CN109336716A - 一种碳基生物复合有机肥及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于土壤修复、肥料以及微生物技术领域，具体涉及一种碳基生物复合有机肥及其制备方法。具体方案为：一种碳基生物复合有机肥，按重量份数计，所述有机肥包括1份复合菌液、2～15份生物炭、15～30份有机辅料；所述复合菌液由假单胞菌和根瘤农杆菌制备而成，所述有机辅料由畜禽粪便拌入复合微生物发酵的堆肥制成。本发明的碳基生物复合有机肥具备向土壤基质中固定氮素，增加可溶性磷、钾以及微生物数量，促进植物生长，提高作物抗性的功效，同时对障碍型基质的逆境环境有缓冲和改良作用，解决了当前生物肥作用不佳，持续效应差，实际成效不稳定等问题。

Description

一种碳基生物复合有机肥及其制备方法

技术领域

本发明属于土壤修复、肥料以及微生物技术领域，具体涉及一种碳基生物复合有机肥及其制备方法。

背景技术

土壤养分失调、有机质含量下降、结构破坏、严重板结、趋于酸化、次生盐碱害、耕作层变浅、连作“土壤病”以及土壤污染和退化等是我国土壤当前存在的主要障碍。上述障碍对土壤质量和经济效益造成了严重影响，并导致现阶段的土壤条件已不能适应发展现代化绿色、优质、高效农业的要求，且在一定程度上加速了生态环境的恶化，因此必须对此类障碍性土壤进行适当的修复改良。

施肥、灌溉、耕作及使用改良剂等措施是目前常用的修复和改良方式，如施用有机肥可提高土壤有机质；漫灌沟排会降低盐渍灾害；犁地翻耕能防止土壤板结；撒施生石灰可改善土壤酸化。但诸如此类的措施不仅存在投入大、浪费多的问题，且对日渐复杂化的障碍性土壤改良已效果甚微。此外，有报道指出通过农艺间作可缓解连作障碍，但此方式并不符合农业增产和高效的要求，因此探索一种高效方便的多元化、集成化改良剂显得尤为重要。

通过微生物改良障碍土壤的报道并不多见，报道多针对生物抗病与固氮、分泌胞外酶和植物生长激素以提高作物抗性和促进植株生长等方面，相关研究主要集中在植物的根际促生菌的探索与发现。与有机肥改良土壤相比，利用生物炭改良土壤的文献也相对较少，其中以生物炭结合不同的农艺措施为研究主题的较多，几乎不存在改性生物炭修复和改良障碍性土壤的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种碳基生物复合有机肥，以修复和改良障碍性土壤。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明公开了一种碳基生物复合有机肥，按重量份数计，所述有机肥包括1份复合菌液、2～15份生物炭、15～30份有机辅料；所述复合菌液由假单胞菌和根瘤农杆菌制备而成，所述有机辅料由畜禽粪便拌入复合微生物发酵的堆肥制成。

优选的，所述假单胞菌由假单胞菌KSX-7、假单胞菌KSX1-2和假单胞菌KSX1-1混合而成，所述假单胞菌KSX-7、假单胞菌KSX1-2和假单胞菌KSX1-1分别于2018年06月07日，在微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为：CGMCC No.15913、CGMCC No.15914和CGMCC No.15915；

所述根瘤农杆菌由根瘤土壤杆菌KSN-1制成，所述根瘤土壤杆菌KSN-1于2018年06月07日，在微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.15916；

所述假单胞菌KSX-7、假单胞菌KSX1-2、假单胞菌KSX1-1与所述根瘤土壤杆菌KSN-1的体积比为2：1.5：1.5：5，菌体浓度均为10⁹CFU/mL。

优选的，所述生物炭为经过碱改性和/或酸改性的生物炭。

本发明还公开了一种碳基生物复合有机肥的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制复合菌液：将假单胞菌KSX-7、假单胞菌KSX1-2、假单胞菌KSX1-1、根瘤土壤杆菌KSN-1四种菌的发酵液混合，培养得到复合菌液；

(2)称量1重量份复合菌液、2～15重量份生物炭、15～30重量份有机辅料混合制得所述碳基生物复合有机肥。

优选的，所述假单胞菌KSX-7、假单胞菌KSX1-2、假单胞菌KSX1-1、根瘤土壤杆菌KSN-1的体积比为2：1.5：1.5：5，菌体浓度均为10⁹CFU/mL。

优选的，所述生物炭为经过碱改性和/或酸改性的生物炭。

优选的，所述生物炭的制备包括以下步骤：将生物炭用2mol·L^-1的NaOH溶液浸泡22～26h，再用去离子水洗涤，直至pH值不再变化，获得碱改性生物炭；将所述碱改性生物炭用2mol·L^-1的HCl溶液浸泡22～26h，再用去离子水洗涤，直至pH值不再变化，获得酸碱改性生物炭；将所述酸碱改性生物质碳放入1mol·L^-1的H₃PO₄或NH₃·H₂O溶液中浸泡处理22～26h，获得所述生物炭。

优选的，所述有机辅料的制备过程为：将碳、氮比为25～30:1的畜禽粪便均匀拌入复合微生物发酵的堆肥中，并转移到发酵装置中，调整参数，然后进行堆肥发酵，即制得有机辅料。

优选的，所述复合微生物发酵的堆肥由5重量份的麸皮吸附1重量份的复合发酵液制成，所述复合发酵液由光合菌、酵母菌、黄孢原毛平革菌、黑曲霉菌以及甲基营养型芽孢杆菌发酵液按1:1:1:1:1体积比混合而成，各菌种发酵液的菌体浓度均为10⁹CFU/mL。

优选的，所述调整参数为搅拌4次/天，每次15min，温度为60℃，底部通气2次/天，每次30s，物料含水率为50％、时长为7天。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明碳基生物复合有机肥由具有固氮能力、溶磷效果、解钾作用、分泌植物生长激素(IAA)和产1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶的复合功能微生物组成，并辅以自制改性生物炭和有机辅料以增强功能微生物促生效应。该有机肥具备向土壤基质中固定氮素，增加可溶性磷、钾以及微生物数量，促进植物生长，提高作物抗性的功效，同时对障碍型基质的逆境环境有缓冲和改良作用。

2、该有机肥还具有增加土壤基质养分、促进成土部分团粒结构形成，充当保水剂，提高水稳性团聚体含量，防止风、水蚀作用的发生，同时还有降低改良成本、应用方便的特点。通过针对性的调节功能菌液比例、生物炭改性方式和制肥配比以改善作物在障碍性土壤的生存环境，优化、强化根际功能微生物群落，促进植株生长并提高其抗性，达到稳定、彻底、低成本、高效率的修复目的。

3、本发明改性生物炭与未改性生物炭相比具有更大的比表面积，能够更好地吸附重金属等污染元素。并且，经过基团活化后的改性生物炭不仅能携带植物营养元素，还可以较好地调节酸碱度，缓冲不同障碍类型土壤基质对作物造成的pH不适或其他不良条件。

附图说明

图1为碳基生物复合有机肥所含菌株在LB固体培养基中的菌落照片；

图2为碳基生物复合有机肥所含菌株革兰氏染色图；

图3为碳基生物复合有机肥所有菌株扫描电镜照片；

图4为假单胞菌KSX1-1在LB固体培养基中的生长曲线图；

图5为假单胞菌KSX1-2在LB固体培养基中的生长曲线图；

图6为假单胞菌KSX-7在LB固体培养基中的生长曲线图；

图7为根瘤土壤杆菌KSN-1在LB固体培养基中的生长曲线图；

图8为碳基生物复合有机肥所含菌株之间的拮抗实验照片；

图9为不同改良处理对西洋蓍草株高和根长的影响示意图；

图10为不同改良剂处理对西洋蓍草地上部分和地下部分生物量的影响示意图；

图11为不同改良剂处理对西洋蓍草冠径和株高的影响示意图；

图12为不同改良剂处理对西洋蓍草根际微生物总DNA浓度的影响示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完善地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1功能菌种的定性筛选

(1)培养基的准备

LB固体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，121℃灭菌20min。

LB液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，121℃灭菌20min。

Ashby无氮固体培养基：甘露醇10g，CaCO₃ 5g，KH₂PO₃ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO₄·2H₂O 0.1g，琼脂20g，pH＝7.4，去离子水1000mL。

Ashby无氮液体培养基：甘露醇10g，CaCO₃ 5g，KH₂PO₃ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO₄·2H₂O 0.1g，pH＝7.4，去离子水1000mL。

NBRIP溶磷固体培养基：葡萄糖10g，磷酸钙5g，硫酸铵0.1g，氯化钾0.2g，七水氯化镁0.25g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.0，115℃高压灭菌30min。

NBRIP溶磷液体培养基：葡萄糖10g，磷酸钙5g，硫酸铵0.1g，氯化钾0.2g，七水氯化镁0.25g，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.0，115℃高压灭菌30min。

解钾细菌筛选固体培养基：蔗糖5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeCl₃ 0.005g，CaCO₃0.1g，钾长石2g，琼脂20g，pH＝7.4，去离子水1000mL。

解钾细菌筛选液体培养基：蔗糖5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeCl₃ 0.005g，CaCO₃0.1g，钾长石2g，pH＝7.4，去离子水1000mL。

DF液体培养基：MnSO₄·7H₂O 0.2g，KH₂PO₄ 4.0g，Na₂HPO₄ 6.0g，柠檬酸2.0g，葡萄糖2.0g，葡萄糖酸钠2.0g，(NH4)₂SO₄2.0g，组份一与组份二溶液各取0.1mL，H₂O 1000mL，pH＝7.2。(组份一的制备：将CuSO₄·5H₂O 78.22mg,MoO₃ 10mg,H₃BO₃10mg,ZnSO₄·7H₂O124.6mg,MnSO₄·H₂O 11.9mg，溶解于100mL无菌蒸馏水中。组分二的制备：将FeSO₄·7H₂O100mg溶于10mL已灭菌的蒸馏水中，充分振荡。注：组份一和组份二，均置于-4℃保存备用。)

ADF固体培养基：把ACC溶于超纯水，用细菌过滤器过滤灭菌，加入到不含有((NH₄)₂SO₄且预先灭菌的DF液体培养基中，同时加入琼脂20g，调节pH＝7.2。ACC添加的终浓度为3.0mmol·L^-1。

ADF液体培养基：把ACC溶于超纯水，用细菌过滤器过滤灭菌，加入到不含有((NH₄)₂SO₄且预先灭菌的DF液体培养基中，pH＝7.2。ACC添加的终浓度为3.0mmol·L^-1。

Salkowski试剂：准确称取FeCl₃ 4.5g，溶于10.8M H₂SO₄中，冷却后定容至1L。其测定范围为5～200mg·L^-1，一般超过100mg·L^-1需要去离子水稀释。

(2)菌株的筛选

选取在侵蚀作用强烈发生养分贫瘠的初育土地区原生植被(这里的侵蚀作用强烈发生的主要外营力为风蚀作用，表土层无保留，母质层保留完整；养分贫瘠是有机质含量<6g/kg，速效氮含量<30mg/kg，有效磷含量<3mg/kg，速效钾含量<30mg/kg；初育土是土壤发育程度微弱，土壤剖面层次分异不明显，母质特征显著，剖面类型多为A-C或A-R型，这里的A为表土层，C为母质层，R为基岩)，小心去掉根周土壤保留根际土后，装袋低温保藏带回实验室。于超净工作台用灭菌毛刷辅以无菌水剥离洗涤，洗涤完成后转移到500mL三角瓶中，置于摇床中30℃，180r·min^-1震荡20min，静置10min，得到土壤悬浊液。取0.2mL土壤悬浊液于血球计数板用显微镜观察并估算洗涤液中菌体大概数量，采用灭菌水进行逐级稀释直至菌体浓度为100CFU/mL，取0.5mL上述稀释液分别均匀涂布于LB固体培养基中。将培养皿倒置30℃恒温培养1～2天，蘸取不同类型的典型单菌落，经3次以上平板划线纯化后，4℃保存于对应的斜面培养基中待用。

从所有菌株的保藏斜面上用接种环均匀刮取一接种环菌体分别画十字于Ashby无氮固体培养基、NBRIP溶磷固体培养基、解钾细菌筛选固体培养基以及ADF固体培养基。将画好的平板倒置放在28℃的培养箱中，每天观察生长情况，结果表明：菌体分别在上述培养基中良好生长并出现十字菌面，表明菌体具备固氮功能，溶解难溶性磷酸盐，利用矿质钾元素以及分解1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)的作用。

同时从所有菌株的保藏斜面上用接种环均匀刮取一接种环菌体接种于含有L-色氨酸(100mg·L^-1)的LB液体培养基中，于28℃，180r·min^‐1摇床培养1d。取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μL Salkowski试剂。将加入50μL 50mg·L^-1吲哚乙酸的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌吲哚乙酸。

实施例2菌株相关功能的定量分析

培养基的准备

CCM培养基：NH₄NO₃ 1g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；KH₂PO₄ 0.2g；甘露醇5.0g；K₂HPO₄0.8g；CaCl₂·2H₂O 0.06g；蔗糖5.0g；NaMoO₄·2H₂O 2.5mg；酵母粉0.1g；乳酸0.5mL；NaCl 0.1g；1.64％乙二胺四乙酸钠铁(Na·Fe·EDTA)4mL；总体积1000mL(蒸馏水补足)；pH＝7.0。

注：灭菌时将MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O和Na·Fe·EDTA分开灭菌，否则会产生沉淀。

1、固氮能力定量测定：挑取一接种环能够在Ashby无氮固体培养基中良好生长且经多次划线纯化后的菌株接种到8mL灭菌Ashby无氮液体培养基试管中，于28℃，180r·min^‐1摇床培养7d得到固氮种子液，再吸取2mL固氮种子液接种到盛有50mL灭菌Ashby无氮液体培养基三角瓶中(从剩余固氮种子液中取出5mL于消煮管内，迅速加入10mL浓硫酸终止固氮作用后测定总氮含量)，将三角瓶置于摇床于28℃，180r·min^‐1培养7d，再次测定溶液中总氮含量，每株菌重复3次，并设置空白对照。

2、溶磷作用定量测定：挑取一接种环能够在NBRIP溶磷固体培养基中良好生长且经多次划线纯化后的菌株接种到8mL LB液体培养基中，于28℃摇床培养24h，制得溶磷种子液，取溶磷种子液2mL接种到50mL NBRIP溶磷液体培养基中，于28℃，180r·min^-1摇床培养7d，将5mL培养液于4℃，12000r·min^-1离心10min，取上清液通过钼锑抗比色法测定有效磷含量，同一菌株重复3次。

3、解钾效果定量测定：挑取一接种环能够在解钾细菌筛选固体培养基中良好生长且经多次划线纯化后的菌株接种到8mL LB液体培养基中，于28℃摇床培养24h，制得解钾种子液，取解钾种子液2mL接种到灭菌的50mL解钾细菌筛选液体培养基中，于28℃，180r·min^-1摇床培养7d，将5mL培养液于4℃、12000r·min^-1离心10min，取上清液并用去离子水稀释至0.2～2mg·L^-1，通过原子吸收火焰分光光度法测定可溶性钾含量，同一菌株重复3次。

IAA(植物生长激素)分泌定量测定：配制含100mg·L^-1色氨酸的CCM培养基，分装于150mL锥形瓶中，每瓶50mL，于121℃条件下灭菌20min备用。在锥形瓶中接种由所有能够分泌吲哚乙酸的菌株制备的菌液(即从实施例1筛选得到的能够分泌吲哚乙酸菌株的保藏斜面上刮取一接种环菌体接种于8mL LB液体培养基中，于28℃摇床培养24h)4mL，每菌株重复3次，以不接种为对照。将对照和接种后的培养液于28℃，180r·min^-1摇床上培养3d。将培养液于4℃，12000r·min^-1离心5min，取上清液5mL加入等量Salkowski试剂，在黑暗条件下静置30min后摇匀，迅速吸取200μL各待测液于96孔板，用酶标仪测定样品在波长530nm下的吸光值，并在标准曲线上查出待测液的IAA浓度(mg·L^-1)。

ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)脱氨酶活性测定：

a、挑取一接种环能够在ADF固体培养基中良好生长且经多次划线纯化后的菌株接种到5mL DF液体培养基，于28℃摇床培养24h，制得脱氨酶种子液，取脱氨酶种子液2mL接种到灭菌的50mL DF液体培养基中，于28℃，180r·min^-1培养24～48h，于4℃，12000r·min^-1离心10min收集菌体。

b、将菌体用不含(NH₄)₂SO₄的DF液体培养基洗涤、离心3次(12000r·min^-1，5min，每管加5mL DF)，将菌体重悬于5mL ADF液体培养基中，于28℃，180r·min^-1摇床培养24h后离心收集菌体。

c、将菌体用0.1mol·L^-1Tris-HCl缓冲液(即0.1mol/L的Tris溶液通过HCl调节pH＝7.6)于4℃，12000r·min^-1离心5min、洗涤2次。取菌体重悬于1mL0.1mol·L^-1Tris-HCl缓冲液中(pH＝7.6)，于4℃，12000r·min^-1离心5min收集菌体，重悬于600μL 0.1mol·L^{- 1}Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)中，添加30μL甲苯迅速振荡30s以破碎细胞，得到粗酶液，取100μL粗酶液4℃储存用于测定蛋白浓度。

d、另取粗酶液200μL并加入20μL 0.5mol·L^-1ACC混匀进行水浴(30℃,15min)，以不添加ACC的空白作对照。同时加入1mL 0.56mol·L^-1HCl终止此反应，于12000r·min^-1离心5min。取上清液1mL加入800μL 0.56mol·L^-1HCl和300μL 0.2％2,4-二硝基苯肼溶液，使其充分溶解，在30℃恒温30min，再加入2mL 2mol·L^-1NaOH混匀，于540nm下测吸光度值，重复4次并设置对照组。

通过实施例1定性方法初步筛选到具备对应功能的菌株后，进一步定量分析其固氮、解磷、解钾能力、IAA分泌量以及ACC脱氨酶活性，最终筛选出相关功能最强的4株菌，并保藏至LB固体培养基的斜面上，分别编号为KSX-7、KSX1-2、KSX1-1、KSN-1，分析结果见下表1所示。

表1目标菌株筛选定量分析表

注：“-”表示该菌株不具备此项功能或没有相关活性。

实施例3目标功能菌株的生理生化鉴定

将实施例2中筛选得到的目标功能菌株KSX-7、KSX1-2、KSX1-1、KSN-1进行一系列生理生化鉴定(包括菌株的菌落形态(如图1所示)、革兰氏染色(如图2所示)、扫描电镜(如图3所示)、生长曲线(如图4～图7所示))，并进行DNA提取，16SrDNA的扩增和测序。

利用引物27F和1492R进行扩增16SrDNA，引物序列如下：

27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3

1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3

PCR扩增条件为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃最终延伸10min。

对PCR扩增产物进行测序，测序结果见序列表所示。据此确认并将其分别命名为假单胞菌KSX-7、假单胞菌KSX1-2、假单胞菌KSX1-1、根瘤土壤杆菌KSN-1。此四株菌株已于2018年06月07日，在微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center)保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。菌种名称：根瘤土壤杆菌KSN-1(Agrobacterium tumefaciens)，保藏编号为CGMCC No.15916；菌种名称：假单胞菌KSX1-1(Pseudomonas sp.)，保藏编号为CGMCCNo.15915；菌种名称：假单胞菌KSX1-2(Pseudomonas sp.)，保藏编号为CGMCC No.15914；菌种名称：假单胞菌KSX-7(Pseudomonas sp.)，保藏编号为CGMCC No.15913。

实施例4目标功能菌株的拮抗实验

选用质地均匀的滤纸，用打孔机切制成直径6mm的圆片，灭菌后烘干备用。将假单胞菌KSX-7、假单胞菌KSX1-2、假单胞菌KSX1-1、根瘤土壤杆菌KSN-1从实施例2的LB固体培养基的斜面上分别刮取一接种环菌体接种到装有50mL的LB液体培养基的三角瓶中，置于28℃，180r·min^-1摇床培养28h制得对应培养液。于无菌操作间取200枚灭菌、烘干后的滤纸片平铺置于4个已灭菌平皿内(每皿50枚)，分别注入20mL上述各菌株培养液，浸润15min备用。

取上述各菌株的培养液0.5mL均匀涂布于4个LB固体培养基中，在距培养皿中心2cm圆周线上，按120°间隔放入3片分别经另三种培养液浸润的滤纸片并编号，重复3次。把上述平皿放置到28℃的培养箱内，每隔12h观察菌株生长情况并记录是否出现抑菌圈。

实验结果表明：功能菌株假单胞菌KSX-7、假单胞菌KSX1-2、假单胞菌KSX1-1、根瘤土壤杆菌KSN-1，两两之间均不存在相互抑制的现象，如图8所示。

实施例5碳基生物复合有机肥的制备

1、复合菌液：将实施例2筛选得到的功能菌株KSX-7、KSX1-2、KSX1-1和KSN-1分别接种于LB固体培养基平皿中进行活化，30℃恒温培养箱内培养8h。挑取一接种环已活化的功能菌株KSX-7、KSX1-2、KSX1-1和KSN-1的单菌落至LB液体培养基中，于28℃、180r·min^-1下培养至菌株对数期(通过生长曲线和OD值确定)得到种子液。将种子液以20％(V/V)的接种量接入LB液体培养基中，在28℃下，0.5(V/V·min^-1)的通气量(无菌空气)，100r·min^-1的搅拌速度，培养18h得到功能菌发酵液，各功能菌发酵液菌体浓度均为10⁹CFU/mL。将各发酵液按照2：1.5：1.5：5的体积比均匀混合，得到生物改良复合菌液。

2、自制改性生物炭：将农作物秸秆于600℃厌氧碳化处理，制得生物炭。厌氧碳化是指高温同时完全隔绝氧气或低、微氧条件下有机物不发生燃烧，直接碳化的过程，此过程伴有可燃气体和焦油的产生。

碱改性：用2mol·L^-1的NaOH溶液浸泡24h处理上述生物炭以去掉其孔道中的硅类物质，处理后的样品用去离子水洗涤，直至pH值不再变化。

酸改性：再用2mol·L^-1的HCl溶液浸泡24h处理以去掉生物炭孔道中的无机盐离子，其余处理同上，以达到扩大生物炭孔道和增加比表面积的目的。

活化处理：将处理好的生物炭放入1mol·L^-1的H₃PO₄或NH₃·H₂O溶液中浸泡处理24h用于活化生物炭表面基团，同时起到携带营养元素磷、氮和缓冲/改良酸碱障碍型土壤的作用，如果是中性土壤，则不需要进行活化处理。

生物炭的碱改性和酸改性可选择其中一种方式进行改性，本实施例为了保证生物炭的效果，优选为先进行碱改性，再进行酸改性。

3、堆制的有机辅料：将畜禽粪便用干燥稻壳粉调节至碳、氮质量比为25～30:1，含水量为60％左右(手抓物料成团无水滴，松手即散)，均匀拌入复合微生物发酵的堆肥(利用5重量份的麸皮吸附1重量份的复合发酵液制成，复合发酵液由光合菌、酵母菌、黄孢原毛平革菌、黑曲霉菌以及甲基营养型芽孢杆菌发酵液按1:1:1:1:1体积比混合而成，各菌种的发酵液由1重量份的各菌种分别接入99重量份的LB液体培养基中培养24～32h制得，各菌种发酵液的菌体浓度均为10⁹CFU/mL)，并转移到发酵装置中，调整参数为：搅拌4次/天，每次15min，温度为60℃，底部通气2次/天，每次30s，物料含水率为50％、时长为7天，然后进行堆肥发酵。当堆温降低，物料疏松，无物料原来的臭味，稍有氨气味，堆内产生白色菌丝时即为完全腐熟(也可通过腐殖化系数(HI)＝HA-C/FA-C<Bernal指数(1.9)进行判断)，装袋备用。

将制备好的复合菌液、自制改性生物炭和堆制的有机辅料，按照1：2～15：15～30的质量比均匀混合，即得到本发明所述的碳基生物复合有机肥。

对比例

采用假单胞菌、根瘤农杆菌分别制备菌液，采用假单胞菌和根瘤农杆菌制备复合菌液，其菌液和复合菌液的制备过程、生物炭的改性过程以及有机辅料的堆制均与实施例5相同，最后按照菌液/复合菌液、生物炭和有机辅料的质量比为1：2～15：15～30均匀混合，即得到复合有机肥，分别作为对比例1、对比例2和对比例3。

其中，假单胞菌购自上海研生实业有限公司，根瘤农杆菌购自上海户实医药科技有限公司。

实施例6碳基生物复合有机肥贫瘠型基质应用试验

试验针对性的选取了养分极端贫瘠的粗砂土(含砂粒达95％以上，沙粒粒径0.5～1毫米)作为待改良基质，同时模拟严酷的干旱条件，通过科学设计试验方案，严苛控制试验条件，真实有效的反应本发明碳基生物复合有机肥的优异品质。

将碳基生物复合有机肥按主要成分复合菌液：自制改性生物炭(未进行活化处理)：堆制的有机辅料＝1：4：30的质量配比制成试验专用的养分障碍型基质修复碳基生物复合有机肥。

取40g试验专用的养分障碍型基质修复碳基生物复合有机肥与5kg粗砂土(风干、过10mm筛，其余理化性质见下表2)均匀混合后(肥土质量比为1：125)装入试验盆内(即BOC处理)，并灌水500mL以备移栽贫瘠耐受作物西洋蓍草(具有药用、观赏价值，可用于萃取植物精油，另一目的是确保极端养分条件下对照组能够存活)。选取长势基本一致的西洋蓍草幼苗进行移栽，移栽深度8～15cm，每盆三穴，每穴一株，移栽后7天内每天适量灌水，返青结束正常生长后按西洋蓍草原生地(乌鲁木齐)年降雨量294mm标准补充水分。

表2粗砂土基础理化性质

此外，试验还设置施用自制改性生物炭处理(C)(未经活化处理)，以及有机辅料+自制改性生物炭处理(OC)(未经活化处理)，同时以不施改良剂为空白对照(CK)，每组处理5个重复，所有处理随机区组排列。

盆栽试验于温网棚内进行，供试土壤为极端贫瘠的粗砂土，试验期间其他农学管理措施一致。2个月后全部收获并测定株高、根长、地上和地下部分鲜重和干重(105℃杀青30min，75℃烘干至恒重)，并采集种植过后的西洋蓍草根际粗砂土样品通过试剂盒(FastDNA Spin Kit for soil-MP Biomedicals)提取测定微生物总DNA浓度。

根据上述的试验步骤采用对比例1作为对照组1(BCK1)，对比例2作为对照组2(BCK2)，对比例3作为对照组3(BCK3)，其中BCK1、BCK2和BCK3的复合有机肥均按照与本发明碳基生物复合有机肥相同的质量配比制成试验专用的养分障碍型基质修复碳基生物复合有机肥。

试验结果表明：不同改良剂处理粗砂土对贫瘠耐受作物西洋蓍草的株高和根长有着显著差异，结果如图9所示。BOC处理的西洋蓍草冠径和株高较CK提高26.94％和55.71％，显著高于CK、C以及OC处理，如图10所示；与CK相比，仅施用生物炭对贫瘠耐受作物西洋蓍草的生物量影响不显著，但经过OC处理后，显著提高西洋蓍草地上部分和地下部分的生物量；与OC处理相比，BOC处理进一步提高了西洋蓍草地上部分的生物量，且达到显著水平，如图11所示。试验还发现，与CK相比，C和OC处理条件下，贫瘠耐受作物西洋蓍草根际微生物总DNA浓度依次增加，但并未达到显著水平，而BOC处理西洋蓍草根际微生物总DNA浓度显著高于除OC处理以外的其他处理，表明养分障碍型基质修复碳基生物复合有机肥能够还可增加贫瘠基质作物根际微生物的数量，如图12所示。

而且，采用BCK1和BCK2对贫瘠耐受作物西洋蓍草的株高和根长具有不同程度的促进作用，其中，BCK1中西洋蓍草的冠径和株高较CK提高3.11％和6.51％；BCK2中西洋蓍草的冠径和株高较CK提高5.11％和5.51％；而BCK3中西洋蓍草的冠径和株高较CK提高13.11％和17.51％。可见，本发明的碳基生物复合肥的效果比对比例制得的三种复合有机肥好。

序列表

<110> 四川大宇中和农业科技发展有限公司

<120> 一种碳基生物复合有机肥及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1391

<212> DNA

<213> 假单胞菌KSX1-1(Pseudomonas sp.)

<400> 1

gtccccccga aggttagact agctacttct ggtgcaaccc actcccatgg tgtgacgggc 60

ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcgacattc tgattcgcga ttactagcga 120

ttccgacttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgga ctacgatcgg ttttgtggga 180

ttagctccac ctcgcggctt ggcaaccctc tgtaccgacc attgtagcac gtgtgtagcc 240

caggccgtaa gggccatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg 300

cagtctcctt agagtgccca ccattacgtg ctggtaacta aggacaaggg ttgcgctcgt 360

tacgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtct 420

caatgttccc gaaggcacca atccatctct ggaaagttca ttggatgtca aggcctggta 480

aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc 540

aattcatttg agttttaacc ttgcggccgt actccccagg cggtcaactt aatgcgttag 600

ctgcgccact aagagctcaa ggctcccaac ggctagttga catcgtttac ggcgtggact 660

accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgca cctcagtgtc agtatcagtc 720

caggtggtcg ccttcgccac tggtgttcct tcctatatct acgcatttca ccgctacaca 780

ggaaattcca ccaccctcta ccatactcta gctcgacagt tttgaatgca gttcccaggt 840

tgagcccggg gatttcacat ccaacttaac gaaccaccta cgcgcgcttt acgcccagta 900

attccgatta acgcttgcac cctctgtatt accgcggctg ctggcacaga gttagccggt 960

gcttattctg tcggtaacgt caaaacacta acgtattagg ttaatgccct tcctcccaac 1020

ttaaagtgct ttacaatccg aagaccttct tcacacacgc ggcatggctg gatcaggctt 1080

tcgcccattg tccaatattc cccactgctg cctcccgtag gagtctggac cgtgtctcag 1140

ttccagtgtg actgatcatc ctctcagacc agttacggat cgtcgccttg gtgagccatt 1200

acctcaccaa ctagctaatc cgacctaggc tcatctgata gcgcaaggcc cgaaggtccc 1260

ctgctttctc ccgtaggacg tatgcggtat tagcgtccgt ttccgagcgt tatcccccac 1320

taccaggcag attcctaggc tttactcacc cgtccgccgc tctcaagagg tgcaagcacc 1380

tctctaccgc t 1391

<210> 2

<211> 1380

<212> DNA

<213> 假单胞菌KSX1-2(Pseudomonas sp.)

<400> 2

ttagactagc tacttctggt gcaacccact cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg 60

cccgggaacg tattcaccgc gacattctga ttcgcgatta ctagcgattc cgacttcacg 120

cagtcgagtt gcagactgcg atccggacta cgatcggttt tgtgggatta gctccacctc 180

gcggcttggc aaccctctgt accgaccatt gtagcacgtg tgtagcccag gccgtaaggg 240

ccatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tctccttaga 300

gtgcccacca ttacgtgctg gtaactaagg acaagggttg cgctcgttac gggacttaac 360

ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccatgcagca cctgtctcaa tgctcccgaa 420

ggcaccaatc catctctgga aagttcattg gatgtcaagg cctggtaagg ttcttcgcgt 480

tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcatttgagt 540

tttaaccttg cggccgtact ccccaggcgg tcaacttaat gcgttagctg cgccactaag 600

agctcaaggc tcccaacggc tagttgacat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta 660

atcctgtttg ctccccacgc tttcgcacct cagtgtcagt atcagtccag gtggtcgcct 720

tcgccactgg tgttccttcc tatatctacg catttcaccg ctacacagga aattccacca 780

ccctctacca tactctagct cgacagtttt gaatgcagtt cccaggttga gcccggggct 840

ttcacatcca acttaacgaa ccacctacgc gcgctttacg cccagtaatt ccgattaacg 900

cttgcaccct ctgtattacc gcggctgctg gcacagagtt agccggtgct tattctgtcg 960

gtaacgtcaa aacaattacg tattaggtaa ctgcccttcc tcccaactta aagtgcttta 1020

caatccgaag accttcttca cacacgcggc atggctggat caggctttcg cccattgtcc 1080

aatattcccc actgctgcct cccgtaggag tctggaccgt gtctcagttc cagtgtgact 1140

gatcatcctc tcagaccagt tacggatcgt cgccttggtg agccattacc tcaccaacta 1200

gctaatccga cctaggctca tctgatagcg caaggcccga aggtcccctg ctttctcccg 1260

taggacgtat gcggtattag cgtccgtttc cgagcgttat cccccactac caggcagatt 1320

cctaggcatt actcacccgt ccgccgctct caagaggtgc aagcacctct ctaccgctcg 1380

<210> 3

<211> 1393

<212> DNA

<213> 假单胞菌KSX-7(Pseudomonas sp.)

<400> 3

gtccccccga aggttaacta gctacttctg gtgcaaccca ctcccatggt gtgacgggcg 60

gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcgacattct gattcgcgat tactagcgat 120

tccgacttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccggac tacgatcggt tttgtgggat 180

tagctccacc tcgcggcttg gcaaccctct gtaccgacca ttgtagcacg tgtgtagccc 240

aggccgtaag ggccatgatg acttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc 300

agtctcctta gagtgcccac cattacgtgc tggtaactaa ggacaagggt tgcgctcgtt 360

acgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccatgcag cacctgtctc 420

aatgctcccg aaggcaccaa tccatctctg gaaagttcat tggatgtcaa ggcctggtaa 480

ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 540

attcatttga gttttaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtcaactta atgcgttagc 600

tgcgccacta agagctcaag gctcccaacg gctagttgac atcgtttacg gcgtggacta 660

ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcac ctcagtgtca gtatcagtcc 720

aggtggtcgc cttcgccact ggtgttcctt cctatatcta cgcatttcac cgctacacag 780

gaaattccac caccctctac catactctag ctcgacagtt ttgaatgcag ttcccaggtt 840

gagcccgggg ctttcacatc caacttaacg aaccacctac gcgcgcttta cgcccagtaa 900

ttccgattaa cgcttgcacc ctctgtatta ccgcggctgc tggcacagag ttagccggtg 960

cttattctgt cggtaacgtc aaaacaatta cgtattaggt aactgccctt cctcccaact 1020

taaagtgctt tacaatccga agaccttctt cacacacgcg gcatggctgg atcaggcttt 1080

cgcccattgt ccaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctggacc gtgtctcagt 1140

tccagtgtga ctgatcatcc tctcagacca gttacggatc gtcgccttgg tgagccatta 1200

cctcaccaac tagctaatcc gacctaggct catctgatag cgcaaggccc gaaggtcccc 1260

tgctttctcc cgtaggacgt atgcggtatt agcgtccgtt tccgagcgtt atcccccact 1320

accaggcaga ttcctaggca ttactcaccc gtccgccgct ctcaagaggt gcaagcacct 1380

ctctaccgct cga 1393

<210> 4

<211> 1338

<212> DNA

<213> 根瘤土壤杆菌KSN-1(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 4

agctgcctcc ttgcggttag cgcactacct tcgggtaaaa ccaactccca tggtgtgacg 60

ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcagca tgctgatctg cgattactag 120

cgattccaac ttcatgcact cgagttgcag agtgcaatcc gaactgagat ggcttttgga 180

gattagctcg acatcgctgt ctcgctgccc actgtcacca ccattgtagc acgtgtgtag 240

cccagcccgt aagggccatg aggacttgac gtcatcccca ccttcctctc ggcttatcac 300

cggcagtccc cttagagtgc ccaactaaat gctggcaact aagggcgagg gttgcgctcg 360

ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc agcacctgtt 420

ctggggccag cctaactgaa ggacaatgtc tccactgccc aaaccccgaa tgtcaagagc 480

tggtaaggtt ctgcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540

ccgtcaattc ctttgagttt taatcttgcg accgtactcc ccaggcggaa tgtttaatgc 600

gttagctgcg ccaccgaaca gtatactgcc cgacggctaa cattcatcgt ttacggcgtg 660

gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgcacctcag cgtcagtaat 720

ggaccagtaa gccgccttcg ccactggtgt tcctccgaat atctacgaat ttcacctcta 780

cactcggaat tccacttacc tcttccatac tcaagatacc cagtatcaaa ggcagttcca 840

gagttgagct ctgggatttc acccctgact taaatatccg cctacgtgcg ctttacgccc 900

agtaattccg aacaacgcta gcccccttcg tattaccgcg gctgctggca cgaagttagc 960

cggggcttct tctccggata ccgtcattat cttctccggt gaaagagctt tacaacccta 1020

aggccttcat cactcacgcg gcatggctgg atcaggcttg cgcccattgt ccaatattcc 1080

ccactgctgc ctcccgtagg agtttgggcc gtgtctcagt cccaatgtgg ctgatcatcc 1140

tctcagacca gctatggatc gtcgccttgg taggccttta ccccaccaac tagctaatcc 1200

aacgcgggcc aatccttccc cgataaatct ttcccccgta gggcgtatgc ggtattaatt 1260

ccagtttccc ggagctattc cgcaggaaag ggtatgttcc cacgcgttac tcacccgtct 1320

gccactcccc ttgcgggg 1338

Claims (10)

1.一种碳基生物复合有机肥，其特征在于，按重量份数计，所述有机肥包括1份复合菌液、2～15份生物炭、15～30份有机辅料；所述复合菌液由假单胞菌和根瘤农杆菌制备而成，所述有机辅料由畜禽粪便拌入复合微生物发酵的堆肥制成。

2.根据权利要求1所述的碳基生物复合有机肥，其特征在于，所述假单胞菌由假单胞菌KSX-7、假单胞菌KSX1-2和假单胞菌KSX1-1混合而成，所述假单胞菌KSX-7、假单胞菌KSX1-2和假单胞菌KSX1-1分别于2018年06月07日，在微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为：CGMCC No.15913、CGMCC No.15914和CGMCC No.15915；

所述根瘤农杆菌由根瘤土壤杆菌KSN-1制成，所述根瘤土壤杆菌KSN-1于2018年06月07日，在微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.15916；

所述假单胞菌KSX-7、假单胞菌KSX1-2、假单胞菌KSX1-1与所述根瘤土壤杆菌KSN-1的体积比为2：1.5：1.5：5，菌体浓度均为10⁹CFU/mL。

3.根据权利要求1所述的碳基生物复合有机肥，其特征在于，所述生物炭为经过碱改性和/或酸改性的生物炭。

4.如权利要求1所述的一种碳基生物复合有机肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制复合菌液：将假单胞菌KSX-7、假单胞菌KSX1-2、假单胞菌KSX1-1、根瘤土壤杆菌KSN-1四种菌的发酵液混合，培养得到复合菌液；

(2)称量1重量份复合菌液、2～15重量份生物炭、15～30重量份有机辅料混合制得所述碳基生物复合有机肥。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述假单胞菌KSX-7、假单胞菌KSX1-2、假单胞菌KSX1-1、根瘤土壤杆菌KSN-1的体积比为2：1.5：1.5：5，菌体浓度均为10⁹CFU/mL。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述生物炭为经过碱改性和/或酸改性的生物炭。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述生物炭的制备包括以下步骤：将生物炭用2mol·L^-1的NaOH溶液浸泡22～26h，再用去离子水洗涤，直至pH值不再变化，获得碱改性生物炭；将所述碱改性生物炭用2mol·L^-1的HCl溶液浸泡22～26h，再用去离子水洗涤，直至pH值不再变化，获得酸碱改性生物炭；将所述酸碱改性生物质碳放入1mol·L^-1的H₃PO₄或NH₃·H₂O溶液中浸泡处理22～26h，获得所述生物炭。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述有机辅料的制备过程为：将碳、氮比为25～30:1的畜禽粪便均匀拌入复合微生物发酵的堆肥中，并转移到发酵装置中，调整参数，然后进行堆肥发酵，即制得有机辅料。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述复合微生物发酵的堆肥由5重量份的麸皮吸附1重量份的复合发酵液制成，所述复合发酵液由光合菌、酵母菌、黄孢原毛平革菌、黑曲霉菌以及甲基营养型芽孢杆菌发酵液按1:1:1:1:1体积比混合而成，各菌种发酵液的菌体浓度均为10⁹CFU/mL。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述调整参数为搅拌4次/天，每次15min，温度为60℃，底部通气2次/天，每次30s，物料含水率为50％、时长为7天。