacocinética de insulina foi reduzida para a insulina quando co-administrada com rHuPH20 em relação ao controlo. A farmacocinética para insulina Humulin® R foi melhorada por co-administração de rHuPH20 de modo que a farmacocinética substancialmente se assemelhou ao perfil farmacocinético de insulina lispro Humalog® quando co-administrada com rHuPH20. Em particular, a velocidade de absorção de insulina e os niveis de insulina no soro durante os primeiros 20 minutos eram comparáveis entre os dois tipos diferentes de insulina quando co-administrados com rHuPH20 (referência às Tabelas 9 e 13) . Em contraste, quando administradas sem rHuPH20, a insulina Humulin® R exibe uma velocidade de absorção muito mais lenta e um nivel de absorção diminuído em comparação com insulina lispro Humalog® nos intervalos de tempo precoces. Assim, a combinação de rHuPH20, uma enzima de degradação de hialuronano, e de uma insulina de acção rápida resulta em composições que actuam mais rápido e numa maior extensão do que a insulina de acção rápida sozinha e, para tempos precoces (i.e. menos de 20 minutos pós-administração) , de modo substancialmente independente do tipo de insulina de acção rápida. D. Efeito da co-administração de rHuPH20 na farmacodinâmica da velocidade de perfusão de glicose (GIR)

Para avaliar o efeito farmacodinâmico que a co-administração com rHuPH20 tem sobre a velocidade de perfusão de glicose (GIR), determinaram-se vários parâmetros farmacodinâmicos (ou glicodinâmicos (GD)) para sujeitos doseados com Humulin® R com ou sem rHuPH20. Estes incluíram o tempo até ao efeito máximo (tGIRmax) (minutos) ; o tempo até ao efeito semi-máximo tardio (tGIRso% tardio) (minutos) ; o tempo até efeito semi-máximo precoce (tGIRso% precoce) (minutos) ; o efeito metabólico máximo (GIRmax) (mL/h) ; AUC-GIRo-βο mm; AUC-GIR0-120 min } AUC-GIRo -180 min; AUC-GIRo -240 min; AUC-GIRo -300 min; Θ a AUC-GIRo-360 mm. A GIR foi expressa em mililitros de dextrose perfundidos por hora (mL/h), que podem ser convertidos em mg/kg/min utilizando o seguinte: GIR (mg/kg/min) = [Velocidade de perfusão IV (mL/h) x concentração de dextrose (g/dL) x 0,0167/massa do sujeito (kg), onde a concentração de dextrose = 190,6 mg/mL.

1. Efeito da co-administração de rHuPH20 e insulina Humalog® na farmacodinâmica de GIR

Calcularam-se as velocidades de perfusão de glicose para cada intervalo de tempo após administração de insulina lispro Humalog® sozinha ou de insulina lispro Humalog®/rHuPH20 e apresentam-se nas Tabelas 13 e 14, respectivamente.

Calcularam-se também as AUC (proporcional à administração de glicose cumulativa) e as AUC relativas (Frei) . É também apresentado o declive incremental, que é determinado por cálculo da alteração de GIR durante um intervalo de tempo.

Determinaram-se também os GIRmax, tmax e AUC-GIR para vários intervalos de tempo para estes sujeitos e são apresentados nas Tabelas 15 e 16. A Tabela 17 proporciona um resumo dos parâmetros PD para cada sequência de doseamento (e.g. PD de GIR para insulina lispro Humalog®/rHuPH20 administrada em primeiro lugar (1) ou em segundo lugar (2) e ambas (total)), e uma análise estatística para determinar se a sequência de doseamento afectava a farmacodinâmica observada. A análise estatística determinou o valor de p da diferença na PD observada utilizando os diferentes grupos de tratamento (i.e. insulina lispro Humalog® sozinha versus insulina lispro Humalog®/rHuPH20), e a diferença na PK observada utilizando as diferentes sequências de doseamento (i.e. insulina lispro Humalog® sozinha em primeiro lugar e depois a insulina lispro Humalog®/rHuPH20, versus insulina lispro Humalog®/rHuPH20 em primeiro lugar e depois insulina lispro Humalog® sozinha) .

Os dados PD da velocidade de perfusão de glicose suportam as constatações PK, mostrando que o tempo até ao efeito máximo (tGIRmax) foi encurtado 36% quando se administrou aos pacientes insulina lispro Humalog® em combinação com rHuPH20 (mediana 135 minutos) em comparação com insulina lispro Humalog® sozinha (mediana 210 minutos) , e o efeito metabólico máximo (GIRmax) aumentou 13% desde uma média de 181 mL/h quando os sujeitos receberam insulina lispro Humalog® sozinha até 205 mL/h quando os sujeitos receberam insulina lispro Humalog® e rHuPH20 (p = 0,35) . O tempo até ao efeito semi-máximo precoce (tGIRso% precoce) foi reduzido 38% desde uma mediana de 68 quando se administrou aos pacientes insulina lispro Humalog® sozinha para 42 min quando se administrou aos pacientes insulina lispro Humalog® em combinação com rHuPH20 (p = 0, 0006) .

2. Efeito da co-administração de rHuPH20 e insulina Humulin® R na farmacodinâmica de GIR

Na etapa 2, os pacientes receberam quer a dose de insulina Humulin® R/rHuPH20 em primeiro lugar e a dose de insulina Humulin® R sozinha em segundo lugar, quer a dose de insulina Humulin® R sozinha em primeiro lugar e depois a dose de insulina Humulin® R/rHuPH20 usualmente 7 dias mais tarde. Calcularam-se as velocidades de perfusão de glicose para cada intervalo de tempo após administração de insulina Humulin® R sozinha ou de insulina Humulin® R/rHuPH20 e apresentam-se nas Tabelas 18 e 19, respectivamente. Calcularam-se também as AUC e as quantidades relativas de glicose perfundidas durante vários intervalos de tempo (Grei) . É também apresentado o declive incremental, que é determinado por cálculo da alteração de GIR durante um intervalo de tempo.

3. Comparação da farmacodinâmica de insulina lispro Humalog® e insulina Humulin® R com ou sem co-administração de rHuPH20

Compararam-se as farmacodinâmicas de insulina lispro Humalog® e insulina Humulin® R com ou sem co-administração de rHuPH20. Avaliou-se o efeito relativo da co-administração de rHuPH20 na farmacodinâmica de cada tipo de insulina. A Figura 2 apresenta um gráfico das velocidades de perfusão de glicose para cada intervalo de tempo. Observou-se que a co-administração de rHuPH20 e Humalog® ou Humulin® R desviou acentuadamente as velocidades de perfusão de glicose em função do tempo de modo ascendente e para a esquerda em comparação com quando as insulinas foram administradas sem rHuPH20, similar ao desvio nos gráficos de concentração de insulina em função do tempo. A velocidade de perfusão máxima foi aumentada de ligeiramente desde uma média de 201 para 221 mL/h para Humalog® e de 187 para 203 mL/h para Humulin® R co-administrada com rHuPH20 em relação ao controlo. Similarmente, o tempo de GIR máxima foi reduzida de 193 para 136 minutos para Humalog® e de 253 para 206 minutos para Humulin® R co-administrada com rHuPH20 em relação ao controlo. O inicio de acção, conforme medido pelo tempo até à GIR semi-máxima precoce (tGIRso% precoce) foi reduzido de 72 para 43 minutos para Humalog® e de 113 a 83 minutos para Humulin® R co-administrada com rHuPH20 em relação ao controlo.

Os carboidratos no momento da refeição são grandemente digeridos e introduzidos na circulação sistémica durante as primeiras poucas horas (e.g. duas a quatro) após uma refeição dependendo do tipo de carboidrato, e assim a GIR cumulativa durante as primeiras 2 ou 3 horas (e.g. de 0 a 120 minutos) é particularmente relevante. O volume cumulativo de uma solução de glicose 190,6 mg/mL entregue durante as primeiras 2 horas aumentou de 163 a 248 mL para Humalog® e de 112 a 226 mL para Humulin® R co-administradas com rHuPH20 em relação ao controlo. O metabolismo do excesso de glicose, após a digestão dos carboidratos do momento da refeição estar completa, pode conduzir a incidentes hipoglicémicos adversos. O volume cumulativo de solução glicose entregue de 4 a 6 horas diminuiu de 289 para 212 mL para Humalog® e de 337 para 252 mL para Humulin® R co-administradas com rHuPH20 em relação ao controlo. Assim, a co-administração quer de um análogo de insulina de acção rápida quer de uma preparação de insulina regular de acção rápida com rHuPH20 aumenta precocemente a capacidade de abaixamento da glicose para facilitar a digestão pós-prandial e diminui a actividade de abaixamento da glicose quando essa actividade poderia conduzir a excursões hipoglicémicas. A GIR é um reflexo da quantidade de glicose que está a ser utilizada pelo corpo (i.e. mais glicose exógena necessita de ser perfundida para manter niveis normais de glicose no sangue i.e. entre 90-110 mg/dL, quando o corpo está a utilizar mais glicose), e, por conseguinte, da actividade farmacológica da insulina administrada (i.e. a actividade de insulina resulta em produção de glicose endógena reduzida e/ou utilização de glicose no sangue aumentada, resultando num declínio global da glicose no sangue). Assim, estes dados demonstram que a acção biológica de cada uma das insulinas foi substancialmente aumentada tanto em velocidade (início do metabolismo de glicose) e extensão quando co-administradas com rHuPH20, uma enzima de degradação de hialuronano, em comparação com quando as insulinas foram administradas sem rHuPH20.

Neste estudo, as propriedades farmacodinâmicas de insulina Humulin® R, quando co-administrada com rHuPH20, foram melhoradas de modo que a farmacodinâmica substancialmente se assemelhou ao perfil farmacodinâmico de Humalog® quando co-administrada com rHuPH20, em contraste com as propriedades farmacodinâmicas substancialmente retardadas de insulina Humulin® R em relação à insulina lispro Humalog® administrada na ausência de rHuPH20. A GIR requerida para manter niveis de glicose no sangue entre 90-110 mg/dL durante os primeiros 60 minutos, e, por extensão, a actividade farmacológica da insulina, particularmente nos primeiros 60-90 minutos após injecção, foi essencialmente a mesma entre os dois tipos de insulina diferentes quando co-administradas com rHuPH20. Em contraste, a insulina Humulin® R, que é uma insulina regular de acção rápida, quando administrada sem rHuPH20 tem um perfil de GIR que mostra uma velocidade mais lenta da acção de insulina em comparação com insulina lispro Humalog® quando administrada sem rHuPH20. Assim, a combinação de rHuPH20, uma enzima de degradação de hialuronano, e de uma insulina de acção rápida, por exemplo, sob condições tais como as descritas neste estudo resulta em composições de insulina de acção super-rápida que actuam mais rápido e numa maior extensão do que a insulina de acção rápida sozinha, e, para tempos mais precoces (i.e. menos de 60 minutos pós-administração), substancialmente independentemente do tipo de insulina de acção rápida.

Exemplo lb

Farmacocinética e resposta glicémica pós-prandial de insulina lispro Humalog® ou insulina Humulin® R injectadas subcu-taneamente com ou sem co-administração de rHuPH20 após uma refeição liquida em pacientes com diabetes mellitus tipo 1

Foi realizado um estudo avaliando a farmacocinética (PK) e a resposta glicémica pós-prandial (i.e. a farmacodinâmica (PD) ) de insulina lispro Humalog® e de insulina Humulin® R injectadas subcutaneamente, com ou sem co-injecção de rHuPH20, após uma refeição liquida em pacientes com Diabetes Mellitus Tipo 1. O estudo foi um ensaio de refeição liquida de ocultação simples (ocultação apenas para os pacientes), num único centro, cruzado, consistindo de uma série de desafios de refeição liquida padronizada, em pacientes diabéticos Tipo 1 com amostragem de sangue 2 horas de pré-doseamento e 8 horas de pós-doseamento para parâmetros PK e PD.

Cada sujeito foi submetido a uma série de visitas de identificação da dose para insulina lispro Humalog® e rHuPH20 (Visitas 2A-C; até três injecções) para determinar a dose de insulina individual apropriada quando co-injectada com rHuPH20 para cobrir a refeição liquida com um controlo glicémico óptimo (definido como a manutenção da glicose no sangue pós-prandial do paciente dentro de um intervalo de 60 mg/dL e 160 mg/dL). Uma vez determinada, esta mesma dose optimizada foi utilizada para uma refeição de teste que foi coberta por insulina lispro Humalog® sem rHuPH20 (Visita 3) . Os sujeitos foram depois submetidos à mesma série de investigações (Visitas 4A-B; até duas injecções) utilizando insulina regular humana (insulina Humulin® R) , para determinar a dose de insulina regular individual apropriada com rHuPH20 para controlo glicémico óptimo. A mesma dose optimizada foi utilizada para uma refeição de teste que foi coberta por insulina Humulin® R sem rHuPH20 (Visita 5). O estudo permitiu a comparação de perfis PK e excursões de glicose pós-prandial quando se administrou insulina prandial com ou sem rHuPH20. Avaliou-se também a hipoglicemia pós-prandial para verificar a relevância clinica de quaisquer diferenças de PK observadas. O objectivo principal foi comparar a exposição a insulina precoce conforme medida pelo ponto final f armacocinét ico (PK) primário de AUC0-60 de insulina lispro Humalog® e insulina Humulin® R injectadas subcutaneamente (SC) antes de uma refeição liquida com ou sem hialuronidase humana recombinante (rHuPH20). Outros parâmetros PK de insulina medidos incluíram Cmax; tmax; tso% precoce (tempo até à concentração no soro semi-máxima precoce), tso% tardio (tempo até à concentração no soro semi-máxima tardia) , AUCúitima (área sobe a curva de concentração-tempo desde o tempo 0 até à última observação que, de acordo com o protocolo, é 480 minutos pós-dose) ; AUC(o-mf) (AUC total desde o tempo 0 até ao infinito); AUCs de intervalos (0-15, 0-30, 0-45, 0-60, 0-90, 0-120, 0-180, 0-240, 0-360, 0-480, 15-480, 30-480, 45-480, 60-480, 90- 480, 120-480, 180-480 e 240-480 minutos); z (constante de velocidade de eliminação terminal; determinada por regressão linear dos pontos terminais da curva log-linear de concentração no soro-tempo); tl/2 (meia-vida de eliminação, definida como 0,693/ z); CL/F (elimição em função da biodisponibilidade; calculada como Dose/AUC(0-inf)); MRT(tardio) (tempo de residência médio desde o tempo 0 até à última observação gue, de acordo com o protocolo é 480 minutos pós-dose); MRT(0-inf) (tempo de residência médio desde o tempo 0 até ao infinito), e Vz/F volume de distribuição em função da biodisponibilidade) .

Os pontos finais farmacodinâmicos (PD) foram os parâmetros de resposta glicémica pós-prandial, incluindo AUCbg o-4h (onde BG designa glicose no sangue) , e outros pontos finais PD incluindo AUCbg para intervalos de tempo especificados, BGmax, t BGmax, t bg 50% precoce, t bg 50% tardio, episódios hipoglicémicos (HE) para intervalos de tempo especificados, perfusão de solução de glicose a 20% (quantidade e duração) para tratar a hipoglicemia, utilização de solução glicose a 50% para ressuscitação de emergência (i.e. presença de sintomas severos e/ou glicose no sangue <36 mg/dL) e excursões hipoglicémicas conforme quantificadas por AUC glicose no sangue acima de 36 mg/dL e abaixo de 70 mg/dL. Foram também avaliados parâmetros de segurança tais como eventos adversos, hematologia, bioquímica, análise à urina, exames físicos, sinais vitais, ECGs, glicose no sangue, tolerância local no sítio da injecção, e formação de anticorpos em relação a agentes de insulina e a rHuPH20. A. Selecção de pacientes

Foram elegíveis para inclusão no estudo pacientes do sexo masculino e feminino com diabetes mellitus Tipo 1, tratados com insulina há > 12 meses. Foi requerido que os pacientes tivessem 18 a 65 anos de idade. Foi requerido às mulheres com potencial para engravidar que utilizassem meios padrão e eficazes de controlo de concepção durante o estudo. Outros critérios de inclusão incluíram: IMC 18,0 a 29,0 kg/m2, inclusive; HbAlc (hemoglobina Alc glicosilada) < 10% com base em resultados de laboratório local; Péptido C em jejum <0,6 ng/mL; tratamento corrente com insulina <1,2 U/kg/dia. Foi também requerido que os pacientes estivessem em bom estado de saúde geral com base na história médica e no exame físico, sem condições médicas que pudessem impedir a completude das injecções de fármaco do estudo e as avaliações requeridas neste protocolo.

Os vários critérios de exclusão do estudo incluiram: alergia conhecida ou suspeita a qualquer componente de qualquer dos fármacos de estudo no ensaio; arrolamento anterior no estudo; pacientes com retinopatia proliferativa ou maculopatia e/ou neuropatia severa, e particular neuropatia autónoma; doença activa clinicamente significativa dos sistemas gastrointestinal, cardiovascular (incluindo uma história de arritmia ou atrasos de condução no ECG), hepático, neurológico, renal, génito-urinário ou hematológico, ou hipertensão descontrolada (pressão sanguínea diastólica > 100 mmHg e/ou pressão sanguínea sistólica > 160 mmHg após 5 minutos na posição deitada); história de qualquer condição ou doença que pudesse confundir os resultados do ensaio ou colocar risco adicional na administração dos fármacos de estudo ao paciente; constatações clinicamente significativas em dados de laboratório de rotina; anemia com hemoglobina mais baixa do que os limites inferiores do normal na triagem É especificamente excludente; utilização de fármacos que possam interferir com a interpretação de resultados do ensaio ou que se conhece que causam interferência clinicamente relevante com a acção de insulina, utilização de glicose ou recuperação a partir de hipoglicemia; hipoglicemia grave recorrente ou desconhecimento de hipoglicemia, conforme avaliado pelo Investigador; dependência corrente do álcool ou de substâncias de abuso; doação de sangue (> 500 mL) nas 9 semanas anteriores às Visita 2A (ver secção B, abaixo) do estudo; gravidez, amamentação, intenção de engravidar ou não utilização de medidas contraceptivas adequadas (medidas contraceptivas adequadas consistem de esterilização, dispositivo intra-uterino [DIU], contraceptivos orais ou injectáveis ou métodos de barreira); incapacidade mental, relutância, ou barreiras de linguagem impedindo a compreensão ou cooperação adequadas; gastroparesia sintomática; recepção de qualquer fármaco em investigação nas 4 semanas da Visita 2A (ver secção B, abaixo) neste estudo; qualquer condição (intrínseca ou extrínseca) pudesse interferir com a participação no ensaio ou com a avaliação de dados; utilização corrente de terapia de bomba de insulina e relutância em mudar para Lantus em conjunto com uma insulina de acção curta no decorrer da duração do ensaio.

Vinte e um pacientes avaliáveis completaram o ensaio: 14 do sexo masculino; 7 do sexo feminino; idade = 41,6 ± 10,6 anos; IMC = 24,4 ± 286 kg/m2) . Um paciente avaliável foi um paciente que completou a visita 3 e a visita 5 e que tinha amostragem de sangue suficiente e avaliações de segurança para análises do ponto final. Qualquer paciente que não completou todas as injecções de fármaco de estudo especificadas no protocolo e/ou sem amostragem de sangue suficiente e avaliações de segurança até à visita 5 foi substituído pelo arrolamento de um paciente adicional. B. Métodos de estudo 1. Procedimentos de visita

Cada paciente participou de uma visita de triagem (Visita 1) para determinar a elegibilidade para participação no ensaio. Uma vez arrolado, cada paciente teve pelo menos uma e até três Visitas 2A-C para identificação do doseamento (insulina lispro Humalog® com rHuPH20), uma Visita 3 de doseamento (insulina lispro Humalog® sozinha), pelo menos uma e até duas Visitas 4A-B para identificação do doseamento (insulina Humulin® R com rHuPH20), uma Visita 5 de doseamento (insulina Humulin® R sozinha), e uma visita de seguimento (Visita 6).

Pacientes utilizando uma bomba de insulina, NPH, ou qualquer outra insulina de acção longa, que participaram no estudo, foram convertidos em Lantus no decorrer da duração do estudo. A conversão ocorreu assim que o sujeito passou as avaliações de triagem mas pelo menos 36 horas antes da sua primeira visita de doseamento.

Cada visita de identificação da dose e cada visita de doseamento foi completada num único dia. Após registo ao início da manhã, os pacientes foram observados e estabilizados durante aproximadamente 2 horas utilizando glicose e/ou insulina intravenosa conforme requerido para levar a glicose no sangue a um valor alvo de 100 mg/dL. Não foi permitida qualquer perfusão de insulina ou glicose durante os 30 minutos imediatamente antes do doseamento. Isto foi depois seguido por doseamento com o artigo de teste (i.e. insulina lispro Humalog®, insulina lispro Humalog®/rHuPH20, insulina Humulin® ou insulina Humulin®/rHuPH20) e depois consumo da refeição liquida aproximadamente às 8:30 AM. Em todas as visitas de doseamento, as avaliações PK e PD prosseguiram durante 8 horas até aproximadamente às 4:30 PM, momento no qual os pacientes receberam uma refeição e foram dispensados se considerado seguro. 2. Preparações para os procedimentos de visita para identificação da dose

Um cateter de calibre 18 foi inserido na veia cubital do mesmo braço para análise da insulina no soro e da glicose no sangue um YSI STAT2300 Glucose Analyzer. A coagulação de sangue no cateter e na tubagem foi impedida por purga com solução salina 0,15 mmol/L. Um segundo cateter de calibre 18 de PTFE foi colocado numa veia do antebraço oposto para perfusão de solução de glicose a 20%, solução salina e insulina conforme considerado apropriado durante o período de pré-doseamento. Sessenta minutos antes do doseamento, determinou-se a concentração de glicose no sangue nos pontos temporais seguintes em relação ao doseamento: -60, -30, -20 e -10 min com um YSI STAT2300 Glucose Analyzer. Utilizou-se a média das leituras de glicose no sangue aos -30, -20 e -10 min para determinar o nível de glicose no sangue em jejum do paciente individual para cada visita de identificação de dose e de dosagem. Um paciente com diferenças entre valores de glicose no sangue em jejum iniciais que são consideradas demasiado elevadas foi reagendado para outra visita ou retirado do estudo. 3. Período de pré-doseamento

Durante o período de introdução de 2 horas, a glicose no sangue foi monitorizada conforme necessário para estabilizar a glicose no sangue no intervalo pretendido. O período de introdução de 2 horas foi utilizado para ajustar os níveis de glicose no sangue como apropriado por administração IV de glicose e/ou insulina por meio de uma bomba de seringa/perfusão de precisão. Não foi administrada qualquer perfusão de insulina ou glicose durante os 30 minutos imediatamente antes do doseamento. No momento da administração de fármaco, o nível de glicose no sangue do paciente estava num intervalo entre 80 e 140 mg/dL (visando um valor tão próximo quanto possível do intervalo de 100-120 mg/dL). 4. Dosagem e ingestão da refeição liquida padrão

Após o período de introdução de 2 horas, administrou-se a injecção do fármaco de estudo (no ponto temporal 0) por injecção subcutânea com uma seringa numa prega de pele levantada da parede abdominal. Os artigos de teste foram preparados como se segue. A dose de insulina Humulin® R sozinha foi preparada por aspiração da dose correcta (como determinada na Visita 4) a partir de um frasco de injectáveis de insulina Humulin® R (100 U/mL; Eli Lilly) utilizando uma seringa de insulina de 0,3 cc de capacidade. A insulina Humulin® R/rHuPH20 foi preparada aspirando primeiro 0,3 cc (150 unidade) a partir de um frasco de injectáveis de insulina Humulin® R (500 U/mL; Eli Lilly) utilizando uma seringa de insulina de 0,3 cc de capacidade e transferindo isto para um frasco de injectáveis contendo 1 mL de rHuPH20 (20 pg/mL; 3000 U/mL). A solução foi misturada rodando suavemente. A dose de insulina lispro Humalog® sozinha foi preparada aspirando a dose correcta (como determinada na Visita 2) a partir de um frasco de injectáveis de insulina lispro Humalog® (100 U/mL; Eli Lilly) utilizando uma seringa de insulina de 0,3 cc de capacidade. A insulina lispro Humalog®/rHuPH20 foi preparada descongelando primeiro um frasco de injectáveis de rHuPH20 (1 mg/mL; aproximadamente 1200 000 U/mL) à temperatura ambiente durante 1 a 2 horas. Utilizando uma seringa estéril de insulina de 0,3 cc de capacidade, 0,27 cc de ar foram puxados para dentro a seringa e expelidos no espaço vazio do frasco de injectáveis rHuPH20, antes de 0,27 cc (0,27 mg; aproximadamente 32400 U) de rHuPH20 serem puxados para dentro da seringa. Isto foi depois transferido lentamente, para evitar a formação de espuma, para um frasco de injectáveis de Hylenex e rodou-se suavemente. Utilizando uma seringa de insulina estéril de 3,3 cc, 1,1 mL de foram puxados e expelidos no espaço vazio do frasco de injectáveis de Hylenex (contendo um extra de 0,27 mg de rHuPH20; aproximadamente 32400 U) antes de 1,1 mL da solução serem aspirados e dispensados para um frasco de injectáveis de insulina lispro Humalog® (100 U/mL; Eli Lilly). A solução foi misturada rodando suavemente.

Administrou-se uma dose média de 5,7 (± 3,0) de insulina lispro Humalog®, com ou sem rHuPH20 (0,2 yg/U insulina) . Administrou-se uma dose média de 6,2 (± 3,5) de insulina Humulin® R, com ou sem rHuPH20 (0,2 yg/U insulina). Os locais de injecção para insulinas co-administradas com rHuPH20 como se segue: injecção na Visita 2A foi na região média abdominal esquerda, na visita seguinte (Visita 2B ou Visita 3 se a Visita 2B não foi necessária) utilizou-se a região média abdominal direita e na visita seguinte utilizou-se a região média abdominal esquerda, com os locais de injecção subsequentes alternando de modo correspondente. A agulha de injecção foi colocada num ângulo de 45 graus e mantida na prega de pele durante 10 segundos.

No prazo de 10 minutos após o doseamento de fármaco de estudo, os pacientes consumiram uma refeição liquida (Ensure) proporcionando 60 g de carboidrato. A refeição liquida foi totalmente ingerida em 10 minutos. A glicose no sangue foi medida durante as 8 horas seguintes a pontos temporais especificados. Medições de glicose no sangue adicionais para propósitos de segurança foram realizadas conforme necessário. 5. Amostragem de avaliação

Durante o período de pré-doseamento e após o doseamento, monitorizou-se a concentração de glicose no sangue por medições frequentes da glicose no sangue utilizando o YSI STAT2300 Glucose Analyzer nos pontos temporais especificados de -60, - 30,-20, -10, 0, 3, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 255, 270, 285, 300, 315, 330, 345, 360, 375, 390, 415, 420, 430, 445, 460, 475 e 480 minutos. Amostras de sangue em série para a determinação da insulina no soro foram colhidas aos -30, -30, -10, 0, 3, 6, 9, 12, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 360, 420 e 480 minutos. B. Farmacocinética de insulina Humulin® R e insulina lispro Humalog® com ou sem rHuPH20 A farmacocinética para insulina lispro Humalog®/rHuPH20 e insulina Humulin® R/rHuPH20 mostrou uma exposição acelerada mas sobretudo comparável em comparação com cada insulina sem rHuPH20. A Tabela 19a apresenta um resumo de vários parâmetros PK para 12 pacientes. Esta foi uma análise provisória que foi realizada antes dos dados de todos os pacientes serem recolhidos. Assim, apenas os dados de 12 dos 21 pacientes contribuíram para esta análise. Inclui-se também o efeito da co-administração com rHuPH20 apresentado como a % do controlo, calculada por [valor de PK média (geométrica ou aritmética) para insulina com rHuPH20] / valor de PK média (geométrica ou aritmética) para insulina sozinha] x 100). Média geométrica e valor de p para dados com transformação logarítmica para parâmetros Cmax e AUC, quando baseados na média aritmética, e valores não transformados para tmax e tso% precoce e tardio. O ponto final principal, exposição insulina total durante a primeira 1 hora (AUC0-60) , foi aumentado 135% para insulina lispro Humalog®/rHuPH20 em comparação com insulina lispro Humalog® sozinha (p = 0,0197) e 304% para insulina Humulin® R/rHuPH20 em relação à insulina Humulin® R sozinha (p = 0,0005) . O 150% precoce diminuiu de 19,9 para 12,6 min (p = 0,0002) para insulina lispro Humalog® e de 40,1 para 14,8 (p = 0,033) para insulina Humulin® R. O tmax diminuiu de 43,8 para 27., min (p =0,002) para insulina lispro Humalog® e de 96,7 para 52,1 (p = 0, 086) para insulina regular; O tso% tardio diminuiu de 98,6 para 68,6 min (p = 0, 0001) para insulina lispro Humalog® e de 219,2 para 111,2 (p = 0,008) para insulina Humulin® R.

A Tabela 19b apresenta um sumário de parâmetros PK para a totalidade dos 21 pacientes que completaram o estudo, mostrando o meio e o desvio padrão. As análises de PK na Tabela 19b foram realizadas na concentração individual de insulina lispro Humalog® ou insulina Humulin® R subtraída da linha de base (onde a linha de base foi a medição no instante 0) versus os dados de tempo utilizando a abordagem não compartimentai (regra trapezoidal linear para calculo de AUC). Utilizaram-se critérios de selecção de utilizador WinNonlin na determinação de Lambda z, a constante de velocidade de eliminação, na qual foram baseados a meia-vida, AUC INFobs, MRT, CL e Vz. Todas as medições inferiores a 20,0 pM foram ajustadas a zero para o propósito do cálculo de PK. A adição de rHuPH20 à injecção de insulina lispro Humalog® ou insulina Humulin® R aumentou a exposição a insulina precoce. A Cmax subtraída da linha de base normalizada em relação à dose média foi aumentada 74% de 46,6 para 81,2 pmol/L com adição de rHuPH20 a insulina lispro Humalog®, e 122% de 25,4 para 56,5 pmol/L para insulina Humulin® R. Para o ponto final de PK primário, AUCo-60min, a co-administração com rHuPH20 aumentou a exposição precoce a insulina lispro Humalog® em 75% de 1690 para 2950 min*pmol/L/IU e aumentou a exposição precoce a insulina Humulin® R em 210% de 649 para 2010 min*pmol/L/IU em relação à administração de controlo sem enzima. A biodisponibilidade após co-administração com rHuPH20 não foi significativamente alterada em relação à injecção de controlo de insulina lispro Humalog® sozinha: 98% para AUCo-mf e 116% para AUCo-úitima. A biodisponibilidade relativa foi 120% para AUCo-mf e 174% para AUCo-úitima com co-administração de insulina Humulin® R com rHuPH20 em relação ao controlo administração sem enzima (dados de média geométrica subtraídos da linha de base, normalizados em relação à dose, utilizados para estes cálculos; dados não mostrados). A co-administração de insulina e lispro com rHuPH20 acelerou tmax e tso% precoce e tardio em comparação com injecção de controlo sem rHuPH20. O tempo até à concentração de pico de insulina foi mais rápido para a injecção de insulina lispro Humalog® com rHuPH20, com a média aritmética de tmax aos 38,8 minutos, versus 47,1 minutos com a injecção de insulina lispro Humalog® sem rHuPH20. A injecção subcutânea de insulina Humulin® R com rHuPH20 resultou num tmax de 58,3 minutos, em comparação com 104 minutos sem rHuPH2 0 .

C. Comparação da resposta glicémica a desafio de refeição após insulina humana regular e insulina lispro com ou sem rHuPH20 A resposta glicémica a um desafio de refeição foi melhorada quando insulina lispro Humalog® ou insulina Humulin® R foi administrada com rHuPH20 em comparação com quando as insulinas foram administradas sozinhas. A Tabela 19c apresenta os parâmetros farmacodinâmicos conforme medidos a partir de 12 pacientes. A co-administração de quer insulina lispro Humalog® quer insulina Humulin® R com rHuPH20 resultou em níveis pós-prandial reduzidos de glicose no sangue em relação à injecção de controlo sem rHuPH20. 0 máximo de glicose no sangue observado no período pós-prandial de 4 h foi reduzido de 186 para 154 mg/dL quando insulina lispro Humalog® foi administrada com rHuPH20 em comparação com insulina lispro Humalog® sozinha (p = 0,0213) e de 212 a 166 mg/dL quando insulina Humulin® R foi administrada com rHuPH20 em comparação com insulina Humulin® R sozinha (p = 0,0406). A glicose pós-prandial (PPG) às 2 h e área de excursão total maior do que 140 mg/dL foram reduzidas similarmente. A área de excursão total menor do que 70 mg/dL e mínima e similar para todos os artigos de teste, com uma tendência menor no sentido da área aumentada para insulina lispro Humalog® e área diminuída para insulina Humulin® R com co-administração rHuPH20.

D. Segurança Não foram reportados quaisquer eventos adversos (EA) graves. O EM mais habitualmente reportado foi glicose no sangue diminuída/hipoglicemia (147 eventos). Dos 147 eventos de glicose no sangue diminuída/hipoglicemia, 21 foram considerados possivelmente ou provavelmente relacionados com rHuPH20. 17 Eventos foram ponderados como moderados em intensidade, 4 dos quais foram considerados possivelmente relacionados com rHuPH20. Os restantes 126 eventos foram pontuados como suaves em intensidade. Todos os outros EAs ocorreram com menos de 5% de frequência neste estudo.

Todos os episódios de hipoglicemia (definidos como possuindo um valor de glicose no sangue valor >70 mg/dL) independentemente dos sintomas foram capturados como AEs neste estudo. E. Sumário A co-administração quer de insulina lispro Humalog® quer de insulina Humulin® R com rHuPH20 resultou em exposição a insulina mais cedo com parâmetros tmax, tso% precoce e tso% tardio mais cedo, bem como maior concentração de pico de insulina em relação a injecções de controlo sem rHuPH20, sem uma alteração significativa em biodisponibilidade. Esta exposição a insulina mais cedo conduziu a menos hiperglicemia pós-prandial, com níveis de glicose 0-4 h de pico reduzidos, níveis de glicose pós-prandial às 2 h reduzidos, e menos excursões hiperglicémicas conforme medido pela AUC > 140 mg/dL. As excursões hipoglicémicas, conforme medido pela AUC < 70 mg/dL, foram mínimas e similares para todos os artigos de teste, com uma pequena tendência no sentido de área aumentada para insulina lispro Humalog® e área diminuída para insulina regular humana (insulina Humulin® R) após co-administração com rHuPH20.

Exemplo lc

Farmacocinética e farmacodinâmica de insulina Humulin® R ou insulina lispro Humalog® administradas subcutaneamente com ou sem doses variáveis de rHuPH20 recombinante em sujeitos humanos saudáveis

Como parte de um estudo em 4 etapas, de ocultação simples (os sujeitos não conhecem o conteúdo de cada injecção), sem ocultação, de fase I, num único centro, para determinar a farmacocinética, farmacodinâmica (ou glicodinâmica; GD) , segurança, tolerância e proporção óptima de rHuPH20:insulina, administraram-se subcutaneamente (SC) uma gama de proporções de doses de rHuPH20 com doses de insulina regular (insulina Humulin® R) ou insulina lispro Humalog®, e avaliaram-se a farmacocinética (PK) e a proporção óptima de rHuPH20:insulina por determinação de tmax, Cmax, AUCo t e biodisponibilidade relativa com base nas concentração de insulina no soro colhidas a pontos temporais especificados.

Avaliou-se o efeito da co-administração de doses variáveis de rHuPH20 na farmacocinética e farmacodinâmica (ou glicodinâmica (GD)) de insulina Humulin® R ou insulina lispro Humalog® administradas subcutaneamente colhendo amostras de sangue para medir os niveis de insulina e de glicose. Utilizou-se um procedimento de Clamp Hiperinsulinémico-Euglicémico (como descrito no Exemplo 1) para manter os niveis de glicose no plasma entre 90-110 mg/dL. Avaliaram-se as concentrações de insulina para determinar os parâmetros PK de insulina: tmax, t5o% precoce, tso% tardio, AUCo te AUCt fim(onde t = 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360 e 480 min após injecção) , AUCo tot»i AUCo i„t Cmax, biodisponibilidade relativa (por comparação com e sem rHuPH20), e variabilidade inter-sujeitos e intra-sujeito com base no coeficiente de variação para todos os parâmetros PK. Mediu-se a velocidade de perfusão de glicose (GIR) para manter a euglicemia enquanto no clamp e utilizou-se para determinar os parâmetros GD seguintes: tGIRmax, tGIRso% precoce, tGIRso% tardia, GIR AUCo te GIR AUCt fim(onde t = 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360 e 480 min após injecção), GIR AUCt totaie cGIRmax, e variabilidade inter-sujeitos e intra-sujeito com base no coeficiente de variação para todos os parâmetros GD. Avaliaram-se também a segurança e a tolerância local de cada uma das injecções SC. A. Administração de insulina Humulin® R com ou sem doses variáveis de rHuPH20 A voluntários saudáveis, administraram-se 30 pL ou 120 pL de insulina Humulin® R (diluída até 100 U/mL) com uma concentração final de qualquer de 0 pg/mL, 1,25 pg/mL, 5 pg/mL, 10 pg/mL, 20 pg/mL ou 80 pg/mL de rHuPH20 (aproximadamente 0 U/mL, 150 U/mL, 600 U/mL, 1200 U/mL, 2400 U/mL ou 9600 U/mL, respectivamente). Assim, administraram-se aos voluntários quer 30 pL contendo 3 U de insulina Humulin® R com aproximadamente 0, 4,5, 18, 36, 72 ou 288 Unidades de rHuPH20, quer 120 pL contendo 12 U de insulina Humulin® R com aproximadamente 0, 18, 72, 144, 288 ou 1152 Unidades de rHuPH20. A Tabela 19d apresenta os parâmetros farmacocinéticos medidos para os sujeitos que receberam 12 U de insulina. Os parâmetros PK caracteristicos de co-administração com hialuronidase (tmax e ti/2max mais cedo, maior Cmax e exposição sistémica precoce e.g. AUCo-60min) estavam aumentados comparavelmente para todas as concentrações de rHuPH20 testadas em comparação com quando a insulina foi administrada sozinha. Os perfis de velocidade de perfusão de glicose (GIR) para todas as concentrações de rHuPH20 foram diferentes dos do placebo (i.e. 0 pg/mL) com um aumento caracteristico nas velocidades precoces e diminuição na perfusão de glicose tardia. Para as doses testadas, todas as concentrações de rHuPH20 foram similarmente eficazes, e não se observou qualquer dose não eficaz.

B. Administração de insulina lispro Humalog® com ou sem doses variáveis de rHuPH20 A voluntários saudáveis, administraram-se 30 pL ou 120 pL de insulina lispro Humalog® (diluída até 50 U/mL) com uma concentração final de qualquer de 0 pg/mL, 0,078 pg/mL, 0,3 pg/mL, 1,2 pg/mL, 5 pg/mL ou 20 pg/mL de rHuPH20 (aproximadamente 0 U/mL, 9,36 U/mL, 36 U/mL, 144 U/mL, 600 U/mL ou 2400 U/mL, respectivamente). Assim, administraram-se aos voluntários quer 30 pL contendo 1,5 U de insulina lispro Humalog® com aproximadamente 0, 0,28, 1,08, 4,32, 18 ou 72

Unidades de rHuPH20, quer 120 pL contendo 6 U de insulina lispro Humalog® com aproximadamente 0, 1,12, 4,32, 17,28, 72 ou 288 Unidades de rHuPH20. A Tabela 19e apresenta os parâmetros farmacocinéticos medidos para os sujeitos que receberam 6 U de insulina lispro Humalog®. Para as doses testadas, todas as concentrações de rHuPH20 maiores do que 0,3 pg/mL foram similarmente eficazes.

Exemplo 2.

Geração de uma linha de células exprimindo rHuPH20 solúvel

Utilizou-se o plasmídeo HZ24 (apresentado na SEQ ID NO:52) para transfectar células de ovário de hamster chinês (células CHO) (ver e.g. Pedidos de Patente dos E.U.A. N.os 10/795095, 11/065716 e 11/238171) . O vector de plasmídeo HZ24 para expressão de rHuPH20 solúvel contém uma cadeia principal de vector pCI (Promega), ADN codificando os aminoácidos 1482 de hialuronidase PH20 humana (SEQ ID NO:49), um local interno de entrada do ribossoma (IRES) do virus ECMV (Clontech), e o gene de di-hidrofolato-redutase (DHFR) de ratinho. A cadeia principal do vector pCI inclui também ADN codificando o gene de resistência de beta-lactamase (AmpR), uma origem de replicação de fl, uma região de intensificador/promotor imediato-precoce de citomegalovirus (CMV), um intrão quimérico, e um sinal de poliadenilação tardio de SV40 (SV40). O ADN codificando o constructo de rHuPH20 solúvel contém um sitio de Nhel e uma sequência de consenso Kozak antes do ADN codificando a metionina na posição de aminoácido 1 da sequência de sinal nativa de 35 aminoácidos de PH20 humana, e um codão de paragem após o ADN codificando a tirosina correspondente à posição de aminoácido 482 da hialuronidase PH20 humana (apresentada na SEQ ID NO:l), seguida por um sitio de restrição BamHI. O constructo pCI-PH2 0-IRES-DHFR-SV4 Opa (HZ24), por conseguinte, resulta numa espécie de ARNm única guiada pelo promotor de CMV que codifica os aminoácidos 1-482 de PH20 humana (apresentada na SEQ ID NO:3) e os aminoácidos 1-186 de di-hidrofolato-redutase de ratinho (apresentada na SEQ ID NO:53), separada pelo local interno de entrada do ribossoma (IRES). Células CHO DG44 não transfectadas cultivadas em meio CD-CHO modificado GIBCO para células DHFR(-), suplementado com glutamina 4 mM e 18 ml/L Plurionic F68/L (Gibco), foram semeadas com 0,5 x 106 células/ml num balão de shaker em preparação para transfecção. Cultivaram-se as células a 37° C em 5% de CO2 numa incubadora humidificada, agitando a 120 rpm. As células CHO DG44 não transfectadas crescendo exponencialmente foram testadas quanto à viabilidade antes da transfecção.

Sessenta milhões de células viáveis da cultura de células CHO DG44 não transf ectadas foram sedimentadas e de novo suspendidas até uma densidade de 2 χ 107 células em 0,7 mL de tampão de transfecção 2x (HeBS 2x: HEPES 40 mM, pH 7,0, NaCl 274 mM, KC1 10 mM, Na2HP04 1,4 mM, dextrose 12 mM) . A cada aliquota de células ressuspendidas, adicionaram-se 0,09 mL (250 pg) do plasmideo HZ24 linear (linearizado por digestão de um dia para o outro com Ciai (New England Biolabs) , e as soluções de células/ADN foram transferidas para cuvettes electroporação BTX (Centronics) com abertura de 0,4 cm à temperatura ambiente. Foi realizada uma electroporação de controlo negativo sem qualquer ADN de plasmideo misturado com as células. As misturas de célula/plasmídeo foram submetidas a electroporação com uma descarga de capacitor de 330 V e 960 pF ou a 350 V e 960 pF.

Removeram-se as células das cuvetes após electroporação e transferiram-se para 5 mL de meio CD-CHO modificado para células DHFR(-), suplementado com glutamina 4 mM e 18 ml/L de Plurionic F68/L (Gibco), e deixaram-se desenvolver num poço de uma placa de cultura de tecido de 6 poços sem selecção durante 2 dias a 37°C em 5% de CO2 numa incubadora humidificada.

Dois dias pós-electroporação, removeram-se 0,5 mL de meio de cultura de tecido de cada poço e testaram-se quanto à presença de actividade de hialuronidase, utilizando o ensaio de microturbidimetria descrito no Exemplo 5. Os resultados são apresentados na Tabela 20.

As células a partir da Transfecção 2 (350 V) foram colhidas a partir do poço de cultura de tecido, contadas e diluídas de 1 χ 104 a 2 χ 104 células viáveis por mL. Uma aliquota de 0,1 mL da suspensão de células foi transferida para cada poço de cinco placas de cultura de tecido de fundo redondo de 96 poços. Adicionaram-se 100 microlitros de meio CD-CHO (GIBCO), contendo suplemento GlutaMAX™-l 4 mM (GIBCO™, Invitrogen Corporation) e sem suplementos de hipoxantina e timidina, aos poços contendo células (volume final 0,2 mL). A partir das 5 placas identificaram-se dez clones cultivados sem metotrexato (Tabela 21).

Seis clones de HZ24 foram expandidos em cultura e transferidos para balões de shaker como suspensões de células individuais. Os clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 e 4D10 foram plaqueados em placas de cultura de tecido de fundo redondo de 96 poços utilizando uma estratégia de diluição infinita bidimensional na qual as células foram diluídas 1:2 ao longo da placa, e 1:3 transversalmente à placa, começando com 5000 células no poço de cima esquerdo. Cultivaram-se os clones diluídos num fundo de 500 células CHO DG44 não transfectadas por poço, para proporcionar factores de crescimento necessários para os dias iniciais em cultura. Prepararam-se dez placas por subclone, com 5 placas contendo metotrexato 50 nM e 5 placas sem metotrexato. 0 clone 3D3 produziu 24 subclones visuais, 13 a partir do tratamento sem metotrexato e 11 a partir do tratamento com metotrexato 50 nM. Mediu-se uma actividade significativa de hialuronidase nos sobrenadantes a partir de 8 dos 24 subclones (>50 Unidades/mL), e expandiram-se estes 8 subclones em balões de cultura de tecidos T-25. Clones isolados a partir do protocolo de tratamento de metotrexato foram expandidos na presença de metotrexato 50 nM. O clone 3D35M foi adicionalmente expandido em metotrexato 500 nM dando origem a clones produzindo um excesso de 1000 Unidades/ml em balões de shaker (clone 3D35M; ou Genl 3D35M). Preparou-se depois um banco de células mestre (BCM) das células 3D35M.

Exemplo 3.

Determinação da actividade de hialuronidase de rHuPH20 solúvel A actividade de hialuronidase de rHuPH20 solúvel em amostras tais como culturas de células, fracções de purificação e soluções purificadas foi determinada utilizando um ensaio turbidométrico, que é baseado na formação de um precipitado insolúvel quando ácido hialurónico se liga a albumina de soro. A actividade é medida por incubação de rHuPH20 solúvel com hialuronato de sódio (ácido hialurónico) durante um período de tempo determinado (10 minutos) e depois precipitação do hialuronato de sódio não digerido com a adição de albumina de soro acidificada. A turvação da amostra resultante é medida a 640 nm após um período de desenvolvimento de 30 minutos. A diminuição em turvação resultante da actividade enzimática sobre o substrato de hialuronato de sódio é uma medida da actividade de hialuronidase rHuPH20 solúvel. O método é realizado utilizando uma curva de calibração gerada com diluições de um padrão de referência de trabalho de ensaio de rHuPH20 solúvel, e as medições de actividade da amostra são efectuadas em relação a esta curva de calibração.

Prepararam-se diluições da amostra em Solução Diluente de Enzima. A Solução Diluente de Enzima foi preparada por diluição de 33,0 ± 0,05 mg de gelatina hidrolisada em 25,0 mL do tampão de Reacção de PIPES 50 mM (NaCl 140 mM, PIPES 50 mM, pH 5,5) e 25,0 mL de SWFI, e diluição de 0,2 mL de solução de Buminato a 25% na mistura e agitação num vórtice durante 30 segundos.

Isto foi realizado no prazo de 2 horas antes do uso e armazenado em gelo até ser necessário. Diluíram-se as amostras até um valor estimado de 1-2 U/mL. Geralmente, a diluição máxima por passo não excedeu 1:100 e o tamanho de amostra inicial para a primeira diluição não foi menos de 20 pL. os volumes mínimos de amostra necessários para realizar o ensaio foram: Fracções FPLC de Amostras em Processamento: 80 pL; Sobrenadantes de Cultura de Tecido: 1 mL; Material Concentrado 80 pL; Material Purificado ou do Passo Final: 80 pL. As diluições foram efectuadas em triplicado numa placa de 96 poços de Baixa Ligação de Proteína, e 30 pL de cada diluição foram transferidos para placas de fundo negro/claro Optilux (BD BioSciences).

Preparam-se diluições de rHuPH20 solúvel conhecida com uma concentração de 2,5 U/mL em Solução Diluente de Enzima para gerar uma curva de calibração e adicionaram-se à placa Optilux em triplicado. As diluições incluíram 0 U/mL, 0,25 U/mL, 0,5 U/mL, 1,0 U/mL, 1,5 U/mL, 2,0 U/mL e 2,5 U/mL. Poços de "Reagente em branco" que continham 60 pL de Solução Diluente de Enzima foram incluídas na placa como um controlo negativo. Cobriu-se depois a placa e aqueceu-se sobre um bloco de aquecimento durante 5 minutos a 37°C. Removeu-se a cobertura e agitou-se a placa durante 10 segundos. Após agitação, retornou-se a placa ao bloco de aquecimento e iniciou-se o Dispositivo de Manuseamento de Líquido MULTIDROP 384 com a solução de hialuronato de sódio 0,25 mg/mL quente (preparada por dissolução de 100 mg de hialuronato de sódio (LifeCore Biomedical) e 20,0 mL de SWFI. Isto foi misturado rodando e/ou sacudindo suavemente a 2-8°C durante 2-4 horas, ou até estar completamente dissolvido). Transferiu-se a placa reaccional para o MULTIDROP 384 e iniciou-se a reacção pressionando o botão de início para dispensar 30 pL de hialuronato de sódio em cada poço. Removeu-se depois a placa do MULTIDROP 384 e agitou-se durante 10 segundos antes de ser transferida para um bloco de aquecimento com a cobertura de placa substituída. A placa foi incubada a 37°C durante 10 minutos.

Preparou-se o MULTIDROP 384 para parar a reacção por purga da máquina com Solução de Trabalho de Soro e alteração da regulação de volume para 240 pL. (25 mL de Solução de Reserva de Soro [1 volume de Soro de Cavalo (Sigma) foi diluído com 9 volumes de Solução Tampão de Acetato 500 mM e o pH foi ajustado a 3,1 com ácido clorídrico] em 75 mL de Solução Tampão de Acetato500 mM). Retirou-se a placa do bloco de aquecimento e colocou-se em cima do MULTIDROP 384 e dispensaram-se nos poços 240 pL de Solução de Trabalho de Soro. Removeu-se a placa e agitou-se num leitor de placas durante 10 segundos. Após mais 15 minutos, mediu-se a turvação das amostras a 640 nm e determinou-se a actividade de hialuronidase (em U/mL) de cada amostra por ajustamento à curva de calibração. A actividade específica (Unidades/mg) foi calculada dividindo a actividade de hialuronidase (U/ml) pela concentração de proteína (mg/mL).

Exemplo 4.

Produção e purificação de sPH20 humana Genl

A. Processo em biorreactor de 5 L

Descongelou-se um frasco de injectáveis de 3D35M e expandiu-se a partir de balões de shaker através de balões rotativos de 1 L em meio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad Calif.) suplementado com metotrexato 100 nM e GlutaMAX™-l (Invitrogen). Transferiram-se as células dos balões rotativos balões rotativos para um biorreactor de 5 L (Braun) para uma densidade de inoculação de 4 χ 105 células viáveis por ml. Os parâmetros foram um ponto de regulação de temperatura de 37°C, pH 7,2 (ponto de regulação de partida), com um ponto de regulação de oxigénio dissolvido de 25% e uma cobertura de ar 0-100 cc/min. Às 168 h, adicionaram-se 250 ml de Meio de Alimentação #1 (CD-CHO com 50 g/L de glicose). Às 216 horas, adicionaram-se 250 ml de Meio de Alimentação #2 (CD-CHO com 50 g/L de glucose e butirato de sódio 10 mM) , e às 264 horas adicionaram-se 250 ml de Meio de Alimentação #2. Este processo resultou numa produtividade final de 1600 Unidades por ml com uma densidade de celular máxima de 6 χ 106 células/ml. A adição de butirato de sódio foi para aumentar acentuadamente a produção de rHuPH20 solúvel nas etapas finais de produção.

Meio condicionado a partir do clone 3D35M foi clarificado por filtração profunda e diafiltração de fluxo tangencial em HEPES 10 mM pH 7,0. Purificou-se depois rHuPH20 solúvel por cromatografia sequencial Q Sepharose de permuta iónica (Pharmacia) , cromatografia de interacção hidrofóbica em fenil-Sepharose (Pharmacia), cromatografia de boronato de fenilo (Prometics) e hidroxiapatite (Biorad, Richmond, CA).

Ligou-se rHuPH20 solúvel a Q Sepharose e eluiu-se em NaCl 400 mM no mesmo tampão. Diluiu-se o eluato com sulfato de amónio 2 M até uma concentração final de sulfato de amónio 500 mM e fez-se passar através de uma coluna de fenil-Sepharose (baixa sub), seguindo-se ligação sob as mesmas condições a uma resina de boronato de fenilo. A rHuPH20 solúvel foi eluida a partir da resina de fenil-Sepharose em HEPES pH 6,9 após lavagem a pH 9,0 em bicina 50 mM sem sulfato de amónio. Carregou-se o eluato sobre uma resina de hidroxiapatite cerâmica a pH 6, 9 em fosfato de potássio 5 mM e CaCl2 1 mM e eluiu-se com fosfato de potássio 80 mM, pH 7,4 com CaCl2 0,1 mM. A rHuPH20 solúvel purificada resultante possuía uma actividade específica em excesso de 65000 Unidades USP/mg proteína através de um ensaio de microturbidimetria (Exemplo 3) utilizando o padrão de referência USP. A sPH20 purificada foi eluida como um único pico de 24 a 26 minutos a partir de uma coluna de estireno-divinilbenzeno 5RPC Pharmacia com um gradiente entre 0,1% de TFA/H2O e 0,1% de TFA/90% de acetonitrilo/10% de H2O e resolvida como uma única banda larda de 61 kDa por electroforese em SDS que foi reduzida para uma banda acentuada de 51 kDa após tratamento com PNGASE-F. A sequenciação de aminoácidos N-terminal revelou que o péptido líder tinha sido removido eficientemente.

B. Processo de expansão de cultura de células a montante para uma cultura de células em biorreactor de 100 L

Utilizou-se um processo de ampliação para separadamente purificar rHuPH20 solúvel a partir de quatro frascos de injectáveis diferentes de células 3D35M para produzir 4 lotes separados de sHuPH20; HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C e HUA0420C. Cada frasco de injectáveis foi expandido separadamente e cultivado passando por um biorreactor de 125 L, e depois purificou-se utilizando cromatografia de coluna. Colheram-se amostras ao longo do processo para avaliar parâmetros tais como o rendimento em enzima. A descrição do processo proporcionada abaixo apresenta especificações representativas para coisas tais como volumes de meio de partida e de alimentação do biorreactor, densidades de células de transferência, e volumes de lavagem e eluição. Os números exactos variam ligeiramente com cada lote, e estão detalhados nas Tabelas 24 a 30.

Descongelaram-se quatro frascos de injectáveis de células 3D35M num banho de água a 372C, adicionou-se CD CHO contendo metotrexato de 100 nM e GlutaMAX 40 mL/L e centrifugaram-se as células. Ressuspenderam-se as células num balão de shaker de 125 mL com 20 mL de meio fresco e colocaram-se numa incubadora a 37°C, 7% de CO2. Expandiram-se as células até 40 mL no balão de shaker de 125 mL. Quando a densidade de células atingiu 1,5 - 2,5 x 106 células/mL, expandiu-se a cultura para um balão rotativo de 125 mL num volume de cultura de 100 mL. Incubou-se o balão a 37°C, 7% CO2. Quando a densidade de células atingiu 1.5 - 2.5 x 105 células/mL, expandiu-se a cultura para um balão rotativo de 250 mL num volume de cultura de 200 mL, e incubou-se o balão a 37°C, 7% de CO2. Quando a densidade de células atingiu 1,5 - 2,5 x 106 células/mL, expandiu-se a cultura para um balão rotativo de 1 L num volume de cultura de 800 mL e incubou-se a 37 °C, 7% de CO2. Quando a densidade de células atingiu 1,5 - 2,5 x 106 células/mL, expandiu-se a cultura para um balão rotativo de 6 L num volume de cultura de 5 L e incubou-se a 372C, 7% de CO2. Quando a densidade de células atingiu 1.5 - 2,5 x 106 células/mL, expandiu-se a cultura para um balão rotativo de 36 L num volume de cultura de 20 L e incubou-se a 37 2C, 7% de C02.

Esterilizou-se um reactor de 125 L com vapor a 121°C, 20 PSI e adicionou-se 65 L de meio CD CHO. Antes da utilização, verificou-se o reactor quanto a contaminação. Quando a densidade de células no balão rotativo de 36 L atingiu 1,8 - 2.5 x 106 células/mL, transferiram-se 20 L de cultura de células do balão rotativo de 36 L para o biorreactor de 125 L (Braun), resultando num volume final de 85 L e numa densidade de sementeira de aproximadamente 4 χ 105 células/mL. Os parâmetros foram Ponto de regulação de temperatura, 37°C; pH: 7,2; Oxigénio dissolvido: 25% ± 10%; Velocidade do rotor 50 rpm; Pressão do vaso 3 psi; Aspersão de ar: 1 L/ min; Sobreposição de ar: 1 L/min. Colheram-se diariamente amostras do reactor para contagens de células, verificação de pH, análise de meio, produção de proteína e retenção. Adicionaram-se alimentações de nutrientes durante a operação. Ao Dia 6, adicionaram-se 3,4 L de Meio de Alimentação #1 (CD CHO + 50 g/L de glicose + 40 mL/L de GlutaMAX™-l) , e alterou-se a temperatura da cultura para 36,5°C. Ao Dia 9, adicionaram-se 3,5 L de Alimentação #2 (CD CHO + 50 g/L de glicose + 40 mL/L de GlutaMAX™-l + 1,1 g/L de butirato de sódio), e alterou-se a temperatura da cultura para 36°C. Ao Dia 11, adicionaram-se 3,7 L de Alimentação #3 (CD CHO + 50 g/L de glicose + 40 mL/L GlutaMAX™-l + 1,1 g/L de butirato de sódio), e alterou-se a temperatura da cultura para 35,5°C. Colheu-se o reactor aos 14 dias ou quando a viabilidade das células caiu para menos de 50%. O processo resultou na produção de rHuPH20 solúvel com uma actividade enzimática de 1600 Unidades/ml com uma densidade de células máxima de 8 milhões de células/mL. Na colheira, colheram-se amostras da cultura para determinação de micoplasma, carga biológica, endotoxina, e vírus in vitro e in vivo, microscopia electrónica de transmissão (TEM) para partículas virais, e actividade enzimática. A colheita da cultura de células do biorreactor de cem litros foi filtrada através de uma série de filtros de cápsula descartáveis possuindo um meio de poliétersulfona (Sartorius): primeiro através de uma cápsula de fundo de 8,0 pm, uma cápsula de fundo de 0,65 pm, uma cápsula de fundo de 0,22 pm, e finalmente através de um filtro de 2000 cm2 Sartopore de 0,22 pm e para um saco de armazenamento estéril de 100 L. Concentrou-se a cultura 10* utilizando dois TFF com filtros MWCO de 30 kDa de poliétersulf ona de espiral (Millipore) , seguindo-se uma troca de tampão 6x com HEPES 10 mM, Na2S04 25 mM, pH 7,0 para um filtro final de 0,22 pm para um saco de armazenamento estéril de 20 L. A Tabela 22 proporciona dados de monitorização relacionados com os passos de cultura de células, colheita, concentração e troca de tampão.

Preparou-se uma coluna de permuta iónica de Q Sepharose (Pharmacia) (3 L de resina, altura = 20 cm, diâmetro = 14 cm) . Colheram-se amostras de lavagem para uma determinação de pH, condutividade e ensaio de endotoxina (LAL). Equilibrou-se a coluna com 5 volumes de coluna de Tris 10 mM, Na2SC>4 20 mM, pH 7,5. A colheita diafiltrada, concentrada, foi carregada na coluna Q com um caudal de 100 cm/h. Lavou-se a coluna com 5 volumes de coluna de Tris 10 mM, Na2SC>4 20 mM, pH 7,5 e HEPES 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. Eluiu-se a proteína com HEPES 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0 e filtrou-se através de um filtro final de 0,22 pm para um saco esterilizado.

Realizou-se a seguir uma cromatografia de interacção hidrofóbica em fenil-Sepharose (Pharmacia). Preparou-se uma coluna de fenil-Sepharose (PS) (9,1 L de resina, Altura = 29 cm, Diâmetro = 20 cm). Eguilibrou-se a coluna com 5 volumes de coluna de fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5 M, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0. O eluato de proteína do passo anterior foi suplementado com soluções de reserva de sulfato de amónio 2 M, fosfato de potássio 1 M e CaCl2 1 M até concentrações finais de 5 mM, 0,5 M e 0,1 mM, respectivamente. Carregou-se a proteína na coluna de PS com um caudal de 100 cm/h. Adicionaram-se fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5 M e CaCl2 0,1 mM pH 7,0 a 100 cm/h. Fez-se passar o fluxo através de um filtro final de 0,22 pm para um saco esterilizado.

Carregou-se a proteína purificada por PS numa coluna de boronato de aminofenilo (ProMedics) (6,3 L de resina, Altura = 20 cm, Diâmetro = 20 cm) gue tinha sido eguilibrada com 5 volumes de coluna de fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5 M. Fez-se passar a proteína através da coluna com um caudal de 100 cm/h, e lavou-se a coluna com fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5 M, pH 7,0. Lavou-se depois a coluna com bicina 20 mM, NaCl 100 mM, pH 9,0 e eluiu-se a proteína com HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,9, através de um filtro estéril e para um saco estéril de 20 L. Testou-se o eluato guanto a carga biológica, concentração de proteína e actividade enzimática.

Uma coluna de hidroxiapat ite (HAP) (BioRad) (1,6 L de resina, Altura = 10 cm, Diâmetro = 14 cm) foi eguilibrada com fosfato de potássio 5 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0. Colheram-se amostras de lavagem e testaram-se guanto a pH, condutividade e ensaio de endotoxina (LAL). A proteína purificada na coluna de boronato de aminofenilo foi suplementada com fosfato de potássio e CaCl2 para dar concentrações finais de fosfato de potássio 5 mM e CaCl2 0,1 mM e carregou-se na coluna de HAP com um caudal de 100 cm/h. Lavou-se a coluna com fosfato de potássio 5 mM pH 7,0, NaCl 100 mM, CaCÍ2 0,1 mM, depois fosfato de potássio 10 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM pH. Eluiu-se a proteína com 70 mM fosfato de potássio pH 7,0 e filtrou-se através de um filtro de 0,22 ym para um saco de armazenamento estéril 5 L. Testou-se o eluato quanto a carga biológica, concentração de proteína e actividade enzimática. A proteína purificada por HAP foi depois bombeada através de um filtro de remoção virai de 20 nM através de um tanque de pressão. Adicionou-se a proteína ao tanque de pressão DV20 e filtro (Pali Corporation), fazendo-a passar através de um filtro Ultipor DV20 com poros de 20 nm (Pali Corporation) para um saco de armazenamento estéril de 20 L. Testou-se o filtrado quanto a concentração de proteína, actividade enzimática, perfil de oligossacárido, monossacárido e ácido siálico, e impurezas relacionadas com o processo. A proteína no filtrado foi depois concentrada até 1 mg/mL utilizando um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) Sartocon Slice com um corte de peso molecular (MWCO) de 10 kD (Sartorius) . Preparou-se primeiro o filtro por lavagem com solução de HEPES/solução salina (HEPES 10 mM, NaCl 130 mM, pH 7,0) e colheram-se amostras do permeato para determinação de pH e condutividade. Após concentração, colheram-se amostras da proteína concentrada e testaram-se quanto a concentração de proteína e actividade enzimática. Uma troca de tampão 6* foi realizada na proteína concentrada para o tampão final: HEPES 10 mM, NaCl 130 mM, pH 7,0. Fez-se passar a proteína concentrada através de um filtro de 0,22 ym para um saco de armazenamento estéril de 20 L. Colheram-se amostras da proteína e testaram-se quanto a concentração de proteína, actividade enzimática, grupos sulfidrilo livres, perfil de oligossacárido e osmolaridade.

As Tabelas 23 a 29 proporcionam dados de monitorização relacionados com cada um dos passos de purificação descritos acima, para cada lote de células 3D35M.

A proteína rHuPH20 solúvel purificada e concentrada foi utilizada para encher assepticamente frascos para injectáveis estéreis com volumes de enchimento de 5 mL e 1 mL. Fez-se passar a proteína através de um filtro de 0,22 pm para uma bomba controlada pelo operador que foi utilizada para encher os frascos para injectáveis utilizando uma leitura gravimétrica. Fecharam-se os frascos para injectáveis com rolhas e fixaram-se com cápsulas cravadas. Inspeccionaram-se visualmente os frascos para injectáveis fechados quando a partículas estranhas e depois rotularam-se. Após rotulagem, congelaram-se instantaneamente os frascos para injectáveis submersão em azoto líquido durante não mais do que 1 minuto e armazenaram-se a <-15°C (-20 ± 5°C).

Exemplo 5.

Produção de células Gen2 contendo PH20 humana (rHuPH20) solúvel

A linha de células 3D35M Genl descrito no Exemplo 2 foi adaptada a níveis de metotrexato mais elevados para produzir clones de geração 2 (Gen2). Semearam-se as células 3D35M a partir de culturas estabelecidas contendo metotrexato em meio CD CHO contendo GlutaMAX-1™ 4 mM e metotrexato 1,0 μΜ. As células foram adaptadas a um nível de metotrexato mais elevado por cultura e passagem das mesmas 9 vezes durante um período de 46 dias numa incubadora humidificada a 37°C, 7% de CO2. A população de células amplificada foi clonada por diluição limitante em placas de cultura de tecidos de 96 poços contendo meio com metotrexato 2,0 μΜ. Após aproximadamente 4 semanas, identificaram-se os clones e seleccionou-se o clone 3E10B para expansão. Cultivaram-se as células 3E10B em meio CD CHO contendo GlutaMAX-1™ 4 mM e metotrexato 2,0 μΜ por 20 passagens. Criou-se um banco de células mestre (BCM) da linha de células 3E10B e congelou-se e utilizou-se para estudos subsequentes. A amplificação da linha de células continuou por cultura das células 3E10B em meio CD CHO contendo GlutaMAX-1™ 4 mM e metotrexato 4,0 μΜ. Após a 12-a passagem, congelaram-se as células em frascos para injectáveis como um banco de células de pesquisa (RCB). Descongelou-se um frasco de injectáveis do RCB e cultivou-se em meio contendo metotrexato 8,0 μΜ. Após 5 dias, aumentou-se a concentração de metotrexato no meio para 16,0 μΜ, e depois para 20,0 μΜ 18 dias mais tarde. As células da 8.a passagem em meio contendo metotrexato 20,0 μΜ foram clonadas por diluição limitante em placas de cultura de tecidos de 96 poços contendo meio CD CHO contendo GlutaMAX-1™ 4 mM e metotrexato 20,0 μΜ. Identificaram-se os clones 5-6 semanas mais tarde e seleccionou-se o clone 2B2 para expansão em meio contendo metotrexato 20,0 μΜ. Após a 11. a passagem, congelaram-se as células 2B2 em frascos para injectáveis como um banco de células de pesquisa (RCB).

As células 2B2 resultantes são células CHO DG44 deficientes em di-hidrofolato-redutase (dhfr-) que exprimem PH20 humana recombinante (rHuPH20) solúvel. A PH20 solúvel está presente em células 2B2 num número de cópias de aproximadamente 206 cópias/célula. A análise Southern blot de ADN genómico de células 2B2 digerido com Spe I, Xba I e BamH I/Hind III, utilizando uma sonda especifica de rHuPH20, revelou o perfil de digerido de restrição seguinte: uma banda de

hibridização principal de ~7,7 kb e quatro bandas de hibridização menores (-13,9, -6,6, -5,7 e -4,6 kb) com ADN digerido com Spe I; uma banda de hibridização principal de -5,0 kb e duas bandas de hibridização menores (~13,9 e 6,5 kb) com ADN digerido com Xba I; e uma banda de hibridização única de 1,4 kb observada utilizando ADN de 2B2 digerido com BamH I/Hind III. A análise de sequência do transcrito de ARNm indicou que o ADNc derivado (SEQ ID NO: 56) era idêntico à sequência de referência (SEQ ID NO:49) excepto para um par de bases de diferença na posição 1131, que se observou ser uma timidina (T) em vez da citosina (C) esperada. Esta é uma mutação silenciosas, sem qualquer efeito na sequência de aminoácidos.

Exemplo 6.

A. Produção de rHuPH20 solúvel Gen2 em cultura de células em biorreactor de 300 L

Descongelou-se um frasco de injectáveis de HZ24-2B2 e expandiu-se a partir de balões de shaker através de balões rotativos 36 L em meios CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementados com metotrexato 20 μΜ e GlutaMAX-1™ (Invitrogen). Resumidamente, descongelou-se o frasco de injectáveis de células num banho de água a 372C, adicionou-se meio e centrifugaram-se as células. Ressuspenderam-se as células num balão de shaker de 125 mL com 20 mL de meio fresco e colocaram-se numa incubadora a 37°C, 7% de CO2. Expandiram- se as células até 40 mL no balão de shaker de 125 mL. Quando a densidade de células atingiu mais de 1,5 x 106 células/mL, expandiu-se a cultura para um balão rotativo de 125 mL num volume de cultura de 100 mL. Incubou-se o balão a 37°C, 7% de CO2. Quando a densidade de células atingiu mais de 1,5 x 106 células/mL, expandiu-se a cultura para um balão rotativo de 250 mL num volume de cultura de 200 mL, e incubou-se o balão a 37°C, 7% de CO2. Quando a densidade de células atingiu mais de 1,5 x 106 células/mL, expandiu-se a cultura para um balão rotativo de 1 L num volume de cultura de 800 mL e incubou-se a 372C, 7% de CO2. Quando a densidade de células atingiu mais de 1,5 x 106 células/mL expandiu-se a cultura para um balão rotativo de 6 L num volume de cultura de 5000 mL e incubou-se a 372C, 7% de CO2. Quando a densidade de células atingiu mais de 1,5 x 106 células/mL expandiu-se a cultura para um balão rotativo de 36 L num volume de cultura de 32 L e incubou-se a 37 2C, 7% de C02.

Esterilizou-se um reactor de 400 L e adicionaram-se 230 mL de meio CD-CHO. Antes da utilização, verificou-se o reactor quanto a contaminação. Transferiram-se aproximadamente 30 L de células a partir dos balões rotativos de 36 L para o biorreactor de 400 L (Braun) para uma densidade de inoculação de 4,0 x 105 células viáveis por ml e um volume total de 260 L. Os parâmetros foram Ponto de regulação de temperatura, 37 °C; Velocidade do rotor 40-55 RPM; Pressão do vaso: 3 psi; Aspersão de ar: 0,5-1,5 L/min.; Sobreposição de ar: 3 L/min. Colheram-se diariamente amostras do reactor para contagens de células, verificação de pH, análise de meio, produção de proteína e retenção. Também, durante a operação adicionaram-se alimentações de nutrientes. Às 120 h (dia 5), adicionaram-se 10,4 L de Meio de Alimentação #1 (4x CD-CHO + 33 g/L de glucose + 160 mL/L Glutamax-1™ + 83 mL/L de Yeastolate + 33 mg/L de rHuInsulina). Às 168 horas (dia 7), adicionaram-se 10,8 L de Alimentação #2 (2x CD-CHO + 33 g/L d glicose + 80 mL/L de Glutamax-1™ + 167 mL/L de Yeastolate + 0,92 g/L de butirato de sódio), e alterou-se a temperatura da cultura para 36,5°C. Às 216 horas (dia 9), adicionaram-se 10,8 L de Alimentação #3 (1 x CD-CHO + 50 g/L de glicose + 50 mL/L de Glutamax-1™ + 250 mL/L de Yeastolate + 1,80 g/L de butirato de sódio), e alterou-se a temperatura da cultura para 36° C. Às 264 horas (dia 11), adicionaram-se 10,8 L de Alimentação #4 (lx CD-CHO + 33 g/L de glucose + 33 mL/L de Glutamax-1™ + 250 mL/L de Yeastolate + 0,92 g/L de butirato de sódio), e alterou-se a temperatura da cultura para 35,5°C. Observou-se que a adição dos meios de alimentação melhora acentuadamente a produção solúvel rHuPH20 solúvel nas etapas finais de produção. Colheu-se o reactor aos 14 ou 15 dias ou quando a viabilidade das células caiu para menos de 40%. O processo resultou numa produtividade final de 17000 Unidades por ml com uma densidade de células máxima de 12 milhões de células/mL. Na colheita, colheram-se amostras da para determinação de micoplasma, carga biológica, endotoxina, e vírus in vitro e in vivo, microscopia electrónica de transmissão (TEM) e actividade enzimática.

Bombeou-se a cultura por uma bomba peristáltica através de quatro módulos de sistema de filtração Millistak (Millipore) em paralelo, cada um contendo uma camada de terra de diatomáceas de grau 4-8 pm e uma camada de terra de diatomáceas de grau 1,4-1,1 pm, seguida por uma membrana de celulose, depois através de um segundo sistema de filtração individual Millistak (Millipore) contendo uma camada de terra de diatomáceas de grau 0,4-0,11 pm e uma camada de terra de diatomáceas de grau <0,1 pm, seguida por uma membrana de celulose, de depois através de um filtro final de 0,22 pm para um saco flexível esterilizado de utilização única com uma capacidade de 350 L. O fluido de cultura de células colhido foi suplementado com EDTA 10 mM e Tris 10 mM até um pH de 7,5. Concentrou-se a cultura 10x com um equipamento de filtração de fluxo tangencial (TFF) utilizando quatro filtros de poliétersulfona (PES) de corte de peso molecular (MWCO) de 30 kDa Sartoslice TFF (Sartorious), seguindo-se uma troca de tampão 10* com Tris 10 mM, Na2SC>4 20mM, pH 7,5 para um filtro final de 0,22 pm para um saco de armazenamento estéril de 50 L. A colheita diafiltrada, concentrada, foi inactivada em relação a vírus. Antes da inactivação virai, preparou-se uma solução de 10% de Triton X-100, 3% de tri(n-butil)fosfato (TNBP). A colheita diafiltrada, concentrada, foi exposta a 1% de Triton X-100, 0,3% de TNBP durante 1 hora num vaso reaccional de vidro de 36 L imediatamente antes da purificação na coluna Q. B. Purificação de rHuPH20 solúvel de Gen2

Preparou-se uma coluna de permuta iónica Q Sepharose (Pharmacia) (9 L resina, H = 29 cm, D = 20 cm) . Colheram-se amostras de lavagem para uma determinação de pH, condutividade e ensaio de endotoxina (LAL). Equilibrou-se coluna com 5 volumes de coluna de Tris 10 mM, Na2SC>4 20 mM, pH 7,5. Após inactivação virai, a colheita diafiltrada concentrada foi carregada na Q coluna com um caudal de 100 cm/h. Lavou-se a coluna com 5 volumes de coluna de Tris 10 mM, Na2SC>4 20 mM, pH 7,5 e HEPES 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. Eluiu-se a proteína com HEPES 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0 para um filtro final de 0,22 ym para um saco esterilizado. Testou-se uma amostra do eluato para carga biológica, concentração de proteína e actividade de hialuronidase. Efectuou-se uma leitura da absorvância A280 no início e no final da permuta. A seguir realizou-se cromatografia de interacção hidrofóbica em fenil-Sepharose (Pharmacia). Preparou-se uma coluna de fenil-Sepharose (PS) (19-21 L de resina, H = 29 cm, D = 30 cm). Recolheu-se a lavagem e colheram-se amostras para determinação de pH, condutividade e endotoxina (ensaio LAL) . Equilibrou-se coluna com 5 volumes de coluna de fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5 M, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0. O eluato de proteína a partir da coluna Q Sepharose foi suplementado com soluções de reserva de sulfato de amónio 2 M, fosfato de potássio 1 M e CaCl2 1 M para dar concentrações finais de 5 mM, 0,5 M e 0,1 mM, respectivamente. Carregou-se a proteína na coluna de PS com um caudal de 100 cm/h e recolheu-se o fluxo atravessante da coluna. Lavou-se a coluna com fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5 M e CaCl2 0,1 mM pH 7,0 a 100 cm/h e adicionou-se a lavagem ao fluxo atravessante recolhido. Combinado com a lavagem da coluna, fez-se passar o fluxo atravessante através de um filtro final de 0,22 ym para um saco esterilizado. Colheram-se amostras do fluxo atravessante para determinar carga biológica, concentração de proteína e actividade enzimática.

Preparou-se uma coluna de boronato de aminofenilo (Prometics). Recolheu-se a lavagem e colheram-se amostras para determinação de pH, condutividade e endotoxina (ensaio LAL) . Equilibrou-se coluna com 5 volumes de coluna de fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5 Μ. O fluxo atravessante de PS contendo proteína purificada foi carregado na coluna de boronato de aminofenilo com um caudal de 100 cm/h. Lavou-se a coluna com fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5 M, pH 7,0. Lavou-se a coluna com bicina 20 mM, sulfato de amónio 0,5 M, pH 9,0. Lavou-se a coluna com bicina 20 mM, cloreto de sódio 100 mM, pH 9,0. Eluiu-se a proteína com HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,9 e fez-se passar através de um filtro estéril para um saco esterilizado. Testou-se a amostra eluida para carga biológica, concentração de proteína e actividade enzimática.

Preparou-se a coluna de hidroxiapatite (HAP) (Biorad). Recolheu-se a lavagem e testou-se para determinação de pH, condutividade e endotoxina (ensaio LAL). Equilibrou-se coluna com fosfato de potássio 5 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0. A proteína purificada de boronato de aminofenilo foi suplementada até concentrações finais de fosfato de potássio 5 mM e CaCl2 0,1 mM e carregou-se na coluna HAP com um caudal de 100 cm/h. Lavou-se a coluna com fosfato de potássio 5 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM. A seguir lavou-se a coluna com fosfato de potássio 10 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM. Eluiu-se a proteína com fosfato de potássio 70 mM, pH 7,0 e fez-se passar através de um filtro estéril de 0,22 pm para um saco esterilizado. Testou-se a amostra eluida para carga biológica, concentração de proteína e actividade enzimática.

Fez-se depois passar a proteína purificada de HAP através de um filtro de remoção virai. Primeiro, preparou-se o filtro Virosart (Sartorius) esterilizado por lavagem com 2 L de fosfato de potássio 70 mM, pH 7,0. Antes do uso, colheram-se amostras do tampão filtrado para determinação de pH e condutividade. Bombeou-se a proteína purificada de HAP por meio de uma bomba peristáltica através do filtro de remoção virai de 20 nm. Fez-se passar a proteína filtrada em fosfato de potássio 70 mM, pH 7,0 através de um filtro final de 0,22 pm para um saco esterilizado. Testou-se a amostra filtrada para remoção virai para concentração de proteína, actividade enzimática, oligossacárido, monossacárido e perfil de ácido siálico. A amostra foi também testada para impurezas relacionadas com o processo. A proteína no filtrado foi depois concentrada até 10 mg/mL utilizando um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) com um corte de peso molecular (MWCO) 10 kD Sartocon Slice (Sartorius). Preparou-se primeiro o filtro por lavagem com histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,0 e colheram-se amostras do permeato para determinação de pH e condutividade. Após concentração, colheram-se amostras da proteína concentrada e testaram-se para concentração de proteína e actividade enzimática. Realizou-se uma troca de tampão 6* na proteína concentrada para o tampão final: histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,0. Após troca de tampão, fez-se passar a proteína concentrada através de um filtro de 0,22 pm para um saco de armazenamento estéril de 20 L. Colheram-se amostras da proteína e testaram-se quanto a concentração de proteína, actividade enzimática, grupos sulfidrilo livres, perfil de oligossacárido e osmolaridade. A proteína em massa filtrada estéril foi depois dispensada assepticamente com 20 ml em frascos para injectáveis estéreis de Teflon de 30 mL (Nalgene). Depois congelaram-se instantaneamente os frascos para injectáveis e armazenaram a - 20±50C. C. Comparação da produção e purificação de rHuPH20 solúvel Genl e rHuPH20 solúvel de Gen2 A produção e purificação de rHuPH20 solúvel de Gen2 numa cultura de células em biorreactor de 300 L continha algumas alterações nos protocolos em comparação com a produção e purificação de rHuPH20 solúvel de Genl numa cultura de células em biorreactor de 100 L (descrita no Exemplo 4B). A Tabela 30 apresenta diferenças exemplificativas entre os métodos, para além das simples alterações de escala.

Exemplo 7.

Determinação do teor em ácido siálico e monossacárido 0 teor em ácido siálico e monossacárido de rHuPH20 solúvel pode ser avaliado por cromatografia liquida de fase reversa (RPLC) após hidrólise com ácido trifluoroacético. Num exemplo, determinou-se o teor em ácido siálico e monossacárido de hialuronidase purificada lote # HUB0701E (1,2 mg/mL; produzida e purificada essencialmente como descrito no Exemplo 6). Resumidamente, hidrolisou-se uma amostra de 100 pg com ácido trifluoroacético a 40% (v/v) e 100°C durante 4 horas em duplicado. Após hidrólise, secaram-se as amostras e ressuspenderam-se em 300 pL de água. Transferiu-se uma alíquota de 45 pL a partir de cada amostra ressuspendida para um novo tubo e secou-se, e adicionaram-se a cada um 10 pL de uma solução de acetato de sódio 10 mg/mL. Os monossacáridos libertados foram marcados de modo fluorescente por uma adição de 50 pL de uma solução contendo 30 mg/mL de ácido 2-aminobenzóico, 20 mg/mL de cianoboro-hidreto de sódio, aproximadamente 40 mg/mL de acetato de sódio e 20 mg/mL de ácido bórico em metanol. Incubou-se a mistura durante 30 minutos a 80°C no escuro. Extinguiu-se a mistura reaccional de derivatização pela adição de 440 pL de fase móvel A (0,2% (v/v) de n-butilamina, 0,5% (v/v) de ácido fosfórico, 1% (v/v) de tetra-hidrofurano). Uma matriz de branco de água foi também hidrolisada e derivatizada como descrito para a amostra de hialuronidase como um controlo negativo. Separaram-se os monossacáridos libertados por RPLC utilizando uma coluna de fase reversa de octadecilo (Cis) (4, 6 x 250 mm, tamanho de partícula 5 pm; J.T. Baker) e monitorizou-se por detecção de fluorescência (excitação a 360 nm, emissão a 425 nm) . A quantificação do teor em monossacárido foi efectuada por comparação dos cromatogramas a partir da amostra de hialuronidase com cromatogramas de padrões de monossacárido incluindo iV-D-glucosamina (GlcN) , iV-D-galactosamina (GalN) , galactose, fucose e manose. A Tabela 31 apresenta a razão molar de cada monossacárido por molécula de hialuronidase.

Exemplo 8.

Heterogeneidade C-terminal de rHuPH20 solúvel a partir de células 3D35M e 2B2 A sequenciação C-terminal foi realizada em dois lotes de sHuPH20 produzidos e purificados a partir de células 3D35M num volume de biorreactor de 100 L (Lote HUA0505MA) e de células 2B2 num volume de biorreactor de 300 L (Lote HUB0701EB). Digeriram-se os lotes separadamente com endoproteinase Asp-N, que especificamente cliva as ligações de péptido N-terminalmente no ácido aspártico e cisteico. Isto liberta a porção C-terminal da rHuPH20 solúvel no ácido aspártico na posição 431 a SEQ ID NO:4. Separaram-se os fragmentos C-terminais e caracterizaram-se para determinar a sequência e abundância de população no Lote HUA0505MA e no Lote HUB0701EB.

Observou-se que as preparações de rHuPH20 solúvel a partir de células 3D35M e 2B2 exibiram heterogeneidade, e continham polipéptidos que diferiam uns dos outros na sua sequência C-terminal (Tabelas 27 e 28) . Esta heterogeneidade é provavelmente o resultado de clivagem C-terminal do polipéptido expresso de 447 aminoácido (SEQ ID NO:4) por peptidases presentes no meio de cultura de células ou outras soluções durante o processo de produção e purificação. Os polipéptidos nas preparações de rHuPH20 solúveis têm sequências de aminoácidos correspondentes aos aminoácidos 1-447, 1-446, 1-445, 1-444 e 1-443 da sequência de rHuPH20 solúvel apresentada na SEQ ID NO:4. A sequência de aminoácidos completa de cada um destes polipéptidos é apresentada na SEQ ID NOS: 4 a 8, respectivamente. Como notado nas Tabelas 32 e 33, a abundância de cada polipéptido é diferente nas preparações de rHuPH20 solúvel a partir de células 3D35M e de células 2B2.

Exemplo 9.

Comparação da actividade de dispersão de diferentes enzimas de degradação de hialuronano A capacidade de diferentes enzimas de degradação de hialuronano para actuarem como um agente de dispersão foi avaliada in vivo. Utilizou-se um ensaio de dispersão em ratinhos para avaliar a capacidade de diferentes enzimas de degradação de hialuronano para actuarem como agentes de dispersão de azul de tripano, e também para avaliar a capacidade das enzimas para melhorar a eficácia de insulina co-administrada na redução dos níveis de glicose no sangue. As enzimas de degradação de hialuronano ensaiadas incluíram rHuPH20, PH20 peguilada (PEG PH20), Hyal 1, Condroitinase ABC, Condroitinase AC e liase de Streptomyces hyalurolyticus. Misturaram-se estas com azul de tripano e insulina Humulin® num tampão neutro (fosfato de sódio 10 mM, pH 7,4, NaCl 145,5 mM, 1 mg/ml de albumina de soro humana) e entregaram-se a ratinhos anestesiados. Mediram-se depois tanto a área de dispersão do azul de tripano como os níveis de glicose no sangue. Como controlos negativos usaram-se o tampão de pH neutro sozinho e insulina Humulin® sozinha. Examinou-se também a capacidade de um tampão de pH neutro (pH 4,5) para actuar como um agente de dispersão.

Nove grupos de ratinhos homozigóticos NCr nu/nu, aproximadamente de 10 semanas de idade e com pesos corporais de 21-25 g, com 3 ratinhos por grupo, foram anestesiados por injecção intraperitoneal de cetamina/xilazina (mistura 10:1 em solução salina). Depois, administraram-se aos ratinhos 40 pL de uma enzima de degradação de hialuronano e 5 Unidades/mL de insulina Humulin® com 0,4% de pigmento azul de tripano por injecção intradérmica na linha media sobre a extremidade caudal da caixa torácica. Aos grupos de controlo administraram-se insulina Humulin® sozinha, tampão sozinho ou incluiu-se também tampão e insulina Humulin®. Especificamente, ratinhos do grupo 1 eram o controlo negativo e receberam azul de tripano com um tampão de pH neutro; os ratinhos do grupo 2 receberam azul de tripano com 5 Unidades/mL de insulina Humulin® num tampão de pH baixo; os ratinhos do grupo 3 receberam azul de tripano com 5 Unidades/mL de insulina Humulin® e 10 Unidades/mL de rHuPH20; os ratinhos do grupo 4 receberam azul de tripano com 5 Unidades/mL de insulina Humulin® e 10 Unidades/mL de PEG-PH20 (gerado como descrito no Exemplo 10, abaixo); os ratinhos do grupo 5 receberam azul de tripano com 5 Unidades/mL de insulina Humulin® e 10 Unidades/mL Hyal 1; os ratinhos do grupo 6 receberam azul de tripano com 5 Unidades/mL de insulina Humulin® e 10 Unidades/mL de Condroitinase ABC (Associates of Cape Cod, E. Falmouth, MA); os ratinhos do grupo 7 receberam azul de tripano com 5 Unidades/mL de insulina Humulin® e 1 Unidade/mL de Condroitinase AC (Associates of Cape Cod, E. Falmouth, MA) ; os ratinhos do grupo 8 receberam azul de tripano com 5 Unidades/mL de insulina Humulin® e 100 Unidades/mL de liase de Streptomyces hyalurolyticus (Calbiochem); os ratinhos do grupo 9 receberam azul de tripano com 5 Unidades/mL de insulina Humulin®. A dispersão do pigmento azul de tripano foi depois medida por um paquímetro aos 2,5, 5, 10, 15 e 20 minutos pós injecção. A área de dispersão de pigmento (mm2) foi calculada por multiplicação do eixo mais longo Ml (comprimento da frente de pigmento) e M2 (largura da frente de pigmento por ^ π (M1M2 Vi π ) . Os níveis de glicose no sangue foram medidos utilizando um glicómetro aos 0, 5, 10, 15 e 20 minutos. 1. Dispersão de pigmento A Tabela 34 apresenta a área média de dispersão de pigmento após administração de cada um dos artigos de teste. O pigmento azul de tripano em tampão de pH neutro e tampão de pH baixo exibiu um espalhamento mínimo, com a área de dispersão variando desde uma média de cerca de 36 mm2 aos 2,5 minutos pós-injecção até cerca de 51 mm2 aos 20 minutos pós-injecção. Quando o pigmento azul de tripano foi misturado e entregue com insulina Humulin®, Hyal 1 ou PEG PH20, não se verificou qualquer aumento estatisticamente significativo na área de dispersão em comparação com a observada quando o pigmento foi misturado apenas com tampão. Em contraste, observou-se um aumento significativo na dispersão do pigmento quando misturado e entregue com rHuPH20, Condroitinase ABC, Condroitinase AC ou liase de Streptomyces hyalurolyticus. A área de dispersão média de pigmento azul de tripano quando misturado e entregue com rHuPH20 foi cerca de 45 mm2, 66 mm2, 80 mm2, 86 mm2 e 102 mm2 aos 2,5, 5, 10, 15 e 20 minutos após injecção, respectivamente. A área de dispersão média de pigmento azul de tripano quando misturado e entregue com Condroit inase AC foi cerca de 76 mm2, 107 mm2, 107 mm2, 110 mm2 e 116 mm2 aos 2,5, 5, 10, 15 e 20 minutos após injecção, respectivamente. A área de dispersão média de pigmento azul de tripano quando misturado e entregue com Condroitinase ABC foi cerca de 57 mm2, 75 mm2, 79 mm2, 81 mm2 e 88 mm2 aos 2,5, 5, 10, 15 e 20 minutos após injecção, respect ivamente. A área de dispersão média de pigmento azul de tripano quando misturado e entregue com liase de Streptomyces hyalurolyticus foi cerca de 7 4 mm2, 7 6 mm2, 101 mm2, 103 mm2 e 130 mm2 aos 2,5, 5, 10, 15 e 20 minutos após injecção, respectivamente.

2. Níveis de glicose no sangue A Tabela 35 apresenta os níveis médios de glicose no sangue (mg/dL) após administração de cada artigo de teste. Os níveis de glicose no sangue em ratinhos aos quais se administrou pigmento e tampão somente aumentaram de uma média de aproximadamente 212 mg/dL antes da injecção para aproximadamente 332 mg/dL aos 5 minutos pós-injecção. Depois, os níveis subiram gradualmente para aproximadamente 367 mg/dL aos 20 minutos pós-injecção. Este aumento de glicose no sangue na ausência de insulina é devido a um defeito bem conhecido de anestésicos sobre a glicose no sangue em roedores (ver, e.g. Saha et al. , (2005) Exp. Biol. Med. 230:777-784) . Quando se administrou insulina Humulin®, os níveis de glicose no sangue subiu momentaneamente para uma média de cerca de 292 mg/dL aos 5 minutos pós-injecção (desde uma média de cerca de 226 mg/dL antes da injecção) antes de cair para uma média de cerca de 171 mg/dL, 122 mg/dL e 97 mg/dL aos 10, 15 e 20 minutos pós- in jecção, respectivamente. Enquanto todas as enzimas de degradação de hialuronano baixaram os níveis de glicose no sangue quando administradas com insulina Humulin®, co-administração de rHuPH20, PEG PH20, Condroitinase ABC e liase Streptomyces hyalurolyticus pareceram reduzir os niveis ainda mais rapidamente do que observado com insulina Humulin® sozinha.

Exemplo 10 PEGilação de rHuPH20 A. Conjugação de mPEG-SBA-30K a rHuPH20

De modo a gerar uma hialuronidase humana solúvel PEGilada, rHuPH20 (que tem aproximadamente 60 KDa de tamanho) foi conjugada covalentemente a um éster linear de N-hidroxi-sucinimidilo de ácido metoxi-poli(etilenoglicol)butanóico (mPEG-SBA-30K), com um peso molecular aproximado de 30 kDa. A estrutura de mPEG-SBA é apresentada no Esquema 2, abaixo:

Métodos utilizados para preparar o mPEG-SBA-30K que foi utilizado para PEGilar rHuPH20 estão descritos, por exemplo, na Patente dos E.U.A. 5672662) . Resumidamente, o mPEG-SBA-30K é preparado de acordo com o procedimento seguinte:

Uma solução de malonato de etilo (2 equivalentes) dissolvido em dioxano é adicionada a hidreto de sódio (2 equivalentes) e tolueno sob uma atmosfera de azoto. Dissolve-se mPEG-metanossulfonato (1 equivalente, MW 30 kDa, Shearwater) em tolueno e adiciona-se à mistura acima. Leva-se a mistura resultante ao refluxo durante aproximadamente 18 horas. Concentra-se a mistura reaccional até metade do seu volume original volume, extrai-se com solução aquosa de NaCl a 10%, extrai-se com ácido clorídrico aquoso a 1%, e combinam-se os extractos aquosos. Extraem-se as fases aquosas recolhidas com diclorometano (3x) e seca-se a fase orgânica com sulfato de magnésio, filtra-se e evapora-se até à secura. Dissolve-se o resíduo resultante em hidróxido de sódio 1 N contendo cloreto de sódio e agita-se a mistura durante 1 hora. Ajusta-se o pH da mistura a aproximadamente 3 por adição de ácido clorídrico 6 N. Extrai-se a mistura com diclorometano (2x).

Seca-se a fase orgânica sobre sulfato de magnésio, filtra-se, concentra-se e verte-se em dietiléter frio. Recolhe-se o precipitado por filtração e seca-se sob vácuo. Dissolve-se o composto resultante em dioxano e leva-se ao refluxo durante 8 horas e depois concentra-se até á secura. Dissolve-se o resíduo resultante em água e extrai-se com diclorometano (2x), seca-se sobre sulfato de magnésio, e concentra-se a solução por evaporação rotativa e depois verte-se em dietiléter frio. Recolhe-se o precipitado por filtração e seca-se sob vácuo. Dissolve-se o composto resultante (1 equivalente) em diclorometano e adiciona-se N-hidroxi-sucinimida (2,1 equivalentes). Arrefece-se a solução até 0°C e adiciona-se gota a gota uma solução de diciclo-hexilcarbodi-imida (2,1 equivalentes) em diclorometano. Agita-se a solução à temperatura ambiente durante aproximadamente 18 horas. Filtra-se a mistura reaccional, concentra-se e precipita-se em dietiléter. Recolhe-se o precipitado por filtração e seca-se sob vácuo para dar mPEG-SBA-30K.

Para preparar a rHuPH20 PEGilada, o mPEG-SBA-30K foi acoplado ao (s) grupo(s) amino de rHuPH20 por conjugação covalente, proporcionando ligações amida estáveis entre rHuPH20 e mPEG, como se mostra no Esquema 3.

Para a conjugação, adicionou-se o mPEG-SBA-30K em forma de pó a rHuPH20 (numa concentração de 10 mg/mL em NaCl 130 mM/HEPES 10 mM; pH 7) . A proporção de PEG:rHuPH20 era 10:1 (proporção molar) . Após o PEG se ter dissolvido no tampão, submeteu-se a solução a filtração estéril (filtro de topo, tubo Cornig de 50 mL, poliestireno, membrana de acetato de celulose 0,22 pm). A conjugação foi realizada de um dia para o outro, com agitação, a 4°C numa sala arrefecida.

Após conjugação, concentrou-se a solução, utilizando uma membrana de TFF de MWCO 100000, e trocou-se o tampão contra NaCl 130 mM/HEPES 10 mM a pH 6,8. O material resultante, que foi testado quanto á actividade enzimática, como descrito no Exemplo 2, acima, foi diluído utilizando NaCl 130 mM/HEPES 10 mM a pH 6,8 para obter uma actividade enzimática final de 100000 U/mL (correspondente a aproximadamente 2,5 mg de péptido/mL). Este material de rHuPH20 PEGilado, em volumes de 1 mL, foi utilizado para encher frascos de injectáveis de vidro de Tipo 1 13 mm com vedante de bromobutilo, e armazenaram-se congelados (congelados de um dia para o outro num congelador a -80°C, e depois colocaram-se um congelador a -20°C para armazenamento mais longo). B. Análise de rHuPH20 PEGilada O material de rHuPH20 PEGilado foi avaliado por electroforese em gel. Três lotes de rHuPH20 PEGilada, preparados como no Exemplo 7A acima, revelaram um padrão idêntico de múltiplas bandas, representando PEG não reagido e múltiplas espécies de conjugados de mPEG-rHuPH20, que migraram a diferentes distâncias. Com base na comparação com a migração de um marcador de peso molecular, as bandas representando as espécies variaram de aproximadamente 90 KDa a 300 KDa, com três bandas escuras migrando acima do marcador de 240 KDa.

Estes dados mostraram que a rHuPH20 PEGilada, gerada por conjugação covalente de mPEG-SBA-30K, continha uma mistura heterogénea de espécies de rHuPH20 PEGilada, provavelmente incluindo proteínas mono-, di- e tri-PEGiladas. A ausência de uma banda visível a 60 KDa sugeriu que toda a proteína tinha reagido com o PEG, e que não estava presente na mistura qualquer rHuPH20 nativa detectável.

Exemplo 11.

Efeito de rHuPH20 na farmacocinética de insulina após administração subcutânea em porcos

Para determinar se um modelo de porco seria adequado para modelar a farmacocinética de insulinas prandiais co- administradas com hialuronidase recombinante (e.g. rHuPH20), avaliou-se a farmacocinética de insulina lispro Humalog® e de insulina Humulin® R após injecção subcutânea com ou sem rHuPH20 em porcos. Os resultados foram depois comparados com os observados em humanos (ver Exemplo 1), para determinar se o modelo de porco reflectia com exactidão o observado em humanos.

Resumidamente, insulina lispro Humalog® e insulina Humulin® R, com ou sem rHuPH20, foram administradas subcutaneamente a seis porcos num estudo randomizado, cruzado, de 4 vias. Cada animal recebeu três ciclos de tratamento com todos os quatro artigos de teste para facilitar a comparação da reprodutibilidade da insulina farmacocinética ao longo de uma série de doseamento. Colheram-se amostras de sangue e avaliou-se o soro para determinar os níveis de insulina imunorreactiva (IRI). Foram então determinados vários parâmetros farmacocinéticos, incluindo tmax, Cmax, tso% precoce, 150% tardio e AUCmax. A. Doseamento e amostragem

As soluções de doseamento (ou artigos de teste) de 100 U/mL de insulina lispro Humalog® ou insulina Humulin® R, com ou sem 4800 U/mL de rHuPH20, foram preparadas como se segue. As soluções 100 U/mL de insulina lispro Humalog® sozinha e de insulina Humulin® R sozinha foram preparadas a partir de lotes comerciais de insulina lispro Humalog® (100 U/mL; Lote A418976, Eli Lilly) e de insulina Humulin® R (100 U/mL; Lote A393318, Eli Lilly) diluídos 1:5 com diluente estéril (Eli Lilly), respectivamente. Para preparar a solução de insulina lispro Humalog®/rHuPH20, misturaram-se 910 pL de insulina lispro Humalog® 100 U/mL (Eli Lilly, Lote A418976), 44,6 mL de HYLENEX recombinante (injecção de hialuronidase humana) (Baxter, Lote 903646) e 45,4 pL de rHuPH20 API 1 mg/mL (Halozyme Therapeutics, Lote HUA0703MA) para uma concentração final de insulina lispro Humalog® de 91 U/mL e uma actividade de hialuronidase de 5454 U/mL. Para preparar a solução de insulina Humulin® R/rHuPH20, misturaram-se 200 pL de insulina Humulin® R 500 U/mL (Eli Lilly, Lote A393318) e 800 pL de produto farmacêutico de rHuPH20 6000 U/mL (Halozyme, Lote 288004; produto farmacêutico de rHuPH20 continha 50 pg de rHuPH20 em NaCl 145 mM, fosfato de sódio dibásico 10 mM, cloreto de cálcio 2,7 mM, EDTA sal dissódico 2,7 mM, 1 mg/mL de albumina de soro humana, pH 7,4) para uma concentração final de insulina de 100 U/mL e actividade de hialuronidase de rHuPH20 de 4800 U/mL.

As soluções contendo rHuPH20 foram submetidas a filtração estéril e utilizadas para encher frascos para injectáveis de vidro de Tipo I de 2 ml (Wheaton) e vedados com rolhas de borracha (Stelmi) de 13 mm. As soluções contendo rHuPH20 foram depois divididas em dois conjuntos; um foi mantido como um controlo refrigerado até ser testado e o outro foi utilizado para administração aos animais neste estudo. Todas as soluções de doseamento foram mantidas refrigeradas sempre e depois retiradas para ensaio. Cada conjunto de soluções foi testado quanto à actividade enzimática de rHuPH20 na mesma data, no prazo de 1-6 dias após serem formuladas.

Seis porcos Yucatan machos adultos (S&S Farms, Ramona, CA) , cada um pesando entre 21 e 25 kg no início do estudo, foram equipados com cateteres implantados cirurgicamente na veia jugular ou na artéria carótida com portas de acesso vascular exterior instaladas para colheita fácil de amostras de sangue ao longo do estudo. Os animais ficaram em quarentena durante 7 dias antes da instrumentação e tratamento. Seis animais foram colocados aleatoriamente aos grupos de estudo como se mostra na Tabela 36, abaixo. Os animais foram atribuídos a um de dois grupos cada um contendo 3 animais por grupo e a afectação foi mantida para os ciclos 1 e 2. Para um terceiro ciclo de doseamento, dois animais foram abandonados devido à não oclusão das cânulas, e os restantes quatro animais foram reafectados com apenas 2 animais por grupo. Os números de ID dos animais no Grupo 1 eram 540, 541 e 542 para os ciclos 1 e 2; e 542 e 544 para o ciclo 3. Números de ID dos animais no Grupo 2: 544, 545 e 546 para os ciclos 1 e 2; 545 e 546 para o ciclo 3.

As soluções de doseamento foram administradas subcutaneamente (SC) no flanco esquerdo de cada porco atrás da linha média do corpo. Antes da administração do artigo de teste, obteve-se uma amostra de sangue pré-tratamento. Os animais receberam uma única dose SC do artigo de teste apropriado (0,2 U/kg; com o animal medido antes de cada administração para determinar com exactidão a dose correcta) num protocolo dia sim, dia não. Cada animal recebeu uma única dose de bólus SC da insulina indicada (i.e., quer insulina quer lispro) a 0,2 U/kg quer num veículo quer numa co-formulação fresca de rHuPH20. Após administração do artigo de teste, pelo menos 0,7-1,0 mL de sangue foram colhidos aos 3, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 180 e 240 minutos. Uma sangria pré-tratamento (pré-sangria) foi também colhida antes da administração. As amostras de sangue foram colocadas imediatamente em tubos de soro não contendo qualquer anticoagulante, colocados em gelo durante um mínimo de 30 minutos, e depois centrifugados a 9500 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Transferiu-se depois o soro para um tubo pré-rotulado, congelou-se e armazenou-se a -80°C, até todas as amostras serem expedidas para a Millipore para bioanálise quanto aos níveis de insulina imunorreactiva (IRI).

B. Níveis de insulina no soro

Determinaram-se as concentrações de IRI no soro para cada amostra de soro por interpolação a partir de uma curva de calibração utilizando o software de análise de ensaios StatLIA® (Brendan Technologies, Carlsbad, CA). A Tabela 37 proporciona a concentração de IRI após administração de insulina lispro Humalog®, insulina lispro Humalog®/rHuPH20, insulina Humulin® R ou insulina Humulin® R/rHuPH20. A Tabela 37 apresenta os niveis de IRI de linha de base, como medidos nas amostras pré-sangrias. Estas linhas de base foram depois subtraídas às concentrações de IRI reais medidas a cada ponto temporal para determinar a concentração de IRI ajustada à linha de base.

Os perfis de concentração de IRI média no soro-tempo para cada tratamento (como observado quando representados num gráfico com a concentração de IRI no eixo dos Y em função do tempo no eixo dos X) eram similares ao longo de múltiplos ciclos. Em todos os ciclos de doseamento, as farmacocinéticas de insulina lispro Humalog® e insulina Humulin® R foram aceleradas quando co-administradas subcutaneamente na formulação de rHuPH20. Quaisquer diferenças observadas entre tratamentos foram substancialmente as mesmas entre ciclos de tratamento, indicando que as diferenças observadas eram devidas ao tratamento e eram estáveis através dos ciclos, durante aproximadamente 5 semanas de ensaio.

C. Farmacocinética de insulina 0 perfil de concentração de insulina-tempo após subtracção da concentração de insulina da linha de base (Tabela 37, acima) foi utilizado para calcular os parâmetros PK seguintes: incluindo tmax, Cmax, tso% precoce, tso% tardio e AUCintervaio. Os parâmetros PK foram derivados por análise não compartimentai utilizando o modelo 200 no WinNonlin

Professional versão 5.2 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). Os cálculos estatísticos foram realizados utilizando o SAS versão 9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC). Todas as análises foram realizadas utilizando um modelo misto com efeitos fixos por tratamento. Assumiu-se uma matriz de covariância simétrica composta entre observações repetidas para cada animal. As análises para Cmax e todos os pontos finais de AUC foram realizadas utilizando valores com transformação logarítmica com os valores de zero substituídos por 1 antes da transformação logarítmica (zero na escala logarítmica). Os pontos finais baseados no tempo foram analisados na escala linear original.

Um sumário da farmacocinética de insulina após administração subcutânea de insulina lispro Humalog® ou insulina Humulin® R, entregues sozinhas (controlo) ou com rHuPH20, é proporcionado na Tabela 38. Os vários parâmetros PK para cada insulina entregue sozinha ou com rHuPH20 são mostrados como a Média ± SD. A % do controlo para cada parâmetro (% do controlo calculada por [valor de PK média (geométrica ou aritmética) para insulina com rHuPH20] / [valor de PK média (geométrica ou aritmética) para insulina sozinha] x 100) é também fornecida na tabela. Os cálculos de % do controlo foram baseados na média geométrica e no valor de p para dados com transformação logarítmica para os parâmetros Cmax e AUC, enquanto foram baseados na média aritmética e nos valores não transformados para tmax e para tso% precoce e tardio. N = 16 porcos a não ser que indicado de outro modo. A Tabela 39 apresenta uma comparação de parâmetros PK de insulina lispro Humalog® sozinha com insulina Humulin® R com rHuPH20. Os valores de PK são proporcionados como a Média ± SD. É também proporcionada a % do controlo para insulina lispro Humalog® (i.e. [valor de PK média (geométrica ou aritmética) para insulina lispro Humalog® com rHuPH20] / [valor de PK média (geométrica ou aritmética) para insulina lispro Humalog® sozinha] x 100). Os cálculos de % do controlo foram baseados na média geométrica e no valor de p para dados com transformação logarítmica para os parâmetros Cmax e AUC, ou baseados na média aritmética e nos valores não transformados para tmax e para tso% precoce e tardio. N = 16 a não ser que indicado de outro modo.

D. Sumário A co-administração de insulina Humulin® R ou insulina lispro Humalog® com rHuPH20 em porcos alterou significativamente parâmetros PK específicos em relação às injecções de controlo (i.e. insulina Humulin® R ou insulina lispro Humalog® sozinha). Especificamente, a exposição máxima (Cmax) foi aumentada 163% para insulina lispro Humalog® (p = 0,0251) e 165% para insulina Humulin® R (p = 0,0218) guando administradas com rHuPH20 em relação aos controlos respectivos. O início de acção (tso% precoce) foi acelerado de 36 para 11 minutos para insulina lispro Humalog® (p = 0,0182) e de 61 para 10 minutos para insulina Humulin® R (p <0, 0001) . O tempo de efeito máximo (tmax) foi acelerado de 58 para 39 minutos para insulina lispro Humalog® (p = 0,1963) e de 94 a 38 minutos para insulina Humulin® R (p = 0, 0004) . O tso% tardio foi acelerado de 110 para 52 minutos para insulina lispro Humalog® (p = 0,0002) e de 170 para 70 minutos para insulina Humulin® R (p <0, 0001) . Exposição total (AUC±nf) não foi alterada significativamente quer para insulina lispro Humalog® (117% do controlo; p = 0,5176) quer para insulina Humulin® R (88% do controlo; p = 0,6118) . A exposição cumulativa foi desviada para janelas temporais mais cedo tanto para insulina lispro Humalog® (a AUC0-30 aumentou 7 63% em comparação com quando insulina lispro Humalog® foi administrada sozinha; p = 0,0198) e insulina Humulin® R (a AUC0-30 aumentou 1429% em comparação com quando insulina Humulin® R foi administrada sozinha; p = 0,0027). A co-administração quer de insulina Humulin® R com rHuPH20 quer de insulina lispro Humalog® com rHuPH20 aumentou a velocidade de absorção de insulina para o compartimento vascular (em comparação com quando a insulina respectiva foi entregue sozinha) como evidenciado por uma redução no tempo até às concentrações de IRI máximas no soro (t max, t5o% precoce, tso% tardio) , e como um aumento em concentrações de exposição de pico (Cmax) em comparação com insulina Humulin® R ou insulina lispro Humalog® sozinhas. Adicionalmente, a exposição cumulativa precoce (AUC0-30) foi aumentada tanto para insulina lispro Humalog® como para insulina Humulin® R quando co-administradas com rHuPH20, em comparação com quando administradas sozinhas. O aumento em exposição de pico e a aceleração de exposição após administração quer de insulina lispro Humalog® quer de insulina Humulin® R com co-administração de hialuronidase foram observadas de forma abrangente, sem impacto significativo no animal, sequência ou ciclo, e reflectem muito aproximadamente os estudos anteriores em humanos (ver Exemplo 1). Por conseguinte, o porco é um modelo adequado para estudar o efeito de hialuronidase na absorção de preparações de insulina prandial.

Exemplo 12.

Farmacocinética de insulina regular para duas doses administradas com ou sem rHuPH20 subcutaneamente A farmacocinética (PK) de regular insulina, quando administrada subcutaneamente para duas concentrações diferentes, tanto sozinha como co-administrada com rHuPH20, foi avaliada no modelo porcino descrito no Exemplo 10, acima. Foi conduzido um estudo de desenho cruzado de 4 vias de múltiplas doses para comparar a PK de insulina regular em concentrações de 20 e 100 U/mL, quando administradas sozinhas, com as mesmas duas concentrações após co-administração com rHuPH20. Em cada caso, administrou-se um total de 0,2 U/kg de insulina. A. Doseamento e colheita de amostras

Prepararam-se quatro artigos de teste para doseamento. Dois artigos de teste continham 20 U/mL e 100 U/mL de insulina regular (insulina Humulin® R; Eli Lilly), respectivamente (designadas Insulina U20 e Insulina U100, respectivamente) . Os restantes dois artigos de teste continham 20 U/mL e 100 U/mL de insulina regular (Diosynth Biotechnologies (uma divisão da Schering-Plough), respectivamente, com 20 pg/mL (aproximadamente 2400 U/mL) de rHuPH20 (designadas Insulina-PH20 U20 e Insulina-PH20 U100, respectivamente). O artigo de teste Insulina U20 foi preparado por diluição de insulina Humulin® R (100 U/mL; Lote A390566A; Eli Lilly) 1:5 com diluente estéril (Eli Lilly). O artigo de teste Insulina U100 era insulina Humulin® R não diluída (100 U/mL; Lote A509721; Eli Lilly). O artigo de teste Insulina-PH20 U20 continha 0,74 mg/mL (20 U/mL) de insulina regular (Lote # SIHR107; Diosynth Biotechnologies) e 20 pg/mL (aproximadamente 2400 U/mL) de rHuPH20 em Tris 25 mM, NaCl 120 mM, 0,01% de polissorbato 80, pH 7,3. O artigo de teste Insulina-PH20 U100 continha 3,69 mg/mL (100 U/mL) de insulina regular (Lote # SIHR107; Diosynth Biotechnologies) e 20 pg/mL (aproximadamente 2400 U/mL) de rHuPH20 em Tris 25 mM, NaCl 120 mM, 0,01% polissorbato 80, pH 7,3.

Seis porcos Yucatan machos adultos (S&S Farms, Ramona, CA) , cada um pesando entre 21 e 25 kg no início do estudo, foram providos com um cateter implantado cirurgicamente quer na veia jugular quer na artéria carótida para permitir a colheita de uma série de amostras de sangue ao longo da duração do estudo. Os animais foram colocados aleatoriamente em dois grupos de estudo, cada um contendo 3 animais/grupo como se mostra na Tabela 40. A afectação ao grupo foi mantida para os ciclos 1 e 2. Cada animal recebeu dois ciclos de tratamento com todos os quatro artigos de teste para facilitar a comparação da reprodutibilidade da farmacocinética de insulina ao longo de uma série de ciclos de doseamento.

Os artigos de teste foram administrados subcutaneamente (SC) no flanco esquerdo de cada porco atrás da linha média do corpo. Cada animal recebeu uma dose bólus SC única da insulina indicada com 0,2 U/kg num protocolo dia sim, dia não. Para os artigos de teste Insulina U20 e Insulina-PH20 U20, administraram-se 10,0 pL/kg. Para os artigos de teste Insulina U100 e Insulina-PH20 U100, administraram-se 2,0 pL/kg. Colheram-se amostras de sangue (0,7-1,0 mL em volume) antes da administração (pré-sangria), e depois aos 3, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 180 e 240 minutos pós-administração. As amostras de sangue foram colocadas em tubos de soro não contendo qualquer anticoagulante, colocados em gelo durante um mínimo de 30 minutos, e depois centrifugados a 9500 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Transferiu-se depois o soro para um tubo pré-rotulado, congelou-se e armazenou-se a -80°C, até todas as amostras serem expedidas para a Millipore BioPharma Services (St. Charles, MO) para determinar os níveis de insulina imunorreactiva (IRI).

B. Níveis de insulina no soro

Determinaram-se as concentrações de IRI no soro para cada amostra de soro por interpolação a partir de uma curva de calibração utilizando o software de análise de ensaios StatLIA® (Brendan Technologies, Carlsbad, CA). A Tabela 41 proporciona a concentração de IRI após administração de Insulina U20, Insulina U100, Insulina-PH20 U20 e Insulina-PH20 U100. A Tabela 41 apresenta os niveis de IRI de linha de base, como medidos nas amostras pré-sangrias. Estas linhas de base foram depois subtraídas às concentrações de IRI reais medidas a cada ponto temporal para determinar a concentração de IRI ajustada à linha de base.

Os perfis de concentração de insulina-tempo após cada ciclo de doseamento para cada grupo de tratamento. Os perfis de concentração de IRI média no soro-tempo para cada artigo de teste (como observado quando representados num gráfico com a concentração de IRI no eixo dos Y em função do tempo no eixo dos X) eram similares em ambos os ciclos. Em ambos os ciclos de doseamento, a PK de insulina foi acelerada quando co-administrada subcutaneamente com a formulação de rHuPH20 para ambas as concentrações. Modelos estatísticos adicionais, que incluíram efeitos fixos para tratamento, sequência, ciclo, a interacção tratamento-por-ciclo, e sequência dentro do animal para dados a partir dos ciclos 1 e 2, foram construídos para parâmetros PK primários e secundários (os parâmetros PK primários incluíram: Área sob a curva (AUC) para a janela temporal atribuída, Cmax, tmax, tso% precoce e tso% tardia; os parâmetros PK secundários incluíram janelas de tempo mais detalhadas para AUC, MRT (último e infinito), Lambda z, HL Lambda z, Eliminação, e Volume de Distribuição), e mostraram que não existe qualquer efeito sistemático de sequência, ciclo, ou animal, nem existe qualquer interacção entre ciclo e tratamento para qualquer destas variáveis.

C. Farmacocinética de insulina 0 perfil de concentração de insulina-tempo após subtracção da concentração de insulina da linha de base (Tabela 41, acima) foi utilizado para calcular os parâmetros PK seguintes: incluindo tmax, Cmax, tso% precoce, tso% tardio e AUCintervaio. Os dados de IRI no soro em função do tempo foram modelados por análise não compartimentai utilizando o modelo 200 no WinNonlin Professional (Versão 5.2, Pharsight Corp., Mountain View, CA) e calcularam-se os parâmetros PK. Os cálculos estatísticos e as comparações estatísticas entre grupos foram realizadas utilizando o SAS versão 9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC). Todas as análises forma realizadas utilizando um modelo misto com efeitos fixos por tratamento. Assumiu-se uma matriz de covariância simétrica composta entre observações repetidas para cada animal. As análises para Cmax e todos os pontos finais de AUC foram realizadas utilizando valores com transformação logarítmica com os valores de zero substituídos por 1 antes da transformação logarítmica (zero na escala logarítmica). Os pontos finais baseados no tempo foram analisados na escala linear original.

Um sumário da farmacocinética de insulina após administração subcutânea de Insulina U20, Insulina U100, Insulina-PH20 U20 e Insulina-PH20 U100, é proporcionado na Tabela 42. A % do controlo para cada parâmetro (% do controlo = [valor de PK média (geométrica ou aritmética) para insulina com rHuPH20] / [valor de PK média (geométrica ou aritmética) para insulina sozinha] x 100) é também fornecida na tabela. Os cálculos de % do controlo foram baseados na média geométrica e no valor de p para dados com transformação logarítmica para os parâmetros Cmax e AUC, enquanto os cálculos de % do controlo foram baseados na média aritmética e nos valores não transformados para tmax e para tso% precoce e tardio. N = 16 porcos a não ser que indicado de outro modo.

D. Sumário

Este estudo examinou o efeito de se administrar subcutaneamente a mesma dose total de insulina para diferentes concentrações, com ou sem rHuPH20.

Na ausência de co-administração com rHuPH20, a redução na concentração de insulina de 100 U/mL para 20 U/mL resultou em absorção de insulina mais rápida com um aumento em concentração de pico de insulina e maior exposição de insulina cumulativa tanto precoce como, numa menor extensão, global. Em relação às injecções de 100 U/mL de controlo, a redução na concentração para 20 U/mL 1) aumentou Cmax de 91% de uma média geométrica de 158 para 302 pmol/L; 2) reduziu tso% precoce médio de 35 para 23 minutos, tmax de 64 para 57 minutos, e tso% tardio de 109 para 84 minutos; e 3) aumentou a média geométrica de AUCo-is 300% de 20 para 80, AUC0-30 256% de 222 para 791, e AUCúitimo 131% de 9021 para 20820 todos em unidades de pmol χ min/L. A co-administração de insulina regular em qualquer das concentrações com rHuPH20 resultou também em absorção mais rápida após injecção subcutânea em relação à insulina sozinha. No entanto, para a concentração mais baixa de insulina de 20 U/mL, os aumentos relativos em relação à insulina administrada sozinha não foram tão acentuados uma vez que a insulina já foi absorvida mais rapidamente para 20 U/mL quando entregue sozinha (como descrito acima).

Para a concentração de 100 U/mL, que é mais tipicamente utilizada por pacientes diabéticos, a co-injecção com rHuPH20 1) aumentou Cmax 137% de uma média geométrica de 158 para 375 pmol/L (p = 0,0095); 2) reduziu tso% precoce médio de 35 para 12 minutos (p = 0,0063), enquanto tmax e tso% tardio não foram alterados significativamente; e 3) aumentou AUC0-15 média geométrica 70 vezes de 20 para 1438 (p <0, 0001), AUC0-30 23 vezes de 222 para 5337 (p = 0,0015), e AUCúitimo 250% de 9021 para 31905 (p = 0,0038) todas em unidades de pmol χ min/L, em comparação com administração de insulina sozinha para a concentração de 100 U/mL.

Para a concentração mais baixa de insulina de 20 U/mL, a co-administração com rHuPH20 resultou nos efeitos seguintes sobre a PK de insulina, em comparação com a administração de insulina sozinha: 1) Cmax não foi significativamente alterada com médias geométricas de 302 e 322 pmol/L (p = 0,84); 2) tso% precoce médio com uma tendência decrescente de 23 para 12 minutos (p = 0,16), enquanto tmax e tso% tardio não forma significativamente alterados; e 3) média geométrica de AUC0-15 aumentou 18 vezes de 80 para 1533 (p = 0,0045), AUC0-30 5 vezes de 791 para 4934 (p = 0,0567), e AUCúitima ficou inalterada 20820 e 22184 (p = 0,88) todas em unidades de pmol χ min/L. O aumento em pico de exposição e aceleração de exposição após administração de rHuPH20 e insulina regular para 100 U/mL em relação à injecção de controlo de insulina sem rHuPH20, reflectiu muito aproximadamente os estudos anteriores em humanos (Exemplo 1) e o estudo em porco (Exemplo 10) . Estes resultados demonstram adicionalmente que a cinética de insulina pode também ser acelerada por administração a uma concentração mais baixa, o que é consistente com um passo de dissociação de hexâmero de insulina limitante da velocidade que é dependente concentração (i.e. quando a insulina é administrada subcutaneamente sozinha, é absorvida quando se dissocia de um hexâmero em monómeros, um processo que ocorre a concentrações mais baixas de insulina) . Quando co-administrada com rHuPH20, esta dependência da concentração de insulina é grandemente reduzida ou mesmo eliminada. Assim, o efeito dispersante de hialuronidase da co-administração de rHuPH20 com insulina pode reduzir o abrandamento indesejado na farmacocinética de insulina que é observado com a injecção de insulina a concentrações mais elevadas.

Exemplo 13

Efeito da concentração de sal narHuPH20 na presença de metilparabeno

Avaliou-se o efeito de NaCl na estabilidade de rHuPH20 com ou sem o conservante metilparabeno, a temperatura acelerada (40°C). Prepararam-se doze formulações diferentes combinando rHuPH20 (10 mg/ml em histidina/HCl, pH 6,5, NaCl 130 mM) com seis concentrações diferentes de NaCl, com ou sem metilparabeno (Fluka). Cada formulação continha 10 pg/mL de rHuPH20, Tris 25 mM, pH 7,3, 0,01% de Tween 80, e NaCl 0, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM ou 250 mM com ou sem 0,2% de metilparabeno. Colheram-se aliquotas das soluções para frascos para injectáveis de vidro de Tipo I de 2 ml com rolhas de borracha e selaram-se com cápsulas de alumínio durante o estudo. Um conjunto de frascos para injectáveis foi armazenado a 40°C durante quatro dias, e o outro conjunto foi mantido no frigorífico a 2-8°C para servir como controlo positivo. Testaram-se depois as amostras quanto à actividade (enzimática) de hialuronidase. Para avaliar o nível de agregados, realizou-se cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC) utilizando uma coluna G2000 SWXL (Tosoh Bioscience) e as condições seguintes com PBS IX como tampão de ensaio e um caudal ajustado a 1 ml/min. A Tabela 43 apresenta os resultados do estudo, incluindo actividade (enzimática) de hialuronidase, % de pico principal (i.e. a percentagem de rHuPH20 que estava contida no pico principal) e % de pico de agregados (i.e. a percentagem de rHuPH20 que estava contida no pico atribuído a agregados) . Observou-se que a estabilidade de rHuPH20 era sensível à concentração de NaCl. Em geral, quando as formulações foram incubadas a 40°C, à medida que a concentração de NaCl diminuiu, a actividade enzimática de rHuPH20 diminuiu. No entanto, quando armazenada no frigorífico a 2-8°C, a rHuPH20 manteve a actividade enzimática independentemente da formulação. A temperatura elevada, quando se eliminou completamente o NaCl da solução, toda a actividade de rHuPH20 foi perdida, existisse ou não metilparabeno. A perda de actividade enzimática foi reduzida à medida que a concentração de NaCl aumentou. Verificou-se uma diferença significativa em actividade enzimática (teste t emparelhado, P = 0,0228) entre amostras com ou sem metilparabeno adicionado.

Observou-se uma correlação similar da concentração de NaCl e dos níveis de agregado de rHuPH20. Os níveis de agregado aumentaram com a diminuição da concentração de NaCl quando as amostras foram armazenada a temperatura elevada. Não se verificaram essencialmente quaisquer alterações com ou sem metilparabeno adicionado quando armazenada a 2-8°C. As formulações armazenadas a -40°C contendo metilparabeno formaram significativamente mais agregado do que as formulações que não continham metilparabeno (teste t emparelhado, P = 0,0058) .

Assim, tanto a actividade enzimática como a percentagem de monómero de rHuPH20 como avaliadas por SEC foram significativamente reduzidas em formulações contendo metilparabeno em comparação com aquelas formulações que não continha qualquer metilparabeno. Adicionalmente, dentro do intervalo de concentrações de NaCl testado (0-250 mM), verificou-se uma relação directa entre a concentração de NaCl e a estabilidade de rHuPH20 aumentada.

Exemplo 14.

Co-formulações de insulina e rHuPH20

Realizou-se uma série de estudos para avaliar a estabilidade de rHuPH20 e insulina sob várias condições, tais como várias temperaturas e pH, e formulações. 1. Efeito de osmolaridade e pH na rHuPH20

No primeiro estudo, avaliou-se o efeito de osmolaridade e pH na estabilidade de rHuPH20 formulada como Hylenex recombinante (injecção de hialuronidase humana) preparando formulações com várias concentrações de sal e valores de pH, e avaliação de qualquer perda de actividade após armazenamento sob condições refrigeradas (5°C), aceleradas (25°C) e de stress (25°C, 35°C e 40°C) durante até 3 meses. 0 Hylenex recombinante (injecção de hialuronidase humana) contém 150 U/mL de rHuPH20, NaCl 144 mM, fosfato de sódio dibásico 10 mM, 1 mg/mL de albumina de soro humana, Edetato dissódico 2,7 mM, CaCl2 2,7 mM, e tem um intervalo de osmolalidade de 290 a 350 mOsm e a pH de 7,4. Ajustou-se esta formulação para preparar as 8 formulações (e Hylenex de controlo) apresentadas na Tabela 44. Determinou-se a actividade enzimática (i.e. actividade de hialuronidase) como descrito acima. Determinou-se também o teor em rHuPH20 por RP-HPLC. Não se observaram quaisquer alterações significativas a nas condições de armazenamento recomendadas (5°C) ou aceleradas (25°C ou 30°C) para as quatro soluções preparadas nos limites de especificação de pH e osmolalidade ou para a solução de controlo às condições de armazenamento recomendadas. Observou-se que a rHuPH20 era estável a pH 7,4 e geralmente mais estável sob condições ácidas em vez de sob básicas condições, como avaliado por perda de actividade enzimática e perda do teor em rHuPH20. O efeito da força iónica foi mais modesto. A temperaturas elevadas, as formulações contendo força iónica mais elevada pareceram ser ligeiramente mais estáveis do que aquelas com força iónica mais baixa. Verificou-se uma diminuição significativa em estabilidade entre 35°C e 40°C.

2. Efeito de pH na rHuPH20

Avaliou-se o efeito de fazer variar o pH dos sistemas de tampão na estabilidade de rHuPH20. rHuPH20 (1 200 000 U/mL, 10 mg/mL) foi formulada em NaCl 130 mM, histidina 10 mM, com um pH de 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 ou 7,0. As formulações foram depois armazenadas a 5°C durante 0, 3, 6, 9 e 12 meses; 25°C em 60% de humidade relativa durante 0, 3, 6, 9 e 12 meses, e 35°C durante 0, 1, 2, 3 e 6 meses. A temperaturas refrigeradas, todas as formulações eram estáveis ao longo de todos os períodos de tempo. A rHuPH20 permaneceu dentro dos limites de tendência durante 12 meses a 5°C, 6 meses a 25°C, e 3 meses a 35°C para os artigos de teste a pH 6,0, 6,5 e 7,0. As formulações preparadas a pH 5,0 e 5,5 foram mais sensíveis a temperatura elevada, resultando numa diminuição significativa em actividade enzimática. 3. Efeito de pH e conservante na rHuPH20 formulada com análogos de insulina

Para avaliar o impacto de pH e conservante na estabilidade de rHuPH20 formulada com análogos de insulina a condições de armazenamento refrigeradas (5°C), aceleradas (30°C e 35°C), e sob agitação (25°C) durante até 4 semanas, combinou-se a rHuPH20 com insulina lispro Humalog® ou insulina aspártico Novolog® e avaliou-se a actividade enzimática e a estabilidade. A estabilidade de insulina foi avaliada por RP-HPLC. Os artigos de teste foram preparados com 10 pg/mL de rHuPH20, 100 U/mL de análogo de insulina, NaCl 140 mM, Tris-HCl 20 mM com qualquer de 0,2% de fenol; 0,2% de m-cresol; 0,2% de parabeno; 0,2% de fenol e 0,1% de F68; ou 0,2% de fenol e benzoato 1 mM. Cada uma destas formulações foi preparada a pH 7, 7,25 e 7,5, resultando num total de 30 artigos de teste (15 artigos de teste de insulina lispro Humalog®/rHuPH20 e 15 artigos de teste de insulina aspártico Novolog®/rHuPH20) . Os artigos de teste forma depois armazenados a 5°C, 30°C, 35°C e 25°C com agitação durante 4 semanas. Avaliou-se a actividade enzimática de rHuPH20 sob todas as condições. Avaliou-se a solubilidade de insulina por RP-HPLC para artigos de teste armazenados a 5°C, e 25°C com agitação.

Observou-se que a actividade de rHuPH20 não foi afectada por qualquer conservante ou pH após 4 semanas a 5°C. Sob condições de stress com agitação (20°C), a actividade de rHuPH20 não foi afectada quando co-formulada com Novolog® insulina aspártico e qualquer dos conservantes a qualquer dos pH testados. Por contraste, em algumas formulações com insulina lispro Humalog®, tal como quando formulada com 0,02% de fenol, m-cresol ou fenol/benzoato, a actividade de rHuPH20 após 6 horas foi reduzida em até 75%, muito tipicamente á medida que o pH aumentava. Esta perda de actividade estava correlacionada com a precipitação de insulina lispro Humalog®. A Tabela 45 apresenta a actividade de rHuPH20 mantida em cada um dos artigos de teste após incubação a 30°C e 35°C. Observou-se uma ligeira perda de actividade de rHuPH20 para uma média de cerca de 85% da actividade original a 30 °C. Observou-se uma perda de actividade maior a 35°C, particularmente, por exemplo, em artigos de teste contendo 0,2% de m-Cresol ou 0,2% de parabeno à medida que o pH aumentava. A insulina aspártico Novolog® permaneceu estável e solúvel em todas as formulações sob todas as condições de armazenamento. Ainda que a solubilidade de insulina lispro Humalog® fosse mantida a pH 7,5 após 4 semanas a 5°C, a insulina lispro Humalog® precipitou a pH mais baixo (7,0 e 7,25) a esta temperatura. A precipitação foi também observada sob condições de stress com agitação após 6 horas.

Uma vez modificações serão evidentes para os peritos nesta especialidade, pretende-se que este invento esteja limitado apenas pelo âmbito das reivindicações acima.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Halozyme, Inc. Frost, Gregory Bilinsky, Igor Vaughn, Daniel Sugarman, Barry <120> Composições de insulina de acção super-rápida

<130> 0119374-00100/3063PC <140> Ainda não atribuído <141> Inclusa <150> US 61/125835 <151> 2008-04-28 <150> US 61/127044 <151> 2008-05-09 <160> 273 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor de PH20 humana <4 0 0> 1

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val 'Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu ?he Ser Phe He Gly Ser Pro Arç 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 50 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 116 120 125

Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Aap Asn Leu Gly Met Ale Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 ISO 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 110 Π&

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lyo Gin Glu Phe 1Θ0 IBS 130

Glu Lys Ala Gly l*ys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Pile Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 2JO 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys He Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser GLn Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He 325 33C 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Scr Gin Val leu Cys GLr. Glu Gin 370 375 390

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 410

Aan Pro Asp Asn Phe Ala lie Glr. Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 ’ 455 460

He Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 455 470 <75 480

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val 485 490 495

Ser lie Leu Phe Leu lie He Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505

<210> 2 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> PH20 madura <400> 2

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp IS 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr SO 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Veil Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val He Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Tip Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asrt Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe T.eu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn Hia 190 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 1SS 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Tie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala E,ys Ser Pro Leu Pro Val Phe A.la Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 205

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320 Α3Π Tyr MeC Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala ALa Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350

He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala Tie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Fhe Thu Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 3B5 390 395 400

Ser Cya Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lya Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val Ser He Leu 450 455 460

Phe Leu He He Ser Ser Val Ala Ser Leu 465 470

<210> 3 <211> 482 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor de rHuPH20 solúvel <4Ο0> 3

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser See Gly Val Eer Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Tip Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe

50 55 -SO

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Eer Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 160 IB 5 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 2J0

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 . 250 255

Thr Ale Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Scr Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arq Glu Ala lie Arq Val 275 200 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lya Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arq lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 30E 310 315 320

Leu Va', Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Tie 325 33C 335

Val He Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Gig Gin 370 375 380

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 480

Phe Tyr

<210> 4 <211> 447 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> rHuPH20 solúvel 1-447 <4Ο0> 4

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 ID 15

Ala Trp Aan Ala Pro Ser Glu Phe Cys Lea Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Tie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly He Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 35 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 ISO 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Tie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg

165 170 17S

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Fro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Axg Val Arg Glu Ala He Arg Val Ser Lys He 245 250 2Ξ5

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin. Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 205

Thr phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val He Trp 290 293 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cya Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lya Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys

335 390 395 40D

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 4CS 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Giu Pro Gin He Phe Tyr 435 440 445

<210> 5 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> rHuPH20 solúvel 1-446 <4Ο0> 5

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro val lie Ptro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10-15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr

50 55 SO

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Fro 65 70 75 B0

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 05 SO 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Fro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 1B5 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 2C 5

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyt Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 2B5

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val He Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu. Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cy3 Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 315 350

Tie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 36C 365

Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe 435 440 445

<210> 6 <211> 445 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> rHuPH20 solúvel 1-445 <4Ο0> 6

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Clu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg He Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 10 15 80

Gin lys lie Ser Leu Gin Asp Bis Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 HO

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Scr lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 15S 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val çlu Thr He Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 110 175

Pro Asn Bis Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 1B5 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys ?ha Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Set Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arq Val Arg Glu Ala He Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Fro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 295

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lya Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 435 440 445

<210> 7 <211> 444 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> rHuPH20 solúvel 1-444 <4Ο0> 7

Leu Asn Phe Arq Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Fro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 10 75 30

Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 0 5 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr l.y3 Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Glu Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 Π0 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 165 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp I.eu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Ann Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 390 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 3D 5 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Ly3 Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp val cys lie Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 42Ξ 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin 435 440

<210> 8 <211> 443 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> rHuPH20 solúvel 1-443 <4Ο0> 8

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp IS 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg He Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Ásri Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr MeL Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 ‘ 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lya Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val ftrg Glu Ala He Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 200 205

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val He Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys 5er Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys 5er Cln Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350

He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Pile Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ale Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro 435 440

<210> 9 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> rHuPH20 solúvel 1-442 <4Ο0> 9

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Fro Val He Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ilç Pro 65 70 75 80

Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 35 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val He Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu lieu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 ISC 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

HiS Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Aan Vsi Glu lie 195 200 206

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 ' 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 Ξ 3 5 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 255 270 ?he Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val He Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 306 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn She Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Fhe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430

Fhe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu 435 440 <210> 10 <211> 450 <212> PRT <213> Bos taurus <22 0> <223> hialuronidase <4 Ο 0> 10

Met Arg Pro phe Set Leu Glu Val ser Leu His Leu Pro Trp Ala net 15 10 15

Ala Ala His Leu Leu Pro Val Cys Thr Leu Phe Leu Asn Leu Leu Ser 20 25 30

Met Thr Gin Gly Ser Arg Asp Pro Val Val Pro Asn Gin Pro Phe Thr 35 40 45

Thr lie Trp Asn Ala Asn Thr Glu Trp Cys Met Lys Lys Mis Gly Val 50 55 SO

Asp Val Asp lie ser lie Fhe Asp val val Thr Asn Pro Gly Gin Thr 65 70 75 80

Phe Arg Gly Pro Asn Met Thr lie Phe Tyr Ser Ser Gin Leu Gly Thr 85 90 35

Tyr Pro Tyr Tyr Thr Ser Ala Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu Pro 100 105 110

Gin Asn Ala Ser Leu Asn Ala His Leu Ala Arg Thr Phe Gin Asp lie IIS 120 125

Leu Ala Ala Met Pro Glu Pro Arg Phe Ser Gly Leu Ala Val lie Asp 130 135 140

Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Thr Lys Asp 145 150 155 160 lie Tyr Arg Gin Arg Ser Arg Ala Leu Val Gin Lys Gin His Pro Asp 165 Π0 175

Trp Leu Ala Pro Arg Val Glu Ala Ala Ala Gin Asp Gin Phe Glu Gly 180 105 190

Ala Ala Glu Glu Trp Met Ala Gly Thr Leu Lya Leu Gly Gin Ala Leu 195 200 205

Arg Pro Gin Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Asn Phe Pro Glu Cys Tyr Asn 210 215 220

Tyr Asp Phe Lys Ser Pro Asn Tyr Thr Gly Arg Cya Pro Leu Asn He 225 230 235 240

Cys Ala Gin Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Gly Gin Ser Arg Ala 245 250 ?55

Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Pro Ala Ala Leu Glu Gly Thr Lys Lys 260 265 270

Thr Gin Met Phe Val Gin His Arg Val Ala Glu Ala Phe Arg Val Ala 275 230 285

Ala Gly Ala Gly Asp Pro Lys Leu Pro Val Leu Pro Tyr Met Gin Leu 290 295 300

Phe Tyr Asp Met Thr Asn His Phe Leu Pro Ala Glu Glu Leu Glu His 305 310 315 320

Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gin Gly Ala Ala Gly Val Val Leu Trp 325 330 335

Val Ser Trp Leu Ser Thr Ser Thr Lys Glu Ser Cya Gin Ala lie Lys 340 345 350

Glu Tyr Val Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ser lie Leu Asn Val Thr Ser 355 360 365

Gly Ala Arg Leu Cys Ser Gin Val Leu Cys 5er Gly His Gly Arg Cys 370 375 330

Ala Arg Arg Pro Ser Tyr Pro Lys Ala Arg Leu lie Leu Asn Ser Thr 385 390 395 400

Ser Phe Ser lie Lys Pro Thr Pro Gly Gly Gly Pro Leu Thr Leu Gin 405 410 415

Gly Ala Leu Ser Leu Glu Asp Arg Leu Arg Met Ala Val Glu Phe Glu 420 425 430

Cys Arg Cys Tyr Arg Gly Trp Arg Gly Thr Arg Cys Glu Gin Trp Gly 435 ' 440 445

Met Trp 450 <210> 11 <211> 553 <212> PRT <213> Bos taurus <22 0> <223> PH20 <4 Ο 0> 11

Met Arg Met Leu Arg Arg His His lie Ser Phe Arg Ser Phe Ala Gly 15 10 15

Set Ser Gly Thr Pro Gin Ala Val Phe Tar Phe Leu Leu Leu Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Ala Leu Asp Phe Arg Ala Pro Pro Leu lie Ser Asn Thr Ser 35 10 15

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Val Glu Arg Cys Val Asn Arg Arg 50 55 60

Phe Gin Leu Pro Pro Asp Leu Arg Leu Phe Ser Val Lys Gly Ser Pro 65 TO 15 80

Gin Lys Ser Ala Thr Gly Gin Phe lie Thr Leu Phe Tyr Ala A3p Arg B5 90 95

Leu Gly Tyr Tyr Pro His lie Asp Glu Lys Thr Gly Lys Thr Val Phe 100 105 110

Gly Gly lie Pro Gin Leu Gly Asn Leu Lys Ser His Met Glu Lya Ala 115 120 125

Lys Asn Asp lie Ala Tyr Tyr lie Pro Asn Asp Ser Val Gly Leu Ala 130 135 140

Val lie Asp Trp Glu Asn Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys 145 150 155 160

Pro Lys Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ser Val Glu Leu Val Leu Gin Lys 16S 170 175

Asn Pro Gin Leu Ser Phe Pro Glu Ala Ser Lys lie Ala Lys Val Asp 180 135 190

Phe Glu Thr Ala Gly Lya Ser Phe Met Gin Glu Thr Leu Lys Leu Gly 195 200 205

Lys Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp 210 215 220

Cys Tyr Asn Hia Asn His Asr. Gin Fro Thr Tyr Asn Gly Asn Cya Pro 225 230 235 240

Asp Val Glu Lys Arg Arg Asn Asp Asp Leu Glu Trp Leu Trp Lys Glu 245 250 255

Ser Thr Ala Lôu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Asn lie Arg Leu Lys Ser

260 265 27 U

Thr Gin Asn Ala Ala Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Gin Glu Ala lie 275 280 285

Arg Leu Ser Lys lie Ala Set Val Glu Ser Pro Leu Pro Val Phe Val 250 295 300

Tyr Ala Arg Pro Val Phe Thr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Leu Ser Gin 305 310 315 320

Gly Asp Leu Val Asn Ser Val Gly Glu lie Val Ser Leu Gly Ala Ser 325 330 335

Gly lie lie Met Trp Gly Ser Leu Asn Leu Ser Leu Ser Met Gin Ser 340 345 350

Cys Met Asn Leu Gly Thr Tyr Leu Asn Thr Thr Leu Aan Pro Tyr Ile 355 360 365

Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys His 370 375 3ΘΟ

Asn Glu Gly Val Cys Thr Arg Lys His Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu 385 390 395 400

His Leu Asn Pro Met Asn Phe Ala Ile Gin Thr Gly Glu Gly Gly ly3 405 410 415

Tyr Thr Val Pro Gly Thr Val Thr Leu Glu Asp Leu Gin Lys Phe Ser 420 425 430

Asp Thr Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ala Asn He Jlis Cys Lys Lys Arg 435 440 445

Val Asp He Lys Asn Val His Ser Val Asn Val Cys Met Ala Glu Asp 450 455 460

He Cys lie Asp Ser Pro Val Lys Leo Gin Pro Ser Asp His Ser Ser 465 470 475 400

Ser Gin Glu Ala Ser Thr Thr Thr Phe Ser See lie Ser Fro Ser Thr 485 490 495

Thr Thr Ala Thr Val Ser Pro Cys Thr Pro Glu Lys His Ser Pro Glu 500 505 510

Cys Leu Lys Val Arg Cy$ Ser Glu Val lie Pro Asn Val Thr Gin Lys 515 520 525

Ala Cys Gin Ser Val Lys Leu Lys Asn Ile Ser Tyr Gin Ser Pro He 530 535 540

Gin Asn Ile Lys Asn Gin Thr Thr Tyr 545 550 <210> 12 <211> 331

<212> PRT <213> Vespula vulgaris <22 0> <223> hialuronidase A <4 0 0> 12

Sec Glu Arg Pro Lys Arg Val Phe Asn lie Tyr Trp Asn Val Pro Tiir 1 5 10 15

Pile Met Cys His Gin Tyr Asp leu Tyr Phe Asp Glu Val Thr Asn Phe 20 25 30

Asn lie lys Arg Asn Eer Lys Asp Asp Phe Gin Gly Asp Lys lie Ala 35 4 0 45 lie Phe Tyr Asp Pro Gly Glu Phe Pro Ala Leu Leu Ser Leu Lys Asp 50 55 60

Gly Lys Tyr Lys Lys Arg Asn Gly Gly Val Pro Gin Glu Gly ftsn lie 65 30 75 80

Thr He His Leu Gin Lys Phe lie Glu Asn Leu Asp Lys lie Tyr Pro 85 90 95

Asn Arg Asn Phe Ser Gly lie Gly Val lie Asp Phe Glu Arg Trp Arg 100 105 110

Pro lie phe Arg Gin Asn Trp Gly Asn Met Lys lie His Ly3 Asn Phe 115 120 125

Ser lie Asp Leu Val Arg Asn Glu His Fro Thr Trp Asn Lys Lys Met 130 135 140 lie Glu Leu Glu Ala Ser Lys Arg Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Phe Phe 145 150 155 160

Met Glu Glu Thr Leu Lys Leu Ala Lys Lys Thr Arg Lys Gin Ala Asp 165 170 175

Trp Gly .Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Cys Phe Asn Met Her Pro Asn Aart

180 185 ISO

Leu val Pro Glu Cys Asp Val Thr Ala Met His Glu Asn Asp Ly3 Met 195 200 205

Ser Trp Leu Phe Asn Asn Gin Asn Val Leu Leu Pro Ser Val Tyr Val 210 215 220

Arg Gin Glu Leu Thr Pro Asp Gin Arg He Gly Leu Val Gin Gly Arg 225 230 235 240

Val Lys Glu Ala Val Arg lie Ser Asn Asn Leu Lys His Ser Pro Lys 245 250 255

Val Leu Ser Tyr Trp Trp Tyr Val Tyr Gin Asp Glu Thr Asn Thr Phe 260 265 27 U

Leu Thr Glu Thr Asp Val Lys Lys Thr Phe Gin Glu lie Val He Asn 275 2 B0 285

Gly Gly Asp Gly He lie lie Trp Gly Ser Ser Ser Asp Val Asn Ser 290 295 300

Leu Eer Lys Cys Lys Arg Leu Gin Asp Tyr Leu Leu Thr Val Leu Gly 305 310 315 320

Pro lie Ala lie Asn Val Thr Glu Ala Val Asn 325 330

<210> 13 <211> 340 <212> PRT <213> Vespula vulgaris <22 0> <223> hialuronidase B <4 0 0> 13

Asp Arg Thr lie Trp Pro Lys Lys Gly Phe Her He Tyr Trp Asn He 15 10 15

Pro Thr His Phe Cys His Asn Phe Gly Val Tyr Phe Lys Clu Leu Lys 20 25 30

Gin Phe Asn He Lys Tyr Asn Ser Met Asn Asn Phe Arg Gly Glu Thr 35 40 45 lie Ser Lea Phe Tyr Asp Pro Gly Asn Phe Pro Ser Met Val Lea Leu SO 55 60

Lys Asn Gly Thr Tyr Glu lie Arg Asn Glu Gly Val Pro Gin Lys Gly 65 70 75 80

Asn Leu Thr lie His Leu Glu Gin Phe Thr Lys Glu Leu Asp Glu lie E5 90 95

Tyr Pro Lys Lys lie Ala Gly Gly lie Gly Val lie His Phe His Asn 100 105 110

Trp Arg Pro lie Phe Arg Arg Asn Val Asp Asn Leu Lys Ile Asn Lys 115 120 125

Asp lie Ser Ile Asp Leu val Arg Lys Glu His Pro Lys Trp Asp Lys 130 135 140

Ser Met Ile Glu Lys Glu Ala Ser Asn Arg Phe Glu Thr Ser Ala Lys 145 ISO 155 160 lie Phe Met Glu Lys Thr Leu Lys Leu Ala Lys Glu lie Arg Lys Lys 165 170 175

Thr Glu Trp Gly Tyr His Gly Tyr Pro His Cys Leu Ser Gly Ser Thr 18 G 185 190

Asp Lys Pro Ser Phe Asp Cys Asp Ala Leu Ser Met Ser Glu Asn Asp 195 200 205

Lys Met Ser Trp Leu Phe ASii Asn Gin Asr. Val Leu Leu Pro Ser lie 210 215 220

Tyr Leu lys Asn Val Leu Lys Pro Asp Glu Lys He His Leu Val Gin 225 230 235 240

Glu Arg Leu Lys Glu Ala He Arg Tie Ser Lys Asn Phe l.ys His Leu 245 250 255

Pro Lys Val Leu Pro Tyr Trp Trp Tyr Thr Tyr Gin Asp Lys Glu Ser 260 265 270 lie Phe Leu Thr Glu Ala Asp Val Lys Asn Thr Phe Lys Glu Ile Leu 275 280 285

Thr Asn Gly Ala Asp Gly He lie He Trp Gly Val Ser Tyr Glu Leu 290 295 300

Thr Asp Arg Lys Arg Cys Glu Lys Leu Lys Glu Tyr Leu Met Lys lie 305 310 315 320

Leu Gly Pro Ile Ala Phe Lys Val Thr Lys Ala Val Lys Glu Asn Thr 325 330 335

Pro Leu Asn Phe 34 0

<210> 14 <211> 382 <212> PRT <213> Apis mellifera <22 0> <223> hialuronidase <4 0 0> 14

Met Ser Arg Pro Leu Val lie Thr Glu Gly Met Piet Ile Gly Val Leu 15 10 15

Leu Met Leu Ala Pro He Asn Ala Leu Leu Leu Gly Phe Val Gin Her 20 25 30

Thr Pro Asp Asn Asn Lys Thr Val Arg Glu Phe Asn Val Tyr Trp Asn 35 40 45

Val Pro Thr Phe Met Cys His Lys Tyr Gly Leu Arg Phe Glu Glu Val 50 55 60

Ser Glu Lys Tyr Gly Ile Leu Gin Asn Trp Met Asp Lys Phe Arg Gly 65 70 75 80

Glu Glu lie Ala lie Lbu Tyr Asp Pro Gly Met Phe Pro Ala Leu Leu 85 90 95

Lys Asp Pro Asn Gly Asn Val Val Ala Arg Asn Gly Gly Val Pro Gin 100 105 110

Leu Gly Asn Leu Thr Lys His Leu Gin Val Phe Arq Asp His Leu lie 115 12D 125

Asn Gin He Pro Asp Lys Ser Phe Pro Gly Val Gly val lie Asp Phe 130 135 140

Glu Ser Trp Arg Pro lie Phe Arg Gin Asn Trp Ala Ser Leu Gin Pro 145 150 155 160

Tyr Lys Lys Leu Ser Val Glu Val Val Arg Arg Glu His Pro Phe Trp 165 Π0 175

Asp Asp Gin Arg Val Glu Gin Glu Ala Lys Arg Arg Phe Glu Lys Tyr 180 185 190

Gly Gin Leu Phe Met Glu Glu Thr Leu Lys Ala Ala Lys Arg Met Arg 195 200 205

Pro Ala Ala Asn Trp Gly Tyr Tyr Ala Tyr Pro Tyr Cys Tyr Asn Leu 210 215 220

Thr Pro Asn Gin Pro Ser Ala Gin Cys Glu Ala Thr Thr Met Gin Glu 225 230 235 240

Asn Asp Lys Met Ser Trp Leu Phe Glu Ser Glu Asp Val Leu Leu Pro 245 £50 255

Ser Val Tyr Leu Arg Trp Asn Leu Thr Ser Gly Glu Arg Val Gly Leu 260 265 270

Val Gly Gly Arg Val Lys Glu Ala Leu Arg lie Ala Arg Gin Met Thr 275 200 2Θ5

Thr Ser Arg Lys Lys Val Leu Pro Tyr Tyr Trp Tyr Lys Tyr Gin Asp 290 295 300

Arg Arg Asp Thr Asp Leu Ser Are Ale Asp Leu Glu Ala Thr Leu Arg 305 310 ' 315 320

Lys lie Thr Asp Leu Gly Ala Asp Gly Phe lie He Trp Gly Ser Ser 325 330 335

Asp Asp lie Asn Thr Lys Ala Lys Cys Leu Gin Phe Arg Glu Tyr Leu 340 345 350

Asn Asn Glu Leu Gly Pro Ala Val Lys Arg He Ala Leu Asn Asn Asn 355 360 365

Ala Asn Asp Arg Leu Thr Val Asp Val Ser Val Asp Gin Val 370 375 380

<210> 15 <211> 331 <212> PRT <213> Dolichovespula maculata <22 0> <223> hialuronidase <4 0 0> 15

Ser Glu Arg Pro Lys Arg Val Phe Asn lie Tyr Trp Asn Val Fro Thr 15 10 15

Phe Met Cys His Gin Tyr Gly Leu Tyr Phe Asp Glu Val Thr Asn Phe 20 25 30

Asn lie Lys His Asn Ser Lys Asp Asp Phe Gin Gly Asp Lys lie Eer 35 40 45

He Phe Tyr Asp Pro Gly Glu Phe Pro Ala Leu Leu Pro Leu Lys Glu 50 55 60

Gly Asn Tyr Lys lie Arg Asn Gly Gly Val Pro Gin Glu Gly Asn lie 65 70 75 80

Thr lie His Leu Gin Arg Phe He Glu Asn Leu Asp Lys Thr 7yr Pro Θ5 90 95

Asn Arg Asn Phe Asn Gly lie Gly Val lie Asp Phe Glu Are Trp Arg

100 105 11C

Pro lie Phe Arg Gin Asn Trp Gly Asn Met Met lie His Lys Ly3 Phe 115 120 125

Ser He Asp Leu Val Arg Asn Glu His Pro Phe Trp Asp Lys Lys Met 130 135 140 lie Glu Leu Glu Ala Ser Lys Arg Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Phe 145 150 155 160

Met Glu Glu Thr Leu Lys Leu Ala Lys Lya The Arg Lys Gin Ala Asp - 165 170 175

Trp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Cys Phe Asn Met Ser Prc Asn Asn 180 185 190

Leu Val Pro Asp Cys Asp Ala Thr Ala Met Leu Glu Asn Asp Lys Met IS 5 200 205

Ser Trp Leu Phe Asn Asn Gin Asn Val Leu Leu Pro Ser Val Tyr He 210 215 220

Arg His Glu Leu Thr Pro Asp Gin Arg Val Gly Leu vaL Gin Gly Arg 225 230 ‘ 235 240

Val Lys Glu Ala Val Arg He Scr Asn Asn Leu Lys His Set Pro Lys 245 250 255

Val Leu Ser Tyr Trp Trp Tyr Val Tyr Gin Asp Asp Thr Asn Thr Phe 260 265 270

Leu Thr Glu Thr Asp Val Lys Lys Thr Phe Gin Glu He Ala lie Asn 275 280 285

Gly Gly Asp Gly He Tie lie Trp Gly Ser Ser Ser Asp Val Asn Ser 290 295 300

Leu Ser Lys Cys Lys Axg Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Thr Val Leu Gly 305 310 315 320

Pro lie Thr Val Asn Val Thr Glu Thr Val Asn 325 330

<210> 16 <211> 367 <212> PRT <213> Polistes annularis <22 0> <223> hialuronidase <4 0 0> 16

Tyr Val Ser Leu Ser Pro Asp Ser Val ?h.e Asn lie lie Thr Asp Asp 15 10 15 lie Ser His Gin lie Leu Ser Arg Ser Asn Cys Glu Arg Ser Lys Arg 20 25 30

Pro Lys Arg Val Phe Ser He Tyr Trp Asn val Pro Thr Phe Met Cys 35 40 45

His Gin Tyr Gly Met Asn Phe Asp Glu Val Thr Asp Phe Asn lie Lys SO 55 60

His Asn Ser Lys Asp Asn Phe Arg Gly Glu Thr He Ser He Tyr Tyr 65 70 75 80

Asp Fro Gly Lys Phe Pro Ala Leu Met Pro.Leu Lys Asn Gly Asn Tyr 85 90 95

Glu Glu Arg Asn Gly Gly Val Pro Gin Arg Gly Asn He Thr lie His 100 105 110

Leu Gin Gin Phe Asn Glu Asp Leu Asp Lys Met Thr Fro Asp Lys Asn 115 120 125

Phe Gly Gly lie Gly Val lie Asp Phe Glu Arg Trp lys Pro lie Phe 130 135 HO

Arg Gin Asn Trp Cly Aan Thr Glu lie His Lys Lys Tyr Ser lie Glu 145 150 155 160

Leu Val Arg Lys Glu His Pro Lys Trp Ser Glu ser Met lie Glu Ala 165 170 175

Glu Ala Thr Lys Lys Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Tyr Phe Met Glu Glu 1Θ0 186 190

Thr Leu Lys Leu Ala Lys Lys Thr Arg Lys Arg Ala Lys Trp Gly Tyr 19S 200 205

Tyr Gly Phe Pro Tyr Cys Tyr Asn Val Thr Pro Asn Asn Pro Gly Pro 210 215 220

Asp Cys Asp Ala Lys Ala Thr lie Glu Asn Asp Arg Leu Ser Trp Met 225 230 235 240

Tyr Asn Asn Glr. Glu He Leu Phe Pro Ser Val Tyr Val Arg His Glu 245 250 255

Gin Lys Pro Glu Glu Arg Val Tyr Leu Val Gin Gly Arg lie Lys Glu 260 265 " 270

Ala Val Arg lie Ser Asn Asn Leu Glu His Ser Pro Ser Val Leu Ala 275 200 205

Tyr Trp Trp Tyr Val Tyr Gin Asp Lys Met Asp lie Tyr Leu Ser Glu 250 295 300

Thr Asp Val Glu Lys Thr Phe Gin Glu lie Val Thr Asn Gly Gly Asp 305 310 315 320

Gly lie He He Trp Gly Ser Ser ser Asp Val Asn Set Leu Ser Lys 325 330 335

Cys Ly3 Arg Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Asn Thr Leu Gly Pro Phe Ala 340 345 350

Val Aan Val Thr Glu Thr Val Asn Gly Arg Ser Ser Leu Asn Phe 355 360 365

<210> 17 <211> 462 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0> <223> hialuronidase <4 0 0> 17

Met Leu Gly léu Thr Gin. His Ala Gin Lya Val Trp Arg Met Lys Pro 15 10 15

Phe Ser Pro Glu Val Ser Pro Gly ser Ser Pro Ala Thr Ala Gly His 20 25 30

Leu Leu Arg lie Set Thr Leu Phe Leu Thr Leu Leu Glu Leu Ala Gin 35 40 45

Val Cys Arg Gly Ser Val Val Ser Asn Arg Pro Phe lie Thr Val Trp 50 55 60

Asn Gly Asp Thr His Trp Cys Leu Thr Glu Tyr Gly Val Asp Val Asp 65 70 75 80

Val ser val Phe Asp Val Val Ala Asn Lys Glu Gin Ser Phe Gin Gly 85 90 95

Ser Asn Mat Thr lie Phe Tyr Arg Glu Glu Leu Gly Thr Tyr Pro Tyr ICO 105 110

Tyr Thr Pro Thr Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu Pro Gin Asn Ala 115 120 125

Ser Leu Val Thr His Leu Ala His Thr Phe Gin Asp lie Lys Ala Ala 130 135 140

Met Pro Glu Pro Asp Phe Ser Gly Leu Ala Val lie Asp Trp Glu Ala 145 150 155 160

Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Sar Lys Asp lie Tyr Arg 165 170 175

Gin Arg Ser Met Glu Leu Val Gin Ala Glu His Pro Asp Trp Pro Glu 190 185 190

Thr Leu Val Glu Ala Ala Ala Lys Asn Gin Phe Gin Glu Ala Ala Glu 195 200 205

Ala Trp Met Ala Gly Thr Leu Gin Leu Gly Gin Val Leu Arg Pro Arg 210 215 220

Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr Asn Asn Asp Phe 225 230 235 240

Leu Ser Leu Asn Tyr Thr Gly Gin Cys Pro Val Phe Val Arg Asp Gin 245 Ξ50 255

Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Asn Gin Ser Tyr Ala Leu Tyr Pro 260 265 270

Ser lie Tyr Leu Pro Ala Ala Leu Met Gly Thr Gly Lys Ser Gin Met 275 260 ΐ B5

Tyr VaL Arg His Arg Val Gin Glu Ala Leu Arg Val Ala He Val Ser 290 295 300

Arg Asp Pro His Val Pro Val Met Pro Tyr Val Gin lie Phe Tyr Glu 305 310 315 320

Met Thr Asp Tyr Leu Leu Pro Leu Glu Glu Leu Glu His Ser Leu Gly 325 330 335

Glu Ser Ala Ala Gin Gly Val Ala Gly Ala Val Leu Trp Leu Ser Ser 34 0 34 5 350

Asp Lys Thr Ser Thr Lys Glu Ser Cys Gin Ala lie Lys Ala Tyr Met 355 360 365

Asp Ser Thr Leu Gly Pro Fhe lie val Asn Val Thr Ser Ala Ala Leu 370 375 360

Leu Cys Ser Glu Ala Leu Cys Ser Gly His Gly Arg Cys Val Arg His 365 390 395 400

Fro Ser Tyr Pro Glu Ala Leu Leu Thr Leu Asn Pro Ala Ser Phe Ser 405 410 415

He Glu Leu Thr His Asp Gly Arg Pro Pro Ser Leu Lys Gly Thr Leu 420 425 430

Ser Leu Lys Asp Arg Ala Gin Met Ala Met Lys Phe Arg Cys Arg Cy3 435 440 445

Tyr Arg Gly Trp Arg Gly Lys Trp Cys Asp Lys Arg Gly Met 450 455 460

<210> 18 <211> 473 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0> <223> Hialuronidase 2 <4 Ο 0> 18

Met Arg Ala Gly Leu Gly Pro He lie Thr Leu Ala Leu Val Leu Glu IS 10 15

Val Ala Tro Ala Gly Glu Leu Lys Pro Thr Ala Pro Pro lie Phe Thr 20 25 30

Gly Arg Fro Phe Val Val Ala Trp Asn Val Pro Thr Gin Glu Cys Ala 35 40 45

Pro Arg Hi3 Lys Val Pm Uu Asp Leu Arg Ala Phe Asp Val Lys Ala 50 55 60

Thr Pro Asn Glu Gly Phe Phe Asn Gin Asn lie Thr Thr Phe Tyr Tyr 65 70 75 80

Asp Arg Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Phe Asp Ala Ala Gly Thr Ser Val 85 90 95 his Gly Gly Val Pro Gin Asn Gly Ser Leu Cys Ala Kis Leu Pro Met 100 105 110

Leu Lys Glu Ser Val Glu Arg Tyr lie Gin Thr Gin Glu Pro Gly Gly 115 120 125

Leu Ala Val Tie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Val Trp Val Arg Asn 130 135 140

Trp Gin Glu Lys Asp Val Tyr Arg Gin Ser Ser Arg Gin Leu Val Ala 145 150 155 160

Ser Arg His Pro Asp Trp Pro Ser Asp Arg Val Met Lys Gin Ala Gin 165 170 175

Tyr Glu Phe Glu Phe Ala Ala Arg Gin Phe Met Leu Asn Thr Leu Arg 180 185 190

Tyr Val Lys Ala Val Arg Pro Gin His Leu Trp Gly Phe Tyr Leu Phe 195 200 205

Pm Asp Cys Tyr Asn His Asp Tyr Val Gin Asn Trp Glu Ser Tyr Thr 210 215 220

Gly Arg Cys Pro Asp Val Glu Val Ala Arg Asn Asp Gin Leu Ala Trp

225 230 235 24C

Leu Trp Ala Glu Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Asp Glu 245 250 255

Thr Leu Ala ser Ser Val His Ser Arg Asn Phe Val Ser Phe Arg val 260 265 270

Arg Glu Ala Leu Arg Val Ala His Thr His His Ala Asn His Ala Leu 275 230 285

Pro Val Tyr Val Phe Thr Arg Pro Thr Tyr Thr Arg Gly Leu Thr Gly 290 295 3C0

Leu Ser Gin Val Asp Lou lie Ser Thr lie Gly Clu Ser Ala Ala Leu 305 310 315 320

Gly Ser Ala Gly Val lie Phe Trp Gly Asp Ser Glu Asp Ala Ser Ser 325 330 335

Met Glu Thr Cys Gin Tyr Leu Lys Asn Tyr Leu Thr Gin Leu Leu Val 34 0 34 5 350

Pro Tyr lie Val Asn Val Ser Trp Ala Thr Gin Tyr Cys Ser Trp Thr 355 360 365

Gin Cys His Gly His Gly Arg Cys Val Arg Arg Aan Pro Ser Ala Asn 370 375 330

Thr Phe Leu His Leu Asn Ala Ser Ser Phe Arg Leu Val Pro Gly Hia 335 390 395 400

Thr Pro Ser Glu Pro Gin Leu Arg Pro Glu Gly Gin Leu Ser Glu Ala 4D5 410 415

Asp Leu Asn Tyr Leu Gin Lys His Phe Arg Cys Gin Cys Tyr Leu Gly 420 425 430

Trp Gly Gly Glu Gin Cys Gin Arg Asn Tyr Lys Gly Ala Ala Gly Asn 435 440 445

Ala Ser Arg Ala Trp Ala Gly Ser His Leu Thr Ser Leu Leu Gly Leu 450 455 460

Val Ala Val Ala Leu Thr Trp Thr I.eu 465 470

<210> 19 <211> 412 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0> <223> hialurinidase 3 <4 Ο 0> 19

Met lie Met His Leu Gly Leu Met Met Val Val Gly Leu Thr Leu Cys 1 5 10 15

Leu Met His Gly Gin Ala Leu Leu Gin Val Pro Glu His Pro Fhe Ser 20 25 30

Val Val Trp Asn Val Pro Ser Ala Arg Cys Lys Ala His Fhe Gly Val 35 40 45

His Leu Pro Leu Asp Ala Leu Gly lie Val Ala Asn His Gly Gin His 50 55 60

Phe His Gly Gin Asn lie Sec lie Phe Tyr Lys Asn Gin Phe Gly Leu 65 70 75 Θ0

Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Arg Gly Thr Ala His Asn Gly Gly lie Pro 85 90 95

Gin Ala Val Ser Leu Asp His His Leu Ala Arg Ala Ala His Gin lie 100 105 110

Leu His Ser Leu Gly Ser Ser Phe Ala Gly Leu Ala Val Leu Asp Trp 115 120 125

Glu Glu Trp Tyr Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Pro His Arg Gin 130 135 140

Val Tyr Leu Ala Ala Ser Trp Val Trp Thr Gin Gin Met Phe Pro Gly 145 150 155 160

Leu Asp Pro Gin Glu Gin Leu His Lys Ala His Thr Ser Phe Glu Gin 165 no ns

Ala Ala Arg Ala Leu Met Glu Tyr Thr Leu Gin Leu Gly Arg Thr Leu

1B0 135 19C

Arg Pro Ser Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Arg Tyr Pro Aia Cys Gly Asn 195 200 205

Gly Trp His Lys Met Ala Ser Asn Tyr Thr Gly His Cys His Ala Ala

210 215 22G lie Thr Thr Gin Asn Thr Gin Leu Arg Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser 225 230 235 240

Ala Leu Phe Pro Ser lie Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Pro Leu Ala Tyr 24 5 250 255

Arg Gin Ala Phe Val Arg His Arg Le.u Glu Glu Ala Phe Arg Val Ala 260 265 270

Lsu Leu Glu Hia Ser His Pro Leu Pro Val Leu Ala Tyr Ser Arg Leu 275 280 295

Thr Hia Arg Ser Ser Gly Arg Phe Leu Ser Leu Asp Asp Leu Met Gin 290 295 300

Thr lie Gly Val Ser Ala Ala Leu Gly Thr Ala Gly Val Val Leu Trp 335 310 315 320

Gly Asp Leu Ser Phe Ser Ser Ser Glu Glu Lys CyS Trp Arg Leu Hia 325 330 335

Asp Tyr leu Val Gly Thr Leu Gly Pro Tyr Val lie Asn Val Thr Lys 340 345 350

Ala Asp Met Ála Cys Ser His Gin Arg Cys· His Gly His Gly Arg Cys 355 360 365

Ala Arg Lys Asp Pro Gly Gin Met Glu Ala Phe Leu His Leu Gin Pro 370 375 380

Asp Asp Ser Leu Gly Ala Trp Asn Ser Phe Arg Cys His Cys Tyr Ser 385 390 395 400

Gly Trp Ala qiy Pro Thr Cys Leu Glu Pro Lys Pro

405 41C <210> 20 <211> 435 <212> PRT <213> Sus scrofa <22 0> <223> hialuronidase <4Ο0> 20

Met Ala Ala His Leu Leu Pro lie Cys Tlir Leu Phe Leu Asn Ijbu Leu IS 10 15

Ser Val Ala Gin Gly Ser Arg Asp Pro Val Val Leu ASH Arg Pro Phe 20 25 30

Thr Thr lie Tip Asn Ala Asn Thr Gin Trp Cys Leu Lys Arg His Gly 35 40 45

Val Asp Val Asp Val Ser Val Phe Glu Val Val Val Asn Pro Gly Gin 50 55 60

Thr Phe Arg Gly Pro Asn Met Thr Tie Phe Tyr Ser Ser Gin Leu Gly 65 70 75 80

Thr Tyr Pro Tyr Tyr Thr Ser Ala Gly Glu Pro Val phe Gly Gly Leu 85 90 95

Pro Gin Asn Ala Ser Leu Asp Val His Leu Asn Arg Thr Phe Lys Asp 100 105 110 lie Lev Ala Ala Met Pro Glu Ser Asn Phe Ser Gly Leu Ala Val He 115 120 125

Asp Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Ala Lys 130 135 140

Asp lie Tyr Arg Gin Arg Ser Arg Ala Leu Val Gin Lys Gin His Pro 145 150 155 160

Asp Trp Pro Ala Pro Trp Val Glu Ala Ala Ala Gin Asp Gin Phe Gin 165 170 175

Glu Ala Ala Gin Thr Trp Met Ala Gly Thr Leu Lys Leu Cly Gin Thr 180 185 190

Leu Arg Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Gly Phe pro Asp Cys Tyr 195 200 205

Asn Tyr Asp Phe Gin Ser Ser Asn Tyr Thr Gly Gin Cys Pro Pro Gly 210 215 220 val Ser Ala Gin Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Gly Gin Ser Arg 225 230 235 240

Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Pro Ser Ala Leu Glu Gly Thr Asn 245 250 255

Lys Thr Gin Leu Tyr Val Gin His Arg Val Asn Glu Ala Phe Arg Val 260 265 270

Ala Ala Ala Ala Gly Asp Pro Asn Leu Pro Val Leu Pro Tyr Ala Gin 275 280 285 lie Phe His Asp Met Thr Asn Arg Leu Leu Ser Arg Glu Glu Leu Glu 290 295 300

His Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gin Gly Ala Ala Gly Val Val Leu 305 310 315 320

Trp Val Ser Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gir. Ser lie 325 330 335

Lys Glu Tyr Val Asp Tlir Thr Leu Gly Pro Phe lie Leu Asn Val Thr 340 345 3SD

Ser Gly Ala Leu Leu Cys Ser Gin Ala Val Cys Ser Gly His Gly Arg 355 360 365

Cys Val Arg Arg Pro Ser His Thr Glu Ala Leu Pro lie Leu Asn Pro 370 375 380

Ser Ser Phe Ser lie Lys Pro Thr Pro Gly Gly Gly Pro Leu Thr Leu 385 390 395 400

Gin GLy Ala Leu Ser Leu Lys Asp Arg Val Gin Met Ala Glu Glu Phe 405 410 415

Gin Cys Arg Cy3 Tyr Pro Gly Trp Arg Gly Thr Trp Cys Glu Gin Gin 420 425 " 430

Gly Thr Arg 435 <210> 21 <211> 419 <212> PRT <213> Sus scrofa <22 0> <223> hialuronidase 3 <4Ο0> 21

Met Thr Met Gin Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Gly Val Ala Met Cys IS 10 15

Leu Gly Cys Gly Gin Pro Leu Leu Arg Ala Pro Glu Arg Pro Phe Cys 20 25 30

Val Leu Trp Asn Val Pro Ser Ala Arg Cys Lys Ala Arg Phe Gly Val 35 40 45

His Leu Pro Leu Glu Ala Leu Gly He Thr Ala Asn His Gly Gin Arg SO 55 60

Phe His Gly Gin Asn lie Thr lie Phe Tyr Lys Ser Gin Leu Gly Leu 65 70 75 80

Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Arg Gly Thr Ala His Aar, Gly Gly lie Pro 85 90 95

Gin Ala Val Ser Leu Asp His His Leu Ala Arg Ala Ala Tyr Gin lie 1O0 105 110

His Arg Ser Leu Arg Pro Gly Phe Thr Gly Leu Ale Val Leu Asp Trp 115 120 125

Glu Glu Trp Cys Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Arg Arg Gin Ala 130 135 140

Tyr Gin Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ala Gin Atq Val Tyr Pro Asn Leu 145 150 155 160

Asp Pro Gin Glu Gin Leu Cys Lys Ala Arg Ala Gly Phe Glu Glu Ala 165 170 175

Ala Arg Ala Leu Met Glu Asp Thr Leu Arg Leu Gly Arg Met Leu Arg 160 135 190

Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr His Tyr PtO Ala Cys Gly Asn Gly 195 200 205

Trp His Giy Thr Ala Ser Asri Tyr Thr Gly His Cys His Ala Ala Ala 210 215 220

Leu flla Arg Asn Thr Gin Leu Tyr Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser Ala 225 230 235 240

Leu Phe Pro Ser He Tyr leu Pro Pro Gly Leu Pro Pro Ala Tyr His 245 250 255

Gin Ala Phe Val Arg Tyr Arg Leu Glu Glu Ala Phe Arg Val Ala Leu 260 265 270

Val Gly His Pro His Pro Leu Pro Val Leu Ala Tyr Ala Arg Leu Thr 275 280 205

His Arg Asn Ser Gly Arg Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Gin Thr 290 29S 300 lie Gly Val Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ser Gly Val Val Leu Trp Gly 3Q5 310 315 320

Asp Leu Ser Phe Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp His Leu Arg Gly 325 330 335

Tyr Leu Val Gly Thr Leu Gly Pro Tyr Val lie Asn Val Thr Arg Ala 340 345 350

Ala Met Ala Cya ser His Gin Arg Cys His Gly His Gly Arg Cys Ala 355 360 365

Trp Gin Asp Pro Gly Gin Leu lys Val Phe Leu His Leu His Pro Gly 370 375 360

Gly Ser Pro Gly Ala Trp Glu Ser Phe Ser Cys Arg Cys Tyr Trp Gly 385 390 395 400

Trp Ala Gly Pro Thr Cys Gin Glu Pro Arg Pro Glu Leu Gly Pro Glu 405 410 415

Glu Ala Thr

<210> 22 <211> 449 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <22 0> <223> hialuronidase 1 <4Ο0> 22

Met Lys Pro Phe Ser Pro Glu Val Ser Pro Asp Pro Cys pro Ala Thr 1 5 10 15

Ala Ala His Leu Leu Arg Thr Tyr Thr Leu ?he Leu Thr Leu Leu Glu 20 25 30

Leu Ala Gin Gly Cys Arg Gly Ser Met Val Ser Asn Arg Pro Plie lie 35 40 45

Thr Val Trp Asn Ala Asp Thr His Trp Cys Leu Lys Asp His Gly Val 50 55 60

Asp Val Asp Val Ser Val Phe Asp Val Val Ala Asn Lys Glu Gin Asn 65 70 75 80

Phe Gin Gly Fro Asn Met Thr lie Phe Tyr Arg Glu Glu Leu Gly Thr Θ5 90 95

Tyr Pro Tyr Tyr Thr Pro Thr Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu Pro 100 105 110

Gin Asn Ala Ser Leu Val Thr His Leu Ala His Ala Phe Gin Asp Tie 115 120 125

Lys Ala Ala Met Pro Glu Pro Asp Phe Ser Gly Leu Ala Val He Asp 130 135 140

Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Ser Lys Asp 145 150 155 160 11« Tyr Gin Gin Arg Ser Met Glu Leu Val Arg Ala Glu His Pro Asp 155 170 175

Trp Pro Glu Thr Leu Val Glu Ala Glu Ala Gin Gly Gin Phe Gin Glu ISO 185 190

Ala Ala Glu Ala Trp Met Ala Gly Thr Leu Gin Letl Gly Gin Val leu 195 200 205

Arg Pro Arg Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr Asn 210 215 220

Tyr Asp Phe Leu Ser Pro Asn Tyr Thr Gly Gin Cys Ser Leu Ser lie 225 230 235 240

His Asp Gin Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Asn Gin Ser Tyr Ala 245 25C 255

Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Pro Ala Ala Leu Met Gly Thr Gly Lys 260 265 270

Ser Gin Met Tyr Val Arg Tyr Arg Val Glr. Glu Ala Phe Arg Leu Ala 275 260 285

Leu Val Ser Arg Asp Pro His Val Pro lie Met Pro Tyr Val Gin lie 290 295 300

Phe Tyr Glu Lys Thr Asp Tyr Leu Leu Pro Leu Glu Glu Leu Glu His 305 310 315 320

Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gin Gly Ala Ala Gly Ala Val Leu Trp 325 330 335 lie 5er Ser Glu Lys Thr Ser Thr Lys Glu Ser Cys Gin Ala lie Lys 340 345 350

Ala Tyr Met Asp Ser Thr Leu Gly Pro Phe lie Leu Asn Val Thr Ser 355 360 365

Ala Ala Leu Leu Cys Ser Glu Ala Leu Cys Ser Gly Arg Gly Arg Cys 370 375 380

Val Arq His Pro Ser Tyr Pro Glu Ala Leu Leu Thr Leu Ser Pro Ala 385 390 395 400

Ear Phe Ser lie Glu Pro Thr His Asp Gly Arg Pro Leu Ser Leu Lys 405 410 415

Gly Thr Leu Ser Leu Lys Asp Arg Ala Gin Met Ala Met Lys Fhe Lys 420 425 430

Cys Arg Cys Tyr Arg Gly Trp Ser Gly Glu Trp Cys Lys Lys Gin Asp 435 440 445

Met

<210> 23 <211> 473 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <22 0> <223> hialuronidase 2 <4Ο0> 23

Met Arg Ale Gly Leu Gly Pro He lie Thr Leu. Ala Leu Val Leu Glu 15 10 15

Val Ala Trp Ala Ser Glu Leu Lys Pro Thr Ala Fro Fro lie Phe Thr 20 25 30

Gly Arg Fro Phe Val Val Ala Trp Aan Val Pro Thr Gin Glu Cys Ala 35 4 0 45

Pro Arg His Lys Val Pro Leu Asp Leu Arg Ala Phe Asp Val Glu Ala 50 55 60

Thr Pro Asn Glu Gly Phe Phe Asn Gin Asn lie Thr Thr Phe Tyr Tyr 65 70 15 80

Asp Arg leu Gly Leu Tyr Pro Arg Phe Asp Ala Ala Gly Met Ser Val 35 90 55

His Gly Gly Val Pro Gin Asn Gly Ser Leu Cys Ala His Leu Pro Met 100 1Π 5 HO

Leu Lys Glu Ala Val Glu Arg Tyr lie Gin Thr Gin Glu Pro Ala Gly 115 120 125

Leu Ala Val lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Val Trp Val Arg Asn 130 135 HO

Trp Gin Glu Lys Asp Val Tyr Arg Gin Ser Ser Arg Gin Leu Val Ala 145 150 155 160

Ser Arg Mrs Pro Asp Trp Pro Ser Asp Arg lie Val Lys Gin Ala Gin 165 170 175

Tyr Glu Phe Glu Phe Ala Ala Arg Gin phe Met Leu Asn Thr Leu Arg 180 185 190

Tyr Val Lys Ala Val Arg Pro Gin His Leu Trp Gly Fhe Tyr Leu Phe 19S 200 205

Pro Asp Cys Tyr Asn His Asp Tyr Val Gin Asn Trp Asp Ser Tyr Thr 210 215 220

Gly Arg Cys Pro Asp Val Glu Val Ala Gin Asn Asp Gin Leu Ala Trp 225 230 235 240

Leu Trp Ala Glu Asn Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Asp Lys 245 250 255

Thr Leu Ala Ser Ser Lys His Ser Arg Asn Phe Val Ser phe Arg Val 260 265 270

Gin Glu Ala Leu Arg Val Ala His Thr His His Ala Asn His Ala Leu 275 280 205

Pro Val Tyr Val Phe Thr A.rg Pro Thr Tyr Thr Arg Arg Leu Thr Glu 290 295 300

Leu Asn Gin Met Asp r.eu lie Ser Thr lie Gly Glu Ser Ala Ala Leu 305 310 315 320

Gly Ser Ala Gly val He Fhe Trp Gly Asp ser Val Tyr Ala Ser Ser 325 330 335

Met Glu Asn Cys Gin Asn Leu Lys Lys Tyr Leu Thr Gin Thr Leu Val 340 345 350

Pro Tyr lie Val Asn Val Ser Trp Ala Thr Gin Tyr Cys Ser Trp Thr 355 360 365

Glu cys His Gly His Gly Arg Cys val Arg Arg Asn Pro Set Ala Ser 370 375 380

Thr Phe Leu His Leu Ser Pro Ser Ser Phe Arg Leu Val Pro GLy Arg 385 390 395 400

Thr Pro Ser Glu Pro Gin Leu Arg Pro Glu Gly Glu Leu Ser Glu Asp 405 410 415

Asp Leu Ser Tyr Leu Gin Met His Phe Arg Cys Hia Cys Tyr Leu Gly 420 425 430

Trp Gly Gly Glu Gin Cys Gin Trp Asn His Lys Arg Ala Ala Gly Asp 435 440 445

Ala Ser Arg Ala Trp Ala Gly Ala His Leu Ala Ser Leu Leu Gly Leu 450 455 460

Val Ala Met Thr Leu Thr Trp Thr Leu 465 470

<210> 24 <211> 412 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <22 0> <223> hialuronidase 3 <4Ο0> 24

Met lie Thr Gin Leu Gly Leu Thr Leu Val Val Gly Leu Thr Leu Cya 15 10 15

Leu Val His Val Gin Ala Leu Leu Gin Val Pro Glu Phe Pro Pile Ser 20 25 30

Val Leu Tip Asn Val Pro Ser Ala Arg Cys Lys Thr Arg Phe Gly Val 35 40 45

His Leu Pro Leu Asp Ala Leu Gly lie He Ala Asn His Gly Gin Arg 50 55 60

Phe His Gly Gin Asn lie Thr lie Phe Tyr Lys Asn Gin Phe Gly Leu 65 70 75 80

Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Arg Gly Thr Ala His Asn Gly Gly lie Pro 85 90 95

Gin Ala Val Ser Leu Asp His His Leu Ala Gin Ala Ala His Gin He 100 105 110

Leu His Asn Leu Gly Ser Ser Phe Ala Gly Leu Ala Val Leu Asp Trp 115 120 125

Glu Glu Trp Tyr Pro Leu 'Irp Ala Gly Asn Trp Gly Thr His Arg Gin 130 135 140

Val Tyr Gin Ala Ala Ser Trp Ala Trp Ala Gin Gin Met Phe Pro Asp 145 150 155 160

Leu Asn Pro Gin Glu Gin Leu His Lys Ala Gin Thr Gly Phe Glu Gin 165 170 175

Ala Ala Arg Ala Leu Met Glu His Thr Leu Arg Leu Gly Gin Met Leu 180 185 190

Arg Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Arg Tyr Pro Val Cys Gly Asn 195 200 205

Gly Trp His Asn Met Ala Ser Asn Tyr Thr Gly His Cys His Pro Ala 210 215 220 lie lie Thr Arg Asn Thr Gin Leu Arg Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser 225 230 235 240

Ala Leu Phe Pro Ser He Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Pro Pro Ala Tyr 245 250 255

His Gin Thr Phe Val Arg His Arg Leu Glu Glu Ala Phe Arg Val Ala 260 265 270

Leu Thr Gly His Ala His Pro Leu Pro Val Leu Ala Tyr Val Arg Leu 275 280 285

Thr His Arg Ser Ser Gly Arg Phe Leu Ser Leu Asp Asp Leu Met Gin 290 295 300

Thr lie Gly Val Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ala Gly Val Val Leu Trp 305 310 315 320

Gly Asp Leu Ser Val Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp Arg Leu His 32S 330 335

Asp Tyr Leu Val Gly Thr Leu Gly Pro Tyr Val lie Asn Val Thr Lys 340 345 350

Ala Ala Thr Ala Cys Ser His Gin Arg Cys His Gly His Gly Arg Cys 355 360 365

Ser Trp Lys Asp Pro Gly Gin Met Glu Ala Phe Leu His Leu Gin Pro 370 375 300

Asp Asp Asn Leu Gly Ala Trp Lys Ser Phe Arg Cys Arg Cy3 Tyr Leu 385 390 395 400

Gly Trp Ser Gly pro Thr Cys Leu Glu Pro Lys Pro 405 410

<210> 25 <211> 545 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <22 0> <223> PH20 <4Ο0> 25

Met Cly Val liCU Lys Phe Lys His lie Phe Phe Gly Ser Ala Val Glu 1 5 10 15

Leu £er Gly Val Phe Gin He Val Phe lie Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Ala Asn Pile Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 4b

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Tbr Glu Phe Cys Leu Gly Lys Ser 50 55 60

Gly Glu Pro Leu Asp Met Ser leu phe Ser Leu Phe Gly Ssr Pro Arg G5 70 75 80

Lys Asn Lys Thr Gly Gin Gly lie Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 10 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Pro His Thr Gly Ala Ila Val His Gly 100 105 110

Arg lie Pro Gin Leu Gly Pro Leu Gin Gin His Leu Thr Lys Leu Arg 115 120 125

Gin Glu He Leu Tyr Tyr net Pro Lys Asp Asn. val Gly Leu Ala val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Leu Pro Thr Trp Leu Arg Asn Trp Lys Pro

145 150 155 16C

Lys Asp lie Tyr Arg lie lys Ser lie Glu Leu Val Lys Ser Gin His 165 170 175

Pro Gin Tyr Asn His Ser Tyr Ala Thr Glu Lys Ala Lys Arg Asp Phe 182 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Met Glu Glu Thr Leu Lys Leu Gly Arg 155 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Asp Lys Fro Asn Leu Tyr Lys Gly Ser Cys Phe 225 230 235 240

Asp lie Glu Lys Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Lys Glu 245 250 255

Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Thr Ser Arg Ala Arg Ser 260 265 270

Ala Thr Ala Leu Ser Lys Leu Tyr val Val Arg Asn Arg Val His Glu 275 280 285

Ala lie Arg Val Ser Lys He Pro Asp Asp Lys Ser Pro Leu Pro Asn 290 295 300

Phs Val Tyr Thr Arg Leu Val Phe Thr Asp Gin lie Phe Gin Phe Leu 305 310 315 320

Ser His His Asp Leu Val Tyr Thr lie Gly Glu He val Ala Leu Gly 325 330 335

Ala Ser Gly He Val Val Trp Gly Ser Gin Ser Leu Ala Arg Ser Met 340 345 350

Lys Ser Cys Leu His Leu Asp Asn Tyr Met Lys Thr He Leu Asn Pro 355 360 365

Tyr Leu lie Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Asn Gin Val Leu 370 375 380

Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys Thr Arg Lys Asn Trp Asn Pro Asn Asp 385 390 395 400

Tyr Leu Hia Leu Asn Fro Gly Asn Phe Ala lie Gin Leu Gly Ser Asn 405 410 415

Gly Thr Tyr Lys Val Asp Gly Lys Pro Thr Leu Thr Asp Leu Glu Gin 420 425 430

PtiB Ser Lys Asn Phe Gin Cys Ser Cys Tyr Thr Asn Leu Asn Cys Lys 435 440 445

Glu Arg Thr Asp Met Asm Asn Val Arg Thr Val Asn Val Cys Ala Val 450 455 460

Glu Asn Val Cys lie Aap Thr Asn Vai Gly Fro Gin Ala Val Thr Tyr 465 470 475 480

Ala Pro Lys Glu Lys Lya Aap Val Ala His lie Leu Ser Asn Thr Thr 485 490 495

Ser He Asn Ser Ser Thr Thr Met Ser Leu Pro Phe Pro Arg Lys His .500 505 510

Val Set Gly Cys Leu Leu Val Leu Cys Met Tyr Ser Gin Tyr Leu Asn 515 520 525 lie Cys Tyr Arg Leu Val Ala He Gly Tie Gin His Gly Tyr Tyr Leu 530 535 540

Lys 54 5 <210> 26 <211> 476 <212> PRT <213> Ovis aries <22 0> <223> hialuronidase 2 <400> 26

Met Trp Tbr Gly Leu Gly Pro Ala Val Thr Leu Ala Leu Val Leu Val IS 10 15

Val Ala Trp Ala Thr Glu Leu lys Pro Thr Ala Pro Pro lie Fhe Thr 20 25 30

Gly Arg Pro Phe Val Val Ala Trp Asp Val Pro Thr Girt Asp Cys Gly 35 4 0 45

Pro Arg His Lys Met Pro Leu Asp Pro Lys Asp Met Lys Ala Phe Asp 50 55 60

Val Gin Ala Ser Pro Asn Glu Gly Phe Val Asn Gin Asn lie Thr lie

65 TO 75 SO

Phe Tyr Arg Asp Arg Leu Gly Met Tyr Pro His Phe Asn Ser Val Gly Θ5 90 95

Arg Ser Val His Gly Gly Val Pro Gin Asn Gly Ser Leu Trp Val His ΐοα 105 110

Leu Glu Met Leu Lys Gly His Val Glu His Tyr lie Arg Thr Gin Glu 115 120 125

Pro Ala Gly Leu Ala Val lie Asp Trp Glu Asp Trp Arg Pro Val Trp 130 13b 140

Val Arg Asn Trp Gin Asp Lys Asp Val Tyr Arg Arg Leu Eer Arg Gin 145 150 155 160

Leu Val Ala Ser His His Pro Asp Trp Pro Pro Glu Arg lie Val Lys

165 ' 1TC ITS

Glu Ala Gin Tyr Glu Phe Glu Phe Ala Ala Arg Gin Phe Met Leu Glu 100 105 190

Thr Leu Arg Fhe Val Lys Ala Phe Arg Pro Arg His Leu Trp Gly Phe 195 200 205

Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His Asp Tyr Val Gin Asn Trp Glu 210 215 220

Thr Tyr Thr Gly Arg Cys Pro Asp Val Glu Val Ser Arg Asn Asp Gin 225 230 235 240

Leu Ser Trp Leu Trp Ala Glu Ser Tht Ala Leu Fhe Pro Ser Val Tyr 245 250 255

Leu Glu Glu Thr Leu Ala Ser Ser Thr His Gly Arg Asn Phe Val Ser 260 265 270

Phe Arg Val Gin Glu Ala Leu Arg Val Ala Asp Val Kis His Ala Asn 275 2 B0 265

His Ala Leu Pro Val Tyr Val Phe Thr Arg Pro Thr Tyr Ser Arg Gly 290 295 300

Leu Thr Gly Leu Ser Glu Met Asp Leu lie Ser Thr lie Gly Glu Ser 305 310 315 320

Ala Ala leu Gly Ala Ala Gly Val lie Leu Trp Gly Asp Ala Gly Phe 325 330 335

Thr Thr Ser Asn Glu Thr Cys Arg Arg Leu Lys Asp Tyr Leu Thr Arg 340 345 350

Ser leu Val Pro Tyr Val Val Asn Val Ser Trp Ala Ala Gin Tyr Cys 355 360 365

Ser Trp Ala Gin Cys His Gly His GLy Arg Cys Val Arg Arg Asp Pro 370 375 300

Asn Ala His Thr Phe Leu His Leu Ser Ala Ser Ser Phe Arg Leu Val 335 390 395 400

Pro Ser His Ala Pro Asp Glu Pro Arg Leu Arg Pro Glu Gly Glu Leu 405 410 415

Ser Trp Ala Asp Arg Asn His Leu Gin Thr His Phe Arg Cys Gin Cys 420 425 430

Tyr Leu Gly Trp Gly Gly Glu Gin Cys Gin Trp Asp Arg Arg Arg Ala 435 440 445

Ala Gly Gly Ala Ser Gly Ala Trp Ala Gly Ser His Leu Thr Gly Leu 450 455 460

Leu Ala Val Ala Val Leu Ala Phe Thr Trp Thr Ser 465 470 475 <210> 27 <211> 114 <212> PRT <213> Ovis aries <22 0> <223> sequência parcial de PH20 <4Ο0> 27

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ale lie Arg Leu Ser Lys lie 1 5 10 15

Ala Ser Val Glu Ser Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr His Arg Pro Val 20 25 30

Phe Thr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Leu Ser Gin Gly Asp Leu Val Asn 35 40 45

Ser Val Gly Glu He Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie lie Met Trp 50 55 60

Gly Ser Leu Asn Leu Ser Leu Thr Met Gin Ser Cys Met Asn Leu Gly 65 70 75 80

Asn Tyr Leu Asn Thr Thr Leu Asm Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu Θ5 93 95

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 100 105 HO lie Arg

<210> 28 <211> 414 <212> PRT <213> Pongo pygmaeus <22 0> <223> hialuronidase 3 <4Ο0> 28

Met Thr Thr Arg Leu Gly Pro Ala Leu Val Leu Gly Val Ala Leu Cys 15 10 IS

Leu Gly Cys Gly Gin Pro Leu Pro Gin Val Pro Glu Arg Pro Phe Ser 20 25 30

Val Leu Trp Asn Val Pro Ser Ala His Cys Lys Ser Arg Phe Gly Val 35 40 45

His Leu Pro Leu Asn Ala Leu Gly lie He Ala Asn Arg Gly Gin His 50 55 $0

Phe His Gly Gin Asn Met Thr Tie Phe Tyr Lys Asn Gin Leu Gly Leu 65 10 75 80

Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Lys Gly Thr Ala His Asn Gly Gly lie Pro 85 90 95

Gin Ala Leu Pro Leu Asp Arg His Leu Ala Leu Ala Ala Tyr Gin lie 1Q0 105 110

His His Ser Leu Arg Pro Gly Phe Ala Gly Pro Ala Val Leu Asp Trp 115 120 128

Glu Glu Trp Cys Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Arg Arg Arg Ala

130 135 HO

Tyr Gin Ala Ala Ser Trp Ala Trp Ala Gin Gin Val Phe Pro Asp Leu 145 150 155 160

Asp Pro Gin Glu Gin Leu Tyr Lys Ala Tyr Thr Gly Phe Glu Gin Ala 165 170 175

Ala Arg Ala Leu Met Glu Asp Thr Leu Arg Val Ala Gin Ala Leu Arg 180 IBS 190

Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr His Tyr Pro Ala Cys Gly Asn Gly 195 200 205

Trp His Ser Met Ala Ser Asn Tyr Thr Gly Arg Cys His Ala Ala Thr 210 215 220

Leu Ala Arg Asn Thr Gin Leu His Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser Ala 225 230 235 240

Leu Phe Pro Ser lie Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Pro Pro Ala His His 245 250 255

Gin Ala Phe Val Arg His Arg Leu Glu Glu Ala Phe Arg Val Ala Leu 260 265 270

Val Cly His Leu Pro Val Leu Ala Tyr Val Arg Leu Thr His Arg Arg 215 200 205

Ser Gly Arg Phe Leu Ser Gin Asp Asp Leu Val Gin Thr He Gly val 290 295 300

Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ala Gly Val Val Leu Trp Gly Asp Leu Ser 305 310 315 3?0

Leu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp His Leu His Asp Tyr Leu Val 325 330 335

Asp Thr Leu Gly Pro Tyr Gly lie Asn Val Thr Arg Ala Ala Met Ala

340 345 35 D

Cys Ser His Gin Arg Cys His Gly His Gly Arg Cys Ala Arg Arg Asp 355 360 365

Pro Cly Gin Met Glu Ala Phe Leu His Leu Trp Pro Asp Gly Ser Leu 370 3ΤΞ 380

Gly Asp Trp Lys Ser Phe Ser Cys His Cys Tyr Trp Cly Trp Ala Gly 385 390 395 400

Fro Thr Cys Gin Glu Pro Arg Leu Gly Pro Lys Glu Ala Val 405 410

<210> 29 <211> 510 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <22 0> <223> PH20 <4Ο0> 29

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe VaL Lys 1 5 10 15 5er Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu He Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro lie lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Clu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asn Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Thr Leu Met Gly Ser Pro Arg 65 30 75 80

He Asn Val Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 05 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Leu Thr Thr Gly Val Thr Val His Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys Val Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ser Lys 115 120 125

Gin Asp lie Leu Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Pro Gin Ala Thr Asp Lys Ala Lys Gin Glu Phe 1Θ0 105 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Pha Met Leu Glu Thr lie Lys Leu Gly Arg 195 200 205

Ser Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Arg Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asp 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Val Val 260 265 270

Val Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Tie Arg Val 275 280 2Θ5

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Asn Pro Leu Pro Val Phe val Tyr Ala 29D 295 300

Arg Leu Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Arg Glu Glu 305 310 315 320

Leu Val Ser Thr Leu Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala ser Gly He 325 330 335

Val He Trp Gly Ser Leu set lie Thr Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Thr Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr lieu Ala Ala Lys Met Cya Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys He Arg Lys Asp Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Aap lie Arg Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val His Gly Lys Pro Thr Val Glu Asp Leu Glu Glu Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Thr Asn Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Ser Leu Lys Pro Pro Val Glu Thr Glu Gly Ser Pro Pro 465 470 475 480 lie Phe Tyr Αεπ Thr Ser Ser Ser Thr Val Ser Thr Thr Met Phe lie 485 490 495

Val Asn lie Leu phe Leu lie He Ser Ser Val Ala Sec Leu 500 505 510

<210> 30 <211> 529 <212> PRT <213> Cavia porcellus <22 0> <223> PH20 <400> 30

Met Gly Ala Phe Thr Phe Lys His Sec Phe Phe Gly Ser Phe Val Glu 1 5 10 15

Cys Ser Gly Val Leu Gin Thr Val phe lie Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Ala Asp Lys Arg Ala Pro Pro Leu He Pro Asn Val Pro Leu 35 40 45

Leu Trp Val Trp Asn Ala Pro Thr Glu Phe Cys lie Gly Gly Thr Asn 50 55 60

Gin Pro Leu Asp Met Ser Phe Phe Ser lie Val Gly Thr Pro Arg Lys 65 70 75 80

Asn lie Thr Gly Gin Ser lie Thr Leu Tyr Tyr Val Asp Arg Leu Gly 65 90 35

Tyr Tyr Fro Tyr lie Asp Pro His Thr Gly Ala lie Val His Gly Gly 100 105 110

Leu Pro Gin Leu Met Asn Leu Gin Gin His Leu Arg Lys Ser Arg Gin 115 120 125

Asp lie Leu Phe Tyr Met Fro Thr Asp Ser Val Gly Leu Ala Val He 130 135 140

Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Thr Arg Asn Trp Arg Pro Lys 145 150 155 160

Asp He Tyr Arg Asn Lys Ser lie Glu Leu Val Lys Ser Gin His Pro 165 170 175

Gin Tyr Asn His ser Tyr Ala Val Ala Val Ala Lys Arg Asp Phe Glu ISO 1Θ5 190

Arg Thr Gly Lys Ala Phe Met Leu Glu Thr Leu Lys Leu Gly Lys Ser 195 200 205

Leu Arg Pro Ser Ser Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr 210 215 220

Asn Thr His Phe Thr Lys Pro Asn Tyr Asp Gly His Cys Prc Pro lie 225 230 235 240

Glu Leu Gin Arg Asn Asn Asp Leu Gin Trp Leu Trp Asn Asp Ser Thr 245 250 255

Ala Leu Tyr Pro Ser Val Tyr Lev Thr Ser Arg Val Arg Ser Ser Gin 260 265 270

Asn Gly Ala Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val His Glu Ser lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys Leu Met Asp Asp Lys Asn Pro Leu Pro Tie Tyr Val Tyr lie 290 295 300

Arg Leu val Phe Thr Asp Gin Thr Thr Thr Phe Leu Glu Leu Asp Asp 305 310 315 ' 320

Leu Val His Ser Val Gly Glu lie Val Pro Leu Gly VaL Ser Gly lie 325 330 335 lie He Trp Gly Ser Leu Ser Leu Thr Arg Ser Leu VaL Ser Cys lie 340 345 350

Gly Leu Glu Asn Tyr Met Lys Gly Thr Leu Leu Pro Tyr Leu lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Gly Gin Val Leu Cys Lys Asn Gin 370 375 3R0

Gly lie Cys Thr Arg Lys Asp Trp Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Ala Thr Asn Phe Asp He Glu Leu Gin Gin Asn Gly Lys Phe Val 405 410 415

Val His Gly Lys Pro Ser Leu Glu Asp Leu Gin Glu Phe Ser Lys Asn 420 425 430

Phe His Cys Ser Cys Tyr Thr Asn Val Ala Cys Lys Asp Arg Leu Asp 435 440 445

Val His Asn Val Arq Ser Val Asn Val Cys Thr Ala Asn Asn lie Cys 450 455 460 lie Asp Ala Val Leu Asn Phe Pro Ser Leu Asp Asp Asp Asp Glu Pro 465 470 475 400

Pro He Thr Asp Asp Thr Ser Gin Asn Gin Asp Ser lie Ser Asp lie 485 490 195

Thr Ser Ser Ala Pro Pro Sex Ser His Tie Leu Pro Lys Asp Leu Ser 500 505 510

Trp CyS Leu Phe Leu Leu Ser Tie Phe Ser Gin His Trp LyS Tyr Leu 515 520 525

Leu <213> Rattus norvegicus <22 0> <210> 31 <211> 512

<212> PRT <223> PH20 <400> 31

Met Gly Glu Leu Gin Phe Lys Trp Leu Phe Trp Arg Ser Phe Ala Glu 15 10 15

Ser Gly Gly Thr Phe Gin Thr Val Leu lie Phe Leu Phe He Pro Tyr 20 25 30

Ser Leu Thr Val Asp Tyr Arg Ala Thr Pro Val Leu Ser Asp Thr. Thr 35 40 45

Phe Val Trp Val Trp Asti Val Pro Thr Glu Ala Cys Val Glu Asn Val 50 55 50

Thr Glu Pro lie Asp Leu Ser Phe Phe Ser Leu He Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80

Lys Thr Ala lie Gly Gin Pro Val Thr Leu Phe Tyr Val Asp Arg Leu 35 90 95

Gly Asn Tyr Pro His lie Asp Ala Gin Gin Thr Glu His His Gly Gly ICO 105 110 lie Pro Gin Lys Gly Asp Leu Thr Thr His Leu Val Lys Ala Lys Glu 115 120 125

Asp Val Glu Arg Tyr T.le Pro Thr Asp Lys Leu Gly Leu Ala He lie 13C 135 140

Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Met Arg Asn Trp "hr Pro Lys 145 150 155 150

Asp He Tyr Arg Asn Lys Ser He Glu Leu Val Gin Ala Ala Asp Pro

165 170 17S

Ala He Asn lie Thr Glu Ala Thr Val Arg Ala Lys Ala Gin Phe Glu 100 1B5 190

Gly Ala Ala Lys Glu Phe Met Glu Gly Thr Leu Lys Leu Gly Lys His 195 200 20S lie Arg Pro Lys His Leu Trp Gly Phe Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr 210 215 220

Asn Asn Lys Phe Gin Val Asp Asn Tyr Asp Gly Gin Cys Pro Asp Val 225 230 235 240

Glu Lya Lya Arg Asn Asp Asp Leu Asp Trp Leu Trp Lys Glu Ser Thr 245 250 255

Gly Leu Tyr Pro Ser Val Tyr Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ser Ser Arg 260 265 270

Lys Ala Thr Leu Tyr Val Arg Tyr Arg Val Leu Glu Ser lie Arg Val 275 230 285

Ser Lys Val Ser Asp Giu Ser Asn Pro Val Pro He Phe Val Tyr He 2S0 295 300

Arg Leu Val Phe Thr Asp His Val Ser Glu Tyr Leu Leu Glu Asp Asp 305 310 315 320

Leu Val Asn Thr lie Gly Glu lie Val Ala Gin Gly Thr Ser Gly He 325 330 335 lie He Trp Asp Ala Met Ser Leu Ala Gin Arg Ser Ala Gly Cys Pro 340 345 350

Tie Leu Arg Gin Tyr Met Lys Thr Thr Leu Asn Fro Tyr lie Val Ash 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Thr Leu Cys Lys Glu Lys 370 375 380

Gly Met Cys Ser Arg Lys Thr Glu Ser Ser Asp Ala Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asp Fro Ser Ser Phe Ser lie Asn Val Thr Glu Ala Gly Lys Tyr Glu 405 410 415

Val Leu Gly Lya Pro Glu Val Lya Asp Leu Glu Tyr Phe Ser Glu His 420 425 430

Phe Lys Cys Ser Cys Phe Ser Lys Met Thr Cys Glu Glu Thr Ser Asp 435 440 445

Met Arg Ser He Gin Asp Val Asn Val Cys Met Gly Asp Asn Val Cys 450 455 460 lie Lya Ala Thr Leu Gly Pro Asn Ser Ala Phe His Leu Leu Pro Gly 465 470 475 480

Lys Gly Leu Leu Leu Met Thr Thr Leu Ala His lie Leu His His Leu 485 490 495

Pro His Asp lie Phe Val Phe Pro Trp Lya Met Leu Val Ser Thr Pro 500 505 510 <210> 32 <211> 512

<212> PRT <213> Mus musculus <22 0> <223> PH20 <400> 32

Met Gly Glu Leu Arg Phe Lys His Leu Fhe Trp Gly Ser Phe Val Glu 1 5 10 IS

Ser Gly Gly Thr Phe Gin The Val Leu lie Phe Leu Leu He Pro Cys 20 25 30

Ser Leu Thr Val Asp Tyr Arg Ala Ala Pro lie Leu Ser Asn Thr Thr 35 40 45

Phe Leu Trp lie Trp Asn Val Pro Thr Glu Arg Cys Val Gly Asn Val 50 55 60

Asn Asp Pro He Asp leu Ser Phe Phe Ser Leu He Gly Ser Pro Arg 65 70 75 30

Lys Thr Ala Thr Gly Gin Pro Val Thr Leu Phe Tyr Val Asp Arg Leu H5 90 95

Gly Leu Tyr Pro His lie Asp Ala Asn Gin Ala Glu His Tyr Gly Gly 100 105 110 lie Pre Gin Arg Gly Asp Tyr Gin Ala His Leu Arg Lys Ala Lys Thr 115 120 125

Asp He Glu His Tyr lie Pro Asp Asp Lys Leu Gly Leu Ala lie lie 130 135 140

Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Leu Arg Asn Trp Lys Pro Lys 145 150 155 160

Asp Asn Tyr Arg Asn Lys Ser He Glu Leu Val Gin Ser Thr Asn Pro 165 170 175

Gly Leu Ser Tie Thr Glu Ala Thr Gin Lys Ala lie Gin Gin Phe Glu ISO 1S5 190

Glu Ala Gly Arg Lys Phe Met Glu Gly Thr Leu His Leu Gly Lys Phe 155 200 205

Leu Arg Pro Asn Gin Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr 210 215 220

Asn Asn Lys Phe Gin Asp Pro Lys Tyr Asp Gly Gin Cys Pro Ala Val 225 23C 235 240

Glu Lys Lys Arg Asn Asp Asn Leu Lys Trp Leu Trp Lys Ala Ser Thr 245 250 255

Gly Leu Tyr Pro Ser Val Tyr Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ser Asn Arg 260 265 270

Gin Ala Thr Leu Tyr Val Arg Tyr Arg Val Val Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys Val Gly Asn Ala Ser Asp Pro Val Pro He Phe Val Tyr He 290 295 300

Arg Leu Val Phe Thr Asp Arg Thr Ser Glu Tyr Leu Leu Glu Asp Asp 305 310 315 320

Leu Val Asn Thr lie Gly Glu lie Val Ala Leu Gly Thr Ser Gly He 325 330 335 lie lie Trp Asp Ala Met Ser Lou Ala Gin Arg Ala Ala Gly Cys Pro 340 345 350 lie Leu His Lys Tyr Met Gin Thr Thr Leu Asn Pro Tyr He Val Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Thr Leu Cys Asn Glu Lys 370 375 3 B0

Gly Met Cys Ser Arg Arg Lya Glu Ser Ser Asp Val Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Ser His Phe Asp lie Mat Leu Thr Glu Thr Gly Lys Tyr Glu 405 410 415

Val Leu Gly Asn Pro Arg Val Gly Asp Leu Glu Tyr Phe Ser Glu His 420 425 430

Phe Lys Cys Ser Cys Phe Ser Arg Met Thr Cys Lys Glu Thr Ser Asp 435 440 445

Val Lys Asn Val Gin Asp Val Asn Val Cys Val Gly Asp Asn Val Cys 450 455 460

Ile Lys Ala Lys Val Glu Pro Asn Pro Ala Phe Tyr Leu Leu Pro Gly 465 470 475 480

Lys Ser Leu Leu Phe Met Thr Thr Leu Gly His Val Leu Tyr His Leu 485 490 495

Pro Gin Asp Ile ?he Val Phe Pro Arg Lys Thr Leu Val Ser Thr Pro 500 505 510 <213> Staphylococcus aureus <22 0> <210> 33 <211> 807

<212> PRT <223> hialuronidase <400> 33

Met Thr Tyr Arg lie Lys Lys Trn Gin Lys Leu Sen Thr lie Thr Leu 1 5 10 15

Leu Met; Ala Gly Val lie Thr Leu Asn Gly Gly Glu Phe Arg Ser Val 20 25 30

Asp Lys His Gin lie Ala Val Ala Asp Thr Asn Val Gin Thr Pro Asp 35 40 45

Tyr Glu Lys Leu Arg Asn Thr Trp Leu Asp Val Asn Tyr Gly Tyr Asp 50 55 60

Lys Tyr Asp Glu Asn Asn Pro Asp Met Lys Lys Lys Phe Asp Ala Thr

65 70 75 SO

Glu Lys Glu Ala Thr Asn Leu Leu Lys Glu Met Lys Thr Glu Ser Gly 35 90 95

Arg Lys Tyr Leu Trp Ser Gly Ala Glu Thr Leu Glu Thr Asn Ser Ser 100 105 110

His Met Thr Arg Thr Tyr Arg Asn Tie Glu Lys lie Ala Glu Ala Met 115 120 125

Arg Asn Pro Lys Thr Thr Leu Asn Thr Asp Glu Asn Lys Lys Lys Val 130 135 140

Lys Asp Ala Leu Glu Trp Leu His Lys Asn Ala Tyr Gly Lys GLu Pro 145 150 155 160

Asp Lys Lys Val Lys Glu Leu Ecr Glu Asn Phe Thr Lys Thr Thr Gly 165 HO 175

Lys Asn Thr Asn Leu Asn Trp Trp Asp Tyr Glu lie Gly Thr Pro Lys 180 .105 190

Ser Leu Thr Asn Thr Leu lie Leu Leu Asn Asp Glr. Phe Ser Asn Glu 195 200 205

Glu Lys Lys Lys Phe Thr Ala Fro lie Lys Thr Phe Ala Pro Asp Ser 2L0 215 220

Asp Lye lie Leu Ser Ser Val Gly Lye Ala Glu Leu Ala Lys Gly Gly 225 230 235 240

Asn Leu val Asp He Ser Lys Val lys Leu Leu Glu Cys lie lie Glu 245 250 255

Glu Asp Lys Asp Met Met Lys Lys Ser lie Asp Ser Phe Asn Lys Val 260 265 2VO

Phe Thr Tyr Val Gin Asp Ser Ala Thr Gly Lys Glu Arg Aan Gly Phe 275 280 285

Tyr Lys Asp Gly Ser Tyr lie Asp His Gin Asp Val Pro Tyr Thr Gly 290 295 300

Ala Tyr Gly Val Val Leu Leu Glu Gly lie Ser Gin Met Met Pro Met 3C5 310 315 320 lie Lys GVu Thr Pre ?he Asn Asp Lys Thr Gin Asn Asp Thr Thr Leu 325 330 335

Lys Ser Trp Tie Asp Asp Gly Phe Met Pro Leu lie Tyr Lys Gly Glu 340 345 350

Met Met Asp Leu Ser Arg Gly Arg Ala lie Ser Arg Glu Asn Glu Thr 355 360 365

Ser His Ser Ala Ser Ala Thr Val Met Lys Sar Leu Leu Arg Leu Ser 310 315 380

Asp Ala Met Asp Asp Ser Thr Lys Ala Lys Tyr Lys Lys lie Val Lys 305 390 395 400

Ser Ser Val Glu Ser Asp Ser Ser Tyr Lys Gin Asn Asp Tyr Leu Asn 405 410 415

Ser Tyr Ser Asp lie Asp Lys Met Lys Ser Leu Met Thr Asp Asn Ser 420 425 430 lie Ser Lys Asn Gly Leu Thr Gin Gin Leu Lys lie Tyr Asn Asp Met 435 440 445

Asp Arg Val Thr Tyr His Asn Lys Asp Leu Asp Phe Ala Phe Gly Leu 450 455 460

Ser Met Thr Ser Lys Asn Val Ala Arg Tyr Glu Ser lie Asn Gly Glu 465 410 415 400

Asn Leu Lys Gly Trp His The Gly Ala Gly Met Ser Tyr Leu Tyr Asn 485 490 495

Ser Asp Val Lys His Tyr His Asp Asn Phe Trp Val Thr Ala Asp Met S00 505 510

Lys Arg Leu Ser Gly Thr Thr Thr Leu Asp Asn Glu lie Leu Lys Asp 515 520 525

Thr Asp Asp Lys Lys Ser Ser Lys Thr Phe Val Gly Gly Thr Lys Val 530 535 540

Asp Asp Gin His Ala Ser lie Gly Met Asp Phe Glu Asn Gin Asu Lys 545 550 555 560

Thr Leu Thr Ala Lys Lys Ser Tyr Phe He Leu Asn Asp Lys lie Val 565 510 515

Phe Leu Gly Thr Gly lie Lys Ser Thr Asp Ser Ser Lys Asn Pro Val 580 5Θ5 590

Thr Thr He Glu Asn Arg lys Ala Aan Gly Tyr Thr Leu Tyr Thr Asp 595 600 605

Asp Lys Gin Thr Thr Asn Ser Asp Asn Gin Glu Asn Asn Ser Val Phe 610 615 620

Leu Glu Ser Thr Asp Thr Lys Lys Asn lie Gly Tyr His Phe lbu Asn 625 630 635 640

Lys Pro Lys lie Thr Val Lys Lys Glu Ser His Thr Gly Lys Trp Lys 645 650 655

Glu He Asn Lys Ser Gin Lys Asp Thr Gin Lys Thr Asp Glu Tyr Tyr 660 665 610

Glu Val Thr Gin Lys His Ser Asn Ser Asp Asn Lys Tyr Gly Tyr Val 675 680 68$

Leu Tyr Pro Gly Leu ser Lys Asp Val Phe Lys Thr Lys Lys Asp Glu 690 695 700

Val Thr Val Val Lys Gin Glu Asp Asp Phe His Val Val Lys Asp Asn 705 HO 115 720

Glu Ser val Trp Ala Gly Val Asn Tyr Ser Asn Ser Thr Gin Thr Phe 725 730 735

Asp lie Asn Asrt Thr Lys Val Glu Val Lys Ala Lys Gly Met Phe He 740 745 750

Leu Lya Lys Lys Asp Asp Asn Thr Tyr Glu Cys Ser Phe Tyr Aan Pro 755 760 765

Glu Ser Thr Asn Ser Ala Ser Asp He Glu Ser Lys lie 5er Met Thr 770 775 780

Gly Tyr Ser lie Thr Asn Lys Aan Thr Ser Thr Ser Asn Glu Ser Gly 785 790 795 800

Val His Phe Glu Leu Thr Lys 805 <210> 34 <211> 371

<212> PRT <213> bacteriófago H4489A de Streptococcus pyogenes <22 0> <223> hialuronidase <400> 34

Met Thr Glu Asn lie Pro Leu Arg Val Gin Phe Lys Arg Met Ser Ala 15 IQ 15

Asp Glu Trp Ala Arg Ser Asp Val lie Leu Leu Glu Gly Glu He Gly 20 25 30

Phe Glu Thr Asp Thr Gly Phe Ala Lys Phe Gly Asp Gly Gin Asn Thr 35 40 45

Phe Ser Lys Leu Lys Tyr Leu Thr Gly Fro Lys Gly Pro Lys Gly Asp 50 55 60

Thr Gly Leu Gin Gly Lys Thr Gly Gly Thr Gly Pro Arg Gly Pro Ala 65 70 75 B0

Gly Lys Pro Gly Thr Thr Asp Tyr Asp Gin Leu Gin Asn Lys Pro Asp 85 90 95

Leu Gly Ala Phe Ala Gin Lys Glu Glu Thr Asn Ser Lys lie Thr Lys 100 105 110

Leu Glu Ser Ser Lys Ala Asp Lys Ser Ala Val Tyr Ser Lys Ala Glu 115 ‘ 120 125

Ser Lys lie Gil Leu Asp Lya Lys Leu 5er Leu Thr Gly Gly lie Val 130 135 140

Thr Gly Gin Leu Gin Phe Lys Pro Asn Lys Ser Gly He Lys Pro Ser 145 150 155 160

Ser Ser Val Gly Gly Ala lie Asn lie Asp Met Ser Lys Ser Glu Gly 165 170 175

Ala Ala Met Val Met Tyr Thr Asn Lys Asp Thr Thr Asp Gly Pro Leu 1B0 185 190

Met lie Leu Arg Ser Asp Lys Asp Thr Phe Asp Gin Ser Ala Gin phe 195 200 205

Val Asp Tyr Ser Gly Ly3 Thr Asn Ala Val Asn lie Val Met Arg Gin 210 215 220

Pro Ser Ala Pro Asn Phe Ser Ser Ala Leu Asn lie Thr Ser Ala Asn 225 230 235 240

Glu Gly Gly Ser Ala Met Gin lie Arg Gly Val Glu Lys Ala Leu Gly 245 250 255

Thr Leu Lys lie Thr His Glu Asn Pro Asn Val Glu Ala Lys Tyr Asp 260 265 270

Glu Asn Ala Ala Ala Leu See He Asp lie Val Lys Lys Gin Lys Gly 275 280 235

Gly Lys Gly Thr Ala Ala Gin Gly lie Tyr lie Asn Ser Thr Ser Gly 290 295 300

Thr Ala Gly Lys Met Leu Arg lie Arg Asn Lys Asn Glu Asp Lys Pha 305 310 315 320

Tyr Val Gly Pro Asp Gly Gly Phe His Ser Gly Ala Asn Ser Thr Val 325 330 335

Ala Gly Asn Leu Thr Val Lys Asp Pro Thr Ser Gly Lys His Ala Ala 340 345 350

Thr Lys Asp Tyr Val Asp Glu Lys He Ala Glu Leu lys bys Leu lie 355 360 365

Leu Lys Lys 370

<210> 35 <211> 1628 <212> PRT <213> Clostridium perfringens <22 0> <223> hialuronidase <4Ο0> 35

Met Asn Lys Asn lie Arg Lye lie lie Thr Sex Thr Val Leu Ale Ale 15 10 15

Met Thr lie Ser Val Leu Pro Ser Asn Leu Val Val Phe Ala Thr Asp 20 25 30

Gly lie Thr Glu Asn Phe Tyr Glu lie Tyr Pro Lys Pro Gin Glu lie 35 40 45

Ser Tyr Ser Gly Gly Glu Phe Gin He Ser Asp Glu lie Asn lie Val SO 55 60

Tyr Asp Asp Gly lie Asp Thr Tyr Thr Lys Lys Arg Val Asp Glu Val

55 70 75 BO I-eu Glu Ala Ser Asn Leu Glu Ala Thr Val Ser Asn Glu lie Val Pro 35 90 95

Gly Lys Thr Asn Phe Leu Val Gly lie Asn Glu Ser Gly Gly Val Val 1O0 105 110

Asp Asn Tyr Phe Asn Lys Asn lie Pro His Asp Glu Ser Phe Phe Asp 115 120 125

Glu Lys Met Asp Ala Asn lie Val Ser Val Lys Asp Gly Val lie Gly 130 135 140 val lie Gly Glu Asp Thr Asp Ssr Ala Phe Tyr Gly Val The Thr Leu 145 150 155 160

Lys His Val Phe Asn Gin Leu Glu Glu Gly Asn Lys lie Gin Ser Phe 165 170 175

Arg Ala Asp Asp Tyr Ala Glu Val Ala His Arg Gly Phe lie Glu Gly ISO 135 190

Tyr Tyr Gly Asn Pro Trp Ser A3h Glu Asp Arg Ala Glu Leu Met Lys 195 200 205

Phe Gly Gly Asp Tyr Lys Leu Asn Gin Tyr Val Phe Ala Pro Lys Asp 210 215 220

Asp Pro Tyr His Asn Scr Lys Trp Arg Asp Leu Tyr Pro Glu Glu Lys 225 230 235 240

Leu Ser Glu lie Lys Lys Leu Ala Gin Val Gly Asn Glu Thr Lys Asn 245 250 255

Arg Tyr Val Tyr Ala Leu His Pro Phe Met Asn Asn Pro Val Arg Phe 260 265 270

Asp Thr Glu Glu Asn Tyr Gin Asn Asp Leu Gly Val lie Lys Ala Lys 215 280 285

Phe Thr Gin Leu Leu Glu Asn Asp Val Arg Gin Phe Ala lie Leu Ala 290 295 300

Asp Asp Ala Ser Ala Pro Ala Gin Gly Ala Ser Met Tyr Val Lya Leu · 305 310 315 320

Leu Thr Asp Leu Thr Arg Trp Leu Glu Glu Gin Gin Ser Thr Tyr Pro 325 330 335

Asp Leu Ly3 Thr Asp Leu Met Phe Cys Pro Ser Asp Tyr Tyr Gly Asn 340 345 350

Gly Ser Ser Ala Gin Leu Lys Glu Leu Asn Lys Ala Glu Asp Asn Val 355 360 365

Ser He Val Met Thr Gly Gly Arg lie Trp Gly Glu Val Asp Glu Asn 370 375 380

Phe Ala Asn Asn Phe Met Asn Asn lie Ser Thr Glu Gly His Pro Gly 3Θ5 390 3 95 400

Arg Ala Pro Phe Phe Trp lie Asn Trp Pro Cys Ser Asp Aan Ser Lye 405 410 415

Gin His Leu He Met Gly Gly Asn Asp Thr Phe Leu His Pro Gly Val 420 425 430

Asp Pro Ser Lys lie Asp Gly lie Val Leu Asn Pro Met Gin Gin Ala 435 440 445

Glu Ala Asn Lys Ser Ala Leu Phe Ala lie Ala Asp Tyr Ala Trp Asn 450 455 460 lie Trp Asp Asn Lys Glu Glu Ala Asp Glu Asn Trp Asn Asp Ser Phe 465 470 475 480

Lys Tyr Met Asp His Gly Thr Ala Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Ala 4B5 490 495

Leu Arg Glu lie Ser Lys Hie Met lie Asn Gin Asn Met Asp Gly Arg 500 505 51C

Val Arg Pro Leu Gin Glu Ser Val Glu Leu Ala Pro Lys Leu Glu Ala 515 520 525

Phe Lys Gin Lys Tyr Asp Ser Gly Ala Ser He Lys Glu Asp Ala Leu 530 535 540

Glu Leu lie Ala Glu Phe Thr Asn Leu Gin Lys Ala Ala Asp Tyr Tyr 545 550 555 560

Lys Asn Asn Pro Gly Asn Glu Arg Thr Arg Asp Gin lie lie Tyr Trp 565 570 575

Leu Asn Cys Trp Glu Asp Thr Met Asp Ala Ala lie Gly Tyr Leu Lys 560 585 5S0

Ser Ala lie Ala lie Glu Glu Gly A3p Asp Glu Ala Ala Trp Ala Asn 595 600 605

Tyr Ser Glu Ala Gin Gly Ala Phe Glu Lys Ser Lys Thr Tyr Gly Phe 610 615 620

His Tyr Val Asp His Thr Glu Tyr Ala Glu Val Gly Val Gin llis Tie 625 630 635 640 val Fro Phe lie Lys Ser Met Gly Gin Asn Leu Ser Val Val He Gly 645 650 655

Ser lie Val Asp Pro Asn Arg lie He Ala Thr Tyr He Ser Asn Arg 660 665 670

Gin Asp Ala Pro Thr Gly Asn Pro Asp Asn He Phe Asp Asn Asn Ala 675 680 685

Ser Thr Glu Leu Val Tyr Lys Asn Pro Asn. Arg He Asp Val Gly Thr 690 69= 7 C Ο

Tyr Vai Gly Vai Lys Tyr Set Asn Pro lie Thr Leu Asn Asn Vai Glu 705 710 715 720

Phe Leu Met Gly Ala Asn Scr Asn Pro Asn Asp Thr Met Gin Lys Ala 725 730 735

Lys He Gin Tyr Thr Vai Asp Gly Arg Glu Ttp lie Asp Leu Glu Glu 740 745 750

Gly Vai Glu Tyr Thr Met Pro Gly Ala Ile Lys Vai Glu Asn Leu Asp 755 760- 765

Leu Lys Vai Arg Gly Vai Arg Leu lie Ala Thr Glu Ala Arg Glu Asn 770 775 730

Thr Trp Leu Gly Vai Arg Asp lie Asn Vai Asn Lys Lys Glu Asp Ser 735 790 795 300

Asn Ser Gly Vai Glu Phe Asn Pro Set Leu lie Arg Set Glu Ser Trp SOS 810 815

Gin Vai Tyr Glu Gly Asn Gin Ala Asn Leu Leu Asp Gly Asp Asp Asn 820 825 830

Thr Gly Vai Trp Tyr Lys Thr Leu Asn Gly Asp Thr Sar Leu Ala Gly 835 840 845

Glu Phe Ile Gly Leu Asp Leu Gly Lys Glu Ile Lys Leu Asp Gly Ile 850 8 55 8 60

Arg Phe Vai Ile Gly Lys Asn Gly Gly Gly Ser Ser Asp Lys Trp Asn 865 870 875 880

Lys Phe Lys Leu Glu Tyr Sei Leu Asp Asn Glu Ser Trp Thr Thr Ile 885 890 895

Lys Glu Tyr Asp Lys Thr Gly Ala Pro Ala Gly Lys Asp Vai Ile Glu 900 905 910

Glu Ser Phe Glu Thr pro lie ser Ala Lys Tyr Ile Arg Leu Thr Asn 915 920 925

Met Glu Asn Ile Asn Lys Trp Leu Thr Phe Ser Glu Phe Ala Ile Ile 930 935 940 ser Asp Glu Leu Glu Asn Ala Gly Asn Lys Glu Asn vai Tyr Thr Asn 945 950 955 960

Thr Glu Leu Asp Leu Leu Ser Leu Ale Lys Glu Asp Vai Thr Lys Leu 965 97 0 975 lie Pro Thr Asp Asp Ile Ser Leu Asn flis Gly Glu Tyr Ile Gly Vai 980 98 5 990

Lys Leu Asn Arg Ile Lys Asp Leu Ser Asn lie Asn Leu Glu Ile Ser 995 1000 1005

Asn Asp Thr Gly Leu Lys Leu Gin Ser Ser Met Asn Gly Vai Glu Trp 1010 1015 1020

Thr Glu Ile Thr Asp Lys Asn Thr Leu Glu Asp Gly Arg Tyr Vai Arg 1025 1030 1035 1040

Leu Ile Asn Thr Ser Asn Glu Ala Vai Asn Phe Asn Leu Thr Lys Phe 1045 1050 1055

Glu Vai Asn Ser Asn Glu Vai Tyr Glu Pro Ser Leu Vai Asp Ala Tyr 1060 1065 1070

Vai Gly Asp Asp Gly Ala Lys Lys Ala Vai Asp Gly Asp Leu Lys Thr 1075 1080 1085

Arg Vai Lys Phe Leu Gly Ala Pro Ser Thr Gly Asp Thr Ile Vai Tyr 1090 1095 1100

Aap Leu Gly Gin Glu Ile Leu Vai Asp Asn Leu Ly3 Tyr Vai Vai Leu 1105 1110 1115 1120

Asp Thr Glu Vai Asp His Vai Arg Asp Gly Lys Ile Gin Leu Ser Leu 1125 1130 1135

Asp Gly Glu Thr Trp Thr Asp Ala Ile Thr Ile Gly Asp Gly Vai Glu 1140 1145 1150

Asn Gly Vai Asp Asp Met Phe Ser Thr Pro Leu Lys Asn Gly Tyr Lys 1155 1160 1165

His Gly Asn Gin Ser Gly Gly lie Val Pro lie Asp Ser Ala Tyr Val 1170 1175 1180

Glu Gly Asp Asn Leu Asn Gin Lys Ala Atg Tyr Val Arg He Leu Phe HB5 1190 1195 1200

Thr Ala Pro Tyr Arg His Arg Trp Thr Val He Asn Glu Leu Met He 12Q5 1210 1215

Asn Asn Gly Gin Tyr He Ser Thr Val Asn Asp Pro Thr Tyr Tie Ser 1220 1225 1230

Asn Pro He Glu Glu Arg Gly Phe Ala Pro Ser Asn Leu Arg Asp Gly 1235 124 C 1245

Asn Leu Thr Thr Ser Tyr Lys Pro Asn Thr Asn Asn Gly Glu lie Ser 1250 1255 1260

Glu Gly Ser lie Thr Tyr Arg Leu Ser Glu Lys Thr Asp Val Arg Lys 1265 1271) 1275 1280

Val Thr lie Val Gin Ser Gly Ser Ser lie Ser Asn Ala Lys Val Met 1285 1290 1295

Ala Arg Val Gly Asp Gly Ser Glu Asn Val Thr Asp Gin Trp Val Gin 1300 1305 1310

Leu Gly Thr Leu Ser Asn Ser Leu Asn Glu Phe He Asn Arg Asp Tyr 1315 1320 1325

Asn Asn lie Tyr Glu lie Lys lie Glu Trp Thr Asp Val Ala Fro Asn 1330 1335 1340 lie Tyr Glu He lie Thr Leu Asn Gin Glu Phe Glu Phe Pro Val Asn 1345 1350 1355 1360

Asp Ser Leu Lys Ala Lys Tyr Asp Glu Leu lie Asn Leu Ser Gly Asp 1365 1370 1375

Glu Tyr Thr Leu Ser Ser Phe Glu Thr Leu Lys Glu Ala Leu Asn Gltn 1380 1385 1390

Ala Lys Ser He Leu Asp Asp Ser Asn Ser Ser Gin Lys Lys lie Asp 1395 1400 1405

Lys Ala Leu Clu Lys Leu Asn Lys Ala Glu Glu Arq Leu A3p Leu Arg 1410 1415 1420

Ala Thr Asp Phe Glu Asp Phe Asn Lys Val Leu Thr Leu Gly Asn Ser 1425 1430 1435 1440

Leu Val Glu Glu Glu Tyr Thr Ala Glu Ser Trp Ala Leu Phe Ser Glu 1445 1450 1455

Val Leu Glu Ala Ala Α3Π Glu Ala Asn Lyn Asn Lys Ala Asp Tyr Thr 1460 1465 1470

Gin Asp Gin lie Asn Gin lie Val lie Asp Leu Asp Ala Ser lie Lys 1475 1480 1485

Ala Leu Val Lys Glu Thr Pro Glu Val Asp Lys Thr Asn Leu Gly Glu 1490 1495 1500

Leu lie Asn Gin Gly Lys Ser Leu Leu Asp Glu Ser Val Glu Gly Phe 1505 1510 1515 1520

Asn Val Gly Glu Tyr His Lys Gly Ala Lys Asp Gly Leu Thr Val Glu 1525 1530 1535 lie Asn Lys Ala Glu Glu Val Phe Asn Lys Glu Asp Ala Thr Glu Glu 1540 1545 1550

Glu lie Asn Leu Ala Lys Glu Ser Leu Glu Gly Ala 11c Ala Arg Fhe 1555 1560 1565

Asn Ser Leu Leu lie Glu Glu Ser Thr Gly Asp Phe Asn Gly Asn Gly 1570 1575 1580

Lys lie Asp Tie Gly Asp Leu Ala Met Val Ser Lys Asn He Gly Ser 1585 1590 1595 1600

Thr Thr Asn Thr Ser Leu Asp Leu Asn Lys Asp Gly Ser He Asp Glu 1605 1610 1615

Tyr Glu lie Ser Phe lie Asn His Arg lie Leu Asn 1620 1625 <210> 36 <211> 435

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Hialuronidase-1 [Precursor] <4Ο0> 36

Met Ala Ala His Leu Leu Pro lie Cys Ale Leu Phe Leu Thr Leu Leu 15 10 15

Asp Met Ala Gin Gly Phe Arg Gly Pro Leu Leu Pro Asn Arg Pro Phe 20 25 30

Thr Thr Val Trp Asn Ala Asn Thr Gin Trp Cys Leu Glu Arg His Gly 35 40 45

Val Asp Val Asp Val Ser Val Phe Asp Val Val Ala Asn Pro Gly Gin

50 55 SO

Thr Phe Arg Gly Pro Asp Met Thr lie Phe Tyr Ser Ser Gin Leu Gly 65 70 75 80

Thr Tyr Pro Tyr Tyr Thr Pro Thr Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu 85 90 95

Pro Gin Asn Ala Ser Leu lie Ala His Leu Ala Arg Thr Phe Gin Asp 100 105 110 lie Leu Ala Ala lie Pro Ala Pro Asp Phe Ser Gly Leu Ala Val lie 115 120 125

Asp Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Thr Lys 130 135 140

Asp lie Tyr Arg Gin Arg Ser Arg Ala Leu Val Gin Ala Gin His Pro 145 150 155 160

Asp Trp Pro Ala Pro Gin Val Glu Ala Val Ala Gin Asp Gin Phe Gin 165 170 175

Gly Ala Ala Arg Ala Trp Met Ala Gly Thr Leu Gin Leu Gly Arg Ala ieo ias isd

Leu Arg Pro Arg Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr 195 200 205

Asn Tyr Asp Phe Leu Eer Pro Asn Tyr Thr Gly Gin Cys Pro Eer Gly 210 215 220

He Arg Ala Gin Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Gly Gin Ser Arg 225 230 235 240

Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Met Pro Ala Val Leu Glu Gly Thr Gly 245 250 Ξ55

Lys Ser Gin Met Tyr val Gin His Arg val Ala Glu Ala Phe Arg Val 260 255 270

Ala Val Ala Ala Gly Asp Pro Asn Leu Pro Val Leu Pro Tyr Val Gin 275 280 285 lie Phe Tyr Asp Thr Thr Asn His Phe Leu Pro Leu A3p Glu lieu Glu 29Í) 295 3D0

His Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gin Gly Ala Ala Gly val Val Leu 305 310 315 320

Trp Val. Ser Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gin Ala lie 325 330 335

Lys Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Gly Pro Phe lie Leu Asn Val Thr 340 345 350

Ser Gly Ala Leu Leu Cys Ser Gin Ala Leu Cys Ser Gly His Gly Arg 355 360 365

Cys val Arg Arg Thr Ser Hia Pro Lys Ala Leu Leu Leu Leu Asn Pro 370 375 380

Ala Ser Phe Ser lie Gin Leu Thr Pro Gly Gly Gly Pro Leu Ser Leu 385 390 395 480

Arg Gly Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gin Ala Gin Met Ala Val Glu Phe 4 OS 410 415

Lys Cys Arg Cys Tyr Pro Gly Trp Gin Ala Pro Trp Cys Glu Arg Lys 420 425 430

Ser Met Trp 435

<210> 37 <211> 473 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Hialuronidase-2 [Precursor] <4Ο0> 37

Met Arg Ala Gly Pro Gly Pro Thr Val Thr Leu Ala Leu Val Leu Ala IS 10 15

Val Ala Trp Ala Met Glu Leu Lys Pro Thr Ala Pro Pro lie Phe Thr 20 25 30

Gly Arg Pro Phe Val Val Ala Trp Asp Val Pro Thr Gin Asp Cys Gly 35 40 45

Pro Arg Leu Lys Val Pro Leu Asp Leu Asn Ala Phe Asp Val Gin Ala 50 55 60

Ser Pro Asn Glu Gly Phe Val Asn Gin Asn lie Thr lie Phe Tyr Arg 65 10 75 80

Asp Arg Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Phe Asp Ser Ala Gly Arg Ser Val ΘΞ 90 95 [[is Gly Gly Val Pro Gin Asn Val Ser Leu Trp Ala His Arg Lys Met 100 105 110

Leu Gin Lys Arg Val Glu His Tyr lie Arg Thr Cln Glu Ser Ala Gly 115 120 125

Leu Ala Val lie Asp Trp Glu Asp Trp Arg Pro Val Trp Val Arg Asn 130 135 140

Trp Gin Asp Lys Asp Val Tyr Arg Aro Leu Ser Arg Gin Leu Val Ala 145 ISO ' 155 160

Ser Arg His Pro Asp Trp Pro Pro Asp Arg lie Val Lys Gin Ala Gin 165 Π0 175

Tyr Glu Phe Glu Phe Ala Ala Gin GLr. Phe Met Leu Glu Thr Leu Arg 180 185 190

Tyr Val Lys Ala Val Arg Pro Arg His Leu Trp Gly Phe Tyr Leu Phe 195 200 205

Pro Asp Cys Tyr Asn His Asp Tyr Val Gin Asn Trp Glu Ser Tyr Thr 210 215 220

Gly Arg Cys Pro Asp Val Glu Val Ala Arg Asn Asp Gin Leu Ala Trp 225 230 235 240

Leu Trp Ala Glu Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ser val Tyr Leu Asp Glu 245 250 255

Thr Leu Ala Ser Ser Arg His Gly Arg Asn Phe Val Ser Phe Arg Val 260 265 270

Gin Glu Ala Leu Arg Val Ala Arg Thr His His Ala Asn His Ala Leu 275 280 285

Pro Val Tyr Val Phe Thr Arg Pro Thr Tyr Ser Arg Arg Leu Thr Cly 290 295 300

Leu Ser Glu Met Asp Leu lie Sar Thr lie Gly Glu Set Ala Ala Leu 305 310 315 320

Gly Ala Ala Gly Val lie Leu Trp Gly Asp Ala Gly Tyr Thr Thr Ser 325 330 335

Thr Glu Thr Cys Gin Tyr Leu lys Asp Tyr Leu Thr Arg Leu Leu Val 340 345 350

Pro Tyr Val Val Asn Val Ser Trp Ala Thr Gin Tyr Cys Ser Arg Ala 355 360 365

Gin Cya Hia Cly His Gly Arg Cys Val Arg Arg Asn Pro Ser Ala Ser 37 C 375 380

Thr Phe Leu His Leu Ser Thr Asn Ser Phe Arg Leu Val Pro Gly His 385 390 395 400

Ala Pro Gly Glu Pro Gin Leu Arg Pro Val Gly Glu Leu Ser Trp Ala 405 410 415

Asp lie Asp His Leu Gin Thr His Phe Arg Cys Gin Cys Tyr Leu Gly 420 425 430

Trp Sec Gly Glu Gin Cys Gin Trp Asp His Arg Gin Ala Ala Gly Gly 435 440 445

Ala Ser Glu Ala Trp Ala Gly Ser His Leu Thr Ser Leu Leu Ala Leu 450 455 460

Ala Ala Leu Ala Phe Thr Trp Thr Leu 465 470

<210> 38 <211> 417 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Hialuronidase-3 [Precursor] <4Ο0> 38

Met Thr Thr Gin .Leu Gly Pro Ala Leu Val Leu Gly Val Ala Leu Cys 15 10 15

Leu Gly Cys Gly Gin Pro Leu Pro Gin Val Pro Glu Arg Pro Phe Ser 20 25 30

Val Leu Trp Sen Val Pro Ser Ala His Cys Glu Ala Arg Phe Gly Val 35 40 45

His Leu Pro Leu Asn Ala Leu Gly lie lie Ala Asn Arg Gly Gin His 50 55 60

Phe His Gly Gin Asn Met Thr lie Phe Tyr Lys Asn Gin Leu Gly Leu 65 70 75 80

Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Arg Gly Thr Ala His Asn Gly Gly lie Pro 35 90 95

Gin Ala Leu Pro Leu Asp Arg His Leu Ala Leu Ala Ala Tyr Gin lie 100 105 110

His His 5er Leu Arg Pro Gly Phe Ala Gly Pro Ala Val Leu Asp Trp 115 120 125

Glu Glu Trp Cys Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Arg Arg Arg Ala 130 135 140

Tyr Gin Ala Ala Ser Trp Ala Trp Ala Gin Gin Val Phe Pro Asp Leu L 4 5 150 155 160

Asp Pro Gin Glu Gin Leu Tyr Lys Ala Tyr Thr Gly Phe Glu Gin Ala 165 170 175

Ala Arg Ala Leu Met Glu Asp Thr Leu Arg Val Ala Gin Ala Leu Arg 180 1Θ 5 190

Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr ilis Tyr Pro Ala Cys Gly Asn Gly 195 200 205

Trp His Ser Met Ala Ser Asn Tyr Thr Gly Arg Cys Kis Ala Ala Thr 210 215 220

Leu Ala Arg Asn Thr Gin Leu His Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser Ala 225 230 235 240

Leu Phe Pro Ser lie Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Pro Pro Ala Hrs His 245 250 255

Gin Ala Phe Val Arg His Arg Leu Glu Glu Ala Phe Arg Val Ala Leu 260 265 2 70

Val Gly His Arg His Pro Leu Pro Val Leu Ala Tyr Val Arg Leu Thr 275 280 235

His Arg Arg Ser Gly Arg Phe Leu Ser Gin Asp Asp Leu Val Gin Ser 290 255 300

He Gly Val Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ala Gly Val Val Leu Trp Gly 305 310 315 320

Asp Leu Ser Leu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp His Leu His Asp 325 330 335

Tyr Leu Val Asp Thr Leu Gly Pro Tyr Val lie Asn Val Thr Arg Ala 340 345 350

Ala Met Ala Cys Ser His Gin Arg Cys His Gly Kis Gly Arg Cys Ala 355 360 365

Arg Arg Asp Pro Gly Gin Met Glu Ala Phe Leu His Leu Trp Pro Asp 370 375 3 B0

Gly Ser I.eu Gly Asp Trp I.ys Ser Phe Ser Cys Kis Cys Tyr Trp Gly 335 390 395 400

Trp Ala Gly Pro Thr Cys Gin Glu Pro Arg Pro Gly Pro Lys Glu Ala 405 410 415

Val

<210> 39 <211> 481 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Hialuronidase-4 <4Ο0> 39

Mat Lys val Leu Ser Glu Gly Gin Leu Lys Leu Cys Val Val Gin Pro 1 5 10 15

Val His Leu Thr Ser Trp Leu Leu lie Phe Phe lie Leu Lys Ser lie 20 25 30

Ser Cys Leu Lys Pro Ala Arg Leu Pro lie Tyr Gin Arg Lys Pro Pne 35 40 45 lie Ala Ala Trp Asn Ala Pro Tbr Asp Gin Cys Leu lie Lys Tyr Asn 50 55 60

Leu Arg Leu Asn Leu Lys Met Pbe Pro yal lie Gly Ser Pro Leu Ala 65 70 75 80

Lys Ala Arg Gly Gin Asn Val Thr He Phe Tyr Val Ash Arg Leu Gly 85 90 85

Tyr Tyr Pro Trp Tyr Thr Ser Gin Gly Val Pro lie Asn Gly Gly Leu lob 105 110

Pro Gin Asn lie Ser Leu Gin Val His Leu Glu Lys Ala Asp Gin Asp 115 120 125 lie Asn Tyr Tyr He Pro Ala Glu Asp Phe ser Gly Leu Ala Val He 130 135 140

Asp Trp Glu Tyr Trp Arg Pro Gin Trp Ala Arg Asn Trp Asn Ser Lys 145 150 155 160

Asp Val Tyr Arg Gin Lys Ser Arg Lys Leu lie Ser Asp Met Gly Lys 165 170 175

Asn Val Ser Ala Thr Asp lie Glu Tyr Leu Ala Lys Val Thr Phe Glu 180 135 190

Glu Ser Ala Lys Ala Phe Met Lys Glu Thr lie Lys Leu Gly lie Lys 195 200 205

Ser Arg Pro Lys Gly Leo Trp Gly Tyr Tyr Leu Tyr Pro Asp Cys His 210 215 220

Asn Tyr Asn Val Tyr Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Ser Cys Pro Glu Asp 225 230 235 240

Glu Val Leu Arg Asn Asn Glu Leu Ser Trp Leu Trp Asn Ser Ser Ala 245 250 255

Ala Leu Tyr Pro Ser He Gly Val Trp Lys Ser Leu Gly Asp Ser Glu 260 265 270

Asn lie Leu Arg Phe Ser Lys Phe Arg Val His Glu Ser Met Arg He 275 200 285

Ser Thr Met Thr Ser His Asp Tyr Ala Leu Pro Val Phe Val Tyr Thr 290 295 300

Arg Leu Gly Tyr Arg Asp Glu Pro Leu Phe Phe Leu Ser Lys Gin Asp 305 310 315 320

Leu Val Ser Thr lie Gly Glu Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ala Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Asp Met Asn Leu Thr Ala Ser Lys Ala Asn Cys Thr 340 345 350

Lys Val Lys Gin Phe Val Ser Ser Asp Leu Gly Ser Tyr He Ala Asn 355 360 365

Val Thr Arg Ala Ala Glu Val Cys Ser Leu His Leu Cys Arg Asn Asn 370 375 380

Gly Arg Cys lie Arg Lys Met Trp Asn Ala Pro Ser Tyr Leu His Leu 385 350 395 400

Asn Pro Ala Ser Tyr His lie Glu Ala Ser Glu Asp Gly Glu Phe Thr 405 410 415

Val Lys Gly Lys Ala Ser Asp Thr Asp Leu Ala Val Met Ala Asp Thr 420 ’ 425 430

Phe Ser Cys His Cys Tyr Gin Gly Tyr Glu Gly Ala Asp Cys Arg Glu 435 440 445 lie Lys Thr Ala Asp Gly Cys Ser Gly Val Ser Pro Ser Pro Gly Ser 450 455 460

Leu Met Thr Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ala Ser Tyr Arg Ser He Gin 465 470 475 480

Leu

<210> 40 <211> 467 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor de sHuPH20 1-467 <4Ο0> 40

Met Gly Val Leu lys Phe Lys Hia He Phe Phe Arg Ser Phe Val Lya i 5 10 15

Ser Ser Gly Val Scr Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Fro Ser Glu Phe Cys Leo Gly Lys Phe

50 55 SO

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 fifl lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro

145 150 ’ 155 ISO

Lys Asp val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 105 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Fhe Pro Asp Cys 210 . 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Fhc Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Fro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Ly3 Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met GLu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn

355 360 36S

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Fro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys

450 455 4 SO lie Asp Ala 4S5

<210> 41 <211> 477 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor de sHuPH20 1-477 <4Ο0> 41

Met Gly Val Leu Lys Fhe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Fhe Arg Ala Pro Pro Val lie Fro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 so

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Fro Arg

S5 70 75 BO lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 55 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys IIS 120 125

Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140

He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 1BC 135 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 155 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Fro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val

260 255 27C

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys He Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg He Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 306 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Prc Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin' Glu Gin 370 375 3B0

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu his Leu 335 390 395 430

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys

4 2 0 4 25 4 3 Q

Fhe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 " 455 4 60 lie Asp Ala Phe Leu Lye Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu 465 470 475

<210> 42 <211> 478 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor de sHuPH20 1-478 <4Ο0> 42

Met Gly Val Lea Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser 31n He Val Phe Thr.Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Fro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 " 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 60 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 35 30 35

Gly lyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Glr. Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg A.sn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Aan Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin C-ln Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 1B0 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu val Glu Thr lie Lys i.eu Gly Lys 195 2QC 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 350 . 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 280 235

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu val Tyr Thr phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Set Gly lie 325 330 335

Val 11s Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu. 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie He Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 355 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin. Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val A.rg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Fro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro 465 470 475

<210> 43 <211> 479 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor de sHuPH20 1-479 <4Ο0> 43

Met Gly Val Leu Lys Fhç Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 1C 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Aan Al.a Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 30 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly

100 105 HO

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 13C 135 140

He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 150

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 IBS 130

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 213 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 24 0

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val

260 265 2 7 C

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 20C 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 293 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser Tie Met Arg Ser Met Ly3 Ser Cya Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Fro Tyr He lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 300

Gly Val Cys He Arg Lya Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 305 390 395 400 •Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Lsu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Ly3 ftsp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin 465 470 475

<210> 44 <211> 480 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor de sHuPH20 1-480 <4Ο0> 44

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys IB 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Are Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 * SO 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80

He Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 1 GO 105 110

Gly lie Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Aan Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin GLu Ehe 180 185 190

Glu Lya Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu He Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn GLu Ser 245 250 255

ThE Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys He Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 ' 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr He lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 3B0

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Fro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Set Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 4R0

<210> 45 <211> 481 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor de sHuPH20 1-481 <4Ο0> 45

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80

He Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arq Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 * . 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Vai 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu 5er Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn Kis Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Ly3 Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 250 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 280 205

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Γ«υ Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Fhe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala 5er Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Ãsn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu A3p Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys

450 4 55 4 SO lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 480

Phe

<210> 46 <211> 483 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor de sHuPH20 1-483 <4Ο0> 46

Met Gly Vai Leu Lys Phe Lys His He Fhe Phe Arg Ser Fhe Val Lys 15 10 15

Set Eer Gly VaL Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asm Fhe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Fhe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 20 75 80

Ue Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asp Gly 1O0 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr MeL Pru Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Giu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn. Trp Lys Pro

145 150 155 ISO

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu val Gin Gin Gin Asn 165 Π0 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe ISO 1B5 .190

Glu lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 23S 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arq Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 2B5

Ser Lys lie Fro Asp Ala Lys Ser Fro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Set Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 3S0

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 3É0 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Eer Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 395 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Fhe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He 465 ' 470 475 480

Phe Tyr Asn

<210> 47 <211> 432 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> sHuPH20 madura 36-467 <4Ο0> 47

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cya Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg He Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser He Git Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr val Arg Asn Axg Val Arg Glu Ala Tie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arq lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 2B0 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val He Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arq Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr l,eu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Scr Gin Val Leu Cys Gin Clu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 35S 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 300

Lya Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

<210> 48 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> sHuPH20 madura 36-483 <4Ο0> 48

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 13 IS

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Fhe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 .25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Set Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 5S SO

Pro Tyr lie Asp ser He The Gly val Thr val Asn Gly Gly lie Pro

65 7 0 75 BO

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Aap Lys Ala Lys Lys Asp lie 65 90 95

Thr Phe Tyr Her Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Ly3 Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Ann His 180 185 ISO

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro 3er lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg val Arg Glu Ala He Arg val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Tie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Fhe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 2 90 2 95 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 335 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala He Gin Leu Glu. Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 3ES 0

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 " 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He Phe Tyr Asn 435 440 445

<210> 49 <211> 1446 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> ADN codificando "precursor" de rHuPH20 solúvel <400> 49 atgggaqtgc taaaattcaa qcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggaqta 60 tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactCtgaa tttcagagca 120 cctectgtta ttccaaatgt qgctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180 cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcscccga 240 ataaacqcca ccgggcaagg tgttecaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcet 300 tacatagatt caatcacagg agLaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attaeatttt atatgecagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactq ggaagaatgg agaçccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtutattgaa ttggttcagn aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgayaa aqcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcccg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 020 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcae tgctctttac 780 ccaLccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg naaaaagtnc acttccggtt 900 tttgcatata ceegcaragt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta cacggagaot 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactqgaatt caagtgacta tcttcaectc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa ngttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagaccrggs gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacu 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgaLgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa ectcccatgg agacagaaga accteaaatt 1440 tretac 1446

<210> 50 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> PH20 variante P48A <400> 50

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Fhe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Levi Tie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn. Val Ala 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Tip Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly íer Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Aap Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr C-ly Val Thr Val Asn Gly 100 105 HO

Gly Ile Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140

Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 Π5

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Fhe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys UO 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu Tie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Ttir Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr filn Gin Eer Pro Vnl 260 265 270

Ale Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Ly3 Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu £er lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Astr Pro Tyr He lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Vai Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Pha Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 ' 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430 phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Fro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 " 470 475 460

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val 485 490 495

Ser lie Leu Phe Leu He lie Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505

<210> 51 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor de PH20 variante L499W <400> 51

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Phe Leu Leu He Pro Cys 20 25 30

Cys leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 " 55 60

Aap Glu Pro Leu Asp Met Ser leu Phe Ser Pha lie Gly Ser Pro Arg 65 τα 75 80

He Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Ary Leu 85 90 95

Cly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Pha Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 340 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 150

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Lou Ser Lou Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Ehe 1 BO 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ssr Trp Leu Trp Asn Glu Sar 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg val 275 280 235

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val He Trn Cly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He He Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Glr Val Leu Cy3 Cln Clu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 335 390 395 400

Asn Pro A3p Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 4 OS 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala val Asp val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He

465 470 475 4BC

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val 485 490 495

Ser lie Trp Phe Leu He lie Ser Ser Val Ala Ser Leu 5D0 505

<210> 52 <211> 6630 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> vector HZ24 <4Ο0> 52 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atetacatca taatatgtac atttafcattg getcatgtcq 150 aacatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 qtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacccacgg taaatggccc 240 qcctggctga ccgcecaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 200 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gogtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat grcaagteeg r.ricf.qtattg angteaatga 4 20 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg <80 gcagcacate tacgtattag tcatcgctat caccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acqqqacttt ccaaaatgtc qtaataaccc 660 cgccccgttg augeaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtcaqa tcactaqaag ctttattgcg gtaqtttatc acaqttaaat 700 tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840 gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900 actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtctctga taggcaccca ttggtcttac 9€0 tgacatccac tttgccttte tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagcbctta 1C20 aggctagagt acttaatacg actcactata ggccagcatg ggaqtgctaa aattcaaqca 1080 catcttcttt agaagctttg ttaaatcaag tggagtatcc cagatagttt tcaccttcct 1140 tctgattcca tgetgcttga ctctgaattt cagageacce cctgttattc caaatgtgcc 1200 tttcctctgg gcctggaatg cqccaagtq-a attttgtctt ggaaaatttg atgagccact 1260 agatatgagc etcttctctc tcataggaag qecccgaata aacgeeaecg ggciaaggtgt 1320 tacaatattt tatgttgata gacttggcta ctatccttac atagattcaa tcacaggagE 1380 aactgtgaat ggaggaatcc cccagaagat ttccttacaa gaccatctgg acaaagctaa 1440 gaaagacatt acattttata tgccaq^aga caatttgqga atggctgtta ctgactggga 1500 agaatggaga cccacttggg caagaaactg gaaacctaaa gatgtttaca agaataggtc 1560 tattgaattg gttcaqgaac aaaatgtaca acttagtctc aciagaggcca qtgagaaagc 1620 aaaacaagaa tttgaaaagg cagggaagga tttcctggta gagactataa aattgggaaa 1680 attacttcqq ccaaatcact tgtggggtta ttatcttttt ccggattgtt acaaccacca 1740 ntataagaaa cccggttaca atggaaqttg cttca&tgta gaaataaaaa gaaatgatga 1800 ectcsgctqg ttgtggaatg aaagcactgc tctttacccia tccatttatt tgaacactca 1860 gcagtctcct qtagctgcta cactctatgt qcgcaatcga gttcgggaag ccatcagagt 1920 ttccaaaata cctgatgqaa aaagtccaot tccggttttt gcatataccc gcatagtttt 1980 tactgatcaa gttttgaaat Lcctttctca agatgaactt gtgtatacat ttggcgaaac 2040 tgttgctctg ggtgcttctg gaattgtaat atggggaacc ctcagtataa tgcgaagtat 2100 gaaatcttgc ttgctectag acaattacat ggagactata ctgaatcctt acataatcaa 2160 cgtcacacta gcagccaaaa tgtgtagcca agtgctttgc caqqagcaag gagtgtgtat 2220 aaggnaaaac tggaattcaa gtgactatct tcacctcaac ccagataatt ttgctattca 2280 acttgagaaa ggtggaaagt tcacagt.aog tggaaaa^og acaorigaag airf:t-ggagr:a 2340 attttctgaa aaattttatt gcagctgtta tagcaccttg agttgtaagg agaaagctga 2400 tgtaaaagac actgatgctg ttgatgtgtg tattgctgat ggtgtctgta tagatgcttt 2460 tctaaaacct cccatggaga cagaagaacc tcaaattlL^’ tactgaggat ccalagctaa 2520 cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgctlgga ataaggccgg 2580 tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc ataqtgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 2640 cqgaascctg gccctg^ctt ctigacgagc attcctagqg gtctEtcccc tctcgcgaaa 2700 ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 2760 caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 2820 ctctgcggcc aaaagccaeg cgtataagat aeacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 2880 cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc cctcctcaag cgtartcaac 2940 aaggggctga aggatgceca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 3000 tgcacatqct ttacatgtgL Ltagtcgagg LLaaáaaaac gtctaggccc cccgaaceac 3060 ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt gccacaaccc acsgcggecg 3120 ctgccatcat ggttcgacca ttgaactgca tcgtcgccgt gtcccaaaat atggggattg 3190 gcaagaacgg agacctaccc tggectccge tcaggaaega gttcaagtac ttccaaagaa 3240 tgaccacaac ctcttcagtg gaaggtaaac agaatctggt gattatgggt aggaaaacct 3300 gçttctccat tcctgagaag aatcgacctt taaaggacag aattaatata qttctcaota 3360 gagaactcaa agaaccacca cgaggagctc attttcttgc caaaagtttg gatgatgcct 3420 taagacttat tgaacaaccg gaattçgcaa gtaaagtaga catggtfctgg atagtcggag 3490 gcagttctgt ttacceggaa gccatgaatc aaccaggcca cctcagactc tttgtgacaa 3540 ggatcatgca ggaatttgaa agtgacacgt ttttcccaga aattgatttg gggaaacata 3600 aacttctcce agaataccca ggcgtcctct ctgaggtcca ggaggaaaaa ggcatcaagt 3660 ataagtttga aqtctacgag aaqaaagact aaacgcgtgg sacctctaga gtcgacccgg 3720 gcggccgctt cgagcagaca tgataagata cattgatçag tttggacaaa ccacaactag 3780 aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac 3840 cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt 3900 tcagggggag atgcgçgagg ttttttaaag caagtaaaac ctctaeaaat gtggcaaaac 3960 cgataaggat ccqggctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 4020 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtageg gcgcattaag cgcggcgggt 4080 gtggtggtta cgcgcaçcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 4140 gctttcttcc cttcctttct cgccaegttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaaccgg 4200 gggctccctt tagggttccg atttagtggt ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 4260 tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 4320 ttggagfceca cgttctttsa tagtggactc ttgtaceaaa ctggaacaac actcaaccct 4380 atctcggtct attcttttga tttataaggg attttçccga tttcggccts ttggccaaaa 4440 aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcrtacaatt 4500 tcctgatgcg gtatttLctç cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgoa 4560 ctctcagtac aatctgctct gatgccgcac agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 4620 ccgctgacçc gccctgaegg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 4680 ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagagge tttcaccgtc atpaccgaaa cgcgcgagac 4740 gaaaqqgcct cglgaLacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttct-t 4800 agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttqt ttatttttct 4360 aaatacatcc aaatatgtat ccgctcat.ga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4920 attgaaaaag gaagagtatg- agtattcaac atttccg-tgt cgcccttatt cccttttttg 4 9S0 cggeattt.tg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 5040 aagatcagtt gggtgcacga gtqggttaca tcgaactgga LuLcaacagc ggLaagatcl; 5100 ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 5160 gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg qgcaagagca actcqgtngc rgcatacact 5220 attctcagaa tgacLtggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 5280 tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 5340 tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacacggggg 5400 atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacçacg 5460 agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg eaacaacgtt gcgcaaacta ttaaeeçgcg 5520 aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 5580 caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatccggag 5640 ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc S700 gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 5760 tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc atcggtaact gtcagaocaa gtttactcat 5820 atatacttta gattgattta aaacttcatt tttsatttaa aaggatctag gtgaagatcc 5880 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aaogtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5940 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 6000 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 6060 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actçttcttc 6120 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 6180 ctctgctaat cctgttacca. gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 6240 tggactcaag acgatagtta ccgçataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 6300 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgage 6360 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 6420 gggtcggaac aggagagcgc acgaçggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 6490 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctcacttg agcgtcgatt tttgtgatgit tcgtcegggg 6540 ggcggagcct atggaaaaac gccaçcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 6600 ggccttttgc tcacatggct cgacagatct 6630 <210> 53

<211> 186 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0> <223> di-hidrofolato-redutase <4Ο0> 53

Vai Arg Pro Leu Asn Cys Ile Vai Ala Vai Ser Gin Asn Met Gly Ile 15 10 15

Gly Lya Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe Lys 20 25 30

Tyr Phe Gin Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Vai Glu Gly Lys Gin Asn 35 40 45

Leu Vsl lie Met Gly Arg Lya Thr Trp Phe Ser lie Pro Glu Lys Asn 50 55 60

Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile Vai Leu Ser Arg Glu Leu Lys

65 70 75 BO

Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp Ala 85 90 95

Leu Arg Leu lie Glu Gin Pro Glu Leu Ala Ser Lys vai Asp Met Vai 100 105 110

Trp Ile Vai Gly Gly Ser Ser Vai Tyr Gin Glu Ala Met Asn Gin Pro 115 120 125

Gly His Leu Arg Leu Phe vai Thr Arg lie Met Gin Glu Píie Glu Scr 130 135 140

Asp Thr Phe Phe Pro Glu lie Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro 145 150 155 160

Glu Tyr Pro Gly Vai Leu Ser Glu Vai Gin Glu Glu lys Gly Ile Ly3 165 170 175

Tyr Lys Phe Glu Vai Tyr Glu Lys Lys Asp 130 135

<210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> marcador His <400> 54

His HÍs His His Hís His 1 5

<210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> marcador Flag <400> 55

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

<210> 56 <211> 1449 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> sequência de ARNm de Gen2 <4Ο0> 56 atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt tecagaagce ttgttaaatc aagtggagta 60 r.occagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120 cctcctgtta tcccaaatçjt gqctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaatt-ttgt ISO cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcecccga 240 ataaacgcca ccgggcaagg tgttauaat.s ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt qggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttectg 600 gtagagaeta taaaattggg aaaattactc cggocaaatc acttgtgggg ttatcatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcaccacaaq aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgcfcotttac 700 ccateeafctt atttgaaeac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttocaaa atacctgatg caaaaagtce acttccggtt 900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgac gaagttttga aatccctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgcc ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatot tgcttgstcc tagacaatta catggagact 1090 atactgejtc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatg-tgtag tcaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactgyaatt ceagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgcggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgueyuty ttatacjuauu 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatqtaaaa gacactgatg ctgttqatqt gtgtattgct 1300 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctactga 1449

<210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Péptido C-terminal clivado a partir de rHuPH20 solúvel aa 431-447 <400> 57

Asp Ala Fhe Lys Leu Pro Pro Met Glu Tbr Glu Glu Pro Gin He Phe 15 10 15

Tyr

<210> 58 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Péptido C-terminal clivado a partir de rHuPH20 solúvel aa 431-446 <400> 58

Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Tbr Glu Glu Pro Gin lie Fhe 15 10 15

<210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Péptido C-terminal clivado a partir de rHuPH20 solúvel aa 431-445 <4Ο0> 59

Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 15 10 15

<210> 60 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Péptido C-terminal clivado a partir de rHuPH20 solúvel aa 431-444 <400> 60

Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin 15 10

<210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Péptido C-terminal clivado a partir de rHuPH20 solúvel aa 431-443 <400> 61

Asp Ala Phe Lys Leu Fro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro 1 5 10

<210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Péptido C-terminal clivado a partir de rHuPH20 solúvel aa 431-442 <400> 62

Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu 15 10 <210> 63 <211> 520 <212> PRT <213> Ovis aries <4Ο0> 63

Leu Asp Phe Pro Ala Pro Pro Leu lie Sar Asn Thr Ser Phs Leu Trp 15 13 15

Ala Tru Asn Ala Pro Ala Glu Arg Cya Val Lys lie Pile Lya Leu Pro 20 25 30

Pro Asp Leu Arg Leu Phe Ser Val Lya Gly Ser Pro Gin Lya Ser Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Phe lie Thr Leu Phe Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Kis lie Asp Glu Lys Thr Gly Asn Thr Val Tyr Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Leu Gly Asn Leu Lys Asn His Leu Glu Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Ala Tyr Tyr lie Pro Aan Asp Ser Val Gly Leu Ala Val lie Asp Trp 100 105 .110

Glu As it Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Fro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Arg Asp Glu Ser Val Glu Leu Val Leu Gin Lys Asn Pro Gin Leu 130 135 140

Ser Phe Pro Glu Ala Ser Lys He Ala Lys Val Asp Phe Glu Thr Ala 105 150 155 160

Gly Lys Ser Phe Met Gin Glu Thr Leu Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 1e 5 17C 175

Pro Asn Hia Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 190 185 190

Asn Tyr Asn Gin Pro Thr Tyr Asn Gly Asn Cys Ser Asp Leu Glu Lys 195 200 205

Arg Arg Asn Asp Asp Leu Asp Trp Leu Trp Lys Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Phe Pro Ser val Tyr Leu Asn He Lys Leu Lys Ser Thr Pro Lys Ala 225 230 235 240

Ala Phe Tyr Val Arg Asn Arg Val Gin Glu Ala Tie Arg Leu Ser Lys 245 250 255 lie Ala Ser Val Glu Ser Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr His Arg Pro 260 265 270

Val Phe Thr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Leu Ser Gin Gly Asp Leu Val 275 200 285

Aan Ser Val Gly Glu He val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie lie Met 290 295 300

Trp Gly Ser Leu Asn Leu Ser Leu Thr Met Gin Ser Cya Met Asn Leu 305 310 315 320

Gly Asn Tyr Asn Thr Thr Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys His Asp Glu Gly Val Cys 340 345 350

Thr Arg Lys Gin Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro lie 355 360 355

Met Asn Phe Ala He Gin Thr Gly Lys Gly Gly Lys Tyr Thr Val Pro 370 3/5 380

Gly Lys Val Thr Leu Glu Asp Leu 01n Thr Phe Ser Asp Lya Phe Tyr 385 390 395 400

Cys Ser Cys Tyr Ala Asn lie Asn Cys Lys Lys Arg Val Asp He Lya 405 410 415

Asn Val His Ser Val Asn Val Cys Met Ala Glu Asp He Cys lie Glu 420 425 430

Gly Pro val Lys Leu Gin Pro Ser Asp His Ser Ser Ser Gin Asn Glu 435 440 445

Ala Ser Thr Thr Thr Val Ser Ser lie Ser Pro Ser Thr Thr Ala Thr 450 455 460

Thr Val Val 5er Pro Cys Thr Pro Glu Lys Gin Ser Pro Glu Cys Leu 465 470 475 490

Lys Val Arg Cys Leu Glu Ala He Ala Asn Val Thr Gin Thr Gly Cys 485 490 495

Gin Gly Val Lys Trp Lys Asn Thr Ser Ser Gin Ser Gin Ser Ser Tie 500 505 510

Gin Asn lie Lys Asn Gin Thr Thr 5L5 520 <210> 64 <211> 474 <212> PRT <213> Bos taurus <22 0> <223> PH20 <400> 64

Met Gly Met Pile Arg Arg Hi3 His 11ε Ser Phe Arg Ser Phe Ala Gly 15 10 15

Ser Ser Gly Thr Pro Gin Ala Val Phe Thr Phe Leu Leu Leu Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Ala Leu Asp Phe Arg Ala Pro Pro Leu He Ser Asn Thr Ser 35 * 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Val Glu Arg Cys Val Asn Arg Arg 50 55 60

Phe Gin Leu Pro Pro Asp Leu Arg Leu Phe Ser Val Lys Gly Ser Fro 65 30 75 80

Gin Lys Ser Ala Thr Gly Gin Phe lie Thr Leu Phe Tyr Ala Asp Arg 85 90 95

Leu Gly Tyr Tyr Pro His lie Asp Glu Lys Thr Gly Lys Thr Val Phe

100 105 HO

Gly Gly lie Pro Gin Leu Gly Asn Leu Lys Ser His Leu Glu Lys Ala 115 120 125

Lys Asn Asp He Ala Tyr Tyr lie Pro Asn Asp Ser Val Gly Leu Ala 130 135 140

Val lie Asp Trp Glu Asn Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys 145 150 155 160

Pro Lys Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ser Val Glu Leu Val Leu Gin Lys 16b 170 lib

Asn Pro Gin Leu Ser Phe Pro Glu Ala Ser Lys lie Ala Lys Val Asp ISO 185 190

Phe Glu Thr Ala Gly Lys Ser Phe Met Gin Glu Thr Leu Lys Leu Gly 195 200 205

Lys Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp 210 215 220

Cys Tyr Asn His Asn His Asn Gin Pro Thr Tyr Asn Gly Asn Cys Pro 225 230 235 240 A3p Val Glu Lys Arg Arg Asn Asp A3p Leu Glu Trp Leu Trp Lys Glu 245 250 255

Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Asn lie Arg Leu Lys Ser 260 265 270

Thr Gin Asn Ala Ala Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Gin Glu Ala He 275 280 205

Arg Leu Ser Lys lie Ala Ser Val Glu Ser Pro Leu Pro Val Phe Val 290 295 300

Tyr Ala Arg Pro Val Phe Thr Aap Gly Ser Ser Thr Tyr Leu Ser Gin 305 310 315 320

Gly Asp Leu Val Asn Ser Val Gly Glu He Val Ser Leu Gly Ala Ser 325 330 335

Gly lie lie Met Trp Gly Ser Leu Asn Leu Ser Leu Ser Val GLn Ser 340 345 353

Cys Met Aan Leu Gly Thr Tyr Leu Asn Thr Thr Leu Asn Pro Tyr lie 355 360 365 lie Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys His 370 375 380

Aap Gly Gly Val Cys Thr Arg Lys His Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu 3B5 390 355 400

His Leu Asn Pro Met Asn Phe Ala lie Gin Thr Gly Glu Gly Gly Lys 405 410 415

Tyr Thr Val Pro Gly Thr Leu Thr Leu Glu Asp Leu Gin Lys Phe Ser 420 425 430

Aap Thr Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Aan Leu Ser Cys Lys Lys Arg 435 440 445

Val Asp lie Lys Aan Val His Ser Val Asp Val Cys Met Ala Glu Asp 450 455 460

Val Cys lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro 465 470 <210> 65 <211> 517 <212> PRT <213> Ovis aries <4Ο0> 65

Asp Phe Arg Ala Pro Pro Leu lie Ser Asn Thr Ser Phe Leu Trp Ala 15 10 15

Trp Asia Ala Pro Ala Glu Arg Cys lie Lys lie Phe Lys Leu Pro Pro 20 25 30

Asp Leu Arg Leu Phe Ser Val Lys Gly Ser Pro Gin Lys Ser Ala Thr 35 40 45

Gly Gin Phe lie Thr Leu Phe Tyr Ala Asp Arg leu Gly Tyr Tyr Pro 50 55 60

His He Asp Glu Lys Thr Gly Asn Thr Val Tyr Gly Gly lie Pro Gin 65 70 75 80

Leu Gly Asn Leu Lys Asn His Leu Glu Lys Ala Lys Lys Asp lie Ala 85 90 95

Tyr Tyr lie Pro Asn Asp Ser Val Gly Leu Ala Val lie Agp Trp Glu 100 105 110

Asn Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr 115 120 125

Arg Asp Glu Ser Val G.l u Leu Val Leu Gin Lys Asn Pro Gin Leu Ser 130 135 140

Phe Pro Glu Ala Ser Lys lie Ala Lys Val Asp Fhe Glu Thr Ala Gly

145 150 155 ISO

Lys Ser Phe Met Gin Glu Thr Leu Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro 165 HD 175

Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His Asn 180 185 190

Tyr Asn Gin Pro Thr Tyr Asn Gly Asn Cys Ser Asp Leu Glu Lys Arg 195 200 205

Arg Asn Asp Asp Leu Asp Trp Leu Trp Lys Glu Ser Thr Ala Leu Phe 210 215 220

Pro Ser val Tyr Leu Asn lie Lys Leu Lys Ser Thr Pro Lys Ala Ala 22S 23Ú 235 240

Phe Tyr Val Arg Asn Arg Val Gin Glu Ala lie Arg Leu Ser Lys lie 245 250 255

Ala Ser val Glu Her Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr His Arg Pro Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Leu Ser Gin Gly Asp Leu Val Asn

275 280 2BS

Ser Val Gly Glu lie Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He lie Met Trp 250 295 300

Gly Ser Leu Asn Leu Ser Leu Thr Met Gin Ser Cys Met Asn Leu Gly 305 310 315 320

Asn Tyr Leu Asn Thr Thr Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys His Asp Glu Gly Val Cys 340 345 350 thr Arg Lys Gin Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn fro Met 355 360 365

Asn Phe Ala He Gin Thr Gly Lys Gly Gly Lys Tyr Thr Val Pro Gly 370 375 380

Lys Val Thr Leu Glu Asp Leu Gin Thr Phe Ser Asp Lys Phe Tyr Cys 335 390 395 400

Ser Cys Tyr Ala Asn lie Asn Cys Lys Lys Arq Val Asp lie Lys Asn 405 410 415

Val His Ser Val Asn Val Cys Met Ala Glu Asp lie Cys lie Glu Gly 420 425 430

Pro val Lys Leu Gin Pro Ser Asp His Ser Ser Ser Gin Asn Glu Ala 435 440 445

Ser Thr Tor Thr Val Ser Ser lie Ser Fro Ser Thr Thr Ala Thr Thr 4 50 4 55 4 60

Val Ser Pro Cys Thr Pro Glu' Lys Gin Ser Pro Glu Cys Leu ’Lys Val 465 470 475 480

Arg Cys Leu Glu Ala lie Ala Asn Val Thr Gin Thr Gly Cys Gin Gly 485 490 495

Val Lys Trp Lys Asn Thr Ser Ser Gin Ser Ser lie Gin Asn lie Lys 500 505 510

Aan Gin Thr Thr Tyr 515 <210> 66 <211> 1620 <212> ADN <213> Ovis aries <4Ο0> 6 6 ttttccgtgt tggttggctc tggacttcag agcaccccct ctcatttcaa acacttcttt 60 cctctgggcc tggaatgccc cagctgaacg ttgtattaaa atctttaaac tacatccaga 120 tctgagactc ttctctgtaa aaggaagccc ccaaaaaagt gctacgggac aatttattac 180 attattttat gctgatagac ttggctaota tcctcatata gatgaaaaaa caggcaacac 240 tgtatatgga ggaattcccc agttgggaaa cttaaaaaat catttggaaa aagccaaaaa 300 agacattgcc tattacafcac caaatgacag egegggcfctg gcggtcattg actgggaaaa 360 ctggaggcct acctgggcaa gaaautggaa açctasagat gtttacaggg atgagtctgt 420 tgagttggtt ctgcaaaaaa atccacaact cagtrtccca gaggcttcca agattgcaaa 480 agtggatttt gagacageag gaaagagttt catgcaagag aetttaaaac tgggaaaatt 540 acttcggcca aateaettat gqggttatta tctttttcct gattgttaca atcataatta 600 taaccagcat acttacaatg gaaattgctç tgatttagaa aaaaggagaa atgatgatct 660 cgactggttg tggaaggaaa gcactgccct tttcccttct gtttatttga atatcaagtt 720 aaaatctact ccaaaagctg ccttctatgt tcgtaatcgt gtccaggaag ccattcggtt '780 gtctaaaata gcgagtgtcg aaagtccact tcurgttttt gtatatcacc gtccagtttt 340 tactgatggg tcttcaacat acctttctea qqqtqacctt gtgaattcgg ttgqtgagat 900 cgttgctcta ggtgcctctg ggattataat gtggggcagt ctcaatctaa gcctaactat 960 gcaatcttgc atgaacctag gcaattactt gaacactaca ctgaatccct acataatcaa 1020 cgtcacccca gcagccaaaa tgtgcagcca agtgçtttgc gacgatgaag gagtgtgtac 1080 aaggaaacaa tggaattcaa gegactatct ecacctgaac ccaatgaatt ctgetattca 1140 aactgggaaa ggtggaaaat acacagtacc tgggaaagtc acacttgaag acctgcaaac 1200 gttrtctgat aaattttatt gnagttgtta tgecaacatc aactgtaaga agagagttga 1260 tataaaaaat gttcatagtg traatgtatg tatggcaçaa gatatttgta tagagggcce 1320 tgtgaagtta caacccagtg aicattcctc tagccagaat gaggcaccta ccaccaccgt 13B0 cagcagtatc tcaccctcta cracagccac cacagtatct ccatgtactc crgagaaaca 1440 glcccctgag tgcctcaaag tcaggtgttt ggaagccatc gccaacgtca cccaaacggg 1500 gtgtcaaggt gttaaatgga agaacacttc cagteagtca agtattcaaa atattaaaaa 1560 tcaaacaacc tattaaaata taaattcagt gcttataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620

<210> 67 <211> 793 <212> PRT <213> Arthrobacter sp. (estirpe FB24) <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 67

Met Thr Arg Glu Phe Ser Arg Arg Thr Ala Leu Lys Gly Ala Ala Leu 15 10 15

Ser Gly Leu Leu Leu Ala Met Vai His Gly Pro Ala H.is Ala Ala Ala 20 25 30

Thr Ala Asn Ala Thr Leu The Fro Ala Asp Phe Ala Gly Leu Arg Gin 35 40 45

Arg Trp Vai Asp Gin Tie Thr Gly Arg Lys Vai Leu Vai Ala Gly Αερ 50 55 60

Asn Asp Phe Vai Thr Ala Leu Ala Ala Leu Asp Lys Lys Ala Arg Thr 65 70 75 Θ0

Ala lie Asp Leu Leu Glu Arg Ser Ala Gly Arg Leu Thr Val Phe Ser 85 90 95

Asp Leu Ser Leu Ala Lys Asp Thr Asp Leu Val Thr Thr His 7hr Arg 100 105 HO

Lsu Ala Thr Met Ala Thr Ala Trp Ala Thr Pro Gly Ser Glu His Fhe 115 120 125

Ala Asp Ala Gly Leu Leu Ala Ala He Arg Ala Gly Leu Ala Asp Ala 130 135 110

Asn Ser Leu Cys Tyr Asn Ala Ser Lys Glu Glu Gin Gly Asn Trp Trp 145 150 1SS 160

Ser Trp Glu Tie Gly Thr Pro Lys Ala Leu Ala Asp Thr Met Val Leu 165 170 175

Leu His Ala Glu Leu Thr Ala Ala Glu Arg Ala Ala Tyr Cys Ala Ala 160 135 190 lie Asp His Phe Val Pro Asp Pro Trp Gin Gin Phe Pro Pro Lys Arg 195 200 205

Gly Lys lie Thr Ser Val Gly Ala Asn Arg Val Asp Lsu Cys Gin Ala 210 215 220

Val Thr He Arg Ser Leu Val Asp Glu Asp Ala Glu Lys Leu Thr His 22S 230 235 240

Ala Val Ala Gly Leu Ser Glu Val Trp Gin Tyr Val Ser Ala Gly Asn 245 250 255

Gly Phe Fhe Thr Asp Gly Ser Phe He Gin His Ser Thr Thr Pro Tyr 260 265 270

Thr Gly Ser Tyr Gly Val Val Leu Leu Thr Gly Leu Ser Lys Leu Phe 275 280 285

Ala Leu Leu Gly Gly Thr Gly Ala Glu Val Ser Asp Pro Ser Arg Asp 290 295 300 lie Leu Phe Lys Thr Val Glu Gly Ser Phe Ala Pro Phe Met Val Ala 305 310 315 320

Gly Ala Met Ala Asp Ser Val Arg Gly Arg Ser lie Ser Arg Glu Ser 325 ” 330 335

Asn Thr Gly Phe Asp Leu Gly Ala Ser Thr He Glu Ser lie Leu Leu 340 345 350

Leu Ala Arg Ala Val Asp Pro Val Thr Ala Arg Arg Trp Arg Ser Leu 355 360 365

Cys Leu Ala Trp He Asn Gin Asn Arg Lys Ala Pro He Leu Ala Asp 370 375 300

Ala Gly Val Gly Arg Thr Ala Leu Val Lys Glu Leu Leu Ala Met Gly 385 390 395 400

Leu Thr Glu Thr Asp Leu Pro Gly Gly His Tyr Leu Phe Pro Ala Met 4 DS 410 415

Asp Arg Thr Met His His Ser Gin Gly Trp Thr Leu Ser Thr Ala Met 420 425 430

Ala Ser Ser Arg lie Ala Trp Tyr Glu Cys Gly Asn Gly Glu Asn Asn 435 440 445

Arg Gly Tyr His Thr Gly Ser Gly Met Thr Tyr val Tyr Asp Gly Asp 450 455 460

Leu Gly Gin Tyr Asp Asp Ala Fhe Trp Ala Thr Ala Asn His Cys Arg 465 470 475 480 Léu Fro Gly lie Thr Val Asp Thr Ser Ser Leu Fro Asp Lys Val Glu 485 490 495

Gly Glu Trp Gly Ala Ala Thr Fro Ala Asn Glu Trp Thr Gly Sar Thr 500 505 510

Ala Tyr Gly Asp Val Ala Ala Val Gly Gin His Leu lie Gly Pro Gly 515 520 525

Gly Thr Gly Leu Thr Ala Arg Lys Set Trp Fhe Val Ser Lys Asp Val 530 535 540 lie Val Cys Leu GJLy Ala Asp lie Arg Thr Gly Ser Gly Ser Arg He 545 550 555 560

Glu Thr Val Val Asp His Arg Asn Leu His Ala Gly Phe Asn Ala Met 565 570 515

Gly Thr Ala Ala Gly Thr Val Ala Ala Thr Pro Gly His Pro Glu Val 580 585 590

Leu Thr Val Asp Arg Trp Val His Leu Glu Gly Phe Gly Gly Tyr Val 595 600 605

val Leu Asp Ala Ala Pro Leu Gin val Leu Arg Glu Gin Arg Glu Gly 610 6lS 62C

Ser Trp Ser Glu Val Asn Val Lys Gly Ser Ala Ala Arg Gin Thr Arg 625 630 635 640

Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Phe Asp His Gly His Glu Pro Glu Ala Ala 545 650 65 5

Ser Tyr Ala Tyr Leu val Ala Pro Gly Ala Ser Ala ser Met Thr Ser 660 665 670

Ser Leu Ser Gly Gin Ser Phe Kis Thr Val Leu Arg Asn Asp Glu Val 675 6B0 635

Ala Gin Ala Val Lys Phe Lys Lys Glu Lys Thr Thr Ala Ala Thr Phe 69C 695 700

Trp Arg Pro Gly Thr Val Gly Asp Leu Ala Leu Ser Gly Pro Ala Cys 705 710 715 720

Val Val Val Lya Glu Val Gly Asp Arg Leu Ser lie Ala Val Ser Asp 725 730 735

Pro Thr Gin Asn Ala Ser Thr Leu Thr Leu Arg Leu Lys Thr Lys Arg 740 745 750

Phe Phe Arg Tie He Glu Gly Gin Gly Ala Ser Leu Ser His Gly Ala 7S5 760 765

Asp Gly Phe Thr Val Leu Glu Val Asp lie Ala Asn His Ala Gly Arg 770 775 700

Thr Lys Gin lie Glu Leu Ser Ala Glu 785 790

<210> 68 <211> 557 <212> PRT <213> Bdellovibrio bacteriovorus <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 68

Met Thr Lys Phe Phe Phe Leu Leu Thr Leu lie Ser Ala Thr Ala Phe IS 10 15

Ala Gin Ser Glu Pro Asp Trp Thr Ala Gly Val Pro Val Pro Pro Gly 20 " 25 30

Gly Arg Ser Asn lie Tyr Ser Trp Asn Asp Phe Asp Phe Gin Ala Thr 35 4C 46

Leu Asn Lys Gly Lys lie His Ala Gin Val Tyr Pro Val Thr Val Thr SO 55 60

Gly Met Leu Pro Pro Tyr Glu Pro Val Arg Arg Leu lie Glu Giu Lys

65 70 75 BO

Asn Ser Asn Fro Leu Arg Lys Trp He Gin Ser Leu Met Lys Gly Leu 85 90 95

Ser Cly Phe Arg Ser Phe Glu A_sp Val Leu Lys Asn Leu Gly Leu His 100 105 110

Lya Tyr Pro Leu Glu Asn Glu Arg Gly Val Tyr Ala Val Pro Tyr Pro 115 120 125

Asn Glu lie Arg Pro Asp Thr Leu Met Gly Phe Gly Leu lie Glu Arg 130 135 140

Asn Gly Ala Glu Gly Phe Thr Phe Ser Cys Ala Ala Cys His Ser Ser

145 150 155 ISO

Asn Leu Phe Gly Lys Thr Val Leu Gly Met Thr Asn Arg Phe Pro Arg 165 170 Π5

Ala Asn Glu Phe Phe lie Lys Ala Lys Lya Val Met Pro Leu Met Asp 180 185 190

Fro His lie Phe Gin Ala Tyr Thr Arg Ala Thr Asp Ala Glu Thr Ala 195 200 205

Leu Leu Val Glu ser Lys Glu Arg leu Lys Ser Val Ala Leu Lys Gin 210 215 220

Pro lie Ala Leu Gly Leu Asp Thr Ser Leu Ala Gin Val Ser Leu Ser 225 230 235 240

Leu Asn Arg Arg Ala Lys Asp Gly Tyr Ala Asn Tyr Ser Asp Lys Ala 245 250 255

Ala Arg Ser Pro Arg Ala Asp Ala Tyr Leu Asp Asn Lys Pro Ala Asp 260 265 270

Ser Lys Pro Ala Val Trp Trp Asn Val Lys Tyr Lys Asn Arg Trp Leu 275 280 285

Ser Asp Gly Ser Val Leu Ser Gly Asn Pro lie Phe Thr Asn Leu lie 290 295 300

Trp Asn Glu lie Gly Arg Gly Ala Asp Leu His Glu Leu Glu Gin Trp 305 310 315 320

Leu Ala Asp Asn Asp His lie lie Lys Glu Leu Thr Thr Ala Val Phe 325 330 335

Ala Ser Glu Ala Pro His lie Thr Asp Phe Tyr Pro Ala Glu Lys lie 340 345 350

Asp Leu Gly Arg Ala Lys Ala Gly Glu Gin lie Phe Lys Asn Thr Cys 355 360 365 A.la Lys Cys His Gly His Tyr Glu Lys Ala Trp Asn Leu Pro Gin Ala 370 375 3 B0

Leu Val Leu Ser Ala Ala Glu Arg Leu Lys Thr Val Glu Val Arg Tyr 385 390 395 400

Lys Glu Lys Thr Pro Val Val Asn Vai Gly Thr Asp Pro Phe Arg Arg 405 410 415

Gin Gly Met Lys Ser Leu Glu Gin Leu Asn Asp Leu Glu lie Ser Lys 420 425 430

Lys Asn Gly Tie Val lie Lys Ala Gin Glu Gly Tyr Val Pro Pro Pro 435 440 445

Leu Val Gly He Trp Ala Arg Trp Pro Tyr Met His Asn Asn Ser lie 450 455 460

Pro Asn leu Cys Val Leu Leu Thr Pro Ala Lya Lya Arg Pro Ser He 465 470 475 480

Tyr Tyr Ser Gly Glu Ala Leu Asn Lys Asp Thr Asp Tyr Asp Phe Ser 485 490 495

Cys Gly Gly Tyr Pro lie Gly Asp Lys Thr Pro Lys Ala Trp Lys Thr 500 505 510

Arg Glu His Leu Tyr Asp Thr Arg Asn Pro Gly Met Gly Asn Met Gly SIS 520 525

His Asp Glu Gly lie Phe He Lys Asp Gly Lys Glu lie Leu Ser Ala 530 535 540

Glu Asp Lys Tyr Asn Leu lie Gin Phe Leu Gin Thr Leu 545 550 555

<210> 69 <211> 813 <212> PRT <213> Propionibacterium acnes <22 0> <223> hialuronano-liase <4Ο0> 6 9

Met Phe Gly Thr Pro Ser Arg Arg Thr Phe Leu Thr Ala Ser Ala Leu 15 10 15

Ser Ala Met Ala Leu Ala Ala Ser Pro Thr Val Thr Asp Ala lie Ala 20 25 ' 30

Ala Pro Gly Pro Asp Ser Trp Ser Ala Leu Cys Glu Arg Trp He Asp 35 40 45 lie tie Thr Gly Arg Arg Ala Ala Arg Thr Ser Asp Pro Arg Ala Arg SO 55 60

Ala lie lie Ala Lys Thr Asp Arg Lys Val Ala Glu lie Leu Thr Asp 65 70 75 Θ0

Leu Val Ser Gly Ser Ser Arg Gin Thr Val Leu lie Ser Ala Asp Leu 85 90 95

Arg Lys Glu Glu Ser Pro Phe lie Thr Lys Thr Ala Arg Ala lie Glu 100 105 110

Ser Met Ala Cys Ala Trp Ala Thr pro Gly Ser Ser Tyr His Lys Asp 115 120 125

Pro Glu lie Leu Ser Ala Cys lie Glu Gly Leu Arg Asp Phe Cys Arg 13C 135 140

Leu Arg Tyr Aae Pro Ser Gin Asp Glu Tyr Gly Aon Trp Trp Asp Trp 145 150 155 160

Glu Asp Gly Ala Ser Arg Ala Val Ala Asp Val Met Cys lie Leu His 165 170 175

Asp Val Leu Pro Pro Glu Val Met Ser Ala Ala Ala Ala Gly lie Asp 180 185 190

His Phe lie Pro Asp Pro Trp Phe Gin Gin Pro Ala Ser Val Lys Pro 195 200 205

Thr Ala Asn Pro Val Gin Pro Val Val Ser Thr Gly Ala Asn Arg Met 210 215 220

Asp Leu Thr Arg Ala Val Met Cys Arg Ser Tie Ala Thr Gly Asp Glu 225 230 235 240

Lys Arg Leu Arg His Ala Val Asp Gly Leu Pro Asp Ala Trp Arg Val 245 250 255

Thr Thr Glu Gly Asp Gly Phe Arg Ala Asp Gly Gly Phe He Gin His 260 265 270

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Leu Ala Met Leu Phe Pro Leu Val Ser Gly Met Arg Phe Asp lie Val 290 295 300

Glu Ser Ala Arg Lys Ala Phe His Asp Gin Val Glu Arg Gly Phe lie 305 310 315 320

Pro Val Met Tyr Asn Gly Gin lie Leu Asp Asp Val Arg Gly Arg Ser 325 330 335

Tie Ser Arg lie Aan Glu Ser Ala Ala Met His Gly He Ser lie Ala 340 345 350

Arg Ala Met Leu Met Met Ala Aap Ala Leu Pro Thr His Arg Ala Glu 355 360 365

Gin Trp Arg Gly lie Val His Gly Trp Met Ala Arg Asn Thr Phe Asp 370 375 380

His Leu Ser Glu Pro Ser Thr Leu Val Asp lie Ser Leu Phe Asp Ala 3B5 390 395 400

Ala Ala Lys Ala Arg Pro Val Pro Glu Ser Ser Thr Pro Ser Tyr Phe 405 410 415

Ala Ser Met Asp Are Leu Val His Arg Thr Ala Asp Trp Leu lie Thr 42D 425 430

Val Ser Asn Cys Ser Asp Arg He Ala Trp Tyr Glu Tyr Gly Asn Gly 435 440 445

Glu Asn Glu Trp Ala Ser Arg Thr Set Gin Gly Met Arg Tyr Leu Leu 450 455 4 bO

Leu Pro Gly Aap Met Gly Gin Tyr Glu Asp Gly Tyr Trp Ala Thr Val 465 470 475 480

Asp Tyr Ser Ala Pro Thr Gly Thr Thr Val Asp Ser Thr Pro Leu Lys 465 490 495

Arg Ala Val Gly Ala Ser Trp Ala Ala Lys Thr Pro Thr Asn Glu Trp 500 505 510

Ser Gly Gly Leu Ala Ser Gly Ser Trp Ser Ala Ala Ala Ser His lie 515 520 525

Thr Ser Gin Aap Ser Ala Leu Lys Ala Arg Arg Leu Trp Val Gly Leu 530 535 540

Lys Asp Ala Met Val Glu Leu Thr Thr Asp Val Thr Thr Asp Ala Ser 545 550 555 560

Arg Ala lie Thr Val Val Glu His Arg Lys Val Ala Ser Ser Ser Thr 565 570 575

Lys Leu Leu Val Asp Gly Asn Arg Val Ser Ser Ala Thr Ser Phe Gin 580 585 590

Asn Pro Arg Trp Ala His Leu Asp Gly Val Gly Gly Tyr Val Phe Ala 595 600 605

Thr Asp Thr Asp Leu Ser Ala Asp Val Ala Thr Arg Lys Gly Thr Trp 610 615 620 lie Asp Val Asn Pro Ser Arg Lys Val Lys Gly Ala Asp Glu Val Tie 625 630 635 640

Glu Arg Ala Tyr Ala Ser Leu His Val Thr His His Asp Arg Pro Val 645 650 655

Ala Trp Ala Leu Leu Pro Thr Ala Scr Arg Ser His Thr Met Ala Leu 660 665 670

Ala Thr Arg Pro Gly Val Glu Pro Phe Thr Val Leu Arg Asn Asp Ala 675 680 665

Thr Val Gin Ala Val Arg Ser Ala Gly Ala Leu Leu Thr Lys Asp Pro 690 695 700

Thr Val Val Thr Thr Leu Ala Phe Trp Lys Pro Ala Thr Cys Gly Gly 735 710 715 720

Val Ala Val Asn Arg Pro Ala Leu Val Gin Thr Arg Glu Ser Ala Asn 725 730 735

Gin Met Gin Val Val lie Val Glu Pro Thr Gin Lys Arg Gly Ser Leu 740 745 750

Thr val Thr lie Glu Gly Ser Trp Lys Val Lys Thr Ala Asp Ser His 755 760 765

Val Asp Val Ser Cys Glu Asn Ala Ala Gly Thr Leu His Val Asp Thr 770 775 780

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Thr Gin Thr Pro Scr Gly Gly Gly Arg His Asp Arg Ala 805 810

<210> 70 <211> 1072 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <22 0> <223> hialuronano-liase <4Ο0> 70

Met Glu He Lys Lys Lys Tyr Arg lie Met Leu Tyr Ser Ala Leu lie 15 10 15

Leu Gly Thr lie Leu Val Αεη Asn Ser Tyr Gin Ala Lys Ala Glu Glu 20 25 30

Leu Thr Lys Thr Thr Ser Thr Ser Glr. lie Arg Asp Thr Gin Thr Asn 35 40 45

Asn lie Glu Val Lei: Gin Thr Glu Ser Thr Thr Val Lys Glu Thr Ser 50 55 60

Thr Thr Thr Thr Gin Gin Asp Leu Ser Asn Pro Thr Ala'Ser Thr Ala 65 7 0 75 80

Thr Ala Thr Ala Thr Sis Ser Thr Met Lys Glr Val Val Asp Asn Gin 35 90 95

Thr Gin Asn Lys Glu Leu val Lys Asn Gly Asp Phe Asn Gin Thr Asn 100 105 110

Pro Val Ser Gly Ser Trp Ser His Thr Ser Ala Arg Glu Trp Ser Ala 115 120 125

Trp Ile Asp Lys Glu Asn Thr Ala Asp Lys Ser Pro lie He Gin Arg L30 135 140

Thr Glu Gin Gly Gin Val Ser Leu Ser Ser Asp Lys Gly Phe Arg Gly 145 150 155 160

Ala val Thr Gin Lys Val Asn He Asp Pro Thr Lys Lys Tyr Glu Val 165 Π0 17 5

Lys Phe Asp lie Glu Thr Ser Asn Lys Ala Gly Gin Ala Phe Leu Arg 180 185 190

He Met Glu Lys Lys Asp Asn Asn Thr Arg Leu Trp Leu Ser Glu Met 195 200 205

Thr Ser Gly Thr Thr Asn Lys His Thr Leu Thr Lys Ile Tyr Asn Pro 210 215 220

Lys Leu Asn Val Ser Glu Val Thr Leu Glu Leu Tyr Tyr Glu Lys Gly 225 230 235 240

Thr Gly Ser Ala Thr Phe Asp Asn Ile Scr Met Lys Ala Lys Gly Pro 245 250 255

Lys Asp Ser Glu His Pro Gin Pro Val Thr Thr Gin Ile Glu Glu Ser 260 2S5 270

Val Asn Thr Ala Leu Asn Lys Asn Tyr Val Phe Asn Lys Ala Asp Tyr 275 280 285

Gin Tyr Thr Leu Thr Asn Pro Ser Leu Gly Lys He Val Gly Gly Ile 290 295 300

Leu Tyr Pro Asn Ala Thr Gly Ser Thr Thr Val Lys lie Ser Asp Lys 305 310 315 320

Ser Gly Lys lie He Lys Glu Val Pro Leu Ser Val Thr Ala Ser Thr 325 330 335

Glu Asp Lys Phe Thr Lys Leu Leu Asp Lys Trp Asn Asp Val Thr He 340 345 350

Gly Asn His Val Tyr Asp Thr Asn Asp Ser Asn Met Gin Lys lie Asn 355 360 365

Gin Lys Leu Asp Glu Thr Asn Ala Lys Asn Ile Lys Thr lie Lys Leu 370 375 330

Asp Ser Asn His Thr Phe Leu Trp Lys Asp Leu Asp Asn Leu Asn Asn 385 390 395 400

Ser Ala Gin Leu Thr Ala Thr Tyr Arg Arg Leu Glu Asp Leu Ala Lys 405 410 415

Gin lie Thr Asn Pro His Ser Thr lie Tyr Lys Asn Gin Lya Ala He 420 425 430

Arg The Val Lys Glu Eer Leu Ala Trp Leu His Gin Asn Phe Tyr Asn 435 440 445

Val Asn Lys Asp lie Glu Gly Ser Ala Asn Trp Trp Asp Phe Glu lie 450 455 460

Gly Val Pro Arg Ser lie Thr Ala Thr Leu Ala Leu Met Asn Asn Tyr 465 470 475 460

Phe Thr Asp Ala Glu lie Lys Thr Tyr Thr Asp Pro lie Glu Fils Phe 4 85 4 90 4 95

Val Pro Asp Ala Gly Tyr Phe Arg Lys Thr Leu Asp Asn Pro Phe Lys 500 505 510

Ala Leu Gly Gly Asn Leu Val Asp Met Gly Arg Val Lys He lie Glu 515 520 525

Gly Leu Leu Arg Lys Asp Asn Thr He lie Glu Lys Thr Ser His Ser 530 535 540

Leu Lys Asn Leu Phe Thr Thr Ala Thr Lys Ala Glu Gly Phe Tyr Ala 545 550 555 560

Asp Gly Ser Tyr He Asp His Thr Asn Val Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr 565 570 575

Gly Asn Val Leu He Asp Gly Leu Thr Gin Leu Leu Pro He lie Gin 580 585 590

Glu Thr Asp Tyr Lys lie Ser Asn Gin Glu Leu Asp Met Val Tyr Lys

595 600 60S

Trp lie A3n Gin Ser Phe Leu Fro Leu lie Val Lys Gly Glu Leu Met 610 615 620

Asp Met Ser Arg Gly Arg Ser lie Ser Arg Glu Ala Ala Ser Ser His 625 630 635 6<0

Ala Ala Ala Val Glu Val Leu Arg Gly Phe Leu Arg Leu Ala Asn Met 645 650 655

Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Ser Thr He Lys Thr lie 660 665 670

He Thr Ser Asn Lys Phe Tyr Asn Val Phe Asn Asn Leu Lys Ser Tyr 675 680 685

Ser Asp He Ala Asn Met Asn Lys Mat Leu Asn Asp Ser Thr Val Ala 690 695 700

Thr Lys Pro Leu Lys Ser Asn Leu Ser Thr Phe Asn Ser Met Asp Arg 705 710 715 720

Leu Ala Tyr Tyr Asn Ala Glu Ly3 Asp Phe Gly Phe Ala Leu Ser Leu 725 730 735

His Ser Lys Arg Thr Leu Asn Tyr Glu Gly Met Asn Asp Glu Asn Thr 740 745 750

Arg Gly Trp Tyr Thr Gly Asp Gly Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Ser Asp 755 760 765

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Met Ala Gly Thr Thr Glu Lys Asp Ala Lys Arg Glu Asp Thr Thr Lys 7J5 790 795 800

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Val Thr Gly Thr Ser Asp Phe Val Gly Ser Val Lys Leu Asn Asp His 8 Ξ0 825 830

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Ala Gin Lys Gly Trp Val He Leu Asn Asp Lys He Val phe Leu Gly 850 855 860

Ser Asn lie Lya Asn Thr Asn Gly He Gly Asn Val Ser Thr Thr He 665 870 875 980

Asp Gin Arg Lys Asp Asp Sec Lys Thr Pro Tyr Thr Thr Tyr Val Α3Π 8S5 890 895

Gly Lys Thr Ils Asp Leu Lys Gin Ala Ser Ser Gin Gin Phe Thr Asp 900 905 910

Thr Lys Ser Val Phe Leu Glu Ser Lys Glu Pro Gly Ary Asn lie Gly 915 920 925

Tyr lie Phe Phe Lys Asn Ser Thr He Asp lie Glu Arg Lys Glu Gin 930 935 940

Thr Gly Thr Trp Asn S«r lie Asn Arq Thr ser Lys Asn Thr Ser He 945 950 955 960

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Asp Lys Leu Ala Asn Ser Lys Glu Val Glu Leu Leu Glu Asn Ser Ser 995 1000 1005

Lys Gin Gin Val lie Tyr Asp Lys Asn Ser Gin Thr Trp Ala Val He 1O10 1015 1020

Lys hrs Asp Asn Gin Glu Ser Leu lie Asn Asn Gin Phe Lys Met Asn 1025 1030 1035 104 0

Lys Ala Gly Leu Tyr Leu Val Gin I.ys Val Gly Asn Asp Tyr Gin Asn 1045 1050 1055

Val Tyr Tyr Gin Pro Gin Thr Met Thr Lys Thr Asp Gin Leu Ala lie 10 BO 1065 1070

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Met Glu lie Lys Lys Lys His Arg lie Met Leu Tyr Ser Ala Leu He 15 10 IS

Leu Gly Thr lie Leu Val Asn Asn Ser Tyr Gin Ala Lys Ala Glu Glu Ξ0 25 30

Leu Thr Lys Thr Thr Ser Thr Ser Gin Tie Arg Asp Thr Gin Thr Asn 35 40 45

Asn lie Glu Val Leu Gin Thr Glu Ser Thr Thr val Lys Glu Thr Ser 50 55 60

Thr Thr Thr Thr Gin Gin Asp Leu Ser Asn Pro Thr Ala Ser Thr Ala

65 70 75 SO

Thr Ala Thr Ala Thr His Ser Thr Met Lys Gin Val Val Asp Asn Gin 85 90 95

Thr Gin Asn Lys Glu Leu Val Lys Asn Gly Asp Phe Asn Gin Thr Asn 100 105 110

Pro Val Ser Gly Ser Trp Ser His Thr Ser Ala Arg Glu Trp Ser Ala 115 120 125

Trp lie Asp Lya Glu Asn Thr Ala Asp Lys Ser Pro lie lie Gin Arg 130 135 HO

Thr Glu Gin Gly Gin Val Ser Leu Ssr Ser Asp Lys Gly Phe Arg Gly 145 150 15S 160

Ala Val Thr Gin Lys Val Asn He Asp Pro Thr Lys Lys Tyr Glu Val 165 170 175

Lys Phe Asp lie Glu Thr Ser Asn Lys Ala Gly Gin Ala Phe Leu Arg 1Θ0 1Θ5 190 lie Met Glu Lys Lys Asp Asn Asn Thr Arg Leu Trp Leu Ser Glu Ket 195 200 205

Thr Ser Gly Thr Thr Asn Lys His Thr Leu Thr Lys He Tyr Asn Pro 21U 215 220

Lys Leu Asn Vai Ser Glu Val Thr Leu Glu Leu Tyr Tyr Glu Lys Gly 225 230 235 240

Thr Gly Ser Ala The Phe Asp Asn lie Ser Met Lys Ala Lys Gly Pro 245 250 255

Lys Asp Ser Glu His Pro Gin Pro Val Thr Thr Gin He Glu Glu Set 2 SO 265 270

Val Asn Thr Ala Leu Asn Lys Asn Tyr Val Phe Asn Lys Ala Asp Tyr 275 280 285

Gin Tyr Thr leu Thr Asn Pro Ser Leu Gly Lys lie Val Gly Gly He 290 295 300

Leu Tyr Pro Asn Ala Thr Gly Ser Thr Thr Val Lys He Ser Asp Lys 305 310 31S 320

Ser Gly Lys He He Lys Glu Val Pro Leu Ser Val Thr Ala Ser Thr 325 330 335

Glu Asp Lys Phe Thr Lys Leu Leu Asp Lys Trp Asn Asp Val Thr lie 340 345 350

Gly Asn His Val Tyr Asp Thr Asn Asp Ser Asn Met Gin Lys lie Asn 355 360 355

Gin Lys Leu Asp Glu Thr Asn Ala Lys Asn He Lys Thr lie Lys Leu 370 375 380

Asp Ser Asn His Thr Phe Leu Trp Lys Asp Leu Asp Asn Leu Asn Asn 385 390 395 400

Ser Ala Gin Leu Thr Ala Thr Tyr Arg Arg Leu Glu Asp Leu Ala Lys 405 410 415

Gin lie Thr Asn Pro His Ser Thr lie Tyr Lys Asn Glu Lys Ala lie 420 425 430

Arg Thr Val Lys Glu 5er Leu Ala Trp Leu His Gin Asn Phe Tyr Asn 435 440 445

Val Asn Lys Asp He Glu Gly Ser Ala Asn Trp Trp Asp Phe Glu lie 450 455 460

Gly val Pro Arg Ser lie Thr Ala Thr Leu Ala Leu Met Asn Asn Tyr 465 470 475 480

Phe Thr Asp Ala Glu lie Lys Thr Tyr Thr Asp Pro lie Glu His Phe 465 490 495

Val Pro Asp Ala Gly Tyr Phe Arg Lys Thr Leu Asp Asn Pro Phe Lys 500 505 510

Ala Leu Gly Gly Asn Leu val Asp Met Gly Arg Val Lys lie He Glu 515 520 525

Gly Leu Leu Arg Lys Asp Asn Thr He He Glu Lys Thr Ser His Ser

530 535 54C

Leu Lys Asn Leu Phe Thr Thr Ala Thr Lys Ala Glu Gly Phe Tyr Ala 545 550 555 560

Asp Gly Ser Tyr lie Asp His Thr Asn Val Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr 565 570 575

Gly Asn Val Leu He Asp Gly Leu Thr Gin Leu Leu Pro lie He Gin 580 " 535 590

Glu Thr Asp Tyr Lys lie Ser Asn Gin Glu Leu Asp Met Val Tyr Lys 595 600 605

Trp lie Asn Gin Ser Phe Leu Pro Leu lie Val Lys Gly Glu Leu Met 610 615 620

Asp Met Ser Arg Gly Arg Ser He Ser Arg Glu Ala Ala Ser Ser His 625 630 635 640

Ala Ala Ala Val Clu Val Leu Arg Gly Phe Leu Arg Leu Ala Asn Met 64 5 650 655

Ser Asr, Glu Glu Arg Asn Leu Asp Leu lie Ser Thr lie Lys Thr lie 660 665 670

He Thr Ser Asn Lys Phe Tyr Asn Val Phe Aan Asn Leu Lys £er Tyr 675 600 685

Ser Asp lie Ala Asn Met Asn Lys Met Leu Asn Asp Ser Thr Val Ala 690 695 700

Thr Lys Fro Leu Lya Ser Aan Leu Ser Thr Phe Asn Ser Met Asp Arg 705 710 715 720

Leu Ala Tyr Tyr Asn Ala Glu Lys Asp Phe Gly Phe Ala Leu Ser Leu 725 730 735

His Ser Lys Arg Thr Leu Asn Tyr Glu Gly Met Asn Asp Glu Asn Thr 740 745 750

Arg Gly Trp Tyr Thr Gly Asp Gly Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Ser Asp 755 760 765

Gin Ser His Tyr Ser Aan HÍ3 Phe Trp Pro Thr Val Asn Pro Tyr Lys 770 775 7Θ0

Met Ala Gly Thr Thr Glu Lys Asp Ala Lys Arg Glu Asp Thr Thr Lys 785 790 795 800

Glu Phe Met Ser Lys His Ser Lys Asp Ala Lys Glu Lys Thr Gly Gin 005 810 815

Val Thr Gly Thr Ser Asp Phe Val Gly Ser Val Lys Leu Asn Asp His 820 825 030

Phe Ala Leu Ala Ala Met Asp Phe Thr Asn Trp Asp Arg Thr Leu Thr 835 040 845

Ala Gin Lys Gly Trp Val lie Leu Asn Asp Lys lie Val Phe Leu Gly 850 855 860

Ser Asn lie Lys Asn Thr Asn Gly He Gly Asn Val Ser Thr Thr lie 865 870 875 880

Asp Gin Arg Lys Asp Asp Ser Lys Thr Pro Tyr Thr Thr Tyr Val Aan 885 890 895

Gly Lys Thr lie Asp Leu Lys Gin Ala Ser ser Gin Gin Phe Thr Asp 900 905 910

Thr Lys Ser Val Phe Leu Glu Ser Lys Glu Pro Gly Arg Asn lie Gly 91.6 920 925

Tyr He Phe Phe Lys Asn Ser Thr He Asp lie Glu Arg Lya Glu Gin 930 935 940

Thr Gly Thr Trp Asn Ser lie Asn Arg Thr Ser Lys Asn Thr Ser lie 945 950 955 960

Val Ser Asn Pro Phe lie Thr lie Ser Gin Lys His Asp Asn Lys Gly 965 970 S75

Asp Ser Tyr Gly Tyr Met Met Val Pro Asn He Asp Arg Thr Ser Phe 980 985 990

Asp Lys Leu Ala Asn Ser Lys Glu val Glu Leu Leu Glu Asn Ser Ser 995 1000 1005

Lys Gin Gin Val lie Tyr Asp Lys Asn Ser Gin Thr Trp Ala Val He 1010 1015 1020

Lys His Asp Asn Gin Glu Ser Leu He Asn Asn Gin Phe Lys Met Asn 1025 1030 1035 1040

Lys Ala Gly Leu Tyr Leu Val Gin Lys Val Gly Asn Asp Tyr Gin Asn 1045 1050 1055

Val Tyr Tyr Gin Pro Gin Thr Met Thr Lys Thr Asp Gin Leu Ala He 1060 1065 1070

<210> 72 <211> 1081 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae serotipo la <22 0> <223> hialuronano-liase <4Ο0> 72

Met Glu lie Lys Lys Lys His Arg lie Met Leu Tyr Ser Ala Leu lie 15 10 15

Leu Gly Thr lie Leu Val Asn Asn Ser Tyr Gin Ala Lys Ala Glu Glu 20 25 30

Phe Thr Lys Thr Thr Ser Thr Ser Gin He Arg Asp Thr Gin Thr Asn 35 40 45

Asn Val Glu Val Pro Gin Thr Glu Ser Thr Thr Val Lys Gly Thr Ser 50 55 60

Thr Thr Thr Thr Gin Gin Asp Leu Ser Asn Ser Thr Ala Ser Thr Ala 65 70 75 00

Thr Ala Thr Ala Thr His ser Thr Met Lys Gin Val val Asp Asn Gin 55 90 95

Thr Gin Asn Lys Glu Leu Val Lys Asn Gly Asp Phe Ly3 Glu Lys He 100 105 110 lie Asp Lys Lys lie Asp Lys Lys Ser Gin Trp Thr Asn Leu Tyr Gly 115 120 125

Ala Lys Asp Trp Asn Thr Tyr lie Asp Gin Thr Lys Ser Val Asn Lys 130 135 140

Ser Pro lie lie Gin Arg Thr Glu Gin Gly Gin Val Ser Leu Ser Ser 145 150 155 160

Asp Lys Gly Phe Arg Gly Ala Val Thr Gin Lys Val Asn lie Asp Pro 165 170 175

Thr Lys Lys Tyr Glu Val lys phe Asp He Glu Thr Ser Asn Lys Val 180 185 190

Gly Gin Ala Phe Leu Arg lie Met Lys lys Lys Asp Lys Asn Thr Arg 195 200 205

Leu Trp Leu Ser Glu Met Thr Sex Gly Thr Thr Asn Lys His Thr Leu 210 215 220

Thr Lys lie Tyr Asn Pro Lys Leu Asn Val Ser Glu Val Thr Lau Glu 225 230 235 240

Leu Tyr Tyr Glu Lys Gly Thr Gly Her Val Thr Phe Asp Asn Tie Ser 245 250 255

Mat Lys Ala Lys Gly Pro Lys Asp Ser Glu His Pro Gin Pro Val Thr 260 255 270

Thr Gin lie Glu Glu Ser Val Asn Thr Ala Leu Asn Lys Asn Tyr Val 275 2 B0 205

Phe Asn Lys Ala Asp Tyr Gin Tyr Thr Leu Thr Asn Pro 5er Leu Gly 290 295 300

Lys lie Val Gly Gly lie Leu Tyr Pro Ser Ala Thr Gly Ser Thr Thr 305 310 315 320

Val Lys lie Ser Asp Lys Ser Gly Ly3 lie He Lys Glu Val Pro Leu 325 330 335

Ser Val Thr Ala Ser The Glu Asp Asn Phe Thr Lys Leu Leu Asp Lys 340 345 350

Trp Asn Asp Val Thr lie Gly Asn His Val Tyr Asp Thr Asn Asp Ser 355 360 365

Asn Met Gin Lys Leu Asn Gin lys Leu Asp Glu Thr Asn Ala Lys Asn 370 375 3S0 lie Lys Asp lie Lys Leu Asp Ser Asn Arg Thr Phe Leu Trp Glu Asp 385 390 395 400

Leu Lys Gly Leu Asn Asn Sec Ala Gin Leu Thr Ala Thr Tyt Arg flrg 405 410 ' 415

Leu Glu Asp Leu Ala Lys Gin lie Thr Ash Pro His Ser Thr lie Tyr 420 425 430

Lys Asn Glu Lys Ala lie Arg Thr Val Lys Glu Ser Leu Ala Trp Leu 435 440 445

His Gin Asn Phe Tyr Asn Val Asn Lys Asp lie Glu Gly Ser Ala Asn 450 .455 4 ¢50

Trp Trp Asp Phe Glu lie Gly Val fro Arg Ser He Thr Ala Thr Leu 465 470 415 480

Ala Leu Met Asn Asn Tyr Phe Thr Asp Ala Glu He Lys Thr Tyr Thr 4B5 490 495 ASp Pro lie Glu His Phe Val Pro Asp Ala Gly Tyr Phe Arg Lys Thr 500 505 510

Leu Val Asn Pro Phe Lys Ala Leu Gly Gly Ash Leu Val Asp Met Gly 515 520 525

Arg Val Lys He lie Glu Gly Leu Leu Arg Lys Asp Asn Thr lie lie 530 535 540

Lys Lys Thr Ser His Ser Leu Lys Asn Leu Phe Thr Thr Ala Thr Lys 545 550 555 560

Ala Glu Gly Phe Tyr Ala Asp Gly Ser Tyr He Asp His Thr Asn Val 565 570 575

Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn val Leu lie Asp Gly Leu Thr Gin 5B0 585 590

Leu I,eu Pro He lie Gin Glu Thr Asp Tyr Lys He Ser Asn Gin Glu 596 600 605

Leu Asp Met Val Tyr Lys Trp lie Asn Gin Ser Phe Leu Pro Leu lie 610 615 620

Val Lys Gly Glu Leu Met Asp Met Ser Arg Gly Arg Ser He Ser Arg 625 630 635 640

Glu Ala Ala Ser Ser His Ala Ala Ala Val Glu Val Leu Arg Gly Phe 645 650 655

Leu Arg Leu Ala Asn Met Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Asp Leu Lys 660 665 670

Ser Thr He Lys Thr lie lie Thr Ser Asn Lys ?he Tyr Asn Val Phe 675 680 685

Asn Asn Leu Lys Ser Tyr Ser Asp lie Ala Asn Met Asn Lys Leu Leu 690 695 700

Asn Asp Ser Thr Val Ala Thr Lys Pro Leu Lys Ser Asn Leu Ser Thr 705 710 715 720

Phe Asn Ser Met Asp Arg Leu Ala Tyr Tyr Asn Ala Glu Lys Asp Phe 725 730 735

Gly Phe Ala Leu Ser Leu His Ser Lys Arg Thr Leu Asn Tyr Glu Gly 740 745 750

Met Ash Asp Glu Asn Thr Arg Gly Trp Tyr Thr Gly Asp Gly Met Phe 755 760 765

Tyr Leu Tyr Asn Ser Asp Gin Ser His Tyr Ser Asn His Phe Trp Pro 770 775 780

Thr Val Asn Pro Tyr Lys Met Ala Gly Thr Thr Glu Lys Asp Thr Gly 785 790 795 800

Arg Glu Asp Thr lie Lys Lys Leu Met Asn Arg Tyr Asp Lys Thr Asn 805 310 815

Lys Asn Ser Lys Val Met Thr Gly Gin Val Thr Gly Thr Ser Asp Phe 820 325 830

Val Gly Ser Val Lys Leu Asn Asp His Phe Ala Leu Ala Ala Met Asp B35 840 845

Phe Thr Asn Trp Asp Arg Thr Leu Thr Ala Gin Lys Gly Trp val He 850 855 B 60

Leu Asn Asp Lys lie Val Phe Leu Gly Sec Asn lie Lys Asn Thr Asn 865 670 675 600

Gly Val Gly Asn Val Ser Thr Thr lie Asp Gin Arg lys Asp Asp Eer ΘΘ5 090 695

Lys Thr Pro Tyr Thr Thr Tyr Val Asn Gly Lys Thr Val Asp Leu Lys 900 905 910

Gin Ala Ser Ser Gin Gin Phe Thr Asp Thr Lys Ser Val Phe Leu Glu 915 920 925

Ser Lys Glu Pro Gly Arg Asn lie Gly Tyr lie Phe Phe Lys Asn Ser 930 935 940

Thr lie Asp lie Glu Arg Lys Glu Gin Thr Gly Thr Trp Asn Ser lie 945 950 955 960

Asn Arg Thr Ser Lys Asn Thr Ser lie Val Ser Asn Pro Phe lie Thr 965 970 975 lie Ser Gin Lys His Asp Asn Lys Gly Asp Ser Tyr Gly Tyr Met Met 980 985 990

Val Fro Asn lie Asp Arg Thr Ser Phe Asp Lys Leu Ala Asn Ser Lys 9 95 1000 1005

Glu Val Glu Leu Leu Glu Asn Ser Ser Lys Gin Gin Val lie Tyr Asp 1010 1015 1020

Lys Asn Ser Glr. Thr Trp Ala Val lie Lys His Asp Asn Gin Glu Ser 1025 1030 1035 1040

Leu He Asn Asn Gin Phe Lys Met Asn Lya Ala Gly Leu Tyr Leu Val 1045 1050 1055

Gin Lys Val Gly Asn Asp Tyr Gin Asn Val Tyr Tyr Gin Pro Gin Thr 1060 1065 1070.

Met Thr lys Thr Asp Gin Leu Ala lie 1075 1030

<210> 73 <211> 984 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae serotipo III <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 73

Met Lys Gin Val Val Asp Asn Gin Thr Gin Asn Lys Glu Leu Val Lys 15 10 IS

Asn Gly Asp Phe Asn Gin Thr Asn Pro Val Ser Gly Ser Trp Ser His 20 25 30

Thr Ser Ala Arg Glu Trp Ser Ala Trp lie Asp Lys Glu Asn Thr Ala 35 40 45

Asp Lys Ser Pro lie lie Gin Arg Thr Glu Gin Gly Gin val Ser Leu 50 55 60

Ser Ser Asp Lys Gly Phe Arg Gly Ala Val Thr Gin Lys Val Asn lie 65 70 75 80

Asp Pro Thr Lys Lys Tyr Glu Val Lys Phe Asp lie Glu Thr Ser Asn 05 90 95

Lys Ala Gly Gin Ala Phe Leu Arg He Met Glu Lys Lys Asp Asn Asn 100 105 HO

Thr Arg Leu Trp Leu Ser Glu Met Thr Se£ Gly Thr Thr Asn Lys His 115 120 125

Thr Leu Thr Lys He Tyr Asn Pro Lys Leu Asn Val Ser Glu Val Thr 130 135 140

Leu Glu Leu Tyr Tyr Glu Lys Gly Thr Gly Ser Ala Thr Phe Asp Asn

145 150 155 ISO

He Ser Met Lys Ala Lys Gly Pro Lya Asp Ser Glu His Pro Gin Pro 165 170 175

Val Thr Thr Gin He Glu Glu Ser Val Asn Thr Ala Leu Asn Lys Asn 180 1H5 190

Tyr Val phe Asn Lys Ala Asp Tyr Gin Tyr Thr Leu Thr Asn Pro Ser 195 200 205

Leu Gly Lys lie Val Gly Gly He Leu Tyr Pro Asn Ala Thr Gly Ser 210 215 220

Thr Thr Val Lys lie Ser Asp I>ys Ser Gly Lys lie lie Lys Glu Val 225 210 235 240

Pro Leu Ser Val Thr Ala Ser Thr Glu Asp Lys Phe Thr Lys Leu Leu 245 250 255

Asp Lys Trp Asn Asp Val Thr lie Gly Asn His Val Tyr Asp Thr Asn 260 265 270

Asp Set Asn Met Gin Lys lie Asn Gin Lys Leu Asp Glu Thr Asn Ala 275 280 285

Lys Asn lie Lys Thr lie Lys Leu Asp Ser Asn His Thr Phe Lou Trp 290 295 300

Lys Asp Leu Asp Asn Leu Asn Asn Ser Ala Gin Leu Thr Ala Thr Tyr 305 " 310 315 320

Arg Arg Leu Glu Asp Leu Ala Lys Glfl lie Thr Asn Pro His Ser Thr 325 330 335 lie Tyr Lys Asn Glu Lys Ala lie Arg Thr Val Lys Glu Ser Leu Ala 340 345 350

Trp Leu His Gin Asn Phe Tyr Asn Val Asn Lys Asp He Glu Gly Ser 355 360 365

Ala Asn Trp Trp Asp Phe Glu lie Gly Val Pro Arg Ser lie Thr Ala 370 375 380

Thr Leu Ala Leu Met Asn Asn Tyr Phe Thr Asp Ala Glu lie Lys Thr 385 390 395 400

Tyr Thr Asp Pro lie Glu His Phe Val Pro Asp Ala Gly Tyr Phe Arg 405 410 415

Lys Thr Leu Asp Asn Pro Phe Lys Ala Leu Gly Gly Asn Leu Val Asp 420 425 430

Met Gly Arg Val Lys He lie Glu Gly Leu Leu Arg Lys Asp Asn Thr 435 440 445

He lie Glu Lys Thr Ser His Ser Leu Lys Asn Leu Phe Thr Thr Ala 450 455 460

Thr Lys Ala Glu Gly Phe Tyr Ala Asp Gly Ser Tyr lie Asp His Thr 465 470 475 480

Asn Val Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn val Leu lie Asp Gly Leu 485 490 495

Thr Gin Leu Leu Pro lie lie Gin Glu Thr Asp Tyr Lys He Ser Asn 500 505 510

Gin Glu Leu Asp Met Val Tyr Lys Trp lie Asn Gin Ser Phe Leu Pro 515 520 525

Leu lie Val Lys Gly Glu Leu Met Asp Met Ser Arg Gly Arg Ser lie 530 535 540

Ser Arg Glu Ala Ala Ser Ser His Ala Ala Ala Val Glu Val Leu Arg 545 550 555 560

Gly File Leu Arg Leu Ala Ash Met Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Asp 565 570 575

Leu Lys Ser Thr He Lys Thr lie lie Thr Ser Asn Lya Phe Tyr Asn 500 5S5 590

Val Phe Asn Asn Leu Lys Ser Tyr Ser Asp lie Ala Asn Met Asn Lys 595 600 605

Met Leu Asn Asp Ser Thr Val Ala Thr Lys Pro Leu Lys Ser Asn Leu 61C 615 620

Ser Thr Phe Asn Ser Met Asp Arg Leu Ala Tyr Tyr Asn Ala Glu Lys 625 630 635 640

Asp Phe Gly Phe Ala Leu Ser Leu His Ser Lys Arg Thr Leu Asn Tyr 695 650 655

Glu Gly Met Asn Asp Glu Asn Thr Arg Asp Trp Tyr Thr Gly Asp Gly 660 655 670

Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Ser Asp Gin Ser His Tyr Ser Asn His Phe 675 £80 685

Trp Pro Thr Val Asn Pro Tyr Lys Met Ala Gly Thr Thr Glu Lys Asp 690 695 700

Ala Lys Arg Glu Asp Thr Thr Lys Glu Phe Mel Ser Lys His Ser Lys 705 710 715 720

Asp Ala Lys Glu Lys Thr Gly Gin Val Thr Gly Thr ser Asp Phe Val 725 730 735

Gly Ser Val Lys Leu Asn Asp His Phe Ala Leu Ala Ala Met ASp Phe 740 745 750

Thr Asn Trp Asp Arg Thr Leu Thr Ala Gin Lys Gly Trp Val lie Leu 755 760 765

Asn Asp Lys lie Val Phe Leu Gly Ser Asn lie Lys Asn Thr Asn Gly 770 775 780

He Gly Asn Val Ser Thr Thr lie Asp Gin Arg Lys Asp Asp Ser Lys

705 790 795 BOO

Thr Pro Tyr Thr Thr Tyr Val Asn Gly Lys Thr lie Asp Leu Lys Gin 805 810 815

Ala Scr 5or Gin Gin Phe Thr Asp Thr Lys Ser Val Phe Leu Glu Ser B20 B25 830

Lys Glu Pro Gly Arg Asn lie Gly Tyr lie Phe Phe Lys Asn Ser Thr 335 840 845 lie Asp lie Glu Arg Lys Glu Gin Thr Gly Thr Trp Asn Ser He Asn 850 855 860

Arg Thr Ser Lys Asn Thr Ser lie Val Ser Asn Pro Phe lie Thr lie 865 370 875 880

Ser Gin Lys His Asp Asn Lys Gly Asp Ser Tyr Gly Tyr Met Met Val

835 890 B9S

Pro Asn lie Asp Arg Thr Ser Phe Asp Lys Leu Ala Asn Ser Lys Glu 900 90 5 910

Val Glu Leu Leu Glu Asn Ser Ser Lys Gin Gin Val Tie Tyr Asp Lys 915 920 925

Asn Ser Gin Thr Trp Ala Val lie Lys His Asp Asn Girt Glu Ser Leu 330 935 940 lie Asn Asn Gin Phe Lys Met Asn Lys Ala Gly Leu Tyr Leu Val Gin 94 5 950 955 960

Lys Val Gly Asn Asp Tyr Gin Asn Val Tyr Tyr Gin Pro Gin Thr Met 965 970 975

Thr Lys Thr Asp Gin Leu Ala lie 980

<210> 74 <211> 807 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus (estirpe COL) <22 0> <223> hialuronano-liase <4Ο0> 74

Met Thr Tyr Arq lie Lys Lys Trp Gin Lys Leu Ser Thr lie Thr Leu 15 10 15

Leu Met Ala Giy Val lie Thr Leu Asn Gly Gly Glu ?he Arg Ser Val 20 25 30

Asp Lys His Gin lie Ala Val Ala Asp Thr Asn Val Gin Thr Pro Asp 35 40 45

Tyr Glu Lys Leu Arg Asn Thr Trp Leu Asp Val Asn Tyr Gly Tyr Asp 50 55 60

Lys Tyr Asp Glu Asn Asn Pro Asp Met Lys Lys Lys ?he Asp Ala Thr 65 70 75 80

Glu Lys Glu Ala Thr Asn Leu Leu Lys Glu Ket Lys Thr Glu Ser Gly 85 90 95

Arg Lys Tyr Leu Trp Ser Gly Ala Glu Thr Leu Glu thr Asn Ser Ser 100 105 110

His Met Thr Arg Thr Tyr Arg Asn He Glu Iy3 lie Ala Glu Ala Met 115 120 125

Arg Asn Pro Lys Thr Thr Leu Asn Thr Asp Glu Asn Lys Lys Lys Val 130 135 140

Lys Asp Ala Leu Glu Trp Leu His Lys Asn Ala Tyr Gly Lys Glu Pro 145 150 155 160

Asp Lys Lys Val Lys Glu Leu Ser Glu Asn Phe Thr Lys Thr Thr Gly 165 170 175

Lys Asn Thr Asn Leu Asn Trp Trp Asp Tyr Glu lie Gly Thr Pro Lys 180 185 190

Ser Leu Thr Asn Thr Leu He Leu Leu Asn Asp Gin Phe Ser Asn Glu 195 200 205

Glu Lys Lys Lys Phe Thr Ala Pro lie Lys Thr Phe Ala Pro Asp ser 210 215 220

Asp Lys lie Leu Ser Ser Val Gly Lys Ala Glu Leu Ala lys Gly Gly 225 230 235 240

Asn Leu Val Asp lie Ser Lys Val Lys Leu Leu Glu Cys lie He Glu 245 250 255

Glu Asp Lya Asp Met Met Lys Lys Ser lie Asp Ser Phe Asn Lys Val 260 265 270

Phe Thr Tyr Val Gin Asp Ser Ala Thr Gly Lys Glu Arg Asn Gly Phe 275 2 B0 285

Tyr Lys Asp Gly Ser Tyr He Asp His Gin Asp Val Pro Tyr Thr Gly 290 295 300

Ala Tyr Gly Val Val Leu Leu Glu Gly lie Ser Gin Met Met Pro Met 305 310 315 320 lie Lys Glu Thr Pro Phe Asn Asp Lys Thr Gin Asn Asp Thr Thr Leu 325 330 335

Lys Ser Trp lie Asp Asp Gly Phe Met Fro Leu lie Tyr Lys Gly Glu 340 345 350

Met Met Asp Leu Ser Arg Gly Arg Ala lie Ser Arg Glu Asn Glu Thr 355 360 365

Ser His 5er Ala Ser Ala Thr Val Met Lys Ser Leu Leu Arg Leu Ser 370 375 390

Asp Ala Met Asp Asp Ser Thr Lys Ala Lys Tyr Lys Lys lie Val Lys 385 390 395 400

Ser Ser Val Glu Ser Asp Ser Sec Tyr Lys Gin Asn Asp Tyr Leu Asn 405 410 415

Ser Tyr Ser Asp lie Asp Lys Met Lys Ser Leu Met Thr Asp Asn Ser 420 425 430 lie 5er Lys Asn Gly Leu Thr Gin Gin Leu Lys lie Tyr Asn Asp Met 435 440 445

Asp Arg Val Thr Tyr His Asn Lys Asp Leu Asp Phe Ala Phe Gly Leu 450 455 460

Ser Met Thr Ser Lys Asn Vai Ala Arg Tyr Glu Ser lie Asn Gly Glu 465 410 475 430

Asn Leu Lys Gly Trp His Thr Gly Ala Gly Met Ser Tyr Leu Tyr Asn 485 490 495

Ser Asp Vai Lys His Tyr His Asp Asn Phe Trp Vai Thr Ala Asp Met 500 505 510

Lys Arg Leu Ser Gly Thr Thr Thr leu Asp Asn Glu lie Leu lys Asp 515 520 525

Thr A3p Asp Lys Lys Ser Ser Lys Thr L’he Vai Gly Gly Thr Lys Vai 530 535 540 ASp ASp Gin Ais Ala Ser lie Gly Met Asp Phe Glu Asn Gin Asp Lys 545 550 555 560

Thr Leu Thr Ala Lys Lys Ser Tyr Phe lie Leu Asn Asp Lys Ile Vai 565 570 575

Phe Leu Gly Thr Gly Ile Lys Ser Thr Asp Ser Ser Lys Asn Pro Vai 500 5S5 590

Thr Thr Ile Glu Asn Arg Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Leu Tyr Thr Asp 595 600 605

Asp Lys Gin Thr Thr Asn Ser Asp Asn Gin Glu Asn Asn Ser Vai Phe 610 615 620

Leu Glu Ser Thr Asp Thr Lys Lys Asn Ile Gly Tyr His Phe Leu Asn 62 5 630 635 640

Lys Pro Lys ile Thr Vai Lys Lys Glu Ser His Thr Gly Lys Trp Lys 645 650 655

Glu lie Asn Lys Ser Gin Lys Asp Thr Gin Lys Thr Asp Glu Tyr Tyr 660 665 670

Glu Vai Thr Gin Lys His Ser Asn Ser Asp Asn Lys Tyr Gly Tyr Vai 675 6Θ0 685

Leu Tyr Pro Gly Leu Ser Lys Asp Vai Phe Lys Thr Lys Lys Asp Glu 690 695 700

Vai Thr Vai Vai Lys Gin Glu Asp Asp Phe His Vai Vai Lys Asp Asn 705 710 715 720

Glu Ser Vai Trp Ala Gly Vai Asn Tyr Ser Asn Ser Thr Gin Thr Phe 725 730 735

Asp lie Asn Asn Thr Lys Vai Glu Vai Lys Ala.Lys Gly Met Phe lie 740 745 750

Leu Lys Lys Lys Asp Asp Asn Thr Tyr Glu Cys Ser Phe Tyr Asn pro 755 760 765

Glu Ser Thr Asn Ser Ala Ser Asp Ile Glu Ser Lys Ile Ser Met Thr 770 775 730

Gly Tyr Ser Tie Thr Asn Lys Asn Thr Ser Thr Ser Asn Glu Ser Gly

785 790 795 SCO

Vai His Phe Glu Leu Thr Lys 805

<210> 75 <211> 420 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus (estirpe MRSA252) <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 75

Met Thr Tyr Arg Met Lys Lys Trp Gin Lys Leu Ser Tnr ile Thr Leu 15 10 15 teu Met Ala Gly Vai Ile Thr leu Asn Gly Gly Glu Phe Arg Ser Ile 20 25 30

Asp Lys His Gin lie Ala Val Ala Asp The Asm Val Gin Thr Thr Asp 35 40 45

Tyr Glu Lys Leu Arg Asn Ila Trp Leu Asp Val Asn Tyr Gly Tyr Asp 50 55 60

Lys Tyr Aap Glu Asn Asn Pro Asp Mat Lys Lys Lys Phe Glu Ala Thr 65 70 75 80

Glu Asn Glu Ala Glu Lys Leu Leu Lys Glu Met Lys Thr Glu Ser Asp 85 50 05

Arg Lys Tyr Leu Trp Glu Ser Ser Lys Asp Leu Asp Thr Lys Ser Ala 100 10S 110

Asp Met Thr Arg Thr Tyr Arg Asn lie Glu Lys lie Ser Glu Ala Met 115 120 125

Lys His Lys Asn Thr Lya Lau Lys Thr Asp Glu Asn Lys Thr Lys Val 130 135 140

Lys Asp Ala Leu Glu Trp Leu His Lys Asn Ala Tyr Gly Lys Glu Pro 145 150 155 160

Asp Lys Lys Val Ala Asp Leu Thr Ser Asn Phe Lys Asn Lys Thr Ser 165 170 Π5

Arg Asn Thr Asn Leu Asn Trp Trp Asp Tyr Glu lie Gly Thr Pro Arg 180 185 150

Ala Leu Thr Asti Thr Leu lie Leu Leu Gin Glu Asp Fhe Thr Asp Glu 195 200 205

Glu Lys r.ys Lys Tyr Thr Ala Pro Tie Lys Thr Phe Ala Pro Asp 5er 210 215 220

Asp Lys lie Leu Ser Ser Val Gly Lys Ser Glu Pro Ala Lys Gly Gly 225 230 235 210

Asn Leu Val Asp lie Ser Lys Val Lys Leu Leu Glu Set lie lie Glu 245 250 255

Glu Asp Lys Asp Met Met Lys Lys Ser lie Asp Ser Phe Aan Thr Val 260 265 270

Phe Thr Tyr Ala Gin Asn Ser Ala Thr Gly Lys Glu Arg Asn Gly Phe 275 280 285

Tyr Lys Asp Gly Ser Tyr lie Asp His Glr. Asp Val Fro Tyr Thr Gly 290 295 300

Ala Tyr Gly Val Val Leu Leu Glu Gly lie Ser Gin Met Met Pro Met 3D5 310 315 320

He Lys Glu Thr Pro Phe Asn Asp Ser Asn Gin Asn Asp Thr Thr Leu 325 33C 335 lys Ser Trp lie Asp Asp Gly Phe Met Pro Leu lie Tyr Lys Gly Glu 340 345 350

Met Met Asp Leu Ser Arg Gly Arg Ala lie Ser Arg Glu Asn Glu Thr 35S 360 365

Ser His Ser Ala Ser Ala Thr Va_ Met Lys Ser Leu Leu Arg Leu Ser 370 375 380

Asp Thr Met Asp Lys Ser Thr Lys Ala Lys Tyr Lys Lys lie Val Lys 335 390 395 400

Thr Ser val Glu Ser Asp Ser Ser Tyr Lya Gin Thr Asp Tyr Leu Ser 405 410 415

Ser Tyr Ser Asp 420

<210> 76 <211> 806 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus (estirpe MRSA252) <22 0> <223> hialuronano-liase <4Ο0> 76

Met Thr Asn Lys Met Lys Lys Trp GL11 Lys Leu Scr Thr lie Thr leu 1 5 ' 10 15

Leu Met Thr Gly Val lie Ala Leu Asn Asn Gly Glu Phe Arg Asn Val 20 25 30

Asp Lys His Gin lie Ala Val Ala Asp Thr Asr. Val Gin Thr Pro Asp 35 40 45

Tyr Glu Lys Leu Lys Lys Thr Trp Leu Asp Val Asn Tyr Gly Tyr Asp 53 55 60

Gin Tyr Asp Glu Asn Asn Gin Asp Met Lys Lys Lys Phe Asp Ala Lys 65 70 75 60

Glu Lys Glu Ala Lys Lys Leu Leu Asp Asp Met Lys Thr Asp Thr Asn 65 90 95

Arg Thr Tyr Leu Trp Scr Gly Ala Glu Asn Leu Glu Thr Asn Ser Ser 100 105 110

His Met Thr Lys Thr Tyr Arg Asn TLe Glu Lys lie Ala Glu Ser Ket 115 120 125

Gin Hia Lya Asn Thr Val Leu Lys Thr Val Glu Asn Lys Leu Lys lie 130 135 140

Lys Glu Ala Leu Asp Trp Met Hrs Lys Asn Val Tyr Gly Lys Asn Pro 145 150 155 160

Ser Gin Lys Val Glu Asp leu Thr Lys Asn Arg Lys Gly Gin Thr Thr 165 170 175

Pro Lys Asn Asn Ser Leu Asn Trp Trp Asp Tyr Glu lie Gly Thr Pro 130 1B5 190

Arg Ala Leu Thr Asn Thr Leu Leu Leu Met Asp Asp Met Leu Thr Lys 195 200 205

Asp Glu Met Lys Asn Tyr Ser Lys Fro lie Ser Thr Tyr Ala Pro Ser 210 215 220

Ser Asp Lys lie Leu Ser Ser Val Gly Glu Ser Glu Asp Ala Lys Gly 225 230 2 35 240

Gly Asn Leu Val Asp He Ser Lys Val Lys Leu Leu Glu Ser Val He 245 250 25b

Glu Glu Asp Val Asp Met Leu Lys Lys Ser lie Asp Ser Phe Asn Lys 26C 265 270

Val Phe Thr Tyr Val Gin Asp Ser Ala Thr Gly Lys Gly Arg Asn Gly 275 280 205

Phe Tyr Lys Asp Gly Ser Tyr lie Asp His Gin Asp Val Pro Tyr Thr 290 295 300

Gly Ala Tyr Gly Val val Leu Leu Glu Gly lie Ser Gin Met Met Pro 305 310 315 320

Met lie Lys Glu Ser Pro Phe Lys Thr Thr Gin Asp Asn Ala Thr Leu 325 33C 335

Ser Asn Trp lie Asp Glu Gly Phe Met Pro Leu lie Tyr Lys Gly Glu 340 345 " 350

Met Met Asp Leu Ser Arg Gly Arg Ala lie Ser Arg Glu Asn Glu Thr 355 360 365

5er his Thr Ala Ser Ala Thr Val Met Lys Ser Leu Leu Arg Leu Asn 370 375 3ÉQ

Asp Thr Met Asp Asp Ser Thr Lys Thr Arg Tyr Lys Gin lie Val Lys 335 390 395 400

Thr Eer Val Asn Ser Asp Ser Ser Tyr Asn Gin Asn Asn Tyr Leu Asn 405 410 415

Ser Tyr Ser Asp He Ala Lys Met Lye Lys Leu Met Asn Asp Ser Thr 420 423 430 lie Ser Lys Asn Asp Leu Thr Gin Gin Leu Lys lie Tyr Asn Asp Met 43b 440 445

Asp Arg Val Thr Tyr His Asn Lys Asp Leu Asp Phe Ala Phe Gly Leu 450 455 460

Ser Met Thr Ser Lys Asn lie Ala Arg Tyr Glu Asn lie Asn Gly Glu 465 470 475 430

Asn Leu Lys Gly Trp His Thr Gly Ala Gly Met Ser Tyr Leu Tyr Asn 485 430 495

Ser Asp Val Lys His Tyr Arg Asp Asn Phe Trp Ala Thr Ala Asp Met 500 505 510

Thr Cys Leu Pro Gly Thr Thr Thr Leu Asn Asp Met Pro Ser Thr Asn 515 520 525

Thr Lys Asn Asp Lys Ser Phe Val Gly Gly Thr Lys Leu Asn Asn Lys 530 535 540

Tyr Ala Ser He Gly Met Asp Phe Glu Asn Gin Asp Lys Thr Leu Thr 545 550 555 560

Ala Lys Lys Ser Tyr Phe lie Lev Asn Asp Lys lie val Phe Leu Gly 565 570 575

Thr Gly lie Lys Ser Thr Asp Ser Ser Lys Asn Pro Val Thr Ser Val 580 585 590

Glu Asn Arg Lys Ala Asn Gly Tyr lys Leu Phe Lys Asp Asp lie Glu 535 600 605 lie Thr Thr Ser Asp Val Asn Ala Gin Glu Thr His Ser Val Fhe Leu 610 615 620

Glu Ser Asn Asp Thr Lys Lys Asn lie Gly Tyr His Phe Leu Asp Lys 625 630 635 640

Pro Lys lie Thr Val Lys Lys Glu Ser His Thr Gly Lys Trp Ser GLu 645 650 655

He Asn Lys Ser Gin Lys Lys Asp Asp Lys Lys Asp Glu Tyr Tyr Glu 660 665 670

Val Thr Gin Thr His Asn Thr Ser Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Val Leu 675 680 685

Tyr Pro Gly Leu Ser Lys Ser Asp Phe Lys Ser Lys Asn Asn Asn Val 690 695 700

Ser lie Val Lys Gin Asp Glu Asp Phe His Val lie Lys Asp Asn Asp 705 710 715 720

Gly Val phe Ala Gly Val Asn Tyr Ser Asp Asn Thr Lys Ser Phe Asp 725 730 735 lie Asn Gly lie Thr Val Glu Leu Lys Glu Lys Gly Met Phe Val lie 740 745 750

Lys Lys Lys Asp Asp Lys Ala Tyr Lys Cys Ser Phe Tyr Asn Pro Glu 755 760 765

Thr Thr Asn Thr Ala Ser Asn He Glu Ser Lys lie Phe lie Ly3 Gly 770 775 780

Tyr Thr lie Thr Asn Lys Ser Val lie Asn Ser Asn Asp Ala Gly Val 785 790 795 800

Asn Phe Glu Leu Thr Lys BOS

<210> 77 <211> 815 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus (estirpe MSSA476) <22 0> <223> hialuronano-liase <4Ο0> 77

Met Thr Tyr Arg lie Lys Lys Trp Gin Lys Leu Ser Thr lie Thr Leu 15 10 15

Leu Met Ale Gly Val 11b Thr Leu Asn Gly Gly Glu Phe Arq Ser lie 20 25 30

Asp Lye Tyr Gin lie Ala Val Ala Asp Thr Asn Val Gin Thr Pro Asp 35 40 45

Tyr Glu Lys Leu Arg Asn Thr Trp Leu Asp Val Asn Tyr Gly Tyr Asp 50 55 60

Lys Tyr Asp Glu Lys Asn Asp Ala Met Lys Lys Lys ?hç Glu Ala Thr 65 TO 75 80

Glu Asn Glu Ala Lys Lys Leu Leu Set Glu Met Lys Thr Glu Ser Asp 85 90 95

Arg Lys Tyr Leu Trp Glu Asn Ser Lys Asp Lau Asp Thr Lys Ser Ala ICO 105 110

Asp Met Thr Arg Thr Tyr Arg Asn lie Glu Lys He Ala Glu Ala Met 115 12C 125

Lya His Lys Asp Thr Lys Leu Lys lie Asp Glu Asn Lys Lys Lys Val 130 135 140

Lys Asp Ala Leu Glu Trp Leu His Lys Asn Ala Tyr Gly Lys Glu Pro 145 150 155 160

Asp Lys Lys Val Ala Asp Leu Thr Ser Asn Phe Lys Asn Lys Thr Ser 165 170 175

Arg Asn Thr Asn Leu Asn Trp Trp Asp Tyr Glu lie Gly Thr pro Arg 180 185 190 AJa Leu Thr Asn Thr Leu lie Leu Leu Asn Asp Gin Fhe Ser Asn Asp 195 20C 205

Glu Lys Lys Lys Tyr Thr Ala Pro lie Lys Thr Phe Ala Pro Glu Ser 210 215 220

Asp Lys lie Leu Ser Ser Val Gly Gin Pro Glu Gin Ala Lys Gly Gly

225 230 235 24C

Asn Leu Val Asp lie Ala Lys Val Lys Leu Leu Glu Ser lie lie Glu 245 250 255

Glu Asp Lys Asp He Thr Lys Asn Ser lie Asp Ala Phe Asn Lys Val 260 265 270

Phe Thr Tyr Val Gin Ser Asn Ala Thr Gly Lys Glu Arg Asn Gly Phe 275 280 285

Tyr Lys Asp Gly Ser Tyr lie Asp His Gin Asp Val Pro Tyr Thr Gly 290 295 300

Lys Ser Trp lie Asp Asp Gly Phe Met Pro Leu lie Tyr Lys Gly Glu 340 345 350

Met Met Asp Leu Ser Arg Gly Arg Ala lie Ser Arg Glu Asn Glu Thr 355 360 365

Ser Fils Thr Ala Ser Ala Thr Val Met Lye Ser Leu Leu Arg Leu Ser 370 375 380

Aap Ala Met A3p Asp Ser Thr Lys Ala Lya Tyr Lys Gin lie Val Lys 385 390 395 400

Thr Ser Val Lys Ser Asp Ser Ser Tyr Gly Gin Asn Asp Thr Leu Ser 405 410 415

Ser Tyr Ser Asp He Ser Lys Met Lys Sar Leu Met Glu Asp Ser Thr 420 425 430 lie Ser Thr Asn Gly Leu Thr Gin Gin Leu Lys lie Tyr Asn Asp Met 435 440 445

Asp Arg Val Tnr Tyr His Aim Lys Asp Leu Asp Pbe Ala Phe Gly Leu 4 SO 455 4 60

Ser Met Thr 5er Lys Asn Val Ala Arg Tyr Glu Ser lie Asn Gly Glu 465 410 415 480

Asn Leu Lys Gly Trp His Thr Gly Ala Gly Met Ser Tyr Leu Tyr Asn 485 490 495

Ser Asp Val Lys His Tyr Arg Asp Aen Phe Trp Ala Thr Ala Asp Met 500 50S 510

Lys Arg Leu Ala Gly Thr Thr Thr Leu Glu Ash Glu Glu Pro Lys Gly 515 520 525

Thr Asp Val Lys Lys Ser Ser Lys Thr Phe Val Gly Gly Thr Lys Phe 530 535 540

Asp Asp Gin His Ala Ser lie Gly Met Asp Phe Glu Asn Gin Asp Lys S4S 550 555 560

Thr Leu Thr Ala Lys Lys Ser Tyr Phe lie Leu Asn Asp Lys lie Val S6S 570 575

Phe Leu Gly Thr Gly He Lys Ser Thr Asp Ser Ser Lys Asn Pro Val 580 585 590

Thr Thr lie Glu Asn Arg Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Leu Tyr Thr Asp 595 600 605

Asp Lys Gin Thr Thr Ala Ser Asp Asn Gin Gly Thr Asn Ser Val Phe 610 615 620

Leu Glu Ser Thr Asrt Ly3 Pro Lys Asn. Asn He Gly Tyr His Phe Leu 625 630 635 640

Asn Glu Ser Lys lie Thr Val Lys Lys Glu Ser His Thr Gly Lys Trp 645 65C 655

Ser Asp lie Asn Lys Ser Gin Lys Gin Asp Ser Lys Thr Asn Gin Tyr 660 665 670

Tyr Glu Val Thr Gin Lys His Ser Asn Thr Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr 675 680 685

Val Leu Tyr Pro Gly Leu Ser Lys Asp Asp Phe Asn Thr Lys Lys Asp 690 695 ' 700

Lys Val Thr Val Val Lys Gin Asp Asp Asp Phe His Val Val Lys Asp 705 HO 715 720

Asn Glu Ser Val Trp Ala Gly Val Asn Tyr Ser Asp Ser Thr Gin Thr 725 730 735

Phe lie He Asn Asn Thr Lys Val Glu Val Lys Ala Lys Gly Met Phe 740 745 750 lie Leu Lys Lys Lys Asp Asp Lys Thr Tyr Glu Cys Ser Phe Tyr Asn 755 760 765

Pro Glu Ser Thr Asn Thr Ala Ser Asp lie Glu Ser Lys He Ser Met 770 775 780

Thr Gly Tyr Ser lie Thr Asn Lys Asn Thr Ser Thr Ser Asn Glu Ser 785 790 795 800

Gly Val Arg Phe Glu Leu Gin Gin Thr Leu Asn Lys Asp Asp Asn 805 SIC 815

<210> 78 <211> 807 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus (estirpe NCTC 8325) <22 0> <223> hialuronano-liase <4Ο0> 78

Met Thr Tyr Arg lie Lys Lys Trp Gin Lys Leu Ser T)ir lie Thr Leu 15 10 15

Leu Met Ala Ely Val lie Thr Leu Asn Gly Gly Glu Phe Arg Ser Val 20 25 30

Asp Lys His Gin lie Ala Val Ala Asp Thr Asn Val Gin Thr Pro Asp 35 40 45

Tyr Glu Lys Leu Arg Asn Thr Trp Leu Asp Val Asn Tyr Gly Tyr Asp 50 55 60

Lys Tyr Asp Glu Asn Asn Pro Asp Met Lys Lys Lys Phe Asp Ala Thr 65 70 75 ao

Glu Lys Glu Ala Thr Asn Leu Leu Lys Glu Met Lys Thr Glu Ser Gly 85 90 95

Arg Lys Tyr Leu Trp Ser Gly Ala Glu Thr Leu Glu Thr Asn Ser Ser 100 105 110

His Met Thr Arg Thr Tyr Arg Asn lie Glu Lys lie Ala Glu Ala Met 115 120 125

Arg Asn Pro Lys Thr Thr Leu Asn Thr Asp Glu Asn Lys Lys Lys Val 130 135 140

Ly3 Asp Ala Leu Gill Trp Leu His Lys Asti Ala Tyr Gly Lys Glu Pro .145 150 155 160

Asp Lys Lys Val Lys Glu Leu Ser Glu Asn Phe Thr Lys Thr Thr Gly 165 170 175

Lys Asn Thr Asn Leu Asn Trp Trp Asp Tyr Glu lie Gly Thr Pro Lys ISO 185 190

Ser Leu Thr Asn Thr Leu He Leu Leu Asn Asp Gin phe Ser Asn Glu 195 200 205

Glu Lys Lys Lys Phe Thr Ala Pro lie Lys Thr Phe Ala Pro Asp Ser 210 215 220

Asp Lys lie Leu Ser Ser Val Gly Lys Ala Glu Leu Ala Lys Gly Gly 225 230 235 240

Asn Leu Val Asp lie Ser Lys Val Lys Leu Leu Glu Cys lie lie Glu 245 250 255

Glu Asp Lys Asp Met Met Lys Lys Ser He Asp Ser Phe Asn Lys Val 260 265 270

Phe Thr Tyr Val Gin Asp Ser Ala Thr Gly Lys Glu Arg Asn Gly Phe 275 280 285

Tyr Lys Asp Gly Ser Tyr lie Asp His Gin Asp Val Pro Tyr Thr Gly 290 295 300

Ala Tyr Gly val Val Leu Leu Glu Gly lie Ser Gin Met Met Fro Met 305 310 315 320 lie Lys Glu Thr Pro Phe Asn Asp Lys Thr Gin Asn Asp Thr Thr Leu 325 330 335

Lys Ser Trp He Asp Asp Gly Phe Met Pro Leu lie Tyr Lys Cly Glu 340 345 350

Met Met Asp Leu Ser Arq Gly Arq Ala He Ser Arg Glu Asn Glu Thr 355 ' 360 365

Ser His Eer Ala Ser Ala Thr Val Met Lys Ser Leu Leu Arg Leu Ser 370 375 360

Asp Ala Met Asp Asp Ser Thr Lys Ala Lys Tyr Lys Lys lie Val Lys 385 390 395 400

Ser Ser Val Glu Ser Asp Ser Ser Tyr Lys Gin Asn Asp Tyr Leu Asn 405 410 415

Ser Tyr Ser Asp lie Asp Lys Met Lys 5er Leu Met Thr Asp Asn Ser 420 425 430

He Ser Lys Asn Gly Leu Thr Gin Gin Leu Lys He Tyr Asn A$p Met 435 440 445

Asp Arg Val Thr Tyr"His Asn Lys Asp Leu Asp Phe Ala Phe Gly Leu 450 455 " 460

Ser Met Thr Ser Lys Asn Vai Ala Arg Tyr Glu Ser He Asn Gly Glu <165 470 475 4 30

Asn Leu Lys Gly Trp Kis Thr Gly Ala Gly Met Ser Tyr Leu Tyr Asn 435 490 495

Ser Asp Vai Lys His Tyr Hie Asp Asn Phe Trp Vai Thr Ala Asp Met 500 505 510

Lys Arg Leu Ser Gly Thr Thr Thr Leu Asp Asn Glu He Leu Lys Asp 515 523 525

Thr Asp Asp Lys Lys Ser Ser Lys Thr Phe Vai Gly Gly Thr Lys Vai 530 535 540

Asp Asp Sir His Ala Ser lie Gly Met Asp Phe Glu Asn Gin Asp Lys 545 550 555 560

Thr Leu rhr Ala Lys Lys Ser Tyr Phe lie Leu Asn Asp Lys lie Val 565 570 575

Phe Leu Gly Thr Gly lie Lys Ser Thr Asp Ser Ser Lys Asn Pr« Val 500 505 590

Thr Thr lie Glu Asn Arg Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Leu Tyr Thr Asp 595 6D0 605

Asp Lys Gin Thr Thr Asn Ser Asp Asn Gin Glu Asn Asn Ser Val Phe 610 615 620

Leu Glu Ser Thr Asp Thr Lys Lys Asn lie Gly Tyr His Phe Leu Asn 625 630 635 640

Lys Pro Lys He Thr Val Lys Lys Glu Ser His Thr Gly Lys Trp Lys 645 650 655

Glu lie Asn Lys Ser Gin Lys Asp Thr Gin Lys Thr Asp Glu Tyr Tyr 660 665 670

Glu Val Thr Gin Lys His Ser Asn Ser Asp Asn Lys Tyr Gly Tyr Val 675 680 685

Leu Tyr Fro Gly Leu Ser Lys Asp Val Fhe Lys Thr Lys Lys Asp Glu 690 695 700

Val Thr Val Val Lys Gin Glu Asp Asp Phe His Val Val Lys Asp Asn 70S 710 715 720

Glu Ser Val Trp Ala Gly Val Asn Tyr Ser Asn Ser Thr Gin Thr Phe 725 730 735

Asp 11c Asn A3n Thr Lys Val Glu Val Lys Ala Lys Gly Met Phe Tic 740 745 750

Leu Lys Lys Lys Asp Asp Asn Thr Tyr Glu Cyg Ser Phe Tyr Asn Pre 755 760 765

Glu Ser Thr Asn Sar Ala Ser Asp He Glu Ser Lys lie Ser Met Thr 770 775 780

Gly Tyr Ser He '[hr Asn Lys Asn Thr Ser Thr Ser Asn Glu Ser Gly

705 790 795 BCO

Val His Phe Glu Leu Thr Lys 005

<210> 79 <211> 809 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus (estirpe bovina RF122) <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 79

Met Thr Tyr Arg Met Lys Lys Trp Gin Lys Leu Ser Thr lie Thr Leu IS 10 15

Leu Met Ala Gly Gly lie Thr Phe Asn Asp Ser Glu Phe Arg Ser Val 20 25 30

Asp Lys His Gin He Ala Val Ala Asp Thr Asn Val Gin The Pro Asn 35 40 45

Tyr Glu Lys Leu Lys Asn Thr Trp Leu Asp Val Asn Tyr Gly Tyr Asp 50 55 60

Lys Tyr Asp Glu Ser Asn Pro Asp Met Lys Lys Lys Phe Glu Ala Thr 65 70 75 " 80

Glu Lys Glu Ala Arg Lys Leu Leu Ser Glu Met Lys Thr Glu Ser Asp 85 90 95

Arg Lys Tyr Leu Trp Glu Asn Ser Lys Asp Leu Asp Thr Lys Ser Ala 100 105 110

Asp Met Thr Arg Thr Tyr Arg Asn lie Glu Lys He Ala Glu Ala Met 115 120 125

Lys His Pro Lys Thr Thr Leu Lys Asn Asp Glu Asn Lys Lys Lys Val 130 135 140

Ly$ Asp Ala Leu Glu Trp Leu His Lys Asn Ala Tyr Gly Lys Glu Pro 145 150 155 160

Gly Lys Lys Val Ala Asp Leu Lys Thr Asn Phe Ser Lya Ser Ala Pro 165 170 Π5

Gin Lys Asn Thr Asn Leu Asn Trp Trp Asp Tyr Glu lie Gly Thr Pro 180 185 190

Arg Ala Leu Thr Asn Thr Leu lie Leu Leu Lys Glu Asp Phe Thr Asp 195 200 205

Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Thr Ala Pro He Lys Thr Phe Ala Pro Lys 210 215 220

Ser Asp Glu lie Leu Ser Ser Val Gly Lys Ala Glu Pro Ala Lys Gly 22S 230 235 240

Gly Asn Leu Val Asp lie Ser Lys Val Lys Leu Leu Glu Ser Tie lie 24S 250 255

Glu Glu Asp Lys Asp Met Met Lys Asn Ser lie Asp Ser Phe Asn Lys 260 265 270

Val Phe Thr Tyr Val Gin Asp Ser Ala Thr Asp Lys Glu Arg Asn Gly 275 280 2 85

Phe Tyr Lys A3p Gly Ser Tyr lie Asp His Lys Asp val Pro Tyr Thr 290 295 300

Gly Ala Tyr Gly Val Val Leu leu Glu Gly lie Ser Gin Met Met Pro 305 310 315 320

Met lie Lys Glu Thr Pro Phe Asn Asp Lys Thr Gin Asn Asn Thr Thr 325 330 335

Leu Thr Ser Trp lie Asp Asp Gly Phe Met Pro Leu He Tyr Lys Gly 340 345 350

Glu Met Met Asp Leu Ser Arg Gly Arg Ala lie Ser Arg Glu Asn Glu 355 360 365

Thr 5er His Ser Ala Ser Ala Thr Val Met Lys Ser Leu Leu Arg Leu 370 375 380

Ser Asp Ala Met Asp Glu Ser Thr Lys Ala Lys Tyr Lys Gin Tie Val 385 390 395 400

Lys Asn Ser Val Lys Ser Asp Ser Ser Tyr Gly Gin Asn Asp Thr Leu 405 410 415 ser Ser Tyr Ser Asp lie Asp Lys Met Lys Ser Leu Met Thr Asp Set 420 425 430

Thr lie Ser Thr Asn Gly Leu Thr Gin Gin Leu Lys lie Tyr Asn ALa 435 440 445

Met Asp Arg val Thr Tyr His Asn Lys Asp Leu Asp Phe Ala Phe Gly 450 455 ~ 460

Leu Ser Met Thr Ser Lys Asn Val Ala Arg Tyr Glu Asn He Asn Gly 465 470 475 480

Glu Asn Leu Lys Gly Trp Hia Thr Gly Ala Gly Met Ser Tyr Leu Tyr 4 B 5 490 495

Asn Ser Asp Val Arg His Tyr Arg Asp Asn Phe Trp Ala Thr Ala Asp 50C 505 510

Met Lys Arg Leu Ala Asp Thr Thr Thr Leu Glu Asn Glu Glu Pro Lys 515 520 525

Gly Thr Asp Val lys Lys Ser Ser Lys Thr Phe Val Gly Gly Thr Lys 530 535 540

Phe Asp Asp Gin His Ala Sar He Gly Met Asp Phe Glu Asn Gin Asp 545 550 555 560

Lys Thr Leu Thr Ala Lys Lys Sar Tyr Phe lie Leu Asn Asp Lys lie 565 570 575

Val Phe Leu Gly Thr Gly He Lys Thr Thr Asp Ser Ser Lys Asn. Pro 580 585 590

Val Thr Thr He Glu Asn Arg Lys Ala His Gly Tyr Thr Leu Tyr Thr 595 600 605

Asp Asp Lys Gin Thr Thr Asn Ser Asn Asn Gin Glu Thr Asn Ser Val 610 615 620

Phe Leu Glu Ser Thr Asn Ser Thr Gin Aan Asn He Gly Tyr His Phe 625 630 635 640

Leu Asn Lys Ser Lys lie Thr Val Lys Lys Glu Ser His Thr Gly Lys 645 650 655

Trp Ser Asp lie Asn Lys Ser Gin Lys Asp Thr Gin Lys Thr Asp Glu 660 665 670

Tyr Tyr Glu val Thr Gin Lys His Ser Asn Thr Asp Asp Lys Tyr Ala 675 680 685

Tyr Val Leu Tyr Pro Gly He Thr Lys Asp Asn Phe Lys Ser Lys Ala 690 695 700

Sar Gin Val Thr Val Val Lys Gin Asp Asp Asp Phe His Val Val Lys 705 710 715 720

Asp Asn Glu Ser Val Trp Ala Gly Val Asn Tyr Ser Asp Ser Thr Gin 725 730 735

Thr Phe Asp lie Asn Gly Thr Lya Val Glu Val Lys Ala Lys Gly Met 740 745 750

Phe He Leu Lys Lys Lys Asp Asp Asn Thr Tyr Glu Cys Ser Phe Tyr 755 760 765

Asn Pro Glu Ser Thr Asn Ser Ala Ser Asp Tie Glu Ser Lys He Ser 770 775 7 BO

Met Thr Gly Tyr Ser lie Thr Asn Lys Asn Thr Ser Asn Thr Asn Glu 785 790 795 800

Ser Gly Val Arg Phe Glu Leu Thr Lys 80S

<210> 80 <211> 807 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus (estirpe bovina RF122) <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 80

Met Thr Tyr Lys Met Lys Lys Trp Gin Lys Leu Ser Thr lie Thr Leu 15 10 IS

Leu Met Ala Gly Val lie Thr Leu Asn Asn Gly Glu Phe Arg Asn Val 20 25 30

Asp Lys His Gin lie Ala Val Ala Asp Thr Asn Val Gin Thr Pro Asp 35 40 45

Tyr Glu Lys Leu Lys Lys Thr Trp Leu Asp val Asn Tyr Gl^ Asn Asp 50 55 60

Gin Tyr Asp Glu Asn Asn Gin Asp Met Lys Lys Lys Phe Asp Ala Lys

65 70 75 BO

Glu Asn Glu Ala Lys Lys Leu Leu Glu Asp Met Lys The Asp Thr Asn 85 30 95

Arg Thr Tyr Leu:Trp Ser Gly Ala Glu Asn Leu Glu Thr Asn Ser Ser 100 105 HO fils Met Thr Lys Thr Tyr Arg Asn lie Glu Lys lie Ala Slu Ala Met 115 120 125

Arg His Lys Asn Thr Ser Leu Lys Thr Asp Glu Asn Lys t>eu Lys lie 130 135 140

Lys Asp Ala lie Lys Trp Leu His His Asn Val Tyr Gly Lys Asp Fro 145 150 155 160

Asp Lys Lys Val Ala Asp Leu Thr Thr Asn Arg Lys GLu Lys Asp Ser 165 170 175

Ser Lys Lys Asn Asn Ser Leu Asn Trp Trp Asp Tyr Glu Ele Gly Thr 180 185 L 9D

Pro Arg Ala Leu Thr Asn Thr Leu Leu Leu Met Asp Asn Met Leu Thr 195 200 205

Lys Asp Glu Met Lys Asn Tyr Ser Lys Pro lie Ser He Tye Ser Pro 210 215 220

Ser Ser Tyr Lys lie Leu Ser Ser Val Gly Glu Ser Glu Asp Ala Lys 225 230 235 240

Gly Gly Asn Leu Val Asp He Ala Lys Val Lys Phe Leu Glia Ser Val 245 250 255 lie Glu Glu Asp Val Asp Met Met Lys Lys Ser lie Asp Ser Phe Asn 260 265 270

Lys Val Phe Thr Tyr Val Gin Asp Ser Ala Thr Gly Lys Ala Arg Asn 275 200 285

Gly Phe Tyr Lys Asp Gly Ser Tyr lie Asp His Gin Asp Val Pro Tyr 290 295 300

Thr Gly Ala Tyr Gly Val Val Leu Leu Glu Gly He Ser Gin Met Met 305 310 315 320

Pro Met lie Lys Glu Ser Pro Phe Lys His Thr Gin Asp Lya Ala Thr 325 330 335

Leu Ser Asn Trp lie Asp Glu Gly Phe Met Pro Leu 11« Tyr Lys Gly 340 345 350

Glu Met Mat Asp Leu Ser Arg Gly Arg Ala lie Ser Arg Glu Asn Glu 355 360 365

Thr Ser His Thr Ala Ser Ala Thr Val Met Lys Ser Leu Leu Arg Leu 370 375 390

Ser Asp Thr Met Asp Glu Ser Thr Lys Thr Lys Tyr Lys Gin lie Val 335 390 395 400

Lys Thr Ser Val Lys Ser Asp Ser Ser Tyr Asp Ser Asn Asp Thr Leu 405 410 415

Aan Ser Tyr Ser Asp lie Asp Lys Met Lys Lys Leu Met Asn Asp Ser 420 425 430

Thr He Ser Lys Asn Asp Leu Thr Gin Gin Leu Lys He Tyr Asn Asp 435 440 445

Met Asp Arg Val Thr Tyr His Asn Lys Glu Leu Asp Phe Ala Phe Gly 450 455 460

Leu Ser Met Thr Ser Lys Asn lie Ala Arg Tyr Glu Asn He Asn Gly 465 470 475 4B0

Glu Asn Leu Lys Gly Trp His Thr Gly Ala Gly Met Ser Tyr Leu Tyr 485 490 495

Asn Ser Asp Val Lys His Tyr Arg Asp Asn Phe Trp Ala Thr Ala Asp SOD SOS 510

Met Thr Arg Leu Pro Gly Thr Thr Thr Leo Asn Asp Met Pro Sec Thr 515 520 525

Asn Thr Lys Asn Asp Lys Ser Phe Val Gly Gly Thr Lys Leu Asn Asn 530 535 540

Lys Tyr Ala Ser lie Gly Met Asp Phe Glu Asn Gin Asp Lys Thr Leu 545 550 555 560

Thr Ala Lys Lys Ser Tyr Phe lie Leu Asn Asp Lys He Val Phe lie 565 570 575

Gly Thr Gly lie Lys Eer Thr Asp Ser Ser Lys Asn Pro Val Thr Ser 58C 585 590

Val Glu Asn Arg Lys Ala Asn Gly Tyr Lys Leu Phe Lys Gly Asp lie 595 600 605

Glu He Thr Thr Ser Asp Val Asn Ala Gin Glu Thr His Ser Val Phe filC 615 620

Leu Glu Ser Asn Asp Thr Lys Lys Asn lie Gly Tyr His Phe Leu Asp 625 630 635 640

Lys Pro Lys lie Thr Val Lys Lys Glu Ser His Thr Gly Lys Trp Ser 645 650 655

Glu lie Asn Lys Ser Gin Lys Thr Asp Asp Lys Lys Asp Glu Tyr Tyr 660 665 670

Glu Val Thr Gin Thr His Asn Thr Ser Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Val 675 680 605

Leu Tyr Pro Gly Leu Ser Lys Ser Asp Phe Lys Ser Lys Asn Asn Asn 690 695 700

Val Ser lie Val Lys Gin Asp Glu Asp Phe His Val lie Lys Asp Asn 735 710 71S 720

Asp Gly Val Phe Ala Gly Val Asn Tyr Ser Asp Ser Thr Lys Ser Phe 725 730 735

Asp lie Asn Gly Thr Tie Val Glu Leu Lys Glu Lys Gly Met Phe Val 740 745 750

He lys Lys Lys Asp Aap Asn Thr Tyr Glu Cys Ser Phe Tyr Asn Pro 755 760 765

Thr Ser Thr Asn Ser Thr Ser Asn Lys Glu Ser Lys lie Ser Val Thr 770 775 780

Gly Tyr Thr lie Thr Asn Gin Ser Val Ser Asn Phe Lys Glu Ser Asp 735 790 795 800

He His Phe Glu Leu Thr Lys 8 G 5

<210> 81 <211> 807 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus (estirpe USA300) <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 81

Met Thr Tyr Arg lie Lys Ly3 Trp Gin Lys Leu Ser Thr lie Thr Leu 1 5 10 15

Leu Net Ala Giy Val lie Thr Leu Asn Gly GLy Glu Phe Arg Ser Val 20 25 30

Asp Lys Hi s Gin He Ala Val Ala Asp Thr Asn Val Gin Thr Pro Asp 35 40 , 45

Tyr Glu Lys Leu Arg Asn Thr Trp Leu Asp val Asn Tyr Gly Tyr Asp 50 55 60

Lys Tyr Asp Glu Asn Asn Pro Asp Met Lys Lys Lys Phe Asp Ala Thr 65 TO 75 00

Glu Lys Glu Ala The Asn Leu Leu Lys Glu Met Lys Thr Glu Ser Gly 85 90 95

Arg Lys Tyr Leu Trp Ser Gly Ala Glu Thi Leu Glu Thr Asn Ser Ser 100 105 110

His Met Thr Arg Thr Tyr Arg Asn He Glu Lys lie Ala Glu Ala Met 115 120 125

Arg Asn Pro Lys Thr Thr Leu Asn Thr Asp Glu Asn Lys Lys Lys val 130 135 140

Lys Asp Ala Leu Glu Trp Leu 01s Lys Asn Ala Tyr Gly Lys Glu Fro 145 150 155 160

Asp Lys Lys Val Lys Glu Leu Ser Glu Asn Pile Thr Lys Thr Thr Gly 165 Π0 Π5 I.ys Asn Thr Asr. Leu Asn Trp Trp Asp Tyr Glu He Gly Thr Pro Lys ISO 135 190

Ser Leu Thr Aan Thr Leu lie Leu Leu Asn Asp Gin Phe Ser Asn Glu 195 200 205

Glu Lys Lys Lys Phe Thr Ala Pro lie Lys Thr Phe Ala Pro Asp Ser 210 215 220

Asp Lys lie Leu Ser Ser Val Gly Lys Ala Glu Leu Ala Lys Gly Gly 225 230 235 240

Asn Leu Val Asp lie Ser Lys Val Lys Leu Leu Glu Cys lie lie Glu 245 250 255

Glu Asp Lys Asp Met Met. Lys l.ys Ser Tie Asp Ser Phe Asn I.ys Val 260 265 270

Phe Thr Tyr Val Gin Asp Ser Ala Thr Gly Lys Glu Arg Asn Gly Phe 275 200 2S5

Tyr Lys Asp Gly Ser Tyr lie Asp His Gin Asp Val Pro Tyr Thr Gly 290 295 300

Ala Tyr Gly Val Val Leu Leu Glu Gly lie Ser Gin Met Met Fro Met 305 310 315 320

He Lys Glu Thr Pro Phe Asn Asp Lys Thr Gin Asn Asp Thr Thr Leu 325 " 330 335

Lys Ser Trp lie Asp Aap Gly Phe Met Pro Leu He Tyr Lys Gly Glu 340 345 350

Met Met Asp Leu Ser Arg Gly Arg Ala lie Ser Arg Glu Asn Glu Thr 355 360 365

Ser His Ser Ala Ser Ala Thr Val Met Lys Ser Leu Leu Arg Leu Ser 370 375 3B0

Asp Ala Met Asp Asp Ser Thr Lys Ala Lys Tyr Lys Lys lie Val Lys 335 390 395 400

Ser Ser Val Glu Ser Asp Ser Ser Tyr Lys Gin Asn Asp Tyr Leu Asn 405 410 415

Ser Tyr Ser Asp lie Asp Lys Met Lys Ser Leu Met Thr Asp Asn Ser 420 425 430

He Ser Lys Asn Gly Leu Thr Gin Gin Leu Lys lie Tyr Asn Asp Met 435 440 445

Asp Arg Val Thr Tyr His Asn Lys Asp Leu Asp Phe Ala Phe Gly Leu 450 455 460

Ser Met Thr Ser Lys Asn Val Ala Arg Tyr Glu Ser.He Asn Gly Glu 465 470 475 400

Asn Leu Lys Gly Trp his Thr Gly Ala Gly Met Ser Tyr Leu Tyr Asn 485 490 495

Ser Asp Val Lys His Tyr His Asp Asn Phe Trp Val Thr Ala Asp Met 500 505 510

Lys Arg Leu 'Scr Gly Thr Thr Thr Leu Asp Asn Glu lie Leu Lya Asp 515 520 525

Thr Asp Asp Lys Lys Scr Ser Lys Thr Phe Val Gly Gly Thr Lys Val S 30 535 540

Asp Asp Gin His Ala Ser lie Gly Mat Asp Phe Glu Asn Gin Asp Lys 545 550 5S5 560

Tiic Leu Thr Ala Lys Lys Ser Tyr Phe lie Leu Asn Asp Lys lie Val 565 570 575

Phe Leu Gly Thr Gly lie Lys Ser Thr Asp Ser Ser Lys Asn Pro Val 500 585 580

Thr Thr lie Glu Asn Arg Lys Ala Aan Gly Tyr Thr Leu Tyr Thr Asp 595 600 605

Asp Lys Gin Thr Thr Asn Ser Asp Asn Gin Glu Asn Asn Ser Val Phe E10 615 620

Leu GLu Ser Thr Asp Thr Lys Lys Asn lie Gly Tyr His Phe Leu Asn 625 630 635 640

Lys Pro Lys lie Thr Val Lys Lys Glu Ser His Thr Gly Lys Trp Lys 615 650 655

Glu lie Asn Lys Ser Gin Lys Asp Thr Gin Lys Thr Asp Glu Tyr Tyr 660 665 670

Glu Val Thr Gin Lys His Ser Asn Ser Asp Asn Lys Tyr Gly Tyr Val S?5 660 685

Leu Tyr Pro Gly Leu Ser Lys Asp Val Phe Lys Thr Lys Lys Asp Glu 690 695 700

Val Thr Val Val Lys Gin Glu Asp Asp Phe Hie Val Val Lys Asp Asn 705 710 715 720

Glu Ser Val Trp Ala Gly Val Asn Tyr Ser Asn Ser Thr Gin Thr Phe 725 730 735

Asp He Asn Asn Thr Lys Val Glu Val Lys Ala Lys Gly Met Phe lie 740 745 750

Leu I.ys Lys Lys Asp Asp Asti Thr Tyr Glu Cys Ser Fhe Tyr Asn Pro 755 760 765

Glu Ser Thr Asn Ser Ala Ser Asp He Glu Ser Lys lie Ser Met Thr 770 775 780

Gly Tyr Ser He Thr Asn Lys Asn Thr Ser Thr Ser Asn Glu Ser Gly 785 790 795 800

Val His Phe Glu Leu Thr Lys 805

<210> 82 <211> 1066 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 82

Met Gin Thr Lys Thr Lys Lys Leu lie Val Ser Leu Ser Ser Leu Val 15 10 15

Leu Ser 01y Phe Leu Leu Ami His Tyr Met Thr lie Gly Ala GlU Glu 20 25 30

Thr Thr Thr Asn Thr He Gin Gin Ser Gin Lys Glu Val Gin Tyr Gin 35 40 «5

Gin Arg Asp Thr Lys Asn Leu Val Glu Asn Gly Asp Phe Gly Gin Thr 50 55 ¢0

Glu Asp Gly Ser Ser Pro Trp Thr Gly Ser Lys Ale Gin Gly Trp Ser 65 70 75 80

Ala Trp Val Asp Gin Lys Asn Ser Ala Asp Ala Ser Thr Arg Val He B5 90 95

Glu Ala Lys Asp Gly Ala lie Thr He Ser Ser His Glu Lys Leu Arg 100 105 110

Ala Ala Leu His Arg Met Val Pro lie Glu Ala Lys Lys Lys Tyr Lys 115 120 125

Inn Arg Phe Lys lie Lys Thr Asp Asn Lys lie Gly lie Ala Lys Val 130 135 140

Arg lie lie Glu Glu Ser Gly Lys Asp Lys Arg Leu Trp Asn Ser Ala 145 150 155 160

Thr Thr Ser Gly Thr Lys Asp Trp Gin Thr lie Glu Ala Asp Tyr Ser 165 170 175

Pro Thr Leu Asp Val Asp Lys lie Lys Leu Glu Leu Phe Tyr Glu Thr 180 IBS 190

Gly Thr Gly Thr Val Ser Phe Lys Asp He Glu Leu Val Glu Val Ala 195 200 205

Asp Gin Leu Ser Glu Asp Ser Gin Thr Asp Lys Gin Leu Glu Glu Lys 210 215 220 lie Asp Leu Pro lie Gly Lys Lys His Val Phe Ser Leu Ala Asp Tyr 225 ' 230 23S 240

Thr Tyr Lys Val Glu Asn Pro Asp Val Ala Ser Val Lys Asn Gly He 245 250 255

Leu Glu Pro Leu Lys Glu Gly Thr Thr Asn Val He Val Ser Lys Asp 260 265 270

Gly Lys Glu Val Lys Lys lie Pro Lau Lys He Leu Ala Ser Val Lys 275 280 285

Asp Ala Tyr Thr Asp Arg Leu Asp Asp Trp Asn Gly lie He Ala Gly 2 SO 2S5 300

Asn Gin Tyr Tyr Asp Ser Lys Asn Glu Gin Met Ala Lys Leu Asn Gin 305 310 315 320

Glu Leu Glu Gly Lys Val Ala Asp Ser Leu Ser Ser lie Ser Ser Gin 325 330 335

Ala Asp Arg Thr Tyr Leu Trp Glu Lys Phe Ser Asn Tyr Lys Thr Ser 340 345 350

Ala Asn Leu Thr Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Glu Glu Met Ala Lys Gin 355 360 365 val Thr Asn Pro Ser Ser Arg Tyr Tyr Gin Asp Glu Thr val Val Arg 370 375 380

Thr Val Arg Asp Ser Met Glu Trp Met His Lys His Val Tyr Asn Ser 3B5 390 395 400

Glu Lys Ser lie Val Gly Asn Trp Trp Asp Tyr Glu lie Gly Thr Pro 405 ~ 410 415

Arg Ala lie Asn Asn Thr Leu Ser Leu Met Lyo Clu Tyr Phe Ser Asp 420 425 430

Glu Glu lie Lys Lys Tyr Thr Asp Val lie Glu Lys Phe Val Pro Asp 435 440 445

Pro Glu His Phe Arg Lys Thr Thr Aso Asn Pm Phe Lys Ala Leu Gly

450 455 ‘ 4 GO

Gly Asn Leu Val Asp Met Gly Arg Val Lys Val Tie Ala Gly Lau Leu 465 470 475 480

Arg lya Asp Asp Gin Glu lie Ser Ser Thr lie Arg Ser He Glu Gin 485 490 495

Val Phe Lys Leu Val Asp Gin Gly Glu Gly Phe Tyr Gin Asp Cly Ser 500 505 510

Tyr lie Asp Bis Thr Asn Val Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn Val 515 520 525

Leu lie Asp Gly Leu Ser Gin Leu Leu Pro Val He Gin Lys Thr Lys 530 535 540 Αεπ Pro lie Asp Lys Asp Lys Met Girt Thr Met Tyr His Trp lie Asp 545 550 555 560

Lys Ser Phe Ala Pro Leu Leu Val Asn Gly Glu Leu Met Asp Met Set 565 570 575

Arg Gly Arg Ser He Ser Arg Ala Asn Ser Glu Gly His Val Ala Ala 530 535 590

Val Glu Val Leu Arg Sly lie His Arg lie Ala Asp Met Ser Glu Gly 595 600 605

Glu Thr Lys Gin Cys Leu Gin Ser Leu Val Lys Thr lie Val Gin Ser 610 615 620 Αερ Ser Tyr Tyr Asp Val Phe Lys Asn Leu Lys Thr Tyr Lys Asp lie 625 630 635 540.

Sec Leu Met Gin Ser Leu Leu Ser Asp Ala Gly Val Ala Ser Val Pro 645 650 655

Arg Pro Ser Tyr Leu Ser Ala Phe Asn Lys Met Asp LyE Thr Ala Met 660 665 670

Tyr Asn Ala Glu Lys Gly Phe Gly Phe Gly Leu Ser Leu Phe Ser Ser 675 6Θ0 605

Arg Thr Leu Asn Tyr Glu His Met Asn Lys Glu Asn Lys Arg Gly Trp 690 695 700

Tyr Thr Ser Asp Gly Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Gly Asp Leu Ser Ris 705 710 715 720

Tyr Ser Asp Gly Tyr Trp Pro The Val Asn Pro Tyr Lys Met pro Gly 725 730 735

Thr Thr Glu Thr Asp Ala Lys Arg Ala Asp Ser Asp Thr Gly Lys Val 740 745 750

Leu Pro Ser Ala Phe val Gly Thr Ser Lys Leu Asp Asp Ala Asn Ala 755 760 755

Thr Ala Thr Met Asp Phe Thr Asn Trp Asn Gin Thr Leu Thr Ala His 770 775 700

Lys Ser Trp Phe Met Leu Lys Asp Lys lie Ala Phe Leu Gly Ser Asn 765 790 795 000 lie Gin Asn Thr Ser Thr Asp Thr Ala Ala Thr Thr lie Asp Gin Arg 005 010 S15

Lys Leu Glu Ser Gly Asn Pro Tyr Lys Val Tyr Val Asn Asp Lys Glu 020 025 030

Ala Ser Leu Thr Glu Gin Glu Lya Asp Tyr Pro Glu Thr Gin Ser Val 835 040 845

Phe Leu Glu Ser Phe Asp Ser Lys Lys Asn lie Gly Tyr Phe Phe Phe 050 855 860

Lys Lys Ser Set lie Ser Met Ser Lys Ala Leu Gin Lys Gly Ala Trp Θ65 B70 875 880

Lys Asp lie Asn Glu Gly Gin Ser Asp Lys Glu Val Glu Asn Glu Phe 335 890 095

Leu Thr lie Ser Gin Ala His Lys Gin Asn Arg Asp Ser Tyr Gly Tyr 900 905 910

Met Leu lie Pro Asn Val Asp Arg Ala Thr Phe Asn Gin Met He Lys 915 920 925

Glu Leu Glu Ser Ser Leu lie Glu Asn Asn Glu Thr Leu Gin Ser Val 930 935 940

Tyr Asp Ala Lys Gin Gly Val Trp Gly lie Val Lys Tyr Asp Asp Ser 945 950 955 960

Val Ser Thr lie See Asn Gin Phe Gin Val Leu Lys Arg Gly Val Tyr 965 970 975

Thr lie Arg Lys Glu Gly Asp Glu Tyr Lys lie Ala Tyr Tyr Asn Pro 980 985 590

Glu Thr Gin Glu Ser Ala Pro Asp Gin Glu Val Phe Lys Lys Leu Glu 995 1000 1005

Gin Ala Ala Gin Pro Gin Val Gin Asn Ser Lys Glu Lys Glu Lys ser 1010 1015 1020

Glu Glu Glu Lys Asn His 5er Asp Gin Lys Asn Leu Pro Gin Thr Gly 1025 1030 1035 1040

Glu Gly Gin Ser lie Leu Ala Ser Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Ala 1045 1050 1055

Phe Tyr Leu Phe Arg Arg Gly Lys Asn Asn 1060 1065

<210> 83 <211> 1078 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae (estirpe ATCC BAA-255/R6) <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 83

Met lie Leu Gin Tyr Val Tyr Trp Ser Val Tyr Met Gin Thr I.ys Thr 1 5 * 10 15

Lys Lya Leu lie Val Ser Leu Set Ser Leu Val Leu Ser Glv Phe Leu 20 25 30

Leu Asn His Tyr Met Thr val Gly Ala Glu Glu The Thr Thr Agn Thr 35 40 45 lie Gin Gin Ser Glri Lys Glu Val Gin Tyr Gin Gin Arg Asp Thr Lys 50 55 60

Asn Leu Val Glu Asn Gly Asp Phe Gly Gin Thr Glu Asp Gly Ser Ser 65 70 75 80

Pro Trp Thr Gly Ser I.ys Ala Gin Gly Trp Ser Ala Trp Val Asp Gin 85 90 95

Lys Asn Ser Ser Ala Asp Ala Ser Thr Arg Val lie Glu Ala Lys Asp 1O0 105 110

Gly Ala lie Thr lie Ser Ser Pro Glu Lys Leu Arg Ala Ala Val His 115 120 125

Arg Met Val Pro lie Glu Ala Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Arg Phe Lys 130 135 140 lie Lys Thr Asp Asn Lys Val Gly lie Ala Lys Val Arg lie lie Glu 145 150 155 160

Glu Ser Gly Lys Asp Lys Arg Leu Trp Asn Ser Ala Thr Thr Ser Gly 165 170 175

Thr Lys Asp Trp Gin Thr lie Glu Ala Asp Tyr Ser Pro Thr Leu Asp 180 185 190

Val Asp Lys He Lys Leu Glu Leu Phe Tyr Glu Thr Gly Thr Gly Thr 155 200 205

Val Ser Phe Lys Asp He Glu Leu Val Glu Val Ala Asp Gin Pro Ser 210 215 220

Glu Asp Ser Gin Thr Asp Lya Gin Leu Glu Glu Lys lie Asp Leu Pro 225 230 23S 240 lie Gly Lys Lys His Val phe Ser Leu Ala Asp Tyr Thr Tyr Lys Val 245 250 255

Glu Asn Pro Asp Val Ala Ser Val Lys Asn Gly lie Leu Glu Pro Leu 260 265 270

Lys Glu Gly Thr Thr Asn Val lie Val Ser Lya Asp Gly Lys Glu Val 275 280 285

Lys lys lie Pro Leu Lys lie Leu Ala Ser Val Lys Asp Thr Tyr Thr 290 295 300

Asp Arg Leu Asp Asp Trp Asn Gly lie He Ala Gly Asn Gin Tyr Tyr 305 310 315 320

Asp Ser Lys Aan Glu Gin Met Ala Lys Leu Asn Gin Glu Leu Glu Gly 325 330 335

Lys Val Ala Asp Ser Leu Ser Ser He Ser Ser Gin Ala Asp Arg lie 340 345 350

Tyr Leu Trp Glu Lys Phe Ser Asn Tyr Lys Thr Ser Ala Asn Leu Thr 355 360 365

Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Glu Glu Met Ala Lys Gin Val Thr Asn Pro 370 375 300

Ser Ser Arg Tyr Tyr Gin Asp Glu Thr Val val Arg Thr Val Arg Asp 3Θ5 390 395 400

Ser Met Glu Trp Met Hie Lys His Val Tyr Asn Ser Glu Lys Ser lie 405 410 415

Val Gly Asn Trp Trp Asp Tyr Glu lie Gly Thr Pro Arg Ala lie Asn 420 42S 430

Asn Thr Leu Ser Leu Mat Lys Glu Tyr Phc Ser Asp Glu Glu lie Lys 435 440 445

Lys Tyr Thr Asp Val lie Glu Lys Phe Val Pro Asp Pro Glu His Pha 450 455 460

Arg Lys Thr Thr Asp Asn Pro Phe Lys Ala Leu Gly Gly Asn Leu Val 465 470 475 400

Asp Met Gly Arg Val Lys Val lie Ala Gly Leu Leo Arg Lys Asp Asp 405 490 495

Gin Glu lie Ser Ser Thr lie Arg Ser lie Glu Gin Val Phe Lys Leu 500 505 510

Val Asp Gin Gly Glu Gly Phe Tyr Gin Asp Gly Ser Tyr lie Asp His 515 520 525

Thr Asn Val Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn Val Leu lie Asp Gly 530 535 540

Leu Ser Gin Leu Leu Pro Val lie Gin Lys Thr Lys Asn Pro lie Asp 54 5 550 5S5 560

Lys Asp Lys Met Gin Thr Met Tyr His Trp lie Asp Lys Ser Phe Ala 565 570 575

Pro ten Leu Val Asn Gly Glu Leu Met Asp Met Ser Arg Gly Arg Ser 530 585 590 lie Ser Arg Ala Asn Ser Gly Gly His Val Ala Ala Val Glu val Leu 595 600 605

Arg Gly lie His Arg He Ala Asp Met Ser Glu Gly Glu Thr Lys Gin 610 615 620 .

Arg Leu Gin Ser Leu Val Lys Thr He Val Gin Ser Asp Ser Tyr Tyr 625 630 635 640

Asp Val Phe Lys Asn Leu Lys Thr Tyr Lys Asp lie Ser Leu Met Gin 645 650 655

Ser Leu leu Ser Asp Ala Gly Val Ala Sar Val Pro Arg Thr Ser Tyr 660 665 670

Leu Ser Ala Phe Asn Lys Met Asp Lys Thr Ala Met Tyr Asn Ala Glu 675 680 685

Lys Gly Phe Gly Phe Gly Leu Ser Leu Phe Ser Ser Arg Thr Leu Asn 690 695 700

Tyr Glu His Met Asn Lys Glu Asn Lys Arg Gly Trp Tyr Thr Ser Asp 705 710 715 720

Gly Met Fhe Tyr Leu Tyr Asn Gly Asp Leu Ser His Tyr Ser Asp Gly 725 730 735

Tyr Trp Pro Thr Val Asn Pro Tyr Lys Met Pro Gly Thr Thr Glu Thr 740 745 750

Asp Ala Lys Arg Ala Asp Sar Asp Thr Gly Lys Val Leu Pro Ser Ala 755 760 765

Phe Val Gly Thr Ser Lys Leu Asp Asp Ala Asn Ala Thr Ala Thr Met 770 775 780

Asp Phe Thr Asn Trp Asn Gin Thr Leu Thr Ala His Lys Ser Trp Phe 785 790 795 000

Met Leu Lys Asp Lys lie Ala Phe Leu Gly Ser Asn He Gin Asn Thr B05 810 Θ15

Ser Thr Asp Thr Ala Ala Thr Thr lie Asp Gin Arg Lys Leu Glu Ser Θ 2 0 825 830

Ser Asn Pro Tyr l.ys Val Tyr Val Asti Asp Lys Glu Ala Ser Leu Thr 835 840 845

Glu Gin Glu Lys Asp Tyr Pro Glu Thr Gin Ser Val Phe Leu Glu Ser 850 855 860

Ser Asp Ser Lys Lys Asn He Gly Tyr Phe Phe Phe Lys Lys Ser Ser 865 8 70 875 080

He Ser Met Ser Lys Ala Leu Gin Lys Gly Ala Trp Lys Asp He Asn 885 890 895

Glu Gly Gin Ser Asp Lys Glu Val Glu Asn Glu Phe Leu Thr He Ser 900 90S 910

Gin Ala His Lys Gin Asn Gly Asp Ser Tyr Gly Tyr Met Leu lie Pro 915 920 925

Asn Val Asp Arg Ala Thr Phe Asn Gin Met He Lys Glu Leu Glu Ser 930 935 940

Ser Leu He Glu Asn Asn Glu Thr Leu Glh Ser Val Tyr Asp Ala Lys 945 950 955 960

Gin Gly Val Trp Gly lie Val Lys Tyr Asp Asp Ser Val Ser Thr He 965 970 975

Ser Asn Gin Phe Gin Val Leu Lys Arg Gly Val Tyr Thr lie Arg Lys 930 985 990

Glu Gly Asp Glu Tyr Lys He Ala Tyr Tyr A311 Pro Glu Thr Sin Glu 995 1000 1005

Ser Ala Pro Asp Gin Glu Val Phe Lys Lys Leu Glu Gin Ala Ala Gin 1010 1015 1020

Pro Gin Val Gin Asn Ser Lys Glu Lys Glu Lys Ser Glu Glu Glu Lys 1025 1030 1035 1043

Asn his Ser Asp Gin Lys Asn Leu Pro Gin Thr Gly Glu Gly Gin Ser 1045 1050 1055 lie Leu Ala Ser Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Phe 1060 1065 1070

Arg Arg Gly Lys Asn Asn 1075

<210> 84 <211> 1067 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae serotipo 2 (estirpe D39/NCTC 7466) <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 84

Met Gin The Lys Thr Lys Lys Leu lie Val Ser Leu Ser Ser Leu Val 15 10 15

Leu Ser Gly Phe Leu Leu Asn His Tyr Met Thr Val Gly Ala Glu Glu 20 25 30

Thr Thr Thr Asn Thr lie Gin Gin Ser Gin Lys Glu val Gin Tyr Gin 35 40 45

Gin Arg Asp Thr Lys Asn Leu Val Glu Asn Gly Asp Phe Gly Gin Thr 50 55 60

Glu Asp Gly Ser Ser Pro Trp Thr Gly Ser Lys Ais Gin Gly Trp Ser 65 70 75 Θ0

Ala Trp Vai Asp Glr. Lys Asn Ser Ser Ala Asp Ala Ser Thr Arg Vai 85 90 95 lie Glu Ala Lys Asp Gly Ala lie Thr lie Ser Ser Pro Glu Lys Leu 100 105 110

Arg Ala Ala Vai His Arg Met Vai Pro lie Glu Ala Lys Lys lys Tyr 115 120 125

Lys Leo Arg Phe Lys He Lys Thr Asp Asn Lys Vai Gly Ile Ala Lys 130 135 140

Vai Arg Ile Ile Glu Glu Ser Gly Lys Asp Lys Arg Leu Trp Asn Ser 145 150 155 160

Ala Thr Thr Ser Gly Thr Lys Asp Trp Gin Thr Ile Glu Ala Asp Tyr 165 Π0 175

Ser Pro Thr Leu Asp Vai Asp Lys lie Lys Leu Glu Leu Phe Tyr Glu 180 165 190

Thr Gly Thr Gly Thr Vai Ser Phe Lys Asp Ile Glu Leu Vai Glu Vai 195 200 205

Ala Asp Gin Pro Ser Glu Asp Ser Gin Thr Asp Lys Gin Leu Glu Glu 210 215 220

Lys lie Asp Leu Pro lie Gly Lys Lys His vai Phe Ser Leu Ala Asp 225 230 235 240

Tyr Thr Tyr Lys Vai Glu Asn Pro Asp Vai Ala Ser Vai Lys Asn Gly 245 2S0 255 lie Leu Glu Pro Leu Lys Glu Gly Thr Thr Asn Vai Ile Vai Ser Lys 260 265 270

Asp Gly Lys Glu Vai Lys Lys lie Pro Leu Lys Ile Lsu Ala Ser Vai 275 280 285

Lys Asp Thr Tyr Thr Asp Arg Leu Asp Asp Trp Asn Gly Ile Ile Ala 290 295 300

Gly Asn Gin Tyr Tyr Asp Ser Lys Asn Glu Gin Met Ala Lys Leu Asn 305 310 315 320

Gin Glii Leu Glu Gly Lys Vai Ala Asp Ser Leu Ser Ser Ile Ser Ser 325 330 335

Gin Ala Asp Arg Ile Tyr Leu Trp Glu Lys Phe Ser Asn Tyr Lys Thr 340 345 350

Ser Ala Asn Leu Thr Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Glu Glu Met Ala Lys 355 360 365

Gin Vai Thr Asn Pro £er Ser Arg Tyr Tyr Gin Asp Glu Thr Vai Vai 370 375 380

Arg Thr Vai Arg Asp Scr Met Glu Trp Met His Lys His Vai Tyr Asn 385 390 395 400

Ser Glu Lya Ser Ile Vai Gly Asn Trp Trp Asp Tyr Glu Ile Gly Thr 405 410 415

Pro Arg Ala Tie Asn Asn Thr leu Ser Leu Met Lys G3 U Tyr Phe Ser 420 425 430

Asp Glu Glu lie Lys Lys Tyr Thr Asp Vai lie Glu Lys Phe Vsl Pro 435 440 445

Asp Pro Glu His Phe Arg Lys Thr Thr Asp Asn Pro Phe Lys Ala Leu 450 455 460

Gly Gly Asn Leu Vai Asp Met Gly Arg Vai Lys Vai Ilç Ala Gly Leu 465 470 475 4B0

Leu Arg Lys Asp Asp Gin Glu Ile Ser Ser Thr Ile Arg Ser Tie Glu 485 490 495

Gin Vai Phe Lys Leu Vai Aap Gin Gly Glu Gly Phe Tyr Gin Asp Gly 500 505 510

Ser Tyr Ile Asp his Thr Asn Vai Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn 515 520 525

Vai Leu lie Asp Gly Leu Ser Gin Leu Leu Pro Vai Ile Gin Lys Thr 530 535 540

Lys Asn Pro He Asp Lys Asp Lys Met Gin Thr Met Tyr nis Trp lie 545 550 555 560 A3p Lya Ser Phe Ala Pro Leu Leu Vai Asn Gly Glu Leu Met Asp Met 565 570 575

Ser Arg Gly Arg Ser lie Ser Arg Ala Asn Ser Glu Gly His Val Ala 580 505 590

Ala Val Glu Val Leu Arg Gly Ile His Arg Ile Ala Asp Met Ser Glu 595 600 605

Gly Glu Thr Lys Gin Arg Leu Gin Ser Leu Val Lys Thr Ile Val Gin 610 615 620

Ser Asp Ser Tyr Tyr Asp Val Phe Lys Asn Leu Lys Thr Tyr Lys Asp 625 630 635 640 tie Ser Leu Met Gin Ser Leu Leu Ser Asp Ala Gly Val Ala Ser Val 645 650 655

Pro Arg Thr Ser Tyr Leu Ser Ala Phe Asn Lys Met Asp Lys Thr Ala 660 665 670

Met Tyr Asn Ala Glu Lys Gly Phe Gly Phe Gly Leu Ser Leu Phe Ser 67 5 6Θ 0 60S

Ser Arg Thr Leu Asn Tyr Glu His Met Asn Lys Glu Asn Lys Arg Gly 690 695 700

Trp Tyr Thr Ser Asp Gly Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Gly Asp Leu Ser 705 710 715 720

His Tyr Ser Asp Gly Tyr Trp Pro Thr Val Asn Pro Tyr Lys Met Pro 725 730 735

Gly Thr Thr Glu Thr Asp Ala Lys Arg Ala Asp Ser Asp Thr Gly Lys 740 745 750

Val Leu Pro Ser Ala Phe Val Gly Thr Ser Lys Leu Asp Asp Ala Asn 755 760 765

Ala Thr Ala Thr Met Asp Phe Thr Asn Trp Asn Gin Thr Leu. Thr Ala 770 775 780

His Lys Ser Trp Phe Met Leu Lys Asp Lys lie Ala Phe Leu Gly Ser 705 790 795 800

Asn lie Gin Asn Thr Ser Thr Asp Thr Ala Ala Thr Thr lie Asp Gin 805 810 815

Arg Lys Leu Glu Ser Ser Asn Pro Tyr Lys Val Tyr Val Asn Asp Lys 820 825 930

Glu Ala Ser Leu Thr Glu Gin Glu Lys Asp Tyr Pro Glu Thr Gin Ser 835 B 4 0 845

Val Phe Leu Glu Ser Ser Asp Ser Lys Lys Asn Ile Gly Tyr Phe Phe B50 BBS 360

Phe Lys Lys Ser Ser Ile Ser Met Ser Lys Ala Leu Gin Lys Gly Ala 865 870 875 860

Trp Lys Asp Ile Asn Glu Gly Gin Ser Asp Lys Glu Val Glu Asn Glu B85 090 895

Phe Leu Thr lie Ser Gin Ala Hie Lys Gin Asn Gly Asp Ser Tyr Gly 900 905 910

Tyr Met Leu lie Pro Asn Val A3p Arg Ala Thr Phe Asn Gin Met Ile 915 920 925

Lys Glu Leu Glu Ser Ser Leu Ile Glu Asn Asn Glu Thr Leu Gin Ser 930 935 940

Val Tyr Asp Ala Lys Gin Gly Val Trp Gly lie Val Lys Tyr Asp Asp 945 950 955 960

Ser Val Ser Thr Ile Ser Asn Gin Phe Gin Val Leu Lys Arg Gly Val 965 970 975

Tyr Thr lie Arg Lys Glu Gly Asp Glu Tyr Lys lie Ala Tyr Tyr Asn 980 985 990

Pro Glu Thr Gin Glu ser Ala Pro Asp Gin Glu Val Phe Lys Lys Leu 995 1000 1005

Glu Gin Ala Ala Gin Pro Gin Val Gin Asn Ser Lys Glu Lys Glu Lys 1010 1015 1020

Ser Glu Glu Glu Lys Asn His Ser Asp Gin Lys Asn Leu Pro Gin Thr 1025 1030 1035 1040

Gly Glu Gly Gin Ser lie Leu Ala Ser Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly 1045 1050 1055

Ala phe Tyr Leu Phe Arg Arg Gly Lys Asn Asn 1060 1065

<210> 85 <211> 805 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes serotipo Ml <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 85

Met Asn Thr Tyr Phe Cys Thr His His Lys Gin Leu Leu Leu Tyr Set 15 ID 15

Asn Leu Phe Leu Set ?he Ala Met Met Gly Gin Gly Thr Ala lie Tyr 20 25 30

Ala Asp Thr Leu T|u Set Asn Set Gle Pro Asn Asn Thr Tyr Phe Gin 35 40 45

Thr Gin Thr Leu Thr Thr Thr Asp Ser Glu Lys Lys Val Val Gin Pro 50 55 60

Gin Gin Lys Asp Tyr Tyr Thr Glu Leu Leu Asp Gin Trp Asn Ser lie 65 70 75 80 lie Ala Gly Asn Asp Ala Tyr Asp Lys Thr Asn Pro Asp Met Val Thr 85 90 95

Phe His Asn Lys Ala Glu Lys Asp Ala Gin Asn lie lie Lys Ser Tyr 100 105 110

Gin Gly Pro Asp His Glu Asn Arg Thr Tyr Leu Trp Glu His Ala Lys 115 120 125

Asp Tyr Ser Ala Ser Ala Asn He Thr Lys Thr Tyr Arg Asn lie Glu 130 135 140

Lys He Ala Lys Gin lie Thr Asn Pro Glu Ser Cys Tyr Tyr Gin Asp 145 150 155 160

Ser Lys Ala He Ala lie Val Lys Asp Gly Met Ala Phe Met Tyr Glu 165 170 175

His Ala Tyr Asn Leu Asp Arg Glu Asn His Gin Thr Thr Gly Lys Glu 180 185 190

Asn Lys Glu Asn Trp Trp Val Tyr Glu lie Gly Thr Pro Arg Ala lie 195 200 205

Asn Asn Thr Leu Ser Leu Met Tyr Pro Tyr Phe Thr Gin Glu Glu lie 210 215 220

Leu Lys Tyr Thr Ala Pro lie Glu Lys Phe Val Pro Asp Pro Thr Arg 225 230 235 240

Phe Arg Val Arg Ala Ala Asn Phe Ser Pro Phe Glu Ala Asn Ser Gly 245 250 255

Asn Leu Ile Asp Met Gly Arg Val Lys Leu lie Ser Gly lie Leu Arg 260 265 270

Lys Asp Asp Leu Glu lie Ser Asp Thr Ile Lys Ala He Glu Lys Val 275 280 285

Phe Thr Leu Vai Asp Glu Gly Asn Gly Phe Tyr Gin Asp Gly Ser Leu 290 295 300

He Asp His Val val Thr Asn Ala Gin 5er Pro Leu Tyr Lya Lys Gly 305 310 315 320 lie Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn Val Leu lie Asp Gly Leu Ser 32S 330 335

Gin Leu lie Pro lie He Gin Lys Thr Lys Ser Pro lie Lys Ala Asp 340 345 350

Lys Met Ala Thr lie Tyr His Trp lie Asn His Ser Phe Phe Pro lie 355 3 SO 365 lie Val Arg Gly Glu Met Met Asp Met Thr Arg Gly Arg Ser lie Ser 370 375 380

Arg Phe Asn Ala Gin Ser His Val Ala Gly lie Glu Ala Leu Arg Ala 385 390 396 400 lie Leu Arg Tie Ala Asp Met Ser Glu Glu Pro His Arg Leu Ala Leu 405 410 415

Lys Thr Arg lie Lys Thr Leu val Thr Gin Gly Asn Ala Phe Tyr Asn 420 425 430

Val Tyr Asp Asn Leu Lys Thr Tyr His Asp lie Lys Leu Met Lys Glu 435 440 445

Leu Leu Ser A.sp Thr Ser Val Pro Val Gin Lys Leu Asp Ser Tyr Val 450 455 460

Ala Ser Phe Asn Ser Met Asp Lys Lev Ala Leu Tyr Asn Asn Lys His 465 470 475 480

Asp Phe Ala Phe Gly Leu Ser Met Phe Ser Asn Arg Thr Gin Asn Tyr 485 490 495

Glu Ala Met Α3Π A3n Glu Asn Leu His Gly Trp Phe Thr Ser Asp Gly 500 505 510

Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Asn Asp Leu Gly His Tyr Ser Glu Asn Tyr 515 520 525

Trp Ala Thr Val Asn Pro Tyr Arg Leu Pro Gly Thr Thr Glu Thr Glu 530 535 540

Gin Lys Pro Leu Glu Gly Thr Pro Glu Asn lie Lys Thr Asn Tyr Gin 545 550 555 560

Gin Val Gly Met Thr Gly Leu Ser Asp Asp Ala Phe Val Ala Ser Lys 565 570 575

Lys Leu Asn Asn Thr Ser Ala Leu Ala Ala Met Thr Phe Thr Asn Trp 580 585 590

Asn Lys Ser Lot Thr Leu Asn Lys Gly Trp Phe lie Leu Gly Asn Lys 595 600 605 lie lie Phe Val Gly Ear Asn He Lys Asn Gin Ser Ser His Lys Ala 610 615 620

Tyr Thr Thr He Glu Gin Arg Lys Glu Asn Gin Lys Tyr Pro Tyr Cys 625 630 635 640

Ser Tyr Val Asn Aan Gin Pro Val Asp Leu Aan Asn Gin Leu Val Asp 645 650 655

Phe Thr Asn Thr Lys Ser lie Phe Leu Glu Ser Asp Asp Pro Ala Gin 660 665 670

Asn 11a Gly Tyr Tyr Phe Phe Lys Pro Thr Thr Leu Ser lie Ser Lys 675 630 585

Ala Leu Gin Thr Gly Lys Trp Gin Asn lie Lys Ala Asp Asp Lys Ser 690 695 700

Pro Glu Ala He Lys Glu Val Ser Asn Thr Phe lie Thr lie Met Gin 70S 710 715 720

Asn His Thr Gin Asp Gly Asp Arg Tyr Ala Tyr Met Met Leu Pro Asn 72S 730 735

Met Thr Arg Gin Glu Phe Glu Thr Tyr lie Ser Lys Leu Asp lie Asp 740 745 750

Leu Leu Glu Asn Asn Asp Lys Leu Ala Ala Val Tyr Asp His Asp Ser 755 760 765

Girl Gin Met His Val lie His Tyr Gly Lys Lys Ala Thr Met Phe Ser 770 775 780

Asn His Asn Leu Ser His Gin Gly Phe Tyr Ser Phe Pro Hie Pro Val 735 790 795 800

Arg Gin Asn Gin Gin 80S

<210> 86 <211> 780 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes serotipo M2 (estirpe MGAS10270) <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 86

Met Val Tyr Phe Tyr Leu Val Ssn Gin Ser Thr Phe lie lie Ser Phe IB ID 15

Leu Tyr Trp Arg Asn Val Ser Val Asn Thr Tyr Phe Cys Thr His His 20 25 30

Lys Gin Leu Leu Leu Tyr Ser Asn Leu Phe Leu Ser Phe Ala Met lie 35 40 45

Gly Gin Gly Thr Ala lie Tyr Ala ASp Thr Leu Thr Ser Asn Ser Glu SO 55 60

Pro Asn Asn Thr Tyr Phe Gin Thr Gin Thr Leu Thr Thr Thr Asp Ser 55 7 D 75 80

Glu Lys Lys Val Val Gin Pro Gin Gin Lys Asp Tyr Tyr Thr Glu Leu 35 90 95

Leu As? Gin Trp Asn Ser Tie lie Ala Gly Asn Asp Ala Tyr Asp Lys 10Π 105 110

Thr Asn Pro Asp Met Val Thr Phe His Aan Lys Ala Glu Lys Asp Ala 115 120 125

Gin Asn lie lie Lys Ser Tyr Gin Gly Pro Asp His Glu Asn Arg Thr 130 135 140

Tyr Leu Trp Glu His Ala Lys Asp Tyr Ser Ala Ser Thr Asn He Thr

145 150 155 ISO

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Glu Ser Cys Tyr Tyr Glu Asp Ser Lys Ala lie Ala lie Val Lys Asp 100 135 190

Gly Net Ala Phe Met Tyr Glu Hia Ala Tyr Asn Leu Asn Arg Glu Asn 195 200 205

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Tyr Phe Thr Gin Glu Glu lie Leu Lys Tyr Thr Ala Pro He Glu Lys 245 250 255

Phe Val Pro Asp Pro Thr Arg Phe Arg Val Arg Ala Ala Asn Phe Ser 260 265 270

Pro Phe Glu Ala Asn Ser Gly Asn Leu lie Asp Met Gly Arg Val Lys 275 280 285

Leu He Ser Gly lie Leu Arg Lys Asp Asp Leu Glu lie Ser Asp Thr 290 295 300 lie Lys Ala He Glu Lys Val Phe Thr Leu Val Asp Glu Gly Asn Gly 305 310 315 320

Phe Tyi Glu Asp Gly Ser Leu lie Asp His Val Val Thr Asn Thr Gin 325 330 33Ξ

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Val Leu lie Asp Gly Leu Ser Gin Leu He Pro Ha He Gin Lys Thr 355 360 365

Lys Ser Pro lie Glu Ala Asp Lys Met Ala Thr. He Tyr His Trp lie 310 375 390

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Gly lie Glu Ala Leu Arg Ala lie Leu Arg lie Ala Asp Met Ser Glu 420 425 430

Glu Pro His Arg Leu Glu Leu Lys Thr Arg lie Lys Thr Leu Val Thr 435 440 445

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Asa He Lys Leu Mat Lys Glu Leu Leu Ser Asp Thr Ser Val Pro Val 465 470 475 480

Gin Lys Leu Asp Ser Tyr Val Ala Ser Phe Asn Ser Met Asp Lys Leu 485 490 495

Ala Leu Tyr Asn Aan Lys His Asp Phe Ala Phe Gly Leu Ser Met Phe

500 505 51C

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Asn He Ly3 Thr Asn Tyr Gin Gin Val Gly Met Thr Ser Leu Ser Asp 580 " 585 590

Asp Ala Phe Val Ala Ser Lys Lys Leu Asn Asn Thr Ser Ala Leu Ala 595 600 605

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Asn Gin Ser Ser His Lys Ala Tyr Thr Thr Ile Glu Gin Arg Lys Glu 645 650 655

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Arg Thr Leu Ser He Ser Lys Ala Leu Gin Thr Gly Lys Trp Gin Asn 705 710 715 720 lie Lys Ala Asp Asp Lys Ser Pro Glu Ala lie Lys G_u Val Ser Asn 725 730 735

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<210> 87 <211> 868 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes serotipo M4 (estirpe MGAS10750) <22 0> <223> hialuronano-liase <4Ο0> 87

Mat Asn Thr Tyr Phe Gys The His (tis Lys Gin Leu Leu Leu Tyr Ser 15 10 15

Asn Leu Phe Leu Ser Phe Ala Met Met Gly Gin GLy Thr Ala lie Tyr 20 25 30

Ala Asp Thr Leu Thr Ser Asn Ser Lys Pro Asn Asn Thr Tyr Phe' Gin 35 40 45

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Gin Gin Lys Asp Tyr Tyr Thr G1U Leu Leu Asp Gin Trp Asn Ser He

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Phe His Asn Lys Ala Glu Lys Asp Ala Gin Asn lie lie Lys Ser Tyr 100 105 110

Gin Clu Pro Asp His Glu Asn Arg Thr Tyr Leu Trp Glu His Ala Lys 115 120 125

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Lys lie Ala Lys Gin He Thr Asn Pro Glu Ser Cys Tyr Tyr Gin Asp 145 150 155 160

Ser'Lys Ala lie Ala lie Val Lys Asp Gly Met Ala Phe Met Tyr Glu 165 170 175

His Aia Tyr Asn Leu Asp Arg Glu Asn His Gin Thr Thr Gly Lys Glu 180 185 190

Asn Lys Glu Asn Trp Trp Asp Tyr Glu lie Gly Thr Pro Arg Ala lie 195 200 205

Asn Asn Thr Leu ser Leu Met Tyr Pro Tyr Phe Thr Gin Glu Glu He 210 215 220

Leu Lys Tyr Thr Ala Pro He Glu Lys Phe Val Pro Asp Pro Thr Arg 225 230 235 240

Phe Arg Val Arg Ala Ala Asn Phe Pro Pro Phe Glu Ala Asn Ser Gly 245 250 255

Asn Leu lie Asp Met Gly Arg val Lys Leu lie Ser Gly He Leu Arg 260 265 270

Lys Asp Asp Leu Glu lie Ser Asp Thr Ilo Lys Ala lie Glu Lys Val 275 280 285

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325 330 33S

Gin leu He Pro lie lie Gin Lys Thr Lys Ser Pro lie Glu Ala Asp 340 345 350

Lys Met Ala The lie Tyr Hig Trp lie Asn His Ser Phe Phe Pro lie 355 360 365 lie Val Arg Gly Glu Met Met Asp Met Thr Arg Gly Arg Ser lie Ser 370 375 330

Arg PHe Asn Ala Gin Ser His Val Ala Gly He Gin Ala Leu Arg Ala 385 390 395 400 lie Leu Arg lie Ala Aso Met Ser Glu Glu Pro His Arg Leu Ala Leu 405 410 415

Lys Thr Arg lie Lys Thr Leu Val Thr Gin Gly Asn Val Phe Tyr Asn 420 425 430

Val Tyr Asp Asn Leu Lys Thr Tyr His Asp lie Lys Leu Met Lys Glu 435 440 445

Leu Leu Ser Asp Thr Ser val Pro val Gin Lys Leu Asp Ser Tyr Val 450 455 460

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495 490 49S

Glu Ala Met Asn Asn Glu Asn Leu His Giy Trp Phe Thr Ser Asp Gly 500 505 510

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Trp Ala Thr Val Asn Pro Tyr Arg Leu Pro Gly Thr Thr Glu Thr Glu 530 535 540

Gin Lys Pro Leu Glu Gly Thr Pro Glu Asn lie Lys Thr Asn Tyr Gin 545 550 555 560

Gin Val Gly Met Thr Ser Leu Ser Asp Asp Ala Phe val Ala Ser Lys 565 570 575

Lys Leu Ash Asn Thr Ser Ala Leu Ala Ala Met Thr Phe Thr Asn Trp 590 595 590

Asn Lys Ser Leu Thr Leu Asn Lys Gly Trp Phe lie Leu Gly Asn Lys 595 600 605 lie lie Phe Val Gly Her Asn Tie Lys Asn Gin Ser Ser His Lys Ala

610 615 62 D

Tyr Thr Thr He Glu Gin Arg Lys Glu Asn Gin Lys His Pro Tyr Cys 625 630 635 640

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Asn lie Gly Tyr Tyr Phe Phe Lys Pro Thr Thr Leu Ser He Ser Lys

675 680 60S

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Pro Glu Ala lie Lys Glu val Ser Asn Thr Phe lie Thr lie Met Gin 705 710 715 720

Asn His Thr Gin Asp Gly Asp Arg Tyr Ala Tyr Met Met Leu Pro Asn 725 730 735

Met Thr Arg Gin Glu Phe Glu Thr Tyr lie Ser Lys Leu Asp lie Asp 740 745 750

Leu Leu Glu Asn Asn Asp Lys Leu Ala Ala Val Tyr Asp His Asp Ser 755 760 765

Gin Gin Met His Val He His Tyr Glu lys Lys Aia Thr Thr The Ser 770 775 780

Asr. His Asn Leu Ser His Gin Gly Phe Tyr Set The Pro His Pro Val 785 790 735 800

Lys Gin Asn Gin Gin Gin Lya Leu Ala His Gin Gly lie Ala Ala Lys 805 910 815

Asn Asn Ala Leu Asn Ser His Lys lie Pro His Lys Arg Gin Arg Arq 820 825 830

Leu Pro Arg Thr Gly Tyr Gin Set Ser Ser Leu Glu Phe Leu Gly Gly 835 840 845

Ala Leu Val Ala Ser Phe Asn His He Thr Lys Pro Phe Arg Lys Lys 850 855 860

Asp Leu Arg lie 865

<210> 88 <211> 828 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes serotipo M6 <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 88

Met Val Tyr Phe Tyr Leu Val Asp Gin Phe Thr Phe lie lie Ser Phe 15 10 15

Leu Tyr Trp Arg Asn Leu Ser Val Asn Thr Tyr Phe Cys Thr His His 20 25 30

Lyg Gin Leu Leu Leu Tyr Ser Asn Leu Phe Leu Ser Phe Ala Met Met 35 10 15

Gly Gin Gly Thr Ala lie Tyr Ala Asp Thr Leu Thr Ser Asn Ser Glu 50 55 60

Pro Asn Asn Thr Tyr Phe Gin Thr Gin Thr Leu Thr Thr The Asp Ser 65 70 75 80

Glu Lys Lys Val Val Gin Pro Gin Gin Lys Asp Tyr Tyr Thr Glu Leu 85 90 95

Leu Asp Gin Trp Asn Ser lie lie Ala Gly Asn Asp Ala Tyr Asp Lys 100 105 HO

Thr Asn Pro Asp Met Val Thr Phe His Asn Lys Ala Glu Lys Asp Ala 115 120 125

Gin Asn. lie lie Lys Ser Tyr Gin Gly Pro Asp His Glu Asn Arg Thr 130 135 HO

Tyr Leu Trp Glu His Ala Lys A3p Tyr Ser Ala Ser Thr Asn lie Thr 145 150 ' 155 160

Lys Thr Tyr Arg Asn lie Glu Lys lie Ala Lys Gin lie Thr Asn Pro 165 170 175

Glu Ser Cys Tyr Tyr Gin Asp Ser Lys Ala lie Ala He Val Lys Asp IBO 185 190

Gly Met Ala Phe Met Tyr Glu His Ala Tyr Asn Leu Asp Arg Glu Asn 195 2G0 205

His Gin Thr Thr Gly Lys Glu Asn Lys Glu Asn Trp Trp Val Tyr Glu 210 215 220 lie Gly Thr Pro Arg Ala lie Asn Asn Thr Leu Ser Leu Met Tyr Pro 225 230 235 240

Tyr Phe Thr Gin Glu Glu lie Leu Lys Tyr Thr Ala Pro lie Glu Lys 245 250 255

Phe Val Pro Asp Pro Thr Arg Phe Arg Val Arg Ala Ala Asn Phe Ser 260 265 220

Pro Phe Glu Ala Asn Ser Gly Asn Leu lie Asp Met Gly Arg Val Lys 275 230 285

Leu lie Ser Gly lie Leu Arg Lys Asp Asp Leu Glu He Ser Asp Thr 290 295 300 IXe Lys Ala lie Glu Lys Val Pile Thr Leu Val Asp Glu Gly Asn Gly 205 310 315 320

Phe Tyr Gin Asp Gly Ser Leu lie Asp His Val Val Thr Asn Ala Gin 325 330 335

Ser Pro Leu Tyr Lys Lya Gly He Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly A3n 310 345 350

Val Leu lie Asp Gly Leu Ser Gin Leu Lie Pro Tie lie Gin Lys Thr 355 360 365

Lys Ser Pro lie Glu Ala Asp Lys Met Ala Thr He Tyr His Trp lie 370 37Ξ 3S0

Asn His Ser Phe Phe Pro lie lie Val Arg Gly Glu Met Met Asp Met 385 390 395 400

Thr Arg Gly Arg Ser lie Ser Arg Phe Asn Ala Gin Ser Hia Val Ala 405 410 415

Gly lie Glu Ala Leu Arg Ala lie Leu Arg lie Ala Asp Met Ser Glu 420 425 430

Glu Pro llis Arg Leu Ala Leu Lys Thr Arg lie Lys Thr Leu Val Thr 435 440 445

Gin Gly Asn Ala Phe Tyr Asn Val Tyr Asp Asn Leu Lys Thr Tyr His 450 455 460

Asp Tie Lys Leu Met Lys Glii I.eu Leu Ser Asp Thr Phe Val Pro Val 465 470 475 4B0

Gin LyS Lej Asp Ser Tyr Val Ala Ser Phe Asn Ser Met Asp Lys Leu 435 430 495

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Gly Trp Phe Thr Ser Asp Gly Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Asn Asp Leu 530 535 540

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Pro Gly Thr Thr Glu Thr Glu Gin Lys Pro Leu Glu Gly Thr Pro Glu 565 570 575

Asn He Lys Thr Asp Tyr Gin Gin Val Gly Met Thr Ser Leu Ser Asp 580 585 590

Asp Ala Phe Val Ala Ser Lys Lys Leu Asn Asn Thr Ser Ala Leu Ala 595 600 603

Ala Met Thr Phe Thr Asn Trp Asn Lys Ser Leu Thr Leu Asn Lys Gly 610 615 62 0

Trp Phe lie Leu Cly Asn Lys lie lie Phe Val Gly Ser Asn lie Lys 625 630 635 640

Asn Gin Ser Ser His Lys Ala Tyr Thr Thr He Glu Gin Arg Lys Glu 645 650 655

Asn Gin Lys His Pro Tyr Cys Ser Tyr Val Aan Asn Gin Pro val Asp 6S0 665 670

Leu Asn Asn Gin Leu Val Asp Phe Thr Asn Thr Lys Ser lie Phe Leu 675 680 ' 685

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Thr Thr Leu Ser lie Ser Lys Ala Leu Gin Thr Gly Lys Trp Gin Asn 705 710 715 720 lie Lys Ala Asp Asp Lys Ser Pro Glu Ala lie Lys Glu Val Ser Asn 725 730 735

Thr Phe lie The lie Met Gin Asn His Thr Gin Asp Gly Asp Arg Tyr 740 745 750

Ala Tyr Met Met Leu Pro Asn Met Thr Arg Gin Glu Phe Glu Thr Tyr 755 760 763

He Ser Lys Leu Asp lie Asp Leu Leu Glu Asn Asn Asp Lys Leu Ala 770 775 730

Ala Val Tyr Asp His Asp Ser Gin Gin Met His Val He His Tyr Glu 785 790 795 800

Lys Lys Ala Thr Met Phe Ser Asn His Asn Leu Ser His Gin Gly Phe 805 B10 815

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<210> 89 <211> 556 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes serotipo M12 (estirpe MGAS2096) <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 89

Met Val Tyr (Tie Tyr Let* Val Asn Gin Ser Thr Phe lie lie Ser Phe 15 10 15

Leu Tyr Trp Arg Asn Leu Ser Val Asr. Thr Tyr Phe Cys Thr His His 20 25 30

Lys Sin Leu Leu Leu Tyr Ser Asn Leu Phe Leu Set Phe Ala Met Met 35 40 45

Gly Sir Sty Thr Ala lie Tyr Ala Asp Thr Leo Thr Ser Asn Ser Glu 50 55 60

Pro Asr. Asn Thr Tyr Phe Gin Thr Gin Thr Leu Thr Thr Thr Asp 5er

65 70 75 BO

Glu Lys Lys Val Val Gin Pro Gin Gin Lys Asp Tyr Tyr Thr Glu Leu 85 90 95

Leu Asp Gin Trp Asn Ser lie He Ala Gly Asn Asp Ala Tyr Asp Lys 100 105 110

Thr Asn Pro Asp Met Val Thr Phe His Asn Lys Ala Glu Lys Asp Ala 115 120 125

Gin Asn lie lie Lys Ser Tyr Gin Gly Pro Asp His Glu Asn Arc Thr 130 135 140

Tyr Leu Cly Asn Met Gin Arg He lie Pro Leu Leu Leu Tie Ser Arg 145 ISO 155 160

Lys Leu Thr Ala lie Leu Lys Lys lie Ser Lys Met Lys Ser Leu Met 165 170 175

Glu Asp Ser Thr lie Ser Thr Asn Gly Leu Thr Gin Gin Leu Lys lie 180 185 190

Tyr Asn Asp Met Asp Arg Val Thr Tyr His Asn Lys Gly Leu Asp Phe 195 200 205

Ala Phe Gly Leu Ser Met Thr Ser Lys Asn Val Ala Arg Tyr Glu Ser 210 215 220 lie Asn Gly Glu Asn Leu Lys Gly Trp liis Thr Gly Ala Gly Met Ser 225 230 235 240

Tyr Leu Tyr Asn Ser Asp Val Lys His Tyr Arg Asp Aan Phe Trp Ala 245 250 255

Thr Ala Asp Met Lys Arg Leu Ala Gly Thr Thr Thr Leu Asp Asn Glu 260 265 270

Glu Pro Lya Ser Thr Asp Val Lys Lys Ser Ser Lys Thr Phe Val Gly 275 230 285

Gly Thr Lys Phe Asp Asp Gin His Ala Ser lie Gly Met Asp Phe Glu 290 295 300

Asn Gin Asp Lys Thr Leu Thr Ala Lys Lys Ser Tyr Phe lie Leu Asn 305 310 315 320

Asp Lys lie Val Phe Leu Gly Thr Gly lie Lye Ser Thr Asp Ser Ser 325 330 335

Lys Asn Pro Val Thr Thr He Glu Asn Arg Lys Ala Asn Asp Tyr Lys 340 345 350

Leu Tyr Lys Asp Asp Thr Gin Thr Thr Asti Ser Asp Asn Gin Glu Thr 355 360 365

Asn Ser Leu Phe Leu Glu Ser Thr Asn Ser Thr Gin Asn Asn lie Gly 370 37S 380

Tyr His Phe Leu Asn Glu Ser Lys lie Thr Val Lys Lys Glu Ser His 335 390 395 400

Thr Gly Lys Trp Ser Asp lie Asn Lys Ser Gin Lys Asp lie Gin Lys 4 C 5 410 415

Thr Asp Glu Tyr Tyr Glu Val Thr Glh Lys His Ser Asn Thr Asp Ser 420 425 430

Lys Tyr Ala Tyr Val Leu Tyr Pro Gly Leu Ser Lys Asp Val Phe Lys 435 440 445

Ser Lys Ala Ser Lys Val Thr Val Val Lys Gin Glu Asp Asp Phe His 450 455 460

Val Val Lys Asp Asn Glu Ser Val Trp Ala Gly lie Asn Tyr Ser Asp 465 470 475 480

Ser Ala Lys Thr Phe Glu lie Asn Asn Thr Lys Val Glu Val Lys Ala 485 490 495

Lya lily Met Phe He Leu Thr Lys Lys Asp Asp Asn Thr Tyr Glu Cys 500 505 510

Ser Phe Tyr Asn Pro Glu Ser Thr Asn Ser Val Ser Asp He Glu Ser 515 520 525

Lys lie Ser Met Thr Gly Tyr Ser He lie Asn Lys Asn Thr Ser Thr 530 535 540 ser Asn Glu Ser Gly Val Arg Phe Glu Leu Thr Lys 545 550 555 <210> 90 <211> 635

<212> PRT <213> Streptococcus pyogenes serotipo M12 (estirpe MGAS2096) <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 90

Met Ala Phe Met Tyr Glu His Ala Tyr Asn Leu Asn Arg Glu Asn His 15 10 15

Gin Thr Thr Gly Lys Glu Asn Lys Glu Asn Trp Trp Val Tyr Glu He 20 25 30

Gly Thr Pro Arg Ala Tic Agn Asn Thr Lieu Ser Leu Met Tyr Pro Tyr 35 40 15

Phe Thr Gin Glu Glu lie Leu Lys Tyr Thr Ala Pro lie Glu Lys Phe 50 55 60

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lie Ser Gly lie Leu Arg Lys Asp Asp Leu Glu lie Ser Asp Thr He 100 105 HO

Lys Ala lie Glu Lys Val Phe Thr Leu Val Αερ Glu Gly Asn Gly Phe 115 120 125

Tyr Gin Asp Gly Ser Leu lie Asp His Val Val Thr Asn Ala Gin Ser 130 135 140

Pro Leu Tyr Lys Lys Gly lie Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn Val 145 150 155 160

Leu He Asp Gly Leu Ser Gin Leu lie Pro lie He Gin Lys Thr Lys 165 170 175 5er Pro Lie Glu Ala Asp Lys Met Ala Thr lie Tyr His Trp lie Asn 1B0 185 190

His Ser Phe Phe Pro He lie Val Arg ,Gly Glu Met Met Asp Met Thr 195 200 205

Arg Gly Arg Ser lie Ser Arg Phe Asn Ala Gin Ser His Val Ala Gly 210 215 220

He Glu Ala Leu Arg Ala lie Leu Arg He Ala Asp Met Ser Glu Glu 225 230 235 240

Pro His Arg Leu Ala Leu Lys Thr Arg He Lya Thr Leu Val Thr Gin 245 250 255

Gly Asn Ala Phe Tyr Asn Val Tyr Asp Asn Leu Lys Thr Tyr His Asp 260 265 270 lie Lys Leu Met Lys Glu Leu Leu Ser Aap Thr Ser Val Pro Val Gin 275 200 235

Lys Leu Asp Ser Tyr Val Ala Ser Phe Asn Ser Met Asp Lys Leu Ala 290 295 300

Leu Tyr Asn Asn Lys His Asp Phe Ala Phe Gly Leu Ser Met phe Ser 305 310 315 320

Asn Arg Thr Gin Asn Tyr Glu Ala Met A3n Asn Glu Asn Leu His Gly 325 330 335

Trp Phe Thr Ser Asp Gly Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Asn Asp Leu Gly 340 345 350

His Tyr Ser Glu Asn Tyr Trp Ala Thr Val Asn Fro Tyr Arg Leu Pro 355 360 365

Gly Thr Thr Glu Thr Glu Gin Lys Pro Leu Glu Gly Thr Pro Glu Asn 370 375 330 lie Lys Thr Asn Tyr Gin Gin Val Gly Met Thr Ser Leu Ser Asp Asp 335 390 395 400

Ala Phe Val Ala Ser Lys Lys Leu Asn Asn Thr Ser Ala Leu Ala Ala 405 41C 415

Met Thr Phe Thr Asn Trp Asn Lys Ser Leu Thr Leu Asn Lys Gly Trp 420 425 430

Phe lie Leu Gly Asn Lys lie lie Phe Val Gly Ser Asn He Lys Asn 435 440 445

Gin Ser Ser His Lys Ala Tyr Thr Thr He Glu Gin Arg Lys Glu Asn 450 455 460

Gin Lys His Pro Tyr Cys Ser Tyr Val Asn Asn Gin Pro Val Asp Leu 465 470 475 480

Asn Asn Gin Leu Val Asp Phe Thr Asn Thr Lys 5er He Phe Leu Glu 485 490 495

Ser Asp Asp Pro Ala Gin Asn lie Gly Tyr Tyr Phe Phe Lys Pro Thr 5Q0 505 510

Thr Leu Ser Tie Ser Lys Ala Leu Gin Thr Gly Lys Trp Gin Asn lie 515 520 525

Lys Ala Asp Asp Lys Ser Pro Glu Ala lie Lys Glu Val Ser Asn Thr 530 535 540

Phe lie Thr lie Met Gin Asn His Thr Gin Asp Gly Asp Arg Tyr Ala 545 560 555 560

Tyr Met Met Leu Pro Asn Mat Thr Arg Gin Glu Phe Glu Thr Tyr lie 565 570 575

Ser Lys Leu Asp lie Asp Leu Leu Glu Asn Asn Asp Lys Leu Ala Ala 5S0 585 590

Val Tyr Asp His Asp Ser Gin Gin Met His Val lie His Tyr Glu Lys 595 600 605

Lys Ala Thr Met Phe Ser Asn His Asn Leu Ser His Gin Gly Phe Tyr 610 615 620

Ser Phe Pro His Pro Val Lys Gin Asn Gin Gin 625 630 635

<210> 91 <211> 828 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes serotipo M12 (estirpe MGAS9429) <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 91

Met Val Tyr Fhe Tyr Leu Val Asn Gin Ser Thr Fhe lie lie Ser Phe 15 10 15

Leu Tyr Trp Arg Asn Leu Ser Val Asn Thr Tyr Phe Cys Thr His His 2 0 25 30

Lys Gin Leu Leu Leu Tyr Ser Asn Leu Phe Leu Scr Phe Ala Met Met 35 40 45

Gly Gin Giy Thr Ala lie Tyr Ala Asp Thr Leu Thr Ser Ash Ser Glu 50 55 60

Pro Asn Asn Thr Tyr Phe Gin Thr Gin Thr Leu Thr Thr Thr Asp Ser 65 10 75 80

Glu Lys Lys Val Val Gin Pro Gin Gin Lys Asp Tyr Tyr Thr Glu Leu 85 90 95

Leu Asp Gin Trp Asn Ser Tie Tie Ala Gly Asn Asp Ala Tyr Val Lys 100 L05 110

Thr Asn Pro Asp Met Val Thr Phe His Asn Lys Ala Glu Lya Asp Ala 115 120 125

Gin Asn Tie lie Lys Ser Tyr Gin Gly Pro Asp His Glu Asn Arg Thr 130 135 140

Tyr Leu Trp Glu His Ala Lys Asp Tyr Ser Ala Ser Thr Asn lie Thr 145 150 155 1G0

Lys Thr Tyr Arg Ash Tie Glu Lys lie Ala Lys Gin lie Thr Asn Pro 165 170 175

Glu Ser Cys Tyr Tyr Gin Asp Ser Lys Ala lie Ala lie Val Lys Asp 180 185 190

Gly Met Ala Phe Met Tyr Glu His Ala Tyr Asn Leu Asn Arg Glu Asn 195 200 205

His Gin Thr Thr Gly Lys Glu Asn Lys Glu Asn Trp Trp Val Tyr Glu 210 215 220 lie Gly Thr Pro Arg Ala Tie Asn Asn Thr Leu Ser Leu Met Tyr Pro 225 230 235 240

Tyr Phe Thr Gin Glu Glu lie Leu Lys Tyr Thr Ala Pro He Glu Lys 245 250 255

Phe Val Pro Asp Pro Thr Arg Phe Arg Val Arg Ala Ala Asn Phe Ser 260 265 270

Pro Phe Glu Ala Ser Ser Gly Asr. Leu He Asp Met Gly Arg Val Lys 275 280 285

Leu He Ser Gly He Leu Arg Lys Asp Asp Leu Glu He Ser Asp Thr 290 295 300 lie Lys Ma lie Glu Lys Val Phe Thr Leu Val Αερ Glu Gly Asn.Gly 305 310 315 320

Phe Tyr Gin Asp Gly Ser Leu lie Asp His Val Val Thr Asn Ala Gin 325 330 335

Ser Pro Leu Tyr Lys Lys Gly lie Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn 340 345 350

Val Leu lie Asp Gly Leu Ser Gin Leu lie Pro He lie Gin Lys Thr 355 360 365

Lys Ser Pro lie Glu Ala Asp Lys Met Ala Thr lie Tyr His Trp lie 310 375 3B0

Asn His Ser Phe Phe Pro lie lie Val Arg Gly Glu Met Met Asp Met·. 385 390 395 400

Thr Arg Gly Arg Ser lie Ser Arg Phe Asn Ala Gin Ser His val Ala 405 410 415

Gly lie Glu Ala Leu Arg Ala lie Leu Arg lie Ala Asp Met Ser Glu 420 425 430

Glu Pro Hus Arg Leu Ala Leu Lys Thr Arg lie Lys Thr Leu Val Thr 435 440 445

Gin Giy Asn Ala Phe Tyr Asn Val Tyr Asp Asn Leu Lys Thr Tyr His 450 455 460

Asp lie Lys Leu Met Lys Glu Leu Leu Ser Asp Thr Ser Val Pro Val 465 470 475 460

Gin Lys Leu Asp Ser Tyr Val Ala Ser Phe Asn Ser Met Asp Lys Leu 405 490 495

Ala Leu Tyr Asn Asn Lys His Asp Phe Ala Phe Gly Leu Ser Met Phe 5C0 505 510

Ser Asn Arg Thr Gin Asn Tyr Glu Ala Met Asn Asn Glu Asn Leu His 515 520 525

Gly Trp Phe Thr Ser Asp Gly Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Asn Asp Leu 530 535 540

Gly His Tyr Ser Glu Asn Iyr Trp Ala Thr Val Asn Pro Tyr Arg Leu 545 550 555 560

Pro Gly Thr Thr Glu Thr Glu Gin Lys Pro Leu Glu Gly Thr Pro Glu 565 S70 575

Asn lie Lys Thr Asn Tyr Gin Gin Val Gly Met Thr Ser Leu Ser Asp 530 585 590

Asp Ala Phe Val Ala Ser Ly3 Lys Leu Asn Asn Thr Ser Ala Leu Ala 595 600 605

Ala Met Thr Phe Thr Asn Trp Asn Lys Ser Lou Thr Leu Asn Lys Gly 610 615 620 •Trp Phe He Leu Gly Asn Lys lie lie Phe Val Gly Ser Asn He Lys 625 630 635 640

Asn Glh Ser Ser His Lys Ala Tyr Thr Thr lie Glu Gin Arg Lys Glu 645 650 655

Asn Gin Lys His Pro Tyr Cys Ser Tyr Val Asn Asn Gin Pro val Asp 660 665 670

Leu Asn Asn Gin Leu Val Asp Phe Thr Asn Thr Lys Ser lie Phe Leu 675 680 68 5

Glu Ser Asp Asp Pro Ala Gin Asn lie Gly Tyr Tyr Phe Phe Lys Pro 690 695 700

Thr Thr Leu Ser lie Ser Lys Ala Leu Gin Thr Gly Lys Trp Gin Asn 705 710 715 720

He Lys Ala Asp Asp Lys Ser Pro Glu Ala lie Ly3 Glu Val Ser Asn 725 730 735

Thr Phe lie Thr lie Met Gin Asn His Thr Gin Asp Gly Asp Arg Tyr 740 745 750

Ala Tyr Met Met Leu Pro Asr. Met Thr Arg Gin Glu Phe Glu Thr Tyr 755 760 765 lie ser Lys Leu Asp lie Asp Leu Leu Glu Asn Asn Asp Lys Leu Ala 770 775 730

Ala Val Tyr Asp His Asp Ser Gin Gin Met His Val 11a His Tyr Glu 735 790 795 800

Lys Lys Ala Thr Met Phe Ser Asn His Ann Leu Ser His Gin Gly Phe 805 810 815

Tyr Ser Phe Pro His Fro Val Lys Gin Ash Gin Gin 82 C E925

<210> 92 <211> 828 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes serotipo M28 <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 92

Met Val Tyr Phe Tyr Leu Val Asn Gin Phe Thr Phe lie He Ser Phe 15 10 15

Leu Tyr Atq Arg Asn Leu Ser Val Asn Thr Tyr Phe Cys Thr His His 20 25 30

Lys Gin Leu Leu Leu Tyr Ser Asn Leu Phe Leu Ser Phe Ale Met Met 35 40 45

Gly Gin Gly Thr Ala lie Tyr Ala Asp Thr Leu Thr Ser Asn SerGlu 50 55 60

Pro Asn Asn Thr Tyr Fhe Gin Thr Gin Met Leu Thr Thr Thr Asp Ser 65 70 75 80

Clu Lys Lys Val Val Gin Pro Gin Gin Lys Asp Tyr Tyr Thr Glu Leu S5 90 95

Leu Asp Gin Trp Asn Ser lie He Ala Gly Asn Asp Ala Tyr Asp Lys 10C 105 110

Thr Asn Pro Asp Met Val Thr Phe His Asn Lys Ala Glu Lys Asp Ala 115 120 125

Gin Asn lie Tie Lys Ser Tyr Gin Gly Pro Asp His Glu Asn. Arp Thr 130 135 HO

Tyr Leu Trp Glu His Ala Lys Asp Tyr Esr Ala Ser Ala Asn Up Thr 145 150 155 160

Lys Thr Tyr Arg Asn lie Glu Lys lie Ala Lys Glu lie Thr Asn Pro 165 170 175

Glu Ser Cys Tyr Tyr Gin Asp Ser Lys Ala He Ala lie Val Lys Asp 180 135 190

Gly Met Ala Phe Met Tyr Glu His Ala Tyr Asn Leu Asp Arg Glu Asn 1S5 200 205

Tyr Phe Thr Gin Glu Glu lie Leu Lys Tyr Thr Ala Pro He Glu Lys 245 250 255

Phe Val Pro Asp Pro Thr Arg Phe Arg Val Arg Ala Ala Asn Phe Ser 260 265 270

Pro Phe Glu Ala Asn Ser Gly Asn Leu lie Asp Met Gly Arg Val Lys 275 200 235

Leu lie Ser Gly He Leu Arg Lys Asp Asp Leu Glu He Scr Asp Thr 290 295 300 lie Lys Ala lie Glu Lys Val Phe Thr Lea Val Asp Glu Gly Asn Gly 305 310 315 320

Phe Tyr Gin Asp Gly Ser Leu lie Asp His Val Val Thr Asn Ala Gin 325 330 335

Ser Pro leu Tyr Lys Lys Gly lie Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn 340 345 350

Val Leu lie Asp Gly Leu Ser Gin Leu lie Pro lie lie Gin Ly3 Thr 355 360 365

Lys Ser Ser lie Glu Ala A3p Lys Met Ala Thr lie Tyr His Trp lie 370 375 380

Asn His Ser Phe Phe Pro lie lie Val Arg Gly Glu Met Met Asp Met 385 390 395 400

Thr Arg Gly Arg Ser lie Ser Arg Phe Asn Ala Gin Ser His Val Ala 405 410 415

Gly lie Glu Ala Leu Arg Ala lie Leu Arg lie Ala Asp Het Ser Glu 420 425 4-30

Glu Pro His Arg Leu Ala Leu Lys Thr Arg He Lys Thr Leu Val Thr 435 440 445

Glu Gly Asn Ala Phe Tyr Asn Val Tyr Asp Asn Leu Lys Thr Tyr His 450 455 460

Asp Tie Lys T.eu Met Lys G.lu Leu Leu Ser Asp Thr Ser Val Pro Val 465 470 475 400

Gin Lys Leu Asp Ser Tyr Val Ala Ser Phe Asn Ser Met Asp Lys Leu 485 490 495

Ala Leu Tyr Aan Asn Lys His Asp Phe Ala Phe Gly Lea Ser Met Phe SCO 505 510

Ser Asn Arg Thr Gin Asn Tyr Glu Ala Mat Asn Asn Glu Asn Leu His 515 520 525

Gly Trp Phe Thr Ser Asp Gly Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Asn Asp Leu 530 535 540

Gly His Tyr Ser Glu Asn Tyr Trp Ala Thr Val Asn Pro Tyr Arg Leu 545 550 555 560

Pro Gly Thr Thr Glu Thr Glu Gin Lys Pro Leu Glu Gly Thr Pro Glu 565 570 575

Asn lie Lys Thr Asn Tyr Gin Gin Val Gly Met Thr Ser Leu Ser Asp 580 585 590

Asp Ala Phe Val Ala Ser Lys Lys Leu Asn Asn Thr 3er Ala Leu Ala 595 600 605

Ala Met Thr Phe Thr Asn Trp Asn Lys Ser Leu Thr Leu Asn Lys Gly 610 615 620

Trp Phe lie Leu Gly Asn Lys lie lie Phe Val Gly Ser A3n "le Lys 625 630 635 640

Asn Gin Ser Set His Lys Ala Tyr Thr Thr lie Glu Gin Arg Lys Glu 645 650 655

Asn Gin Lys His Pro Tyr His Ala Tyr Val Asn Asn Gin Pro Val Asp 660 665 670

Leu Asn Asn Gin Leu vai Asp phe Thr Asn Thr Lys ser He phe Leu 675 680 685

Glu Ser Asp Asp Ser Ala Gin Asn lie Gly Tyr Tyr Phe Phe Lys Pro 690 695 700

Thr Thr Leu Ser lie Ser Lys Ala Leu Gin Thr Gly Lys Trp Gin Asn 305 310 715 720 lie Lys Ala Asp Asp Lys Ser Pro Glu Ala lie Ly3 Glu Val Ser Asn 725 730 735

Thr Phe lie Thr lie Met Gin Aan His Thr Gin Asp Gly Asp Arg Tyr 740 745 750

Ala Tyr Met Met Leu Pro Asn Met Thr Arg Gin Glu Phe Glu Thr Tyr 755 750 765 lie Ser Lys Leu Asp lie Asp Leu Leu Glu Asn Asn Asp Lys Leu Ala 770 775 780

Ala Val Tyr Asp Kis Asp Ser Gin Gin Met His Val lie His Tyr Glu 785 790 795 800

Lys Lys Ala Thr Met Phe Ser Asn His Asn Leu Ser His Gin Gly Phe 805 810 S15

Tyr Ser Phe Pro His Pro val Lys Gin Asn Gin Gin B20 ' 825

<210> 93 <211> 522 <212> PRT <213> Streptococcus suis <22 0> <223> hialuronano-liase <4Ο0> 93

Met Gly Phe Phe He Ser Gin 5er Lys Gin His Tyr Gly lie Arg Lys 1 5 10 15

Tyr Lys Val Gly Val Cys Ser Ala Leu lie Ala Leu Ser He Leu Gly 20 25 30

Thr Arg Val Ala Ala Asn Gin Leu Pro Ser Thx Glu Thr Ala Ser Pro 35 40 45

Gin Ser Ser Gin Leu Val Glu Thr Thr Pro Glu Thr Thr Glu Ala Val 50 55 60

Asn Leu Thr Thr Glu Ala Val Met Thr Ser Glu Val Ser Ser Glu Val

65 10 75 SO

Ser Pro Val Thr Ser Thr Glu Thr Gin Pro Ser Ser Thr Ala Ala Glu 05 90 95

Thr Leu Ala Ser Pro Gin Ala Val Gin Ala Thr Lys Glu Glu Glu Lys 100 105 110

Asn Leu Val Ala Asn Gly Glu Phe Ala Ser Thr Thr Ala Ala Ser Gly Π5 120 125

Asn Trp Ala Asp PrD Ala Ala Thr Asn Trp Glu Thr Trp lie Pro Ala 130 135 140

Asn Val Lys Lys Glu Asn Gly Gin Val Arg lie Asp Glu Gly Arg Leu 145 150 155 160

His lie Ser Ser Thr Ala Ser Tyr Arg Val Ala val His Gin Thr Val 165 HO 175

Asp Val Asp Pro Asn Lys Arg Tyr Leu Phe Ser Tyr Asn Val Glu Thr 1B0 IBS 190

Lys Asp Leu Lys Gly Ser Gly Val Arg Val Arg Leu Arg Ser Leu Thr

195 200 20S

Ala Glu Gly Lys Asp Leu Ser Pro Gin Glu Phe Ala Tyr Thr Pro Tyr 210 215 220

Lys Asn Gly Ser Gin Ala Glu His lie Glu Gin lie Leu Thr Val Ser 225 230 235 240

Pro Glu Thr Arg Lys Leu Lys Val Glu Leu Phe Phe Glu Asn Ser Val 245 250 255

Gly Gin Ala Trp Leu Asp Asn He Ser Leu Val Glu Tyr Val Glu Lys 260 265 270

Thr Pro Gill Thr Pro Glu Pro Ser Leu Glu Leu Val Gin Pro Glu Thr 275 280 285

Gly Gin He Ser Leu Ala Ser Asn Lys Val Tyr Leu Pro Val Arg Pro 290 295 300

Asp Leu Thr Tyr Arg lie Ala Asp Ala Ala val Ala lie Val Glu Lys 305 310 315 320

Asn Met lie Arg Pro Leu Ala Ala Gly Lys Thr Gin Val Asp Val Tyr 325 330 335

Asp Lys Asp Thr Lys Leu Ser Ser Phe Glu Leu Thr Val Thr Glu His 340 345 350

Gin Ala Thr Val Phe Asp Thr Leu Arg Asn Asn Trp Glu Asp He Ser 355 360 365

Leu Ala Asn Lys Arg Tyr Gin Ser Asn Asp Thr Gin Met Lys Ala Phe 370 375 380

Leu Gly Arg Leu Asp Ala Gly Val Ala Ser Ser Leu Lys Lys Trp Val 385 390 395 400

Glu Pro Thr Asn Gin Gly Lys Thr lie Phe Asn Asp He Asp Phe Ser 405 410 415

Lys Ser Ser His Leu Thr Thr Val Tyr Arg Arg Leu Glu Gin Met Ala 420 425 430

Gin Val Val Glu Asn Pro Asp Ser Ala Tyr Tyr His Asp Arg Ser Leu 435 440 445

Tie Asp Leu Val Arg Lys Gly Met Asn Trp Leu Tyr Thr Asn Val Tyr 450 455 460

Asn Glu Asn Lys Ser lie Asp Gly Asn Trp Trp Asp Tyr Glu He Gly 465 470 475 480

Thr Pro Arg Ala Val Vel Asn Thr Leu He Tyr Met His Pro Tyr Phe 485 490 495 5er Gin Glu Glu He Leu Thr Tyr Thr Lys Pro lie Ser Lys Phe val 600 505 510

Pro Asp Pro Thr Thr He Ser Val Lys His 515 520

<210> 94 <211> 1164 <212> PRT <213> Streptococcus suis <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 94

Met Gly Phe Phe lie Ser Gin See Lys Gin His Tyr Gly lie Arg Lys 15 10 IS

Tyr Lys Val Gly Val Cys Scr Ala Leu He Ala Leu Ser He Leu Giy 20 25 30

Thr Arg Val Ala Ala Asn Gin Leu Pro See Thr Glu Tht Ala Ser Pro 35 40 45

Gin Ser Ser Gin Leu Val Glu Thr Thr Fro Glu Thr Thr Glu Ala Val 50 55 60

Met Thr Ser Glu Val Ser Sec Glu Val Ser Pro Val Thr Ser Thr Glu 65 70 75 80

Thr Gin Pro Ser Ser Thr Thr Ala Glu Thr Leu Ala Ser Pro Gin Ala Θ 5 90 95

Val Gin Ala Thr Lys Glu Glu Lys Asn Leu Val Ala Asn Gly Glu Phe 100 105 HO lie Ser Thr Thr Ala Pro Ser Gly Asn Trp Lys Glu Leu Ala Ala Thr 115 120 125

Asn Trp Glu Thr Trp lie Pro Ala Asn Val Lys Lys Glu Asn Gly Gin 130 135 140

Val Arg lie Asp Glu Gly Arg Leu His He Ser Ser Thr Ala Ser Tyr

14S ISO 155 ISO

Arg Val Ala Val His Gin Thr Val Asp Val Asp Pro Asn Lys Arg Tyr 165 HO 115

Leu Phe See Tyr Asp Val Glu Thr Lys Asp Leu Lys Gly Ser Gly Val 1Θ0 1B5 190

Arg Val Arg Leu Arg Ser Leu Thr Ala Glu Gly Lys Asp Leu Ser Pro 195 200 205

Gin Glu Phe Ala Tyr Thr Pro Tyr Lys Asn Gly Ser Gin Ala Glu His 210 216 220 lie Glu Gin lie Leu Thr Val Ser Pro Glu Thr Arg Lys Leu Lys Val 225 210 235 240

Glu Leu Phe Phe Glu Asn Ser Val Gly Gin Ala Trp Leu Asp Asn He 245 250 255

Ser Leu Val Glu Tyr Val Glu Lys Thr Pro Glu Thr Pro Glu Gin Ser 260 265 270

Pro Glu Leu Val Gin Pro Glu Thr Gly Gin lie Ser Leu Ala Ser Asn 275 280 2Θ5

Lys Val Tyr Leu Pro Val Arg Pro Asp Leu Thr Tyr Arg lie Ala A3p 290 295 300

Ala Ala Val Ala Thr Val Glu Lys Asn Met lie Arg Pro Leu Ala Ala 305 310 315 320

Gly Lys Thr Gin Val Asp Val Tyr Asp Lys Asp Thr Lys Leu Ser Ser 325 330 335

Phe Glu Leu lie Val Thr Glu His Gin Ala Thr Val Phe Asp Thr Leu 340 345 350

Arg Asn Asn Trp Glu Asp He Ser Leu Ala Asn Lys Arg Tyr Gin Ser 355 360 355

Asn Asp Ala Gin Met Lys Ala Phe Leu Gly Arg Leu Asp Ala Gly Val 370 375 380

Ala Ser Ser Leu Glu Lys Trp Val Glu Pro Thr Glu Gin Ser Lys Thr 385 390 395 400 lie Phe Asn Asp lie Asp Phe Ser Lys Ser Ser His Leu Thr Thr Val 405 410 415

Tyr Arg Arg Leu Glu Gin Met Ala Gin Val Val Glu Asn Pro Asp Ser 420 125 430

Ala Tyr Tyr His Asp Arg Ser Leu lie Asp Leu Val Arg Lys Gly Met 435 440 445

Asn Trp Leu Tyr Ala Asn Val Tyr Asn Glu Asn Lys Ser lie Asp Gly 450 455 460

Asn Trp Trp Asp Tyr Glu He Gly Thr Ser Arg Ala Val val Asn Thr 465 470 475 430

Leu He Tyr Met His Pro Tyr Phe Ser Gin Glu Glu lie Leu Thr Tyr 485 490 495

Thr Lys Pro lie Ser Lys Phe Val Pro Asp Pro Thr Thr lie Arg Ly3 500 505 510

Thr Leu Thr Asn Pro Val Pro Ala Val Gly Gly Asn Gin Thr Asp Leu 515 520 525

Ser Lys Val Ala lie Leu Glu Gly Ala Leu Arg Glu Asp Ala Asp Arg 530 535 540

Val Arg Ala Gly Ala Gin Gly Leu Thr Thr He Met Lys Phe Val Asp 545 550 555 560

Lys Gly Glu Gly Phe Tyr Arg Asp Gly Ser Phe lie Asp His Thr Asn 565 570 575

Val Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn Val Leu lie Glu Gly Phe Ser 580 505 590

Gin Leu Leu Pro Val He Gin Pro Thr Glu Phe Ala Leu Lys Glu Glu 595 600 605

Gin Thr Asn lie Leu Tyr Glu Trp He Glu Lys Ala Phe Met Pro He βΙΟ 615 620

Leu Vai Arg Gly Glu leu Met Asp Met Thr Arg Gly Arg Ser Ile Ser 625 630 635 640

Arg Ala Thr Gly Glu Ser His Vai Gin Ala, Met Glu Ile Leu Arg Ser 64 5 650 555

Leu Vai Arg Ile Ala Glu Ser Ala Gin Pro Glu Gin Lys Thr Lys Leu 660 665 670

Leu Ser Phe Vai Lys Ala Gin Leu Thr Ser Asp Thr Phe Tyr Asp Ser 675 6B0 6B5

Tyr Arg Ser Leu Lys Ser Tyr Lys Asp lie Asp Leu Vai Asn Lys Leu 690 695 700

Leu Ala Asp Asn Gin He Pro Ala Glu Vai Asp Lys Asp Tyr Ile Ala 705 710 715 720

Ala Phe Asn Asn Met Asp Lys Phe Vai Tyr Arg Ser Ala Gin Glu Gly 725 730 735

Phe Thr Phe Ala Leu Ser Met Tyr Ser Ser Arg Thr Gin Asn Tyr Glu 740 745 750

Asp Met Asn Asn Glu Asn Arg Lys Gly Trp Tyr Thr Ala Asp Gly Met 755 760 765

Vai Tyr Leu Tyr Asn Asp Asp Leu Ser His Tyr Ser Asn His Tyr Trp 770 775 780

Ala Thr Vai Asp Pro Tyr Arg Leu Pro Gly Thr The Thr Thr Lys Asp 785 790 795 800

Lys Arg Glu Asp Gly Ser Gly Glu Vai Thr Leu Ala Ser Asp Phe Vai

80S 810 SIS

Gly Ala Ser Gin Leu Gly Asn Arg Leu Ala Thr lie Ala Met Asp Phe 82Q 025 830

Asn Asn Trp Asn Asm Ser Leu Thr Ala Arg Lys Ala Trp Ile Vai Leu 935 840 845

Gly Asn Lys Ile Vai Phe Leu Gly Thr Asp Ile Gin His Gin Ser Ala 850 855 860

Gin Gly Ala Glu Thr Thr Ile Glu Asn Arg Lys Leu Leu Thr Gly Glu 865 870 075 880

Lys Tyr Ser Tyr Tyr lie Asn Gly Gin Pro Vai Asp Leu Ser Lys Glu 885 390 895

Vai Vel Thr Asp Lys Thr Gin Ser Phe Tyr Met Thr Asn Gly Lys Asp 900 905 910

Asn Gin Ser lie Gly Tyr Vai Phe Leu Asn Gin Leu Pro Thr His Ala 915 920 925

Lys Leu Asp Gin Arg Thr Gly Lys Trp Ser Asp Ile Asn Tyr Asn Gin 530 935 940

Ser Lys Glu Glu Vai Ser Asn Ser Phe Vai Ser Leu Trp His Glu His 945 950 955 960

Ala Gin Thr Ser Ser Asn Tyr Ala Tyr val Leu Vai Pro Asn Gin Ser 965 970 975

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Asp Arg Asp Leu Gin Vai Vai Tyr Asp Gin Glu Gin Asn Vai Trp Gly 995 1000 1005

Val Vai Lys Tyr Thr Asp Thr Ala Tyr Lys Leu Thr Asp Asp Ile Thr 1010 1015 1020

Leu Thr Asp Ala Gly Leu Tyr Thr Ile Gin Lys Val Glu Gly Gly Tyr 1025 1030 1035 1040

Arg lie Ala Phe Tyr Asn Pro Seu Thr Arg Thr Val Lys Asn Gly Ile 1045 1050 1055

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Ala Ala Tyr Pro Ser Thr Val Trp Lys Val Thr Met Pro Glu Gly Ser 1075 1080 1085

Asp Lys Gin Thr Gly Ser Val Glu Lys Thr Glu Lys Glu Glu Lys Gin 1090 1095 1100

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Ala Ala Glu Lys Thr Lys Pro Ser Lys Pro Arg Leu Pro Gin Thr Gly 1125 1130 1135

Glu,Glu Ala Ser Leu Gly Leu Gly Phe Leu Gly Leu Leu Thr Leu Gly 1140 1145 1150

Ala Val val Asp Phe Lys Cys Arg Arg Ser His Ser 1155 1160

<210> 95 <211> 1164 <212> PRT <213> Streptococcus suis <22 0> <223> hialuronano-liase <400> 95

Met Gly Phe Phe lie Ser Gin Ser Lys Gin His Tyr Gly lie Arg Lys 15 10 15

Tyr Lys Val Gly Val Cys Ser Ala Leu lie Ala Leu Ser lie Leu Gly 20 25 30

Thr Arg Val Ala Ala Am Gin Leu Pro Ser Thr Glu The Ala Ser Pro 35 40 45

Gin Ser Ser Glr. Leu Val Glu Thr Thr Pro Glu Thr Thr Glu Ala Val 50 ' 55 GO

Met Thr Ser Glu Val Ser Ser Glu Val Ser Pro Val Thr Ser Thr Glu

SS 70 75 SO

Thr Gin Pro Ser Ser Thr Thr Ala Glu Thr Leu Ala Ser Pro Gin Ala SS 90 95

Val Sin Ala Thr Lye Glu Glu Lys Am Leu Val Ala Asn Gly Glu Phe LOO 105 110

He Ser Thr Thr Ala Pro Ser Gly Asn Trp Lys Glu Leu Ala Ala Thr 115 120 126

Asn Trp Glu Thr Trp lie Pro Ala Asn Val Lys Lya Glu Aon Gly Gin 130 135 140

Val Arg lie Asp Glu Gly Arg Leu His lie Ser Ser Thr Ala Ser Tyr 145 150 155 160

Arg Val Ala Val His Gin Thr Val Asp Val Asp Pro Asn Lys Arg Tyr 165 170 175

Leu Phe Ser Tyr Asp Val Glu Thr Lys Asp Leu Lys Gly Ser Gly Val 180 IBS 190

Arg Val Arg Leu Arg Ser Leu Thr Ala Glu Gly Lys Asp Leu Ser Pro 195 200 205

Gin Glu Phe Ala Tyr Thr Pro Tyr Lys Asn Gly Ser Gin Ala Glu His 210 215 220

He Glu Gin lie Leu Thr Val Ser Pro Glu Thr Arg Lys Leu Lys Val 225 230 235 240

Glu Leu Phe Phe Glu Asn Ser Val Gly Gin Ala Trp Leu Asp Asn lie 245 250 255

Sec Leu Val Glu Tyr Val Glu Lys Thr Pro Glu Thr Pro Glu Gin Ser 260 265 270

Pro Glu Leu Val Gin Pro Glu Thr Gly Gin lie Ser Leu Ala Ser Am 275 280 2Θ5

Lya Val Tyr Leu Pro Val Arg Pro Asp Leu Thr Tyr Arg lie Ala Asp 290 295 300

Ala Ala Val Ala Thr Val Glu Lys Asn Met lie Arg Pro Leu Ala Ala 305 310 315 320

Gly Lys Thr Gin val Asp Val Tyr Asp Lys Asp Thr Lys Leu Ser Ser 325 330 335

Phc Glu Leu lie Val Thr Glu His Gin Ala Thr Val Phe Asp Thr Leu 340 345 350

Arg Asn Asn Trp Glu Asp lie Ser Leu Ala Asn Lys Arg Tyr Gin Ser 355 360 365

Asn Asp Ala Gin Met Lya Ala Phe Leu Gly Arg Leu Asp Ala Gly Val 310 375 3S0

Tyr Arg Arg leu Glu Gin Met Ala Gin Val Val Glu Asn Pro Asp Ser 420 425 430

Ala Tyr Tyr His Asp Aig Ser Leu lie Asp Leu Val Arg Lys Gly Met 435 440 415

Aan Trp Leu Tyr, Thr Asn Val Tyr Asn Glu Asn Lys Ser lie Asp Gly 450 455 460

Asa Trp Trp Asp Tyr Glu Ils Gly Thr Pro Arg Ala Val Val Asn Thr 465 470 475 480 T.ej Tie Tyr Met Hie Pro Tyr Phe Ser Gin Glu Glu lie Leu Thr Tyr 485 490 495

Thr Lys Pro lie Ser Lys Phe Val Pro Asp pro Thr Thr lie Arg Lys 500 505 510

Thr Leu Thr Asn Pro Val Pro Ala Val Gly Gly Asn Gin Thr Asp Leu 515 520 525

Ser Lys Val Ala lie Leu Glu Gly Ala Leu Arg Glu Asp Ala Asp Arg 530 535 540

Val Arg Ala Gly Ala Gin Gly Leu Thr Thr lie Met Lys Phe Val Asp 545 550 555 560

Lys Gly Glu Gly Phe Tyr Arg Asp Gly Ser Phe lie Asp llis Thr Asn 565 570 575

Val Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn Val Leu He Glu Gly Phe Ser 580 585 590

Gin Leu Leu Pro Val lie Gin Pro Thr Glu Phe Ala Leu Lys Glu Glu 595 S00 60S

Gin Thr Asn lie Leu Tyr Glu Trp lie Glu Lys Ala Phe Met Pro lie 610 615 620

Leu Val Arg Gly Glu Leu Met Asp Met Thr Arg Gly Arg Ser lie Ser 625 630 635 640

Arg Ala Thr Gly Glu Ser His Val Gin Ala Met Glu lie Leu Arg Ser 645 650 655

Leu val Arg He Ala Glu Ser Ala Gin Pro Glu Gin Lys Thr Lys Leu 660 665 670

Leu Ser Phe Val Lya Ala Gin Leu Thr Ser Asp Thr Phe Tyr Asp Ser 675 6Θ0 635

Tyr Arg Ser Leu Lys Ser Tyr Lys Asp lie Asp Leu Val Asn Lys Leu 690 695 700

Lau Ala Asp Asn Gin lie Pro Ala Glu Val Asp Lys Asp Tyr lie Ala 705 710 715 720

Ala Phe Asn Asn Met Asp Lya Phe Val Tyr Arg Ser Ala Gin Glu Gly 725 730 735

Phe Thr Phe Ala Leu Ser Met Tyr Ser Ser Arg Thr Gin Asn Tyr Glu 740 745 750

Asp Met Asn Asn Glu Asn Arg Li's Gly Trp Tyr Thr Ala Asp Gly Met 755 760 765

Val Tyr Leu Tyr Asm Asp Asp Leu Ser His Tyr Sec Asn His Tyr Trp 770 775 7Θ0

Ala Thr Val Asp Pro Tyr Arg leu Pro Gly Thr The Thr Thr Lys Asp 785 790 795 800

Lys Arg Glu Asp Gly Ser Gly Glu Val Thr Leu Ala Ser Asp Phe Val 805 310 815

Gly Ala Ser Gin Leu Gly Asr. Arg Leu Ala Thr lie Ala Met Asp Phe 820 825 830

Asn Asn Trp Asn Asn Ser Leu Thr Ala Arq Lys Ala Trp lie Val Leu 335 840 845

Gly Asn Lys lie Val Phe Leu Gly Thr Asp lie Gin His Gin Ser Ala 850 855 " 860

Gin Gly Ala Glu Thr Thr lie Glu Asn Arg Lys Leu Leu Thr Gly Glu 865 870 375 380

Lys Tyr Sec Tyr Tyr lie Asn Gly Gin ?ro Val Asp Leu Ser Lys Glu 8 Θ 5 990 895

Val Val Thr Asp Lys Thr Gin Ser Phe Tyr Met Thr Asn Gly Lys Asp 900 905 910

Asn Gin Ser lie Gly Tyr Val Phe Leu Asn Gin Leu Pro Thr His Ala 915 920 925

Lys Leu Asp Gin Arg Thr Gly Lys Trp Ser Asp lie Asn Tyr Asn Gin 930 935 * 94 0

Ser Lys Glu Glu Val Ser Asn Ser Phe Val Ser Leu Trp His Glu His 945 950 955 950

Ala Gin Thr Ser Ser Asn Tyr Ala Tyr Val Leu Val Pro Asn Gin Ser 965 970 975

Met Glu Lys Val Asn Gin Ala Ala Ala Ser Val Lys Leu Leu His Gin 930 9S5 990

Asp Arg Asp Leu Gin Val Val Tyr Asp Gin Glu Gin Asn. Val Trp Gly 995 1000 1005

Val Val Lys Tyr Thr Asp Thr Ala Tyr Lys Leu Thr Asp Asp lie Thr 1010 1015 1020

Leu Thr Asp Ala Gly Leu Tyr Thr lie Gin Lys Val Glu Gly Gly Tyr 1025 1030 1035 1040

Arg He Ala Phe Tyr Asn Pro Ser Thr Arg Thr Val Lys Asn Gly lie

1045 1050 1D5S

Glu Leu Thr Lys Ala Gly Ser Ser Leu Thr Val Glu Met Glu Pro Thr 1060 1065 1070

Ala Ala Tyr Pro Ser Thr Val Trp Lys Val Thr Met Pro Glu Gly Ser 1075 1080 1085

Asp Lys Gin Thr Gly Ser Val Glu Lys Thr Glu Lys Glu Glu Lys Gin 1090 1095 1100

Ala Ala Glu Lys Thr Lys Fro Ser Lys Pro Arg Leu Pro Gin Thr Gly 1125 1130 1135

Glu Glu Ala Ser Leu Gly Leu Gly Phe Leu Gly Leu Leu Thr Leu Gly 1140 1145 1150

Ala Val Val Asp Phe Lys Cys Arg Arg Ser His Ser 1155 1160

<210> 96 <211> 802 <212> PRT <213> Vibrio fischeri (estirpe ATCC 700601 / ES114) <22 0> <223> hialuronano-liase <4Ο0> 9 6

Met Tyr Met lie Lys Lys Hie Arg Leu Asn Thr lie Ala Leu Ser Met 15 10 15

Leu Phe Leu Pbe Thr Gly Asn Ala Tyr Ala Ala Lys Asn Thr Gin Thr 20 25 30

Pro Gin Tyr Leu Pro Ser Asp Phe Glu Gin Val Arg Glu Asn Trp Ala 35 4 0 45

Glu Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Ala lie Thr Phe Asp Gin Thr Leu Lys 50 55 60

Asn Met Val Thr Ser Thr Asn Ser Ser Ala Gin Lys Hia Trp Asp Ser 65 70 75 80

Met Thr Pro Gin Pro Asn Ala Ser Gly lie Trp Asp Asp Leu Pro Leu 85 90 95 lie Asp Lys Asp Thr Thr Leu Gly Pro Asn lie.Arg Asn Ser Tyr Gin 100 105 110

Arg Leu Phe Thr Met Ala Lys Ala Tyr Arg Leu Arg Asp Gly Asn Leu 115 120 125

Glu Α3Π Asn Gin Leu Met Leu Asn Asp lie Met Thr Ala Met Aan Tyr 130 135 140 lie Asn Gin Asn Phe Tyr ?he Val Asn Gin Leu Glu Tyr Gly Asn Trp 145 150 155 160

Trp Gin Trp Glu Leu Ala He Pro Lys Asp lie His Asn lie Leu Val 165 170 175

Leu Leu Phe Asp Asp lie Lys Asp Asn Tyr Gin Thr lie He Thr Asn 180 1B5 190

His Leu Asn Ala Thr Arg Tyr Phe Thr Pro Asp Pro Thr His Leu Gly 195 200 205

Val Ser Pro Gly Ala Ala Glu Ser Thr Asn Pro Asn Tyr Arg Glu Ser 210 215 220

Thr Gly Gly ASH Arg Thr Asp Asn Ala Gin Val Val Leu He Arg Gly 225 230 235 240

Mat Lau Glu Asn Asn Ser Glu Glu Tie Ser Gin Ala lie Ala Ala Leu 245 250 255

Pro Ala Val lie Glu Tyr Val Ser Glu Gly Asp Gly Tyr Tyr Thr Asp 260 265 270

Gly Ser Phe Leu Gin His Ser Asp lie Ala Tyr Asn Gly Thr Tyr Gly 275 ' 280- 285

Asn Val Leu Leu Gly Gly Leu Gly He Gin Met Asn Ala Val Ala Gly 290 295 300

Ser Pro Trp Ser Het Asp Asn Gin Thr lie Ser Asn Val Tyr Asn Tie 305 310 315 320 lie Asn Gin Ser Tyr Glu Pro Leu Leu Tyr Lys Gly Ala Met Met Asp 325 330 335

Met Val Asn Gly Arg Ser Tie Ser Arg Ser Ala Glu Gin Asn His Asp 340 345 3S0

Val Gly Leu Asn lie Val Asn Ser Met Leu Phe Tyr Thr Aan Gly Pro 355 3S0 365

Asp Ser Asp Lys Asn Lys Gin Leu Ser Ser Leu lie Lys Thr Gin lie 370 375 360

Thr Asp Asp Thr Tyr Gin Asn Phe Phe Asp Lys Tie Tyr Tyr val Ser 335 390 395 400

Thr Tyr Gin Ala Ala Gin His lie Val Asn Asp Pro Thr Val Ser Leu 405 410 415

Lys Asp Pro Leu lie Gly Asn Phe Ser Tyr Pro Ser Mot Asp Arg He Ί 20 925 430

Val His Arg Arg Thr Asp Trp Ala Phe Ala Leu Ala Met His Set Tyr 435 440 445

Arg lie Gly Asn Tyr Glu Cys Met Aar Gly Glu Asn Leu Lys Gly Trp 450 455 460

Phe Thr Gly Asp Gly Met lie Tyr Leu Tyr Asn Asp Gin Leu Asp His 465 470 475 4S0

Tyr Thr Gly Tyr Trp Pro Thr Val Asn Ala Ser Arg Met Pro Gly Thr 465 490 495

Thr Val Asp Ser Gin lie Met Ala Asp Cys Ser Gly Glu Arg Val Gly 500 505 510

Gly Asn Val Asn Thr Asn Met Gin Trp Val Gly Ser Thr Ser Leu Asn 515 520 525

Asn Tyr Gly lie Ala Gly Met Gin Phe Tyr Asn Trp Ser Asp Thr Leu 530 535 540

Ser Ala Tyr Lys Ser Trp Phe Met Phe Asp Asn Glu val VaL Met Leu 545 553 ' 555 560

Gly Ser Asn lie Lys Asp Gin Ser Asn Ala Asn Asn lie Thr Thr lie 565 570 575

Glu Asn Arg Lys Arg Leu Ala Glu Thr Lys Leu Phe lie Asp Gly Thr 580 585 590

Glu Gin Ala Ala Leu Pro Tyr Gin Gly Ala Pro Ala Thr Phe Ser lie 595 600 605

Arg Asn Lys Thr Leu Ala Asn Set Asp Leu Ser Tyr Val Met Leu Thr 610 615 620

Pro Lys Thr lie Ser lie Ser Gin Asn Asp Val Asp Gly Asn Trp Ser 625 630 635 640

Asp lie Gly Asn Ser Lys Gly Asp Val Ser Asp Ser Tyr Leu Gin Ala 645 650 655

Thr Leu Thr Gin Val Asp Gin Ala Asp Tyr Gin Tyr Ala Leu Leu Pro 660 665 670

Asn Gin Asn Asn Asp Thr Val Gin Asn Tyr Ala Gin Jlis Pro A3p Val 675 680 6B5

Thr Val Leu Arg Gin Asp Glu Gin Ala His Ala Val Gin Glu Asn Thr 690 695 700

Leu Asn lie lie Ala Ala Asn Asn Trp Lys Asn Asn Pro Val Asn lie 705 710 715 720

Thr Asp Thr lie Thr Leu Asn Ser Met Met Gly Phe Met He Lys Glu 725 730 735

Glu Ser Ser Asn Thr ?he Thr Val Ala Val Ser Glu Pro lie Gin Thr 740 745 Í50 lie Asp Ser Val Asn ?ha Thr Phe Asp Lys Gin Gly lie Val He Lys 755 760 765

Glu Asp lie Glu Asn Arg Val Val Leu Asn Gly Thr Thr Leu Thr lie 770 775 780

Asn Thr Ser Gly Leu Gin Gly Gin Set Tyr Ser Phe Gin val Thr lie 785 790 795 800

Gin Asp

<210> 97 <211> 517 <212> PRT <213> Synechococcus sp. (estirpe RCC307) <22 0> <223> hialuronano-liase <4Ο0> 97

Met Gly Ala Pro Ala lie Pro Lys Val Pro Arg Ser Pro Ser Lys Ser 15 10 15

Glu His Thr Thr Arg Pro Asn Ser Gly Gin Ser Glu Val Val Arg Gin 20 25 30

Ala Glu Glu Leu Fhe Glu Gin Thr Leu Val Asn Val Arg Gly Gin Leu 35 40 45

Ala Gly Ala Val Ala Ala Lev Glu Ser Ser Val His Asp Ser Glu Leu 50 55 60

Asn Tyr Gly Glu lie Phe Leu Arg Asp Asn Val Pro Val Met Val Tyr

65 70 75 BO

Leu Leu Leu Arg Gly Arg Phe Glu lie Val Arg His Fhe Leu Asp Leu 05 90 95

Cys Leu Glu Leu Gin Ser Arg Ser Tyr Arg Thr Arg Gly Val Phe Pro 100 105 110

Thr Ser Phe Val Glu Glu Asp Asp Lys He Leu Ala Asp Tyr Gly Gin 115 120 125

Arg Ser lie Gly Arg lie Thr Ser Val Asp Ala Ser Leu Trp Trp Pro 130 135 140

Val Leu Cys Trp Met Tyr Val Arg Ala Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly 145 150 155 160

Thr Ser Pro Lys Val Gin Arg Ala Val Gin Leu Leu Leu Asp Leu Val 165 170 175

Leu Gin Pro Ser Phe Tyr Glu Pro Pro Val Leu Phe Val Pro Asp Cys 160 185 190

Ala Phe Met lie Asp Arg Pro Met Asp Val Trp Gly Ala Pro Leu Glu 195 200 205

Val Glu Val Leu Leu phe Gly Cys Leu Lys Ser Cys Cys Gin Leu Met 210 215 220

Ser Leu Val Glu Gly Gly Gly His Gly Gly Pro Leu lie Gin Gin Arg 225 230 235 240

Leu Glu Leu Thr Arg Thr Trp Met Arg Asp Leu Arg Val Tyr Leu Leu 245 250 255

Asn Hi a Tyr Trp Val Thr Ser Lys Thr Met Gin Val Leu Arg Arg Arg 260 265 270

Pro Thr Glu Gin Tyr Gly Asp Tyr Gin Ser Arg Asn Glu Phe Asn Val 275 2B0 295

Gin Pro Glu Val lie Pro His Trp Leu Gin Glu Trp Leu Asp Asp Arg 290 295 300

Gly Gly Tyr Leu lie Gly Asn Met Arg Thr Gly Arg Pro Asp Phe Arg 305 310 31Ξ 320

Phe Tyr Ser Leu Gly Asn Ala Leu Gly Ser Leu Phe Gly Leu Leu Thr 325 330 335

Gly pro Gin Gin Leu Ala Leu Phe Arg Leu Val lie His Asn Arg Gin 340 345 350

His Leu Met Ala Glu Met Pro Met Arg lie Cys His Pro Pro Met Asp 355 360 365

Gin Asp Glu Trp lie Thr Asn Thr Gly Met Asp Pro Lys Asn Trp Pro 370 375 " 300

Trp Ser Tyr His Asn Gly Gly His Trp Pro Ser Leu leu Trp Fro Met 385 390 395 400

Ala Ala Ala Val Leu Met His Gin Arg Leu Tyr Pro Asn Asp Asp Leu 405 410 415

Leu Leu Leu Gly Gin Thr Arg Thr Met Leu Glu Glu Cys Tyr Trp Gin 420 425 430

Gin Leu Asn Gin Leu Pro Arg Gin Gin Trp Ala Glu Tyr Phe Asp Gly 435 440 445

Pro Thr Gly Thr Trp Val Gly Gin Gin Ala Arg lie Asn Gin Thr Trp 450 455 460

Thr lie Val Gly Fhe Leu Leu Leu His His Leu Met Arg Lys Ala Pro 4SS 470 475 4B0

Gin Asp Val Lys Leu Leu Asp Leu Asp Asp Val Gly Pro Leu Arg Leu 405 490 495

Ser Phe Gin Asp Gin Hi3 Glu Lys Ser Ser Thr Asp Glu Arg Lys Ser 500 505 510 i’ha Leu Lys Asn Tyr 5-15

<210> 98 <211> 1021 <212> PRT <213> Proteus vulgaris <22 0> <223> condroitina-sulfato-ABC-endoliase <400> 98

Met Pro lie Phe Arg phe Thr Ala Leu Ala Met Thr Leu Gly Leu Leu 15 ID 15

Ser Ala Pro Tyr Asn Ala Met Ala Ala Thr Ser Asn Pro Ala Phe Asp 20 25 30

Pro Lys Asn Leu Met Gin Ser Glu lie Tyr His Phe Ala Gin Asn Asn 35 40 45

Pro Leu Ala Asp Phe Ser Ser Asp Lys Asn Ser lie Leu Thr Leu Ser 50 55 60

Asp Lys Arg Ser lie Met Gly Asn Gin Ser Leu Leu Txp Lys Trp Lys 65 70 75 80

Gly Gly Ser Ser Phe Thr Leu His Lys Lys Leu lie Val Pro Thr Asp 85 90 95

Lys Glu Ala Ser Lys Ale Trp Gly Arg Ser Ser Thr Pro Val Phe Ser 1O0 105 110

Phe Trp Leu Tyr Asn Glu Lys Pro lie Asp Gly Tyr Leu Thr lie Asp 115 120 125

Phe Gly Glu Lys Leu lie Ser Thr Ser Glu Ala Gin Ala Gly Phe Lys 130 135 140

Val Lys Leu Asp Phe Thr Gly Trp Arg Ala Val Gly Val Ser Leu Asn 145 150 155 160

Asn Asp Leu Glu Asn Arg Glu Met Thr Leu Asn Ala Thr Asn Thr Ser 165 170 175

Scr Asp Gly Thr Gin Asp Ser He Gly Arg Ser Leu Gly Ala Lys Val ISO 185 190

Asp Ser lie Arg Phe Lys Ala Pro Ser Asn Val Sec Gin Gly Glu lie 195 200 205

Tyr lie Asp Arg lie Met Phe Ser Val Asp Asp Ala Arg Tyr Gin Trp 210 2L5 220

Ser Asp Tyr Gin Val Lys Thr Arg Leu Ser Glu Pro Glu lie Gin Phe 225 230 235 240 HÍS ήsn Val Lys Pro Gin Leu Pro Val Thr Pro Glu flan Leu Ala Ala 245 250 255 lie Asp Leu lie Arg Gin Arg Leu He A3n Glu Phe val Gly Gly Glu 263 265 270

Lys Glu Thr Asn Leu Ala Leu Glu Glu Asn lie Ser Lys Leu Lys Ser 275 2 SO 285

Asp Phe A3P Ala Lew Asn lie His Thr Leu Ala Asn Gly Gly Thr Gin 290 295 300

Gly Arg His Leu He Thr Asp Lys Gin lie He lie Tyr Gin Pro Glu 305 310 315 320

Asn Leu Asn Ser Gin Asp Lys Gin Leu Phe Asp Asn Tyr Val He Leu 325 330 335

Gly Asn Tyr Thr Thr Leu Wet Phe Asn lie Ser Arg Ala Tyr Val Leu 34 0 345 350

Glu Lys Asp Pro Thr Gin Lys Ala Gin Leu Lys Cln Met Tyr Leu Leu 355 360 365

Met Thr Lys His Leu Leu Asp Cln Gly Phe Val Lys Gly Set Ala Leu 370 375 380

Val Thr Thr His His Trp Gly Tyr Ser Ser Arg Trp Trp Tyr lie Ser 385 390 -395 400

Thr Leu Leu Met Ser Asp Ala Leu Lys Glu Ala Asn Leu Gin Thr Gin 405 410 415

Val Tyr Asp Ser Leu Leu Trp Tyr Ser Arg Glu Phe Lys Ser Ser Phe 420 425 430

Asp Met Lys val Ser Ala Asp Ser ser Asp Leu Asp Tyr Phe Asn Thr 4 35 440 445

Leu Ser Arg Gin His Leu Ala Leu Leu Leu Leu Glu Fro Asp Asp Gin 450 455 460

Lys Arg lie Asn Leu Val Asn Thr Phe Ser His Tyr lie Thr Gly Ala 465 470 475 4Ê0

Leu Thr Gin Val Pro Pro Gly Gly Lys Asp Gly Leu Arg Pro Asp Gly 485 490 495

Thr Ala Trp Arg His Glu Gly Asn Tyr Pro Gly Tyr Ser Phe Pro Ala 500 505 510

Phe Lys Asn Ala Ser Gin Leu Tie Tyr Lsu Leu Arg Asp Thr Pro Phe 515 520 525

Ser Val Gly Glu Ser Gly Trp Asn Asn Leu Lys Lys Ala Met Val Ser 530 535 540

Ala Trp lie Tyr Ser Agn Pro Glu Val Gly Leu Pro Leu Ala Gly Arg 545 550 555 560

His Prs Phe Asn Ser Pro Ser Leu Lys Ser Val Ala Gin Gly Tyr Tyr 555 570 575

Trp Leu Ala Met Ser Ala Lys Ser Ser Pro Asp Lys Thr Leu Ala Ser 580 585 590

He Tyr Leu Ala lie Ser Asp Lys Thr Gin Asn Glu Ser Thr Ala lie 555 600 605

Phe Gly Glu Thr lie Thr Pro Ala Ser Leu Pro Gin Gly Phe Tyr Ala 610 615 620

Phe Asn Gly Gly Ala Phe Gly lie His Arg Trp Gin Asp Lys Met Val 625 630 635 640

Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Thr Asn val Trp Ser Ser Glu lie Tyr Asn 645 550 655

Lys Asp Aari Arg Tyr Gly Arg Tyr Gin Ser His Gly Val Ala Gin lie 660 665 670

Val Ser Asn Gly Ser Gin leu Ser Gin Gly Tyr Gin Gin Glu Gly Trp 675 680 685

Asp Trp Asn Arg Met Glu Gly Ala Thr Thr lie His Leu Pro Leu Lys 690 695 700

Asp Leu Asp Ser Pro Lys Pro His Thr Leu Met Gin Arg Gly Glu Arg 705 710 715 720

Gly Phe Ser Gly Thr Ser Ser Leu Glu Gly Gin Tyr Gly Met Met Ala 725 730 735

Phe Asn Leu lie Tyr Pro Ala Asn Leu Glu Arg Phe Asp Pro Asn Phe 740 .745 750

Thr Ala Lys Lys Ser Val Leu Ala Ala Asp Asti His Leu lie Phe lie 755 760 765

Gly Ser Asn He Asrt Ser Ser Asp Lys Asn Lys Asn Val Glu Thr Thr 770 775 7 BO

Leu Phe Gin Kis Ala lie Thr PrP Thr Leu Asn Thr Leu Trp lie Ash 7 B 5 790 795 800

Gly Gin Lys lie Glu Asn Met Pro Tyr Gin Thr Thr Leu Gin Gin Cly 905 810 ais

Asp Trp Leu He Asp Ser Asn Gly Asn Gly Tyr Leu He Thr Gin Ala 020 825 830

Glu Lys Val Asn Val Ser Arg Gin His Gin Val Ser Ala Glu Asn Lys 035 B40 845

Asn Arg Gin Pro Thr Glu Gly Aan Phe Ser Ser Ala Trp He Asp His 050 855 860

Ser Thr Arg Pro Lys Asp Ala Ser Tyr Glu Tyr Met Val Phe leu Asp 865 870 875 880

Ala Thr Pro Glu Lys Met Gly Glu Met Ala Gin Lys Phe Arg Glu Asn 385 830 895

Asn Gly Leu Tyr Gin val Leu Arg Lys Asp Lys Asp Val His lie lie SOO 905 910

Leu Asp Lys Leu Ser Asn Val Thr Gly Tyr Ala Fhe Tyr Gin Pro Ala 915 920 925

Ser Tie Glu Asp Lys Trp lie Lys Lys Val Asn Lys Pro Ala He Val 930 935 940

Met Thr His Arg Gin Lys Asp Thr Leu He Val Ser Ala Val Thr Pro 945 950 955 960

Asp Leu Asn Met Thr Arg Gin Lys Ala Ala Thr Pro Val Thr He Asn 965 970 975

Val Thr lie Asr. Gly Lys Trp Gin Ser Ala Asp Lys Asn Ser Glu Val 930 985 990

Lys Tyr Gin Val Ser Gly Asp Asn Thr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Tyr 995 1000 1005

Phe Gly lie Pro Gin Glu lie Lys Leu Ser Pro Leu Pro 1O10 1015 1020

<210> 99 <211> 700 <212> PRT <213> Pedobacter heparinus <22 0> <223> condroitina-AC-liase <400> 99

Met Lys Lys Leu Phe Val Thr Cys lie Val Phe Phe Ser He Leu Ser 1.5 10 15

Pro Ala Leu Leu lie Ala Gin Gin Thr Gly Thr Ala Glu Lou He Met 20 25 30

Lys Arg Val Met Leu Asp Leu Lys Lys Pro Leu Arg Asn Met Asp Lys 35 40 45

Val Ala Glu Lys Asn Leu Asn Thr Leu Gin Fro Asp Gly Ser Trp Lys 50 55 60

Asp Val Pro Tyr Lys Asp Asp Ala Met Thr Asn Trp Leu Pro Aan Asn

65 70 75 SO

His Leu Leu Gin Leu Glu Thr He He Gin Ala Tyr lie Glu Lys Asp 35 90 95

Ser His Tyr Tyr Gly Asp Asp Lys Val Phe Asp Gin lie Ser Lys Ala 100 105 110

Phe Lys Tyr Trp Tyr Asp Ser Asp Pro Lys Ser Arg Asn Trp Trp His 115 120 125

Asn Glu lie Ala Thr Fro Gin Ala Leu Gly Glu Met Leu He Leu Met 130 135 140

Arg Tyr Gly Lys Lys Pro Leu Asp Glu Ala Leu Val His Lys Leu Thr 145 150 155 160

Glu Arg Met Lys Arg Gly Glu Pro Glu Lys Lys Thr Gly Ala Asn Lys 165 1)0 175

Thr Asp Tie Ala Leu His Tyr Phe Tyr Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asp

100 105 19C

Glu Ala Leu Leu Ser Phe Ala Val Lys Glu Leu Phe Tyr Pro Vel Gin 195 200 205

Phe Val His Tyr Glu Glu Gly Leu Gin Tyr Asp Tyr Ser Tyr Leu Gin 210 215 220

His Gly Pro Gin Leu Gin lie Ser Ser Tyr Gly Ala Val Phe lie Thr 225 230 235 240

Gly Val Leu Lys Leu Ala Asn Tyr Val Arg Asp Thr Pro Tyr Ala Leu 24 5 250 255

Ser Thr Glu Lys Leu Ala lie Phe Ser Lys Tyr Tyr Arg Asp Ser Tyr 260 265 270

Leu Lys Ala lie Arg Gly Ser Tyr Met Asp Phe Asn Val Glu Gly Arg 275 280 285

Gly Val Ser Arg Pro Asp lie Leu Asn Lys Lys Ala Glu Lys Lys Arg 290 295 300

Leu Leu Val Ala Lys Met lie Asp Leu Lys His Thr Glu Glu Trp Ala 305 310 315 320

Asp Ala lie Ala Arg Thr Asp Ser Thr Val Ala Ala Gly Tyr Lys lie 325 330 335

Glu Pro Tyr His His Gin Phe Trp Asn Gly Asp Tyr Val Gin His Leu 310 345 350

Arg Pro Ala Tyr Ser Phe Asn Val Arg Met Val Ser Lys Arg Thr Arg 355 360 365

Arg Ser Glu Ser Gly Asn. Lys Glu Asn Leu Leu Gly Arg Tyr Leu Ser 370 375 330

Asp Gly Ala Thr Asn lie Gin Leu Arg Gly Pro Glu Tyr Tyr Asn lie 385 390 395 400

Met Pro Val Trp Glu Trp Asp Lys lie Pro Gly lie Thr Ser Arg Asp 405 410 415

Tyr Leu Thr Asp Arg Pro Leu Thr Lys Leu Trp Gly Glu Gin Gly Ser 420 425 430

Asn Asp Phe Ala Gly Gly Val Ser Asp Gly Val Tyr Gly Ala Ser Ala 435 440 445

Tyr Ala Leu Asp Tyr Asp Ser Leu Gin Ala Lys Lys Ala Trp Phe Phe 450 455 460

Phe Asp Lys Glu He Val Cys Levi Gly Ala Gly lie Asn Ser Asn Ala 465 470 475 480

Pro Glu Asn lie Thr Thr Thr Leu Asn Gin Ser Trp Leu Asn Gly Pro 485 490 495

Val lie Ser Thr Ala Gly Lys Thr Gly Arg Gly Lys He Thr Thr Phe 500 505 510

Lys Ala Gin Gly Gin Phe Trp Leu Leu His Asp Ala lie Gly Tyr Tyr 515 520 525

Phe Pro Glu Gly Ala Asn Leu Ser Leu Ser Thr Gin Ser Gin Lys Gly 530 535 540

Asn Trp Phe His He Asn Asn Ser Ilis Ser Lys Asp Glu Val Ser Cly 545 550 555 560

Asp Val Phe Lys Leu Trp lie Asn His Gly Ala Arg Pro Glu Asn Ala 565 570 575

Gin Tyr Ala Tyr lie Val Leu Pro Gly lie Asn Lys Pro Glu Glu He 580 585 590

Lys Lys Tyr Asn Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu Ala Asn Thr Asn Gin 595 600 605

Lnu Gin Ala Val Tyr His Gin Gin Leu Asp Met Val Gin Ala Tie Phe 610 615 620

Tyr Thr Ala Gly Lys Leu Ser Val Ala Gly lie Glu lie Glu Thr Asp 625 630 635 640

Lys fro Cys Ala Val Leu He Lys His lie Asn Gly Lys Gin Val lie 645 650 655

Trp Ala Ala Asp Pro Leu Gin Lyg Glu Lys Thr Ala Val Leu Ser lie 660 665 670

Arg Asp Leu Lys Thr Gly Lys Thr Asti Arg Val Lys lie Asp Phe Pro 675 680 G85

Gin Gin Glu Phe Ala Gly Ala Thr Val Glu Leu Lys 690 695 700 <210> 100 <211> 844

<212> PRT <213> Victivallis vadensis ATCC BAA-548 <22 0> <223> condroitina-AC-liase <4 0 0> 100

Met His Arg Lys lie Val Phe Pro Leu Phe Val Leu Leu Phe Thr Ala 15 10 15

Phe Ala Ala Pha Ala Ala Sar Gin Pro Gin Trp Lys Trp Arg Gin Sar 20 25 30

Lys Tyr Cys Arg lie Thr Glu His Ala Gly Lys Lys Leu Leu Thr Val 35 40 45

Ala lie Pro Ala Asp Ala Pro Glu lie Ser Arg Arg Asn Thr Ala Asp 50 55 60

Thr Pro Val Gly Leu Thr Cys Phe Glu Gly Gin Pro lie Glu Phe Ser 65 10 75 80 lie Arg Leu Arg Asn Ser Gly Ila Ser Arg Pro Asp Asn Leu His Asn 85 90 95

Gly lie Lys Phe Gin Leu Tyr Phe Arg Asp Gly Asn Gly Thr Glu Arg 100 105 110

Trp Thr Gin Ala Glu lie Pro His Glu Pro Phe Pro Trp Arg Arg phe 115 120 125

Arg Phe Ser Glu Arg lie Pro Ala Asp Ala Thr Ser Gly Thr Leu Arg 130 135 140

Leu Gly Leu Gin Gly See Ser Gly Asn Val Glu Phe Asp Leu Asp Ser 145 150 . 155 160

Lbu Gin He Arg Pro leu Asp Pro Glu Leu Ser Pro Val Pro Pro Thr 165 170 175

Fro Glu Gin lie Arg Glu Cys Glu Leu lie Glu Ser Arg Leu Arg Ala 180 .185 190

Gly Leu Pro Ala Gin Gin Pro Pro Pro Gly Pro Glu Val Lys Lys Lau 195 200 205

Leu Glu Arg Gin Asn Gly Asp Gly Thr Phe Arg Asp Leu Asp Tyr Ser 210 215 220

Ala Arg Asn Arg Ser tie Trp Pro Ala Ala Arg His Lau Lys Arg Thr 225 230 235 240

Phe Glu Leu Ala Leu Ala Arg Ala Thr Pro Gly His Ala Leu Tyr Arg 245 250 255

Asp Pro Ala Ala Gly Glu Ala Val Arg Lys Ala Val Ala Trp Trp Ala 260 265 210

Glu Arg Gin Pro Gin Asn Gly Asn Trp Trp Trp Asn Asp Met Tyr Val 275 200 285

Pro Lys He Leu Gly Asn Tie Leu Leu Leu Ser Pro Glu Leu Phe Pro 290 295 300

Asp Gly Pro Arg Arg Arg Ala Ala Leu Asn Val Cys Arg Gin Ala Cya 305 310 315 320

Phe Leu Ser Arg Tyr Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe lie Ala Ala Asn 325 330 335 lie Phe Cys Arg Ala Leu Leu Glu Arg Asn Leu Pro Val Her Asp Arg 340 345 350

Ala Ala Ala Val Leu Ser Glu Glu lie Arg Phe Ala Fro Ala Glu His 355 . 360 365

Lys Thr Ala Trp Ser Phe Gly Gly lie Arg Ala Asp Gly Cys Tyr His 370 375 380

Gin His Gly Pro Gin lie Gin Phe Gly Asn Tyr Gly Gly Glu Phe Leu 385 390 395 400

Ala Asn lie Ala Tyr Trp Ser Asn lie Leu Lys Glu Thr His Trp Glu 405 910 415

Leu Ser Pro Glu Gin Trp Arg lie Met Arg His Leu Thr phe Asn Gly 420 425 430

Phe Gin Trp Val Leu Trp Arg Gly Arg Met Asp Leu Leu Ala Cys Gly 435 440 445

Arg Gin Leu Gly Arg Asn Ala Ala Glu Thr Lys Gly Glu Arg Thr Leu 450 455 460

Asn Ala Phe Ala Glu Leu Arg Asn Ala Asp Pro Gly Asp Arg Ala Pro 465 470 475 400

Tyr Asp Ala Ala Leu Arg Arg Asn Arg Asp Gly Glu Asn Thr Leu Thr 485 490 495

Gly Asn Arg His Phe Trp Asn Ser Asp Tyr Met Val His Arg Arg Pro 500 505 510

Thr Trp Tyr Ala Ser Val Arg Met Asn Ser Val Arg Val Arg Pro lie 515 520 525

Glu Asp Asp Thr Asn Trp Asp Asn Ala Leu Gly Arg Tyr Phe Ser Asp 530 535 540

Gly Ala Cys Leu Val Met Arg Ser Gly Arg Glu Tyr Glu Asn lie Thr 545 550 555 560

Ala Cys Tro Asp Trp Thr Arg Leu Pro Gly Thr Thr Leu Fro Lys Thr 565 570 575

Pro Val Tyr Thr Gly Glu Asp Ala Arg Arg Phe Gly Leu Lys He Gly 580 535 590

Gly Gly Asp Leu Pro Arg Trp Thr His Ser Arg Asn Trp Arg Gin Leu 595 600 605

Gly Glu Thr Gly Phe Val Gly Gly Val Thr Asp Gly Glu Arg Gly Ala 610 615 620

Ala val Tyr Thr Gin Asp Leu Asp Gly Val Arg Ala Arg Ly3 Ala Trp 625 633 635 640

Phe phe Asp Arg Asp Ala Tie Tyr Cys Leu Gly Ser Gly 11a Thr Ser 645 650 655

Thr Ser Pro Tyr Glu Val Ala Thr Thr Val Asn Ser Cys Leu Arg Asn 660 665 670

Gly Glu lie Gin Gin Gly Asp Gly Trp Phe Arg His Asp Gly lie Gly 675 680 685

Tyr Arg Gly Glu Asn Leu Lys Leu Thr Ala Gly Pro Arg Thr Gly Asp 690 695 7C0

Trp Arg Tyr Val Glu Gly Gly Leu Thr Arg Pro Val Pro Glu Thr Lys 70S 710 715 720

Glu Leu Phe Thr Leu Thr Val Glu His Gly Val Lys Pro Arg Asn Ala 725 730 735

Ser Tyr lie Tyr Thr lie Leu Pro Gly Ala Thr Pro GLu Glu Thr Ala 740 745 750

Gly Thr Pro Pro Gly Arg Val Leu Arg Asn Thr Pro Glu Cys Gin Ala 755 760 765

Val Glu Phe Ala Asp Gly Val Arg Ala Ala He Phe Tyr Glu Pro Gly 770 775 780

Arg Leu Asp Asp Phe Glu Thr Asp Thr Pro Gly Val Phe Leu lie Gly 785 790 795 800

Lys Gly Thr Val His Ala Ala Asp Pro Thr Gly Arg His Ser Ser Phe 80S 810 815

Thr Leu Lys Leu Asn Gly Val Ser Arg Lys Val Pru Leu Pro Ala Gly

820 B25 83C

Glu Phe Ala Gly Gin Ser Val Lys lie Val Leu Lys 835 840

<210> 101 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Pré-pró-insulina <22 0> <221> SINAL <222> (1)...(24) <223> Sequência de sinal <22 0> <221> CADEIA <222> (25) ...(54) <223> Cadeia B de insulina <22 0> <221> PROPEP <222> (57)...(87) <223> Péptido C de insulina <22 0> <221> CADEIA <222> (90)...(110) <223> Cadeia A de insulina <4 0 0> 101

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gin His Leu Gys Gly 20 25 30

Str His leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Giu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly 50 55 60

Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu 65 70 75 00

Ala Leu Glu Gly 3er Leu Gin Lys Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys BS 90 95

Thr Ser He Cys 3er Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Pys Asn ICO 105 110

<210> 102 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Pró-insulina <22 0> <221> CADEIA <222> (66)...(86) <223> Cadeia B de insulina <22 0> <221> PROPEP <222> (33)...(63) <223> Péptido C de insulina <22 0> <221> CADEIA <222> (1)...(30) <223> Cadeia A de insulina <4 0 0> 102

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly ssr His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30

Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45

Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys 50 55 SO

Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin 65 70 75 80

Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 05

<210> 103 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Cadeia A de insulina <4 0 0> 103

Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn 20

<210> 104 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Cadeia B de insulina <4 0 0> 104

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30

<210> 105 <211> 110 <212> PRT <213> Gorilla gorilla <22 0> <223> Pré-pró-insulina <22 0> <221> CADEIA <222> (66)...(86) <223> Cadeia B de insulina <22 0> <221> CADEIA <222> (1)...(30) <223> Cadeia A de insulina <4 0 0> 105

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 IS

Trp Gly Fro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 2b 30

Set His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly SO 55 60

Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin pro Leu 65 70 75 80

Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110

<210> 106 <211> 110 <212> PRT <213> Pongo pygmaeus <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 106

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Trp Gly Pro Asp Pro Ala Gin Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly 50 55 60

Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Set Leu Gin Pro Leu ¢5 70 75 80

Ala leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Val Glu Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn IOC 105 110

<210> 107 <211> 110 <212> PRT <213> Pan troglodytes <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 Ο 0> 107

Met Ale Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Val Leu Leu Ala Leu 1 5 . 10 15

Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ser Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly SO 55 SO

Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu 65 TO 75 80

Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys 35 90 95

Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 10D 105 110

<210> 108 <211> 110 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 108

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 15.

Trp Gly Pro Asp Pro Ala Pro Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Giu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly 50 55 60

Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu 65 70 75 80

Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Val Glu Glr\ Cys Cy3 85 90 95

Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110

<210> 109 <211> 110 <212> PRT <213> Cercopithecus aethiops <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 109

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Trp Gly Pro Asp Pro Val Pro Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly 50 55 60

Glu Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu 65 70 75 80

Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110

<210> 110 <211> 110 <212> PRT <213> Canis familiaris <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 110

Met Ala leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Trp Ala Pro Ala Pro Thr Arg Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 00

Eer His leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Arg Arg Glu Val Glu Asp Leu Gin Val Arg SO 55 60

Asp Val Glu Leu Ala Gly Ala Pro Gly Glu Gly Gly Leu Gin Pro Leu 65 70 7S Θ0

Ala leu Glu Gly Ala Leu Gin Lys Arg Gly He Val Glu Gin Cys Cys 65 90 95

Thr Ser lie Cys Set Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 HO

<210> 111 <211> 110 <212> PRT <213> Spermophilus tridecemlineatus <22 0> <223> Pré-pró-insulina <400> 111

Met Ala Leu Trp Thr Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Leu Gly Pro Aep Pro Ala Gin Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys GLy Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Pha Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Glu Gin Gin Gly Gly 50 55 60

Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Leu Pro Gin Pro Leu 65 70 75 80

Ala Leu Glu Met Ala Leu Gin Lys Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys 65 90 95

Thr Eer lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110

<210> 112 <211> 110 <212> PRT <213> Volemys kikuchii <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 Ο 0> 112

Mat Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Leu 15 10 IS

Trp Glu Pro Asn Pro Ala Gin Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cvs Gly 20 25 30

Ser His Leu Val 31u Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Gly Val Glu Asp Pro Gin Val Ala 50 55 60

Gin Leu Glu Leu Gly Gly Gly Fiu Gly Ala Gly Asp Leu Gin Thr Leu 65 70 75 80

Ala Leu Glu Val Ala Gin Girt Lys Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asr. Tyr Cys Asn 100 105 110

<210> 113 <211> 108 <212> PRT <213> Aotus trivirgatus <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 113

Met Ala Leu Trp Met His Leu leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Trp Gly Pro Glu Pro Ala Pro Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys.Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Ala Pro Lys Thr Arg Arg Gin Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly 50 55 60

Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Ser lie Thr Gly Ser Leu Pro Pro Leu 6S 70 7 5 80

Glu Gly Pro Met Gin Lys Arg Gly Val Val Asp Gin Cys Cys Thr Ser 85 90 95 lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Gin Asn Tyr Cys Asn 100 105

<210> 114 <211> 110 <212> PRT <213> Apodemus semotus <22 0> <223> Pré-pró-insulina 1 <4 0 0> 114

Met Ala Leu Cys Val Arg Phe Leu Ser Leu Leu lie Leu Leu He Leu 15 13 15

Trp Glu Pro A.sn Pro Ala Gin Ala Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gin Val Glu 50 55 60

Gin Leu Glu Leu Gly Gly Ala Pro Gly Thr Gly Asp Leu Glu Thr Leu 65 70 75 80

Ala Leu Glu Val Ala Arg Gin Lys Arg Gly lie val Asp Gin Cys Cys 35 90 95

Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 10C 105 110

<210> 115 <211> 110 <212> PRT <213> Apodemus semotus <22 0> <223> Pré-pró-insulina 2 <4 0 0> 115

Met Ala Leu Trp Met Arg Phe Leu Pro Leu Leu Val Leu Leu Phe Leu 1 5 10 15

Trp Glu pro Asn Pro Ala Gin Ala Phe Val Lys Gin His Leu Cy$ Giy 20 25 30

Ser His Leu val Giu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Met Eer Arg Arg Giu Val Glu Asp Pro Gin Val Ala 50 55 60

Gin Leu Glu Leu GLy Gly Gly Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gin Thr Leu 65 70 75 Θ0

Ala Leu Clu Val Ala Arg Gin Lys Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110

<210> 116 <211> 110 <212> PRT <213> Cricetulus longicaudatus <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 116

Met Thr Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Thr Leu Leu Val Leu 15 10 15

Trp Glu Pro Asn Pro Ala Gin Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Sir His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Gly Val Clu Asp Pro Gin Val Ala 50 55 60

Gin Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Asp Asp Leu Gin Thr Leu 65 70 75 80

Ala Leu Glu Val Ala Gin Gin Lys Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys 85 90 25

Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110

<210> 117 <211> 110 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <22 0> <223> Pré-pró-insulina 1 <4 Ο 0> 117

Met fila Leu Trp Met Arg Phs Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Leu 15 10 15

Trp Glu Pro Lys Pro Ala Gin Ala Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyc Thr Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gin Val Pro 50 55 60

Gin Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Glu Ala Gly Asp Leu Gin Thr Leu 65 70 75 80

Ala Leu Glu Val Ala Arg Gin Lys Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn loo 105 no

<210> 118 <211> 110 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <22 0> <223> Pré-pró-insulina 2 <4 0 0> 118

Hot Ala Lou Trp lie Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala T.-eu Leu lie Leu 15 10 15

Trp Glu Pro Arg Pro Ala Gin Ala Phe val Lys Gin His I.eu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Met Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gin Val Ala 50 55 60

Gin Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gin Thr Leu 65 70 75 80

Ala Leu Glu Val Ala Arg Gin Lys Arg Gly Tie Val Asp Gin Cys Cys B5 90 95.

Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110

<210> 119 <211> 110 <212> PRT <213> Rattus losea <22 0> <223> Pré-pró-insulina 1 <4 0 0> 119

Met Ala Leu Trp Met Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Val 15 10 15

Trp Glu Pro Lys Pro Ala Gin Ala Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Pro Hia Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gin Val Pro 50 55 60

Gin Leu Glu Leu Gly Gly Ser Pro Glu Ala Gly Asp Leu Gin Thr Leu 65 70 75 60

Ala Leu Glu Val Ala Arg Gin Lys Arg Gly He val Asp Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110

<210> 120 <211> 110 <212> PRT <213> Rattus losea <22 0> <223> Pré-pró-insulina 2 <4 0 0> 120

Met Ala Leu Trp lie Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Leu 15 ID 15

Trp Clu Pro Arg Pro Ala Gin Ala Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Val Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Glr. Val Ala 50 55 60

Gin Gin Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Asp Leo Gin Thr Leu 65 10 75 80

Ala Leu Glu Val Ala Arg Gin Lys Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Lau Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110

<210> 121 <211> 110 <212> PRT <213> Niviventer coxingi <22 0> <223> Pré-pró-insulina 1 <4 0 0> 121

Met Ala Leu Trp Met Arg Pha Lau Pro Leu Leu Ala Leu Leu val Leu 1 5 10 15

Trp Glu Pro Asn Pro Ala Gin Ala Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 ?he Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gin Val Ala 50 55 60

Gin Leu Glu Leu Gly Glu Gly Pro Glu Ala Giy Asp Leu Gin Thr Leu 65 70 75 80

Ala Leu Glu Val Ala Arg Gin Lys Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110

<210> 122 <211> 110 <212> PRT <213> Niviventer coxingi <22 0> <223> Pré-pró-insulina 2 <4 0 0> 122

Met Ala Leu Trp lie Arg Phe Leu Pro Leo Leu Ala Leu Leu Val Leu 15 10 15

Trp Glu Pro Hi9 Pro Aid Sin Aid Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Pile Tyr Thr Pro Met Ser Arq Arg Glu Val Glu Asp Pro Gin Val Pro 50 55 60

Gin Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Thr Gly Asp Leu Gin Thr Leu 65 10 05 80

Ala Leu Glu Val Ala Arg Gin lys Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Ser lie Cys See Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 123 <211> 108 <212> PRT <213> Sus scrofa <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 123

Met Ala Leu Trp Thr Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Trp Ala Pro Ala Pro Ala Gin Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Lau Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Arg Arg Glu Ala Glu Asn Pro Gin Ala Gly 50 55 60

Ala Val Glu Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gin Ala Leu Ala Leu 65 70 75 80

Glu Gly Pro Pro Gin Lys Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser 05 90 95 lie Cys Ser Lau Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105

<210> 124 <211> 110 <212> PRT <213> Meriones unguiculatus <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 124

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Phe Leu lie Leu 15 10 15

Trp Glu Pro Thr Pro Ala His Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Giy 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cya Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Phe Arg Arg Gly Val Glu Asp Pro Gin Met Pro 50 55 60

Gin Leu Glu Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gin. Ala Leu 65 70 75 80

Ala Leu Glu Val Ala Arg Gin Lys Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Gly He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 1D 5 110

<210> 125 <211> 110 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 Ο 0> 125

Net Ala Ser Leu Ala Ala Leu Leu Fro Leu Leu Ala Leu Leu Val Leu 15 10 15

Cys Arg Leu Asp Pro Ala Gin Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Glu Leu Gin Val Gly 50 55 60

Gin Ala Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Leu Gin Pro Ser 65 70 75 80

Ala Leu Glu Leu Ala Leu Gin Lys Arg Gly lie Val Glu Gin Cya Cys 85 90 95

Thr Ser lie Cya Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110

<210> 126 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0> <223> Pré-pró-insulina 1 <4 0 0> 126

Met Ala Leu Leu Val His Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15

Trp Glu Pro Lys Pro Thr Gin Ala Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Fro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gin Val Glu 50 55 60

Gin Leu Glu Leu Gly Gly Ser Pro Gly Asp Leu Gin Thr Leu Ala Leu 65 70 75 , 80

Glu Val Ala Arg Gin Lys Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys Thr Ser 85 90 95

lie Cya Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Aan 100 ICS

<210> 127 <211> 110 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0> <223> Pré-pró-insulina 2 <4 0 0> 127

Met Ala Leu Trp Met Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Phe Leu 1 5 10 15

Trp Glu Ser His Pro Thr Gin Ala Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu-Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Met Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gin Val Ala 50 55 60

Gin Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gin Thr Leu 65 70 75 B0

Ala Leu Glu Val Ala Gin Gin Lys Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 10O 105 110 <210> 128 <211> 110 <212> PRT <213> Mus spretus <22 0> <223> Pré-pró-insulina 2 <4 0 0> 128

Met Ala Leu Trp Met Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Phe Leu 15 10 15

Trp Glu Ser His Pro Thr Gin Ala Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Tht Pro Met Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gin Val Ala 50 55 60

Gin Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gin Thr Leu 55 10 75 80

Ala Leu Glu Val Ala Gin Gin Lys Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 10O 105 110 <210> 129 <211> 108 <212> PRT <213> Mus caroli <22 0> <223> Pré-pró-insulina 1 <4 0 0> 129

Met Ala Leu Leu Val Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Trp Glu Pro Lys Pro Thr GLn Ala Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Ser Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gin Val Glu 50 55·- 60

Gin leu Glu Leu Gly Gly Ser Pro Gly flap Leu Gin Thr Leu Ala Leu

65 70 75 SO

Glu Val Ala Arg Glu Lya Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys Thr Ser 85 90 95 lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 130 <211> 110 <212> PRT <213> Mus caroli <22 0> <223> Pré-pró-insulina 2 <4 Ο 0> 130

Met Ala Leu Trp Met Arg Phe Leu Fro Leu Val Ala Leu Leu Fhe Leu 15 1G IS

Trp Glu Ser His Pro Thr Gin Ala Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Met Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gin Val Ala 50 55 60

Cln Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gin Thr Leu 65 TO 75 80

Ala leu Glu Val Ala Gin Gin Lys Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys A3n 100 105 110

<210> 131 <211> 110 <212> PRT <213> Psammomys obesus <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 131

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Phe Leu He Leu 15 10 15

Trp Glu Pro Ser Pro Ala His Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Fro Lys Phe Arg Arg Gly Val Asp Asp Pro Gin Met Pro 50 55 60 GJn Leu Glu Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ala Gly Asp Leu Arg Ala Leu 65 70 75 80

Ala Leu Glu Val Ala Arg Gin Lys Arg Gly lie Val Glu Gin. Cys Cys 95 90 95

Thr Gly lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn. 100 105 110

<210> 132 <211> 110 <212> PRT <213> Felis silvestris catus <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 132

Met Ala Pro Trp Thr Arg Leu Leu Fro Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu 15 1Π 15

Trt> lie Pro Ala Pro Thr Arg Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Giy Glu Arg Gly Fhe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Gly Lys 60 55 60

Asp Ala Glu Leu Gly Glu Ala Pro Gly Ala Gly Gly Leu Gin Pro Ser 65 70 75 80

Ala Leu Glu Ala Fro Leu Gin Lys Arg GLy lie Val Glu Gin Cys Cya B5 90 95

Ala Ser Val Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu His Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 133 <211> 105 <212> PRT <213> Bos taurus <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 133

Met Ala Leu Trp Thr Arg Leu Arg Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Trp Pro Pro Pro Pro Ala Arg Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Cly Glu Arg Gly Phe 35 4 0 4 5

Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Arg Arg Glu Val Glu Gly Pro Gin Val Gly 50 55 60

Ala Leu Glu Leu Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Leu Glu Gly Pro 65 70 75 80

Pro Gin Lys Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser 35 90 95

Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn LOO 105 <210> 134 <211> 105 <212> PRT <213> Ovis aries <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 134

Met Ala Leu Trp Thr Arg Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Trp Ala Pro Ala Pro Ala Hi3 Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Arg Arg Glu Val Glu Gly Pro Gin Val Gly 50 55 60

Ala Leu Glu Leu Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Leu Glu Gly Pro 65 70 75 80

Pro Gin Lys Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Ala Gly Val Cys Ser B5 , 90 95

Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105

<210> 135 <211> 110 <212> PRT <213> Cavia porcellus <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 Ο 0> 135

Met Ala Leu Trp Met His Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 ID 15

Trp Gly Pro Asn Thr Gly Gin Ala Phe Val £er Arg fiis Leu Cys Gly 20 25 30

Set Asn Leu Val Glu Thr Leu Tyr Set Val Cys Gin Asp Asp Gly Phe 35 40 45 ?he Tyr He Pro Lys Asp Arg Arg Glu Leu Glu Asp Pro Gin Val Glu 50 55 60

Gin The Glu Leu Gly Met Gly Leu Gly Ale Gly Gly Leu Gin Pro Leu 65 70 15 80

Ala Leu Glu Met Ala Leu Gin Lys Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys 85 90 95

Thr Gly Thr Cys Thr Arg His Gin Leu Glu Ser Tyr Cys Asn 100 105 110

<210> 136 <211> 86 <212> PRT <213> Equus caballus <22 0> <223> Pró-insulina <22 0> <221> INCERTA <222> 31 <223> Xaa = Resíduo básico assumido por homologia <22 0> <221> INCERTA <222> 32 <223> Xaa = Resíduo básico assumido por homologia <22 0> <221> INCERTA <222> 64 <223> Xaa = Resíduo básico assumido por homologia <22 0> <221> INCERTA <222> 65 <223> Xaa = Resíduo básico assumido por homologia <4 0 0> 136

Phe Val Asn Gin Ais Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro lys Ala Xaa Xaa 20 25 30

Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Glu Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45

Gly Leu Gly Gly Leu Gin Pro Leu Ala Leu Ala Gly Pro Gin Gin Xaa 50 55 60

Xaa Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Gly Ile Cys Ser Leu Tyr Gin 65 70 75 80

Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85

<210> 137 <211> 109 <212> PRT <213> Octodon degus <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 Ο 0> 137

Met Ala Pro Trp Met His Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Trp Gly Pro Asn Ser Val Glri Ala Tyr Ser Ser Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser As A Leu val Glu Ala Leu Tyr Met Thr Cys Gly Arg Ser Gly phe 35 40 45

Tyr Arg Pro His Asp Arg Atg Glu Leu Glu Asp Leu Gin Val Glu Gin 50 55 GO

Ala Glu Leu Gly Leu Glu Ala Gly Gly Leu Gin Pro Ser Ala Leu Glu 65 70 75 80

Met He Leu Gin Lys Arg Gly lie Val Asp Gin Cys Cys Asn Asn lie 85 90 95

Cys Thr Phe Asn Gin Leu Gin Asn Tyr Cys Asn Val Pro 100 105

<210> 138 <211> 86 <212> PRT <213> Chinchilla brevicaudata <22 0> <223> Pró-insulina <22 0> <221> INCERTA <222> 31 <223> Xaa = Resíduo básico assumido por homologia <22 0> <221> INCERTA <222> 32 <223> Xaa = Resíduo básico assumido por homologia <22 0> <221> INCERTA <222> 64 <223> Xaa = Resíduo básico assumido por homologia <22 0> <221> INCERTA <222> 65 <223> Xaa = Resíduo básico assumido por homologia <4 0 0> 138

Phe Val Asn Lys His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Asp Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Met Ala Xaa xaa 20 25 30

Glu Leu Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Ala Asp Pro Gly Val Val Pro 35 40 45

Glu Ala Gly Arg Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Met Th.r Leu Gin Xaa SO 55 60

Xaa Gly He Val Aap Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Thr Leu Tyr Gin 65 70 75 80

Leu Glu Asn Tyr Cys Asn BS

<210> 139 <211> 107 <212> PRT <213> Gallus gallus <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 139

Met Ala Leu Trp lie Arg Ser Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Phe 15 10 15

Ser Gly Pro Gly Thr Ser Tyr Ala Ala Ala Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45

Phe Tyr Ser Pro Lys Ala Arg Arg Asp Val Glu Gin Pro Leu Val Ser 50 55 60

Ser Pro Leu Arg Gly Glu Ala Gly Val Leu Pro Phe Gin Gin Glu Glu 65 10 75 ao

Tyr Glu Lys Val Lys Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys His Asn Thr 85 90 95

Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asri IDO 105

<210> 140 <211> 103 <212> PRT <213> Selasphorus rufus <22 0> <223> Pró-insulina <4 0 0> 140

He Gin Ser Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ser Gly Pro Gly 15 10 15

Thr Ser His Ala Ala Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 20 25 30

Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ser Pro 35 40 45

Lys Ala Arg Arg Asp Ala Glu His Pro Leu Val Asn Gly Pro Leu His Ò0 55 60

Gly Glu Val Gly Asp Leu Pro Phe Gin Gin Glu Glu Phe Glu Lys Val

65 70 75 SO

Lys Arg Gly lie Val Glu Glh Cys Cys His Asn Thr Cys Her Leu Tyr B5 90 95

Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100

<210> 141 <211> 106 <212> PRT <213> Xenopus laevis <22 0> <223> Pré-pró-insulina 1 <4 Ο 0> 141

Met Ala Leu Trp Met Gin Cys Leu Pro Leu Val Leu Val Leu Phe Phe 15 10 15

Ser Thr Pro Asn Thr Glu Ala Lsu Val Ann Gin His Leu Cys Gly 5er 20 25 30

His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Pha 35 40 45

Tyr Tyr Pro Lys Val Lys Arg Asp Met Glu Gin Ala Leu Val Ser Gly 50 55 60

Pro Gin Asp Asn Glu Leu Asp Gly Met Gin Leu Gin Pro Gin Glu Tyr S5 70 75 60

Gin Lys Met Lys Arg Gly He Val Glu Gin Cys Cys His Ser Thr Cys 85 90 95

Ser Leu Phe Gin Leu Glu Ser Tyr Cys Asn 100 105

<210> 142 <211> 106 <212> PRT <213> Xenopus laevis <22 0> <223> Pré-pró-insulina 2 <4 0 0> 142

Met Ala Leu Trp Met Gin Cys Leu Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Phe 1 5 10 15

Set Thr Pro Asn Thr Glu Ala Leu Ala Asn Gin His Leu Cys Gly Ser 20 25 30

His Leu val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe 35 40 45

Tyr Tyr Pro Lys lie Lys Arg Asp lie Glu Gin Ala Gin Val Asn Gly 50 55 50

Prc Gin Asp Asn Glu Leu Asp Gly Met Gin Phe Gin Pro Gin Glu Tyr 65 70 75 Θ0

Gin Lys Met Lys Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys His Ser "hr Cys 85 90 95

Ser Leu Phe Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105

<210> 143 <211> 106 <212> PRT <213> Xenopus tropicalis <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 143

Met Ala Leu Trp Met Cln Cys Leu Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Phe 15 10 15

Ser Thr Pro Asn Thr Glu Ala Leu Ala Asn Gin His Leu Cys Gly Ser 20 25 30

His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe 35 40 45

Tyr Tyr Pro Lys lie Lys Arg Asp lie Glu Gin Ala Mat Val Asn Gly 50 55 60

Pro Gin Asp Asn Glu Leu Asp Gly Met Gin Leu Gin Pro Glr. Glu Tyr 65 70 75 80

Gin Lys Met Lys Arg Gly He Val Glu Gin Cys Cys Hia Ser Thr Cys 85 90 95

Ser Leu Phe Gin Leu Glu Ser Tyr Cys Asn 100 105

<210> 144 <211> 106 <212> PRT <213> Rana pipiens <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 144

Met Ala leu Trp lie Gin Cys Leu His lie Ala Val Leu Leu Ser Leu 15 10 IS

Phe Thr Pro Thr Leu Lys Thr Phe Asp Asn Gin Tyr Leu Cys Gly Ser 20 2b 30

His Leu Val Glu Ala Leu 1’yr Met Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe 35 40 45

Tyr Ser Pro Arg Ser Ary Arg Asp Leu Glu Gin Pro Leu Val Asn Gly £0 55 SO

Leu Gin Gly Ser Glu Leu Asp Glu Met Gin Val Gin Ser Gin Ala Phe 65 30 7b 80

Gin Lys Arg Lys ?ro Gly lie Val Glu Gin Cys Cys His Asn Thr Cys 85 90 95

Ser Leu Tyr Asp Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 10Π 105

<210> 145 <211> 81 <212> PRT <213> Anas platyrhynchos <22 0> <223> Pré-pró-insulina <22 0> <221> INCERTA <222> 31 <223> Xaa = Resíduo básico assumido por homologia <22 0> <221> INCERTA <222> 32 <223> Xaa = Resíduo básico assumido por homologia <22 0> <221> INCERTA <222> 59 <223> Xaa = Resíduo básico assumido por homologia <22 0> <221> INCERTA <222> 60 <223> Xaa = Resíduo básico assumido por homologia <4 0 0> 145

Ala Ala Asn Gin HÁS Leu Cys C-ly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ser Pro Lys Thr Xaa Xaa 20 25 30

Asp Vai Glu Gin Pro Leu Val Asn Gly Pro Leu His Gly Glu Val Gly 35 40 45

Glu Leu Pro Phe Gin His Glu Glu Tyr Gin Xaa Xaa Gly lie Val Glu 50 55 SO

Gin Cys Cys Glu Asn Pro Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys 65 70 75 80

Asn

<210> 146 <211> 51 <212> PRT <213> Capra hircus <22 0> <223> Pré-pró-insulina <4 0 0> 146

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr IE 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Gly lie 20 25 30

Val Glu Gin Cys Cys Ala Gly Val Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn 35 4 0 4 5

Tyr Cys Asn 50

<210> 147 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Insulina aspártico <22 0> <223> Análogo de cadeia B de insulina <4 0 0> 147

Phe Val Asn Gin His Leu cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 IS

Leu Val Cya Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr 20 25 30

<210> 148 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Insulina lispro <22 0> <223> Análogo de cadeia B de insulina <4 0 0> 148

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pm Thr 20 25 30

<210> 149 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Insulina glulisina <22 0> <223> Análogo de cadeia B de insulina <4 0 0> 149

Fhe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg |Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 30

<210> 150 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Insulina glargina <22 0> <223> Análogo de cadeia A de insulina <4 0 0> 150

Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 1 5 10 , 15

Glu Asn Tyr Cys Gly

2D

<210> 151 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Insulina glargina <22 0> <223> Análogo de cadeia B de insulina <4 0 0> 151

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly ?he Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30

<210> 152 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Insulina detemir <22 0> <223> Análogo de pró-insulina <22 0> <221> CADEIA <222> (33)...(53)

<223> Cadeia A <22 0> <221> CADEIA <222> (1) ... (29)

<223> Cadeia B <4 0 0> 152

Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala leu Tyr 15 10 15

Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys 20 25 30

Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 40 45

Glu Asn Tyr Cys Asn 50

<210> 153 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Análogo de cadeia B de insulina <22 0> <221> VARIANTE <222> 28 <223> Xaa = Pro, Lys, Leu, Vai ou Ala <22 0> <221> VARIANTE <222> 29 <223> Xaa = Lys ou Pro <4 0 0> 153

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr 20 25 30

<210> 154 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Análogo de cadeia B de insulina (des 28-30) <4 0 0> 154

Phe Vel Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr 20 25

<210> 155 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Análogo de cadeia B de insulina (des 27) <4 0 0> 155

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 IS

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Pro Lys Thr 20 25

<210> 156 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Análogo de cadeia A de insulina <22 0> <221> VARIANTE <222> 21 <223> Xaa = Ala, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, Thr ou Ser <4 0 0> 156

Gly He Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Xaa 20

<210> 157 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Análogo de cadeia B de insulina <22 0> <221> VARIANTE <222> 1 <223> Xaa = Phe, Asp ou nenhum <22 0> <221> VARIANTE <222> 2 <223> Xaa = Val ou nenhum <22 0> <221> VARIANTE <222> 3 <223> Xaa = Asn ou Asp <22 0> <221> VARIANTE <222> 9 <223> Xaa = Ser ou Asp <22 0> <221> VARIANTE <222> 10 <223> Xaa = His ou Asp <22 0> <221> VARIANTE <222> 28 <223> Xaa = qualquer aminoácido <22 0> <221> VARIANTE <222> 29 <223> Xaa = L-Pro, D-Pro, D-hidroxipro, L-hidroxipro, L- (N-metil-lisina), D-lisina, L-(N-metil-arginina) ou D-arginina <22 0> <221> VARIANTE <222> 30 <223> Xaa = Ala ou Thr <22 0> <221> VARIANTE <222> 31 <223> Xaa = Arg, Arg-Arg, Lys, Lys-Lys, Arg-Lys, Lys-Arg ou nenhum <4 0 0> 157

Xaa Xaa Asn Gin His Leu Cys Gly Xaa Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyt 15 10 15

Leu Val Cys Sly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30

<210> 158 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Análogo de cadeia A de insulina <22 0> <221> VARIANTE <222> 8 <223> Xaa = His, Phe, Gly, Gin, Glu, Ser, Asn, Asp ou Pro <22 0> <221> VARIANTE <222> 9 <223> Xaa = Gly, Asp, Glu, Thr, His, Gin, Asn, Ala ou Pro <22 0> <221> VARIANTE <222> 10 <223> Xaa = Leu, Pro, Val, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Gin ou Asn <22 0> <221> VARIANTE <222> 13 <223> Xaa = Pro, Val, Arg, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Gly, Gin ou Asn <22 0> <221> VARIANTE <222> 21 <223> Xaa = Asp ou Glu <4 0 0> 158

Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ser Xaa Tyr Gin Leu 15 ID 15

Glu Asn Tyr CyS Xaa 20

<210> 159 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Análogo de cadeia B de insulina <22 0> <221> VARIANTE <222> 1 <223> Xaa = Phe, Glu, Asp, Thr ou Ser <22 0> <221> VARIANTE <222> 2 <223> Xaa = Val, Arg, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Pro, Gly, Gin, Ser ou Asn <22 0> <221> VARIANTE <222> 5 <223> Xaa = His, Ala, Glu, Aps, Thr, Ser, Gin, ou Asn <22 0> <221> VARIANTE <222> 9 <223> Xaa = Ser, Leu, Asp, Pro, Glu, lie, Val, His, Thr, Gin, Asn, Met, Tyr, Trp ou Phe <22 0> <221> VARIANTE <222> 10 <223> Xaa = His, Asn, Leu, Asp, Arg, Glu, Ser, Thr, lie ou Gin <22 0> <221> VARIANTE <222> 12 <223> Xaa = Val, Asn, His, lie ou Tyr <22 0> <221> VARIANTE <222> 14 <223> Xaa = Ala, Glu, Asp, Asn, Gin, Ser, Thr, Gly <22 0> <221> VARIANTE <222> 16 <223> Xaa = Tyr, Asp, Glu, Gin, Asn, Ser, Thr, His ou Arg <22 0> <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = Leu, Ser, Thr, Asn, Gin, Glu, Asp ou His <22 0> <221> VARIANTE <222> 18 <223> Xaa = Val, Ser, Thr, Asn, Gin ou His <22 0> <221> VARIANTE <222> 20 <223> Xaa = Gly, Gin, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, His ou Arg <22 0> <221> VARIANTE <222> 26 <223> Xaa = Tyr, Ala, Asp, His ou Glu <22 0> <221> VARIANTE <222> 27 <223> Xaa = Thr, Asp, His ou Glu <22 0> <221> VARIANTE <222> 28 <223> Xaa = Pro, Asp ou Glu <4 0 0> 159

Xaa Xaa Αεπ Gin Xaa Leu Cys Gly Xaa Xaa Leu Xaa Glu Xaa Leu Xaa 15 10 IS

Xaa Xaa Cys Xaa Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Xaa Xaa i.ys 7 hr 20 25 30

<210> 160 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Análogo de cadeia A de insulina <22 0> <221> VARIANTE <222> 21 <223> Xaa = Asn, Gly, Ala, Vai, Leu, lie, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp ou Glu <4 0 0> 160

Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Scr lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Xaa 20

<210> 161 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Análogo de cadeia B de insulina <22 0> <221> VARIANTE <222> 1 <223> Xaa = Phe ou nenhum <22 0> <221> VARIANTE <222> 29 <223> Xaa = Lys, Ala, Thr ou Ser <22 0> <221> VARIANTE <222> 30 <223> Xaa = Thr, Arg, Lys, Hyl, Orn ou Cit <4 0 0> 161

Xaa Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Pha Tyr Thr Pro Xaa Xaa 20 25 30

<210> 162 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Análogo de cadeia A de insulina <22 0> <221> VARIANTE <222> 21 <223> Xaa = Asn, Gly, Ala, Val, Leu, lie, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp, Glu, His ou Gin <4 Ο 0> 162

Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr 5er lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu IE 10 15

Glu Asn Tyr Cys Xaa 20

<210> 163 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Análogo de cadeia B de insulina <22 0> <221> VARIANTE <222> 1 <223> Xaa = Phe ou nenhum <22 0> <221> VARIANTE <222> 3 <223> Xaa = Asn, Gly, Ala, Val, Leu, lie, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp, Glu, His ou Gin <22 0> <221> VARIANTE <222> 30 <223> Xaa = Asn, Gly, Ala, Val, Leu, lie, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp, Glu, His ou Gin <4 0 0> 163

Xaa Val Xaa Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Xaa 20 25 30

<210> 164 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Análogo de cadeia A de insulina <22 0> <221> VARIANTE <222> 8 <223> Xaa = Ala ou Thr <22 0> <221> VARIANTE <222> 10 <223> Xaa = Val ou lie <22 0> <221> VARIANTE <222> 21 <223> Xaa = Asn, Asp, Gly, Ser, Thr ou Ala <4 0 0> 164

Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Xaa Ser Xaa Cys Ser Leu Tyr Gin Lau 1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Xaa 20

<210> 165 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Análogo de cadeia B de insulina <22 0> <221> VARIANTE <222> 1 <223> Xaa = Phe ou nenhum <22 0> <221> VARIANTE <222> 1 <223> Xaa = Thr ou nenhum <4 0 0> 165

Xaa Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Xaa 2D 25 30

<210> 166 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 166

Arg Pro Pro Pro Pro Cys 1 5

<210> 167 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 167

Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys 1 5

<210> 168 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 168

Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

<210> 169 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <22 0> <221> REPEAT <222> (1) ... (5) <223> Péptido ligador repetido <4 0 0> 169

Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

<210> 170 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 170

Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser 1 5 10

<210> 171 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 171

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 15 10

<210> 172 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 172

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 10 15

Lys Gly

<210> 173 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 173

Giy Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Scr Glu Gly Lys Gly 15 10

<210> 174 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 174

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 E 10 15

Lys Gly

<210> 175 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 175

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Eer Glu Ser Lys Glu Phe 15 10

<210> 176 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 176

Ser Arq Ser Ser Gly 1 S

<210> 177 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 177 Ser Gly Ser Ser Cys 1 5

<210> 178 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 178

Ala Ala Lys 1

<210> 179 <211> 2 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 179

Val Ket 1

<210> 180 <211> 2 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <4 0 0> 180

Ala Ket 1

<210> 181 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de péptido ligador <22 0> <221> REPETIÇÃO <222> (3) ... (5) <223> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 repetições <22 0> <221> VARIANTE <222> 4 <223> Xaa = Gly, Gly-Gly ou Gly-Gly-Gly <4 0 0> 181

Ala Ket Gly Xaa Her Ala Met 1 S

<210> 182 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Cadeia B de HMR-1 153 <4 0 0> 182

Phe Val Lya Gin His Leu Cya Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr lie Lys Thr 20 25 30

<210> 183 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Cadeia A de HMR-1 1423 <4 0 0> 183

Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 ID 15

Glu Asn Tyr Cys Gly 20

<210> 184 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Cadeia B de HMR-1 1423 <4 0 0> 184

Phe Val Asn Gin His Lou Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His 20 25 30

<210> 185 <211> 510 <212> PRT <213> Pan troglodytes <22 0> <223> PH20 de chimpanzé <4 0 0> 185

Met Gly Vai Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys IS 10 IS

Ser Ser Gly Val Set Gin lie val Phe Thr phe Leu leu lie Pro Cys 20 2b 30

Cys Leu Thr Leu Agn Phe Arg Ale Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys leu Gly Lys Phe 50 55 ¢0

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 ' 7 S 80 lie Asn Val Thr Gly Gin Asp Val Thr He Phe Tyr val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175 val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lye Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cy3 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Her Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Sec Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Gin Glu Ala lie Arg Val 275 200 285

Ser Lys He Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Thr 290 295 300

Arg Tie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lya Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lya £cr Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Gin Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Léu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Set Gin He 465 470 475 480

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Asp 485 490 495

Leu Cys Asp Leu Tyr Leu Val Pro Thr Ser Tyr Leu lie leu 500 505 510

<210> 186 <211> 512 <212> PRT <213> Macaca mulatta <22 0> <223> PH20 de macaco rhesus <4 0 0> 186

Met Gly Val Leu Lys Phe Lye His lie Phe Phe Arg Sec Phe Val Lys IS 10 15

Sec Ser Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arq Ala Pro Pro lie lie Pro Asn Val Fro 35 40 05

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Sec Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asa Glu Pro Leu Asp Met Sec Leu Phe Thr Leu Met Gly Ser Pro Arg 65 70 75 00 lie Asn lie Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leo 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Leu Thr Thr Gly Val Thr Val HIS Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys Val Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ser Lys 115 120 125

Gin Asp lie Leu Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140

He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150. 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175 val Gin Leu Ser Leu Pro Gin Ala Thr Asp Lys Ala Lys Gin Glu Phe 100 105 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Met Leu Glu Thr lie Lys Leu Gly Arg 195 200 205

Ser Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 21S 220

Tyr Asn Hig His Tyr Arg Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asp 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu 5cr Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Eer lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Val Val 260 265 270

Val Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg val 275 200 205

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Asn Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Ala 290 295 3C0

Arg Leu Val Ph« Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Arg Glu Glu 305 310 315 320

Leu Val Ser Thr Leu Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Ser Leu Eer He Thr Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leo leu Asp Thr Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys 5er Gin Val Leu Cys Gin Giu Gin 370 375 300

Gly Val Cys He Arg Lys Asp Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Asp He Arg Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val His Gly Lys Pro Thr Val Glu Asp Leu Glu Glu Phe 3ar Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Thr Asn Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Ser Leu Lys Pro Pro Val Glu Thr Glu Gly Ser Pro Pro 465 470 47S 430 lie Phe Tyr Asn Thr Ser Ser Ser Thr Val Ser Thr Thr Met Phe lie 485 490 495 1

Trp Arg Leu Glu Val Trp Asp Gin Gly lie Ser Arg lie Gly Phe Phe 500 505 510

<210> 187 <211> 505 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor de HuPH20 1-505 <4 0 0> 187

Met Gly Val Leu Lys Pile Lys His lie Fhe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Pile Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu. Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie. Gly Ser Pro Arg 65 70 75 B0 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu B5 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly He Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 Π0 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 1B0 105 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Αβρ Cys- 210 218 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 * 240

Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser

245 250 25S

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 290 2B5

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg Ile Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glj Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Αξπ Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr Ile lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Glri Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser 5er Asp Tyr Leu His Leu 335 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lye Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val 4 65 490 495

Ser lie Leu Phe Leu Ile lie Ser Ser 500 505

<210> 188 <211> 503 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 precursor 1-503 <4 0 0> 188

Met Sly val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Set Phe Val Lys 1 5 10 15

Ser Sec Gly Val Ser Gin He Val Phe The Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Aan Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Clu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80

He Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Cly lie Pro Sin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Tip Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 146 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Glr. Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Glr. Glu Phe 180 185 150

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn. Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 280 2B5

Sar Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe rhr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lya Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Glr. Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 3B5 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 416

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

He Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 430

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val 485 490 495

Ser lie Leu Phe Leu lie lie 50C

<210> 189 <211> 501 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-501 <4 0 0> 189

Met Gly val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Eer Phe Val Lys 15 10 15

Set Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu He Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Lev Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe SO 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 60 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90' 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser Tie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 . 110

Gly He Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175 val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe ISO 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn Kis Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 720

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu He Lys Arq Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 255 27 D

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Her Lys lie Fro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Gin 305 310 315 32 0

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 34 C 34 5 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lya Asn Trp Asn Ser See Asp Tyr Leu His Leu 3BS 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 430

Phe Tyr Asn Ala 3er Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val 405 490 495

Ser He Leu Phe Leu 500

<210> 190 <211> 499 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-499 <4 0 0> 190

Met Gly Val Leu Lys Phe Lye His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Set Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Levi lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Αεη Phe Arg Ala Pro Pro val lie Pro Asn val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asπ Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 30

He Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 05 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Fro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 1S5 170 176

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Prc Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu Tie Lys Arg Asn Asp Asp Léu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 290 285

Ser Lys lie Pro Asp Ale Lys Ser Pro Leu Pro Vel Fhe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg He Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 3C5 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 3Θ0

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 335 390 395 400

Asn Pro Asp Asn phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys ALa Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Clu Thr Glu Glu Pro Gin ILc 465 470 475 480

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser.Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val 405 490 495

Ser lie Leu

<210> 191 <211> 497 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-497 <4 0 0> 191

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Ehe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 10 15

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 50

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr val Aap Arg Leu 85 50 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 " 105 110

Gly lie Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Gin Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 1B0 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 210

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Fro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Fhe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Pha Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Set Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Fro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin Tie 465 470 475 430

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val 485 490 495

Ser

<210> 192 <211> 495 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-495 <4 0 0> 192

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys IS 10 15

Ser Ser Sly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 2b 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Fro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe SO 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg

65 70 75 SO lie Asr. Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser Tie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lya lie Ser Leu Gin Asp liis Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 150

Lys Aap Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Ash 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 186 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asr> His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr A3n Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 200 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 316 320

Leu Val Tyr Thr Pha Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Scr Gly lie 32 5 33C 335

Val He Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 34 C 345 “ 350

Leu leu Asp Asr. Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Glr. Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Aap Asn ?he Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 435 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lya Aap Thr Asp Ala Val Aap Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He 465 470 475 460

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie 4B5 490. 495

<210> 193 <211> 493 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-493 <4 0 0> 193

Met Gly val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Fh® Leu Leu He Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro IS 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys J-eu C-ly lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 7 5 80 lie Ash Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 35 30 35

Gly Tyr Tyr Pro Tyr Tie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 10O 105 110

Gly lie Pro Gin Lys Tie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Mat Ala Val 130 135 140

He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 1.60 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 105 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn Kis Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Tie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 200 265

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg He Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Aap Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie He Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 330

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 305 330 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Mat Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 480

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thx Leu Ser Ala Thr Met 485 490

<210> 194 <211> 491 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-491 <4 0 0> 194

Met Sly Val leu Lys Phe Lys His lie Fhe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Set Ser Giy Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phs Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leo Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leo Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asr. Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp tys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 2C0 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 2SQ 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Sex Gly lie 325 33D 335

Val He Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Set Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Ly3 Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Le i Glu G.ln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He 465 470 475 430

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala 435 490

<210> 195 <211> 489 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-489 <4 0 0> 195

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Fhe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser 5er Gly Val Ser Gin lie Val Fhe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arq Ala Pro Pro Val Tie Pro Asn. Val Pro 35 4 0 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 5S 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 55 70 - 75 80

He Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Agp $er He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly

100 105 HO

Gly lie Pro Gin Lys He Sar Lau Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 I.ys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val ASO Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 ‘ 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 ΠΟ 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Gin Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lya Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn his Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 233 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn G.lu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Fro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arq Glu Ala lie Arg Val 275 200 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Sec Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335'

Val Tie Trp Giy Thr Leu Ser He Met Arg Ber Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie He Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 39D 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cya Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

He Asp Ala Phe Leu Lys Fro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pee Gin lie 465 470 475 480

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu 485

<210> 196 <211> 490 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-490 <4 0 0> 196

Met Gly Val Leu Lye Phe Lya His He Pile ?he Arg Ser Phe Val Lya 15 10 IS

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu leu lie Fro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Aan Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 25 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg

65 70 75 GO

He Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 55 90 " 95

Gly Tyr Tyr Fro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly ' 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser 7,eu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lye Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Aar Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro

145 150 155 ISO

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 1Θ5 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Léu Leu Arg Pro Asn 3 is Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Set Gly lie 325 330 335 val lie Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Aan Pro Tyr He lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala Tie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cya Lya Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lya Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He 465 470 475 480

Phe Tyr Aan Ala Ser Pro Ser Thr Lau Ser 485 490

<210> 197 <211> 487 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-487 <4 0 0> 197

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 S 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 2b 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala' Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe SO SS 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Vsl Thr Tie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 HO

Gly He Pro Gin Lys lie Set Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140

He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lya Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe ISO 135 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 21S 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 280 285

Ser Lys Tie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He 325 330 335 val He Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Cln Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Lsu 3B5 39D 395 400

Asn Era Asp Asn Phe Ala lie Cln Leu Glu Lys Gly Gly Lya Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Lea Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lye 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Fro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 480

The lyr Asn Ala Ser Pro Ser 485

<210> 198 <211> 485 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-485 <4 0 0> 198

Met Gly Val Leu lys Phe Lys His lie Fhe Phe Arg Set Fhe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Fhe Thr Fhe Leu Leu lie Fro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp A_a Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Lau Gly Lys Phe 50 55 ' 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg

65 7 0 75 BO

He Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 10C IDS 110

Gly lie Pro Glr. Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp He Thr Fhe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 lib 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Fhe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 Ξ55

Thr Ala Leu Tyr Fro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn. Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg He Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser G.l n Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val He Trp Gly Thr Leu Eer lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 315 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 100

Asn Pro Aep Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 105 110 115

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lva 120 125 130

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 140 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp GJ y Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 165 170 475 400

Fhe Tyr Asn Ala Ser 485

<210> 199 <211> 484 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-484 <4 0 0> 199

Met Gly Val Leu Lys Phe Lye His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr phe leu Leu lie pro cys 20 25 30

Cys Leu l’hr Leu Αεη Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe SO SS 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu S5 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 HO

Gly lie Pro Gin Lya lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lya Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 HO 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His Hi3 Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Ly3 Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Tie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 2B5

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Pile Ala Tyr Thr 293 295 300

Arg He Val Phe Thr Asp Gin val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 3C5 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 3BO

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 3B5 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

He Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 065 470 475 430

Phe Tyr Asn Ala

<210> 200 <211> 476 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-476 <4Ο0> 200

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys Hie lie Phe Phe Arg Ser Pile Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe The Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Lêu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe

50 55 GO

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Scr Phe lie Gly Ser Pro Arg 55 70 75 80

Tie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly He Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp A3n Leu Gly Met Ala Val 130 135 140

He Asp Trp Glu Giu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro

145 150 155 ISO

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 17 Q 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Prc Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 2Ξ0

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Fhe Asn 225 230 233 240

Val Glu He Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 230 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala T.ys Ser Pro Leu Pro VaL Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly, Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 35S 350 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala Tie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 42C 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val CyS lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu 465 470 475

<210> 201 <211> 475 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-475 <4Ο0> 201

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Set Phe Val Lys 1 -5 10 15

Set Set Gly Val Set Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Ley Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Fro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe

50 55 6C

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 55 70 '75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyt Val Asp Arg Leu 8 5 30 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly -lie Pro Gin Lys 11s Ser Leu Gin Asp His Leu A3p Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Fro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140

He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Acg Asn Trp Lys Pro 145 ISO 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 Π0 Π5

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cya Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys Ha Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asts Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr tie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Set Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Ash Pro ASp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Aap Ala Val Asp Val Cys 11a Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr 465 470 475 -

<210> 202 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-474 <4Ο0> 202

Met Gly Val Leu Lys phe Lys His lie ?he Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 IS

Ser Ser Gly Val Ser Sin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 B0 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr Ila Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Sor Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe ISO 185 ISO

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 2 30 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Sec Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 2Í5

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val Tie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 39S 400

Asn Fro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu 465 470

<210> 203 <211> 473 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-473 <4Ο0> 203

Met Gly Val Leu Lys Fhe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser £er Sly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu ihr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 JO 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe ils Gly Ser Pro Arg

65 70 75 SO

Tie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyc Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly He Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 , 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 2B5

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thu Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val He.Tip Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 550

Leu leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He He Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Aan Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys A3p Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met 465 470

<210> 204 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-472 <4Ο0> 204

Met Gly Val Leu Lys Fhe Lys KlS lie Fhe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30 .

Cys Leu Thr Leu Ash Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Fra Leu Asp Mat Ser Leu Fhe Sex .Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 ISO 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin A.sn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Fhe 180 185 19C

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Ann Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 210

Val Glu He Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 215 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 2B0 2B5

Ser Lys He Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg He Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Glr. Asp Glu 305 310 315 320

Leu val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 32S 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr He lie Asn 355 350 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

He Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro 46S 470

<210> 205 <211> 471 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-471 <4Ο0> 205

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cya Leu Tin Leu Asu Phe Arg Ale Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro 3b 40 45

Ptie Leu Trp Ala Trp Ash Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu GLy Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 30 75 Θ0 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Fro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu val Gin Gin Gin Aan 165 170 175

Val Gin Leu Ser I.eu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 1B5 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Ly3 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn. His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn ills His Tyr Lys Lys Fro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu He Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Fro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 2S0 2BS

Ser Lys He Fro Asp Ala Lys Ser Fro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Fhe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr He lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Tie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

He Asp Ala Phe Leu Lys Pro 465 470

<210> 206 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-470 <4Ο0> 206

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asa Val Pro 35 40 15

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glia Pro Leu Asp Met ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 30 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly He Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Ly3 Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140

He Asp Trp Glu Glu Tru Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 1S5 170 135

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Cly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 2S5

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Scr Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Ly3 Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu KiS Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys The Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Set Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

lie Asp Ala Phe Leu Lys 465 47 D

<210> 207 <211> 469 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-469 <4Ο0> 207

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15

Ser Ser Gly Val ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 10O 105 110

Gly lie Pro Glr Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val

130 135 14 C lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Ash Trp Lys Pro 145 ISO 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 17D 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ale Lys Gin Glu Phe 160 1S5 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin 5er Pro val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Tie Arg Val 275 280 265

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 34 C 345 350

Lau Leu Asp Asr. Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 360

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu Kis Leu 335 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Set Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lya Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

He Asp Ala Phe Leu 465

<210> 208 <211> 468 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-468 <4Ο0> 208

Met Gly val Lee Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lya 1 5 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu He Pro Cys 20 25 30

Cys leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 10 75 B0 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 130 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn ills Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 2 B0 235

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Vai Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe 4 65

<210> 209 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-466 <4Ο0> 209

Met Gly Val leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg ser Phe Val Lys 1 5 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Phe leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arq Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 B0 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr Tie Phe Tyr Val Asp Arg Leu S5 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr Tie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp Hj_s Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140

He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 173 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lya Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Ly3 Ala Gly Lys Asp ?he Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 2C5

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val .Glu lie Lys Arg Ash Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys He Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lya Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu G.ln 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 4 50 455 4 6C lie Asp 465

<210> 210 <211> 465 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-465 <4Ο0> 210

Met Gly Val Leu Lys ?he Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Scr 5er Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 A 0 A 5

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 SO

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Ph.e He Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ale Thr. Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lye Ala Lys 115 120 125

Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 HO

He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lya Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser CyS Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu He Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg He Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cya Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 38C

Gly Val Cys lie Arq Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 335 390 395 400

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

He 4 65

<210> 211 <211> 464 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-464 <4Ο0> 211

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 ID 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arq Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Tie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80

Ila Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr val Aap Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly He Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu val Gin Gin Gin Asn 165 Π0 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 135 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Clu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser Tie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 35C

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie He Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Fro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 42D 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

<210> 212 <211> 462 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-462 <4Ο0> 212

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 13 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Aar. Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arq 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arq Leu 95 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr Tie Aap Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140

He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro

145 150 155 16C

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 1 SO 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arq Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Aan Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin ser Pro Vai 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 2 BO 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg He Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Vai lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Ary Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 350 365

Val Thr leu Ala Ala Lys Met Cys Eer Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Scr Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly 450 455 460

<210> 213 <211> 460 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-460 <4Ο0> 213

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie File Phe Arg Ser phe Val Lys IS 10 15

Ser Sir Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Lev Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Fro 3S 40 45

Phe Leu Tip Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80

He Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 65 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 10S 110

Gly He Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn lien Gly Met Ala val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Ly3 Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala l.vs Gin Glu Phe 180 185 " 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu He Lys Arg Asn Aso Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 " 250 ' 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr .Gin Gin Ser Pro Val 2SC 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 235

Ser Lys He Pro Αξρ Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arq lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys ?ha Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser 11« Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 343 345 350

Lau Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 390

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His l>eu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Giy Lys Pro Thr Leu GLu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr CyS Ser CyS Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys A3p Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala 450 455 460

<210> 214 <211> 458 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-458 <4Ο0> 214

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Phe Pile Arg Set Phe Val Lys IS 10 15

Ser Set Gly Val Set Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro val lie Pro Asm Val Pro 35 40 45

Phe leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Set Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arq Leu 35 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyt lie Asp Sat He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly ICO 105 110

Gly lie Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 . 13S 140

He Asp Trp Glu Glu Trp Arq Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe iaa 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Aen 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arq Asn Arg Val Arg GlU Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys The Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He He Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 i 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr '405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala val Asp Val Cys 450 455

<210> 215 <211> 456 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-456 <4Ο0> 215

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Set Set Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Phe Lou Lou lie Fro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Aan Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 ' 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser GLu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 10 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys US 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 155 170 Π5

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe ISO 105 190

Glu Lya Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Era Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser pro Val 260 265 2Ί0

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 280 2B5

Ser Lys lie Pro Asn Ala Lys Ser Pro Lau Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 ‘ 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 31Õ 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr He lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lya Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 4 05 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys GLii Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp 450 455

<210> 216 <211> 454 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-454 <4Ο0> 216

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe val Lys IS 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Pile Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 4 0 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 50

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn. Ala Thr Gly Gin Gly Val Tlir lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr Tie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly He Pro Gin Lys Tie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu phe 130 185 190

Gin Lya Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Açn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lya lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 29S 300

Arg lie val Phe Thr Asp Gin val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser tie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lya Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro A.sp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 40S 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala 450

<210> 217 <211> 452 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-452 <4Ο0> 217

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Phe Fhe Arg Ser Fhe Val Lys 1 5 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro 35 40 45

Fhe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro See Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 ao

Tie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr val Asp Arg Leu 55 90 95

Gly Tyr Tyr ?ro Tyr He Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 130 105 110

Gly He Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140

He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 ISO 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 17C 1Ή

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu LyS Ala Gly Lys Asp Phe leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His' Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys He Fro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Fro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Fhe Thr Asp Gin Val Leu Ly3 Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr Ile lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Glr Val Leu Cys Gin Gin Gin 370 375 380

Gly Val Cys 11a Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 335 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Fhe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr 450

<210> 218 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-450 <4Ο0> 218

Het Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Fhe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Pile Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 3S 10 45

Phe Leu Tro Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 5C ’ S5 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 10 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr rle Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly ICO 105 11C

Gly He Pro Gin lya lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arq Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

LyS Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 105 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Lou Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val [Liu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr G.ln Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arc Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 ' 2B0 2B5

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg He Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val He Trp Gly Thr Leu Ser lie Mat Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 300

Gly Val Cys lie Arq Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyx Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu 5er Cys Lys Glu Lys A.1a Asp 435 440 445

Val Lys 450

<210> 219 <211> 508 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-508 <4Ο0> 219

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys ilis lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu He Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg

65 70 75 SO lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly He Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin A3p Hi3 Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Ash 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 100 1S5 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 730 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 , 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Aia Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val

275 2S0 2BS

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val Ils Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Cln 370 375 300 GLy Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser GLu Lys 420 425 430

Fhe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Lou 5er Ala Thr Met Phe lie val 485 430 495

Ser lie Leu Phe Leu lie lie Ser Ser Val Ala Ser S00 505

<210> 220 <211> 506 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-506 <400> 220

Met Gly Val Leu Lys phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Set Ser Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 93

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser He Thr Gly Val "hr Val Asn Gly 100 10 5 HO

Gly lie Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Ti-p Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 1 BO 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245' 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Fhe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cya Leu 34 0 34 5 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn ?ro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 3Θ0

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Fro Asp Ash Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 480

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe .He Val 485 490 495

Ser He Leu Phe Leu He lie Ser Ser Val 500 505

<210> 221 <211> 504 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-504 <400> 221

Met Gly Val Leu Lys Pile Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Pile Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 GO

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 HO 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 ISO

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Tcp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu He Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 235

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg He Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Set Gly He 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys aer Gin V«1 Lr.u Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arq Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asr. Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe He Val 495 490 495

Ser He Leu Phe Leu lie He Ser 500

<210> 222 <211> 502 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-502 <400> 222

Met Gly Vai Leu Lya Phe Lya Hia He Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys

IS 10 IS

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Ain Phe Arg Ale Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe LCU Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 GO

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 8Π lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 109 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Tie Thr Phe Tyr Met Pro val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 1B0 185 190.

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Ash 225 230 235 ' 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 2 B0 28 5

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg He Val Phe Thr A.sp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 360

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu Hia Leu

305 390 3S5 40D

Aan Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Cly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

He Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 430

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe He Val 485 490 495

Ser lie Leu Phe Leu lie 500 <210> 223 <211> 500

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-500 <400> 223

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 It) 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu 1 l.e Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Set GlU Phe Cys Leu Gly Lys Phe

SO 55 SO

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg SE 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Acq Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Va_ Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140

He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Tie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 IBS 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 310 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Gin 305 31C 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val He Trp Gly Thr Leu 5er lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr Tie lie Asn 355 360 3S5

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 436 440 44=

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cya lie Ala Asp Gly Val Cys 4=0 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He 465 470 475 460

Phe Tyr Asn Ala Sar Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val 4Θ5 490 4 95

Ser He Leu Phe 500 <210> 224 <211> 498

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-498 <400> 224

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Fhe Phe Arg Ser phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu Tie Pro Cys 20 25 30

Cys leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 ’ 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser leu Phe Ser Phe lie Gly 5er Pro Arg 65 70 75 B0

He Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 95 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr Tie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 ' 105 110

Gly lie Pro Gin Lys Tie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lye Ala Lys Gin Glu Phe 130 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Lou Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg A3n Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val He Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 3B0

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu Sis Leu 335 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

He Asp Ala Phe Leu Lys Pro Fro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He 465 470 475 430

Phe Tyr Asn Ala See Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val 405 490 495

Ser He <210> 225 <211> 496

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-496 <400> 225

Met Gly Val Leu Lys Ehe Lys His lie Phe Phe Arg Set Phe Val Lys 15 10 15

Ser 5er Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro 5er Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe

SO 55 SO

Asp Glu Pro Leu Asp Met; Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys '115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 185 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 210

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Tie Arg Val 275 2B 0 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Pha Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asti Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 3=5 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ran Ser Asp Tyr Leu His Leu 3B5 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu I.ys pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 480

Phe Tyr Asn Ala Eer Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe He Val 485 490 495 <210> 226 <211> 494

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-494 <400> 226

Met. Gly Val Leu Lys Phe Lys Hie lie Phe Phe Arg Sec Phe Val Lys 1 5-10 15

Ser Set Gly Val Ser Gin lie Val Phe The Phe Leu Leu He Pro Cys 20 25 30

Cys Leu The Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Tip Ala Tip Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Sec Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 10 75 80 lie Ash Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu B5 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140

He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro

145 150 155 ISO

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asri 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 1B5 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lya Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 200 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 3S0

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Tie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val I.eu CyS Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Eer Ser Asp Tyr Leu His Leu 335 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 41C 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Scr Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe 485 490 <210> 227 <211> 492

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-492 <400> 227

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Scr Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro val lie Fro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Sec Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Mat Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80

He Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 - 90 95

Gly Tyr Tyr Prc Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 IDS Π0

Gly lie Pro Gin Lys Ile Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg fro The Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 105 190

Glu I.ys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Fro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arq Glu Ala lie Arg Val 275 280 235

Ser Lys lie Fro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr

290 295 30U

Arg He Val Fhe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val He Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr He lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arq Lys Asn Trp Asn Ser Sér Asp Tyr Leu His Lau 3S5 390 3S5 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lya Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

He Asp Ala Phe Leu Lya Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He 465 470 475 4Θ0

Phe Tyr Asn. Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr 435 430 <210> 228 <211> 488

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-488 <400> 228

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Phe Phe Arg Ser Pile Val Lys 15 ID 15

Ser Ser Gly val ser Gin lie val Phe The Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trt> Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 ' 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg

65 70 75 SO lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 65 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly He Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175 val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 val Glu He Lys Arg Asn Asp Asp leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Sar 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 2B5

Ser Lys He Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly. He 325 330 335 val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg 5er Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Aan Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 45C 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He 465 470 475 430

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr 485 <210> 229 <211> 486

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor de HuPH20 1-486 <400> 229

Met (Sly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 13 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 Θ0 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 100 105 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 280 2B5

Ser Lys He Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser Tie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Lau Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 300

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 305 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 <55 450 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He 465 410 475 480

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro 405 <210> 230 <211> 472

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-507 <400> 230

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 ' 5 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Her Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser 11s Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 B0

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp Bis Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val He Asp Trp ICO 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro ’Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 1B0 IBS 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu A3n Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Vai 250 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 260 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser Ils Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie He Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 300

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 4 OS 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe He Val Ser lie Leu 450 455 460

Phe Leu lie lie Ser Ser Val Ala 465 470 <210> 231 <211> 470

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-505 <400> 231

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp

IS 10 IS

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 43

Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 7 0 75 60

Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leo Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 10O 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp val 115 120 " 125

Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Ly3 Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val Ser Lys Tie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 260 265

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Giy lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Set Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys

340 345 35C lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 ' 375 360

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 3B5 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 433

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He Phe Tyr A3n 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe He Val Ser lie Leu 450 455 460

Phe Leu lie lie Ser Ser 4E5 470 <210> 232 <211> 468

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-503 <400> 232

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro VaL lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala 7rp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin ly3 lie Ser Leu Gin Asp His leu Asp T.ys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Ihr Fhe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 HO

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Frc Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 235

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 29S 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu The lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 330

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys I.ys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 110 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp A.la 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Fhe lie Val Ser lie Leu 450 455 460 phe Leu He He 4 65 <210> 233 <211> 466

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-501 <400> 233

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Prc Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Gil) Phe Cys Leu Gly Lys phe Asp Glu Pro 20 25 20

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr 11a Asp Set lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro

65 7G 75 SO

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp j.le 85 93 95

Thr Phe Tyr Met pro Val Asp Aan Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 HO

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 ISO

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205

Lys Arg Aan Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Ly3 Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe I.eu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val He Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Lsu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly val Cys He Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Fro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val Ser He Leu 450 455 460

Phe Leu 465 <210> 234 <211> 464

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-499 <400> 234

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Fhe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Mat Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro

65 70 75 BO

Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie B5 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Ly3 Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 Π5

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Fro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 290 2Θ5

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val He Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Giu Thr lie Lou Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys

34 C 345 35Q lie Arg Lys Asti Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala Tie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 335 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Ly3 Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie VaL Ser lie Leu 450 455 460 <210> 235 <211> 462

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> esHuPH20 36-497 <400> 235

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro ser Glu Phe cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 10

Leu Asp Met Eer Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg He Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 TO 75 80

Gin Ly3 lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He B5 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 HO

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205

Lys Arg Ann Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 " 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Aan Pro Tyr lie He Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 330 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Aan Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 335 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Fhe lie Val Ser 450 455 460 <210> 236 <211> 460

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> esHuPH20 36-495 <400> 236

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Pie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15

Ala Txp Asn Ala Pro Sar Glu Phe Cys Leu Sly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe 3er Phe lie Gly Set Pro Arg lie Asn Ala 35 tO 45

Thr Gly Gin Gly Vál Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Tie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 10C IDS 110

Glu Glu Trp Arq Pro Thr Trp Ala Arg Asn'Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser Ila Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 , 160

Gly Lys Asp Phe T.eu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arq 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 2Q0 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thz 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Set Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 220

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 2S0 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu Hi3 Leu Asn pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 330

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 3B5 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu. Ser Cys Ly3 Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe He 450 455 460

<210> 237 <211> 458 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> esHuPH20 36-493 <400> 237

Leu Asti Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly I.ys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arq Leu Gly Tyr Tyr

50 55 GO

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 7 0 75 80

Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 05 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Eer lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Slu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn fils 180 1B5 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Set Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val He Trp

290 295 3DD

Gly Thr leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu A3p 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Scr Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cya lie Asp Ala 4 2 C 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He Phe Tyr Asn 435 440 44b

Ala ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met 450 455

<210> 238 <211> 456 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> esHuPH20 36-491 <4Ο0> 238

Leu Asn Phe Arq Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro tyr Tie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro

65 70 75 RQ

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp

100 105 HO

Glu Glu Trp Arq Pro Thr Trp Ala Arg Asr. Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lya Leu Leu Arq 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 100 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 2CC 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asr Arg val Arg Glu Ala He Arg Val Ser Lya He 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Ehe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Vai Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie C-ln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 390

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin Tie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala 450 455

<210> 239 <211> 454 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-489 <400> 239

Leu Asn ?he Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Set Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly val Thr lie Pile Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr He Asp Sec lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 $0

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val He Asp Trp 100 105 HO

Glu Glu Trp Arg Pro rhr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lya Asn Arg Ser He Clu Leu Val Gin Glr. Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Aan Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 24 0

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Va] Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 250 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 2Θ0 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val Tie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lya Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val l.ys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser pro Ser Thr Leu 450

<210> 240 <211> 455 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-490 <4Ο0> 240

Leu Asn Pho Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Tip '1 5 13 15

Ala Trp Aan Ala Pro Sar Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Fro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr He Pile Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly He Pro

65 70 75 BO

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie B5 90 95

Thr Phe Tyr Met Fro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp LOO 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 12C 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu The lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 IBS 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 ZOO 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn The Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 2β0 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cya lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 450 455

<210> 241 <211> 452 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-487 <4Ο0> 241

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Vai lie Pro Asn vai Pro Phe Leu Trp 1.5 13 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 3Q

Leu Asp Met: Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg He Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Vai Thr He Phe Tyr Vai Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 SS 60

Pro Tyr Ile Asp Ser lie rhr Gly Vai Thr Vai Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys Ile Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 35 30 95

Thr Phe Tyr Met Pro Vai Asp Asn Leu Gly Met Ala Vai He Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Vai 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Lau Vai Gin Gin Gin Asn Vai Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly lys Asp Phe Leu Vai Glu Thr Tla Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro tóp Cyg Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cyg Phe Asn Vai Glu Ile 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Vai Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Vai Arg Asn Arg Vai Arg Glu Ala Ile Arg Vai Ser Lys Ile 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro vai Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Vai 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Vai Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Vai Tyr 275 2B0 285

Thr Phe Gly Glu Thr Vai Ala Leu Gly Ala Scr Gly He Vai Ile Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Vai Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Vai Leu Cys Gin Glu Gin Gly Vai Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Vai Arg Gly 370 375 300

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 305 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Va.1 Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Vai Asp Vai Cys lie Ala Asp Gly Vai Cys He Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser 4 50

<210> 242 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-485 <4Ο0> 242

Leu Asn Phe Arç Ala Pro Fro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp IS 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Tie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Vsl Thr Val Asn Gly Gly lie Pro

65 70 75 SO

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 1Ê0

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arq Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser I.ys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin. Asp Glu Leu Val Tyr 27S 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350

He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys GJy Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 335 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin Tie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser 450

<210> 243 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-484 <4Ο0> 243

Lea Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie pro Asn Val Fro Phe Leu Trp 1 5 .10 IS

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly He Pro

65 70 75 SO

Gin lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 50 55

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Aan Trp Lye Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala

145 150 155 ISC

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Cly Lys Leu Leu Arg 165 Π0 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Eer Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val Ser Lys lie 245 2S0 255

Pro Asp Ala Lys ser Fra Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu 5er Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 2B5

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 305 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu lys Pre Pro MeL Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala

<210> 244 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-476 <4Ο0> 244

Leu Asn Fhe Arg Ala Fro Fro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 Ί5

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyc Val Asp Arq Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 Θ0

Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp

100 105 HO

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Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Fhe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 135 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Fhe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Aon Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser Tie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 226 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Fro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin A3p Glu Leu Val Tyr 275 230 285

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Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350

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Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lya Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cya He Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430 phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu 435 440

<210> 245 <211> 440 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-475 <4Ο0> 245

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro flan Val Pro Phe Leu Trp

15 10 IS

Ala Trp Aan Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 £5 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 05 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro .Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val He Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Axg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Axg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 15S 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys leu Leu Arg 1.65 170 175

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His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

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Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Fro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr He He Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 3Θ0

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe 5er Glu Lys Phe Tyr Cys 305 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 4.30

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr 435 440

<210> 246 <211> 439 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-474 <4Ο0> 246

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr He Asp Ser 11a Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 , 70 75 Θ0

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

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Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 HO

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 135

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205

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Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys He 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp 31n Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp

305 310 315 32D

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He He Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala Ila Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Lou Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp

405 410 41S

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe leu Lys Pro Pro Met Glu 435

<210> 247 <211> 438 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-473 <4Ο0> 247

Leu Asn Phe Arg Ala Fxo Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Fhe lie Gly Set Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 SO

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly He Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

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Ser Leu Thr Slu Ale Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 14 5 150 155 150

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 Π0 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Scr Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 £40

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 355

Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 3BC

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 380 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 4CS 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430

Phe leu Lys Pro Pro Met 435

<210> 248 <211> 437 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-472 <4Ο0> 248

Leu Ssn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Clu Pro SO 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Fhe He Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 4b

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

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Gin lys lie Ser leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 65 50 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arq Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arq 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn. Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser Tie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Aan Arg val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val

260 265 27 U

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 260 2Θ5

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys-Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350

He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu Hia Leu Aan Pro Asp 3S5 360 365

Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

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Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro 435

<210> 249 <211> 436 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-471 <4Ο0> 249

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 2C 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly 5er Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr SO 55 60

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Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lya Ala Lya Lys Asp Tie 85 30 95

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Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cya Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp A3p Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Fhe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu £er Gin Asp Glu Leu Val Tyr 2/5 200 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cya Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cya Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 I la Arg Lys Asn Trp Asn Sei Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

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Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp .Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro 435

<210> 250 <211> 435 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-470 <4Ο0> 250

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Pile Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

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Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie B5 90 95

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Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 ISO 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 130 IBS 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser CyS Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Scr lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 230 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser He Met Arq Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala lys Met Cys ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 35C lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys

385 390 395 40U

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val. Cys Tie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys 435

<210> 251 <211> 434 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-469 <4Ο0> 251

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Fro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly fier Pro Arg lie Ash Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr JCle Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 50

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly He Pro 6S 70 75 80

Glu Lys lie Ser Leu Glu Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Lou Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ecr lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Lou Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 130 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Fro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Fro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arq lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val He Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe S»r Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala VaJ Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu

<210> 252 <211> 433 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-468 <4Ο0> 252

Leu Asn Phe Arg Ala Fro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg- lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Cly Tyr Tyr 50 55 SO

Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 10 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cy3 Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 ZOO 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 Z35 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285 rhr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val He Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350

He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 310 375 3B0

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp val Cys He Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430

Phe

<210> 253 <211> 431 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-466 <4Ο0> 253

Leu Asn Fhe Arg Ala Fro Pro Val lie Pro Abu Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 10

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Tbr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Fio Tyr He Asp Ser lie Thr GLy Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pm 65 70 75 80

Gin Lys Tie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys lya Asp lie Θ5 90 95

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Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Aap Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 1Θ5 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val He Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Fro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn The Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu G.ln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 3B5 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cya lie Asp 420 ~ 425 430

<210> 254 <211> 430 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-465 <4Ο0> 254

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 4 0 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly val Thr Val Asn Gly Gly He Pro 65 70 75 80

Gin lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie BS 90 95

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Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 1È5 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His ISO 1B5 190

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Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 2Θ5

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly val Cys 340 345 350

He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Ásp 355 360 365

Asn Ehe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Ero Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys lie 420 425 430

<210> 255 <211> 429 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-464 <4Ο0> 255

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Fro Val He Pro Asn val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 1¾

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lya Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Ary lie Asn Ala 35 40 45

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Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 85 90 95

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Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

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Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

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Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285 .

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu 5er He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Lau Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr Tie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350

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Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 420 425

<210> 256 <211> 427 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-462 <4Ο0> 256

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15

Ale Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu ?he Eer Phe He Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

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Pro Tyr lie Asp Ser Lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly He Pro 65 70 75 30

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 35 90 95

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100 105 HO

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Gly lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arq 165 170 175

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Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro vel Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val Ser Lys He 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val He Trp 290 295 300

Gly'Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Le-j Asn Pro Tyr Tie Tie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 34 5 35 0 lie Arg Lys Asn Tip Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Fro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr L«u Ser Cys Ly3 Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly 420 425

<210> 257 <211> 425 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-460 <4Ο0> 257

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp IS 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

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Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asrt Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Pha Leu Val Glu Thr He Lys Leu Cly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

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Lys Arg Asn Asp Asp Leu Sex Txp Lea Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 295

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly tie Val He Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Mat Arg Ser Met Lys Ser Cya Leu Leu Leu Asp 305 J10 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Aan Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350

He Arg Lys Asn Trp Ash Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lya Gly Gly LyS Phe Thr Val Arg Cly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Eer Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala 420 425

<210> 258 <211> 423 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-458 <400> 258

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn val pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Assn Gly Gly lie Pro

65 70 75 BO

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Thr Phe Tyr Met Pro val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 * 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Fhe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Aan Gly Ser Cys Phe Ash Val Glu He 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Fhe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr Lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cya Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 34 0 34 5 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lya Gly Gly Lya Phe Thr Vai Arg Gly 370 375 3B0

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 38 5 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lya Glu Lys Ala Asp Val Lya Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys 420

<210> 259 <211> 421 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-456 <4Ο0> 259

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 55 70 75 00

Gin Ly3 He aer Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp 11c 35 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 1O0 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Fro Lys Asp Val 115 * 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala

145 150 155 16D

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Fro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Set Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 34 U 345 350 lie Arg Lys A3n Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 3Õ0

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 360 395 400

Ser Cys Tyr ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp 470

<210> 260 <211> 419 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-454 <4Ο0> 260

Leu Asn Phe Arg Ala Pro pro Val lie pro Asn Val Pro Phe Leu Trp IS 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60 pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 7 0 75 30

Gin Lys Ile Ser Leu Gin Aap His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 10O 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro .Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 130 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu A.la lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val

260 265 27 C

Phe Thr A3p Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 290 235

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ale Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350

He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 365 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 495 410 415

Thr Asp Ala

<210> 261 <211> 417 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-452 <4Ο0> 261

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

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Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly He Pro 65 70 75 30

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 65 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 130 165 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu val Tyr 275 230 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cy3 Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lye Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr

<210> 262 <211> 415 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-450 <4Ο0> 262

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Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Pha Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys Ile Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 ’ 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Lau Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His IB 0 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr A3n Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 23G 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Lsu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He He Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Giu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr 5er Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys 405 410 415

<210> 263 <211> 473 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-508 <4Ο0> 263

Leu Asn Phe Arg Ala Fro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Ph.e Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg He Asn Ala 35 40 45

Thu Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg LSU Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro

65 70 75 BO

Sin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 05 90 95

Thr Phe Tyr Mat Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp

100 105 HO

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly LyS Leu Leu Arg 165 170 175

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Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys He 245 250 255

Prn Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 255 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Va.l Tyr 275 280 205

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 300

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Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 ’ 425 430

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Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val Ser He Leu 450 455 460

Phe Leu lie lie Ser Ser Val Ala Ser 455 470

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Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cvs Leu Gly Lys phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Fhe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg Tie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr Tie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr Tie Asp Ser Tie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 TO 75 00

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 85 90 55

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala US 150 155 160

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Tyr Pro 5er lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Fhe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 215 200 205

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 330 315 320

Asn Tyr Met Clu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350

He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 3É5

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 330

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 Π5

Thr Asp Ala Val Asp val Cys He Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430

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Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe He Val Ser He Leu 450 455 460

Phe Leu He He Ser Ser Val 4 55 4 70

<210> 265 <211> 469 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-504 <4Ο0> 265

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Sex Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr SO 55 60

Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro

65 10 75 SO

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val He Asp Trp 100 105 110

GlU Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Alá Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn his Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 1Θ0 185 190

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Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Tie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 2B5

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie He Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340- 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 37{J 375 300

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Ly3 Pro Pro Met Glu Thr Glu Giu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Scr Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val Ser lie Leu 450 455 460

Phe Leu lie lie Ser 465

<210> 266 <211> 467 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-502 <4Ο0> 266

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Assn Ala Pro Set Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 2S 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

The Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 TO 75 30

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 720 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 22S 233 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys 5er Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Tie Val 260 265 279

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 235

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val He Trp 290 295 500

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu CyS Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arq Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Aan Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu 5er Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He Phe Tyr Asn 435 440 445

Ale Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe He Val 5er lie Leu 4 50 4 55 4 60

Phe Leu lie 4 65

<210> 267 <211> 465 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-500 <4Ο0> 267

Leu Asn Phe Arg Ala Fro Fro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 HI

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val-Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp 3er lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 10 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 35 90 95

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Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 1B0 135 190

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Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val Ser Lys ILe 245 250 255

Fro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arq lie Val 260 265 270 phe Thr Asp Gin Val l,eu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 295

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asti Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Fhe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 305 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Fro Pro Met Glu Thr Glu Glu Fro Gin He Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe He Val Ser He Leu 450 455 460

Phe 465

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Ala Tip Asn Ala Pro £er Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Vai Thr lie Phe lyr Vai Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr Ile Asp Ser lie Thr Gly Vai Thr Vai Asn Gly Gly lie Pro

ÊS 70 75 SO

Gin Lys Ile Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile S5 90 95

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Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 1G0

Gly Lys Asp Phe Leu Vai Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 1ÊS 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His ISO 195 190

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Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Vai Ala Ala Thr 225 230 235 210

Leu Tyr Vai Arg Asn Arg Vai Arg Glu Ala Ile Arg Vai Ser Lys Ile 245 250 255

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Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Vai Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Vai Leu Cys Gin Glu Gin Gly Vai Cys 340 345 350

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Asn Phe Ala ile Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Vai Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lya Ala Asp Vai Lys Asp 4C5 410 415

Thr Asp Ala Vai Asp Vai Cys Ile Ala Asp Gly Vai Cys Ile Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Vai Ser Ile 450 455 460

<210> 269 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> esHuPH20 36-496 <4Ο0> 269

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Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ssr Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 8 5 90 95_

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 10S 110

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Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 16S 170 175

Pro Asn HI a Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 160 165 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr ASH Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys He 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 230 285

Thr Fhe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val He Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu leu Leu Asp 3D5 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie He Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Fro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 3U0

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala A3p Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe leu Lya Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe He Val 450 455 460

<210> 270 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> esHuPH20 36-494 <4Ο0> 270 LôU Asn Phe Arg Ma Pro Pro Val He Pro Asn Val Fro Phe Leu. Trp 15 10 15

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Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie θ5 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arq Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arq Ser He Glu Leu val Gin Gin Gin Asn val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu.Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Fhe Glu Lys Ala. 145 150 155 160 '

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Fro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Giy Tyr Asn Gly Ser Cys Phe A3n Val Glu lie 135 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asr. Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Fro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Fhe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Len Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Léu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Aan Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Fro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin -Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 300

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 305 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp val Cys He Ala Asp Gly val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe 450 455

<210> 271 <211> 457 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> esHuPH20 36-492 <4Ο0> 271

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Pbe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 1 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 TO 15 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys lys Asp He 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Cly Met Ala Val lie Asp Trp ICO 105 110

Glu Glu Trp Arq Pro Thr Trp Ala Arq Asn Trp Lys Pro lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arq Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly LyS Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 ’ 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 130 185 190 HÍ3 Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 ' 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val He Trp 290 295 300

Gly Thr Lau Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 . 330 336

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350

He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425- 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Fro Ser Thr Leu Ser Ala Thr 450 455

<210> 272 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-488 <4Ο0> 272

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asti Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Cly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro fi5 TO 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp HÍ3 Leu A3p Lys Ala Lys Lys Asp lie 05 90 95

Thr phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 ISO 125

Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Glu Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg val Arg Glu Ala He Arg val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 2B0 2S5

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Lew Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 2S0 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lya Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 305 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr 450

<210> 273 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> HuPH20 madura 36-486 <4Ο0> 273

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Pile Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser Lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Cly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 65 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp

100 105 HO

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lya Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu val Gin Gin Gin Asn val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lya Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Va.l Glu Thr He Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 260 255

Pro Asp Ala Lys Ser Fro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg 11a Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 235

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu. Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350

Tie Arg Lya Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 4 2 D 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Fro Gin lie Phe Tyr A3n 435 440 445

Ala Ser Fro 450

Lisboa, 2015-03-23

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição de insulina de acção super-rápida, compreendendo: uma concentração terapeuticamente eficaz de um análogo de insulina de acção rápida para manter os níveis normais de glicose no sangue, onde: o análogo de insulina de acção rápida é insulina glulisina ou insulina aspártico; os níveis de glicose no sangue são níveis de glicose no sangue pós-prandiais; e uma concentração de uma enzima de degradação de hialuronano suficiente para tornar a composição uma composição de insulina de acção super-rápida após administração, onde a composição de insulina de acção super-rápida tem um início de acção que mimetiza mais aproximadamente a libertação de insulina pós-prandial endógena de um sujeito não diabético; e a composição de insulina de acção super-rápida é formulada para uma via de administração seleccionada entre administração subcutânea, intramuscular, intradérmica e intraperitoneal.
2. Composição da revindicação 1, onde a quantidade de enzima de degradação de hialuronano é funcionalmente equivalente a 10 Unidades, 20 Unidades, 30 Unidades, 40 Unidades, 50 Unidades, 100 Unidades, 150 Unidades, 200 Unidades, 250 Unidades, 300 Unidades, 350 Unidades, 400 Unidades, 450 Unidades, 500 Unidades, 600 Unidades, 700 Unidades, 800 Unidades, 900 Unidades, 1000 Unidades, 2000 Unidades, 3000 Unidades, 4000 ou mais de actividade de hialuronidase.
3. Composição da revindicação 1 ou reivindicação 2, onde a quantidade de enzima de degradação de hialuronano para insulina na composição é 1 U de hialuronidase/1 U de insulina U (1:1) até 50:1, ou é 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1.
4. Composição de qualquer das reivindicações 1-3, que é formulada para administração de dose única, onde a quantidade de enzima de degradação de hialuronano está formulada para se administrar ao sujeito uma dosagem prandial para uma única refeição e é 1U, 2U, 3U, 4U, 5U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2000 U, 3000 U, 4000 Unidades, 5000 U ou mais.
5. Composição de qualquer das reivindicações 1-4 que está formulada para administração de dose múltipla ou administração de dose única.
6. Composição de qualquer das reivindicações 1-5 que está formulada para entrega por um sistema em circuito fechado, uma caneta de insulina ou uma bomba de insulina.
7. Composição de qualquer das reivindicações 1-6, onde, quando a composição está formulada para administração de dosagem única, a quantidade de insulina para uma única dose é de 0,05 Unidades, 0,06 Unidades, 0,07 Unidades, 0,08 Unidades, 0,09 Unidades, 0,1 Unidades, 0,2 Unidades, 0,3 Unidades, 0,4 Unidades, 0,5 Unidades, 0,6 Unidades, 0,7 Unidades, 0,8 Unidades, 0,9 Unidades, 1 Unidade, 2 Unidades, 5 Unidades, 10 Unidades, 15 Unidades, 20 Unidades, 25 Unidades, 30 Unidades, 35 Unidades, 40 Unidades ou 50 Unidades.
8. Composição de qualquer das reivindicações 1-7, compreendendo adicionalmente um ou mais ingredientes opcionais seleccionados entre: um agente quelante, zinco, um estabilizador, um conservante e um consumidor de oxigénio.
9. Composição de qualquer das reivindicações 1-8, onde o análogo de insulina é seleccionado entre uma insulina possuindo uma cadeia A com uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ NO:103 e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOS :147 ou 149.
10. Composição de qualquer das reivindicações 1-9, onde a enzima de degradação de hialuronano é uma hialuronidase ou uma condroitinase.
11. Composição da revindicação 10, onde a hialuronidase é uma PH20, ou uma sua forma truncada para remover a totalidade ou uma porção de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI).
12. Composição da revindicação 11, onde a PH20 é seleccionada entre uma PH20 ovina, bovina ou humana truncada.
13. Composição da revindicação 12, onde a PH20 humana truncada é seleccionada entre polipéptidos possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer das SEQ ID NOS:4-9, ou suas variantes que têm 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em relação aos polipéptidos apresentados em qualquer das SEQ ID NOS :4-9, e que mantêm actividade de hialuronidase.
14. Composição da revindicação 1, onde uma composição de insulina de acção super-rápida, que tem um inicio de acção que é mais rápido do que o do análogo sozinho, e uma duração de acção que é mais curta do que a do análogo sozinho, pelo que, após administração, a composição mimetiza mais aproximadamente a resposta de insulina pós-prandial fisiológica de um sujeito não diabético para conseguir controlo glicémico.
15. Seringa ou frasco de injectáveis, compreendendo a composição de qualquer das reivindicações 1-14.
16. Sistema em circuito fechado, compreendendo a composição de qualquer das reivindicações 1-14.
17. Bomba de insulina, compreendendo a composição de qualquer das reivindicações 1-14.
18. Caneta de insulina, compreendendo a composição de qualquer das reivindicações 1-14.
19. Sistema em circuito fechado para controlar os niveis de glicose no sangue num sujeito, compreendendo: um análogo de insulina de acção rápida, onde o análogo de insulina de acção rápida é insulina glulisina ou insulina aspártico, e uma enzima de degradação de hialuronano; o análogo de insulina de acção rápida e a enzima de degradação de hialuronano estão no mesmo ou em reservatórios diferentes, onde um sistema em circuito fechado mimetiza mais aproximadamente a resposta de insulina endógena num sujeito não diabético.
20. Sistema em circuito fechado da reivindicação 19, compreendendo adicionalmente um ou mais de um sensor de glicose, um sistema de entrega para entregar a enzima de degradação de hialuronano e a insulina de acção rápida, e software programado para integrar as funções de bombagem e de monitorização, pelo que a enzima de degradação de hialuronano e a insulina de acção rápida são entregues para conseguir um controlo glicémico que mimetiza o controlo glicémico num sujeito não diabético.
21. Sistema em circuito fechado da reivindicação 20, onde um análogo de insulina é seleccionado entre uma insulina com uma cadeia A com uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 103 e uma cadeia B com uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:147 ou 149.
22. Sistema em circuito fechado de qualquer das reivindicações 19-21, onde o reservatório contendo a insulina de acção rápida contém 0,1 Unidades, 0,2 Unidades, 0,3 Unidades, 0,4 Unidades, 0,5 Unidades, 0,6 Unidades, 0,7 Unidades, 0,8 Unidades, 0,9 Unidades, 1 Unidade, 2 Unidades, 5 Unidades, 10 Unidades, 15 Unidades, 20 Unidades, 25 Unidades, 30 Unidades, 35 Unidades, 40 Unidades, 50 Unidades, 100 Unidades, 200 Unidades, 300 Unidades, 400 Unidades, 500 Unidades, 600 Unidades, 700 Unidades, 800 Unidades, 900 Unidades, 1000 Unidades, 2000 Unidades, 5000 Unidades, 6000 Unidades, 7000 Unidades ou mais de insulina.
23. Sistema em circuito fechado de qualquer das reivindicações 19-22, onde o sistema é capaz de entregar a insulina de acção rápida em incrementos de dose individual de 0,1 Unidades, 0,2 Unidades, 0,3 Unidades, 0,4 Unidades, 0,5 Unidades, 0,6 Unidades, 0,7 Unidades, 0,8 Unidades, 0,9 Unidades, 1 Unidade, 2 Unidades, 5 Unidades, 10 Unidades, 15 Unidades, 20 Unidades, 25 Unidades, 30 Unidades, 35 Unidades, 40 Unidades, 50 Unidades ou mais de insulina.
24. Sistema em circuito fechado de qualquer das reivindicações 19-23, onde o reservatório contendo a enzima de degradação de hialuronano contém uma quantidade de enzima de degradação de hialuronano que é funcionalmente equivalente a 0,3 Unidades, 0,5 Unidades, 1 Unidade, 2 Unidades, 5 Unidades, 10 Unidades, 20 Unidades, 30 Unidades, 40 Unidades, 50 Unidades, 100 Unidades, 150 Unidades, 200 Unidades, 250 Unidades, 300 Unidades, 350 Unidades, 400 Unidades, 450 Unidades, 500 Unidades, 600 Unidades, 700 Unidades, 800 Unidades, 900 Unidades, 1000 Unidades, 2000 Unidades, 3000 Unidades, 4000 Unidades, 5000 Unidades, 6000 Unidades, 7000 Unidades, 8000 Unidades, 9000 Unidades, 10000 Unidades, 20000 Unidades ou mais de actividade de hialuronidase.
25. Sistema em circuito fechado de qualquer das reivindicações 19-24, onde o sistema é capaz de entregar a enzima de degradação de hialuronano em incrementos de dose individual de uma quantidade de enzima de degradação de hialuronano que é funcionalmente equivalente a 0,3 Unidades, 0,5 Unidades, 1 Unidade, 2 Unidades, 3 Unidades, 5 Unidades, 10 Unidades, 20 Unidades, 30 Unidades, 40 Unidades, 50 Unidades, 100 Unidades, 150 Unidades ou mais de actividade de hialuronidase.
26. Método para preparação de uma composição de insulina de acção super-rápida de qualquer das reivindicações 1-14, compreendendo: seleccionar um análogo de insulina de acção rápida, onde o análogo de insulina de acção rápida é insulina glulisina ou insulina aspártico; e combinar este com uma quantidade suficiente de enzima de degradação de hialuronano para tornar a composição uma composição de insulina de acção super-rápida, onde uma composição de insulina de acção super-rápida tem um inicio de acção que mimetiza mais aproximadamente a libertação de insulina pós-prandial endógena de um sujeito não diabético.
27. Utilização de uma composição de qualquer das reivindicações 1-14 para preparar um medicamento para manter os niveis normais de glicose no sangue num sujeito.
28. Composição de qualquer das reivindicações 1-14, para preparar um medicamento para administração a um diabético menos de 15 minutos antes de uma refeição até 10 minutos após uma refeição ou com uma refeição para controlar os niveis de glicose pós-prandial no sangue no sujeito.
29. Composição de qualquer das reivindicações 1-14 para utilização para administração a um diabético menos de 15 minutos antes de uma refeição até 10 minutos após uma refeição ou com uma refeição para controlar os niveis de glicose pós-prandial no sangue no sujeito. Lisboa, 2015-03-23