CN108821908A - 一种包含巴达维亚芽胞杆菌hj-1的菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包含巴达维亚芽胞杆菌HJ‑1的菌剂及其应用。新筛选的菌株巴达维亚芽孢杆菌HJ‑1是一株功能广泛且强大的菌株。它具有钝化重金属镉和/或铅和/或砷等多种功能。利用该菌株制备的菌剂可广泛应用于轻中度镉、铅、砷污染稻田，可使重金属污染稻田的土壤活性态镉、铅和砷分别下降52.2‑53.3％、51.0‑58.1％和45.0‑48.8％，精米镉、铅和砷含量分别下降54.2‑55.5％、53.3‑55.0％和47.8‑50.0％，同时，还使土壤pH值提高0.7‑1.13，该产品兼具修复酸化土壤、培肥地力和改善土壤理化特性等多种功能，具有巨大推广应用价值。

Description

一种包含巴达维亚芽胞杆菌HJ-1的菌剂及其应用
技术领域
本发明属于微生物修复重金属污染土壤的技术领域，具体涉及一种包含巴达维亚芽胞杆菌HJ-1的菌剂及其在铅镉砷复合污染土壤中的应用。
背景技术
土壤是宝贵的自然资源，是人类生存的必要条件。随着工业“三 废”、城市废弃物、机动车尾气的排放、污水灌溉和劣质化肥的使用， 土壤重金属污染日趋严重。湖南是全国最大的稻米产区之一，素有“鱼 米之乡”的美誉，但同时湖南省也是重金属污染最严重的地区之一。
土壤重金属污染不仅使土壤肥力下降、作物产量、品质下降，还会导致水体污染，最重要的是土壤重金属污染会通过食物链的作用造成重金属最终在人体内的累积，严重影响人类的身体健康。重金属对人类有致癌、致畸、致突变作用。例如重金属镉，长期接触会导致高血压，引起肾脏损害，破坏骨钙，进而导致骨质疏松和软化。
目前重金属污染土壤修复技术主要有植物修复法、电动力修复法、淋滤法、热解吸法、玻璃化法和固定稳定化法等，在以上重金属污染土壤治理方法中，植物修复法需要相当长的时间(几十年甚至几百年)且存在植物的处理问题；电动力学修复只适用于小面积污染，而且现场不易操作；淋滤法需要添加表面活性剂，存在污染地下水的危险；热解吸法是利用加热回收气体的方法，该方法不适合现场操作，且存在费用高，适用范围窄等问题；玻璃化法改变了土壤的性质，只适用于污染严重且面积小的情况；添加石灰的稳定化方法提高了土壤的pH值，会造成土壤板结，而且对碱性土壤效果不好。因此都不适合用来治理大面积的稻田重金属污染。
土壤重金属污染的微生物修复是利用微生物的生物活性对重金属的亲和吸附或转化为低毒产物，从而降低重金属的污染程度。利用微生物来减轻或消除重金属污染，国内外已有许多报道，微生物不能降解和破坏重金属，但可通过改变它们的化学或物理特性而影响金属在环境中的迁移与转化，而且微生物培养简单，相应的制剂成本低、修复重金属污染效果好，起效快、时效长，不会造成二次污染。因此，微生物修复不失为重金属土壤治理的理想方法。但现阶段，还需要进一步筛选更多的、功能上更加强大的微生物种类，以期在实际应用中发挥更加突出的作用。
原位钝化修复方法从成本和时间上能较好的满足治理土壤中重金属污染的要求。原位钝化就是通过往土壤中加入钝化剂，调节和改变重金属在土壤中的物理化学性质，使其产生沉淀、吸附、离子交换、腐殖化和氧化-还原等一系列反应，降低其在土壤环境中的生物有效性和可迁移性，可显著减少重金属进入食物链，可以实现环保与生产的协调发展以及确保社会与经济的持续发展。
现有修复技术大都采用单一的有机钝化剂或无机钝化剂，随着稻田土壤重金属污染风险的加大，单一的无机或有机钝化剂的修复效果往往不够理想，存在施用量大、效果不稳定或破坏土壤质量等问题，很难达到修复标准。联合使用多种钝化剂，找到一个合适的比例进行复合，相互间取长补短，可以发挥复合钝化剂的最佳效益，其钝化能力大于单一的无机或有机钝化剂，有效提高修复效果。
如果将复合的钝化剂与功能强大的微生物联合起来制备的产品用于土壤重金属修复，综合了两种修复方式的优势，必将有良好的应用前景。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种包含巴达维亚芽胞杆菌(Bacillus bataviensis)HJ-1的菌剂，巴达维亚芽胞杆菌HJ-1保藏编号为CGMCC NO.13239。该菌株在降低土壤中有效态铅、镉和砷方面有突出显著的效果。
本发明巴达维亚芽胞杆菌菌株的筛选及分子鉴定：
于重金属污染耕地采集土壤样品，用无菌纸袋带回实验室，进行菌株的分离和筛选。采用梯度稀释法分离菌株，称取土样10g，放入装有90ml无菌水的三角瓶中，摇床上震荡30min，即得稀释度为10–1的土壤悬液。另取装有4.5ml 无菌水的玻璃试管6支，分别标记稀释度为10–2，10–3，10–4，10–5，10–6，10–7。从稀释度为10–1土壤悬液中吸取0.5ml加入到标记稀释度为10–2的玻璃试管(15 ×150mm)，充分震荡混匀，即得稀释度为10–2土壤稀释液。依次按10倍法梯度稀释，可得稀释度分别为10–3，10–4，10–5，10–6，10–7土壤稀释液。分别吸取稀释度为10–4、10–5、10–6，10–7土壤稀释液0.1mL，加在已制备的分别含有2 mmol/L Cd(II)、Pb(II)、As(III)的LB固体培养基上。用涂布棒将稀释液反复涂布，充分混匀，铺平后于培养箱中倒置培养。待长出菌落后挑取细菌单菌落，划线以获得纯培养。镜检，转至斜面4℃保存。
筛选结果如下表1
表1细菌初步梯度筛选结果
注：“△”指LB平板生长菌落太多，连成一片，无法统计。
将筛选获得的菌株取生长至对数期的菌液，离心收集菌体，用试剂盒提取基因组DNA。依照细菌16S rDNA中的保守区设计并合成引物，为27-F和 1492-R，
27-F:GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
1492-R:AAGGAGGTGATCCARCCGCA。
用该对引物以提取的基因组DNA为模板扩增，获得PCR产物。跑胶检测后，由上海生工生物工程技术股份有限公司完成测序。
将获得的拼接序列，通过Blast程序与GenBank数据库中已有的16S rDNA 序列进行比对，与巴达维亚芽胞杆菌(Bacillus bataviensis)具有99％的高度同源性，该菌株HJ-1初步鉴定为巴达维亚芽胞杆菌(Bacillus bataviensis)。
本发明所述的巴达维亚芽胞杆菌HJ-1能够与土壤中的重金属镉和/或铅和/ 或砷结合。
本发明所述的巴达维亚芽胞杆菌HJ-1是依靠细胞壁上包括羟基、羰基、酰胺基、磷酸基在内的基团进行表面吸附重金属。
本发明所述的巴达维亚芽胞杆菌HJ-1通过其代谢产物进行胞外络合、胞外沉淀、吸附等方式固定土壤中的重金属。
本发明所述的巴达维亚芽胞杆菌HJ-1利用硫源生产硫化氢，游离的硫离子与镉和/或铅和/或砷结合，生成难溶的硫化镉和/或硫化铅和/或硫化砷。
本发明所述的巴达维亚芽胞杆菌HJ-1还能用于还原铁。
本发明的次要目的是提供一种具体的含有巴达维亚芽胞杆菌HJ-1的菌剂。具体配方如下：
各组分的重量百分比为：腐熟农业副产物10wt％～20wt％，钙镁磷肥 10％～20wt％，巯基功能化凹凸棒石10％～20wt％，巯基功能化蒙脱石15wt％～ 20wt％，生物炭5％～15wt％，堆积发酵甘蔗滤泥10wt％～20wt％，草炭5wt％～ 15wt％，微生物发酵液1.5％～2.5％，所述的微生物发酵液中的微生物是保藏编号为CGMCC NO.13239的巴达维亚芽胞杆菌(Bacillus bataviensis)HJ-1。
进一步优选各组分的重量百分比为：腐熟农业副产物15％，钙镁磷肥15％，巯基功能化凹凸棒石15％，巯基功能化蒙脱石18％，生物炭10％，堆积发酵甘蔗滤泥15％，草炭10％，微生物发酵液2％。
上述微生物发酵液的制备如下：
a、菌种活化
将巴达维亚芽胞杆菌接种于固体种子培养基斜面上，在28～35℃条件下活化培养24～36h；
固体种子培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；琼脂2％；pH自然；
b、种子液制备
将巴达维亚芽胞杆菌从固体种子培养基斜面上接种于液体种子培养基中，在28～35℃条件下震荡培养24～36h，制备种子液；
液体种子培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；pH 自然；
c、种子罐发酵
将步骤b得到的种子液以待接种培养基体积百分比5％-8％的接种量接种到种子罐；通入无菌空气和搅拌，在28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～2 Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，得一级种子罐发酵菌液；将一级种子罐发酵液按体积百分比5％～8％接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌，在 28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～2Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，得二级种子罐发酵菌液；
1L一级或二级种子罐培养基配方：牛肉膏0.3～0.8％，蛋白胨0.7～1.2％，葡萄糖0.1～0.6％，NaCl 0.1～0.6％，MgSO4·7H2O 0.01～0.06％，K2HPO4 0.01％～0.06％，MnSO40.001％～0.008％，余为水，pH值消毒前7.0～7.8，消毒后pH6.8～7.5；所述培养基配方成分的百分比含量均为重量百分比；
d、生产发酵罐培养
28℃～35℃，按培养基体积百分比5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐，通入无菌空气和搅拌，在28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～ 2Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，发酵完毕后微生物发酵液中巴达维亚芽胞杆菌含量：1×106～1×108个活菌/毫升；
1L发酵罐培养基配方：淀粉2％～3％，豆饼粉0.5～1.5％，酵母粉0.5～1.0％，KH2PO4 0.08～0.22％，K2HPO4 0.10～2.2％，CaCO3 0.1～2.20％,FeSO4·7H2O 0.001～0.005％，余为水，pH值消毒前8.5～11.0，消毒后6.5～9.5；所述培养基配方成分的百分比含量均为重量百分比。
腐熟农业副产物是将粉碎后过2mm筛的农作物秸秆和牛粪等比例混合混合均匀，调节碳氮比至20～30，调节含水量至55wt％，加入3wt‰-5wt‰有机物料腐熟剂(含高低温芽孢杆菌和高温真菌等)，进行堆肥，当堆温超过50℃时，开始翻堆通气，翻堆为每天2-3次，直到温度降至30℃以下时，停止翻堆，即得。
堆积发酵甘蔗滤泥的具体制备过程如下：将甘蔗滤泥堆积于发酵场，自然发酵30d-40d，甘蔗滤泥自上而下腐化变熟；将腐熟的甘蔗滤泥摊开，使其厚度 15cm，在阳光下晒1-2d；利用破碎机对晒干的滤泥进行破碎80目筛。
生物炭、草炭经粉碎后过3-5mm筛备用；
巯基功能化凹凸棒石、巯基功能化蒙脱石的具体制备过程如下：将0.5mol/L 的半胱胺盐酸水溶液与质量百分比3％的凹凸棒石水悬浮液按照体积比1:5的比例混合，并在搅拌机中搅拌反应1.5h；反应后的样品经离心分离，去除掉上层水溶液，保留固态物质，得到的固态物质经蒸馏水洗涤5次后，60℃烘干，研磨后过80-110目筛备用。以同样的方法得到巯基功能化的蒙脱石。
本发明菌剂制备时将各组分依次混合即可。
上述的腐熟的农业副产物(农作物秸秆、牛粪)组分是一种优质的有机肥，其有机质含量30wt％～45wt％，其具有的活性基团(如：羧基，氨基和羟基等) 很容易作为配位体与重金属元素Cd、Pb、As等络合或螯合，钝化土壤中的重金属。
上述的草炭组分富含有机质(50wt％-80wt％)和腐殖质(20wt％-40wt％)，含氮、磷、钾总含量在3wt％以上，具有很大的内表面(孔隙率约为95％，比表面积约为200m2/g)和良好的胶体表面性质，如吸附力、黏结力和高度分散性等，含有大量的极性基团，包括醇类、醛类、羧酸、羟基等，可络合或螯合土壤中的重金属，同时，可以增进土壤透气、透水性，改良土壤，提高肥料利用率。
上述的钙镁磷肥主要成分包括Ca3(PO4)2、CaSiO3、MgSiO3，其主要化学组成为：MgO≥12％，SiO2≥20％，CaO≥25％，可提高土壤中有效钙、镁、硅的含量，提高土壤pH值，降低土壤中有效镉、铅、砷含量，进而防止水稻吸收过多的重金属。
上述的生物炭主要由农林废弃物、有机废弃物等残体在缺氧的情况下，经高温慢热解产生的一类难溶的、稳定的、高度芳香化的、富含碳素的固态物质，生物炭具有疏松多孔的结构、比表面积巨大、表面带有大量负电荷和较高的电荷密度，并且富含一系列含氧、含氮、含硫官能团，具有很大的阳离子交换量，是一种良好的吸附材料。
上述的巯基功能化凹凸棒石组分是一种层链状结构的含水富镁铝硅酸盐粘土矿物，其主要化学组成为：(Mg，Al，Fe)O 23.83％，SiO2 56.96％，其结构内 Mg-O、Si-O、OH-、SH-具有很强的化学活性，与重金属离子结合组成可变电荷表面，发生配合反应，吸附土壤中的重金属。
上述的巯基功能化蒙脱石的分子式为(Al,Mg)2[Si4O10](OH)2·nH2O,中间为铝氧八面体，上下为硅氧四面体所组成的三层片状结构的硅酸盐黏土矿物，在晶体构造层间含水及一些交换阳离子，有较高的离子交换容量。其主要化学组成为：SiO2 66.72％，Al2O328.53％，其结构内Mg-O、Si-O、OH-、SH-具有很强的化学活性，对土壤中的重金属具有很强的吸附能力。
上述的堆积发酵甘蔗滤泥富含有机质(214.6g/kg)，氮磷钾全量及速效氮磷钾含量均相当丰富，pH值呈弱碱性，可以明显增加土壤中的有机质、全氮和全磷含量，显著改善土壤中的速效养分状况，提高土壤pH值、降低土壤中有效镉、铅、砷含量，培肥地力。
上述的微生物发酵液组分是指巴达维亚芽孢杆菌发酵液，一方面该微生物可依靠细胞壁上的羟基(-OH)、羰基(-CO-)、酰胺基 (-CO-NH-)、磷酸基(-PO43-)等基团进行表面吸附、并通过其代谢产物进行胞外络合、胞外沉淀等络合和固定土壤中的重金属镉、铅和砷；另一方面，该菌株在生长过程中会利用土壤中的硫源生产大量的硫化氢，游离的硫离子与土壤中的镉或铅或砷结合，生成难溶的硫化镉或硫化铅或硫化砷，进而有效降低土壤中的有效镉、铅、砷含量。本发明巴达维亚芽孢杆菌来源于长沙市宁乡县镉污染稻田土壤，革兰氏染色阳性，兼性厌氧，杆状，产芽孢，经16S rDNA分子鉴定和系统发育分析初步鉴定为巴达维亚芽孢杆菌。在土壤中，该菌株定殖能力强，能够高效钝化土壤中的重金属，降低植物的吸收。所述巴达维亚芽胞杆菌(Bacillus bataviensis)HJ-1于2016年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.13239。
本发明新筛选的菌株巴达维亚芽孢杆菌HJ-1是一株功能广泛且强大的菌株。它依靠细胞壁上的羟基(-OH)、羰基(-CO-)、酰胺基(-CO-NH-)、磷酸基(-PO43-) 等基团进行表面吸附重金属镉、铅和砷。它能利用硫源生产硫化氢，游离的硫离子与镉和/或铅和/或砷结合，生成难溶的硫化镉和/或硫化铅和/或硫化砷，从而有效降低土壤中的有效态镉、铅和砷。因此，该菌株可以用于制备降低土壤中有效镉、铅、砷含量的制剂。它还可利用有机物为电子供体，在氧化有机物的同时，以Fe(Ⅲ)作为惟一的电子受体，使Fe(Ⅲ)还原为Fe(Ⅱ),并由代谢过程中获得能量支持生长，并且该菌株对多种重金属表现出一定的抗性。因此，本发明的菌株具有广阔的应用前景。
本发明的第三个目的是提供上述菌剂的应用。包括如下几方面：
所述的包含巴达维亚芽胞杆菌HJ-1的菌剂用于与重金属结合。尤其是用于与镉和/或铅和/或砷结合。更进一步的是用于与土壤中的重金属镉和/或铅和/或砷结合。
所述的包含巴达维亚芽胞杆菌HJ-1的菌剂能用于制备降低土壤中有效镉、铅、砷中一种或几种含量的制剂。
所述的包含巴达维亚芽胞杆菌HJ-1的菌剂还能用于制备降低水稻中镉、铅、砷中一种或几种含量的制剂。
本发明的菌剂产品与现有土壤调理剂产品相比，有着以下优势：(1)本产品由提高土壤有机质含量的农业副产物、生物炭和草炭，钝化土壤中重金属和提高土壤pH值的钙镁磷肥、甘蔗滤泥、巯基功能化凹凸棒石、巯基功能化蒙脱石和微生物高效固定菌剂组成。研究表明，土壤有机物质不仅影响土壤重金属的积累，而且能与重金属元素形成络合物，影响各形态重金属的迁移转化，进而影响土壤重金属的有效性。本产品可以迅速提高土壤的有机质含量，最直接的作用是改良土壤结构，促进团粒状结构的形成，从而增加土壤的疏松性，改善土壤保水、保肥能力和通透性；
另外，土壤中的有机质、堆积发酵甘蔗滤泥、钙镁磷肥、巯基功能化凹凸棒石和巯基功能化蒙脱石优势互补、协同增效，有效吸附、络合或螯合土壤中的重金属，对比试验结果表明，
单施有机钝化剂(CK2)或单施无机矿物(CK3)或缺施菌液(CK4)的钝化效果明显低于本产品(SP)，复合材料间取长补短，进而有效降低了土壤中有效镉、铅、砷含量，减少植物的吸收。田间试验的结果表明，施用本发明产品，可使重金属污染稻田的土壤活性态镉、铅和砷分别下降52.2-53.3％、51.0-58.1％和45.0-48.8％，精米镉、铅和砷含量分别下降54.2-55.5％、53.3-55.0％和 47.8-50.0％。
(2)本产品集钙镁肥、硅肥、有机质和提高土壤pH值于一体，因此，本产品既具有肥料的生产功能，又具有原位钝化土壤有效镉、铅、砷的土壤修复功能，是一种多功能的环保型产品。水稻是需硅量较多的作物，在水稻优化配方施肥中，重视大量元素合理施肥，硅元素在水稻生长发育过程中起到了很大的作用，不仅大幅度降低水稻对重金属的富集，而且使水稻植株产生一种较强硬的硅化细胞，使害虫不易咬噬，减少病虫危害。
(3)土壤酸化带来的直接影响是增加了重金属在土壤中的有效性，从而进一步加剧了重金属污染的危害。本产品兼具有酸性土壤改良的功能，能够大幅度提高酸性土壤的pH值，促进土壤中有效态重金属向难溶态及残渣态的转化，而且适用于各种不同成土母质的水稻土壤。田间试验的结果表明，施用本发明产品，稻田土壤的pH值比对照提高了0.7-1.13。
(4)本产品包含高定殖力、高固定的微生物钝化剂，通过向污染土壤中添加镉、铅、砷高固定微生物，利用这些微生物对重金属的胞外络合、胞内积累、沉淀和氧化还原反应等作用，降低土壤中重金属的生物可利用率，进而降低农作物和农产品中镉、铅、砷的含量。
(5)本产品治理修复过程属于原位修复，不占用耕地、不影响农业生产和收益，而且成本低、对环境影响小、不破坏土壤环境，非常适合用来处理大面积受到轻中度镉、铅、砷污染的农田土壤。
(6)本发明的原材料来源广泛，成本低廉，制备工艺简单，方便易行，具有很广阔的应用前景。
总之，本发明制备的菌剂可广泛应用于轻中度镉、铅、砷污染稻田，可使重金属污染稻田的土壤活性态镉、铅和砷分别下降52.2-53.3％、51.0-58.1％和 45.0-48.8％，精米镉、铅和砷含量分别下降54.2-55.5％、53.3-55.0％和47.8-50.0％，同时，还使土壤pH值提高0.7-1.13，该产品兼具修复酸化土壤、培肥地力和改善土壤理化特性等多种功能，具有巨大推广应用价值。
附图说明
图1.菌株HJ-1硫化氢变色实验；
左为HJ-1醋酸铅试纸变色实验；右为未其它芽孢杆菌对照。
图2.菌株HJ-1在镉溶液中的培养实验；
CK：未接菌对照；12-48h：分别为HJ-1接菌12h、24h和48h后，
图中显示了，该菌株在含镉离子的溶液中，培养12h、24h和48h，溶液中 CdS的产生情况，CdS为桔黄至深棕色的晶体。
图3.菌株HJ-1的傅立叶红外(FT-IR)光谱分析；
波长为3414cm-1的条带表明该菌株含有基团-NH和-OH，波长为1649,1545, 1454,1237和1056cm-1的条带表明该菌株含有-NH扭转基团或羰基基团。该菌株的表面含有-NH,-OH和C-O等基团。
图4.HJ-1菌株的铁还原能力实验结果；
CK1：Fe(III)未接菌对照；CK：Fe(II)未接菌对照；HJ-1：接菌HJ-1的Fe(III) 还原为Fe(II)的实验。
图5.菌株HJ-1的重金属抗性实验。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明，而不会形成对本发明的限制。
实施例1
本发明硫化氢产生实验(醋酸铅试纸验证实验)。
1.巴达维亚芽胞杆菌(Bacillus bataviensis)HJ-1产硫化氢初步判断
活化菌株HJ-1，在LB培养基中通过醋酸铅试纸初步筛选可产硫化氢的情况。
结果：采用磨口严封三角瓶，接入菌株之后，先用封口膜封口摇床培养至菌株稍微生长，然后在无菌条件下换为磨口筛，并固定悬挂醋酸铅试纸，继续培养。结果表明，在过夜培养后，醋酸铅试纸变黑，显示了该菌株可产生硫化氢，生成了黑色硫化铅。结果见图1。
2.镉溶液中培养菌株HJ-1后CdS的产生实验。
将菌株HJ-1在镉溶液中的培养，CK：未接菌对照；12-48h：分别为HJ-1 接菌12h、24h和48h后，图中显示了，该菌株在含镉离子的溶液中，培养12h、 24h和48h，溶液中CdS的产生情况，CdS为桔黄至深棕色的晶体。可见该菌株可产生硫化氢，生成了CdS。
实施例2
菌株HJ-1的傅立叶红外(FT-IR)光谱分析。
HJ-1菌株培养后，冷冻干燥，并进行傅立叶红外光谱分析(FT-IR)。见图3。
结果表明，波长为3414cm-1的条带表明该菌株含有基团-NH和-OH，波长为1649,1545,1454,1237和1056cm-1的条带表明该菌株含有-NH扭转基团或羰基基团。该菌株的表面含有-NH,-OH和C-O等基团。
实施例3
在装有无菌培养基的三角瓶中分别添加镉(II)、铅(II)、砷(III)母液，使镉(II)、铅(II)、砷(III)的终浓度分别达到100mg/L，在无菌条件下，以2％的接种量分别接种巴达维亚芽胞杆菌HJ-1，对照CK不接菌。接种后于30℃震荡(180rpm) 培养48h，之后6000rpm离心10min，分别测定上清液中的镉(II)、铅(II)、砷(III) 的含量。结果见表2。
表2.菌株HJ-1在培养液中对镉(II)、铅(II)、砷(III)的吸附效果
实施例4
HJ-1菌株的铁还原能力实验
异化Fe(III)还原是厌氧及兼性厌氧水稻土中重要的生物化学过程之一，该菌株可利用有机物为电子供体，在氧化有机物的同时，以Fe(III)作为惟一的电子受体，使Fe(III)还原为Fe(II)，并由代谢过程中获得能量支持生长。结果见图4。
CH3COO-+8Fe(III)+4H2O→2HCO3 -+8Fe(II)+9H+
实施例5
菌株HJ-1的重金属抗性实验，结果见图5。
图中显示了菌株HJ-1对多种重金属离子的最低抑制浓度；说明该菌株对多种重金属表现出一定的抗性。
实施例6
菌株HJ-1的钝化镉、铅、砷的效果。
无菌草炭和微生物发酵液以5∶1的比例混合均匀，即为微生物菌剂产品。整地前将所述的微生物菌剂产品按100kg/亩全田均匀撒施，翻地，经耕耙整地后即可种植。单独施用所述的微生物菌剂产品，米镉、米铅和米砷的降低率分别为36％、33％和38％。
实施例7
本发明降低镉、铅、砷含量的菌剂均按照：腐熟的农业副产物(农作物秸秆、牛粪)10wt％～20wt％，钙镁磷肥10％～20wt％，巯基功能化凹凸棒石 10％～20wt％，巯基功能化蒙脱石15wt％～20wt％，生物炭5％～15wt％，堆积发酵甘蔗滤泥10wt％～20wt％，草炭5wt％～15wt％，微生物发酵液1.5％～2.5％混合制备。
但实施例优选：包含有腐熟的农业副产物(农作物秸秆、牛粪)15％，钙镁磷肥15％，巯基功能化凹凸棒石15％，巯基功能化蒙脱石18％，生物炭10％，堆积发酵甘蔗滤泥15％，草炭10wt％，微生物发酵液2％。
烘干农业副产物(农作物秸秆、牛粪)经粉碎后过2mm筛备用；生物炭、草炭经粉碎后过3-5mm筛备用；巯基功能化凹凸棒石、巯基功能化蒙脱石经机械破碎、细磨后过80-110目筛备用；堆积发酵甘蔗滤泥经晒干粉碎后过80目筛。
制备方法：
A.烘干农作物秸秆和牛粪经粉碎后过2mm筛备用；
B.将粉碎后的农作物秸秆、牛粪按重量比1:1的比例混合均匀，调节碳氮比至 20～30，调节含水量至55wt％，加入3wt‰-5wt‰有机物料腐熟剂(含高低温芽孢杆菌和高温真菌等，如“湘润邦”牌有机物料腐熟剂)，进行堆肥，当堆温超过 50℃时，开始翻堆通气，翻堆为每天2-3次，直到温度降至30℃以下时，停止翻堆，得到腐熟的农业副产物(农作物秸秆、牛粪)组分；
C.生物炭、草炭经粉碎后过3-5mm筛灭菌备用；
巯基功能化凹凸棒石、巯基功能化蒙脱石的具体制备过程如下：将0.5mol/L的半胱胺盐酸水溶液与质量百分比3％的凹凸棒石水悬浮液按照体积比1:5的比例混合，并在搅拌机中搅拌反应1.5h；反应后的样品经离心分离，去除掉上层水溶液，保留固态物质，得到的固态物质经蒸馏水洗涤5次后，60℃烘干，研磨后过80-110目筛备用。以同样的方法得到巯基功能化的蒙脱石。
D.甘蔗滤泥堆积发酵过程：
a、将甘蔗滤泥堆积于发酵场，自然发酵30d-40d，甘蔗滤泥自上而下腐化变熟；
b、将腐熟的甘蔗滤泥摊开，使其厚度15cm左右，在阳光下晒1-2d；
c、利用破碎机对晒干的滤泥进行破碎过80目筛。
E.微生物发酵菌剂；
a、菌种活化
将巴达维亚芽胞杆菌HJ-1接种于固体种子培养基斜面上，在28～35℃条件下活化培养24～36h；
固体种子培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；琼脂2％；pH自然；
b、种子液制备
将巴达维亚芽胞杆菌从固体种子培养基斜面上接种于液体种子培养基中，在28～35℃条件下震荡培养24～36h，制备种子液；
液体种子培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；pH 自然；
c、种子罐发酵
将步骤b得到的种子液以待接种培养基体积百分比5％-8％的接种量接种到种子罐；通入无菌空气和搅拌，在28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～2 Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，得一级种子罐发酵菌液；将一级种子罐发酵液按体积百分比5％～8％接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌，在 28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～2Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，得二级种子罐发酵菌液；
1L一级或二级种子罐培养基配方：牛肉膏0.3～0.8％，蛋白胨0.7～1.2％，葡萄糖0.1～0.6％，NaCl 0.1～0.6％，MgSO4·7H2O 0.01～0.06％，K2HPO4 0.01％～0.06％，MnSO40.001％～0.008％，余为水，pH值消毒前7.0～7.8，消毒后pH6.8～7.5；所述培养基配方成分的百分比含量均为重量百分比；
d、生产发酵罐培养
28℃～35℃，按培养基体积百分比5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐，通入无菌空气和搅拌，在28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～ 2Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，发酵完毕后微生物发酵液中巴达维亚芽胞杆菌：1×106～1×108个活菌/毫升；
1L发酵罐培养基配方：淀粉2％～3％，豆饼粉0.5～1.5％，酵母粉0.5～1.0％，KH2PO4 0.08～0.22％，K2HPO4 0.10～2.2％，CaCO3 0.1～2.20％,FeSO4·7H2O 0.001～0.005％，余为水，pH值消毒前8.5～11.0，消毒后6.5～9.5；所述培养基配方成分的百分比含量均为重量百分比。
发酵完毕放罐后的功能菌菌液，无菌草炭和功能菌菌液以5:1的比例混合均匀，即为微生物菌剂产品。
F.将步骤A、B、C、D、E制备的原料按比例混合均匀，即为本发明菌剂产品。
本发明实施例产品有机质含量30-40％，降低土壤重金属有效成分 SiO2+MgO+CaO含量28.7％，可广泛应用于被重金属污染的土壤。
大田肥效试验：
(1)试验设计：
2015年在宁乡县回龙铺镇(土壤属于镉污染类型)和益阳市赫山区(土壤属镉污染类型)两地进行了田间试验。两地为本发明申请人-湖南省微生物研究院建立的“降低水稻镉吸收综合调控技术示范基地”。
1.试验处理
试验田共分5个处理，设置不施用任何钝化剂CK1；每亩施用100kg有机钝化剂按照腐熟农业副产物15份、生物炭10份、草炭10份和堆积发酵甘蔗滤泥15份的重量份混合(CK2)；每亩施用100.0kg无机钝化剂按照钙镁磷肥15 份、巯基化凹凸棒石15份和巯基化蒙脱石18份的重量份混合(CK3)；每亩施用100.0kg的腐熟农业副产物+钙镁磷肥+巯基化凹凸棒石+堆积发酵甘蔗滤泥+ 生物炭+巯基化蒙脱石+草炭，其中腐熟农业副产物15份，钙镁磷肥15份，巯基化凹凸棒石15份，巯基化蒙脱石18份，生物炭10份，草炭10份，堆积发酵甘蔗滤泥15份的重量份(CK4)；和每亩施用100.0kg的本发明产品(SP)，每个处理3次重复，共15个小区，种植水稻的小区面积为30.0m2(5m×6m)，用0.2m宽的厚塑料膜包裹田埂(埋深0.4m)隔开。田间管理、追肥和病虫害防治：按当地农民种植常规方式进行。
2.各地均统一选用中早籼39号作物品种。
3.施用方法
根据土壤营养条件和污染状况合理调整施用量，整地前全田均匀撒施(也可与基肥混合均匀后撒施)，经耕耙整地后即可种植。
4.检测项目
土壤pH值、土壤有效态镉含量、精米中镉含量；土壤有效铅含量、精米中铅含量；土壤有效态砷含量、精米中砷含量。
5.主要结果
结果表明(见附表3-6)，施用本产品至水稻成熟后，可使重金属污染稻田的土壤活性态镉、铅和砷分别下降52.2-53.3％、51.0-58.1％和45.0-48.8％，精米镉、铅和砷含量分别下降54.2-55.5％、53.3-55.0％和47.8-50.0％，同时，还使土壤pH值提高0.70-1.13。
表3产品在水稻上应用的降镉效果及对比试验
表4产品在水稻上应用的降铅效果及对比试验
表5产品在水稻上应用的降砷效果及对比试验
表6产品增加土壤pH值的效果
序列表
<110> 湖南省微生物研究院
<120> 一种包含巴达维亚芽胞杆菌HJ-1的菌剂及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
gagagtttga tcctggctca g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
aaggaggtga tccarccgca 20

Claims (10)

1.一种包含巴达维亚芽胞杆菌(Bacillus bataviensis)HJ-1的菌剂，巴达维亚芽胞杆菌HJ-1保藏编号为CGMCC NO.13239。
2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于，组分及其重量百分比为：腐熟农业副产物10wt％～20wt％，钙镁磷肥10％～20wt％，巯基功能化凹凸棒石10％～20wt％，巯基功能化蒙脱石15wt％～20wt％，生物炭5％～15wt％，堆积发酵甘蔗滤泥10wt％～20wt％，草炭5wt％～15wt％，微生物发酵液1.5％～2.5％，所述的微生物发酵液中的微生物是保藏编号为CGMCC NO.13239的巴达维亚芽胞杆菌(Bacillus bataviensis)HJ-1。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，组分及其重量百分比为：腐熟农业副产物15％，钙镁磷肥15％，巯基功能化凹凸棒石15％，巯基功能化蒙脱石18％，生物炭10％，堆积发酵甘蔗滤泥15％，草炭10wt％，微生物发酵液2％。
4.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，腐熟农业副产物是将粉碎后过2mm筛的农作物秸秆和牛粪按等比例混合均匀，调节碳氮比至20～30，调节含水量至55wt％，加入3wt‰-5wt‰有机物料腐熟剂，进行堆肥，当堆温超过50℃时，开始翻堆通气，翻堆为每天2-3次，直到温度降至30℃以下时，停止翻堆，即得；
堆积发酵甘蔗滤泥的具体制备过程如下：将甘蔗滤泥堆积于发酵场，自然发酵30d-40d，甘蔗滤泥自上而下腐化变熟；将腐熟的甘蔗滤泥摊开，使其厚度15cm，在阳光下晒1-2d；利用破碎机对晒干的滤泥进行破碎80目筛；
生物炭、草炭经粉碎后过3-5mm筛备用；
巯基功能化凹凸棒石、巯基功能化蒙脱石研磨后过80-110目筛备用。
5.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，微生物发酵液中巴达维亚芽胞杆菌达到1×106～1×108个活菌/毫升。
6.权利要求1-5任一项所述的包含巴达维亚芽胞杆菌HJ-1的菌剂用于与重金属结合。
7.权利要求1-5任一项所述的包含巴达维亚芽胞杆菌HJ-1的菌剂用于与镉和/或铅和/或砷结合。
8.权利要求1-5任一项所述的包含巴达维亚芽胞杆菌HJ-1的菌剂用于与土壤中的重金属镉和/或铅和/或砷结合。
9.权利要求1-5任一项所述的包含巴达维亚芽胞杆菌HJ-1的菌剂用于制备降低土壤中有效镉、铅、砷中一种或几种含量的制剂。
10.权利要求1-5任一项所述的包含巴达维亚芽胞杆菌HJ-1的菌剂用于制备降低水稻中镉、铅、砷中一种或几种含量的制剂。
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