PT94557B - Agentes biologicos melhorados para o controlo de insectos e metodos de producao e utilizacao - Google Patents

Description

Este invento foi real izado com fundeis do National Institutes of Health (Subsídio NS SE00£91S>.0 governo dos Estados Unidos poderá ter direitos sobre este invento.

Campo Técnico presente invento está relacionado com de métodos e pragas de composiçSes para um melhor controle biológica insectos. Mais partioularmente, o presente invento está relacionada com a utilização e manipulação de um gene de baculovírus e seu produto genético o qual é eficaz no controle do crescimento e desenvolvimento de insectos. □ presente invento também está relacionado com baculovírus genéticamente modificados e outros agentes de controle de insectos que afectem adversamente as pragas de insectos infectadas.

Fundamento do Invento

V) interesse no controle biológico das pragas de insectos surgiu como resultado das desvantagens dos pesticidas químicos convencionais. Os pesticidas químicos geralmente afectam indiscriminadaments espécies prejudiciais e não prejudiciais. As pragas de insectos tendem a adquirir resistência, a tais produtos químicos de modo que rapidamente se podem desenvolver novas populações de insectos resistentes a estes pesticidas. Ainda, os í ~c-.--~iu.ι;:> \.jUxhiiuOa cuiULcim ptírxguS par a u ambiente — problemas com a saúde. 0 controle bioló-qico aprsenta alternativo para o controle de pragas que pode reduzir dên cia dos pes t í c i d as q u í m í c os.

um meio depenV

Az estratégias principais de controle biológico incluem envolvimento de organismos naturais que sejam patogénieos para os insectos (entomopatoqénios) e cultivares mais resistentes às pragas de o desenvolciviroento de insectos. As abordagens incluem a identificação e caracterização de genes de insectos ou. produtos de genes que possam servir de alvos adequadas para os agentes de controle de insectos, a identificação e exploração de microorganismos anteriormente não usados ( incluindo a modificação de microorganismos naturais não patogénieos pa.ra. os tornar patogénieos para os insectos), a modificação e e refinamento de entcmopatogénicís correntemente usados e o desenvolvimento de cultivares alterados por engenharia genética que apresentem maior resistência às pragas de insectos.

Os vírus que dentro das populações de insectos estão entre os entomopatoçénios bacu. 1 o— víru.s são um qrupo grande de vírus que infectam apenas artrópodes 'Mil ler, b.K. (1931) em Senetic Engineering in Plant Sciences, N.

Praeger Pu.bl . , New York, pp. 203-224; tarstens, (1930) Trends in Biological Science 52:107-110; Harrap e Payne (1979) em ftdvarices in Virus Research. Vol. 25, Lawfer et al., (eds), Academic Press, New York, pp„273-355). Muitos baculovírus infectam infectam insectos que são praqas para cultivares agrícolas e florestais que são comercialmente importantes. Tais baculovírus são potencia1 mente importantes como apentes de controle biológico. Quatro baculovírus diferentes foram registados para usar como insecticidas pela U.S. Environmental Protection Agsncy. Entre as var b i o 1 ó g i c o s está a s u a e s q< ε baculovírus como um grupo estirpes individuais de baculovírus geralmente infactam apenai provocam doenças epizoóticas naturais que têm sido desenvolvidos como pesticidas biológicos. Os saculo

Panopoulos, (ed.), r ·>-

	lovírus como	pestí	L 1 d 3 3
pS.r* ci	o b o s p e d e i r o.	Não	3 ó O 3
enas	artrópodes, c	□mo t	ambém

um numero r eduz i d o de insectos. Assii ser

nãu i_ Ο1ί— 5. m rÍ5LUi para O homem OU para O ambiente e podix-m usados sem afectarem adversamente as espécies de insectos prejudiciais.

não

Qs subgrupos de baculovírus incluem vírus da poliedrese nuclear (NF'7), vírus da granulose <GV) s baculovírus não oc lusos. Nas formas eclusas de baculovírus, os viriSes (nuc1eocépsides com invólucro) estão embebidos numa matriz proteica cristalina. Esta estructura, referida como um corpo de inclusão ou oclusão, é a forma encontrada fora do organismo na natureza e é responsável pelo alastramento da infecçâo entre os organismos. A propriedade característica dos vírus NPV é que muitos viriSes estão embebidos num corpo de oclusão. Os corpos de oclusão de NPV são mente grandes (até 5 micras). Os corpos de oclusão dos são mais pequenos e cada um contem apenas um virião. A matriz proteica cristalina dos corpos de oclusão de ambas as formas é composta principalmente por um único polipeptídeo de 25000 a 230O0 dal tons que é conhecido como poliedrina ou granulina. Os baculovírus do subgrupo não oclu.so não produzem uma proteína poliedrina ou granulina e não formam corpos de oclusão.

relativavírus GV

Ma natureza, a infecçâo é iniciada quando um insecto ingere alimentos contaminados com partículas de baculovírus, tipicamente na forma, de corpos de oclusão. Os corpos de oclusão ^;nsecto, libertando partículas de vírus ind que depoi invadem as células irraiii o intc tino.

uma célula hospedeira, o baculovírus migra, para o núcleo onde se dá a replieação. IniciaImente, são produzidas certas proteínas virais específicas dentro da célula infectada pela transcrição e ra-du-_Jrau uos chamados {(genes precoces® « t.ntre outras funçSes, estas proteínas são necessárias à replicarão do DNA virai, a qual começa 4 a 6 horas após a entrada do vírus na célula. A )

replicação de DNA virai extensiva prossegue até csrca de pós·—infecçãc- (pi). Entre as 8 s í€* horas pi, a célula infectada produz grandes quantidades de «produtos de genes virais tardios?!. Estes incluem componentes da nuc1eccápside que rodeia o DNA virai du r an te a for mação partículas virais das partículas virais filhas. A produção de filhas começa por volta das 12 horas pi.

Inicialmente o vírus da progénie migra para a membrana celular onde adquire um invólucro à medida que se dá a gemulação através da superfície celular. Este vírus não ocluso pode então infectar outras células do insecto. A síntese de poliedrina começa entre as 12 e as 13 horas após infecção e aumenta até níveis muito elevados pelas 24 horas pi. Naquela altura existe um decréscimo no número de partículas em gemulação e a progénie virai é então embebida nos corpos de oclusão. A formação dos corpos de oclusão continua até a célula morrer ou lisar. Alguns baculcvírus infectam virtualmente qualquer tecido no insecto hospedeiro de tal forma que no fim do processa de infecção todo o insecto está liquefeito, libertando números extremamente grandes de corpos de oclusão que podem então espalhar a infecção a outros insectos. (Revisto em The 5io1oqy of Bacu1oviruses, Vol.I e II, Granados e Federici (eds), CRC Press, Boca Raton, Florida, 19Q&.)

Uma desvantagem significativa da utilização de báculovírus como pesticidas é o período que medeia entre a ingestão do vírus e amorte do insecto. Durante este empo a. praga de insectos continua a. alifltentar-se e a destruir as colheitas. Uma vez que o agricultor provavelmente aplicará o pesticida. apenas após a infestação ser aparente, é crítico que o tempo de alimentação s e j a mini m i z a d c<.

um pesticida que reduz.

il imentação do insecto antes da morte deste, é preferido um pesticida uio icgico por:

:ria menos problemas para o ambienta do que um )

pesticida química,

osmbém desejáveluma morte mais rápida do insecto. A procura de um ou mais genes que proteínas que controlem o desenvolvimento codifiquem uma ou mais ? a sua de insectos incorporação em vários organismos permitirá melhorar o biológico das pragas de insectos.

controle

Su.mário do Invento

No presente invento são identificados um baculovírus e o seu produto que afectem o crescimento,

V-í.ffien Lo ou comportamento dos insectos. 0 presente invento proporciona métodos para a utilização deste gene e do seu produto, assim como métodos para a inactivação deste gene ou do seu produto em estratégias de controle de insectos. Numa realização preferida, o gene aqt codifica UDP—g1ucosi1transferase de ecdisteróides (EGT) do AcilNPV. A expressão do gene eqt de baculovírus provoca a produção de EGT que inactiva as hormonas de eclosão, evitando assim que as larvas de insecto saiam ou entrem na fase gene de desenvolde pupa. A inactivação do gene eqt de baculovírus permite prosseguimento das fases de eclosão e de pu.pa das larvas infecta presente invento engloba uma larga gama de agentes de on que utilizam os genes eqt , Os agentes de controle de insectos do iam a síntese inadequada da proteína EGT e os seus presen te funcionamento normal ou expressão da proteína EGT m produinvento in.sec to pi· e j udic is Ide modo normal do insecto.

que seja irroispidt d esen vo 3. v i men to

LtfTí

De preferencia, o organismo contendo o gene egt é vírus específico do insecto prejudicial e em qus o gane eqt do vírus foi inactivado,, permitindo assim o desenvolvimento continuado do insecto hospedeiro infectado coa o vírus. 0 desenvolvimento do insecto hospedeiro induz alterações do comportamento como sejam uma redução da ingestão de alimentos e guando infectado pelo pesticida virai observa—se um crescimento reduzido 5 uma morte mais rápida. 0 presente invento também inclui um método para a produção de pesticidas virais melhorados. Em adição, o presente invento inclui um método' para o controle de pragas tíe insectos caracterizado pela exposição da praga de insectos ao pesticida virai melhorado.

Os vírus genéticamente alterados englobados pelo presente invento são pesticidas mais eficazes do gue os vírus até agora, usados. Os baculovírus, tais como o vírus da nuclear de Autoqrapfiica cal ifornica (AcMNPV) e o poliedrose nuclear de Qrqyia pseudotsugata (QpMNPV), naturalmente um gene eqt cuja ρο1i ed rose vírus da expressam expressão prolonga o período de tempo que uma larva infectada dispende a alimentar-se antes de sucumbir à infecção virai. 0 presente invento inclui inactivação do gene eqt no genoma de vírus tais como baculovírus mas não lhes estando limitados. 0 gene eqt pode ser inactivado por substituição ou inserção de um outro gene nele como seja um gene marcador não virai da íl-ga 1 aotosidase. Deverá entender-se que qualquer sequência de DNA poderá ser usada para gue destrua a expressão da sequência alternativa, todo o gene eqt ou parte dele pode ser removido do genoma por eliminação de um segmento de DMA codificador adequado ou alteração ou remoção da parte reguladora do genoma que controla a expressão do gene eqt. Os baculovírus com deleçSes que inactivam o gene eqt podem também ser produzidas por passagem seriada do vírus em culturas de cálulasds insecto. Os vírus oe soe;

destruir o gene egt codificadora de eqt, )

DNA de resu1ten tes corn ;3es têm

vantagem de não possuírem estranhe e diferirem dos vírus selvagens apenas pela ausência um gene eqt funcional. Tais baculovírus modificados funcionam melhor como agentes de controle de pragas do que os vírus presentemente usados» Como -simples mutantes de deleção, eles deverão também ser- aceites pelas agências reguladoras (e.g., U.S. EF'A) como pesticidas obtidos por engenharia genética pois não contêm DNA heterólogo. Os baculovírus que não expressam um gene eqt funcional podem ser modificados por inserção de outros genes além do eqt os quais interferem com o desenvolvimento de insectos, aumentando assim a eficácia de tais vírus como agentes de controle de insectos.

presente invento também inclui um método de controle de pragas de insectos através da infecção das larvas de insectos com um vírus mutante sem um gene eqt intacto ou. incapaz de expressar um produto EGT funcional. As larvas infectadas com

-írus mutante tendem a entrar ^:ase de mudas e de pupa, consequert temen te alimentam-se durante um período de tempo mais cu.rto do que as larvas infectadas com o tipo selvagem ou outros vírus antes usados. As larvas de insectos infectadas com o vírus mutante também morrem mais cedo do que as infectadas com o vírus selvagem ou com outros vírus anteriormente u.sados.

έ um o pr ιπνεπιο prOjjor cionci?

U.Ti vírus recombinante que seja um pesticida mais eficaz da que o v.i.rus tipo selvagem ou outros vírus ate agora usados» 0 presente invento é exemplificado pele AcMNPV recombinante designada vEGTZ, naqual foi eliminada uma uma fracção do gene sqt e substituída por gene bacteriano codificador da β—qalactosidase.

Qual ssquència o gene po;

substi tu .ida por alguém fami1iarizado com esta área. □ presente eempl ι ΐ i c a d o □ p-e 1 o hs rui rsv recombinante )

designado vEGTDEL, no qual foi elminada uma fracção do gene eqt. Também estão incluídos baculovírus em que uma mutação natural, incluindo uma deleção, resultou na inactivação do gene eqt

Assim, constitui um objectivo do presente invento proporcionar um gene eqt e o seu produto que são úteis na controle de pragas de insectos. Também estão dentro do âmbito deste inventa UDP-glucosiItansferase de ecdisteróides substancialmente purificada, e anticorpo específico dela. Os genes eqt podem ser identifiçados por homologia da sequência com a sequência de nucleotídeos do gene eqt na Tabela 1 ou após determinação da actividade da enzima EGT e subsequente análise do DNA. Qualquer sequência de DNA codificadora de UDP-glucosi1transfí de ecdisteróides é um gene eqt como aqui. é definido. Uma proteína eqt pode ser purificada usando técnicas convencionais e o processo de ensaia descrito no Exemplo 4. Uma preparação de proteína eqt substancialmente pura é uma que compreenda. pelo menos 707. (ρ/ρ) de UDP-glucosi1trsnsferase de ecdisteróides. Uma proteína eqt recombinante é uma que tenha sido feita em qualquer organismo diferente daquele em que o gene da referida proteína ocorre nsturalmente. A proteína recombinante é expressa como resultado de tecnologia de engenharia genética ou de DNA recombinante.

Constitui um outro objectivo do presente invento proporcionar um vírus alterado por engenharia genéticaque seja um pesticida eficaz e também aceitável para o ambiente.

έ -ainda um c i o n ar u. m p e s t i c. i d a funcional e expressa vi men to d os insect os p Γ3Ξ-£ Π u £? Π ΰ Ο Ϊ”g ciΓi ã. Ξ-in ρ r odu. t o quo f ec t e- e.

outro objectivo do presente inventa proporrecombinante não possuidor ds um qen.e eqt um segundo gene qua interfira com odesenvoleste segundo gene não estando naturalmente . tste segundo gene é um que codifique um eclosão. Tal produto pode ser uma hormona de )

ι uma insecto que afecte? o desenvolvimento dos insectos ou que ve uma. hormona de insecto qu.a.l regula a hormon;

')

Exemplos específicos incluem hormona protoracicotrópica da. eclosão e estearase da. hormona juvenil. Quando se incorporar genes codificadores destas proteínas num vírus de insecto para produzir um agente de controle insectos, o vírus deve ser um que não contenha um gene eqt ou um em que um gene egt tenha sido inactivarfo.

pretende ± ainda um outro objectivo do presente invento proporcionar um organismo modificada genéticamente para usar como um agente de controle de insectos que expresse um gene eqt genéticamente inserido onde nenhum gene eqt era natura1mente expresso. Tais organismos modificados genéticamente expressando EGT afectarão adversamente as pragas de insectos resultando em menores estragos para, as plantas.

ainda um objectivo deste invento proporcionar compo^- siçSes insecticidas adequadas para aplicação em agricultura. Tais composiçSes compreendem um veículo adequada para a agricultura tal coítíC! é entendido na área e um vírus de insecto, como seja um baculovírus, o qual foi genéticamente modificado de modo a inactivar um eqt do referido vírus. Tal baculovírus EGT pode ser ainda modificado genéticamente para expressar um gene heteróloqocodificador de uma hormona de insectos que afecte a eclosão ou hormona, de insecto que afecte a cujos produtos afectam a eclosão incluem, mas não estão limitados a hormona protoracicotrópica, hormona de eclosão e estearase da hormona juvenil. De preferência, as composiçSes insecticidas compreendendo baculovírus genéticamente modificados são formuladas para aplicação por vaporização.

u. m a enzima q u e i n a. c t i ν e uma eclosão. Os genes heterólogos )

Também são incluídas como composiçSes; insecticidas as que empreendem um veículo adequad ricultura e parasita<

de insectos genéticamente modificados. Um parasita de insectos é um organismo que vive ou se replica em estreita associação com uma larva de insecto e que tem efeitos adversos sobre as larvas. Um parasita pode ser uma bactéria., um fungo, um vírus ou um outro insecto. Tais parasitas de insectos genéticamente modificados compreendendo um qene eqt serão um agente de controle de insectos melhorado pela inactivação daquele gene eqt.

Qualquer uma das composiçSes insecticidas atrás referidas pode ainda compreender ingredientes para estimular a alimentação de insectos. As composiçSes insecticidas do presente invento podem ser ingeridas pelas pragas de insectos após aplicação nas plantas e as pragas de insectos susceptíveis ao agente de controle de insectos na. composição insecticida apresentarão uma alimentação reduzida e morrerão.

Constitui u.m outro objectivo do presente inventoproporcionar um pesticida biológico modificado que iniba a expressão do gene eqt ou com a função do seu. produto.

Breve Descrição dos Desenhos

A Fiq. 1 é uma represen tação esquemática cdci gertoma de □ genoma

AcHNPV mostrando a localização está, apresentado em unidades de mapa e como mapas de restrição EcoFI e Hindi II.

de AcMNP'7

A Fiq. 2 é um resumo esquematizado dos resultados de gene aqt e análise da sequância. G painel A descreve um mapa de endonucleases de restrição da região. No

')

anãlise por

- ., πϊ= iiniias «traduzida» cada cadeia aberta (2) painel B estão apresentados os resultados de dã computador da sequência das grelhas de leitura aberta verticais indicam codões de paragem. A sequência é nas três potenciais gralhas de leitura abertas para πμα. ' , -r . , o.- A orelha de leitura '•J X—' ‘ 4f~! V J. 4j jC. 4} * l| Jl φ X- I] »* correspondendo a egt_ está, marcada. EGT.

A Fig.. 3 é uma representação esquemática das estruturas das regiões do gene eqt de AcMNPV (A> e dos vírus recombinantes vEGTZ (B) s vEGTDEL ÍC). As caixas a tracejado representam o gene lacZ.

.)

A Fig,. 4 ê uma representação esquemática da electroforese em gel de agarose ε análise de transferências Southern para a identificação de um gene eqt no baculovírus OpMNPV.

A Fig.	5 é um mapa, de restrição esquemático	do	g encima
OpMNPV.
A Fig.	6 é um gráfico do ganho de peso	de	1 arvas
temu.nha não	infectadas ou após infecção das Isrv	’as	no 42

instar com AcMNPV tipo selvagem ou com vEGTZ.

A Fig. 7 é um gráfico da mortalidade larvar após infecção das larvas no 45insta.r com AcMNPV tipo selvagem ou com vEGTZ.

A Fig. S é um gráfico do ganho de peso após infecção ; no 52 instar com AcMNPV tipo selvagem ou vEGTZ.

nu 52

A Fig. P é um gráfico da mortalidade larvar após infecção das larvas no 52 instar com AcMNPVtipo selvagem ou cem VEGTZ.

)

Α Fig. 1Θ é um gráfico da mortalidade larvar após infecção das larvas no primeiro instar com AcMNPV tipo selvagem ou com vEGTZ numa concentração de 4,8 x 10^¹ corpos de inclusão poliédricos (F'IB)/ml.

A Fig. 11 ê um gráfico da mortalidade larvar após injecção das larvas no primeiro instar com AcMNPV tipo selvagem ou com vEGTZ numa concentração de 2,4 xlO PIB/ml.

Descrição Detalhada das Realizações Preferidas

Ds insectos lepidópteros passam por uma sequência de acontecimentos durante o desenvolvimento desde o ovo até ao insecto adulto (ver .□ra;

-ehensive Insect Physiology, Biochemstry and Rharmacology, Vols. 7 e 8, Kerkut e Gilbert (eds.), Pergamon Press, Oxford, 1984 para revisões detalhadas). Após a eclosão, as larvas de insectos entram num período de abundante ingestão de alimentos durante o qual muda o tegumento várias vezes para permitir o crescimento continuado. As fases entre as mudas de tegumento sucessivas são conhecidas como instares . No final do período de crescimento larvar a larva pu.pa e finalmente emerge como um insecto adulto. Ds processos de muda de tegumento e passagem a pupa (colectivamente designados ecdise) são regulados pelas acções concertadas de vários grupos de diferntes hormonas. D estímulo inicial é a libertação da hormona protoracicotrópica (FTTH)por certas células do cérebro. Isto estimula as glândulas protorácicas para produzirem e secreterem ecdisteróides, muitas vezes referidas como as hormonas das mudas dos insectos. Na.

to larvar sairá, enquanto larva passará è fase ds

presença	da. hormona	j u.ven i 1,	um teçum
q u e a a	usência. da	hormona, j	uveni1,
pupa. A	hormona da.	ec1 osão	é também
várias a	11er«ços5 do	comporta	imento as

Ο baculovírus AcMNPV, que é usado como sistema modelo pare, muita da pesquise em baculovírus, interfere com o processo do desenvolvimento de insectos discutido atrás de um modo até agora não previsto, As larvas de insecto infectadas com AcMNPVficam incapazes de mudar de tegumento ou de passar à fase de pupa pois AcMNPV dirige a síntese de uma enzima, conhecida como UDP-g1ucosi1transferase de ecdisteróides (EGT), a qual inactiva especificamente os ecdisteriéides de insecto.

O gene codificador de EGT foi identificado pelos presentes inventores; ele esteride~se das unidades de mapa S,4 a 9,6 do genoma de AcMNPV (Figs. 1 e 2). Como se mostra no Painel C da Fig.l, os fragmentos de DNA virai englobando o gene eqt foram cionados nos plasmideos pUC19, Bluescript M13^ e Bluescript Ml3 . A Figura 2 mostra o mapa de restição da região eqt do genoma e a análise da grelha de leitura aberta auxiliada por computador da região eqt. Apenas a grelha de leitura 2 contem uma grelha de leitura aberta relativamente grande, a qual foi identificada como a região codificadora do gene eqt. A sequência de de nucleotídeos do gene eqt e a sequência de aminoácidos deduzida dos 5Θ6 aminoácidos estão aprsentadas na Tabela 1. A sequência codificadora de eqt estende-se aproximadamente desde o nucleotídeo Í49 até aproximadamente ao nucleotídeo 1670.

Numa, realização preferida do presente invento, o gene eq t do baculovírus Ac MNP V ê inactiva.do por substituição de uma fracção do gene eqt por uma sequência, bacteriana. codificadora da. D-gaIaetosidase. Este baculovírus recombinante é designado vESTZ. Numa, segunda realização preferida, parte do gene eqt do AcMNPV é eliminado sem substituição, como se mostra na Fig. 3 Uma comparação das proteínas sintetizadas durante a infecção por AcMNPV tipo vagem e por vESTZ revelou que a pi

EGT é uma proteína de

6€» KDa. que é secretada pelas células infectadas. Um mecanismo alternativo para a inactivação do gene eqt de vírus de insectos é a inserção de um gene codificador de uma hormona ds insectos que afecte a muda ou uma enzima que inactive uma hormona de insectos que afecte a muda, gene esse que é expressável numa célula de insecto infectada com o referido vírus de insectos.

Uma pesquisa da base de dados Genbank revelou de homologia da sequência de aminoácidos entre eqt UDF’-glucoronosi 1 transferasss de mamíferos» Também ss homologia com uma LJDP-glucosi 1 transferase vegetal. 0 al da sequência de aminoácidos de eqt com as sequências de dos de algumas destas enzimas está, apresentado na Tabela

a 227. e várias encontrou inhamento aminoáci0

Tabela 1

Sequência de Nucleotídeos e Sequência de aminoácidos deduzida do eqt de ftcHNPV

GTCG ACG CG CTTCTG CGTAT A ATTG C AC ACT A AC ATGTTG C C CTTTG AZi CTTG AC CT C G A T TG TGTTAZ.TTTTTGGCT AT

1 AAAAAGGTCACCCTTTAAAATTTGTTACATAATCAAATTACCAGTACAGTTATTCGGTTTGAAGCAAAATGACTATTCTC eqt : Μ Τ I L

6 1 TGCTGGCTTGCACTGCTGTCTACGCTTACTGCTGTAAATGCGGCCAATATATTGGCCGTGTTTCCTACGCCAGCTTACAG

CHLALLSTLTAVHAANI L A V F PTPAYS

4 1 CC AC C AT AT AGTGT AC A AAGTGT AT ATTG A AGC CCTTG CCG A A A A ATGT C AC AACGT T AC G GTCGTC AAG C CCA AACTGT

HHIVYKVYIEALAEKCHNVTVVKPKLF

21 TTGCGTATTCAACTAAAACTTATTGCGGTAATATCACGGAAATTAATGCCGAC ATGT C TGTTG AG C AAT AC A A A A A ACT A

AYSTKTYCGNITE 1 NADMS V EQYKKL

0 1 GTGGCGAATTCGGCAATGTTTAGAAAGCGCGGAGTGGTGTCCGATACAGACACGGTAACCGCCGCTAACTACCTAGGCTT

VANSAMFRKRGVVSDTDTVTAANYLGL 48 1 GATTGAAATGTTCAAAGACCAGTTTGACAATATCAACGTGCGCAATCTCATTGCCAACAACCAGACGTTTGATTTAGTCG iemfkdqfdninvrnliannqtfdlvv

561 TCGTGGAAGCGTTTGCCGATTATGCGTTGGTGTTTGGTCACTTGTACGATCCGGCGCCCGTAATTCAAATCGCGCCTGGC

VEAFADYALVFGHLYDPAPV1QIAPG 6 4 1 TACGGTTTGGCGG AAAACTTTG AC ACGGTCGGCG CCGTGGCG CGGC AC C CCG T C C AC C AT C CT A AC ATTTGG CG C AG CAA

YGLAENFDTVGAVARHPVHH PN1WRSN 2 21 TTTCG ACG AC ACGG AGGC AAACGTG ATG ACG G A AATG CGTTTGT ATA AAG A AT TT Λ A Z^ Ζ-Τ Τ T TG G CCA AC ATC. TCC A ACG

F D D Τ Ε A Ν V Μ Τ Ε Μ P. L ϊ K Ε I F Λ Μ M S Ν A

0 1 CGTTG CT C A AAC A AC AGTTTGG AC C C A AC AC AC CG AC A ATTG A A A A ACT Z. c r, z. z. c A *-. ’· 7- T c r ATTG C TTTTG C T A A AC

LLKQQFGI NTPTI EKLRNhVQLLLLN 88 1 CTGCATCCCATATTTGACAACAACCGACCCGTGCCGCCCAGCGTGCAGTATCTTGGCGGAGGAATCCATCTTGTAAAGAG

LHPIFDNNRPVPPSVQYLGGG 1 HLVKS 961 CGCGCCGTTGACCAAATTAAGTCCGGTCATCAACGCGCAAATGAACAAGTCAAAAAGCGGAACGATTTACGTAAGTTTTG

APLTKLSPVINAQMNKS KS GT I YVSFG 10 41 GGTCGAGCATTGACACCAAATCGTTTGCAAACG AGTTTCTTT ACATGTT AATC AATACGTTCAAAACGTTGGATAATTAC

SS I DTKSFANEFLYMLI NT F KTLDNY 112 1 ACCATATTATGGAAAATTGACGACGAAGTAGTAAAAAACATAACGTTGCCCGCCAACGTAATCACGCAAAATTGGTTTAA

TILWKIDDEVVKNITLPANV ITQNWFN 1201 TCAACGCGCCGTGCTGCGTCATAAAAAAATGGCGGCGTTTATTACGCAAGGCGGACTACAATCGAGCGACGAGGCCTTGG

QRAVLRHKKMAAF ITQGG LO S S DEALE

8 1 AAG CCGGG AT ACCC ATGGTGTGTCTGCCC ATG ATGGGCG ACC AGTTTT AC C ATG CG C AC A A ATT AC AG C A ACTCGG CGT A

AGI PMVCLPHMGDQFYHAH K LQQLGV

6 1 G CCCG CGCCTTGG AC ACTGTT ACCGTTTC C AGCG ATC AACT ACTAGTGG CG AT A A AC G A C GT GTTGTTT A ACGCG CCT AC

ARALDTVTVSSDQLLVAl NDVLFNAPT

4 1 CT AC AAA A AAC ACATGGCCG AGTT AT ATGCGCTC ATC AATC ATG AT A AAGC A ACGTTT C CG C CTC T AG AT A A AG CC ATC A

YKKHMAELYALINHDKATF F P LDKAI K

21 A ATTC AC AG AACG CGT AATTCG AT AT AG ACATG AC ATC AGTCGTC A ATTGT ATT C ATT A A A A A C AAC AG CTGC C A ATGT A

FTERVIRYRHDISRQLYSLKTTAANV 160 1 CCGTATTCAAATTACTACATGTATAAATCTGTGTTTTCTATTGTAATGAATCACTTAAC AC ACTTTTAATTACGTCAATA

PYSNYYMYKSVFSIVMNHLTHF*

168 1 AATGTT ATTC ACCATT ATTT ACCTGGTTTTTTTG AG AGGGGCTTTGTGCG ACTGCGC A C TT C C AGC CTTT AT A A A CG CTC

1761 ACCAACCAAAGCAGGTCATTATTGTGCCAGGACGTTCAAA

Tabela 2

Comparação entre a Sequência de EGT e Outras Enzimas Modificadoras de Esteróides )

LGT

HUIIUDrGAT

IIUSUDrGAT

HATUDrGAT

EGT nunuDrGA r

IIUSUOTGftT ' - >, ratudpgat )

EGT nunuDrGAr nusuorGhT ηΛνυοΓΟΛτ

II I 1LCWI.AI.LS-----TbTAVIlAAUII.AVf I .AU........(KS . π .qkwl.-V . Al.b.......£ -SVk .qkvl. V . AI.E.......E . S . li . gk υ I. V

VKr1 . R 1 ι Ρ 1 K.F ι γλϊγ.ιιιι ι wr.vY ι r.Ai.M.r.ijniv ι v

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IIP V I V IIP V IV IIP V I V

EGT

HUIIUDrGAT

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HUIIUDrGAT

HUSUDFGAT líATUDPGAT

EGT

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HUIIUDrGAT

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EGT

HUIIUDrGAT

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RATUDrGAT

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EGT

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A Tabela 2 ilustra o al inhamen toda sequência de sminciáeidos de eqt com uma de UDP-qlucosi 1 transferases de aminoácidos previ elecção de UDP-gl par = (1+oronosi1transferases e outras espécies. A sequência de está comparada UDP-glucuronos.iltransferase humana (HUMUDPGAT) (Jackson et el. (1987) Biochem. J„ 242:581; de ratinho (MUSUDPGAT) (Kimura e Owens (1987) Eur. J. Biochem. 168: 515 ; e de rato (RATUDPGAT) (MacKenzie (1987) J. Siol. Chem. 262:9744); e UDP-glucosi1transferase de milho (ZMAYUDPST) (Ralston et al. (1988) Sertetics 119: 185) , usando o algoritmo PftSTP (Lipman e Pearson (1935) Science 227:1455), conforme estabelecido por International Biotechnologies Inc. As letras superiores indicam empareihamentos exactos; as letras inferiores significam substituições que ocorrem frequentemente entre proteínas relacionadas, (Dayhoff, (1987) A11 as of Protain Sequence and Structure, National Biomedica 1 Research Foundation,

Vol. 5, Suplemento , Silver Spring, MD); os pontos representam substituições que ocorrem raramente; numa sequência; e um sinal de intercal nado um aminoácido da sequência. Os foram eliminados do gene eqt em vESTZ gene AcMNPV com as UDP-glucose e apoia a identificação desta sequência codificadora de eqt.

os traços indicam faltas ação marca onde foi elimiaminoácidos entre as seta.s e vEGTDEL. A homologia do UDP-g1ucoronosi1trsnsferase do ftcMNPV como a sequência

Nos mamíferos, a UDP-glucuronosi1transferase catalisa &

transferencia de ácido qlucorónicD para	uma	larga variedade-	d s
~-L. l_.· zi l.L íHΐ.O -zí + i p£5’* ι I IC Oi5 Ξ' ;<oQ·Ξ'Γ< LL-óí £? 5	ndóg	ecos (revisto	EuTi
Glucuronidation of Drugs and Other Com o o	unds	, Dutton (ed.),	CRC
Press, Boca Raton, Florida, 1986). Esta	reac	ç ά o d e* c on j lig s ç <3 □	c?
importante para a desintoxicação e eliminaçã	o sequra d<= cer	t s. s

drogas e carcincgénios. Ainda, o metabolismo normal e distibuição de vários compostos endógenos tais como bilirru.bina e hormonas esteróides, desenrola-se via conjugação com o ácido )

glucurónico.Os dados disponíveis sabre sistemas de insectos indica que as reacções de conjuqação com açúcares deste tipo envolvem transferência de glucose em vez de ácido glucurónico (revisto em Sm.ith (1977) em Druq Metabolism - From Mie robe to

Man, Parke s Smith (eds), Taylor e 219-232). Tal como nos mamíferos, uma tas exógenos e endógenos são sujeitos

Francis Ltd., London, pp. larga variedade de composa conjugação nos insectos.

Ds inventores mostraram que a proteína EGT de AcMNPV é uma UDP-g lucosi I transfera.se que conjuga especif icamente glucose com eedisteróides tais como eedisona, 2Φ—hidroxieedisona e macisterona A (ver Tabela 3). Nem os lisados nem o meio extracelular de células não infectadas ou de células infectadas com VEGTZ modifica eedisona. A maior parte da actividade de glucosi 1 transfera.se de eedisteróides expressa por células infectadas com AcMNPV é ssecretada para o meio extracelular; apenas um nível relativamente pequeno de actividade é observado nos lisados de células infectadas, com AcMNPV.

Usando o uo um gs/ttf eq t num de Drovia pseudots reconhecido pelos gene eqt do AcMNPV outro baculovírus, .qata (DpMNPV) , como fami1larizados com como sonda, vírus da po se mostra a. matéria desta divulgação que o gene eqt de qualquer báculo insecto ou insecto pode ser local de modo semelhante ao aqui exempl manas 7@’Z de homologia da saguênci cia da Tabela 1 são considerados Tabela* 1, desde que aqueles genes que é uma UDP—q1ucosi1transferase izado, caracteri ificado. Os qene a de nucleotídeo equi v a1en tes à h o m ό 1 o g o s c o d ι f ι de eedisteróides foi identifica— iedrose nuclear a Fig. 4. Será com o auxílio ν í r u s , ν í r u s d e zado e isolado -· 1 com pelo sequência na quem uma enzima

Us equivalentes italisass a •uncionais do gene inactivação de eedisterióides são aquele? f a i como )

Γ- 1

ecdísona por transferência de uma. fracção glucose de LÍDF'-glucose p ::j v- c. { cr, \ podem ser identificados usando os métodos de ensaio aqui descri-scdisteróide(s). Aqueles equivalentes funcionais de eqt

Com a localização, identificação e isolamento de um gene o investigadc

-ami1iarizado com a área pode inactivar jquele gene usando os ensinamentos da presente divulgação e para produz ir um sgen ce de controle insectos mais eficaz.

r comparação das propriedades de vEGTZ com as propriedades cio AcMNF'V tipo selvagem (wt), os presentes inventores eqt evita que o insecto passe pelas

.. -L ..	ram que	5 c* X p Γ S tf Ξ <tf. O ; j ctf	mt	evit
c.£5	de muda	d& t&?Gu.fn©nto ou.	de	pupa
MNpt	' wt não	tf? Π £ <tf. iTi i *f -tf. 3 £0	de	muda

ju ds popa, ma;

insectos .nfectados com vEGTZ mudam o tegumento e tentam pupar (ver Tabela e fases de muda e de pupa, a infecção pelo AcMHPv tipo selvagem pode de facto prolongar o tempo de alimentação larvar. As larvas infectadas no começo do quinto instar (o último instar larvar) com o vírus selvagem continuam a alimentar-se atá ã morte 5 ou b dias após a infecção. Mo entanto, as larvas não infectadas param de se alimentar 2 a 3 dias após entrarem no quinto instar na. preparação para a fase de pupa (ver Fig. 3). Efeitos semelhantes são observados quando são examinadas as larvas dos primeiros instares. As larvas não infectadas cessam □ tf -···=:

d u r an te a ρ r o: · i m a d a me n t f

-“Λ Λ t.

.·· «4 i í •ioras na muda, do cento, enquanto as larvas infectadas pelo AcMNPV wt não mudam consequentemente não param de ιn qerιr ali men tos er ΠΠ, O ,

is a 1 i men ta,, ão larvar. Assim,

Os baculovírus recombinantes que não possuem um gene eat funcional não - — ~ p ▲ Qi i Çj cGVi D l ΙΞííi p Cj as larvas infectadas com vEGTZ no início do quinto instar cessam de s« alimentar

Í1S dias após a infecção na preparação para n a no fase cie pupa (ver Fig. Θ) . No entanto, eles não entram na fase de pupa e sucumbem à infecção virai mesmo mais rapidamente do que as larvas infectadas com o vírus tipo selvagem, como se mostra Fig. 9. De modo semelhante, as larvas infectadas com vEGTZ início dc? quarto instar cessam de se alimentar dois dias após a. infecção para entraem na fase de pupa e depois morrem mais rápidamente do que as larvas infectadas com com o tipo selvagem (ver Figs. ó e 7). A morte mais rápida por um baculovírus sem um gene eqt funcional é observada mais dramaticamente quando larvas no primeiro instar recentemente eclodidas são infectadas com

AcMNFV tipo selvagem e com vEGTZ conto se mostra nas Figs. 11. As larvas infectadas com com vEGTZ sucumbem á infecção

IO e v i r a 1 tipo a 4 dias mais cedo do que as larvas infectadas com AcMNPV selvagem. Portanto, os baculovírus recombinantes sem um gene são consideravelmente mais eficazes como agentes de controle de nse do que os baculovírus tipo selvagem,, Será óbvio para familiarizados com a matéria com o auxílio desta divulgação que o gene aqt pode ser tornado não funcional em qualquer báculos ou vírus de insecto por quaisquer métodos conhecidos na área,

Ds efeitos descritos atrás e nos exemplas que se seguem serão mais dramáticos rto campo. As larvas infectadas com vEGTZ têm dificuldade sm entrar na fase de mudas e só o conseguem fazer com êxito apenas em condições laboratoriais bem controladas. Quando a temperatura e a luz não estão rigorosasiente controladas, muitos; insectos não conseguem terminar a fase de pupa. Estes pOUi_ sj )

Se bem que o tempo que a progénie virai pode dournular o mi b a. o u 1 o v r r u s s e m um g e n e e q u f u η c ι ο π a i seja encurtado ε o insecto infectado apresente menor crescimento,

Π ··:< Ξuma produção substan de •oqénie virai oua.ntidade de vírus obtido por larva após infecção com vEGTZ de larvas nos últimos instares é cerca de metade da obtida oom o vírus selvaIsto é suficiente para permitir a transmissão do vírus campe e viável am termos económicos quantidades de partículas virais.

no

Numa outra realização do presente invento, um insecto sem um gene eqt funcionalé modificado por técnicas de engenharia genética de modo que a sua eficácia como agente de controle biológico de insectos seja ainda aumentada por incorporação de um segundo gene cujo produto afeeta o desenvolvimento dos insectos.

ser	ií t	serido no genz
ΞΈ'Γ'		.presso em ní\
muda	s	d e t e g u m e n t o
víru	s	a ρ r e sen t a m e x t

□ gene codificador de PTTH (uma hormona peptídica? pode virai com o gene eqt eliminado s PTTH pode larvas infectadas com tais apresentam extremas dificuldades no controle hormonal do desenvolvimento. Estes insectos tornam-se doentes rápidamente resultando num crescimento e desenvolvimento severamente comprometidos, diminuição daingestão de alimentos e morte antecipada.

A hormona da eclosão é também uma hormona peptídica pequena cujo gene pode ser inserido no genoma virai com um gene eqt não funcional, usando técnicas conhecidas. Devido à hormona de eclosão governar muitas alterações de comportamento associadas à fase de muda, os insectos infectadas por u.m vírus EGT“ produzindo níveis suficientemente altos desta hormona. apresentarão anormalidades no comportamento e/ou. desenvolvimento, como seja alimentação reduzida.

Um dos principais regu1adores dos títulos de hormona juvenil no insecto é a enzima sstearase da hormona juvenil, a qual inactiva a hormona juvenil. Um vírus recombinante sem um gene eqt funcional a expressando níveis suficientemente altos da esteara.se de hormona juvenil pode afectar adversamenta o comportamento e/ou desenvolvimento dos insectos.

É importante notar que, se bem que todos os genes possam ser adicionados ao genoma virai tipo selvagem, não será de esperar que eles afectem grandemente o comportamento dos insectos no vírus tipo selvagem pois a expressão do gene eqt pelo vírus tipo selvagem inactiva as hormonas ecdisteróides das mudas e a fase de muda é evitada, independentemente da produção de outras hormonas. Assim, estratégias bem sucedidas envolvendo a geração de vírus destinados a interferir com as mudas ds insectos dependem da inactivação prévia do gene eqt, como descrito neste invento.

Será entendido pelos familiarizados com a matéria que organismos mutantes sem um gene eqt intacto ou incapazes de expressar um produto de eqt funcional e os que são ainda, modificados genéticamente de modo a expressarem uma outra enzima de modificação de hormonas ou uma hormona peptídica estão incluídos agentes de controle de insectos do presente inventa,

Mostrou-se que o produto do gene eqt interfere com. o desenvciivimento dos insectos deum modo forte e sspscífico.Os ecdisteróides desempenham um papel crítico no desenvolvimento de práticamente todas as espécies de insectos (revisto em Comorshen sive Phvsioloqy Biochemstry and Pharmacoloqy , K e r k u t e g i 1 b e r t Ceds) Pergamon Press, Oxford, 1934). Assim, o próprio eqt possui considerável potencial para usar em estratégias latas de controle de insectos. Por exemplo numa quarta realização preferida do

presente invento, as espécie» Lultivsre» podem Ser alteradas po engenharia genética de modo a produzirem constitutivamente a proteína EGT através de técnicas conhecidas. Os insectos ac alimentarem-se de tais culturas serão incapazes de completar o seu desenvolvimento para insectos adultos, proporcionando assim uma protecção eficaz da cultura a longo termo. De modo semelhante, as bactérias normalmente presentes na planta ou insectc podem ser alteradas por engenharia genética através de técnicas conhecidas para produzirem a enzima EGT. Tais bactérias funcionarão igualmente como agentes eficazes do controlo biológico de insectos .

De um modo semelhante, bactérias não fitopatogénicas colonizadoras de plantas podem ser modificadas genéticamente para expressarem o gene EGT. As- plantas colonizadas por aquelas bactérias genéticamente modificadas estarão protegidas das pragas de insectos susceptiveis a acção da.(s) proteína(s) expressa(s). Bactérias não fitopatogénicas colonizadoras de plantas estão descritas, por exemplo, na Patente U.S. N2 4,798,723 e as modificações genéticas de certas bactérias colonizadoras de plantas estão descritas na. na Patente U.S. NQ 4,771,131 e Publicação EPO NS 01850Θ5. São do conhecimento geral outras bactérias colonizadoras de plantas. Quaisquer meios conhecidos podem ser empregues para introduzir genes expressáveis tais como os referidas atrás para produzir agentes de controle de insectos.

A ingestão de tal material vegetal m; mente ou. de material vegetal colonizado por tais bactérias genéticamente modificadas colonizadoras de plantas por um insecto susceptível resultará na interferência do desenvolvimento normal daquele insecto. ± conhecido que certos insectos, e.g., afídeos, possuem tecido intestinal particularmente permeável. Ds entendi— biologia ie tal gene expressável em plantas e os passos necessários á construção o’e tal gene expressável em plantas e os passos necessários á mvorpurâçdO ue tal gene nu genoma da planta.

é provável que os próprios insectos expressem um gene eqt em fases específicas durante o seu ciclo de vida e que isto constituaum componente importante do mecanismo de regulação do desenvolvimento. Assim, é possível que um gene de insecto possa ser um alvo adequado para novas estratégias de controle insectos. A divulgação do presente invento proporciona os meios para a programação de tais estratégias.

eq t de

Uma realização adicional do presente invento, refere-se à produção de análogas que se liguem á enzima EGT, mas que não podem ser clivados e libertados da enzima. Tais «substratos suicidas» ligar-se-ão competitivamente à enzima EGT e inibirão ou bloquearão a sua acção, consequentemente interferindo com o d e s en vo 1 v i m e n to dos recombinantes podem meios aqui descritos ntatériade modo a ser por exemplo através insectos. Como alternativa, os organismos ser genéticamente manipulados empregando e do conhecimento dos familiarizados com a evitada a expressão do gene eqt de insectos da produção de RMA «anticodão».

Conforme aqui é usado uma composição ou o ingr •ssui um efeito adverse?

um agente de controle de insecdisnte activo de uma composição sobre as pragas de insectos. A s é reduzida em resposta ao mudas normais dos insectos é tos. Um agente de controle de vírus de insectos alterado codificador de uma enzima de ingestão de alimentos pelos insecto agente de? controle de insectos, asperturbada e dá-se a morte dos insec insec tos deste invento pode ser um geriêticamente para inactivar um gens fnodi.ficação de eedisteróides ou um que seja ainda alterado para

expressar um gene beterólogo codificador de uma proteína que aíects o desenvolvimento dos insectos ou pode ser uma planta, parasita de insectos ou uma bactéria não fitopatogénica, quslquer um deles tendo sido genéticamente manipulado para expressar um gene beterólogo codificador de uma. proteína que afecta as mudas;.

As composições insecticidas adequadas para aplicações em plantas para o controle de pragas de insectos comprendem um veículo adequado para a agricultura e um agente de controle de insectos. A aplicação de uma composição insecticida deste invento pode proteger as plantas das pragas de insectos através da redução da ingestão de alimentos pelos insectos e morte dos insect o s suscep tίv e is,

Os familiarizados com a matéria sabem como escolher um agente de controle ue insectos, e.g., um vírus de insecto, o qual é adequado ao controle de uma praga de insectos particular.

Será entendido pelos que estão dentro do campo que as pragas de insectos- podem ser expostas ao agente de controle de insectos do presente inventa por meios convencionais incluindo a ingestão, inalação ou contacto directo do agente de controle de msectos.

insectos, plantas e microorgsnismos entomopstogênicos qu.e

Também estão inclu.idos nos agentes de controle de ΡI ΠώίΓι sido genéticamente alterados para expressar pelo menos- u.ma. proteina que afecte o desenvolvimento de insectos. Exemplos de tal proteína incluem, mas não estão limitados a hormona protoracicotrópica, hormona de eclosão, estearase da hormona juvenil e g 1 u c o s i 11 r a n s f e r a s e de ecdipona

Ds parasitas ds- insectos, incluindo vírus de bactérias, fungos & outros insectos, podem também ssr genéticamente modificados para expressarem eqt. 0 parasitismo de insectos adequados por tais parasitas ds insectos resultará ns interrupção do desenvolvimento normal além da sintomologia normalmente associada ao parasita não modificado. A interrupção do desenvolvimento em insectos infectados aumenta a gravidade da doença. A ingestão de alimentos e infecção das pragas de insectos reduzirá a quantidade de alimentos consumida e acelerará a morte.

As sequências de DNA codificadoras de uma proteína EGT que afecte o desenvolvimento de insectos aqui descritas, expressas sob o controle regulador de um promotor adequado ao organismo, podem ser usadas para modificar genéticamente um organismo para produzir um agente de controle de insectos.Ds organismos alvo para a modificação genética incluem parasitas de insectos, plantas e bactérias não fitopatogénicas colcnizadoras de plantas., gene eqt, o produto do gene, anticorpos dirigidos contra o último e todos os outros reagentes derivados ou ligados a eles estão dentro do âmbito do presente invento. A proteína EGT pode ser substaneialmente purificada, usando o ensaio aqui descrito e técnicas conhecidas.

en pen1

A principal utilização dos ria genética dp presente invento c u 1 ο ν í r u s a. Iterados erá como componentes

composições a usar efectuar o controle São conhecidas muit adequadas para util em agricultura para a biológico das pragas as variações da prepa ização em agricultura plicação em plantas de insectos em pla ração de tais compos no controle de inse para nta.s.

1Ç uS'5 ctos.

A concentração do agente de controle de insectos que será necessária para, produzir para produzir composições eficazes

como insecticidas a. usar em agricultura, para, protecção de plantas dependerá do tipo ds organismo ·e mutação usados s da formulação da composição. A concentração eficaz como insecticida. do agente de controle de insectos da composição pode ser fácilmente determinado experimentalmente, conforme será entendido pelos entendidos na matéria. Por exemplo, uma concentração eficaz como insecticida.s de um vírus pode ser fácilmente determinada usando variações das técnicas descritas em qualquer um dos Exemplos VI XI .

As composições para agricultura devem ser adequadas como tal e dispersáveis; nos campos. De um modo geral, os componentes da composição não devem ser fitotóxicos e não prejudiciais para a integridade dos vírus oclu.sos. As aplicações; foliares não devem danificar as folhas das plantas. Além de veículos sólidos ou, de pref rência, liquidos adequados, as composições; para usar em agricultura podem incluir agentes aglomerantss e adesivos, agentes emulsionantes e molhantes, mas nenhuns componentes qu.e impeçam □ insecto de se alimentar ou quaisquer funções virais. Pode também ser desejável adicionar componentes qu.e protejam o agente de controle de insectos. da inactivação pelos UV. As composições para usar em agricultura no controle de insectos podem também incluir agenti insectos„ que estimulem a alimentação do?

Exitem :n.i’ descrevendo métodos de aplicação dos agentes de controle biológico de insectos e da.

aplicação em agricultura por exempla, Couch e IgnffD (1981) em Miorobial Control of Fests and Plant Disease 1970—1980, Burqe5 ·. ed . ) , capítulo 34, ρρ. 621—834; Corke e Eishbeth, i b i d , capítulo

39,pp. 717-731 h ! -5 4

Brockwel1 (1980) em Métodos for Evaluation raqen Fixation, Bergersen (ed) pp. 417-488; Burtcn (1982) em loqical Mitroqen Fixation Technology for Tropicai fiqriculture,

Grbam e Harris (eds.) pp. 105-114; e Roughley (1982) ibtd, pp. 115-127; The Biology of Bacu1oviruses, Vol. II, supra.

Este invento é ilustrado pelos exemplos que se seguem, os quais não devem ser pensados como impondo quaisquer limitações ao seu âmbito. Compreende—se gue se pode recorrer a várias outras realizações, modificações e seus equivalentes que possam ser sugeridos após leitura da. descrição aqui apresentada sem qe afastamento do espírito do presente invento a/ou do âmbito reivindicações apensas.

iaj a .J _ ... U Cl —

Exemplo I

á i 1	ust rada a.	posição do	gene eq t	no
cima	do imapa do	genoma de	AcMNPV e	stá
em un	idades de	mapa. Para	determinar	a

?ste gene e das regiões delimitentes

5U&ni_ i3 de »iUu 1^s-.'u t í d(

Pstΐ 7,6 um até ao sítio BamHI plasmídeo pUC19; os para, permitir subsequente manipulação· do gene, é primeiro necessário cionar vários fragmentos de DNA inserindo esta região em vectores plasmídeos (ver T. Maniatis et al. (1982) em Mo1ecu1 ar Cloning; a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, para os processos de clonagem convencionais). 0 painel A mostra um mapa linear do genoma do AcMNPV após clivagem com as endonucleases de restrição EcoRI e H i n d 111. 0 Painel B ê uma ampliação do genoma desde 7,6 até 11,1 uniodades ds mapamostrando a localização do gene eqt. A estirpe de AcMNPV original usada é a estirpe Lí (Lee e Miller (1973) J. Virol. 27:754). Os fragmentos de DNA clcnados e os nomes dos plasmídeos resultantes estão apresentados na Fig. 1, Painel C. 0 fragmento 1, que se estende desde o· sítio l,1 um, foi cionado no vector 3 (desde o sítio Pst.I (7,6 um) f r a cj m e n tos 2 e a tá Ec cR I (365 um) e desde Et_ oR I (3, m5 um) a tá 3a 11 ( 1 d , a li tu i respectivamente) foram ambos clonados nos vectores Bluescnpt M13+ e Bluescript M13- (Stratagene, San Diego, Califórnia). 0 fragmento 5 (BstEII (8,35 um ) a BstEII (8,7 um) fd cionado em Bluescript K13+.

Obteve-se um grande número de subclones dos plasmideos BCPsE e BCES (Henikoff (1984) Gene 2Ss351). Estes subclones têm deleçSes progressivamente maiores da inserção de ΕΊΜΑ virai de tal modo que contêm quantidades diferentes de DNA virai, variando desde menos de 50 pares de bases até todo o fragmento virai . Muitos destes subclones e o plasmídeo BCB, foram então sequenciados (Sanger et al. (1977) Proc . Natl. Acad. Sei. USA 74 s 5463) de modo a ser sequenciado todo o gene eqt em ambas as direcções. As sequências de nucleotídeos obtidas foram então analizadas· por computador relativamente à presença de grelhas de leitura abertas que podem codificar proteínas usando programas de Pustell e íefatos (1984) Nuc1. Acids Res.

387-396. Esta análise indica que o qens sequência de eqt codifica uma proteína de 506 aminoácidos. A nucleotídeos do gene eqt e a sequência de? aminoácidos prevista do produto do gene eqt estão apresentados na Tabela .

Exemplo II • l^-' *·' -:¾ Γ” ct L Ο ι I bo L i^r U. Ϊ. F V i * ’ LÀ Ξ- '”* ~ ^1—1 —^41—5 sar um gene eqt funcional, á necessária posterior manipulação dos clones de plasmídeo descritos no Exemplo I. O plasmídeo pUCBCPsB foi clivado com as endoriuc 1 eases de restrição EcoRI e Xbsl (Vr-M

Fig.3 para sítios dentro do gene eqt) e rejeitado o fragmento pequeno. 0 gene 1acZ de Escherichia co1i, retirado de p3KS104 (Casadaban et al. (1983) Methods Enzymol. 1OOs293-303) com EcoRI com

e AhalII, foi então inserido entre os sítios EccRl e Xbal após extremos protuberantes Xbal terem sido preenchidos com DNA-polimerase de T4. 0 plasmídeo resultante foi designado pEGTZ. Neste plasmídeo, o gene I ac 7. está na mesma, grelha de leitura da.s sequências codificadoras de eqt precedentes. Como alternativa, o plasmídeo pEGTDEL foi construído ligando simplesmente os sítios EcoRI e Xbal um ao outro (após ambos os sítios terem sido tornados cerses/sem inserção de quaisquer sequências entre eles.

Todos os vírus derivaram originalmente de AcMNPV L.-1 (Lee e Mil ler (1978) su. ρ r a.) e foram purificados por placa e propagados na, linha celular Spodoptera fruqiperda IPLB-SF-21 (células SF) (Vaughn et al . (1977) In. Vitro 13:213-217) usando métodos descritos anteriormente (Lee e Mil ler (1.973); Mil ler et al. (1986) Sengtic Engineering, Principies and Methods, Vol. S (eds. J„ Setlow e A. Hollaender!, Plenum Press, N.Y., pp. 277-29S, 1986).

□ ρ 1 a sm í deo p-EST Z f o i AcMNPV wt para células SF coíbo supra. Este processo permite q então cotransfectado com DNA de descrito em Miller et al. (198ó) e se dê a recombinação homóloga entre sequências nos DNAs virai e de plasmídeo, resultando na substituição do gene virai eqt com o gene de fusão eqt-lacZ do plasmídeo. Devido à. restante sequência codificadora do gene eqt estar na mesma grelha de leitura das sequências 1acZ, tal vírus recombinante produzirá uma proteína de fusão compreendendo os primeiros 84 aminoácidos de eqt 1 ν í rus rec.ombinan te, des iqnado vEGT à expressão de β-galactosidase dar gados à fl-galactosidase. Este , pode ser identificado devido placas virais azuis na presença de um indicador cromogénico com seja indo 1 :i.—β—D—ga 1 actopiranosido (X—qal). Na Fiq. apresentado um diagrama do gene eqt do vEGTZ.

5-bromc~4~c 1 oro-·;

es^J

Ο vírus recombinante vEGTDEL foi obtido por catransfec~&u de células SF com o plasmideo pEGTDEL e DNA do vírus vESTZ,, A recombinação homóloga resulta na substituição do gene de fusão eqt do pEGTDEL eqt-lacZ em vESTZ com o gene vírus recombinante vEGTDEL é tendo delecSe:

identificado por não formar placas ζ’. Ζ 'ϋ ΐ- S ;Ί <zá p í“ Ε’ Ζ- Ξ¹ Π Z tl ~ ÇJ 3.1 ι N 3 F i Ç, · ·' 5 P <3t Í Γ) £ϊ 1 E <, Z 't ά cd. ρ Γ* S S Π t Si íJ 5l

a. estructurs dc qene e?qt de vEGTDEL»

Exemplo III □ produto do gene eqt foi identificado por comparação das proteínas sintetizadas porAcMNPV wt (o qual faz EGT) com as produzidas por vEGTZ ou vEGTDEL. (o qual não pode fazer EGT). As células SF foram infectadas com AcMNPV wt ou com vEGTZ a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20 como descrito em 0’Reilly e Miller (1990) d. Virol. 64:1321-1328. Foram também analisadas células não infectadas. Após 6 horas de infecção, as células foram incubadas na presença de metionina. marcada radioac ti vamente “7* cr com l'^jS3 durante 1 hora para marcar rad ioac ti vamen te todas asproteínas feitas durante aquele período.As células foram então lisadas e a.s proteínas separadas por e 1 ec trof orese em gel de SDS-ρσΙiacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli et al. (1970) Nature 227;680-685), As proteínas secretadas pelas células foram também colhidas e analisadas. Após SDS-PAGE, as proteínas marcadas radioactivamente foram detectadas por auto-radioqrafia. Nos 12.da -.jas células j.nfectadas com vtS! z. não se ccnssquiu detectar esta proteína de 60 kDa mostrando que ela é secretada para fora da célula.Estes resultados demonstram que o produto do gene eqt é uma proteína secretada de 60 kDa, propriedades que ío de acorda uom inoa.c idos .

Ho a oa.s seuusncias uta hUí-Iboí-iuSuí

Exemplo IV

A actividade enzimática da proteína EGT foi identificada por comparação de células SF infectadas com AcMNPV wt ou com vESTZ. As células SF infectadas com AcMNPV wt ou com vESTZ são descritas no Exemplo III. Doze horas pi as célu.las e os meios extracelularss foram colhidos e processados separadamente. Células não infectadas foram tratadas em paralelo. Os lisados; celulares ou meios sxtrace 1u1 ares foram incubados na presença de UDP-glucose 1 mM a o,25 pCi de E^HIecdiscna conto descrito em de

CPPeilly e Miller (1939> Science 245:1110-1112. A actividade UDF'~q lucosi 1 transferase de ecdisteróides nos lisados celulares ou meios catalisará a transferência de glucose da UDP-g1ucose para a ecdisona para formar um conjugado de ecdisona-q1ucose.

η ecoisona de ecdisona-g1ucose são sepados um do outro por cromatografia em camada fina em silica. gel (Bansl a Gessner (193S) Anal» Biochem» 109.321) e visualizados por autorradiografia. Gs conjugados de ecdisona—glucose (Q) são formados apenas quando o lisado da células infectadas com AcMNPV wt ou meio extracelular é testado. Quando se usa lisados ou meios d células não infectadas ou infectadas com vESTZ não se observam conjugados, mostrando que a actividade é devida à expressão de eqt. A maior parte da actividade está situada no meio extracelular, de acordo com os dados discutidos no Exemplo III. A prova, de que está glucose conjugada com ecdisona é obtida testando os lisados de células infactadsscom wt como descrito atrás excepto a UDF’— «♦ d glucose ser substituída por UDP-ÍU-‘ 'Cl marcada radioactivamente.

í 4,sacçSes efectuadas com UDP-glucose não marcada ou com UDP-EUDglucose marcada, reacções e

E'~HI ecdisona isente em am ba. —on tag em do c on j ug ad o cintilação mostra que '~'Hda ecdisona e * 'C da glucose podem ser detectados. Estes resultados provam que o produto do gene eqt é uma UDP-qlucosi1transferase transferência de qlucose da l!D?~q 1 uccse

que catalisa azdisona.

E f e c t u a r a m - s e e n t Ά o s:·:.;3 e c i'? nc i a s ρ a. r a i η v e s t i q a. r m a i s do su!

stracto de EGT. Nes!

• xaustivaaiente a especificidade substractos- (1 mM) foram incubados na presens infectadas com AcMNPV e x pe r i ê n c i as v á r i o s ça de meio extracelular derivado d« wt contendo actividade de eqt significativa. Como testemunhas, jbssrvada é devida a EGT, :él.L conjugação cada, um do·· não infectadas produ para assegurar que qualquei substractcs foi também incubado com meio de células ou infectadas com vEGTZ, as quais não podem zir EGT. A cada um das reacções foi adicionado 0,05 pC-i de 14

UDP-CU- Clglucose. Quaisquer compostos qu.e funcionem como substractos ds EGt serão conjugados· com glucose; eles podem ser detectados com devido è glucose estar marcada radioactivamente.

TABELA 3

Especificidade do substrato de EGT

Substrato

Não infectado (pmol de Glucose transferida)

Tipo selvagem (pmol de Glucose transferida)

Ácido p-aminobenzóico —

Bi 1 irrubina — — j Cloranfenicol — —

D.i.eti 1 sti 1 bestrol — —

Ecdisona — 155,,7

Π-Estradiol

Hidroxiecdisona — 87,,8

Hidroxiquinolina — —

Macisterona A — 87,8

-Mentol

Metilumbe r i f erol — — a-Naftol p-Nitrofenol — —

Fenolftaleina — —

Testosterona — — ) a-Tetra1c1

Os substratos foram incubados na presença de meio derivado de células adequadamente infectadas e Ο Θ5 p.Ci de UDF'—CLÍ—^{i t}CZlqlucoquan Cidades rjaHae Hja glucose transferida foram calculadas contagem por cintilação das regiões adequadas das placas de

Um outro controle é a adição de ácido UDP-CU- Clglucurónico a uma série separada da reacções com meio de células de células infectadas com wt para demonstrar que o ácido qlucu.rónico não á transferido por esta reacção. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 3. Cls únicos substratos identificados são ecdisona, 20-hidrcxiscdisona e macisterona A, todos eles são ecdisteróides. Não foi observada qualquer conjugação usando meio de células não infectadas ou infectadas com vEGTZ, confirmand;

que a actividade observada é devida à expressão de eqt Não se 1 4 observou, conjugação quando se usou ácidc» UDP-CU- Clg1ucurónico, demonstrando que EOT não transfere ácido glucurónico.

Exemplo V

Para demonstrar que outros baculovírus também contêm genes apresentando bomologia substancial com α gene eqt de AcMNPV, o DNA de OpMNPV foi isolado s digerido separadamente com as endonuc1eases de restrição EcoRI, BamHI ε Hind111. Estas enzimas cortam o DNA virai em vários fragmentos de diferentes tamanhos cuja posição no genoma de OpMNPV são já conhecidas

CLeisy et al. (1934) J. Viroi. 52:098). As hibridações Southern são efectuadas como descrito em T. Maniatis et al. (1932) supra. Removeu-se um fragmento interno do gene eqt de AcMNPV a partir do plasmídeo BCES.com as enzimas EcoRI e Xbal (ver Fig. 1). Este fragmenta foi marcado radioactivamente com ''Τ' e usado coma sonda para identificar quaisquer sequências relacionadas no genoma de OpMNPV. Nas condiçSes adequadas, como é entendido no campo, um a um outro fragmento de DNA que contenha sequências semelhantes ou idênticas a ele,

HSSlf de egt do AcMNPV deverá . ιqar-se :;uai;

fragmentos de

OpMNPVrta membrana de nylon qu.e contenha sequências de cionadas. A posição da sonda ligada pode ser v / i z ua1izada ílapor é

de

M, a

exposição da membrana a primeiro hibridada com filme de raios X. A sonda de eqt ϊ membrana de nylon em condições restrição baixa (cloreto de sódio 1 M, citrato de sódio 0,3 dextran-sul fato a 57, solu.ção de Denhardt 5x e 0,257 de SDS

37°C)- Isto permite que a sonda hibride com com sequências relativamente distanciadas. A restrição da hibridação é então aumentada per aumentos sucessivos, por subida da. temperatura de hibridação ou pela adição de formamida à solução de hibridação até se observarem bandas que hibridam especificamente. As condições de hibridação da Fig. 4 cloreto de sódio 1 M, citrato de sódio 0,3 M, dextran~sul f ato a 57, solução de Denhardt 5;< e 0,025 ,o_r

1avada horas. A membrana foi então cada em cloreto ue sódio citrato de sódio 0,1 M, 0,1 7 SAS a 68°C. A Fig. 4 mostra qua a sonda de eqt do AcMNPV se liga a fragmentos específicos do DNA de OpMNPV, nomeadamente ao fragmento EcoRI Eí, fragmento BamHI A e fragmentos HindIII N e S. Note-se que o gene egt de OpMNPV está de SDS a du.as vezes

ÓS C, durante 11 durante 15 min

M.

na mesma pu-. i ela tiva nu gtuuiiia ql iene ds AcMNP7 (Fig.

5). Protocolos semelhantes podem ?r aplicados na .den ti f icação de genes homólogos de eqt noutros entomcpatogénios. é óbvio que para sequências altamente divergentes, será necessário confirmar a actividade de EGT usando α método de ensaio descrito no Exemplo IV. Em segu.ida. uma análise de genética molecular do genoma será necessária para isolar o gene codificador da enzima EGT usando metodologia conhecida.

Gomo alternativa, o gene EST pode também ser encontrada noutros organismos usando o ensaio específico para a. actividade de UDP-g1ucosi1transfsrass de ecdisteróidss descrito no Exemplo IV. Este ensaio é usado para, identificar a enzima. durante a purificação por técnicas convencionais de bioquímica. Uma vez purificada determinou-se uma sequência de aminoácidos parcial da proteína EGT. Esta inf,armação foi usada -·ol igonu.c leotídica que foi então usada no genorna.

para looa.lizar o gene

EGT

Exemplo VI

Ds títulos de ecdisteróides na hemolinfa flutuam de modo cíclico para regular as mudas larvar-larvar e larvar-pupa e uma. vez que se suspeita, que a conjugação de glucose inactiva os Ecd isteróides CWarren et al . (1986) J. Liq. Chromt.ogr. 9:1757; Thompson et al . (1957) firch. Insect Biochem. Physiol, 4: 1 ; Thompson et al,. (1938) Arch. Insect Biochem. Physiol. 7:1575, έ provável que a expressão do gene eqt durante a. infecção pelo AcMNPV interrompa o processa de desenvolvimento normal do insecto infectado. Para demonstrar tal intervenção larvas de S. frugiper-

da no quarto instar de mu.da recente foram infectadas por injecção com AcMNPV wt ou vEGTZ e controladas diáriamente relativamente a quaisquer perturbações do seu desenvolvimento. Um grupo de larvas foi injectado com meio de cultura de tecidos como controle negativo. Os resultados desta experiência estão apresentados na Tabela 4 abaixo. Todas as larvas injectadas com meio de cultura de tecidos (infecção simulada) passam ao quinto instar oomo seria de esperar. Apenas uma de dezasseis larvas infectadas com vírus wt faz esta transição. Pelo contrário, :od<

as larvas infectadas com o mutante vEGTZ sofrem uma muda do quarto para instar. Assim, a expressão de eqt pelo AoMNPV wt clara o quinto especificamente inibe as mudas do hospedeiro. Ambos os grupos de larvas infectadas subsequentemente sucumbem à infecção virai, mostrando que a danificação de eqt não evita que vEGTZ mate o insecto huspedsi ro.

TABELA 4

Inibição das mudas através da infecção com AcMNF'V

Vírus	Mudas	Mortal idade
Infecção simulada	16	o
Tipo selvagem	1	16
vEGTZ	1 ά	16

j--Larvas de S. frugiperda no quarto instar foram injectadas 5 com 1 x IO pfu. de AcMNF‘V wt ou vEGTZ em 5 μΐ . As larvas com infecção simulada são injectadas com 5 j_il de meio de cultura de tecidos. Cada grupo inclui 16 larvas que foram mantidas com uma uieta artificial (R. L. Burton (1969) ARS publication, pp. 33-134), a 28°C com um ciclo de luziescuridão de 14:10. As larvas foram controladas diáriamente quanto às mudas e a mortalidade registada no dia 7.

Resultados semelhantes foram obtidos com larvas injectadas no inicio do quinto instar. Usando larvas do quinta instar racentemente mudado o tegumento nehuaia larva infectada com wt mostrou sinais de passagem à fase de pupa, enquanto a maioria das larvas infectadas com vESTZ apresentaram várias modificações do comportamento (paragem da ingestão de alimentos, excitação e fiação) carascterístico de uma muda larva-pupa eminente. No entanto, todas as larvas infectadas com vírus morreram antes de passarem a pupa. Estes dados mostram que a infecção por AcMNPV evita que as larvas dos insectos mudem o tegumento ou pupem» Ainda, os dados mostram gue esta interrupção do desenvolvimento dos insectos seja devida à expressão do gene eqt.

Exemplo VII

Os bioensaios in vivo de AcNNPV tipo selvagem (wt) e de vEGTZ revelam que a expressão do gene eqt prolonga o tempo que as larvas infectadas gastam a alimentar-se e que a destruição do gene eqt melhora as características do vírus como pesticida. Nestes estudos, as larvas de S. frugiperda foram injectadas com AcNNPV wt ou vEGTZ · no início do quarto instar. Para comparação larvas testemunha foram injectadas com meio de cultura de tecidos sem vírus. As larvas foram testadas diáriamente quanto ao aumento de peso, sinais de mudas ou de passagem a pupa, e mortalidade. 0 aumento médio diário de peso dos diferentes grupos de larvas, juntamente com a percentagem de mortalidade, está representado nas Figs 6 e 7 respectivamente. As larvas testemunhas apresentaram crescimento moderado durante os dois primeiros dias. Durante o segundo dia, todos passaram ao quinto instar. Depois cresceram dramáticamente durante mais dois dias antes de pararem de se alimentar em preparação para a fase de pupa. Apenas 1 de 16 larvas infectadas com AcMNPV tipo selvagem sofreu mudas e em seu lugar as larvas apresentaram um crescimento contínuo durante três dias após a infecção. Mesta fase, começaram a ficar enjoadas mas nenhuma larva morreu até ao dia 5. Todas as larvas infectadas oom AcNNPV wt morreram no dia 6. Pelo contrário todas as larvas infectadas com vEGTZ passam pela muda do quarto para o quinto instar e por este período e param de se alimentar. Isto é responsável pela ausência de crescimento do dia. 1 para o dia 2. Após as mudas, elas começam a alimentar-se mas começam a mostrar sinais de enjôo sd dia.

Elas começam a morrer 4 dias após a infecção e

estão todas mortas no dia 5. As larvas infectadas com uni derivado de AcMMPV sem um gene eqt funcional apresentam menor ingestão de alimentos e morrem mais rápidamente após a infecção do que as infectadas com o AcMNPV tipo selvagem.

Estes fenómenos são mesmo mais claramente observados após infecção de larvas no 53 instar íFiqs. 8 e 9).. Conforme esperado, as larvas testemunha apresentam crescimento considerável durante dois dias; antes de pararem de alimentar em preparação para a fase de pupa. Esta paragem da ingestão de alimentos é acompanhada de uma dramática perda de peso. As larvas infectadas com AcMNPV wt não apresentam sinais de tal paragem de ingestão de alimentos; elas continuam a alimentat-se e aumentam de peso durante mais dois dias antes de começarem a ficar enjoadas. A mortalidade só está, completa sete dias após infecção.

Em resumo, pode—se ver que as larvas infectadas com com vEGTZ tal como ss testemunhas, alimentam-se apenas durante os dois primeiros dias após infecção. Após este ponto, verifica-se uma ij r aiTiâ. t ú. o a p^erda de peso á medida que se prep^jaram para a fase de pupa. No entanto, nenhuma destas larvas entram na fase de pupa; elas apresentam sinais sinais de doença no dia 3 e estão todas mortas seis após infecção. Novamente, a infecção com vEGTZ edução da alimentação e morte antecipada.

Exemplo VIII rsmparou-se os efeitos da infecção com vEGTZ e AcMNPV wt em larvas de S. fruqiperda no primeiro instar e recentemente i 4“ co H ·-, ό contendo várias concentrações de cie

ΞΒΤ1 ou de AcMNPV

Ϊ j. L. ct corpos de inclusão poliédricos wt e controladas diáriamente

reiativamente à mortalidade. Nas Figs. 10 e 11 estão apresentados os resultados para duas doses separadas. Pode—se observar que, em ambas as doses, as larvas infectadas com vEGTZ apresentam considerável mortalidade substancialmente mais cedo do que as larvas infectadas com o vírus wt. Em geral, as larvas infectadas com com o vírus reccmbinante são mortas entre três e quatro dias mais cedo do que as larvas infectadas com wt. Este resultado proporciona mais apoio à ideia que os baculcvírus compreendendo genes eqt. inactivados funcionam melhor como pesticidas biológicos do que os baculcvírus tipo selvagemcom genes eqt intactos.

Exemplo IX

Para construir vírus recombinantes que expressem a hormona protoracicotrópica (PTTH), o gene PTTH foi clonado no plasmídeo· pEVmodXIV, plasmídeo este que está descrito no Pedido de Patente U.S. N9 ds Série 07/353,347, entregue em 17 de Maio, 1989, que aqui está incluido como referência. Este plasmídeo

ι n c 1 u i ifqu ã π u i. a a	a montan	te e a j usa
AcMNPV, o qual	medeia a	recombinaç
eχ pressáve1 par a o	vírus Eq	t . Um síti
colocado no sítio	habitual	da iniciaç
na, a jusante dc<	promotor	d a. po 1 i ed r i

tradução da poliedri-

·- » · 1 *»	Gene, 7O;3?	(19835).	□
renovido	do plasmíd·	eo pBc22k·	-Cl 9
Τ „ *	, (1990)) no	r digestão	c6m

(Kawakami et úe Bombvx mon il olence.

iindIII .

enzima de restrição Qs extremos coesivos Hind111 foram preenchidos com DNA-pol imerase íe T4 e o plasmídeo ;m seguida clivada com EcoPI. 0 sqmen to poliedrina contendo o gene PTTH foi clonado no plasmídeo através destes sítios.No plasmídeo resultante, pEVPTTH, o gene PTTH está situado imediatamente a jusante do promotor do promotor da.

mo d i f i cad o LS XIV.

Os víru.s recombinantes expressando PTTH foram obtidas por cotransfseção de células SF com pEVPTTH e com DNA de vEGTDEL. ou AcM?4PV wt. A recombinação entre as sequências delimitantes da poliedrina no DNA virai e as delimitantes do gene PTTH em pEVPTTHresulta na substituição do gene da poliedrina com PTTH. Os vírus em que esta recombinação tevelu.gar são identifiçados pelo seu fenótipo negetivo para a oclusão (Mil ler et al-, em Senetic Engineering,, Principies and Methods, Vol. 8, J. Setlow e A. Hollaender, eds. Plenum Press N.Y., 1986, pp. 277-298). Os respectivos vírus recombinantes foram designados vEST PTTH e vWTPTTH.

□ método para a produção de vírus recombinantes expressando a estearase da. hormona juvenil é semelhante. Primeiro, o gene da estearase da hormona juvenil de Heliothis virescens (Hanzlik et al., (1939) J. Biol. Chem. 234:12419) foi removido do plasmideo pJHElóS (Hammock et al . , (199Ô) Nature 244:458) por digestão com EcoPI e com ΚpnI . 0 plasmideo de trarisco 1 ocação pEV.wdXIV foi também cortado oom EcoRI e ΚρηI ε o fragmento contendo o gene da estearase da hormona juvenil foi. inserido entre estes sítios. pEVTHE inclui assim as sequências do gene da ploiedrina delimitantes do gene de estearase da. hormona juvenil. Os vírus recombinantes vEGT JHE e vWTJHE foram obtidos por cotransfecção ds pEVJHE com DNA de vEGTZ ou de AcMNPV wt, respectivamente, e despiste de placas negativas para a oclusão.

Pa.ra construir vírus recombinantes expressando hormona de eclosão, o gene da hormona, de eclosão de Nariduci foi removido do plasmideo pF5-3 (Horodyski ey al. (1939) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., Só :3123) por digestão com EcoRI s Hpal. pEVmodXIV foi clivado com ΚρηI, o extremo protuberante HpnI removido com DNA-po 1 imera.se de T4 contendo o e depois clivado com EcoRI. A gene da hormona de eclosão no plasmideo de transcolocação dá o pEVEH recombinante, no qual gene cia hormona de eclosão está colocado a jusante do promotor da. poliedrina modificado LSXIV. A cotransfecção deste plasmídeo com DNA de vEGTZ ou de vDA26Z permite o isolamento dos vírus recombinantes vEGT EH e vDA2óZEH, respectivamente. vDA26Z é um vírus recombinante com o gene 1 acZ de E. col i. inserido no gene DA26 (CPReiliy et al. 3„ Gen- Vi rol., no prelo). Desconhece-se a função do gene DA2ó e vDA2óZ é fenotipicamente tipo selvagem em relação às mudas. Devido à presença do gene 1acZ, os derivados de vDA26Z dão origem a placas azuis na presença de X-gal.

Exemplo X

Para testar os efeitos in vivo destes vírus recombinantes, as larvas de S. frugiperda foram injectadas com 2 x 10¹⁵ pfu de vEGTDEL, vEGT^_PTTH, vWTPTTH ou ambos vEGT~PTTH e _ cr vEGT JHE (1 x 10' pfu cada) no final do 32 instar ou no inicio do 42 instar. Na Tabela. Sestá apresentada a percentagem de mortalidade diária. Para todos os vírus EGT , os insectos infectados passam pelo 42instar e mostram deslizamento da cápsula da cabeça, o que .indica uma muda iminente, pelo dia 3. Após infecção por vEGT PTTH sózinho ou por vEGT PTTH e vEGT JHE em conjunto, a. expressão de PTTH faz com que os insectos infectados se tornem enjoados rápidamente e ao dia 4 observa-se mortalidade significaapresentam mortal idade considerável atá? ao dia. 5, esperado, os insectos infectados com vWTPTTH nunca

Conforme sinais de muda. para, o 52 instar. Não se observou deslizamento da capsuia da os insectos não apresentam mortalidade considerável até ao dia 6. A expressão de doPTTH na ausência de EGT adianta a altura da morte após infecção em 1 dia. comparada com vEGTDEL. Estes dados demonstram o melhoramento das propriedades pesticidas dos baculovírus através da expressão de genes que

afectam as mudas dos insectos e mostram que eqtdeve ser do para que tais estratégias sejam eficazes.

TABELA % de Mortalidade

Vírus

Dia 3

D i a 5 D i a 6 D i a

Dia 8 vESTDEL

63,2 90,9

90, vWTPTTH

13,0 39,1

Έ.ΕΤ PTTH 4,

87,5 100,0 ^?Ε8Ί PTTH

Έ8Τ JHE

Exemplo XI ibtenção ds vírus positiv

US US. f -1 S. UL.

sais expressam proteínas heteróloqas que afectam o desenvolvimento dos

i.

uunstruiu-se em dois passos um vírus negativo para a oclusão EbT expressando β—galactosidase. 0 gene IacZ de Ε. o o1i. codificador t r a η s· c o 1 oc adescrito no Pedido de Patente LLS. de Série ma β-galactosidase,

07/353,847, entregue em 29 de Junho, 1989. pSynVI inclui sequênci as a ffiuntaiits e a jusants do gene da poliedrina de AcMNPV, com um sítio de clonagem múltipla situado imediatamente a jusante de um promotor sintético da poliedrina modificado. 0 gene 1acZ foi removido do plasmídeo pSKSl©5 (Casadaban et al. (1983) supra ) por corte com PstI. □ extrema pratuberante PstI foi removido com nuclease de Phaseolus aureus («mung bean») e o plasmídeo cortado com Ss111. ρ-SynVI foi clivado com EcoRV e Sst.II e o gene 1 acZ clonado nestes sítios. 0 plasmídeo resultante foi designado pSynVI gal e contem o gene 1acZ imediatamente a jusante do promotor sintético da poliedrina modificado. pSynVI

') gal foi cotransí ec tado para células SF com DNA de vESTDEL e isolaram-se as placas negativas para a oclusão expressando fl-ga 1 ac tcsidase, dando o vírus vEGT SynVI gal.

Para construir um vírus recombinante positivo para oclusão que expresse PTTH, o gene PTTH foi clonado no vector transcolocação pSpXIVVI⁺X3.

de

Para construir pSpXIVVI⁺X3, construiu.~se . + pn.

ro um no plasmídeo intermediária pSpXIVVI . pSpLSXIVVI CAT Pedido de Patente dos Estados Unidos NQ de Série 07/353,847, en egi.

em de Junho de 1989) foi cortado com Eq1IIe os extremos preenchidos com DNA-polimerase. D plasmídeo pSynVI+wtp ,847, entregue sm 29 de Junho, 1989) ! Τ' e SacI e purificada fr ag men to pequ en o EccRVOt5r J_ tc* cortado com EcoRV 0s f ra g m en to s iL i dos dois plasntxdeos foram ligados e seleccionado pSpXIVVI+. 0 plasmídeo pSpXIWI+· é igual a pSPLSXI WI+CAT excepto o sítio de clonagem múltipla desde o sítio Bg111 até ao sítio Sac I ser o mesmo do pSynVI+wtp. Para construir o sítio de clonagem múltipla #3 (descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos NQ de Série 07/353,347, entregue em 29 de Junho de 1939) foi inserido entre os sítios EcoR I — Sac I de pSpXIVVI+. A sequência do sítio de

clonagem múltipla em pSPX IWI+X3 desde o sítio BgJ^I I até ao

AGATCATC gaattctcgag ctgcagatct gtcgacccggg aataaa gagctc EcoRV/Bq1I EcoRI-Xhol Pst.I-Bql I Sal I-SmaI poli A Saci

Este plasmideo inclui um gene intacto da poliedrina. sob o controlede um promotor da poliedrina tipo selvagem. A montante do gene da ploiedrina e na orientação oposta está um promotor sintético de poliedrina. modificado. Colocou-se um sítio de clonagem múltipla para permitir a inserção de genes a serem promotor sintético da poliedrina removido do plasmideo pBc22K-C-19 (Kwakami. et al. (1990) supra) por digestão oom Hind III. Q extremo protubera.n te HindIII foi preenchido com DNA-polimerase de T4 e o plasmideo clivado com EcoRI, pSpXIWI X.3 foi cortado com EcoRI e SmaI e o gene PTTH foi clonado nestes sítios, dando o plasmideo pSpPTTH. Neste plasmideo, o gene PTTH está a. jusante do promotor expressos sob o controle do modificado. 0 gene PTTH foi >intético da poliedrina modificai o qual está adjacente e orientação oposta ao ao promotor e sequências codificadoras da.

poliedrina tipo selvagem. Qs genes PTTH delimitados por sequências a montante e Ρ o 1 c e da poliedrina a jusante do gene da pSpPTTH foi cotransfectado para células SF com DNA de '--EGT SynVI ga.l „ A, recombinação entre as sequências a montante e a jusante oa poliedrina no DNA virai e as delimitantes dos genes PT1H e da poliedrina no pSpPTTH resulta na. substituição do gene 1acZ ce vEGT SynVI qal com os genes PTTH e da poliedrina do pSpPTTH. 0 vírus recombinante vEGT SpPTTH foi identificado por u.m * , ι σ tipo Ou i Ubáo pos i 11 vo , fl g a i a o tosi d sse n eq a f. X vo .

Para construir um vírus oclusão-positivo expressando a estearase da hormona juvenil, o gene da esteara.se da hormona juvenil foi removido do plasmídeo pJHElòB (Hammock et al . (1.990) supra por diqestão com ΚρηI, remoção do extremo protuberante com DNA-polimerase de T4 e digestão com EcoRI. 0 gene da estearase da hormona juvenil foi então clonado no plasmídeo pSpXIWI >:3 o qual tinha sido clivado com EcoRI e SmaI. 0 plasmídeo resultante, pSp-jHE, foi cotransf ectado com DNA de vEGT SynVI gal para dar origem ao vírus recombinante vEGT SpJHE. Este vírus oc1usão-posi— tivoexpressa a estearase da hormona juvenil sob □ controle do promotor sintético do gene da. poliedrina modificado.

De um modo semelhante, o gene da hormona de eclosão foi removido do plasmídeo pF5-3 (Horodyski et al. (1.990) su.pra) por digestão com EcoRI e Hpal e clonado em pSpXIVVI⁺X3 o qual foi cortado com EcoRI a SmaI. 0 plasmídeo resultante, pSpEH, foi cotransfectado com DNA de vEGT SynVI gal para gerar o vírus recombinante vEGT SpEH.

Qs vírus EST oclusão-positivas que foram ainda genéticamente modificados de modo a expressarem uma proteína que afecte as mudas (uma hormona peptídica de insectos ou uma encima que inactive hormonas de insectos) reduzirá a ingestão de alimentos e provocará uma morte mais rápida das larvas de irtsecto infectadas do que os baculovírus wt ou baculovírus genéticamente alterados apenas para inactivar o gene eqt.

Devido aos apentes de controle de insectos; do Exemplo ç:Ses eficazes como insecticidas e aceitáveis para a agricultura que possam ser aplicadas em culturas infectadas. A ingestão de tais partículas virais oclusas resulta, na propagação daqueles impo alastramento do aqente de c on trr relata podem tamento

-eivininsectos. A infecção protecção das culturas relativamente às pragas de insectos,

Deverá ser entendido que a descrição anterior apenas as realizações preferidas do presente invento e que ser feitas numerosas modificações ou alterações sem afasl do espírito e âmbito do invento conforme estabelecido nas r dicações apensas.

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES lê. - Agente de controlo de insectos, caracterizado por compreender um parasita de insectos em que está inactivado um gene natural codificador de uma enzima de modificação de ecdisteróide.
2. 2ê. - Agente de controlo de insectos de acordo com a. reivindicação 1, caracterizada por o referida gene ser um gene eaí.·
3. 3®. - Agente de controlo de insectos de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por c? referido parasita de insecto ser um vírus de insecto.
4. 4ê. - Agente de controlo de insectos de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o referido vírus de insectos s e r u m bac u. 1 ο ν í r u s .
5. 5®. - Agente de controlo de insectos de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido baculovírus ser um vírus da poliedrose nuclear.

   - Agente de controlo de insectos de acordo com a 5, caracterizada por o referido vírus da poliedrose seleccionado do grupo constituído por vírus da. clear de ftutoqrapha californica e vírus da poliede Orqyia pseu d o t su g a t a..

   reivindicação nuclear ser poliedrose nu drose nuclear

   7®. - Agente de controlo de insectos de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido vírus de insectos )

   da U DF' - g 1 u c o s i 1 vEGTDEL.

   compreendendo um gene inactivada codificador transferase de ecdisteróides ssr um dos vEGTZ e

   8ã. — Agente de controlo de insectos de acordo com a reivindicação 3 cujo vírus de insectos foi ainda modificado pela inserção de pelo menos um gene heterólogo, caracterizado por o(s) referidoís) gensís) heterólogo(s) seriem) expressável(eis) em células de insectos infectadas cont o referido vírus e, por o(s) referido(s) geneís) cadificarsm(m) uma proteína que afecta a ec1osão.

   9ã. - Agente de controlo de insectos de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido gene heterólogo ser seleccionado do grupo de genes codificadores de proteínas consistindo em hormona protoracicotrópica, hormona da eclosão e estearase da hormona juvenil.

   10ã. - Agente de controlo de insectos de acordo com a. reivindicação 9, caracterizado por o referido gene heterólogo ser o da hormona, protorac icotrópica.

   Ilã. - Agente de controlo de inoeo tos de acordo com a reivindicação 10 , caracterizado por ser vEG^1-SpPTTH. 12ã. - Agente de controlo de insectos de acordo com a reivindicação 1Θ , caracterizado po r o referido qen e heterólogo •ser o da hormona da eclosão. 13ã. - Agente de controlo de ι~isec tos de a c o r d o c. o m a r e i v i n d i. c a ção 12 , caracterizado por ::· & T vEG' SpEH.

   14â. - Agente de controlo de insectos de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido gene heterólogo ser o da estears.se da hormona juvenil.

   15â. - Agente de controlo de insectos de acordo com a reivindicação 14, carac ter.içado por ser vEu* SpJHE.

   lóâ» - Método para a produção de um agents de controlo de insectos melhorado, caracterizado por compreender os passos Hf.- ) <a) isolamento de um gene que codifica uma proteína que afecta a eclosão; e (b) inserção do referido gene nu.m organismo que não expressa naturalmente o referido gene.

   17â. - Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o referido gene codificar uma proteína seleccionada a partir do grupo de proteínas que afectam a eclosão consistindo em UDP-glucosiItransferase de ecdisteróides, hormona protoracicotrópica, hormona, da eclosão e estearase da hormona juvenil.

   13â. - Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o referido organismo ser um vírus de insectos que não expressa um gene eqt.

   19â.

   por o

   - Método de acordo com a reivindicação referido gene ser de um baculovírus.

   ÍS.

   carac20ê. - Método de acordo com a reivindicação 19, terizado por o referido baculovírus ser um vírus da pc caracnuc1ear )

   215. - Método de acordo com a reivindicação 2Θ, caracterizado por o referido vírus da poliedrose nuclear ser seleccionado a partir do grupo de vírus de poliedroses nucleares constituído por vírus da poliedrose nuclear de Autoqrapha californica e vírus da poliedrose nuclear de Orqyia pseu.dotsuqata.

   22ã. - Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o referido organismo ser seleccionado a partir do grupo constituído por parasitas fitopatogénicas colonizadoras de génicos e plantas.

   de insectos, bactérias não plantas, fungos entomopato235. - Método para a produção de um agente melhorado de controlo de insectos, caracterizado por compreender o passo de inactivação ds um gene codificador de uma enzima de modificação de eedisteróides num organismo, o referido gene sendo uma parte natural do genoma do referido organismo.

   245.

   terizado por o eedisteróides.

   terizado por o izado por

   Método de acordo com a reivindicação tu, caracreferido gene codificar UDP-g 1 ucosi 1 transferase de

   - Método de acordo com a reivindicação 24, referido organismo ser um vírus de insecto.

   :arac- Método de acordo com a reivindicação 25, caracreferido vírus de insecto ser um baculovírus.

   275.. - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por o referido baculovírus ser um vírus da.

   poliedrose nuc1sar„

   2Sã. - Método de acordo com a reivindicação 23, carac- terizado por um derivado dc> vírus da poliedrose nuclear de Autoqrapha californica com uma deleção que inactiva o gene codificador de UL'F'~q 1 ucosi 1 transf erase de ecdisteróides ser isolado após passagem seriada do referido vírus em células de insectos.

   oça _n terizado por o nado do grupo

   Autoqrapha californica e vírus da poliedrose nuclear de Grqyia pseudotsugata.

   30sí. - Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por o referido vírus da poliedrose nuclear ser um dos vEGTZ e vEGTDEL.

   Método de acordo com a reivindicação 2/, caracreferido vírus da. poliedrose nuclear ser seleccioconstituido por vírus da poliedrose nuclear de

   31â. - Método ds acordo terizado por compreender ainda o referido organismo pela inserção vel numa célula de insecto, gene que afecta a eclosão.

   com a reivindicação 23, Ctsracpasso de alteração genética do e um gene heterólogo expressáeste que codifica uma proteína

   32â·. - Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o referido segundo gene ssr seleccionado do grupo constituído pelos genes codificadores de hormona protoracicotró— piua, iiurniuna da trulu^ao e :ear a

   ΓίΓιοΓ j uven11.

   zado um ag insec s a r

   33â. - Método para o controlo de um insecto, caracteripor compreender o passo de exposição do referido insecto a ente de controlo de insectos, agente esse de controlo de tos que foi modificado por engenharia genética para expresum gene codificador de uma enzima de modificação de ecdisteróides, em que a referida enzima afecta. adversamente ref er:

   345,. - Método para o controlo de insectos, caracteriza— do por compreender o passo de exposição do insecto a um aqente dc-? controlo de insectos contendo um gene codificador de uma enzima de mod i f icação Ó ‘ t’L disteróides, em que o referido gene foi ina.c ti vado.

   35.5. - Método de acorda com a reivindicação 34, carac- ) terizado por o referido gene codificar UDF’-g lucosi 1 transf erase de ecdisteróides.

   365. - Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por o referido agente de contraio de insectos ser um vírus de insectos.

   375. - Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por o referido vírus de insectos ser um baculovírus.

   385. - Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por o referido vírus da poliedrose nuclear ser seleccionado do grupo constituido por vírus da poliedrose nuclear de

   -----Au tog ranha cal i fprnica e vírus da poliedrose nuclear de Cirqy.ia

   395. — Método cie acordo com a rei vindicação 38, carac — srizado por o referido gene ter sido inactivado pela inserção de um gene beterólogo espressâve!

   nu.ma. célula de in< com o referida vírus, gene beterólogo esse qu>: proteína que afecta a eclosão.

   :to infectada codifica uma

   40â.

   Método de acordo com a reivindicação 39, carac— terizado por o referido segundo gene seleccionado a partir do qrupo constituido pelos penes codificadores de hormona prctoracicotrópica, hormona da eclosão e estearase da hormona juvenil, genes esses que são expressáveis em células de insecto infectadas com o referido vírus.

   4íê. - Composição insecticida caracterizada. por compreender, um agente de controlo de insectos e um veículo adequado para a agricultura, tendo o referido agente de controlo de insectos sido genéticamente modificado de modo a inactivar um gene natural codificador de UDF'-g 1 ucosi 1 transferase de ecdisteróides.

   42â. - Composição insecticida de acordo com a reivindicação 41, caracterizada por compreender um agente de controlo cie insectos que foi modificado de modo a. expressar um gene heterólogo codificador de uma proteína que afecta a eclosão.

   43â. - Agente de controlo de insectos de acordo com reivindicação 41 ou 42, caracterizado por o referido agente controlo de insectos ser um vírus de insectos.

   de

   44;

   Agente de controla de insectos de acordo com reivindi ão 43, caracterizado por o vírus de insecto ser um jacu, i ovirus.

   45â. - Agente de controlo de insectos de acordo com a ·, caracterizado por o referido baculovírus ser u;

   í r u s d a ρ o1i ed r os ε n u c 1 e a r .

   4óè. - Agente da poliedrose nuclear de acordo com reivindicação 45, caracterizado por o referido vírus da poliedrose nuclear ser seleccionado a partir do grupo constituído por Au toq rapina cal item ica e Qrqyia pseudo tsu cata .

   47ê. - Molécula de DNA recombinante, caracterizada por compreender uma. sequência de nucleotídeos de uin gene codificador de UDF'~q 1 ucosi 1 transi erase de ecdisteróides.

   48®. - Molécula de DMA recombinante de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por a referida sequência ser a sequência da. Tabela 1 :

   ')

   1 GTCG xca CC CTT C TC COTAT a ATTCC AC AC Τ A AC ATG TTGC C TTTG A Λ C TTG AC CT C G ATTG TGT ΤΛ ATT TTTCC CT AT

   8 1 AAAAAGGTC ACC CTTT A AA ATTTGTT AC AT A ATC A A ATT AC C AGT AC AGT T ATTCGG Τ T TG AAG C A A A ATG ACT ATT C TC <· q t · M T l L

   1 6 l TGCTGGCTTGC ACTGCTGTCTACGCTTACTGCTGTAAATGCGGCCAATAT ATTC.GCCGTGTTTCCTACGCC AG CTT AC AG

   CWLALLSTLTAVHAAHJ l a V ( Ρ Τ Ρ A Y S

   2 4 1 CC ACC AT AT AG TG T AC A AAGTGTAT ATTG A AG CCCTTG CCGA A A A ATGT C AC AACGTT ACGGTCGT C AAG CC CA AACTG T

   HHIVYKVYICALACKCKNVTVVKPKLF

   3 21 TTG CGT ATTC AACT A A A ACTTATTGCGGT A AT ATC A CGG AA ATT A ATG C C GA C ATC TC TGTTG AG CA AT AC A AAA AAC Τ A

   AYSTKTYCGNITEIHAOMSVEQYKKL

   4 01 GTGG CG A ATTCG G C A ATGTTT AG AA AGCG CGG AGTG GTGTCCG AT AC AG A C ACGGT AAC C G C CGCT AAC T ACCTAGG C Τ T

   VANS AMrRKRGVVSDTDTVTAAN Y LG L 4 01 GATTCAAATGTTCAAAGACCAGTTTGACAATATCAACGTGCGCAATCTCATTGCCAACAACCAGACGTTTGATTTAGTCG

   IEKF K OQFDN1NVRNLI ANHQTF DLVV 561 TCGTGGAAGCGTTTGCCGATTATGCGTTGGTGTTTGGTCACTTGTACGATCCGCCGCCCGTAATTCAAATCGCGCCTGGC veafkdyalvfghlydpapviqi apg
6. 6 4 1 TACGGTTTCGCGG AAAACTTTG ACACGGTCGGCGCCGTGGCGCGGC ACCCCCTCC AC C ATCCT AACATTTGGCGC AG C AA

   YGt-AENFOTMGAVARHPVHHPNIWRSN 721 TTTCGACG ACACGG AGG C AA ACGTG ATG ACGC A A ATG CGTTTG Τ ΛΤ Λ AAG A A TT ΤΛ A Λ Λ TT TTGG C C Λ A C Λ TGTCC A A CG

   F D Ο Τ Ε A Η V η T C f*. Ρ I » L I K : t. A H 14 S H A
7. 8 01 CGTTG CTC A A AC A AC AG TTTGG AC C C A AC AC AC CG A C A ATTC A Λ A /· Λ^Γ' T ^rA Λ ^r Λ /· ' ' T ^r· ^r Λ A T TG C TTTTG C T A A AC

   LLKQQFGINTPTICALHUAVOLLLLN 8 11 CTGCATCCCATATTTGACAACAACCCACCCGTGCCGCCCAGCGTGCAGTATCTTGGCGGAGGAATCCATCTTCTAAAG AG

   L Η P I F DNNRFVFPSVQY LGGG I H L V K S 961 CGCGCCGTTG ACCAAATTAAGTCCGGTCATCAACGCGCAAATG AACAAGTCAAAAAGCGGAACGATTTACGTAAGTTTTQ

   APLTKLSFVINAQMNKSKSGTIYVSFG 1041 GGTCG AGC ATTG AC ACCAAATCGTTTGCAAACG AGTTTCTTT AC ATGTTA ATC AATACGTTC AA AACGTTGG ATAATT AC

   SSI DT RSrANEFLYMLINTrKTLDNY 1121 accatattatggaaaattgacgaccaagtagtaaaaaacataaccttgcccgccaacgtaatcacgcaaaattggtttaa

   Τ I L W K I DDEVVKNITLPANV I TQNWF N 1201 TC A ACGCGCCGTGCTGCGTC ATA AAA A AATGCCGGCGTTTATTACG CA AGGCGG AC TACA ATC GAGCG ACC AGG CCTTCG

   QRAVLRHKKMAAFITQGGLQSSDEALE 128 1 A AG CCGGG AT AC CC ATGG TGTGTCTG CCC ATG ATGGGCG AC C AGTT TT AC C ATG CG C AC A A ATT AC AG C A ACTCG G CGT A

   AGI PMVCLPMMGDQFYHAHKLQQLGV 1161 GC CCG CG CCTTGC AC ACTGTT ACCGTTTCC AGCG ATC A ACT A C T AG TGG CG ATA A AC G AC G TGTTGTTT A ACGC G CCT AC

   ARALDTVTVSSDQLLVAl NOVLFNAPT

   14 4 1 CT AC A AAA AAC AC ATCGC CG AGTT AT ATGCGCTC ATC A ATC A TG AT A AAG C A A CG Τ Τ T C CG C CTC T AG AT A AAG C C AT C A

   YKKHMAELYALINHDKATFPPLDKAI K

   15 21 A ATTC AC AG A ACG CG Τ A ATTCG AT AT AGAC ATG AC ATC AGTCG T C A ATTGT ATT C AT Τ Λ ΛΛ Λ AC ΑΛ C AG C TG C C A ATGT A

   PTERVIRYRHDISRQI. yslfttaanv 160 1 CCGTATTCAAATTACTACATGTATAAATCTCTGTTTTCTATTCTAATGAATCactTAA». AI ACTTTTAAT TACGTCAATA

   Ρ Y 5 Ν Y YMYKSVFSIVMN II LT HF 1681 A ATGTT ATTC AC C ATT ATTT ACCTGGTTTTTTTG AG AGGGGC Τ T TGTG CG ACTGCGf ac TTC AGCCTTT AT A A ACGCTC

   1761 ACC AACC A AAG C AG GTC ATT ATTG TGCC AGG ACGTT C A A A aproximadamente desde o nucleotídeo 149 até ao nucleotídeo 16:70 ou um seu equivalente funcional.

   49é. - Vírus de insectos, caracterizado por ser preparada pelo método de acordo com a reivindicação 25.

   SO®. - Método para a preparação de vEGTZ, caracterizado por compreender os passos des

   a) digestão de pUCBCRsB com as endonu.c leases de restrição EcoRI e XbaI e purificação de um fragmento grande resultante;

   b) remoção do gene lacZ do pSKS104 com as endonucleases de restrição EcoRI e fihalII;

   c) ligação do referido gene 1acZ com o referido fragmenta grande EcoRI-Xbal do pUCBCRsB após tornar cerse o extremo Xbal com DNA-polimerase de T4 para formar pEGTZ;

   d) cotransfecção de células SF com pEGTZ e AcMNPV;

   e) identificação de recombinantes virais por expressão de β-çalactosidase; e

   f) purificação do referido vírus recombinante, o qual é vEGTZ.

   olé. Método para a preparaçao de vEóTDEL. zado por compreender os passos de:

   caracterí61 fO o

   a) digestão de plJCBCPsB com as endonucleases de restrição EcoRI e Xbal e purificação de um fragmento grande resultante;

   , , tornar cerses ambos os extremos do referido

   b) fragmento grande de DNA do passo a);

   c) ligação do referido fragmento grande de DNA do passo (b);

   d) cotransfecção de células SF com pEGTDEL e vEGTZ para permitir recombinação homóloga;

   e) identificação de vEGTDEL recombinante pele? ausência de expressão de β-galactosidase; e

   f) purificação do referido vEGTDEL recombinante.

   52â. - UDF‘-g lucosi 1 transf erase de ecdisteróides recombinante, caracterizada por compreender a sequência de aminoácidos da Tabela 1, anteriormente apresentada, ou uma UDP-glucosi1transfera.se de ecdisteróides tendo uma. sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70% de homologia.

   53®. — UDP—g1ucosi1transferase de ecdisteróides substancia 1 men te pura, caracterizada por ter uma. sequência de aminoácidos da Tabela 1, anteriormente apresentada, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70% de homologia.

   do por róides

   54â. - Anticorpo monoclonal ou policlonal, caracteriza ser específico para a UDF'-glucosi 1 transferase de ecdiste de acordo com a reivindicação 53.