WO2003006631A1 - Bacterie legumineuse ayant une aptitude de fixation de l'azote potentialisee - Google Patents

Bacterie legumineuse ayant une aptitude de fixation de l'azote potentialisee Download PDF

Info

Publication number
WO2003006631A1
WO2003006631A1 PCT/JP2002/006950 JP0206950W WO03006631A1 WO 2003006631 A1 WO2003006631 A1 WO 2003006631A1 JP 0206950 W JP0206950 W JP 0206950W WO 03006631 A1 WO03006631 A1 WO 03006631A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
bacterium
catalase
rhizobia
leguminous
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/006950
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hidetoshi Okuyama
Takuji Owada
Nobutoshi Ichinose
Original Assignee
Japan Science And Technology Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science And Technology Corporation filed Critical Japan Science And Technology Corporation
Priority to EP02743878A priority Critical patent/EP1416043A4/en
Priority to CA002453672A priority patent/CA2453672A1/en
Priority to US10/483,225 priority patent/US7109020B2/en
Publication of WO2003006631A1 publication Critical patent/WO2003006631A1/ja
Priority to US11/503,954 priority patent/US20060270555A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like

Definitions

  • the invention of this application relates to rhizobia whose nitrogen fixing ability has been enhanced by the expression of a introduced catalase gene, and a preparation for legumes containing the rhizobia as an active ingredient.
  • Legume crops such as soybeans, azuki beans, and kidney beans form symbiotic nodules due to rhizobial infection, and fix aerial nitrogen using the bacteroids formed in these nodules, thereby securing soil even in soils with low nitrogen content. It can grow well. For this reason, when cultivating legume crops, in addition to applying normal fertilizers, precultured rhizobia is applied to the seeds of the crops. In order to further promote the growth and increase the yield of various legume crops, the search for suitable Staphylococcus strains for each legume crop is being vigorously conducted. Attempts have also been made to develop transformed rhizobia by gene transfer.For example, Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Rhizobia plays an important role in the growth and yield of leguminous crops due to its nitrogen fixation ability.
  • legume crops depend on rhizobia to absorb nitrogen 30 times. Extremely high at ⁇ 65%. Therefore, rhizobial bacteria with enhanced nitrogen fixation are expected to greatly expand the potential for legume crop cultivation in various soils and increase in yield.
  • increasing the efficiency of nitrogen absorption of legume crops by such rhizobia will inevitably reduce the dependence on inorganic nitrogen fertilizers such as ammonium sulfate, which will reduce agricultural costs and reduce environmental pollution. Contribute greatly.
  • catalase has the effect of decomposing hydrogen peroxide, which acts harmfully on animals and plants, into water and oxygen.
  • the inventors of the present application isolated a novel strain of vibrio rumoiensis S-1 having an extremely strong catalase activity (J. Ferment. Bioeng. 85: 1 13-1 16, 1998), and furthermore, The gene has been identified (JP-A-2000-316584; Appl. Environ. Microbiol. 65: 67-72, 1999; J. Biosci. Bioeng.
  • the invention of this application provides a rhizobial bacterium which is a transformed bacterium into which a catalase gene has been introduced, and whose nitrogen fixation ability has been enhanced by the enzyme produced by this gene.
  • the introduced catalase gene is a DNA fragment containing the catalase gene derived from Vibrio rumoiensis strain S-1 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the invention of this application provides a preparation for legume crops containing the above rhizobia as an active ingredient.
  • the invention of this application further provides a method for cultivating a leguminous crop, which comprises cultivating a leguminous crop seed that has been brought into contact with the rhizobia or the preparation.
  • the rhizobial bacterium of the present invention is a transformed bacterium into which a catalase gene has been introduced.
  • a catalase gene polynucleotides (genomic DNA, mRNA, cDNA, etc.) that encode catalase produced by various species can be used.
  • Catalase genes include, for example, catalase genes derived from Legionella pneumophilla (la Bacteriol. 182: 6679-6686, 2000; GenBank AF276752, FEMS Microbiol. Lett. 176: 339-344, 1999; GenBank AB017595) and Aspergillus nidulans. Force cod-lase gene (J. Bacteriol.
  • GenBank AF316033 catalase gene derived from Pseudomonas fluorescence (FEMS Microbiol. Lett. 200: 235-240, 2001; GenBank U72068), derived from Nicotiana tabacum Catalase Gene (Plant J. 11: 993-1005, 1997; GenBank U93244), catalase gene from Straphyrococcus aureus (Microbiology 146: 465-475, 2000; GenBank AJ000471, AJ000472), catalase gene from Xanthomonas campestris pv.
  • the scope of the rhizobia of the present invention includes all those prepared using a known catalase gene in a database or the like or an unknown catalase gene that can be identified in the future.
  • the catalase gene to be introduced may be one having its own expression control region (promoter noen eight), or a fusion sequence in which the expression control region of a gene frequently expressed in rhizobia is linked. Good.
  • one embodiment of the transformed rhizobia of the present invention is a transformed bacterium into which a DNA fragment containing the vktA gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 has been introduced. More specifically, as shown in the Examples, this rhizobia was introduced with a DNA fragment (4.9 kb) containing the coding region of the vktA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and its promoter sequence. It is.
  • the vktA gene can be isolated from the Vibrio rumoiensis S-1 strain and used by the method described in JP-A-2000-315684.
  • Rhizobium is a gram-negative bacterium that infects the roots of leguminous crops and forms nodules, and known rhizobial strains having a growth promoting effect on leguminous crops can be used. Specifically, it is a microorganism belonging to the genus Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizorium, etc.More specifically, Rhizobium meliloti, Rhizobium trifolii. Rhizobium lupin Rhizobium fredii, Rhizobium lotu Rhizobium leguminosarurru Bradyrhizobium japonicum, Azorhizorium caulinodans and the like.
  • rhizobial bacteria are inoculated in an appropriate amount into a culture medium (TY medium, etc.) suitable for the growth, grown by shaking culture at 25-30 ° C for about 12-36 hours, and collected by centrifugation. It can be subjected to transformation.
  • the vktA gene is introduced into rhizobia by introducing a recombinant vector carrying the transgene into the rhizobia by a known method such as electroporation, calcium phosphate method, ribosome method, and DEAE dextran method. Can be.
  • transformed rhizobia can also be prepared by a conjugative transfer method by co-culture with rhizobia, a bacterial host (such as Escherichia coli) having a recombinant vector and a bacterial host having a helper plasmid. can do.
  • the transformed rhizobia thus prepared has a high nitrogen fixing ability as shown in the examples, and can form nodules well when coexisting with seeds of legume crops. .
  • the preparation for legume crops of the present invention contains the above-mentioned transformed rhizobia as an active ingredient.
  • the formulation can be prepared root nodule bacteria of the present invention in root nodule bacteria can grow liquid medium (e.g., TY medium, etc.) as a mixture to 105 to about eight ZML.
  • liquid medium e.g., TY medium, etc.
  • it can be mixed with an organic or inorganic carrier.
  • inorganic carriers such as Akadama clay, calcined Akadama soil, Kanuma soil, black pork soil, bamikiuraito, perlite, zeolite, peat moss, charcoal, pulp, straw, bagasse, oil cake, fish cake It is an organic carrier such as bone meal, blood meal, shell fossils, and Rinichi-gara.
  • the rhizobia of the present invention can be carried on a carrier by mixing a suspension of rhizobia with the carrier.
  • the rhizobial content may be about 10 5 to 10 8 rhizobia per 1 g of the carrier.
  • the stability of rhizobia can be improved by adding 40% or more of water to the mixture of rhizobia and the carrier.
  • the storage stability of rhizobial bacteria can be further improved by adjusting the pH of the preparation to about 5.5 to 8.0 by blending coal ash etc. as a part of the carrier.
  • the preparation thus prepared can be, for example, mixed with seeds before planting in an appropriate amount, or can be sprayed with fertilizer upon sowing on farmland.
  • the vktA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (including the promoter sequence and the catalase coding region) was introduced into the Hiroshuku range vector (pBBRI MCS-2: Gene 166: 175-176, 1995) and possessed the vktA gene.
  • the recombinant vector pBBR1 MCS-2: vktA was constructed.
  • Rhizobium leguminosarum bv. Phaseoli 2676 Phaseoli 2676 (Phaseolus vulgaris) and Rhizobium fredii USDA 191 (Soybean bacterium) were used.
  • E. coli MM294 carrying PR 2013 was used as a helper plasmid-carrying bacterium.
  • Each of the recipient bacterium, the donor bacterium and the orchid-bearing orchid-bearing orchid was orchestrated in 5 ml of TY medium at 30 ° C with shaking (100 strokes) and grown to late logarithmic phase.
  • Each of the two types of Escherichia coli cultures (40 / xl) and rhizobial cultures (1006I) were aseptically mixed in 1.5 ml microtubes, centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute, and collected. Supernatant After removing the cells, the cells were suspended in 100 I of sterile water and centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute to wash the cells.
  • the bacteria were suspended in 100 ⁇ sterile distilled water, and a mixed bacterial solution of 50 ii
  • the diluted bacterial solution diluted prepared to 10 5 times with sterile distilled water selective agar medium (Sodium succinate 1 .35g, Sodium glutamate 1.1 g, K 2 HP0 4 220mg, MgS0 4 100mg, FeCI 2 440mg, CaCI 2 440mg, Biotin (0.2 mg / L distilled water (pH 7.0)) was applied at 100 I at a time, cultured at 30 ° C for 4-5 days, and the transformed rhizobial strain with vktA was screened.
  • sterile distilled water selective agar medium Sodium succinate 1 .35g, Sodium glutamate 1.1 g, K 2 HP0 4 220mg, MgS0 4 100mg, FeCI 2 440mg, CaCI 2 440mg, Biotin (0.2 mg / L distilled water (pH 7.0)
  • H 2 0 2 H 2 0 2.645ml as a substrate 0.5M KPB (pH6.9) 0.3ml, the 30% H 2 0 2 5 n ⁇ were mixed in a quartz cell, and incubated 25 ° C, 3 min After temperature equilibration, 50 ⁇ l of the cell extract was mixed, and the enzymatic activity was measured by the change in the absorbance at 240 nm. Molar extinction coefficient of H 2 0 2, was used 0.0436 ⁇ ⁇ 1 ⁇ 1.
  • CBB Coomassie brilliant blue
  • the catalase activity of Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 2676 and Rhizobium fredii USDA 191 transformed with the vktA gene was 7,500 U / mg protein and 6,100 U / mg protein, respectively, and the catalase activity of each parent strain (3.4 and 2.9 U / mg protein).
  • Soybean (breed name: Kita-sumume) and King bean (breed name: Yukitebo) were used. After soaking each seed in 70% ethanol for 2 minutes, it was washed three times with sterile distilled water, further sterilized with 10% sodium hypochlorite, and washed six times with sterile distilled water. Gedback (15 x 16 cm) was used for cultivation of each crop. 30 ml of nitrogen-free cultivation solution (Norris-Date's solution) was poured, and the whole was wrapped in aluminum foil and sterilized by autocrepe.
  • nitrogen-free cultivation solution Neorris-Date's solution
  • phaseoli 2676 Pink bean
  • Rhizobium fredii USDA 191 Soybean transformed with the vktA gene
  • TY medium 5 g of paktryptone, 3 g of yeast extract, 1.3 g of calcium chloride hexahydrate / 5 ml
  • Click / min absorbance values of the late logarithmic growth phase (OD 660 nm under the conditions 1.0 or more, it was grown in 10 9 cells / ml) or.
  • This sterile phosphate buffered saline (phosphate buffered saline: PBS) [ 0.7g KH 2 P0 4, 6.8g NaCI, 2.4g Na 2 HP0 4 ⁇ 12H 2 0 / L distilled water (pH7.0) ] was diluted 1,000 times to obtain a bacterial inoculum adjusted to a bacterial concentration of 10 6 cells / ml.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the plants were taken out of the pot, the nodules were separated and dried overnight in a desiccator, and the weight (dry weight) was measured.
  • the invention of this application provides a rhizobial bacterium which is transformed by introducing a catalase gene and has excellent nitrogen fixing ability. This will promote the growth of legume crops and increase legume yield. The reduction of nitrogen fertilizer will also reduce agricultural costs and reduce environmental pollution.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)

Description

明細書 窒素固定能を増強した根粒菌
技術分野 この出願の発明は、 導入されたカタラーゼ遺伝子発現によって窒素固定能が増 強された根粒菌と、 この根粒菌を有効成分とするマメ科作物用製剤に関するもの である。
背 技術
ダイズ、 ァズキ、 インゲン等のマメ科作物は、 根粒菌の感染によって共生的に 根粒を形成し、 この根粒中に形成されたバクテロイドによって空中窒素固定を行 うことにより、 窒素含量の低い土壌においても良好に生育することができる。 このため、 マメ科作物を栽培する場合には、 通常の肥料を与えること以外に、 予め培養した根粒菌を作物の種子に塗布することが行われている。 そして、 各種のマメ科作物のさらなる成長促進と収量の増加を目的として、 各 マメ科作物に適した根球菌株の探索が勢力的に行われている。 また、 遺伝子導入 による形質転換根粒菌の開発も試みられており、 例えば、 特表 2000-514663 号 公報には、 卜リフォキ卜キシン遺伝子を導入し、 競合する根粒菌の成長を抑制す るように改変された根粒菌が開示されている。 根粒菌は、 その窒素固定能によってマメ科作物の成長や収量に重要な役割を果 たしている。 例えば、 マメ科作物が窒素を吸収する際の根粒菌への依存度は 30 〜65 %と極めて高い。 従って、 窒素固定能を増強した根粒菌は、 様々な土壌に おけるマメ科作物栽培やその収量増加の可能性を大きく拡大するものと期待され ている。 またそのような根粒菌によるマメ科作物の窒素吸収の効率化は、 必然的 に硫安等の無機窒素肥料への依存度を低減することとなり、 農業コストの削減と ともに、 環境汚染の緩和にも大きく貢献する。 しかしながら、 自然界からの新たな根粒菌の探索や、 あるいは遺伝子操作によ る改変根粒菌の作出によっては、 実用化可能な程度に窒素固定能が増強された根 粒菌は得られていない。 一方、 カタラーゼは動植物個体に対して有害に作用する過酸化水素を水と酸素 に分解する作用を有している。 この出願の発明者らは、 極めて強いカタラーゼ活 性を有する新菌 ¼ Vibrio rumoiensis S-1 株を単離し ( J. Ferment. Bioeng. 85:1 13-1 16, 1998) 、 さらにこの菌株のカタラーゼ遺伝子を特定している （特開 2000-316584 号公報； Appl. Environ. Microbiol. 65:67-72, 1999 ； J. Biosci. Bioeng. 90:530-534, 2000) 。 しかしながら、 カタラーゼ活性によって根粒菌の 窒素固定能が増強されることは従来知られておらず、 またカタラーゼ遺伝子の導 入によって窒素固定能を増強した根粒菌も全く知られていない。 この出願の発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、 遺伝 子導入によって窒素固定能が増強された新規根粒菌を提供することを課題として いる。
発明の開示 マメ科植物は、 根粒菌が感染した初期に、 過酸化水素を生じ、 これが細胞毒と なるため、 過酸化水素を分解する酵素 （力夕ラーゼ） を有している。 従って、 根 粒菌自体も高いカタラーゼ活性を有していれば、 過酸化水素の細胞毒性をさらに 抑制し、 マメ料作物の成長促進ゃマメ収量のさらなる向上が期待される。 事実、 この出願の発明者らは、 自らが先に発明した Vibrio rumoiensis S-1 株由来の力 夕ラーゼ遺伝子 （vktA) を導入した形質転換根粒菌が、 強い根粒着生能と窒素固 定能を有することを見出してこの発明を完成させた。 すなわち、 この出願の発明は、 カタラーゼ遺伝子を導入した形質転換菌であつ て、 この遺伝子の産生する力夕ラーゼによって窒素固定能が増強された根粒菌を 提供する。 この発明の根粒菌においては、 導入したカタラーゼ遺伝子が、 配列番号 1 の塩 基配列を有する Vibrio rumoiensis S-1株由来のカタラーゼ遺伝子を含む DNA断 片であることを好ましい態様としている。 またこの出願の発明は、 前記の根粒菌を有効成分とするマメ科作物用製剤を提 供する。 さらにこの出願の発明は、 前記の根粒菌または製剤と接触させたマメ科作物種 子を栽培することを特徴とするマメ科作物の栽培方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態 この発明の根粒菌は、 カタラーゼ遺伝子を導入した形質転換菌である。 力タラ ーゼ遺伝子は、 各種の生物種が産生するカタラーゼをコ一ドするポリヌクレオチ ド （ゲノム DNAや mRNA、 cDNA等） を利用することができる。 カタラーゼ遺 伝子は、 例えば、 Legionella pneumophilla 由来のカタラーゼ遺伝子 （丄 Bacteriol. 182:6679-6686, 2000; GenBank AF276752, FEMS Microbiol. Lett. 176:339-344, 1999; GenBank AB017595) 、 Aspergillus nidulans由来の力タラ -ゼ遺伝子 ( J. Bacteriol. 183:1434-1440, 2001 ; GenBank AF316033 ) 、 Pseudomonas fluorescence 由来のカタラーゼ遺伝于 ( FEMS Microbiol. Lett. 200:235-240, 2001 ; GenBank U72068) 、 Nicotiana tabacum由来のカタラーゼ 遺伝子 ( Plant J. 1 1 :993-1005, 1997; GenBank U93244 ) 、 Straphyrococcus aureus 由来のカタラーゼ遺伝子 ( Microbiology 146:465-475, 2000; GenBank AJ000471 , AJ000472) 、 Xanthomonas campestris pv. phaseoli由来のカタラー ゼ遺伝子 ( Gene 241 :259-265, 2000； GenBank AF170449) 、 Synechoccus Sp.由来のカ タ ラ ーゼ遺伝子 ( Biochimie 82:21 1 -219, 2000; GenBank AF197161 ) 等、 多くが知られている。 従ってこの発明の根粒菌の範囲には、 文 献ゃデータベース等において既知のカタラーゼ遺伝子、 あるいは今後同定され得 る未知のカタラーゼ遺伝子を用いて作成されたもの全てが含まれる。 導入するカタラーゼ遺伝子は、 それ本来の発現制御領域 （プロモーターノエン 八ンサ一） を備えたものでもよく、 あるいは根粒菌で高頻度で発現する遺伝子の 発現制御領域を連結した融合配列であってもよい。 さらに、 この発明の形質転換根粒菌の一つの態様は、 配列番号 1の塩基配列を 有する vktA遺伝子を含む DNA断片を導入した形質転換菌である。 具体的には、 この根粒菌は実施例にも示したように、 配列番号 1の塩基配列からなる vktA 遺 伝子のコード領域とそのプロモーター配列を含む DNA断片 （4.9kb) を導入した 根粒菌である。 vktA 遺伝子は、 特開 2000-315684 号に記載の方法によって Vibrio rumoiensis S-1株から単離して用いることができる。 あるいは、 配列番号 1 の DNA 配列の両端一部領域に対応する合成オリゴヌクレオチドをプライマー とし、 S-1 株ゲノムを錶型とする PCR 法によっても得ることができる。 さらに は、 配列番号 1 の一部配列に基づいて合成したプローブを用いて、 Vibrio rumoiensis S-1株から調製したゲノムライブラリ一をスクリーニングすることに よって取得することもできる。 クローニングした vktA 遺伝子は適当なベクター にサブクロ一ニングし、 根粒菌の形質転換に使用することができる。 根粒菌は、 マメ科作物の根に感染して根粒を形成するグラム陰性菌であり、 マ メ科作物に対して生育促進作用を有する公知の根粒菌株を用いることができる。 具体的には、 Rhizobium 属、 Bradyrhizobium 属、 Azorhizorium 属等に属する微 生物であり、 さらに具体的には、 Rhizobium meliloti、 Rhizobium trifolii . Rhizobium lupin Rhizobium fredii、 Rhizobium lotu Rhizobium leguminosarurru Bradyrhizobium japonicum, Azorhizorium caulinodans等である。 これらの根粒 菌は、 その増殖に適した培地 （TY 培地等） に適量を接種し、 25〜30°Cで 12~ 36 時間程度の振盪培養を行って増殖させ、 遠心分離で集菌して形質転換に供す ることができる。 vktA 遺伝子の根粒菌への導入は、 導入遺伝子を保有する組換えベクターを、 電気穿孔法、 リン酸カルシウム法、 リボソーム法、 DEAEデキス卜ラン法など公 知の方法によって根粒菌に導入することによって行うことができる。 あるいは、 実施例に示したように、 根粒菌、 組換えベクターを保有する細菌宿主 （大腸菌 等） およびへルパープラスミドを有する細菌宿主との共培養による接合伝達法に よっても形質転換根粒菌を作成することができる。 このようにして作成した形質転換根粒菌は、 実施例に示したように高い窒素固 定能を有しており、 マメ科作物の種子と共存させることによって、 良好に根粒を 形成することができる。 この発明のマメ科作物用製剤は、 前記の形質転換根粒菌を有効成分としている。 具体的には、 この製剤は、 根粒菌が生育可能な液体培地 （例えば TY培地等） に この発明の根粒菌を 105〜108個 Zml程度に混合したものとして調製することが できる。 あるいは、 有機質または無機質の担体と混合することもできる。 具体的 には、 赤玉土、 焼成赤玉土、 鹿沼土、 黒ポク土、 バーミキユラィ卜、 パーライ 卜、 ゼォライ卜等の無機質担体、 ピー卜モス、 木炭、 パルプ、 藁、 バガス、 油かす、 魚かす、 骨粉、 血粉、 貝化石、 力二がら等の有機質担体である。 この発明の根粒 菌を担体に担持させるには、 根粒菌の混濁液と担体とを混合することによって行 うことができる。 その場合の根粒菌の含有量は、 担体 1 gに対して根粒菌 105〜 108個程度を混合すればよい。 さらに、 根粒菌と担体との混合物には、 水を 40% 以上含有させることによって根粒菌の安定性を向上させることもできる。 またさ らに、 石炭灰等を担体の一部として配合することによって製剤の pHを 5.5〜8.0 程度に調整することによって根粒菌の保存安定性を一層向上させることもできる。 このようにして調製した製剤は、 例えば、 植え付け前の種子と適量を混合した リ、 あるいは農地への蒔種時に肥料とともに散布することができる。
実施例 以下、 実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明す るが、 この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
1 . 組換えベクターの構築
配列番号 1 の塩基配列からなる vktA 遺伝子 （プロモーター配列とカタラーゼ コード領域を含む） を広宿生域ベクター （pBBRI MCS-2: Gene 166:175-176, 1995) に揷入し、 vktA 遺伝子を保有する組換えベクター pBBR1 MCS-2:vktA を 構築した。
2. 形質転換菌の構築 2.1 使用菌株：
形質転換する根粒菌 （受容菌） として、 Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 2676 (インゲンマメ菌） および Rhizobium fredii USDA 191 (ダイズ 菌） を使用した。 供与菌としては、 組換えベクター pBBR1 MCS-2:vktA による形 質転換大腸菌 E. coli JM109を使用した。 ヘルパープラスミド保有菌としては、 PR 2013を保有する大腸菌 E. coli MM294を使用した。
2.2 接合伝達による遺伝子導入：
受容菌、 供与菌およびへルパープラスミド保有蘭のそれぞれを 5 ml の TY培 地にて 30°Cで振盪培養 （100 ストローク 分） し、 対数増殖後期まで増殖させ た。 無菌的に 2種の大腸菌培養物それぞれ 40 /x l と根粒菌培養物 100 6 I を 1 .5 ml 容マイクロチューブに混合し、 10，000rpm で 1分間遠心し、 集菌した。 上澄 みを除いた後、 菌体を 100 I の滅菌水に懸濁し、 1 0，000rpm で 1分間遠心して 菌体を洗浄した。 菌を 100 ^の滅菌蒸留水に懸濁し、 TY寒天培地上に置かれた ミリポアフィルタ一に 50 ii |の混合菌液を乗せ、 30°Cで一晚メーティングさせた。 そして、 菌体が付着したフィルタ一部分を切り出し、 1 .5ml 容マイクロチューブ に入れ、 滅菌蒸留水 1 ml を加えてよく懸濁した。 フィルターを除いた後、 10，000φηιで 1分間遠心し、 集菌し、 さらに滅菌蒸留水 1 ml に菌を懸濁した。 次いで、 滅菌蒸留水で 105 倍まで希釈調製した希釈菌液を選択寒天培地 ( Sodium succinate 1 .35g， Sodium glutamate 1.1 g， K2HP04 220mg, MgS04 100mg， FeCI2 440mg， CaCI2 440mg, Biotin 0.2mg/L distilled water(pH7.0)) に 100 I づっ塗布し、 30°Cで 4 ~ 5日培養して、 vktA による根粒菌の形質転換株 をスクリ一二ングした。
3. カタラーゼ活性の測定 3.1 培養条件：
TY液体培地 （5ml) にて 30°C、 往復振盪培養 （100 ストローク Z分） を行つ た対数増殖後期の菌液 （前培養培地） を本培養 TY培地 （200ml) に移し、 30°C で対数増殖後期から定常期初期まで培養した。
3.2 無細胞抽出液の調製：
培養菌液を 9，000i"pm で 10 分間、 4 °Cで遠心し、 集菌した。 その後、 50mM K-phosphate buffer ( KPB: 50mM KH2P04 8.5mi, 50mM K2HP04 91 .5ml, pH7.8) を用いて 2回洗浄した。 洗浄後、 1 ml の KPB に懸濁し、 超音波処理 （200W, 2 分 X 8) によリ菌体を粉砕し、 この試料を 19，000rpm、 10分間、 4 °Cで遠心した。 得られた上清液を無細胞抽出液として測定に用いた。
3.3 カタラーゼ活性の測定：
H202を基質として H20 2.645ml、 0.5M KPB(pH6.9) 0.3ml、 30% H202 5 n \を 石英セル中で混合し、 25°C、 3分間インキュベートして温度平衡させた後、 無 細胞抽出液 50 μ Ι を混合し、 240nm での吸光値の変化により酵素活性を測定し た。 H202のモル吸光係数、 0.0436Μ·1 τ 1を用いた。
3.4 タンパク量の測定：
Bradfoard (0 Coomassie brilliant blue (CBB) を用いる方法に基づき、 CBB溶 液 5mlに無細胞抽出液 1 00 を混合し、 595nmの吸光値から測定した。 標準タ ンパク質としてゥシ血清アルブミンを用いた。
3.5 結果：
vktA遺伝子で形質転換した Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 2676およ び Rhizobium fredii USDA 191 のカタラーゼ活性は、 それぞれ 7，500 U/mg protein および 6,100 U/mg protein であり、 それぞれの親株のカタラーゼ活性 (3.4および 2.9 U/mg protein) に比較して有意に高い酵素活性を示した。
4. マメ科作物への形質転換根粒菌の接種 4.1 宿主作物：
ダイズ （品種名 ：キタ厶スメ） およびィンゲンマメ (品種名 ：ユキテボウ） を 使用した。 それぞれの種子を 70%エタノール中に 2分間浸した後、 滅菌蒸留水 で 3回洗浄し、 さらに 1 0%次亜塩素酸ナトリウムで表面殺菌し、 滅菌蒸留水で 6回洗浄した。 また、 各作物の栽培にはジードバック （15 X 1 6cm) を用いた。 無窒素栽培液 （Norris-Date 氏液） を 30ml 注ぎ、 アルミホイルで全体を包んで ォー卜クレープ滅菌した。
4.2 接種菌：
vktA遺伝子で形質転換した Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 2676 (ィ ンゲンマメ菌） および Rhizobium fredii USDA 191 (ダイズ菌） 、 ならびにそれ ぞれの親株を使用した。 各菌株は、 TY培地 （パク卜卜リプトン 5g、 酵母エキス 3g、 塩化カルシウム 6水和 1 .3g / 5ml 中にて 30°C、 往復振盪 （1 00ストロー ク /分） 条件で対数増殖後期 （OD660nm の吸光値で 1 .0以上、 109cells/ml) ま で増殖させた。 これを滅菌したリン酸緩衝化生理食塩水 （phosphate buffered saline: PBS) [0.7g KH2P04, 6.8g NaCI, 2.4g Na2HP04■ 12H20/L distilled water (pH7.0)】にて 1 ,000 倍希釈して菌濃度を 106cells/ml に調製した接種菌液とした。
4.3 根粒菌の宿主作物への接種：
シーバック 1枚につき 2個の種子を置き、 種子 1個につき 1 ml の接種用菌液 を種子にかけた。 全体をアルミホイルで覆い、 これらを明期 14時間 （22°C ) 、 暗期 10 時間 （18°C ) の条件下に静置した。 6日後にアルミホイルを外した。 栽 培中は 20 日目までは滅菌蒸留水を加え、 20 目以降は Norris-Date氏液を適宜捕 充した。
4.4 窒素固定活性の測定：
根粒菌の接種後、 40日後 （インゲンマメ） または 50日後 （ダイズ） に測定を 行った。 1 ,000ml 容ガラスポットに植物体を入れ、 ゴ厶栓にて密封した。 ゴ厶栓 からシリンジを用いて各ポッ ト内から 100ml (ポッ ト内空気量の 10%) の空気 を抜いた後、 同僚のアセチレンを充填した。 30°Cで 1 時間インキュべ一卜した 後、 ポット内から 1 ml をシリンジで抜き取り、 ガスクロマ卜グラフィー (日立 K53、 検出器： FID、 カラム ： PORAPAK N50〜80 mesh、 カラム温度： 50°C、 インジェクション温度： 150°C、 流速： 30ml/分） で生成されたエチレン量を測 定した。
4.5 根粒重の測定：
窒素固定活性の測定後、 植物体をポッ卜から取り出し、 根粒を分離してデシケ 一ターで一晩乾燥させ、 重量 （乾重量） を測定した。
4.6 結果
表 1 は、 vktA 遺伝子で形質転換した根粒菌 Rhizobium fredii USDA 191 (Tf 株： n=6) またはその親株 （n=6) を接種したダイズにおける各栽培日ごとの植 物体当たりの根粒数、 根粒重量、 および二卜ロギナーゼ活性 （ARA) の比較であ る。 また表 2は、 vktA 遺伝子で形質転換した Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 2676 (Tf株： n=26) またはその親株 （n=29) を接種したインゲンマメ における同様の比較である。
表 1 に示したように、 形質転換菌株を接種したダイズは、 植物個体当たりの根 粒数が親株接種に比べて有意に増加し、 また二卜ロゲナーゼ活性の増加も観察さ れた。 一方、 表 2に示したように、 形質転換菌株を接種したインゲンマメは、 根 粒数は増加しないものの、 ニトロゲナーゼ活性の有意な増加が確認された。 表 1
Figure imgf000011_0001
表 2
Figure imgf000011_0002
産業上の利用可能性 以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 カタラーゼ遺伝子の導 入によって形質転換された窒素固定能の優れた根粒菌が提供される。 これによつ て、 マメ科作物の成長促進とマメ収量の増加が可能となる。 また窒素肥料の削減 による農業コストと低減化と環境汚染の緩和も図られる。

Claims

請求の範囲
1 . カタラーゼ遺伝子を導入した形質転換菌であって、 この遺伝子の産生する カタラーゼによって窒素固定能が増強された根粒菌。
2 . 導入したカタラーゼ遺伝子が、 配列番号 1 の塩基配列を有する Vibrio rumoiensis S-1 株由来の力タラ一ゼ遺伝子を含む DNA断片である請求項 1の根 粒菌。
3 . 請求項 1 または 2の根粒菌を有効成分とするマメ科作物用製剤。
4 . 請求項 1 または 2の根粒菌、 もしくは請求項 3の製剤と接触させたマメ科 作物種子を栽培することを特徴とするマメ科作物の栽培方法。
PCT/JP2002/006950 2001-07-10 2002-07-09 Bacterie legumineuse ayant une aptitude de fixation de l'azote potentialisee WO2003006631A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02743878A EP1416043A4 (en) 2001-07-10 2002-07-09 LEGUMINOUS BACTERIUM HAVING POTENTIALIZED NITROGEN FIXATION FIXATION
CA002453672A CA2453672A1 (en) 2001-07-10 2002-07-09 Root nodule bacteria having enhanced nitrogen-fixation ability
US10/483,225 US7109020B2 (en) 2001-07-10 2002-07-09 Leguminous bacterium having potentiated nitrogen fixation ability
US11/503,954 US20060270555A1 (en) 2001-07-10 2006-08-15 Root nodule bacteria having enhanced nitrogen-fixation ability

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001209214A JP2003033174A (ja) 2001-07-10 2001-07-10 窒素固定能を増強した根粒菌
JP2001-209214 2001-07-10

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/503,954 Division US20060270555A1 (en) 2001-07-10 2006-08-15 Root nodule bacteria having enhanced nitrogen-fixation ability

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003006631A1 true WO2003006631A1 (fr) 2003-01-23

Family

ID=19044901

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2002/006950 WO2003006631A1 (fr) 2001-07-10 2002-07-09 Bacterie legumineuse ayant une aptitude de fixation de l'azote potentialisee

Country Status (6)

Country Link
US (2) US7109020B2 (ja)
EP (1) EP1416043A4 (ja)
JP (1) JP2003033174A (ja)
CN (1) CN1537160A (ja)
CA (1) CA2453672A1 (ja)
WO (1) WO2003006631A1 (ja)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4686395B2 (ja) * 2005-04-01 2011-05-25 有限会社Ｓ．Ｇラボラトリー カタラーゼ高生産性リゾビウム属微生物
FR2899580B1 (fr) * 2006-04-10 2008-06-06 Inst Microbiologie De L Academ Le nitragin et la zeolite naturelle : nouveaux procedes de leur utilisation dans l'agriculture.
CN102206671A (zh) * 2010-03-26 2011-10-05 中国科学院上海生命科学研究院 一种改变植物性状的方法
CN103237884B (zh) * 2010-06-14 2015-08-19 株式会社爱茉莉太平洋 新的土壤微生物、从所述土壤微生物分离的新氧化还原酶、编码所述氧化还原酶的基因和使用所述微生物、氧化还原酶和基因产生糖苷配基的方法
US20130160165A1 (en) * 2010-06-24 2013-06-20 BASF Plant Science Company BmbH Plants Having Enhanced Yield-Related Traits and Method for Making the Same
CA2838955C (en) 2011-06-16 2023-10-24 The Regents Of The University Of California Synthetic gene clusters
WO2013132518A1 (en) 2012-03-03 2013-09-12 Department Of Biotechnology Ministry Of Science & Technology Recombinant nitrogen fixing microorganism and uses thereof
US10968446B2 (en) 2012-11-01 2021-04-06 Massachusetts Institute Of Technology Directed evolution of synthetic gene cluster
US20140352376A1 (en) * 2013-05-28 2014-12-04 BiOWiSH Technologies, Inc. Fertilizer compositions methods of making and using same
JP2014230534A (ja) * 2013-05-30 2014-12-11 国立大学法人東北大学 Ｎ２ｏ還元能が強化された根粒菌及びｎ２ｏの除去方法
US20160340658A1 (en) * 2014-02-04 2016-11-24 University Of Florida Research Foundation, Inc. Pteris vittata phytase nucleotide and amino acid sequences and methods of use
CN115418357A (zh) 2015-07-13 2022-12-02 皮沃特生物公司 改良植物性状的方法及组合物
JP2018537119A (ja) 2015-10-05 2018-12-20 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー リファクターされたｎｉｆクラスターを使用する窒素固定
EP3208254B1 (en) 2016-02-17 2020-05-20 Fertinagro Biotech, S.L. Fertilizing composition which includes ions complexed with humic substances to improve the biological fixation of nitrogen by microorganisms present in the soil
US11203761B2 (en) * 2016-08-26 2021-12-21 Codex Dna, Inc. Genetically engineered Vibrio sp. and uses thereof
CN110799474B (zh) 2017-01-12 2022-07-26 皮沃特生物公司 用于改良植物性状的方法及组合物
CN107164261B (zh) * 2017-05-09 2019-06-11 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 一株促进毛叶苕子增长的根瘤菌及其应用
MX2020013875A (es) 2018-06-27 2021-08-11 Pivot Bio Inc Composiciones agricolas que comprenden microbios remodelados de fijacion de nitrogeno.
CN115508509B (zh) * 2022-09-16 2023-04-28 吉林省农业科学院 一种大豆苗期耐低氮能力评价方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000316584A (ja) * 1999-05-14 2000-11-21 Japan Science & Technology Corp カタラーゼ遺伝子

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5906929A (en) * 1997-05-01 1999-05-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Enhanced inoculant for soybean cultivation

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000316584A (ja) * 1999-05-14 2000-11-21 Japan Science & Technology Corp カタラーゼ遺伝子

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BISHNOI N.R. ET AL.: "Influence of sodium chloride on nitrogen fixation and enzymes associated with scavenging hydrogen peroxide in clusterbean root nodules", INDIAN J. EXP. BIOL., vol. 35, no. 2, 1997, pages 193 - 196, XP002956177 *
OHWADA T. ET AL.: "Susceptibility to hydrogen peroxide and catalase activity of root nodule bacteria", BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 63, no. 3, 1999, pages 457 - 462, XP002956178 *
OHWADA T.: "Rhizobium fredii USDA191", vol. 21, no. 1, 1998, pages 17 - 25, XP002956179 *
OHWADA T.: "Rhizobium fredii USDA191", vol. 21, no. 1, 1998, pages 27 - 35, XP002956180 *
See also references of EP1416043A4 *
SWARAJ K. ET AL.: "Effect of salt stress on nodulation and nitrogen fixation in legumes", INDIAN J. EXP. BIOL., vol. 37, no. 9, 1999, pages 843 - 848, XP002956176 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2453672A1 (en) 2003-01-23
EP1416043A4 (en) 2006-05-24
US20060270555A1 (en) 2006-11-30
JP2003033174A (ja) 2003-02-04
US20040241847A1 (en) 2004-12-02
US7109020B2 (en) 2006-09-19
CN1537160A (zh) 2004-10-13
EP1416043A1 (en) 2004-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20060270555A1 (en) Root nodule bacteria having enhanced nitrogen-fixation ability
US10450556B2 (en) Microbial fermentation methods and compositions
US20160073641A1 (en) Microbial Inoculant Formulations
HU230555B1 (hu) Környezetbarát mikroorganizmus-készítmény és annak előállítása
EP1135462A1 (en) Microorganisms for improving plant productivity
WO2013141815A1 (en) Nitrogen-fixing bacterial inoculant for improvement of crop productivity and reduction of nitrous oxide emission
AU2487399A (en) Liquid nutrient plant formulation with microbial strains
AU2012342047B2 (en) Recombinant nitrogen-fixing bacterial strain, inoculum containing the same and application methods
JP4955431B2 (ja) 根粒菌
CA1328238C (en) Nodulation promoting bacteria and use thereof
KR102271642B1 (ko) 식물생장촉진 효과를 갖는 신규한 엔테로박터속 균주 및 이의 용도
ES2234417B1 (es) Nuevo fertilizante biologico y procedimiento de obtencion.
KR100460633B1 (ko) 토양의 불용성 인산염을 가용화하는 신규의 균주 레클레르시아 아데카르복실라타 케이에스제이8
Nakano et al. Nodulation of Rj-soybean varieties with Rhizobium fredii USDA 193 under limited supply of nutrients
JP3574685B2 (ja) マメ科植物用微生物製剤
CN114717160B (zh) 肠杆菌和菌剂以及其应用
JPH09227323A (ja) 作物栽培用微生物資材及びそれを用いた作物の栽培方法
JP2005013003A (ja) 窒素固定能を増強した内生ならびに単生窒素固定菌
KR100646601B1 (ko) 작물생장을 촉진시키는 미생물 바실러스 에스피 ｋｒ083(ｋａｃｃ91050) 및 이를 함유하는 미생물 제제
KR100460634B1 (ko) 토양의 불용성 인산염을 가용화하는 신규의 균주엔테로박터 인터메디우스 케이에스제이16
KR890004023B1 (ko) 퍼라이트(perlite)를 이용한 근류균접종제 제조방법
JP3574686B2 (ja) マメ科植物用微生物製剤
JPH09165312A (ja) 作物栽培用微生物資材
KR20240009700A (ko) 슈도모나스 플루오레센스 및 브레디라이조비움 자포니쿰의 혼합물을 포함하는 식물 성장 촉진용 조성물 및 이를 식물에 살포하는 식물 성장 촉진 방법
JPH05192050A (ja) リゾビウム接種材料の製法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA CN US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SK TR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 20028138171

Country of ref document: CN

Ref document number: 2453672

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002743878

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10483225

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002743878

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2002743878

Country of ref document: EP