JP2010273676A - 転移基で修飾された基質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】転移酵素を発現している発芽バキュロウイルスの存在下において、基質に転移基を含む物質を接触させることを含む、転移基で修飾された基質の製造方法。特に、転移酵素がスルホトランスフェラーゼ又はグリコシルトランスフェラーゼであり、転移基が硫酸基又はグリコシル基である方法。
【選択図】なし
Description
(1) 転移酵素を発現している発芽バキュロウイルスの存在下において基質に、転移基を含む物質を接触させることを含む、転移基で修飾された基質の製造方法。
(2) 転移酵素が、スルホトランスフェラーゼ又はグリコシルトランスフェラーゼであり、転移基が硫酸基又はグリコシル基である、(1)に記載の方法。
(3) 基質がタンパク質である、(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 転移酵素をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルスを回収することによって得られる発芽バキュロウイルスを、上記転移酵素を発現している発芽バキュロウイルスとして使用する、(1)から(3)の何れかに記載の方法。
本発明による転移基で修飾された基質の製造方法は、転移酵素を発現している発芽バキュロウイルスの存在下において基質に、転移基を含む物質を接触させることを特徴とする。
本発明では、適宜選択した転移酵素、ドナー基質、アクセプター基質を用いることにより、所望の転移基で修飾された基質を製造することができる。基質を修飾する転移基は1でも良いし、2以上でも良い。また、基質を修飾する転移基をさらに転移基により修飾することもできる。例えば、O−結合型糖鎖のうちムチン型糖鎖を合成する場合には、はじめにセリンまたはスレオニンを含むペプチドにUDP-GalNAc:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase(Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 1;ppGalNAcT1)を発現した発芽型バキュロウイルス、および基質となるUDP-N-アセチルガラクトサミン(UDP-GalNAc)を加え、GalNAca1−O−Ser/Thr構造を作製し、ムチン型糖鎖の合成を開始する。次に、ムチン型糖鎖はN-アセチルガラクトサミンの次に結合する糖残基によりコア1からコア8までのタイプに分類されているが、例えばコア1構造(Galb1−3GalNAca1−O−Ser/Thr)を作製するには、そこにcore1 UDP-galactose : N-acetylgalactosamine-a-R b 1,3-galactosyltransferase 1(Core1 β-1,3-galactosyltransferase 1;C1GalT1)を発現した発芽型バキュロウイルスおよびUDP-ガラクトース(UDP-Gal)を加えれば合成でき、コア3構造(GlcNAcb1−3GalNAca1−O−Ser/Thr)を作製するには、UDP-GlcNAc : bGal b 1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 6を発現した発芽型バキュロウイルスおよびUDP-N-アセチルグルコサミン(UDP-GlcNAc)を加えれば合成できる。GalNAca1−O−Ser/Thr構造にα-N-acetylgalactosaminide α-2,6-sialyltransferase 1(ST6GalNAc I)を発現した発芽バキュロウイルス、および糖基質となるCMP-N-アセチルノイラミン酸(CMP-NeuNAc)を加えればNeuNAcα2−6GalNAca1−O−Ser/Thrを作製できる。さらに、コア1型構造にβ-galactoside α-2,3-sialyltransferase 1(ST3Gal I)を発現した発芽バキュロウイルスおよびCMP- N-アセチルノイラミン酸を加えれば、シアル酸が1つ付加されたNeuNAcα2−3Galb1−3GalNAca1−O−Ser/Thr(2, 3 sialyl-T antigen)を作製することができ、ここにさらにα-N-acetylgalactosaminide α-2,6-sialyltransferase 3(ST6GalNAc III)を発現した発芽バキュロウイルスおよびCMP- N-アセチルノイラミン酸を加えれば、シアル酸が2つ付加されたNeuNAcα2−3Galb1−3(NeuNAcα2−6)GalNAca1−O−Ser/Thr(disialyl-T antigen)を作製することができる。
目的の反応が完了した後に、発芽バキュロウイルスは反応系に残しても良いが、遠心分離、ろ過等の公知の方法により反応系から取り除くことも容易に行うことができる。
先ず、発現させたい蛋白質の遺伝子をトランスファーベクターに挿入して組換えトランスファーベクターを構築する。
(1)ヒトTPST2発現組換えバキュロウイルスの調製
ヒトTPST2のN末側にT7タグを付加したT7-TPST2を発現させるための組換えバキュロウイルスは以下のようにして調製した。
ヒトppGalNAcT1のN末側にV5タグを付加したV5-ppGalNAcT1を発現させるための組換えバキュロウイルスは上記と同様の方法により行った。
ヒトC1GalT1のN末側にHAタグを付加したHA-C1GalT1を発現させるための組換えバキュロウイルスは上記と同様の方法により行った。
T7-TPST2もしくはV5-ppGalNAcT1を発現する発芽型ウイルスの調製は以下のようにして行った。すなわち、上記により調製した組換えウイルスをMOI(Multiplicity of infection)=3となるようにSf9細胞(1 x 106個/mL)に加え感染させた。27℃で4日間培養した培養液を1,000 x gで15分間遠心分離し、細胞ならびに細胞破砕物を除去した。遠心分離により回収した上清をさらに40,000 x gで30分間遠心分離した後、沈殿物を50mM Tris-HCl (pH 7.4)に懸濁した。それを1,000 x gで15分間遠心分離することで再度、細胞成分を除去した。その上清を40,000 x gで30分間遠心分離し、沈殿物を50mM Tris-HCl (pH 7.4)に再懸濁したものを発芽型ウイルス画分とした。
発芽型ウイルスにT7-TPST2、V5-ppGalNAcT1またはV5-ppGalNAcT1とHA-C1GalT1が発現していることは、ウエスタンブロット法により確認を行った。
(1)マウスへの免疫ならびにハイブリドーマの作製
マウスモノクローナル抗体を単離する際に免疫動物として抗原分子の発現をなくしたノックアウトマウスを用いることで効率よく抗体が単離できることが知られている(Roes J., ら、J. Immunol. Methods, 1995; 183: 231-237., Declerck PJ., ら、J. Biol. Chem. 1995; 270: 8397-8400.)。そこで免疫動物としてCCR5ノックアウトマウス(Kuziel WA., ら、Atherosclerosis, 2003; 167: 25-32.)を用いた。抗原にはKLHコンジュゲートしたCCR5のN端領域の硫酸化修飾ペプチド1(Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr(SO3H) Asp Ile Asn-NH2)(配列番号19、ペプチド研究所社製)を用いた。1回の免疫にはマウス1匹当たり100μgのペプチドを免疫し、初回免疫時にはFreund's Complete Adjuvant(DIFCO社製)と混合したものをマウスの腹腔内に投与した。さらに2週間ごとに追加免疫を2回行い、その際にはFreund's Incomplete Adjuvant(DIFCO社製)と混合したものを腹腔内に投与した。最終免疫3日後にマウスより無菌的に脾臓を摘出し、常法によりマウスミエローマ細胞株NS-1と細胞融合させハイブリドーマ細胞を作製した。
NaClO3含有培地で培養した細胞はチロシン残基への硫酸化修飾が抑制されることが報告されている(Hortin GL., ら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 1988; 150: 342-348.)。そこでNaClO3含有培地およびNaClO3不含培地で培養した細胞を用いて、フローサイトメトリー解析を行った。細胞はヒトCCR5(塩基配列は配列番号22、アミノ酸配列は配列番号23に示す)を強制発現させたCHO細胞株(CCR5/CHO)および陰性対照としてヒトCCR2B(塩基配列は配列番号24、アミノ酸配列は配列番号25に示す)を強制発現させたCHO細胞(CCR2/CHO)を用いた。すなわちCCR5/CHOおよびCCR2/CHOを、1%ウシ胎児血清を含むHam F-12培地(Invitrogen社製)に播種し、硫酸化修飾を抑制する細胞にはNaClO3を、硫酸化修飾を抑制しない細胞にはMgSO4をそれぞれ10 mMとなるように添加し、37℃で18時間培養した。その後PBSで1回洗浄し、続いて5 mM エチレンジアミン四酢酸を含むPBSを加えて細胞をプレートから剥離させた。剥離させた細胞を、2%ウシ胎児血清を含むPBS(PBS-FCS)で2回洗浄後、ハイブリドーマ培養上清25μLとPBS-FCS 25μLを添加し、4℃で1時間インキュベートした。その後PBS-FCSで2回洗浄し、14μg/mLのFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体(Jackson ImmunoResearch社製)を含むPBS-FCSを50μLずつ添加し、さらに室温で1時間インキュベートした。PBS-FCSで3回洗浄した後、フローサイトメトリー解析を行った。その結果、MgSO4を添加した培地で培養したCCR5/CHOには強く反応するが、NaClO3を添加した培地で培養したCCR5/CHOおよびCCR2/CHOにはほとんど反応しないハイブリドーマC1324をクローニングした(図4)。
(1)試験管内での硫酸基転移反応
ヒトCCR5のN末端のチロシン残基は硫酸化修飾されることが報告されている(Farzan M., ら、Cell, 1999; 96: 667-676)。そこでT7-TPST2を発現した発芽型ウイルスが、硫酸基供与体PAPSからヒトCCR5のN末端領域の合成ペプチドへ硫酸基を転移させるかを検討した。
硫酸基がペプチドへ転移されているかを評価するために、抗硫酸化CCR5抗体および抗CCR5抗体を用いてドットブロット法により検討を行った。すなわち上記の方法でインキュベートした反応溶液のうち2μLをニトロセルロース膜に滴下した。水分が蒸発したことを目視で確認した後、ブロックエースで室温、1時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄した後、25 ng/mLの抗硫酸化CCR5抗体C1324または100 ng/mLの抗CCR5抗体12D1(Chemicon社製)を含む10%ブロックエース水溶液で室温、1時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄した後、10 ng/mLのHRP標識ヤギ抗マウス抗体(Jackson ImmunoResearch社製)を含む10%ブロックエース水溶液で室温、1時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄した後、化学発光試薬Supersignal West Dura Extended Duration Substrateを用いて発行させて、X線フィルムを用いて検出した。その結果、抗CCR5抗体12D1で検出した場合、各インキュベート時間で、T7-TPST2を発現した発芽型ウイルスを含む反応液およびT7-TPST2を発現していない発芽型ウイルスを含む反応液で同等の反応が検出された(図5B)。一方、抗硫酸化CCR5抗体C1324を用いて検出した場合、T7-TPST2を発現した発芽型ウイルスを加えた反応液にだけ反応が検出された(図5A)。このことから、T7-TPST2を発現した発芽型ウイルスがペプチドに硫酸基を転移させたことが確認された。
(1)試験管内でのN-アセチルガラクトサミンの転移反応
ヒトCCR5のN末端は6,7,17位にセリン残基が、16位にスレオニン残基があり、そのいずれかの複数箇所がO型糖鎖修飾される可能性のあることが報告されている(Bannert N., ら、J. Exp. Med., 2001; 194: 1661-1673.)。そこでV5-ppGalNAcT1発現発芽型ウイルスが、UDP-N-アセチルガラクトサミン(UDP-GalNAc)からヒトCCR5のN末端領域の合成ペプチドへ複数個のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)を転移させるかを検討した。
続いてN-アセチルガラクトサミンがペプチドへ転移されているか評価するために、逆相クロマトグラフィーを用いて検討を行った。
V5-ppGalNAcT1を発現した発芽型ウイルスによるペプチドへのN-アセチルガラクトサミンの転移反応をさらに確認するために、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry : MALDI-TOF MS)を用いて逆相クロマトグラフィーにより得られたフラクションを測定した。標準ペプチドとして非修飾ペプチド(配列番号20、モノアイソトピック質量2386.0)と、これにN-アセチルガラクトサミン修飾ペプチド(配列番号21、モノアイソトピック質量2589.1、ペプチド研究所社製)(Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser(GalNAc) Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr Ser Glu Pro Cys-NH2)の2種類のペプチドを使用した(図7)。
これらの1から3分子のN-アセチルガラクトサミン結合相当のピークのMS/MSスペクトル解析(図9)により、図8のピーク(a)では1分子のN-アセチルガラクトサミン脱離、ピーク(b)では2分子のN-アセチルガラクトサミン脱離、ピーク(c)では3分子のN-アセチルガラクトサミン脱離相当のピークが検出され、それぞれ1から3分子のN-アセチルガラクトサミンが結合していると考えられた。
(1)試験管内でのN-アセチルガラクトサミンおよびガラクトースの転移反応
O型糖鎖修飾はppGalNacTによるセリン、スレオニン残基へのN-アセチルガラクトサミンの転移反応から開始される。そしてセリン、スレオニン残基に結合したN-アセチルガラクトサミン残基にさらに単糖が逐次的に転移して、O型糖鎖の基本骨格であるコア構造が形成される。そのコア構造の1つであるコア1構造は、C1GalT1によりUDP-ガラクトース(UDP-Gal)に由来するガラクトース(Gal)がセリン、スレオニン残基に結合したN-アセチルガラクトサミン残基に転移され形成される。そこでV5-ppGalNAcT1およびHA-C1GalT1を発現した発芽型ウイルスがヒトCCR5のN末端領域の合成ペプチドへ、N−アセチルガラクトサミン、ガラクトースの順に転移させるかを検討した。
続いてN-アセチルガラクトサミンおよびガラクトースがペプチドへ転移されているか評価するために、逆相クロマトグラフィーを用いて検討を行った。
更にそれらのフラクションについてLC-MS/MS で、N-アセチルガラクトサミンおよびガラクトースの転移反応の確認を行った。今回用いたペプチドは硫酸化修飾ペプチドのため解析中に硫酸基が脱離してしまい、糖の結合と硫酸基の脱離の複雑なパターンを示す。そこで表1にそれぞれの修飾におけるLC-MS/MSで検出されるm/zの理論値を示した。この理論値に対しMSスペクトルでは0.01以内の精度、MS/MSスペクトルでは0.5以内の精度を持つ。LC-MSのベースピークイオンクロマトグラムではfr. B-1、fr. C-2、fr. D-3で基質ペプチドから硫酸基が脱離したと考えられるペプチドの2価イオンであるm/z635.80がメインピークとして検出された。fr. C-1、fr. D-2からは基質ペプチドにN-アセチルガラクトサミンが結合した物から脱硫酸したものに相当するm/z737.34のピーク、fr. D-1からは基質にN-アセチルガラクトサミンとガラクトースが結合したものから脱硫酸したものに相当するm/z818.37のピークが検出された(図11)。
N-アセチルガラクトサミン結合・脱硫酸ペプチド相当のfr. C-1のm/z737.34のピークのMS/MS解析によりN-アセチルガラクトサミン脱離相当のピーク、N-アセチルガラクトサミンとガラクトース結合・脱硫酸ペプチド相当のfr. D-1のm/z818.37のピークのMS/MS解析からN-アセチルガラクトサミンとガラクトース脱離、N-アセチルガラクトサミンとガラクトース結合ペプチド相当のfr. D-1のm/z858.35のピークのMS/MS解析からはガラクトース脱離相当のピークが検出され、ペプチドにN-アセチルガラクトサミン、ガラクトースの順で結合していることが示唆された(図13)。
実施例1(3)で作製したC1GalT1は活性が弱い傾向があった。C1GalT1はシャペロンタンパク質Cosmcの作用により転移活性をもつ状態となる。そこで、発芽バキュロウイルスにC1GalT1とCosmcを共発現させることにより、Cosmcと接触するC1GalT1の量を増やした場合に、C1GalT1を単独で発現している発芽バキュロウイルスよりもガラクトースの転移活性が亢進するかを検討した。
ヒトCosmcのN末側にT7タグを付加したT7-Cosmcを発現させるための組換えバキュロウイルスは実施例1と同様の方法により作製した。
PCRによりヒトCosmc遺伝子(塩基配列は配列番号27、アミノ酸配列は配列番号28に示す)の5'-端にT7タグをコードする塩基配列を付加した後、pFastBac 1に挿入してpFastBac-T7Cocmcを作製し、Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systemを用いて組換えバクミドおよび組換えバキュロウイルスを作製した。すなわち、Cosmcをコードする遺伝子の5'-端の塩基配列にハイブリダイズし、かつT7タグの一部をコードする塩基配列を持つように設計したPCRプライマーT7CosmcF1(配列番号29)ならびにCosmcをコードする遺伝子の3'-端の塩基配列にハイブリダイズし、かつ制限酵素XhoIの認識配列(CTCGAG)を持つように設計したPCRプライマーCosmcR(配列番号30)をそれぞれ用い、Human Brain whole Marathon-Ready cDNAを鋳型DNAとしExpand High Fidelity PCR Systemの添付の方法に従いPCRを実施した。さらにそのPCRにより増幅されたDNAを鋳型として、制限酵素EcoRIの認識配列(GAATTC)ならびにT7タグをコードする塩基配列を持つように設計したPCRプライマーT7CosmcF2(配列番号31)ならびにプライマーCosmcRでPCRを行った。その結果得られたPCRの結果増幅産物をpGEM-T Easy vectorに挿入しTAクローニングを行った。そこからEcoRIおよびXhoIを用いてT7-CosmcをコードするDNAを切断し、アガロースゲルからT7-CosmcをコードするDNAをQIAquick Gel Extraction Kitを用いて抽出した。そのDNAをpFastBac 1に挿入しpFastBac-T7Cosmcを作製した。
実施例1(3)で調製したHA-C1GalT1発現組換えバキュロウイルスをMOI=10となるように、T7-Cosmc発現組換えバキュロウイルスをMOI=5となるように同時にSf9細胞(1 x 106個/mL)に加え感染させた。27℃で4日間培養した培養液を1,000 gで15分間遠心分離し、細胞ならびに細胞破砕物を除去した。遠心分離により回収した上清をさらに40,000 gで30分間遠心分離した後、沈殿物を50mM Tris-HCl (pH 7.4)に懸濁した。それを1,000 gで15分間遠心分離することで再度、細胞成分を除去した。その上清を40,000 gで30分間遠心分離し、沈殿物を50mM Tris-HCl (pH 7.4)に再懸濁したものを発芽バキュロウイルス画分とした。
発芽バキュロウイルス上にHA-C1GalT1、T7-Cosmcがそれぞれ単独で、HA-C1GalT1とT7-Cosmcが共発現していることをウエスタンブロット法により確認を行った。実施例1(5)と同様にSDS-PAGEを実施した。
マウス抗HA抗体(シグマ社製)最終濃度 370ng/mL
マウス抗T7抗体 (Novagen社製) 最終濃度 100 ng/mL
HRP標識ヤギ抗マウス抗体(Jackson ImmunoResearch社製)最終濃度 80 ng/mL
10μgのヒトCCR5のN端領域の硫酸化ペプチド2と90μgのV5-ppGalNAcT1を発現した発芽バキュロウイルス、さらに糖供与体としてUDP-N-アセチルガラクトサミンを50μLの溶媒C液(50 mM MES(pH 6.0)、20 mM MnCl2、10 mM NaF、2 mM ATP)中で37℃、24時間インキュベートした。その後、15μgのHA-C1GalT1を単独で発現した発芽バキュロウイルスまたは15μgのHA-C1GalT1およびT7-Cosmcを発現した発芽バキュロウイルス、さらに糖供与体としてUDP-ガラクトースを50μLの溶媒C液中で37℃、24時間インキュベートした。また陰性対照として発芽バキュロウイルスを加えない条件でもインキュベートを行った。
N-アセチルガラクトサミンおよびガラクトースがペプチドへ転移されているかを評価するために、逆相クロマトグラフィーを用いて検討を行った。
(1)ヒトST3Gal I発現組換えバキュロウイルスの調製
ヒトST3Gal IのN末側にHisタグを付加したHis-ST3GalIを発現させるための組換えバキュロウイルスを実施例1と同様の方法により作製した。
ヒトST6GalNAc IのN末側にc-mycタグを付加したmyc-ST6GalNAcIを発現させるための組換えバキュロウイルスは実施例1と同様の方法により作製した。
ヒトST6GalNAc IIIのN末側にc-mycタグを付加したmyc-ST6GalNAcIIIを発現させるための組換えバキュロウイルスは実施例1と同様の方法により作製した。
実施例1(4)に記載した方法と同様の方法で、His-ST3GalI、myc-ST6GalNAcI、myc-ST6GalNAcIIIをそれぞれ単独で発現する発芽バキュロウイルスを調製した。
発芽バキュロウイルス上にHis-ST3GalI、myc-ST6GalNAcI、myc-ST6GalNAcIIIが発現していることを、ウエスタンブロット法により確認を行った。実施例1(5)と同様にSDS-PAGE法を実施した。
マウス抗His抗体(Sigma社製)最終濃度 700 ng/mL
マウス抗c-Myc抗体(Santa Cruz Biotechnology社製)最終濃度 20 ng/mL
HRP標識ヤギ抗マウス抗体 最終濃度 160ng/mL
シアル酸付加糖鎖修飾ペプチドの合成手順の概略を図19に示した。
10μgのヒトCCR5のN端領域の硫酸化ペプチド2と90μgのV5-ppGalNAcT1を発現した発芽バキュロウイルス、さらに糖供与体としてUDP- N-アセチルガラクトサミンを50μLの溶媒C液中で37℃、24時間インキュベートした(図19反応(1))。その後、40μgのmyc-ST6GalNAcIを発現した発芽バキュロウイルスと糖供与体としてCMP-N-アセチルノイラミン酸を50μLの溶媒C液中で37℃、24時間インキュベートした(図19反応(3))。
2,6 sialyl T-antigen(Galb1−3(NeuNAcα2−6)GalNAc−O−Ser/Thr)は以下の方法で合成をおこなった。すなわち10μgのヒトCCR5のN端領域の硫酸化ペプチド2と90μgのV5-ppGalNAcT1を発現した発芽バキュロウイルス、さらに糖供与体としてUDP- N-アセチルガラクトサミンを50μLの溶媒C液中で37℃、24時間インキュベートした。その後、15μgのHA-C1GalT1およびT7-Cosmcを発現した発芽バキュロウイルス、さらに糖供与体としてUDP-ガラクトースを50μLの溶媒C液中で37℃、24時間インキュベートした(図19反応(2))。さらにその後、40μgのmyc-ST6GalNAcI発現した発芽バキュロウイルスと糖供与体としてCMP-N-アセチルノイラミン酸を50μLの溶媒C液中で37℃、24時間インキュベートした(図19反応(4))。
Disialyl T-antigen(NeuNAcα2−3Galb1−3(NeuNAcα2−6)GalNAc−O−Ser/Thr)は以下の方法で合成をおこなった。すなわち10μgのヒトCCR5のN端領域の硫酸化ペプチド2と90μgのV5-ppGalNAcT1を発現した発芽バキュロウイルス、さらに糖供与体としてUDP- N-アセチルガラクトサミンを50μLの溶媒C液中で37℃、24時間インキュベートした(図19反応(1))。その後、15μgのHA-C1GalT1およびT7-Cosmcを発現した発芽バキュロウイルス、さらに糖供与体としてUDP-ガラクトースを50μLの溶媒C液中で37℃、24時間インキュベートした(図19反応(2))。その後、40μgのHis-ST3GalIを発現した発芽バキュロウイルスと糖供与体としてCMP-N-アセチルノイラミン酸を50μLの溶媒C液中で37℃、24時間インキュベートした(図19反応(5))。その後、40μgのmyc-ST6GalNAcIIIを発現した発芽バキュロウイルスと糖供与体としてCMP-N-アセチルノイラミン酸を50μLの溶媒C液中で37℃、24時間インキュベートした(図19反応(6))。
Sialyl Tn-antigenの合成の確認は以下のようにおこなった。はじめに反応溶液に逆相クロマトグラフィーの溶媒C液を600μLを加えて、5分間静置した後、20,000 gで30分間遠心分離し、上清を回収した。さらにその上清を孔径0.22μmのPVDFフィルターに通して発芽バキュロウイルスを除き、逆相クロマトグラフィーのサンプルとした。逆相カラムSOURCE 5RPC ST 4.6/150をあらかじめ溶媒C液で平衡化しておき、フィルターを通したサンプル500μLを逆相カラムに吸着させた。7.5 mLの溶媒C液でカラムを洗浄した後、溶媒D液を0.8 mL/分の流速で流し、溶出を行った。検出はペプチド結合に由来する220 nmの波長の吸光度を測定した。その結果、発芽バキュロウイルスを添加せずUDP- N-アセチルガラクトサミンを添加した反応溶液から得られたクロマトグラム(図20(A)上段)とV5-ppGalNAcT1を発現した発芽バキュロウイルスとUDP- N-アセチルガラクトサミンを添加した反応溶液から得られたクロマトグラム(図20(A)中段)を比較すると、V5-ppGalNAcT1を発現した発芽バキュロウイルスとUDP- N-アセチルガラクトサミンを添加した反応溶液から得られたクロマトグラムには、反応に使用した硫酸化ペプチド2に由来するピーク(n)とN-アセチルガラクトサミンが転移したペプチドに由来する新たなピーク(0)が観察された。またV5-ppGalNAcT1を発現した発芽バキュロウイルスによる反応後、myc-ST6GalNAcIを発現した発芽バキュロウイルスを添加した反応溶液から得られたクロマトグラム(図20(A)下段)には、N-アセチルガラクトサミンが転移したペプチドに由来するピークが消失し、NeuNAc−GalNAcが転移したペプチドに由来する特異的なピーク(p)が検出された。
2,6 sialyl T-antigenの合成の確認も(4)に記載の方法により同様に行った。その結果、V5-ppGalNAcT1を発現した発芽バキュロウイルスを添加せずUDP- N-アセチルガラクトサミンを添加した反応溶液から得られたクロマトグラム(図20(B)上段)とV5-ppGalNAcT1を発現した発芽バキュロウイルスによる反応後にHA−C1GalT1による反応をおこなって得られたクロマトグラム(図20(B)中段)を比較すると、反応に使用した硫酸化ペプチド2に由来するピーク(r)とGal−GalNAcが転移したペプチドに由来する新たなピーク(s)が観察された。またHA-C1GalT1を発現した発芽バキュロウイルスによる反応後、myc-ST6GalNAcIを発現した発芽バキュロウイルスを添加した反応溶液から得られたクロマトグラム(図20(B)下段)には、Gal−GalNAcが転移したペプチドに由来するピークが消失し、Gal−(NeuNAc−)GalNAcが転移したペプチドに由来する特異的なピーク(t)が検出された。
Disialyl T-antigenの合成の確認も(4)に記載の方法により同様に行った。その結果、2,6 sialyl T-antigenの合成と同様にV5-ppGalNAcT1を発現した発芽バキュロウイルスによる反応後にHA−C1GalT1による反応をおこなって得られたクロマトグラム(図20(C)上から2番目)は、Gal−GalNAcが転移したペプチドに由来する新たなピーク(w)が観察された。HA-C1GalT1を発現した発芽バキュロウイルスによる反応後、His-ST3GalIを発現した発芽バキュロウイルスを添加した反応溶液から得られたクロマトグラム(図20(C)上から3番目)には、Gal−GalNAcが転移したペプチドに由来するピークが消失し、NeuNAc−Gal−GalNAcが転移したペプチドに由来する特異的なピーク(x)が検出された。さらにmyc-ST6GalNAcIIIを発現した発芽バキュロウイルスを添加した反応液から得られたクロマトグラム(図20(C)一番下)にはNeuNAc−Gal−GalNAcが転移したペプチドに由来する特異的なピークが消失し、NeuNAc−Gal−(NeuNAc−)GalNAcが転移したペプチドに由来する特異的なピーク(y)が検出された。
Claims (4)
- 転移酵素を発現している発芽バキュロウイルスの存在下において基質に、転移基を含む物質を接触させることを含む、転移基で修飾された基質の製造方法。
- 転移酵素が、スルホトランスフェラーゼ又はグリコシルトランスフェラーゼであり、転移基が硫酸基又はグリコシル基である、請求項1に記載の方法。
- 基質がタンパク質である、請求項1又は2に記載の方法。
- 転移酵素をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルスを回収することによって得られる発芽バキュロウイルスを、上記転移酵素を発現している発芽バキュロウイルスとして使用する、請求項1から3の何れかに記載の方法。
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- 2010-04-28 JP JP2010103175A patent/JP2010273676A/ja active Pending
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