CN114432435A - 一种基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于多角体纳米结构的SARS‑Cov‑2疫苗及其构建方法和应用，利用多角体纳米结构包裹SARS‑Cov‑2刺突蛋白受体结合域（RBD），实现SARS‑Cov‑2疫苗免疫原的制备。通过构建体外重组杆状病毒载体表达多角体和RBD的融合蛋白，利用多角体蛋白前110氨基酸残基能够形成纳米晶体结构的特点，实现多角体和RBD的融合表达，且RBD蛋白能够被多角体蛋白晶体包裹；此蛋白晶体在实验室只需简单离心就可分离纯化，直接用于免疫实验，应用此法制备的疫苗，过程简单、纯度较高、常温保存和运输。

Description

一种基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及病毒基因工程技术领域，具体涉及一种基于多角体纳米结构的SARS冠状病毒-2疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒（SARS-Cov-2）可以导致严重的呼吸道疾病。此病毒主要通过人-人传播，利用人血管紧张素转化酶2（ACE2）作为病毒感染宿主细胞的受体。直至目前，急需有效的医学防护措施阻止SARS-Cov-2的散播。疫苗的开发和研制则是未来抑制病毒肆意传播的最佳措施。为此全世界的科研工作者都在努力开发SARS-Cov-2的抗病毒药物、针对ACE2抗病毒的DNA疫苗和蛋白疫苗。目前，已有诸多报道显示病毒受体结构域RBD是一个理想的免疫原，通过体外和体内研究证明其能够激发机体潜在的抗体免疫反应，对宿主起到保护作用。但是针对疫苗的制备方法还需进一步改善且疫苗的保存与运输还需要简单化。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于多角体纳米结构的SARS冠状病毒-2疫苗及其制备方法和应用；杆状病毒表达系统作为一个商业化的真核表达系统，可以用来表达多种候选疫苗和生物活性蛋白。杆状病毒具有特异的感染宿主（鳞翅目昆虫），对哺乳动物没有感染性，此类病毒最主要的特征是病毒粒子外包裹一个多孔状蛋白晶体，此蛋白晶体是由病毒基因编码，且在病毒感染的后期，超量表达。蛋白晶体包裹的病毒粒子免受环境因素的破坏，能够抗高温，抗强碱，抗强酸，抗紫外线等。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗的构建方法，包括以下步骤，将SEQID NO:1序列、SEQ ID NO:2序列分别克隆入pFSATBacDual载体，得到pFSATBacDual-Polyhedrin330-RBD质粒；然后质粒转化DH10/Bac感受态细胞，然后涂布于LB 琼脂培养基平板上，培养，再挑取白色菌落，得到重组Bacmid-Polyhedrin330-RBD DNA；将重组Bacmid-Polyhedrin330-RBD DNA转染家蚕培养细胞，培养至细胞发病，然后收集细胞培养上清，获重组病毒Bacmid-polh-RBD，再将重组病毒Bacmid-polh-RBD接种家蚕幼虫或家蚕培养细胞，通过收集感染家蚕的血淋巴或家蚕培养细胞，12000转/分的离心即可获得纳米晶体包裹的疫苗，为基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗。
优选的，将重组病毒Bacmid-polh-RBD感染家蚕培养细胞，发病后，收集家蚕培养细胞上清，得到二代重组病毒Bacmid-polh-RBD；再将二代重组病毒Bacmid-polh-RBD接种家蚕幼虫或家蚕培养细胞，通过收集感染家蚕的血淋巴或家蚕培养细胞，12000转/分的离心即可获得纳米晶体包裹的疫苗，为基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗。进一步的，将二代重组病毒Bacmid-polh-RBD感染家蚕培养细胞，发病后，收集家蚕培养细胞上清，得到三代重组病毒Bacmid-polh-RBD，再将三代重组病毒Bacmid-polh-RBD接种家蚕幼虫或家蚕培养细胞，通过收集感染家蚕的血淋巴或家蚕培养细胞，12000转/分的离心即可获得纳米晶体包裹的疫苗，为基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗。
具体的，将SEQ ID NO:1序列克隆进pFSATBacDual的BamHⅠ/SalⅠ位点；将SEQ IDNO:2序列克隆进pFSATBacDual的SalⅠ/Hind III位点。优选的，将SEQ ID NO:2序列克隆进pFSATBacDual的SalⅠ/Hind III位点，获pFSATBacDual-RBD载体，再将SEQ ID NO:1序列克隆进pFSATBacDual-RBD的BamHⅠ/SalⅠ位点，获pFSATBacDual-Polyhedrin330-RBD质粒。
具体的，将pFSATBacDual-Polyhedrin330-RBD质粒转化DH10/Bac感受态细胞，然后涂布于LB 琼脂培养基平板上，于37℃培养，再挑取白色菌落，提取重组Bacmid-Polyhedrin330-RBD DNA；将重组Bacmid-Polyhedrin330-RBD DNA转染家蚕培养细胞，常规培养3～5天，然后收集细胞培养上清，获重组病毒Bacmid-polh-RBD；将重组病毒Bacmid-polh-RBD感染家蚕培养细胞3～5天，再收集家蚕培养细胞上清，获二代重组病毒Bacmid-polh-RBD；将二代Bacmid-polh-RBD接种家蚕，发病后，收集家蚕血淋巴，离心纯化得到纳米晶体包裹的疫苗，即基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗；或者将Bacmid-polh-RBD感染家蚕培养细胞3～5天，收集家蚕培养细胞上清，离心纯化得到纳米晶体包裹的疫苗，即基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗。三代病毒感染同此步骤。
发明还公开了根据上述制备方法制备的基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗；上述基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗在制备SARS冠状病毒-2免疫预防药物中的应用。
上述技术方案中，以pUC57-COVID-19-spike-RBD质粒为模板，用引物对进行PCR反应，克隆SEQ ID NO:2序列，插入pMD19载体构建pMD19-RBD质粒；pMD19-RBD质粒用SalⅠ/HindIII限制性内切酶消化后，将回收片段克隆进pFSATBac Dual的SalⅠ/ HindIII位点获pFSATBacDual-RBD载体。其中，引物对如下：
RBD-1: GTCGACATGCCTAATATTACAAACTTG
RBD-2:AAGCTTTTACTCAAGTGTCTGTGGATC
上述技术方案中，以pET28-BmNPV-Polyhedrin质粒为模板，用引物对进行PCR反应，克隆SEQ ID NO:1序列，插入pMD19载体构建pMD19-Polyhedrin330质粒；pMD19-Polyhedrin330质粒用BamHⅠ/SalⅠ限制性内切酶消化后，将回收片段克隆进pFSATBacDual-RBD的BamHⅠ/SalⅠ位点获pFSATBacDual-Polyhedrin330载体。其中，引物对如下：
Polyhedrin330-1：GGATCCATGCCGAATTATTCATACACC
Polyhedrin330-2：GTCGACTACAATGGGGAAGCTGTCCTC
上述技术方案中，将pFSATBacDual-Polyhedrin330-RBD质粒转化DH10/Bac感受态细胞，于37℃培养4h，然后涂布于含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、IPTG、X-gal的LB 琼脂培养基平板上，于37℃培养18h，再挑取白色菌落，提取重组Bacmid-Polyhedrin330-RBDDNA。
上述技术方案中，所述家蚕为4～5龄幼虫或初化蛹；离心纯化的转速为12000转/分钟，纯化时采用SDS缓冲液清洗，可得到纯化的纳米晶体包裹的疫苗。
本发明中，pFSATBacDual质粒是美国Invitrogen公司的产品，属于Bac-to-Bac（Bacteria to Baculovirus）表达系统载体。
本发明首次公开了基于多角体纳米结构的SARS冠状病毒-2疫苗，微米结构的蛋白晶体包裹病毒粒子，免受环境因素的破坏，能够抗高温，抗强碱，抗强酸，抗紫外线等；本发明用杆状病毒作为疫苗载体，可以通过注射、口服和浸泡等方式实现免疫，增加了免疫途径的选择，通过此法制备的疫苗，制备过程简单、实现疫苗常温保存和运输。
附图说明
图1为重组质粒pFastbac-dual-pH-Polyhedrin-RBD-p10-gfpPCR与酶切电泳 1,5：Marker 2：RBD PCR产物 3：Polyhedrin330 PCR产物 4：GFP PCR产物 6,7：pFastbac-dual-pH-Polyhedrin- RBD-p10-GFP酶切产物。
图2为实施例一重组载体pFastbac-dual-pH-Polyhedrin-RBD-p10-gfp示意图。
图3为实施例一重组Bacmid-polh-RBD-GFP的鉴定图。
图4为一代病毒BmNPV-polh-RBD-GFP感染家蚕BmN细胞免疫荧光分析。
图5为二代病毒BmNPV-polh-RBD-GFP感染家蚕BmN细胞免疫荧光分析。
图6为三代病毒BmNPV-polh-RBD-GFP感染家蚕BmN细胞免疫荧光分析。
图7为Western Blotting 检测重组蛋白polh-RBD表达，目的蛋白RBD在BmN细胞中的表达结果，一抗：anti-2019-nCoV S1 mAb 二抗：羊抗鼠IgG-HRP。
图8为杆状病毒BmNPV-polh-RBD-GFP感染家蚕细胞的透射电镜观察。
具体实施方式
本发明采用的原料都是本领域常规原料，具体操作方法比如PCR反应、克隆、酶切、转染、感染、离心纯化、测序等，都是本领域常规方法，可参见申请人公开的文献。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述，其中一些常规方法所示简略。
Figure 749325DEST_PATH_IMAGE001
实验方法概述。
（1）构建质粒载体pFastbac-dual-pH-Polyhedrin330-RBD-p10-GFP；获取质粒RBD-T、Polyhedrin330-T、GFP-T；将RBD序列（319–545氨基酸残基）、Polyhedrin330序列（1-330 bp）、GFP序列克隆进Pfastbac-dual载体的多角体启动子，连接后转化转化DH5α，质粒抽提获得重组质粒pFastbac-dual-pH-Polyhedrin330-RBD-p10-GFP。
（2）将构建好的pFastbac-dual-pH-Polyhedrin330-RBD-p10-GFP载体转入DH10bac。
（3）蓝白斑筛选，挑取目标菌落。
（4）重组病毒感染家蚕培养细胞和家蚕。
（5）Western Blotting检测重组蛋白。
Western blotting检测重组蛋白polh-RBD的表达
（1）SDS-PAGE电泳后进行转膜：根据目的条带大小剪取PVDF膜，于甲醇中活化5min。将三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸按顺序依次放置于夹板的负极，赶走气泡，将夹板夹紧，放于转膜槽中。接通电源，330 mA 跑30 min。
（2）封闭：取出PVDF膜，用PBST漂洗倒掉，加入3% BSA，室温摇床孵育2 h。
（3）一抗：取出PVDF膜，加入3% BSA 稀释的一抗（一抗：anti-2019-nCoV S1 mAb），4℃过夜。
（4）洗膜：回收一抗，用PBST摇床快速洗3次，每次5 min。
（5）二抗：取出PVDF膜，加入3% BSA 稀释的二抗（二抗：羊抗鼠IgG-HRP），稀释倍数1:10000，室温孵育1 h。
（6）洗膜：回收二抗，用PBST摇床快速洗3次，每次5 min。
（7）曝光：将曝光液A液和B液等体积混匀，滴加到PVDF膜上，机器曝光，观察结果。
电镜观察多角体纳米晶体。收集感病细胞，送公司（杭州浩克生物技术有限公司）进行透射电镜观察。透射电镜步骤：取感病细胞，投入电镜固定液4℃固定2-4h。0.1M磷酸缓冲液PBS（PH7.4）漂洗3次，每次15 min。再1%的锇酸-0.1M磷酸缓冲液PBS（PH7.4）室温（20℃）固定2 h。0.1M磷酸缓冲液PBS（PH7.4）漂洗3次，每次15 min。再依次用50%-70%-80%-90%-95%-100%-100%酒精脱水，每次15min。丙酮︰812包埋剂=1︰1混合液渗透过夜，纯812包埋剂渗透过夜，60℃聚合48 h。切片机切片，铀铅双染色（2%醋酸铀饱和水溶液，枸橼酸铅，各染色15 min），切片室温干燥过夜。透射电子显微镜下观察，采集图像分析。
引物对如下：
Polyhedrin330-1：GGATCCATGCCGAATTATTCATACACC
Polyhedrin330-2：GTCGACTACAATGGGGAAGCTGTCCTC
RBD-1: GTCGACATGCCTAATATTACAAACTTG
RBD-2: AAGCTTTTACTCAAGTGTCTGTGGATC
Gfp-1: CTCGAGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAA
Gfp-2: GGTACCTTAATCCATGCCATGTGTAATCC。
实施例一
（1）以pUC57-COVID-19-spike-RBD质粒为模板，用引物对RBD-1和RBD-2进行PCR反应，克隆RBD序列并插入pMD19载体构建pMD19-RBD，进行测序验证，将验证正确的质粒命名为pMD19-RBD；
以pET28- BmNPV-Polyhedrin质粒为模板，用引物对Polyhedrin330-1和Polyhedrin330-2进行PCR反应，克隆Polyhedrin330序列并插入pMD19载体构建pMD19-Polyhedrin330，进行测序验证，将验证正确的质粒命名为pMD19-Polyhedrin330；
以pIZT-V5/His质粒为模板，用引物对Gfp-1和Gfp-2进行PCR反应，克隆GFP序列插入pMD19载体构建pMD19-GFP，进行测序验证，将验证正确的质粒命名为pMD19-GFP。
Polyhedrin330序列为SEQ ID NO:1、RBD序列为SEQ ID NO:2、GFP序列为SEQ ID NO:3。
PCR体系：
ddH2O 16.5 μL
10×PCR buffer 2.5 μL
Mg2＋ 2 μL
dNTPs（2.5 mmol/L） 1 μL
引物 1 μL
模板DNA 1 μL
Taq 酶（5U/μL） 1 μL
总计： 25 μL
PCR反应程序为：95℃ 预变性5min；95℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸1min，共重复35个循环；最后72℃延伸10min。
琼脂糖DNA电泳，配置1%的琼脂糖凝胶：1 g琼脂糖粉末加入100 mL 0.5×TBE，煮沸，冷至50℃，加10 μL GelRed染料，摇匀灌制。PCR产物与 3 µL 10×Loading Buffer 混匀，转移至 1%琼脂糖凝胶的上样孔，进行电泳分离，电泳缓冲液为 0.5×TBE，电压 50-100V。电泳结束后将凝胶放置于紫外曝光仪器中曝光拍照，与 DNA 分子标准 Marker对比观察，用刀片割取目的条带凝胶于1.5 mL EP中，进行胶回收。
胶回收产物与T载体连接，体系如下（10 µL）：
10×buffer 1 µL
目的片段 7.5µL
T载体（pMD19-T vector） 0.5 µL
T4 DNA ligase 1 µL
16℃金属浴过夜。然后转化DH5α，最后进行质粒抽提。最后获得质粒pMD19-RBD、pMD19-Polyhedrin330、pMD19-GFP。
（2）分别利用BamHⅠ/SalⅠ、SalⅠ/ HindIII和kpn I/Sma I限制性内切酶消化pMD19-Polyhedrin330、pMD19-RBD和pMD19-GFP载体，分别回收Polyhedrin330、RBD和GFPDNA片段；
将回收的RBD片段克隆进pFSATBacDual的SalⅠ/ HindIII位点，获pFSATBacDual-RBD载体；将回收的Polyhedrin330片段克隆进pFSATBacDual-RBD载体的BamHⅠ/SalⅠ位点，获pFSATBacDual-Polyhedrin330-RBD质粒，利用多角体启动子启动转录；将回收的GFP片段克隆pFSATBacDual-Polyhedrin330-RBD质粒的kpn I/Sma I位点，利用p10启动子启动转录；构建的重组载体pFastbac-dual-pH-Polyhedrin-RBD-p10-gfp见图1；
将RBD序列克隆进Pfastbac-dual载体的多角体启动子，以获得重组载体pFastbac-dual-RBD。对质粒RBD-T，pFastbac-dual均进行双酶切。（酶切位点：SalⅠ，HindⅢ）
双酶切体系（20μL）：
质粒 2 µL
10×buffer K 2 µL
SalⅠ酶 1 µL
HindⅢ酶 1 µL
ddH2O 14 µL
37℃金属浴放置2.5h。
琼脂糖DNA电泳，对目的条带进行胶回收。将pMD19-RBD双酶切产物进行胶回收，作为目的片段；将pFastbac-dual双酶切产物进行胶回收，作为载体片段。
连接（10μL体系）：
10×buffer 1 µL
RBD片段 7.5 µL
pFastbac-dual载体片段 0.5 µL
T4 DNA ligase 1 µL
16℃过夜。转化DH5α。然后进行质粒抽提，获得重组质粒pFastbac-dual-RBD；重组质粒鉴定：菌液PCR鉴定及酶切鉴定。
将Polyhedrin330序列克隆进重组质粒pFastbac-dual-RBD上，以获得重组质粒pFastbac-dual-Polyhedrin-RBD。先对质粒pMD19-Polyhedrin330，pFastbac-dual-RBD均进行BamHⅠ单酶切（酶切位点:BamHⅠ，SalⅠ）
体系：
质粒 2 µL
Q.10×buffer 2 µL
Q. BamHⅠ酶 1 µL
ddH2O 15 µL
37℃酶切1h。然后琼脂糖DNA电泳，对目的条带进行胶回收。
对各自胶回收产物均进行SalⅠ单酶切。
体系：
DNA产物 17µL
10×buffer H 2 µL
sal酶 1 µL
37℃酶切2.5h。
琼脂糖DNA电泳，对目的条带进行胶回收。将Polyhedrin330-T双酶切产物进行胶回收，作为目的片段；将pFastbac-dual-RBD双酶切产物进行胶回收，作为载体片段。
连接（10 μL体系）：
10×buffer 1 µL
Polyhedrin330片段 7.5 µL
pFastbac-dual-RBD载体片段 0.5 µL
T4 DNA ligase 1 µL
16℃过夜。转化DH5α，步骤同上。
质粒抽提，获得重组质粒pFastbac-dual-Polyhedrin-RBD，重组质粒pFastbac-dual-Polyhedrin-RBD 进行PCR鉴定。
将GFP序列克隆进重组质粒pFastbac-dual-Polyhedrin-RBD上，以获得重组质粒pFastbac-dual-pH-Polyhedrin-RBD-p10-GFP。对质粒pMD19-GFP，pFastbac-dual-Polyhedrin-RBD均进行双酶切。酶切位点为SmaⅠ，KpnⅠ。
双酶切体系（20 μL）：
质粒 2 µL
10×buffer T 2 μL
BSA 2 µL
SmaⅠ酶 1 µL
KpnⅠ酶 1 µL
ddH2O 12 µL
37℃酶切2.5h。
琼脂糖DNA电泳，对目的条带进行胶回收。将pMD19-GFP双酶切产物进行胶回收，作为目的片段；将pFastbac-dual-Polyhedrin-RBD双酶切产物进行胶回收，作为载体片段。
连接（10 μL体系）：
10×buffer 1 µL
GFP片段 7.5 µL
pFastbac-dual-Polyhedrin-RBD载体片段 0.5 µL
T4 DNA ligase 1 µL
16℃过夜。
转化DH5α，步骤同上；质粒抽提：获得重组质粒pFastbac-dual-pH-Polyhedrin-RBD-p10-GFP；重组质粒pFastbac-dual-pH-Polyhedrin-RBD-p10-GFP进行PCR及酶切鉴定。
将上述目的片段进行回收并连接，连接产物转化感受态DH5ɑ，并涂布含有对应抗生素的筛选培养基平板，经培养后挑取单克隆菌落进行扩大培养并提取重组质粒。以该重组质粒为模板，分别用引物RBD-1和RBD-2、Polyhedrin330-1和Polyhedrin330-2、Gfp-1和Gfp-2对RBD、Polyhedrin330和GFP编码序列进行PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR产物大小约为768 bp、330 bp和708 bp，与理论大小一致。同时对重组质粒用限制性内切酶SmaⅠ和KpnⅠ进行双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示插入片段GFP和载体片段pFastbac-dual-Polyhedrin-RBD大小与理论值相符（图1），表明重组质粒构建成功，并将其命名为pFastbac-dual-pH-Polyhedrin-RBD-p10-GFP（图2）。
（3）将5 μL pFastbac-dual-pH-Polyhedrin-RBD-p10-gfp转化200 ul DH10/Bac感受态细胞，轻轻吹打混匀，0℃放置 30 min，置于42℃金属浴中热击90 s，0℃放置5 min，加入1 mL预热的LB液体培养基，37℃培养4 h；5000 r/min离心 5 min，弃去上清，留200 μL将沉淀吹打悬浮，涂布于含抗生素的LB固体培养基上，37℃正置30 min，然后倒置培养12h，挑取菌落于含抗生素的3 mL LB 液体培养基中培养过夜（12 h），蓝白斑筛选，PCR鉴定重组Bacmid-polh-RBD-GFP；抗生素为:Kan+ 1：1000，庆大 1：1000，四环 1：1000，IPTG 1：1000，X-gal 1：500；PCR体系：（选用Ex taq）
ddH2O 17.5 μL
10×Ex buffer 2.5 μL
dNTPs（2.5 mmol/L） 2 μL
引物 1 μL
模板DNA 1 μL
Ex taq酶 1 μL
总计： 25 μL
PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸2min，一共35个循环；最后72℃延伸10min。琼脂糖DNA电泳，鉴定重组病毒。
将重组杆状病毒转移载体pFastbac-dual-pH-Polyhedrin-RBD-p10-GFP转化DH10/Bac感受态细胞通过，利用Bac-to-Bac系统构建重组Bacmid，利用M13引物可以在重组Bacmid中扩增出与理论值4236 bp（Bacmid-polh-RBD-GFP=Bacmid 2430 bp+RBD 768 bp+Polyhedrin 330 bp+GFP 708 bp）相符的特异性产物(图3），表明重组bacmid成功构建，将其命名为Bacmid-polh-RBD-GFP。
（4）将重组Bacmid-polh-RBD-GFP转染BmN细胞，对照为野生Bacmid。Bacmid-polh-RBD-GFP浓度：3161.9 ng/μL；野生Bacmid浓度：4038.2 ng/μL。
进行细胞转染：将2×105 个BmN细胞用含有10% FBS 的TC-100 培养基吹起，平铺在培养皿上，待细胞贴壁且状态良好时进行转染。取两个空管：A管和B管，在A管中加入197μL无血清培养基和3 μL Roche脂质体，B管中加入198 μL无血清培养基和2 μg质粒，然后将两管中的液体混合到一起，静置30 min，形成脂质体-质粒混合物。将培养板里的旧培养基去掉，在混合液里加入1.6 mL无血清培养基混匀，加入培养皿。在26℃培养箱中培养6 h后更换新的有血清培养基，待细胞发病，发病症状：细胞变圆，从半贴壁状态转变为悬浮状态。荧光观察感病细胞，用ep管收集发病细胞，12000r/min离心3 min，上清即为病毒液，利用病毒液复感BmN细胞。另对细胞沉淀进行蛋白提取，为后续western blotting用。
用Bacmid-polh-RBD-GFP转染BmN细胞，转染72h后，与正常BmN细胞相比，实验组细胞出现变圆，细胞附着能力变弱等明显的细胞病变（图4），此时收集细胞培养基上清获得第一代（P1）病毒，将其命名为BmNPV-polh-RBD-GFP。将P1代重组病毒感染BmN细胞，收集细胞培养液上清得到P2代病毒，重复该操作得到P3代病毒。3代病毒BmNPV-polh-RBD-GFP感染家蚕BmN细胞免疫荧光分析见4、图5以及图6。
以anti-2019-nCoV S1 mAb检测抗体，检测重组杆状病毒BmNPV-polh-RBD-GFP感染BmN细胞后RBD蛋白的表达，Western blotting结果显示与野生BmNPV感染相比。重组杆状病毒BmNPV-polh-RBD-GFP在家蚕细胞中成功表达目的蛋白RBD（图7）。
（5）取二代重组病毒，按1∶100（V/V）接种家蚕培养细胞，27℃培养4天，发病后，收集细胞培养上清，1000转/分离心10分钟，去除细胞碎片，上清以12000转/分4度离心60分钟，弃上清，沉淀用1*SDS缓冲液溶解后，2000转/分离心10分钟，上清以12000转/分4度离心60分钟，沉淀用1*SDS缓冲液清洗，得到基于多角体纳米结构的SARS冠状病毒-2（SARS-Cov-2）疫苗。
用重组杆状病毒BmNPV-polh-RBD-GFP感染细胞，离心收集感染96 h的BmN细胞，送公司做切片并透射电镜观察。电镜结果显示，细胞核内出现致密的黑色颗粒，大小约为200nm，为多角体纳米晶体（图8）。
实施例二
（1）～（4）同实施例一步骤（1）～（4）；
（5）用昆虫针醮取二代重组病毒，从节间膜处穿刺接种5龄起蚕，25℃左右正常饲养，5天蚕发病后，收集家蚕血淋巴，冻融交替3次以上。1000转/分离心10分钟，去除细胞碎片后，12000转/分4度离心60分钟。弃上清，沉淀用1*SDS缓冲液溶解后，1000转/分离心10分钟，上清以12000转/分4度离心60分钟，沉淀用1*SDS缓冲液清洗，得到基于多角体纳米结构的SARS冠状病毒-2（SARS-Cov-2）疫苗。
针对目前SARS-Cov-2，急需开发安全性高、成本低和使用方便的疫苗种类，本研究利用多角体纳米结构包裹SARS-Cov-2刺突蛋白受体结合域，制备SARS-Cov-2疫苗。通过此法制备的疫苗，制备过程简单、实现疫苗常温保存和运输，而且本发明解决了现有多角体疫苗为微米的缺陷，首次得到纳米结构的多孔状蛋白晶体，且实现了对RBD的高效包裹。
本发明中，序列SEQ ID NO:1为：
ATGCCGAATTATTCATACACCCCCACCATCGGGCGTACTTACGTGTACGACAATAAATATTACAAAAACTTGGGCTGTCTTATCAAAAACGCCAAGCGCAAGAAGCACCTAGTCGAACATGAACAAGAGGAGAAGCAATGGGATCTTCTAGACAACTACATGGTTGCCGAAGATCCCTTTTTAGGACCGGGCAAAAACCAAAAACTTACCCTTTTTAAAGAAATTCGCAGTGTGAAACCCGATACCATGAAGTTAATCGTCAACTGGAGCGGCAAAGAGTTTTTGCGTGAAACTTGGACCCGTTTTGTTGAGGACAGCTTCCCCATTGTA
序列SEQ ID NO:2为：
ATGCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGTAA
SEQ ID NO:3
ATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGTCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATTAA。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 一种基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗及其制备方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcgacatgc ctaatattac aaacttg 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagcttttac tcaagtgtct gtggatc 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggatccatgc cgaattattc atacacc 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgactaca atggggaagc tgtcctc 27
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcgagatgg ctagcaaagg agaagaa 27
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtaccttaa tccatgccat gtgtaatcc 29
<210> 7
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgccgaatt attcatacac ccccaccatc gggcgtactt acgtgtacga caataaatat 60
tacaaaaact tgggctgtct tatcaaaaac gccaagcgca agaagcacct agtcgaacat 120
gaacaagagg agaagcaatg ggatcttcta gacaactaca tggttgccga agatcccttt 180
ttaggaccgg gcaaaaacca aaaacttacc ctttttaaag aaattcgcag tgtgaaaccc 240
gataccatga agttaatcgt caactggagc ggcaaagagt ttttgcgtga aacttggacc 300
cgttttgttg aggacagctt ccccattgta 330
<210> 8
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgcctaata ttacaaactt gtgccctttt ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca 60
tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta 120
tataattccg catcattttc cacttttaag tgttatggag tgtctcctac taaattaaat 180
gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga 240
caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt gctgattata attataaatt accagatgat 300
tttacaggct gcgttatagc ttggaattct aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat 360
tataattacc tgtatagatt gtttaggaag tctaatctca aaccttttga gagagatatt 420
tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt 480
tactttcctt tacaatcata tggtttccaa cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac 540
agagtagtag tactttcttt tgaacttcta catgcaccag caactgtttg tggacctaaa 600
aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt gtcaatttca acttcaatgg tttaacaggc 660
acaggtgttc ttactgagtc taacaaaaag tttctgcctt tccaacaatt tggcagagac 720
attgctgaca ctactgatgc tgtccgtgat ccacagacac ttgagtaa 768
<210> 9
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggctagca aaggagaaga acttttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60
ggtgatgtta atgggcacaa attttctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgctacatac 120
ggaaagctta cccttaaatt tatttgcact actggaaaac tacctgttcc atggccaaca 180
cttgtcacta ctttctctta tggtgttcaa tgcttttccc gttatccgga tcatatgaaa 240
cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaacg cactatatct 300
ttcaaagatg acgggaacta caagacgcgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt 360
gttaatcgta tcgagttaaa aggtattgat tttaaagaag atggaaacat tctcggacac 420
aaactcgagt acaactataa ctcacacaat gtatacatca cggcagacaa acaaaagaat 480
ggaatcaaag ctaacttcaa aattcgtcac aacattgaag atggatccgt tcaactagca 540
gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600
tacctgtcga cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagcgtga ccacatggtc 660
cttcttgagt ttgtaactgc tgctgggatt acacatggca tggattaa 708

Claims (10)

1.一种基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，将SEQ ID NO:1序列、SEQ ID NO:2序列分别克隆入pFSATBacDual载体，得到pFSATBacDual-Polyhedrin330-RBD质粒；然后质粒转化DH10/Bac感受态细胞，然后涂布于LB 琼脂培养基平板上，培养，再挑取白色菌落，得到重组Bacmid-Polyhedrin330-RBD DNA；将重组Bacmid-Polyhedrin330-RBD DNA转染家蚕培养细胞，培养至细胞发病，然后收集细胞培养上清，获重组病毒Bacmid-polh-RBD，再将重组病毒Bacmid-polh-RBD接种家蚕幼虫或家蚕培养细胞，收集感染家蚕的血淋巴或家蚕培养细胞，离心获得基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗。
2.根据权利要求1所述基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗的构建方法，其特征在于，将SEQ ID NO:1序列克隆进pFSATBacDual的BamHⅠ/SalⅠ位点；将SEQ ID NO:2序列克隆进pFSATBacDual的SalⅠ/Hind III位点。
3. 根据权利要求2所述基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗的构建方法，其特征在于，将SEQ ID NO:2序列克隆进pFSATBacDual的SalⅠ/Hind III位点，获pFSATBacDual-RBD载体，再将SEQ ID NO:1序列克隆进pFSATBacDual-RBD的BamHⅠ/SalⅠ位点，获pFSATBacDual-Polyhedrin330-RBD质粒。
4.根据权利要求1所述基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗的构建方法，其特征在于，所述家蚕为4～5龄幼虫或初化蛹。
5. 根据权利要求1所述基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗的构建方法，其特征在于，所述LB 琼脂培养基含有四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG 和X-gal。
6.根据权利要求1所述基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗的构建方法，其特征在于，离心纯化的转速为10000～150000转/分钟，纯化时采用SDS缓冲液清洗。
7.根据权利要求1所述基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗的构建方法构建的基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗。
8.一种SARS-Cov-2免疫预防药物，包括权利要求7所述基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗。
9. 重组病毒Bacmid-polh-RBD在制备权利要求7所述基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗中的应用，其特征在于，将SEQ ID NO:1序列、SEQ ID NO:2序列分别克隆入pFSATBacDual载体，得到pFSATBacDual-Polyhedrin330-RBD质粒；然后质粒转化DH10/Bac感受态细胞，然后涂布于LB 琼脂培养基平板上，培养，再挑取白色菌落，得到重组Bacmid-Polyhedrin330-RBD DNA；将重组Bacmid-Polyhedrin330-RBD DNA转染家蚕培养细胞，培养至细胞发病，然后收集细胞培养上清，获重组病毒Bacmid-polh-RBD。
10.权利要求7所述基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗在制备SARS冠状病毒-2免疫预防药物中的应用。
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