LT3807B - Insect control agents, process for preparing thereof, method of insects control, insecticidal composition, recombinant dna molecule, insect's virus, process for preparing viruses, proteines - Google Patents

Insect control agents, process for preparing thereof, method of insects control, insecticidal composition, recombinant dna molecule, insect's virus, process for preparing viruses, proteines Download PDF

Info

Publication number
LT3807B
LT3807B LTIP1581A LTIP1581A LT3807B LT 3807 B LT3807 B LT 3807B LT IP1581 A LTIP1581 A LT IP1581A LT IP1581 A LTIP1581 A LT IP1581A LT 3807 B LT3807 B LT 3807B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
insect
gene
virus
agent
egt
Prior art date
Application number
LTIP1581A
Other languages
English (en)
Inventor
Lois K Miller
David R O'reilly
Original Assignee
Univ Georgia Res Found
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Georgia Res Found filed Critical Univ Georgia Res Found
Publication of LTIP1581A publication Critical patent/LTIP1581A/xx
Publication of LT3807B publication Critical patent/LT3807B/lt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Prostheses (AREA)

Description

Siūlomas išradimas susijęs su vabzdžių-kenkėjų pagerintos biologinės kontrolės būdais ir kompozicijomis. Imant siauriau, šis išradimas susijęs su lazdelės pavidalo geno ir šio geno produkto, kuris yra efektyvus reguliuojant vabzdžių augimą ir vystymąsi, panaudojimu. Šis išradimas taip pat susijęs su genetiškai pakeistu lazdelės pavidalo virusu ir kitais vabzdžių kontrolės agentais, kurie nepalankiai paveikia infekuotų vabzdžių-kenkėjų vystymąsi.
Išradimo prielaidos
Susidomėjmą vabzdžių-kenkėjų biologine kontrole apsprendžia tradicinių cheminių pesticidų trūkumai. Paprastai cheminiai pesticidai paveikia ir naudingas ir nenaudingas rūšis. Yra tendencija, kad vabzdžiai-kenkėj ai įgyja atsparumą panašiems chemikalams, tuo būdu greitai gali išsivystyti atsparių tokiems pesticidams vabzdžių populiacija. Dar daugiau, cheminių medžiagų liekanos kenkia aplinkai ir potencialiai žmonių sveikatai. Biologinė kontrolė yr.a alternatyvus vabzdžių kontrolės būdas, leidžiantis sumažinti priklausomybę nuo cheminių pesticidų.
Pagrindinė biologinės kontrolės strategija apima panaudojimą gamtoje sutinkamų organizmų, kurie yra patogeniški vabzdžiams (entomopatogenai), ir auginimą kultūrų, atsparesnių vabzdžiams-kenkėjams. Šio išradimo sprendimo traktavimas apima identifikavimą ir charakterizavimą vabzdžių genų ir genų produktų, kurie gali tarnauti tinkama baze vabzdžių kontrolės agentams, identifikavimą ir eksploatavimą anksčiau nenaudotų mikroorganizmų (prie to taip pat priklauso gamtoje egzistuojančių nepatogeninių mikroorganizmų modifikavimas, norint paversti juos patogeniniais vabzdžių atžvilgiu), šiuo metu naudojamų entomopatogenų modifikavimą ir pagerinimą, otaip pat sukūrimą genų inžinerijos metoLT 3807 B dais kultūrų, kurios yra atsparesnės vabzdžiams-kenkėj ams.
Eutomopatogenams, pasiūlytiems kaip biologiniai pesticidai, priklauso virusai, sukeliantys natūralias epizootijas vabzdžių populiacijose. Lazdelių pavidalo virusai (bakulevirusai) sudaro didelę grupę virusų, infekuojančių tik naruotakojus vabzdžius (Miller Z.K. /1981/, Genetic Engineering in the Plant Sciences, N. Panopoulous (ed) Praeger Pabl., New York, pp. 203-224; Carstens (1980) Trends in Biochemical Science 52: 107110; Harrapf Payne (1979) Advances in Virus Research. Vol. 25, Zawber et ai., (eds) Academic Press N. Y. pp. 273-355). Daugelis bakulevirusų infekuoja vabzdžius, kurie yra pramonei svarbių žemės ūkio ir miškų kultūrų kenkėjai. Tokie bakulevirusai yra potencialiai vertingi biologinės kontrolės agentai (JAV gamtos apsaugos agentūra. U.S. Environment Protection Agency), kaip insektidų panaudojimui, užregistravo keturis lazdelių pavidalo virusus. Vienas iš bakulevirusų, kaip biologinių pesticidų, privalumų yra jų specifiškumas vabzdžio-šeimininko atžvilgiu. Ne tik bakulevirusai, kaip grupė, infekuoja tik nariuotakojus, tačiau taip pat ir individualus lazdelės pavidalo viruso štamas infekuoja tik vieną ar kelias vabzdžių rūšis.Tuo būdu jie nėra pavojingi nei aplinkai, nei žmogui, ir gali būti naudojami, nekenkiant naudingų rūsių vabzdžiams.
Bakulevirusų grupė apima branduolinės poliedrozės virusų (BPV), branduolinės granuliozės virusų (GV) ir lazdelės formų virusų, nesudarančių įsiterpimo kūnų, pogrupius. Lazdelės formos virusų okliuduojančiose formose virjonai (apgaubti apvalkalu nukleokapsidai) yra kristalinės baltyminės matricos viduje. Tokia struktūra, taip vadinamas įsiterpimo kūnas arba įtaškytas kūnas - tai viruso radimo gamtoje forma, kuri sąlygoja infekcijos perdavimą organizmui nuo organizmo. IšskirLT 3807 B tinis BPV virusų bruožas yra tai, kad kiekviename įsiterpimo kūne yra daug virjonų. BPV-virusų įsiterpimo kūnai yra santykiniai dideli (iki 5 mikrometrų) . GVvirusų įsiterpimo kūnai yra mažesni ir turi po vieną virjoną. Abiejų formų įsiterpimo kūnų kristalinė baltyminė matrica daugiausia yra sudaryta iš vieno polipeptido nuo 25000 iki 33000 daltonų, vadinamo poliedrinu arba granulinu. Neokliuduoj ančių formų lazdelės pavidalo virusai negamina poliedrino arba granulino baltymus ir nesudaro įsiterpimo kūnų.
Gamtoje infekcija inicijuojama, kai vabzdys ryja lazdelių pavidalo virusais užterštą maistą, dažniausiai įsiterpimo kūnų pavidale. Vabzdžio vidurinio žarnyno šarminėje terpėje įsiterpimo kūnai disocijuoja, išskirdami atskiras virusines daleles, kurios po to patenka į žarnyno sieneles dengiančias epitelines ląsteles. Ląstelės šeimininko viduje lazdelės pavidalo virusas migruoja į branduolį, kur įvyksta replikacija. Pradžioje infekuotoje ląstelėje taip vadinamų ankstyvųjų genų sintezuojami kai kurie specifiniai virusiniai baltymai transkripcijos ir transliacijos būdu. Be kitų funkcijų, šie baltymai yra būtini virusinės DNR replikacijai, kuri prasideda po 4-6 valandų po viruso patekimo į ląstelę. Virusinės DNR intensyvi replikacija tęsiasi maždaug 12 valandų po užsikrėtimo (post infektion=pi). Maždaug po 8-10 valandų pi infekuota ląstelė pagamina didelius kiekius taip vadinamų vėlyvųjų virusinių genų produktų. Jiems priklauso nukleokapsido, supančio virusinę DNR dukterinių virusinių dalelių susidarymo proceso metu, komponentai. Dukterinės virusinės dalelės pradeda susidaryti maždaug po 12 valandų pi. Pradžioje dukteriniai virusai migruoja prie ląstelės membranos, kur, įšėję į ląstelės paviršių, įgyja apvalkalą. Tokios rūšies neokliuduotas virusas po to gali infekuoti kitas vabzdžio-šeimininko ląsteles. Poliedrino sintezė prasideda po 12-18 valandų po užsikrėtimo ir po 24 valandų pi ji pasiekia labai aukštą lygi- Tuo metu stebimas iš ląstelės išėjusių virusinių dalelių skaičiaus sumažėjimas, o po to dukterinis virusas sudaro įsiterpimo kūnus. Įsiterpimo kūnų susidarymas tęsiasi iki ląstelės mirties arba dalinimosi. Kai kurie lazdelės pavidalo virusai infekuoja visus vabzdžio-šeimininko audinius, tuo būdu, pasibaigus infekcijos vystymosi procesui, visas vabzdys pavirsta skysčiu, išsiskiriant dideliam įsiterpimo kūnų kiekiui, kurie perneša infekciją kitiems individams. (Apžvalga pateikta The Biology of Baculeviruses, vol. I and II, Granados and Federici (eds), CRS Press, Boca Raton, Florida, 1986).
Vienas iš esminių lazdelės formos virusų, kaip pesticidų, panaudojimo trūkumų yra ilgas laiko tarpas momento, kai vabzdys įryja virusą, ir kai miršta. Tuo metu kenkėjas maitinasi ir kankia derliui. Kadangi mažai įtikėtina, kai šeimininkas bers pesticidus iki to momento, kad užkrėtimas nepasidarys akivaizdžiai matomu, tai pagrindiniu dalyku turėtų būti vabzdžio maitinimosi laiko sumažinimas iki minimumo.
Jei ko reikia, tai biolaginio pesticido, kuris sumažintų vabzdžio maitinimosi apimtį iki jo mirties. Pirmenybę turi biologinis pesticidas, kadangi aplinkai jis yra mažiau kenksmingas už cheminį. Taip pat pageidautina, kad vabzdys mirtų greičiau. Geno (genų) panaudojimas, kurie koduoja baltymo (baltymų), kontroliuojančių vabzdžių vystymąsi, susidarymą, ir jų įvedimas į įvairius organizmus leis pagerinti biologinę vabzdžių-kenkėjų kontrolę.
Išradimo esmė
Šis išradimas apibūdina lazdelės pavidalo viruso geną ir šio geno produktą, įtakojantį vabzdžių augimą, vystymąsį ir elgesį. Šis išradimas užtikrina šio geno ir jo produkto panaudojimo būdus, o taip pat šio geno arba jo produkto inaktyvavimo būdus, norint kontroliuoti vabzdžius. Pirmenybę turinčiame realizavimo variante egt genas koduoja viruso AcMNPV ekdisteroid-UDPgliukozil-transferazę egt geno ekspresija inaktyvuoja hormonus, (EGT) . Lazdelės pavidalo virusų iššaukia EGT susidarymą, kuri sąlygojančius vabzdžių nėrimąsi, tuo būdu užkirsdama kelią nėrimuisi arba lervos virtimui lėlyte. Lazdelės pavidalo virusų egt geno inaktyvavimas leidžia normaliai vykti nėrimuisi ir lervos virtimui lėlyte.
Siūlomas išradimas apima visą eilę vabzdžių kontrolės agentų, panaudojant egt genus ir šių genų funkcionavimo produktus. Šio išradimo vabzdžių kontrolės agentai vabzdžiui kenkėjui iššaukia arba netinkamą EGT baltymo sintezę, arba slopina normalų EGT baltymo funkcionavimą arba pasireiškimą, tuo būdu sutrikdomas normalus vabzdžio vyatymasis.
Tinkamiausia, kad - organizmas, turintis egt geną, būtų specifinis tai vabzdžių rūšiai virusas, ir kad viruso egt genas būtų inaktyvuotas, o tai leistų ilgiau vystytis šiuo virusu infekuotam vabzdžiui-šeimininkui. Vabzdžio šeimininko vystymasis susijęs su tokiu jo elgesio pakitimu, kaip mitybos sumažėjimas, ir užsikrėtus virusiniu pesticidu, sulėtėja vabzdžio augimas ir jis greičiau miršta. Šis išradimas taip pat apima pagerinto virusinio pesticido gamybos būdą. Be to, šis išradimas apima vabzdžių kenkėjų kontrolės būdą, kurio esmė yra ta, kad vabzdys-kenkėjas yra paveikiamas pagerintu virusiniu pesticidu.
Šiuo išradimu siūlomi genetiškai pakeisti virusai yra efektyvesni pesticidai, lyginant su iki šiol naudotais virusais. Lazdelės pavidalo virusuose, tokiuose kaip, pavyzdžiui, branduolinės poliedrozės virusas Autographa californica (AcMNPV) arba branduolinės poliedrozės virusas Orgyia pseudotsugata (OpMNPV) , natūraliai pasireiškia egt genas. Jo ekspresija prailgina laiko periodą, kurio metu infekuota lerva maitinasi, nekamuojama virusinės infekcijos. Šis išradimas apima egt geno inaktyvavimą viruso genome, ir, pavyzdžiui, ne tik lazdelės pavidalu egt geną galima inaktyvuoti, įvedant į jo vietą arba į jį kitą geną, pavyzdžiui, genąmarkerį, koduojantį β-galaktozidazės sintezę. Turėtų būti aišku, kad egt geno pažeidimui gali būti naudojama bet kuri DNR seka, kadangi ji pažeidžia egt koduojančios sekos pasireiškimą. Priešingai, ištrinant atitinkamą koduojantį DNR segmentą, galima pašalinti iš genomo visas egt geno dalis, arba pašalinti ar pakeisti reguliuojančią genomo dalį, kontroliuojančią egt geno ekspresiją. Lazdelės pavidalo virusai su ištrynimais, inaktyvuo j ančiais egt geną, taip pat gali būti gauti nuosekliai praleidžiant virusą per vabzdžio ląstelių kultūrą. Taip gauti virusai su ištrynimais turi šį privalumą: juose nėra svetimos DNR ir jie skiriasi nuo laikinio tipo virusų tik funkcinio egt geno nebuvimu. Panašūs modifikuoti bakulevirusai, kaip kenkėjų kontrolės agentai, yra efektyvesni už tuos, kurie naudojami šiuo metu. Kaip paprasti mutantai su ištrynimais jie turi būti taip pat priimtini reguliuojančioms žinyboms (pavyzdžiui, U.S. EPĄ) kaip pesticidai, gauti genų inžinerijos būdu, kadangi juose nėra nehomologinės DNR. Lazdelės pavidalo virusai, kuriuose nepasireiškia funkcinis egt genas, gali būti pakeisti įvedant besiskiriančius nuo egt genus, kurie gali įtakoti vabzdžio vystymąsi, tuo pačiu padidindami tokių virusų, kaip vabzdžių kontrolės agentų, efektyvumą.
Šis išradimas taip pat apima vabzdžių-kenkėjų kontrolės būdą, infekuojant vabzdžių lervas mutantiniu virusu, kuriame nėra intaktinio egt geno, arba jis nesugeba gaminti funkcinį EGT produktą. Lervos, infekuotos muLT 3807 B tantiniu virusu, stengiasi nertis ir virsti lėlyte, ir, reiškia, jų mitybos laikas sutrumpėja, lyginant su lervomis, infekuotomis laukinio tipo ar kitais šiuo metu žinomais virusais. Mutantiniu virusu užkrėstos lervos tip pat miršta greičiau, negu lervos, infekuotos laukinio tipo ar kitais šiuo metu naudojamais virusais.
Šio išradimo tikslas yra sukūrimas rekombinantinio viruso, kuris yra efektyvesnis, lyginant su laukinio tipo ar šiuo metu naudojamais virusais. Šio išradimo pavyzdys yra rekombinantinis virusas AcMNPV, žymimas kaip vEGTZ, kuriame dalis egt geno pašalinta ir pakeista bakteriniu genu lacZ, koduojančiu β-galaktozidazės susidarymą. Šios srities specialistams aišku, kad gali būti pakeista bet kuri DNR seka, inaktyvuojanti egt geną. Šio išradimo realizavimo pavyzdys taip pat yra rekombinantinis lazdelės pavidalo virusas, žymimas vEGTDEL, kuriame pašalinta dalis egt geno. Šio išradimo realizavimo pavyzdys yra pesticidas, pagamintas lazdelės pavidalo viruso, su pašalintu egt genu, pagrindu. Jiems taip pat priklauso lazdelės pavidalo virusai, kuriuose natūraliu būdu įvykusios mutacijos, įskaitant ištrynimą, sukėlė egt geno inaktyvavimą.
Šio išradimo tikslas yra, atitinkamai, egt genas ir šio geno pasireiškimo produktas, efektyviai veikiantys kontroliuojant vabzdžius kenkėjus. Šis išradimas taip pat žymiu mastu apima ekdisteroid-UDP-gliukozil-transferazę ir jai specifinius antikūnius. egt genas gali būti identifikuotas pagal egt geno nukleotidų sekos homologiškumą, pateiktą 1 lentelėje, arba nustatant EGT germento aktyvumą ir po to atliekamą DNR analizę. Pagal čia pateiktas definicijas, egt genas yra bet kuri DNR grandinė, koduojanti ekdisteroid-UDP-gliukozil-transferazės susidarymą, egt geno aktyvumo produktas - baltymas gali būti išvalytas ir išbandytas žinomais būdais, aprašytais 4 pavyzdyje. Turima omenyje, kad egt baltyLT 3807 B mas yra pakankamai švarus, jei jame yra ne mažiau kaip 70% (svorio) ekdisteroid-UDP-gliukozil-transferazės. Rekombinantinis egt baltymas, tai baltymas, kurį gamina bet koks organizmas, besiskiriantis nuo tokio, kuriame natūraliame pavidale yra šio baltymo sintezę koduojantis genas. Rekombinantinio geno pasireiškimas yra genų inžinerijos arba technikos rezultatas - DNR rekombinacij a.
Dar vienas šio išradimo tikslas yra, panaudojus genų inžineriją, sukūrimas viruso, kuris būtų efektyviu pesticidu ir tuo pat metu būtų nežalingas aplinkai.
Šio išradimo tikslas taip pat yra rekombinantinis pesticidas, kuriame nebūtų funkcinio egt geno ir pasireikštų antras genas, įtakojantis vabzdžių vystymąsi, be to organizme šio antro geno natūraliu pavidalu nėra. Nurodytas antras genas koduoja metamorfozę įtakojančio produkto sintezę. Tokiu geno produktu gali būti vabzdžių hormonas, įtakojantis vabzdžio vystymąsi, arba fermentas, inaktyvuoj antis metamorfozę reguliuojantį hormoną. Ypatingi pavyzdžiai yra protorakotropinis hormonas, išsilukštenimo hormonas ir juvenylinio hormono esterazė. Jei, norint gauti vabzdžių kontrolės agentą, į vabzdžių virusą reikia įvesti baltymus koduojančius genus, tai šiame viruse neturi būti egt geno arba jis turi būti jame inaktyvuotas.
Dar vienas šio išradimo tikslas yra sukūrimas genetiškai pakeisto organizmo, skirto naudoti vabzdžių vystymosi kontrolės agentu, kuriame pasireiškia genų inžinerijos metodais įvestas egt genas, ir kuriame natūraliomis sąlygomis nebūtų egt geno ekspresijos. Tokie genetiškai pakeisti organizmai, kuriuose pasireiškia EGT, turėtų nepalankiai veikti vabzdžius-kenkėjus, o to pasėkoje sumažėtų žemės ūkio kultūrų pakenkimas .
Kitas šio išradimo tikslas yra sukūrimas insekticidinių kompozicijų, tinkamų naudoti žemės ūkyje. Kaip žinoma, į tokių kompozicijų sudėtį įeina ūkio prasme tinkamas nešėjas ir vabzdžių virusas, pavyzdžiui lazdelės pavidalo virusas, prieš tai genetiškai modifikuotas taip, kad nurodyto viruso egt genas yra inaktyvuotas. Po to tokiems egt bakulevirusams gali būti įvykdyti genetiniai pakitimai, iššaukiantys heteroroginio geno, kuris koduoja vabzdžių hormono, įtakojančio metamorfozei, arba fermento, inaktyvuojančio tokį įtakojantį metamorfozę vabzdžių hormoną, ekspresiją. Heterologiniams genams, kurių produktai įtakoja metamorfozę, priklauso, tačiau tuo neapsiribojama, protorakotropinis hormonas, išsilukštenimo hormonas ir juvenylinio hormono esterazė. Pirmenybę turinčioje realizavimo formoje insektidinės kompozicijos, turinčios genetiškai pakeistus lazdelės pavidalo virusus, yra skirtos išpurškimui.
Kaip insektidinės kompozicijos nagrinėjamos taip pat ir tokios, į kurių sudėtį įeina žemės ūkiui tinkamas nešėjas ir genetiškai pakeistas vabzdžių parazitas. Vabzdžių parazitas - tai organizmas, kuris gyvena ir dauginasi tampriame tarpusavio ryšyje su vabzdžio lerva, o tai neigiamai atsiliepia lervai. Vabzdžių parazitu gali būti bakterija, grybelis, virusas arba kitas vabzdys. Tokio genetiškai pakeisto vabzdžių parazito, turinčio egt geną, veikimas vabzdžių kontrolės agentu stiprės dėl šio geno inaktyvacijos.
Bet kuri iš aukščiau minėtų insekticidinių kompozicijų taip pat gali turėti savo sudėtyje ingredientus, stimuliuojančius vabzdžių mitybą. Vabzdys-kenkėjas gali ryti šio išradimo insekticidines kompozicijas, užneštas ant augalų, ir vabzdžiai-kenkėj ai, kurie yra jautrūs šios kompozicijos vabzdžių kontrolės agentui, pradės mažiau maitintis ir mirs.
Taip pat šio išradimo tikslas yra užtikrinti modifikuotą biologinį pesticidą, kuris inhibuoja egt geno arba šio geno funkcionavimo produkto pasireiškimą.
Trumpas figūrų aprašymas figūra schematiškai vaizduoja genomą AcMNPV, parodantį egt geno lokalizaciją. AcMNPV genomas pateiktas sąlyginiais vienetais, o taip pat Eco RI ir Hind III restrikcijos kortos pavidalu.
figūroje schematiškai pateikti egt geno sekos tyrimų ir šios sekos analizės rezultatai. 2A figūroje pavaizduota šios genomo srities endonukleazinės restrikcijos korta. 2B fig. pateikti sekos kompiuterinės analizės rezultatai, ieškant atvirų nuskaitymo rėmelių. Vertikaliomis linijomis parodyti terminuojantys kodonai, kurie yra polipeptidinės grandinės sintezės sustabdymo signalai. Seka transliuojama vesose trijose potencialiai atidarytuose nuskaitymo rėmeliuose, kiekvienoje DNR gijoje (1, 2, 3, 1', 2', 3'). egt atitinkantis atviras nuskaitymo rėmelis (2) pažymėtas kaip EGT.
figūra schematiškai vaizduoja egt geno sričių struktūras viruse AcMNPV(A) ir rekombinantiniuose virusuose (B) ir vEGTDEL(C). Užštrichuotas stačiakampis yra lacZ genas.
figūroje schematiškai pateikti elektroforezė agarozės gene ir dėmių analizė pagal Southern'y, kurios atliekamos lazdelės pavidalo OpMNPV egt geno indetifikacij ai.
figūra vaizduoja kontrolinių neinfekuotų lervų arba ketvirto amžiaus lervų, užkrėstų laukinio tipo virusais AcMNPV arba vEGTZ, svorio padidėjimo grafiką.
fig. pateiktas lervų, užkrėtus 4 amžiaus lervas laukinio tipo virusais AcMNPV arba vEGTZ, mirtingumo grafikas .
fig. yra svorio padidėjimo grafikas, infekavus 5 amžiaus lervas laukinio tipo AcMNPV virusais arba vEGTZ.
fig. pateiktas lervų, infekavus 5 amžiaus lervas laukinio tipo virusais AcMNPV arba vEGTZ, mirtingumo grafikas .
fig. pateiktas lervų, infekavus pirmo amžiaus lervas laukinio tipo virusais AcMNPV arba vEGTZ, kuriuose poliedrinių įsiterpimo kūnų (PIK) koncentracija yra 4,8 x 10 PĮK/ml, mirtingumo grafikas.
fig. pateiktas lervų, infekavus pirmo amžiaus lervas laukinio tipo virusais AcMNPV arba vEGTZ, kuriuose PIK koncentracija yra 2,4 x 10 PĮK/ml, mirtingumo grafikas.
Detalus Išradimo realizavimo variantų aprašymas
Žvynasparniai vabzdžiai vystymosi nuo kiaušinėlio iki suaugusio individo procese keičiasi pagal gerai charakterizuotą virsmų seką (detalesnį aprašymą žr. Comprehensive Insekt Physiology, Biochemistry and Pharmacology, Vels. 7 and 8, Kerkut and Gilbert (eds)., Pergamon Press, Oxford, 1984).
Po išėjimo iš kiaušinėlio pas vabzdžio lervą prasideda intensyvios mitybos periodas, kurio metu ji kelis kartus išsiners, o tai užtikrina jos nepertraukiamą augimą. Laiko tarpai tarp nuosekliai einančių nėrimųsi yra vadinami amžiaus (lervingumo) stadijomis. Pasibaigus augimo periodui, lerva virsta lėlyte ir galų gale pavirsta suaugusiu vabzdžiu. Nėrimosi ir virtimo lėlyte procesus (apibendrinančiai vadinamus metamorfoze) reguLT 3807 B liuoja bendras kelių įvairių hormonų grupių veikimas. Pradinis stimulas yra tam tikrų smegenų ląstelių išskiriamas proktorakotropinis hormonas (PTTH). Tai stimuliuoja ekdisteroidų, kurie dažnai vadinami vabzdžių nėrimosi hormonais, sekreciją grotorakalinėmis liaukomis. Esant juvenyliniam hormonui, yra garantuotas lervos nėrimasis, o jam nesant virs lėlyte. Išsilukštenimo hormonas taip pat yra svarbus kai kurių su metamorfoze susijusių elgsenos pakitimų realizavimui.
Lazdelės pavidalo virusas AcMNPV, naudojamas kaip modelinė sistema daugelyje lazdelių pavidalo virusų tyrimų, visai nelauktai įsikiša į aukščiau aprašytą vabzdžio vystymosi procesą. Infekuotos AcMNPV vabzdžių lervos nebesugeba daugiau nertis ir virsti lėlyte, o tai susiję su tuo, kad AcMNPV valdo sintezę fermento, kuris žinomas kaip ekdisteroid-UDP-gliukozil-transferazė (EGT), ir kuris selektyviai inaktyvuoja vabzdžių ekdisteroidus.
Šio išradimo autoriai identifikavo EGT koduojantį geną AcMNPV genome jis tęsiasi nuo 8,4 iki 9,6 sąlyginių vienetų (1 ir 2 fig.). Kaip parodyta 1C fig., virusinės DNR fragmentai, supantys egt geną, buvo klonuoti į pUC 19, Bluescript M13+ ir Bluescript M13 plazmidus. 2 fig. parodyta egt genomo srities restrikcijos korta ir kompiuterinė analizė, norint nustatyti šioje srityje atvirų nuskaitymui rėmelių buvimą. Tik 2 rėmeles turi sąlyginai ilgą, atvirą nuskaitymui seką, kuri buvo identifikuota kaip egt geno kodavimo sritis. 1 lentelėje pateikta egt geno nukleotidų seka ir iš jos išvesta 506 aminorūgščių seka. egt geno koduojamoji seka tęsiasi maždaug nuo 149 iki 1670 nukleotido.
Nukleotidų seka ir AcMNPV viruso egt geno aminorūgščių pranašauta seka lentelė
1 GTCGACGCGC TTCTGCGTAT AATTGCACAC TAACATGTTG CCCTTTGAAC
51 TTGACCTCGA TTGTGTTAAT TTTGGCTAT AAAAAGGTCA CCCTTTAAAA
101 TTTGTTACAT AATCAAATTA CCAGTACAGT TATTCGGTTT GAAGCAAAAT egt: M
151 GACTATTCTC TGCTGGCTTG CACTGCTGTC TACGCTTACT GCTGTAAATG
T I L C W L A L L S T L T A V N A
201 CGGCCAATAT ATTGGCCGTG TTTCCTACGC CAGCTTACAG CCACCATATA
ANI L A V F P T P A Y S H H I
251 GTGTACAAAG TGTATATTGA AGCCCTTGCC GAAAAATGTC ACAACGTTAC
V Y K V Y I E ALA E K C H N V T
301 GGTCGTCAAG CCCAAACTGT TTGCGTATTC AACTAAAACT TATTGCGGTA
V V K P K L F A Y S T K T Y C G N
351 ATATCACGGA AATTAATGCC GACATGTCTG TTGAGCAATA CAAAAAACTA
I T E INA D M S V E Q Y K K L
401 GTGGCGAATT cggcaAtgtt TAGAAAGCGC GGAGTGGTGT CCGATACAGA
V A N S A M F R K R G V V S D T D
451 CACGGTAACC GCCGCTAACT ACCTAGGCTT GATTGAAATG TTCAAAGACC
T V T A A N Y L G L I E M F K D Q
501 AGTTTGACAA TATCAACGTG CGCAATCTCA TTGCCAACAA CCAGACGTTT
F D N I N V R N L I ANN Q T F
551 GATTTAGTCG TCGTGGAAGC GTTTGCCGAT TATGCGTTGG TGTTTGGTCA
D L V V V E A F A D Y A L V F G H
601 CTTGTACGAT CCGGCGCCCG TAATTCAAAT CGCGCCTGGC TACGGTTTGG
LYD P A P V I Q I A P G Y G L A
651 CGGAAAACTT TGACACGGTC GGCGCCGTGG CGCGGCACCC CGTCCACCAT
E N F D T V G A V A R H P V H H
lentelė (tęsinys)
701 CCTAACATTT GGCGCAGCAA TTTCGACGAC ACGGAGGCAA ACGTGATGAC
P N I W R S N FDD T E A N V M T
751 GGAAATGCGT TTGTATAAAG AATTTAAAAT TTTGGCCAAC ATGTCCAACG
E M R L Y K E F K I LAN M S N A
801 CGTTGCTCAA ACAACAGTTT GGACCCAACA CACCGACAAT TGAAAAACTA
L L K Q Q F G P N T P T I E K L
851 CGCAACAAGG TGCAATTGCT TTTGCTAAAC CTGCATCCCA TATTTGACAA
R N K V Q L L L L N L H P I F D N
901 CAACCGACCC GTGCCGCCCA GCGTGCAGTA TCTTGGCGGA GGAATCCATC
N R P V P P S V Q Y L G G G I H L
951 TTGTAAAGAG CGCGCCGTTG ACCAAATTAA GTCCGGTCAT CAACGCGCAA
V K S A P L T K L S P V I N A Q
1001 ATGAACAAGT CAAAAAGCGG AACGATTTAC gtaagttttg GGTCGAGCAT
M N K S K S G T I Y V S F G S S I
1051 TGACACCAAA TCGTTTGCAA ACGAGTTTCT TTACATGTTA ATCAATACGT
DTK S F A N E F L Y M L I N T F
1101 TCAAAACGTT GGATAATTAC ACCATATTAT GGAAAATTGA CGACGAAGTA
K T L D N Y T I L W K I D D E V
1151 gtaaaaaaca TAACGTTGCC CGCCAACGTA ATCACGCAAA ATTGGTTTAA
V K N I T L P A N V I T Q N W F N
1201 TCAACGCGCC GTGCTGCGTC ATAAAAAAAT GGCGGCGTTT ATTACGCAAG
Q R A V L R H K K M A A F I T Q G
1251 GCGGACTACA ATCGAGCGAC GAGGCCTTGG AAGCCGGGAT ACCCATGGTG
G L Q S S D E A L E AGI P M V
1301 TGTCTGCCCA TGATGGGCGA CCAGTTTTAC CATGCGCACA AATTACGCA
C L P M M G D Q F Y H A H K L Q Q
lentelė (tęsinys)
1351 ACTCGGCGTA GCCCGCGCCT TGGACACTGT TACCGTTTCC AGCGATCAAC
L G V A R A L D T V T V S S D Q L
1401 TACTAGTGGC GATAAACGAC GTGTTGTTTA ACGCGCCTAC CTACAAAAA
LVA IND V L F N A P T Y K K
1451 CACATGGCCG AGTTATATGC GCTCATCAAT CATGATAAAG CAACGTTTCC
H M A E L Y A L I N H D K A T F P
1501 GCCTCTAGAT AAAGCCATCA AATTCACAGA ACGCGTAATT CGATATAGAC
PLD K A I K F T E R V I R Y R H
1551 ATGACATCAG TCGTCAATTG TATTCATTAA AAACAACAGC TGCCAATGTA
D I S R Q L Y S L K T T A A N V
1601 CCGTATTCAA ATTACTACAT GTATAAATCT GTGTTTTCTA TTGTAATGAA
P Y S N Y Y M Y K S V F S I V M N
1651 TCACTTAACA CACTTTTAAT TACGTCAATA AATGTTATTC ACCATTATTT
H L T H F *
1701 ACCTGGTTTT TTTGAGAGGG GCTTTGTGCG ACTGCGCACT TCCAGCCTTT
1751 ATAAACGCTC ACCAACCAAA GCAGGTCATT ATTGTGCCAG GACGTTCAAA
Pirmenybę turinčiame šio išradimo realizavime AcMNPV 5 bakuleviruso egt genas inaktyvuoj amas, pakeičiant jo dalį bakterine seka, koduojančia β-galaktozidazes.Toks rekombinantinis bakulevirusas žymimas vEGTZ. Antrame pirmenybę turinčiame realizavimo variante, kaip parodyta 3 fig., viruso AcMNPV egt geno dalis pašalinama be pakeitimo. Baltymų, sintezuojamų infekuojant laukinio tipo AcMNPV ir vEGTZ, palyginimas parodė, kad EGT baltymas yra peptidinė grandinė su 60 kDa molekuline mase, išskiriama infekuotomis ląstelėmis. Vabzdžių viruso egt geno inaktyvavimo alternatyvinis mechanizmas yra įter15 pimas geno, kuris koduoja hormono, įtakojančiometamorfozę, arba inaktyvuojančio tokį hormoną fermento sinLT 3807 B tezę, ir kuris pasireiškia nurodytu virusu infekuotoje vabzdžių ląstelėje.
Genų banko duomenų Bazės tyrimai parodė, kad nuo 21 iki 22% egt aminorūgščių sekos yra homologiška žinduolių UPD-gliukozil-transferazėms. egt aminorūgščių linijinės sekos ir kai kurių šių fermentų sugretinimas parodytas 2 lentelėje.
lentelė iliustruoja egt aminorūgščių linijinės sekos ir kitų biologinių rūšių UDP-gliukozil-transferazių sugretinimą. Pranašauta egt aminorūgščių seka lyginama su žmogaus (HUMVDPGAT) (Jackson et ai. (1987) Biochem. J. 242:531), pelių (MVSVDPGAT) (Kimura and Owens (1987) Eur. J. Biochem. 163:515) ir žiurkių (RATVDPGAT) (Mackenzie (1987) J. Biol. Chem. 262:9744) UDP-gliukoronozil-transferazėmis ir su kukurūzų (ZMAYVDPGT) (Ralston et ai. (1988) Genetics 119:185) UDP-gliukoziltransferaze, panaudojant FASTER algoritmą (Zipman and Pearson (1985), siūlomo International Biotechnologics.). Viršutinio registro raidės rodo tikslų sutapimą; apatinio registro raidės apibrėžia pakeitimus, kurie dažnai sutinkami tarp giminingų baltymų (Dayhoff, (1978) lentelė
EGT MTILCWLALLS— --TLTAVNAANILAVFPTPAYSHHIVYKVYIEALAEKCHNVTV
HUMUDPGAT Msm. ...ALL. s,gkvL-V.PT-. . fSH.m.-K..ld.L.qr.HeVTV
MUSUDPGAT M. . . ...ALL. ...f.sVk.gkvL-V.P.- .fSH.m..Ki.ld.L.qr.HeVTV
RATUDPGAT M. . . ...ALf. ...f.s. h.gkvL-V.P.- .fSH.m..Ki.ld.L.qr.HeVTV
EGT VKP- KLFAYSTKTYCGNITEI
'iMAUrloVlj ”
HUMUDPGAT 1. s. ..inf.. ns. .....Ev .... lt.....- . . .KqLV. . .A-. . .kd......s
MUSUDPGAT lrP. ..y.... K. . .G...E. ..t.vS.d.... ...K.v...t.-...Rd.......
RATUDPGAT 1KP. ..F.... K. . .d...EI .st.iS.d.... ...K.L...t.-...Rd.......
lentelė (tęsinys)
EGT VTAANYLGLIEMFKDQF-DNINVRNLIANNQ—TFDLVVVEAFADYALVFGHLYDPA
HUMUDPGAT ..... ...f.dilr. . ..D.vs.kkLm. k. Q. ..FDvVl.dAl..fg.llaeL... P
MUSUDPGAT 1.. . . ...f.d.F. . . ..D.vs.keLmtk.Q. ..FDvll.dpiA..g.liaeL.q.p
RATUDPGAT i. . . . ...f...y... ..D.vs.kgLmtk.Q. ..FDvl..dpiA..g.liaeL.h.p
EGT PVI—QIAPGYGLAENFDTVGAVAR-HPVHHPNIW-RSNFDDTEANVMTEMRLYKEF
HUMUDPGAT .V. . . .rfsPGYai..h.g.1. . .p. . . .PV. . sel. .q. .F.e. ..Nmi- .v-LY.EF
MUSUDPGAT .1. . . .rfsPGY.i..s.g. . . . .p. . . .PV. . s. 1. ,q. .F.e. ..Nmi- .M-LY.dF
RATUDPGAT .1. . . ..fsPG..L..sig. . . . .p. . . .PV. . s. 1. .k. .F.D. ..Nmi- .M-LY.dF
EGT —KIL-ANMSNALLKQQFGPNTPTIEKLRNKVQLLLLNLHPIFDNNRPVPPSVQYLG
HUMUDPGAT GG1H.. ..a.PL.K... .f-.Q.s..ng..vf-SlGS.v-.-n.seE.. .vi.sal..
MUSUDPGAT GG1H.. ..a.PL.K... .f-.Q.s...g..vf-SlGS.v-.-n.teE.. ..i..ai..
RATUDPGAT GG1H.. ..a.PL.K... .f-.Q.s...g..vf-SlGS.v-.-n.teE.. ..L..ai..
ZMAYUDPGT 285 qp..G..YVSFGT....rp...EI. ..L.ds...
EGT LDNYTILWKIDDEWKNITLPANVITQNWFNQRAVLRHKKMAAFITQGGLQSSDEAL
HUMUDPGAT i.-. .vLWrfDgn. . . .l.L.t,1—.kWi.Q..1L.H.K..AFIThGG.ng. . .Ai
MUSUDPGAT i.-. .vLWKfDg.... .1. . .t.V— .kWl.Q. .1L.H.K. .AFhThGG.ng. .EAi
RATUDPGAT i.-. .vLWKfDg... . .1. . .t.V— .kWl.Q. .1L.H.K. .AFvThGG.ng. .EAi
ZMAYUDPGT L. . . ...W.l....1. ..a..g..1...W..Q.AVLRH..vgAFvThaG..S. .EgL
EGT
EAGIPMVCLPPMGDQFYHAHKLQQLGVARALDTVTVSSDQLLVAINDVLFNAPTYKK
HUMUDPGAT .p.IPMV.vPl.aDQ. .n. . . .mk ..G.A.sLD. .TmSS.dLL.Alk.Vi-N.P.YK.
MUSUDPGAT ..GIPMi.iPl.GeQ. .n. . . .m. ..G.A.ALn. .TmS..dvL.AleeVi-..P.YKK
RATUDPGAT ..GIPMi.iPl.GDQ. . n. . . .m. ..G.A.sLn. .TmS..dfL.AleeVi-d.P.YKK
ZMAYUDPGT .sGvPM.C.P.,GDQ. .nAr.v. hvG.G.Afe. -amtS. .v. .AveelL......rr
EGT
HUMUDPGAT
MUSUDPGAT
RATUDPGAT
HMAELYALINHDKATFPPLDKAIKFTERVIRYRHDISRQLYSLKTTAANVPYSNYYM
n. . .L-s.IhHDqp-. .PLDrA-.F.. ..v-.RH. .akhL... A.dl. .f
n. . .L-s.IhHDqp-. .PLDrA-.F.. ..v-.RH. .akhL.pL---g.NI.--- .f
nv. .L-s.IhHDgp-. .PLDrA-.F.. ..I-.RH. .akhL.pL g.N1P .Y
ZMAYUDPGT . .AEL.ALv.e. .g......K. frF.E.V.R.
lentelė (tęsinys)
EGT YKSVFSIVMNHLTHF*
HUMUDPGAT Y.S-l.v.. ..La...
MUSUDPGAT Y.S-l.vi. ..Ls...
RATUDPGAT Y.S-l.vi. ..LT.F.
Atlas of Protein Seąuence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Vol. 5 Supplement 3, Silver Spring, MD); taškai žymi retai sutinkamus pakeitimus; brūkšnelis rodo praleidimą sekoje; intarpas duodamas aminorūgšeių pašalinimo iš sekos vietose. vEGTZ ir vEGTDEL egt geno aminorūgštys tarpuose tarp strėlyčių yra pašalintos. AcMNPV geno homologiškumas žinomoms UDP-gliukozil-transferazei ir UDP-gliukoronozil-transferazei patvirtina identifikavimą šios AcMNPV sekos, kaip koduojančios egt geno sekas.
Pas žinduolius UDP-gliukuronazil-transferazės katalizuoja gliukurono rūgšties pernešimą į visą eilę kaip egzogeninių, taip ir endogeninių lipofilinių substratų (žiūrėk apžvalgą Glucuronidation of Drugs and Other Compounds, Dutton (ed), CRC Prees, Boca Raton Florida, 1988) . Ši prisijungimo reakcija atlieka esminį vaidmenį detoksikacijoje ir saugiame tam tikrų vaistinių preparatų ir kancerogenų pašalinime. Be to per junginius su gliukurono rūgštimi vyksta normalaus metabolizmo ir įvairių endogeninių junginių, kaip bilirubinas ir steroidiniai hormonai, paskirstymo procesai.Turimi duomenys apie vabzdžių sistemas rodo, kad panašios cukrų prisijungimo reakcijos apima gliukozės, o ne gliukurono rūgšties pernešimą (žiūrėk apžvalgą Smith (1977) Drug Metabolism From Microbs to Man, Parke and Smith (eds), Taylor and Francis LTD London, pp. 19-232). Kaip ir pas žinduolius, taip ir pas vabzdžius panašiose prisijungimo reakcijose dalyvauja įvairūs egzogeniniai ir endogeniniai junginiai.
Šio išradimo autoriai parodė, kad AcMNPV viruso EGT baltymas yra UDP-gliukozil-transferazė, kuri selektyviai sujungia gliukozę su tokiais ekdisteroidais, kaip ekdizonas, 20-hidroksiekdizonas ir makisteronas A (žiūrėk 3 lentelę). Nei lizatai, nei neląstelinė neinfekuotų ląstelių arba infekuotų vEGTZ ląstelių terpe nemodifikuoja ekdizono. Didžioji dalis aktyvios ekdisteroid-gliukozil transferazės, gaminamos AcMNPV infekuotomis ląstelėmis, išsiskiria į tarpląstelinę terpę; santykinai žemas jos aktyvumo lygis yra stebimas AcMNPV infekuotų ląstelių lizatuose.
Panaudojant AcMNPV viruso egt geną kaip žymę, egt genas, kaip parodyta 4 fig., buvo identifikuotas kitame lazdelės pavidalo viruse, ir būtent branduolinės poliedrozės viruse Orgyia preudotsugata (OpMNPV). Specialistui turi būti suprantami pranašumai, kuriuos teikia šis atradimas, tai yra bet kurio lazdelės pavidalo viruso, vabzdžio ar vabzdžių viruso, egt genas gali būti lokalizuotas, charakterizuotas ir analogišku būdu išskirtas, egt gertai, kurių nukleotidinė seka ne mažiau kaip 70% homologiška sekai, pateiktai 1 lentelėje, laikomi ekvivalentiški šiai sekai, su sąlyga, kad homologiški genai koduoja fermentą, kuris yra ekdisteroidUDP-gliukozil-transferazė.
egt geno funkciniais ekvivalentais yra tokie ekvivalentai, kaip ekdizonas, kurie taip pat katalizuoja ekdisteroidų inaktyvaciją, pernešdami pusę gliukozės nuo UDP-gliukozės į ekdisteroidą (ekdisteroidus). Tokie funkciniai egt-ekvivalentai gali būti identifikuoti čia aprašytais metodais.
Lokalizuojant, identifikuojant ir išskiriant egt geną, patyręs specialistas, pasinaudodamas šiuo išradimu ir žinomomis metodikomis, gali inaktyvuoti šį geną ir gauLT 3807 B ti agentą, užtikrinantį vabzdžio vystymosi ir augimo efektyvesnę kontrolę.
Lygindami vEGTZ savybes su laukinio tipo (wt) AcMNPV, šio išradimo autoriai parodė, kad egt geno ekspresija užkerta kelią vabzdžio nėrimuisi ir virtimui lėlyte. Vabzdžiai, infekuoti wtAcMNPV, nesineria ir nevirsta lėlytėmis, tuo tarpu infekuotieji vEGTZ-neriasi ir stengiasi virsti lėlyte (žr. II pavyzdžio 4 lentelę) .
Dėl nėrimosi ir virtimo lėlyte slopinimo, infekavimas laukinio tipo virusu AcMNPV iš tikro gali prailginti lervos mitybos periodą. Lervos, užkrėstos laukinio tipo virusu penktos amžiaus stadijos pradžioje (paskutinė amžiaus stadija), maitinasi iki pat mirties, kuri įvyksta 5 arba 6 dieną po užkrėtimo. Tačiau neinfekuotos lervos, besiruošdamos virsti lėlyte, nustoja maitintis po 2-3 dienų, sulaukus penktos amžiaus stadijos (žiūrėk 8 fig.). Analogiški efektai stebimi ir tiriant ankstesnių amžiaus stadijų lervas. Nėrimosi metu neinfekuotos lervos nustoja maitintis maždaug 24 valandas, tuo tarpu wtAcMNPV užkrėstos lervos nesineria ir, atitinkamai, toliau maitinasi (žiūr. 6 fig.).
Rekombinantiniai lazdelės pavidalo virusai, neturintys funkcinio egt geno, neprailgina lervos mitybos periodo trukmę. Tuo būdu infekuotos lervos penktos amžiaus pradiniame periode, praėjus dviems dienoms po užkrėtimo, nustoja maitintis ir ruošiasi virtimui lėlyte (žiūr. 8 fig.) . Tačiau, kaip parodyta 9 fig., jos nevirsta lėlytėmis ir vietoje to miršta nuo virusinės infekcijos net greičiau, negu laukinio tipo virusu infekuotos lervos. Analogiškai lervos, infekuotos virusu ankstyvojoje ketvirtoje amžiaus stadijoje, nustoja maitintis praėjus dviem dienoms po užkrėtimo ir po to miršta greičiau, negu infekuotosios laukinio tipo virusu (žiūrėk 6 ir 7 fig.) Tai, kad lazdelės pavidalo virusas, neturintis funkcinio geno, užmuša vabzdžius greičiau, o tai aiškiai matyti, tada, kaip parodyta 10 ir 11 fig., kai AcMNPV ir vEGTZ virusais infekuojamos tik ką iš kiaušinėlių išsiritusios pirmos amžiaus stadijos lervos. vEGTZ užkrėstos lervos nuo virusinės infekcijos miršta 3-4 dienomis anksčiau, lyginant su tomis, kurios buvo užkrėstos wtAcMNPV. Reiškia, rekombinantiniai lazdelės pavidalo virusai, neturintys funkcinio egt geno, yra žymiai efektyvesni kaip vabzdžių kontrolės agentai, negu laukinio tipo lazdelės pavidalo virusai. Šios srities specialistams turėtų būti akivaizdūs privalumai šio išradimo, kurio esmė yra tame, kad egt genas bet kuriuo žinomu būdu gali būti padarytas nefunkciniu bet kuriame lazdelės pavidalo viruse arba vabzdžių viruse.
Aukščiau ir žemiau esančiuse pavyzdžiuose aprašytas efektas laukuose bus dar stipresnis. vEGTZ infekuotos lervos turi sunkumų su nėrimųsi, tačiau tai sėkmingai realizuojasi tik kruopščiai kontroliuojamose laboratorinėse sąlygose. Nesant griežtai temperatūros ir apšvietimo kontrolei, daugelis lervų negali baigti nėrimosi. Tokie vabzdžiai napradeda vėl maitintis ir po to greitai miršta.
lazdelės pavidalo geno, ir sumažėja
Nežiūrint į tai, kad kiek sutrumpėja laikas, per kurį viruso palikuonys gali kauptis lervije, užkrėstoje virusu, neturinčiu funkcinio egt infekuoto vabzdžio mityba, yra pastebimas žymus dukterinio viruso gaminimasis. Viruso kiekis, skaičiuojant vienai lervai, gautas po vėlesnių amžiaus stadijų lervų užkrėtimo vEGTZ, sudaro maždaug pusę to, kas gaunama užkrėtus laukinio tipo virusu. To užtenka, kad būtų užtikrintas viruso pernešimas į lauką ir efektyviai, kainos prasme, būtų gauti dideli virusinių dalelių kiekiai.
Kitame šio išradimo realizavimo variante vabzdžių virusą, kuriame nėra funkcinio egt geno, genų inžinerijos pagalba modifikuoja taip, kad jo, kaip biologinės kontrolės agento, efektyvumas išauga geno, kurio produktas Įtakoja vabzdžio vystymąsi, įvedimo sąskaita.
Genas, koduojantis PTTH (peptidinis hormonas) gali būti įvestas į viruso, neturinčio egt geną, genomą, ir PTTH ekspresija bus pakankamai aukšta, kad įtakotų nėrimosi procesus. Pas tokio tipo virusu infekuotas lervas yra aukščiausiu laipsniu pažeista vystymosi hormoninė kontrolė. Tokie vabzdžiai greitai suserga, o tai kenkia vystymuisi ir augimui, ir yra mitybos sumažėjimo ir mirties priežastimi.
Išsilukštenimo hormonas taip pat yra smulkus peptidinis hormonas, kurio genas, panaudojant žinomus metodus, gali būti įvestas į virusinį genomą su nefunkciniu egt genu. Ryšium su tuo, kad išsilukštenimo hormonas apsprendžia daugelį su metamorfoze susijusių elgsenos pakitimų, vabzdys, užkrėstas Egt- virusu, gaminančiu šį hormoną užtektinai dideliais kiekiais, nenormaliai elgsis ir/arba vystysis, pavyzdžiui, mažiau maitinsis.
Vabzdyje pirminiu juvenylinio hormono aktyvumo reguliatoriumi yra fermentas esterazė, inaktyvuoj antis juvenylinį hormoną. Rekombinantinis virusas, neturintis funkcinio egt geno ir gaminantis pakankamai aukštą juvenylinio hormono esterazės lygį, gali neigiamai įtakoti vabzdžio elgesį ir/arba vystymąsi.
Svarbu pažymėti, kad nors visi aukščiau paminėti genai gali būti įvesti į laukinio tipo virusų genomą, negalima laukti, kad šiuo atveju jie žymiu mastu įtakotų vabzdžio elgesį, kadangi egt geno ekspresija laukinio tipo virusais inaktyvuoja ekdisteroidinius nėrimosi hormonus ir tai kliudo, nežiūrint į kitų hormonų gaLT 3807 B mybą, normaliai metamorfozės eigai. Tuo būdu sėkminga strategija turi apimti, kaip aprašyta šiame išradime, generavimą virusų metamorfozės eigos pakeitimui, priklausomai nuo prieš tai atlikto egt geno inaktyvavimo.
Specialistams aišku, kad šio išradimo vabzdžių kontrolės agentams priklauso mutantiniai organizmai, kuriuose nėra intaktinio egt geno, arba jis nesugeba gaminti funkcinį egt produktą, o taip pat taip genetiškai pakeisti organizmai, kad jie išskiria kitą fermentą arba peptidinį hormoną, kurie modifikuoja hormoną.
Kaip parodyta, egt geno produktas galingai ir specifiškai įtakoja vabzdžių vystymąsi. Ekdisteroidai vaidina lemiamą vaidmenį pagrindinai visų vabzdžių rūšių vystymesi (žr. apžvalgą Comprehensive Insert Physiology, Biochemistry and Pharmacology, Kerkut and Gilbert (eds) Pergamon Press, Oxford (1984). Tuo būdu egt genas siūlo plačias potencialias galimybes plataus masto vabzdžių kontrolės strategijai. Pavyzdžiui, ketvirtame pirmenybę turinčiame šio išradimo realizavimo variante, žemės ūkio kultūra, panaudojant žinomus metodus, yra taip genetiškai pakeičiama, kad ji žymiu mastu pradeda gaminti EGT baltymą. Ant tokios kultūros besimaitinantys vabzdžiai nesugebės baigti vystymąsi ir virsti suaugusiu individu, tuo būdu užtikrinama ilgalaikė žemės ūkio kultūros apsauga. Bakterijos, paprastai esančios ant augalo arba jo viduje, taip pat gali būti analogišku būdu pakeistos, panaudojant žinomus genų inžinerijos metodus, ir to pasėkoje gaminti EGT fermentą. Tokios bakterijos taip pat gali aktyviai funkcionuoti kaip vabzdžių kontrolės biologiniai agentai.
Norint iššaukti egt geno ekspresiją, genetiškai gali būti pakeistos nefitopatogeninės besikolonizuojančios ant augalų bakterijos. Augalai su tokių genetiškai modifikuotų bakterijų kolonijomis bus apsaugoti nuo vabzdžių-kenkėjų, jautrių išryškinamų baltymų (baltymo) poveikiui.Nefitopatogeninės bakterijos, sudarančios kolonijas ant augalų, yra aprašytos, pavyzdžiui, U. S. Patent Nr 4.798.723, o kai kurių ant augalų besikolonizuoj ančių bakterijų genetinis modifikavimas aprašytas U. S. Patent Nr 4. 771.131 ir EPO Publication
Nr 0185005. Taip pat yra žinomos kitos ant augalų besikolonizuojančios bakterijos. Ekspresyvių genų įvedimui, tam kad būtų užtikrintas vabzdžių kontrolės sukūrimas, gali būti panaudoti visi metodai, panašūs aukščiau aprašytiems.
atsiras jų normalaus kad kai kurie vabzVabzdžiams įrijus tokią genetiškai modifikuotą medžiagą arba augalinę medžiagą, kurioje yra tokių genetiškai modifikuotų bakterijų kolonijos, vystymosi sutrikimai.Yra žinoma, džiai, pavyzdžiui amarai, turi ypatingai pralaidų žarnyną. Prityrę specialistai supranta, kokios molekulinės-biologinės stadijos yra būtinos tokio augaluose pasireiškiančio geno sukonstravimui ir ką būtina atlikti, kad šį ganą įvesti į augalo genomą.
Atrodo, jog yra įmanoma, kad tam tikrose gyvenimo ciklo stadijose pačiuose vabzdžiuose pasireiškia egt genas, ir kad jis yra svarbus vystymosi reguliavimo mechanizmo komponentas. Tuo būdu, matyt, vabzdžių egt genas pasirodys besąs tinkama naujos vabzdžių kontrolės strategijos priemone. Šis išradimas užtikrina būdą, leidžiantį tokios strategijos planavimą.
Papildomą šio išradimo realizavimo formą sudaro ekdisteroidų analogai, kurie susijungia su EGT fermentu, tačiau jų atskilimas nuo fermento nėra įmanomas. Tokie savižudybės substratai sudarys konkurenciją prisijungimui prie EGT fermento ir slopins arba blokuos jo veikimą, tuo pačiu įsikišdami į vabzdžio vystymąsi. Priešingai, rekombinantiniai organizmai gali būti paLT 3807 B keisti genų inžinerijos metodais, pasinaudojant teiginiais, aprašytais šiame išradime, tuo būdu vabzdžio egt geno ekspresija bus nuslopinta gaminantis, pavyzdžiui, anti-RNR.
Šiame išradime vabzdžių kontrolės agentas yra kompozicija arba aktyvus ingredientas kompozicijos, kuri nepalankiai veikia vabzdį kenkėją. Reakcija į vabzdžių kontrolės agentą yra mitybos sumažėjimas, pažeidžiama normali metamorfozė, ko pasėkoje vabzdžio mirtis yra neišvengiama. Pagal šį išradimą vabzdžių kontrolės agentu gali būti vabzdžių virusas, genetiškai pakeistas norint inaktyvuoti geną, koduojantį fermento, apsprendžiančio ekdisteroido modifikaciją, sintezę, arba vabzdžių virusas su tolimesniais genetiniais pakitimais, kurių rezultatas yra heterologinio geno, įtakojančio metamorfozę, ekspresija, arba tai gali būti augalas, vabzdžių parazitas arba nefitopatogeninė bakterija, be to bet kuriame iš šių organizmų, genų inžinerijos pasėkoje, pasireiškia heterolitinis genas, koduojantis metamorfozę įtakojančio baltymo sintezę.
Insekticidinės kompozicijos, tinkamos užnešti ant augalų, norint kontroliuoti vabzdžius-kenkėjus, turi žemės ūkio atžvilgiu priimtiną nešėją ir vabzdžių vystymąsi kontroliuojantį agentą. Šio išradimo insekticidinės kompozicijos užnešimas gali apsaugoti augalus nuo vabzdžių-kenkėjų, jų mitybos sumažėjimo ir jautrių vabzdžių nužudymo pasėkoje.
Specialistai žino, kokiu būdu parinkti vabzdžių kontrolės agentą, pavyzdžiui, virusą, tinkamą atitinkamam vabzdžiui kenkėjui.
Specialistams aišku, kad vabzdžiai-kenkėj ai gali būti paveikti šio išradimo kontroliuojančiu agentu bet ku26 riuo tradiciniu budu, įskaitant ryjimą, įkvėpimą ir tiesioginį kontaktą.
Kaip kontroliuojantys agentai gali būti naudojami taip pat augalai arba entomopatogeniniai mikroorganizmai su atitinkamais genetiniais pakitimais ir todėl gaminantys bent vieną baltymą, įtakojantį vabzdžių vystymąsi. Tokių baltymų pavyzdžiai apima, tačiau neapsiriboja, protorakotropinį hormoną, nėrimosi hormoną, juvenylinio hormono esterazę ir ekdipon-gliukozil-transferazę.
Norint iššaukti egt geno ekspresiją, taip pat gali būti genetiškai pakeisti vabzdžių parazitai, įskaitant virusus, bakterijas, grybelius ir kitus vabzdžius. Tokių parazitų parazitavimas ant atitinkamų vabzdžių iššauks, be simptomų, susijusių paprasčiausiai su nemodifikuotų buvimu, vabzdžio normalaus vystymosi pažeidimas. Infekuoto vabzdžio vystymosi pažeidimai sustiprins ligotumo būvį. Vabzdžio-kenkėj o infekavimo pasėkoje sumažėja mityba ir greičiau įvyksta mirtis.
Genetiniam modifikavimui organizmo, kurio tikslas yra vabzdžių kontrolės agento gaminimas, gali būti panaudotos DNR sekos, koduojančios sintezę šiame išradime aprašyto EGT-baltymo, kuris įtakoja vabzdžio vystymąsį ir kurio ekspresiją kontroliuoja tą organizmą atitinkantis promotoris. Tokie genetiniai pakitimai gali būti atlikti vabzdžių parazitams, augalams ir ant augalų besikolonizuojančioms nefitopatogeninėms bakterijoms.
Į šio išradimo sferą patenka egt genas, šio geno produktas, nukreipti prieš paskutinįjį antikūną visi kiti reagentai, aukščiau išvardintų komponuotų dariniai arba su jais susiję. EGT baltymas gali būti žymiu mastu išvalytas panaudojant čia aprašytus, o taip pat žinomus metodus.
Šiame išradime aprašyti lazdelės pavidalo virusai su genetiniais pakitimais pagrindinai naudojami kaip komponentai žemės ūkio kompozicijų, skirtų užnešimui ant augalų, tam kad būtų galima biologiškai kontroliuoti vabzdžius, kurie yra augalų kenkėjai. Yra žinomi įvairūs tokių vabzdžių kontrolės kompozicijų, priimtinų žemės ūkiui, gamybos būdai.
Kontroliuojančio agento koncentracija, reikalinga gavimui efektyvių insekticidinių kompozicijų, naudojamų žemės ūkyje augalų apsaugai, priklauso nuo organizmo tipo, naudojamos mutacijos ir kompozicijos receptūros. Specialistui suprantama, kad efektyvias kontroliuojančio agento koncentracijų reikšmes kompozicijoje galima lengvai nustatyti eksperimentiškai. Pavyzdžiui, viruso koncentraciją, kuri jau pasižymi insekticidinių efektu, lengvai galima nustatyti bet kuriuo iš būdų, pateiktų VI-ΧΙ pavyzdžiuose.
Žemės ūkio kompozicijos turi būti tinkamos naudoti žemės ūkyje ir gerai disperguotis lauke. Bendru atveju kompozicijos komponentai neturi būti fitotoksiški ir kenkti visai okliuduoj ančių virusų bendrijai. Užnešimas ant palų neturi kenkti lapams ir žaloti juos. Be atitinkamų kietų arba, o tai turi pirmenybę, skystų nešėjų, žemės ūkio kompozicijos gali turėti komponentus, kurie padidina lipnumą ir adheziją, emulgatorius ir drėkintojus, tačiau ne komponentus, kurie mažina vabzdžių mitybą arba viruso funkcionavimą. Gali būti pageidautina įvesti komponentus, apsaugančius kontroliuojantį agentą nuo inaktyvacijos ultravioletiniu spinduliavimu. Vabzdžių-kenkėjų kontrolės žemės ūkio kompozicijos taip pat gali turėti agentus, stimuliuojančius vabzdžių mitybą.
Yra apžvalgų, kuriuose aprašomi vabzdžių biologinės kontrolės agentų užnešimo ir jų naudojimo žemės ūkyje būdai. Žiūrėk, pavyzdžiui, Couch and Ignoffo (1981) Microbial Control of Pests and Plant Disease, 19701980, Burgės (ed) chapter 34, pp. 621-634; Carke and Rishbeth, ibid, chapter 39, pp. 717-732, Brockwell (1980) Methods for Evaluating Nitrogen Fixation, Bergsen (ed), pp. 417-488; Burton (1982) Biological Nitrogen Fixation Technology for Tropical Agriculture, Graham and Harris (eds) pp. 105-114; ir Roughley (1982) ibid, pp. 115127, The Biology of Baculevirusses, vol. II supra.
Šis išradimas iliustruojamas žemiau pateiktais pavyzdžiais, į kuriuos jokiu būdu negalima žiūrėti kaip į šio išradimo srities apribojimą. Aišku, kad specialistams gali atsirasti įvairūs konkretaus realizavimo variantai, išradimo modifikacijos ir ekvivalentai, neišeinantys iš šio išradimo idėjos ir/arba pridedamos išradimo apibrėžties ribų.
I pavyzdys fig. parodyta egt geno padėtis AcMNPV genome, virš AcMNPV genomo kortelės parodytas mastelis sąlyginiais vienetais. Norint nustatyti šio geno ir jam gretimų sričių nukleotidinę seką, o tai leistų po to atlikti genetines manipuliacijas, iš pradžių reikia klonuoti kai kuriuos DNR fragmentus, flankuojančius šią sritį, į plazmidžių vektorius (standartines klonavimo metodikas žiūrėk: T. Maniatis et ai. (1982) Molekular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N 4). 1 fig. A panelėje parodyta AcMNPV genomo linijinė kortelė, po jo suskaidymo Eco RI ir Hind III restrikcinėmis endonukleazėmis. B panelėje padidintu masteliu parodyta genomo sritis nuo 7,6 iki
11,1 sąlyginio vieneto, parodanti egt padėtį. Kaip pradinis AcMNPV buvo naudojamas štamas LI (Lee and Miller (1978) J. Virol. 27:754). Klonuojami DNR fragmentai ir gautų plazmidžių pavadinimai parodyti 1 fig., C panelė.
fragmentas, užimantis stitį nuo PstI saito, esančio
7,6 s.v. taške, iki DamHI saito (11,1 s.v.), klonuojamas į plazmidinį vektorių pUC19; abu fragmentai 2 ir 3 (atitimkamai nuo PstI (7,6 s.v.) iki EcoRI (8,65 s.v.) ir nuo EcoRI (8,65 s.v.) iki Salį (10,5 s.v.) klonuojami į vektorius Bluescript M13+ ir Buescript M13 (Stratagene, San Diego, Californij a) . 5 fragmentas (esantis nuo BstEII (8,35 s.v.) iki BstEI (8,7 s.v.) klonuojamas į Bluescript M13+.
Po to generuojasi daug BCPSE ir BGES plazmidų paklonių (Henikoff (1984) Gene 28:251). Šie pakloniai besiskiria nuosekliai didėjančiais virusinių intarpų ištrynimais, tuo būdu jie turi skirtingus virusunės DNR kiekius, kuriems iki pilno virusinio fragmento trūksta iki 50 bazinių elementų porų. Po to daugeliui tokių paklonių ir BCB plazmidei yra atliekamas priauginimas (Sander et ai. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463), tuo būdu abiejose kryptyse atstatoma pilno egt geno seka. Po to gauta nukleotidinė seka yra analizuojama, nirint nustatyti nuskaitymui atvirus rėmelius, kurie gali koduoti baltymus. Tam naudojamos kompiuterinės programos Pūsteli and Kefatas (1984) Nucl. Acids Res. 12:643-655 ir Devereaux et ai. (1984) Nucl. Acids Res. 12:387-396. Tokia analizė rodo, kad egt genas koduoja baltymą, susidedantį iš 506 aminorūgščių. egt geno nukleotidų seka ir šio geno produkto pranašauta aminorūgščių seka pateikta 1 lentelėje.
pavyzdys
Tam, kad sukonstruoti rekombinantinius virusus, nesugebančius atlikti egt geno ekspresijos, reikia atlikti tolimesnes manipuliacijas su 1 pavyzdyje aprašytais plazmidžių klonais. pUCBCPsB plazmidą suskaido pasinaudojant EcoRI ir Xbal restriktuojančiomis endonukleazėmis (restrikcijos egt geno viduje saitus žr. 3 fig.) ir atmeta mažą fragmentą. lacZ Escherichia coli genas, atskeltas nuo pSKS 104 (Casadabom et ai. (1983) Methods Enzimol. 100:293-303), panaudojant EcoRI ir Aha III endonukleazes, po to, kai laisvi Xbal galai užpildomi T4 fago DNR-polimeraze, Įsiterpia tarp saitų EcoRI ir Xbal. gauta plazmidė žymima PEGTZ.
Į šią plazmidę įterptas lacZ genas yra rėmelio ribose kartu su prieš tai buvusia koduojančia egt seka. Priešingai, pEGTDEL plazmidę konstruoja paprasčiausiai sujungiant EcoRI ir Xbal saitus (po to kai abu abiejų saitų galai užpildomi), neįstatant tarp jų jokios nukleotidinės sekos. Visi virusai yra štamo L-l AcMNPV (Lee and Miller (1978) supra išvestinės, gryna linija gauta per ženklelius ir padauginta nusistovėjusioje ląstelių linijos kultūroje Spoclopetra frugiperda IPLBSF2L (SF-ląstelės) (Vaughn et ai. (1977) In vitro 13:213-217), naudojant aukščiau aprašytus metodus (Lee and Miller (1978); Miller et ai., (1986) Genetic Ingineering Principles and Methods, vol. 8 (eds. J.Setlow and A.Hollaender) , Plenum Press, N.Y., 277-298, 1986).
Po to, pasinaudojant laukinio tipo AcMNPV DNR, pEGTZ plazmidė buvo perkelta į SF-ląsteles. Ši procedūra leidžia atlikti homologišką rekombinaciją tarp virusinės ir plazmidinės DNR sekų, to pasėkoje viruso egt genas pakeičiamas plazmidės egt-lacZ genų jungtimi. Kadangi pasiliekanti egt koduojanti seka lieka rėmelyje kartu su lacZ sekomis, tai toks rekombinantinis virusas gamins jungtini baltymą, kuris bus sudarytas iš 84 egt aminorūgščių, sujungtų su β-galaktozidaze. Rekombinantini virusą žymimą cEGTZ, galima identifikuoti, kadangi β-galaktozidazės ekspresijos pasėkoje susidaro žydros virusinės žymės, esant tokiam chromogeniniam indikatoriui, kaip 5-brom-4-chlor-3-indolin^-D-galaktopiranozidas (X-gal). vEGTZ viruso egt geno diagrama pateikta 3 fig. B panelėje.
Rekombinantinis virusas vEGTDEL gaunamas pernešant pEGTDEL plazmidę ir DNR iš vEGTZ viruso į SF-ląsteles. Homologinės rekombinacijos pasėkoje vEGTZ geninė jungtis egt-lacZ pakeičiama egt genu su pEGTDEL ištrynimu. Rekombinantinis vEGTDEL virusas identifikuojamas pagal jo nesugebėjimą sudaryti žydras žymes, esant X-gal. vEGTDEL viruso egt geno struktūra parodyta 3 fig., C.
III pavyzdys egt geno produktą identifikuoja lyginant baltymus, sintezuotus laukinio tipo AcMNPV virusu (kuris gamina EGT) ir sintezuojamus cEGTZ arba vEGTDEL virusais (kurie nesugeba gaminti EGT) . SF-ląstelės infekuojamos arba laukinio tipo AcMNPV, arba vEGTZ su gaugybe užkrėtimų (MOl)20, kaip tai aprašyta O’Reilli and Miller (1990) J. Virol. 64:1321-1328. Infekuotas ląsteles taip pat analizuoja. Praėjus 6 valandoms po užkrėtimo, ląsteles
O c valandą infekuoja, esant radioaktyviais / S/ izotopais žymėtam metioninui, tam, kad radioaktyvios žymės būtų įvestos į visus baltymus. Po to ląstelės lizuojamos ir baltymai atskiriami elektroforizuoj ant SDSpoliakrilamido gelyje (SDS-PAGE) (Laemmli et ai. (1970) Nature 227:68-685). Visi ląstelių pagaminti baltymai taip pat surenkami ir analizuojami. Po SDS-PAGE radioizotopais žymėti baltymai nustatomi, panaudojant autoradiografiją. Iš infekuotų wtAcMNPV ląstelių buvo išskirtas 60 kDa molekulinės masės baltymas, kas nebuvo gauta vEGTZ infekuotų arba neinfekuotų ląstelių atveju. Šis baltymas nėra nustatomas lizatinėse ląstelėse, infekuotose laukinio tipo AcMNPV, o tai įrodo jo sekreciją ląstelėmis. Šie duomenys rodo, kad egt geno produktu yra sintezuojamas 60 kDa baltymas, o tai gerai derinasi su duomenimis apie nukleotidų ir aminorugščių seką.
IV pavyzdys
EGT baltymo fermentinį aktyvumą nustatinėj ome lyginant SF-ląsteles, infekuotas wtAcMNPV arba vEGTZ. SF-ląstelės, infekuotos wtAcMNPV arba vEGTZ, aprašytos III pavyzdyje. Po 12 valandų pi ląstelės ir tarpląstelinė terpė buvo surenkami ir apdorojami atskirai. Lygiagrečiai buvo apdorojamos neinfekuotos ląstelės. Ląstelinį lizatą ir tarpląstelinę terpę inkubavome esant 1 mM UDP-gliukozės ir 0,25 ųCi/3H/ ekdizono, kaip tai aprašyta pas O'Reilly and Miller (1989) Science 245:1110-1112.
Ekdisteroid-UDP-gliukozil-transferazės aktyvumas ląsteliniuose lizatuose ir tarpląsteliniame skystyje katalizuos gliukozės pernešimą nuo UDP-gliukozės į ekdizoną, susidarant ekdizono-gliukozės junginiui (konjagatui). Ekdizonas ir ekdizono-gliukozės junginys atskiriami plonasluoksnės chromatografijos ant silikagelio pagalba (Bausal and Gessner (1988) Anai. Biochem. 109-321) ir vizualizuojami autoradiografijos būdu. Ekdizono-gliukozės junginiai (b) susidaro tik testuojant AcMNPV infekuotus ląstelinius lizatus arba tarpląstelinį skystį. Junginiai nestebimi, jeigu naudojamos neinfekuotos arba vEGTZ infekuotos ląstelės arba tarpląstelinis skystis, o tai įrodo, kad aktyvumą apsprendžia egt ekspresija. Didžioji aktyvumo dalis yra susikaupusi tarpląstelinėje terpėje, o tai atitinka III pavyzdyje aptariamus duomenis. Gliukozės prisijungimo prie ekdizono įrodymą gauna testuojant wt-infekuotus lizatus aukščiau aprašytu būdu, išskyrus tai, kad UDPgliukozę pakeičia radioaktyviais izotopais žymėta UDP/U-14C/-gliukoze. Reakcijos, vykstančios dalyvaujant nežymėtai UDP-gliukozei arba žymėtai UDP/U-14C/-gliukoO zei, abiejose reakcijose dalyvaujant / H/ ekdizonui, ir susidarančių junginių scintiliacijų paskaičiavimas rodo, kad gali būti nustatytas 3H iš ekdizono ir 14 C iš gliukozės. Šie duomenys rodo, kad egt geno produktu yra UDP-gliukozil-transferazė, kuri yra gliukozės pernešimo nuo UDP-gliukozės į ekdizoną katalizatoriumi.
Toliau atliekami eksperimentai, norint detaliau išsiaiškinti EGT specifiškumą substratui. Šiuose eksperimentuose buvo inkubuojami įvairūs substratai (1 mM) , esant tarpląstelinei terpei, gauti iš wtAcMNPV infekuotų ląstelių, kuriuose buvo stebimas gana aukštas egt aktyvumas. Norint įsitikinti, kad visus stebimus junginių susidarymo atvejus sąlygoja EGT, kiekvienas substratas taip pat buvo inkubuojamas su terpe, gauta iš neinfekuotų arba infekuotų vEGTZ ląstelių, kurios nesugeba gaminti EGT. Kiekvienu atveju reakcijoje dalyvaudavo 0,05 ųCi UDP/U14C/-gliukozės. Visi junginiai, kurie EGT atžvilgiu elgiasi kaip substratai, turi prisijungti gliukozę; juos galima nustatyti, kadangi gliukozė žymėta radioaktyviais izotopais.
lentelė
EGT specifiškumas substratui
Substratas
Perneštos gliukozės kontrolė
Perneštos gliukozės laukinis tipas p-aminobenzoinė rūgštis bilirubinas chloramfenikopas dietilstilbestrolas ekdizonas - 155,7 estradiolas
2o-hidroksiekdizonas - 87,8 hidroks ichinolinas lentelė (tęsinys)
Substratas Perneštos Perneštos
gliukozės gliukozės
kontrolė laukinis tipas
makisteronas A - 89, 6
(-)mentolas - -
metilumbeliferonas - -
α-naftolas - -
p-nitrofenolis - -
fenolftaleinas - -
testosteronas - -
a-tetralolas - -
Substratus inkubuoja esant terpei, gautai iš atitinkamu būdu infekuotų ląstelių ir 0,05 ųCi UDP/U14C/-gliukozės. Perneštos gliukozės kiekis apskaičiuojamas iš scinciliacijų skaičiaus nuo atitinkamų chromatografinės plokštelės vietų.
Norint pademonstruoti, kad šiose reakcijose gliukurono rūgštis nėra pernešama, tolimesnei kontrolei UDP/U14 C/gliukurono rūgštis buvo įvedinėjama į reakcijų sistemas su terpėmis, gautomis ląstelių, infekuotų laukinio tipo virusu. Gauti rezultatai pateikti 3 lentelėje. Kaip substratai buvo identifikuoti tik ekdizonas, 20-hidroksiekdizonas ir makisteronas A, visi - ekdisteroidai. Terpėse, gautose iš neinfekuotų arba vEGTZ infekuotų ląstelių, konjugatai neaptikti, o tai patvirtina, kad stebimą aktyvumą apsprendžia egt ekspresija. Naudojant UDP/U14 C/-gliukurono rūgštį, konjugatai nestebimi, o tai rodo, kad gliukurono rūgštis nėra pernešama su EGT pagalba.
V pavyzdys ir hind į kelis
Tam, kad gauti taip pat ir kitų bakulevirusų genų, žymiu mastu homologiškų AcMNPV egt genui, buvimo įrodymą, buvo atskirta OpMNPV DNR ir atskirai paveikta restrikcinėmis endonukleazėmis EcoRI, BamHI
III. Šie fermentai suskaldo virusinę DNR įvairaus dydžio segmentus, kurių padėtis OpMNPV genome jau yra žinoma (Leisy et ai. (1984) J. Virol. 52:699) . Po to buvo atlikta hibridizacija pagal Southern'y, pagal būdą, aprašytą T. Maniatis et ai. (1982) supra. Pasinaudojant fermentais EcoRI ir Xbal, iš plazmidės BGES buvo išpjautas AcMNPV egt geno vidinis segmentas (žr. 1 fig.). Sį fermentą pažymėjome radioaktyviu izotopu P ir naudojome kaip bet kurių giminingų sekų OpMNPV genome nustatymo būdą. Aišku, kad atitinkamomis sąlygomis DNR fragmentas prisijungs kitą fragmentą, kurio sudėtyje yra analogiška arba identiška seka. Tuo būdu, ant neiloninės membranos vyksta AcMNPV egt geno-žymės prisijungimas prie bet kokio DNR OpMNPV fragmento, kuriame yra giminingos DNR sekos. Vietoje prijungimo, žymes galima vizualizuoti, panaudojant membranos ekspoziciją rentgeno spinduliais. Pradžioje vyksta egt-žymės hibridizacija su neilonine membrana švelniomis sąlygomis/ΙΜ natrio chloridas, 0,3M natrio citratas, 5% dekstrino sulfato, 5x Denhardt'o tirpalo, 0,25% SDS, esant 37°C/. Tai leidžia žymės hibridizaciją su sąlyginai tolimomis giminingomis sekomis. Po to palaipsniui griežtina hibridizacijos sąlygas, keliant hibridizacijos temperatūrą, arba į hibridizacijos tirpalą įvedant formamidą tol, kol neatsiras specifiniai hibridizaciniai ryšiai. Hibridizacija, parodyta 4 fig., vyksta šiomis sąlygomis: 1M natrio chloridas, 0,3M natrio citranas, 5% dekstrino sulfatas, 5x Denhardt'o tirpalo 0,25% SDS, temperatūra 68°C, trukmė 15val. Po to membraną du kartus praplauna, kiekvieną kartą po 15 minučių, 0,3M natrio chlorido, 0, 1M natrio citrato ir
0,1% SDS tirpale, esant 68°C temperatūrai. 4 fig. parodyta, kad AcMNPV egt-žymė jungiasi prie tam tikrų OpMNPV DNR, ir būtent, prie EcoRI B fragmento, BamHI A fragmento ir prie Hind III ir S fragmentų. Pažymėtina, kad egt genas OpMNPV genome užima tą pačią sąlyginę vietą, kaip ir AcMNPV genas (5 fig.). Analogiškas raštas yra naudojamas egt-homologiškų genų identifikacijai kituose entomopatogenuose. Aišku, kad EGT aktyvumo patvirtinimui, esant stipriai besiskiriančioms sekoms, prireiks testavimo metodo, aprašyto IV pavyzdyje. Tada geno, koduojančio EGT fermentą, išskyrimui reikės molekulinės-genetinės analizės, kurios metodologija yra žinoma.
EGT geno radimui kituose organizmuose naudojamas, skirtingai nuo aukščiau aprašytojo, specifinis aktyvumo UDP-gliukozil-transferazei testavimo būdas, aprašytas IV pavyzdyje. Šis testas naudojamas enzimo nustatymui valymo standartiniais biocheminiais metodais procese. Po valymo standartiniais biocheminiais metodais, nustatoma EGT baltymo dalinė aminorūgščių seka. Gautą informaciją naudoja oligonukleotidinės žymės sukūrimui, su kurios pagalba po to nustato EGT geno padėtį genome.
VI pavyzdys
Ekdisteroido titras hemolimfoje keičiasi cikliškai, reguliuodamas pasikeitimus ir lerva-lerva ir lervalelytė, ir kadangi daroma prielaida, kad gliukozės prisijungimas inaktyvuoja ekdist roidus (Warren et ai. (1986) J.Liq. Chromatogr. 9:1759; Thompson et ai. (1987) Arch. Insect Biochem. Physiol. 4:1; Thompson et ai. (1988) Arch. Insect Biochem. Physiol. 7:157), tai yra įmanomas tarpusavio ryšys tarp vabzdžio normalaus vystymosi proceso pažeidimo ir infekavimo AcMNPV virusu su egt ekspresija. Vystymosi pažeidimą demonstruoja šiuo būdu: tik ką nusinėrusias ketvirto amžiaus
S. frugiperda lervas įpurškimo būdu infekavo wtAcMNPV ir vEGTZ virusais ir kasdien stebėjo jų įmanomus vystymosi pakitimus. Neigiamai kontrolei vienai grupei lervų įvedė audinių kultūros skystį. Eksperimento rezultatai pateikti 4 lentelėje, žiūrėk žemiau. Visos lervos, kurioms buvo įvesta audinių kultūra (netikras infekavimas), nusinėrė, ir kaip buvo laukta, virto penkto amžiaus lervomis. Iš 16 lervų, infekuotų laukinio tipo virusu, panaši transformacija buvo pastebėta tik pas vieną lervą. Priešingai, visos lervos, infekuotos mutantiniu virusu vEGTZ, nusinėrė iš ketvirtos į penktą amžiaus stadiją. Tuo būdu, wtAcMNPV viruso egt geno ekspresija aiškiai ir specifiškai slopina vabzdžio-šeimininko nėrimąsi. Po to abi infekuotos lervų grupės žuvo nuo virusinės infekcijos, kas įrodo, kad VEGTZ viruso egt funkcijos pažeidimas nekliudo jam nužudyti šeimininką.
lentelė
Nėrimosi slopinimas, infekuojant wtAcMNPV virusu
Virusas Nėrimasis Mirtingumas
Netikras infekavimas 16 0
Laukinis tipas 1 16
vEGTZ 16 16
Ketvirto amžiaus S. frugiperda lervoms įvedė 1 x 10Jpfu wtAcMNPV arba vEGTZ 5-se μΐ. Netikrai infekuotoms lervoms įvedė 5 μΐ skystos audinio kultūros. Kiekvienoje grupėje buvo po 16 lervų, kurios buvo laikomos šiomis sąlygomis: dirbtinė dieta (R.L. Burton (1969) ARS publication pp . 33-134), 28°C temperatūra, ciklas šviesa : tamsa=14 : 10 valandų. Lervos kiekvieną dieną buvo apžiūrimos ar nenusinėrė, ir 7-ą dieną buvo · registruojamas mirtingumas.
Atlikus viruso injekciją penktos ankstyvosios stadijos lervoms, gauti analogiški rezultatai. Nė viena iš ką tik nusinėrusių penkto amžiaus lervų, infekuotų laukinio tipo virusu, nerodė lėlytės susidarymo požymių, tuo tarpu kai dauguma vEGTZ infekuotų lervų rodė kai kuriuos elgesio nukrypimus (nustojo maitintis, neramumas kokono pynimas), o tai yra artėjančio lervos virtimo lėlyte požymiai. Tačiau visos lervos, kurioms buvo įvesta virusinė infekcija, žuvo iki lėlytės susidarymo. Šie duomenys rodo, kad infekavimas AcMNPV kliudo lervų nėrimuisi ir lėlytės susidarymui. Jie taip pat rodo, kad tokios rūšies vabzdžių vystymosi pažeidimą sąlygoja egt geno ekspresija.
VII pavyzdys
Laukinio tipo AcMNPV/wt/ ir vEGTZ bisanalizė in vivo išryškino, kad egt geno ekspresija prailgina laiką, kurio metu lerva maitinasi, ir kad egt funkcijos pažeidimas gerina viruso, kaip pesticido, charakteristiką. Atliekant šiuos tyrimus, S. frugiperda lervoms buvo daromos arba wtAcMNPV, arba vEGTZ injekcijos ankstyvoje 4-je stadijoje. Palyginimui kontrolinėms lervoms buvo įvedama audinio kultūra, kuri neturėjo viruso. Kiekvieną dieną buvo tikrinamas lervų priesvoris, nėrimosi požymiai ir mirtingumas. 6 ir 7 fig., atitinkamai, pateiktas įvairių grupių lervų dienos priesvoris, o taip pat mirtingumo procentas. Kontrolinės grupės lervos per pirmas dvi dienas nuosaikiai augo, o po to nustojo maitintis ir pasiruošė virsti lėlyte. Tik viena iš 16 lervų, infekuotų wtAcMNPV, nusinėrė, vietoje to tris dienas po užkrėtimo lervos nepertraukiamai augo. Šioje stadijoje jos suserga, tačiau iki 5 dienos nė viena lerva nežuvo. 6-ai dienai visos wtAcMNPV infekuotos lervos žuvo.
visos vEGTZ infekuotos lervos nusinėrė iš
Priešingai, ketvirtos į penktą amžiaus stadiją ir per tą laiką nesimaitino. Tuo paaiškinamas priesvorio nebuvimas nuo 1-os iki 2-os dienos. Po nėrimosi jos vėl pradeda maitintis, tačiau
3-ai dienai joms pradeda reikštis ligos požymiai. Praėjus 4 dienoms po užkrėtimo, jos pradeda mirti ir 5-ai dienai visos žūva. Lervos, infekuotos išvestiniu iš AcMNPV virusu, kuriame nėra funkcinio egt geno, mažiau maitinasi ir žūsta nuo užkrėtimo greičiau, lyginant su lervomis, infekuotomis laukinio tipo AcMNPV.
Infekavus 5-os amžiaus stadijos lervas, šie reiškiniai stebimi dar aiškiau (8 ir 9 fig.) . Kaip ir tikėtasi, kontrolinės lervos per dvi dienas žymiai išaugo, o po to nustojo maitintis, ruošdamosis lėlytės susidarymui. Nustojimą maitintis lydi staigus svorio sumažėjimas. Lervoms, infekuotoms wtAcMNPV, nepasireiškė maitinimosi nustojimo požymiai; jos toliau maitinosi ir jų svoris didėjo dar dvi dienas, o po to pradėjo reikštis susirgimo požymiai. Iki 7-sios dienos po užkrėtimo mirtingumas nebuvo visiškas.
Galima padaryti šią išvadą. Lervos, infekuotos vEGTZ, kaip ir kontrolinės, maitinasi tik pirmas dvi dienas po užkrėtimo. Po to stebimas ryškus svorio sumažėjimas, kadangi lervos ruošiasi lėlytės susidarymui. Tačiau nė viena lerva nevirsta lėlyte, trečiai dienai stebimi ligos požymiai, o per šešias dienas po užkrėtimo visos jos žūsta.
VIII pavyzdys
Palyginama užkrėtimo vEGTZ ir wtAcMNPV įtaka ką tik išsiritusioms pirmo amžiaus S, frugiperdi lervoms. Ką tik gimusioms S. frugiperdi lervoms duoda maistą, kuriame yra įvairūs kiekiai vEGTZ ir wtAcMNPV poliedrinių įsiterpimo kūnų, ir kiekvieną dieną stebimas jų mirtingumas. 10 ir 11 fig. pateikti rezultatai, gauti naudojant dvi skirtingas dozes. Galima matyti, kad abiem atvejais vEGTZ infekuotoms lervoms mirtis, žymiu mastu, įvyksta daug anksčiau, palyginus su lervomis, infekuotomis laukinio tipo virusu. Bendrai paėmus, lervos, užkrėstos rekombinantiniu virusu, žūsta 3-4 dienom anksčiau, negu užkrėstos wt-virusu. Šis rezultatas yra papildomas Įrodymas to, kad bakulevirusai, turintys inaktyvuotus egt genus, kaip biologiniai pesticidai geriau veikia, negu laukinio tipo bakulevirusai su intaktiniais genais.
IX pavyzdys
Rekombinantiniu virusų su protorakotropinio hormono (PTTH) ekspresija konstravimui, PTTH geną klonuoja į perdislokavimo plazmidą pEV mod XIV, kuris aprašytas U.S. Patent application Šeriai No 07/353.847, 1989 gegužės 17d: čia paraiška Įtraukta kaip nuoroda. Ši plazmidė turi poliedrino AcMNPV geno, kuris yra ekspresyvinio PTTH geno rekombinacijos į EGT virusą mediatorius, kylančią ir nusileidžiančią sekas. Daugybinio klonavimo saitas prie įprastinio poliedrino transliacijos indukavimo saito, žemyn nuo LS XIV-modifikuoto poliedrino promotorio (Rankin et ai. bene 70:39 (1988)) . PTTH Bombix more genas išskiriamas iš pBc22kC19 plazmides (Kowakami et ai., Science 247:1333, (1990), panaudojant restrikcinį fermentą Hind III. Hind III rišamieji galai yra užpildomi su fago T4 DNRpolimeraze, o po to plazmidę suskaido panaudojant EeoRI. Plazmidę pEV mod XIV suskaldo panaudojant Kpnl, nukarusį Kpnl galą pašalina su fago T4 DNR-polimeraze ir plazmidą suskaido panaudojant EeoRI. Fragmentą, kuriame yra PTTH genas, klonuoja per šiuos saitus į perdislokavimo plazmidą. Gautoje plazmidėje žymimoje pEVPTTH, PTTH genas yra betarpiškai žemiau LSXIVmodifikuoto poliedrino promotorio.
Rekombinantinius virusus su PTTH ekspresija gauna pernešant pEVPTTH į SF-ląsteles per virusų wtAcMNPV ir EGT
E. Rekombinacijos tarp sekų, flankuoj ančių poliedriną virusinėje DNR, ir sekų, flankuoj ančių PTTH geną pEVPTTH plazmide, pasėkoje poliedrino genas pakeičiamas PTTH genu. Virusai, kurių genome yra tokia rekombinancija pagal neigiamą okliuzijos fenotipą (Miller et ai., Genetic Engineering, Principles and Methods, vol. 8, J.Setlav and A.Hollaender, eds., Plenųm Press N.Y., 1986, pp. 277-298). Atitinkami rekombinantiniai virusai žymimi vEGTTPTTH ir vwTPTTH.
Analogišku būdu gaunami rekombinantiniai virusai su juvenylinio hormono esterazės ekspresija. Pradžioje išpjauna juvenylinio hormono esterazės geną Helithis virescens Hanzlik et ai., (1989) J. Biol. Chem. 264:12119) iš plazmidės pCHEL6B (Hammock et ai. (1990) Nature 334:458), panaudojant skaidymą EcoRI ir Kpnl. Perdislokavimo plazmidą pEV mod XIV taip pat atskelia panaudojant EcoRI ir Kpnl ir fragmentą, turintį juvenylinio hormono, esterazės geną, įterpia tarp šių saitų. Tuo būdu pEVIHE savo sudėtyje turi poliedrino geno sekas, flankuojančias juvenylinio hormono esterazės geną. EGT IHE ir vwTIHE rekombinantiniai virusai gaunami pEVIHE transfekuoj ant, atitinkamai, su vEGTZ arba wtAcMNPV, ir atrenkant ženklelius be įsiterpimo kūnų.
Rekombinantinių virusų su išsilukštenimo hormono ekspresija konstravimui iš plazmidės pF5-3 išpjauna išsilukštenimo hormono Manduca sexta geną (Horodyski et ai. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8123), suskaidant EcoRI ir HpaI pagalba. pEV mod XIV suskaido panaudojant Kpnl, laisvą Kpnl galą pašalina panaudojant fago T4 DNR polimerazę, o po to suskaido su EcoRI. Fragmento, turinčio išlukštenimo hormono geną, įterpimas į perdislokavimo plazmidę duoda pEVEH rekombinantą, kuriame išsilukštenimo hormono genas eina žemyn nuo poliedrino LSXIV-modifikavimo promotorio. Šio plazmido kontrasfekcija su vEGTZ arba vDA26I DNR leidžia išskirti rekombinantinius virusus, atitinkamai, vEGT EH ir vDA26ZEH. vDA26Z yra rekombinantinis virusas su lacZ E. coli geno intarpu DA26 geno viduje (0' Reilly et ai., J. Gen. Virol., in Press) . DA26 geno funkcija nėra žinoma, tačiau metamorfozės atžvilgiu pagal fenotipą vDA26Z yra laukinio tipo. Dėl lacZ geno buvimo, vDA26Z išvestinės, esant X-gal, duoda žydrus ženklelius.
X pavyzdys
Tam kad in vitro įvertinti tokių rekombinantinių virusų efektą, S. frugiperda lervoms įvedė po 2xl05 pfu vEGTDL, vEGT’PTTH, vwTPTTH virusų, arba tuo pat metu vEGT’PTTH ir vEGT IHE (po lxlO5 pfu kiekvieno) ; lervos buvo vėlyvoje 3-je amžiaus stadijoje, arba ankstyvoje
4-je. įvedus visus EGT -virusus, infekuoti vabzdžiai išsinėrė ir pergyveno 4-ą stadiją, ir 3-iai dienai buvo pastebėtas galvos kapsulės nuslydimas, o tai rodo artėjantį nėrimąsi. Infekavus vien tik vEGT PTTH arba vEGT’PTTH kartu su vEGT IHE, vabzdžiai greitai suserga, ir 4-ai dienai stebimas žymus mirtingumas. Priešingai, vabzdžiams infekuotiems vEGTDEL, iki 5-os dienos nebuvo stebimas žymus mirtingumas. Kaip ir buvo tikėtasi, vabzdžiai, infekuoti vwPTTH virusu, niekada nerodo nėrimosi į 5-ą stadiją požymių. Galvos kapsulės nuslydimas nėra stebimas, ir iki 6-os dienos nebuvo pastebėta žymaus mirtingumo. Tuo būdu, PTTH ekspresija, nesant EGT, priartina vabzdžių žuvimą dėl užkrėtimo 1-a diena, lyginant su vEGTDEL infekcija. Šie duomenys iliustruoja bakulevirusų pesticidinių savybių pagerinimą dėka ekspresijos genų, įtakojančių vabzdžių metamorfoze, ir rodo, kad tokios strategijos efektyvumas yra įmanomas tik inaktyvuoj ant egt geną.
lentelė
Mirtingumo %
Virusas 3 4 5 6 7 8
vEGTDEL 4,5 4,5 68,2 90, 9 90, 9 95,5
vwTPTTH 0 0 13, 0 39, 1 78, 3 95, 7
vEGTPTTH 4,2 62,5 87,5 100, 0
vEGT PTTH
ir
vEGT'lHE 8,7 60,9 91,3 95,7 100,0
XI pavyzdys
Sudarančių įsiterpimo kūnus virusų su heterologinių baltymų, įtakojančių vabzdžių vystymąsi, ekspresija generavimas gali būti atliekamas pagal šią schemą. Pradžioje konstruojamas neokliuduoj antis virusas su β-glaktozidazės ekspresija. lacZ geną, koduojantį fermentą β-galaktozę, klonuoja į perdislokavimo vektorių pSyn VI , aprašytą U.S. Patent Application Šeriai No 07/353.847, 1989m. gegužės 17d. Vektorius pSyn VI’ savyje turi sekas, esančias genome į viršų ir į apačią nuo poliedrinio geno, be to daugybinio klonavimo saitas yra betarpiškai į apačią nuo sintetinio modifikuoto poliedrino promotorio. lacZ genas nupjaunamas nuo plazmido PSKS105 (Casadaban et ai. (1988, supra), suskaidant su Pstl. Laisvas PstI galas pašalinamas panaudojant nukleazę numg bean, ir plazmidas suskaidomas su SstlI. pSyn YI suskaido pagal saitus EcoTI ir SstlI ir lacZ geną klonuoja į tuos saitus. Gautas plazmidas žymimas pSynYI gal, jame lacZ genas yra betarpiškai į apačią nuo sintetinio modifikuoto poliedrino promotorio. pSynYI gal į SF ląsteles yra pernešami su vEGTDEL viruso DNR, ir yra atskiriami neokliuduoj antys ženkleliai su β-galaktozidazės ekspresija, kurie yra cEGT SynYI virusas.
Norint sukurti įsiterpimo kūnus sudarantį rekombinantinį virusą su PTTH ekspresija, PTT geną klonuoja į perdislokavimo vektorių pSpXIYYI+X3.
Konstruojant pSpXIYYI+X3, pradžioje padaromas tarpinis pSpXIYYI+plazmidas. Plazmidė pSpLSXIYYI+CAT (aprašytas JAV patento paraiškoje, Ser. No 07/353.847, 1989m.
gegužės 17d.) yra pjaunamas pagal BglIII, ir galai yra užpildomi DNR-polimeraze. Plazmidė pSynYI +wtp (aprašytas JAV patento paraiškoje, Ser. No 07/353.847, 1989m.
gegužės 17d.) yra pjaunamas per EcoRI ir SacI, ir mažą fragmentą EcoRI-SacI nuvalo. Dviejų plazmidžių produktus sujungia ir atrenka pSpXIYYI+. Plazmidė pSpXIYYI+ yra identiškas plazmidei pSpLSXIYYI+CAT, išskyrus tai, kad daugybinio klonavimo saitas tarpe tarp BglIII saito ir SacI saito sutampa su pSynYI+wtp. Daugybinio klonavimo saito v3 (aprašyto JAV patento paraiškoje, Ser. No 07/353.847, 1989m. gegužės 17d.) konstravimui tarp pSpXIYYI+plazmidės saitų EcoRI-SacI įvedimas polilinkeris. pSpXIYYI+X3 daugybinio klonavimo saito seka nuo saito BglIII iki saito SacI yra tokia:
AGATCATC GAATTCTCGAG CTGCAGATCT GTCGACCCGGG AATAAA
GAGCTC
EcoRv/Bgl EcoRI-XhoI PstI BglI Salį SmaI polyA.
Šioje plazmidėje yra intaktinis poliedrino genas, kurį kontroliuoja laukinio tipo poliedrino promotoris. Sintetinis modifikuotas poliedrino promotoris yra aukščiau nuo poliedrino jono ir su priešinga orientacija. Daugybinio klonavimo saito padėtis leidžia įterpti genus, kurių ekspresija turėtų vykti kontroliuojant sinLT 3807 B tetiniam modifikuotam poliedrino promotoriui. PTTH geną nupjauna nuo pBc22k plazmido (Kawasaki et ai., (1990) supra), suskaidant pagal Hind III. Laisvą Hind III galą užpildo fago T4 DNR-polimeraze ir plazmidą skaido pagal EcoRI. pSpXIYYI+X3 skaido pagal EcoRI ir SmaI, ir PTTH geną klonuoja į tuos saitus, kurie duoda pSpPTTH plazmidę. Šioje plazmidėje PTTH genas yra žemyn nuo sintetinio modifikuoto poliedrino promotorio einančioje atšakoje, tačiau kaimynystėje, jo orientacija ir koduojančios sekos yra priešingi laukinio tipo poliedrino promotoriui. Abu genai, PTTH genas ir poliedrino genas, flankuojamų į AcMNPV genomo poliedrino geno aukštyn ir žemyn einančias sekas.
pSpPTTH į SF-ląsteles yra pernešamas su cEGT SynYI gal DNR. Rekombinacijos tarp aukštyn ir žemyn einančiomis poliedrino sekomis virusinėje DNR ir sekomis, flankuojančiomis PTTH ir poliedrino genus pSpPTTH, pasėkoje lacZECT SynVI gal genas yra pakeičiamas PTTH ir poliedrino genais iš pSpPTTH. Rekombinantinis EGT SpPTTH virusas yra identifikuojamas pagal fenotipą, kuris yra neigiamas pagal β-galaktozės požymį ir teigiamas pagal okliuzijos požymį.
Konstruojant okliuduoj antį virusą su juvenylinio hormono esterazės ekspresija, juvenylinio hormono esterazės geną išpjaudavo iš PHEI6B plazmido (Hammock et ai., (1990) supra), suskaidant pagal Kpnl, pašalinant laisvą galą su fago T4 DNR-polimerazės pagalba ir nupjaunant pagal EcoRI. Po to juvenylinio hormono esterazės geną klonavo į pSpXIYYI+X3 plazmidę, kuria skaidė pagal EcoRI ir SmaI. Gauta plazmidė pSpJHE kontrasfekuojamas su vEGT SynYl’gal DNR, gaunamas rekombinantinis virusas vEGT SpJHE. Tokiame okliuduojančiame viruse juvenylinio hormono esterazės ekspresija vyksta kontroliuojant sintetiniam modifikuoto poliedrino promotoriui .
Analogišku būdu išpjauna išsilukštenimo hormono geną iš pF 5-3 plazmidės (Horodyski et ai. (1990) supra), perkertant jį per EcoRI ir HpaI, ir klonuojant į pSpXIYYI+X3, kuris po to suskaidomas pagal EcoRI ir SmaI . Gautos PSpEH plazmidės kontrasfekcijos su vEGT’SynYI’gal DNR pasėkoje gaunamas rekombinantinis virusas vEGT pEH.
Po to sudarantys įsiterpimo kūnus EGT -virusai yra toliau genetiškai keičiami, sukeliant ekspresiją baltymo, kuris įtakoja vabzdžių metamorfozę (vabzdžių peptidinis hormonas arba fermentas, inaktyvuoj antis vabzdžių hormonus), to pasėkoje jie sumažina mitybą ir pagreitina infekuotų vabzdžių lervų mirtį efektyviau, lyginant su laukinio tipo bakulevirusais, arba bakulevirusais, kuriuose genetiniai pakitimai iššaukė tik egt geno inaktyvavimą.
Kadangi XI pavyzdžio augimo ir vystymosi reguliatoriai sudaro įsiterpimo kūnus, šie virusai gali būti įvedami į efektyvias insektidines, priimtinas žemės ūkiui, kompozicijas, kurias galima užnešti ant infekuotų pasėlių. Vabzdžių maitinimosi tokiomis okliuduotomis virusinėmis dalelėmis pasėkoje, virusai ir, tuo pačiu, kontroliuojantis agentas pasklis po lauką. Infekcija iššauks vabzdžių žuvimą ir, iš to seka, apsaugos pasėlius nuo vabzdįų-kenkėjų.
Turi būti aišku, kad tai, kas aukščiau parašyta, yra susiję su ypatingais, pirmenybę turinčiais šio išradimo realizavimo pavyzdžiais, ir kad daugybė modifikacijų ir pakeitimų gali atitikti išradimo idėjų ir sritį, kaip tai yra postuluojama pridedamoje išradimo apibrėžtyje.

Claims (23)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    1. Kovos su vabzdžiais agentas, besiskiriantis tuo, kad jis yra vabzdžių parazitas, kuriame yra inaktyvuotas genas, koduojantis modifikuojantį ekdisteroidą fermentą.
  2. 2. Agentas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas genas, koduojantis viruso ekdisteroid-UDP-gliukoziltransferazę (egt genas).
  3. 3. Agentas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas vabzdžių parazitas yra vabzdžių virusas.
  4. 4. Agentas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas vabzdžių virusas yra bakulevirusas.
  5. 5. Agentas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas bakulevirusas yra branduolinės poliedrozės virusas._
  6. 6. Agentas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytą branduolinio poliedrono virusą pasirenka iš grupės, susidedančios iš branduolinio poliedrono viruso Autographa californica ir branduolinio poliedrono viruso Orgyia pseudotsugata.
  7. 7. Agentas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas vabzdžių virusas, turintis inaktyvuotą geną, koduojanti ekdisteroid-UDP-gliukoziltransferazę, yra rekombinantinis virusas, kuriame dalis egt geno pašalinta ir pakeista bakteriniu genu lacZ, koduojančiu β-galaktozidazės susidarymą (vEGTZ) , arba rekombinantinis virusas, kuriame pašalinta dalis egt geno (vEGTDEL).
  8. 8. Agentas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad vabzdžių papildomai modifikuoja, įterpiant bent vieną heterologinį geną; šis heterologinis genas ekspresuojasi vabzdžių ląstelėse, infekuotose nurodytu virusu, ir koduoja metamorfozę veikiantį baltymą.
  9. 9. Agentas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytą heterologinį geną pasirenka iš grupės, apimančios baltymus koduojančius genus, kurie yra protoraciklotropinis hormonas, išsilukštenimo hormonas ir juvenylinio hormono esterazė.
  10. 10. Agentas pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas heterologinis genas yra protoraciklotropinis hormonas.
  11. 11. Agentas pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra rekombinantinis virusas su protocikotropinio hormono ekspresija (vEGTSpPTTH).
  12. 12. Agentas pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas heterologinis genas yra išsilukštenimo hormonas.
  13. 13. Agentas pagal 12 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra rekombinantinis virusas su išsilukštenimo hormono ekspresija (vEGTSpEH).
  14. 14. Agentas pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas heterologinis genas yra juvenylinio hormono esterazė.
  15. 15. Agentas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra rekombinantinis virusas su juvenylinio hormono esterazės ekspresija (vEGTSpJHE).
  16. 16. Kovos su vabzdžiais pagerinto agento gavimo būdas, besi skiriantis tuo, kad atlieka šias stadijas:
    (a) geno, kuris koduoja metamorfozę veikiantį baltymą, išskyrimą ir (b) šio geno įvedimą į organizmą, kuriame natūraliomis sąlygomis nėra šio geno ekspresijos.
  17. 17. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas genas koduoja baltymą iš metamorfozę veikiančių baltymų grupės, apimančios ekdisteroid-CJDPgliukoziltransferazę, protoracikotropinį hormoną, išsilukštenimo hormoną ir juvenylinio hormono esterazę.
  18. 18. Būdas pagal 17 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas organizmas yra vabzdžių virusas, kuriame nėra egt geno ekspresijos.
  19. 19. Būdas pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytą geną išskiria iš bakuleviruso.
  20. 20. Būdas pagal 19 punktą, besiskiriantis tuo, kad bakulevirusas yra branduolinės poliedrozės virusas.
  21. 21. Būdas pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytą branduolinės poliedrozės virusą pasirenka iš branduolinės poliedrozės virusų grupės, susidedančios iš branduolinės poliedrozės viruso Autographa californica ir branduolinės poliedrozės viruso Orgyia pseudotsugata.
  22. 22. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytą organizmą pasirenka iš grupės, apimančios vabzdžių parazitus, nefitogenines ant augalų besikolonizuojančias bakterijas, entomopatogeninius grybelius ir augalus.
  23. 23. Kovos su vabzdžiais pagerinto agento gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad organizme atlieka geno, koduojančio ekdisteroid-modifikuoj antį fermentą, inaktyvavimo stadiją; šis nurodytas genas yra nurodyto organizmo genomo natūrali dalis.
    24. Būdas pagal 23 tuo, kad nurodytas koziltransferazę. punktą, besiskiriantis genas koduoja ekdisteroid-UDP-gliu- 25. Būdas pagal 24 punktą, bes iskiriantis tuo, kad nurodytas organizmas yra vabzdžių virusas. 26. Būdas pagal 25 punktą, bes iskiriantis tuo, kad nurodytas vabzdžių virusas yra bakulevirusas. 27. Būdas pagal 26 punktą, bes iskiriantis tuo, kad nurodytas bakulevirusas yra branduolinės po- liedrozės virusas. 28. Būdas pagal 23 punktą, bes iskiriantis
    tuo, kad iš nurodyto viruso pasažų serijos vabzdžių ląstelių kultūroje išskiria branduolinės poliedrozės viruso Autographa californica darinį, turintį ištrynimą, kuris inaktyvuoja geną, koduojantį ekdisteroidUDP-gliukoziltransferazę.
    29. Būdas pagal 27 punktą, besiskiriantis tuo, kad branduolinės poliedrozės virusą pasirenka iš grupės, susidedančios iš branduolinės poliedrozės viruso Autographa californica ir branduolinės poliedrozės viruso Orgyia pseudotsugata.
    30. Būdas pagal 29 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas branduolinės poliedrozės virusas yra vEGTZ arba vEGTDEL.
    31. Būdas pagal 23 punktą, besiskiriantis tuo, kad papildomai atlieka nurodyto organizmo genetinės modifikacijos stadiją, įvedant heterologinį geną, sugebantį ekspresuoti vabzdžio ląstelėje; šis genas koduoja metamorfozę veikiantį baltymą.
    32. Būdas pagal 31 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytą antrąjį geną pasirenka iš grupės, susidedančios iš genų, koduojančių protoracikotropinį hormoną, išsilukštenimo hormoną ir juvenylinio hormono esterazę.
    33. Kovos su vabzdžiais būdas, besiskiriantis tuo, kad atlieka stadiją, kurioje nurodytas vabzdys paveikiamas kovos su vabzdžiais agentu, kuris genų inžinierijos būdu yra pakeistas taip, kad ekspresuotųsi genas, .koduojantis ekdisteroido modifikavimo fermentą; šis fermentas nepalankiai veikia vabzdį.
    34. Kovos su vabzdžiais būdas, besiskiriantis tuo, kad vabzdį paveikia kovos su vabzdžiais agentu, turinčiu geną, koduojantį ekdisteroido modifikavimo fermentą; nurodytas genas yra inaktyvuotas.
    35. Būdas pagal 34 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas genas koduoja ekdisteroid-UDP-gliukoziltransferazę.
    36. Būdas pagal 35 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas kovos su vabzdžiais agentas yra vabzdžių virusas.
    37. Būdas pagal 36 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas vabzdžio virusas yra bakulevirusas.
    38. Būdas pagal 37 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas bakulevirusas yra vienas iš branduolinės poliedrozės virusų Autographa californica arba Orgyia pseudotsugata.
    39. Būdas pagal 38 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas genas yra inaktyvuotas intarpu heterologinio geno, kuris ekspresuojasi nurodytu virusu infekuotoje vabzdžio ląstelėje, o šis heterologinis genas koduoja metamorfozę veikiantį baltymą.
    40. Būdas pagal 39 punktą, besiskiriantis tuo, kad geną pasirenka iš grupės genų, koduojančių protoracikotropinį hormoną, išsilukštenimo hormoną ir juvenylinio hormono esterazę.
    41. Insekticidinė kompozicija, besiskiriant i tuo, kad į ją įeina kovos su vabzdžiais agentas ir tinkamas naudoti žemės ūkyje nešiklis, kurioje nurodytas kovos su vabzdžiais agentas yra genetiškai modifikuotas taip, kad natūralioje būsenoje esantis genas, koduojantis ekdisteroid-UDP-gliukoziltransferazę, yra inaktyvuotas .
    42. Insekticidinė kompozicija pagal 41 punktą, besiskirianti tuo, kad joje yra kovos su vabzdžiais agentas, papildomai modifikuotas taip, kad ekspresuojasi heterologinis genas, koduojantis metamorfozę veikiantį baltymą.
    43. Agentas pagal 41 ir 42 punktus, besiskiriantis tuo, kad jis yra vabzdžio virusas.
    44. Agentas pagal 43 punktą, besiskiriantis tuo, kad vabzdžio virusas yra bakulevirusas
    45. Agentas pagal 44 punktą, bes i s k i r i a n t i s 5 tuo, kad nurodytas liedrozės virusas. bakulevirusas yra branduolinės po — 46. Agentas pagal 45 punktą, bes i s k i r i a n t i s
    tuo, kad branduolinės poliedrozės virusą pasirenka iš 10 grupės, sudarytos iš Autographa californica ir Orgyia pseudotsugata.
    47. Rekombinantinė DNR molekulė, besiskiriant i tuo, kad ji turi geno, koduojančio ekdisteroid15 UDP-gliukoziltransferazę, seką.
    48. Rekombinantinė DNR molekulė pagal 47 punktą, besiskirianti tuo, kad jos nukleotidų seka yra tokia:
    101 151 GACTATTCTC TGCTGGCTTG maždaug CACTGCTGTC nuo A TACGCTTACT GCTGTAAATG 201 CGGCCAATAT ATTGGCCGTG TTTCCTACGC CAGCTTACAG CCACCATATA 251 GTGTACAAAG TGTATATTGA AGCCCTTGCC GAAAAATGTC ACAACGTTAC 301 GGTCGTCAAG CCCAAACTGT TTGCGTATTC AACTAAAACT TATTGCGGTA 351 ATATCACGGA AATTAATGCC GACATGTCTG TTGAGCAATA CAAAAAACTA 401 GTGGCGAATT CGGCAATGTT TAGAAAGCGC GGAGTGGTGT CCGATACAGA 451 CACGGTAACC GCCGCTAACT ACCTAGGCTT GATTGAAATG TTCAAAGACC 501 AGTTTGACAA TATCAACGTG CGCAATCTCA TTGCCAACAA CCAGACGTTT 551 GATTTAGTCG TCGTGGAAGC GTTTGCCGAT TATGCGTTGG TGTTTGGTCA 601 CTTGTACGAT CCGGCGCCCG TAATTCAAAT CGCGCCTGGC TACGGTTTGG 651 CGGAAAACTT TGACACGGTC GGCGCCGTGG CGCGGCACCC CGTCCACCAT 701 CCTAACATTT GGCGCAGCAA TTTCGACGAC ACGGAGGCAA ACGTGATGAC
    751 GGAAATGCGT TTGTATAAAG AATTTAAAAT TTTGGCCAAC ATGTCCAACG 801 CGTTGCTCAA ACAACAGTTT GGACCCAACA CACCGACAAT TGAAAAACTA 851 CGCAACAAGG TGCAATTGCT TTTGCTAAAC CTGCATCCCA TATTTGACAA 901 CAACCGACCC GTGCCGCCCA GCGTGCAGTA TCTTGGCGGA GGAATCCATC 951 TTGTAAAGAG CGCGCCGTTG ACCAAATTAA GTCCGGTCAT CAACGCGCAA 1001 ATGAACAAGT CAAAAAGCGG AACGATTTAC GTAAGTTTTG GGTCGAGCAT 1051 TGACACCAAA TCGTTTGCAA ACGAGTTTCT TTACATGTTA ATCAATACGT 1101 TCAAAACGTT GGATAATTAC ACCATATTAT GGAAAATTGA CGACGAAGTA 1151 GTAAAAAACA TAACGTTGCC CGCCAACGTA ATCACGCAAA ATTGGTTTAA 1201 TCAACGCGCC GTGCTGCGTC ATAAAAAAAT GGCGGCGTTT ATTACGCAAG 1251 GCGGACTACA ATCGAGCGAC GAGGCCTTGG AAGCCGGGAT ACCCATGGTG 1301 TGTCTGCCCA TGATGGGCGA CCAGTTTTAC CATGCGCACA AATTACAGCA 1351 ACTCGGCGTA GCCCGCGCCT TGGACACTGT TACCGTTTCC AGCGATCAAC 1401 TACTAGTGGC GATAAACGAC GTGTTGTTTA ACCCGCCTAC CTACAAAAA.A 1451 CACATGGCCG AGTTATATGC GCTCATCAAT CATGATAAAG CAACGTTTCC 1501 GCCTCTAGAT AAAGCCATCA AATTCACAGA ACGCGTAATT CGATATAGAC 1551 ATGACATCAG TCGTCAATTG TATTCATTAA AAACAACAGC TGCCAATGTA 1601 CCGTATTCAA ATTACTACAT GTATAAATCT GTGTTTTCTA TTGTAATGAA 1651 TCACTTAACA CACTTTTAAT r
    arba jos funkcinis ekvivalentas.
    49. Vabzdžių virusas, b esiskirianti s tuo, 5 kad jis yra gautas būdu pagal 19 punktą. 50 . Viruso vEGTZ gavimo būdas, besiskir i a n - t i s tuo, kad atlieka šias stadijas: 10 a) plazmidę pUCBCPSB perpjauna restrikcinėmis endonu-
    kleazėmis Ecol ir Xbal ir valo gautą didelį fragmentą;
    b) panaudojant restrikcines endonukleazes EcoRI ir Aha III atskelia lacZ geną nuo pSKS104;
    c) nurodytą lacZ geną liguoja su nurodytu dideliu (EcoRIXbaI) pUCBCPJB fragmentu po to, kai, panaudojant
    T4 fago DNR-polimerazę, buvo užpildytas Xbal ir gautas pEGTZ;
    d) pEGT ir AcMNPV koperneša į SF-ląsteles;
    e) identifikuoja virusinius rekombinantus pagal β-galaktozidazės ekspresiją; ir
    f) valo rekombinantini virusą, kuris yra vEGTZ.
    51. Viruso vEGTDEL gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad atlieka šias stadijas:
    a) plazmidę pUCBCPS suskaido, panaudojant restrikcines endonukleazes EcoRI ir Xbal, ir valo gautą dideli fragmentą;
    b) užbukina (a) stadijoje nurodyto didelio DNR fragmento abu galus;
    c) liguoja (b) stadijoje nurodytą didelį DNR fragmentą;
    d) pEGTDEL ir vEGTZ koperneša į SF-ląsteles, kas leidžia atlikti homologinę rekombinaciją;
    e) identifikuoja rekombinantinį vEGTDEL pagal tai, kad nevyksta β-galaktozidazės ekspresija;
    f) valo nurodytą rekombinantini vEGTDEL.
    52. Rekombinantinė ekdisteroid-UDP-gliukoziltransferazė, turinti tokią aminorūgščių seką:
LTIP1581A 1989-06-29 1993-12-10 Insect control agents, process for preparing thereof, method of insects control, insecticidal composition, recombinant dna molecule, insect's virus, process for preparing viruses, proteines LT3807B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/373,952 US5180581A (en) 1989-06-29 1989-06-29 Biological insect control agents and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1581A LTIP1581A (en) 1995-06-26
LT3807B true LT3807B (en) 1996-03-25

Family

ID=23474601

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1581A LT3807B (en) 1989-06-29 1993-12-10 Insect control agents, process for preparing thereof, method of insects control, insecticidal composition, recombinant dna molecule, insect's virus, process for preparing viruses, proteines

Country Status (26)

Country Link
US (2) US5180581A (lt)
EP (1) EP0432256B1 (lt)
JP (1) JP2968997B2 (lt)
KR (1) KR0165121B1 (lt)
AR (1) AR243604A1 (lt)
AU (1) AU627910B2 (lt)
BR (1) BR9006835A (lt)
CA (1) CA2033169C (lt)
DD (1) DD296311A5 (lt)
DE (1) DE69007952T2 (lt)
DK (1) DK35191A (lt)
EG (1) EG20419A (lt)
ES (1) ES2063370T3 (lt)
FI (1) FI104263B1 (lt)
GE (1) GEP19991540B (lt)
HU (1) HU217846B (lt)
IE (1) IE62564B1 (lt)
IL (1) IL94820A (lt)
LT (1) LT3807B (lt)
LV (1) LV10996B (lt)
NO (1) NO308691B1 (lt)
NZ (1) NZ234115A (lt)
PT (1) PT94557B (lt)
RU (1) RU2099420C1 (lt)
WO (1) WO1991000014A1 (lt)
ZA (1) ZA905123B (lt)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5674485A (en) * 1988-11-01 1997-10-07 The Regents Of The University Of California Insect diagnostic and control compositions with truncated JHE
US5643776A (en) * 1988-11-01 1997-07-01 The Regents Of The University Of California Insect diagnostic and control compositions
US6689356B1 (en) 1988-12-19 2004-02-10 The Regents Of The Unviersity Of California Recombinant baculoviruses producing insect toxins
GB9106185D0 (en) * 1991-03-22 1991-05-08 Wellcome Found Biological control agents
KR970704356A (ko) 1994-07-05 1997-09-06 스티븐슨 린다 에스. 유전공학적인 생살충제를 사용한 곤충구제 방법(insect control method with genetically engineered biopesticides)
EP0772399A1 (en) * 1994-07-27 1997-05-14 American Cyanamid Company Mixtures of genetically modified insect viruses with chemical and biological insecticides for enhanced insect control
US6156309A (en) * 1994-07-27 2000-12-05 University Of Georgia Research Foundation Insecticidal compositions and methods
US5662897A (en) * 1994-07-27 1997-09-02 U. Of Ga Research Foundation Insect viruses, sequences, insecticidal compositions and methods of use
US5639454A (en) * 1995-04-06 1997-06-17 Board Of Trustees Operating Michigan State University Recombinant baculovirus with broad host range
US5756340A (en) * 1995-05-08 1998-05-26 The Regents Of The University Of California Insect control with multiple toxins
US5716831A (en) * 1995-05-24 1998-02-10 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method and test kit for detecting insecticide resistance
US5925346A (en) * 1995-06-01 1999-07-20 Queen's University At Kingston Antisense strategy for the production of species specific viral insecticides
US5753249A (en) 1995-12-08 1998-05-19 Mycogen Corporation Materials and methods for pest control
US6596271B2 (en) 1996-07-12 2003-07-22 The Regents Of The University Of California Insect control method with genetically engineered biopesticides
US5882913A (en) * 1997-08-07 1999-03-16 The United States Of American As Represented By The Secretary Of Agriculture Strain of gypsy moth virus with enhanced polyhedra and budded virus production
US5853982A (en) * 1997-10-03 1998-12-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of isolating strains of the Lymantria dispar nuclear polyhedrosis virus
AUPP135698A0 (en) 1998-01-15 1998-02-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Insectical modalities
US6200561B1 (en) 1998-12-11 2001-03-13 BILIMORIA SHäN L. Use of viral proteins for controlling the cotton boll weevil and other insect pests
AU2002332534B2 (en) 2001-08-14 2007-08-16 Sentisearch, Inc. Nucleic acids and proteins of insect Or83b odorant receptor genes and uses thereof
AU2008284664B2 (en) * 2007-08-07 2014-05-15 Educational Foundation Jichi Medical University Baculoviral vectors with a dual vertebrate and baculovirus promoter controlling an immunogenic fusion gene
JP2010273676A (ja) * 2009-04-28 2010-12-09 Univ Of Tokyo 転移基で修飾された基質の製造方法
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
US9737592B1 (en) 2014-02-14 2017-08-22 David Gordon Bermudes Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7353847B2 (en) 2001-06-21 2008-04-08 Davy Process Technology Limited Method of loading a particulate solid into a vessel

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1441094A (en) * 1972-11-08 1976-06-30 Shell Int Research Cell culture
JPH0615447B2 (ja) * 1985-12-02 1994-03-02 進 前田 ウイルスを利用した殺虫剤及びその調製法
CA1336120C (en) * 1988-04-06 1995-06-27 Robert R. Granados Baculovirus proteins and viral pesticides containing same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7353847B2 (en) 2001-06-21 2008-04-08 Davy Process Technology Limited Method of loading a particulate solid into a vessel

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HORODYSKI FM ET AL.: "Isolation and expression of the eclosion hormone gene from the tobacco hornworm, Manduca sexta", PROC NATL ACAD SCI U S A., 1989, pages 8123 - 8127
KAWAKAMI A ET AL.: "Molecular cloning of the Bombyx mori prothoracicotropic hormone", SCIENCE, 1990, pages 1333 - 1335
LEISY DJ ET AL: "Conservation of genome organization in two multicapsid nuclear polyhedrosis viruses", J. VIROL., 1984, pages 699 - 702
N.J. PANOPOULOS: "Genetic Engineering in the Plant Sciences"
PARKE AND SMITH: "Drugs metabolites from microbes to man"
T N HANZLIK ET AL.: "Isolation and sequencing of cDNA clones coding for juvenile hormone esterase from Heliothis virescens. Evidence for a catalytic mechanism for the serine carboxylesterases different from that of the serine proteases", J. BIOL. CHEM., 1989, pages 12419 - 12425
WARREN, J. T. ET AL.: "Metabolism of ecdysteroids during the embryogenesis of Manduca sexta", J. LIQ. CHROMATOGR., 1986, pages 1759 - 1782

Also Published As

Publication number Publication date
LV10996A (lv) 1996-02-20
US5180581A (en) 1993-01-19
US5352451A (en) 1994-10-04
KR0165121B1 (ko) 1999-01-15
EP0432256A1 (en) 1991-06-19
WO1991000014A1 (en) 1991-01-10
AR243604A1 (es) 1993-08-31
FI104263B (fi) 1999-12-15
HU217846B (hu) 2000-04-28
ES2063370T3 (es) 1995-01-01
HUT58475A (en) 1992-03-30
DK35191D0 (da) 1991-02-28
IE62564B1 (en) 1995-02-08
NO910796D0 (no) 1991-02-27
DD296311A5 (de) 1991-11-28
AU5958890A (en) 1991-01-17
CA2033169A1 (en) 1990-12-30
NO308691B1 (no) 2000-10-16
PT94557B (pt) 1997-02-28
HU905629D0 (en) 1991-10-28
DE69007952D1 (de) 1994-05-11
DK35191A (da) 1991-02-28
CA2033169C (en) 1999-11-23
IL94820A (en) 1997-04-15
GEP19991540B (en) 1999-03-05
LV10996B (en) 1996-10-20
NZ234115A (en) 1991-09-25
EP0432256B1 (en) 1994-04-06
DE69007952T2 (de) 1994-10-13
FI104263B1 (fi) 1999-12-15
EG20419A (en) 1999-04-29
BR9006835A (pt) 1991-08-06
IL94820A0 (en) 1991-04-15
AU627910B2 (en) 1992-09-03
RU2099420C1 (ru) 1997-12-20
IE902391A1 (en) 1991-06-19
LTIP1581A (en) 1995-06-26
PT94557A (pt) 1991-02-08
JP2968997B2 (ja) 1999-11-02
NO910796L (no) 1991-02-27
KR920700545A (ko) 1992-08-10
IE902391L (en) 1990-12-29
ZA905123B (en) 1991-05-29
FI910968A0 (fi) 1991-02-27
JPH04500611A (ja) 1992-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
LT3807B (en) Insect control agents, process for preparing thereof, method of insects control, insecticidal composition, recombinant dna molecule, insect's virus, process for preparing viruses, proteines
KR100226241B1 (ko) 곤충-특이 마비성 신경독 유전자를 포함하는 재조합 dna 분자 및 그 신경독의 제조방법
Hawtin et al. Liquefaction ofAutographa californicaNucleopolyhedrovirus-Infected Insects Is Dependent on the Integrity of Virus-Encoded Chitinase and Cathepsin Genes
AU692290B2 (en) Insect viruses, sequences, insecticidal compositions and methods of use
JPH02502876A (ja) ワクチンと生物学的殺虫剤における組換えバクロウイルス閉塞体
JPH02502873A (ja) ヘリオティス発現系
Eldridge et al. Efficacy of a baculovirus pesticide expressing an eclosion hormone gene
KR20000048845A (ko) 곤충-특이적 진드기 독소 유전자를 발현하는 생물학적 곤충방제제, 방법 및 조성물
WO2006008652A1 (en) Insect population control
KR20010043627A (ko) 재조합 바큐로바이러스에 기초한 살충제
US6156309A (en) Insecticidal compositions and methods
US5639454A (en) Recombinant baculovirus with broad host range
US7009090B1 (en) Plants and feed baits for controlling damage from feeding insects
Kariuki A new baculovirus isolate for the control of the diamondback moth, Plutella xylostella (L.)(Plutellidae: Lepidoptera)
Park Effect of baculovirus infection and ecdysteroid glucosyl transferase gene expression on hormonal regulation in gypsy moth larval development
MXPA00010981A (es) Insecticidas con base en basculovirus recombinantes

Legal Events

Date Code Title Description
MM9A Lapsed patents

Effective date: 20031210