CN112457394B - 一种抗菌肽TgHbpe及其突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽TgHbpe及其突变体。本发明从泥蚶血红蛋白亚基中分离出一段具有抗菌特性的抗菌肽TgHbpe，并对其进行定点突变，获得突变体抗菌肽mTgHbpe。通过功能分析和鉴定，发现这两种抗菌肽对大肠杆菌和溶藻弧菌均具有较强的杀菌效果，且经突变筛选的mTgHbpe抗菌活力要明显强于TgHbpe；抗菌肽TgHbpe对大肠杆菌的MIC约为120μM，对溶藻弧菌的MIC约为100μM；抗菌肽mTgHbpe对大肠杆菌的MIC约为20μM，对溶藻弧菌的MIC约为7μM。这为泥蚶血红蛋白源抗菌肽的开发利用奠定了基础。

Description

一种抗菌肽TgHbpe及其突变体
技术领域
本发明属于应用海洋生物技术领域，具体涉及一种抗菌肽TgHbpe及其突变体。
背景技术
贝类是我国海水养殖的重要对象，是海水养殖的重要组成部分，对我国的经济有着极其重要的推动作用。随着人们对贝类需求的不断增加，贝类养殖得到了迅猛的发展。泥蚶(Tegillarca granosa)，属软体动物门，双壳纲，列齿目，蚶科，蚶属，是中国传统的养殖贝类。泥蚶肉质鲜美，壳可入药，有消血块和化痰积的功效。因为其实惠的价格，被众多沿海城市的人们所喜爱。
血红蛋白(hemoglobin，Hb)是红细胞内运输氧的特殊蛋白质，是使血液呈红色的蛋白，所有脊椎动物和部分无脊椎动物血液中都含有这一类呼吸蛋白。血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，具有多重生物学功能，是最具有研究价值的蛋白质家族之一。绝大多数无脊椎动物，其携氧蛋白是血蓝蛋白。而泥蚶作为一种无脊椎动物，其携氧蛋白是血红蛋白。除了运输氧气的功能外，血蓝蛋白和血红蛋白还有抗菌、抗病毒等功能。有相关研究表明，泥蚶的血红蛋白对于一些细菌具有明显的抗菌作用。
抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)又称为抗微生物肽或者宿主防御肽，是生物体经诱导产生的具有广谱抗菌活性和免疫调节活性的一类小分子多肽，属于机体非特异性防御系统的固有组成部分。随着科学技术的进步，生物信息学技术已被广泛应用于科学研究中，可以通过一系列的在线软件对抗菌肽进行预测和筛选，大大缩短了研究的时间，提高了效率。目前所发现的海洋生物抗菌肽绝大多数都来源于海洋无脊椎动物，包括环节动物、软体动物、棘皮动物、甲壳动物、鱼类等。大部分海洋生物抗菌肽无需外界刺激，可以直接表达，即组成型表达。其中，软体动物是抗菌肽研究最多的类群之一。在过去的20年中，对海洋生物抗菌肽的研究已经取得了足够多的进展，但相对于陆生动物而言，其广度和深度仍然不足。与传统抗生素相比，抗菌肽的主要作用在细菌的细胞膜上，通过改变细胞膜的通透性而杀灭细菌，使用后在人体内几乎无残留，不易产生抗药性，属于机体非特异性免疫活动的一部分，长期添加可激发提高机体免疫力，增强抗病力。而长期使用抗生素的话，会使生物体产生抗药性，会产生超级细菌，且对人体损害较大，会直接破坏机体免疫系统，降低机体抵御病害的能力。因此，对抗菌肽的研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的泥蚶血红蛋白源抗菌肽TgHbpe及其突变体mTgHbpe。
本发明的一种抗菌肽TgHbpe，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供所述的抗菌肽TgHbpe在制备抗菌药物中的应用。
优选，所述的抗菌药物，是抗溶藻弧菌和大肠杆菌的药物。
本发明还提供了所述的抗菌肽TgHbpe的突变体，即抗菌肽mTgHbpe，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供所述的抗菌肽mTgHbpe在制备抗菌药物中的应用。
优选，所述的抗菌药物，是抗溶藻弧菌和大肠杆菌的药物。
本发明从泥蚶血红蛋白HbI、HbII亚基为研究对象，泥蚶血红蛋白能产生功能性的抗菌肽，并且通过生物信息学在线预测肽段发现血红蛋白亚基中的6种肽段具有抗菌活性的可能性最大。在此基础上选择一种肽段S2(即抗菌肽TgHbpe)，对其二级结构和3D模型进行初步预测。接着在肽段S2的基础上对其进行突变，筛选出一条抗菌效果更好的抗菌肽mS2(即抗菌肽mTgHbpe)。实验结果表明，该抗菌肽及其突变肽对两种致病菌溶藻弧菌和大肠杆菌有较强的杀菌效果，这为研制新型的具有抗菌活性的药物和在水产养殖业上作为替代抗菌素的新型病害预防治疗制剂奠定了基础。
附图说明
图1是抗菌肽TgHbpe的3D模型；
图2是抗菌肽mTgHbpe的3D模型；
图3是抗菌肽S2(即抗菌肽TgHbpe)对大肠杆菌(Escherichia coli)的抑菌作用；
图4是抗菌肽S2(即抗菌肽TgHbpe)对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的抑菌作用；
图5是抗菌肽mS2(即抗菌肽mTgHbpe)对大肠杆菌(Escherichia coli)的抑菌作用；
图6是抗菌肽mS2(即抗菌肽mTgHbpe)对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的抑菌作用。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：泥蚶血红蛋白的抗菌肽预测
通过三个在线软件AntiBP Server、CAMP、APD2对泥蚶血红蛋白的HbⅠ、HbⅡ的两个亚基序列进行预测和筛选，得到了6条可能性最高的抗菌肽，其序列如表1中所示。
表1泥蚶血红蛋白源抗菌肽预测
Figure BDA0002771200970000031
Figure BDA0002771200970000041
实施例2：抗菌肽的选取
实验用抗菌肽(对应为表1中的6种)由合肥国肽生物科技有限公司合成，多肽N端乙酰化、C端酰胺化修饰，纯度为﹥95％。
2.1抗菌肽的选取操作步骤
(1)取少许保存在-80℃冰箱的两种致病菌(大肠杆菌、溶藻弧菌)的菌液，在LB平板上划线活化，挑选单菌落接种在15mL的LB液体培养基中，放在37℃恒温摇床上摇4-6h直至对数生长期；
(2)分别取活化后菌液100μL于1.5mL的离心管中，再加入900μL的灭菌后的PBS进行稀释，即稀释10倍，依次稀释，直至稀释至106-7CFU/mL；
(3)合成好的抗菌肽也用灭菌后的PBS进行稀释，得到不同浓度的抗菌肽。取稀释后的菌液10μL分别与浓度为100μM、200μM、300μM的10μL抗菌肽进行等体积混合，将10μL的稀释好的菌液与10μL的PBS进行等体积混合作为阴性对照，与其他样品一起放于37℃的恒温培养箱中孵育2-3h。取少量孵育好的混合液涂于96孔板中，每组设置三个平行，倒置于37℃培养箱中，培养12-24h后观察菌落生长情况；
(4)对比六种抗菌肽对两种细菌的抑菌情况，筛选出其中抗菌效果最好的一个抗菌肽，为S2，同时记录其不同浓度下的菌落数量。抗菌肽S2对E.coil的抑菌作用结果如图3所示，抗菌肽S2对大肠杆菌的MIC约为120μM；抗菌肽S2对V.alginolyticus的抑菌作用结果如图4所示，抗菌肽S2对溶藻弧菌的MIC约为100μM。
根据来源，将抗菌肽S2命名为抗菌肽TgHbpe，其分子量为1666Da，其氨基酸序列对应如SEQ ID NO.1所示。
实施例3：研究抗菌肽TgHbpe的二级和三级结构
(1)抗菌肽TgHbpe的3D模型预测
通过在线软件SWISS-MODE对泥蚶血红蛋白HbIIB的氨基酸序列进行三维结构预测，选择相似度较高的三维结构图，下载pdb文件，在PyMol软件中打开进行查看与编辑，标注出抗菌肽TgHbpe的序列，得到抗菌肽TgHbpe的3D模型图如图1所示。
(2)抗菌肽TgHbpe的二级结构预测
通过在线软件APD2和SOPMA对抗菌肽TgHbpe进行二级结构预测，发现该抗菌肽可能存在α-螺旋结构。
实施例4：突变肽的选取
抗菌肽的抗菌性跟其带的电荷特性和数量以及疏水性的大小有关，并根据天然抗菌肽的结构特征，对泥蚶血红蛋白源抗菌肽TgHbpe进行定点突变，得到七条不同的突变肽，其序列如表2中所示。
表2泥蚶血红蛋白源突变抗菌肽预测
Figure BDA0002771200970000061
将上述表2中的序列送由合肥国肽生物科技有限公司合成，多肽N端乙酰化、C端酰胺化修饰，纯度为﹥95％。重复上述实施例2的抗菌肽选取的操作步骤，得到杀菌效果最好的抗菌肽，为表2中序号7对应的抗菌肽，编号为mS2。抗菌肽mS2对E.coil的抑菌作用如图5所示，抗菌肽mS2对大肠杆菌的MIC约为20μM；抗菌肽mS2对V.alginolyticus的抑菌作用如图6所示，抗菌肽mS2对溶藻弧菌的MIC约为7μM。
根据来源，将抗菌肽mS2命名为抗菌肽mTgHbpe，其分子量为1761Da，其氨基酸序列对应如SEQ ID NO.2所示。上述结果表明，经突变筛选获得的mTgHbpe抗菌活力要明显强于TgHbpe。
实施例5：研究抗菌肽mTgHbpe的二级和三级结构
(1)抗菌肽mTgHbpe的3D模型预测
通过在线软件SWISS-MODE对突变的泥蚶血红蛋白源抗菌肽mTgHbpe的氨基酸序列进行三维结构预测，选择相似度较高的三维结构图，下载pdb文件，在PyMol软件中打开进行查看与编辑，标注出抗菌肽mTgHbpe的序列，得到抗菌肽mTgHbpe的3D模型图如图2所示。
(2)抗菌肽mTgHbpe的二级结构预测
通过在线软件APD2和SOPMA对抗菌肽mTgHbpe进行二级结构预测，发现该抗菌肽可能存在α-螺旋结构。
序列表
<110> 浙江万里学院
中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种抗菌肽TgHbpe及其突变体
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Pro Ile Arg Ala Val Leu Lys Ala Arg Met Gly Ser Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Trp Ile Arg Ala Val Leu Lys Ala Arg Met Gly Lys Lys Phe
1 5 10 15

Claims (4)

1.一种抗菌肽TgHbpe，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的抗菌肽TgHbpe在制备抗菌药物中的应用；所述的抗菌药物是抗溶藻弧菌和大肠杆菌的药物。
3.一种抗菌肽mTgHbpe，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求3所述的抗菌肽mTgHbpe在制备抗菌药物中的应用；所述的抗菌药物是抗溶藻弧菌和大肠杆菌的药物。
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