KR20160135768A - 옥수수 이삭벌레를 방제하기 위한 Cry1D - Google Patents

Abstract

본 발명은 부분적으로 Cry1Da가 옥수수 이삭벌레 (CEW), 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea) (바디(Boddie))에 대해 활성이라는 놀라운 발견에 관한 것이다. 심각한 작물 손상을 방지하기 위해 트랜스제닉 식물의 Cry1Da를 사용하는 방법이 기재되어 있다. 전장, 코어 독소 영역 또는 키메라 Cry1Da를 발현하는 트랜스제닉 메이즈를 사용하는 잎 및 수염 생물검정은 CEW 유충 손상에 대해 우수한 곤충 방지를 입증하였다.

Description

옥수수 이삭벌레를 방제하기 위한 Cry1D {CRY1D FOR CONTROLLING CORN EARWORM}

상호 참조

본 출원은 2014년 3월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 61/968,703을 우선권 주장한다. 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 명백하게 참조로 포함된다.

Cry1Da는 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)의 특정 종에 의해 생산되는 공지된 델타-내독소이고, 미국 특허 5,691,308에 최초로 기재되었다. 보다 최근에 2개의 독립적인 상호 검토된 논문에 의해 옥수수 이삭벌레 (CEW)에 대해 불활성인 것으로 보고된 바 있다: 문헌 [Karim et al. (2000) 및 Frankenhuyzen (2009)]. 따라서 하기의 놀랍고 예상하지 못한 관찰은 이러한 공개된 결과를 직접 반박하고, Cry1Da가 그 유전자가 식물에서 발현되는 경우 CEW 유충에 대해 우수한 살곤충 활성을 갖는다는 것을 분명하게 보여준다.

본 발명은 부분적으로 Cry1Da가 옥수수 이삭벌레 유충 (CEW), 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea) (바디(Boddie))에 대해 활성이라는 놀라운 발견에 관한 것이다. 전장, 말단절단된, 및 키메라 버전의 Cry1Da를 발현하는 트랜스제닉 메이즈를 사용하는 잎 및 수염 생물검정은 CEW 유충 손상에 대한 우수한 곤충 방지를 입증하였다. 메이즈 수염의 CEW 유충 섭식 방지가 Cry1Fa를 생산하는 상업용 식물과 비교하여 말단절단된 Cry1Da를 발현하는 트랜스제닉 식물에서 우월한 것으로 밝혀진 것이 또한 놀라웠다.

CEW는 바실루스 투린기엔시스 (Bt) 단백질로 방제하기 어려운 곤충 해충이고, Cry1Da를 발현하는 트랜스제닉 메이즈가 이 곤충에 의해 유발되는 섭식 손상으로부터 메이즈 수염을 보호하는 생물학적 활성을 나타낸다는 관찰이 최초로 기재된다. 성체 CEW 나방은 전형적으로 옥수수 수염 상에 그의 알을 산란하고, 새로 발생하는 유충은 이삭으로 되기 전에 옥수수 수염을 섭식한다. 따라서, 곤충 방지제 활성을 메이즈 수염 조직에 위치하게 하는 것은 메이즈의 이러한 심각한 및 파괴성 해충에 의해 유발되는 섭식 손상에 대해 상당한 방지 효과를 제공할 것이다.

도 1. CEW 유충으로 시험감염된 비-형질전환된 메이즈 (B-104), YFP 발현 트랜스제닉 메이즈 (109812), 허큘렉스1(Herculex1)^TM 메이즈 (HX1), 또는 전장 Cry1Da (109840) 또는 말단절단된 Cry1Da (109841)를 발현하는 트랜스제닉 T-1 메이즈의 퍼센트 잎 손상 활성.

서열의 간단한 설명

서열식별번호(SEQ ID NO): 1은 DIG-911 코딩 서열 (CDS)을 갖는 DNA 단편이다.

서열식별번호: 2는 DIG-911 단백질에 대한 아미노산 서열이다 (본질적으로 진뱅크 수탁 번호 AFK79795.1에 개시된 바와 같은, Cry1Ab (DIG-911 아미노산 595 내지 1139)로부터 유래된 전독소 절편 및 Cry1Da (진뱅크(GENBANK) 수탁 번호 176415.1 및 미국 특허 번호 5,691,308에 개시된 바와 같은, 아미노산 1 내지 594)의 코어 독소 절편으로 이루어진, Cry1Da2/Cry1Ab 키메라 살곤충 독소).

서열식별번호: 3은 DIG-180 코딩 서열 (CDS)을 갖는 DNA 단편이다.

서열식별번호: 4는 DIG-180 (Cry1Fa2) 단백질이다.

서열식별번호: 5는 Cry1Da2 코어 독소 살곤충 단백질 (서열식별번호: 6)을 코딩하는 메이즈-최적화된 코딩 서열 (서열식별번호: 5)을 포함하는 게이트웨이(Gateway)® (인비트로젠(INVITROGEN)) 진입 벡터 pDAB109825이다.

서열식별번호: 6은 Cry1Da2 코어 독소 살곤충 단백질이다.

서열식별번호: 7은 AAD-1에 대한 프라이머이다; 표 2 참조.

서열식별번호: 8은 AAD-1에 대한 프라이머이다.

서열식별번호: 9는 AAD-1에 대한 프로브이다.

서열식별번호: 10은 스펙티노마이신 저항성 유전자에 대한 프라이머이다.

서열식별번호: 11은 스펙티노마이신 저항성 유전자에 대한 프라이머이다.

서열식별번호: 12는 스펙티노마이신 저항성 유전자를 위한 프로브이다.

서열식별번호: 13은 메이즈 인버타제 유전자에 대한 프라이머이다.

서열식별번호: 14는 메이즈 인버타제 유전자에 대한 프라이머이다.

서열식별번호: 15는 메이즈 인버타제 유전자에 대한 프로브이다.

상세한 설명

본 발명은 부분적으로 Cry1Da가 옥수수 이삭벌레 유충 (CEW), 헬리코베르파 제아 (바디)에 대해 활성이라는 놀라운 발견에 관한 것이다. 시험관내 사료 생물검정으로부터의 생물검정 결과는 Cry1Da/Cry1Ab 전독소 키메라가 CEW 유충에 대해 상당한 성장 억제 및 사멸률을 초래함을 보여준다. Cry1Da 살곤충 단백질 또는 독소는 서열식별번호: 6 또는 그의 변이체에 제시된 코어 독소를 포함하는 임의의 살곤충 단백질이다. 이러한 변이체는 서열식별번호: 6에 대해 적어도 95% 서열 동일성, 바람직하게는 서열식별번호: 6에 대해 99% 서열 동일성을 갖는다.

말단절단된 버전의 Cry1Da를 발현하는 트랜스제닉 메이즈를 사용하는 잎 및 수염 생물검정은 CEW 유충 손상에 대한 우수한 곤충 방지를 입증하였다. CEW 섭식에 대한 대등한 잎 보호가 말단절단된 Cry1Da를 발현하는 트랜스제닉 메이즈 식물 및 Cry1Fa를 발현하는 상업용 허큘렉스® I (HX1) 제품 둘 다에서 관찰되었다.

놀랍게도, 메이즈 수염의 CEW 유충 섭식 방지는 HX1 식물과 비교하여 말단절단된 Cry1Da를 발현하는 트랜스제닉 식물에서 우월한 것으로 밝혀졌다. 말단절단된 Cry1Da를 발현하는 트랜스제닉 메이즈로부터의 수염 조직을 섭식한 곤충은 사멸률 (~25%)을 겪었으며, 이는 HX1 식물로부터의 수염 조직을 섭식한 곤충에서 관찰되는 것 (<10%)보다 수치적으로 보다 우수하다.

CEW는 바실루스 투린기엔시스 (Bt) 단백질로 방제하기 어려운 곤충 해충이고, Cry1Da를 발현하는 트랜스제닉 메이즈가 이 곤충에 의해 유발되는 섭식 손상으로부터 메이즈 수염을 보호하는 생물학적 활성을 나타낸다는 관찰이 최초로 기재된다. 성체 CEW 나방은 전형적으로 옥수수 수염 상에 알을 산란하고, 새로 발생하는 유충은 이삭으로 되기 전에 옥수수 수염을 섭식한다. 따라서, 곤충 방지제 활성을 메이즈 수염 조직에 위치하게 하는 것은 메이즈의 이러한 심각한 및 파괴성 해충에 의해 유발되는 섭식 손상에 대해 상당한 방지 효과를 제공할 것이다. 본 발명의 배치 옵션은 대두- 및 옥수수-성장 영역을 비롯한, CEW가 존재하고 문제가 되는 지리적인 영역에서의 Cry1Da 단백질의 사용을 포함한다.

본원에 기재된 데이터는 Cry1Da가 허큘렉스 1®과 비교하여 수염 조직을 통해 CEW를 방제하는데 탁월한 단백질임을 입증한다. 본원에 사용된 용어 "방제" 및 "방제하는"은 성장 억제 및/또는 사멸률을 포함한다.

Cry1Da/Cry1Ab 전독소 키메라는 사료 곤충 생물검정에서 에이치. 제아(H. zea)에 대해 살곤충 활성을 갖는 것으로 본원에서 밝혀졌다. 말단절단된 형태의 Cry1Da가 트랜스제닉 메이즈에서 발현되었을 경우, 이는 식물을 CEW 또는 가을 거염벌레 (FAW), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)에 의해 유발되는 잎 및 수염 섭식 손상으로부터 보호하였다. 이러한 결과는 Cry1Da가 CEW에 대해 활성이지 않고 (Karim, 2000), FAW에 대해서만 활성 (Van Frankenhuyzen, 2009)인 것으로 이전에 보고되었기 때문에 놀라운 것이다. Cry1Da 살곤충 단백질은 공지되어 있으나; 본 발명은 식물, 특히 작물 식물에 대한 심각한 CEW 손상을 방지하기 위한 Cry1Da의 신규한 예상외의 용도이다.

헬리코베르파 제아는 다식성 유충 섭식 습성을 갖는다. 바람직하게는 질소-풍부한 생식 구조 및 성장 조직, 예컨대 메이즈 수염, 이삭, 속대 및 웅수, 목화 다래 및 눈뿐만 아니라 대두 꼬투리를 섭식한다. 이것은 작물 수확량에 직접적으로 영향을 미치는 식물 손상이기 때문에 매우 해로운 곤충 (작물에 대한 해충)이다. 메이즈를 제외하고는, Cry1Da는 높은 가치의 작물, 예컨대 목화 및 대두뿐만 아니라 채소, 예컨대 토마토에서 이 곤충 종을 방제하는데 유용성을 갖는다.

곤충 저항성 관리 (IRM)는 곤충 해충이 살충제에 대해 저항성이 되는 잠재력을 감소시키는데 사용되는 농업 실시를 기재한다. 곤충 저항성이 트랜스제닉 작물에서의 Cry 독소 사용에 수많은 위협을 제기하기 때문에 IRM은 주요 작물 식물에서의 Cry 독소의 사용과 관련하여 매우 중요하다. 구체적인 IRM 전략, 예컨대 고용량 및 구조화 피난처는 곤충이 특정 Cry 독소에 대해 저항성을 발생시킬 가능성을 감소시키는 능력을 갖는다. 효과적 IRM 실시는 저항성 발생의 위험을 감소시킬 수 있다.

미국 환경 보호청은 그의 웹사이트 (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) 상에, 표적 해충에 대해 활성인 단일 Cry 독소를 생산하는 트랜스제닉 작물과 사용하기 위한 비 Cry 독소-보유 식물로 구성된 피난처를 제공하기 위한 하기 요건을 공개한다.

"옥수수 천공충-보호된 Bt (Cry1Ab 또는 Cry1F) 옥수수 제품에 대한 구체적인 구조화 요건은 하기와 같다:

- 구조화 피난처:

옥수수 지대에서 20% 비-인시목 Bt 옥수수 피난처;

목화 지대에서 50% 비-인시목 Bt 피난처

- 블록

내부 (즉, Bt 재배지 내)

외부 (즉, 무작위 교배를 최대화하기 위한 Bt 재배지의 ½ 마일 (가능한 경우에 ¼ 마일) 내의 별도의 재배지)

- 재배지 내 스트립

스트립은 유충 이동의 영향을 감소시키기 위해 적어도 4열 (바람직하게는 6열)의 너비여야 함"

또한, 국립 옥수수 재배자 협회는 그의 웹사이트: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) 상에 또한 피난처 요건에 관해 유사한 안내를 제공한다. 예를 들어:

"옥수수 천공충 IRM 요건:

- 생산자의 옥수수 에이커의 적어도 20％에 피난처 하이브리드를 심어야 함

- 목화 생산 영역에서는, 피난처가 50%여야 함

- 피난처 하이브리드의 1/2 마일 이내에 심어야 함

- 피난처는 Bt 재배지 내에 스트립으로서 심어질 수 있고; 피난처 스트립은 적어도 4열 너비여야 함

- 피난처는 표적 곤충에 대해 경제적 한계에 이를 때에만 통상적인 살충제로 처리될 수 있음

- Bt-기반 분무가능한 살곤충제는 피난처 옥수수에 사용될 수 없음

- 적절한 피난처는 모든 농장에서 Bt 옥수수가 심어져야 함"

재배지에서의 다양한 기하학적 재식 패턴 (상기 언급된 바와 같음) 및 문헌 [Roush et al. (상기 문헌)] 및 미국 특허 번호 6,551,962에 의해 추가로 논의된 바와 같은 자루내 종자 혼합물을 포함하여, 피난처의 IRM 효과를 제공하는 다양한 방식이 존재한다.

곤충 독소, 및 곤충 활성 변이체 본원에 논의된 바와 같은 구체적으로 예시된 유전자 및 단백질 이외에 살곤충 활성 변이체가 포함된다. 본 출원인은 용어 "변이체"가 단편, 특정 결실 및 삽입 돌연변이체, 및 특정 융합 단백질을 포함하도록 의도한다. Cry1Da 단백질은 전형적 3-도메인 Cry 독소이다. 본 발명에 포함되는 Cry1Da 곤충 독소의 변이체를 기재하는 것에 대한 서론으로서, 일반적으로 3-도메인 Cry 독소 및 Cry1Da 곤충 독소의 구조를 간략하게 검토하는 것이 유용할 것이다.

대다수의 바실루스 투린기엔시스 델타-내독소 결정 단백질 분자는 2개의 기능적 절편으로 구성된다. 프로테아제-저항성 코어 독소는 제1 절편이고, 단백질 분자의 약 제1 절반부에 상응한다. ~130 kDa의 전체 전독소 분자는 곤충의 장에서 프로테아제에 의해 저항성 코어 절편으로 신속하게 프로세싱된다. 이러한 프로세싱에 의해 결실되는 절편은 본원에서 "전독소 절편"으로 지칭될 것이다. 전독소 절편은 독소 결정 형성에 참여하는 것으로 여겨진다 (Arvidson et al., (1989)). 따라서 전독소 절편은 독소 분자의 프로테아제 프로세싱을 감소시킴으로써 (Haider et al., (1986)) 또는 독소 용해도를 감소시킴으로써 (Aronson et al., (1991)) 곤충에 대한 코어의 접근성을 제한함으로써 독소에 대한 부분적 곤충 특이성을 전달할 수 있다. B.t. 독소는, 특정 부류 내에서도, 길이 및 코어 독소 부분에서 전독소 부분으로의 전이의 정확한 위치에서 어느 정도 달라진다. 코어 독소 부분에서 전독소 부분으로의 전이는 전형적으로 전장 독소의 약 50% 내지 약 60%에서 일어날 것이다.

3차원 결정 구조가 Cry1Aa1, Cry2Aa1, Cry3Aa1, Cry3Bb1, Cry4Aa, Cry4Ba 및 Cry8Ea1에 대해 결정되었다. 코어 독소에 대한 이들 구조는 현저하게 유사하고, 3개의 특징적인 도메인으로 구성된다 (문헌 [de Maagd et al., 2003]에서 검토됨).

제한된 수의 아미노산 결실, 치환, 또는 부가를 일으킴으로써 생성된 곤충 독소 변이체 예시된 아미노산 서열에 대한 아미노산 결실, 치환, 및 부가가 순차적인 방식으로 용이하게 이루어질 수 있고, 살곤충 활성에 대한 이러한 변이의 영향은 생물검정에 의해 시험될 수 있다. 변화의 수가 수적인 면에서 제한된다면, 이러한 시험은 불합리한 실험을 수반하지 않는다. 본 발명은 10개 이하, 15개 이하, 또는 20개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환이 일어난 코어 독소의 살곤충 활성 변이체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 예시된 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코어 독소 절편을 갖는 것을 포함하는 Cry1Da 살곤충 활성 변이체가 포함된다. 또한 예시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 동일성을 갖는 유사한 활성 단백질이 포함된다.

공식 명명법 절차에 따르면, Cry 및 B.t. 명명법은 대략 95% (예를 들어, Cry1Da의), 78% (Cry1D의), 및 45% (Cry1의) 서열 동일성의 경계에 기초한다 (문헌 ["Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813]에 따름).

변이체는 무작위 돌연변이를 일으킴으로써 만들어질 수 있거나, 변이체는 설계될 수 있다. 설계된 돌연변이체의 경우, 아미노산 동일성이 생물학적 활성의 원인이거나 생물학적 활성을 궁극적으로 담당하는 3차원 형상의 결정에 수반되는 중요한 독소 영역 내에서 유지될 때, 천연 독소와 유사한 활성을 갖는 변이체가 생성될 가능성이 높다. 높은 확률의 활성 유지는 또한 치환이 보존적인 경우 발생할 것이다. 아미노산은 하기 부류에 배치될 수 있다: 비-극성, 비하전된 극성, 염기성, 및 산성. 하나의 부류의 아미노산이 동일한 유형의 또 다른 아미노산으로 대체되는 보존적 치환은 변이체의 생물학적 활성을 실질적으로 변경시킬 가능성이 가장 적다. 하기는 각 부류에 속하는 아미노산의 예를 열거한다.

아미노산의 부류 아미노산의 예

비극성 측쇄 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp

비하전된 극성 측쇄 Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln

산성 측쇄 Asp, Glu

염기성 측쇄 Lys, Arg, His

베타-분지형 측쇄 Thr, Val, Ile

방향족 측쇄 Tyr, Phe, Trp, His

일부 경우에, 비-보존적 치환이 또한 만들어질 수 있다. 결정적 인자는 이러한 치환이 독소의 생물학적 활성을 유의하게 손상시키지 않아야 한다는 것이다. 변이체는 돌연변이 유발로 인해 아미노산 서열이 상이한 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명에 포괄되는 변이체 단백질은 생물학적으로 활성이며, 즉 이는 천연 단백질의 목적하는 생물학적 활성을 계속하여 보유하며, 즉 살곤충 활성을 유지한다.

서열 수준에서는 상이하지만 동일한 또는 유사한 전체 본질적 3차원 구조, 표면 전하 분포 등을 보유하는 변이체 단백질이 또한 설계될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7058515; 문헌 [Larson et al., (2002); Stemmer (1994a, 1994b, 1995); 및 Crameri et al., (1996a, 1996b, 1997)]을 참조한다.

핵산 Cry1Da 곤충 독소를 코딩하는 단리된 핵산은 본 발명의 한 측면이다. 이는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 4, 및 서열식별번호: 6을 코딩하는 핵산, 및 그의 상보체뿐만 아니라 살곤충 활성 변이체를 코딩하는 다른 핵산의 신규 용도를 포함한다. 본 출원인은 "단리된"이 핵산 분자가 그의 천연 환경으로부터 제거되고, 인공적으로 상이한 환경에 배치되었다는 것을 의미하게 한다. 유전자 코드의 중복성 때문에, 다양한 상이한 DNA 서열이 본원에 개시된 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 동일한, 또는 본질적으로 동일한 독소를 코딩하는 이러한 대안적 DNA 서열을 생성하는 것은 관련 기술분야의 숙련된 통상의 기술자의 기술 내에 충분히 포함된다.

본 발명의 코딩 서열은 비-B.t. 프로모터를 포함하는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 서열은, 예를 들어 식물 게놈에서 재현가능하게 존재하는 바와 같은 것을 포함하는 발현 구축물, 형질전환 카세트, 및 발현 카세트에 포함될 수 있다.

유전자 합성 본원에 기재된 개선된 Cry 단백질을 코딩하는 유전자는 관련 기술분야에 널리-공지된 다양한 방법에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 합성 유전자 절편 및 합성 유전자는 포스파이트 트리-에스테르 및 포스포르아미다이트 화학에 의해 만들어질 수 있으며 (Caruthers et al., 1987), 상업적 판매업체는 요구에 따라 유전자 합성을 수행할 수 있다. 전장 유전자는, 예를 들어 제한 단편의 라이게이션 또는 중첩 올리고뉴클레오티드의 폴리머라제 연쇄 반응 조립에 의한 것을 포함하는 다양한 방식으로 조립될 수 있다 (Stewart and Burgin, 2005). 추가로, 말단 유전자 결실은 부위-특이적 말단 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 증폭에 의해 만들어질 수 있다.

Cry1Da 곤충 독소를 코딩하는 핵산은, 예를 들어 여러 상업적 공급업체 중 임의의 것에 의해 현재 실시되는 방법에 의한 합성 구축에 의해 만들어질 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7482119 B2 참조). 이러한 유전자, 또는 그의 부분 또는 변이체는 또한, 예를 들어 유전자 합성기의 사용 및 예를 들어, 미국 특허 번호 5380831의 설계 방법에 의해 합성적으로 구축될 수 있다. 대안적으로, 합성 또는 자연 발생 유전자의 변이는 점 돌연변이를 만드는 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 용이하게 구축될 수 있다. 이러한 유전자의 단편은 또한 표준 절차에 따라 상업적으로 입수가능한 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 효소, 예컨대 Bal31 또는 부위-지정 돌연변이유발이 이러한 유전자의 말단으로부터 뉴클레오티드를 체계적으로 절단하는데 사용될 수 있다. 또한, 활성 독소 단편을 코딩하는 유전자 단편은 다양한 제한 효소를 사용하여 수득될 수 있다.

Cry1Da 곤충 독소에 대한 아미노산 서열을 고려하여, 의도된 숙주에 의해 선호되는 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 역번역한 후, 대안적 코돈을 사용하여 문제를 야기할 수 있는 서열을 제거하고 주기적인 정지 코돈을 제공하여 비-코딩 리딩 프레임 내의 긴 오픈 코딩 서열이 제거되도록 서열을 정밀화함으로써 코딩 서열이 설계될 수 있다.

서열 동일성 정량화 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열을 최적 비교 목적을 위해 정렬한다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, 퍼센트 동일성 = 동일한 위치의 수 / 위치 (예를 들어, 중첩 위치)의 총수 x100). 한 실시양태에서, 2개의 서열은 길이가 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭(gap)을 허용하거나 허용하지 않으면서, 하기 기재된 것과 유사한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성의 계산에서, 전형적으로 정확한 매치가 계수된다.

2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 알고리즘의 비제한적 예는 문헌 [Altschul et al. (1990), 및 Karlin and Altschul (1990)]의 것이고, 이는 문헌 [Karlin and Altschul (1993)]에서와 같이 변형되고, BLASTN 및 BLASTX 프로그램에 포함된다. BLAST 검색은 핵산 또는 단백질 데이터베이스에서 질의 서열과 상동인 (유사한) 서열을 확인하는데 편리하게 사용될 수 있다. BLASTN 검색은 본 발명의 청구된 핵산 분자에 대해 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 확인하기 위해 수행될 수 있다 (점수 = 100, 단어 길이 = 12). BLASTX 검색은 본 발명의 청구된 살곤충 단백질 분자에 대해 상동성을 갖는 아미노산 서열을 확인하기 위해 수행될 수 있다 (점수 = 50, 단어 길이 = 3).

갭이 있는 BLAST (Altschul et al., (1997))를 사용하여 비교 목적을 위한 갭이 있는 정렬을 수득할 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast를 사용하여 분자 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행할 수 있다 (Altschul et al., (1997)). BLAST, 갭이 있는 BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.

서열 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 비-제한적 예는 클러스탈W(ClustalW) 알고리즘이다 (Thompson et al., (1994)). 클러스탈W는 서열을 비교하고, 아미노산 또는 DNA 서열의 전체를 정렬하고, 그에 따라 전체 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 서열 보존에 관한 데이터를 제공할 수 있다. 클러스탈W 알고리즘은 여러개의 상업적으로 입수가능한 DNA/아미노산 분석 소프트웨어 패키지, 예컨대 벡터 NTI 프로그램 스위트(Vector NTI Program Suite) (인비트로젠, 인크.(Invitrogen, Inc.), 캘리포니아주 칼스배드)의 ALIGNX 모듈에서 사용된다. ALIGNX를 사용하여 아미노산 서열들을 정렬할 때, 갭 개방 페널티 10, 갭 연장 페널티 0.1 및 blosum63mt2 비교 매트릭스를 포함하는 디폴트 설정치를 편리하게 사용하여, 2개의 서열 사이의 퍼센트 아미노산 유사성 (컨센서스) 또는 동일성을 평가할 수 있다. ALIGNX를 사용하여 DNA 서열을 정렬할 때, 갭 개방 페널티 15, 갭 연장 페널티 6.6 및 swgapdnamt 비교 매트릭스를 포함하는 디폴트 설정치를 편리하게 사용하여, 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성을 평가할 수 있다.

서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 비-제한적 예는 문헌 [Myers and Miller (1988)]의 것이다. 이러한 알고리즘은 wEMBOSS 서열 정렬 소프트웨어 패키지 (http://emboss.sourceforge.net/에서 입수가능함)의 일부인 wSTRETCHER 프로그램에 포함된다. wSTRETCHER은 선형 공간을 사용하는 전형적인 동적 프로그래밍 알고리즘의 변형을 사용하여 2개의 서열의 최적 전체 정렬을 계산한다. 정렬의 계산에 사용되는 치환 매트릭스, 갭 삽입 페널티 및 갭 연장 페널티는 명시될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 비교를 위해 wSTRETCHER 프로그램을 사용할 때, 갭 개방 페널티 16 및 갭 연장 페널티 4가 점수화 매트릭스 파일 EDNAFULL과 사용될 수 있다. 아미노산 서열의 비교에 사용될 때, 갭 개방 페널티 12 및 갭 연장 페널티 2가 EBLOSUM62 점수화 매트릭스 파일과 사용될 수 있다.

서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 추가의 비-제한적 예는 문헌 [Needleman and Wunsch (1970)]의 것이며, 이는 서열 정렬 소프트웨어 패키지 갭(GAP) 버전 10 및 wNEEDLE (http://emboss.sourceforge.net/)에 포함된다. 갭 버전 10은 하기 파라미터를 사용하여 서열 동일성 또는 유사성을 결정하는데 사용될 수 있다: 뉴클레오티드 서열의 경우, ％ 동일성 및 ％ 유사성은 갭 가중치 50 및 길이 가중치 3, 및 nwsgapdna. cmp 점수화 매트릭스를 사용하여 확인된다. 아미노산 서열 비교의 경우, ％ 동일성 및 ％ 유사성은 갭 가중치 8 및 길이 가중치 2, 및 BLOSUM62 점수화 프로그램을 사용하여 결정된다.

wNEEDLE는 2개의 입력 서열을 판독하고, 그의 전체 길이를 따라 최적 정렬 (갭을 포함함)을 찾아내고, 그의 최적 전체 서열 정렬을 파일에 기록한다. 알고리즘은 모든 가능한 정렬을 탐구하고, 모든 가능한 잔기 또는 뉴클레오티드 매치에 대한 값을 함유하는 점수화 매트릭스를 사용하여 최상의 것을 찾아낸다. wNEEDLE는 최대의 가능한 점수를 갖는 정렬을 찾아내며, 여기서 정렬의 점수는 점수화 매트릭스로부터 취해진 매치의 합에서 정렬된 서열 내의 갭의 개방 및 연장에서 생기는 페널티를 차감한 것과 동일하다. 치환 매트릭스 및 갭 개방 및 연장 페널티는 사용자-명시된다. 아미노산 서열이 비교될 때, 디폴트 갭 개방 페널티 10, 갭 연장 페널티 0.5, 및 EBLOSUM62 비교 매트릭스가 사용된다. DNA 서열을 wNEEDLE를 사용하여 비교할 때, 갭 개방 페널티 10, 갭 연장 페널티 0.5, 및 EDNAFULL 비교 매트릭스가 사용된다.

등가의 프로그램이 또한 사용될 수 있다. "등가의 프로그램"은, ALIGNX, wNEEDLE, 또는 wSTRETCHER에 의해 생성된 상응하는 정렬과 비교했을 때 임의의 2개의 해당 서열에 대해 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 매치 및 동일한 퍼센트 서열 동일성을 갖는 정렬을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램으로 의도된다. % 동일성은 보고된 정렬된 영역 (길이에서 임의의 갭을 포함함) 상에서의 2개의 서열 사이의 동일한 매치의 백분율이고, % 유사성은 보고된 정렬된 영역 (길이에서 임의의 갭을 포함함) 상에서의 2개의 서열 사이의 매치의 백분율이다.

정렬은 또한 검사에 의해 수동으로 수행될 수 있다.

재조합 숙주 본 발명의 곤충 독소-코딩 유전자가 매우 다양한 미생물 또는 식물 숙주 내로 도입될 수 있다. 곤충 독소 유전자의 발현은 직접적으로 또는 간접적으로 살충 단백질의 세포내 생산 및 유지를 초래한다. 적합한 미생물 숙주, 예를 들어 슈도모나스(Pseudomonas)를 사용하여, 미생물이 그가 증식하고 섭취될 해충 환경에 적용될 수 있다. 결과는 해충의 방제이다. 대안적으로, 곤충 독소 유전자의 숙주인 미생물이 독소의 활성을 연장하고 세포를 안정화시키는 조건 하에 처리될 수 있다. 이어서, 독성 활성을 보유하는 처리된 세포는 표적 해충의 환경에 적용될 수 있다. (대상 Cry 독소 유전자 중 적어도 하나를 포함하는) 본 발명의 식물로부터의 비-재생가능한 / 비-전능 식물 세포가 본 발명 내에 포함된다.

B.t. 독소 유전자가 적합한 벡터를 통해 미생물 숙주 내로 도입되고, 상기 숙주가 살아있는 상태로 환경에 적용되는 경우에, 특정 숙주 미생물이 사용되는 것이 필수적이다. 하나 이상의 관심 작물의 "식물권" (엽면, 엽권, 근권, 및/또는 근면)을 점유하는 것으로 공지된 미생물 숙주가 선택된다. 이러한 미생물은 특정한 환경 (작물 및 다른 곤충 서식지)에서 야생형 토착 미생물과 성공적으로 경쟁할 수 있도록 선택되고, 폴리펩티드 살충제를 발현하는 유전자의 안정한 유지 및 발현을 제공하고, 바람직하게는 환경 분해 및 불활성화로부터의 살충제의 개선된 보호를 제공한다.

수많은 미생물이 매우 다양한 중요한 작물의 엽면 (식물 잎의 표면) 및/또는 근권 (식물 뿌리 주위 토양)에 산다는 것이 알려져 있다. 이러한 미생물은 박테리아, 조류, 및 진균을 포함한다. 특히 관심있는 것은 미생물, 예컨대 박테리아, 예를 들어 슈도모나스, 에르위니아(Erwinia), 세라티아(Serratia), 클레브시엘라(Klebsiella), 크산토모나스(Xanthomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces), 리조비움(Rhizobium), 시노리조비움(Sinorhizobium), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 메틸로필리우스(Methylophilius), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아세토박터(Acetobacter), 락토바실루스(Lactobacillus), 아르트로박터(Arthrobacter), 아조토박터(Azotobacter), 류코노스톡(Leuconostoc), 및 알칼리게네스(Alcaligenes) 속; 진균, 특히 효모, 예를 들어 사카로미세스(Saccharomyces), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 스포로볼로미세스(Sporobolomyces), 로도토룰라(Rhodotorula), 및 아우레오바시디움(Aureobasidium) 속이다. 특히 관심있는 것은 식물권 박테리아 종, 예컨대 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 아세토박터 크실리눔(Acetobacter xylinum), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 로도슈도모나스 스페로이데스(Rhodopseudomonas spheroides), 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 시노리조비움 멜리로티(Sinorhizobium meliloti) (이전에 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti)), 알칼리게네스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus), 및 아조토박터 비네란디이(Azotobacter vinelandii); 식물권 효모 종, 예컨대 로도토룰라 루브라(Rhodotorula rubra), 알. 글루티니스(R. glutinis), 알. 마리나(R. marina), 알. 아우란티아카(R. aurantiaca), 크립토코쿠스 알비두스(Cryptococcus albidus), 씨. 디풀루엔스(C. diffluens), 씨. 로우렌티(C. laurentii), 사카로미세스 로세이(Saccharomyces rosei), 에스. 프레토리엔시스 (S. pretoriensis), 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae), 스포로볼로미세스 로세우스(Sporobolomyces roseus), 에스. 오도루스(S. odorus), 클루이베로미세스 베로나에(Kluyveromyces veronae), 및 아우레오바시디움 폴루란스(Aureobasidium pollulans)이다. 특히 관심있는 것은 유색 미생물이다.

곤충 해충을 방제하는 방법. 곤충이 트랜스제닉 식물 발현, 제제화된 단백질 조성물(들), 분무가능한 단백질 조성물(들), 미끼 매트릭스 또는 다른 전달 시스템을 통해 전달되는 유효량의 독소와 접촉하게 되는 경우, 결과는 전형적으로 곤충의 사멸이거나, 독소가 곤충에 대해 이용가능하게 되는 공급원을 곤충이 섭식하지 않는 것이다.

대상 단백질 독소는 다양한 방식으로 표적 곤충과 접촉하도록 "적용"되거나 제공될 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 식물 (여기서, 단백질은 식물에 의해 생산되고 식물 내에 존재함)이 사용될 수 있고, 이는 관련 기술분야에 널리-공지되어 있다. 독소 유전자의 발현은 또한 뿌리, 잎 등과 같은 식물의 특정 조직에서 선택적으로 달성될 수 있다. 이는, 예를 들어 조직-특이적 프로모터의 사용을 통해 달성될 수 있다. 분무식 적용은 또 다른 예이고, 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 대상 단백질은 목적하는 최종 용도를 위해 적절하게 제제화된 다음, 침입이 발견되기 전에, 표적 곤충이 발견된 후에, 그 전 및 그 후 둘 다에 등 - 보호할 식물 상에 및/또는 식물 주위에 / 식물 부근에 분무 (또는 다르게는 적용)될 수 있다. 예를 들어, 미끼 과립이 또한 사용될 수 있고, 이는 관련 기술분야에 공지되어 있다.

트랜스제닉 식물. 대상 단백질은 곤충 해충에 의한 손상으로부터 임의의 유형의 식물을 실제로 보호하는데 사용될 수 있다. 이러한 식물의 예는 몇 가지 예로 메이즈, 해바라기, 대두, 목화, 카놀라, 벼, 소르굼, 밀, 보리, 채소, 관상식물, 페퍼 (고추 포함), 사탕무, 과일, 및 잔디를 포함한다. 식물을 형질전환시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예시적인 형질전환 방법이 실시예에 기재되어 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태는 대상 살곤충 단백질 또는 그의 변이체를 코딩하는 유전자로의 식물의 형질전환이다. 형질전환된 식물은 형질전환된 식물의 세포에서의 방제량의 대상 살곤충 단백질 또는 그의 변이체의 존재에 의해 곤충 표적 해충에 의한 공격에 대해 저항성이 있다. B.t. 살곤충 독소의 살곤충 특성을 코딩하는 유전 물질을 특정한 곤충 해충에 의해 섭취된 식물의 게놈에 도입함으로써, 성충 또는 유충은 먹이 식물을 소모한 후 사멸할 것이다. 단자엽 및 쌍자엽 분류의 다수 구성원이 형질전환되었다. 트랜스제닉 농경학적 작물뿐만 아니라 과일 및 야채가 상업적 관심 대상이다. 이러한 작물은 메이즈, 벼, 대두, 카놀라, 해바라기, 알팔파, 소르굼, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 외래 유전 물질을 식물 세포 내로 도입하고, 도입된 유전자를 안정하게 유지하고 발현하는 식물을 수득하는 것에 대한 여러 가지 기술이 존재한다. 이러한 기술은 마이크로입자 상에 코팅된 유전 물질을 직접적으로 세포 내로 가속화하는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 4945050 및 미국 특허 번호 5141131). 식물은 아그로박테리움(Agrobacterium) 기술을 사용하여 형질전환될 수 있다 (미국 특허 번호 5177010, 미국 특허 번호 5104310, 유럽 특허 출원 번호 0131624B1, 유럽 특허 출원 번호 120516, 유럽 특허 출원 번호 159418B1, 유럽 특허 출원 번호 176112, 미국 특허 번호 5149645, 미국 특허 번호 5469976, 미국 특허 번호 5464763, 미국 특허 번호 4940838, 미국 특허 번호 4693976, 유럽 특허 출원 번호 116718, 유럽 특허 출원 번호 290799, 유럽 특허 출원 번호 320500, 유럽 특허 출원 번호 604662, 유럽 특허 출원 번호 627752, 유럽 특허 출원 번호 0267159, 유럽 특허 출원 번호 0292435, 미국 특허 번호 5231019, 미국 특허 번호 5463174, 미국 특허 번호 4762785, 미국 특허 번호 5004863, 및 미국 특허 번호 5159135 참조). 다른 형질전환 기술은 휘스커스(WHISKERS)^TM 기술을 포함한다 (미국 특허 번호 5302523 및 미국 특허 번호 5464765 참조). 전기천공 기술은 또한 식물을 형질전환시키는데 사용되었다 (WO 87/06614, 미국 특허 번호 5472869, 미국 특허 번호 5384253, WO 9209696, 및 WO 9321335 참조). 이러한 형질전환 특허 및 공개는 전부 본원에 참조로 포함된다. 식물 형질전환을 위한 수많은 기술뿐만 아니라, 외래 유전자와 접촉되는 조직의 유형이 또한 다양할 수 있다. 이러한 조직은 배아발생 조직, 제I형 및 제II형 유합조직, 배축, 분열 조직 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 거의 모든 식물 조직은 통상의 기술자의 기술 내에서 적절한 기술을 사용하여 탈분화 동안에 형질전환될 수 있다.

Cry1Da 살곤충 독소를 코딩하는 유전자는 상기 개시된 바와 같이 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 기술을 사용하여 식물 세포 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 형질전환된 미생물 세포 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 기능하는 복제 시스템의 선택을 가능하게 하는 마커를 포함하는 수많은 클로닝 벡터가 고등 식물 내로의 삽입을 위한 외래 유전자의 제조 및 변형에 이용가능하다. 이러한 조작은, 예를 들어 의도된 용도에 요구되는 바와 같이 돌연변이의 삽입, 말단절단, 부가, 또는 치환을 포함할 수 있다. 벡터는 예를 들어, pBR322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, pACYC184 등을 포함한다. 따라서, Cry 단백질 또는 변이체를 코딩하는 서열은 적합한 제한 부위에서 벡터 내로 삽입될 수 있다. 생성된 플라스미드는 이. 콜라이(E. coli)의 형질전환에 사용되며, 그의 세포는 적합한 영양 배지에서 배양된 다음, 수거되고, 작업가능한 양의 플라스미드가 회수되도록 용해된다. 서열 분석, 제한 단편 분석, 전기영동, 및 다른 생화학적-분자 생물학적 방법이 일반적으로 분석 방법으로서 수행된다. 각각의 조작 후에, 사용된 DNA 서열은 절단되어, 다음 DNA 서열에 연결될 수 있다. 각각의 조작된 DNA 서열은 동일한 또는 다른 플라스미드에서 클로닝될 수 있다.

식물 세포의 형질전환을 위한 T-DNA-함유 벡터의 용도가 집중적으로 연구되고, 유럽 특허 출원 번호 120516; 문헌 [Lee and Gelvin (2008), Fraley et al., (1986), 및 An et al., (1985)]에 충분히 기재되었고, 이는 관련 분야에 널리 확립되어 있다.

일단 삽입된 DNA가 식물 게놈에 통합되고 나면, 후속 세대 전반에 걸쳐 비교적 안정하다. 식물 세포를 형질전환시키는데 사용되는 벡터는 보통 형질전환된 식물 세포에 제초제 또는 항생제, 예컨대 특히 비알라포스, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 또는 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 코딩하는 선택 마커 유전자를 함유한다. 개별적으로 사용되는 선택 마커 유전자는 따라서 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 해야 하고, 삽입된 DNA를 함유하지 않은 세포의 성장은 선택적 화합물에 의해 억제된다.

수많은 기술이 DNA를 숙주 식물 세포 내로 삽입하는데 이용가능하다. 이러한 기술은 형질전환 작용제로서 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)에 의해 전달되는 T-DNA로의 형질전환을 포함한다. 추가적으로, 전달될 DNA를 함유하는 리포솜과의 식물 원형질체의 융합, DNA의 직접 주입, 바이오리스틱 형질전환 (마이크로입자 충격), 또는 전기천공뿐만 아니라 다른 가능한 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 식물은 유전자로 형질전환될 것이며, 여기서 단백질 코딩 영역의 코돈 사용빈도는 식물에 대해 최적화되어 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5380831을 참조한다. 또한, 유리하게는, 말단절단된 독소를 코딩하는 식물이 사용될 것이다. 말단절단된 독소는 전형적으로 전장 독소의 약 55% 내지 약 80%를 코딩할 것이다. 식물에서 사용하기 위한 합성 B.t. 유전자를 생성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (Stewart 2007).

형질전환 기술에 관계없이, 유전자는 바람직하게는 벡터 내에 식물 프로모터를 포함시킴으로써 식물 세포에서 B.t. 살곤충 독소 유전자 및 변이체를 발현하도록 적합화된 유전자 전달 벡터 내로 혼입된다. 식물 프로모터뿐만 아니라, 다양한 공급원으로부터의 프로모터가 식물 세포에서 효율적으로 사용되어, 외래 유전자를 발현할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 기원의 프로모터, 예컨대 옥토핀 신타제 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터, 만노핀 신타제 프로모터; 바이러스 기원의 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 및 19S 프로모터 등이 사용될 수 있다. 식물 프로모터는 리불로스-1,6-비스포스페이트 (RUBP) 카르복실라제 소형 서브유닛 (ssu), 베타-콘글리시닌 프로모터, 파세올린 프로모터, ADH (알콜 데히드로게나제) 프로모터, 열-쇼크 프로모터, ADF (액틴 탈중합 인자) 프로모터, 및 조직 특이적 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 프로모터는 또한 전사 효율을 개선할 수 있는 특정 인핸서 서열 요소를 함유할 수 있다. 전형적인 인핸서는 ADH1-인트론 1 및 ADH1-인트론 6을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구성적 프로모터가 사용될 수 있다. 구성적 프로모터는 거의 모든 세포 유형에서 거의 항상 연속적인 유전자 발현을 유도한다 (예를 들어, 액틴, 유비퀴딘, CaMV 35S). 조직 특이적 프로모터는 특정 세포 또는 조직 유형, 예컨대 잎 또는 종자에서의 유전자 발현 (예를 들어, 제인, 올레오신, 나핀, ACP (아실 운반 단백질))을 담당하며, 이러한 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 식물 발생의 특정 단계 동안에 활성인 프로모터뿐만 아니라, 특정한 식물 조직 및 기관에서 활성인 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 뿌리 특이적, 화분-특이적, 배아 특이적, 옥수수 수염 특이적, 목화 섬유 특이적, 종자 내배유 특이적, 체관부 특이적 프로모터 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

특정 환경하에서는 유도성 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 유도성 프로모터는 특정한 신호, 예컨대: 물리적 자극 (예를 들어, 열 쇼크 유전자); 광 (예를 들어, RUBP 카르복실라제); 호르몬 (예를 들어, 글루코코르티코이드); 항생제 (예를 들어, 테트라시클린); 대사물; 및 스트레스 (예를 들어, 가뭄)에 반응하는 유전자의 발현을 담당한다. 식물에서 기능하는 다른 바람직한 전사 및 번역 요소, 예컨대 5' 비번역 리더 서열, RNA 전사 종결 서열 및 폴리-아데닐레이트 부가 신호 서열이 사용될 수 있다. 수많은 식물-특이적 유전자 전달 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다.

곤충 저항성 (IR) 형질을 함유하는 트랜스제닉 작물은 북미 전역에 걸쳐 옥수수 및 목화 식물에서 보편적이고, 이 형질의 사용빈도는 전세계적으로 확장되고 있다. IR 및 제초제 내성 (HT) 형질이 조합된 상업용 트랜스제닉 작물은 다수의 종자 회사에 의하여 개발되어 왔다. 이는 B.t. 살곤충 단백질에 의해 부여되는 IR 형질과 HT 형질, 예컨대 아세토락테이트 신타제 (ALS) 억제제, 예컨대 술포닐우레아, 이미다졸리논, 트리아졸로피리미딘, 술폰아닐리드 등, 글루타민 신테타제 (GS) 억제제, 예컨대 비알라포스, 글루포시네이트 등, 4-히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD) 억제제, 예컨대 메소트리온, 이속사플루톨 등, 5-엔올피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 억제제, 예컨대 글리포세이트 등, 및 아세틸-조효소 A 카르복실라제 (ACCase) 억제제, 예컨대 할록시포프, 퀴잘로포프, 디클로포프 등에 대한 내성과의 조합을 포함한다. 트랜스제닉적으로 제공된 단백질이 제초제 화학물질 부류, 예컨대 페녹시산 제초제 및 피리딜옥시아세테이트 옥신 제초제 (WO 2007/053482 A2 참조), 또는 페녹시산 제초제 및 아릴옥시페녹시프로피오네이트 제초제 (WO 2005107437 A2, A3 참조)에 대한 식물 내성을 제공하는 다른 예가 공지되어 있다. IR 형질을 통해 다중 해충 문제를 제어하는 능력은 가치있는 상업용 제품 개념이고, 이 제품 개념의 편의성은 곤충 방제 형질 및 잡초 방제 형질이 동일한 식물에 조합되는 경우 증진된다. 추가로, 본 발명의 것과 같은 B.t. 살곤충 단백질에 의해 부여되는 IR 형질과 하나 이상의 추가의 HT 형질, 예컨대 상기 언급된 것 + 하나 이상의 추가의 인풋 형질 (예를 들어, B.t.-유래 또는 다른 살곤충 단백질에 의해 부여되는 다른 곤충 저항성, RNAi 등과 같은 메카니즘에 의해 부여되는 곤충 저항성, 질병 저항성, 스트레스 내성, 개선된 질소 사용 등), 또는 아웃풋 형질 (예를 들어, 높은 오일 함량, 건강한 오일 조성, 영양 개선 등)의 단일 식물 조합을 통해 개선된 가치가 수득될 수 있다. 이러한 조합은 통상적인 육종 (육종 스택)을 통해 또는 다중 유전자 (분자 스택)의 동시 도입을 수반하는 신규 형질전환 사례로서 함께 수득될 수 있다. 이익은 생산자 및/또는 소비자에게 2차 이익을 제공하는 작물 식물에서의 곤충 해충 관리 능력 및 개선된 잡초 방제를 포함한다. 따라서, 본 발명은 다른 형질과 조합되어 사용되어, 유연하게 및 비용 효과적으로 임의의 수의 농경학적 문제를 제어할 수 있는 개선된 작물 품질의 완전한 농경학적 패키지를 제공할 수 있다.

본원에서 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원, 및 공보는 본 명세서의 명백한 교시와 상반되지 않는 정도로 그 전문이 참조로 포함된다.

구체적으로 나타내거나 시사하지 않는 한, 단수 용어는 본원에 사용된 "적어도 하나"를 의미한다.

다음은 본 발명의 실시를 위한 절차을 설명하는 실시예이다. 이러한 실시예는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 백분율는 중량 기준이고, 모든 용매 혼합물 비율은 부피 기준이다. 모든 온도는 섭씨 온도이다.

실시예 1

DIG-911 및 DIG-180을 코딩하는 플라스미드의 구축 및 박테리아 숙주에서의 발현

DIG-911 단백질 (Cry1Da2/Cry1Ab 키메라 살곤충 독소; 서열식별번호: 2)은 Cry1Da (진뱅크 수탁 번호 176415.1 및 미국 특허 번호 5,691,308에 개시된 바와 같은, 아미노산 1 내지 594)의 코어 독소 절편 및 본질적으로 진뱅크 수탁 번호 AFK79795.1에 개시된 바와 같은 Cry1Ab (DIG-911 아미노산 595 내지 1139)로부터 유래된 전독소 절편으로 이루어진다. 다른 Cry 또는 Vip 살곤충 독소와 조합된 Cry1Da 코어 독소 절편의 용도는 미국 특허 출원 공개 번호 20130007923, 20120331590, 20120331589, 및 20120317681에 이전에 개시되었지만, 옥수수 이삭벌레 (CEW; 헬리코베르파 제아 (바디))를 방제하기 위한 Cry1Da 살곤충 단백질의 용도는 고려되지 않는다.

달리 나타내지 않는 한, 이 실시예 및 후속 실시예에 기재된 분자 생물학적 및 생화학적 조작은, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., eds. (1989 및 최신판, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.), Ausubel et al., eds. (1995 및 최신판, Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) 및 Harlow & Lane, eds. (1988, 및 최신판, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY)]에 개시된 바와 같은 표준 방법론에 의해 수행하였다. 표준 클로닝 방법을 DIG-911 및 DIG-180 (즉, Cry1Fa2; 서열식별번호: 4) 단백질을 생산하도록 조작된 슈도모나스 플루오레센스 (Pf) 발현 플라스미드의 구축에 사용하였다. 플라스미드 제조를 공급업체의 낮은-카피 플라스미드 단리 지침서에 따라 뉴클레오스핀(NUCLEOSPIN) 플라스미드 키트 (마슈레-나겔 인크.(MACHEREY-NAGEL Inc.), 펜실베니아주 베들레헴)를 사용하여 수행하였다.

기본 클로닝 전략은, 각각 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 3에 의해 제공되는 바와 같은 DIG-911 또는 DIG-180 코딩 서열 (CDS)을 갖는 DNA 단편을 SpeI 또는 XbaI, 및 XhoI 또는 SalI 제한 부위에서 pDOW1169로 서브클로닝하는 것을 수반하였으며, 이에 의해 DIG-911 및 DIG-180 CDS는 플라스미드 pKK223-3 (피엘 파마시아(PL PHARMACIA), 위스콘신주 밀워키)으로부터의 Ptac 프로모터 및 rrnBT1T2 종결인자의 발현 제어 하에 위치하였다. pDOW1169는 RSF1010 복제 기점 및 pyrF 유전자를 갖는 중간 카피 플라스미드이다 (미국 특허 번호 7,618,799). 단백질 코딩 영역 서열을 포함하는 DNA 단편을 pDOW1169 서열 내에 존재하는 리보솜 결합 부위의 하류의 제한 부위에서 pDOW1169 DNA로 클로닝시킬 수 있거나, 대안적으로, 개별 리보솜 결합 부위를 단백질 코딩 영역의 상류의 코딩 영역 단편 상에 존재하는 서열로서 도입할 수 있다. 발현 플라스미드 pDOW2848의 DNA (DIG-911)를 전기천공에 의해 DC454 세포 (돌연변이 ΔpyrF 및 lsc::lacIQI를 갖는 근접 야생형 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주)에 형질전환시켰고, pDAB1817 DNA (DIG-180)를 MB214 세포에 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 SOC-Soy 가수분해물 매질에서 회수되도록 한 다음, 선택적 배지 (우라실이 결여된 M9 글루코스 한천 또는 적절한 농도로 테트라시클린을 함유하는 LB 배지 상에; 상기 문헌 [Sambrook et al.]) 상에 플레이팅하였다. 피. 플루오레센스에 대한 미생물학적 조작의 세부사항은 본원에 참조로 포함된, 문헌 [Squires et al. (2004)], 미국 특허 번호 7,985,564, 미국 특허 번호 7,681,799, 및 미국 특허 출원 번호 20080058262에서 입수가능하다. 재조합 콜로니를 미니프렙(miniprep) 플라스미드 DNA의 제한 소화에 의해 확인하였다

진탕 플라스크에서의 성장 및 발현 분석. 특징화 및 곤충 생물검정을 위한 DIG-911 및 DIG-180 단백질의 생산을 진탕-플라스크-성장된 피. 플루오레센스 균주 DPf150 (플라스미드 pDOW2848 보유) 또는 균주 Dpf129 (플라스미드 pDAB1817 보유)에 의해 달성하였다. 1% 글루코스 및 미량 원소로 보충된 M9 배지에서 성장시킨 시드 배양물을 5% 글리세롤을 갖는 50 mL의 규정된 최소 배지 (테크노바(TEKNOVA) 카탈로그 # 3D7426, 캘리포니아주 홀리스터)에 접종하는데 사용하였다. Ptac 프로모터를 통한 DIG-911 또는 DIG-180 유전자의 발현을, 진탕과 함께 30℃에서 24시간의 초기 인큐베이션 후 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)의 첨가에 의해 유도하였다. 배양물을 유도의 시간에 및 유도후 다양한 시간에 샘플링하였다. 세포 밀도를 600 nm에서의 광학 밀도 (OD₆₀₀)에 의해 측정하였다. 예를 들어, 문헌 [Huang et al. (2007, Prot]에 기재된 바와 같이, 슈도모나스 플루오레센스의 성장에 적합한 다른 배양 배지를 또한 사용할 수 있다.

진탕 플라스크 샘플의 세포 분획화 및 SDS-PAGE 분석. 각 샘플링 시간에 2 mL 분취물을 5분 동안 14000 x g에서 원심분리하였고, 세포 펠릿을 -80℃에 저장하였다. 단백질 추출을 위해, 펠릿을 해동시키고, 0.5 mL의 포스페이트 완충제 pH7.2 중에 현탁시켰다. 세포를 20 유닛의 일정한 유출을 갖는 1/8 인치 직경 마이크로 팁을 사용하는 브랜슨 250 소니파이어(BRANSON 250 SONIFIER) (브랜슨 울트라소닉스(BRANSON ULTRASONICS), 코네티컷주 댄버리)를 사용하여 초음파처리에 의해 용해시켰다. 2회의 45초 버스트를 사용하였고, 버스트 사이에 샘플을 얼음 상에서 수분 냉각시켰다. 용해물을 14,000 rpm에서 5분 동안 미세원심분리기에서 원심분리하여 분획화한 후, 상청액 (가용성 분획)을 제거하였고, 펠릿 (불용성 분획)을 0.5 ml의 포스페이트 완충제 중에 현탁시켰다.

샘플을 β-메르캅토에탄올을 함유하는 4X 램리(Laemmli) 샘플 완충제와 1:3으로 혼합하고 (Sambrook et al., 상기 문헌), 5분 동안 비등시킨 후에, 노벡스(NOVEX)® 4-20% 트리스 글리신 SDS 폴리아크릴아미드 겔 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드) 상에 로딩하였다. 전기영동을 트리스 글리신 노벡스® 전개 완충제 (인비트로젠) 중에서 수행하였다. 겔을 제조업체 (바이오-라드 인크.(BIO-RAD Inc.), 캘리포니아주 허큘레스) 프로토콜에 따라 바이오-사페(BIO-SAFE) 쿠마시 염색으로 염색하였다.

봉입체 제조. Cry 단백질 봉입체 (IB) 제조는, SDS-PAGE 및 MALDI-MS (매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광측정법)에 의해 입증되는 바와 같이 불용성 B.t. 살곤충 단백질을 생산하는 피. 플루오레센스 발효물로부터의 세포 상에서 수행하였다. 피. 플루오레센스 발효물 펠릿을 37℃ 수조에서 해동시켰다. 세포를 용해 완충제 (50 mM 트리스, pH 7.5, 200 mM NaCl, 20 mM EDTA 이나트륨 염 (에틸렌디아민테트라아세트산), 1％ 트리톤 X-100, 및 5 mM 디티오트레이톨 (DTT)) 중에 25％ w/v로 재현탁시키고; 5 mL/L의 박테리아 프로테아제 억제제 칵테일 (P8465 시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH), 미주리주 세인트 루이스)을 사용 직전에 첨가하였다. 완전한 현탁액을 최저 설정에서 핸드-헬드 균질화기를 사용하여 수득하였다 (티슈 티어러(TISSUE TEAROR)^TM, 바이오스펙 프로덕츠, 인크.(BIOSPEC PRODUCTS, Inc.), 오클라호마주 바틀스빌). 리소자임 (25 mg의 시그마 L7651, 닭 난백 유래)을 금속 스패튤라를 사용하여 혼합함으로써 세포 현탁액에 첨가하고, 현탁액을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 현탁액을 얼음 상에서 15분 동안 냉각시킨 다음, 브랜슨 250 소니파이어 (50% 듀티 사이클, 30% 출력에서 2회의 1-분 세션)를 사용하여 초음파처리하였다. 세포 용해를 현미경검사에 의해 확인하였다. 필요한 경우, 추가의 25 ㎎의 리소자임을 첨가하고, 인큐베이션 및 초음파처리를 반복하였다. 세포 용해가 현미경검사를 통해 확인되면, 용해물을 11,500 x g에서 25분 동안 원심분리하여 (4℃), IB 펠릿을 형성시키고, 상청액을 폐기하였다. IB 펠릿을 100 mL 용해 완충제로 재현탁시키고, 핸드-헬드 혼합기로 균질화하고, 상기와 같이 원심분리하였다. 상청액이 무색이 되고, IB 펠릿이 단단해지고 색상이 회백색이 될 때까지 IB 펠릿을 재현탁 (50 mL 용해 완충제 중), 균질화, 초음파처리, 및 원심분리에 의해 반복적으로 세척하였다. 최종 세척의 경우, IB 펠릿을 2 mM EDTA를 함유하는 멸균-여과된 (0.22 μm) 증류수 중에 재현탁시키고, 원심분리하였다. 최종 펠릿을 멸균 상태로 재현탁시켰다.

봉입체의 가용화. Pf 단리물 DPf150 또는 Dpf129로부터의 봉입체 현탁액 (약 30 mg/mL의 DIG-911 또는 DIG-180 단백질 함유) 6 mL를 미세원심분리기의 최고 세팅 (대략 14,000 x g)에서 원심분리하여, 봉입체를 펠릿화시켰다. 저장 완충제 상청액을 제거하고, 50 mL 원추형 튜브 내에서 25 mL의 100 mM 탄산나트륨 완충제, pH 11로 대체하였다. 봉입체를 피펫을 사용하여 재현탁시키고, 볼텍싱하여 완전히 혼합하였다. 튜브를 온화한 교반 플랫폼 상에 4℃에서 밤새 배치하여, 표적 단백질을 추출하였다. 추출물을 4℃에서 30분 동안 30,000 x g에서 원심분리하고, 생성되는 상청액을 아미콘 울트라-15(AMICON ULTRA-15) 재생 셀룰로스 원심분리 필터 장치 (30,000 분자량 컷오프; 밀리포어(MILLIPORE))를 사용하여 5배 농축하였다. 이어서, 샘플 완충제를 일회용 PD-10 칼럼 (지이 헬스케어(GE HEALTHCARE), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 10 mM CAPS (3-(시클로헥사미노)1-프로판술폰산) pH10으로 교체하였다.

IB 제제의 단백질의 SDS-PAGE 분석 및 정량화를 IB 펠릿의 1 mL 분취물을 해동시키고, 멸균-여과된 증류수로 1:20 희석함으로써 수행하였다. 이어서, 희석된 샘플을 4X 환원 샘플 완충제 (250 mM 트리스, pH6.8, 40% 글리세롤 (v/v), 0.4% 브로모페놀 블루(Bromophenol Blue) (w/v), 8% SDS (w/v) 및 8% β-메르캅토-에탄올 (v/v))을 사용하여 비등시키고, 노벡스® 4-20% 트리스-글리신, 12+2 웰 겔 (인비트로젠) 상에 로딩하고, 이를 1X 트리스/글리신/SDS 완충제 (바이오-라드)로 전개시켰다. 겔을 200 볼트에서 대략 60분 동안 전개시킨 다음, 쿠마시 블루(Coomassie Blue) (45% 메탄올, 10% 아세트산 중 50% G-250/50% R-250)로 염색하고, 증류수 중 7% 아세트산, 5% 메탄올로 탈염색시켰다. 표적 밴드의 정량화를 밴드에 대한 밀도측정 값을 동일한 겔 상에서 전개시킨 소 혈청 알부민 (BSA) 샘플에 대해 비교함으로써 수행하여, 표준 곡선을 생성하였다. 농축된 추출물을 전기영동을 위해 환원제로서 5 mM 디티오트레이톨을 함유하는 누페이지(NuPAGE)® LDS 샘플 완충제 (인비트로젠)에 1:50 희석함으로써 제조하고, 95℃에서 4분 동안 가열하였다. 샘플을 (표준 곡선 생성을 위해) 0.2 내지 2 μg/레인 범위의 5개의 BSA 표준물과 함께 4-12％ 누페이지® 겔의 이중 레인에 로딩하였다. 전압을 트래킹 염료가 겔의 바닥에 도달할 때까지 MOPS SDS 전개 완충제 (인비트로젠)를 사용하여 200V에서 적용하였다. 겔을 45% 메탄올, 10% 아세트산 중 0.2% 쿠마시 블루 G-250으로 염색하고, 백그라운드가 투명해질 때까지 처음에는 간단하게 45% 메탄올, 10% 아세트산으로, 이어서 길게 7% 아세트산, 5% 메탄올로 탈염색시켰다. 탈염색 후, 겔을 바이오-라드 플루오르-S 멀티이미저(FLUOR-S MULTIIMAGER)로 스캐닝하였다. 기기의 퀀터티 원(QUANTITY ONE) v.4.5.2 소프트웨어를 사용하여, 염색된 단백질 밴드의 백그라운드-감산 부피를 수득하고, 스톡 용액 중 DIG-911 또는 DIG-180 단백질의 농도를 계산하는데 사용되었던 BSA 표준 곡선을 생성하였다.

실시예 2

CEW 유충에 대한 슈도모나스 플루오레센스에서 생산되는 DIG-911 및 DIG-180 살곤충 독소의 활성

샘플 제조 및 생물검정. 10 mM CAPS pH10 중 봉입체 제제를 3,000, 1,000, 333.3, 111.1, 37.0, 12.3 또는 4.1 ng/cm²의 표적 Cry1Da 단백질 용량을 전달하기 위해 동일한 완충제 중에 희석하였다. 모든 생물검정은 10 mM CAPS pH10 완충제 또는 물로 이루어진 대조군 처리를 함유하였으며, 이는 사멸률 또는 성장 억제에 대한 백그라운드 체크로서 역할을 하였다.

생물검정 완충제 중 단백질 농도를 BSA를 사용하여 겔 전기영동에 의해 추정하여, 겔 밀도측정법을 위한 표준 곡선을 생성하였으며, 이는 바이오라드 영상화 시스템 (퀀터티 원 소프트웨어 버전 4.5.2를 사용하는 플루오르-S 멀티이미저)을 사용하여 측정하였다. 겔 매트릭스 중 단백질을 쿠마시 블루-기반 염색으로 염색하고, 판독 전에 탈염색시켰다.

CEW의 유충은 상업적 곤충 연구소 (벤존 리서치 인크.(BENZON RESEARCH INC.), 펜실베니아주 칼라일))에서 유지되는 콜로니로부터 수득된 알로부터 부화하였다. 생물검정은 특히 곤충 생물검정을 위해 설계된 128-웰 플라스틱 트레이 (씨-디 인터내셔널(C-D INTERNATIONAL, 뉴저지주 피트먼))에서 수행하였다. 각각의 웰은 1.5 mL의 다종 인시목 사료 (사우스랜드 프로덕츠(SOUTHLAND PRODUCTS), 아칸소주 레이크 빌리지)를 함유하였다. 단백질 샘플의 40 μL 분취물을 피펫으로 각각의 웰의 1.5 ㎠ 사료 표면 상에 전달하였다 (26.7 μL/㎠). 사료 농도를 웰 내의 표면적의 제곱 센티미터 (㎠) 당 살곤충 독소 단백질의 양 (ng)으로서 계산하였다. 처리된 트레이는 사료 표면 상의 액체가 증발하거나 사료에 흡수될 때까지 흄 후드에서 유지하였다.

24 내지 48시간의 우화 이내에, 개별 유충을 습윤 카멜 헤어 브러시로 피킹하여, 웰 당 유충 1마리로 처리된 사료 상에 두었다. 이어서, 침입된 웰을 투명 플라스틱 접착 시트로 밀봉하고, 기체가 교환되도록 환기시켰다 (씨-디 인터내셔널). 생물검정 트레이를 5일 동안 제어된 환경 조건 (28℃, ~60% 상대 습도, 16:8 (명:암)) 하에 유지하고, 그 후에 각 단백질 샘플에 노출된 곤충의 총수, 살아있는 및 사멸한 곤충의 수, 및 생존 곤충의 중량을 기록하였다. 퍼센트 사멸률 및 퍼센트 성장 억제를 각 처리에 대해 계산하였다. 성장 억제 (GI)는 하기와 같이 계산하였다:

GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]

여기서 TWIT는 처리군에서의 곤충의 총 중량이고,

TNIT는 처리군에서의 곤충의 총수이고;

TWIBC는 백그라운드 체크 (완충제 대조군)에서의 곤충의 총 중량이고,

TNIBC는 백그라운드 체크 (완충제 대조군)에서의 곤충의 총수이다.

사멸률 및 성장 억제 데이터를 공칭 로지스틱 회귀에 의해 분석하였다 (P<0.05). GI₅₀은 GI 값이 50%인 사료 중 살곤충 독소 단백질의 농도인 것으로 결정하였고, LC₅₀ (50% 치사 농도)은 시험 곤충의 50%가 사멸되는 사료 중 살곤충 독소 단백질의 농도로서 기록하였다. 통계 분석 (일원 ANOVA)은 JMP® 프로(Pro) 소프트웨어 (버전 9.0.3; 에스에이에스(SAS), 노스캐롤라이나주 캐리)를 사용하여 수행하였다. 표 1은 사료 생물검정에서 측정된 바와 같은 DIG-911 및 DIG-180 단백질의 활성을 보여준다.

표 1

옥수수 이삭벌레 (CEW)의 신생 유충에 대한 사료 생물검정에서의 DIG-911 및 Cry1Fa 단백질의 활성.

* = 신뢰 구간

표 1의 데이터는 Cry1Da 코어 독소 절편을 포함하는 DIG-911 단백질이 옥수수 이삭벌레 (CEW) 유충에 대해 사멸률 및 성장 억제 활성을 둘 다 나타낸다는 놀라운 발견을 기록한다. 이 결과는 Cry1Da 단백질이 옥수수 이삭벌레에 대해 불활성이라는 다른 사람들에 의해 보고된 결과와 상반된다 (문헌 [Karim et al. (2000) Pesticide Biochemistry and Physiology 67(3):198-216; 및 Frankenhuyzen (2009) Journal of Invertebrate Pathology. 101:1-16] 참조).

실시예 3

식물 형질전환 벡터의 구축

게이트웨이® (인비트로젠) 진입 벡터를 표준 분자 클로닝 방법에 의해 구축하였다. 진입 벡터 pDAB109825는 Cry1Da2 코어 독소 살곤충 단백질 (서열식별번호: 6)을 코딩하는 메이즈-최적화된 코딩 서열 (서열식별번호: 5)을 포함한다. 진입 벡터 pDAB109840은 Cry1Da2 전장 살곤충 단백질을 코딩하는 메이즈-최적화된 코딩 서열을 포함한다. Cry1Da2 코어 독소 코딩 서열의 식물 발현은 연관 인트론 1을 갖는 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터의 카피의 제어 하에 있다 (미국 특허 번호 5,510,474). 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자로부터의 3'UTR을 포함하는 단편 (ZmPer5 3'UTR; 미국 특허 번호 6,699,984)을 사용하여 Cry1Da2 mRNA의 전사를 종결시켰다. 아그로박테리움-매개 메이즈 배아 형질전환을 위한 형질전환/발현 벡터 (pDAB109841)를 표준 클로닝 방법의 사용 및 전형적인 목표 이원 벡터 (pDAB109805) 및 상기 기재된 진입 벡터 pDAB109825를 사용하는 게이트웨이® 재조합 반응을 통해 구축하였다. 이원 목표 벡터 pDAB109805는 사탕수수 간균형 바이러스 프로모터 (SCBV; 본질적으로 미국 특허 번호 6,093,569에 기재된 바와 같음)의 카피의 발현 제어 하에 AAD-1 제초제 내성 단백질 코딩 영역을 포함한다 (미국 특허 번호 7,838,733, 및 문헌 [Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-20245]). 메이즈 스트리크 바이러스(Maize Streak Virus) (MSV) 코트 단백질 유전자 5'UTR로부터의 서열 및 메이즈 알콜 데히드로게나제 1 (ADH1) 유전자로부터의 인트론 6으로 구성된 합성 5'UTR 서열은 SCBV 프로모터 절편의 3' 말단과 AAD-1 코딩 영역의 개시 코돈 사이에 배치된다. (상기와 같은) 메이즈 리파제 유전자로부터의 3'UTR을 포함하는 단편을 사용하여 AAD-1 mRNA의 전사를 종결시켰다.

음성 대조군 이원 벡터 (pDAB101556)는 (상기와 같은) 인트론1을 갖는 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터의 카피 및 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자로부터의 3'UTR을 포함하는 단편 (ZmPer5 3'UTR; 미국 특허 번호 6,699,984)의 발현 제어 하에 황색 형광 단백질 (YFP) 마커 유전자 코딩 영역을 포함하였다 (Shagin et al. (2004) Molecular Biology and Evolution 21:841-850). pDAB101556은 추가로 (상기와 같은) 인트론1을 갖는 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터의 제2 카피 및 (상기와 같은) 메이즈 리파제 유전자로부터의 3'UTR의 발현 제어 하에 AAD-1 제초제 내성 단백질 코딩 영역을 포함한다.

실시예 4

아그로박테리움-매개 메이즈 형질전환

아그로박테리움-매개 형질전환을 사용하여 Cry1Da2 코어 독소 코딩 영역을 식물 게놈 내로 안정하게 통합시키고, 그에 따라 전장 또는 말단절단된 Cry1Da2 살곤충 단백질을 생산하는 트랜스제닉 메이즈 세포, 조직, 및 식물을 생성하였다. 초이원 또는 이원 형질전환 벡터를 사용하는 메이즈 형질전환 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 국제 PCT 공개 번호 WO2010/120452에 기재된 바와 같다. 형질전환된 조직을 R-할록시포프-함유 배지 상에서 성장하는 그의 능력에 의해 선택하였다.

아그로박테리움 배양 개시. 프로젝트 벡터의 글리세롤 스톡을 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주 균주 DAt13192에 제공하였다 (WO 2012/016222A2). 아그로박테리움 배양물을 글리세롤 스톡에서 AB 최소 배지로 스트리킹하고 (Watson, et al., (1975) J. Bacteriology 123:255-264), 적절한 항생제를 함유시켜 3일 동안 어둠에서 20℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 배양물을 항생제를 갖는 YEP 배지 (gm/L: 효모 추출물, 10; 펩톤, 10; NaCl, 5)의 플레이트 상에 스트리킹하고, 1-3일 동안 어둠에서 20℃에서 인큐베이션하였다.

실험 당일에, 접종 배지 및 아세토시린곤의 혼합물 (Frame et al. (2011) Methods in Molecular Biology 710:327-341)을 실험의 구축물의 수에 적절한 부피로 제조하고, 무균 일회용 250 mL 플라스크 내로 피펫팅하였다. 접종 배지는 pH 5.4에서 다음을 함유한다: 2.2 gm/L MS 염; 변형된 MS 비타민 (Frame et al., 상기 동일 문헌) 68.4 gm/L 수크로스; 36 gm/L 글루코스; 115 mg/L L-프롤린; 및 100 mg/L 미오-이노시톨. 아세토시린곤을 접종 배지를 함유하는 플라스크에 100% 디메틸 술폭시드 중 1M 스톡 용액으로부터 200 μM의 최종 농도로 첨가하였다.

각 구축물의 경우, YEP 플레이트로부터의 아그로박테리움의 1 접종 루프풀을 무균 일회용 50 mL 원심분리 튜브 내의 15 mL의 접종 배지/아세토시린곤 혼합물에 현탁시키고, 550 nm에서의 용액의 광학 밀도 (OD₅₅₀)를 분광광도계에서 측정하였다. 이어서, 현탁액을 추가의 접종 배지/아세토시린곤 혼합물을 사용하여 0.3 내지 0.4의 OD₅₅₀으로 희석하였다. 이어서, 아그로박테리움 현탁액의 튜브를 실온에서 약 75 rpm으로 설정된 플래폼 진탕기 상에 수평으로 놓고, 1 내지 4시간 동안 진탕시킨 후에 사용하였다.

이삭 멸균 및 배아 단리. 제아 메이스(Zea mays) 근교계 B104로부터의 이삭 (Hallauer, et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406)을 온실에서 생산하고, 수분 10 내지 12일 후 수확하였다. 수확된 이삭을 껍질제거하고, 20분 동안 상업용 표백제 (울트라 클로록스(Ultra Clorox)® 살균 표백제, 6.15% 차아염소산나트륨; 2 방울의 트윈(TWEEN) 20 포함)의 20% 용액 중 침지에 의해 표면-멸균한 다음, 층류 후드 안에서 무균 탈이온수 중에서 3회 헹구었다. 미성숙 접합 배아 (1.8 내지 2.2 mm 길이)를 각 이삭으로부터 무균 절제하고, 2 μL의 10% 브레이크-스루(BREAK-THRU)® S233 계면활성제 (에보닉 인더스트리즈(EVONIK INDUSTRIES); 독일 에센)가 첨가된 아그로박테리움 현탁액의 2.0 mL를 함유하는 1개 이상의 마이크로-원심분리 튜브로 분배하였다.

아그로박테리움 공동-배양. 단리 후에, 배아를 5분 동안 로커 플랫폼 상에 두었다. 이어서, 튜브의 내용물을 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH 중 3.3 mg/L 디캄바 (3,6-디클로로-o-아니스산 또는 3,6-디클로로-2-메톡시벤조산); 100 mg/L 미오-이노시톨; 100 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO₃; DMSO 중 200 μM 아세토시린곤; 및 3 gm/L 한천 (시그마-알드리치, 시험된 식물 세포 배양물)을 함유하는 공동-배양 배지의 플레이트 상에 부었다. 액체 아그로박테리움 현탁액을 무균 일회용 전달 피펫으로 제거하고, 배아를 함유하는 공동-배양 플레이트를 30분 동안 뚜겅을 약간 열어놓은 채로 층류 후드의 뒤쪽에 두고, 그 후에 배아를 현미경의 도움으로 무균 겸자를 사용하여 배반이 위를 향하도록 배향시켰다. 플레이트를 추가 15분 동안 뚜겅을 약간 열어놓은 채로 층류 후드의 뒤쪽으로 복귀시켰다. 이어서, 플레이트를 닫고, 3M^TM 마이크로포어(Micropore)^TM 의료용 테이프로 밀봉하고, 대략 60 μEm^-2 sec^-1 광 강도에서의 연속광을 사용하는 25℃의 인큐베이터에 두었다.

캘러스 선택 및 트랜스제닉 사례의 재생. 공동-배양 기간 후에, 배아를 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH 중 3.3 mg/L 디캄바; 100 mg/L 미오-이노시톨; 100 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO₃; 0.5 gm/L MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 1수화물; 피토테크놀로지스 래보러토리즈(Phytotechnologies labr.); 캔자스주 레넥사); 250 mg/L 세포탁심; 및 7.0 gm/L 한천으로 구성되는 휴지 배지로 전달하였다. 36개 이하의 배아를 각각의 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 마이크로포어^TM 테이프로 감싸고, 대략 50 μmol m-2 s-1 광 강도에서의 연속광을 사용하여 7 내지 10일 동안 27℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 캘러스를 갖는 배아 (<18개/플레이트)를 휴지 배지 (상기)로 구성되나 단지 6.5 gm/L 한천이 있고, 100 nM R-할록시포프산 (0.0362 mg/L)이 있는 선택 배지 I 상으로 전달하였다. 플레이트를 마이크로포어^TM 테이프로 감싸고, 대략 50 μEm^-2 sec^-1 광 강도에서의 연속광을 사용하여 7일 동안 27℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 증식된 캘러스 (<12개/플레이트)를 휴지 배지 (상기)로 구성되나 단지 6.5 gm/L 한천이 있고, 500 nM R-할록시포프산 (0.181 mg/L)이 있는 선택 배지 II로 전달하였다. 플레이트를 감싸고, 대략 50 μEm^-2 sec^-1 광 강도에서의 연속광을 사용하여 14일 동안 27℃에서 인큐베이션하였다.

이 단계에서, 저항성 캘러스 (<9개/플레이트)를 예비-재생 배지로 이동시켰다. 예비-재생 배지는 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 변형된 MS 비타민; 45 gm/L 수크로스; 350 mg/L L-프롤린; 100 mg/L 미오-이노시톨; 50 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 1.0 mg/L AgNO₃; 0.5 gm/L MES; NaOH 중 0.5 mg/L 나프탈렌아세트산; 에탄올 중 2.5 mg/L 아브시스산; 1 mg/L 6-벤질아미노퓨린; 250 mg/L 세포탁심; 5.5 gm/L 한천; 및 500 nM R-할록시포프산 (0.181 mg/L)을 함유한다. 플레이트를 감싸고, 대략 50 μEm^-2 sec^-1 광 강도에서의 연속광을 사용하여 7일 동안 27℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 재생 캘러스 (<6/플레이트)를 피타트레이스(Phytatrays)^TM (시그마-알드리치) 중 재생 배지로 전달하고, 14일 동안 또는 싹이 발생할 때까지 대략 150 μmol m^-2s^-1 광 강도에서 일당 16시간 명기/8시간 암기로 28℃에서 인큐베이션하였다. 재생 배지는 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 변형된 MS 비타민; 60 gm/L 수크로스; 0.50 gm/L MES; 125 mg/L 세포탁심; 5.5 gm/L 한천; 및 500 nM R-할록시포프산 (0.181 mg/L)을 함유한다. 이어서, 1차 뿌리를 갖는 작은 싹을 단리하고, 추가의 성장을 위해 선택 없이 신장 배지 (즉, R-할록시포프산이 없고, 60 gm/L 수크로스 대신 30 gm/L 수크로스가 있는 재생 배지)로 전달하였다. 약 6 cm 이상 발근된 소식물체를 토양으로 이식하고, 튼튼하게 하기 위해 성장 챔버로 이동시켰다.

검정 및 종자 생산을 위한 온실에서의 T₀ 식물의 전달 및 확립. 할록시포프를 함유하는 배지 상에서 성장하는 그의 능력에 의해 선택된 형질전환된 식물 조직을 피타트레이스^TM로부터 성장 배지 (프로믹스 BX(PROMIX BX); 프리미어 테크 홀티컬쳐(Premier Tech Horticulture))로 채운 작은 화분 (티. 오. 플라스틱스(T. O. Plastics), 3.5" SVD)으로 이식하고, 휴미돔 (아크로 플라스틱스 리미티드(Arco Plastics Ltd.))으로 덮고, 이어서 성장실 (28℃ 낮/24℃ 밤, 16-시간 광주기, 50-70% RH, 200 μEm^-2 sec^-1 광 강도)에서 튼튼하게 하였다. 식물이 V3-V4 단계에 도달하였을 때, 이를 선샤인 커스텀 블렌드 160(Sunshine Custom Blend 160) 토양 혼합물로 이식하고, 성장시켜 온실 (광 노출 유형: 광 또는 동화; 높은 광 한계: 1200 PAR; 16-시간 낮 길이; 27℃ 낮/24℃ 밤)에서 개화시켰다. 추정 트랜스제닉 소식물체를 트랜스진의 상대 카피수를 검출하도록 설계된 프라이머를 사용하여 정량적 실시간 PCR 검정에 의해 트랜스진 카피 수에 대해 분석하고, 통합된 Cry1Da2 유전자의 1개 또는 2개의 카피만을 갖는 사례를 5 갤런 화분으로 이식하였다. 주기적으로 관찰하여, 임의의 비정상적 표현형을 추적하였다. T₀ 트랜스제닉 식물의 수염을 T₀ 식물로부터 수집된 화분으로 자기-수분시키고 생성된 종자를 심어 T₁ 세대의 식물을 수득하였다. 사례 109841[3]-106으로부터의 T₁ 종자를 심고, 식물에 퀴잘로포프를 분무하고, 재생 단계까지 생존 식물을 유지함으로써 선택하여, 옥수수 이삭벌레 생물검정 및 웨스턴 블롯 분석을 위한 수염을 수득였다.

트랜스제닉 메이즈 식물을 황색 형광 단백질 유전자 발현 카세트를 보유하는 이원 벡터 pDAB101556을 사용하는 형질전환에 따라 유사하게 생산하였다.

실시예 5

트랜스제닉 메이즈 조직의 분자 및 생화학적 분석

카피수 분석을 위한 가수분해 프로브 qPCR. 분자 분석을 사용하여 낮은 카피, 단순 사례를 스크리닝하였다. 잎 조직을 토양에 이식하기 전에 발근된 추정 트랜스제닉 식물로부터 수집하였다. DNA를 바이오스프린트(Biosprint)96, 퀴아젠(QIAGEN) 추출 로봇 및 공급업체의 추천 프로토콜을 사용하여 퀴아젠 맥어트랙트(MagAttract)^TM 키트로 추출하였다. 통합된 트랜스진 카피수 분석을 AAD-1 유전자에 대해 특이적 가수분해 프로브 검정을 사용하여 수행하였다. 또한, 이원 벡터 플라스미드 백본의 우연한 통합에 의한 오염을 이원 벡터 백본 상에 보유된 스펙티노마이신 (Spec) 저항성 유전자에 대해 특이적인 가수분해 프로브 검정에 의해 검출하였다. 내인성 메이즈 유전자 인버타제; (진뱅크^TM 수탁 번호 U16123)를 위한 가수분해 프로브 검정을 내부 참조 표준으로서 개발하였다. 표 2는 가수분해 프로브 검정 성분의 올리고뉴클레오티드 서열 (인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies), 아이오와주 코랄빌 & 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티에 의해 합성됨)을 열거한다. 바이플렉스 가수분해 프로브 PCR 반응을 약 10 ng의 DNA로 표 3에 따라 설정였고, 검정 조건은 표 4에 제시된다.

표 2

트랜스진 카피수 및 상대 발현 검출에 사용된 정방향 및 역방향 뉴클레오티드 프라이머 및 형광 프로브의 목록.

* 형광 프로브 표지는 다음과 같다: FAM = 6-카르복시 플루오레세인 아미다이트; HEX = 헥사클로로-플루오레세인; MGB & VIC = "작은 홈 결합제"; VIC®는 인비트로젠으로부터의 독점적 형광 표지이다.

표 3

트랜스진 DNA 카피수 분석을 위한 가수분해 프로브 PCR 혼합물.

표 4

가수분해 프로브 PCR 증폭을 위한 써모사이클러 조건.

증폭을 위해, 라이트사이클러(LIGHTCYCLER)®480 프로브스 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 인디애나주 인디애나폴리스)를 10 μL 부피 멀티플렉스 반응물 (0.4 μM의 각각의 프라이머 및 0.2 μM의 각각의 프로브) 중 1X 최종 농도로 제조하였다. FAM (6-카르복시 플루오레세인 아미다이트) 형광 모이어티를 465 nm에서 여기시키고, 형광을 510 nm에서 측정하였다; HEX (헥사클로로플루오레세인) 형광 모이어티에 대한 상응하는 값은 533 nm 및 580 nm였다. 각각의 반응에 대해 생성된 형광 수준을 제조업체의 권장에 따라 로슈 라이트사이클러®480 실시간 PCR 시스템을 사용하여 분석하였다. 트랜스진 카피수를 미지의 샘플에 대한 표적/참조 유전자 값의 라이트사이클러®480 출력값을 카피수가 공지된 표준물의 표적/참조 유전자 값에 비교함으로써 결정하였다 (1-카피는 반접합 식물을 나타냄, 2-카피는 동형접합 식물을 나타냄).

Cp 점수, 즉 형광 신호가 피트 포인트 알고리즘 (라이트사이클러® 소프트웨어 1.5 배포판), 및 상대 퀀트(Quant) 모듈을 사용하여 백그라운드 역치와 교차하는 지점을 사용하여, 실시간 PCR 데이터의 분석을 수행하였다.

라이트사이클러® 피트 포인트 알고리즘 소프트웨어에서, 입력된 DNA 주형 농도의 로그값을 측정된 Cp 값에 대해 플롯팅하여 데이터의 그래프를 만들었다. 곡선의 기울기는 목적하는 비교 파라미터이고; 따라서, 초기 로그 입력 숫자는 곡선 상의 임의의 시작점일 수 있고, 단 입력된 DNA 주형에 사용된 임의의 농도 값은 사용된 실제의 연속 희석물을 나타낸다. 예를 들어, 10-배 연속 희석물 시리즈에 대해, 실제 입력값 농도는 1000, 100, 10 등일 수 있고, 이러한 지점에 대해 LC480 피트 포인트 알고리즘 소프트웨어는 입력값의 로그값으로서 3, 2, 1 등을 플롯팅한다. 이어서, 선형 회귀를 사용하여, 이러한 선 (입력 로그 대 Cp)의 생성된 베스트 피트를 y = mx+b 형태의 식으로부터 기울기 (m)를 추정하는데 사용한다. 출발 주형 양과 Cp 값 사이의 반비례 관계가 존재하고, 그에 따라 기울기 (m)는 항상 음성이다.

완전한 (즉, 100% 효율적인) PCR 반응은 매 사이클마다 전체 주형을 배가시킨다. PCR 효율 (Eff)은 다음과 같이 계산된다: Eff = 10e(-1/m). 따라서, 로그 입력값 대 Cp의 그래프의 기울기 (m)는 완전하게 효율적인 반응 (이의 효율은 2.00으로 정의됨)에 대해 -3.3219일 것이다.

다시 말해서, 100% 효율적인 PCR 반응은 다음으로 정의된다: 2.0 = 10e(-1/-3.3219). LC480 피트 포인트 알고리즘 소프트웨어는 제1 식에 의한 효율 값을 보고한다. 따라서 99% 효율적인 반응은 Eff 값이 0.99보다는 1.99이다. 이를 퍼센트 효율로서 표현하기 위해, 이 값에서 1을 빼고 100을 곱한다. 또는, %Eff = [(10e(-1/m)-1)] x 100.

식물-생산된 말단절단된 Cry1Da2 단백질의 검출. 단백질을 0.6 mL의 PBST (0.05 % 트윈 20을 함유하는 PBS 완충제) 중 200 내지 240 mg의 이삭 수염 (비수분 이삭으로부터 수집함)에서 추출하였다. 2 ㎜ 스틸 비드를 첨가하고, 튜브를 캡핑하고, 제노/그라인더(GENO/GRINDER) (세르티프렙(CERTIPREP); 뉴저지주 메투첸)에서 고정시키고, 5분 동안 1500 rpm에서 진탕시켰다. 튜브를 4000 rpm에서 7분 동안 4℃에서 원심분리하고, 가용성 단백질을 함유하는 상청액을 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

총 단백질 농도를 공급업체의 지침서에 따라 피어스(PIERCE) 660 nm 단백질 검정 키트 (써모 사이언티픽(THERMO SCIENTIFIC); 일리노이주 록포드)를 사용하여 결정하였다. 단백질 이뮤노블롯 분석을 표준 절차를 사용하여 토끼에서 생성된 폴리클로날 항체를 사용하여 수행하였다 (예를 들어, 문헌 [Harlow, E., and Lane, D.P. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY] 및 그의 최신판 참조). 샘플을 제조하였고, 변성 전기영동을 위한 제조업체의 제안된 프로토콜 (인비트로젠)에 따라 MES 전개 완충제 중 누페이지 4-12% 비스-트리스 겔을 통한 전기영동에 의해 단백질을 분리하였다. 단백질을 누페이지 전달 완충제 중에서 30 V로 80분 동안 니트로셀룰로스 막으로 전달하였다. 블롯은 5% 유액/PBST (0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS) 중에서 실온에서 1시간 동안 차단한 다음, 1차 항체 (Cry1Da 코어 독소 단백질에 특이적임)로 프로빙하고, 이어서 차단 용액 중에서 실온에서 각각 1시간 동안 2차 항체로 프로빙하였다 (각 항체 사이에서 15분 동안 PBST 중에서 헹구었음). 블롯의 전개는 제조업체의 프로토콜 (써모 피셔 사이언티픽(THERMO FISHER SCIENTIFIC), 일리노이주 록포드)에 따라 피어스의 ECL 웨스턴 블롯팅 기질을 사용하여 이루어졌다. 말단절단된 Cry1Da 단백질의 존재를 사례 109841[3]-106으로부터 생성된 메이즈 식물 (식물 109841[3]-106.AJ001.008, 109841[3]-106.AJ001.013, 109841[3]-106.AJ001.020, 109841[3]-106.AJ001.027, 및 109841[3]-106.AJ001.028)의 수염 조직의 이중 샘플로부터의 추출물에서 확인하였다. 2개의 밴드가 전형적으로 검출되었으며, 하나는 구축물 pDAB109841에 의해 코딩되는 Cry1Da2 단백질의 분자 크기에 상응하는, 대략 65 kDa에 상응하는 이동성을 갖고, 제2 밴드는 65 kDa보다 다소 작은 단백질에 상응하는 이동성을 갖는다. 보다 작은 단백질은 Cry1Da 코어 독소 단백질의 N-말단으로부터의 아미노산 1-28의 절단 후에 남은 생성물에 상응할 수 있다. (Cry1 단백질로부터의 몇몇 N-말단 아미노산의 프로세싱이 종종 검출된다.) 어떠한 이러한 밴드도 비-트랜스제닉 B104 식물로부터의 수염 추출물에서 나타나지 않았다.

표 5

RNA 관련 전사체 수준 (RTL) 및 단백질 발현에 대한 T1 식물의 분석.

*측정은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 웨스턴 분석에 의해 수행하고 LC/MS/MS에 의해 정량화하였다.

실시예 6

트랜스제닉 메이즈 조직의 생물검정

T₁ 메이즈 사례를 갖는 V5 잎 생물검정. 생물검정 트레이 (32-웰/트레이; 씨-디 인터내셔널)를 부분적으로 2% 한천 용액으로 채웠고, 한천은 고체화되도록 하였다. 2개의 잎 섹션 (면적 중 약 1 제곱 인치)을 각각의 식물에서 채취하였고, 각각을 32-웰 트레이의 개별 웰에 넣었다. 10마리의 신생 헬리코베르파 제아 (CEW) 유충 (우화 약 24 내지 48시간 후)을 각 웰에 넣었다. 트레이를 시험 동안 통풍되도록 천공 점착성 뚜껑으로 밀봉하였고, 이어서 16시간 명기:8시간 암기로 28℃, 40% RH에 두었다. 3일 후에, 단순 퍼센트 잎 면적 손상 점수를 각각의 잎 조각에 대해 수득하였다. 각 시험에 대한 손상 점수를 평균화하였다.

옥수수 이삭벌레 수염 생물검정. 비수분 이삭을 수집하였고, 그의 길이를 측정하였고, 이삭은 생물검정에 사용될 때까지 4℃에서 저장하였다. 약 10 mL의 2% 물 한천을 32-웰-생물검정 트레이의 각 검정 웰 하부 (약 1 제곱 인치)에 넣어, 수염 및 옥수수 이삭벌레 유충에 수분을 공급하였다. 5개의 가닥의 수염 (약 10 cm 길이)을 각 웰에서 2마리의 CEW 신생물에 공급하였다. 각각의 사례를 완전 무작위 포맷으로 4회 반복 (웰)으로 시험하였다. 곤충 침입 후에, 트레이를 시험 동안 통풍되도록 천공 점착성 뚜껑으로 밀봉하였다. 트레이는 16시간 명기/8시간 암기로 28℃, 60% RH에 두었다. 침입 3일 후에, 퍼센트 수염 손상을 수염 조직 상의 분변의 양의 시각적 평가에 의해 기록하였다. 살아있는, 사멸한 및 잃어버린 곤충의 수를 사례당 기록하였고, 퍼센트 유충 사멸률을 추정하였다.

CEW 유충에 대한 식물-생산된 Cry1Da 활성. 이뮤노블롯 분석으로 T₁ pDAB109841 트랜스제닉 식물의 이삭의 수염에서 Cry1Da 코어 독소 단백질을 검출하였고, 수염은 에이치. 제아 유충에 의한 섭식 손상에 대해 우수한 보호를 제공받았다 (생물검정에서 단지 4.6% 수염 손상을 가짐) (표 6). 비-살곤충 황색 형광 단백질 (YFP; 구축물 pDAB101556)을 생산하는 음성 대조군 트랜스제닉 메이즈 식물 또는 비-트랜스제닉 B104 식물로부터의 수염은 에이치. 제아 유충에 의해 90% 내지 95% 평균 수염 손상을 겪었다. 또한, Cry1Da 코어 독소 단백질을 생산하는 식물로부터 수염을 섭식하는 유충의 사멸률은 26.8%였고, 음성 대조군 식물 샘플에서는 유충의 사멸률은 관찰되지 않았다. Cry1Da 구축물은 V5 단계 샘플에 우수한 잎 보호를 제공하였으며 (pDAB109851 트랜스제닉 식물은 에이치. 제아에 의해 12% 내지 25% 잎 손상이 유발됨) (표 6), 반면에 음성 대조군 식물 (B104 및 YFP-생산)은 거의 100% 잎 손상을 겪었다. 수염 및 잎 생물검정 둘 다로부터의 결과는 Cry1Da 코어 독소 단백질이 메이즈 식물을 에이치. 제아 유충으로부터의 손상으로부터 보호함에 있어 고도로 효과적임을 입증하였다.

표 6

음성 대조군 식물과 비교하여 Cry1Da 코어 독소-생산 식물로부터의 샘플에 대한 에이치. 제아 신생 유충을 사용한 생물검정의 결과. 칼럼 내의 평균은 터키-크레이머(Tukey-Kramer) HSD 검정에 의해 분리하였다.

* 4회 반복의 평균

** NA = 적용되지 않음

*** 하나의 칼럼 내에서 동일한 문자에 의해 연결되지 않은 수준은 유의하게 상이하다.

표 7은 에이치. 제아의 퍼센트 사멸률, 퍼센트 잎 손상 및 퍼센트 수염 손상을 보여준다. 수염 손상의 양은 조직 상의 시각적 곤충 배설물 양에 따라 점수화하였다. 백분율 잎 손상은 1 제곱 인치 엽삽 상의 유충 섭식 면적의 시각적 평가에 따라 점수화하였다. 메이즈 품종 B104 및 구축물 101556 (또는 잎 손상의 경우 구축물 109812)은 각각 하이브리드 재배품종으로부터의 음성 대조군 및 황색 형광 단백질 (YFP) 대조군이었고, HX1은 Cry1Fa 단백질을 발현하는 상업용 하이브리드 허큘렉스® I이었다. 구축물 109841은 말단절단된 버전의 Cry1Da를 발현하는 T1 메이즈였다. 데이터는 ANOVA 및 터키-크레이머 평균 분리 검정에 의해 분석하였다.

표 7

에이치. 제아의 퍼센트 사멸률, 퍼센트 잎 손상 및 퍼센트 수염 손상.

*SEM = 평균의 표준 오차. 괄호 안의 문자는 통계적 수준을 지정한다. 동일한 문자로 연결되지 않은 수준은 유의하게 상이하다 (P<0.05).

**구축물 109812는 잎 손상 생물검정에 대한 YFP 음성 대조군이었다.

실시예 7

CEW에 대한 Cry1Da 코어 독소 단백질의 재배지 효능

8개의 T₁ pDAB109841 트랜스제닉 B104 사례로부터의 종자를 다우 아그로사이언시스 필드 스테이션(DOW AGROSCIENCES Field Station) (인디애나주 포울러)에서 재배지 시험 플롯으로 시험하였다. 이 사례를 상기 기재된 바와 같이 분자 기술에 의해 분석하였고, 검출가능한 이원 벡터 백본 서열을 갖지 않는 단일 카피 사례인 것으로 밝혀졌다. 모든 사례는 Cry1Da/AAD1 통합 사례에 대해 1:1 (반접합:널)로 분리하여 T₁ 식물로서 시험하였다. 음성 대조군은 비트랜스제닉 B104 (널) 식물이었다.

시험 플롯은 각각 시험된 곤충 종에 대해 하나의 20 피트 행을 함유하였다. 처리물을 4회 반복으로 무작위 완전 블록 설계로 심었다. 실험 엔트리를 널 식물이 제거되도록 헥타르당 184 gm 산-당량 (ae/ha) + 1% COC에서 어슈어(ASSURE)® II (듀폰^TM 크롭 프로텍션(DUPONT™ CROP PROTECTION), 델라웨어주 윌밍톤)로 V2 단계에서 처리하였다. 어슈어® II는 활성 성분 (ai) 퀴잘로포프 P-에틸 에틸(R)-2-4-[4-6-클로로퀴녹살린-2-일 옥시)-페녹시]프로피오네이트를 함유한다. 상업용 제품은 갤런당 0.88 lb ai 및 1.0% (v/v) 작물 오일 농축물 (COC)을 함유한다. COC는 약 85 % 파라핀계 오일 및 약 15 % 유화제를 함유하는 유화가능한 정제된 파라핀계 오일이다. 표준 카운트는 처리 2주 후에 수득하였다. 플롯당 5개의 식물을 곤충 손상에 대해 평가하였다.

옥수수 이삭벌레 알 (CEW; 헬리코베르파 제아 바디)은 벤존 리서치에 의해 공급되었다. CEW에 대한 효능을 평가하기 위해, 각 식물에 개화기 (주요 성장기 #6) 중 2012년 8월 21일에 이삭의 수염에 5마리의 제2령 CEW 유충을 공급하였다. 2012년 9월 4일에, 이삭을 살아있는 유충 및 섭식 손상에 대해 조사하였으며, 이는 표 8에 열거된 기준에 따라 결정하였다.

표 8

옥수수 이삭벌레 손상 평가를 위한 기준.

표준 프로토콜을 사용하는 정량적 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 각 사례에서의 Cry1Da 잎 단백질 수준을 평가하였다. ELISA를 식물 추출물의 다중 희석물을 사용하여 및 본질적으로 ELISA 키트 공급업체에 의해 제공된 바와 같은 시약 및 지침서를 사용하여 수행하였다. 상기 기재된 바와 같은 Cry1Da 항체를 사용하였다.

표 9

재배지-성장된 식물에 대한 분석 및 곤충 섭식 시험의 결과. 평균은 터키-크레이머 HSD 검정에 의해 분리하였다.

* 동일한 문자로 연결되지 않은 수준은 유의하게 상이하다.

** N/A = 적용되지 않음

폭넓은 범위의 Cry1Da 축적 수준이 존재하였다 (67 ng/cm² 내지 135 ng/cm²). 시험된 pDAB109841 사례 전부는 Cry1Da 생산 수준에 관계없이 커넬 소모 및 이삭 침입 수준 둘 다에서 CEW에 대해 통계적으로 유사한 수준의 보호를 제공하였다.

참고문헌

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gtttatacta accattgtgt ggatacgtat aatcagggat taaggcgttt ggaaggtcgt 660 tttcttagcg attggattgt atataatcgt ttccggagac aattgacaat ttcagtatta 720 gatattgttg cgttttttcc aaattatgat attagaacat atccaattca aacagctact 780 cagctaacga gggaagtcta tctggattta ccttttatta atgaaaatct ttctcctgca 840 gcaagctatc caaccttttc agctgctgaa agtgctataa ttagaagtcc tcatttagta 900 gactttttaa atagctttac catttataca gatagtctgg cacgttatgc atattgggga 960 gggcacttgg taaattcttt ccgcacagga accactacta atttgataag atccccttta 1020 tatggaaggg aaggaaatac agagcgcccc gtaactatta ccgcatcacc tagcgtacca 1080 atatttagaa cactttcata tattacaggc cttgacaatt caaatcctgt agctggaatc 1140 gagggagtgg aattccaaaa tactataagt agaagtatct atcgtaaaag cggtccaata 1200 gattctttta gtgaattacc acctcaagat gccagcgtat ctcctgcaat tgggtatagt 1260 caccgtttat gccatgcaac atttttagaa cggattagtg gaccaagaat agcaggcacc 1320 gtattttctt ggacacaccg tagtgccagc cctactaatg aagtaagtcc atctagaatt 1380 acacaaattc catgggtaaa ggcgcatact cttgcatctg gtgcctccgt cattaaaggt 1440 cctggattta caggtggaga tattctgact aggaatagta tgggcgagct ggggacctta 1500 cgagtaacct tcacaggaag attaccacaa agttattata tacgtttccg ttatgcttcg 1560 gtagcaaata ggagtggtac atttagatat tcacagccac cttcgtatgg aatttcattt 1620 ccaaaaacta tggacgcagg tgaaccacta acatctcgtt cgttcgctca tacaacactc 1680 ttcactccaa taaccttttc acgagctcaa gaagaatttg atctatacat ccaatcgggt 1740 gtttatatag atcgaattga atttataccg gttactgcaa cactggaggc agagtctgac 1800 ttggaaagag cacagaaggc ggtgaatgct ctgttcactt cgtccaatca gattgggctc 1860 aagacagatg tgactgacta tcacatcgat cgcgtttcca accttgttga gtgcctctct 1920 gatgagttct gtttggatga gaagaaggag ttgtccgaga aggtcaaaca tgctaagcga 1980 cttagtgatg agcggaactt gcttcaagat cccaactttc gcgggatcaa caggcaacta 2040 gatcgtggat ggaggggaag tacggacatc accattcaag gaggtgatga tgtgttcaag 2100 gagaactatg ttacgctctt gggtaccttt gatgagtgct atccaacata cctgtaccag 2160 aagatagatg aatcgaaact caaagcctac acaagatacc agttgagagg ttacatcgag 2220 gacagtcaag accttgagat ctacctcatc agatacaacg ccaaacatga gacagtcaat 2280 gtgcctggga cgggttcact ctggccactt tcagccccaa gtcccatcgg caagtgtgcc 2340 catcactcac accacttctc cttggacata gacgttggct gtaccgacct gaacgaagac 2400 ctcggtgtgt gggtgatctt caagatcaag actcaagatg gccatgccag gctaggcaat 2460 ctggagtttc tagaagagaa accacttgtt ggagaagccc tcgctagagt gaagagggct 2520 gagaagaagt ggagggacaa gagagagaag ttggaatggg aaacaaacat tgtgtacaaa 2580 gaagccaaag aaagcgttga cgctctgttt gtgaactctc agtatgatag gctccaagct 2640 gataccaaca tagctatgat tcatgctgca gacaaacgcg ttcatagcat tcgggaagct 2700 taccttcctg aacttagcgt gattccgggt gtcaatgctg ctatctttga agagttagaa 2760 gggcgcatct tcactgcatt ctccttgtat gatgcgagga atgtcatcaa gaatggtgac 2820 ttcaacaatg gcctatcctg ctggaatgtg aaagggcacg tagatgtaga agaacagaac 2880 aatcaccgct ctgtccttgt tgttcctgag tgggaagcag aagtttcaca agaagttcgt 2940 gtctgtcctg gtcgtggcta cattcttcgt gttaccgcgt acaaagaagg atacggagaa 3000 ggttgcgtca ccatacacga gattgagaac aacaccgacg agctgaagtt cagcaactgc 3060 gtcgaggagg aagtctaccc aaacaacacc gtaacttgca atgactacac tgcgactcaa 3120 gaggagtatg agggtactta cacttctcgc aatcgaggat acgatggagc ctatgagagc 3180 aactcttctg tacccgctga ctatgcatca gcctatgagg agaaggctta caccgatgga 3240 cgtagggaca atccttgcga atctaacaga ggctatgggg actacacacc gttaccagcc 3300 ggctatgtca ccaaagagtt agagtacttt ccagaaaccg acaaggtttg gattgagatt 3360 ggagaaacgg aaggaacatt cattgttgat agcgtggagt tacttctgat ggaggaatga 3420 <210> 2 <211> 1139 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence for the DIG-911 protein (Cry1Da2/Cry1Ab chimeric insecticidal toxin, which consists of a core toxin segment of Cry1Da (amino acids 1 to 594, as disclosed in GENBANK Accession No. 176415.1 and U.S Patent No. 5,691,308) and a <400> 2 Met Glu Ile Asn Asn Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Lys Glu Ile Ile Leu Gly Glu Glu Arg Leu Glu Thr Gly Asn 20 25 30 Thr Val Ala Asp Ile Ser Leu Gly Leu Ile Asn Phe Leu Tyr Ser Asn 35 40 45 Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Val Gly Leu Leu Glu Leu Ile Trp 50 55 60 Gly Phe Ile Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ile Phe Leu Ala Gln Ile Glu 65 70 75 80 Gln Leu Ile Ser Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Lys Val Tyr Val Arg Ala 100 105 110 Phe Ser Asp Trp Glu Lys Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu 115 120 125 Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Ile Thr Ala Ile 130 135 140 Pro Leu Phe Arg Val Gln Asn Tyr Glu Val Ala Leu Leu Ser Val Tyr 145 150 155 160 Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Ile Leu Arg Asp Val Ser Val 165 170 175 Phe Gly Glu Arg Trp Gly Tyr Asp Thr Ala Thr Ile Asn Asn Arg Tyr 180 185 190 Ser Asp Leu Thr Ser Leu Ile His Val Tyr Thr Asn His Cys Val Asp 195 200 205 Thr Tyr Asn Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Gly Arg Phe Leu Ser Asp 210 215 220 Trp Ile Val Tyr Asn Arg Phe Arg Arg Gln Leu Thr Ile Ser Val Leu 225 230 235 240 Asp Ile Val Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Ile Arg Thr Tyr Pro Ile 245 250 255 Gln Thr Ala Thr Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Leu Asp Leu Pro Phe 260 265 270 Ile Asn Glu Asn Leu Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Phe Ser Ala 275 280 285 Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe Leu Asn 290 295 300 Ser Phe Thr Ile Tyr Thr Asp Ser Leu Ala Arg Tyr Ala Tyr Trp Gly 305 310 315 320 Gly His Leu Val Asn Ser Phe Arg Thr Gly Thr Thr Thr Asn Leu Ile 325 330 335 Arg Ser Pro Leu Tyr Gly Arg Glu Gly Asn Thr Glu Arg Pro Val Thr 340 345 350 Ile Thr Ala Ser Pro Ser Val Pro Ile Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Ile 355 360 365 Thr Gly Leu Asp Asn Ser Asn Pro Val Ala Gly Ile Glu Gly Val Glu 370 375 380 Phe Gln Asn Thr Ile Ser Arg Ser Ile Tyr Arg Lys Ser Gly Pro Ile 385 390 395 400 Asp Ser Phe Ser Glu Leu Pro Pro Gln Asp Ala Ser Val Ser Pro Ala 405 410 415 Ile Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Leu Glu Arg Ile 420 425 430 Ser Gly Pro Arg Ile Ala Gly Thr Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser 435 440 445 Ala Ser Pro Thr Asn Glu Val Ser Pro Ser Arg Ile Thr Gln Ile Pro 450 455 460 Trp Val Lys Ala His Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Val Ile Lys Gly 465 470 475 480 Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Thr Arg Asn Ser Met Gly 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900 905 910 Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser 915 920 925 Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly 930 935 940 Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn 945 950 955 960 Asn His Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser 965 970 975 Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr 980 985 990 Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile 995 1000 1005 Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu 1010 1015 1020 Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Ala 1025 1030 1035 Thr Gln Glu Glu Tyr Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly 1040 1045 1050 Tyr Asp Gly Ala Tyr Glu Ser Asn Ser Ser Val Pro Ala Asp Tyr 1055 1060 1065 Ala Ser Ala Tyr Glu Glu Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Asp 1070 1075 1080 Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr Pro Leu 1085 1090 1095 Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr 1100 1105 1110 Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile 1115 1120 1125 Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu 1130 1135 <210> 3 <211> 3447 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DIG-180 DNA; Cry1Fa2 <400> 3 atggaaaata atattcaaaa tcaatgcgta ccttacaatt gtttaaataa tcctgaagta 60 gaaatactga acgaagaacg cagcaccggc cgcctgccgc tggacatcag cctgagcctt 120 acacgtttcc ttttgagtga atttgttcca ggtgtgggag ttgcgtttgg attatttgat 180 ttaatatggg gttttataac tccttctgat tggagcttat ttcttttaca gattgaacaa 240 ttgattgagc aaagaataga aacattggaa aggaaccggg caattactac attacgaggg 300 ttagcagata gctatgaaat ttatattgaa gcactaagag agtgggaagc aaatcctaat 360 aatgcacaat taagggaaga tgtgcgtatt cgatttgcta atacagacga cgctttaata 420 acagcaataa ataattttac acttacaagt tttgaaatcc ctcttttatc ggtctatgtt 480 caagcggcga atttacattt atcactatta agagacgcag tatcgtttgg gcagggttgg 540 ggactggata tagctactgt taataatcat tataatagat taataaatct tattcataga 600 tatacgaaac attgtttgga cacatacaat caaggattag aaaacttaag aggtactaat 660 actcgacaat gggcaagatt caatcagttt aggagagatt taacacttac tgtattagat 720 atcgttgctc tttttccgaa ctacgatgtt agaacatatc caattcaaac gtcatcccaa 780 ttaacaaggg aaatttatac aagttcagta attgaggatt ctccagtttc tgctaatata 840 cctaatggtt ttaatagggc ggaatttgga gttagaccgc cccatcttat ggactttatg 900 aattctttgt ttgtaactgc agagactgtt agaagtcaaa ctgtgtgggg aggacactta 960 gttagttcac gaaatacggc tggtaaccgt ataaatttcc ctagttacgg ggtcttcaat 1020 cctggtggcg ccatttggat tgcagatgag gatccacgtc ctttttatcg gacattatca 1080 gatcctgttt ttgtccgagg aggatttggg aatcctcatt atgtactggg gcttagggga 1140 gtagcatttc aacaaactgg tacgaaccac acccgaacat ttagaaatag tgggaccata 1200 gattctctag atgaaatccc acctcaggat aatagtgggg caccttggaa tgattatagt 1260 catgtattaa atcatgttac atttgtacga tggccaggtg agatttcagg aagtgattca 1320 tggagagctc caatgttttc ttggacgcac cgtagtgcaa cccctacaaa tacaattgat 1380 ccggagagga ttactcaaat accattggta aaagcacata cacttcagtc aggtactact 1440 gttgtaagag ggcccgggtt tacgggagga gatattcttc gacgaacaag tggaggacca 1500 tttgcttata ctattgttaa tataaatggg caattacccc aaaggtatcg tgcaagaata 1560 cgctatgcct ctactacaaa tctaagaatt tacgtaacgg ttgcaggtga acggattttt 1620 gctggtcaat ttaacaaaac aatggatacc ggtgacccat taacattcca atcttttagt 1680 tacgcaacta ttaatacagc ttttacattc ccaatgagcc agagtagttt cacagtaggt 1740 gctgatactt ttagttcagg gaatgaagtt tatatagaca gatttgaatt gattccagtt 1800 actgcaacat tggaagcaga atctgattta gaaagagcac aaaaggcggt gaatgcgctg 1860 tttacttcta gcaaccaaat agggctaaaa acagatgtga cggattatca tatcgatcga 1920 gtatccaatt tagttgagtg tttatctgat gaattttgtc tggatgaaaa aaaagaattg 1980 tccgagaaag tcaaacatgc gaagcgactt agtgatgagc ggaatttact tcaagatcca 2040 aactttagag ggatcaatag acaactagac cgtggctgga gaggaagtac ggatattacc 2100 atccaaggag gcgatgacgt attcaaagag aattacgtta cgctattggg tacctttgat 2160 gagtgctatc caacgtattt atatcaaaaa atagatgagt cgaaattaaa agcctatacc 2220 cgttaccaat taagagggta tatcgaagat agtcaagact tagaaatcta tttaattcgc 2280 tacaatgcca aacacgaaac agtaaatgtg ccaggtacgg gttccttatg gccgctttca 2340 gccccaagtc caatcggaaa 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tgaaagcaat tcttctgtac cagctgatta tgcatcagcc 3240 tatgaagaaa aagcatatac agatggacga agagacaatc cttgtgaatc taacagagga 3300 tatggggatt acacaccact accagctggc tatgtgacaa aagaattaga gtacttccca 3360 gaaaccgata aggtatggat tgagatcgga gaaacggaag gaacattcat cgtggacagc 3420 gtggaattac ttcttatgga ggaataa 3447 <210> 4 <211> 1148 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DIG-180 protein; Cry1Fa2 <400> 4 Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn 1 5 10 15 Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu 20 25 30 Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe 35 40 45 Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly 50 55 60 Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln 65 70 75 80 Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr 85 90 95 Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu 100 105 110 Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val 115 120 125 Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn 130 135 140 Asn Phe Thr Leu Thr Ser Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val 145 150 155 160 Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe 165 170 175 Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn 180 185 190 Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr 195 200 205 Tyr Asn Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp 210 215 220 Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp 225 230 235 240 Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln 245 250 255 Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu 260 265 270 Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu 275 280 285 Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe 290 295 300 Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu 305 310 315 320 Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr 325 330 335 Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro 340 345 350 Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly 355 360 365 Phe Gly Asn Pro His Tyr Val Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln 370 375 380 Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile 385 390 395 400 Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp 405 410 415 Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro 420 425 430 Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp 435 440 445 Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile 450 455 460 Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr 465 470 475 480 Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr 485 490 495 Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu 500 505 510 Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu 515 520 525 Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe 530 535 540 Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser 545 550 555 560 Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser 565 570 575 Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile 580 585 590 Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu Ser 595 600 605 Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Ser 610 615 620 Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Arg 625 630 635 640 Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu 645 650 655 Lys Lys Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp 660 665 670 Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Arg Gly Ile Asn Arg Gln 675 680 685 Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly 690 695 700 Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Leu Gly Thr Phe Asp 705 710 715 720 Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu 725 730 735 Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln 740 745 750 Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val 755 760 765 Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala Pro Ser Pro 770 775 780 Ile Gly Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp 785 790 795 800 Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe 805 810 815 Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe 820 825 830 Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg 835 840 845 Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr 850 855 860 Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe Val 865 870 875 880 Asn Ser Gln Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile 885 890 895 His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro 900 905 910 Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu 915 920 925 Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val 930 935 940 Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys 945 950 955 960 Gly His Val Asp Val 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19 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> InvertaseP Probe <400> 15 cgagcagacc gccgtgtact t 21

Claims (16)

1. Cry1Da 살곤충 단백질 또는 변이체를 섭취를 위해 옥수수 이삭벌레에게 제공하는 것을 포함하는, 식물에 대한 옥수수 이삭벌레 손상을 방제하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 Cry1Da 살곤충 단백질 또는 변이체가 식물 세포에 의해 생산되고 식물 세포에 존재하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 Cry1Da 살곤충 단백질 또는 변이체가 생식력 있는 전체 식물에 의해 생산되고 생식력 있는 전체 식물에 존재하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 Cry1Da 살곤충 단백질이 서열식별번호: 6과 적어도 95% 동일한 코어 독소 영역을 포함하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 Cry1Da 살곤충 단백질이 서열식별번호: 6과 적어도 99% 동일한 코어 독소 영역을 포함하는 것인 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 식물이 옥수수, 대두, 및 목화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
7. 비-Bt 피난처 식물 및 Cry1Da 코어 독소를 포함하는 살곤충 단백질을 발현하는 복수의 식물을 포함하는 재배지 내의 복수의 식물이며, 여기서 상기 피난처 식물이 상기 재배지 내의 모든 작물 식물의 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만을 구성하는 것인 복수의 식물.
8. 제7항에 있어서, 10 에이커 초과를 점유하는 복수의 식물.
9. 제7항에 있어서, 피난처 식물이 존재하지 않는 복수의 식물.
10. 제7항에 있어서, 상기 피난처 식물이 블록 또는 스트립에 있는 것인 복수의 식물.
11. 비-Bt 피난처 식물로부터의 피난처 종자 및 Cry1Da를 발현할 수 있는 복수의 종자를 포함하는 종자의 혼합물이며, 상기 피난처 종자가 혼합물 내의 모든 종자의 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만을 구성하는 것인 종자의 혼합물.
12. 옥수수 이삭벌레 곤충이 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 식물을 섭식하게 함으로써 옥수수 이삭벌레 곤충을 방제하는 방법.
13. 식물 세포를, 서열식별번호: 6을 포함하는 코딩 영역을 발현하는 DNA 서열로 형질전환시키고, 상기 형질전환된 식물 세포로부터 생식력 있는 트랜스제닉 식물을 재생시키고, 상기 형질전환된 식물로부터 상기 DNA 서열을 보유하는 종자를 수집하고, 상기 형질전환된 식물의 종자를 성장시키고, 옥수수 이삭벌레가 상기 DNA 서열에 의해 발현되는 단백질을 섭식하도록 하는 것을 포함하는, 식물에 대한 옥수수 이삭벌레 손상을 방제하는 방법.
14. 제13항에 있어서, DNA 서열이 서열식별번호: 6과 적어도 99% 동일한 것인 방법.
15. 서열식별번호: 6을 포함하는 코딩 영역을 발현하는 상기 형질전환된 식물에 의해 생산되는 종자를 성장시키고, 옥수수 이삭벌레가 상기 DNA 서열에 의해 발현되는 단백질을 섭식하도록 하는 것을 포함하는, 식물에 대한 옥수수 이삭벌레 손상을 방제하는 방법.
16. 제15항에 있어서, DNA 서열이 서열식별번호: 6과 적어도 99% 동일한 것인 방법.

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