CN116217738A - 禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒及其制备方法和应用，属于病毒多价新型疫苗研发领域，该嵌合病毒样颗粒以新城疫病毒NA‑1株基质蛋白M为骨架，将Ⅰ群血清4型禽腺病毒的Fiber‑2蛋白及Ⅰ群血清8a型、8b型、11型禽腺病毒的Fiber蛋白分别嵌合于新城疫病毒样颗粒载体NDVVLPs表面，得到该禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒。该嵌合病毒样颗粒腺病毒保护全面，1次免疫可预防两类禽类疫病，疫苗免疫次数减少，可保护I群禽腺病毒4个血清型，一针多防，简化疫苗免疫程序，降本增效，免疫原性好，有利于助力家禽养殖业防控4型、8a型、8b型及11型禽腺病毒，巩固鸡群固有免疫系统，符合现代养殖理念。

Description

禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于病毒多价新型疫苗研发技术领域，具体涉及一种禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
I群禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAV-I)对各日龄、各种禽类均易感，导致其生产性能下降和不同程度地死亡，给养禽业带来了巨大的经济损失。根据群特异性抗原可将FAV-I分为A、B、C、D和E共5个种、12个血清型。C(血清4型)禽腺病毒处于优势流行地位，主要引起心包积水综合征；E(血清8a型和8b型)禽腺病毒病毒株分离率日益增加，主要引起包涵体肝；同时D(血清11型)禽腺病毒病毒株分离也时有报导。伴随更多血清型出现，禽腺病毒病总体以新发动物传染病的形式流行。
经批准的鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病(Ⅰ群血清4型禽腺病毒)三联灭活疫苗(LaSota株+YBF13株+YBAV-4株)为我国第一个禽腺病毒病疫苗，但单基因型灭活疫苗无法满足当前的多基因型禽腺病毒病的防控形式。因此急需研制一种与当前流行毒株相匹配、绿色、安全且可“一针多防”的多联多价新型疫苗。Ⅰ群血清4型禽腺病毒(Fowladenovirus serotype-4，FAdV-4)的纤维蛋白Fiber-2、Ⅰ群血清8型禽腺病毒(Fowladenovirus serotyp e-8，FAdV-8)和Ⅰ群血清11型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype-11，FAdV-11)的纤维蛋白Fiber均是禽腺病毒连接细胞的受体，决定着毒力的变化，同时也是主要保护性抗原蛋白。大量国内外研究表明Fiber-2蛋白(F4型)和Fiber蛋白(F8a型、F8b型、F11型)具有成为预防FAdV-4、FAdV-8、FAdV-11的亚单位疫苗的潜力，但如何提高其免疫原性尤其是诱导细胞免疫应答的能力对预防胞内复制的病毒性疾病至关重要。
病毒样颗粒(Virus Like Particles，VLPs)是由一个或多个具有自组装能力的不同分子组成的病毒衍生结构，具有自组装能力，与病毒的结构和大小相似，无遗传物质，无法感染宿主细胞能力。病毒结构蛋白的表达和自组装可以在各种活的或无细胞的表达系统中完成，病毒结构可以组装和重建。VLP具有高度的免疫原性，能够通过不同于传统灭活病毒疫苗诱导的途径引发抗体和细胞介导的免疫反应。安全、无污染，保护养殖生态环境，是国际化新型疫苗研发的趋势。新城疫病毒样颗粒载体(Newcastle disease virus-likeparticles，NDV VL Ps)是以新城疫病毒NA-1株的基质蛋白M为骨架装配而成的空心蛋白颗粒。
发明内容
针对现有单基因型灭活疫苗无法满足当前的多基因型禽腺病毒病的防控形式，本发明提供一种禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒及其制备方法和应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒，以新城疫病毒NA-1株的基质蛋白M为骨架，将Ⅰ群血清4型禽腺病毒的Fiber-2蛋白、Ⅰ群血清8a型禽腺病毒的Fiber蛋白、Ⅰ群血清8b型禽腺病毒的Fiber蛋白、Ⅰ群血清11型禽腺病毒的Fiber蛋白分别嵌合于新城疫病毒样颗粒载体NDV VLPs表面，得到该禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒，命名为FAdV4-8a-8b-11cVLPs。
作为优选的实施方式，所述Ⅰ群血清4型禽腺病毒的Fiber-2蛋白采用胞外域替换策略嵌合于新城疫病毒样颗粒载体NDV VLPs表面，即将新城疫病毒样颗粒载体NDV VLPs的F蛋白胞外域替换成Ⅰ群血清4型禽腺病毒的Fiber-2蛋白胞外域，通过overlap PCR将两者连接；所述Ⅰ群血清8a型禽腺病毒的Fiber蛋白、Ⅰ群血清8b型禽腺病毒的Fiber蛋白、Ⅰ群血清11型禽腺病毒的Fiber蛋白均采用GPI锚定策略嵌合于新城疫病毒样颗粒载体NDV VLPs表面。
本发明的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、目的基因的优化及合成；
步骤二、重组穿梭质粒的构建；
步骤三、重组杆粒的构建；
步骤四、重组杆状病毒的拯救；
步骤五、禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒的制备及纯化。
作为优选的实施方式，步骤一的具体操作步骤如下：
分别对基因Ⅶ型新城疫病毒M基因序列、Ⅰ群血清4型禽腺病毒HB1510株Fiber-2基因序列、Ⅰ群血清8a型禽腺病毒TR-59株Fiber基因序列、Ⅰ群血清8b型禽腺病毒764株Fiber基因序列、Ⅰ群血清11型禽腺病毒380株Fiber基因序列进行优化，优化后的M基因序列、F4基因序列、F8a基因序列、F8b基因序列、F11基因序列分别见SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5。
作为优选的实施方式，步骤二的具体操作步骤如下：
根据优化后的M基因序列、F4基因序列、F8a基因序列、F8b基因序列、F11基因序列和pFastbac-1载体信息、pFastbac-GPI载体信息设计目的基因特异性引物和M13通用鉴定引物，利用PCR进行基因扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确，再将合成的各个质粒分别进行双酶切，使用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，将回收的M基因和F4基因连接至pFastbac1载体，将回收的F8a基因、F8b基因、F11基因分别连接至pFastbac1-GPI载体，转化至DMT感受态细胞中进行PCR及双酶切筛选，获得重组穿梭质粒pFastbacl-M、pFastbac1-FcF4、pFastbac1-GPI-F8a、pFastbac1-GPI-F8b、pFastbac1-GPI-F11。
作为优选的实施方式，步骤三的具体操作步骤如下：
将构建的各重组穿梭质粒分别转化至Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞中进行同源重组，涂板于三抗固体选择平板进行培养，挑取白色单菌落，利用目的基因特异性引物和M13通用鉴定引物进行PCR鉴定，将鉴定正确的阳性菌液质粒再次涂板于三抗固体选择平板，反复进行筛选，直至阳性率为100％，获得重组杆粒rBacmid-M、rBacmid-FcF4、rBacmid-GPI-F8a、rBacmid-GPI-F8b、rBacmid-GPI-F11。
作为优选的实施方式，步骤四的具体操作步骤如下：
采取脂质体介导转染方式，将构建的各重组杆粒分别转染至昆虫杆状病毒表达系统中，悬浮盲传三代收取上清，提取病毒基因组，利用目的基因特异性引物和M13通用鉴定引物进行PCR鉴定，获得重组杆状病毒rBV-M、rBV-FcF4、rBV-GPI-F8a、rBV-GPI-F8b、rBV-GPI-F11。
作为优选的实施方式，步骤五的具体操作步骤如下：
将构建的重组杆状病毒rBV-M、rBV-FcF4、rBV-GPI-F8a、rBV-GPI-F8b、rBV-GPI-F11按照MOI＝1的比例接种于昆虫杆状病毒表达系统中进行培养；感染72h-96h后，收集上清，采用蔗糖密度梯度超速离心法进行纯化，获得禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs。
本发明的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒在制备禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒疫苗中的应用。
作为优选的实施方式，所述禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒疫苗用于预防将Ⅰ群血清4型禽腺病毒、Ⅰ群血清8a型禽腺病毒、Ⅰ群血清8b型禽腺病毒和Ⅰ群血清11型禽腺病毒。
本发明的有益效果是：
本发明针对现有单基因型灭活疫苗无法满足当前的多基因型禽腺病毒病的防控形式提供一种禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒及其制备方法和应用。本发明利用昆虫杆状病毒表达系统、病毒反向遗传操作系统、胞外域替换策略、GPI锚定策略以及靶基因筛选鉴定与嵌合策略等先进分子生物学技术，同时利用新城疫病毒样颗粒载体NDV VLPs的载体效应，在新城疫病毒样颗粒载体NDV VLPs表面展示Ⅰ群血清4型禽腺病毒的Fiber-2蛋白(F4)、Ⅰ群血清8a型禽腺病毒的Fiber蛋白(F8a)、Ⅰ群血清8b型禽腺病毒的Fiber蛋白(F8b)、Ⅰ群血清11型禽腺病毒的Fiber蛋白(F11)信息，以提高F4、F8a、F8b和F11的免疫原性，尤其是诱导细胞免疫应答的能力。
本发明制备的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs，腺病毒保护全面，禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒1次免疫可预防两类禽类疫病，减少了疫苗免疫次数，同时保护I群禽腺病毒4个血清型(4型、8a型、8b型、11型)，一针多防，简化疫苗免疫程序，降本增效，有利于助力家禽养殖业防控4型、8a型、8b型及11型禽腺病毒，巩固鸡群固有免疫系统，符合现代养殖理念，且可大规模悬浮培养及批量生产。同时，本发明制备的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs，具有免疫原性好，不含有病毒核酸，安全、绿色、高效，疫苗种毒与流行毒株匹配度高。
附图说明
图1为重组穿梭质粒双酶切结果。M：
Figure BDA0004071277650000041
Plus DNA Marker；(a)pFastbac1-M质粒双酶切结果；(b)pFastbac1-FcF4质粒双酶切结果；(c)pFastb ac1-GPI-F8a质粒双酶切结果；(d)pFastbac1-GPI-F8b质粒双酶切结果；(e)pF astbac1-GPI-F11质粒双酶切结果。
图2为重组杆状病毒基因组的特异性引物及M13通用鉴定引物的PCR扩增结果。M：
Figure BDA0004071277650000051
Plus DNA Marker；(a)重组杆状病毒rBV-M PCR扩增结果，甬道1为M基因特异性引物扩增片段约1100bp，甬道2为M13通用鉴定引物扩增片段约3600bp；(b)重组杆状病毒rBV-FcF4 PCR扩增结果，甬道1为FcF4基因特异性引物扩增片段约2000bp，甬道2为M13通用鉴定引物扩增片段约4500bp；(c)重组杆状病毒rBV-GPI-F8a PCR扩增结果，甬道1为GPI-F8a基因特异性引物扩增片段约1850bp，甬道2为M13通用鉴定引物扩增片段约4350bp；(d)重组杆状病毒rBV-GPI-F8b PCR扩增结果，甬道1为GPI-F8b基因特异性引物扩增片段约1850bp，甬道2为M13通用鉴定引物扩增片段约4350bp；(e)重组杆状病毒rBV-GPI-F11 PCR扩增结果，甬道1为GPI-F8b基因特异性引物扩增片段约1900bp，甬道2为M13通用鉴定引物扩增片段约4400bp。
图3为禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs的各重组杆状病毒表达蛋白的免疫印迹结果。(a)M蛋白条带；(b)FcF4蛋白条带；(c)F8a-GPI蛋白条带；(d)F8b-GPI蛋白条带；(e)F811-GPI蛋白条带。
图4为禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs的透射电镜图。
图5为禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs的免疫后抗体效价监测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在介绍具体实施例前，对下述实施例中所涉及部分实验原理、生物材料、实验设备情况简要介绍说明如下。
生物样品：E.coli DH10bac感受态细胞、sf9昆虫细胞、pFastbac1载体及pFastbac1-GPI载体均由吉林大学预防兽医学传染病实验室冻存；SPF鸡胚购自哈尔滨兽医研究所；DMT感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。
实验试剂：
Figure BDA0004071277650000061
-无缝克隆试剂盒、DNA Marker、EasyII蛋白定量试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；蛋白Marker购自赛默飞公司；DNA纯化回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司；BeyoECL Plus购自碧云天生物；鼠抗His标签抗体和HRP标记羊抗小鼠IgG(H+L)购自immunoway公司；Sf-900TMII昆虫细胞培养基购自Gibco公司；BacPAK杆状病毒滴度测定试剂盒购自宝生物工程有限公司；X-treme GENE HP DNA转染试剂购自Roche公司。
实验设备：-40℃冰箱购自上海力申科学仪器有限公司；凝胶成像系统和化学发光成像仪均购自上海天能生命科学有限公司；电热恒温水槽购自上海一恒科学仪器有限公司；细胞培养箱、冷冻高速离心机均购自美国赛默飞公司；蛋白电泳仪及转膜仪均购自美国BioRed公司；酶标仪购自美国BioTek公司。
实施例1目的基因的优化及合成
根据GenBank中公布的基因Ⅶ型新城疫病毒M基因(GenBank号：DQ659677)序列、Ⅰ群血清4型禽腺病毒HB1510株(GenBank号：KU587519.1)Fiber-2基因(命名为F4基因)序列、Ⅰ群血清8a型禽腺病毒TR-59株(GenBank号：KT862810)Fiber基因(命名为F8a基因)序列、Ⅰ群血清8b型禽腺病毒764株(GenBank号：KT862811)Fiber基因(命名为F8b基因)序列、Ⅰ群血清11型禽腺病毒380株(GenBank号：KT862812)Fiber基因(命名为F11基因)序列及昆虫细胞密码子偏好进行目的基因的优化，即根据pFastbac-1载体信息和pFastbac-GPI载体信息分别在F4基因、F8a基因、F8b基因、F11基因依次引入蜂素信号肽序列、TEV切割序列和GPI信号肽序列，进行人工合成；优化后的M基因序列信息如SEQ ID NO.1所示，优化后的F4基因序列信息如SEQ ID NO.2所示，优化后的F8a基因序列信息如SEQ ID NO.3所示，优化后的F8b基因序列信息如SEQ ID NO.4所示，优化后的F11基因序列信息如SEQIDNO.5所示；优化后的各基因序列由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例2重组穿梭质粒的构建
(1)引物设计
根据优化后M基因序列(SEQ ID NO.1)、优化后F4基因序列(SEQ ID NO.2)、优化后F8a基因序列(SEQ ID NO.3)、优化后F8b基因序列(SEQ ID NO.4)和优化后F11基因序列(SEQ ID NO.5)以及pFastbac-1载体信息、pFastbac-GPI载体信息，并参考
Figure BDA0004071277650000071
-无缝克隆试剂盒说明书设计目的基因特异性引物，并设计M13通用鉴定引物。
M基因特异性引物序列为：
M-EcoR I-F：5’-CCGAAGCGCGCGGAATTCGCCACCATGGATTCTTCTCGTA-3’，
M-Kpn I-R：5’-TACTTCTCGACAAGCTTGGTACCTTACTTGCGGAATGGGT-3’；
FcF4基因特异性引物序列为：
F4-BamH I-F：5’-ACCATCGGGCGCGGATCCGCCACCATGGACC-3’，
F4-Kpn I-R：5’-CTTCTCGACAAGCTTGGTACCTTAGGGGACACTCGCA-3’；
GPI-F8a基因特异性引物序列为：
F8a-Sal I-F：5’-GCTGCCTTTATTTGGGGTACCGCTCACGTCAGCTG-3’，
F8a-Kpn I-R：5’-TGCCTTTATTTGGGGTACCGCTCACGTCAGCTGTT-3’；
GPI-F8b基因特异性引物序列为：
F8b-Sal I-F：5’-GGCAAGGGCTCTGTCGACATGGCTACTTCAACCCCTC-3’，
F8b-Kpn I-R：5’-CTGCCTTTATTTGGGGTACCAGGAGCGTTAGCGGT-3’；
GPI-F11基因特异性引物序列为：
F11-Sal I-F：5’-AGGGCAAGGGCTCTGTCGACATGGCTAAGAGC-3’，
F11-Kpn I-R：5’-GCTGCCTTTATTTGGGGTACCCGTTGGCCTGG-3’。
M13通用鉴定引物序列为：
M13-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’，
M13-R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。
(2)基因扩增及纯化
利用PCR进行基因扩增，PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、65℃退火45秒、72℃延伸1分钟，总计35个循环；72℃再延伸10分钟。PCR结束后PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并回收纯化目的片段。
(3)重组穿梭质粒的构建
将步骤(2)鉴定正确的含有各个基因的质粒、pFastbac1载体质粒和pFast bac1-GPI载体质粒分别进行双酶切，具体为，含有优化后M基因序列的质粒采用EcoRI和KpnI双酶切，含有优化后F4基因序列的质粒采用BamHI和KpnI双酶切，含有优化后F8a基因序列的质粒采用KpnI和KpnI双酶切，含有优化后F8b基因序列的质粒采用KpnI和KpnI双酶切，含有优化后F11基因序列的质粒采用KpnI和KpnI双酶切；pFastbac1载体分别采用EcoRI和KpnI双酶切、BamHI和KpnI双酶切，pFastbac1-GPI载体采用KpnI和KpnI双酶切。酶切体系为：质粒25μL、ddH2O 15μL、酶各2μL、Buffer 6μL，37℃酶切90分钟后进行琼脂糖凝胶电泳，使用DNA胶回收试剂盒回收M基因、F4基因、F8a基因、F8b基因和F11基因。
将回收的M基因与经EcoRI和KpnI双酶切的pFastbac1载体采用无缝克隆试剂盒进行连接(得到pFastbacl-M质粒)，将回收的F4基因与经BamHI和KpnI双酶切的pFastbac1载体采用无缝克隆试剂盒进行连接(得到pFastbac1-FcF4质粒)，将回收的F8a基因、F8b基因和F11基因分别与经KpnI和KpnI双酶切的pFastbac1-GPI载体采用无缝克隆试剂盒进行连接(分别得到pFastbac 1-GPI-F8a质粒、pFastbac1-GPI-F8b质粒和pFastbac1-GPI-F11质粒)。连接体系为：载体1μL、目的基因4μL、2×Assembly Mix 5μL，50℃反应15min后转化至DMT感受态细胞中，涂板于Amp筛选选择平板，37℃过培养24h，挑取单菌落进行PCR鉴定。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、65℃退火45秒、72℃延伸1分钟，总计30个循环；72℃再延伸10分钟；提取鉴定正确的阳性菌液质粒，利用双酶切进行鉴定。
鉴定结果如图1所示，通过图1中a可知，pFastbacl-M质粒双酶切后，所得pFastbac1载体片段大小约4700bp，所得优化后M基因序列片段大小约1100bp；通过图1中b可知，pFastbac1-FcF4质粒双酶切后，所得pFastbac1载体片段大小约4700bp，所得FcF4基因片段大小约2000bp；通过图1中c可知，pFastbac1-GPI-F8a质粒双酶切，所得pFastbac1载体片段大小约4700bp，所得GPI-F8a基因片段大小约1850bp；通过图1中d可知，所得pFastbac1-GPI-F8b质粒双酶切，所得pFastbac1载体片段大小约4700bp，GPI-F8b基因片段大小约1850bp；通过图1中e可知，所得pFastbac1载体片段大小约4700bp，所得GPI-F11基因片段大小约1900bp。结果与理论值相符，表明重组穿梭质粒pFastbacl-M、pFastbac1-FcF4、pFastbac1-GPI-F8a、pFastbac1-GPI-F8b和pFastbac1-GPI-F11构建成功。
实施例3重组杆状病毒的构建
(1)重组杆粒的构建
将实施例2构建的各重组穿梭质粒分别转化至Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞中进行同源重组，42℃热激90s后，加入0.5mL无抗液体LB培养基，置于30℃摇床培养3h，涂板于三抗固体选择平板(100μg/mL X-gal、40μg/mL IPTG、20μg/mL TET、30μg/mL GM、100μg/mL Kan)，37℃培养24h，挑取白色单菌落，利用实施例1设计的目的基因特异性引物以及M13通用鉴定引物进行PCR鉴定。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、55℃退火45秒、72℃延伸150秒，总计30个循环；72℃再延伸10分钟。将鉴定正确的阳性菌液质粒再次涂板于三抗固体选择平板(100μg/mL X-gal、40μg/mL IPTG、20μg/mL TET、30μg/mLGM、100μg/mL Kan)，反复进行筛选，直至阳性率为100％，最终获得重组杆粒rBacmid-M、rBacmid-FcF4、rBacmid-GPI-F8a、rBacmid-GPI-F8b、rBacmid-GPI-F11。
(2)重组杆状病毒的拯救
参照X-treme GENEHP DNA Transfection Reagent操作说明书，将上述步骤(1)构建的各重组杆粒分别转染至贴壁sf9昆虫细胞(密度70％-80％)中，27℃培养72h-96h后收取细胞上清即为P1代重组杆状病毒，悬浮盲传三代收取上清，提取病毒基因组，利用实施例1设计的目的基因特异性引物以及M13通用鉴定引物进行PCR鉴定。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、55℃退火45秒、72℃延伸150秒，总计30个循环；72℃再延伸10分钟；获得重组杆状病毒rBV-M、rBV-FcF4、rBV-GPI-F8a、rBV-GPI-F8b、rBV-GPI-F11。
结果如图2所示，通过图2中a可知，重组杆状病毒rBV-M经PCR扩增后，M13通用鉴定引物扩增片段大小约3600bp，M基因特异性引物扩增片段大小约1100bp；通过图2中b可知，重组杆状病毒rBV-FcF4经PCR扩增后，M13通用鉴定引物扩增片段大小约4500bp，FcF4基因特异性引物扩增片段大小约2000bp；通过图2中c可知，重组杆状病毒rBV-GPI-F8a经PCR扩增后，M13通用鉴定引物扩增片段大小约4350bp，GPI-F8a基因特异性引物扩增片段大小约1850bp；通过图2中d可知，重组杆状病毒rBV-GPI-F8b经PCR扩增后，M13通用鉴定引物扩增片段大小约4350bp，GPI-F8b基因特异性引物扩增片段大小约1850bp；通过图2中e可知，重组杆状病毒rBV-GPI-F11经PCR扩增后，M13通用鉴定引物扩增片段大小约4400bp，GPI-F11基因特异性引物扩增片段大小约1900bp。结果与预期条带相符，表明重组杆状病毒rBV-M、rBV-FcF4、rBV-GPI-F8a、rBV-GPI-F8b、rBV-GPI-F11拯救成功。
利用免疫印迹分析各重组杆状病毒携带靶蛋白的表达情况，结果如图3所示，通过图3中a可知，M蛋白约40kDa；通过图3中b可知，FcF4蛋白约71kDa；通过图3中c可知，F8a-GPI蛋白约65kDa；通过图3中d可知，F8b-GPI蛋白约65kDa；通过图3中e可知，F811-GPI蛋白约67kDa；结果与预期大小均相符。
实施例4禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒的制备及纯化
(1)禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs的制备
采用昆虫杆状病毒表达系统将实施例3构建的重组杆状病毒rBV-M、rBV-FcF4、rBV-GPI-F8a、rBV-GPI-F8b、rBV-GPI-F11按照MOI＝1的比例接种于悬浮的sf9昆虫细胞(密度2×106个/mL)中进行培养，其中，重组杆状病毒rBV-M、rBV-FcF4、rBV-GPI-F8a、rBV-GPI-F8b、rBV-GPI-F11的病毒滴度比例为5∶1∶1∶1∶1，28℃、120r/min震荡培养72h后，收集含有禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs的培养上清，3000×g离心10min去除细胞碎片。
(2)禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs的纯化
采用蔗糖密度梯度(20％-30％-60％)超速离心法纯化禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs。具体为：将含有禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs的细胞上清于4℃、100000×g离心2h，吸净上清，加入适量PBS重悬沉淀，置于4℃过夜充分溶解，次日从下往上依次加入60％蔗糖溶液、40％蔗糖溶液、20％蔗糖溶液、FAdV4-8a-8b-11 cVLPs溶解液，4℃、100000×g离心90min，吸取40％蔗糖层与60％蔗糖层中间的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-1 1cVLPs，利用适量PBS溶解，4℃、100000g离心2h，吸净上清，加入适量PBS重悬禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs，采用透射电镜分析禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs的形态结构。
禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs的电镜结果如图4所示。通过图4可知，本发明制备的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs的形态结构与真实病毒类似，呈现约100nm的椭圆形结构，表面有囊膜和纤突的空心蛋白聚合体结构，这表明禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs制备成功。禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs的入侵模式与病毒类似，容易被抗原递呈细胞摄取、加工。
实施例5禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11cVLPs的应用
(1)动物免疫
将SPF小鸡随机分为PBS组和实验组，每组15只，PBS组免疫200μL的PBS，实验组免疫200μL含有80μg禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs(禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs与弗氏完全佐剂1∶1(v/v)混合乳化完全)，颈背部皮下免疫，7日龄首免，28日龄加强免疫，期间每周采集血清，冻存于-40℃备用。
(2)ELISA抗体效价的监测
将禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs与包被液进行混合，按照1μg/孔(100μL)加入至ELISA板中，置于4℃包被过夜；加入100μL 1％脱脂奶粉，置于37℃培养箱封闭90分钟；加入100μL 1∶2000稀释的血清样本，置于37℃培养箱孵育90分钟；加入100μL 1∶4000稀释的HRP标记抗鸡IgG抗体，置于37℃培养箱孵育60分钟；期间每步均弃掉上清，拍干，加入200μL的0.5％的PBST清洗3次，每遍5分钟；加入100μL TMB底物溶液，37℃显色15分钟后，加入50μL的2M硫酸终止反应，采用酶标仪中读取OD450数值。
结果如图5所示，禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs免疫后能够刺激机体产生较高滴度的抗体，免疫后随着时间的增加而抗体滴度也增加，且在加强免疫后的3周达到峰值，表明禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11 cVLPs免疫原性良好，能应用于禽腺病毒多血清型的防控。
本发明公开了一种禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110>吉林大学
<120>禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒及其制备方法和应用
<160>5
<210>1
<211>1095
<212>DNA
<213>人工
<400>1
atggattcttctcgtaccatcggcctgtacttcgatagtgcattgccttccagctcactgcttgcgtttcccatcgttctgcaggacacaggcgacggcaaaaagcagatcaccccccaatatcgtatccaacgcttggacagctggactgattctaaggaggattcggtgttcattaccacctacggtttcatcttccagatcggcaatgaagaggctacagtaggtgtgattaacgataacccccgccatgagctgctgtcatcagccatgctttgtctcggttctgtccctaacgacggagacctcgtggaactggcccgtgcatgcctgaccatggtcgtgacacgcaagaagtccgcaacaaacaccgaaaggatcgtgttcagcgtggtgcaggctcctcgcgtgctgcagtcgtgtatggtggtagctaaccgctactcatctgtcaatgcagtaaaacacgtgaaagctccagagaaaatccctggctctggaactctggaatacaaggtcaattttgtgtcccttacggtggttcccagaagggacgtgtatcgcatcccgactgcggtgctgaaggtgtctggtagcagtctctacaatttggctctgaacgttacaatcgacgtcgacgtggatcccaagtcacctttggtaaagtcgctgagtaagtcggacagcggctactacgcaaatctgttcctccatattggtctcatggctaccgttgacaaaaaaggtaagaaagtcaccttcgacaagatcgaggagaagatcagacgtctgaatctcagtgtcggtctgagcgatgtactcggaccaagcgttctggtaaaggcccgcggcgcacgtacaaagttgcttgctcccttcttctcaagtagtggtacggcttgctaccctattgctaacgccagtccacaggtcgcaaagatcctttggtcgcagactgcacaccttaggtccgtaaaggtcatcatccaggctggtacacaaagggctgtagccgttacggctgaccacgaggtgacatccacaaaaatcgaaaagcgccacgctatcgctaaatataacccattccgcaagtaa
<210>2
<211>2076
<212>DNA
<213>人工
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<210>3
<211>1575
<212>DNA
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<400>3
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<210>4
<211>1569
<212>DNA
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<210>5
<211>1614
<212>DNA
<213>人工
<400>5
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Claims (10)

1.禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒，其特征在于，以新城疫病毒NA-1株的基质蛋白M为骨架，将Ⅰ群血清4型禽腺病毒的Fiber-2蛋白、Ⅰ群血清8a型禽腺病毒的Fiber蛋白、Ⅰ群血清8b型禽腺病毒的Fiber蛋白、Ⅰ群血清11型禽腺病毒的Fiber蛋白分别嵌合于新城疫病毒样颗粒载体NDVVLPs表面，得到该禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒，命名为FAdV4-8a-8b-11cVLPs。
2.根据权利要求1所述的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒，其特征在于，所述Ⅰ群血清4型禽腺病毒的Fiber-2蛋白采用胞外域替换策略嵌合于新城疫病毒样颗粒载体NDVVLPs表面，即将新城疫病毒样颗粒载体NDVVLPs的F蛋白胞外域替换成Ⅰ群血清4型禽腺病毒的Fiber-2蛋白胞外域，通过overlap PCR将两者连接；所述Ⅰ群血清8a型禽腺病毒的Fiber蛋白、Ⅰ群血清8b型禽腺病毒的Fiber蛋白、Ⅰ群血清11型禽腺病毒的Fiber蛋白均采用GPI锚定策略嵌合于新城疫病毒样颗粒载体NDVVLPs表面。
3.如权利要求1-2中任意一项所述的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、目的基因的优化及合成；
步骤二、重组穿梭质粒的构建；
步骤三、重组杆粒的构建；
步骤四、重组杆状病毒的拯救；
步骤五、禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒的制备及纯化。
4.根据权利要求3所述的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤一的具体操作步骤如下：
分别对基因Ⅶ型新城疫病毒M基因序列、Ⅰ群血清4型禽腺病毒HB 1510株Fiber-2基因序列、Ⅰ群血清8a型禽腺病毒TR-59株Fiber基因序列、Ⅰ群血清8b型禽腺病毒764株Fiber基因序列、Ⅰ群血清11型禽腺病毒380株Fiber基因序列进行优化，优化后的M基因序列、F4基因序列、F8a基因序列、F8b基因序列、F11基因序列分别见SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5。
5.根据权利要求4所述的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤二的具体操作步骤如下：
根据优化后的M基因序列、F4基因序列、F8a基因序列、F8b基因序列、F11基因序列和pFastbac-1载体信息、pFastbac-GPI载体信息设计目的基因特异性引物和M13通用鉴定引物，利用PCR进行基因扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确，再将合成的各个质粒分别进行双酶切，使用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，将回收的M基因和F4基因连接至pFastbac1载体，将回收的F8a基因、F8b基因、F11基因分别连接至pFastbac1-GPI载体，转化至DMT感受态细胞中进行PCR及双酶切筛选，获得重组穿梭质粒pFastbacl-M、pFastbac1-FcF4、pFastbac1-GPI-F8a、pFastbac1-GPI-F8b、pFastbac1-GPI-F11。
6.根据权利要求5所述的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤三的具体操作步骤如下：
将构建的各重组穿梭质粒分别转化至Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞中进行同源重组，涂板于三抗固体选择平板进行培养，挑取白色单菌落，利用目的基因特异性引物和M13通用鉴定引物进行PCR鉴定，将鉴定正确的阳性菌液质粒再次涂板于三抗固体选择平板，反复进行筛选，直至阳性率为100％，获得重组杆粒rBacmid-M、rBacmid-FcF4、rBacmid-GPI-F8a、rBacmid-GPI-F8b、rBacmid-GPI-F11。
7.根据权利要求6所述的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤四的具体操作步骤如下：
采取脂质体介导转染方式，将构建的各重组杆粒分别转染至昆虫杆状病毒表达系统中，悬浮盲传三代收取上清，提取病毒基因组，利用目的基因特异性引物和M13通用鉴定引物进行PCR鉴定，获得重组杆状病毒rBV-M、rBV-FcF4、rBV-GPI-F8a、rBV-GPI-F8b、rBV-GPI-F11。
8.根据权利要求7所述的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤五的具体操作步骤如下：
将构建的重组杆状病毒rBV-M、rBV-FcF4、rBV-GPI-F8a、rBV-GPI-F8b、r BV-GPI-F11按照MOI＝1的比例接种于昆虫杆状病毒表达系统中进行培养；感染72h-96h后，收集上清，采用蔗糖密度梯度超速离心法进行纯化，获得禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒FAdV4-8a-8b-11cVLPs。
9.如权利要求1-2中任意一项所述的禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒在制备禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒疫苗中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒疫苗用于预防将Ⅰ群血清4型禽腺病毒、Ⅰ群血清8a型禽腺病毒、Ⅰ群血清8b型禽腺病毒和Ⅰ群血清11型禽腺病毒。
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