CN114045230B - 一种促进植物根部生长的放线菌及其应用 - Google Patents

一种促进植物根部生长的放线菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种促进植物根部发育的放线菌，该放线菌分类命名为林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)，所述林肯链霉菌的保藏编号为CGMCCNo.22255。该菌株可以通过利用色氨酸合成生长素IAA，促进植物根部生长发育；可以将难溶的无机磷和有机磷转化成可溶的速效磷，提高植物对磷元素的吸收利用；可以合成嗜铁素与植物病原菌竞争铁离子，抑制植物病原菌的生长，减少植物病原菌在植物生长过程中的危害作用。该菌株可以刺激植物细胞的生长和增殖，从而促进植物根系的生长发育及有效吸收土壤中的水分和养分。

Description

一种促进植物根部生长的放线菌及其应用
技术领域
本公开涉及微生物技术领域，具体地，涉及一种促进植物根部生长的放线菌及其应用。
背景技术
植物根际促生菌(PGPR)，泛指能够直接或间接促进植物生长、增加作物产量、防治病虫害的根际微生物。目前，已发现的PGPR包括假单胞菌属、芽孢杆菌属、农杆菌属、黄杆菌属、沙雷氏菌等20多个种属。作用机制主要有：与其他土壤微生物相比更能在根部有效的定殖、对有害微生物具有拮抗作用、在根围的营养竞争特别是对铁的竞争中处于优势、可分泌植物激素促进植物生长、能诱导植物产生系统抗性和分泌降解病原微生物的酶等。植物根际促生优良菌株的筛选，一般从植物的根际微生物、非病原栖居地土壤或海洋微生物资源中筛选优良菌株进行诱变育种，或采用基因克隆、基因缺失等基因工程手段，以获取新的高效低毒的生产菌株。
因此，为促进植物根部生长发育，培育快速生长的植物，筛选促进根部生长的菌株，鉴定促进植物根部生长的基因，将该基因转化作物，进而提高植物合成生长素、提高植物解磷固氮的能力、产生铁载体，从而对促进植物根部生长和植物生长具有重大意义。
发明内容
本公开的目的是提供一种放线菌，该放线菌能够提高植物合成生长素、提高植物解磷固氮的能力、产生铁载体，促进植物根部生长。
为了实现上述目的，本公开一方面提供一种促进植物根部发育的放线菌，该放线菌分类命名为林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)，所述林肯链霉菌的保藏编号为CGMCCNo.22255。
所述林肯链霉菌的16S rRNA基因的编码序列如SEQ IN NO：1所示。
另一方面，本公开提供了如上所述的放线菌在制备吲哚-3-乙酸中的应用。
另一方面，本公开还提供了如上所述的放线菌在解磷和/或固氮中的应用。
另一方面，本公开还提供了如上所述的放线菌在制备铁载体方面的应用。
另一方面，本公开还提供了如上所述的放线菌在促进植物根部生长发育中的应用。
再一方面，本公开还提供了一种促进植物根部生长发育的蛋白，该蛋白来源于如上所述的放线菌，并且该抗氧化蛋白的氨基酸序列如SEQ IN NO：2所示。
再一方面，本公开还提供了一种促进植物根部生长发育的基因，该基因来源于如上所述的放线菌，该基因的核苷酸序列如SEQ IN NO：3所示，并且该基因编码该所述促进植物根部生长发育的蛋白。
再一方面，本公开还提供了一种促进植物根部生长发育的方法，在植物中转入如上所述的基因。
通过上述技术方案，本公开提供了一种促进植物根部生长的放线菌及其应用，该菌属于链霉菌属，被命名为林肯链霉菌，该林肯链霉菌的保藏编号为CGMCCNo.22255，该菌株可以通过利用色氨酸合成生长素吲哚-3-乙酸(IAA)，促进植物根部生长发育；可以将难溶的无机磷和有机磷转化成可溶的速效磷，提高植物对磷元素的吸收利用；将难溶的无机磷和有机磷转化成可溶的速效磷，提高植物对磷元素的吸收利用；可以合成嗜铁素与植物病原菌竞争铁离子，抑制植物病原菌的生长，减少植物病原菌在植物生长过程中的危害作用。该菌株可以刺激植物细胞的生长和增殖，从而促进植物根系的生长发育及有效吸收土壤中的水分和养分。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏信息
本公开的林肯链霉菌保藏编号为CGMCCNo.22255，保藏日期为2021年04月28日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为林肯链霉菌(Streptomyceslincolnensis)。
序列信息
SEQ ID NO.1：林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)的16S rRNA基因的编码序列。
SEQ ID NO.2：促进植物根部生长发育蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO.3：促进植物根部生长发育的基因的核苷酸序列。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是林肯链霉菌产IAA能效图。
图2是无氮培养基图。
图3是解无机磷培养基图。
图4是解有机磷培养基图。
图5是拟南芥根部生长图。
图6是拟南芥4倍显微镜下根部(局部)照片。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
一方面，本公开提供了一种促进植物根部发育的放线菌，该放线菌是发明人从土壤中分离培养出的一种新菌株，经鉴定该菌属于链霉菌属(Streptomyces)，被命名为林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)。该菌种已在国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2021年04月28日，保藏编号为CGMCCNo.22255。
根据本公开，所述林肯链霉菌的16S rRNA基因的编码序列如SEQ IN NO：1所示。
本公开中，所述林肯链霉菌是从广西省柳州市七年生黄花蒿根部土壤中分离出具有促生作用效果最好的放线菌菌株；发明人将根部土壤进行宏基因组测序，经过数据分析，发现放线菌门在七年生黄花蒿土壤中与一年生土壤相比有更多积累。
另一方面，本公开提供了如上所述的放线菌在制备吲哚-3-乙酸中的应用。
本公开中，所述林肯链霉菌可以通过利用色氨酸来合成生长素吲哚-3-乙酸(IAA)，进而促进植物生长。
另一方面，本公开还提供了如上所述的放线菌在解磷和/或固氮中的应用。
本公开中，所述林肯链霉菌可以将难容的无机磷和有机磷转化成可溶的速效磷，提高植物对磷元素的吸收和利用。另外，所述林肯链霉菌还可以将大气中的氮气还原成氨，为植物生长提供氮源，由于全部固氮过程都是生物活动，无污染物排放，有利于保护生态环境；同时，由于减少和免除了化学氮素的投入，使农产品中硝酸和亚硝酸物质大幅度降低，提高了农产品的品质，减少致癌物质对人类的危害。
另一方面，本公开还提供了如上所述的放线菌在制备铁载体方面的应用。
本公开中，所述林肯链霉菌可以合成嗜铁素与植物病原菌竞争铁离子，抑制植物病原菌的生长，减少植物病原菌在植物生长过程中的危害作用。
另一方面，本公开还提供了如上所述的放线菌在促进植物根部生长发育中的应用。
再一方面，本公开提供一种促进植物根部生长发育的蛋白，该蛋白来源于如上所述的放线菌，并且该抗氧化蛋白的氨基酸序列如SEQ IN NO：2所示。
再一方面，本公开提供一种促进植物根部生长发育的基因，该基因来源于如上所述的放线菌，该基因的核苷酸序列如SEQ IN NO：3所示，并且该基因编码该所述促进植物根部生长发育的蛋白。
再一方面，本公开还提供了一种促进植物根部生长发育的方法，在植物中转入如上所述的基因。
优选地，所述植物为拟南芥、水稻和小麦中的至少一种。
下面通过实施例来进一步举例说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)在实施例中可称为L4。
实施例中所用到的高氏一号培养基成分为：硝酸钾1g/L；磷酸二氢钾0.5g/L；硫酸镁0.5g/L；硫酸亚铁0.01g/L；氯化钠0.5g/L；可溶性淀粉20g/L；琼脂15g/L。该培养基的pH7.2-7.4。
实施例中所用到的LB培养基的成分为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L。
实施例中所用到的CAS培养基成分为：CAS 60.5mg/L；HDTMA72.9mg/L；FeCl·6H2O2.645mg/L；蛋白胨4.5g/L；葡萄糖9g/L；牛肉浸出粉2.7g/L；NaCl 4.5g/L；琼脂20g/L。该培养基的pH 6.8±0.2(25℃)
实施例中所用到的MS琼脂培养基成分为：NH4NO3 1650mg/L；KNO3 1900mg/L；CaCl2·2H2O 440mg/L；MgSO4·7H2O 370mg/L；KH2PO4 170mg/L；KI 0.83mg/L；H3BO3 6.2mg/L；MnSO4·4H2O 22.3mg/L；ZnSO4·7H2O 8.6mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L；CuSO4·5H2O0.025mg/L；CoCl2·6H2O 0.025mg/L；FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L；肌醇100mg/L；烟酸0.5mg/L；维生素B60.5 mg/L；维生素B10.1 mg/L；甘氨酸2.0mg/L；
实施例中所用到的无氮培养基成分为：甘露醇或葡萄糖5.0g/L，KH2PO4 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaCl 0.2g/L，CaSO4·2H2O 0.2g/L，CaCO3 5g/L，琼脂15g/L，蒸馏水1L，pH＝7.0-7.2。
实施例中所用到的解机磷培养基成分为：葡萄糖10.0g/L，Ca3(PO4)2 5.0g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KCl 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.0001g/L，酵母提取物0.5g/L，MnSO4·2H2O 0.0001g/L，琼脂15g/L，蒸馏水1L。
实施例1
本实施例用于说明L4的制备及鉴定过程
本实施例所使用的土壤为从广西省柳州市七年生黄花蒿根部采集的土壤。
称取1g土壤，接种到LB液体培养基中，在28℃下孵育，150rpm旋转摇晃24小时。将富集的土壤微生物培养液按梯度稀释10倍、100倍和1000倍，将稀释液体培养物(每个样品200μL)接种在高氏一号培养基(20g/L可溶性淀粉，1g/L KNO3，0.51g/L K2HPO4，0.5g/LMgSO4 7H2O，0.5g/L NaCl，0.01g/L FeSO4 7H2O，20g/L琼脂，1L蒸馏水，pH＝7.4-7.6)，并在28℃孵育5天。挑取放射状单菌落进行独立培养。
该菌株的菌落表面有毛绒放射状菌丝、菌落整体成白色。
经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该菌株属于链霉菌属，被命名为林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)。
实施例2
本实施例对L4扩增得到的16S r RNA基因进行测序。
将实施例1分离得到的L4基因组使用OMEGA公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。L4的16S rRNA基因的编码序列扩增所用的通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。扩增所用的试剂盒购买于天根生物公司。
正向引物
27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQ ID NO：4)
反向引物
1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，SEQ ID NO：5)
表1为PCR扩增体系：
表1
Figure BDA0003317184400000071
表2为PCR反应程序：
表2
Figure BDA0003317184400000072
将扩增得到的PCR产物序列，连接于诺赛公司的T载体上，对插入序列进行测序。测序得到的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例3
本实施例用于说明L4产生长素(IAA)的效能。
将L4菌株接种至含有5mL液体LB培养基的10mL试管中，于170r/min，28℃条件下振荡培养48h，然后加入Salkowsky生长素显色试剂，观察显色反应，确定其产IAA能力强弱，如显粉红色则为产生长素菌株，记号并进行生长素定量检测。
定量测定：将接种于IAA检测培养基(LB培养基中加入含有0.2％的L-色氨酸)的菌株在24℃、150r/min条件下振荡培养48h后，经12000×g离心10min，1mL菌悬液加入2mLSalkowsky试剂并混匀，于28℃培养30min后得到粉色显色，并在530nm条件下进行比色，以10-100μg/mL的标准IAA稀释液设置标准曲线作为对照，单位表示为μg/mL。结果如图1所示。
从图1可以看出，L4菌株在第六天对IAA的产量放缓，第九天达到峰值3.03±0.31μg/mL，随后IAA的产量呈下降趋势；说明L4具有产生长素的能效。
实施例4
本实施例用于说明L4产铁载体的活性
定性测定采用CAS检测法。将待测菌株点接到CAS培养基上，28℃培养5-7d，观察菌落周围是否有黄色晕圈。若有晕圈则说明具有产铁载体的活性，测定晕圈直径与菌落直径的比值，比值越大产铁载体活性越大。
定量测定：按7％的接种量将待测菌株种子液接种到产铁载体定量测定SA限铁培养基中，从接种时刻算起，每隔12h取样，4℃，5000×g离心10min，将上清液按1:1体积比与CAS检测液混匀，避光静置40min，测定OD630的吸光值(As)，重复3次。以接种大肠杆菌的产铁载体定量测定培养基为对照，以其吸光值作为参比值(Ar)，铁载体量用铁载体活性单位表示，铁载体活性单位(％)＝[(Ar-As)/Ar]×100。根据定量测定林肯链霉菌产铁载体活性最高值为2.36％。
实施例5
本实施例用于说明L4解磷、固氮的能力
将菌株L4点接种于解磷培养基上，有透明圈产生，说明其具有溶解难溶的磷的能力。
将菌株L4涂布于无氮培养基上，连续在无氮培养基接种传代至三代仍有菌落长出，说明其具有固氮能力。
结果如图2-4所示。
从图2-4可以看出：L4菌株能在无氮源的培养基上生长，说明它具有将空气中的氮气转化为其生长发育所需的氮源功能，体现它的固氮作用；L4菌株在无机磷和有机磷培养基上生长，在菌株周围都能看到透明圈，说明它能够利用难溶的磷进行生命活动，证明它具有解磷作用。
实施例6
本实施例用于说明L4对拟南芥根部发育的影响
用根伸长实验作为评价L4菌株对拟南芥幼苗生长的影响的方法。拟南芥种子在使用前进行表面消毒。将种子(每次处理约0.2g)用70％乙醇在玻璃培养皿中洗涤1min，然后用1％次氯酸钠洗涤6-8min，然后用无菌蒸馏水进一步冲洗这些灭菌种子，去除灭菌剂。用灭菌手术刀和镊子将15颗种子放入半切MS琼脂培养基中，并加入100μL L4的LB培养上清液(经过10000×g离心2min)，每个板垂直放置在日28℃(夜25℃)温室，以12小时黑暗开始，随后12小时的光(18μmol m-2s-1)。第14天拍照根毛测定根长。结果如图5和6所示。
从图5和6可以看出：经L4菌液处理的拟南芥无菌苗，其主根长度与根毛长度、根毛数量都明显高于对照组；说明L4具有对拟南芥根部生长发育的作用。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所
<120> 一种促进植物根部生长的放线菌及其应用
<130> 21831CAAS-E-HDF
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1614
<212> DNA
<213> 林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)
<400> 1
cgaatcaaac atccacgcgt tgggagctct cccatatggt cgacctgcag gcggccgcga 60
attcactagt gattggttac cttgttacga cttcgtccca atcgccagtc ccaccttcga 120
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gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcagcaatgc tgatctgcga 240
ttactagcaa ctccgacttc atggggtcga gttgcagacc ccaatccgaa ctgagaccgg 300
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gaaagaggtt tacaacccga aggccgtcat ccctcacgcg gcgtcgctgc atcaggcttt 1200
cgcccattgt gcaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt 1260
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cctcaccaac aagctgatag gccgcgggct catccttcac cgccggagct ttcaaccacc 1380
acagatgccc gtggtagtgg tatccggtat tagaccccgt ttccagggct tgtcccagag 1440
tgaagggcag attgcccacg tgttactcac ccgttcgcca ctaatcccca ccgaagtggt 1500
tcatcgttcg acttgcatgt gttaagcacg ccgccagcgt tcgtcctgag ccaggatcaa 1560
actctaatcg aattcccgcg gccgccatgg cggccggagc atgcgactcg cacc 1614
<210> 2
<211> 344
<212> PRT
<213> 林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)
<400> 2
Met Ala Thr Ala Ala Pro Lys Ser Leu Ser Ser Tyr Glu Arg Tyr Pro
1 5 10 15
Leu Leu Phe Gly Pro Ser Pro Val His Pro Leu Glu Arg Leu Thr Ala
20 25 30
His Leu Gly Gly Ala Ser Leu Trp Ala Lys Arg Glu Asp Cys Asn Ser
35 40 45
Gly Val Ala Tyr Gly Gly Asn Lys Thr Arg Lys Leu Glu Tyr Leu Val
50 55 60
Ala Asp Ala Leu Ala Gln Gly Cys Asp Thr Leu Val Ser Ile Gly Gly
65 70 75 80
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Gly Leu Lys Cys Val Leu Val Gln Glu Ser Trp Val Glu Trp Pro Asp
100 105 110
Ala Val Tyr Asp Lys Val Gly Asn Ile Leu Ile Ser Arg Leu Ala Gly
115 120 125
Ala Asp Val Arg Leu Val Lys Ala Gly Phe Gly Ile Gly Phe Lys Glu
130 135 140
Ser Trp Glu Gln Ala Leu Arg Glu Val Glu Glu Gly Gly Gly Lys Pro
145 150 155 160
Tyr Ala Ile Pro Ala Gly Ala Ser Asp His Pro Leu Gly Gly Leu Gly
165 170 175
Phe Ala Gly Trp Ala His Glu Val Ala Glu Gln Glu Gln Glu Leu Gly
180 185 190
Val Phe Phe Asp Thr Val Val Val Cys Ser Val Thr Gly Ser Thr Gln
195 200 205
Ala Gly Met Val Ala Gly Phe Arg Ala Leu Glu Glu Ala Gly Gly Arg
210 215 220
Pro Arg Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Ser Ala Lys Pro Ala Thr Thr
225 230 235 240
Arg Glu Gln Ile Ala Arg Ile Ala Asp Arg Thr Gly Gln Leu Ile Gly
245 250 255
Val Gln Lys Glu Leu Thr Val Ala Asp Val Glu Leu Asp Glu Arg Tyr
260 265 270
His Ala Gly Val Tyr Gly Ile Pro Asp Glu Thr Thr Leu Glu Ala Met
275 280 285
Arg Leu Ala Ala Arg Thr Glu Gly Met Val Thr Asp Pro Val Tyr Glu
290 295 300
Gly Lys Ser Met Ala Gly Met Val Asp Leu Val Ala Arg Gly Glu Ile
305 310 315 320
Asp Thr Gly Ser Thr Val Leu Tyr Ala His Leu Gly Gly Gln Pro Ala
325 330 335
Leu Asn Ala Tyr Ser Ala Leu Phe
340
<210> 3
<211> 1035
<212> DNA
<213> 林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)
<400> 3
atggcaaccg cagcacccaa gtccctctcc tcgtacgagc gttaccccct cctcttcggc 60
ccctcgcccg tccaccccct ggaacggctc accgcgcacc tcggcggcgc ctccctgtgg 120
gccaagcgcg aggactgcaa ctccggtgtc gcgtacggcg gcaacaagac ccgcaagctg 180
gagtacctgg tcgccgacgc cctcgcccag ggctgcgaca ccctcgtctc gatcggcggc 240
gtgcagtcca accacacccg tcaggtcgcc gcctgtgccg cccgcgccgg gctcaagtgc 300
gtgctggtgc aggagagttg ggtggagtgg ccggacgccg tgtacgacaa ggtcggcaac 360
atcctgatca gccggctcgc cggggccgac gtacggctgg tgaaggccgg gttcggcatc 420
gggttcaagg agagctggga gcaggcgctc agggaggtcg aggagggcgg cggcaagccg 480
tacgccattc ccgccggtgc ctccgaccac ccgctcggcg gtctcggctt cgccggctgg 540
gcccatgaag tcgccgagca ggaacaggag ttgggcgtct tcttcgacac cgtcgtggtg 600
tgctcggtga ccgggtccac ccaggccggc atggtcgccg gcttccgggc gctggaggag 660
gccggcgggc ggccccggcg cgtgctcggc atcgacgcct ccgccaagcc cgccaccacc 720
cgggagcaga tcgcgcggat cgccgaccgc accgggcaac tcatcggcgt acagaaggag 780
ttgacggtgg ccgacgtcga actcgacgag cgctaccacg cgggcgtcta cggcatcccc 840
gacgagacca ccctggaggc gatgcggctc gccgcccgta ccgagggcat ggtcaccgac 900
ccggtgtacg agggcaagtc gatggccggg atggtcgacc tggtcgcccg tggcgagatc 960
gacacgggtt ccaccgtgct ctacgcccac ctgggcggcc agccggcgct gaacgcgtac 1020
agcgcgctgt tctga 1035
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (5)

1.一种促进植物根部发育的放线菌，其特征在于，该放线菌分类命名为林肯链霉菌（Streptomyces lincolnensis），所述林肯链霉菌的保藏编号为CGMCC No. 22255。
2.权利要求1所述的放线菌在制备吲哚-3-乙酸中的应用。
3.权利要求1所述的放线菌在解磷和/或固氮中的应用。
4.权利要求1所述的放线菌在制备铁载体方面的应用。
5.权利要求1所述的放线菌在促进拟南芥根部生长发育中的应用。
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