MX2012007120A - Uso combinado de las proteínas insecticidas vip3ab y cry1fa para el manejo de insectos resistentes. - Google Patents

Abstract

La presente invención incluye métodos y plantas para el control de insectos lepidópteros, donde dichas plantas comprenden una proteína insecticida Vip3Ab en combinación con una proteína insecticida Cry1Fa a fin de demorar o prevenir el desarrollo de resistencia por el/los insecto(s).

Description

USO COMBINADO DE LAS PROTEÍNAS INSECTICIDAS VIP3AB Y CRY1 FA PARA EL MANEJO DE INSECTOS RESISTENTES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los humanos cultivan el maíz para aplicaciones alimenticias y energéticas. Los humanos también cultivan muchos otros cultivos, entre ellos, soja y algodón. Los insectos comen y dañan plantas, y de ese modo, destruyen los esfuerzos humanos. Se gastan miles de millones de dólares por año en el control de plagas de insectos, y se pierden miles de millones adicionales por el daño que estas infligen. Los insecticidas químicos orgánicos sintéticos han sido las herramientas primarias utilizadas para el control de plagas de insectos, si bien los insecticidas biológicos, tales como las proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bf), han cumplido un importante rol en algunas áreas. La capacidad para producir plantas resistentes a insectos a través de la transformación con genes de proteínas insecticidas de Bt ha revolucionado la agricultura moderna, y ha sobresaltado la importancia y el valor de proteínas insecticidas y sus genes.

Se han utilizado varias proteínas de Bt para crear las plantas transgénicas resistentes a insectos que han sido exitosamente registradas y comercializadas, hasta la fecha. Estas incluyen CryIAb, CryIAc, CryI F y Cry3Bb en maíz, CryIAc y Cry2Ab en algodón, y Cry3A en papa.

Los productos comerciales que expresan estas . proteínas expresan una sola proteína, excepto en casos donde se desea el espectro insecticida combinado de dos proteínas (por ejemplo, CrylAb y Cry3Bb, en maíz, combinadas de manera de proporcionar resistencia a plagas de lepidópteros y a la lombriz de las raíces, respectivamente), o donde la acción independiente de las proteínas las hace útiles como una herramienta para demorar el desarrollo de resistencia en poblaciones de insectos sensibles (por ejemplo, CryIAc y Cry2Ab en algodón, combinadas de manera de proporcionar el manejo de la resistencia para la lombriz del brote del tabaco). Ver, además, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. US 2009 0313717, que se refiere a una proteína Cry2 más una Vip3Aa, Cryl F, o CryIA, para el control de Helicoverpa zea o armigerain. El documento WO 2009 132850 se refiere a Cry F o CryIA y Vip3Aa para el control de Spodoptera frugiperda. La Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. 2008 031 1096 se refiere, en parte, a CrylAb para el control de ECB (sigla en inglés de: perforador del maíz europeo) resistente a Cryl F.

Esto es, algunas de las cualidades de las plantas transgénicas resistentes a insectos que han llevado a la rápida y diseminada adopción de esta tecnología también dan origen a cuestiones relacionadas con el desarrollo de resistencia de las poblaciones de plagas a las proteínas insecticidas producidas por estas plantas. Se han sugerido varias estrategias para la preservación de la utilidad de rasgos de resistencia de insectos a base de Bt, que incluyen el desplegado de proteínas a alta dosis, en combinación con un refugio, y la alternación o el desplegado conjunto con diferentes toxinas (McGaughey et al. (1998), "B. t. Resistance Management", Nature Biotechnol. 16: 144-146).

Es necesario que las proteínas seleccionadas para el uso en una acumulación de IRM (sigla en inglés de: manejo de la resistencia de insectos) ejerzan su efecto insecticida de manera independiente, de manera que la resistencia desarrollada a una proteína no confiera resistencia a la segunda proteína (es decir, no hay resistencia cruzada a las proteínas). Por ejemplo, si una población de plaga seleccionada para la resistencia a la "Proteína A" es sensible a la "Proteína B", se concluirá que no hay resistencia cruzada, y que una combinación de Proteína A y Proteína B será eficaz en la demora de la resistencia a la Proteína A sola.

En ausencia de poblaciones de insectos resistentes, pueden efectuarse evaluaciones sobre la base de otras características supuestamente relacionadas con el mecanismo de acción y el potencial de resistencia cruzada. Se ha sugerido la utilidad de la unión mediada por receptor, en la identificación de proteínas insecticidas que probablemente no exhiban resistencia cruzada (van Mellaert et al. 1999). El pronosticador clave de la falta de resistencia cruzada inherente en este enfoque es que las proteínas insecticidas no compiten por receptores en una especie de insecto sensible.

En el caso de que dos toxinas de Bt compitan por el mismo receptor, entonces, si dicho receptor muta en dicho insecto, de modo que una de las toxinas ya no se une a dicho receptor, y en consecuencia, ya no es insecticida contra el insecto, este podría ser el caso de que el insecto también sea resistente a la segunda toxina (que se ha ligado competitivamente al mismo receptor). Es decir, se afirma que el insecto tiene resistencia cruzada a ambas toxinas de Bt. Sin embargo, si dos toxinas se unen a dos receptores diferentes, esta podría ser una indicación de que el insecto no será simultáneamente resistente a dichas dos toxinas.

CryI Fa es útil en el control de muchas especies de plagas de lepidópteros, que incluyen el perforador del maíz europeo (ECB, según su sigla en inglés; Ostrínia nubilalis (Hübner)) y la oruga combatiente del otoño (FAW, según su sigla en inglés; Spodoptera frugiperda), y es activa contra el perforador de la caña de azúcar (SCB, según su sigla en inglés; Diatraea saccharalis). La proteína CryI Fa, producida en plantas de maíz que contienen el evento TC1507, es responsable de un rasgo de resistencia de insectos líder en la industria, para el control de FAW. La proteína CryIFa también es desplegada en los productos Herculex®, SmartStax™ y WideStrike™.

La capacidad para conducir estudios de unión de receptor (competitiva u homologa) usando proteína CryI Fa es limitada, debido a que la técnica más común disponible para el marcado de proteínas, a fin de obtener la detección en ensayos de unión de receptor, inactiva la actividad insecticida de la proteína Cry1 Fa.

Se citan toxinas adicionales de Cry en la página de Internet del comité oficial de nomenclaturas de B. t. (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt ). Actualmente, existen casi 60 grupos principales de toxinas "Cry" (Cry1-Cry59), con toxinas adicionales Cyt y toxinas VIP y similares. Muchos de todos los grupos numéricos tienen subgrupos de letras mayúsculas, y los subgrupos de letras mayúsculas tienen subgrupos de letras minúsculas (Cry1 tiene A-L, y CrylA tiene a-i, por ejemplo).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, en parte, al sorprendente descubrimiento de que una población de orugas combatientes de otoño (Spodoptera frugiperda; FAW) resistente a la actividad insecticida de la proteína CryI Fa no es resistente a la actividad insecticida de la proteína Vip3Ab. El presente par de toxinas proporciona acción resistente no cruzada contra FAW.

Como será reconocido por el experto en la técnica con el beneficio de esta revelación, las plantas que expresan Vip3Ab y Cry Fa, o sus porciones insecticidas, serán útiles en la demora o la prevención del desarrollo de resistencia a cualquiera de estas proteínas insecticidas sola.

La presente invención también es fundamentada por el descubrimiento de que Vip3Ab y Cry1 Fa no compiten entre sí por sitios de unión en el intestino de FAW.

Por lo tanto, la presente invención se refiere, en parte, al uso de una proteína Vip3Ab en combinación con una proteína CryI Fa. Las plantas (y las áreas plantadas con dichas plantas) que producen Vip3Ab más CryI Fa se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

La presente invención además se refiere, en parte, a acumulaciones triples o "pirámides" de tres toxinas, o más, donde Vip3Ab y CryI Fa son el par de base. En algunas modalidades de pirámide preferidas, las toxinas seleccionadas tienen acción resistente no cruzada contra FAW.

Algunas proteínas preferidas para estas combinaciones piramidales de acumulación triple son CryI Fa más Vip3Ab más CryI C, CryI D, CryI Be, o CryI E. Estas acumulaciones triples particulares, de acuerdo con la presente invención, proporcionarán de manera conveniente y sorprendente la acción resistente no cruzada contra FAW. Esta acción puede ayudar a reducir o eliminar la necesidad de refugio o de áreas.

Debido a que Cry1 Fa es activa tanto contra FAW como contra el perforador del maíz europeo (ECB), y en vista de la información presentada en esta solicitud, podría seleccionarse también una acumulación cuádruple (de cuatro vías) de manera de proporcionar cuatro proteínas, donde tres de las cuatro tienen actividad resistente no cruzada contra ECB, y tres de las cuatro tienen actividad resistente no cruzada contra FAW. Esta acumulación podría obtenerse usando CryI Be (activa tanto contra ECB como contra FAW) junto con el presente par de proteínas, más una proteína adicional que es activa contra ECB. Dichas acumulaciones cuádruples, de acuerdo con la presente invención, son: Cry F más CryI Be más Vip3Ab (activa contra FAW) más CrylAb, Cry2A, Cryl l, o DIG-3 (activa contra ECB).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Respuestas de dosis de inhibición de crecimiento (barras) y mortalidad (?) para Vip3Ab1 de longitud completa contra Spodoptera frugiperda de tipo silvestre (J. E. Smith), (FAW) y Spodoptera frugiperda de tipo resistente a CryI Fa (J. E. Smith), (rFAW). El porcentaje de inhibición de crecimiento se basa en la comparación del peso promedio de 8 larvas tratadas solo con regulador, con el peso de las larvas expuestas a la toxina durante 5 días.

Figura 2. Imagen de fósforo de 25l CryI Fa ligada a BBMV (sigla en inglés de: vesículas de membrana de borde de microvellosidad) de S. frugiperda luego de la separación por SDS-PAGE (sigla en inglés de: "electroforesis de dodecil sulfato sódico-gel de poliacrilamida"). Las muestras se efectuaron por duplicado. La concentración de 125l CryI Fa fue 1 nM. El control representa el nivel de unión de 25l CryI Fa a BBMV en ausencia de cualquier ligando competitivo. La expresión 1000 nM CryI Fa representa el nivel de unión de 125l CryI Fa a BBMV en presencia de 1000 nM de CryI Fa no radiomarcada, que muestra el desplazamiento completo del ligando radiomarcado, de la proteína BBMV. La expresión 1000 nM Vip3Ab1 representa el nivel de unión de 125l CryI Fa a BBMV en presencia de 1000 nM de Vip3Ab1 no radiomarcada, que muestra que esta proteína no tienen la capacidad de desplazar 125l CryI Fa de BBMV de S. frugiperda, aun cuando es agregada en una cantidad de 1000 veces la concentración del ligando radiomarcado.

Figura 3. Imagen de fósforo de 25l CryI Fa ligada a BBMV de S. frugiperda de tipo silvestre (FAW) o S. frugiperda resistente a Cry1 Fa (rFAW), luego de la separación por SDS-PAGE. Las muestras se efectuaron por duplicado. La concentración de 125l CryI Fa fue 2.5 nM. FAW-0 representa el nivel de unión de 25l CryI Fa a BBMV de S. frugiperda de tipo silvestre en ausencia de cualquier ligando competitivo. FAW-1000 nM CryIFa representa el nivel de unión de 125l CryI Fa a BBMV de S. frugiperda de tipo silvestre en presencia de 1000 nM de CryI Fa no radiomarcada, que muestra el desplazamiento del ligando radiomarcado, de la proteína BBMV. rFAW-0 representa el nivel de unión de 125l CryI Fa a BBMV de S. frugiperda resistente a CryI Fa en ausencia de cualquier ligando competitivo. Obsérvese la ausencia de unión de 125l CryI Fa a las BBMV de FAW resistente. rFAW-1000 nM CryIFa representa el nivel de unión de 125l CryI Fa a BBMV en presencia de 1000 nM de Vip3Ab1 no radiomarcada, nuevamente, mostrando la incapacidad de 125l CryI Fa para la unión a BBMV de S. frugiperda resistente a CryI Fa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se informa en esta solicitud, una toxina Vip3Ab producida en maíz transgénico (y otras plantas, por ejemplo, algodón y soja) puede ser muy eficaz en el control de la oruga combatiente de otoño (FAW; Spodoptera frugiperda) que ha desarrollado resistencia a la actividad de CryI Fa. Por lo tanto, la presente invención se refiere, en parte, al sorprendente descubrimiento de que la oruga combatiente de otoño resistente a Cry1 Fa es sensible (es decir, no tiene resistencia cruzada) a Vip3Ab. En otras palabras, la presente invención se refiere además, en parte, al sorprendente descubrimiento de que la toxina Vip3Ab es eficaz en la protección de plantas (como plantas de maíz) contra el daño por la oruga combatiente de otoño resistente a CryI Fa. Para una descripción de esta plaga, ver, por ejemplo, la referencia de Tabashnik, PNAS (2008), vol. 105 nro. 49, 19029-19030.

La presente invención incluye el uso de la toxina Vip3Ab para la protección de maíz y otras especies de plantas importantes desde el punto de vista económico (tales como soja), contra el daño y la pérdida de rendimiento causados por la alimentación de la oruga combatiente de otoño, o por poblaciones de orugas combatientes de otoño que han desarrollado resistencia a CryI Fa.

La presente invención, en consecuencia, describe una acumulación IRM que comprende Vip3Ab a fin de prevenir o mitigar el desarrollo de resistencia de la oruga combatiente de otoño a CryI Fa.

La presente invención provee composiciones para el control de plagas de lepidópteros que comprenden células que producen una proteína que contiene toxina núcleo CryI Fa y una proteína que contiene toxina núcleo Vip3Ab.

La invención además comprende un huésped transformado para producir tanto una proteína insecticida CryI Fa como una proteína insecticida Vip3Ab, donde dicho huésped es un microorganismo o una célula de planta. Los presentes polinucleótidos, preferentemente, se presentan en una construcción genética bajo el control de (funcionalmente ligada a/que comprende) uno o más promotores no Bacillus-thuringiensis. Los presentes polinucleótidos pueden comprender el uso de codones, para la mayor expresión en una planta.

Se tiene la intención además de que la invención provea un método para el control de plagas de lepidópteros, que comprende el contacto de dichas plagas o el entorno de dichas plagas, con una cantidad eficaz de una composición que comprende una proteína que contiene toxina núcleo CryI Fa y que además comprende una proteína que contiene toxina núcleo Vip3Ab.

Una modalidad de la invención comprende una planta de maíz que comprende un gen de expresión en plantas que codifica una proteína que contiene toxina núcleo Vip3Ab, y un gen de expresión en plantas que codifica una proteína que contiene toxina núcleo CryI Fa, y semillas de dicha planta.

Una modalidad adicional de la invención comprende una planta de maíz, donde se ha efectuado, en dicha planta de maíz, la introgresión de un gen de expresión en plantas que codifica una proteína que contiene toxina núcleo Vip3Ab, y de un gen de expresión en plantas que codifica una proteína que contiene toxina núcleo CryI Fa; y semillas de dicha planta.

Como se describe en los Ejemplos, los estudios de unión competitiva usando la proteína de toxina núcleo radiomarcada Vip3Ab muestran que la proteína de toxina núcleo CryI Fa no compite por la unión en tejidos de insectos FAW a los cuales se une Vip3Ab. Estos resultados además indican que la combinación de las proteínas CryI Fa y Vip3Ab es un medio eficaz para mitigar el desarrollo de resistencia en poblaciones de FAW, a CryI Fa (y asimismo, el desarrollo de resistencia a Vip3Ab), y probablemente, aumente el nivel de resistencia a esta plaga en plantas de maíz que expresan ambas proteínas. Por lo tanto, sobre la base, en parte, de la información que se describe en esta solicitud, se cree que la producción conjunta (acumulación) de las proteínas Vip3Ab y CryI Fa puede usarse para la producción de una acumulación IRM de alta dosis para FAW. Debido a que CryI Fa es activa tanto contra FAW como contra el perforador del maíz europeo (ECB), el presente par de toxinas proporciona la acción no competitiva contra los FAW.

Pueden agregarse otras proteínas a este par, a fin de expandir el espectro de control de insectos. Otra opción de desplegado consiste en el uso de proteínas Cry1 Fa y Vip3Ab en combinación con otro tercer componente de toxina/gen, y el uso de esta acumulación triple para mitigar el desarrollo de resistencia en FAW a cualquiera de estas toxinas. Por lo tanto, otra opción de desplegado de la presente invención consiste en el uso de dos, tres o más proteínas en regiones de cultivo donde FAW puede desarrollar poblaciones resistentes.

En consecuencia, la presente invención también se refiere, en parte, a acumulaciones triples o "pirámides" de tres (o más) toxinas, donde las toxinas CryIFa y Vip3Ab son el par de base.

En algunas modalidades piramidales preferidas, las tres proteínas seleccionadas proporcionan la acción resistente no cruzada contra FAW. Algunas combinaciones piramidales preferidas de "triple acción" son CryI Fa más Vip3Ab más CryIC o CryI D. Ver USSN 61/284,281 (presentada el 16 de diciembre de 2009), que muestra que CryIC es activa contra FAW resistente a CryI F; y USSN 61/284,252 (presentada el 16 de diciembre de 2009), que muestra que CryI D es activa contra FAW resistente a CryIF. Estas dos solicitudes también muestran que CryIC no compite con CryIF por la unión en preparaciones de membrana de FAW, y que CryI D no compite con CryI F por la unión en preparaciones de membrana de FAW. En algunas modalidades, CryI Be o CryIE podría combinarse con Vip3A y CryI F como la tercera proteína anti-FAW. Para el uso de CryI Be con CryI F, ver USSN 61/284,290 (presentada el 16 de diciembre de 2009). Para el uso de CryI E con CryI F, ver USSN 61/284,278 (presentada el 16 de diciembre de 2009). Estas acumulaciones triples particulares, de acuerdo con la presente invención, proporcionarán de manera conveniente y sorprendente tres proteínas que proporcionan la acción resistente no cruzada contra FAW. Esta acción puede ayudar a reducir o eliminar la necesidad de áreas de refugio.

En vista de la información presentada en esta solicitud, podría seleccionarse también una acumulación cuádruple (cuatro vías) de manera de proporcionar tres proteínas con acción resistente no cruzada contra ECB y tres proteínas con acción resistente no cruzada contra FAW. Esta acción podría obtenerse usando CryI Be (activa tanto contra ECB como contra FAW) junto con CryI Fa (activa tanto contra ECB como contra FAW), junto con la presente Vip3Ab (activa contra FAW) y una cuarta proteína -que tiene toxicidad para ECB (ver USSN 61/284,290, presentada el 16 de diciembre de 2009, que se refiere a combinaciones de CryI Fa y CryI Be.) Ejemplos de acumulaciones cuádruples de acuerdo con la presente invención son: CryI F más CryI Be más Vip3 (activa contra FAW) más (CryIAb, Cry2A, Cryl l, o DIG-3 -todas activas contra ECB).

DIG-3 se revela en la Solicitud US 2010 00269223.

Las plantas (y las áreas plantadas con dichas plantas) que producen cualquiera de las presentes combinaciones de proteínas se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Pueden agregarse también toxinas/genes adicionales, si bien las acumulaciones particulares descriptas con anterioridad proporcionan de manera conveniente y sorprendente múltiples modos de acción contra FAW y ECB. Esto puede ayudar a reducir o eliminar la necesidad de áreas de refugio. Un campo plantado de este modo, de más de 4 ha (10 acres), se incluye, por lo tanto, dentro de la presente invención.

Asimismo, puede emplearse GENBANK a fin de obtener las secuencias para cualquiera de los genes y de las proteínas que se revelan o mencionan en esta solicitud. Ver Apéndice A, a continuación.

La Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5,188,960 y la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5,827,514 describen proteínas que contienen toxina núcleo CryI Fa, adecuadas para el uso con el fin de llevar a cabo la presente invención. La Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6,218,188 describe secuencias de ADN optimizadas en plantas que codifican proteínas que contienen toxina núcleo CryI Fa, adecuadas para el uso en la presente invención.

Cry Fa se encuentra en los productos Herculex®, SmartStax™ y WidesStrike™. Podría combinarse un gen de vip3Ab, por ejemplo, en un producto CryI Fa tal como Herculex®, SmartStax™ y WideStrike™. En consecuencia, el uso de Vip3Ab podría ser significativo en la reducción de la presión de selección sobre estas y otras proteínas comercializadas. Vip3Ab podría usarse, por lo tanto, como en la combinación de 3 genes para maíz y otras plantas (por ejemplo, algodón y soja).

Las combinaciones de proteínas descriptas en esta solicitud pueden usarse para el control de plagas de lepidópteros. Los lepidópteros adultos, por ejemplo, mariposas y polillas, se alimentan principalmente de néctar de flores, y son un efector significativo de la polinización. Casi todas las larvas de lepidópteros, es decir, las orugas, se alimentan de plantas, y muchas son plagas graves. Las orugas se alimentan sobre el follaje o dentro del follaje, o sobre las raíces o el tallo de una planta, y de ese modo, privan a la planta de nutrientes y, a menudo, destruyen la estructura de soporte físico de la planta. Además, las orugas se alimentan de frutos, géneros y granos y flores almacenados, y arruinan estos productos para la venta, o disminuyen en gran medida su valor. De acuerdo con esta solicitud, la referencia a las plagas de lepidópteros se refiere a diversas etapas del ciclo de vida de las plagas, que incluyen las etapas de larvas.

Algunas toxinas quiméricas de la presente invención comprenden una porción de toxina núcleo N-terminal completa de una toxina de Bt, y, en cierto punto después del final de la porción de toxina núcleo, la proteína tiene una transición a una secuencia de protoxina heteróloga. La porción de toxina N-terminal, insecticidamente activa, de una toxina de Bt se denomina la toxina "núcleo". La transición del segmento de toxina núcleo al segmento de protoxina heteróloga puede producirse aproximadamente en la unión de toxina/protoxina, o en forma alternativa, una porción de la protoxina nativa (que se extiende más allá de la porción de toxina núcleo) puede ser retenida, donde la transición a la porción de protoxina heteróloga se produce corriente descendente.

A modo de ejemplo, una toxina quimérica de la presente invención es una porción de toxina núcleo completa de CryI Fa (aproximadamente los primeros 600 aminoácidos) y una protoxina heteróloga (el resto de la proteína al término C). En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina deriva de una toxina de proteína CryIAb. En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina deriva de una toxina de proteína CryIAb.

El experto en la técnica apreciará que las toxinas de Bt, aun dentro de una cierta clase, tal como CryI F, variarán a cierto alcance en la longitud y en la ubicación precisa de la transición desde la porción de toxina núcleo hasta la porción de protoxina. Habitualmente, las toxinas CryI Fa son de alrededor de 1 150 a alrededor de 1200 aminoácidos de longitud. La transición de la porción de toxina núcleo a la porción de protoxina habitualmente se producirá a entre alrededor de 50% y alrededor de 60% de la toxina de longitud completa. La toxina quimérica de la presente invención incluirá la expansión completa de esta porción de toxina núcleo N-terminal. Por lo tanto, la toxina quimérica comprenderá por lo menos aproximadamente 50% de la longitud completa de la proteína de toxina de Bt CryI Fa, que habitualmente, será por lo menos aproximadamente 590 aminoácidos. Con respecto a la porción de protoxina, la expansión completa de la porción de protoxina CryIAb se extiende desde el extremo de la porción de toxina núcleo hasta el término C de la molécula.

Genes y toxinas Los genes y las toxinas útiles de acuerdo con la presente invención incluyen no solo las secuencias de longitud completa reveladas, sino, además, fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes y proteínas de fusión que retienen la actividad pesticida característica de las toxinas que se ejemplifican específicamente en esta solicitud. De acuerdo con esta invención, los términos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren a secuencias de nucleótidos que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes que tienen actividad pesticida. De acuerdo con esta solicitud, el término "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma o esencialmente la misma actividad biológica contra las plagas blanco, que las toxinas reivindicadas.

De acuerdo con esta solicitud, las limitaciones representan aproximadamente 95% (CryI Fa y Vip3Ab), 78% (CryI F y Vip3A) y 45% (Cry1 y Vip3) de identidad de secuencia, conforme a "Revisión of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D. R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D. H. Dean.: Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Estos cortes también pueden aplicarse solamente a toxinas núcleo (por ejemplo, para CryI Fa).

Será evidente para el experto en la técnica que los genes que codifican toxinas activas pueden identificarse y obtenerse a través de varios medios. Los genes o las porciones de genes específicos ejemplificados en esta solicitud pueden obtenerse a partir de aislados depositados en un depositario de cultivos. Estos genes, o sus porciones o variantes, también pueden construirse en forma sintética, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de genes. Las variaciones de genes pueden construirse sin dificultad empleando técnicas convencionales para hacer mutaciones puntuales. Además, pueden prepararse fragmentos de estos genes usando exonucleasas o endonucleasas comerciales, de acuerdo con procedimientos estándares. Por ejemplo, pueden usarse enzimas tales como Bal31 o la mutagénesis dirigida de sitio a fin de cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. Los genes que codifican fragmentos activos también pueden obtenerse empleando una diversidad de enzimas de restricción. Pueden usarse proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas de proteína.

Se encuentran dentro del alcance de la presente invención los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas. Además, debido a la redundancia del código genético, una diversidad de diferentes secuencias de ADN pueden codificar las secuencias de aminoácidos que se revelan en esta solicitud. Se encuentra dentro del conocimiento del experto en la técnica la creación de estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas, o esencialmente las mismas toxinas. Estas secuencias de ADN variantes se encuentran dentro del alcance de la presente invención. De acuerdo con esta solicitud, la referencia a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que no afectan materialmente la actividad pesticida. Los fragmentos de genes que codifican proteínas que retienen actividad pesticida se incluyen también en esta definición.

Un método adicional para la identificación de los genes que codifican las toxinas y las porciones de genes útiles de acuerdo con la presente invención es mediante el uso de sondas de oligonucleótidos. Esas sondas son secuencias de nucleótidos detectables. Estas secuencias pueden ser detectables en virtud de una marca apropiada, o pueden ser inherentemente fluorescentes como se describe en la Solicitud Internacional Nro. WO 93/16094. Como es bien sabido en el arte, si la molécula de sonda y la muestra de ácido nucleico hibridan mediante la formación de un enlace fuerte entre las dos moléculas, puede asumirse razonablemente que la sonda y la muestra tienen homología sustancial. Preferentemente, la hibridación se lleva a cabo en condiciones rigurosas por medio de técnicas bien conocidas en el arte, como lo describen, por ejemplo, Keller, G. H., M. M. Manak (1987): DNA Probes, Stockton Press, New York, N. Y., pp. 169-170. Algunos ejemplos de concentraciones salinas y combinaciones de temperatura son los siguientes (en orden de rigurosidad creciente): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X SSPE o SSC a 42°C; 0.1 X SSPE o SSC a 42°C; 0.1 X SSPE o SSC a 65°C. La detección de la sonda proporciona un medio para la determinación, de manera conocida, de la producción de hibridación. Dicho análisis de sonda proporciona un rápido método para la identificación de genes que codifican toxinas de la presente invención. Los segmentos de nucleótidos que se usan como sondas de acuerdo con la invención pueden sintetizarse usando un sintetizador de ADN y procedimientos convencionales.

Estas secuencias de nucleótidos también pueden usarse como cebadores de PCR (sigla en inglés de: "reacción en cadena de la polimerasa") a fin de amplificar genes de la presente invención.

Toxinas vanantes Ciertas toxinas de la presente invención se han ejemplificado específicamente en esta solicitud. Debido a que estas toxinas son solamente ejemplares de las toxinas de la presente invención, debería ser fácilmente evidente que la presente invención comprende toxinas variantes o equivalentes (y secuencias de nucleótidos que codifican toxinas equivalentes) que tienen la misma o similar actividad pesticida que la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendrán homología de aminoácidos con respecto a una toxina ejemplificada. Esta homología de aminoácidos típicamente será superior al 75%, preferentemente, superior al 90%, y con mayor preferencia, será superior al 95%. La homología de aminoácidos será mayor en regiones críticas de la toxina que representan la actividad biológica o que están involucradas en la determinación de la configuración tridimensional que, en última instancia, es responsable de la actividad biológica. En este sentido, ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables, y pueden esperarse si estas sustituciones se encuentran en regiones que no son críticas para la actividad, o son sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, pueden colocarse aminoácidos en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos y ácidos. Las sustituciones conservadoras, por las cuales un aminoácido de una clase es reemplazado con otro aminoácido del mismo tipo, se encuentran dentro del alcance de la presente invención, siempre que la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. A continuación se presenta un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

CUADRO 1 En algunos casos, pueden hacerse también sustituciones no conservadoras. El factor decisivo es que estas sustituciones no deben privar significativamente de la actividad biológica de la toxina.

Huéspedes recombinados Los genes que codifican las toxinas de la presente invención pueden introducirse en una amplia variedad de huéspedes de plantas o microbianos. La expresión del gen de toxina logra, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del pesticida. Pueden usarse la transferencia de conjugación y la transferencia recombinada a fin de crear una cepa de Bt que expresa ambas toxinas de la presente invención. Pueden transformarse también otros organismos huéspedes con uno o ambos de los genes de toxina, y luego, usarse para lograr el efecto sinérgico. Con huéspedes microbianos adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios pueden aplicarse al sitio de la plaga, donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es el control de la plaga. Alternativamente, el microbio que alberga el gen de toxina puede tratarse en condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada, que retiene la actividad tóxica, puede entonces aplicarse al entorno de la plaga blanco.

Cuando se introduce el gen de toxina Bt por medio de un vector adecuado en un huésped microbiano, y dicho huésped es aplicado al entorno en un estado vivo, es esencial la utilización de ciertos microbios huéspedes. Se seleccionan los huéspedes de microorganismos que se sabe ocupan la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de modo de ser capaces de competir exitosamente en el entorno particular (cultivo y otros hábitats de insectos), con los microorganismos de tipo silvestre; de proporcionar el mantenimiento y la expresión estables del gen que expresa el pesticida de polipéptido; y convenientemente, de proporcionar la mejorada protección del pesticida contra la inactivación y la degradación ambiental.

Se conocen una gran cantidad de microorganismos que habitan el filoplano (la superficie de las hojas de la planta) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las raíces de la planta) de una amplia variedad de cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son de particular interés los microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, de los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos, en particular, levaduras, por ejemplo, de los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Son de particular interés las especies bacterianas de la fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus y Azotobacter vinlandii; y especies de levaduras de la fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffiuens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans. Son de particular interés los microorganismos pigmentados.

Pueden obtenerse una amplia variedad de métodos para la introducción de un gen de Bt que codifica una toxina en un huésped de microorganismo, en condiciones que permiten el mantenimiento y la expresión estables del gen. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5135867, incorporada en la presente solicitud a modo de referencia.

Tratamiento de células Pueden tratarse células de Bacillus thuringiensis o recombinadas que expresan las toxinas de Bt, a fin de prolongar la actividad de la toxina y estabilizar la célula. La microcápsula pesticida formada comprende una o más de las toxinas de Bt dentro de una estructura celular que ha sido estabilizada y que protegerá la toxina cuando la microcápsula es aplicada al entorno de la plaga blanco. Las células huéspedes adecuadas pueden incluir o bien procariotos o eucariotos, y normalmente, se limitan a aquellas células que no producen sustancias tóxicas para organismos superiores, tales como mamíferos. Sin embargo, podrían usarse organismos que producen sustancias tóxicas para organismos superiores, cuando las sustancias tóxicas sean inestables, o el nivel de aplicación sea suficientemente bajo de modo de evitar cualquier posibilidad de toxicidad a un huésped mamífero. Como huéspedes, serán de particular interés los procariotos y los eucariotos inferiores, tales como hongos.

La célula habitualmente será intacta, y estará sustancialmente en la forma proliferativa cuando es tratada, en lugar de en la forma de espora, si bien, en algunos casos, pueden emplearse esporas.

El tratamiento de la célula microbiana, por ejemplo, un microbio que contiene el gen o los genes de toxina B. t., puede efectuarse por medios químicos o físicos, o mediante una combinación de medios químicos y físicos, siempre que la técnica no afecte de manera nociva las propiedades de la toxina, ni disminuya la capacidad celular para proteger la toxina. Ejemplos de reactivos químicos son agentes halogenantes, en particular, halógenos de número atómico 17-80. Más en particular, puede usarse yodo en condiciones leves y durante un tiempo suficiente para lograr los resultados deseados. Otras técnicas adecuadas incluyen el tratamiento con aldehidos, tales como glutaraldehído; agentes antiinfecciosos, tales como cloruro de zefirano y cloruro de cetilpiridinio; alcoholes, tales como isopropilico y etanol; diversos fijadores histológicos, tales como yodo de Lugol, fijador de Bouin, diversos ácidos y fijador de Helly (ver: Humason, Gretchen L, Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); o una combinación de agentes físicos (calor) y químicos que preservan y prolongan la actividad de la toxina producida en la célula, cuando la célula es administrada al entorno del huésped. Ejemplos de medios físicos son la radiación de longitud de onda corta, como la radiación gamma y la radiación X, el congelamiento, la irradiación de UV, la liofilización y similares. Los métodos de tratamiento de células microbianas se revelan en las Patentes de los Estados Unidos de América Nros. 4,695,455 y 4,695,462, incorporadas en la presente solicitud a modo de referencia.

Las células, en general, tendrán mayor estabilidad estructural, que aumentará la resistencia a las condiciones ambientales. Cuando el pesticida se presenta en una proforma, el método de tratamiento celular debe seleccionarse de modo de no inhibir el procesamiento de la proforma hasta la forma madura del pesticida, por el patógeno de la plaga blanco. Por ejemplo, el formaldehído entrecruzará proteínas y podría inhibir el procesamiento de la proforma de un pesticida de polipéptido. El método de tratamiento debe retener por lo menos una porción sustancial de la biodisponibilidad o bioactividad de la toxina.

Las características de interés particular en la selección de una célula huésped para los propósitos de producción incluyen la facilidad de introducción de uno o más de los genes de B. t. en el huésped; la disponibilidad de sistemas de expresión; la eficiencia de expresión; la estabilidad del pesticida en el huésped; y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Las características de interés para el uso como una microcápsula de pesticida incluyen las cualidades protectoras para el pesticida, tales como paredes celulares gruesas, pigmentación y empaquetado intracelular o la formación de cuerpos de inclusión; sobrevida en entornos acuosos; falta de toxicidad mamífera; atracción para plagas en términos de ingestión; facilidad de muerte y fijación sin daño a la toxina; y similares. Otras consideraciones abarcan la facilidad de formulación y manipulación, la economía, la capacidad de almacenamiento y similares.

Cultivo de células El huésped celular que contiene uno o más genes insecticidas de B. t. puede cultivarse en cualquier medio nutriente conveniente, donde la construcción de ADN proporcione una ventaja de selección, a fin de proporcionar un medio de selección de modo que sustancialmente la totalidad o la totalidad de las células retienen el gen de B. t.. Estas células entonces pueden ser cosechadas de acuerdo con las formas convencionales. Alternativamente, las células pueden tratarse antes de la cosecha.

Las células de B. t. que producen las toxinas de la invención pueden cultivarse usando medios del arte y técnicas de fermentación convencionales. Al finalizar el ciclo de fermentación, las bacterias pueden ser cosechadas, en primer lugar, mediante la separación de las esporas de B. t. y los cristales del caldo de fermentación, por medios bien conocidos en el arte. Los cristales y las esporas de B. t. recuperados pueden formularse como un polvo para mezclar con agua, un concentrado líquido, como gránulos u otras formulaciones, mediante la adición de surfactantes, dispersantes, portadores inertes y otros componentes, a fin de facilitar la manipulación y la aplicación para las plagas blanco particulares. Estas formulaciones y estos procedimientos de aplicación son bien conocidos en el arte.

Formulaciones Pueden aplicarse al suelo gránulos de cebo formulados, que contienen un atrayente y esporas, cristales y toxinas de los aislados de B. t., o microbios recombinados que comprenden los genes que se obtienen a partir de los aislados de B. t. que se describen en esta solicitud. El producto formulado también puede aplicarse como un revestimiento de semillas o tratamiento de raíces, o un tratamiento de la planta total, en etapas posteriores del ciclo de cultivo. Los tratamientos de plantas y de suelo de células de B. t. pueden emplearse como polvos para mezclar con agua, gránulos o polvos para espolvoreo, mediante la mezcla con diversos materiales inertes, tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos y similares) o materiales botánicos (mazorcas de maíz en polvo, vainas de arroz, cáscaras de nueces y similares). Las formulaciones pueden incluir coadyuvantes para la diseminación y la adhesión, agentes estabilizadores, otros aditivos pesticidas, o surfactantes. Las formulaciones líquidas pueden ser de base acuosa o no acuosa, y pueden emplearse como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsionables, o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes Teológicos, surfactantes, emulsionantes, dispersantes o polímeros.

Como será apreciado por el experto en la técnica, la concentración pesticida variará ampliamente de acuerdo con la naturaleza de la formulación particular, en especial, la forma, a decir, un concentrado, o un producto para su utilización directa. El pesticida se presentará en por lo menos 1 % en peso, y puede presentarse en 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán de alrededor de 1-95% en peso del pesticida, mientras que las formulaciones líquidas, en general, tendrán aproximadamente 1-60% en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones, en general, tendrán de aproximadamente 102 a aproximadamente 104 células/mg. Estas formulaciones se administrarán en una proporción de aproximadamente 50 mg (líquidos o secos) a 1 kg o más por hectárea.

Las formulaciones pueden aplicarse al entorno de la plaga de lepidópteros, por ejemplo, al follaje o al suelo, mediante la pulverización, el espolvoreo, el rociado, o métodos similares.

Transformación de plantas Un huésped recombinado preferido para la producción de las proteínas insecticidas de la presente invención es una planta transformada. Los genes que codifican proteínas de toxinas de Bt, como se revelan en esta solicitud, pueden insertarse en células de plantas empleando una diversidad de técnicas bien conocidas en el arte. Por ejemplo, una gran cantidad de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en Escherichia coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas pueden obtenerse para la preparación para la inserción de genes extraños en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, la serie pUC, la serie M13mp, pACYC184, inter alia. En consecuencia, el fragmento de ADN que tiene la secuencia que codifica la proteína de toxina de Bt puede insertarse en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para la transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, luego se cosechan y se lisan. Se recupera el plásmido. Se llevan generalmente a cabo el análisis de secuencia, el análisis de restricción, la electroforesis y otros métodos bioquímicos y de biología molecular, como métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN utilizada puede disociarse y unirse a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido puede clonarse en los mismos o diferentes plásmidos. De acuerdo con el método de inserción de los genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Por ejemplo, si se usa el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula de planta, entonces por lo menos el borde derecho, si bien, a menudo, los bordes derecho e izquierdo, del ADN-T de plásmido Ti o Ri deben unirse como la región flanqueante de los genes por ser insertados. El uso de ADN-T para la transformación de células de plantas ha sido investigado extensamente y ha sido descripto suficientemente en la patente EP 120 516, en las referencias de Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986), y An et al., (1985), y se encuentra bien establecido en el arte.

Una vez que el ADN insertado ha sido integrado en el genoma de la planta, es relativamente estable. El vector de transformación normalmente contiene un marcador de selección que confiere, en las células de plantas transformadas, resistencia a un biocida o un antibiótico, tal como bialafos, kanamicina, G418, bleomicina o higromicina, ínter alia. El marcador empleado individualmente, en consecuencia, debe permitir la selección de células transformadas, en lugar de células que no contienen el ADN insertado.

Pueden obtenerse una gran cantidad de técnicas para la inserción de ADN en una célula de planta huésped. Dichas técnicas incluyen la transformación con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación; la fusión, inyección, biolística (bombardeo de micropartículas), o la electroporación, al igual que otros métodos posibles. Si se usan Agrobacterium para la transformación, el ADN por ser insertado debe ser clonado en plásmidos especiales, a decir, o bien en un vector intermediario o en un vector binario. Los vectores intermediarios pueden integrarse en el plásmido Ti o Ri por medio de la recombinación homologa, debido a secuencias que son homologas a secuencias en el ADN-T. El plásmido Ti o Ri además comprende la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermediarios no pueden replicarse a sí mismos en Agrobacterium. El vector intermediario puede transferirse a Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse a sí mismos, tanto en E. coli como en Agrobacterium. Estos vectores comprenden un gen marcador de selección y un conector o policonector, que son enmarcados por las regiones de borde de ADN-T derecho e izquierdo. Pueden ser transferidos directamente a Agrobacterium (Holsters et al., 1978). La Agrobacterium utilizada como célula huésped debe comprender un plásmido que porta una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T en la célula de planta. Puede contener ADN-T adicional. La bacteria transformada de este modo se usa para la transformación de células de plantas. Las explantaciones de plantas pueden cultivarse de modo conveniente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula de planta. Entonces pueden regenerarse plantas enteras a partir del material de planta infectado (por ejemplo, trozos de hoja, segmentos de tallo, raíces, aunque también, protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas obtenidas de esta manera luego pueden ser ensayadas a fin de establecer la presencia del ADN insertado. No hay exigencias especiales de los plásmidos en el caso de la inyección y la electroporación. Es posible el uso de plásmidos comunes, tales como derivados de pUC.

Las células transformadas crecen dentro de las plantas en la manera habitual. Pueden formar células germinales y transmitir los rasgos transformados a plantas de descendencia. Dichas plantas pueden cultivarse de la manera normal y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las correspondientes propiedades fenotípicas.

En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas serán transformadas con genes donde se ha optimizado el uso de codones para plantas. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5380831 , incorporada en la presente solicitud a modo de referencia. Si bien en esta solicitud se ejemplifican algunas toxinas truncadas, es bien sabido en el arte de Sí que las toxinas de tipo 130 kDa (longitud completa) tienen una mitad N-terminal que es la toxina núcleo, y una mitad C-terminal que es la "cola" de protoxina. Por lo tanto, las "colas" apropiadas pueden usarse con toxinas truncadas/núcleo de la presente invención. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6218188 y la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6673990. Además, se conocen en el arte los métodos para la creación de genes sintéticos de Bt para el uso en plantas (Stewart and Burgin, 2007). Un ejemplo no limitativo de una planta transformada preferida es una planta de maíz fértil que comprende un gen de expresión en plantas que codifica una proteína Cryl Fa, y que además comprende un segundo gen de expresión en plantas que codifica una proteína Vip3Ab.

La transferencia (o introgresión) de los rasgos determinados de Cryl Fa y Vip3Ab en líneas de maíz endogámicas puede lograrse mediante el cultivo de selección recurrente, por ejemplo, mediante el retrocruce. En este caso, se cruza en primer lugar el progenitor recurrente deseado con una planta endogámica donante (el progenitor no recurrente) que porta los genes apropiados para los rasgos determinados de Cryl F y Vip3Ab. La descendencia de este cruce es luego apareada nuevamente con el progenitor recurrente, y a continuación, se realiza la selección en la descendencia resultante, a fin de establecer los rasgos deseados por ser transferidos desde el progenitor no recurrente. Después de tres, preferentemente, cuatro, más preferentemente, cinco o más generaciones de retrocruces con el progenitor recurrente con la selección de los rasgos deseados, la descendencia será heterocigota con respecto a los loci (lugares) que controlan los rasgos transferidos, aunque será como el progenitor recurrente para la mayoría de, o para casi todos, los otros genes (ver, por ejemplo, la referencia de Poehlman & Sleper (1995): Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987): Principies of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376).

Estrategias de manejo de la resistencia de insectos (IRM) Roush et al., por ejemplo, reseña estrategias de dos toxinas, también denominadas "piramización" o "acumulación", para el manejo de cultivos transgénicos insecticidas (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).

En su página de Internet, la Agencia para la Protección Ambiental de los Estados Unidos de América (United States Environmental Protection Agency) (epa.gov/oppbppd 1 /biopesticides/pips/bt_com_refuge_2006. htm) publica los siguientes requisitos para la provisión de refugios no transgénicos (es decir, no B. t.) (una sección de cultivos/maíz no Bt) para el uso con cultivos transgénicos que producen una sola proteína de Bt activa contra plagas blanco.

"Los requisitos estructurados específicos para productos de maíz Bt con protección del perforador de maíz (Cry1 Ab o Cry1 F) son los siguientes: Refugios estructurados 20% refugio de maíz Bt no lepidóptero en región de maíz; 50% refugio de Bt no lepidóptero en región de algodón.

Bloques Interno (es decir, dentro del campo de Bt) Externo (es decir, campos separados dentro de los 804.5 m (½ milla) (402.25 m (¼ milla), si es posible) del campo de Bt a fin de maximizar el apareamiento aleatorio).

Franjas dentro del campo Las franjas deben tener por lo menos 4 filas de ancho (preferentemente, 6 filas) de manera de reducir los efectos del movimiento larval".

Además, la Asociación Nacional de los Estados Unidos de Agricultores del Maíz (National Corn Growers Association), en su página de Internet: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) proporciona asimismo pautas similares con respecto a los requisitos de refugio. Por ejemplo: "Requisitos del IRM del perforador de maíz: -Plantar por lo menos 20% del área de maíz para el refugio de híbridos -En regiones de producción de algodón, el refugio debe ser el 50% -La plantación debe ser dentro de los 804.5 m (1/2 milla) de los híbridos de refugio -El refugio puede plantarse como franjas dentro del campo de Bt; las franjas de refugio deben tener por lo menos 4 filas de ancho -El refugio puede tratarse con pesticidas convencionales solo si se alcanzan los umbrales económicos para insectos blanco -Los insecticidas pulverizables a base de Bt no pueden ser usados en el maíz de refugio -Debe plantarse refugio apropiado en todas las plantaciones con maíz Bt".

Como lo establecen Roush er al. (en las páginas 1780 y 1784, columna derecha, por ejemplo), la acumulación o piramización de dos proteínas diferentes, cada una, eficaz contra las plagas blanco y con escasa o nula resistencia cruzada, puede permitir el uso de un refugio menor. Roush sugiere que para una acumulación exitosa, un tamaño de refugio inferior al 10% de refugio puede proporcionar el manejo de la resistencia comparable a aproximadamente un 50% de refugio para un solo rasgo (no piramidal). Para los productos de maíz Bt piramidales actualmente en el mercado, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos requiere un refugio estructurado significativamente menor (en general, del 5%) de maíz no Bt plantado, que para productos de rasgos únicos (en general, del 20%).

Existen diversas formas de proporcionar los efectos de IRM de un refugio, que incluyen diversos patrones geométricos de plantación en los campos (como se menciona anteriormente) y mezclas de semillas en bolsa, como lo describen adicionalmente Roush et al. (supra), y la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6,551 ,962.

Los porcentajes anteriores, o relaciones de refugio similares, pueden usarse para las presentes pirámides o acumulaciones dobles o triples. Para las acumulaciones triples con tres modos de acción contra una sola plaga blanco, una meta sería cero refugio (o menos del 5% de refugio, por ejemplo). Este es el caso particular de las áreas comerciales -por ejemplo, de más de 4 ha (10 acres).

Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisionales y publicaciones referidas o citadas en esta solicitud se incorporan a modo de referencia en su totalidad, al alcance que no sean incoherentes con las descripciones explícitas de esta memoria descriptiva.

A menos que sea indicado o implicado específicamente, los términos "un", "una" y "el/la" significan "por lo menos uno/a", según se emplea en esta solicitud.

A continuación se presentan ejemplos que ilustran procedimientos para la puesta en práctica de la invención. Estos ejemplos no deben ser interpretados como limitaciones. Todos los porcentajes se expresan en peso, y todas las proporciones de mezclas de solventes se expresan en volumen, a menos que se observe lo contrario. Todas las temperaturas son en grados Celsius.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Síntesis de los Ejemplos Se proporcionan ejemplos que muestran que Vip3Ab1 es activa contra larvas de tipo silvestre de Spodoptera frugiperda (oruga combatiente de otoño), y contra una cepa recogida en el lugar de Spodoptera frugiperda hallada en Puerto Rico, que es resistente a la toxina de cristal de Bacillus thuringiensis CryI Fa. Esta información biológica fundamenta la utilidad de Vip3Ab1 para el empleo en el combate del desarrollo de resistencia a Cry en insectos, ya que los insectos que desarrollan resistencia a las toxinas CryI Fa continuarán siendo sensibles a la toxicidad de Vip3Ab1.

De modo similar, en Spodoptera frugiperda, CryI Fa radiomarcada con 125l se une a proteínas de receptor, y la unión puede ser desplazada usando CryI Fa no radiomarcada. Sin embargo, Vip3Ab1 no puede desplazar la unión de 125l CryI Fa de su receptor, en estos experimentos. Estos resultados indican que Vip3Ab1 tiene un sitio de unión único en comparación con CryI Fa. La capacidad de Vip3Ab1 para ejercer toxicidad contra insectos resistentes a CryI Fa surge de su no interacción demostrada en el sitio donde se unen estas toxinas. Se presenta información adicional que muestra que la naturaleza de la resistencia a CryI Fa en Spodoptera frugiperda se debe a la incapacidad de CryI Fa para la unión a BBMV preparadas a partir de este insecto. La actividad biológica de Vip3Ab1 contra larvas de S. frugiperda resistentes a CryI Fa que perdieron su capacidad de unión a CryI Fa fundamenta adicionalmente el sitio blanco no interactuante de Vip3Ab1 en comparación con CryI Fa.

EJEMPLO 2 Purificación v procesamiento de tripsina de proteínas CryI Fa y Vip3Ab1 Los genes que codifican las protoxinas CryI Fa y Vip3Ab1 se expresaron en cepas de expresión de Pseudomonas fluorescens, y se aislaron las proteínas de longitud completa como cuerpos de inclusión insolubles. Los cuerpos de inclusión lavados se solubilizaron mediante la agitación a 37°C en regulador que contenía regulador CAPS, 20 mM, pH 1 1 , + DTT, 10 mM, + 0.1 % 2-mercaptoetanol, durante 2 h. La solución se centrifugó a 27,000 x g durante 10 min a 37°C, y se trató el sobrenadante con 0.5% (p/v) de tripsina tratada con TCPK (Sigma). Esta solución se incubó con mezcla, durante 1 hora adicional, a temperatura ambiente, se filtró, luego se cargó en una columna Pharmacia Mono Q 1010 equilibrada con CAPS, 20 mM, pH 10.5. Después del lavado de la columna cargada con 2 volúmenes de columna de regulador, se eluyó la toxina truncada usando un gradiente lineal de 0 a 0.5 M NaCI en CAPS, 20 mM, en 15 volúmenes de columna con un caudal de 1.0 ml/min. Las proteínas Cry truncadas con tripsina purificadas eluyeron a aproximadamente 0.2-0.3 M de NaCI. La pureza de las proteínas fue controlada por SDS PAGE y con visualización usando colorante azul brillante de Coomassie. En algunos casos, las fracciones combinadas de la toxina purificada se concentraron y se cargaron en una columna Superóse 6 (1.6 cm de diámetro, 60 cm de largo), y se purificaron adicionalmente mediante la cromatografía de exclusión por tamaño. Las fracciones que comprendían un solo pico del peso molecular monómero se combinaron y se concentraron, a fin de obtener una preparación de más del 95% homogénea para una proteína que tenía un peso molecular de aproximadamente 60,000 kDa.

El procesamiento de Vip3Ab1 se logró de manera similar, iniciando con la proteína purificada de longitud completa de 85 kDa (DIG-307) proporcionada por Monte Badger. La proteína (12 mg) se dializó en regulador de fosfato de sodio, 50 mM, pH 8.4, y luego se procesó agregando 1 mg de tripsina sólida y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La solución se cargó en una columna de intercambio amónico MonoQ (1 cm de diámetro, 10 cm de largo), y se eluyó con un gradiente lineal de NaCI, de 0 a 500 mM en regulador de fosfato de sodio, 20 mM, pH 8.4, para 7 volúmenes de columna. La elución de la proteína se controló por SDS-PAGE. La banda principal procesada tuvo un peso molecular de 65 kDa, según lo determinado por SDS-PAGE usando guías de peso molecular para la comparación.

EJEMPLO 3 Bioensayos de insectos Las proteínas purificadas se ensayaron a fin de establecer la actividad insecticida en bioensayos llevados a cabo con larvas neonatas de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) alimentadas con una dieta artificial de insectos. Se recogieron las FAW resistentes a CryI F de los campos de maíz Herculex I (CryI Fa) en Puerto Rico, y se llevaron al insectario Dow AgroSciences Insectary para el cultivo continuo. La caracterización de esta cepa de FAW resistente se reseña en el informe interno de Schlenz, et al. (Schlenz et al., 2008).

Los bioensayos de insectos se llevaron a cabo en bandejas de bioensayo de plástico de 128 receptáculos (C-D International, Pitman, NJ). Cada receptáculo contenía 0.5 mi de dieta de lepidópteros de múltiples especies (Southland Products, Lake Village, AR). Se suministró una alícuota de 40 µ? de la proteína purificada Cry o Vip3Ab1 diluida a diversas concentraciones en CAPS, 10 mM, pH 10.5, o solución de control, por medio de una pipeta, a la superficie de dieta de 1.5 cm2 de cada receptáculo (26.7 µ?/cm2). Se ensayaron 16 receptáculos por muestra. El control negativo fue un control de solución reguladora que no contenía proteína. Los controles positivos incluyeron preparaciones de CryI F. Las bandejas tratadas se mantuvieron en una capucha de humo hasta que el líquido en la superficie de la dieta se evaporó o fue absorbido por la dieta.

Dentro de algunas horas de la eclosión, se recogieron larvas individuales con un cepillo humedecido de pelo de camello, y se depositaron en la dieta tratada, una larva por receptáculo. Los receptáculos infestados luego se sellaron con láminas adhesivas de plástico transparente, con orificios a fin de permitir el intercambio de gases (C-D International, Pitman, NJ). Las bandejas de bioensayo se mantuvieron en condiciones ambientales controladas (28°C, -40% HR, 16:8 [L:D] fotoperíodo). Después de 5 días, se registraron la cantidad total de insectos expuestos a cada muestra de proteína, la cantidad de insectos muertos y el peso de insectos sobrevivientes.

EJEMPLO 4 Yodación de toxinas CrylFa Se ha informado que la yodación de CryI F destruye tanto la toxicidad como la capacidad de unión de esta proteína cuando es ensayada contra las larvas de lombrices del brote del tabaco y BBMV preparadas a partir de estos insectos (Luo et al., 1999; Sheets and Storer, 2001 ). La inactivación se debe supuestamente a la necesidad de residuos tirosina no modificados cerca de su sitio de unión. Cuando Cry F fue yodado usando el método de cuentas de yodo, la proteína perdió toda su capacidad de exhibir características de unión especifica usando BBMV de H. virescens. Empleando Nal no radiomarcado para yodar CryI F utilizando el método de cuentas de yodo, la CryI F yodada también perdió su actividad insecticida contra H. virescens.

Los estudios previos en nuestros laboratorios demostraron que CryI Fa pudo ser fluorescentemente marcada usando reactivos de marcado conjugados con maleimida que alquilan específicamente proteínas en residuos cisteína. Debido a que la toxina núcleo de tripsina CryI Fa contiene un solo residuo cisteína en la posición 205, el marcado de la proteína con dicho reactivo logrará la alquilación de la proteína en un solo sitio específico. Se determinó que CryI Fa pudo ser marcado fluorescentemente con fluoresceína-5-maleimida, y que la proteína marcada retenía la actividad insecticida. Sobre la base de la retención de la actividad biológica de la cisteína CryI Fa marcada con fluoresceína, se determinó que también podríamos radioyodar la porción de fluoresceína de la marca, por el método de Palmer et al. (Palmer et al., 1997), y adjuntarla a la cisteína de CryI Fa y tener una CryI Fa radiomarcada que retiene la actividad biológica.

Se disolvió fluoresceína-5-maleimida a 10 mM (4.27 mg/ml) en DMSO, y luego se diluyó a 1 mM en PBS, según lo determinado por su coeficiente de extinción molar de 68,000 M~1cm"1. A una solución de 70 µ? de PBS que contenía dos cuentas de yodo, se agregaron 0.5 mCi de Na125l detrás de un escudo de plomo. La solución se dejó en mezcla a temperatura ambiente durante 5 min, y luego se agregaron 10 µ? de la fluoresceína-5-maleimida, 1 mM. Los reactivos se dejaron reaccionar durante 10 min, y luego se removieron de las cuentas de yodo. A la solución reaccionada se agregaron 2 pg de toxina núcleo CryI Fa truncada con tripsina altamente purificada en PBS. La proteína se incubó con la solución yodada de fluoresceína-5-maleimida durante 48 h a 4°C. La reacción se detuvo mediante la adición de 2-mercapto etanol a 14 mM. La mezcla de reacción luego se agregó a una columna espín Zebra equilibrada en CAPS, 20 mM, KCI, 150 mM, pH 9, y se centrifugó a 1500 x g durante 2 min a fin de separar el colorante yodado no reaccionado de la proteína. La fluoresceína-Cryl Fa 125l radiomarcada se sometió al recuento en un contador gamma a fin de establecer su actividad específica, determinada sobre la base de una recuperación asumida del 80% de la toxina de entrada. Además, la proteína se caracterizó por SDS-PAGE y se visualizó por medio de la imagen de fósforo, de modo de garantizar que la radiactividad medida se asociaba covalentemente con la proteína CryI Fa.

EJEMPLO 5 Preparación y fraccionación de BBMV solubilizadas Se emplearon métodos convencionales de cuantificación de proteína y SDS-electroforesis de gel de poliacrilamida como se describe, por ejemplo, en la referencia de Sambrook et al. (Sambrook and Russell, 2001 ) y sus actualizaciones. Se sometió al ayuno de una noche a larvas de la última crisálida de S. frugiperda, y luego se disecaron las larvas después del enfriamiento en hielo durante 15 minutos. Se extrajo el tejido de la zona embrionaria del tubo digestivo de la cavidad corporal, dejando atrás la parte posterior del canal alimenticio adjunto al integumento. La zona embrionaria del tubo digestivo se colocó en un volumen 9 X de regulador helado de homogeneización (manitol, 300 mM, EGTA, 5 mM, base Tris, 17 mM, pH 7.5), suplementado con cóctel de inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich P-2714) diluido según lo recomendado por el proveedor. El tejido se homogenizó con 15 golpes de un homogeneizador de tejido de vidrio. Se prepararon BBMV por el método de precipitación de MgC de Wolfersberger (Wolfersberger, 1993). En resumen, se mezcló un volumen equivalente de una solución, 24 mM, de MgCI2 en manitol, 300 mM, con el homogenado de la zona embrionaria del tubo digestivo, y la mezcla se agitó durante 5 minutos y luego se dejó reposar en hielo durante un período de 15 min. La solución se centrifugó a 2500 x g un lapso de tiempo de 15 min a 4°C. Se reservó el sobrenadante, y la miniesfera se suspendió en el volumen original de regulador de homogeneización diluido 0.5 X y se centrifugó nuevamente. Los dos sobrenadantes se combinaron y se centrifugaron a 27,000 x g durante 30 min a 4°C, a fin de formar la fracción de BBMV. La miniesfera se suspendió en regulador de almacenamiento de BBMV (HEPES, 10 mM, KCI, 130 mM, glicerol al 10%, pH 7.4) a una concentración de alrededor de 3 mg/ml de proteína. La concentración de proteína se determinó usando BSA como guía.

Se determinó la actividad de L-leucina-p-nitroanilida aminopeptidasa (una enzima marcadora para la fracción BBMV) antes de la congelación de las muestras. En resumen, se agregaron 50 µ? de L-leucina-p-nitroanilida (1 mg/ml en PBS) a 940 mi de Tris, 50 mM, HCI, en una probeta convencional. La probeta se colocó en un espectrofotometro Cary 50 Bio, se reguló a cero para la lectura de absorbancia a 405 nm, y la reacción se inició mediante la adición de 10 µ? o bien de homogenado de la zona embrionaria del tubo digestivo de insecto, o de preparación de BBMV de insecto. Se controló el incremento en la absorbancia a 405 nm durante 5 minutos a temperatura ambiente. La actividad específica de las preparaciones de homogenado y BBMV se determinó sobre la base de la cinética del incremento de absorbancia en función del tiempo, durante un incremento lineal en la absorbancia por unidad de proteína total agregada al ensayo, sobre la base de la siguiente ecuación: AOD/(min*mg) = índice de aminopeptidasa (AOD/ml*min)/ [proteína] (mg/ml).

La actividad específica de esta enzima típicamente incrementó 7 veces, en comparación con aquella hallada en la fracción inicial de homogenado de la zona embrionaria del tubo digestivo. Las BBMV se dividieron en alícuotas en muestras de 250 µ?, se congelaron instantáneamente en N2 líquido y se almacenaron a -80°C.

EJEMPLO 6 Electroforesis El análisis de proteínas por SDS-PAGE se llevó a cabo en condiciones reductoras (es decir, en 5% de ß-mercaptoetanol, BME) y desnaturalizantes (es decir, calentadas 5 minutos a 90° en presencia de SDS (dodecilsulfato sódico) al 4%). Las proteínas se cargaron en receptáculos de un gel al 4% al 20% de tris-glicina poliacrilamida (BioRad; Hercules, CA) y se separaron a 200 voltios durante 60 minutos. Las bandas de proteína se detectaron mediante la tinción con azul brillante de Coomassie Brilliant Blue R-250 (BioRad) durante una hora, y se destiñeron con una solución de metanol al 5% en ácido acético al 7%. Se tomaron imágenes de los geles, y se analizaron usando un instrumento de análisis de imágenes BioRad Fluro-S Multi Imager™. Los pesos moleculares relativos de las bandas de proteína se determinaron mediante la comparación con las movilidades de proteínas de pesos moleculares conocidos en una muestra de BenchMark™ Protein Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA) cargada en un receptáculo del gel.

EJEMPLO 7 Imágenes Se determinaron la radiopureza de las proteínas Cry yodadas y la medición de CryI Fa radiactiva en ensayos para determinar la interacción física entre dos o más proteínas {pulí dowrí) por SDS-PAGE e imágenes de fósforo. En resumen, se tomaron imágenes de geles de SDS-PAGE mediante la envoltura de los geles en una película de Mylar (12 pm de espesor), luego de la separación y fijación de la proteína, a continuación, la exposición del gel bajo una pantalla de fósforo de almacenamiento Molecular Dynamics (35 cm x 43 cm) durante por lo menos una noche, y hasta 4 días. Las placas se desarrollaron usando un instrumento de toma de imágenes de fósforo Molecular Dynamics Storm 820, y la imagen se analizó empleando el programa informático ImageQuant™.

EJEMPLO 8 Síntesis de los resultados Los resultados de la mortalidad de los bioensayos de la proteína de longitud completa Vip3Ab1 ensayada en una diversidad de dosis contra las larvas de tipo silvestre y resistentes a Cry1 Fa de S. frugiperda se muestran en la Figura 1. Contra las larvas de tipo silvestre de S. frugiperda, obtuvimos 100% de mortalidad en la concentración más alta ensayada (9000 ng/cm2), y niveles menores de mortalidad, en dosis más bajas. Se estimó que el valor LC-50 fue de aproximadamente 2000 ng/cm2. Vip3Ab1 fue altamente eficaz contra S. frugiperda en la inhibición del crecimiento de las larvas, con más del 95% de inhibición del crecimiento en concentraciones de 1000 ng/cm2 y superiores. El alto nivel de inhibición de crecimiento observado para ambas larvas de S. frugiperda sugiere que estos insectos muy probablemente avanzarán hasta la mortalidad, si se dejan durante un período de tiempo mayor.

Se condujo además un bioensayo a fin de comparar la actividad biológica de Vip3Ab1 contra S. frugiperda de tipo silvestre, en comparación con S. frugiperda resistente a Cry Fa (Figura 1 ). El porcentaje de inhibición de crecimiento se indica por medio de las barras verticales, y el porcentaje de mortalidad, por medio de los símbolos de diamantes. La mortalidad medida 5 días luego de la exposición a la toxina fue inferior al 50% para ambos tipos de insectos, en todas las concentraciones ensayadas. Se obtuvo una clara respuesta a la dosis para la inhibición del crecimiento. Vip3Ab1 logró >95% de inhibición del crecimiento larval, tanto de larvas de S. frugiperda sensibles a Cryi Fa como de aquellas resistentes a Cryi Fa, en concentraciones superiores a 1000 ng/cm2, y logró una inhibición de aproximadamente el 50% de crecimiento larval de la S. frugiperda de tipo silvestre en una concentración de aproximadamente 40 ng/cm2. Vip3Ab1 logró una inhibición del crecimiento de más del 50% de S. frugiperda resistente a Cryi Fa en todas las concentraciones ensayadas, hasta la menor, de 4.1 ng/cm2. Por lo tanto, Vip3Ab1 tiene alta actividad contra larvas de S. frugiperda resistentes a Cryi Fa.

Se condujeron replicaciones de bíoensayos adicionales para generar concentraciones letales (LC50), concentraciones de inhibición de crecimiento mediano. El cuadro 2 muestra (GI50) y 95% de intervalos de confianza de Spodoptera frugiperda susceptible a CryI F y Spodoptera frugiperda resistente a Cry1 F para Vip3Ab1 comparada con los controles.

CUADRO 2 Se condujeron ensayos de unión de competición radiomarcados a fin de determinar si Vip3Ab1 interactúa en el mismo sitio que CryI Fa se une en FAW. Se desarrolló un ensayo de competición a fin de medir la capacidad de Vip3Ab para competir con la unción de CryI Fa marcada con 125l. La Figura 2 muestra la imagen de fósforo de CryI Fa radiactiva separada por SDS-PAGE luego de la unión a proteínas BBMV. En ausencia de cualquier ligando de competición, 125l CryI Fa puede detectarse asociada con la proteína BBMV. Cuando se incuba en presencia de 1000 nM de CryI Fa no marcada (exceso de 500 veces en comparación con la concentración de proteína marcada utilizada en el ensayo), se detecta muy poca radiactividad correspondiente a 25l CryI Fa. Por lo tanto, este resultado muestra que la CryI Fa no marcada compite efectivamente con la CryI Fa radiomarcada, por la unión a las proteínas de receptor, como es esperado, ya que estas proteínas homologas se unen al mismo sitio. Cuando se conduce el mismo experimento usando 1000 nM de proteína no marcada Vip3Ab1 como la proteína de competición, no observamos cambio en el nivel de unión de 125l CryI Fa a las proteínas BBMV de S. frugiperda, lo que indica que Vip3Ab1 no compite con la unión de 125l CryI Fa. Este resultado se interpreta de modo de indicar que Vip3Ab1 no se une en el mismo sitio que CryI Fa.

Los insectos pueden desarrollar resistencia a la toxicidad de proteínas Cry a través de una cantidad de diferentes mecanismos bioquímicos, si bien el mecanismo más común se debe a una reducción en la capacidad de la proteína de toxina Cry para la unión a su receptor específico en el intestino del insecto (Heckel et al., 2007; Tabashnik et al., 2000; Xu et al., 2005). Esto puede producirse a través de pequeñas mutaciones puntuales, deleciones de genes grandes, o a través de otros mecanismos genéticos o bioquímicos. Cuando investigamos las proteínas BBMV de S. frugiperda resistente a CryI Fa para comprender la naturaleza de su resistencia a Cry Fa, descubrimos que BBMV preparadas a partir de insectos resistentes a CryI Fa eran mucho menos capaces de unión a CryI Fa radiomarcada con 125l, en comparación con BBMV preparadas a partir de los insectos de tipo silvestre (Figura 3). Por lo tanto, el mecanismo de resistencia a CryI Fa en S. frugiperda se debe a un nivel de unión reducido en gran medida, de CryI Fa a BBMV de los insectos resistentes. Debido a que mostramos, en la Figura 2, que Vip3Ab1 no compite con la unión de CryI Fa, esto demuestra, además, que la Vip3Ab1 no debería ser afectada por un mecanismo de resistencia involucrado con la unión de CryI Fa a su receptor específico. Esto es demostrado en los bioensayos. En consecuencia, Vip3Ab1 complementa la actividad de CryI Fa, en términos de que tiene actividad biológica contra insectos similares, y sin embargo, no se une a los mismos sitios de receptor que estas proteínas Cry, y por lo tanto, no es afectada por los mecanismos de resistencia que involucrarían la reducción de la unión de toxina Cry. Concluimos, a partir de estos estudios, que Vip3Ab1 es una excelente toxina de insecto para combinar con CryI Fa como un enfoque de manejo de resistencia de insectos a fin de proporcionar actividad biológica contra insectos que pueden haber desarrollado resistencia a cualquiera de estas proteínas, y además, evitar insectos resistentes.

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APENDICE A Listado de delta-endotoxinas - de la página de Internet de Crickmore et al. (citada en la solicitud) El Número de Acceso es a la entrada del NCBI (Centro Nacional de Información sobre Biotecnología de los Estados Unidos).

Denominación Acc. Nro. Autores Año Cepa fuente Observación Crv1Aa1 AAA22353 Schnepf et al 1985 Bt kurstakl HD1 Crv1Aa2 AAA22552 Shibano et al 1985 Bt sotto Crv1Aa3 BAA00257 Shimizu et al 1988 Bt aizawai IPL7 Cry1Aa4 CAA31886 Masson et al 1989 Bt entomocidus Udayasuriyan et Crv1Aa5 BAA04468 1994 Bt Fu-2-7 al Bt kurstaki NRD- Crv1Aa6 AAA86265 Masson et al 1994 12 Crv1Aa7 AAD46139 Osman et al 1999 Bt C12 Sólo secuencia Cry1Aa8 126149 Liu 1996 de ADN Bt dendrolimus Crv1 Aa9 BAA77213 Nagamatsu et al 1999 T84A1 Bt kurstaki HD- Crv1Aa10 AAD55382 Hou and Chen 1999 1-02 Crv1Aa1 1 CAA70856 Tounsi et al 1999 Bt kurstaki Crv1Aa12 AAP80146 Yao et al 2001 Bt Ly30 Crv1Aa13 AAM44305 Zhong et al 2002 Bt sotto Crv1Aa14 AAP40639 Ren et al 2002 no publicada Crv1Aa15 AAY66993 Sauka et al 2005 Bt lNTA Mol-12 Crv1Ab1 AAA22330 Wabiko et al 1986 Bt berliner 1715 Crv1Ab2 AAA22613 Thorne et al 1986 Bt kurstaki Crv1Ab3 AAA22561 Geiser et al 1986 Bt kurstaki HD1 Crv1Ab4 BAA00071 Kondo et al 1987 Bt kurstaki HD1 Crv1Ab5 CAA28405 Hofte et 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B-Pr-88 CrylDd ABK35074 Lertwiriyawong et ^QQQ al Bt JC291 Crv1Ea1 CAA37933 Visseretal 1990 Bt kenyae 4F1 Crv1Ea2 CAA39609 Bosseetal 1990 Bt kenyae Crv1Ea3 AAA22345 Feitelson 1991 Bt kenyae PS81F Barboza-Corona Crv1Ea4 AAD04732 Bt kenyae LBIT- 1998 et al 147 Crv1Ea5 A15535 Botterman et al 1994 Sólo secuencia de ADN Crv1Ea6 AAL50330 Sun et al 1999 Bt YBT-032 Crv1Ea7 AAW72936 Huehne et al 2005 Bt JC190 Crv1Ea8 ABX11258 Huang et al 2007 Bt HZM2 Cry1Eb1 AAA22346 Feitelson Bt aizawai 1993 PS81A2 Crv1Fa1 Bt aizawai AAA22348 Chambers et al EG6346 Crv1Fa2 AAA22347 Feitelson 1993 Btaizawai PS81I Crv1Fb1 CAA80235 Lambert 1993 Bt BTS00349A Crv1Fb2 BAA25298 Bt morrisoni Masuda & Asano 1998 INA67 Crv1Fb3 AAF21767 Song et al 1998 Bt morrisoni Crv1Fb4 AAC10641 Payneetal 1997 Crv1Fb5 AA013295 L¡ et al 2001 Bt B-Pr-88 Crv1Fb6 ACD50892 Huang et al 2008 Bt012 Crv1Fb7 ACD50893 Huang et al 2008 Bt 087 Crv1Ga1 CAA80233 Lambert 1993 Bt BTS0349A Crv1Ga2 CAA70506 Shevelevetal 1997 Bt wuhanensis Crv1Gb1 AAD10291 Kuo&Chak 1999 Bt wuhanensis HD525 Crv1Gb2 AA013756 Lietal 2000 Bt B-Pr-88 CrvlGc AAQ52381 Baumetal 2003 Crv1Ha1 CAA80236 Lambert 1993 Bt BTS02069AA Crv1Hb1 AAA79694 Koo et al 1995 Bt morrisoni BF190 TipoCrvlH AAF01213 Srifahetal 1999 Bt JC291 secuencia insuficiente Crv1la1 CAA44633 Tailoretal 1992 Bt kurstaki Crv1la2 AAA22354 Gleaveetal 1993 Bt kurstaki Crv1la3 AAC36999 Shin et al 1995 Bt kurstaki HD1 Crv1la4 AAB00958 Kostichka et al 1996 Bt AB88 Crv1la5 CAA70124 Selvapandiyan 1996 Bt61 Crv1la6 AAC26910 Zhong etal 1998 Bt kurstaki S101 Crv1la7 AAM73516 Porcaretal 2000 Bt Crv1la8 AAK66742 Song et al 2001 Crv1la9 AAQ08616 Yao etal 2002 Bt Ly30 Crv1la10 AAP86782 Espindola et al 2003 Bt thuringiensis Crv1la11 CAC85964 Tounsi et al 2003 Bt kurstaki BNS3 Crv1la12 AAV53390 Grossi de Sa et al 2005 Bt Crv1la13 ABF83202 Martins et al 2006 Bt Crv1la14 ACG63871 Liu & Guo 2008 Bt11 Cry1la15 FJ617445 GuanPengetal 2009 Bt E-1B Sin enlace NCBI julio 2009 Cry1la1S FJ617448 GuanPengetal 2009 Bt E-1A Sin enlace NCBI julio 2009 Crv1lb1 AAA82114 Shin etal 1995 Bt entomocidus BP465 Crv1lb2 ABW88019 Guan etal 2007 Bt PP61 Crv1lb3 ACD75515 Liu & Guo 2008 Bt GS8 Crvlld AAC62933 Osman et al 1998 BtC18 Crv1lc2 AAE71691 Osman et al 2001 Crv1ld1 AAD44366 Choi 2000 Crv1le1 AAG43526 Song et al 2000 Bt BTC007 Crv1lf1 AAQ52382 Baumetal 2003 Tipo Crvll AAC31094 Payneetal 1998 secuencia insuficiente Tipo Cryl l ABG88859 Lin & Fang 2006 Bt Iy4a3 secuencia insuficiente CrvUal AAA22341 Donovan 1994 Bt EG5847 CrvUbl 1994 Bt EG5092 CrvUd AAC31092 Payne et al 1998 Crv1Jc2 AAQ52372 Baum et al 2003 CrvUdl CAC50779 Arnaut et al 2001 Bt Crv1 Ka1 AAB00376 Koo et al Bt morrisoni 1995 BF190 Crv1 La1 AAS60191 Je et al 2004 Bt kurstaki K1 Tipo Cry1 AAC31091 Payne et al 1998 secuencia insuficiente Cry2Aa1 AAA22335 Donovan et al 1989 Bt kurstaki Cry2Aa2 Widner & AAA83516 1989 Whiteley Bt kurstaki HD1 Cry2Aa3 D86064 Sasaki et al 1997 Bt sotto Sólo secuencia de ADN Cry2Aa4 AAC04867 Misra et al 1998 Bt kenyae HD549 Crv2Aa5 CAA10671 Yu & Pang 1999 Bt SL39 Cry2Aa6 CAA 10672 Yu & Pang 1999 Bt YZ71 Cry2Aa7 CAA 10670 Yu & Pang 1999 Bt CY29 Cry2Aa8 AA013734 Wei et al 2000 Bt Dongbei 66 Cry2Aa9 AAO13750 Zhang et al 2000 Cry2Aa10 AAQ04263 Yao et al 2001 Crv2Aa1 1 AAQ52384 Baum et al 2003 Crv2Aa12 ABI83671 Tan et al 2006 Bt Rpp39 Crv2Aa13 ABL01536 Arango et al 2008 Bt 146-158-01 Crv2Aa1 ACF04939 Hire et al 2008 Bt HD-550 Crv2Ab1 Widner & AAA22342 Whiteley 1989 Bt kurstaki HD1 Crv2Ab2 CAA39075 Dankocsik et al 1990 Bt kurstaki HD1 Crv2Ab3 AAG36762 Chen et al 1999 Bt BTC002 Cry2Ab4 AA013296 Li et al 2001 Bt B-Pr-88 Crv2Ab5 AAQ04609 Yao et al 2001 Bt Iy30 Crv2Ab6 AAP59457 Wang et al 2003 Bt WZ-7 Crv2Ab7 Udayasuriyan et AAZ66347 2005 Bt 14-1 al Crv2Ab8 ABC95996 Huang et al 2006 Bt WB2 Crv2Ab9 ABC74968 Zhang et al 2005 Bt LLB6 Crv2Ab10 EF157306 Lin et al 2006 Bt LyD Crv2Ab1 1 CAM84575 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT1 Crv2Ab12 ABM21764 Lin et al 2007 Bt LyD Crv2Ab13 ACG76120 Zhu et al 2008 Bt ywc5-4 Crv2Ab14 ACG76121 Zhu et al 2008 Bt Bts Crv2Ac1 CAA40536 Aronson 1991 Bt Shanghai S1 Crv2Ac2 AAG35410 Song et al 2000 Crv2Ac3 AAQ52385 Baum et al 2003 Crv2Ac4 ABC95997 Huang et al 2006 Bt WB9 Crv2Ac5 ABC74969 Zhang et al 2005 Crv2Ac6 ABC74793 Xia et al 2006 Bt wuhanensis Crv2Ac7 CAL18690 Saleem et al 2008 Bt SBSBT-1 Crv2Ac8 CAM09325 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT1 Crv2Ac9 CAM09326 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT2 Crv2Ac10 ABN 15104 Bai et al 2007 Bt QCL-1 Crv2Ac11 CA 83895 Saleem et al 2007 Bt HD29 Crv2Ac12 CA 83896 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT3 Crv2Ad1 AAF09583 Choi et al 1999 Bt BR30 Crv2Ad2 ABC86927 Huang et al 2006 Bt WB10 Crv2Ad3 CAK29504 Saleem et al 2006 Bt 5_2AcT(1 ) Crv2Ad4 CAM32331 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT2 Crv2Ad5 CA078739 Saleem et al 2007 Bt HD29 Crv2Ae1 AAQ52362 Baum et al 2003 Crv2Af1 ABO30519 Beard et al 2007 Bt C81 Crv2Aq ACH91610 Z u et al 2008 Bt JF19-2 Cry2Ah EU939453 Zhang et al 2008 Bt Sin enlace NCBI julio 09 Crv2Ah2 ACL80665 Zhang et al 2009 Bt BRC-ZQL3 Cry2Ai Udayasuriyan et FJ788388 2009 Bt Sin enlace NCBI al julio 09 Crv3Aa1 AAA22336 Herrnstadt et al 1987 Bt san diego Crv3Aa2 AAA22541 Sekar et al 1987 Bt tenebrionis Crv3Aa3 CAA68482 Hofte et al 1987 Crv3Aa4 AAA22542 McPherson et al 1988 Bt tenebrionis Crv3Aa5 AAA50255 Donovan et al Bt morrisoni 1988 EG2158 Crv3Aa6 AAC43266 Adams et al 1994 Bt tenebrionis Crv3Aa7 CAB4141 1 Zhang et al 1999 Bt 22 Crv3Aa8 AAS79487 Gao and Cai 2004 •Bt YM-03 Crv3Aa9 AAW05659 Bulla and Candas 2004 Bt UTD-001 Crv3Aa10 AAU2941 1 Chen et al 2004 Bt 886 Crv3Aa1 1 AAW82872 Kurt et al 2005 Bt tenebrionis Mm2 Crv3Aa12 ABY49136 Sezen et al 2008 Bt tenebrionis Crv3Ba1 CAA34983 Sick et al 1990 Bt tolworthi 43F Crv3Ba2 CAA00645 Peferoen et al 1990 Bt PGSI208 Crv3Bb1 AAA22334 Donovan et al 1992 Bt EG4961 Crv3Bb2 AAA74198 Donovan et al 1995 Bt EG51 4 Crv3Bb3 115475 Peferoen et al 1995 Sólo secuencia de ADN Crv3Ca1 CAA42469 Lambert et al Bt kurstaki 1992 BU109P Crv4Aa1 CAA68485 Ward & Ellar 1987 Bt israelensis Crv4Aa2 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L366 Crv5Ba1 AAA68598 Foncerrada & Narva 1997 Bt PS86Q3 Crv5Ba2 ABW88932 Guo et al 2008 YBT 1518 Crv6Aa1 AAA22357 Narva et al 1993 Bt PS52A1 Crv6Aa2 AA 46849 Bai et al 2001 YBT 1518 Crv6Aa3 ABH03377 Jia et al 2006 Bt 96418 Crv6Ba1 AAA22358 Narva et al 1991 Bt PS69D1 Crv7Aa1 AAA22351 Lambert et al Bt galleriae 1992 PGSI245 Crv7Ab1 AAA21 120 Narva & Fu 1994 Bt dakota HD511 Bt Crv7Ab2 AAA21 121 Narva & Fu 1994 kumamotoensis 867 Crv7Ab3 ABX24522 Song et al 2008 Bt WZ-9 Cry7Ab4 EU380678 Shu et al 2008 Bt Sin enlace NCBI julio 09 Crv7Ab5 Bt monterrey ABX79555 ^?|GGß-?G?°?3 et 2008 GM-33 Crv7Ab6 ACI44005 Deng et al 2008 Bt HQ122 Cry7Ab7 FJ940776 Wang et al 2009 Sin enlace NCBI septiembre 09 Cry7Ab8 GU145299 Feng Jing 2009 Sin enlace NCBI noviembre 09 Crv7Ba1 ABB70817 Zhang et al Bt 2006 huazhongensis Crv7Ca1 ABR67863 Gao et al 2007 Bt BTH-13 Crv7Da1 ACQ99547 Y¡ et al 2009 Bt LH-2 Crv8Aa1 AAA21117 Narva & Fu Bt 1992 kumamotoensis Cry8Ab1 EU044830 Cheng et al 2007 Bt B-JJX Sin enlace NCBI julio 09 Crv8Bal AAA21 1 18 Narva & Fu Bt 1993 kumamotoensis Crv8Bb1 CAD57542 Abad et al 2002 Crv8Bc1 CAD57543 Abad et al 2002 Crv8Ca1 AAA21 1 19 Sato et al. 1995 Bt japonensis Buibui Crv8Ca2 AAR98783 Shu et al 2004 Bt HBF-1 Cry8Ca3 EU625349 Du et al 2008 Bt FTL-23 Sin enlace NCBI julio 09 Crv8Da1 BAC07226 Asano et al 2002 Bt galleriae Crv8Da2 BD133574 Asano et al 2002 Bt Solo secuencia de ADN Crv8Da3 BD133575 Asano et al 2002 Bt Solo secuencia de ADN Crv8Db1 BAF93483 Yamaguchi et al 2007 Bt BBT2-5 Crv8Ea1 AAQ73470 Fuping et al 2003 Bt 185 Cry8Ea2 EU047597 Liu et al 2007 Bt B-DLL Sin enlace NCBI julio 09 Crv8Fa1 AAT48690 Shu et al 2004 Bt 185 además, AAW81032 Crv8Ga1 AAT46073 Shu et al 2004 Bt HBF-18 Crv8Ga2 ABC42043 Yan et al 2008 Bt 145 Sin enlace NCBI Cry8Ga3 FJ198072 Xiaodong et al 2008 Bt FCD114 julio 09 Sin enlace NCBI Cry8Ha1 EF465532 Fuping et al 2006 Bt 185 julio 09 Sin enlace NCBI Cry8la1 EU381044 Yan et al 2008 Bt su4 julio 09 Cry8Ja1 Sin enlace NCBI EU625348 Du et al 2008 Bt FPT-2 julio 09 Cry8Ka1 Sin enlace NCBI FJ422558 Quezado et al 2008 julio 09 Crv8Ka2 ACN87262 Noguera & Ibarra 2009 Bt kenyae Tioo Crv8 FJ770571 Noguera & Ibarra 2009 Sólo secuencia Bt canadensis de ADN Tioo Crv8 ABS53003 Mangena et al 2007 Bt Cry9Aa1 CAA41 122 Shevele et al 1991 Bt galleriae Crv9Aa2 CAA41425 Gleave et al 1992 Bt DSIR517 Sin enlace NCBI Cry9Aa3 GQ249293 Su et al 2009 Bt SC5(D2) julio 09 Cry9Aa4 GQ249294 Su et al Sin enlace NCBI 2009 Bt T03C001 julio 09 Tioo Crv9Aa AAQ52376 Baum et al secuencia 2003 incompleta Crv9Ba1 CAA52927 Shevele et al 1993 Bt galleriae Crv9Bb1 AAV28716 SNva-Wemeck et 2004 Bt japonensis al Crv9Ca1 CAA85764 Lambert et al 1996 Bt tolworthi Crv9Ca2 AAQ52375 Baum et al 2003 Bt japonensis Crv9Da1 BAA19948 Asano 1997 N141 Crv9Da2 AAB97923 Wasano & Ohba 1998 Bt japonensis Sin enlace NCBI Cry9Da3 GQ249295 Su et al 2009 Bt T03B001 julio 09 Sin enlace NCBI Cry9Da4 GQ249297 Su et al 2009 Bt T03B001 julio 09 Bt kurstaki Crv9Db1 AAX78439 A ^íba"d"39*" & 2005 DP1019 Bt aizawai SSK- Crv9Ea1 BAA34908 Midoh & Oyama 1998 10 Crv9Ea2 AAO12908 Li et al 2001 Bt B-Hm-16 Crv9Ea3 ABM21765 Lin et al 2006 Bt lyA Crv9Ea4 ACE88267 Zhu et al 2008 Bt ywc5-4 Crv9Ea5 ACF04743 Zhu et al 2008 Bts Crv9Ea6 ACG63872 Liu & Guo 2008 Bt 1 1 Sin enlace NCBI Cry9Ea7 FJ380927 Sun et al 2008 julio 09 Cry9Ea8 GQ249292 Su et al 2009 GQ249292 Sin enlace NCBI julio 09 Crv9Eb1 CAC50780 Arnaut et al 2001 Cry9Eb2 Sin enlace NCBI GQ249298 Su et al 2009 Bt T03B001 julio 09 Crv9Ec1 AAC63366 Wasano et al 2003 Bt galleriae Crv9Ed1 Bt kurstaki AAX78440 ^™393" & 2005 Abad DP1019 Cry9Ee1 Sin enlace NCBI GQ249296 Su et al 2009 Bt T03B001 agosto 09 Tipo Crv9 secuencia AAC63366 Wasano et al 1998 Bt galleriae insuficiente Crv10Aa1 AAA226 4 Thorne et al 1986 Bt israelensis Crv10Aa2 E00614 Bt israelensis Aran & Toomasu 1996 Sólo secuencia ONR-60A de ADN Cry10Aa3 CAD30098 Berry et al 2002 Bt israelensis Mahalakshmi et Tipo Cryl OA DQ167578 secuencia 2006 Bt LDC-9 al incompleta Crv1 1 Aa1 AAA22352 Donovan et al 1988 Bt israelensis Crv1 1Aa2 AAA2261 1 Adams et al 1989 Bt israelensis Crv1 1Aa3 CAD30081 Berry et al 2002 Bt israelensis Mahalakshmi et Tipo Cry1 1Aa DQ166531 secuencia 2007 Bt LDC-9 al incompleta Bt jegathesan Crv11 Ba1 CAA60504 Delecluse et al 1995 367 Crv1 1 Bb1 AAC97 62 Orduz et al 1998 Bt medellin Crv12Aa1 AAA22355 Narva et al 1991 Bt PS33F2 Cry13Aa1 AAA22356 Narva et al 1992 Bt PS63B Crv14Aa1 AAA21516 Narva et al 1994 Bt sotto PS80JJ1 Crv15Aa1 AAA22333 Brown & Whiteley 1992 Bt thompsoni Cb malaysia Crv16Aa1 CAA63860 Barloy et al 1996 CH18 Crv17Aa1 CAA67841 Cb malaysia Barloy et al 1998 CH18 Paenibacillus Crv18Aa1 CAA67506 Zhang et al 1997 popilliae Crv18Ba1 Paenibacillus AAF89667 Patel et al 1999 popilliae Cry18Ca1 Paenibacillus AAF89668 Patel et al 1999 popilliae Rosso & Bt jegathesan Crv19Aa1 CAA68875 1996 Delecluse 367 Crv19Ba1 BAA32397 Hwang et al 1998 Bt higo Crv20Aa1 AAB93476 Lee & Gilí 1997 Bt fukuokaensis Cry20Ba1 ACS93601 Noguera & Ibarra 2009 Bt higo LBIT-976 Tipo Cry20 GQ144333 Yi et al 2009 Sólo secuencia Bt Y-5 de ADN Crv21Aa1 I32932 Payne et al Solo secuencia 1996 de ADN Sólo secuencia Crv21 Aa2 I66477 Feitelson 1997 de ADN Crv21 Ba1 BAC06484 Sato & Asano 2002 Bt roskildiensis Sólo secuencia Crv22Aa1 I34547 Payne et al 1997 de ADN Crv22Aa2 CAD43579 Isaac et al 2002 Bt Crv22Aa3 ACD9321 1 Du et al 2008 Bt FZ- Crv22Ab1 AAK50456 Baum et al 2000 Bt EG4140 Crv22Ab2 CAD43577 Isaac et al 2002 Bt Crv22Ba1 CAD43578 Isaac et al 2002 Bt Binario con Crv23Aa1 AAF76375 Donovan et al 2000 Bt Cry37Aa1 Crv24Aa1 AAC61891 Kawalek and Gill 1998 Bt jegathesan Crv24Ba1 BAD32657 Ohgushi et al 2004 Bt sotto Crv24Ca1 CAJ43600 Beron & Salerno 2005 Bt FCC-41 Crv25Aa1 AAC61892 Kawalek and Gill 1998 Bt jegathesan Wojciechowska Bt finitimus B- Crv26Aa1 AAD25075 1999 et al 1 166 Crv27Aa1 BAA82796 Saitoh 1999 Bt higo Wojciechowska Bt finitimus B- Crv28Aa1 AAD24189 1999 et al 1 161 Crv28Aa2 AAG00235 Moore and Debro 2000 Bt finitimus Crv29Aa1 CAC80985 Delecluse et al 2000 Bt medellin Crv30Aa1 CAC80986 Delecluse et al 2000 Bt medellin Crv30Ba1 BAD00052 Ito et al 2003 Bt entomocidus Crv30Ca1 BAD67157 Ohgushi et al 2004 Bt sotto Bt jegathesan Crv30Ca2 ACU24781 Sun and Park 2009 367 Sin enlace NCBI Cry30Da1 EF095955 Shu et al 2006 Bt Y41 julio 09 Bt aizawai Crv30Db1 BAE80088 Kishida et al 2006 BUN1-14 Crv30Ea1 ACC95445 Fang et al 2007 Bt S2160-1 Sin enlace NCBI Cry30Ea2 FJ499389 Jun et al 2008 Bt Ywc2-8 julio 09 Crv30Fa1 ACI22625 Tan et al 2008 Bt MC28 Crv30Ga1 ACG60020 Zhu et al 2008 Bt HS18-1 Crv31Aa1 BAB11757 Saitoh & Mizuki 2000 Bt 84-HS-1-1 1 Crv31Aa2 AAL87458 Jung and Cote 2000 Bt M15 Crv31Aa3 BAE79808 Uemori et al 2006 Bt B0195 Crv31Aa4 BAF32571 Yasutake et al 2006 Bt 79-25 Crv31Aa5 BAF32572 Yasutake et al 2006 Bt 92-10 Crv31Ab1 BAE79809 Uemori et al 2006 Bt B0195 Crv31Ab2 BAF32570 Yasutake et al 2006 Bt 31-5 Crv31Ac1 BAF34368 Yasutake et al 2006 Bt 87-29 Balasubramaniar Crv32Aa1 AAG3671 1 ' 2001 Bt yunnanensis et al Crv32Ba1 BAB78601 Takebe et al 2001 Bt Crv32Ca1 BAB78602 Takebe et al 2001 Bt Crv32Da1 BAB78603 Takebe et al 2001 Bt Crv33Aa1 AAL26871 Kim et al 2001 Bt dakota Crv34Aa1 AAG50341 Ellis et al Binario con 2001 Bt PS80JJ1 Cry35Aa1 Crv34Aa2 AAK64560 Rupar et al Binario con 2001 Bt EG5899 Cry35Aa2 Binario con Crv34Aa3 AAT29032 Schnepf et al 2004 Bt PS69Q Cry35Aa3 Crv34Aa4 AAT29030 Schnepf et al 2004 Binario con Bt PS185GG Cry35Aa4 Binario con Crv34Ab1 AAG41671 Moellenbeck et al 2001 Bt PS149B1 Cry35Ab1 Crv34Ac1 Binario con AAG50118 Ellis et al 2001 Bt PS167H2 Cry35Ac1 Crv34Ac2 AAK64562 Rupar et al Binario con 2001 Bt EG9444 Cry35Ab2 Binario con Crv34Ac3 AAT29029 Schnepf et al 2004 Bt KR1369 Cry35Ab3 Binario con Crv34Ba1 AAK64565 Rupar et al 2001 Bt EG4851 Cry35Ba1 Crv34Ba2 AAT29033 Schnepf et al 2004 Binario con Bt PS201 L3 Cry35Ba2 Binario con Crv34Ba3 AAT29031 Schnepf et al 2004 Bt PS201 HH2 Cry35Ba3 Crv35Aa1 AAG50342 Binario con Ellis et al 2001 Bt PS80JJ1 Cry34Aa1 Crv35Aa2 Binario con AAK64561 Rupar et al 2001 Bt EG5899 Cry34Aa2 Binario con Crv35Aa3 AAT29028 Schnepf et al 2004 Bt PS69Q Cry34Aa3 Crv35Aa4 Binario con AAT29025 Schnepf et al 2004 Bt PS185GG Cry34Aa4 Binario con Crv35Ab1 AAG41672 Moellenbeck et al 2001 Bt PS149B1 Cry34Ab1 Crv35Ab2 AAK64563 Rupar et al Binario con 2001 Bt EG9444 Cry34Ac2 Binario con Crv35Ab3 AY536891 AAT29024 2004 Bt KR1369 Cry34Ab3 Crv35Ac1 AAG501 17 Binario con Ellis et al 2001 Bt PS167H2 Cry34Ac1 Binario con Crv35Ba1 AAK64566 Rupar et al 2001 Bt EG4851 Cry34Ba1 Crv35Ba2 AAT29027 Schnepf et al Binario con 2004 Bt PS201 L3 Cry34Ba2 Crv35Ba3 AAT29026 Schnepf et al 2004 Binario con Bt PS201 HH2 Cry34Ba3 Crv36Aa1 AAK64558 Rupar et al 2001 Bt Crv37Aa1 AAF76376 Donovan et al 2000 Bt Binario con Cry23Aa Crv38Aa1 AAK64559 Rupar et al 2000 Bt Crv39Aa1 BAB72016 Ito et al 2001 Bt aizawai Crv40Aa1 BAB72018 Ito et al 2001 Bt aizawai Crv40Ba1 BAC77648 Ito et al 2003 Bun1-14 Cry40Ca1 EU381045 Shu et al 2008 Bt Y41 Sin enlace NCBI julio 09 Crv40Da1 ACF15199 Zhang et al 2008 Bt S2096-2 Crv41Aa1 BAD35157 Yamashita et al 2003 Bt A 462 Crv41Ab1 BAD35163 Yamashita et al 2003 Bt A1462 Crv42Aa1 BAD35166 Yamashita et al 2003 Bt A1462 Crv43Aa1 Yokoyama and BAD 15301 2003 P. lentimorbus Tanaka semadara Cry43Aa2 BAD95 74 Nozawa 2004 P. popilliae popilliae Crv43Ba1 Yokoyama and BAD 15303 Tanaka 2003 P. lentimorbus semadara Tipo Crv43 BAD15305 Yokoyama and P. lentimorbus 2003 Tanaka semadara Cry44Aa BAD08532 Ito et al Bt entomocidus 2004 INA288 Crv45Aa BAD22577 Okumura et al 2004 Bt 89-T-34-22 Cry46Aa BAC79010 Ito et al 2004 Bt dakota Cry46Aa2 BAG68906 Ishikawa et al 2008 Bt A1470 Crv46Ab BAD35170 Yamagiwa et al 2004 Bt Crv47Aa AAY24695 Kongsuwan et al 2005 Bt CAA890 Crv48Aa CAJ 18351 Jones and Berry 2005 Bs IAB59 binario con 49Aa Crv48Aa2 CAJ86545 Jones and Berry binario con 2006 Bs 47-6B 49Aa2 Crv48Aa3 CAJ86546 Jones and Berry 2006 binario con Bs NHA15b 49Aa3 Crv48Ab CAJ86548 Jones and Berry 2006 Bs LP1 G binario con 49Ab1 Crv48Ab2 CAJ86549 Jones and Berry 2006 binario con Bs 2173 49Aa4 Cry49Aa CAH56541 Jones and Berry 2005 Bs IAB59 binario con 48Aa Cry49Aa2 CAJ86541 Jones and Berry binario con 2006 Bs 47-6B 48Aa2 Cry49Aa3 CAJ86543 Jones and Berry binario con 2006 BsNHA15b 48Aa3 binario con Crv49Aa4 CAJ 86544 Jones and Berry 2006 Bs 2173 48Ab2 binario con Crv49Ab1 CAJ86542 Jones and Berry 2006 Bs LP1 G 48Ab1 Crv50Aa1 BAE86999 Ohgushi et al 2006 Bt sotto Crv51Aa1 AB 114444 Meng et al 2006 Bt F1 -1 Sin enlace NCBI Cry52Aa1 EF613489 Song et al 2007 Bt Y41 julio 09 Sin enlace NCBI Cry52Ba1 FJ361760 Jun et al 2008 Bt B 59-2 julio 09 Sin enlace NCBI Cry53Aa1 EF633476 Song et al 2007 Bt Y41 julio 09 Sin enlace NCBI Cry53Ab1 FJ361759 Jun et al 2008 Bt MC28 julio 09 Crv54Aa1 ACA52194 Tan et al 2009 Bt MC28 Crv55Aa1 ABW88931 Guo et al 2008 YBT 1518 Crv55Aa2 AAE33526 Bradfisch et al 2000 BT Y41 Sin enlace NCBI Cry56Aa1 FJ597621 Jun & Furong 2008 Bt YWC2-8 julio 09 Sin enlace NCBI Cry56Aa2 GQ483512 Guan Peng et al 2009 Bt G7-1 agosto 09 Crv57Aa1 ANC87261 Noguera & Ibarra 2009 Bt kim Crv58Aa1 ANC87260 Noguera & Ibarra 2009 Bt entomocidus Crv59Aa1 ACR43758 Noguera & Ibarra 2009 Bt kim LBIT-980

Claims (45)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una planta transgénica que comprende ADN que codifica una proteína insecticida Vip3Ab y ADN que codifica una proteína insecticida CryI F.

2. Semilla de una planta de la reivindicación 1.

3. La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho ADN fue introducido mediante la introgresión en dicha planta.

4. Semilla de una planta de la reivindicación 3.

5. Un campo de plantas que comprende plantas de refugio no Bt y una pluralidad de plantas de la reivindicación 1 , donde dichas plantas de refugio comprenden menos de 40% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

6. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 30% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

7. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 20% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

8. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 10% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

9. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 5% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

10. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio están en bloques o franjas.

1 1. Una mezcla de semillas que comprende semillas de refugio de plantas de refugio no Bt, y una pluralidad de semillas de la reivindicación 2, donde dichas semillas de refugio representan menos de 40% de todas las semillas en la mezcla.

12. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 30% de todas las semillas en la mezcla.

13. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 20% de todas las semillas en la mezcla.

14. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 10% de todas las semillas en la mezcla.

15. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 5% de todas las semillas en la mezcla.

16. Un método para el manejo del desarrollo de resistencia por un insecto a una proteína insecticida derivada de un Bacillus thuringiensis, dicho método comprende la plantación de semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 5.

17. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha planta además comprende ADN que codifica una tercera proteína insecticida, dicha tercera proteína se selecciona del grupo que consiste en Cry1 C, Cry D, Cry 1 Be y Cry1 E.

18. Un campo de plantas que comprende plantas de refugio no Bt y una pluralidad de plantas transgénicas de la reivindicación 17, donde dichas plantas de refugio representan menos de aproximadamente 20% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

19. Un campo de plantas que comprende una pluralidad de plantas de la reivindicación 17, donde dicho campo comprende menos de aproximadamente 10% de plantas de refugio.

20. Un método para el manejo del desarrollo de resistencia por un insecto a una proteína insecticida derivada de un Bacillus thuringiensis, dicho método comprende la plantación de semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 19.

21. Una composición para el control de plagas de lepidópteros, que comprende células que expresan cantidades eficaces tanto de una proteína que contiene toxina núcleo CryI F, como de una proteína V¡p3Ab.

22. La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque comprende un huésped transformado para expresar tanto una proteína que contiene toxina núcleo Cry F como una proteína Vip3Ab, donde dicho huésped es un microorganismo o una célula de planta.

23. Un método para el control de plagas de lepidópteros, que comprende la presentación a dichas plagas o al entorno de dichas plagas de una cantidad eficaz de una composición de la reivindicación 21.

24. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha planta además comprende ADN que codifica una tercera proteína insecticida, dicha tercera proteína se selecciona del grupo que consiste en Cryl C, Cry1 D y Cry1 E.

25. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque dicha planta produce una cuarta proteína y una quinta proteína seleccionadas del grupo que consiste en Cry2A, Cryl l, CryIAb y DIG-3.

26. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque dicha planta produce una cuarta proteína seleccionada del grupo que consiste en Cry2A, Cry1 1, CryIAb y DIG-3.

27. Un método para el manejo del desarrollo de resistencia a una toxina Cry por un insecto, dicho método comprende la plantación de semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 26.

28. Un campo de plantas que comprende plantas de refugio no Bt y una pluralidad de plantas de la reivindicación 26, donde dichas plantas de refugio comprenden menos de aproximadamente 10% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

29. El campo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicho campo comprende menos de aproximadamente 5% de plantas de refugio.

30. Un método para el manejo del desarrollo de resistencia a una toxina Cry por un insecto, dicho método comprende la plantación de semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 28 ó 29.

31. Una mezcla de semillas que comprende semillas de refugio de plantas de refugio no Bt y una pluralidad de semillas de una planta de la reivindicación 26, donde dichas semillas de refugio comprenden menos del 10% de todas las semillas en la mezcla.

, 32. El campo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5, 18 y 28, caracterizado además porque dichas plantas ocupan más de 4 ha (10 acres).

33. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 17, 24 y 26, caracterizada además porque dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, soja y algodón.

34. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicación 1 , 2, 17, 24 y 26, caracterizada además porque dicha planta es una planta de maíz.

35. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque dicha tercera proteína es una proteína Cry 1 Be.

36. Un método para el manejo del desarrollo de resistencia a una toxina Cry por un insecto, dicho método comprende la plantación de semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 35.

37. Un campo de plantas que comprende plantas de refugio no Bt y una pluralidad de plantas de la reivindicación 35, donde dichas plantas de refugio comprenden menos de aproximadamente 10% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

38. El campo de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque dicho campo comprende menos de aproximadamente 5% de plantas de refugio.

39. Un método para el manejo del desarrollo de resistencia a una toxina Cry por un insecto, dicho método comprende la plantación de semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 37 ó 38.

40. Una mezcla de semillas que comprende semillas de refugio de plantas de refugio no Bt y una pluralidad de semillas de una planta de la reivindicación 35, donde dichas semillas de refugio comprenden menos del 10% de todas las semillas en la mezcla.

41. El campo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37 y 38, caracterizado además porque dichas plantas ocupan más de 4 ha (10 acres).

42. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 17, 24, 25, 26, 33 y 34, caracterizada además porque dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, soja y algodón.

43. La planta de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque dicha planta es una planta de maíz.

44. Una célula de planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 17, 24, 25, 26, 33 y 34, en donde dicha célula de planta comprende dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida CryI F y dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida Vip3Ab, en donde dicha proteína insecticida Cry1 F es por lo menos 99% idéntica con la SEQ ID NO:1 , y dicha proteína insecticida Vip3Ab es por lo menos 99% idéntica con la SEQ ID NO:2.

45. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 17, 24, 25, 26, 33 y 34, caracterizada además porque dicha proteína insecticida Cry F comprende la SEQ ID NO:1 y dicha proteína insecticida Vip3Ab comprende la SEQ ID NO:2.