JP2014525748A - Cry1Abと組み合わせたDIG3殺虫性結晶タンパク質の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
人は、食物用途およびエネルギー用途のためにトウモロコシを栽培する。人は、ダイズおよびワタを含む他の多くの作物も栽培する。昆虫は、植物を食べて損傷し、それによってこれらの人の努力を台無しにする。害虫を防除するために毎年何10億ドルも費やされ、害虫が与える損傷に対してさらに数10億ドルが失われる。合成有機化学殺虫剤は、害虫を防除するために用いられる主な手段であったが、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)(Bt)に由来する殺虫性タンパク質などの生物殺虫剤が一部の領域である重要な役割を演じてきた。Bt殺虫性タンパク質遺伝子による形質転換を通して昆虫抵抗性植物を作出できたことにより、現代農業が革新し、殺虫性タンパク質およびその遺伝子の重要性および価値が高まっている。
配列番号1は、完全長Cry1Abの例示的タンパク質である。(MR818)
配列番号2は、完全長DIG−3の例示的タンパク質である。
「コーンボーラー保護Bt(Cry1AbまたはCry1F)トウモロコシ製品の特定の構造化要件は、以下の通りである:
構造化緩衝帯:
コーンベルトで20%の非鱗翅目Btトウモロコシ緩衝帯;
コットンベルトで50%の非鱗翅目Bt緩衝帯
ブロック
内部(すなわち、Bt圃場内)
外部(すなわち、任意交配を最大にするためにBt圃場から1/2マイル(可能であれば1/4マイル)以内に別個の圃場)
圃場内の帯状地
幼虫の移動の影響を低減するために、帯状地は少なくとも4条(好ましくは6条)の幅でなければならない」
緩衝帯要件に関して類似した指針を提供する。例えば:
「コーンボーラーIRMの要件:
・トウモロコシ畑地の少なくとも20%に緩衝帯雑種を植える
・綿花生産地では、緩衝帯は50%でなければならない
・緩衝帯雑種の1/2マイル以内に植えなければならない
・緩衝帯は、Bt圃場内に帯状地として植えることができる;緩衝帯の帯状地は少なくとも4条の幅でなければならない
・標的昆虫の経済的許容限界に到達する場合だけ、緩衝帯を従来の殺虫剤で処理することができる
・Btベースの噴霧可能な殺虫剤を緩衝帯トウモロコシで用いることはできない
・Btトウモロコシのあらゆる農場に適当な緩衝帯を設けなければならない」
[実施例]
Cry1Abコア毒素のヨウ素化。Cry1Ab毒素(配列番号1)をトリプシンで活性化し、Iodo−Bead(Pierce)を用いてヨウ素化した。簡潔には、2つのIodo−Beadを500μlのリン酸緩衝食塩水、PBS(20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.5)で2回洗浄し、鉛シールドの後の1.5ml遠心管に入れた。これに、100μlのPBSを加えた。フード内で、および適切な放射能取扱い技術を用いることにより、0.5mCi Na125I(17.4Ci/mg、Amersham)をIodo−BeadのPBS溶液に加えた。構成成分を室温で5分間反応させ、次に高度に純粋なトランケーションされたCry1Abタンパク質の10μgを溶液に加え、さらなる5分間反応させた。Iodo−Beadから溶液を取り出し、それを20mM CAPS緩衝液、pH10.5 + 1mM DTTで平衡させた0.5mlの脱塩Zebaスピンカラム(InVitrogen)に加えることによって、反応を停止した。Iodo−Beadを各々10μlのPBSで2回洗浄し、洗浄溶液も脱塩カラムに加えた。放射性溶液を1,000×gで2分間の遠心によって脱塩カラムを通して溶出した。放射ヨウ素化されたCry1Abの放射純度は、SDS−PAGE、蛍光画像化およびガンマ計数によって測定した。簡潔には、4〜20%のトリスグリシンポリアクリルアミドゲル(1mm厚、InVitrogen)を用いて、SDS−PAGEによって2μlの放射性タンパク質を分離した。分離後、製造業者の説明書に従ってBioRadゲル乾燥装置を用いてゲルを乾燥させた。マイラー膜(厚さ12μm)で包み、Molecular Dynamics保存蛍光スクリーン(35cm×43cm)の下でそれらを1時間露光させることによって、乾燥ゲルを画像化した。Molecular Dynamics Storm820蛍光造影装置を用いてプレートを現像し、像はImageQuant(商標)ソフトウェアを用いて分析した。特異的活性は、1μgタンパク質につきおよそ4μCiであった。
可溶性BBMVの調製および分画。終齢オストリニア・ヌビラリス(Ostrinia nubilalis)幼虫を一晩絶食させ、次いで、翌朝、氷の上で15分間冷やしたのちに解剖した。中腸組織を体腔から取り出し、外皮に接着した後腸を残した。中腸を、仕入先の推奨通りに希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル1(SigmaP−2714)を追加した、9倍容量の氷冷ホモジナイゼーション緩衝液(300mMマンニトール、17mMトリス、塩基、pH7.5)に入れた。15ストロークのガラス組織ホモジナイザーで組織をホモジナイズした。Wolfersberger(1993)のMgCl2沈殿法によってBBMVを調製した。簡潔には、300mMマンニトール中の等量の24mM MgCl2溶液を中腸ホモジネートと混合し、5分間撹拌し、氷上で15分間静置させた。4℃で15分間、2,500×gで溶液を遠心分離した。上清を保存し、元の容量の0.5倍希釈のホモジナイゼーション緩衝液にペレットを懸濁して再び遠心分離した。2つの上清を合わせ、4℃で30分間、27,000×gで遠心分離してBBMV分画を形成した。ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を追加した10mlホモジナイゼーション緩衝液に懸濁し、4℃で30分間、27,000×gで再び遠心分離してBBMVを洗浄した。生じたペレットをBBMV保存緩衝液(10mM HEPES、130mM KCl、10%グリセロール、pH7.4)に懸濁して、約3mg/mlタンパク質の濃度にした。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミン(BSA)を用いてBradford法(1976)を用いることによって測定した。製造業者の説明書に従ってSigmaアッセイを用いて、試料を凍結させる前にアルカリ性ホスファターゼの測定を行った。BBMV分画中のこのマーカー酵素の比活性は、中腸ホモジネート分画で見られるものと比較して一般的に7倍増加した。BBMVを250μlの試料に等分し、液体N2で瞬間冷凍し、−80℃で保存した。
(1カクテル構成成分の最終濃度(μΜ)は、AEBSF(500)、EDTA(250mM)、ベスタチン(32)、E−64(0.35)、ロイペプチン(0.25)およびアプロチニン(0.075)である。)
BBMVへのl25I Cry1Abタンパク質の結合。結合アッセイで用いるBBMVタンパク質の最適量を決定するために、飽和曲線を作成した。125I放射性標識Cry1Abタンパク質(0.5nM)を、結合緩衝液(8mM NaHPO4、2mM KH2PO4、150mM NaCl、0.1%ウシ血清アルブミン、pH7.4)中に0〜500μg/mlの様々な量のBBMVタンパク質と、28℃で1時間インキュベートした。全容量は、0.5mlであった。1.5ml遠心管から500μl遠心管に反応混合液の150μlを3反復で採取し、室温で6分間、14,000×gで試料を遠心分離することによって、結合した125I Cry1Abタンパク質を未結合のものから分離した。上清を静かに除去し、氷冷結合緩衝液でペレットを3回静かに洗浄した。ペレットを含む遠心器の底を切り取り、13×75mmガラス培養試験管に入れた。試料をガンマ計数器でそれぞれ5分間計数した。試料に含まれる計数をバックグラウンド計数(タンパク質なしでの反応)から引き、BBMVタンパク質濃度に対してプロットした。用いるタンパク質の最適量は、0.15mg/mlのBBMVタンパク質であると決定された。
図1は、非標識の相同的Cry1Ab(●)および非相同的DIG−3(■)による競合に対してオストリニア・ヌビラリス(Ostrinia nubilalis)からのBBMVにおける125I Cry1Ab(0.5nM)の特異的結合百分率を示す。Cry1Abによる相同的競合の置換曲線は、約0.5nMのCry1Abで放射性リガンドの50%の置換を示すS字形の曲線をもたらす。DIG−3は、100nM以下の濃度(アッセイでの125I Cry1Abの濃度より200倍高い)でその結合部位から125I Cry1Abのいかなる結合も置換しない。300nMだけで、DIG−3による125I Cry1Abの入札の約25%の置換が観察される。これらの結果は、オストリニア・ヌビラリス(Ostrinia nubilalis)からのBBMVに位置する受容体部位へのCry1Abの結合に関して、DIG−3が効果的に競合しないことを示す。
Claims (23)
- Cry1Ab殺虫性タンパク質をコードするcry1Abポリヌクレオチド、およびDIG−3殺虫性タンパク質をコードするDIG−3ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物であって、前記DIG−3ポリヌクレオチドが、配列番号2のコア毒素をコードするポリヌクレオチドの相補配列と42℃で、1×SSC中でハイブリダイズするトランスジェニック植物。
- Cry1Fa、Cry1BeおよびCry2Aaからなる群から好ましくは選択される第三の殺虫性タンパク質をコードするDNAをさらに含む、請求項1に記載のトランスジェニック植物。
- Cry1BeおよびCry2Aaからなる群から好ましくは選択される第四の殺虫性タンパク質をコードするDNAをさらに含み、前記第三の殺虫性タンパク質がCry1Faタンパク質である、請求項2に記載のトランスジェニック植物。
- 請求項1から3のいずれかに記載の植物の種子。
- 非Bt緩衝帯植物および請求項1から3のいずれかに記載の複数の植物を含む植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の40%未満を構成する、圃場。
- 前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の30%未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。
- 前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の20%未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。
- 前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の10%未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。
- 前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の5%未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。
- 前記緩衝帯植物がブロックまたは帯状地にある、請求項5に記載の植物の圃場。
- 非Bt緩衝帯植物からの緩衝帯種子および請求項4に記載の複数の種子を含む種子混合物であって、前記緩衝帯種子は混合物の全ての種子の40%未満を構成する、種子混合物。
- 前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の30%未満を構成する、請求項11に記載の種子混合物。
- 前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の20%未満を構成する、請求項11に記載の種子混合物。
- 前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の10%未満を構成する、請求項11に記載の種子混合物。
- 前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の5%未満を構成する、請求項11に記載の種子混合物。
- 種子を播いて請求項5から10のいずれかに記載の植物の圃場を作製することを含む、昆虫によるCryタンパク質への抵抗性の発達を管理する方法。
- 前記植物が10エーカーよりも多くを占める、請求項5から10のいずれかに記載の圃場。
- トウモロコシ、ダイズおよびワタからなる群から選択される、請求項1から3のいずれかに記載の植物。
- メイズ植物である、請求項18に記載の植物。
- Cry1Ab殺虫性タンパク質をコードするcry1Abポリヌクレオチド、およびDIG−3殺虫性タンパク質をコードするDIG−3ポリヌクレオチドを含む非全能性植物細胞であって、前記DIG−3ポリヌクレオチドが、配列番号2のコア毒素をコードするポリヌクレオチドの相補配列と42℃で、1×SSC中でハイブリダイズする非全能性植物細胞。
- コーンボーラー昆虫を防除する方法であって、前記昆虫または前記昆虫の環境を、Cry1Ab殺虫性タンパク質を含有し、さらにDIG−3殺虫性タンパク質を含有する組成物の有効量と接触させることを含む方法。
- 前記組成物が複数の植物細胞である、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞を複製することを含む、請求項22に記載の組成物を生成する方法。
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