CN112458118A - 新流法腺四联病毒样颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

新流法腺四联病毒样颗粒及其制备方法和应用，属于四联疫苗研发领域，制备方法包括：目的基因的优化及合成、重组穿梭质粒的构建、重组杆粒的构建、重组杆状病毒的拯救、嵌合病毒样颗粒的制备及纯化，最终获得嵌合病毒样颗粒NDV‑AIV‑IBDV‑FAdV4 cVLPs。通过本发明的制备方法制备的新流法腺四联病毒样颗粒具有以下优点：该新流法腺四联病毒样颗粒能够重复高密度的展现外源抗原，具有较强的免疫原性；同时不含有病毒核酸，绿色、安全，有利于新流法腺的净化，符合现代绿色、安全的养殖理念；疫苗种毒与流行毒株匹配；一针多防，简化疫苗免疫程序，避免了多种疫苗的相互干扰；适合大规模悬浮培养及批量生产。

Description

新流法腺四联病毒样颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于四联疫苗研发技术领域，具体涉及一种新流法腺四联病毒样颗 粒及其制备方法和应用。
背景技术
新城疫(Newcastle disease，ND)、禽流感(Avine influenza，AI)、传染性 法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)和禽4型腺病毒病(Fowl adenovirus， FAd)是目前危害国内家禽养殖业的主要动物疫病，造成的经济损失非常严重。 根据近期分子流行病学调查数据报道，新城疫在我国的主要流行毒株为基因V II 型，而主要疫苗株为基因II型LaSota弱毒株，基因型的不匹配和活疫苗的不安 全性导致新城疫的净化困难重重。禽流感血清学调查结果表明H9N2亚型分离 率位于AIV各亚型之首，自2003年起农业部指定研制并批准了禽流感灭活疫苗 (如H9亚型：SS株)，但灭活疫苗存在免疫原性不足和无法有效区分疫苗抗体 与野毒感染抗体等局限性。传染性法氏囊病疫苗大多基于经典毒株研制的，对临床流行的超强毒株或变异株感染的鸡不能产生完全保护，并且活疫苗可使法 氏囊组织损伤，导致免疫抑制，造成继发感染和降低其他疫苗的免疫效果等问 题。禽腺病毒病目前缺少血清型匹配的商品疫苗，无法达到控制或净化目的， 并且在规模化养殖方式下，往往不是单独发病，经常并发或继发其他病毒性或 细菌性疾病，导致病情更加复杂。印发的《国家中长期动物疫病防治规划 (2012-2020年)》将新城疫和高致病性禽流感列为国内优先防治的动物疫病， 要求在2020年年底全国达到控制标准，并且全国种鸡场达到净化标准。为贯彻 落实规划，迎合绿色、安全养殖技术理念，简化疫苗免疫程序，以及推动新城 疫、禽流感、法氏囊病和禽腺病毒病的控制和净化，研发一种绿色、安全、高 效、可有效区分疫苗免疫抗体和野毒感染抗体并可“一针多防”的新型疫苗尤 为重要。
新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)的F蛋白参与病毒与宿主细胞 及宿主细胞间融合过程，是重要的保护性抗原。禽流感病毒(Avine influenza virus，AIV)感染是HA结合宿主的细胞受体过程，HA决定着病毒结合宿主受 体特异性，具有亚型特异性和血凝活性，是最重要的抗原基因和毒力基因。传 染性法氏囊病毒(Infectious bursaldisease virus，IBDV)的VP2蛋白是IBDV的 衣壳蛋白和主要保护性抗原，与病毒的毒力、细胞嗜性和抗原变异有关，具有 良好的免疫原性和稳定性。禽4型腺病毒(Fowl adenovirusserotype-4，FAdV-4) 的纤维蛋白Fiber-2是腺病毒连接细胞的受体，决定着毒力的变化和组织取向。 大量国内外表明F蛋白、HA蛋白、VP2蛋白和Fiber-2蛋白具有成为分别预防NDV、AIV、IBDV和FAdV-4的亚单位疫苗的潜力，但如何提高其免疫原性尤 其是诱导细胞免疫应答的能力对预防胞内复制的病毒性疾病至关重要。
病毒样颗粒疫苗(Virus Like Particles，VLPs)安全、无污染，保护养殖生 态环境，是国际化新型疫苗研发的趋势。VLPs表面高度重复有序的结构无需在 T细胞辅助下即可完成与B细胞抗原受体(BCR)的交联，被认为是一种典型 的T细胞非依赖性B细胞抗原。除了诱导高效的B细胞应答外，VLPs还通过 与APCs(Antigen-presenting cel，APCs)特别是与树突状细胞(Dendritic cells， DC)相互作用，经TLR4/NF-κB信号通路刺激DC成熟及CCR7-CCL19/CCL21 轴促进DC迁移，最终将抗原信息递呈给T细胞，激发强烈的T细胞免疫应答。 NDVVLPs的释放效率高达84％，显著高于其他副黏病毒科成员，是递送外源 蛋白的理想载体。目前，现有的嵌合型病毒样颗粒改造策略为胞外域替换策略， 该策略主要基于融合序列的基因转染水平，存在多基因表达操控困难、锚定蛋 白无法定量的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种新流法腺四联病毒样颗粒及其制备方法和应用， 具有绿色、安全、高效等特点。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的新流法腺四联病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、目的基因的优化及合成
根据昆虫细胞密码子偏好性对NDVNA-1株的M基因和F基因、H9N2AIV 株的HA基因、IBD SH99株的VP2基因、HB 1510株的Fiber-2基因进行密码 子优化；M基因优化后序列如SEQ ID NO.1所示；F基因优化后序列如SEQ ID NO.2所示；HA基因优化后序列如SEQ IDNO.3所示；VP2基因优化后序列如 SEQ ID NO.4所示；Fiber-2基因优化后序列如SEQ IDNO.5所示；
步骤二、重组穿梭质粒的构建
根据各基因优化后序列和pFastbac-1载体信息设计特异性引物和M13鉴定 引物，利用PCR进行基因扩增及鉴定，将合成的各个质粒分别进行双酶切并利 用胶回收试剂盒回收目的片段，将各目的片段分别连接至pFastbac1载体，转化 至Escherichia coli DH5α感受态细胞中进行PCR及双酶切筛选，最终获得重组穿 梭质粒pFastbac1-M、pFastbac1-F、pFastbac1-GPI-HA、pFastbac1-GPI-VP2和 pFastbac1-GPI-Fiber-2；
步骤三、重组杆粒的构建
将步骤二构建的各重组穿梭质粒分别转化至Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞中进行同源重组，涂板于三抗固体选择平板，37℃过夜培养，挑取纯净 白斑，利用步骤二设计的特异性引物及M13鉴定引物进行PCR鉴定，将鉴定正 确的阳性菌液质粒再次涂板于三抗固体选择平板，反复筛选，直至阳性率为 100％，最终获得重组杆粒rBacmid-M、rBacmid-F、rBacmid-GPI-HA、 rBacmid-GPI-VP2和rBacmid-GPI-Fiber-2；
步骤四、重组杆状病毒的拯救
采取脂质体介导转染方式，将步骤三构建的各重组杆粒分别转染至昆虫杆 状病毒表达系统中，盲传三代收获上清，利用步骤二设计的特异性引物及M13 鉴定引物进行PCR鉴定，最终获得重组杆状病毒rBV-M、rBV-F、rBV-GPI-HA、 rBV-GPI-VP2和rBV-GPI-Fiber-2；
步骤五、嵌合病毒样颗粒的制备及纯化
将步骤四构建的重组杆状病毒rBV-M、rBV-F、rBV-GPI-HA、rBV-GPI-VP2 和rBV-GPI-Fiber-2按照总MOI＝5的比例接种至昆虫杆状病毒表达系统中，收集 细胞上清；采用蔗糖密度梯度进行纯化，最终获得嵌合病毒样颗粒 NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs。
作为优选的实施方式，步骤一中，根据pFastbac-1载体信息分别在HA基因、VP-2基因和Fiber-2基因依次引入蜂素信号肽序列、HIS标签序列、TEV切割序 列和GPI信号肽序列。
作为优选的实施方式，步骤二中，所述特异性引物序列如下：
M-Xba I-F：5’-TCTAGAATGGATAGCAGTCGTACGATTGGC-3’，
M-HindIII-R：5’-AAGCTTTTATTTTCTGAATGGATTGTATTTCGCG-3’；
F-Xba I-F：5’-TCTAGAGGATCCTTGTGGAAGGTTTTGATCCCAT-3’，
F-Kpn I-R：5’-GGTACCTTAAGCACGAGTAGTTGCGCG-3’；
HA-Xba I-F：5’-TCTAGAATGGAACAGGTGTCGCTC-3’，
HA-Kpn I-R：5’-GAGCTCTTAGATACAGATGTTACACCTACACG-3’；
VP2-Sac I-F：5’-GAGCTCGCCACCATGAAGTTCC-3’，
VP2-HindIII-R：5’-AAGCTTTTAGGTCAGCAGACCCATGGTC-3’；
Fiber-2-BamHI-F：5’-GGATCCGCCACCATGAAGTTCCT-3’，
Fiber-2-Kpn I-R：5’-GGTACCTTAGGTCAGCAGGCCCATG-3’；
所述M13鉴定引物序列如下：
M13-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’，
M13-R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。
作为优选的实施方式，步骤二中，利用PCR进行基因扩增及鉴定，PCR反 应程序如下：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、58℃退火45秒、72℃延伸 1分钟，总计30个循环；72℃再延伸10分钟。
作为优选的实施方式，步骤二中，将合成的各个质粒分别进行双酶切并利 用胶回收试剂盒回收目的片段，酶切体系为：质粒20μL、ddH2O 20μL、酶各2 μL、Buffer 6μL，37℃反应1h后进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒回收 M基因、F基因、HA基因、VP2基因及Fiber-2基因。
作为优选的实施方式，步骤二中，将各目的片段分别连接至pFastbac1载体， 连接体系为：pFastbac1载体1.5μL、目的基因6.5μL、T4DNA连接酶1μL、 Buffer2μL，25℃反应30min后转化至Escherichia coli DH5α感受态细胞中，涂 板于Kan筛选选择平板，37℃过夜培养，挑取单菌落进行PCR鉴定，PCR反应 程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、58℃退火45秒、72℃延伸1分 钟，总计30个循环；72℃再延伸10分钟；提取鉴定正确的阳性菌液质粒利用 双酶切进行鉴定。
作为优选的实施方式，步骤三的具体过程如下：将构建的各重组穿梭质粒 分别转化至Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞中，42℃热激后加入1mL无抗 液体LB培养基，置于30℃培养3h，涂板于三抗固体选择平板，该三抗固体选 择平板含有100μg/mLX-gal、40μg/mL IPTG、20μg/mL TET、30μg/mL GM和 100μg/mLKan，37℃过夜培养，挑取纯净白斑，利用步骤二设计的特异性引物 及M13鉴定引物进行PCR鉴定，PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃ 变性45秒、55℃退火45秒、72℃延伸150秒，总计30个循环；72℃再延伸10 分钟。
作为优选的实施方式，步骤四中，所述昆虫杆状病毒表达系统为昆虫sf9细 胞、昆虫High Five细胞或昆虫Sf21细胞，将步骤三构建的各重组杆粒分别转化 至密度为70-80％的贴壁昆虫sf9细胞中，27℃培养72-96h后收取细胞上清即为 P1代重组杆状病毒，盲传3代以后提取病毒基因组，利用步骤二设计的特异性 引物及M13鉴定引物进行PCR鉴定，PCR反应程序为：94℃预变性5分钟； 94℃变性45秒、55℃退火45秒、72℃延伸150秒，总计30个循环；72℃再延 伸10分钟；步骤五中，所述昆虫杆状病毒表达系统为昆虫sf9细胞、昆虫High Five 细胞或昆虫Sf21细胞，将步骤四构建的各重组杆状病毒按照rBV-M、rBV-F、rBV-GPI-HA、rBV-GPI-VP2、rBV-GPI-Fiber-2的病毒滴度比例为5:1.5:1.5:1:1的 比例接种至密度为2×106个/mL的悬浮的昆虫sf9细胞中，28℃、120r/min震荡 培养72h后，4℃、8000×g离心收集含有嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs的培养上清。
本发明还提供一种利用上述制备方法制备获得的新流法腺四联病毒样颗 粒。
本发明的新流法腺四联病毒样颗粒在制备用于预防禽类新城疫病毒、禽流 感病毒、法氏囊病毒和禽血清4型腺病毒疫苗中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明采用昆虫杆状病毒表达系统及GPI锚定策略，所制备的嵌合病毒样 颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs能够重复高密度的展现外源抗原，具有较强 的免疫原性，同时不含有病毒核酸，符合现代绿色、安全的养殖理念，这种无 核酸污染的疫苗对于新流法腺的净化也至关重要，并且该颗粒疫苗可以“一针 多防”，简化了疫苗的免疫程序及避免了多种疫苗的相互干扰。具体而言，其技 术优势主要表现在：
(1)疫苗种毒与流行毒株匹配。疫苗的各抗原组分均来源于各个病毒的流 行毒株，M基因和F基因来源于NDV国内流毒株NA-1，HA基因来源于AIV 分离率最高的H9N2亚型、VP2基因来源于IBDV流行毒株SH99株，Fiber-2 基因来源于FAdV-4的流行毒株HB 1510株。
(2)免疫原性强。其一，采用的表达系统为昆虫杆状病毒表达系统，能够 对嵌合病毒样颗粒的各组分蛋白进行翻译后修饰，表达的蛋白能进行正确的折 叠，保留了完整的抗原信息；其二，嵌合病毒样颗粒具有与真实病毒粒子类似 的结构，其入侵模式与病毒类似，易被抗原递呈细胞摄取、加工；其三，NDVVLPs 释放率较高，且可重复高密度的展现囊膜表面蛋白。
(3)绿色、安全，有利于新流法腺的净化。嵌合病毒样颗粒是由各个病毒 主要的抗原蛋白组装而成，不含有病毒的核酸，符合现代绿色、安全的养殖理 念，并且可根据各个病毒的其余组分设计区分疫苗免疫抗体和野毒感染抗体的 检测试剂盒，有利于移除持续带毒禽类进而推动新流法腺的净化。
(4)“一针多防”，简化疫苗免疫程序。嵌合病毒样颗粒1次免疫可预防4 种禽类疫病(新城疫(Newcastle disease，ND)、禽流感(Avine influenza，AI)、 传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)和禽4型腺病毒病(Fowl adenovirus，FAd))，减少了疫苗免疫的次数及操作难度，且避免了传统疫苗多 次免疫的互相干扰。
(5)适合大规模悬浮培养及批量生产。本发明制备的嵌合病毒样颗粒 NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs适用于sf9、HighFive或Sf21等多类昆虫细胞大 批量悬浮培养生产，且纯化工艺成熟。
附图说明
图1为重组穿梭质粒的酶切电泳图；其中，Marker：
Figure BDA0002797347010000061
Plus DNA Marker；(a)pFastbac1-M质粒双酶切结果，pFastbac1载体片段大小约4700bp， M基因片段大小约1100bp；(b)pFastbac1-F质粒双酶切结果，pFastbac1载体 片段大小约4700bp，F基因片段大小约1660bp；(c)pFastbac1-GPI-VP2质粒 双酶切结果，pFastbac1载体片段大小约4700bp，GPI-VP2片段大小约1640bp； (d)pFastbac1-GPI-Fiber-2质粒双酶切结果，pFastbac1载体片段大小约4700bp， GPI-Fiber-2片段大小约1725bp；(e)pFastbac1-GPI-HA质粒双酶切结果， pFastbac1载体片段大小约4700bp，GPI-HA片段大小约1960bp。
图2为重组杆状病毒的特异性引物及M13鉴定引物的PCR鉴定电泳图；其 中，M：
Figure BDA0002797347010000071
Plus DNAMarker；(a)rBV-M PCR扩增结果，甬道1为M13 鉴定引物扩增片段约3600bp，甬道2为M基因特异性引物扩增片段约1100bp； (b)rBV-F PCR扩增结果，甬道1为M13鉴定引物扩增片段约4160bp，甬道 2为F基因特异性引物扩增片段约1660bp；(c)rBV-GPI-VP2 PCR扩增结果， 甬道1为M13鉴定引物扩增片段约4140bp，甬道2为GPI-VP2基因特异性引 物扩增片段约1640bp；(d)rBV-GPI-Fiber-2 PCR扩增结果，甬道1为M13鉴 定引物扩增片段约4250bp，甬道2为GPI-Fiber-2基因特异性引物扩增片段约 1725bp；(e)rBV-GPI-GPI-HAPCR扩增结果，甬道1为M13鉴定引物扩增片 段约4460bp，甬道2为GPI-HA基因特异性引物扩增片段约1725bp。
图3为嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs的各组分蛋白免疫印 迹鉴定图；其中，(a)M蛋白鉴定结果，条带大小约40kDa；(b)F蛋白鉴定 结果，条带大小约59kDa；(c)VP2蛋白鉴定结果，条带大小约60kDa；(d) Fiber-2蛋白鉴定结果，条带大小约60kDa；(e)HA蛋白鉴定结果，条带大小 约70kDa。
图4为嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs的透射电镜图。
图5为嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs的免疫后抗体效价监 测图。
具体实施方式
本发明的新流法腺四联病毒样颗粒，是由新城疫病毒国内优势流行毒株 NA-1株的基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、H9N2禽流感病毒的血凝素蛋白(HA)、 法氏囊病毒的结构蛋白(VP2)以及禽血清4型腺病毒纤突蛋白(Fiber-2)组装 而成，具体为通过GPI锚定策略在以M蛋白为骨架形成的病毒样颗粒的表面展 示F蛋白、HA蛋白、VP2蛋白和Fiber-2蛋白，即将H9N2AIV HA蛋白、IBDV VP2蛋白和FAdV4 Fiber-2蛋白采用GPI锚定策略嵌合至VLPs囊膜表面；GPI 锚定蛋白是一种通过其羧基末端的GPI结构锚定于磷脂膜双分子层表面的蛋白。
本发明采用GPI锚定策略将HA蛋白、VP2蛋白和Fiber-2蛋白嵌合至NDV VLPs表面，具有蛋白量可精确定量、操作简单等优势。本发明经动物试验证实 其所制备的嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs具有较强的免疫原 性，能够诱导机体产生较高的抗体水平。该嵌合型病毒样颗粒不含有病毒核酸， 符合现代绿色、安全的养殖理念，并且具有免疫原性强、绿色、安全、高效、 适合大规模批量生产、免疫程序简单、可实现多方位免疫(细胞免疫、体液免 疫等)等优点，为新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒的联合防控及推动其净化提供了新思路。
本发明的新流法腺四联病毒样颗粒的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤一、目的基因的优化及合成
根据昆虫细胞密码子偏好性对NDVNA-1株的M基因和F基因、H9N2AIV 株的HA基因、IBD SH99株的VP2基因、HB 1510株的Fiber-2基因进行密码 子优化；M基因优化后序列如SEQ ID NO.1所示；F基因优化后序列如SEQ ID NO.2所示；HA基因优化后序列如SEQ IDNO.3所示；VP2基因优化后序列如 SEQ ID NO.4所示；Fiber-2基因优化后序列如SEQ IDNO.5所示；
步骤二、重组穿梭质粒的构建
根据各基因优化后序列和pFastbac-1载体信息设计特异性引物和M13鉴定 引物，利用PCR合成质粒，将合成的各个质粒分别进行双酶切并利用胶回收试 剂盒回收目的片段，将各目的片段分别连接至pFastbac1载体，转化至Escherichia coli DH5α感受态细胞中进行PCR及双酶切筛选，最终获得重组穿梭质粒 pFastbac1-M、pFastbac1-F、pFastbac1-GPI-HA、pFastbac1-GPI-VP2和 pFastbac1-GPI-Fiber-2；
步骤三、重组杆粒的构建
将步骤二构建的各重组穿梭质粒分别转化至Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞中进行同源重组，涂板于三抗固体选择平板，37℃过夜培养，挑取纯净 白斑，利用步骤二设计的特异性引物及M13鉴定引物进行PCR鉴定，将鉴定正 确的阳性菌液质粒再次涂板于三抗固体选择平板，反复筛选，直至阳性率为 100％，最终获得重组杆粒rBacmid-M、rBacmid-F、rBacmid-GPI-HA、 rBacmid-GPI-VP2和rBacmid-GPI-Fiber-2；
步骤四、重组杆状病毒的拯救
采取脂质体介导转染方式，将步骤三构建的各重组杆粒分别转染至昆虫杆 状病毒表达系统中，盲传三代收获上清，利用步骤二设计的特异性引物及M13 鉴定引物进行PCR鉴定，最终获得重组杆状病毒rBV-M、rBV-F、rBV-GPI-HA、 rBV-GPI-VP2和rBV-GPI-Fiber-2；
步骤五、嵌合病毒样颗粒的制备及纯化
将步骤四构建的重组杆状病毒rBV-M、rBV-F、rBV-GPI-HA、rBV-GPI-VP2 和rBV-GPI-Fiber-2按照总MOI＝5的比例接种至昆虫杆状病毒表达系统中，收集 细胞上清；采用蔗糖密度梯度进行纯化，最终获得嵌合病毒样颗粒 NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整 地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实 施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前 提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在介绍具体实施例前，对下述实施例中所涉及部分实验原理、生物材料、 实验设备情况简要介绍说明如下。
生物样品：E.coli DH5α感受态细胞、E.coli DH10bac感受态细胞、昆虫sf9 细胞、pFastbac1载体均由吉林大学预防兽医学传染病实验室冻存；SPF鸡胚购 自北京勃林格殷格翰维通公司。
实验试剂：T4 DNA连接酶、
Figure BDA0002797347010000091
HiFi DNA聚合酶、核酸Marker、 BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；蛋白分子 Marker购自Thermo公司；DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自Axygen 公司；ECL化学发光检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；anti-His Tag mAb和HRP-goat-anti-mouse IgG均购自Sigma公司；Sf-900TM II昆虫细胞无血 清培养基、胎牛血清均购自Gibco公司；BacPAK杆状病毒滴度测定试剂盒购自 Takara公司；X-treme GENE HP DNA转染试剂购自Roche公司。
实验设备：电热恒温水槽购自上海一恒科学仪器有限公司；震荡培养箱购 自哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；细胞培养箱、冷冻高速离心机均购自 美国Thermo公司；蛋白电泳仪、PCR仪均购自美国BioRed公司。
实施例1目的基因的优化及合成
按照GenBank中公布的NDV NA-1株的M基因和F基因(GenBank登录 号：DQ659677)、A/chicken/Jilin/SJ150/2012(H9N2)株的HA基因(GenBank登 录号：KF886457.1)、IBDSH99株的VP2基因(GenBank登录号：LM651365.1)、 HB 1510株的Fiber-2基因(GenBank登录号：KU587519.1)，为提高嵌合病毒 样颗粒的表达量，根据昆虫细胞密码子偏好性进行密码子优化。同时根据 pFastbac-1载体信息分别在HA基因、VP-2基因和Fiber-2基因依次引入蜂素信 号肽序列、HIS标签序列、TEV切割序列和GPI信号肽序列。
优化后的序列由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
M基因优化后序列如SEQ ID NO.1所示。
F基因优化后序列如SEQ ID NO.2所示。
HA基因优化后序列如SEQ ID NO.3所示。
VP2基因优化后序列如SEQ ID NO.4所示。
Fiber-2基因优化后序列如SEQ ID NO.5所示。
实施例2重组穿梭质粒的构建
(1)引物设计
根据M基因优化后序列SEQ ID NO.1、F基因优化后序列SEQ ID NO.2、 HA基因优化后序列SEQ ID NO.3、VP2基因优化后序列SEQ ID NO.4、Fiber-2 基因优化后序列SEQ IDNO.5以及pFastbac-1载体信息设计特异性引物，并设 计M13鉴定引物，特异性引物序列如下所示：
M-Xba I-F：5’-TCTAGAATGGATAGCAGTCGTACGATTGGC-3’，
M-HindIII-R：5’-AAGCTTTTATTTTCTGAATGGATTGTATTTCGCG-3’；
F-Xba I-F：5’-TCTAGAGGATCCTTGTGGAAGGTTTTGATCCCAT-3’，
F-Kpn I-R：5’-GGTACCTTAAGCACGAGTAGTTGCGCG-3’；
HA-Xba I-F：5’-TCTAGAATGGAACAGGTGTCGCTC-3’，
HA-Kpn I-R：5’-GAGCTCTTAGATACAGATGTTACACCTACACG-3’；
VP2-Sac I-F：5’-GAGCTCGCCACCATGAAGTTCC-3’，
VP2-HindIII-R：5’-AAGCTTTTAGGTCAGCAGACCCATGGTC-3’；
Fiber-2-BamHI-F：5’-GGATCCGCCACCATGAAGTTCCT-3’，
Fiber-2-Kpn I-R：5’-GGTACCTTAGGTCAGCAGGCCCATG-3’；
M13鉴定引物序列如下：
M13-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’，
M13-R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。
(2)基因扩增及鉴定
PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、58℃退火45秒、 72℃延伸1分钟，总计30个循环；72℃再延伸10分钟；PCR扩增产物进行1％ (m/v)琼脂糖凝胶电泳，并按需要进行胶回收纯化。
(3)含有各病毒优化后基因的重组穿梭质粒的构建
将步骤(2)合成的各质粒和pFastbac1载体质粒分别按照预设的酶切位点 (M基因对应的酶切位点为Xba I-F和HindIII；F基因对应的酶切位点为Xba I 和Kpn I；HA基因对应的酶切位点为Xba I和Kpn I；VP2基因对应的酶切位点 为Sac I和HindIII；Fiber-2基因对应的酶切位点为BamHI和Kpn I)进行双酶 切，其中M基因相关质粒采用Xba I和HindIII限制性内切酶、F基因相关质粒 采用Xba I和Kpn I限制性内切酶、HA基因相关质粒采用XbaI和Kpn I限制性 内切酶、VP2相关质粒采用Sac I和HindIII限制性内切酶、Fiber-2基因采用BamH I和Kpn I限制性内切酶。酶切体系为：质粒20μL、ddH2O 20μL、酶各2μL、 Buffer 6μL，37℃反应1h后进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒回收M基 因、F基因、HA基因、VP2基因及Fiber-2基因，随后与pFastbac1载体进行连 接，连接体系为：pFastbac1载体1.5μL、目的基因6.5μL、T4DNA连接酶1μL、Buffer2μL，25℃反应30min后转化至Escherichia coliDH5α感受态细胞中，涂 板于Kan(100μg/mL)筛选选择平板，37℃过夜培养，挑取单菌落按照上述步 骤(2)的PCR反应程序进行菌液PCR筛选，提取鉴定正确的阳性菌液质粒利 用双酶切进行鉴定。
结果如图1所示，通过图1中a可知，pFastbac1载体片段大小约4700bp， M基因片段大小约1100bp；通过图1中b可知，pFastbac1载体片段大小约4700 bp，F基因片段大小约1660bp；通过图1中c可知，pFastbac1载体片段大小约 4700bp，GPI-VP2片段大小约1640bp；通过图1中d可知，pFastbac1载体片 段大小约4700bp，GPI-Fiber-2片段大小约1725bp；通过图1中e可知，pFastbac1 载体片段大小约4700bp，GPI-HA片段大小约1960bp。结果与预期条带相符， 表明重组穿梭质粒pFastbac1-M、重组穿梭质粒pFastbac1-F、重组穿梭质粒pFastbac1-GPI-HA、重组穿梭质粒pFastbac1-GPI-VP2和重组穿梭质粒 pFastbac1-GPI-Fiber-2构建成功。
实施例3重组杆状病毒的构建
(1)重组杆粒的构建
将实施例2中构建的各重组穿梭质粒分别转化至Escherichia coli DH10 Bac 感受态细胞中，42℃热激后加入1mL无抗液体LB培养基，置于30℃培养3h， 涂板于三抗固体选择平板(100μg/mL X-gal、40μg/mL IPTG、20μg/mL TET、 30μg/mL GM、100μg/mL Kan)，37℃过夜培养，挑取纯净的白斑，利用特异性 引物(见实施例2)及M13鉴定引物(见实施例2)进行PCR鉴定。该PCR反 应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、55℃退火45秒、72℃延伸150 秒，总计30个循环；72℃再延伸10分钟。
将鉴定正确的阳性菌液质粒再次涂板于三抗固体选择平板(100μg/mL X-gal、40μg/mL IPTG、20μg/mL TET、30μg/mL GM、100μg/mL Kan)，挑取 纯净的白斑，按照上述相同方式进行鉴定，反复筛选2-3次，直至阳性率为100％， 指示完全同源重组，表明重组杆粒rBacmid-M、重组杆粒rBacmid-F、重组杆粒 rBacmid-GPI-HA、重组杆粒rBacmid-GPI-VP2和重组杆粒rBacmid-GPI-Fiber-2 构建成功。
(2)重组杆状病毒的拯救
采用脂质体介导转染方式，提取各重组杆粒并进行无类毒素处理，按照 X-tremeGENEHP DNATransfection Reagent操作说明书将重组杆粒rBacmid-M、 重组杆粒rBacmid-F、重组杆粒rBacmid-GPI-HA、重组杆粒rBacmid-GPI-VP2 和重组杆粒rBacmid-GPI-Fiber-2分别转化至密度为70-80％的贴壁的昆虫sf9细 胞中，27℃培养72-96h后收取细胞上清即为P1代重组杆状病毒，盲传3代以 后提取病毒基因组，利用特异性引物(见实施例2)及M13鉴定引物(见实施 例2)进行PCR鉴定。该PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、55℃退火45秒、72℃延伸150秒，总计30个循环；72℃再延伸10分钟。
结果如图2所示，通过图2中a可知，M13鉴定引物扩增片段约3600bp， M基因特异性引物扩增片段约1100bp；通过图2中b可知，M13鉴定引物扩增 片段约4160bp，F基因特异性引物扩增片段约1660bp；通过图2中c可知， M13鉴定引物扩增片段约4140bp，GPI-VP2基因特异性引物扩增片段约1640 bp；通过图2中d可知，M13鉴定引物扩增片段约4250bp，GPI-Fiber-2基因特 异性引物扩增片段约1725bp；通过图2中e可知，M13鉴定引物扩增片段约4460 bp，GPI-HA基因特异性引物扩增片段约1725bp。结果与预期条带相符，表明 重组杆状病毒rBV-M、重组杆状病毒rBV-F、重组杆状病毒rBV-GPI-HA、重组 杆状病毒rBV-GPI-VP2和重组杆状病毒rBV-GPI-Fiber-2构建成功。
实施例4嵌合病毒样颗粒的制备及纯化
(1)嵌合病毒样颗粒的制备
按照BacPAK杆状病毒滴度测定试剂盒说明书，测定重组杆状病毒rBV-M、 重组杆状病毒rBV-F、重组杆状病毒rBV-GPI-HA、重组杆状病毒rBV-GPI-VP2 和重组杆状病毒rBV-GPI-Fiber-2的病毒滴度，以总MOI＝5(其中，重组杆状病 毒rBV-M、重组杆状病毒rBV-F、重组杆状病毒rBV-GPI-HA、重组杆状病毒 rBV-GPI-VP2和重组杆状病毒rBV-GPI-Fiber-2的病毒滴度比例为5:1.5:1.5:1:1) 接种至密度为2×106个/mL的悬浮的昆虫sf9细胞中，28℃、120r/min震荡培养 72h后，4℃、8000×g离心收集含有嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs的培养上清。
(2)嵌合病毒样颗粒的纯化
采用蔗糖密度梯度离心对嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs进 行纯化。具体为：将培养上清4℃、100000×g离心2h，小心弃掉培养上清，利 用适量PBS进行重悬，4℃过夜溶解，次日分别依次铺垫60％、40％和20％的蔗 糖，随后将过夜溶解的嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs小心加至 不同蔗糖密度梯度层上，4℃、100000×g离心1.5h，小心吸取40％与60％蔗糖 层中间的白色颗粒层，加入适量PBS进行稀释溶解，4℃、100000g离心2h， 利用适量PBS进行溶解纯化的嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4cVLPs， 并利用透射电镜和Wetern blot进行鉴定，分析嵌合病毒样颗粒 NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs的各组分蛋白。
嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs的各组分蛋白免疫印迹鉴定 结果如图3所示，通过图3中a可知，M蛋白条带大小约40kDa；通过图3中 b可知，F蛋白条带大小59kDa；通过图3中c可知，VP2蛋白条带大小约60kDa； 通过图3中d可知，Fiber-2蛋白条带大小约60kDa；通过图3中e可知，HA 蛋白条带大小约70kDa。结果与预期条带相符。
嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs的透射电镜结果如图4所 示。通过图4可知，本发明制备的嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs 是与真实病毒类似的椭圆形粒子，表面嵌合病毒样颗粒组装成功。
实施例5嵌合病毒样颗粒的应用
(1)免疫方案制定
将20只SPF小鸡随机分为2组，每组10只，采用肌肉注射方式评价嵌合 病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs的免疫原性。具体为：将600μg(1.2 mL)嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs缓慢滴加至1.2mL弗氏完 全佐剂，磁力搅拌乳化30分钟，取200μL(50μg)孵化完全的嵌合病毒样颗 粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs肌肉注射7日龄SPF小鸡，21日龄进行加强 免疫，期间每周分离血清置于-40℃备用。
(2)ELISA抗体效价的测定
将嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs按照1μg/孔(100μL)过 夜包被于ELISA板固相载体中；利用1％脱脂奶粉37℃封闭90分钟；加入1:2000 稀释的待检血清样品，37℃孵育90分钟；加入1:4000稀释的HRP标记抗鸡IgG 二抗，37℃孵育60分钟；期间每步均弃掉上清加入200μL的0.5％的PBST清 洗3次，每次5分钟；加入100μL可溶型单组分TMB底物溶液，37℃显色15 分钟后，加入50μL的2M硫酸终止反应；在提前预热的酶标仪中读取OD450 数值。
结果如图5所示，免疫后产生的抗体效价随时间增加而增高，并且在二免 后4周达到峰值，免疫后鸡体内能够快速产生针对嵌合病毒样颗粒 NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs的抗体，表明嵌合病毒样颗粒 NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs具有较高的免疫原性，可作为预防新流法腺的新 型疫苗候选。
本发明公开了一种新流法腺四联病毒样颗粒及其制备方法和应用，本领域 技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所 有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括 在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在 不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组 合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 新流法腺四联病毒样颗粒及其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggatagca gtcgtacgat tggcttgtac ttcgactccg ccttgccatc gtcgtcgctg 60
ttggctttcc ctattgtgct ccaagacacc ggcgatggta aaaagcagat aactccccag 120
tacaggatcc aaaggcttga ttcgtggacc gactccaaag aagattccgt cttcatcacg 180
acctatggtt tcatctttca gatcggtaac gaagaggcca cagttggagt gatcaatgac 240
aaccctcgtc acgaattgct gagttctgca atgctctgct tgggatcggt ccccaacgac 300
ggtgaccttg tggaactggc cagggcttgc ctgacaatgg tggttacgag gaaaaagtcc 360
gctaccaata ccgagaggat tgttttctcg gtggtccaag cgcctagagt cctccagtca 420
tgcatggtag tcgctaaccg ctacagcagc gtcaacgctg tcaaacacgt taaggcacca 480
gaaaaaatcc ctggaagcgg taccctggag tataaggtaa atttcgtttc actcacagta 540
gttccccgta gagacgtcta ccgcatcccc acggcagtgc ttaaagtatc gggctctagc 600
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<211> 1662
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ctgatccagg caaaccagaa cgcagcaaac atcctgcgta tcaaggaatc aattgcggca 480
actaacgaag ctgtccacga ggttaccgac ggactcagtc aactgtcggt ggccgtcggc 540
aagatgcagc aattcgtgaa cgaccagttt aacaatacag ctcgcgagct ggattgcatt 600
aagattacac aacaggtcgg tgtcgagctg aatctgtacc tcactgagtt gactacagta 660
tttggccccc agataacctc accagctctc acgcagctta cgattcaggc actgtataac 720
ttggccggcg gtaacatgga ctacctgctg accaagttgg gaatcggcaa caaccaactc 780
agctctctga tcggtagtgg tctgattaca ggctacccta ttctgtacga ctctcagacc 840
caactcctgg gaattcaagt aaacctgccc agtgtaggta acctcaacaa tatgcgtgcg 900
acctacttgg agactcttag tgtcagcacc acaaagggat acgctagtgc cctcgtacct 960
aaagtggtta cccaggtcgg ttcggttatt gaggaactgg atacaagcta ctgcatcgag 1020
tcagaccttg atttgtactg tacacgtatc gtgacattcc ctatgagtcc tggcatctat 1080
tcctgtttgt ctggtaatac gtcagcgtgt atgtactcca agaccgaagg cgctttgaca 1140
actccataca tggctttgaa gggctcagta atcgctaatt gcaagataac gacgtgcagg 1200
tgtgcagacc ctcctggtat catttcacag aactacggcg aggccgtgtc actgatagat 1260
agacactcgt gtaacgtctt gagcctggac ggaattacct tgaggcttag cggcgagttc 1320
gacgctacat accagaagaa catctcaatt cttgacagtc aggttattgt tactggaaac 1380
ttggacatta gtaccgagct tggcaacgtg aacaactcca tttcgaacgc cctcgaccgc 1440
cttgccgaat ctaactcaaa actggacaaa gtgaacgtcc gccttacctc gacctcggct 1500
ctcataacct acatcgtcct cacggttata tccctcgtct tcggtgcgtt gtctctcgtg 1560
ctcgcttgct acttgatgta taagcaaaag gcacagcaaa aaacgctgtt gtggctcggt 1620
aacaacacac tggatcaaat gcgcgcaact actcgtgctt aa 1662
<210> 3
<211> 1683
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaacagg tgtcgctcat cactattctc ctcgtcgtta cagtcagcaa cgcggataaa 60
atctgcatcg gataccaatc aaccaactcc actgagacag tggacacgct gaccgaaaac 120
aacgtgccag tcacgcacgc taaggagctg ctccacaccg aacataacgg aatgctctgc 180
gccactagtt tgggtcatcc tctgattctc gacacttgca caatcgaggg cttgatttac 240
ggaaacccct cgtgtgattt gctgctcggt ggcagggagt ggtcctacat cgttgaaaga 300
cctagcgctg tgaacggact gtgctacccc ggtaacgttg aaaacctcga ggaattgcgc 360
tctctgttct ccagcgcccg ctcataccag cgtatccaaa ttttccctga cacgatctgg 420
aacgtctcct acagcggtac ttccaaggcc tgttctgatt cattctaccg cagcatgcgt 480
tggctgacac agaaaaacaa cgcttacccc atccaggacg cccaatacac caacaaccaa 540
gagaagaaca tcctcttcat gtggggcatt aaccaccctc ccacggacac cgttcagacc 600
aacttgtaca ctcgcacaga taccactaca agcgtggcta ctgaggaaat taacaggaca 660
ttcaagcctc tcatcggacc aagaccgctc gtgaacggct tgcagggacg catcgactac 720
tactggtccg tcctgaagcc aggtcaaact ctcaggatca gaagcaacgg caacctcatt 780
gctccgtggt acggacacat cttgagtgga gagtcgcatg gccgcatcct gaagacagat 840
ctcaaacgtg gatcctgcac tgtgcagtgt caaacagaaa agggaggttt gaacacgacc 900
ctgccattcc agaacgtcag caagtacgca ttcggcaact gcagtaaata catcggaatt 960
aagtcgttga aactggcggt gggcttgcgt aacgtcccga gtaggtcttc aagaggtctg 1020
ttcggcgcaa tcgcgggttt cattgagggc ggatggtctg gcctggtcgc aggatggtac 1080
ggtttccagc actcaaacga ccaaggtgtt ggcatggctg ccgacaggga ttctactcag 1140
aaggccatcg ataaaattac atcaaaggtc aacaacatcg ttgacaagat gaaccgtcaa 1200
tacgagatca ttgatcatga attctcagag ttcgaaacta ggctcaacat gatcaacaac 1260
aagattgacg atcagatcca agacatttgg gcttacaacg ccgagttgct ggtgctcttg 1320
gaaaaccaga aaaccttgga cgagcacgat gctaacgtca acaacttgta caacaaggtt 1380
aaacgtgcac tgggctctaa cgcggtcgag gacggaaagg gttgtttcga actgtaccac 1440
aaatgcgacg atcattgtat ggaaacgatc agaaacggaa cctacaaccg ccgtaagtac 1500
caggaggaat caaaactcga gcgccaaaag gttgaaggtg tgaaactgga gagtgaaggc 1560
acctacaaga tcctcacgat ttactcgacc gtggcaagtt cgctgatgat cgcgatgggt 1620
ttcgcagcct tcctcttctg ggcaatgagc aacggttcgt gtaggtgtaa catctgtatc 1680
taa 1683
<210> 4
<211> 1644
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagctcgcca ccatgaagtt cctggtgaac gtggccctgg tgttcatggt ggtgtacatc 60
tcctacatct acgctgaccg ttggggccat caccaccacc accacgacta cgacatccct 120
accaccgaaa acctgtactt ccagggcaag ggtagctcta gaatgactaa cctgcaggac 180
cagacacaac agatcgtgcc tttcatccgc tccctcctga tgccaactac aggacctgct 240
tccatccctg acgacaccct cgagaagcac acactgcgtt cagaaacaag cacatacaac 300
ctgaccgtcg gcgacaccgg cagcggcctc atcgtgttct tccccggctt tcccggtagc 360
atcgtgggcg ctcactacac tctgcagagc aacggtaact ataagttcga ccagatgctg 420
ctgaccgctc aaaacctccc agctagttac aactactgta ggctggtgag ccgctccctg 480
actgtgagat cctccacatt gcctggcggt gtgtacgccc tgaacggaac aatcaacgcc 540
gtgaccttcc aaggtagcct gagtgagctg actgacgttt cttacaacgg cctgatgtcc 600
gctactgcta acatcaacga caagattggt aacgtgctgg tgggtgaggg cgttaccgtg 660
ctctccctcc ccaccagtta cgacctcgga tacgtgcgcc tcggcgaccc aatccctgct 720
atcggcctgg accccaagat ggttgccact tgcgactcca gcgaccgccc tcgtgtctac 780
accatcactg ccgccgacga ctaccagttc agtagccagt accaggccgg tggcgtcaca 840
atcacattgt ttagcgctaa catcgacgct atcacttctt tgagtatcgg cggtgaactg 900
gttttccaga catctgttca gggactgatc ctgggcgcta caatctactt gatcggattc 960
gacggtactg ctgttatcac ccgtgctgtg gctgccgaca acggtctgac tgctggcact 1020
gacaacctga tgcctttcaa catcgtgatc ccaacctccg agatcactca gccaatcacc 1080
tccatcaagc tcgagatcgt gacatctaag tcaggaggtc aagccggcga ccagatgagc 1140
tggtctgcca gcggtagcct ggctgtgact atccatggcg gtaactaccc cggtgccctg 1200
cgccctgtga ccctggtcgc ttacgaacgc gtcgccacag gttctgtcgt gacagtggcc 1260
ggtgtttcca acttcgaact gatcccaaac cctgagctgg ccaagaacct agtcaccgaa 1320
tacggtcgtt tcgaccccgg tgccatgaac tacactaagc tgatcctgag cgagagggac 1380
cgtttgggta tcaagaccgt gtggcccaca cgtgaataca ctgacttccg tgaatacttc 1440
atggaagtcg ctgacctgaa cagccctctg aagatcgccg gcgctttcgg cttcaaggac 1500
atcatcaggg ccctgcgcgg tacccctaac aagggtagcg gcaccacctc cggcacaacc 1560
cgcctgctga gcggtatgac ctgtttcacc ctgaccggcc tgctgggtac tctggtgacc 1620
atgggtctgc tgacctaaaa gctt 1644
<210> 5
<211> 1725
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggatccgcca ccatgaagtt cctggtgaac gtggctctgg tgttcatggt ggtgtacatc 60
agctacatct acgctgaccg ttggggtcac caccaccacc accatgacta cgacatccct 120
accaccgaga acctgtactt ccagggcaag ggtagcgagc tcatgctgcg cgcccctaag 180
cgtcgtcact ccgaaaacgg aaagcctgaa actgaagctg gaccttcccc cgctcctatc 240
aagcgcgcta aacgcatggt ccgtgcttct cagctggacc tggtgtaccc ttttgactac 300
gttgctgacc cagtcggcgg cctcaaccct ccattcttgg gtggttccgg ccctttggtt 360
gaccaaggtg gtcagctgac cctcaacgtg acagacccta tcatcattaa gaacagatcc 420
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gacctcgaaa ttaaccctaa catgttcacc gtcaacacca gcaccggttc tggcgtgctg 780
gagctgaacc tcaaggccca aggcggcatc caagccgact ccagcggcgt gggcgtgagt 840
gtggatgaat ctctccagat cgtgaacaac acactggaag tgaagcctga cccctccggc 900
ccattgacag tctcagccaa cggcctggga ctcaaatacg acacaaacac cctcgctgtg 960
acagccggcg ctctcaccgt cgtcggtggc ggctccgtca gcacaccaat tgccacattc 1020
gtgagcggtt ccccctccct gaacacttac aacgccacaa ctgttaactc atccgctaac 1080
gcttttagct gcgcttacta cctccaacaa tggaacatcc agggactgct ggtgactagc 1140
ctctacctga agctggattc agctactatg ggtaacaggc caggagacct gaactctgcc 1200
aacgctaagt ggttcacctt ctgggtgtcc gcttacctgc agcagtgtaa cccatcagga 1260
atccaagctg gcacagttag cccatccacc gccacattga ctgacttcga acccatggct 1320
aaccgtagcg tgaccagccc ctggacttac tccgctaacg gatactacga gccctctatc 1380
ggtgagttcc aagtgttctc cccagtcgtg accggagctt ggaaccctgg taacatcggc 1440
atccgtgtgc tccccgtgcc agttagcgct agcggtgagc gttacaccct cctctgttac 1500
tccctgcagt gtactaacgc cagcatcttc aaccctaaca acagcggcac catgatcgtc 1560
ggcccagtgt tgtactcttg cccagccgcc tccctgcccc tcgagcctaa caagggtagc 1620
ggcaccacct ccggcaccac ccgtctgctg agcggtatga cctgtttcac cctgaccggt 1680
ctgctgggta ctctggtgac catgggcctg ctgacctaag gtacc 1725

Claims (10)

1.新流法腺四联病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、目的基因的优化及合成
根据昆虫细胞密码子偏好性对NDVNA-1株的M基因和F基因、H9N2AIV株的HA基因、IBDSH99株的VP2基因、HB 1510株的Fiber-2基因进行密码子优化；M基因优化后序列如SEQ IDNO.1所示；F基因优化后序列如SEQ ID NO.2所示；HA基因优化后序列如SEQ ID NO.3所示；VP2基因优化后序列如SEQ ID NO.4所示；Fiber-2基因优化后序列如SEQ ID NO.5所示；
步骤二、重组穿梭质粒的构建
根据各基因优化后序列和pFastbac-1载体信息设计特异性引物和M13鉴定引物，利用PCR进行基因扩增及鉴定，将合成的各个质粒分别进行双酶切并利用胶回收试剂盒回收目的片段，将各目的片段分别连接至pFastbac1载体，转化至Escherichia coli DH5α感受态细胞中进行PCR及双酶切筛选，最终获得重组穿梭质粒pFastbac1-M、pFastbac1-F、pFastbac1-GPI-HA、pFastbac1-GPI-VP2和pFastbac1-GPI-Fiber-2；
步骤三、重组杆粒的构建
将步骤二构建的各重组穿梭质粒分别转化至Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞中进行同源重组，涂板于三抗固体选择平板，37℃过夜培养，挑取纯净白斑，利用步骤二设计的特异性引物及M13鉴定引物进行PCR鉴定，将鉴定正确的阳性菌液质粒再次涂板于三抗固体选择平板，反复筛选，直至阳性率为100％，最终获得重组杆粒rBacmid-M、rBacmid-F、rBacmid-GPI-HA、rBacmid-GPI-VP2和rBacmid-GPI-Fiber-2；
步骤四、重组杆状病毒的拯救
采取脂质体介导转染方式，将步骤三构建的各重组杆粒分别转染至昆虫杆状病毒表达系统中，盲传三代收获上清，利用步骤二设计的特异性引物及M13鉴定引物进行PCR鉴定，最终获得重组杆状病毒rBV-M、rBV-F、rBV-GPI-HA、rBV-GPI-VP2和rBV-GPI-Fiber-2；
步骤五、嵌合病毒样颗粒的制备及纯化
将步骤四构建的重组杆状病毒rBV-M、rBV-F、rBV-GPI-HA、rBV-GPI-VP2和rBV-GPI-Fiber-2按照总MOI＝5的比例接种至昆虫杆状病毒表达系统中，收集细胞上清；采用蔗糖密度梯度进行纯化，最终获得嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，根据pFastbac-1载体信息分别在HA基因、VP-2基因和Fiber-2基因依次引入蜂素信号肽序列、HIS标签序列、TEV切割序列和GPI信号肽序列。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述特异性引物序列如下：
M-Xba I-F：5’-TCTAGAATGGATAGCAGTCGTACGATTGGC-3’，
M-Hind III-R：5’-AAGCTTTTATTTTCTGAATGGATTGTATTTCGCG-3’；
F-Xba I-F：5’-TCTAGAGGATCCTTGTGGAAGGTTTTGATCCCAT-3’，
F-Kpn I-R：5’-GGTACCTTAAGCACGAGTAGTTGCGCG-3’；
HA-Xba I-F：5’-TCTAGAATGGAACAGGTGTCGCTC-3’，
HA-Kpn I-R：5’-GAGCTCTTAGATACAGATGTTACACCTACACG-3’；
VP2-Sac I-F：5’-GAGCTCGCCACCATGAAGTTCC-3’，
VP2-Hind III-R：5’-AAGCTTTTAGGTCAGCAGACCCATGGTC-3’；
Fiber-2-BamH I-F：5’-GGATCCGCCACCATGAAGTTCCT-3’，
Fiber-2-Kpn I-R：5’-GGTACCTTAGGTCAGCAGGCCCATG-3’；
所述M13鉴定引物序列如下：
M13-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’，
M13-R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，利用PCR进行基因扩增及鉴定，PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、58℃退火45秒、72℃延伸1分钟，总计30个循环；72℃再延伸10分钟。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，将合成的各个质粒分别进行双酶切并利用胶回收试剂盒回收目的片段，酶切体系为：质粒20μL、ddH2O 20μL、酶各2μL、Buffer 6μL，37℃反应1h后进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒回收M基因、F基因、HA基因、VP2基因及Fiber-2基因。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，将各目的片段分别连接至pFastbac1载体，连接体系为：pFastbac1载体1.5μL、目的基因6.5μL、T4DNA连接酶1μL、Buffer 2μL，25℃反应30min后转化至Escherichia coli DH5α感受态细胞中，涂板于Kan筛选选择平板，37℃过夜培养，挑取单菌落进行PCR鉴定，PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、58℃退火45秒、72℃延伸1分钟，总计30个循环；72℃再延伸10分钟；提取鉴定正确的阳性菌液质粒利用双酶切进行鉴定。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三的具体过程如下：将构建的各重组穿梭质粒分别转化至Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞中，42℃热激后加入1mL无抗液体LB培养基，置于30℃培养3h，涂板于三抗固体选择平板，该三抗固体选择平板含有100μg/mL X-gal、40μg/mL IPTG、20μg/mL TET、30μg/mL GM和100μg/mL Kan，37℃过夜培养，挑取纯净白斑，利用步骤二设计的特异性引物及M13鉴定引物进行PCR鉴定，PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、55℃退火45秒、72℃延伸150秒，总计30个循环；72℃再延伸10分钟。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述昆虫杆状病毒表达系统为昆虫sf9细胞、昆虫High Five细胞或昆虫Sf21细胞，将步骤三构建的各重组杆粒分别转化至密度为70-80％的贴壁昆虫sf9细胞中，27℃培养72-96h后收取细胞上清即为P1代重组杆状病毒，盲传3代以后提取病毒基因组，利用步骤二设计的特异性引物及M13鉴定引物进行PCR鉴定，PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、55℃退火45秒、72℃延伸150秒，总计30个循环；72℃再延伸10分钟；步骤五中，所述昆虫杆状病毒表达系统为昆虫sf9细胞、昆虫High Five细胞或昆虫Sf21细胞，将步骤四构建的各重组杆状病毒按照rBV-M、rBV-F、rBV-GPI-HA、rBV-GPI-VP2、rBV-GPI-Fiber-2的病毒滴度比例为5:1.5:1.5:1:1的比例接种至密度为2×106个/mL的悬浮的昆虫sf9细胞中，28℃、120r/min震荡培养72h后，4℃、8000×g离心收集含有嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs的培养上清。
9.如权利要求1至8中任意一项所述的制备方法制备的新流法腺四联病毒样颗粒。
10.如权利要求9所述的新流法腺四联病毒样颗粒在制备用于预防禽类新城疫病毒、禽流感病毒、法氏囊病毒和禽血清4型腺病毒疫苗中的应用。
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