JPH04500611A - 改良された生物学的昆虫制御物質および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改良された生物学的昆虫制御物質および使用方法本発明は、国立衛生研究所の研 究費（許可番号Ｎｏ、ＧＥＯＯＯ９１８）の援助を受けてなされた。アメリカ合 衆国政府は、本発明において所定の権利を有する。

本発明は、害虫の改良された生物学的制御の方法および組成物に関する。特に、 本発明は、昆虫の成長および発育の制御に効果があるバキュロウィルス遺伝子お よびその遺伝子生産物の使用と操作に関する。本発明はまた、感染した害虫に対 して悪影響を与える、遺伝子学的に改変されたバキュロウィルスならびに他の昆 虫制御物質に関する。

害虫の生物学的制御に関する興味は、従来の化学的殺虫剤の不都合さの結果から 生じたものである。化学的殺虫剤は、一般に、無益な種はもちろんのこき有益な 種にも作用する。

害虫は、このような化学物質に対する抵抗力を獲得する傾向があり、これらの殺 虫剤に対して抵抗性をもつ新しい害虫個体群が急速に増大し得る。さらに、化学 残渣は、環境の害にもなるし健康をも脅かす。生物学的制御は、害虫の制御にお いて、化学的殺虫剤への依存を減らすことができる代替手段である。

生物学的制御の主要な戦略は、昆虫に対して病原性である天然界に存在する生物 （昆虫の病原体）の使用および害虫に抵抗性のある作物の開発を含んでいる。研 究方法には、昆虫遺伝子、あるいは昆虫制御物質にとって適切な標的物となり得 る遺伝子生産物を同定し特徴づけること、以前には使われていなかった微生物の 同定ならびに開発（天然に存在する非病原性微生物を昆虫に対し病原性を与える ように改変することを含む）、現在使用されている昆虫病原体の改変および改良 、ならびに遺伝子工学による害虫に対してより強い抵抗性を示す作物の開発が含 まれる。

天然における昆虫個体群の中で、流行性の病気の原因となるウィルスが、生物学 的殺虫剤として開発されてきた昆虫病原体に属する。バキュロウィルスは、節足 動物のみに感染するウィル、ＩＩ、の大きな群である。　（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｌ 、に、（１９８１）、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｌｎｅｅｒｌｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ 　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｎ、　Ｐａｎｏｐｏｕｌｐｕｓ編、　Ｐｒ ａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、２０３−２２４；　Ｃ ａｒｓｔｅｎｓ、　（１９８０）Ｌａｗｆｅｒら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、２７３−３５５）　。

多くのバキュロウィルスは、商業上重要な農林業の作物の害虫である昆虫に感染 する。このようなバキュロウィルスは、生物学的制御物質として潜在的な価値を 有している。４種の異なるバキュロウィスルが、米国環境保護局（Ｕ、Ｓ、Ｅｎ ｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　Ａｇｅｎｃｙ）に殺虫剤としての 使用のために登録されている。生物学的殺虫剤としてのバキュロウィルスの利点 の中には、宿主特異性がある。生物学的殺虫剤としてのバキュロウィルスは、群 として節足動物にだけ感染するのではなく、バキュロウィルス個々の株は、普通 １種ないし数種の昆虫に感染する。それ故に、これらは人類および環境に害をも たらさないし、有益な種の昆虫に不利な影響もあたえずに使用され得る。

バキュロウィルスのサブグループには、核多角体病ウィルス（ＮＰＶ）　、顆粒 病ウィルス（ＧＶ）および非閉塞性バキュロウィルスが含まれる。バキュロウィ ルスの閉塞型では、ピリオン（エンベロープに包まれたヌクレオカプシド）が、 結晶性タンパク質マトリックス中に埋めこまれている。封入体あるいは閉塞体と 呼ばれるこの構造は、天然では生物体外で見出される形態であり、生物間での感 染の拡大に関与している。

ＮＰＶウィルスの特徴的な形は、多くのピリオンが各々の閉塞体中に埋め込まれ ていることである。それらの１ｆＰＶ閉塞体は、比較的大きいく最高５μｍ）。

６ｖウイルスの閉塞体はより小さく、各々１個のピリオンを有している。両者の 閉塞体の結晶性タンパク質マトリックスは、主として２５０００から３３０００ ダルトンのポリペプチドからなっていて、ポリヘトリンあるいはグラヌリンと呼 ばれている。非閉塞性サブグループのバキュロウィルスは、ポリヘトリンやグラ ヌリンのタンパク質を生産しないし、閉塞体も形成し！＝い。

実際には、感染は、昆虫がバキュロウィルス粒子、とくに閉塞体型のバキュロウ ィルス粒子で汚染された餌を食べたときに起こる。その閉塞体は、昆虫中腸の中 で、アルカリ状態下で分解し、各々のウィルス粒子を放出し、腸壁の上皮細胞を 犯す。宿主細胞中で、バキュロウィルスは核に移動し、そこで複製がおこる。最 初は、ある特定のウィルスタンパク質は、感染細胞の中で、いわゆる転写と“初 期遺伝子（ｅａｒｌｙ　ｇｅｎｅｓ）”の翻訳によって生産される。他の機能の 中で、これらのタンパク質は、ウィルスが細胞に侵入後、４時間から６時間後に 始まるウィルスＤＮＡの複写を可能とするために必要とされる。広範囲のウィル ス性ＤＮＡの複写は、宿主感染後（ｐｉ）約１２時間にわたって進行する。約８ 時間から１０時間ｐｉの間に、感染した細胞は、“後期ウィルス性遺伝子生産物 ”を多量に生産する。これらには、後代ウィルス粒子の形成において、ウィルス ＤＮＡを含むヌクレオカプシドの構成要素が含まれる。

後代ウィルス粒子の生産は、１２時間ｐ１の付近で始まる。最初に、後代ウィル スは細胞膜に移り、そこで細胞表面から出芽するときに包皮を必要とする。この 非閉塞のウィルスは、次に、昆虫の中の他の細胞に感染し得る。ポリヘトリン合 成は、感染後１２時間から１８時間に始まり、２４時間ｐ１までにかなり高いレ ベルにまで増加する。その時、出芽状ウィルスは閉塞体に埋め込まれる。閉塞体 形成は、細胞が死滅するかあるいは溶菌するまで続く。ある種のバキュロウィル スは、事実上宿主昆虫のどの組織にも感染して、感染過程の終着時点で昆虫は全 部液化され、他の昆虫に感染を広め得る閉塞体を数多く放出する（Ｔｈｅ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ、　Ｖｏｌ、ｌおよびＩＩ。

ＧｒａｎｄｏｓおよびＦｅｄｅｒｉｃｉ編、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　 Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉｄａ、１９８６．の総説）。

殺虫剤としてバキュロウィルスを使用する上での一つの重大な欠点は、ウィルス の摂取と昆虫の死亡との間の時間の長さにある。この時間の間に、害虫は餌を食 べて作物に害を与える。栽培者は、昆虫の出没が明らかになるまで殺虫剤を使用 しそうにもないので、餌を与える時間を最小限にすることが重要である。

必要とされるのは、昆虫が死亡するまでに食べる量を減少させる生物学的殺虫剤 である。生物学的殺虫剤は、化学的殺虫剤より環境に及ぼす害が少ないので好ま しい。さらに早期の昆虫の死亡が望ましい。昆虫の発育を制御するタンパク質を コードする遺伝子の開発、およびそれを種々の生物に導入することは、害虫の改 良された生物学的制御を可能とするで本発明において、昆虫の発育、成長、ある いは行動に影響を及ぼすバキュロウィルス遺伝子、およびその遺伝子生産物が同 定されている。本発明４、昆虫制御戦略において、この遺伝子あるいは遺伝子生 産物を不活性化する方法、およびこの遺伝子および遺伝子生産物を使用する方法 も提供する。好テロイドＵＤＰグリコジルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）をコー ドする。バキュロウィルスｅｇｔ遺伝子の発現は、昆虫の脱皮ホルモンを不活性 化するＥＧＴの生産をもたらし、昆虫の幼虫が脱皮あるいはさなぎになるのを阻 害する。バキュロウィルスｅｇｔ遺伝子の不活性化により、感染幼虫の脱皮ある いはさなぎ化が進む。

本発明は、ｅｇｔ遺伝子およびそれらの遺伝子生産物を用いる昆虫制御物質の広 い範囲を包含している。本発明の昆虫制御物質物質により、ＥＧＴタンパク質の 不適切な合成が引き起こされ、あるいは害虫中でのＥＧＴタンパク質の正常な機 能化または発現が阻害される。その結果、害虫の正常な発育が中断される。

不活性化されているので、このウィルスにより感染している宿主昆虫の継続的な 発育を可能とする。その宿主昆虫の発育は摂餌の減退のような行動の変化を引き 起こし、ウィルス性殺虫剤により感染した時には、成長の減退およびさらにより 迅速な死に及ぶ。本発明はまた、改良されたウィルス性殺虫剤の生産の方法を包 含している。さらに、本発明は、害虫にこの改良されたウィルス性の殺虫剤を与 えて害虫を制御する方法を包含する。

本発明が意図するところの遺伝的に変化が加えられたウイ核多角体病ウィルス（ ＡｃＭＮＰＶ）ならｑにＯｒｇｙｉａ　ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ核多角体病 ウィルス（ＯｐＭＮＰＶ）は、自然状態において里遺伝子を発現し、その遺伝子 発現により、感染幼虫がそのウィルス感染のために死ぬまでに摂餌に費やされる 時間が延びる。

本発明は、例えばくしかし限定されるわけではないが）、ノ＜クトシダーゼに対 する遺伝子のような非ウィルス性のマーカー遺伝子でその位置を置換するか、あ るいはその中に挿入す列でも使用され得ると理解されるべきである。あるいは、 里遺伝子の全て、あるいは一部は、適切なりＮＡコード断片を欠失させることに よってゲノムからとり除かれ得るか、もしくのあるバキュロウィルスは、昆虫細 胞培養中において、一連のウィルスの継代によっても生産され得る。得られた欠 失ウィルスは、外来のＤ＼へを含んでＬ）？＝＜て、機能性のｇｅｔ遺伝子を欠 いている点にお参で野生型とは異なっているという利点を有している。このよう ！＝改変されたバキュロウィルスは、現在使用されているウィルスよりも害虫制 御物質としてすぐれた機能をする。単純デ＝欠失変異体に関していえば、これら は異種のＤＮＡを含んでい！；いので、遺伝子工学でつくられた殺虫剤として、 規制機関（例えば、アメリカ合衆国ＥＰＡ）に受の遺伝子を挿入することにより 改変され得る。従って、このようなウィルスの昆虫制御物質としての有効性が改 良される。

（以下余白） 本発明は、完全なｅｇｔ遺伝子が欠失しているか、あるいは機能的にＥＧＴ生産 物の発現が不可能である変異型のウィルスの幼虫を感染させることにより、害虫 を制御する方法をも包含している。変異型のウィルスに感染した幼虫は脱皮し蝋 化しようと試み、結果として野生型あるいは従来技術のウィルスに感染した幼虫 よりも、えさを食べる期間が短くなる。変異型ウィルスに感染した幼虫は、野生 型あるいは従来技術のウィルスに感染した幼虫よりも死ぬのも早い。

゛本発明の目的は、野生型、あるいは従来技術のウィルスよりもより効果的な殺 虫剤である組換え型ウィルスを提供することである。本発明は、ｖＥＧＴＺと称 される組換え型ＡｃＭＮＰＶによって例証される。そのｖ　ＥＧＴＺにおいては 、ｅｇｔ遺伝子の一部が欠失し、β−ガラクトシダーゼをコードする細菌性遺伝 子あらゆるＤＮＡ配列が置換され得る。本発明は、ｅｇｔ遺伝子の一部が欠失し ているｖＥＧＴＤＥＬと称される組換え型／ＮＪキュロウイルスによって更に例 証される。もうひとつの実施態様としてヲモたらすバキュロウィルスもこれらに 含まれる。

従って、本発明の目的は害虫の制御に有用である里遺伝子およびその遺伝子生産 物を提供することである。さらに、本発明の範囲には、実質上精製されたエフダ イステロイド−Ｕ叶−グルコシルトランスフェラーゼおよびそれに特異的な抗体 が含まれる。ｅｇｔ遺伝子は、表１のｅｇｔ遺伝子のヌクレオチド配列に対する 配列相同性により、あるいはＥＧＴ酵素活性の決定とそれに引き続＜　ＤＮＡの 分析の後に同定され得る。

エフダイステロイド・ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼをされ得、そのアッ セイ工程は実施例４に示される。実質的に純粋なｅｇｔタンパクの精製は少なく とも約７０％（Ｉｌｌ／Ｗ＞のエフダイステロイド・Ｕ叶−グルコシルトランス フェラーゼを含有することである。組換え型ｅｇｔタンパクとは、該タンパクを コードする遺伝子が天然に存在する以外の他の生物で作られるタンパクである。

その組換え型タンパクは、遺伝子工学的あるいはＤＮＡの組換えの技術の結果と して発現する。

本発明のもうひとつの目的は、効果的な殺虫剤であって、さらに環境に対しても 無害な、遺伝子工学によってつくられるウィルスを提供することである。

本発明のもうひとつの目的は、機能性ｅｇｔ遺伝子が欠損しており、昆虫の発育 を妨害する第２の遺伝子を発現する組み換え型殺虫剤を提供することであり、こ こで第２の遺伝子は生物中に自然には存在しない。この第２の遺伝子は、脱皮に 影響を及ぼす遺伝子生産物をコードする。この様な遺伝子生産物は昆虫の発育に 影響を及ぼす昆虫ホルモンか、又は脱皮を調節する昆虫ホルモンを、不活性化す る酵素となり得る。特定の例には、前胸腺刺激ホルモン、羽化ホルモンおよび幼 若ホルモンエステラーゼが包含される。これらのタンパクをコードする遺伝子が 、昆虫制御物質を生産するために昆虫ライればならない。

本発明のもうひとつの目的は、昆虫制御物質としての使用のために、遺伝子的に 改変された生物を提供することであり、を発現する遺伝子的に改変された生物は 、害虫にとって有害であり、結果として植物への害を軽減する。

更に本発明の目的は、農業への応用に適した殺虫組成物を提供することである。

このような組成物は当該分野で理解され得る農業的に適した担体と、バキュロウ ィルスのような、前記ウィルスのｅｇｔが不活性化される様に遺伝子的に改変さ れた昆虫ウィルスを包含する。このようなＥｇｔ−バキュロウィルスはさらに遺 伝的に改変されて、脱皮に影響する昆虫ホルモンまたは脱皮に影響する昆虫ホル モンを不活性化する酵素をコードする異種遺伝子を発現する。遺伝子生産物が脱 皮に影響を与える異種遺伝子には、前胸腺刺激ホルモン、羽化ホルモン、および 幼若ホルモンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、 遺伝子的に改変されたバキュロウィルスを包含する殺虫組成物は、スプレー塗布 用に処方される。

更に殺虫組成物として意図されたものは農業用に適した担体と、遺伝子的に改変 された昆虫寄生体を有するものである。

昆虫寄生体は、幼虫と密接にかかわりながら生活し、複製する生物であり、幼虫 にとっては有害となる。昆虫寄生体は、細菌であり、真菌であり、ウィルスであ り、もしくは他の昆虫制御物質として改良される。

上述の殺虫組成物のいずれもが、昆虫がえさを食べるのを、刺激する成分をさら に含有している。本発明の殺虫組成物は、植物に付与した後に害虫に食べられて 、殺虫組成物中の昆虫抑制物質の影響を受け易い害虫はえさを食べる量が減少し てはその遺伝子生産物の機能により阻害する、改変された生物学的殺虫剤を提供 することである。

の制限酵素切断地図として提供されている。

第２図は、ｅｇｔ遺伝子を配列決定し、その配列分析した結果の略要約図である 。パネルＡはその領域の制限酵素切断地図を表す。パネルＢに、オーブンリーデ ィングフレームについての配列のコンピューターによる分析結果を示す。縦線は 停止コドンを示す。この配列は、各々のＤＮＡｔＪｌ　（１，２，３，１’。

２′、３°）について、すべての３つの可能なオーブンリープイン　グフレーム に“翻訳”されている。ｅｇｔに相当するオーブンリーディングフレーム（２） はＥＧＴとラベルされている。

第３図は、以下の（Ａ）　（Ｂ）および（Ｃ）の各構造の概略図で転子を表す。

第４図は、バキュロウィルスＯｐＭＮＰＶにおけるｅｇｔ遺伝子の同定のための アガロースゲル電気泳動、およびサザンプロット分析の概略図である。

第５図は、ＯｐＭＮＰＶゲノムの制限酵素切断地図の略図である。

第６図は、コントロールの非感染幼虫あるいは第４齢でｗｔ　ＡｃＭＮＰＶまた はｖＥＧＴＺに、感染した幼虫の体重増加のグラフである。

第７図は、第４齢でｗｔ　ＡｃＭＮＰＶまたはｖＥＧＴＺに、感染した幼虫の死 亡率を示すグラフである。

第８図は、第５齢でｗｔ　ＡｃＭＮＰＶまたはｖＥＧＴＺに、感染した幼虫の体 重増加を示すグラフである。

第９図は、第５齢でｗｔ　ＡｃＭＮＰＶまたはｖＥＧＴＺに、感染した幼虫の死 亡率を示すグラフである。

第１０図は、第１齢での、４．８Ｘ１０’多面封入体濃度（ＰＩＢ／ｄ）でｗｔ 　ＡｃＭＮＰＶまたはｖＥＧＴＺに感染した幼虫の死亡率を示すグラフである。

またはｖＥＧＴＺに感染した幼虫の死亡率を示すグラフである。

開示された実施様態の詳細な説明 鱗翅類の昆虫は、卵から成虫までの発育の間に固有の一連びＧｌｌｂｅｒｔ編、 Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　１９８４の詳細な総説を参 照。）ふ化後、幼虫は多量のえさを食べる期間に入り、その期間中にさらに成長 を続けるため数回脱皮する。この脱皮の間の段階を齢期とよんでいる。幼虫の成 長期の最後には、幼虫を軸化し最終的に成虫となる。脱皮と軸化の過程（これを まとめて脱皮（ｅｃｄｙｓｉｓ）という言葉で表す）は、いくつかの異なった種 類のホルモンの相互作用によって調節されている。最初の刺激は、ある種の脳細 胞からの前胸腺刺激ホルモン（ＰＴＴ）ｌ）の放出である。この刺激によって前 胸線を刺激し、エフダイステロイドを生産し分泌するが、これはしばしば昆虫脱 皮ホルモンと呼ばれている。幼若ホルモンの存在下に脱皮が起こり、幼若ホルモ ンの非存在下に踊化が起こる。羽化ホルモンもまた脱皮に関連したいくつかの行 動変化をもたらすのに重要である。

バキュロウィルスＡｃＭＮＰＶは、多くのバキュロウィルス研究のモデル系とし て使用されており、以前には予測もできない方法で、前に議論された昆虫の発育 の過程を妨害する。ＡｃＭＮＰＶに感染した幼虫は、もはや脱皮も蛸化もできな くなる。これはＡｃＭＮＰＶが、エクダイステロイドＵＤＰ−グルコシルトラン スフェラーゼ（ＥＧＴ）として知られる酵素の合成を誘導し、それが昆虫エフダ イステロイドを特異的に不活性化させるためである。

ＥＧＴをコードする遺伝子は本発明者によって同定された。

それはＡｃＭＮＰＶのゲノム上の８．４から９．６の地図単位に延びている　（ 第１図および第２図）。第１図のパネルＣに示すようＣ１９と、ブルースクリプ ト　（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）　Ｍ１３＋と、ブルースクリプトＭ１３−との中 にクローン化されている。簗２図は、ゲディングフレーム２のみが相対的に長い オーブンリープイン列は、ヌクレオチド１４９付近からヌクレオチド１６７０付 近まで延びている。

本発明の好ましい実施態様において、バキュロウィルスＡｃＭＮＰνの遺伝子は 、ｅｇｔｉｉｉｉ伝子の一部を転子−ガラクトシダーゼをコードする細菌の配列 で置換することによって不活性化されている。この組み換え型バキュロウィルス をｖＥＧＴＺと命名する。第２の好ましい実施態様では、第３図に示す様に、Ａ ｃＭＮＰＶのｅｇｔ遺伝子の品分が置換されることなく欠失していることである 。ｗｔ　ＡｃＭＮＰＶの、感染中に合成されたタンパク、およびｖＥＧＴＺの感 染中に合成されたタンパクを比較することにより、ＥＧＴタンパクは、感染細胞 から分泌される６０ＫＤａのり子の不活性化のもうひとつの機構は、脱皮に影響 する昆虫ホルモンあるいは脱皮に影響する昆虫ホルモンを不活性化させる酵素を コードする遺伝子の挿入であり、その遺伝子は前記の昆虫ウィルスで感染した細 胞で発現しうる。

シーンバンク　（Ｇｅｎｂａｎｋ）データベースの検索により、ｅｇｔといくつ かのは乳類のＵＤＰ−グルクロノジルトランスフェラーゼの間に２１から２２％ の配列の相同性がみられた。これらの２に示されている。

（以下余白） 表１ ＡｃｌｌＮＰＶ　ｃｇｔのヌクレオチド配列、および推測されるアミノ酸配列ユ 　（：、ＴＣＣ，ＡＣＧＣＧＣＴＴＣＴＧＣにＴＡＴ　入入ＴＴｃｃｘｃ＾Ｃ丁 入＾Ｃ入ＴＧＴＴＧ　ＣＣＣＴＴＴＧ入ＡＣ５ユ　ＴＴＧＡＣＣＴＣＧＡ　ＴＴ ＧＴＧ：ＴＴ入λ丁　Ｔｍ’ＧＧＣＴ入Ｔ　入入入＾λＧＧＴＣＡ　ＣＣＣＴＴ ’ＴＡ入λλユＯ）　Ｔ７ＴＣＴＴＡＣＡＴ　入入ＴＣ入入入ＴＴ入　ＣＣ＾Ｇ ＴλＣ＾Ｃ丁　Ｔλｒｒｃｃｃｒｒｒ　ｃ入＾ＧＣ入入へ入Ｔ＠ｑｚ：　Ｍ 表１　（続き） １７０１λＣＣＴＧＧ−、、丁＝７ＧλＧ入ＣＧＧ　ＧσニーゝＣ賀ｔＧλσＧ ＣＧυに７〒αスＧＣσ−丁ユ７５ユ　λ７人λ＾ＣＧＣＴＣλＣＣλ＾ＣＣ入 λλ　ＧＣλＧＳＴ口λＴＴ　入ＴＴＧＴＧＣＣλＧＧλｃｃ’ｒ丁Ｃλλλ表 ２ 表２は、他の種由来のＵＤＰ−グルクロノジルトランスフェラーゼとｔｌＤＰ− グルコシルトランスフェラーゼとを選んで、れたアミノ酸配列は、次のものと比 較されている。ヒト（ＨｌｌＭＵＤＰＧＡＴ）　（Ｊａｃｋｓｏｎら　（１９８ ７）　Ｂｉｏｖｅｍ、Ｊ、２４２　：５８１）　、マウス　（ＭＬＩＳＩＩＤＰ ＧＡＴ）　（ＫｉｍｕｒａとＯｗｅｎｓ　（１９８７）　Ｂｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ。

フェラーゼ、およびとうもろこしのＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（Ｚ ＭＡＹＵＤＰＧＴ）　（Ｒａｌｓｔｏｎら　（１９８８）　Ｇｅｎｅｔｉｃｓよ って実行されたＦＡＳＴＰアルゴリズム（ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）　（Ｌｉｐｍａ ｎ字は正確に一致するが小文字は関連するタンパク間でしばしａｒｃｈ　Ｆｏｕ ｎｄａｔｉｏｎ、シｏｌ、５．　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　３．５ｉｌｖｅｒ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　ＭＤ）　；点は、めったに起こらない置換を示し、ハイフンは配列 間の間隙を示し、脱字記号はアミノ酸が配列から欠失していることをしるしてい る。矢印の間のアミノ酸はｖＥＧＴＺとｖＥＧＴＤＥＬのＵＤＰ−グルコースお よびＵＤＰ−グルクロノジルトランスフェラーゼと相同性を有することにより、 このへｃＭＮＰＶ配列が、は乳類に於いて、ＵＤＰ−グルクロノジルトランスフ ェラーゼはグルクロン酸の多種多用な外因性および内因性親脂質性Ｆｌｏｒｉｄ ａ、　１９８６年に論じられている）。この結合反応は、何らかの薬や発がん性 物質の解毒と安全な消失にとって重要である。さらに、ビリルビンおよびステロ イドホルモンのような種々の内因性化合物の正常な代謝と除去とは、グルクロン 酸との結合を経て進行する。昆虫の系において入手し得る証拠により、このタイ プの糖との結合反応は、グルクロン酸よりもむしろグルコースの転移を経て起こ るということが示さＬｏｎｄｏｎ　ｐｐ２１９−２３２）。は乳類と同様、多く の種類の外因性および内因性化合物が昆虫の中で結合される。

本発明者らはＡｃＭＮＰＶ　ＥＧＴタンパクが、グルコースをエクダイソン、２ ０−ヒドロキシエクダイソン、およびマキステロンＡのようなエフダイステロイ ドと特異的に結合させるＩＩＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼであることを 示した（表３参照）。溶解産物も、非感染のあるいはＶＥＧＴＺに感染した細胞 の細胞外媒体もエクダイソンを改変しない。ＡｃＭＮＰＶ感染細胞で発現したエ フダイステロイドグルコシルトランスフェラーゼ活性のほとんどは、細胞外媒体 に分泌される。比較的低レベルの活性のみがＡｃＭＮＰＶ感染細胞溶解産物に観 察される。

ＡｃＭＮＰＶｅｇｔ遺伝子をプローブとして用いて、ｅｇｔ遺伝子が他ウィルス 　（ＯｐＭＮＰＶ）中で同定された。これは第４図に示すとおりである。あらゆ るバキュロウィルス、昆虫ウィルス、あるいは昆虫のｅｇｔ遺伝子が本発明で例 示されたのと同様の方法で位置づけされ、特徴づけられ、そして単離され得るこ とは、この明細書の開示によって当業者に認められるであろう。

表１に示した配列と少なくとも７０％のヌクレオチド配列の相同性をもつｅｇｔ 遺伝子は、表１中の配列と同等であると考えられる。但しこれはそれら相同性を もつ遺伝子がエフダイステロイドＵ叶−グルコシルトランスフエラーゼである酵 素をコードする場合である。

ｅｇｔ遺伝子の機能等偽物とは、グルコース部分をＵ叶グルコースからエクダイ ソテロイドへと転移させることによって、エクダイソンの様なエフダイステロイ ドの不活性化をも触媒するものである。そのようなｅｇｔの機能等価物は本発明 に記述した評価方法を用いて同定され得る。

ｅｇｔ遺伝子を位置づけし、同定し、単離すれば、当業者は、より効果的な昆虫 制御物質を生産するための、本発明で開示された方法と既知の技術を用いてその 遺伝子を不活性化できる。

ｖＥＧＴＺの性質と野生型（ｗｔ）のＡｃＭＮＰＶの性質を比較して、本発明者 らはｅｇｔの発現は昆虫が脱皮し踊化するのを妨げることを示した。ｗｔ　Ａｃ ＭＮＰＶに感染した昆虫は脱皮せず踊化しないが、ｖＥＧＴＺに感染した昆虫は 脱皮し、蛸化しようとする（実施例■の表４参照）。

脱皮と桶化を阻害することにより、ｗｔ　ＡｃＭＮＰＶの感染は、実際に幼虫が えさを食べる時間を延長する。第５齢期間（最後の齢期）の初めて−・ｔウィル スに感染した幼虫は、感染後５．６日後の死までえさを食べ続ける。しかし、非 感染の幼虫は第５齢期に入った後、蛸化を準備して２．３日後にえさを食べるの をやめる（第８図参照）。同様の効果がより早い齢期の幼虫にも観察される。非 感染の幼虫は脱皮せず、その結果えさを食べることをやめない（第６図参照）。

機能性ｅｇｔｉｌ伝子が欠転子た組み換え型バキュロウィルスは、幼虫がえさを 食べる時間を延長しない。このように、第５齢期初期でｖＥＧＴＺｉ、：感染し た幼虫は蛸化の準備のため感染後２日間はえさを食べるのをやめる（第８図参照 ）。しかしながらそれらは’ｆｆ９図に示すように蛸化せず、代わりにｗｔウィ ルスに感染した幼虫よりももっと早くウィルスの感染に屈服する。同様に、第４ 齢期の初期にｖＥＧＴＺに感染した幼虫は脱皮のため、感染後２日間はえさを食 べるのをやめ、そしてｗｔ感染した幼虫よりも死ぬのが早い（第６図および第７ 図参照）。第１０図および第１１図に示すように、ふ化したばかりの第１齢期の 幼虫がｗｔ　ＡｃＭ〜’ＰＶに感染したとき、およびｖＥＧＴＺに感染したとき には、機能性ｅｇｔＪ伝子を転子したバキュロウィルスによって、より迅速な死 亡が劇的に観察される。ｖＥＧＴＺに感染した幼虫はｗｔ　ＡｃＭＮＰＶに感染 した幼虫よりも３〜４日間早く死ぬ。それ故に、機能性ｅｇｔ遺伝子を欠く組み 換え型のバキュロウィルスは、昆虫制御物質として野生型のバキュロウィルスよ りかなり効果的である。ｅｇｔ遺伝子を、当該分野に既知の方法によって、どの バキュロウィルスあるいは昆虫においても非機能性にすることは、当業者にとっ てはこの明細書の開示によって明らかとなる。

上述の効果および次の実施例は、当分野においてより劇的である。ｖＥＧＴＺに 感染した幼虫は脱皮が困難であるが、注意深く制御された実験室の条件では脱皮 する。温度と光が厳密に制御されなければ、多くの昆虫は完全に脱皮しｆＬい。

そしてこれらは再びえさを食べ始め、その後まもなく死に到る。

後代のウィルスが、機能性ｅｇｔ遺伝子を欠損したバキュロウィルスに感染した 幼虫の中に集まることができる時間の長さはいく分切り詰められ、そして感染し た昆虫の成長が遅れるが、そこには後代のウィルスが実質的に生産されている。

おそい齢期の幼虫のｖＥＧＴＺ感染の結果、各幼虫あたり得られるウィルスの量 は、ｗｔウィルスの感染で得られる量の約半分である。当分野では、ウィルスを 伝染させコスト的に有効な多量のウィルスの微粒子を調製するにはこれで充分で ある。

く昆虫ウィルスが、遺伝子工学技術によって改変されることであり、その結果、 生物的制御因子としての効果が、その生産物が昆虫の発育に影響する第２の遺伝 子を取り込むことによって、更に増強される。

ＰＴＴＩ（（ペプチドホルモン）をコードする遺伝子は、ｅｇｔ遺伝子が欠失し たウィルスのゲノムの中へ挿入され得るし、かつＰＴＴＨは脱皮に影響するのに 十分に高いレベルで発現され得る。このようなウィルスに感染した幼虫は、発育 ホルモンの制御において、極端な混乱を経験する。このような昆虫は急激に病気 になり、成長と発育が危うくなり、えさを食べる量が減り早期に死滅する。

羽化ホルモンもまた小さなペプチドホルモンであり、その遺伝子は従来の技術を 用いて非機能性ｅｇｔ遺伝子をもつウィルスの中へ挿入され得る。羽化ホルモン は、脱皮に関連した多くの行動の変化を支配するので、十分に高いレベルにこの ホルモンを産出するＥｇｔ−ウィルスに感染した昆虫は、えさをたべる量が少な くなるなどの行動上のおよび／または発育上の異常を示すことになる。

昆虫における幼若ホルモンの濃度（ｔｉｔｅｒｓ）の主要な調節物は幼若ホルモ ンエステラーゼであり、これは幼若ホルモンを不活性化する。機能性ｅｇｔが欠 損し、十分に高いレベルの幼若ホルモンエステラーゼを発現する組み換え型ウィ ルスは昆虫の行動または／あるいは発育にとって有害となる。

上記の遺伝子のすべては野生型のウィルスゲノムに付加されることが可能である 一方、それらは、野生型ウィルスに感染した昆虫の行動に有意な影響を及ぼすこ とは期待できないと認識することが重要である。なぜなら、他のホルモンの生よ り、エフダイステロイド脱皮ホルモンが不活性化し、脱皮が妨げられるからであ る。このような、昆虫の脱皮を妨害するように意図されたウィルスの生産に関す る成功した戦略は、本発明に記載のように、ｅｇｔ遺伝子の優先的な不活性化に よるものである。

完全なｅｇｔ遺伝子が欠損しているか機能性ｅｇｔ生産物を発現できない変異生 物、および酵素を改変する他のホルモンあるいはペプチドホルモンを発現するよ うに、さらに遺伝子的に改変された変異生物が本発明では昆虫制御物質として含 められることは、当業者に理解されるところである。

ｅｇｔ遺伝子生産物が、強力でかつ特異的な方法で昆虫の発育を妨害することが 示された。エフダイステロイドは、実質的にあらゆる種類の昆虫の発育に於いて 重大な役割を演じてい昆虫制御戦略に於ける使用にとってかなりの可能性をもつ ものである。たとえば、本発明の第４の好適な実施態様において、農作物は、遺 伝子工学によって、既知の技術で、ＥＧＴタンバタを本質的に生産するようにな され得る。そのような作物を食べている昆虫は完全に成虫に発育できず、それ故 に効果的な長期間の作物保護が提供される。同様に植物あるいは昆虫に正常に存 在する細菌は、遺伝子工学によって既知の方法でＥＧＴ酵素を生産することが可 能となる。この様な細菌はさらに効果的な生物制御因子として作用する。

同様に、非植物病原性で植物に集落化する（ｐｌａｎｔ−ｃｏ！ｏｎｉｚｉｎｇ ）細菌は遺伝子的に改変されてＥＧＴ遺伝子を発現する。これらの遺伝子的に改 変された細菌が集落化した植物は、発現したタンパクの影響を受け易い害虫から 保護される。

非植物病原性で植物に集落化する細菌は、例えば、米国特許Ｎｏ、　４．７９８ ．７２３に記載されている。ある植物集落化細菌の遺伝子的改変は米国特許Ｎｏ 、４．７７１．１３１とヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ、　０１８５００５に記載 されている。植物に集落化する他の細菌は当該技術分野で既知である。既知の技 術によるどの方法も、上述の昆虫制御物質を生産する、発現可能な遺伝子を導入 するのに使用可能である。

このように遺伝子的に改変された植物物質、あるいはこのように遺伝子的に改変 された、植物集落化細菌が集落化した植物物質を、感受性のある昆虫が摂取する と、その昆虫の正常！＝発育を破壊することにブ＝る。ある種の昆虫（たとえば アブラムシ（ａｐｈｉｄｓ）　）は、特に浸透性のある腸細胞をもつことが当該 分野で既知となっている。当業占はその様な植物発現性の遺伝子を構築するのに 必要な工程、およびその様な遺伝子を植物のゲノムに取り込むのに必要な工程を 理解している。

昆虫自身がそのライフサイクル中の特定の段階でｃｇｔ遺伝子を発現し、このこ とが発育を規制する機構の重要な構成要新既な昆虫制御の戦略に適した目標にな り得る可能性がある。

本発明の開示はそのような戦略を組み立てる手段を提供するものである。

更に本発明の実施態様によれば、ＥＧＴ酵素に結合しているが、該酵素からは開 裂も遊離もされないエフダイステロイド類縁体がデザインされ得る。その様な“ 自己不活化基質”　（ｓｕｉｃｉｄｅ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ）はＥＧＴ酵素と競 争的に結合し、ＥＧＴ酵素の活動を阻害するか遮断する。あるいは、組み換え型 の生物は、本発明で提供した方法を採用し当該分野で理解されるよ産によって妨 げられように、遺伝子工学によって作られる。

ここで使用される昆虫制御物質とは、組成物、あるいは害虫に有害フ＝紹戊物の 活性成分である。昆虫がえさを食べるのは、昆虫制御物質に応じて減じられ、正 常な昆虫の脱皮は妨害され、引き続き死に到る。本発明の昆虫制御物質は、エフ ダイステロイド改変酵素をコードする遺伝子を不活性化するように遺伝子工学的 につくられた昆虫ウィルスであり、あるいは昆虫の発育に影響するタンパクをコ ードする異種遺伝子を発現するためにより手を加えられたウィルスでありうる。

あるいはそれは植物であり、昆虫寄生生物であり、または非植物病原性細菌であ り、それらのいずれもが脱皮に影響するタンパクをコードする異種遺伝子を発現 するように遺伝子工学によってつくられたものである。

害虫を制御するための植物への付与に適した殺虫組成物は、農業に適した担体と 昆虫制御物質とを含有する。本発明の殺虫組成物の付与により、えさを食べるの を減らし、感受性のある昆虫を殺すことによって、害虫から植物を保護すること が可能となる。

当業者は、たとえば昆虫ウィルスなどの特別な害虫の制御に適した昆虫制御物質 の選択方法を知っている。

昆虫制御物質の接種、吸入、直接の接触などを含む従来の方法によって、本発明 の昆虫制御物質に害虫をさらすことは、当業者にとって理解されることである。

その他に昆虫制御物質として考え出されたものは、昆虫の発育に影響を与える少 なくとも一種のタンパクを発現するように遺伝子的に改変された植物と昆虫病原 性の微生物である。

その様なタンパクの例は、前胸腺刺激ホルモンと、羽化ホルモンと、幼若ホルモ ンエステラーゼと、エクジボン（ｅｃｄ　ｉ　ｐｏｎｅ）グルコシルトランスフ ェラーゼとを包含するが、これらに限定される。

（以下＊ｂ） 細菌ウィルスと真菌と他の昆虫を包含する昆虫寄生生物も寄生生物による寄生は 改変されていない寄生生物に正常に関連した症候に加え、正常な発育の破綻をも たらす。感染した昆虫に於ける発育の破綻は、昆虫の病気の段階を激化させる。

害虫による接触と害虫の感染はえさを食べるのを減少させ死を早めることになる 。

本発明で開示され、生物に特有のプロモーターの適切な制御のもとに発現した昆 虫の発育に影響を及ぼすＥＧＴタンパクをコードするＤＮＡ配夕１］は、生物を 遺伝子的に改変し昆虫制御物質を生産するように使用され得る。遺伝子的改変の ための目標の生物は昆虫寄生生物と植物と非植物病原性植物集落化細菌を包含す る。

導入された抗体と、そして上記に由来しあるいは関連する他のすべての試薬は本 発明の範囲内に属する。ＥＧＴタンパクは本発明に記載の評価法と既知の技術を 用いて実質上精製され得る。

本発明の遺伝子工学的につくられたバキュロウィルスの主要な用途は植物に適用 して害虫を生物学的に制御するための農業組成物の成分としてである。昆虫制御 のためのそのような農業的に適した生産物を調製する多種多様の方法が当該分野 で知られている。

植物保護のために殺虫剤として効果的な農業組成物を生産する必要性のある昆虫 制御物質の濃度は使用される生物および変異体のタイプと成分の剤型に依存する 。組成物内で殺虫剤として効果的な殺虫制御物質の濃度は経験的にすみやかに決 定されるがこれは当業者には理解できることである。例えばウィルスの殺虫剤と して効果的な濃度は実施例ｖ１からＸＩに記載の種々の方法を用いてすみやかに 決定される。

農業組成物は農場での農業的使用き分散に適していなければならない。一般に組 成物は植物に対して毒性がなく完全な閉塞ウィルスに対して無害でなければなら ない。葉への適用は植物の葉に損傷をあたえてはならない。適当な固体のあるい はより好ましくは液体の単体に加えて、農業組成物はくっつき易く粘着性のある 因子や、乳化し易く湿った因子を包含するが、昆虫の摂食やウィルスの作用を鈍 くする様な成分を包含しない。ＭＶ不活性から昆虫制御物質を保護する成分を加 えることもまた望ましい。害虫の制御のための農業組成物は昆虫の摂食を刺激す る因ｊ′−をも包含する。

生物的昆虫制御物質の適用と農業的適用の方法を記述した論文が入手可能である 。以下に例を掲げる。ＣｏｕｃｈとＩｇｎｏｆｆ。

５ｈｂｅｔｈ、同書、　Ｚ３９ｔ　ｐｐ、７１７−７３２；　Ｂｒｏｃｋｗｅｌ ｌ（１９８０）　Ｍｅｔｈｅｄｓ、）　ｐｐ、１０５−１４４；そして、Ｒｏｕ ｇｈｌｅｙ　（１９８２）同書、　ＰＰ、１１５−１２７；　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ、第２巻、前出。

本発明は以下の例によって説明されるがそれらの範囲に制限を加えるようには解 釈されるものではない。様々の実施態様や改変や等傷物が手段として用いられ、 本発明中の記述を読んだ後に、それらが本発明の精神および／あるいは添付の請 求の範囲から離れることなく当業者に対する提案となり得ることは理解されると ころである。

図単位中のスケールはＡｃＭＮＰＶゲノムの地図の上に示されている。この遺伝 子のヌクレオチド配列と、隣接する領域を決定し、その後に続く遺伝子の操作を 許容するために、まず始めにプラスミドベクターの内へこの領域を取り囲んでい るいくつかのＤＮＡ断片をクローン化することが必要である（次の文ｇ　ｆｌａ ｒｂｏｒ、　ＮＹ、ＦＡ準クローニングのための手続き）。バネを示す７．６か ら１１．１地図単位までのゲノムの拡大図を示す。

使用されるもとのＡｃＭＮＮＰＶの菌株はＬｌ菌株である（ＬｅｅとＭｉｌｌｅ ｒ（１９７８）　Ｊ、　Ｖ＋ｒｏｌ、　２７：７５４）。クローン化したＤＮＡ 断片とその結果生じるプラスミドの名前が図１のパネルＣに示されている。断片 １は７．６ｍｕのＰｓｔ１部位から１１．１ｍｕのＢａｍｌｌｌ部位まで広がっ ているが、この断片は、プラスミドベクターｐＵｃ１まで）は共にベクターブル ースクリプト（Ｂｌｕｅ　５ｃｒｉｐｔ）　Ｍ１３＋とブルースクリプトＭ１３ −ヘクローン化される。（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ。

Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　。断片４　（ＢｓｔＥ　ＩＩ　 （８，３５ｍｕ＞からＢｓｔＥ　ＩＩ　（８，７ｍｕ）まで）はブルースクリプ トＭ１３＋ヘクローン化される。

多くのＢＣｐｓＥと８［：ＥＳプラスミドのサブクローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅｓ ）がつくり出される。（ｆｌｅｎｉｋｏｆｆ　（１９８４）　Ｇｅｎｅ　２８： ３５１）　、これらのサブクローンはウィルス挿入の非常に大きな欠失をもって いるので５０より少ないベースペアから完全なウィルスの断片の範囲まで異なっ た量のウィルスＤＮＡを含有する。これらのサブクローンの多くとプラスミドＢ ＣＢは完全なｅｇｔ遺伝子が同じ方向に配列するように配列している（Ｓａｎｇ ｅｒら＜１９７７＞の配列はタンパクをコードするオーブンリーディングフレー ムの存在のために以下の文献に記載されたプログラムを使用してコンピューター によって分析された。文献：Ｐｕ５ｔｅｌｌとＫｅ伝転子５０６個のアミノ酸か ら成るタンパクをコードしている子産物の予想されたアミノ酸配列を表１に示す 。

るために実施例Ｉに記述したプラスミドクローンを更に操作する必要がある。プ ラスミドｐＨｃＢｃＰｓＢは制限エンドヌクレア生じるプラスミドはｐＥＧＴＺ と命名される。このプラスミド内した後で）、その間に何の配列も挿入せずに構 築される。

すべてのウィルスは本来ＡｃＭＮＰＶ　Ｌ−１に由来しくＬｅｅとＭｉｌｌｅｒ ｏｗ　ａｎｄ　Ａ、Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ）、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、 Ｙ、、ｐｐ、２７７−２９８．１９８６）。

プラスミドｐＥＧＴＺは前述のＭｉｌｌｅｒら（１９８６）の方法に従いＳＦ細 胞中にｍｔ　ＡｃＭＮＰＶ　ＤＮＡとコトランスフェクトされる。この工程はウ ィルスＤＮＡとプラスミドＤＮＡの配列間で起こる相同ので、このような組換え 型ウィルスはβ−ガラクトシダーゼバクを生産する。ｖＥＧＴＺと表示される組 換え型ウィルスは同定可能である。なぜならば、β−ガラクトシダーゼの発現が 、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ −ｇａｌ）のような指示薬の存在下青いウィルスのプラークを引き起こすためで ある。ｖＥＧＴＺのｅｇｔ遺伝子の図が図３のパネル已に示される。

組換え型ウィルスｖＥＧＴＤＥＬは、プラスミドρＥＧＴＤＥＬとウィルスＶＥ ＧＴＺ由来の［ｌＮＡとをＳＦ細胞中にコトランスフエクトす起こす。組換え型 ウィルスｖＥＧＴＤＥＬはＸ−ｇａｌの存在下青いプラークを形成しないことに よって同定される。ｖＥＧＴＤＥＬのｅｇｔ遺伝子の構造は図３のパネルＣに示 される。

合成されたタンパクをｖＥＧＴＺあるいはｖＥＧＴＤＥＬ　（ＥＧＴをつくらな い）によって生産されたタンパクと比較することによって同定される。ＳＦ細胞 は０“Ｒｅ１ｌｌｙとＭｉｌｌｅｒが記述するように（（ｃＭＮＰＶまたはｖＥ ＧＴＺに感染する。非感染細胞もまた分析されている。感染後６時間ののち、細 胞を放射性元素でラベルした［”Ｓ　）−メチオニンの存在した全タンパクが放 射性元素でラベルされるまで１時間培養した。その後細胞をアルカリ性にしタン パクをＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯＳ−ＰＡＧＥ＞　（Ｌａ ｅｍｍｌｉら（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　２２７　：　６８０−６８５）によ って分離した。細胞から分泌されたどのタンパクも取出し、分析した。５Ｏ３− ＰＡＧＥの処理後放射性元素でラベルされたタンパクはオートラジオグラフィー にて検出された。６０ＫＤａのタンパクがｉｖｔ　ＡｃＭＮＰＶに感染した細胞 から分泌されるが、ｖＥＧＴＺに感染した細胞あるいは非感染細胞からは分泌さ れない。この６０ＫＤａのタンパクはｗｔ−ＡｃＭＮＰＶに感染した細胞の溶解 産物中には検出されないが、このことはタンパクが細胞から分泌されていること を示している。これらのデータはｅｇｔ遺伝子の生産物は６０ＫＤａの分泌され たタンパクでありヌクレオチドとアミノ酸配列のデータとよく一致した特徴を示 している。

実施例ＩＶ ＥＧＴタンパクの酵素活性はｍｔ　ＡｃＭＮＰＶとｖＥＧＴＺに感染したＳＦ細 胞を比較することによって同定される。ｗｔ　ＡｃＭＮＰＶとｖＥＧＴＺに感染 したＳＦ細胞は列■に記載しである。感染後１２時間で細胞と細胞外媒体は集め られ別々に分離される。非感染細胞も平行して処理される。細胞の溶解産物ある いは細胞外媒体は１ｍＭ　１１叶−グルコースと０．２５μ［：ｉ　［３Ｈ］エ クダイソンの存在下、０’　Ｒｅ１１１ｙとＭｉｌｌｅｒが記載した方法（（１ ９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ２４５：１１１０−１１１２）によって培養される。

細胞の溶解産物あるいは媒体におけるエクダイステロイドＵＤＰ〜グルコシルト ランスフェラーゼの活性はエクダイソンーグルコースの結合を形成するためＩＩ ＤＰ−グルコースからエクダイソンへグルコースの転移を触媒するものである。

エクダイソンとエクダイソンーグルコース結合はシリカゲルを用いた薄層クロマ トグラフィーによってそれぞれ分離され（［３ａｎｓａｌとＧｅ５ｓｎｅｒ（１ ９８８）　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０９：３２１）　、オートラジオグラフィーによって視覚化 される。エクダイソンーグルコース結合（Ｇ）はｗｔ　ＡｃＭＮＰＶに感染した 細胞溶解産物あるいは細胞外媒体が分析された時にだけ形成される。非感染のあ るいはｖＥＧＴＺ感染の細胞溶解産物かまたは媒体が使用される時には結合が観 察されないが、これは活性はｅｇｔの発現に依存していることを示している。

はとんどの活性は細胞外媒体中にかたよっており、このことは実施例■で議論し たデータと一致している。そのグルコースがエクダイソンと結合していることの 証拠は、ＩＩＤＰ−グルコースが放射性元素でラベルしたＵＤＰ−［：Ｕ−”Ｃ ：］グルコースと置換することを除く上述の方法に従いｗｔに感染した溶解産物 を分析することによって得ることができる。ラベルされていないＵＤＰ−プルコ ースあるいはラベルした［ＩＤＰ−［０−”Ｃ〕グルコースで実効された反応は 、共に〔３Ｈ〕エクダイソンが存在するが、これらの反応と結合のシンチレーシ ョンの計数はエクダイソン由来の３Ｈとグルコース由来の＋４ｃが共に検知され Ｕ叶−グルコースからエクダイソンへのグルコースの転移を触媒するＵＤＰ−グ ルコシルトランスフェラーゼであることがわかる。

ＥＧＴの基質特異性をより完全に調べるための実験を行った。

これらの実験では、著しいｅｇｔ活性を有するｗｔ−ＡｃＭＮＰＶに感染した細 胞由来の細胞外媒体の中へ種々の基質（１ｍＭ）を入れて培養した。どの観察さ れる結合もｅｇｔに依存していることを確実にするためのコントロールとして、 ＥＧＴを産出しない非感染細胞由来の媒体およびｖＥＧＴＺに感染した細胞由来 の媒体で、各々基質を培養した。０．０５μｍｃｉのＩＩＤＰ−Ｃｌ−１４Ｃ’ ］グルコースがそれぞれの反応に加えられた。ＥＧＴのための基質として作用す るどの化合物もグルコースと結合する。グルコースは放射性元素によってラベル れているので検出され得る。

（以下余白） 表３ Ｐ−アミノ安息香酸　−一一一 ビリルビン　−−−− クロラムンフェニコール　−−−− ジエチルスチルベストロール　−−−−２０−ヒドロキシエクダイソン　８７， ８ヒドロキシキノリン　−一一一 マキステロンＡ　８９．６ α−テトラロール　−一一一 更なるコントロールはｔｌＤＰ−［ｔｌ−”Ｃ”ｌグルクロン酸を、ｗｔ感染細 胞由来の媒体との反応の別の組に加えることであり、そのことによりグルクロン 酸が本反応で転移しないということが示される。得られたデータを表３に示す。

同定された基質はエクダイソンと２０−ヒドロキシエクダイソンとマキステロン Ａだけでありこれらすべてエフダイステロイドである。

結合はにせのあるいはｖＥＧＴＺ感染の細胞由来の媒体を使用しに依存している ことが確かめらた。ＵＤＰ−〔ｌｌ−”Ｃ）グルクロン酸が使用されると結合が 観察されないが、これはＥＧＴはグルクロン酸を転移しないことを実証している 。

に相同性をもつ遺伝子を含有することを実証するために、口ρＭＮＰＶのＤＮＡ が単離され制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１とＢａｍｔｔｌルスＤＮＡを開裂 し、ＯｐＭＮＰシゲノム上における位置がすでに知られている異なった大きさの いくつかの断片に分解する（Ｌｅ　ｉｓｙら＜１９８４）Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５２ ：６９９）　。サザンハイプリダイゼーショってプラスミドＢＣＥＳから切除さ れたく図１参照）。この断片を放射性元素３２Ｐでラベルし０ρＭＮＰＶゲノム 内のあらゆる関連する配列を同定するプローブとして使用する。適当な条件のも とに、当該分野では理解されているが、ＤＮＡ断片は類似のあるいは同様の配列 を含有するＤＮＡの他の断片に結合する。

このようにＡｃＭＮＮＰＶ　ｅｇｔプローブは関連するＤＮＡ配列を有するナイ ロン膜上でどのＯｐＭＮＰＶ　ＤＮＡ断片とも結合する。結合したプローブの位 置は膜をＸ線フィルムにさらすことにより視覚化される。ｅｇｔプローブではま ず最初におだやかな条件のもと　（１Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナト リウム、５％デキストランサルフェート、５Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶媒および０ ．２５％ＳＯＳ　３７℃）でナイロン膜とハイブリダイズする。これはプローブ を比較的離れた関係の配列にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの 温度を上げたり、あるいはハイブリダイゼーション溶液の中ヘホルムアミドを添 加する二とによって特異的なハイブリダイゼーションバンドが観察されるまでハ イブリダイゼーションの厳格さは増大する。図４のハイブリダイゼーションの条 件は１Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、５％デキストランサル フェート、５Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔゲノム中相対的に同じ位置にあることに注目 されたい。同様の実験記録が他の昆虫病原体中のｅｇｔ相同性遺伝子の同定に応 用され得る。非常に相同性の低い（ｈｉｇｈｌｙ　ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）配列に とって実施例ＩＶに示される分析方法を使用してＥＧＴの活性を確かめることが 必要となる。その後、ゲノムの分子遺伝学的分析は既知の方法論を用いてＥＧＴ 酵素をコードする遺伝子を単離することが必要となる。

また、実施例ＩＶに示したエフダイステロイド［ＩＤＰ−グルコシルトランスフ ェラーゼ活性測定用の特異な分析方法を用いて他の生物中にＥＧＴ遺伝子を見出 すことも可能である。この分析方法は従来の生物学的技術で精製する間に酸素を 同定するのに使用される。一旦精製されるとＥＧＴタンパクの部分的アミノ酸配 列は決定される。この情報はゲノム中にＥＧＴ遺伝子を位置づけるのに使用され るオリゴヌクレオチドプローブを作り出すのに使われる。

実施例Ｖｌ エフダイステロイドの血液リンパ滴定量は幼虫−幼虫および幼虫−蝋の脱皮を規 制すべく環状に変動していく。そしてグルコースの結合はエフダイステロイドを 不活性化する恐れな発育の過程を破壊する。そのような破壊を実証するために、 新たに脱皮した第４齢のＳ、ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ幼虫をｗｔ　ＡｃＭＮＰＶあ るいはｖＥＧＴＺを注入して感染させ、それらの発育にどのような妨害があって もわかるように毎日モニターした。幼虫のひとつの同船集団にネガティブコント ロールとして細胞培養液を注入した。この実験結果を次の表４に示す。細胞培養 液を注入したすべての幼虫は（偽感染）予想どおり第５齢期に脱皮する。ｗｔウ ィルスで感染した１６匹の幼虫の内１匹だけがこの変化をする。対称的に、変異 型のｖＥＧＴＺに感染したすべての幼虫は第４から第５齢期への脱皮を受ける。

このようにｗｔ　ＡｃＭＮＰＶによるｅｇｔの発現は明らかにがっ特異的に宿主 の脱皮を阻害する。感染した幼虫の両方の集団はその結果ウィルスの感染に屈し 、ｅｇｔの破壊はｖＥＧＴＺにその宿主を殺すことを妨げない。

表４ ＡｃＭＮＰＶ感染による脱皮の阻害 偽　１６　０ 野生型　１　２６ ｖＥＧＴＺ　１６　１６ またはｖＥＧＴＺ（５μβ中）を注入する。偽感染の幼虫には５μｌの細胞培養 液を注入する。各々の同船集団は人工的な食事と（Ｒ，Ｌ、Ｂｕｒｔｏｎ（１９ ６９）　ＡＲＳ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、　ｐｐ、３３−１３４＞　２８℃で １４　：　１０の明：暗の時間比で飼育した１６匹の幼虫を含む。脱皮は毎日モ ニターされ死亡数は７日目に記録される。

同様の結果が第５齢期初期に注入した幼虫でも得られている。新しく脱皮した第 ５齢期幼虫を使用すると、ｗｔ感染した幼虫は軸化の徴候を示さなかった。他方 、ｖＥＧＴＺ感染した幼虫の大多数はいくつかの行動上の変化を示した（えさを 食べるのをやめたり、ふらふらしたり、回転したりなど）が、これはまさに幼虫 −輛への脱皮の特徴である。しかし、すべてのウィルス感染した幼虫は桶化前に 死亡した。これらのデータはＡｄＮＰＶの感染が幼虫が脱皮し軸化するのを妨げ ていることを示している。さらにデータは昆虫の発育の妨害はｅｇｔの発現によ るものであることを示している。

実施例■■ 野生型（ｗｔ）　ＡｃＭＮＰＶとｖＥＧＴＺとの生体内での生物検定は、かを注 入している。比較としてコントロールの幼虫にはウィルスを含まない細胞培養媒 体を注入する。幼虫は毎日体重増加と脱皮あるいは軸化の徴候と死亡数をチェッ クされる。幼虫の異なった集団の毎日の平均体重増加量と死亡率は図６と図７に それぞれ示している。コントロールの幼虫は最初の２日間でほどほどの成長を示 している。第２８目の間にすべての第５齢期に脱皮する。その後、軸化の＄備の ためえさを食べるのをやめる前の更に２日間で劇的な成長をする。ｗｔ　ＡｃＭ ＮＰＶに感染した１６匹のうちのわずか１匹が脱皮し、かわりに幼虫は引き続き 感染したまま３日間成長を続ける。この段階で病気にかかりはじめたが５日目ま ではどれも死なない。

ｗｔ　ＡｃＭＮＰＶに感染した幼虫は６日目までにすべて死ぬ。対称的にｖＥＧ ＴＺに感染したすべての幼虫は第４から第５齢期へ脱皮し、この期間にえさを食 べるのをやめる。このことが１日目から２日目への成長の停止を意味している。

脱皮後再びえさを食べ始めたが３日目までに病気の徴候を示し始めた。感染後４ 日間たって死に始め５日目までにすべて死んだ。機能的ｅｇｔが欠落したＡｃＭ ＮＰＶ誘導体に感染した幼虫は野生型のＡｃＭＮＰＶに感染したものよりもえさ を食べるのが減少し、感染後より早く死ぬ。

これらの現象は第５齢期の幼虫の感染により、より顕著に表される（図８と９） 。予想どおりコントロールの幼虫は蛸化準備のためにえさを食べるのをやめる前 の２日間にかなり成長する。えさを食べなくなってから引き続き劇的な体重の減 少がある。ｗｔ　ＡｃＭＮＰＶに感染した幼虫はそのようなえさを食べなくなる 徴候をみせない。病気になり始める前の２日間にえさを食べ続は体重を増やす。

死亡は感染後７日間までは完結しない。

要約するとｖＥＧＴＺに感染した幼虫は、コントロールと同様に、感染後最初の ２日間だけえさを食べるということがわかる。この後蛸化の前に劇的な体重の減 少がみられる。しかしながら、どの幼虫も軸化せず、３日目までに病気の徴候が みられ、感染後６日ですべて死ぬ。またもｖＥＧＴＺはえさの摂食を減少させ死 に至るのを早める。

実施例Ｖ■ ｖＥＧＴＺとｗｔ　ＡｃＭＮＰＶの感染効果を新たにふ化した第１齢のＳ、ｆｒ ｕｇｉｐｅｒｄａ幼虫で比較する。新生のＳ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ幼虫に様 々な濃度のｖ　ＥＧＴＺあるいはｗｔ　ＡｃＭＮＰν多面体くポリヘトリン；　 ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）封入体を含んだえさを与え、毎日の死亡率を観察した。

２つの異なった投与に対する得られた結果を図１０および図１１に示す。双方の 投与に対してｖＥＧＴＺに感染した幼虫はｗｔウィルスに感染した幼虫よりも実 質的にかなり早い死亡率を示すことがわかる。一般に組換え型ウィルスに感染し た幼虫はｗｔ型に感染した幼虫よりも３．４日早く死亡も生物農薬としてより優 れたものであることを支持する。

実施例ＩＸ 前胸腺刺激ホルモン（ＰＴＴＩＩ）を発現する組換え型ウィルスを構築するため に、ＰＴＴＨ遺伝子がトランスブレスメン）　（ｔｒａｎｓｐ　ｌａｃｅｍｅｎ ｔ）プラスミドｐＥＶｍｏｄＸＩＶへクローン化された。このプラスミドは１９ ８９年５月１７日に出願された米国特許出願Ｎα０７／３５３．８４７に記載さ れている。これについては本願明細書に記載されている。このプラスミドはＡｃ ＭＮＰＶ多面体遺伝子の上流と下流の配列を包含しているが、この遺伝子は発現 可能なＰＴＴＨ遺伝子のＥｇｔ−ウィルスへの相同的組換えを媒介する。

マルチクローニング部位は通常の多面体翻訳開始部位に位置し、ＬＳＸＩシー改 変多面体プロモーターから下流へと向かってい転子をもつ断片はこれらの部位を 経由してトランスプレスメンドブラスミドの中へクローン化される。この結果生 じるプラスミドｐＥＶＰＴＴＨの中で、ＰＴＴＨ遺伝子はＬＳＸＩＶ改変された 多面体プロモーターからすぐに下流に位置する。

ＰＴＴＨを発現する組換え型ウィルスはｐＥＶＰＴＴＨをＳＦ細胞の内へｖＥＧ ＴＤＥＬあるいは−を八ｃｌｌＮＰνとコトランスフェクトすることによって得 られる。ウィルスＤＮＡ中で隣接する多面体配列とｐＥＶＰＴＴＩｌ中でＰＴＴ ＩＬＪ伝子に隣接転子配列との間の組換えは多面体遺伝子とＰＴＴＨとの置換と なる。この組換えが起こったウィルスは閉塞陰性型の表現型によって同定される （ＭｉｌｌｅｒらＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ７ｉｎｅｅｒｉｎｇＰｒｉｎｃｉｐｌｅ ｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｖｏｌ、８．　Ｊ。

Ｓｅｔｌｏｗ　ａｎｄ　Ａ、　ｌ１ｏｌｌａｎｄｃｒ、ｅｄｓ、　Ｐｌｅｎｕｍ 　Ｐｒｅｓｓ　Ｎ、Ｙ、、　１９８６゜ｐｐ、２７７−２９８）　。それぞれの 組換え型ウィルスはｖＥＧＴ−ＰＴＴ）ＩとｖＷＴＰＴＴ）Ｉと命名された。

幼若ホルモンエステラーゼを発現する組換え型ウィルスを幼若ホルモンエステラ ーゼ遺伝子（）ｌａｎｚｌｉｋら（１９８９）　Ｊ、　Ｂｉで切り出される。ト ランスプレスメンドブラスミドｐＥＶｍｏｄＸＩＶもまたＥｃｏＲＩとＫｐｎｌ によって切り出され、断片を含む幼若ホルモンエステラーゼ遺伝子はこの部位に 挿入される。ｐＥＶＪＨＥはこのよ・うに幼若ホルモンエステラーゼ遺伝子に隣 接する多面体遺伝子配列を含む。ｖＥＧＴ−Ｊｌ（ＥとｖＷＴＪＨＥとの組換え 型ウィルスはｐＥＶＪＨＥとｖＥＧＴＺあるいはｗｔ　ＡｃＭＮＰν［］ＮＡと をそれぞれコトランスフエクトし、閉塞陰性型プラークをスクリーニングするこ とによって得られる。

羽化ホルモンを発現する組換え型ウィルスを構築するため、含有断片のトランス プレスメンドブラスミドへの挿入は組換えρＥＶＥＨを産出するが、そのｐＥＶ Ｅ）ｉの中で羽化ホルモン遺伝子はＬＳＸＩＶ改変多面体プロモーターから下流 へと位置づけられる。このプラスミドのｖＥＧＴＺあるいはｖＤＡ２６Ｚ　ＤＮ Ａとのコトランスフエクトにより組換えウィルスジＥＧＴ−ＥｌｆおよびｖＤＡ ２６ＺＥｌ（それぞれの単離が可能となる。ｖ［１Ａ２６ＺはＤＡ２６遺伝子に 挿入ら、、　Ｊ、　Ｇｅｎνｉｒｏ］、　Ｉｎ　Ｐｒｅｓｓ）。ＤＡ２６遺伝子 の作用はわかつ遺伝子の存在のため、ｖＤＡ２６Ｚ誘導体はＸ−ｇａ　！存在し た青いプラークを引き起こす。

実施例Ｘ 生体内でのこれらの組換え型ウィルスの効果を評価するだの早期に２　Ｘ　１０ ５ｐｆｕのｖＥＧＴＤＥＬあるいはｖＥＧＴ−ＰＴＴｔｌあるいはｖＷＴＰＴＴ ＨあるいはそれぞれＩ　Ｘ　１０’ｐｆｕのｖＥＧＴ−ＰＴＴＨとｖＥＧＴ−Ｊ ＨＥを合わせたもので感染させる。毎日の死亡率の割合（％）を表５に示す。全 ＥＧＴ−ウィルスに関し、感染した昆虫は第４齢期を通過し、そして頭がいのず れを示す。これは３日目までに脱皮がまさに起ころうとしているのを示すもので ある。ｖＥＧＴ−ＰＴＴＨ単独の感染あるいはｖＥＧＴ−ＰＴ刊とｖＥＧＴ−Ｊ ｔｌＥ両方による感染後、ＰＴＴＨの発現は感染した昆虫を早く病気にさせ、４ 日目までに高い死亡率がみられる。対称的にｖＥＧＴＤＥＬに感染した昆虫は５ 日目までに高い死亡率を示さない。予想どおり、ｖＷＴＰＴＴＨに感染した昆虫 は脱皮して第５齢期に入る徴候を示さない。頭がいのずれは観察されず、６日目 まで高い死亡率を示さない。ＥＧＴの非存在下ＰＴＴ）ｌの発現はｖＥＧＴＤＥ Ｌと比べて１日で感染を引き起こり、この様に死の時期を早める。これらのデー タは昆虫の脱皮に影響する遺伝子を発現することによってバキュロウィルスの農 薬の特徴を改善することを実証なければならないことを示している。

表５ 死亡率（％） ウィルス　３日目　４日目　５日目　６日目　７日目　８８目ｖＥＧＴＤＥＬ　 ４．５　４．５　６８．２　９０．９　９０．９　９５．５ｖＷＴＰＴＴＨＯＯ １３，０３９，１７８，３９５，７ｖＥＧＴ−ＰＴＴ）！　４，２　６２．５　 ８７．５　１００．０ｖＥＧＴ−ＰＴＴ）Ｉと　８．７　６０．９　９１．３　 ９５．７　１００，０ｖＥＧＴ−ＨＥ 昆虫の発育に影響する異種のタンパクを発現する閉塞陽性型ウィルスの生産は以 下の方法で行われ得る。最初に、β−ガラクトシダーゼを発現するＥＧＴ−閉塞 陰性型ウィルスが次の一ン化される。このｐＳｙｎＶドは１９８９年５月１７日 に出願された米国特許出願Ｎ（１０７／３５３．８４７に記述されている。ｐＳ ｙｎＶヒはＡｃＭＮＰＶ多面体遺伝子から上流と下流の配列を含み、マルチクロ ーニング部位は合成改変多面体プロモーターからすぐ下流にＰｓｔｌの張り出し 末端はムングビーン（ｍｕｎｇｂｅａｎ）ヌクレア位中にクローン化される。そ の結果生じるプラスミドはｐＳｙｎＶｌ”ｇａｌと呼ばれ、合成改変多面体プロ モーターのすぐ下流にＤＮＡとコトランスフェクトされ、β−ガラクトシダーゼ を発現する閉塞陰性型のプラークは単離され、ウィルスｖＥＧＴ−３ｙｎＶｌ− ｇａｌを与える。

ＰＴＴ）Ｉを発現する閉塞陰性型の組換えウィルスを構築するため、ＰＴＴＨ遺 伝子はトランスブルスメントベクターｐＳｐＸ　Ｉ　ＶＶ　Ｉ＋Ｘ３中にクロー ン化される。

ｐｓｐＸＩＶＶＩ＋Ｘ３を構築するために、中間体のプラスミドｐＳｐＸＩＶＶ Ｉ＋カ最初ニ構築される。ｐＳｐＬＳＸ　Ｉ　ＶＶｂｃＡＴ　（１９８９年５月 １７日出願の米国特許出願ＮＧＯ７／３５３．８４７に記載）はＢｇＩＩＩで切 断され両端はＤＮＡポリメラーゼで埋められる。プラスミドｐＳｙｎνｌ−ｗｔ ｐ（１９８９年５月１７日出願の米国特許出願Ｎα０７／３５３．８４７に記載 ）はＥｃｏＲνと５ａｃｌで切断されＥｃｏＲＶ−Ｓａｃｌの小断片は精製され る。２つのプラスミドの断片が連結されＰＳｐＸＩＶＶＩ＋が選択される。Ｂｇ ｌ　１１部位から５ａｃｌ部位までのマルチクローニング部位が、ｐｓｙｎＶｌ ＋ｗｔρと同じであることを除いてはｐＳｐＸＩＶＶ＋＋プラスミド′はｐＳＰ ＬＳＸ　Ｉ　ＶＶ　ｌ　＋ＣＡＴと同じである。マルチクローニング部位１３　 （１９８９年５月１７日出願の米国特許出願Ｎα０７／３５３．８４７に記載） を構築するためにポリリンカー＜ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ）がＰＳＰＸＩνＶドの ＥｃｏＲｌ−３ａｃｌ部位に挿入される。融合しクローニング部位は次のとおり である。

ＡＧＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴ［：ＴＣＧＡＧ　ＣＴＧ［：ＡＧＡＴ［：Ｔ　ＧＴ ＣＧＡＣＣＣＧＧＧ　ＡＡＴＡＡＡＧＡＧＣＣ ＥｃｏＲＶ／Ｂｇｌ　ＥｃｏＲｌ−Ｘｈｏｌ　Ｐｓｔｌ−ＢｇＩＩ　Ｓａｌｌ− ３ｍａｌ　ｐｏｌｙＡ　５ａｃｌ−−−――−−−−照−――−一一　―闇−■ 　−−■−−−−―――−―−一一−−轡ｌ―−このプラスミドは野生型の多面 体プロモーターの制御のもと完全な多面体遺伝子を含有する合成による改変され た多面体プロモーターは多面体遺伝子の上流でかつ反対方向に位置する。マルチ クローニング部位はこの合成による改変された多面体プロモーターの制御のもと 遺伝子の挿入の発現を許容すべく位置している。ＰＴＴＩＩ遺伝子はプラスミド ｐＢｃ２２に−Ｃ１９（−ン化し、プラスミドｐＳｐＰＴＴ）Ｉを産出した。こ のプラスミド内でＰＴＴＩｌ遺伝子はこの合成により改変された多面体プロモー ターから下流にあり、野生型多面体プロモーターとコード配列の隣に位置し、か つ反対の方向を向いている。ＰＴＴＨも多面体遺伝子もＡｃＭＮＰＶ内で多面体 遺伝子の上流と下流の配列に対して隣接している。

ｐｓｐＰＴＴｌｌはＳＦ細胞の中にｖＥＧＴ−３ｙｎＶＩ−ｇａｌ　ＤＮＡとコ トランスフェクトしている。ウィルスＤＮＡにおける多面体の上流と下流の配列 およびｐＳｐＰＴＴ）ｌにおけるＰＴＴ）Ｉと多面体遺伝子に隣接する配列との 組換えはｖＥＧＴ−ｓｙｎＶヒｇａｌの！ａｃＺ遺伝子をｐＳｐＰＴＴ）Ｉ由来 の多面体遺伝子と置換することになる。組換え型ウィルスｖＥＧ’ｌ”５ｐＰＴ ＴＨは閉塞陽性型でβ−ガラクトシダーゼ陰性の表現型によって同定される。

幼若ホルモンエステラーゼを発現する閉塞陽性型ウィルスを構築するために、幼 若ホルモンエステラーゼ遺伝子がプラスミドｐＪ）ＩＥ１６Ｂ　（ｔｌａｍｍｏ ｃｋら（１９９０）同上）から、Ｋｐｎ　Ｉで分解し、張り出し末端をＴ４　Ｄ ＮＡポリメラーゼで除去し更にＥｃｏＲｌで分解することによって切除される。

その後幼若ホルモンエステラーゼ遺伝子を、ＥｃｏＲｌと５ａｒｎＩですでに開 裂したプラスミドｐｓｐＸＩＶＶＩ”Ｘ３にクローン化する。その結果生じたプ ラスミドｐＳｐＪＨＥをｖＥＧＴ−ｓｙｎνＪ−ｇａｌ　ＤＮＡとコトランスフ エクトして組換え型ウィルスｖＥＧＴ−ＳｐＪＨＥを産出する。この閉塞陽性型 ウィルスは合成によって改変された多面体プロモーターの制御のもと幼若ホルモ ンエステラーゼを発現する。

同様に羽化ホルモンをプラスミドｐＦ５−３　（Ｈｏｒｏｄｙｓｋ　ｉら（１９ ９０）それによって得られたプラスミドｐＳｐＥＨをｖＢＧＴ−ＳｙｎＶＩ−ｇ ａｌＤＮＡとコトランスフェクトして組換えウィルスｖＥＧ’ｌ”５ｐＥＨを産 出する。

脱皮に影響するタンパク　（昆虫ペプチドホルモンあるいは昆虫ホルモンを不活 性化する酵素）を発現するように更に遺伝的に改変された閉塞陽性型のＥＧＴ− ウィルスは、ｗｔバキュロウィルス、あるいはｅｇｔ遺伝子だけを不活性化する ために変えられたバキュロウィルスよりも、感染した昆虫がえさを食べるのを減 少させ、より早く死に到らしめる。

実施例ＸＩの昆虫制御物質は閉塞しているので、これらのウィルスを、感染した 作物に適用可能で、殺虫剤として効果的で、農業的に受容され得る組成物に取り 込むことができる。

このような閉塞ウィルス粒子の摂取はそれらウィルスの農場での繁殖と昆虫制御 物質の蔓延につながる。感染は昆虫を死に至らしめ、それ故害虫からの作物の保 護となる。

以上の事項は単に本発明の好ましい特定の実施態様にのみ関連するということ、 そして多くの改変や変更が添付されたクレーム中に述べられている発明の精神と 範囲から離れることなくなされるということは理解されねばならない。

′Ｓｔ〜覧り晴間（Ｅ） ＦＩＧ、６ ：を刈す晴間（す ＦＩＧ、　７ 珈）Ｘｌ支っ晴間（す ＦＩＧ、　８ シ生人ｔ、Ｌつりへ町（す ＦＩＧ、　９ う抵入？Ｎつｅ’ｌ＋ＰＩＩ（９） ＦＩＧ、　１０ ２．４　ｘ　１０　ＰＩＢｓ／ｍｌ ′、を入３χ乃時聞（ワ） ＦＩＧ、１１ 国際調査報告 ｌｌｌ１．１％＃ｈ、１ムＭ１　つ１や鉢灯ハＪＳ　９０１０３７絽国際調査報 告 ＰＣｒＡＪＳ　９０１０３７５８ ＳＡ　３８７１８ １にｌ噂―軸Ｐ＆Ｉｎ

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. １．エクダイステロイド改変酵素をコードし、天然に存在する、遺伝子が不活性 化される、昆虫寄生生物を包含する昆虫制御物質。
2. ２．前記直伝子がｅｇｔ遺伝子である請求項１に記載の昆虫制御物質。
3. ３．前記昆虫寄生生物が昆虫ウィルスである請求項２に記載の昆虫制御物質。
4. ４．前記昆虫ウィルスがバキュロウィルスである請求項３に記載の昆虫制御物質 。
5. ５．前記バキュロウィルスが核多角体病ウィルスである請求項４に記載の昆虫制 御物質。
6. ６．前記の核多角体病ウィルスがＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ 核多角体病ウィルスおよびＯｒｇｙｉａｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ核多角体病 ウィルスでなる群から選択される、請求項５に記載の昆虫制御物質。
7. ７．前記エクダイステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼをコードす る不活性化された遺伝子を有する昆虫ウィルスがｖＥＧＴＺおよびｖＥＧＴＤＥ Ｌのうちのひとつである、請求項６に記載の昆虫制御物質。
8. ８．前記昆虫ウィルスが少なくとも１種の異種遺伝子の挿入によって、さらに改 変された請求項３に記載の昆虫制御物質であって、前記異種遺伝子が前記ウィル スに感染した昆虫細胞で発現可能であり、そして、前記遺伝子が脱皮に影響する タンパクをコードする、昆虫制御物質。
9. ９．前記異種遺伝子が、前胸腺刺激ホルモン、羽化ホルモン、および幼若ホルモ ンエステラーゼでなるタンパクをコードする遺伝子の群から選択される、請求項 ８に記載の昆虫制御物質。
10. １０．前記異種遺伝子が前胸腺刺激ホルモンである、請求項９に記載の昆虫制御 物質。
11. １１．ｖＥＧＴ−ＳｐＰＴＴＨである請求項１０に記載の昆虫制御物質。
12. １２．前記異種遺伝子が羽化ホルモンである請求項９に記載の昆虫制御物質。
13. １３．ｖＥＧＴ−ＳｐＥＨである請求項１２に記載の昆虫制御物質。
14. １４．前記異種遺伝子が幼若ホルモンエステラーゼである請求項９に記載の昆虫 制御物質。
15. １５．ｖＥＧＴ−ＳｐＪＨＥである請求項１４に記載の昆虫制御物質。
16. １６．次の（ａ）および（ｂ）の工程を包含する改良された昆虫制御物質を製造 する方： （ａ）脱皮に影響するタンパクをコードする遺伝子を単離すること；および （ｂ）前記遺伝子を本来発現しない生物中に前記遺伝子を挿入すること。
17. １７．前記遺伝子が、エクダイステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラー ゼ、前胸腺刺激ホルモン、羽化ホルモン、および幼若ホルモンエステラーゼでな る脱皮に影響するタンパクの群から選択されるタンパクをコードする、請求項１ ６に記載の方法。
18. １８．前記生物がｅｇｔ遺伝子を発現しない昆虫ウィルスである請求項１７に記 載の方法。
19. １９．前記遺伝子がバキュロウィルス由来である請求項１８に記載の方法。
20. ２０．前記バキュロウィルスが核多角体病ウィルスである請求項１９に記載の方 法。
21. ２１．前記核多角体病ウィルスが、ＡｕｔｏｇｒａｐｙａＣａｌｉｆｏｒｎｉｃ ａ核多角体病ウィルスおよびＯｒｇｙｉａｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ核多角体 病ウィルスでなる核多角体病ウィルスの群から選択される、請求項２０に記載の 方法。
22. ２２．前記生物が、昆虫寄生生物、非植物病原性、植物集落化細菌、昆虫病原性 細菌、昆虫病原性真菌、および植物でなる群から選択される、請求項１６に記載 の方法。
23. ２３．生物中のエクダイステロイド改変酵素をコードする遺伝子を不活性化する 工程を包含する、改良された昆虫制御物質を生産する方法であって、該遺伝子が 該生物の本来のゲノムの一部である方法。
24. ２４．前記遺伝子がエクダイステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ をコードする請求項２３に記載の方法。
25. ２５．前記生物か昆虫ウィルスである請求項２４に記載の方法。
26. ２６．前記昆虫ウィルスがバキュロウィルスである請求項２５に記載の方法。
27. ２７．前記バキユロウイルスが核多角体病ウィルスである請求項２６に記載の方 法。
28. ２８．エクダイステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼをコードする 遺伝子を不活性化する欠失をもったＡｕｔｏｇｒａｐｈａＣａｌｉｆｏｒｎｉｃ ａ核多角体病ウィルス誘導体が、昆虫細胞中の該ウィルスの連続する移動の後に 単離される請求項２３に記載の方法。
29. ２９．前記核多角体病ウィルスが、ＡｕｔｏｇｒａｐｈａＣａ１ｉｆｏｒｎｉｃ ａ核多角体病ウィルスおよびＯｒｙｉａｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ核多角体病 ウィルスでなる核多角体病ウィルスの群から選択される、請求項２７に記載の方 法。
30. ３０．前記核多角体病ウィルスがｖＥＧＴＺおよびｖＥＧＴＤＥＬのうちのひと つである請求項２９に記載の方法。
31. ３１．昆虫細胞内で発現しうる異種遺伝子の挿入により、前記生物を遺伝子的に 変換する工程をさらに包含する請求項２３に記載の方法であって、該遺伝子が脱 皮に影響するタンパクをコードする、方法。
32. ３２．前記第２の遺伝子か、前胸腺刺激ホルモンをコードする遺伝子、羽化ホル モンをコードする遺伝子、および幼若ホルモンエステラーゼをコードする遺伝子 でなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
33. ３３．前記昆虫を昆虫制御物質にさらす工程を包含する昆虫を制御する方法であ って、該昆虫制御物質がエクダイステロイド改変酸素をコードする遺伝子を発現 するように遺伝子操作されており、該酵素が該昆虫に有害に作用する、方法。
34. ３４．エクダイステロイド改変酵素をコードする遺伝子を含む昆虫制御物質に昆 虫をさらす工程を包含する昆虫制御のための方法であって、該遺伝子が不活性化 されている、方法。
35. ３５．前記遺伝子がエクダイステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ をコードする請求項３４に記載の方法。
36. ３６．前記昆虫制御物質が昆虫ウィルスである請求項３５に記載の方法。
37. ３７．前記昆虫ウィルスがバキュロウィルスである請求項３６に記載の方法。
38. ３８．前記バキュロウィルスが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ 核多角体病ウィルスおよびＯｒｇｙｉａｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ核多角体病 ウィルスでなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
39. ３９．前記遺伝子が、前記ウィルスに感染した昆虫細胞中で発現しうる異種遺伝 子の挿入により不活性化された、請求項３８に記載の方法であって、異種遺伝子 が脱皮に影響するタンパクをコードする、方法。
40. ４０．前記の第２の遺伝子が、前胸腺刺激ホルモンをコードする遺伝子、羽化ホ ルモンをコードする遺伝子、および幼若ホルモンエステラーゼをコードする遺伝 子でなる群から選択される、請求項３９の方法であって、該遺伝子が前記ウィル スに感染した昆虫細胞中で発現し得る、方法。
41. ４１．昆虫制御物質と農業に適した担体とを含有する殺虫組成物であって、該昆 虫制御物質がエクダステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼをコード し天然に存在する遺伝子を不活性化するように遺伝子的に改変された、組成物。
42. ４２．脱皮に影響するタンパクをコードする異種遺伝子を発現するように遺伝子 的にさらに改変された昆虫制御物質を含む、請求項４１に記載の殺虫組成物。
43. ４３．前記昆虫制御物質が昆虫ウィルスである請求項４１または４２に記載の昆 虫制御剤。
44. ４４．前記昆虫ウィルスがバキュロウィルスである請求項４３に記載の昆虫制御 剤。
45. ４５．前記バキュロウィルスが核多角病体ウィルスである請求項４４の昆虫制御 剤。
46. ４６．前記核多角ウィルスがＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多 角体病ウィルスおよびＯｒｇｙｉａｐｓｅｕｄｏｔｓｙｇａｔａでなる群から選 択される、請求項４５に記載の核多角体病因子。
47. ４７．エクダイステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼをコードする 遺伝子のヌクレオチド配列を有する組換えＤＮＡ分子。
48. ４８．前記配列が表１の約１４９番目のヌクレオチドから約１６７０番目のヌク レオチドまでの配列、あるいはその機能的等価物である、請求項４７に記載の組 換えＤＮＡ分子。
49. ４９．請求項２５に記載の方法で調製される昆虫ウィルス。
50. ５０．次のａ）〜ｆ）までの工程を包含する、ｖＥＧＴＺを調製する方法： ａ）制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＸｂａＩとでｐＵＣＢＣＰｓＢを分解 し、それによって生じる大きな断片を精製すること；ｂ）制限エンドヌクレアー ゼＥｃｏＲＩとＡｈａＩＩＩとでｐＳＫＳ１０４からｌａｃＺ遺伝子を切り出す こと； ｃ）Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでＸｂａＩ末端を平滑化した後に、該ｌａｃＺ遺伝 子をｐＵＣＢＣＰｓＢのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩの大きい方の断片と連結し、ｐＥ ＧＴＺを形成すること； ｄ）ｐＥＧＴＺとＡｃＭＮＰＶとをＳＦ細胞中ヘコトランスフェクトすること； ｅ）β−ガラクトシダーゼの発現により組換体を同定すること； ｆ）該組換体ウィルスｖＥＧＴＺを精製すること。
51. ５１．次のａ）からｆ）の工程を包含する、ｖＥＧＴＤＥＬの調製方法： ａ）制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＸｂａＩとでｐＵＣＢＣＰｓＢを分解 し、その結果生じる大きな断片を精製すること；ｂ）工程（ａ）の大きなＤＮＡ 断片の両端を平滑化すること；ｃ）工程（ｂ）の大きなＤＮＡ断片を連結するこ と；ｄ）ＳＦ細胞中にｐＥＧＴＺとｖＥＧＴＺとをコトランスフェクトし、相同 組換えを行うこと； ｅ）β−ガラクトシダーゼを発現しないことにより組換えｖＥＧＴＤＥＬを同定 すること； ｆ）該組換えｖＥＧＴＤＥＬを精製すること。
52. ５２．表１のアミノ酸配列を有する組換型エクダイステロイドＵＤＰ−グルコシ ルトランスフェラーゼ、あるいはそれと少なくとも７０％の相同性をもつアミノ 酸配列を有するエクダイステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ。
53. ５３．表１のアミノ酸配列を有するかあるいはそれと少なくとも７０％の相同性 をもつアミノ酸配列を有する、実質的に純粋なエクダイステロイドＵＤＰ−グル コシルトランスフェラーゼ。
54. ５４．請求項５３に記載のエクダイステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェ ラーゼに特異的なモノクローナルあるいはポリクローナル抗体。