MX2012007130A - Combinacion de proteínas insecticidas que comprenden cry1ab y cry2aa, para controlar el perforador de maíz europeo, y métodos para el control de la resistencia de los insectos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere en parte al apilamiento de una proteína Cry1Ab y una proteína Cry2Aa para conseguir que las plantas (especialmente maíz) tengan mayor durabilidad y resulten menos proclives a permitir el desarrollo de insectos con resistencia a la actividad de alguna de estas dos toxinas; estos apilamientos pueden ser utilizados específicamente dirigidos al perforador de maíz europeo.

Description

COMBINACIONES DE PROTEÍNAS INSECTICIDAS QUE COMPRENDEN CRY1 AB Y CRY2AA, PARA CONTROLAR EL PERFORADOR DE MAÍZ EUROPEO, Y MÉTODOS PARA EL CONTROL DE LA RESISTENCIA DE LOS INSECTOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El ser humano cultiva maíz con fines alimentarios y energéticos. Los insectos comen plantas de maíz y las dañan, lo que perjudica notablemente estas actividades humanas.

El control actual en las plantas transgénicas de estas plagas se consigue a través de la expresión en una planta de un gen de endotoxina delta cristal (Cry) que codifica la proteína CryI Fa del Bacillus thuringiensis. CryI Fa es la toxina de proteína que se usa actualmente en las semillas transgénicas de maíz de la marca Herculex™ de Dow AgroSciences (Herculex, Herculex-Extra, y Herculex-RW) que son resistentes a las plagas de insectos FAW (siglas en inglés de "gusano cogollero de otoño") y ECB (siglas en inglés de "perforador de maíz europeo"). Esta proteína funciona uniéndose a receptor/es específico/s que se encuentran en el intestino medio de los insectos, y forma poros en las células del intestino. La formación de estos poros impide a los insectos regular el equilibrio osmótico, lo cual produce su muerte.

Sin embargo, existe un grado de preocupación respecto del hecho de que los insectos podrían desarrollar resistencia a la acción de CryI Fa a través de alteraciones genéticas de los receptores que se encuentran dentro de su intestino y que se unen a CryI Fa. Los insectos que producen receptores con una capacidad reducida para unirse a CryI Fa pueden ser resistentes a la actividad de CryI Fa, y así sobrevivir en plantas que expresan esta proteína.

Considerando una sola toxina Cry que esté continuamente presente en la planta durante el período de crecimiento, se teme que los insectos desarrollen resistencia a la actividad de esta proteína mediante alteraciones genéticas del receptor que se une a la toxina CryI Fa en el intestino del insecto. Una reducción en la unión de la toxina debido a estas alteraciones en el receptor produciría una disminución de la toxicidad de la CryI Fa que posiblemente llevaría a una disminución eventual de la eficacia de la proteína cuando se expresa en un cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en parte al apilamiento de una proteína CryIAb y una proteína Cry2Aa para conseguir que las plantas (especialmente maíz) tengan mayor durabilidad y resulten menos proclives a permitir el desarrollo de insectos con resistencia a la actividad de alguna de estas dos toxinas. Estos apilamientos pueden ser utilizados específicamente dirigidos al perforador de maíz europeo (ECB, por sus siglas en inglés).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA La Figura 1 muestra el porcentaje de unión específica de CryIAb marcada con 125l (0,5 nM) en BBMV de ECB contra la competencia de CryIAb homologa no marcada (?) y Cry2Aa heteróloga (?).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en parte al apilamiento de una proteína insecticida CryIAb y una proteína insecticida Cry2Aa para conseguir que las plantas (especialmente maíz) tengan mayor durabilidad y resulten menos proclives a permitir el desarrollo de insectos con resistencia a la actividad de alguna de estas dos toxinas. Estos apilamientos pueden ser utilizados específicamente dirigidos al perforador de maíz europeo (ECB; Ostrinia nubilalis).

La presente invención también se refiere en parte a apilamientos triples o "pirámides" de tres (o más) toxinas de proteínas, con una proteína CryIAb y una proteína Cry2Aa como el par base. (Por "sitios de acción separados" se quiere decir que cualquiera de las proteínas especificadas no causan resistencia cruzada entre sí.) El agregado de una tercera proteína que va dirigida al ECB puede proporcionar una proteína con un tercer sitio de acción contra el ECB. En algunas modalidades preferidas, la tercera proteína puede seleccionarse del grupo integrado por DIG-3 (véase el documento US 2010-00269223), Cryl l, CryI Be, Cry2Aa, y CryI Fa. Véase p. ej. el documento USSN 61 /284.278, presentado el 16 de diciembre de 2009. Véase también el documento US 2008-031 1096.

Por consiguiente, en algunas modalidades de pirámides preferidas, las toxinas escogidas tienen tres sitios de acción separados contra el ECB. Una vez más, las combinaciones piramidales preferidas son el par principal de proteínas más una tercera proteína para IRM.

Los pares principales y/o apeamientos triples (activos contra el ECB) también pueden combinarse con otras proteínas adicionales -dirigidas al gusano cogollero del otoño (FAW), por ejemplo. Estas proteínas pueden incluir Vip3, Cry C, CryI D y/o CryI E, por ejemplo. CryI Be y/o CryI Fa también pueden usarse dirigidas a FAW y ECB.

El GENBANK puede usarse para obtener las secuencias de cualquiera de los genes y proteínas que se divulgan o mencionan en la presente. Ver el Apéndice A.

La presente invención también se refiere a tres proteínas insecticidas (proteínas Cry en algunas modalidades preferidas) que son activas contra una plaga diana única pero que no producen resistencia cruzada entre sí.

Las plantas (y el acreaje (superficie) plantado con estas plantas) que producen estas (por lo menos) tres toxinas están comprendidas en el alcance de la presente invención. También pueden añadirse toxinas/genes adicionales, pero estos apilamientos triples en particular podrían, de acuerdo con la presente invención, de manera ventajosa y sorprendente, proporcionar tres sitios de acción contra el ECB.

Los pares o apilamientos triples (y/o combinaciones de proteínas adicionales) de la presente invención pueden ayudar a reducir o eliminar el requisito de acreaje (superficie) de refugios (p. ej. menos del 40%, menos del 20%, menos del 10%, menos del 5%, o incluso 0% de refugio). Un campo de más de 10 acres (~4,048 ha) plantado de esta manera está, por consiguiente, también incluido en la presente invención. El/los polinucleótido/s del caso se encuentran preferiblemente en una construcción genética controlada por un promotor, o promotores, no Bacillus-thuringiensis. Los polinucleótidos del caso pueden comprender el uso de codones para incrementar su expresión en una planta.

Para contrarrestar la capacidad que tienen los insectos de desarrollar resistencia a una proteína Cry, se han identificado toxinas Cry que se unen de manera no competitiva a receptores de proteína en el intestino del ECB. Se ha descubierto que CryIAb no desplaza la unión de Cry2Aa a los receptores ubicados en el intestino del insecto de larvas de ECB.

Se ha encontrado que Cry2Aa y CryIAb resultan tóxicas para las larvas de ECB, aunque no ¡nteractúan completamente con el mismo sitio, o sitios, de los receptores; esto muestra que su toxicidad no sufriría resistencia cruzada en el ECB.

Por consiguiente, los insectos que hubieran desarrollado resistencia a CrylAb serían todavía sensibles a la toxicidad de las proteínas Cry2Aa, por ejemplo, que se unen a sitios de receptores alternativos. Se han obtenido datos bioquímicos que apoyan lo que se acaba de afirmar. Las combinaciones de estas proteínas expresadas en plantas transgénicas proporcionan entonces un mecanismo útil y valioso para reducir la probabilidad del desarrollo de la resistencia en insectos en el campo y esto da lugar a una reducción del requisito sobre refugios. Los datos que se presentan más adelante aquí muestran que la proteína Cry2Aa interactúa en sitio/s diana separado/s dentro del intestino del insecto en comparación con CrylAb y esto permitiría obtener excelentes parejas de apilamiento.

Si la resistencia ocurriera por alteraciones en la afinidad de los receptores del intestino del insecto que se unen a las toxinas Cry, la alteración debería producirse en por lo menos dos receptores diferentes al mismo tiempo para que los insectos pudieran sobrevivir en plantas que expresan las proteínas múltiples. La probabilidad de que esto suceda es extremadamente remota, lo que aumenta la durabilidad del producto transgénico para impedir que los insectos desarrollen tolerancia a las proteínas.

Se ha radioyodado la proteína CrylAb y usado las técnicas de ensayo de unión de radiorreceptores para medir la interacción de fijación con proteínas putativas de receptores ubicadas en las membranas del intestino del insecto. Las membranas del intestino fueron preparadas como vesículas de membrana de borde en cepillo (BBMV) por el método de Wolfersberger. La yodación de las toxinas fue realizada usando tubos tratados con perlas de yodo o gen de yodo de Pierce Chemicals. La actividad específica de la toxina radiomarcada fue de aproximadamente 1 -4 pCi/pg de proteína. Los estudios de unión fueron realizados esencialmente con los procedimientos de Liang (1995).

La información que se presenta aquí muestra que las toxinas interactúan en sitios diana separados dentro del intestino del insecto en comparación con CryIAb y esto las convierte en excelentes parejas de apilamiento.

La presente invención es de utilidad con una variedad de plantas. Entre los ejemplos se incluyen el maíz, la soya y el algodón.

Los genes y las toxinas útiles de acuerdo con la presente invención incluyen no sólo las secuencias de longitud completa que se divulgan aquí sino también fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes y proteínas de fusión que retienen la actividad pesticida característica de las toxinas que se dan como ejemplos específicos en la presente invención. Tal como se emplea en este contexto, los términos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren a secuencias de nucleótidos que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes con actividad pesticida. Tal como se emplea en este contexto, la expresión "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma, o esencialmente la misma, actividad biológica contra las plagas diana que las toxinas reivindicadas.

Tal como se emplean en este contexto, los límites representan aproximadamente 95% (p. ej. de CryIAb y Cry2Aa), 78% (p. ej. de CryIA y Cry2A) y 45% (de Cry1 y Cry2) de identidad de secuencia, según "Revisión of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, y D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Estos límites también pueden aplicarse a las proteínas nucleares solamente.

Los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas quedan comprendidas en el alcance de la presente invención. Por otra parte, debido a la redundancia del código genético, una variedad de diferentes secuencias de ADN puede codificar las secuencias de aminoácidos divulgadas en la presente. La persona con experiencia en la técnica sabe muy bien cómo crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas, o esencialmente las mismas, toxinas. Estas secuencias de ADN variantes quedan comprendidas en el alcance de la presente invención. Tal como se emplea en este contexto, la referencia a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que no afectan de manera categórica la actividad pesticida. Los fragmentos de genes que codifican proteínas que retienen la actividad pesticida también están incluidos en esta definición.

Otro método para identificar los genes que codifican las toxinas y porciones de genes útiles de acuerdo con la presente invención consiste en el uso de sondas de oligonucleótidos. Estas sondas son secuencias detectables de nucleótidos. Estas secuencias pueden ser detectadas gracias a una marca apropiada o pueden elaborarse fluorescentes en sí, como se describe en la Solicitud Internacional N.° WO93/16094. Como se sabe muy bien en la técnica correspondiente, si la molécula de sonda y la muestra de ácido nucleico se hibridan formando un enlace fuerte entre las dos moléculas, se puede pensar con razón en que la sonda y la muestra tienen una homología considerable. Preferiblemente, la hibridación ocurre en condiciones estringentes por medio de técnicas que se conocen bien en el arte como se describe, por ejemplo, en Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, Nueva York, N.Y., pp. 169-170. Algunos ejemplos de concentraciones salinas y combinaciones de temperatura son los siguientes (en orden creciente de estringencia): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1 X SSPE o SSC a 42°C; 0, 1 X SSPE o SSC a 42°C; 0, 1 X SSPE o SSC a 65°C. La detección de la sonda constituye un medio para determinar de manera conocida si la hibridación se ha producido. Dicho análisis de sondas proporciona un método rápido para identificar los genes que codifican toxinas de la presente invención. Los segmentos de nucleótidos que se usan como sondas de acuerdo con la invención pueden sintetizarse con un sintetizador de ADN y procedimientos convencionales. Estas secuencias de nucleótidos también pueden usarse como cebadores de PCR para amplificar genes de la presente invención.

Algunas proteínas de la presente invención han sido ejemplificadas específicamente en la presente invención. Dado que estas proteínas son meramente ejemplos de las proteínas de la presente invención, queda obviamente clarificado que la presente invención comprende las proteínas variantes o equivalentes (y las secuencias de nucleotidos que codifican las proteínas equivalentes) que tienen la misma actividad pesticida, o similar, que la proteína ejemplificada. Las proteínas equivalentes tendrán una homología de aminoácidos con una proteína ejemplificada. Esta identidad de los aminoácidos normalmente será mayor a 75%, mayor a 90% y podría ser aún mayor a 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99%. La identidad de los aminoácidos estará en su punto más alto en las regiones críticas de la proteína encargadas de controlar la actividad biológica o que intervienen en la determinación de la configuración tridimensional que es definitivamente la responsable de la actividad biológica. En este sentido, son aceptables algunas sustituciones de aminoácidos y pueden ser necesarias si estas sustituciones se hacen en regiones que no son críticas para la actividad o son sustituciones conservativas de aminoácidos que no afectan la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos se pueden ubicar en las siguientes clases: no polares, polares sin carga, básicos y acídícos. Las sustituciones conservativas por las que un aminoácido de una clase es reemplazado por otro aminoácido del mismo tipo quedan dentro del alcance de la presente invención en tanto la sustitución no altere de manera concreta la actividad biológica del compuesto. A continuación se brinda una lista de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase. En algunos casos, también pueden efectuarse sustituciones no conservativas. El factor crítico es que estas sustituciones no deben modificar de manera sensible la actividad biológica de la proteína.

Transformación de plantas Un hospedante recombinante preferido para la producción de las proteínas insecticidas de la presente invención es una planta transformada. Los genes que codifican proteínas de toxinas de Bt, según se divulga en la presente, pueden ser insertados en células vegetales usando una variedad de técnicas de uso difundido en esta ciencia. Por ejemplo, se dispone de una gran cantidad de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en Escherichia coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas que han de ser preparadas para la inserción de genes foráneos en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, series pUC, series M13mp, pACYC184, entre otros. Por consiguiente, el fragmento de ADN que tiene la secuencia que codifica la proteína de toxina de Bt puede ser insertado en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante puede ser usado para la transformación en E. coli. Las células de E. cotí son cultivadas en un medio de nutrición adecuado, luego cosechadas y lisadas. El plásmido es recuperado. El análisis de las secuencias, el análisis de la restricción, la electroforesis y otros métodos biológicos bioquímicos-moleculares son los que se llevan a cabo generalmente como métodos de análisis. Luego de cada manipulación, la secuencia de ADN utilizada puede escindirse y unirse a la próxima secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido puede clonarse en el mismo plásmido o en otros. Según el método para insertar los genes que se desean en la planta, pueden resultar necesarias otras secuencias de ADN. Si por ejemplo, el plásmido Ti o R¡ se usa para la transformación de la célula vegetal, entonces por lo menos el borde derecho, aunque también con frecuencia el borde derecho y el izquierdo del ADN-T del plásmido Ti o Ri, tiene que unirse como región flanqueadora de los genes que se han de insertar. El uso de ADN-T para la transformación de células vegetales ha sido investigado intensamente y está suficientemente descripto en el documento EP 120 516, Lee y Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley er a/., (1986), y An er a/., (1985), y está bien desarrollado en la técnica.

Una vez que el ADN insertado ha quedado integrado al genoma de la planta, es relativamente estable. El vector de transformación contiene normalmente un marcador seleccionable que le confiere a las células vegetales transformadas resistencia a un biocida o un antibiótico, tales como Bialafós, Kanamicina, G418, Bleomicina o Higromicina, entre otros. El marcador usado en particular debería permitir, por consiguiente, la selección de las células transformadas en lugar de las células que no contienen el ADN insertado.

Se dispone de una gran cantidad de técnicas para insertar ADN en una célula vegetal hospedante. Dichas técnicas incluyen transformación con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolística (bombardeo de micropartículas), o electroporación además de otros métodos posibles. Si se usan Agrobacterias para la transformación, el ADN que se ha de insertar debe ser clonado en plásmidos especiales, a saber en un vector intermediario o en un vector binario. Los vectores intermediarios pueden ser integrados en el plásmido Ti o R¡ por recombinación homologa gracias a secuencias que son homologas a las secuencias del ADN-T. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir que es necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermediarios no pueden replicarse a sí mismos en las Agrobacterias. El vector intermediario puede transformarse en Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido ayudante (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse a sí mismos tanto en E. coli como en las Agrobacterias. Ellos comprenden un gen marcador de selección y un conector o policonector que están enmarcados por las regiones del borde derecho y del borde izquierdo del ADN-T. Pueden transformarse directamente en Agrobacterias (Holsters et al., 1978). El Agrobacterium que se usa como célula hospedante debe comprender un plásmido que porta una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T a la célula vegetal.

Puede haber más contenido de ADN-T. La bacteria transformada de esta forma se usa para la transformación de células vegetales. Pueden cultivarse explantas de manera ventajosa con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN a la célula vegetal. A partir del material vegetal infectado (por ejemplo, pedazos de hoja, segmentos de tallo, raíces, además de protoplastos o células cultivadas en suspensión) se pueden regenerar plantas completas en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas así obtenidas pueden someterse a evaluaciones para constatar la presencia del ADN insertado. No hay requisitos especiales respecto de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible la utilización de plásmidos comunes como por ejemplo, derivados de pUC.

Las células transformadas crecen dentro de las plantas de la manera usual. Ellas pueden formar células germinales y transmitir el rasgo transformado, o los rasgos transformados, a las plantas de la progenie. Estas plantas pueden cultivarse de la manera usual y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.

En una modalidad preferida de la presente descripción, las plantas serán transformadas con genes en donde el uso de codones ha sido optimizado para las plantas. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense N.° 5.380.831 , que se incorpora así como referencia. Si bien en la presente invención se dan como ejemplos algunas toxinas truncadas, es harto conocido en la técnica del Bt que las toxinas (de longitud completa) del tipo 130 kDa tienen una mitad N-terminal que es la toxina nuclear, y una mitad C-terminal que es la "cola" de la protoxina. Por consiguiente, las "colas" apropiadas pueden ser usadas con toxinas truncadas / nucleares de la presente descripción. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense N.° 6.2 8.188 y la Patente Estadounidense N.° 6.673.990. Por otra parte, en la técnica se conocen los métodos para crear genes sintéticos de Bt destinados a la utilización en plantas (Stewart y Burgin, 2007). Un ejemplo no limitativo de una planta transformada preferida es una planta de maíz fértil que comprende un gen expresable en una planta que codifica una proteína CryI Da, y que además comprende un segundo gen expresable en una planta que codifica una proteína CryI Be.

La transferencia (o introgresión) del rasgo, o de los rasgos, determinados por CryI Da y CryI Be en líneas de maíz endocriadas puede conseguirse aplicando cultivo por selección recurrente, por ejemplo retrocruzamiento. En este caso, se cruza en primer término un progenitor recurrente deseado a un donante endocriado (el progenitor no recurrente) que porta el gen, o los genes, apropiados para los rasgos determinados por CryI D y CryI C. La progenie de este cruzamiento se retrocruza con el progenitor recurrente y se efectúa a continuación una selección en la progenie resultante en búsqueda del rasgo, o de los rasgos, deseados que se han de transferir desde el progenitor no recurrente. Después de tres, preferiblemente cuatro, más preferiblemente cinco o más generaciones de retrocruzamientos con el progenitor recurrente seleccionando el rasgo deseado, o los rasgos deseados, la progenie será heterocigota de los loci que controlan el rasgo, o los rasgos, que se están transfiriendo, pero serán iguales al progenitor recurrente en la mayor parte de los otros genes o en casi todos (véase, por ejemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4.a Ed., 172-175; Fehr (1987) Principies of Cultivar Development, Vol. 1 : Theory and Technique, 360-376).

Estrategias para el manejo de la resistencia en insectos (IRM) Roush et al., por ejemplo, establecen estrategias de dos toxinas, también llamadas "pirámides" o "apilamiento", para el manejo de cultivos transgénicos insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).

En su sitio web, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (United States Environmental Protection Agency) (epa.gov/oppbppd 1 /biopest¡cides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) publica los siguientes requisitos para proveer refugios no transgénicos (es decir, no B.t.) (una sección de cultivos / maíz no Bt) para utilizar en cultivos transgénicos que producen una única proteína activa de Bt contra plagas diana.

"Los requisitos estructurados específicos para los productos del maíz Bt (CryIAb o CryI F) protegidos contra el perforador de maíz son los siguientes: Refugios estructurados 20% de refugio de maíz Bt no Lepidóptero en el Cinturón Maicero; 50% de refugio Bt no Lepidóptero en el Cinturón Algodonero. Bloques: Internos (es decir, dentro del campo Bt) Externos (es decir, campos separados por ½ milla (-0,804 km) (¼ de milla (~0,402 km) si es posible) del campo Bt para maximizar la multiplicación aleatoria) Franjas dentro del campo Las franjas deben ser de por lo menos 4 hileras de ancho (preferiblemente 6 hileras) para reducir los efectos del desplazamiento de las larvas." Por otra parte, la Asociación Nacional de Agricultores Maiceros (National Corn Growers Association), en su sitio web: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) también proporciona lineamientos similares con respecto a los requisitos sobre refugios. Por ejemplo: "Requisitos para el IRM del perforador de maíz: -Plantar por lo menos 20% de los acres (hectáreas) de maíz como refugio de híbridos -En las regiones productoras de algodón, el refugio debe ser del 50% -Se debe plantar a 1/2 milla (-0,804 km) de los híbridos del refugio -El refugio puede ser plantado en franjas dentro del campo Bt; las franjas de refugio deben ser de por lo menos 4 hileras de ancho -El refugio puede ser tratado con pesticidas convencionales sólo si se alcanzan umbrales redituables respecto del insecto diana -No pueden emplearse insecticidas pulverizables a base de Bt en el maíz de refugio -Se debe plantar refugio apropiado en cada granja con maíz Bt." Como lo establecen Roush et al. (páginas 1780 y 1784, columna de la derecha, por ejemplo), el apilamiento o las pirámides de dos proteínas diferentes cada una de las cuales es eficaz contra las plagas diana y con poca o nula resistencia cruzada pueden permitir el uso de un refugio más pequeño. Roush sugiere que para conseguir un apilamiento eficaz, un tamaño de refugio inferior al 10% del refugio puede proveer manejo de la resistencia comparable a aproximadamente 50% del refugio para un rasgo único (no piramidal). Para los productos de maíz Bt piramidales actuales, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos exige muchísimo menos refugio estructurado de maíz no Bt plantado (generalmente 5%) que para los productos con rasgos únicos (generalmente 20%).

Existen diversas maneras de obtener los efectos del IRM de un refugio, que incluyen diversos patrones de plantación geométrica en los campos (como se mencionó más arriba) y mezclas de semillas embolsadas, otro punto también analizado por Roush et al. (más arriba), y la Patente Estadounidense N.° 6.551 .962.

Los porcentajes precedentes, o proporciones de refugio similares, pueden usarse para los apilamientos o pirámides dobles o triples de la presente. En el caso de los apilamientos triples con tres sitios de acción contra una plaga diana única, un objetivo sería el cero refugio (o menos del 5% de refugio, por ejemplo). Esto resulta especialmente relevante para lo que es el acreaje (superficie) comercial, es decir, de más de 10 acres (~4,048 ha) por ejemplo.

Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisionales y publicaciones a las que se ha hecho referencia o que han sido citadas en el presente documento quedan incorporadas como referencia en su totalidad hasta el punto en que no resulten contradictorias respecto de lo que se explica específicamente en esta memoria descriptiva.

A menos que se lo indique o que quede implícito específicamente, los términos "un", "una", "el" y "la significan "por lo menos uno/una", tal como se los emplean en este contexto.

A continuación se presentan ejemplos que ilustran los procedimientos para llevar a la práctica la invención. Estos ejemplos no deben tomarse como limitantes en ningún sentido. Todos los porcentajes están por peso y todas las proporciones de las mezclas de solventes están por volumen a menos que se aclare lo contrario. Todas las temperaturas están en grados Celsius.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Etiquetación de proteínas Cry marcadas con 125l Yodación de toxinas Cry Se yodaron toxinas Cry truncadas y purificadas empleando lodo-Beads (perlas de yodo) o lodo-gen (gen de yodo) (Pierce). En pocas palabras, se lavaron dos perlas de yodo dos veces con 500 µ? de solución salina con tampón de fosfato, PBS (fosfato de sodio 20 mM, NaCI 0, 15 M, pH 7,5), y se colocaron en un tubo de centrífuga de 1 ,5 mi detrás de un escudo de plomo. A esto se le añadieron 100 µ? de PBS. En una campana y empleando técnicas de manipulación de radiactividad apropiadas, se añadió 0,5 mCi Na125l (17,4 Ci/mg, Lote 0114, Amersham) a la solución de PBS con las perlas de yodo. Se permitió que los componentes reaccionaran durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego se agregaron 2-25 pg de proteína Cry truncada de alta pureza a la solución y se dejó reaccionar durante otros 3-5 minutos. La reacción finalizó al retirar la solución de perlas de yodo y aplicarla a una columna de spin desalinizadora Zeba de 0,5 mi (InVitrogen) equilibrada en PBS. La perla de yodo fue lavada dos veces con 10 µ? de PBS en cada ocasión y la solución de lavado también fue aplicada a la columna desalinizadora. La solución radiactiva fue eluida por la columna desalinizadora centrifugando a 1000 x g durante 2 min. Con este procedimiento, primeramente se despojó a la toxina cry en tampón de fosfato 100 mM (pH 8) de lipopolisacáridos (LPS) pasándola a través de una pequeña columna de polimixina de 0,5 mi varias veces. Al tubo de gen de yodo (Pierce Chem. Co.) se le añadieron 20 pg de la toxina CryI Da sin LPS, luego 0,5 mCi de Na 25l. La mezcla de reacción se agitó durante 15 min a 25°C. La solución fue retirada del tubo y se agregaron 50 µ? de Nal 0,2M sin radiomarca para desactivar la reacción. La proteína fue dializada vs PBS con 3 cambios de tampón para eliminar todo 125l que no se hubiere fijado.

La radiopureza de las proteínas Cry yodadas fue determinada por SDS-PAGE, imágenes en fósforo y recuento gamma. En pocas palabras, se separaron 2 µ? de la proteína radiactiva por SDS-PAGE. Después de la separación, se secaron los geles utilizando un equipo de secado en gel BioRad respetando las instrucciones del fabricante. Se tomaron imágenes de los geles secados envolviéndolos en película Mylar (12 µ?? de espesor), y exponiéndolos bajo una pantalla de almacenamiento de fósforo provista por Molecular Dynamics (35 cm x 43 cm), durante 1 hora. Las placas fueron desarrolladas mediante el uso de un tomador de imágenes en fósforo Storm 820 de Molecular Dynamics y las imágenes fueron analizadas por Software ImageQuant™. La banda radiactiva junto con las áreas inmediatamente superiores e inferiores de la banda fueron recortadas del gel con una hojita de afeitar y el recuento se hizo con un contador de rayos gamma. Sólo se detectó radiactividad en la banda de la proteína Cry y en las áreas por debajo de la banda. No se detectó radiactividad por encima de la banda, lo cual indica que todos los contaminantes radiactivos estaban compuestos por componentes de proteína más pequeños que la proteína Cry truncada. Estos componentes representan con toda probabilidad los productos de la degradación.

EJEMPLO 2 Protocolo de preparación de BBMV Preparación y fraccionamiento de BBMV solubilizadas Larvas de Spodoptera frugiperda, Ostrinia nubilalis o Heleothis. zea en su último instar fueron sometidas a ayuno durante una noche y a la mañana siguiente fueron diseccionadas después de enfriamiento sobre hielo durante 15 minutos. Se extrajo el tejido del intestino medio de la cavidad corporal, y se desechó el intestino posterior ligado al integumento. El intestino medio fue colocado en un volumen 9X de tampón de homogenización helado (manitol 300 mM, EGTA 5 mM, tris. base 17 mM, pH 7,5), suplementado con Cóctel Inhibidor de Proteasa1 (Sigma P-2714) diluido en la forma recomendada por el proveedor. El tejido fue homogeneizado con 15 golpes en un homogenizador de vidrio para tejidos. Las BBMV fueron preparadas por el método de precipitación en MgC de Wolfersberger (1993). En pocas palabras, se mezcló un volumen igual de una solución de MgCI2 24 mM en manitol 300 mM con el homogenado de intestino medio, se agitó durante 5 minutos y se dejó reposar sobre hielo durante 15 min. La solución fue centrifugada a 2500 x g durante 15 min a 4°C. Se recuperó el sobrenadante y el pellet se suspendió en el volumen original de tampón de homogenización diluido 0,5X y se volvió a centrifugar. Los dos sobrenadantes fueron combinados, centrifugados a 27 000 x g durante 30 min a 4°C para formar la fracción de BBMV. El pellet fue suspendido en 10 mi de tampón de homogenización y suministrado a inhibidores de proteasa y se volvió a centrifugar a 27 000 x g durante 30 min a 4°C para lavar las BBMV. El pellet resultante fue suspendido en tampón de almacenamiento de BBMV (HEPES 10 mM, KCI 130 mM, 10% de glicerol, pH 7,4) hasta una concentración de aproximadamente 3 mg/ml de proteína. La concentración de proteína fue determinada aplicando el método Bradford (1976) con albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. La determinación de fosfatasa alcalina se hizo antes de congelar las muestras mediante el ensayo Sigma respetando las instrucciones del fabricante. La actividad específica de esta enzima marcadora en la fracción de BBMV aumentó en general 7 veces con respecto a la que se encontró en la fracción de homogenado de intestino medio. Se hicieron alícuotas de las BBMV en muestras de 250 µ?, se las congeló inmediatamente en N2 líquido y se las almacenó a -80°C.

EJEMPLO 3 Método para medir la unión de proteínas Crv marcadas con 25l a proteínas de BBMV Unión de proteínas Crv marcadas con 125l a BBMV Para determinar la cantidad óptima de proteína de BBMV que se debe usar en los ensayos de fijación, se generó una curva de saturación. La proteína Cry radiomarcada con 125l (0,5 nM) fue inoculada durante 1 hora a 28°C con distintas cantidades de proteína de BBMV, que iban de 0 a 500 g/ml en tampón de unión (NaHPO4 8 mM, KH2P04 2 mM, NaCI 150 mM, 0, 1 % de albúmina de suero bovino, pH 7,4). El volumen total fue de 0,5 mi. La proteína Cry marcada con 25l fijada se separó de la no fijada tomando muestras de 150 µ? de la mezcla de reacción por triplicado de un tubo de 1 ,5 mi de centrífuga y colocándolas en un tubo de 500 µ? de centrífuga y centrifugando las muestras a 14 000 x g durante 6 minutos a temperatura ambiente. Se retiró el sobrenadante con cuidado, y se lavó el pellet también con cuidado tres veces en tampón de unión helado. El fondo de la centrífuga que contenía el pellet fue recortado y colocado en un tubo de cultivo de vidrio de 13 x 75 mm. Las muestras fueron contadas durante 5 minutos cada vez en el contador gamma. Los recuentos contenidos en la muestra fueron restados de los recuentos antecedentes (reacción sin proteínas) y se elaboró una gráfica contra la concentración de proteína de BBMV. Se determinó que la cantidad óptima de proteína que se debe usar es de 0, 15 mg/ml de proteína de BBMV.

Para determinar la cinética de la unión, se generó una curva de saturación. En pocas palabras, se incubaron BBMV (150 pg/ml) durante 1 hora a 28°C con concentraciones crecientes de toxina Cry marcada con 125l, que iban de 0,01 a 10 nM. La fijación total fue determinada tomando muestras de 150 µ? de cada concentración por triplicado, centrifugando la muestra y contando como se describió más arriba. La unión no específica fue determinada de la misma manera, agregando 1000 nM de la toxina Cry no radiactiva tripsinizada homologa añadida a la mezcla de reacción para saturar todos los sitios de unión inespecífica de receptores. La unión especifica fue calculada como la diferencia entre la unión total y la unión no específica.

Los ensayos de unión competitiva homógoga y heteróloga fueron realizados con 150 pg/ml de proteína de BBMV y 0,5 nM de la proteína Cry radiomarcada con 25l. La concentración de la toxina Cry competitiva sin radiomarca añadida a la mezcla de reacción iba de 0,045 a 1000 nM y fue añadida al mismo tiempo que el ligando radiactivo, para garantizar una verdadera competencia de unión. Las incubaciones se realizaron durante 1 hora a 28°C y se midió la cantidad de proteína Cry marcada con 125l fijada a su toxina receptora como se describió más arriba, restando la unión no específica. Se determinó el cien por ciento de la unión total en ausencia de ligando competidor. Los resultados fueron llevados a una gráfica semilogaritmica como porcentaje de unión específica total contra la concentración de ligando competitivo añadido.

EJEMPLO 4 Síntesis de los resultados La Figura 1 muestra el porcentaje de unión específica de CryIAb marcada con 125l (0,5 nM) en BBMV de ECB contra la competencia de CryIAb homologa no marcada (?) y Cry2Aa heteróloga (?). La curva del desplazamiento de la competencia homologa de CryIAb da como resultado una curva de forma sigmoide que muestra el 50% de desplazamiento del radioligando a aproximadamente 3 nM de CryIAb. Cry2Aa a una concentración de 1000 nM (2000 veces más que el desplazamiento de CryIAb marcada con 25l) da como resultado menos del 50% de desplazamiento. Las barras de error representan el rango de valores obtenidos de las determinaciones efectuadas por triplicado.

Referencias Wolfersberger, M.G., (1993), Preparation and Partial Characterization of Amino Acid Transporting Brush Border Membrane Vesicles from the Larval Midgut of the Gypsy Moth (Lymantria Dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol. 24: 139-147.

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APENDICE A Lista de endotoxinas delta - del sitio web de Crickmore et al. (citado en la solicitud) y su sitio web relacionado Nombre N.° de acc. Autores Año Cepa original Comentario Crv1Aa1 AAA22353 Schnepf et al 1985 Bt kurstaki HD1 Crv1Aa2 AAA22552 Shibano et al 1985 Bt sotto Crv1Aa3 BAA00257 Shimizu et al 1988 Bt aizawai IPL7 Crv1Aa4 CAA31886 Masson et al 1989 Bt entomocidus Crv1Aa5 BAA04468 Udayasuriyan et al 1994 Bt Fu-2-7 Crv1Aa6 AAA86265 Masson et al 1994 Bt kurstaki NRD-12 Crv1Aa7 AAD46139 Osman et al 1999 Bt C12 Secuencia de Crv1Aa8 126149 Liu 1996 ADN solamente Bt dendrolimus Crv1Aa9 BAA77213 Nagamatsu et al 1999 T84A1 Crv1Aa10 AAD55382 Hou y Chen 999 Bt kurstaki HD-1 -02 Crv1Aa1 1 CAA70856 Tounsi et al 1999 Bt kurstaki Crv1Aa12 AAP80146 Yao et al 2001 Bt Ly30 Crv1Aa13 AAM44305 Z ong et al 2002 Bt SOtto Crv1Aa14 AAP40639 Ren et al 2002 sin publicar Crv1Aa15 AAY66993 Sauka et al 2005 Bt lNTA Mol-12 Crv1 Ab1 AAA22330 Wabiko et al 1986 Bt berliner 1715 Crv1 Ab2 AAA22613 Thorne et al 1986 Bt kurstaki Crv1 Ab3 AAA22561 Geiser et al 1986 Bt kurstaki HD1 Crv1Ab4 BAA00071 Kondo et al 1987 Bt kurstaki HD1 Crv1Ab5 CAA28405 Hofte et al 1986 Bt berliner 1715 Crv1Ab6 AAA22420 Hefford et al 1987 Bt kurstaki NRD-12 Crv1 Ab7 CAA31620 Haider & Ellar 1988 Bt aizawai IC1 Crv1 Ab8 AAA22551 Oeda et al 1987 Bt aizawai IPL7 Crv1Ab9 CAA38701 Chak & Jen 1993 Bt aizawai HD133 Crv1Ab10 A29125 Fischhoff et al 1987 Bt kurstaki HD1 Secuencia de Crv1 Ab1 1 112419 Ely & Tippett 1995 Bt A20 ADN solamente Crv1 Ab12 AAC64003 Silva-Werneck et al 1998 Bt kurstaki S93 Crv1 Ab13 AAN76494 Tan et al 2002 Bt c005 Meza-Basso & Crv1Ab14 AAG16877 2000 Bt nativas chilenas Theoduloz Crv1 Ab15 AAO13302 L¡ et al 2001 Bt B-Hm-16 Crv1Ab16 AAK55546 Yu et al 2002 Bt AC-1 1 Crv1Ab17 AAT46 15 Huang et al 2004 Bt WB9 Crv1Ab18 AAQ88259 Stobdan et al 2004 Bt Crv1 Ab19 AAW31761 Zhong et al 2005 Bt X-2 Crv1Ab20 ABB72460 Liu et al 2006 BtC008 Crv1Ab21 ABS18384 Swiecicka et al 2007 Bt IS5056 Crv1Ab22 ABW87320 Wu and Feng 2008 BtS2491Ab CrvlAb- Secuencia AAK14336 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX24 similar incierta CrvlAb- Secuencia AAK14337 Nagarathinam et al 2001 similar Bt kunthala RX28 incierta CrvlAb- Secuencia AAK14338 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX27 similar incierta CrvlAb- Secuencia ABG88858 Lin et al 2006 Bt Iy4a3 similar insuficiente Crv1 Ac1 AAA22331 Adang et al 1985 Bt kurstaki HD73 Crv1Ac2 AAA22338 Von Tersch et al 1991 Bt kenyae Crv1Ac3 CAA38098 Dardenne et al 1990 Bt BTS89A Crv1Ac4 AAA73077 Feitelson 1991 Bt kurstaki PS85A1 Bt kurstaki Crv1Ac5 AAA22339 Feitelson 1992 PS81 GG Crv1Ac6 AAA86266 Masson et al 1994 Bt kurstaki NRD-12 Cry1 Ac7 AAB46989 Herrera et al 1994 Bt kurstaki HD73 Crv1 Ac8 AAC44841 Ornólo et al 997 Bt kurstaki HD73 Crv1 Ac9 AAB49768 Gleave et al 1992 Bt DSIR732 Bt kurstaki YBT- Crvl AdO CAA05505 Sun 1997 1520 Makhdoom & Crv1Ac11 CAA10270 1998 Riazuddin Secuencia de Crv1Ac12 112418 Ely & Tippett 1995 Bt A20 ADN solamente Crv1 Ac13 AAD38701 Qiao et al 1999 Bt kurstaki HD1 Crv1Ac14 AAQ06607 Yao et al 2002 Bt Ly30 Crv1 Ac15 AAN07788 Tzeng et al 2001 Bt de Taiwán Crv1 Ac16 AAU87037 Zhao et al 2005 Bt H3 Crv1 Ac17 AAX18704 Hire et al 2005 Bt kenyae HD549 Crv1Ac18 AAY88347 Kaur & Allam 2005 Bt SK-729 Crv1Ac19 ABD37053 Gao et al 2005 Bt C-33 Crv1Ac20 ABB89046 Tan et al 2005 Crv1Ac21 AAY66992 Sauka et al 2005 INTA Mol-12 Crv1 Ac22 ABZ01836 Zhang & Fang 2008 Bt W015-1 Crv1 Ac23 CAQ30431 Kashyap et al 2008 Bt Crv1Ac24 ABL01535 Arango et al 2008 Bt 146-158-01 Sin vinculo con el Cry1Ac25 FJ513324 Guan Peng et al 2008 Bt Tm37-6 NCBI julio 2009 Cry1Ac2S FJ617446 Guan Peng et al 2009 BtTm41-4 Sin vínculo con el NCBI julio 2009 Cry1Ac27 FJ6174 7 Guan Peng et al 2009 Bt Tm44-1B Sin vínculo con el NCBI julio 2009 Cry1Ac28 ACM90319 U et al 2009 Bt Q-12 Crv1Ad1 AAA22340 Feitelson 1993 Btaizawai PS81I Crv1Ad2 CAA01880 Anonymous 1995 Bt PS81RR1 Cry1Ae1 AAA22410 Lee & Aronson 1991 Bt alesti Cry1Af1 AAB82749 Kang et al 1997 Bt NT0423 Cry1Aq1 AAD46137 Mustafa 1999 Cry1A 1 AAQ14326 Tan et al 2000 Crv1Ah2 ABB76664 Qi et al 2005 Bt alesti Cry1Ai1 AA039719 Wang et al 2002 CrylA- AAK14339 Secuencia similar Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala nags3 incierta Cry Ba2 CAA65003 Soetaert 1996 Bt entomocidus HD110 Cry1Ba3 AAK63251 Zhang et al 2001 Cry1Ba4 AAK51084 Nathan et al 2001 Bt entomocidus HD9 Cry1Ba5 ABO20894 Song et al 2007 Bt sfw-12 Cry1Ba6 ABL60921 Martins et al 2006 Bt S601 Cry Bb1 AAA22344 Donovan et al 1994 Bt EG5847 Cry1Bc1 CAA86568 Bishop et al 994 Bt morrisoni Crv1Bd1 AAD10292 Kuo et al 2000 Bt wuhanensis HD525 Cry Bd2 AAM93496 Isakova et al 2002 Bt834 Crv1Be1 AAC32850 Payne et al 1998 BtPS158C2 Cry1Be2 AAQ52387 Baum et al 2003 Cry1Be3 FJ716102 Xiaodong Sun et al 2009 Sin vínculo con el NCBI julio 2009 Cry1Bf1 CAC50778 Arnaut et al 2001 Cry1Bf2 AAQ52380 Baum et al 2003 Cry Bql AAO39720 Wang et al 2002 Cry1Ca1 CAA30396 Honee et al Bt entomocidus 1988 60.5 Cry1Ca2 CAA31951 Sanchis et al 1989 Btaizawai 7.29 Cry1Ca3 AAA22343 Feitelson 993 Btaizawai PS81I Cry1Ca4 CAA01886 Bt entomocidus Van Mellaert et al 1990 HD110 Cry1Ca5 CAA65457 Strizhov 1996 Bt aizawai 7.29 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etal 1999 Bt YBT-032 Crv1Ea7 AAW72936 Huehne et al 2005 Bt JC190 Crv1Ea8 ABX1 258 Huang et al 2007 Bt H2M2 Crv1Eb1 AAA22346 Feitelson 1993 Bt aizawai PS81A2 Crv1Fa1 AAA22348 Chambers et al 1991 Bt aizawai EG6346 Crv1Fa2 AAA22347 Feitelson 1993 Bt aizawai PS81I Crv1Fb1 CAA80235 Lambert 1993 Bt BTS00349A Crv1Fb2 BAA25298 Masuda & Asano 1998 Bt morrisoni INA67 Crv1Fb3 AAF21767 Song et al 1998 Bt morrisoni Crv1Fb4 AAC 10641 Payne et al 1997 Crv1Fb5 AA013295 Li et al 2001 Bt B-Pr-88 Crv1Fb6 ACD50892 Huang et al 2008 Bt 012 Crv1Fb7 ACD50893 Huang et al 2008 Bt 087 Crv1Ga1 CAA80233 Lambert 1993 Bt BTS0349A Crv1Ga2 CAA70506 Shevelev et al 1997 Bt wuhanensis Crv1Gb1 AAD10291 Kuo & Chak 999 Bt wuhanensis HD525 Crv1Gb2 AA013756 Li et al 2000 Bt B-Pr-88 CrvIGc AAQ52381 Baum et al 2003 Cn 1Ha1 CAA80236 Lambert 1993 Bt BTS02069AA Crv1Hb1 AAA79694 Koo et al 1995 Bt morrisoni BF190 Crvl H- Secuencia AAF01213 Srifah et al 1999 Bt JC291 similar insuficiente Crv1 la1 CAA44633 Tailor et al 1992 Bt kurstaki Crv1 la2 AAA22354 Gleave et al 1993 Bt kurstaki Cry1 la3 AAC36999 Shin et al 1995 Bt kurstaki HD1 Crv1 la4 AAB00958 Kostichka et al 1996 Bt AB88 Cry1 la5 CAA70124 Selvapandiyan 1996 Bt 61 Crv1 la6 AAC26910 Zhong et al 1998 Bt kurstaki S101 Crv1 la7 AAM73516 Porcar et al 2000 Bt Crv1 la8 AAK66742 Song et al 2001 Crv1 la9 AAQ08616 Yao et al 2002 Bt Ly30 Cry1 la10 AAP86782 Espindola et al 2003 Bt thuringiensis Crv1 la1 1 CAC85964 Tounsi et al 2003 Bt kurstaki BNS3 Crv1 la12 AAV53390 Grossi de Sa et al 2005 Bt Crv1 la13 ABF83202 Martins et al 2006 Bt Crv1 la14 ACG63871 Liu & Guo 2008 Bt11 Sin vínculo con el Cry1 la15 FJ617445 Guan Peng et al 2009 Bt E-1 B NCBI julio 2009 Sin vinculo con el Cry1 la16 FJ617448 Guan Peng et al 2009 Bt E-1 a NCBI julio 2009 Bt entomocidus Crv1 lb1 AAA82114 Shin et al 1995 BP465 Crv1 lb2 ABW88019 Guan et al 2007 Bt PP61 Crv1 lb3 ACD75515 Liu & Guo 2008 Bt GS8 Crvl ld AAC62933 Osman et al 1998 Bt C18 Crv1 lc2 AAE71691 Osman et al 2001 Crv1 ld1 AAD44366 Choi 2000 Cn 1 le1 AAG43526 Song et al 2000 Bt BTC007 Crv1 lf1 AAQ52382 Baum et al 2003 Crvl l- Secuencia AAC31094 Payne et al 1998 similar insuficiente Crvl l- Secuencia ABG88859 Lin & Fang 2006 Bt Iy4a3 similar insuficiente CrvUal AAA22341 Donovan 1994 Bt EG5847 Von Tersen & CrvUbl AAA98959 1994 Bt EG5092 González CrvUd AAC31092 Payne et al 1998 Crv1Jc2 AAQ52372 Baum et al 2003 CrvUdl CAC50779 Arnaut et al 2001 Bt Crv1 Ka1 AAB00376 Koo et al 1995 Bt morrisoni BF1 Crv1 La1 AAS60191 Je et al 2004 Bt kurstaki K1 CP 1- Secuencia AAC31091 Payne et al 1998 similar insuficiente Crv2Aa1 AAA22335 Donovan et al 1989 Bt kurstaki Crv2Aa2 AAA83516 Widner & Whiteley 1989 Bt kurstaki HD1 Crv2Aa3 D86064 Sasaki et al 1997 Bt sotto Secuencia de ADN solamente Crv2Aa4 AAC04867 Misra et al 1998 Bt kenyae HD549 Crv2Aa5 CAA10671 Yu & Pang 1999 Bt SL39 Crv2Aa6 CAA 10672 Yu & Pang 1999 Bt YZ71 Crv2Aa7 CAA 10670 Yu & Pang 1999 Bt CY29 Crv2Aa8 AA013734 Wei et al 2000 Bt Dongbei 66 Crv2Aa9 AAO13750 Zhang et al 2000 Crv2Aa10 AAQ04263 Yao et al 2001 Crv2Aa11 AAQ52384 Baum et al 2003 Crv2Aa12 ABI83671 Tan et al 2006 Bt Rpp39 Crv2Aa13 ABL01536 Arango et al 2008 Bt 146-158-01 Crv2Aa14 ACF04939 Hire et al 2008 Bt HD-550 Crv2Ab1 AAA22342 Widner & Whiteley 1989 Bt kurstaki HD1 Crv2Ab2 CAA39075 Dankocsik et al 1990 Bt kurstaki HD1 Crv2Ab3 AAG36762 Chen et al 1999 Bt BTC002 Crv2Ab4 AA013296 Li et al 2001 Bt B-Pr-88 Crv2Ab5 AAQ04609 Yao et al 2001 Bt Iy30 Crv2Ab6 AAP59457 Wang et al 2003 Bt WZ-7 Crv2Ab7 AAZ66347 Udayasuriyan et al 2005 Bt 14-1 Crv2Ab8 ABC95996 Huang et al 2006 Bt WB2 Crv2Ab9 ABC74968 Zhang et al 2005 Bt LLB6 Crv2Ab10 EF157306 Lin et al 2006 Bt LyD Crv2Ab1 1 CAM84575 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT1 Crv2Ab12 ABM21764 Lin et al 2007 Bt LyD Crv2Ab13 ACG76120 Zhu et al 2008 Bt ywc5-4 Crv2Ab14 ACG76121 Zhu et al 2008 Bt Bts Crv2Ac1 CAA40536 Aronson 1991 Bt Shanghai S1 Crv2Ac2 AAG35 10 Song et al 2000 Crv2Ac3 AAQ52385 Baum et al 2003 Crv2Ac4 ABC95997 Huang et al 2006 Bt WB9 Crv2Ac5 ABC74969 Zhang et al 2005 Crv2Ac6 ABC74793 Xia et al 2006 Bt wuhanensis Crv2Ac7 CAL18690 Saleem et al 2008 Bt SBSBT-1 Crv2Ac8 CAM09325 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT1 Crv2Ac9 CAM09326 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT2 Crv2Ac10 ABN 15104 Bai et al 2007 Bt QCL-1 Crv2Ac1 1 CAM83895 Saleem et al 2007 Bt HD29 Crv2Ac12 CAM83896 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT3 Crv2Ad1 AAF09583 Choi et al 1999 Bt BR30 Crv2Ad2 ABC86927 Huang et al 2006 Bt WB10 Crv2Ad3 CAK29504 Saleem et al 2006 Bt 5_2AcT(1 ) Crv2Ad4 CAM32331 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT2 Crv2Ad5 CA078739 Saleem et al 2007 Bt HD29 Crv2Ae1 AAQ52362 Baum et al 2003 Crv2Af1 ABO30519 Beard et al 2007 Bt C81 Crv2Aq ACH91610 Zhu et al 2008 Bt JF19-2 Sin vínculo con el Cry2A EU939453 Zhang et al 2008 Bt NCBI julio 2009 Crv2Ah2 ACL80665 Z ang et al 2009 Bt BRC-ZQL3 Sin vínculo con el Cry2Ai FJ788388 Udayasuriyan et al 2009 Bt NCBI julio 2009 Crv3Aa1 AAA22336 Herrnstadt et al 1987 Bt san diego Crv3Aa2 AAA22541 Sekar et al 1987 Bt tenebrionis Crv3Aa3 CAA68482 Hofte et al 1987 Crv3Aa4 AAA22542 McPherson et al 1988 Bt tenebrionis Bt morrisoni Crv3Aa5 AAA50255 Donovan et al 1988 EG2158 Crv3Aa6 AAC43266 Adams et al 1994 Bt tenebrionis Crv3Aa7 CAB41411 Zhang et al 1999 Bt 22 Crv3Aa8 AAS79487 Gao y Cai 2004 Bt YM-03 Crv3Aa9 AAW05659 Bulla y Candas 2004 Bt UTD-001 Crv3Aa10 AAU29411 Chen et al 2004 Bt 886 Crv3Aa1 1 AAW82872 Kurt et al 2005 Bt tenebrionis Mm2 Crv3Aa12 ABY49136 Sezen et al 2008 Bt tenebrionis Crv3Ba1 CAA34983 Sick et al 1990 Bt tolworthi 43F Crv3Ba2 CAA00645 Peferoen et al 1990 Bt PGSI208 Crv3Bb1 AAA22334 Donovan et al 1992 Bt EG4961 Crv3Bb2 AAA74198 Donovan et al 1995 Bt EG5144 Secuencia de Crv3Bb3 115475 Peferoen et al 1995 ADN solamente Crv3Ca1 CAA42469 Lambert et al 1992 Bt kurstaki Btl109P Crv4Aa1 CAA68485 Ward & Ellar 1987 Bt israelensis Bt israelensis Crv4Aa2 BAA00179 Sen et al 1988 HD522 Crv4Aa3 CAD30148 Berry et al 2002 Bt israelensis Crv4A- Secuencia AAY96321 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9 similar insuficiente Chungjatpornchai Bt israelensis 4Q2- Crv4Ba1 CAA30312 1988 et al 72 Cn 4Ba2 CAA301 14 Tungpradubkul et al 1988 Bt israelensis Crv4Ba3 AAA22337 Yamamoto et al 1988 Bt israelensis Bt israelensis Crv4Ba4 BAA00178 Sen et al 1988 HD522 Crv4Ba5 CAD30095 Berry et al 2002 Bt israelensis Crv4Ba- Secuencia ABC47686 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9 similar insuficiente Cry4Ca 1 EU646202 Shu et al Sin vinculo con el 2008 NCBI julio 2009 Cry4Cb1 FJ403208 Jun & Furong Sin vínculo con el 2008 BÍ HS18-1 NCBI julio 2009 Cry4Cb2 FJ597622 Jun & Furong 2008 Sin vinculo con el Bt Ywc2-8 NCBI julio 2009 Cry4Cc1 FJ403207 Jun & Furong Sin vinculo con el 2008 Bt MC28 NCBI julio 2009 Crv5Aa1 AAA67694 Narva et al 1994 Bt darmstadiensis PS17 Crv5Ab1 MA67693 Narva et al Bt darmstadiensis 1991 PS17 Crv5Ac1 I34543 Payne et al 1997 Secuencia de ADN solamente Crv5Ad1 ABQ82087 Lenane et al 2007 Bt L366 Crv5Ba1 Foncerrada & AAA68598 1997 Narva Bt PS86Q3 Crv5Ba2 ABW88932 Guo et al 2008 YBT 1518 Crv6Aa1 AAA22357 Narva et al 1993 Bt PS52A1 Crv6Aa2 AAM46849 Bai et al 2001 YBT 1518 Crv6Aa3 ABH03377 Jia et al 2006 Bt 96418 Crv6Ba1 AAA22358 Narva et al 1991 Bt PS69D1 Crv7Aa1 AAA22351 Lambert et al Bt galleriae 1992 PGSI245 Crv7Ab1 AAA21 120 Narva & Fu 1994 Bt dakota HD51 1 Crv7Ab2 AAA21 121 Narva & Fu Bt kumamotoensis 1994 867 Crv7Ab3 ABX24522 Song et al 2008 Bt WZ-9 Cry7Ab4 EU380678 Shu et al 2008 Sin vínculo con el Bt NCBI julio 2009 Crv7Ab5 ABX79555 Bt monterrey GM- Aguirre-Arzola et al 2008 33 Crv7Ab6 ACI44005 Deng et al 2008 Bt HQ122 Sin vínculo con el Cry7Ab7 FJ940776 Wang et al 2009 NCBI septiembre 2009 Sin vínculo con el Cry7Ab8 GU 145299 Feng Jing 2009 NCBI noviembre 2009 Crv7Ba1 ABB70817 Zhang et al 2006 Bt huazhongensis Crv7Ca1 ABR67863 Gao et al 2007 Bt BTH-13 Crv7Da1 ACQ99547 Y¡ et al 2009 Bt LH-2 Crv8Aa1 AAA21 117 Narva & Fu 1992 Bt kumamotoensis Cry8Ab1 EU044830 Cheng et al 2007 Bt B-JJX Sin vínculo con el NCBI julio 2009 Crv8Ba1 AAA21 1 18 Narva & Fu 1993 Bt kumamotoensis Crv8Bb1 CAD57542 Abad et al 2002 Crv8Bc1 CAD57543 Abad et al 2002 Bt japonensis Crv8Ca1 AAA21 1 19 Sato et al. 1995 Buibui Crv8Ca2 AAR98783 Shu et al 2004 Bt HBF-1 Sin vínculo con el Cry8Ca3 EU625349 Du et al 2008 Bt FTL-23 NCBI julio 2009 Crv8Da1 BAC07226 Asano et al 2002 Bt galleriae Secuencia de Crv8Da2 BD133574 Asano et al 2002 Bt ADN solamente Secuencia de Crv8Da3 BD133575 Asano et al 2002 Bt ADN solamente Crv8Db1 BAF93483 Yamaguchi et al 2007 Bt BBT2-5 Crv8Ea1 AAQ73470 Fuping et al 2003 Bt 185 Sin vínculo con el Cry8Ea2 EU047597 Liu et al 2007 Bt B-DLL NCBI julio 2009 También Crv8Fa1 AAT48690 Shu et al 2004 Bt 185 AAW81032 Crv8Ga1 AAT46073 Shu et al 2004 Bt HBF-18 Cn 8Ga2 ABC42043 Yan et al 2008 Bt 145 Sin vínculo con el Cry8Ga3 FJ 198072 Xiaodong et al 2008 Bt FCD1 14 NCBI julio 2009 Sin vínculo con el Cry8Ha1 EF465532 Fuping et al 2006 Bt 185 NCBI julio 2009 Sin vínculo con el Cry8la1 EU381044 Yan et al 2008 Bt su4 NCBI julio 2009 Sin vinculo con el Cry8Ja1 EU625348 Du et al 2008 Bt FPT-2 NCBI julio 2009 Sin vínculo con el Cry8Ka1 FJ422558 Quezado et al 2008 NCBI julio 2009 Crv8Ka2 ACN87262 Noguera & Ibarra 2009 Bt kenyae Cry8- Secuencia de FJ770571 Noguera & Ibarra 2009 Bt canadensis similar ADN solamente Cr/8- ABS53003 Mangena et al 2007 Bt similar Cr/9Aa1 CAA41 122 Shevelev et al 1991 Bt galleriae Crv9Aa2 CAA41425 Gleave et al 1992 Bt DSIR517 Sin vínculo con el Cry9Aa3 GQ249293 Su et al 2009 Bt SC5(D2) NCBI julio 2009 Sin vinculo con el Cry9Aa4 GQ249294 Su et al 2009 Bt T03C001 NCBI julio 2009 Crv9Aa- Secuencia AAQ52376 Baum et al 2003 similar incompleta Crv9Ba1 CAA52927 Shevelev et al 1993 Bt galleriae Crv9Bb1 AAV28716 Silva-Werneck et al 2004 Bt japonensis Crv9Ca1 CAA85764 Lambert et al 1996 Bt tolworthi Crv9Ca2 AAQ52375 Baum et al 2003 Crv9Da 1 BAA19948 Asano 1997 Bt japonensis N 141 Crv9Da2 AAB97923 Wasano & Ohba 1998 Bt japonensis Sin vínculo con el Cry9Da3 GQ249295 Su et al 2009 Bt T03B001 NCBI julio 2009 Sin vínculo con el Cry9Da4 GQ249297 Su et al 2009 Bt T03B001 NCBI julio 2009 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israelensis CrylOA- Secuencia DQ167578 Mahalakshmi et al 2006 Bt LDC-9 similar incompleta Cry11Aa1 AAA22352 Donovan et al 1988 Bt israelensis Crv11 Aa2 AAA2261 1 Adams et al 1989 Bt israelensis Cry11Aa3 CAD30081 Berry et al 2002 Bt israelensis Crv11 Aa- Secuencia DQ166531 Mahalakshmi et al 2007 Bt LDC-9 similar incompleta Cry11 Ba1 CAA60504 Delecluse et al 1995 Bt jegathesan 367 Crv11 Bb1 AAC97162 Orduz et al 1998 Bt medellin Cry12Aa1 AAA22355 Narva et al 1991 Bt PS33F2 Cry13Aa1 AAA22356 Narva et al 1992 Bt PS63B Crv14Aa1 AAA21516 Narva et al 1994 Bt sotto PS80JJ1 Cry15Aa1 AAA22333 Brown & Whiteley 1992 Bt thompsoni Crv16Aa1 CAA63860 Barloy et al 996 Cb malaysia CH18 Crv17Aa1 CAA67841 Barloy et al 1998 Cb malaysia CH18 Paenibacillus Cry18Aa1 CAA67506 Zhang et al 1997 popilliae Paenibacillus Cry18Ba1 AAF89667 Patel et al 1999 popilliae Paenibacillus Cry18Ca1 AAF89668 Patel et al 1999 popilliae Cry19Aa1 CAA68875 Rosso & Delecluse 1996 Bt jegathesan 367 Cry19Ba1 BAA32397 Hwang et al 1998 Bt higo Cry20Aa1 AAB93476 Lee & Gill 1997 Bt fukuokaensis Cry20Ba1 ACS93601 Noguera & Ibarra 2009 Bt higo LBIT-976 Cry20- Secuencia de GQ144333 Y¡ et al 2009 Bt Y-5 similar ADN solamente Secuencia de Crv21Aa1 I32932 Payne et al 1996 ADN solamente Secuencia de Crv21 Aa2 I66477 Feitelson 1997 ADN solamente Crv21 Ba1 BAC06484 Sato & Asano 2002 Bt roskildiensis Secuencia de Cry22Aa1 I34547 Payne et al 1997 ADN solamente Crv22Aa2 CAD43579 Isaac et al 2002 Bt Crv22Aa3 ACD9321 1 Du et al 2008 Bt FZ-4 Crv22Ab1 AAK50456 Baum et al 2000 Bt EG4140 Cry22Ab2 CAD43577 Isaac et al 2002 Bt Crv22Ba1 CAD43578 Isaac et al 2002 Bt Binaria con Crv23Aa1 AAF76375 Donovan et al 2000 Bt Cry37Aa1 Cry24Aa1 AAC61891 Kawalek y Gill 1998 Bt jegathesan Crv24Ba1 BAD32657 Ohgushi et al 2004 Bt sotto Crv24Ca1 CAJ43600 Beron & Salerno 2005 Bt FCC-41 Crv25Aa1 AAC61892 Kawalek y Gill 1998 Bt jegathesan Wojciechowska et Crv26Aa1 AAD25075 1999 Bt finitimus B-1 166 al Crv27Aa1 BAA82796 Saitoh 1999 Bt higo Wojciechowska et Cry28Aa1 AAD24189 1999 Bt finitimus B-1 161 al Cry28Aa2 AAG00235 Moore y Debro 2000 Bt finitimus Crv29Aa1 CAC80985 Delecluse et al 2000 Bt medellin Crv30Aa1 CAC80986 Delecluse et al 2000 Bt medellin Cry30Ba1 BAD00052 Ito et al 2003 Bt entomocidus Crv30Ca1 BAD67157 Ohgushi et al 2004 Bt sotto Crv30Ca2 ACU24781 Sun y Park 2009 Bt jegathesan 367 Sin vínculo con el Cry30Da1 EF095955 Shu et al 2006 Bt Y41 NCBI julio 2009 Bt aizawai BUN1 - BAE80088 Kishida et al 2006 14 ACC95445 Fang et al 2007 Bt S2160-1 Sin vínculo con el FJ499389 Jun et al 2008 Bt Ywc2-8 NCBI julio 2009 ACI22625 Tan et al 2008 Bt MC28 I ACG60020 Zhu et al 2008 Bt HS18-1 Crv31Aa1 BAB1 1757 Saitoh & Mizuki 2000 Bt 84-HS-1 -1 1 Cry31 Aa2 AAL87458 Jung y Cote 2000 Bt M15 Cry31 Aa3 BAE79808 Uemori et al 2006 Bt B0195 Cry31Aa4 BAF32571 Yasutake et al 2006 Bt 79-25 Cry31 Aa5 BAF32572 Yasutake et al 2006 Bt 92-10 Cry31Ab1 BAE79809 Uemori et al 2006 Bt B0195 Crv31 Ab2 BAF32570 Yasutake et al 2006 Bt 31 -5 Cry31Ac1 BAF34368 Yasutake et al 2006 Bt 87-29 Balasubramanian Crv32Aa1 AAG3671 1 2001 et al Bt yunnanensis Crv32Ba1 BAB78601 Takebe et al 2001 Bt Crv32Ca1 BAB78602 Takebe et al 2001 Bt Cry32Da1 BAB78603 Takebe et al 2001 Bt Crv33Aa1 AAL26871 Kim et al 2001 Bt dakota Crv34Aa1 AAG50341 El!is et al Binaria con 2001 Bt PS80JJ 1 Cry35Aa1 Crv34Aa2 AAK64560 Binaria con Rupar et al 2001 Bt EG5899 Cry35Aa2 Cry34Aa3 AAT29032 Binaria con Schnepf et al 2004 Bt PS69Q Cry35Aa3 Cry34Aa4 AAT29030 Binaria con Schnepf et al 2004 Bt PS185GG Cry35Aa4 Crv34Ab1 AAG41671 Binaria con Moellenbeck et al 2001 Bt PS149B1 Cry35Ab1 Cry34Ac1 AAG501 18 Ellis et al Binaria con 2001 Bt PS167H2 Cry35Ac1 Crv34Ac2 AAK64562 Binaria con Rupar et al 2001 Bt EG9444 Cry35Ab2 Cry34Ac3 AAT29029 Binaria con Schnepf et al 2004 Bt K 1369 Cry35Ab3 Cry34Ba1 AAK64565 Rupar et al Binaria con 2001 Bt EG4851 Cry35Ba1 Crv34Ba2 AAT29033 Binaria con Schnepf et al 2004 Bt PS201 L3 Cry35Ba2 Crv34Ba3 AAT29031 Binaria con Schnepf et al 2004 Bt PS201 HH2 Cry35Ba3 Cry35Aa1 AAG50342 Ellis et al Binaria con 2001 Bt PS80JJ1 Cry34Aa1 Crv35Aa2 AAK64561 Rupar et al Binaria con 2001 Bt EG5899 Cry34Aa2 Cry35Aa3 AAT29028 Schnepf et al 2004 Binaria con Bt PS69Q Cry34Aa3 Cry35Aa4 AAT29025 Binaria con Schnepf et al 2004 Bt PS185GG Cry34Aa4 Cry35Ab1 AAG41672 Moellenbeck et al Binaria con 2001 Bt PS149B1 Cry34Ab1 Crv35Ab2 AAK64563 Rupar et al Binaria con 2001 Bt EG9444 Cry34Ac2 Cry35Ab3 AY536891 AAT29024 2004 Bt KR1369 Binaria con Cry34Ab3 Cry35Ac1 AAG501 17 Ellis et al 2001 Bt PS167H2 Binaria con Cry34Ac1 Cry35Ba1 AAK64566 Rupar et al 2001 Bt EG4851 Binaria con Cry34Ba 1 Crv35Ba2 AAT29027 Schnepf et al 2004 Bt PS201 L3 Binaria con Cry34Ba2 Cry35Ba3 AAT29026 Schnepf et al 2004 Bt PS201 HH2 Binaria con Cry34Ba3 Crv36Aa1 AA 6 558 Rupar et al 2001 Bt Crv37Aa1 AAF76376 Donovan et al 2000 Bt Binaria con Cry23Aa Crv38Aa1 AAK64559 Rupar et al 2000 Bt Crv39Aa1 BAB72016 Ito et al 2001 Bt aizawai Crv40Aa1 BAB72018 Ito et al 2001 Bt aizawai Crv40Ba1 BAC77648 Ito et al 2003 Bun 1-14 Cry40Ca1 EU381045 Shu et al 2008 Bt Y41 Sin vínculo con el NCBI julio 2009 Crv40Da1 ACF15199 Zhang et al 2008 Bt S2096-2 Crv41Aa1 BAD35157 Yamashita et al 2003 Bt A1462 Crv41 Ab1 8AD35163 Yamashita et al 2003 Bt A1462 Crv42Aa1 BAD35166 Yamashita et al 2003 Bt A1462 Crv43Aa1 BAD15301 Yokoyama y P. lentimorbus Tanaka 2003 semadara Crv43Aa2 BAD95474 Nozawa 2004 P. popilliae popilliae Crv43Ba1 Yokoyama y BAD15303 P. lentimorbus Tanaka 2003 semadara Crv43-like BAD 15305 Yokoyama y Tanaka 2003 P. lentimorbus semadara Crv44Aa BAD08532 Ito et al Bt entomocidus 2004 INA288 Crv45Aa BAD22577 Okumura et al 2004 Bt 89-T-34-22 Cn 46Aa BAC79010 Ito et al 2004 Bt dakota Crv46Aa2 BAG68906 Ishikawa et al 2008 Bt A1470 Crv46Ab BAD35170 Yamagiwa et al 2004 Bt Crv47Aa AAY24695 Kongsuwan et al 2005 Bt CAA890 Crv48Aa CAJ18351 Jones y Berry 2005 Bs IAB59 Binaria con 49Aa Crv48Aa2 CAJ86545 Jones y Berry 2006 Bs 47-6B Binaria con 49Aa2 Crv48Aa3 CAJ86546 Jones y Berry 2006 Bs NHA15b Binaria con 49Aa3 Crv48Ab CAJ86548 Jones y Berry 2006 Bs LP1G Binaria con 49Ab1 Crv48Ab2 CAJ86549 Jones y Berry 2006 Bs 2173 Binaria con 49Aa4 Cry49Aa CAH56541 Jones y Berry 2005 Bs IAB59 Binaria con 48Aa Binaria con Crv49Aa2 CAJ86541 Jones y Berry 2006 Bs 47-6B 48Aa2 Crv49Aa3 CAJ86543 Jones y Berry Binaria con 2006 BsNHA15b 48Aa3 Crv49Aa4 Binaria con CAJ86544 Jones y Berry 2006 Bs 2173 48Ab2 Binaria con Crv49Ab1 CAJ86542 Jones y Berry 2006 Bs LP1 G 48Ab1 Crv50Aa1 BAE86999 Ohgushi et al 2006 Bt sotto Crv51 Aa1 AB114444 Meng et al 2006 Bt F14-1 Sin vínculo con el Cry52Aa1 EF613489 Song et al 2007 Bt Y41 NCBI julio 2009 Sin vinculo con el Cry52Ba1 FJ361760 Jun et al 2008 Bt BM59-2 NCBI julio 2009 Sin vínculo con el Cry53Aa1 EF633476 Song et al 2007 Bt Y41 NCBI julio 2009 Cry53Ab1 Sin vínculo con el FJ361759 Jun et al 2008 Bt MC28 NCBI julio 2009 Cry54Aa1 ACA52194 Tan et al 2009 Bt MC28 Crv55Aa1 ABW88931 Guo et al 2008 YBT 1518 Crv55Aa2 AAE33526 Bradfisch et al 2000 BT Y41 Sin vínculo con el Cry56Aa1 FJ597621 Jun & Furong 2008 Bt Ywc2-8 NCBI julio 2009 Sin vínculo con el Cry56Aa2 GQ483512 Guan Peng et al 2009 Bt G7-1 NCBI agosto 2009 Crv57Aa1 ANC87261 Noguera & Ibarra 2009 Bt kim Crv58Aa1 ANC87260 Noguera & Ibarra 2009 Bt entomocidus Cry59Aa1 ACR43758 Noguera & Ibarra 2009 Bt kim LBIT-980 US ¡W09818932 6656908 Vip3Aa6 Jav90 Sup AAR81081 Feitelson et al ¡1998 ¦Bt !(A2,A3) 7 de diciembre smayo 1998 !2003 Vip3Aa7 Vip83 AAK95326 Cai et al 2001 sin publicar 'Bt YBT-833 Loguercio et Vip3Aa8 Vip3A AAK97481 12001 sin publicar ¡Bt HD125 al iSelvapandiya Vip3Aa9 VipS CAA76665 ¡sin publicar ¡Bt A13 n et al Vip3Aa10 Vip3V AAN60738 ¡Doss et al jBt Vip3Aa11 Vip3A AAR36859 Liu et al ¡2003 sin publicar Bt C9 Vip3Aa12 Vip3A-WB5 AAM22456 Wu y Guan 2003 sin publicar ¡Bt Vip3AaÍ9 Vip3ALD DQ241674 Liu et al •2006 ¡sin publicar ÍBt AL ¡Vip3Aa19 Vip3A-1 DQ539887 iHart et ai ¡2006' ¡sin publicar Vip3Aa20 ,Vip3A-2 DQ539888 .Hart et al 2006 ¡sin publicar Vip3Aa21 'Vip ABD84410 ¡Panbangred Í2006 sin publicar ¡Bt aizawai Vip3Aa22 Vip3A-LS1 AAY41427 ,Lu et al ¡2005 ¡sin publicar ÍBt LS1 ,Vip3Aa23 Vip3A-LS8 AAY41428 ÍLu et al 2005 sin publicar ¡Bt LS8 Vip3Aa24 ; Bl 880913 ;Song et al ¡2007 ¡sin publicar ÍBt WZ-7 Vip3Aa25 EF608501 !Hsieh et al ¡2007 ¡sin publicar L Vip3Aa26 EU 294496 :Shen y Guo ¡2007" sin publicar Bt TF9 Vip3Aa27 EU332167 ;Shen y Guo ¡2007 sin publicar ¡Bt 16 Vip3Aa28 FJ494817 sXiumei Yu 12008 sin publicar Bt JF23-8 Vip3Aa29 FJ626674 'Xieumei et al 2009 sin publicar ¡Bt JF21-1 ,Vip3Aa30 . FJ626675 ¦Xieumei et al ¡2009 sin publicar |MD2-1 Vip3Aa31 FJ626676 iXieumei et al 2Ó0S sin publicar ÍJF21-1 V¡p3Aa32 FJ626677 Xieumei et al 2009 sin publicar MD2-1 Vip3Ab1 Vip3B AAR40284 Vip3Ab2 Vip3D AAY88247 !Feng y Shen '2006 'sin publicar Bt 'Solicitud .estado- ,V¡p3Ac1 ;PS49C INarva et al ¡. junidense 1200401287 !16 Solicitud 'estado¬ V¡p3Ad1 PS158C2 ¡Narva et al unidense 200401287 Vip3Ad2 .ISP3B CAI43276 ¡Van Rie et al ¡2005 V¡p3Ae1 ISP3C CAI43277 *Van Rie et al '2005 sin publicar 'Bt Vip3Af1 ISP3A CAI43275 'Van Rie et al !2005 isin publicar ¡Bt WO Vip3Af2 Vip3C ADN08753 ÍSyngenta Í03/075655 WO Vip3Ag1 Vip3B ADN08758 Syngenta 02/078437 Vip3Ag2 FJ556803 !Audtho et al ;Bt ;Vip3Ah1 Vip3S DQ832323 ¡L¡ y Shen ;2006 sin publicar Bt Vip3Ba1 AAV70653 jRang et al ¡2004 ¡sin publicar WO ÍVip3Bb1 ;Vip3Z 'ADN08760 -Syngenta 03/075655 ÍVip3Bb2 EF439819 !Akhurst et al ¡2007

Claims (23)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 . - Una planta transgénica que comprende ADN que codifica una proteína insecticida Cry Ab y ADN que codifica una proteína insecticida Cry2Aa.

2. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente ADN que codifica una tercera proteína insecticida, tercera proteína que se selecciona del grupo integrado por Cry1 Fa, Cry1 Be, Cry11 y DIG-3.

3. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha tercera proteína se selecciona del grupo integrado por CryI Fa y CryI Be, dicha planta comprende adicionalmente ADN que codifica las cuarta y quinta proteínas insecticidas seleccionadas del grupo integrado por CryI Ca, CryI Da, CryI E y Vip3Ab.

4. - Una semilla de una planta como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha semilla comprende dicho ADN.

5. - Un campo de plantas que comprende plantas refugio no Bt y una pluralidad de plantas como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas plantas de refugio comprenden menos del 40% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.

6. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos del 30% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.

7. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos del 20% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.

8. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos del 10% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.

9.- El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos del 5% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.

10. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio están dispuestas en bloques o en franjas.

1 1 . - Una mezcla de semillas que comprende semillas de refugio de plantas refugio no Bt, y una pluralidad de semillas como la que se reclama en la reivindicación 4, en donde dichas semillas de refugio comprenden menos del 40% de todas las semillas de la mezcla.

12.- La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos del 30% de todas las semillas de la mezcla.

13.- La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos del 20% de todas las semillas de la mezcla.

14 - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos del 10% de todas las semillas de la mezcla.

1 5. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos del 5% de todas las semillas de la mezcla.

16. - Un método para manejar el desarrollo de la resistencia a una proteína Cry en un insecto, método que comprende plantar semillas para producir un campo de plantas como el que se reclama en la reivindicación 5.

17 - Un campo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-10, caracterizado además porque dichas plantas ocupan más de 10 acres (-4.048 ha).

18 - Una planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizada además porque dicha planta se selecciona del grupo integrado por maíz, soya y algodón.

19.- La planta de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque dicha planta es una planta de maíz.

20.- Una célula de planta de una planta como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde dicha célula de planta comprende dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida CryI Ab y dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida Cry2Aa, en donde dicha proteína insecticida CryIAb es por lo menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 1 y dicha proteína insecticida Cry2Aa es por lo menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 2.

21. - La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada además porque dicha proteína insecticida CryIAb comprende la SEQ ID NO: 1 y dicha proteína insecticida Cry2Aa comprende la SEQ ID NO: 2.

22. - Un método de producir una planta de célula como la que se reclama en la reivindicación 20.

23. - Un método para controlar el insecto perforador de maíz europeo poniendo en contacto dicho insecto con una proteína insecticida CryIAb y una proteína insecticida Cry2Aa.