CN102108399B - 转基因棉花检测芯片、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及转基因棉花检测芯片，该芯片包括基片和位于基片上的核酸探针，该核酸探针由选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.20和SEQID NO.23的核酸探针中的一个或多个核酸探针组成。本发明还涉及包含本发明的转基因棉花检测芯片的试剂盒，检测转基因棉花的方法，以及本发明的转基因棉花检测芯片和试剂盒在检测转基因棉花中的应用。使用本发明的转基因棉花检测芯片能够简单、高通量、快速、特异且灵敏地测定转基因棉花。

Description

转基因棉花检测芯片、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及转基因棉花检测芯片、试剂盒及应用。

背景技术

转基因生物是指利用生物技术，将外源基因转移到其它物种中以改造其遗传特性，从而获得具有人类所需性状、营养品质的生物新品种。

转基因棉花的发展状况

棉花是一种重要的经济作物，全世界有18亿人口以种植棉花为生。从1987年第一例转基因棉花在美国诞生至今，棉花基因工程的研究工作迅速在全世界展开。目前我国通过国家和省级审定的转基因棉花品种50多个，累计推广600多万公顷。至今已培育出抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆及品质改良等特质的转基因棉花品系，为改良棉花品种、提高产量以及解决环境问题提供了行之有效的方法。

转基因棉花的国内外监管

随着转基因作物的广泛种植，作为一种新兴的生物技术，其对人体健康、生态平衡是否具有危害还未确定。它潜在的安全性如转基因食品的过敏性、生态危害等越来越受到消费者的关注。

世界上主要国家都已立法对转基因产品进行管理，美国、欧盟、日本、韩国、澳大利亚、新加坡的法律明确规定，转基因品种需经政府批准，并经严格的生物安全、环境安全测试才可以田间种植、环境释放及作为食品、饲料，欧盟、日本、韩国、澳大利亚、新加坡等要求转基因产品进行标识，并规定了相应阈值水平。我国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安全管理条例》，规定对农业转基因生物实行检验检疫。2002年3月20日，棉花等5类17种产品，成为我国第一批正式实施转基因标识制度的农业转基因生物。由于转基因棉花产品的国内外贸易迅速发展，因此转基因棉花的检测显得尤为重要。

转基因棉花的检测方法

转基因棉花检测可分为两类方法，一类是核酸检测，当外源基因插入到受体细胞染色体时，一般要构建启动子、终止子、选择标记基因和报告基因，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，胭脂碱合酶NOS终止子等，转基因食品核酸检测的靶标是插入的外源基因，包括外源基因的整合位点、启动子、终止子、选择标记基因和报告基因的核酸序列。另一类是蛋白检测，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，已有多种转基因棉花蛋白检测方法在转基因检测领域中投入了使用。

核酸检测主要应用PCR方法和基因芯片技术。PCR方法具有很高的灵敏度，在转基因领域使用最为广泛。与蛋白质具有组织特异性相比，PCR技术不受到材料的限制。另外，核酸比蛋白质稳定，变性之后容易复性，在加工食品中仍可检出。基因芯片(DNA Microarray)，又称为DNA微探针阵列。随着转基因技术的大量应用，转基因的品种越来越多，所转的外源基因种类越来越庞杂，普通PCR技术一次只能检测一种转基因成分，利用普通PCR技术往往不能获得转基因植物的完整信息，特别当大量的不同品系转基因存在于同一待测样品中时。相比之下，DNA芯片检测一次可以定性筛选大量不同种类的报告基因、启动子、终止子、外源基因，如将通用的报告基因、抗性基因、启动子和终止子等常用转基因元件制成检测芯片与待测样品杂交，即可鉴别出样品中所含的各种转基因成分。基因芯片具有高通量、集成化的特点，在转基因棉花监管、国内外转基因棉花检验中，将会有越来越广泛的应用。

目前，国内外少见报道利用芯片技术快速、高通量地检测转基因棉花的方法。

因此，本领域需要一种快速、高通量、特异性好、灵敏度高的转基因棉花检测方法，进行转基因棉花的检测。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供高通量、操作简单、特异且灵敏地检测转基因棉花的芯片。

本发明的另一个目的在于，提供包括本发明的转基因棉花检测芯片的试剂盒。

本发明的再一个目的在于，提供一种可视性检测转基因棉花的方法。

本发明的再一个目的在于，提供本发明的芯片和试剂盒在检测转基因棉花中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明根据从有关数据库和文献收集的序列资料设计了针对转基因棉花品系3006-210-23、转基因棉花品系281-24-236、转基因棉花品系LLCOTTN 25、转基因棉花品系Mon531、转基因棉花品系Mon15985、转基因棉花品系Mon1445、转基因棉花品系GHB614和转基因棉花品系GK128个品系的外源基因设计了特异性寡核苷酸引物对和探针。通过大量的筛选工作建立了稳定的PCR体系。将核酸探针点布在基片上，制备成用于转基因农产品检测的芯片。芯片与PCR扩增的待测样品杂交，根据杂交信号直观的确定待测样品中是否含有外源目标基因。

根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于检测转基因棉花的芯片，所述芯片包括基片和位于基片上的核酸探针，所述核酸探针包括选自核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.23的核酸探针中的一种或多种核酸探针，其中在所述探针的5’端从5’到3’方向依次连接有醛基基团(ALD)10-20个脱氧腺嘌呤核苷酸残基，并通过氨醛缩合反应固定在基片上。在本发明的芯片中，所述核酸探针是针对转基因棉花中外源基因插入位点处的旁侧序列设计的。在一个优选的实施方案中，本发明的芯片包括基片和位于基片上的核苷酸序列为SEQ ID NO.3(针对转基因棉花品系3006-210-23旁侧序列)、SEQ ID NO.5(针对转基因棉花品系281-24-236旁侧序列)、SEQ ID NO.8(针对转基因棉花品系LLCOTTN 25旁侧序列)、SEQ ID NO.11(针对转基因棉花品系Mon531旁侧序列)、SEQ ID NO.14(针对转基因棉花品系Mon15985旁侧序列)、SEQ ID NO.17(针对转基因棉花品系Mon1445旁侧序列)、SEQ ID NO.20(针对转基因棉花品系GHB614旁侧序列)和SEQ ID NO.23(针对转基因棉花品系GK12)的全部核酸探针，其中在所述探针的5’到3’端依次连接有ALD和10-20个脱氧腺嘌呤核苷酸残基(a)。在一个实施方案中，本发明的芯片为可视芯片。在本发明的芯片中，所述基片为聚苯乙烯材料、玻璃片和经特殊处理的硅片等。在优选的实施方案中，为了控制杂交反应结果，本发明的转基因棉花检测芯片设有严格的质控，包括阳性对照和阴性对照。如果杂交后阴性对照点没有检测到信号，表明正常，如果有信号，表明杂交失败。为了监控杂交反应中假阴性的出现，设立阳性对照，阳性对照探针为与目标检测基因无关的核苷酸片段。在一个优选的实施方案中，所述阳性对照探针为20个脱氧腺嘌呤核苷酸残基组成，例如SEQ ID No.22。在一个优选的实施方案中，为监控杂交结果的准确性，每个探针在芯片上至少重复2个点，例如至少重复3个点，至少重复4个点，至少重复5个点，至少重复6个点或以上。在杂交后同一探针的所有点如果信号一致，表明正常，如果有的点没有信号，则重新进行实验进行验证。

在本发明中，所述棉花包括棉花原材料及其加工产品。所述原料包括但不限于棉花的根、茎、叶、花、果实、种子等，所述加工产品包括简单加工和深加工产品。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供一种转基因棉花检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明的转基因棉花检测芯片和用于PCR扩增的与所述芯片上的探针相对应的特异性寡核苷酸引物对，所述引物对包括以下一对或多对引物：

用于扩增转基因棉花品系3006-210-23的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；扩增转基因棉花品系281-24-236的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4；扩增转基因棉花品系LLCOTTN 25的SEQID NO.6和SEQ ID NO.7；扩增转基因棉花品系Mon531的SEQID NO.9和SEQ ID NO.10；扩增转基因棉花品系Mon15985的SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13；扩增转基因棉花品系Mon1445的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；扩增转基因棉花品系GHB614的SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19；扩增转基因棉花品系GK12的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22，所述引物的5’端连接有共价结合的生物素。

在一个优选的实施方案中，本发明的转基因棉花检测试剂盒还包括用于可视性检测转基因棉花的辣根过氧化物酶标记的亲和素抗体和辣根过氧化物酶的底物。优选地，在本发明的转基因棉花检测试剂盒中，所述辣根过氧化物酶的底物为四甲基联苯胺。

在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用于样品DNA提取的试剂和用于PCR反应的试剂以及使用说明书。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒中的使用说明书包括对转基因棉花检测的PCR扩增条件的描述。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供检测转基因棉花的方法，所述方法包括：

(1)提取待测棉花的DNA，所述棉花包括棉花原料和/或棉花加工产品；

(2)使用以下一对或多对引物进行PCR扩增；

用于扩增转基因棉花品系3006-210-23的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；扩增转基因棉花品系281-24-236的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4；扩增转基因棉花品系LLCOTTN 25的SEQID NO.6和SEQ ID NO.7；扩增转基因棉花品系Mon531的SEQID NO.9和SEQ ID NO.10；扩增转基因棉花品系Mon15985的SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13；扩增转基因棉花品系Mon1445的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；扩增转基因棉花品系GHB614的SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19；扩增转基因棉花品系GK12的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22，所述引物的5’端连接有共价结合的生物素。

(3)将PCR扩增产物与本发明所述的转基因棉花检测芯片杂交；

(4)将步骤(3)的芯片与辣根过氧化物酶标记的亲和素抗体杂交，洗涤；和

(5)在步骤(4)的芯片上加入辣根过氧化物酶的底物进行反应，水洗，干燥；

(6)观察颜色变化，确定所述待测棉花是否为转基因棉花。

根据本发明的一个优选实施方案，在本发明的转基因棉花检测方法中，使用实时荧光PCR方法进行样品DNA的扩增。在另一个优选的实施方案中，在本发明的转基因棉花检测方法中，所述辣根过氧化物酶的底物为四甲基联苯胺。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供本发明的转基因棉花检测芯片或转基因棉花检测试剂盒在检测转基因棉花中的应用。本发明的转基因棉花检测芯片或试剂盒可以用于棉花或其加工产品是否含有外源目标基因的检测，以及用于转基因品种的鉴定。

在本发明中，使用生物素残基标记引物，将生物素标记的扩增产物与芯片杂交，洗涤后加入亲和素连接的荧光物，通过生物素与亲和素的结合及靶序列与探针的结合产生荧光信号，然后利用荧光检测系统对荧光信号进行检测。

在本发明的转基因棉花检测芯片中，所述基片由硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯或载玻片构成，或为可商购的空白可视芯片。

本发明采用可视光学薄膜生物传感器芯片用于检测转基因棉花。该可视光学薄膜生物传感器芯片是经过特殊处理的硅晶片，结构可分为三层，由硅基质组成的基底层；基底层上面的由氮化硅构成的可视层；以及在可视层上面的反应层。可视光学薄膜生物传感器是一种基于光的折射原理，将芯片表面沉淀物的厚度变化转化为折射波长的变化，通过肉眼可视的颜色变化，判断芯片表面的杂交反应结果的检测方法。所用芯片必须是高度平整光滑的表面，首先在芯片表面覆盖一层带氨基、羟基或羧基等活性官能团的多聚物，然后将寡核苷酸以相应基团标记，并用芯片点样仪有序喷点于芯片表面，通过核酸杂交反应检测样品中的靶基因分子。

本发明的可视转基因棉花检测芯片通过在8种转基因棉花的旁侧序列(flanking sequence)设计相应的引物/探针，然后用生物素标记的引物扩增待测样品中的目标基因，用标记了生物素的PCR扩增产物与芯片上的探针杂交，用亲和素过氧化物酶偶联物(streptavidin-HRP)与生物素结合，用四甲基联苯胺(TMB)与辣根过氧化物酶进行沉淀反应，由于沉淀物改变了芯片表面的厚度，从而改变芯片表面的折射波长，引起肉眼可视的颜色变化，据此判断芯片表面的杂交反应结果。

本发明的DNA芯片能够高通量地检测样品中的大量的不同种类的外源基因，检测结果更灵敏、准确。

本发明的转基因棉花检测芯片、试剂盒和方法中使用的探针和引用退火温度尽量保持一致，各引物间尽量减少互补序列。本发明通过大量的实验，筛选出的8对高特异性引物进行PCR扩增的效率较高，探针的同源性较低。

使用本发明的芯片检测方法，其简单、高通量、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场上转基因棉花的检测。

附图说明

图1是探针排列示意图，其中C：阳性对照(核苷酸序列：aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ ID NO.24))；1：转基因棉花品系3006-210-23(SEQ ID NO.3)；2：转基因棉花品系281-24-236(SEQ ID NO.5)；3：LLCOTTN 25(SEQ ID NO.8)；4：转基因棉花品系Mon531(SEQ ID NO.11)；5：转基因棉花品系Mon15985(SEQ ID NO.14)；6：转基因棉花品系Mon1445(SEQID NO.17)；7：转基因棉花品系GHB614(SEQ ID NO.20)；8：转基因棉花品系GK12(SEQ ID NO.23)；9：阴性对照ddH₂O。

图2是8种转基因棉花品系特异性杂交结果，依次为转基因棉花品系3006-210-23、281-24-236、LLCOTTN25、Mon531、Mon15985、Mon1445、GHB614以及GK12。

图3是8种转基因棉花品系引物特异性筛选及多重PCR中最佳引物浓度组合结果图，1：3006-210-23；2：281-24-236；3：LLCotton；4：Mon531；5：Mon15985；6：Mon1445；7：GH614；8：GK12；9：八重PCR；10：阴性棉花；M：Marker。

图4是以转基因棉花M1445为例，实验不同点样浓度的探针杂交结果示意图。图中探针浓度依次为1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L。

图5是转基因棉花品系灵敏度验证结果，分别为转基因棉花3006-210-23与GHB614的灵敏度梯度结果，各图中从左到右DNA含量依次为1ng、0.1ng、10pg。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

本发明的发明人首次通过可视芯片技术实现了对8种转基因棉花的同时、快速检测。

所使用的检测主要仪器：

微量移液器(10μL、100μL、1000μL Eppendorf)、荧光定量PCR仪(ABI 7700Applied Biosystems，USA))、高速台式离心机(Pico17Thermo)、高速粉碎机(IKA-WEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C北京六一仪器厂)、紫外凝胶成像仪为Syngene公司生产Gene Genius系统；BioDot公司生产AD3200芯片点样仪等。

检测主要试剂：

引物与探针序列均为本实验室自行设计，由北京奥科生物技术有限责任公司合成(其具体序列见表1)。Taq酶、dNTPs、10×PCR Buffer、溴化乙锭、DNA Ladder Marker(Takara)；TaqManUniversal PCR Master Mix(ABI)；移液器Tips：使用带滤芯的型号，否则在混匀和分样时非常容易污染；同时10μL和2.5μL的移液器务必使用长Tips，普通短Tips在工作时，移液器杆部可能会与离心管内壁接触，造成污染。2000 bp DNA LadderMarker、核糖核酸酶(RNaseA)、蛋白酶K等购自宝生物工程(大连)有限公司；辣根过氧化物酶标记的亲和素抗体溶液、5mg/mL酸处理酪蛋白购自北京纽海文公司科技有限公司；Hotstar Taq购自美国Qiagen公司。无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇、SDS等其他化学试剂均为国产分析纯；实验中所用空白可视芯片购自美国BioStar公司。

CTAB提取缓冲液(2％CTAB；100mmol/LTris-Cl pH 8.0；20mmol/LEDTApH 8.0；1.2mmol/LNaCl；2％PVP)；CTAB沉淀液(0.5％CTAB；100mM Tris-Cl pH 8.0；20mmol/LEDTA pH8.0；1.2mmol/L NaCl)；TE缓冲液(10mmol/L Tris-Cl；1mmol/LEDTA pH 8.0)；5×SSC溶液由pH 7.0的0.75mol/L的氯化钠溶液和0.075mol/L的柠檬酸钠溶液组成；1％的TMB溶液用二甲基甲酰胺溶解配制。

检测主要步骤：

1DNA提取

称取50.0mg样品粉末，加入1.0ml CTAB提取缓冲液及4.0μL蛋白酶K(10mg/ml)，65℃温浴孵化1h；12000rpm离心15min，取几近清澈的上清700μl；加入500μL氯仿，高速涡旋混合30秒；12000rpm离心10min，收集500μL上清，转移到新的1.5ml反应管中；加入两倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温，孵育1h；12000rpm离心5min弃上清，将沉淀溶于350μL的1.2mol/L的氯化钠溶液中，充分溶解；加入350μL三氯甲烷，小心高速涡旋混合30秒；以12000rpm离心10min，将上清转移到新的反应管中；加入0.8倍的异丙醇，室温孵育至少20min；12000rpm离心10min，弃上清；在沉淀中加入500μL70％乙醇，高速涡旋30秒，以12000rpm离心10min；弃上清，60℃干燥15-25min，并溶于50μLTE(pH 8.0)，-20℃保存备用。每次提取均设立相应的空白对照(以双蒸水代替样品)。

2芯片检测所用引物和探针

表1基因芯片引物与探针序列

3PCR反应体系

注：每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；

4PCR反应参数

注：不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。

5可视芯片的制备与后处理

用基因芯片点样器将探针(终浓度1μmol/L)按照点样的程序点在空白芯片上，温度、湿度等参数均按说明书设置，各探针点体积为50nL，其间距为1mm。点样完毕后，芯片在湿度为70％的环境经2h水合固定，后用浓度为0.1％(W/V)的SDS清洗芯片3次，再用无菌水清洗3次，并使用干燥气流吹干表面水分。制好的芯片需室温下干燥保存。按照上述的点样程序点制基因芯片，其探针分布情况见图1。

C：阳性对照(核苷酸序列：aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ ID NO.24))；1：转基因棉花品系3006-210-23(SEQ ID NO.3)；2：转基因棉花品系281-24-236(SEQ ID NO.5)；3：LLCOTTN 25(SEQID NO.8)；4：转基因棉花品系Mon531(SEQ ID NO.11)；5：Mon15985(SEQ ID NO.14)；6：转基因棉花品系Mon1445(SEQID NO.17)；7：转基因棉花品系GHB614(SEQ ID NO.20)；8：转基因棉花品系GK12(SEQ ID NO.23)；9：阴性对照ddH₂O

6芯片杂交

将10μLPCR产物用杂交缓冲液(5×SSC和5mg/mL酸处理酪蛋白)稀释至100μL，并滴加至芯片上。45℃水浴30min后，用0.1×SSC冲洗3次并使用干燥气流吹干表面。

7沉淀反应

将辣根过氧化酶标记的亲和素抗体溶液加入芯片中，孵育5min，再用0.1×SSC溶液洗涤3次并吹干表面；将TMB溶液加入芯片中，显色5min，无菌水洗净。结果用肉眼即可进行分析，并用相机进行拍照保存。

实验结果

如图2所述，检测了8种转基因棉花品系，每个样品重复2点。阳性对照均表现出较好的信号强度，阴性对照无杂交信号产生。而所有的特异性杂交点均出现肉眼可观察到的杂交信号点。结果表明所有品系的棉花探针均与本品系PCR产物有特异性杂交反应，与其他品系的PCR产物无交叉杂交现象。

实施例2

利用多重PCR技术同时检测八种转基因棉花

本实验通过调整序列长度和TM值使八组引物序列的退火温度均保持在60℃左右，八条探针的杂交温度均保持在50℃左右，以此确保同时扩增八种转基因棉花样品的多重PCR及杂交时条件一致。

首先用常规PCR方法对8种样品分别进行检测，以确定各引物序列的特异性(结果见图3)。分别将八组引物设置5个浓度梯度(0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L)，并依次交叉混合进行多重PCR扩增，确定多重PCR反应体系内各组引物的最佳浓度。

结果表明多重PCR反应中最佳浓度组合为：Primer-3006-210-23(SEQ ID NO.1&2)0.4μmol/L；2：Primer-281-24-236(SEQ ID NO.2&4)0.4μmol/L；Primer-LLCOTTN 25(SEQID NO.6&7)0.2μmol/L；Primer-Mon531(SEQ ID NO.9&10)0.1μmol/L；Primer-Mon15985(SEQ ID NO.12&13)0.2μmol/L；Primer-Mon 1445(SEQ ID NO.15&16)0.4μmol/L；Primer-GHB614(SEQ ID NO.18&19)0.2μmol/L；Primer-GK12(SEQID NO.21&22)0.4μmol/L。(结果见图3)

实施例3

以样品Mon 1445为例，确定杂交探针的点样浓度。将浓度依次为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的Probe-Mon 1445(SEQID NO.17)探针溶液点至芯片上，按照实施例1所述条件进行杂交试验。结果如图4所示，三探针点杂交信号强度基本一致，即当探针浓度为1μmol/L时已达到饱和，再此基础上提高探针浓度对其杂交信号强弱影响不大。

实施例4

将提取的各品系转基因棉花基因组DNA浓度调至2ng/μL、0.2ng/μL和0.02ng/μL的DNA浓度。反应条件：除DNA模板浓度不同之外，灵敏度实验的反应体系和条件同上述特异性实验保持一致。

结果表明(图5)当样品中DNA含量从10ng下降到0.1ng时，此方法仍能得到肉眼可以观察到的杂交信号，具有较高的灵敏度。

使用本发明的特异性引物对和探针的组合，相对于其他引物对和探针而言，能够特异、灵敏地同时检测出不同转基因棉花品系中的含有的不同外源基因片段，从而高特异、高灵敏地鉴别出含有不同外源基因的转基因产品。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

Claims (10)

1.转基因棉花检测芯片，所述芯片包括基片和位于基片上的核酸探针，所述核酸探针由核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.23的核酸探针组成，其中在所述探针的5’端从5’到3’方向依次连接有醛基和10-20个脱氧腺嘌呤核苷酸残基。

2.如权利要求1所述的转基因棉花检测芯片，其中所述芯片为可视芯片。

3.如权利要求1或2所述的转基因棉花检测芯片，所述基片由聚苯乙烯材料、玻璃片或经处理的硅片构成，或为可商购的空白芯片。

4.如权利要求1或2所述的转基因棉花检测芯片，所述芯片还包括阳性对照和阴性对照。

5.一种转基因棉花检测试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1-4中任一项所述的转基因棉花检测芯片和用于PCR扩增的特异性寡核苷酸引物对，所述引物对由以下引物组成：

用于扩增转基因棉花品系3006-210-23的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；扩增转基因棉花品系281-24-236的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4；扩增转基因棉花品系LLCOTTN25的SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7；扩增转基因棉花品系Mon531的SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10；扩增转基因棉花品系Mon15985的SEQID NO.12和SEQ ID NO.13；扩增转基因棉花品系Mon1445的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；扩增转基因棉花品系GHB614的SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19；扩增转基因棉花品系GK12的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22，所述引物的5’端连接有共价结合的生物素。

6.如权利要求5所述的转基因棉花检测试剂盒，其还包括用于可视性检测转基因棉花的辣根过氧化物酶标记的亲和素抗体和辣根过氧化物酶的底物。

7.如权利要求6所述的转基因棉花检测试剂盒，其中所述辣根过氧化物酶的底物为四甲基联苯胺。

8.检测转基因棉花的方法，所述方法包括：

(1)提取待测棉花的DNA，所述棉花包括棉花原料或棉花加工产品；

(2)使用以下一对或多对引物进行PCR扩增；

用于扩增转基因棉花品系3006-210-23的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；扩增转基因棉花品系281-24-236的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4；扩增转基因棉花品系LLCOTTN25的SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7；扩增转基因棉花品系Mon531的SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10；扩增转基因棉花品系Mon15985的SEQID NO.12和SEQ ID NO.13；扩增转基因棉花品系Mon1445的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；扩增转基因棉花品系GHB614的SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19；扩增转基因棉花品系GK12的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22，所述引物的5’端连接有共价结合的生物素。

(3)将PCR扩增产物与权利要求1-3中任一项所述的转基因棉花检测芯片杂交；

(4)将步骤(3)的芯片与辣根过氧化物酶标记的亲和素抗体杂交，洗涤；和

(5)在步骤(4)的芯片上加入辣根过氧化物酶的底物进行反应，水洗，干燥；

(6)观察颜色变化，确定所述待测棉花是否为转基因棉花。

9.如权利要求8所述的检测转基因棉花的方法，其中所述辣根过氧化物酶的底物为四甲基联苯胺。

10.权利要求1-4中任一项所述的转基因棉花检测芯片或权利要求7的转基因棉花检测试剂盒在检测转基因棉花中的应用。

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