JP4686395B2 - カタラーゼ高生産性リゾビウム属微生物 - Google Patents
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Description
aurantiacus)、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)(特許文献1)や、細菌の一種であるミクロコッカス
ルテウス(Micrococcus luteus)等が使用されてきた。しかしながら、製品にするには酵素の活性値を十分に高めるために精製などの濃縮工程を要していた。さらに、サーモアスカス
オーランティアカスやアスペルギルス ニガーなどのカビは培養に5〜10日間要するため生産効率が悪かった。細菌については培養効率が良いが熱安定性が低いなどそれぞれに欠点を抱えている。
エスピー(Rhizobium sp.) 2−1(寄託番号FERM P−20348)である。
細胞の形態:桿菌
運動性:有り
胞子形成:無し
<生育状態>
コロニーの形態:円形
コロニーの色調:ベージュ
コロニーの表面:平滑
生育温度:4℃、30℃、40℃で生育する。45℃で生育しない
生育pH:5.5〜9.5(至適生育pH:6.5〜7.5)
酸素要求性:好気
<生理学的性質>
グラム染色性:陰性
O−Fテスト:oxidative
カタラーゼテスト:陽性
オキシダーゼテスト:陽性
資化性(D−フルクトース、マルトース、D−マンノース、メリビオース、D−マンニトール、グリセロール、Lアラビノース、スクロース、D−ソルビトール、D−ガラクトース、L−ラムノース):有り
rDNAの部分をPCR法により増幅して塩基配列を決定し、その塩基配列についてFASTAサーチを行ったところリゾビウム属に属することが判明した。
エスピー(Agrobacterium sp.))と同定された。本出願人はこれをリゾビウム エスピー 2−1(Rhizobium sp. 2-1)と命名し(旧分類による名称:アグロバクテリウム エスピー 2−1(Agrobacterium sp. 2−1))、平成16年12月22日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(郵便番号305-8566、茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に寄託番号FERM P−20348として寄託した。
トリプトン 10g
酵母エキス 5g
塩化ナトリウム 10g
蒸留水 1L
pH 6.5
(a)熱安定性
60℃で15分間放置したとき放置前の75%以上、好ましくは85%以上のカタラーゼ活性を保持する。
65℃で15分間放置したとき放置前の45%以上、好ましくは55%以上のカタラーゼ活性を保持する。
(b)pH安定性
30℃で30分間処理したときpH5〜11でpH7のときの80%以上、好ましくは90%以上のカタラーゼ活性を保持する。
(c)至適温度
至適温度は4〜65℃、好ましくは30〜50℃である。
(d)至適pH
至適pHは5〜9、好ましくは6〜9である。
カタラーゼを生産する微生物のスクリーニング:
工場廃水や土壌約200サンプルについて、カタラーゼ活性が高い微生物をスクリーニングした。まず、工場廃水や土壌等を下記に示す培地に添加し培養した。過酸化水素存在下で増殖することを指標に、さらにその菌体そのものまたは菌体抽出液を、過酸化水素溶液に添加し過酸化水素を分解する速度を指標に選択した。菌体抽出液は培養液を超音波照射やフレンチプレス等によって破砕して菌体抽出液を調製し、そのカタラーゼ活性を測定した。
トリプトン 10g
酵母エキス 5g
塩化ナトリウム 10g
過酸化水素 500ppm
蒸留水 1L
luteus)NBRC3333よりも数倍高いカタラーゼ活性を有する微生物として2−1株を取得した。この2−1株についてBIOLOG簡易同定システムおよび16S
rDNAの塩基配列を用いたFASTAサーチを行った結果、リゾビウム エスピーと同定された。本発明者は2−1株をリゾビウム エスピー 2−1と名付けた。リゾビウム
エスピー 2−1株の分類学上の位置を図1に示した。尚、旧分類による名称アグロバクテリウム エスピーSG2−1株の分類学上の位置を図2に示した。
菌体抽出液の調製:
リゾビウム エスピー 2−1株(以下、単に「2−1株」という)を下記に示す培地で定常期前期まで培養し、遠心分離(10,000g、15分)によって集菌した。回収した菌体約5g(湿重量)を50mMリン酸緩衝液(pH7)にて洗浄後、培地量と同量(1L)の50mMリン酸緩衝液(pH7)に懸濁し、菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液をフレンチプレス(20,000lb/in 2 )で菌体破砕して破砕液を得、更に遠心分離(10,000g、15分)することによって未破砕の微生物が除かれ、カタラーゼを含む菌体抽出液を得た。また、比較としてミクロコッカス
ルテウス NBRC3333(以下、単に「NBRC3333」という)の菌体抽出液を2−1株と同様にして得た。これら菌体抽出液のカタラーゼ活性とタンパク質あたりのカタラーゼ活性を測定した。
トリプトン 10g
酵母エキス 5g
塩化ナトリウム 10g
蒸留水 1L
また、菌体湿重量あたりのカタラーゼ活性としては、2−1株は6,508kU/gであり、NBRC3333株では236kU/gであった。
カタラーゼの性質の測定:
実施例2で得られた2−1株の菌体抽出液に含まれるカタラーゼについて以下の性質を測定した。また、比較としてNBRC3333の菌体抽出液に含まれるカタラーゼについても同様に測定した。
試験管に実施例2で得られた菌体抽出液1mlを入れ、各温度(30、35、40、45、50、55、60、65、70、75)で15分間インキュベートした後、カタラーゼ活性を測定した。その結果を図3に示した。
菌体抽出液を各pH(4、5、6、7、8、9、10、11)の緩衝液に添加し、30℃で30分静置後のカタラーゼ活性を測定した。緩衝液は、50mMクエン酸緩衝液(pH3〜6)、50mMリン酸緩衝液(pH6〜8)、50mMトリス緩衝液(pH8〜9)、50mMグリシン緩衝液(pH10〜11)を使用した。
過酸化水素を30mM含む各pH(3、4、5、6、7、8、9、10、11)の緩衝液を調整し、その緩衝液中でのカタラーゼ活性を測定した。
カタラーゼ抽出液(菌体抽出液)を用いた過酸化水素の分解:
2−1株を実施例2と同様に定常期前期まで培養し、遠心分離(10,000g、15分)によって集菌した。得られた菌体約5g(湿重量)を50mMリン酸緩衝液(pH7)で洗浄後、培地量の1/5(200ml)の50mMリン酸緩衝液に懸濁し、菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液をフレンチプレス(20,000lb/in2)で菌体破砕して破砕液を得、更に遠心分離(10,000g、15分)することによって未破砕の微生物が除かれ、カタラーゼを含む菌体抽出液を得た。この菌体抽出液のカタラーゼ活性は126,600U/mlであった。この菌体抽出液を終濃度0.1%になるように過酸化水素を1%含む工場廃水に添加し、過酸化水素分解試験を行った。廃水中の過酸化水素の濃度を経時的に測定した結果を図4に示した。
カタラーゼを用いた過酸化水素の分解:
2−1株を下記に示す培地で定常期前期まで培養し、遠心分離(10,000g、10分)によって集菌した。得られた菌体約23g(湿重量)を200mlの50mMリン酸緩衝液に懸濁し、菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液をフレンチプレス(20,000lb/in2)で菌体破砕して破砕液を得、更に遠心分離(10,000g、15分)することによって未破砕の微生物が除かれ、カタラーゼを含む菌体抽出液を得た。この菌体抽出液のカタラーゼ活性は212,840U/mlであった。この菌体抽出液を終濃度100U/mlになるように過酸化水素を1%含む工場廃水に添加し、過酸化水素分解試験を行った。NBRC3333の菌体抽出液についても同時に試験を行い、比較した。
酵母エキス 5g
塩化ナトリウム 10g
クエン酸ナトリウム 1g
グルタミン酸ナトリウム 10g
コーンスティープリカー 5g
蒸留水 1L
Claims (4)
- リゾビウム エスピー(Rhizobium sp.) 2−1(寄託番号FERM P−20348)であるリゾビウム属微生物。
- 請求項1に記載のリゾビウム属微生物を培養して得られる培養液中の菌体を破砕することによって得られ、
60℃で15分間放置したとき放置前の75%以上のカタラーゼ活性を保持し、かつ65℃で15分間放置したとき放置前の45%以上のカタラーゼ活性を保持することを特徴とするカタラーゼ抽出液。 - 請求項1に記載のリゾビウム属微生物を培養して培養液を得、次いで培養液中の菌体を破砕してカタラーゼを抽出することを特徴とするカタラーゼ抽出液の製造方法。
- 請求項3に記載のカタラーゼ抽出液を過酸化水素に作用させることを特徴とする過酸化水素の分解方法。
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