KR0165121B1 - 개량된 생물학적 곤충 조절제 및 그의 제조방법과 그를 이용한 곤충 조절방법 - Google Patents

개량된 생물학적 곤충 조절제 및 그의 제조방법과 그를 이용한 곤충 조절방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 곤충의 성장, 발육 또는 행동에 악영향을 미치는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 계량된 생물학적 곤충 조절제에 관한 것이다. 곤충의 탈피 및 번데기 형성을 막기 위해 유전자를 활성화하거나 먹이 섭취 행동을 바꾸고 성장을 억제하기 위해 유전자를 불활성화하면 결과적으로 곤충 숙주는 조기 사망하게 된다. 그러한 곤충 조절제는 엑디스테로이드 글루코실 트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자가 불활성화된 배큘로바이러스에 의해 실례화되어 있다.
부가적으로, 그러한 배큘로바이러스는 탈피에 악영향을 미치는 단백질을 형질발현시키기 위해 좀 더 변이시킬 수 있다. 또한 본 발명은 그 곤충 조절제를 제조하는 방법 및 곤충을 본 발명의 곤충 조절제에 노출시킴으로써 곤충을 조절하는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
개량된 생물학적 곤충 조절제 및 그의 제조방법과 그를 이용한 곤충 조절방법
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 국립보건원(National Institutes of Health) 기금(증서 제 AI-23719호)과 미국 농무성의 해치 액트(Hatch Act) 기금(증서 제 GE000918호)으로 개발되었다.
[기술분야]
본 발명은 개량된 생물학적 곤충 조절제 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 곤충의 성장과 발육을 조절하는데 효과적인 바쿨로바이러스 유전자 및 그 유전자 산물의 이용과 조절에 관한 것이다. 또한 본 발명은 유전자 변이시킨 바쿨로바이러스 및 감염된 해충에 대해 역영향을 미치는 다른 곤충 조절제에 관한 것이다.
[본 발명의 배경]
생물학적 해충 조절에 대한 관심은 종래 화학 살충제의 폐단 결과 부각되었다. 일반적으로 화학 살충제는 해로운 종(species)이외에 이로운 종에게도 영향을 미친다. 해충은 이러한 화학 살충제에 대한 저항성을 갖도록 급속히 변화하여 새로운 곤충집단을 형성한다. 더구나 화학 잔류물은 환경에 대해 악영향을 미치고 건강에 대한 근심거리를 유발하게 한다. 생물학적 조절이 화학살충제에 대한 의존도를 감소시킬 수 있는 해충 조절의 선택적 수단임을 제시한다.
생물학적 조절에 관한 첫 번째 전략은 곤충에 대해 병원성인 자연 발생적인 유기체(곤충 병원체)를 전개시켜 해충에 좀 더 저항성을 갖는 농작물을 개발하는 것이다. 연구방법은 곤충 조절제로서 적합한 표적물로의 역할을 할 수 있는 유전자 및 유전자 산물을 확인하고 특정화하는 것과 종래에 사용하지 않은 미생물을 확인하고 개척하는 것(곤충에 질병이 유발되도록 자연 발생적인 비병원성 미생물을 변이시키는 것을 포함), 현재 사용하는 곤충 병원체를 변이시키고 정제하는 것, 해충에 대해 높은 저항성을 나타내는 유전자 공학에 의해 생산된 농작물을 발육시키는 것을 포함한다. 곤충집단 내에서 자연 가축 유행병을 야기시키는 생물학적 살충제로서 개발되어 온 곤충병원체중 하나이다. 바쿨로바이러스는 절지동물만을 감염시키는 대규모 바이러스군이다.[Miller, L. K. 의 (1981) Genetic Engineering in the plant Sciences, N. Panopoulous, (ed.), Praeger Publ, New York, pp. 203-224 : Carstens 의 (1980) Trends in Biochemical Science 52 : 107-110 Harrap 및 Payne 의 (1979) Advances In Virus Research, Vol. 25, Lawfer 등 (eds.), Academic Press, New York, pp. 273-355 참조]. 많은 바쿨로바이러스는 상업적으로 중요한 농업 및 임업 작물의 해충을 감염시킨다. 그러한 바쿨로바이러스들은 생물학적 조절제로서의 잠재적인 가치가 있다. 다른 네 바쿨로바이러스가 미국 환경 보호 협회(U.S. Environmental Protection Agency)에 살충제로서 등록되었다. 생물학적 곤충 조절제로서 바쿨로바이러스의 잇점 중 하나는 그들의 숙주 특이성이다. 일군으로서의 바쿨로바이러스는 절지동물만을 감염시킬 뿐만 아니라 개별 바쿨로바이러스 균주는 항상 몇몇 한정된 곤충종만을 감염시킨다. 그러므로 바쿨로바이러스는 인간이나 환경에는 해를 미치지 않고 유용한 곤충종에는 부작용없이 사용할 수 있다.
바쿨로바이러스 아군은 ATCC 제 VR-1344호, ATCC 제 VR-1345호, ATCC 제 VR-2156호, 및 ATCC 제 VR-992호의 핵 다면성바이러스증 바이러스 (nuclear polyhedrosis viruses ; NPV), 과립증 바이러스(granulosis viruses ; GV), 및 비폐색 바쿨로바이러스(nonoccluded baculoviruses)를 포함한다. 바쿨로바이러스의 폐색형에 있어서, 비리온(누클레오캡시드에 싸여 있음)은 결정형 단백질 기질에 파묻혀 있다. 봉입체 또는 폐색체라 일컫는 이 구조는 자연계에서 유기체 외적으로 발견되는 유형이고 유기체 사이에 감염을 일으키는 역할을 담당한다. NPV 바이러스의 특징은 많은 비리온이 각 폐색체내에 파묻혀 있다는 점이다. NPV 폐색체는 상대적으로 크다(5㎛ 이내). GV바이러스의 폐색체는 좀 작으며 각각 단일 비리온을 함유한다. 두 유형의 폐색체를 가진 결정형 단백질 기질은 주로 폴리헤드린 또는 그래눌린으로 알려진 25,000 내지 33,000 달톤의 단일 폴리펩티드로 이루어져 있다. 비폐색 아군의 바쿨로바이러스는 폴리헤드린 또는 그래눌린 단백질을 생성하지 않고 폐색체를 형성하지 않는다.
자연계에서, 감염은 전형적인 폐색체 형태의 바쿨로바이러스 입자에 오염된 음식물을 곤충이 섭취할 때 이루어진다. 폐색체는 곤충중장(中腸)의 알칼리성 조건하에서 해리되어 개별 바이러스 입자를 방출한 후 장내 상피세포에 침입한다. 숙주세포내에서, 바쿨로바이러스는 복제가 일어나는 핵으로 이동한다. 초기에, 특정한 특이 바이러스 단백질이, 감염된 세포내에서 소위 시발 유전자(early genes)의 전사 및 번역에 의해 생성된다. 다른 기능들 중에서 이들 단백질은 바이러스가 세포내에 삽입된 후 4 내지 6시간째에 바이러스 DNA가 복제되도록 하는데 필요하다. 광범위한 바이러스 DNA의 복제는 감염 후(post-infection ; Pi), 약 12시간이내에 진행된다. Pi 약 8시간 내지 10시간에서부터 감염세포는 후기 바이러스 유전자 산물(late viral gene products)을 다량으로 생성한다. 이것은 자손 바이러스 입자를 형성하는 동안 바이러스 DNA를 둘러싸는 누클레오캡시드 성분을 포함한다. 자손 바이러스 입자의 생성은 Pi 12시간 쯤에 시작된다. 초기에 자손 바이러스는 세포표면으로부터 출아될 때 표면막(envelope)을 얻을 수 있는 세포막으로 이동한다. 폴리헤드린 합성은 감염 후 12시간 내지 18시간 사이에 시작하여 Pi 24시간까지 매우 높은 수준으로 증가한다. 그때 출아된 바이러스 입자의 수는 감소하고 자손 바이러스는 폐색체내에 파묻힌다. 폐색체 형성은 세포가 죽거나 용해될 때까지 계속된다. 어떤 바쿨로 바이러스는 실질적으로 숙주 곤충의 모든 조직을 감염시켜 결국 감염 과정 마지막에는 곤충의 온몸이 액체화되어 나중에 다른 곤충들을 감염 시킬 수 있는 매우 많은 수의 폐색체를 방출하게 한다.[The Biology of Baculoviruses, Vols. I 및 II, Granados 및 Federici(eds.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1986 참조].
바쿨로바이러스를 살충제로 사용할 때 한 가지 중요한 단점은 곤충이 바이러스를 섭취하여 죽기까지 걸리는 시간이다. 이 시간 동안 해충은 농작물을 계속 먹어치우고 피해를 입힐 것이다. 왜냐하면 재배자는 해충의 극성이 분명히 나타날 때까지는 살충제를 적용할 것 같지 않기 때문이며, 따라서 먹이섭취 시간을 최소화하는 것이 매우 중요하다.
곤충이 죽기전에 곤충의 먹이섭취를 감소시키는 생물학적 살충제가 필요하다. 생물학적 살충제는 화학 살충제보다 환경적인 피해가 덜하기 때문에 바람직하다. 곤충을 좀 더 빨리 죽이는 것 또한 바람직하다. 곤충 발육을 조절하는 단백질(들)을 암호하는 유전자(들)을 개발하고 그것을 다양한 유기체내로 삽입함으로써 해충의 개량된 생물학적 조절이 가능할 것이다.
[발명의 요약]
본 발명에서는 곤충의 성장, 발육 또는 행동에 영향을 미치는 바쿨로 바이러스 유전자 및 그것의 유전자 산물을 확인하였다. 본 발명은 곤충조절 전략에 있어서 이 유전자 및 유전자 산물을 이용하는 방법들 뿐만 아니라 이 유전자 및 유전자 산물을 불활성화시키는 방법들을 제공한다. 바람직한 실시구체형태에 있어, egt 유전자는 AcMNPV의 엑디스테로이드 UDP-글루코실 전이효소(EGT)를 암호한다. 바쿨로바이러스 egt 유전자의 발현은 곤충 탈피호르몬을 불활성시키는 EGT를 생성하여 유충이 탈피되거나 번데기로 되는 것을 방지한다. 바쿨로바이러스 egt 유전자가 불활성화되면 감염 유충은 탈피하고 번데기가 형성되는 과정은 계속 진행된다.
본 발명은 egt 유전자 및 그 유전자 산물을 이용한 광범위한 곤충 조절제를 포함한다. 본 발명의 곤충 조절제는 부적합한 EGT 단백질 합성이 야기되거나 아니면 해충의 정상적인 발육이 혼란되도록, 해충내 EGT 단백질의 정상적인 기능이나 발현을 차단시킨다.
바람직하게, egt 유전자를 함유하는 유기체는 해충에 대해 특이적인 바이러스이고 여기서 바이러스의 egt 유전자는 불활성화되어져 왔으며 이로 인해 상기 바이러스에 감염된 곤충 숙주는 계속적으로 발육할수 있었다. 곤충 숙주의 발육면에 있어서는 먹이섭취의 감소와 같은 행동의 변화가 생기고, 바이러스 살충제에 감염되었을 때 성장속도는 감소하고 사망속도가 더 빨라진다. 또한 본 발명은 개량된 바이러스 살충제의 제조방법 및 개량된 바이러스 살충제에 해충을 노출시킴을 포함하는 해충 조절방법을 제공한다.
본 발명에서 의도한 유전자 병형시킨 바이러스는 선행기술 바이러스보다 더 효율적인 살충제이다. egt 유전자를 자연적으로 발현하는 오토그라파 캘리포르니카(Autographa californica) 핵 다면성바이러스증 바이러스(AcMNPV) 및 오르기아 슈도츄가타(Orgyia pseudotsugata) 핵 다면성 바이러스증 바이러스(OpMNPV)와 같은 바쿨로바이러스들은 감염된 유충이 바이러스 감염으로 인해 죽기 전에 먹이섭취 기간을 연장시킨다. 본 발명은 바쿨로바이러스와 같은(여기에만 한정된 것은 아님) 바이러스들의 게놈내 egt 유전자를 불활성화시키는 것을 포함한다. egt 유전자는, β-갈락토시다제에 대한 비바이러스 표식 유전자와 같은 다른 유전자를 egt 유전자내에 삽입하거나 그 egt 유전자의 위치를 치환함으로써 불활성화시킬 수 있다. 어떠한DNA 서열이라도 이것이 egt 암호화 서열의 발현을 혼란시키는 한 egt 유전자를 혼란시키는데 사용할 수 있다. 택일적으로, 적당한 DNA 암호화 단편을 삭제함으로써 egt 유전자의 발현을 조절하는 게놈의 조절부분을 변형시키거나 제거할 수 있다. 또한 egt 유전자를 불활성화시키는 삭제부위를 갖는 바쿨로바이러스는 곤충 세포 배양주내에서 연속 바이러스 계대배양하여 생성시킬 수 있다.
그 결과 생성된 삭제 바이러스는 외래 DNA를 포함하지 않고, 기능적 egt 유전자가 결여되어 있다는 점에서만 야생형 바이러스와 다른 잇점을 지닌다. 이와 같은 변이 바쿨로바이러스는 현재 사용중인 바이러스보다 해충 조절제로서 더 좋은 기능을 갖는다. 유전자공학에 의해 생산된 살충제와 마찬가지로 단순한 삭제 돌연변이체로서의 상기 바이러스는 이들이 이형 DNA를 포함하고 있지 않으므로 미국 EPA와 같은 관리기관에 용인될 수 있어야 한다. 기능적 egt 유전자를 발현하지 않는 바쿨로바이러스는 곤충의 발육을 저해하는 egt 이외의 다른 유전자를 삽입함으로써 변이시킬 수 있으므로, 곤충 조절제로서 사용할 수 있을 정도로 바이러스의 효능이 증진된다.
본 발명은 또한 본래의 egt 유전자가 결여된 돌연변이 바이러스로 유충을 감염시키거나 기능적 EGT 산물을 발현할 수 없게 함으로써 해충을 조절하는 방법을 포함한다. 돌연변이 바이러스로 감염된 유충은 탈피하여 번데기가 되려고 하고 그 결과 야생형 또는 선행기술의 다른 바이러스로 감염된 유충보다 먹이섭취 기간이 짧아진다. 또한 돌연변이 바이러스로 감염된 유충은 야생형 또는 선행기술의 다른 바이러스로 감염된 유충보다 빨리 죽는다.
본 발명의 목적은 야생형 또는 종래 기술의 바이러스보다 더 유효한 살충제인 재조합 바이러스를 제공하는 것이다. 본 발명은 egt 유전자의 일부를 삭제하고 β-갈락토시다제를 암호하는 박테리아 유전자인 lacZ로 치환한, vEGTZ로 명명한 재조합 AcMNPV로 실례화된다. 본 분야의 숙련된 기술자들이 잘 알고 있는 바와 같이, egt 유전자를 불활성화시키는 어떠한 DNA 서열로도 치환할 수 있다. 또한 본 발명은 egt 유전자의 일부를 삭제한, vEGTDEL로 명명한 재조합 바쿨로바이러스에 의해 실례화된다. 다른 실시형태는 egt 유전자를 제거한 바쿨로바이러스 살충제이다. 또한 본 발명은 삭제부위를 함유하는 자연 발생적인 돌연변이에 의해 결과적으로 egt 유전자의 불활성화가 초래되는 바쿨로바이러스를 포함한다.
따라서, 본 발명의 목적은 해충 조절에 유용한 egt 유전자 및 그 유전자 산물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 범위내에서 엑디스테로이드 UDP-글루코실 전이효소 및 이에 대한 특이 항체가 실질적으로 정제된다. egt 유전자는, 표 1에 제시한 egt 유전자의 누클레오티드 서열에 대한 서열 상동에 의해 확인할 수 있거나 EGT 효소 활성도를 측정한 후에 후속적으로 DNA 분석하여 확인할 수 있다. 엑디스테로이드 UDP-글루코실 전이효소를 암호하는 어떠한 DNA 서열도 본원에서 정의한 바와 같은 egt 유전자이다. egt 단백질은 본 분야의 공지된 기술을 이용하여 정제할 수 있고, 그 검정 과정은 실시예 4에 언급되어 있다. 실질적으로 순수한 egt 단백질 제제는 적어도 약 70%(w/w)의 엑디스테로이드 UDP-글루코실 전이효소를 포함하는 것이다. 재조함 egt 단백질은, 이 단백질을 암호하는 유전자를 자연적으로 발생시키는 유기체 이외의 다른 모든 유기체에서도 생성시킨 것이다. 이 재조합 단백질은 유전공학 기술이나 재조합 DNA 기술의 결과로서 발현된다. 본 발명의 다른 목적은 유효한 살충제이며 또한 환경적으로도 용인될 수 있는 유전자 공학에 의해 생산된 바이러스를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 기능적 egt 유전자가 결여되어 있고 곤충의 발육을 저해하는 제2유전자(제2유전자는 본래 유기체내에 존재하지 않음)를 발현하는 재조합 살충제를 제공하는 것으로, 여기서 제2유전자는 탈피에 악영향을 미치는 유전자 산물을 암호하는 것이다.
그러한 유전자 산물은 곤충의 발육에 악영향을 미치는 곤충호르몬이나 탈피를 조절하는 곤충 호르몬을 불활성화시키는 효소일 수 있다. 그러한 특정예로는 전흉선자극호르몬(prothoracicotropic hormone), 부화 호르몬(eclosion hormone), 및 유충 호르몬 에스테라제(juvenile hormone esterase)가 포함된다. 이들 단백질을 암호하는 유전자들을 곤충 조절제를 생성하기 위해 곤충 바이러스 내에 삽입할 때, 이 바이러스는 egt 유전자를 함유하지 않은 것이거나 불활성화시킨 egt 유전자이어야 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전학적으로 삽입시킨 egt 유전자를 발현하나 곤충 조절제(egt 유전자는 자연적으로 발현되지 않음)로서 사용하기 위해 유전자 변이시킨 유기체를 제공하는 것이다. EGT를 발현하는 유전자 변이시킨 그러한 유기체들은 역으로 해충에게 악영향을 미칠 것이며 결과적으로는 식물에는 피해가 줄어들 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 농업용으로 적합한 살충제 조성물을 제공하는 것이다. 그러한 조성물은 본 분야의 기술자에게 공지된 바와 같이 농업용으로 적합한 담체, 및 egt가 불활성화되도록 유전자 변이시킨 바쿨로바이러스와 같은 곤충 바이러스를 포함한다.
그러한 EGT 바쿨로바이러스를, 탈피에 영향을 미치는 곤충 호르몬이나 탈피를 저해하는 곤충 호르몬을 불활성화시키는 효소를 암호하는 이형유전자가 발현되도록 좀 더 유전자 변이시킬 수 있다. 탈피를 저해하는 이형 유전자의 유전자 산물에는 전흉선자극호르몬, 부화 호르몬 및 유충 호르몬 에스테라제가 포함되나 여기에 한정되는 것은 아니다. 유전자 변이시킨 바쿨로바이러스를 포함하는 살충제 조성물을 분무용으로 제제하는 것이 바람직하다.
또한 살충제 조성물로서 예상되는 것은 농업용으로 적합한 담체 및 유전자 변이시킨 곤충 기생체를 포함한 것이다. 곤충 기생체는 유충과 밀접하게 관련되어 생존하거나 복제되어 그 유충에 역영향을 미치는 유기체이다. 곤충 기생체는 박테리아. 균류, 바이러스 또는 다른 곤충일 수 있다. 이와 같이 egt 유전자를 포함하는 유전자 변이시킨 곤충 기생체를 그 egt 유전자를 불활성시킴으로써 곤충 조절제로서 개량할 수 있다.
상기한 살충제 조성물은 모두 곤충의 먹이섭취를 자극하는 성분을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 살충제 조성물은 식물에 살포된 후 해충에 의해 섭취되고 살충제 조성물내의 곤충 조절제에 대해 민감한 해충들은 먹이 섭취가 감소하고 죽을 것이다.
본 발명의 다른 목적은 egt 유전자의 발현을 억제하거나 egt 유전자산물의 기능을 억제하는 변이된 생물학적 살충제를 제공하는 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 EcoRI과 HindIII 제한지도 및 지도 단위들로 나타낸 AcMNPV 게놈상의 egt 유전자의 위치를 나타내는 AcMNPV 게놈의 개략도.
제2도는 egt 유전자를 서열결정하여 그 서열을 분석한 결과의 개략도로서, 패널 A는 egt 유전자 부위의 제한 엔도누쿨레아제 지도를 나타내고, 패널 B는 오픈 리딩 프레임에 대한 상기 서열을 컴퓨터 보조 분석한 결과를 나타낸 것이며, 수직선은 정지코돈을 나타내고, 상기 서열은 각 DNA 가닥(1,2,3,1',2',3')에 대한 세 개의 모든 잠정적 오픈 리딩 프레임에서 번역된 것이며, egt에 상응하는 오픈 리딩 프레임(2)은 EGT로 표시한 것이고,
제3도는 AcMNPV(A) 및 재조합 바이러스 vEGTZ(B)와 vEGTDEL(C)의 egt 유전자 부위의 구조를 나타낸 개략도이되. 빗금친 부분은 lacZ 유전자를 나타내고,
제4도는 바쿨로바이러스 OpMNPV내의 egt 유전자를 확인하기 위한 겔 전기영동 및 서던 블롯 분석의 개략도.
제5도는 OpMNPV 게놈의 개략적인 제한지도이고,
제6도는 감염시키지 않은 대조 유충 또는 제4충기에서 야생형 AcMNPV나 vEGTZ로 감염시킨 후의 유충의 체중 증가량을 나타낸 그래프.
제7도는 제4충기에서 야생형 AcMNPV나 vEGTZ로 유충을 감염시킨 후의 유충의 사망률을 나타낸 그래프.
제8도는 제5충기에서 야생형 AcMNPV나 vEGTZ로 유충을 감염시킨 후의 유충의 체중 증가량을 나타낸 그래프.
제9도는 제 5충기에서 야생형 AcMNPV나 vEGTZ로 유충을 감염시킨 후의 사망률을 나타낸 그래프.
제10도는 제1충기에서 4.8 × 106다면성 세포 봉입체 (PIB)/ml 농도의 야생형 AcMNPV나 vEGTZ로 유충을 감염시킨 후의 유충의 사망률을 나타낸 그래프.
제11도는 제1충기에서 2.4 × 106PIB/ml 농도의 야생형 AcMNPV나 vEGTZ로 유충을 감염시킨 후의 유충의 사망률을 나타낸 그래프.
[본 발명의 실시구체형태에 대한 상세한 설명]
인시류 곤충둘은 알에서 성충으로 발육하는 동안 변화가 아주 특징적인 순서로 진행된다(보다 상세한 설명은, Comprehensive Insect Physiology, Biochmistry and Pharmacology, vols. 7 및 8, Kerkut 및 Gilbert(eds.), Pergamon Press, Oxford, 1984 참조].
부화 후 유충은 오랜기간 먹이섭취 시기에 들어가 이 기간 동안 계속적인 성장을 하도록 몇 차례의 탈피를 할 것이다. 연속적인 탈피시기 사이의 단계들은 충기라고 알려져 있다.
유충의 성장시기가 끝날무렵에 유충은 번데기가 되고 결국 성충이 되어 나온다. 탈피 및 번데기 과정(총괄하여 탈피(ecdysis)라 칭함)은 몇몇 다른 호르몬군의 공동작용에 의해 조절된다. 초기 자극은 특정 뇌세포들에 의한 전흉성자극호르몬(PTTH)의 방출이다. 이것은 엑디스테로이드를 생성하고 분비하는 전흉선을 자극하는데 흔히 엑디스테로이드를 곤충 탈피호르몬이라 일컫는다. 유충 호르몬 존재시에는 유충이 곧 탈피하는 반면 유충 호르몬 부재시에는 유충이 번데기로 될 것이다. 또한 부화 호르몬은 탈피와 관련된 몇몇 행동상의 변화를 중재함에 있어 중요하다.
바쿨로바이러스에 관한 많은 연구를 위한 모델계로서 사용하는 바쿨로 바이러스 AcMNPV는 종전에 알려지지 않은 방식으로 상기 곤충의 발육과정을 방해한다. AcMNPV에 감염된 유충은 AcMNPV가 엑디스테로이드 UDP-글루코실 전이효소 (EGT)의 합성을 유도하여, 특히 곤충의 엑디스테로이드를 불활성화하기 때문에 탈피 또는 번데기 형성이 더 이상 불가능하다.
본 발명의 발명자들이 EGT를 암호하는 유전자를 확인하였는데 그것은 AcMNPV 게놈상의 8.4내지 9.6 지도단위에 이른다.(제1 및 2도 참조). 제1도의 패널 C에 나타난 바와 같이, egt 유전자를 포함하는 바이러스 DNA 단편들을 플라스미드 pUC19, 블루스크립트 M13+ 및 블루스크립트 M13-에 클로닝시켰다. 제2도는 게놈상의 egt 부위의 제한지도 및 컴퓨터 보조 분석한 egt 부위의 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. 오픈 리딩 프레임 2가 비교적 긴 오픈 리딩 프레임을 가지므로 그것을 egt 유전자에 대한 암호화 부위로서 확인하였다. egt 유전자의 누클레오티드 서열 및 506개의 아미노산에 대한 연역 아미노산 서열은 표1에 나타나 있다. egt의 암호화 서열은 약 누클레오티드 149내지 약 누클레오티드 1670까지 연장되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 바쿨로바이러스 AcMNPV의 egt 유전자 부분을 β-갈락토시다제를 암호하는 박테리아 서열로 치환함으로써 상기 유전자를 불활성화시킨다. 이 재조합 바쿨로바이러스를 vEGTZ라 명명한다. 바람직한 두 번째 실시형태에서, AcMNPV egt 유전자 부분을 제3도에 나타난 바와 같이 치환없이 삭제한다. 야생형 AcMNPY 및 vEGTZ 감염 중에 합성된 단백질을 비교한 결과 감염된 세포들로부터 분비되는 60킬로 달톤의 단백질이 EGT 단백질이라는 사실이 드러났다. 곤충 바이러스의 egt 유전자를 불활성화시키기 위한 선택적 기작은 탈피에 악영향을 미치는 곤충 호르몬을 암호하는 유전자나 그 곤충 호르몬을 불활성화시키는 효소를 암호하는 유전자를 삽입하는 것인데, 이 유전자는 상기 곤충 바이러스로 감염된 곤충 세포내에서 발현가능하다.
진뱅크 데이터베이스(Genbank database)의 연구에서, egt와 몇몇 포유동물의 UDP-글루쿠로노실 전이효소 사이에 21내지 22%의 아미노산 서열이 상동이라는 사실이 드러났다. 상동성은 식물 UDP-글루코실 전이효소에서도 발견하였다. 이들 효소중 몇몇 효소의 아미노산 서열과 egt 아미노산 서열이 표2에 정렬되어 있다.
표2는 다른 종에서 선택한 UDP-글루쿠로노실 전이효소 및 UDP-글루코실 전이효소와 함께 egt 아미노산 서열의 정렬을 나타낸 것이다. egt의 예상 아미노산 서열을, 사람(HUMUDPGAT)[Jackson 등의 (1987) Biochem. J. 242 : 581 참조] ; 마우스(MUSUDPGAT[Kimura 및 Owens의 (1987) Eur. J. Biochem. 168 : 515 참조] : 및 랫 (RATUDPGAT)[MacKenzie의 (1987) J. Biol. Chem. 262 : 9744 참조] ; UDP-글루코실 전이효소와 옥수수 UDP-글루코실 전이효소 (ZMAYUDPGT) [Ralston 등의 (1988) Genetics 119 : 185 참조]에 대해 인터내셔날 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(International Biotechnologies Inc.)에서 수단으로 사용한 FASTP 연산방식[Lipman 및 Pearson의 (1985) Science 227 : 1435 참조]을 이용하여 비교해 놓았다. 대문자는 정확한 대응을 나타내고 소문자는 관련 단백질들 사이에서 자주 발생하는 치환을 나타내고 [Dayhoff의 (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundaton, Vol. 5, Supplement 3, Silver Spring MD 참조], 점(.)은 자주 발생하지 않는 치환을 나타내고, 하이픈(-)은 서열내 갭(gap)을 나타내며, 탈자부호( ) 표시는 서열로부터 삭제된 아미노산을 나타낸다. 화살표사이의 아미노산들은 vEGTZ 및 vEGTDEL내의 egt 유전자로부터 삭제된다. 공지된 UDP-글루코실 및 UDP-글루쿠로노실 전이효소들에 대한 AcMNPV 유전자의 상동성은 이 AcMNPV 서열이 egt를 암호하는 서열임을 확인하는 근거가 된다.
포유동물에서 UDP-글루쿠로노실 전이효소는 다양한 외인성 지방친화성 기질과 내인성 지방친화성 기질에 글루쿠론산을 전이하는 촉매 역할을 한다. [Glucuro nidation of Drugs and Other Compounds, Dutton(ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1986 참조].
이 결합 반응은 마약 및 발암물질을 해독하고 안전하게 제거함에 있어서 중요하다. 게다가 빌리루빈 및 스테로이드 호르몬과 같은 다양한 내인성 화합물의 정상대사와 배치는 글루쿠론산과의 결합을 통해 진행된다. 곤충계에 관한 유용한 증거는 이 유형의 당 결합반응(Sugar conjugation reactions)이 글루쿠론산 보다는 오히려 글루코스의 운반과 관련되어 있음을 지적해 준다 [smith 의 (1977) Drug Metabolism From Microbe to Man, PP 219-232, Parke 및 Smith(eds.), Taylor 및 Francis Ltd., London 참조]. 포유동물에서와 같이, 각양각색의 외인성 및 내인성 화합물은 곤충에서도 결합된다. 본 발명자들은 AcMNPV EGT 단백질이 글루코스를 엑디손, 20-히드록시엑디손 및 마키스테론 A와 같은 엑디스테로이드와 특이하게 결합시키는 UDP-글루코실 전이효소임을 입증하였다.(표 3 참조).
감염되지 않은 세포의 용해질이나 세포의 배지 모두 엑디손을 변형시키진 않는다. AcMNPV로 감염된 세포들에 의해 발현되는 대부분의 엑디스테로이드 그루코실 전이효소 활성도는 세포외 배지에 분비되는데 ; 비교적 낮은 수준의 활성도만이 AcMNPV로 감염된 세포 용해질에서 관찰되었다.
프로브로서 AcMNPV egt 유전자를 사용하여 다른 바클로바이러스, 즉 오르기아 슈도츄가타(Orgyia pseudotsugata) 핵 다면성바이러스증 바이러스(OpMNPV)에서 egt 유전자를 확인하였으며 그 결과는 제4도에 나타나 있다. 모든 바쿨로바이러스, 곤충 바이러스 또는 곤충의 egt 유전자를 본 발명의 실시예와 유사한 방식으로 위치를 정하고, 특정화하고 분리할 수 있는 본 발명의 잇점을 본 분야의 숙련된 기술자들은 인식할 것이다. 표 1의 서열과 최소한 70%의 누클레오티드 서열 상동성을 가지는 egt 유전자들을 표1의 서열과 동일한 것으로 간주하며, 엑디스테로이드 UDP-글루코실 전이효소를 암호하는 상동 유전자들을 제공하였다.
egt 유전자의 기능적 동등물은 또한 UDP-글루코스로부터 엑디스테로이드(들)에 글루코스 성분을 전이시킴으로써 엑디손과 같은 엑디스테로이드의 불활성화를 촉매하는 것들이다. 이들 egt 유전자의 기능적 동등물은 본 발명에서 기술한 검정 방법에 따라 확인할 수 있다.
본 분야의 기술자는 본 발명의 기술과 공지 기술을 이용하여 egt 유전자의 위치선정, 확인 및 분리와 함께 더 효율적인 곤충 조절제를 생성하기 위해 egt 유전자를 불활성화시킬 수 있다.
본 발명가들은 vEGTZ의 특성과 야생형(이하 wt라 약칭) AcMNPV의 특성을 비교함으로써, egt 유전자의 발현이 곤충의 탈피 또는 번데기 형성을 억제한다는 것을 밝혔다. wt AcMNPV로 감염된 곤충들은 탈피하거나 번데기를 형성하지 않지만, vEGTZ로 감염된 곤충들은 탈피하고 번데기를 형성하려고 한다.(실시예2의 표 4 참조).
탈피 및 번데기 형성이 억제됨으로써, 사실상 wt AcMNPV의 감염은 유충의 먹이섭취 기간을 연장시킬 수 있다. 제5충기(마지막 유충기) 초기에 wt 바이러스로 감염된 유충은 감염 후 유충이 죽는 5일 또는 6일까지 계속 먹이를 섭취한다. 그러나, 감염되지 않은 유충은 제5충기에 접어든 후 2일 내지 3일이 경과하면 먹이섭취를 중단하고 번데기를 형성하려고 한다.(제8도 참조). 더 이른 충기에서 실험한 유충에서도 이와 유사한 효과가 관찰된다. 감염되지 않은 유충은 탈피중에 약 24시간 동안 먹이섭취를 중단하는 반면에 wt AcMNPV로 감염된 유충은 탈피하지 않고 결과적으로 먹이섭취를 중단하지 않는다(제6도 참조).
기능적 egt 유전자가 결여된 재조합 바쿨로바이러스는 유충 먹이섭취 기간을 연장시키지 않는다. 그러므로 제5충기 초기에 vEGTZ로 감염된 유충은 감염 후 2일이 경과하면 먹이 섭취를 중단하고 번데기를 형성하려고 한다(제8도 참조). 그러나 이 유충은 번데기를 형성하지 않고 대신 제9도에 나타난 바와 같이 wt 바이러스로 감염된 유충보다 더 빨리 바이러스 감염으로 인해 죽게 된다. 이와 유사하게, 제4충기 초기에 vEGTZ로 감염된 유충은 감염 후 2일 경에는 탈피하기 위해 먹이섭취를 중단하고 wt 바이러스로 감염된 유충보다 더 빨리 죽게된다.(제6도 및 7도 참조). 기능적 egt 유전자가 결여된 바쿨로바이러스를 이용한 더 신속한 살충효과는 제10도 및 11도에 나타난 바와 같이 새로 부화된 제1충기의 유충을 wt AcMNPV 및 vEGTZ로 감염시켰을 때 가장 극적으로 나타난다. vEGTZ로 감염된 유충은 wt AcMNPV로 감염된 유충보다 3일 내지 4일 더 빨리 바이러스 감염으로 인해 죽는다. 그러므로 기능적 egt 유전자가 결여된 재조합 바쿨로 바이러스는 야생형 바쿨로바이러스 보다 상당히 더 효과적인 곤충 조절제일 수 있다. 본 분야의 공지된 모든 방법을 이용하여 모든 바쿨로바이러스 또는 곤충 바이러스내에서 egt 유전자를 비기능적이도록 할 수 있다는 점은 본 발명의 잇점과 함께 본 분야의 숙련된 기술자들에게 자명할 것이다.
상기한 효과 및 다음의 실시예에서 나타나는 효과는 본 분야에 있어 더욱 극적일 것이다. vEGTZ로 감염된 유충은 탈피에 있어 어려움을 보이고 조심스럽게 조절한 실험실 조건하에서만 성공적으로 탈피한다. 온도 및 빛을 엄밀하게 조절하지 않았을 때는 많은 곤충들이 무사히 탈피하지 못한다. 이 곤충들은 먹이섭취를 회복하지 못하고 그 후 짧은 시간내에 죽는다.
기능적 egt 유전자가 결여된 바쿨로바이러스로 감염된 유충내에 자손 바이러스가 축적될 수 있는 시간이 다소 짧아지고 감염된 곤충의 성장이 감소된다 할지라도 자손 바이러스는 충분한 양으로 생성된다. 후 충기에 접어든 유충을 vEGTZ로 감염시킨 결과 생기는 유충 한 마리당 수득되는 바이러스의 양은 wt 바이러스로 감염시켰을 경우 수득되는 양의 절반 정도이다. 이것은 논밭에 상기 바이러스를 전염시킬 수 있기에 충분한 양이며, 비용 효율적이면서 다량으로 바이러스 입자를 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 기능적 egt 유전자가 결여된 곤충 바이러스를 유전공학 기술에 의해 변형, 즉 그 산물이 곤충의 발육에 악영향을 미치는 제2유전자를 삽입함으로써, 기능적 egt 유전자가 결여된 곤충 바이러스가 생물학적 조절제로서의 효능을 발휘할 수 있도록 한다.
PTTH(펩티드 호르몬)를 암호하는 유전자를 egt 유전자가 삭제된 바이러스 게놈내로 삽입하여 탈피에 악영향을 미치기에 충분히 높은 수준으로 PTTH를 발현시킬 수 있다. 그러한 바이러스로 감염된 유충은 발육에 관여하는 호르몬 조절에 있어 극도의 혼란을 경험한다. 이 곤충들은 곧 병에 걸려 성장 및 발육이 매우 부진하고 먹이섭취가 감소되어 결국 조기 사망한다.
또한 부화 호르몬은 작은 펩티드 호르몬이므로 본 분야의 공지된 기술에 따라 이 유전자를 비기능적 egt 유전자를 가진 바이러스 게놈내로 삽입할 수 있다. 부화 호르몬은 탈피에 관련된 많은 행동상의 변화들을 조절하므로 이 호르몬을 충분히 높은 수준으로 생성하는 EGT 바이러스로 감염시킨 곤충은 먹이 섭취의 감소와 같은 행동 및/또는 발육 이상을 보인다.
유충 호르몬의 적정농도에 관여하는 제1조절자는 유충 호르몬을 불활성화하는 유충 호르몬 에스테라제 효소이다. 기능적 egt 유전자가 결여된 유충 호르몬 에스테라제를 충분한 수준으로 발현시키는 재조합 바이러스는 반대로 곤충의 행동 및/또는 발육에 악영향을 미칠 수 있다.
상기의 모든 유전자들을 야생형 바이러스 게놈내로 삽입시킬 수 있으나 이 유전자들이 야생형 바이러스내에서 곤충에 행동에 중요한 악영향을 미칠 것이라고는 기대되지 않는다는 점을 예의 주시해야 하는데 그 이유는 야생형 바이러스에 의한 egt 유전자의 발현은 다른 호르몬의 생성에는 관계없이 엑디스테로이드 탈피 호르몬을 불활성화시켜 탈피를 억제하기 때문이다. 따라서, 곤충의 탈피를 방해하도록 고안한, 바이러스의 생성과 관련된 성공적인 계획들은 본 발명에서 기술한 바와 같이 첫째로 egt 유전자의 불활성화에 달려있다.
본래의 egt유전자가 결여되어 있거나 기능적 egt 유전자 산물을 발현할 수 없는 돌연변이체, 및 다른 호르몬 변이 효소나 펩티드 호르몬이 발현되도록 더 유전자 변이시킨 돌연변이체가 본 발명의 곤충 조절제로서 포함된다는 사실은 본 분야의 숙련된 기술자에게 자명하다.
egt 유전자 산물은 유력하고 특이한 방식으로 곤충의 발육을 저해한다고 밝혀졌다. 엑디스테로이드는 모든 곤충종의 발육에 있어 필수적으로 중요한 역할을 한다. [Comprehensive Insect physiology, Biochemistry and Pharmacology, Kerkut 및 Gilbert (eds.), Pergamon Press, Oxford, 1984 참조]. 그러므로 egt 자체는 총괄적인 곤충조절 계획에 사용하기 위한 상당한 잠재력을 가진다. 예를들어, 본 발명의 네 번째 바람직한 실시 형태에 있어서, 모든 기술분야에서 공지된 기술을 사용하여 EGT 단백질이 구성성분으로서 생성되도록 농작물 종을 유전자 공학에 의해 생산할 수 있다.
그러한 농작물을 섭취하는 곤충들은 성충으로 완전하게 발육할 수 없을 것이므로 효과적인 장기간의 농작물 보호 방법을 제공한다.
이와 유사하게, 보통 식물 또는 곤충의 내부 또는 표면에 존재하는 박테리아를 EGT 효소가 생산되도록 본 분야의 공지된 기술에 따라 유전자 공학에 의해 생산할 수 있다. 그러한 박테리아 역시 효과적인 생물학적 조절제로서의 기능을 할 수 있을 것이다.
유사하게, 비식물병원성의 식물-군체형성 박테리아 (plant-colonizing bacteria)를 EGT 유전자가 발현되도록 유전자 변이시킬 수 있다. 유전자 변이시킨 이들 박테리아에 의해 군체화된 식물은 발현 단백질(들)의 작용에 민감한 해충으로부터 보호될 수 있다. 비식물 병원성의 식물-군체형성 박테리아는 미국 특허 제4,798,723호에 기술되어 있고 특정 식물-군체형성 박테리아의 유전변이체(modification)들은 미국 특허 제4,771,131호 및 EPO 공개 제 0185005호에 기술되어 있다. 상기에서 제시한 것과 같은 발현가능한 유전자들을 도입시키기 위해 본 분야의 모든 공지된 방법들을 사용하여 곤충 조절제를 생성할 수 있다.
유전자 변이시킨 식물체 또는 유전자 변이시킨 식물-군체형성 박테리아에 의해 군체화된 식물체를 감수성 곤충이 섭취하면 그 결과 곤충의 정상적인 발육은 혼란을 초래하게 된다. 진딧물과 같은 특정 곤충들이 특히 투과성 장(腸)조직을 가진다는 것은 공지된 사실이다. 본 분야의 숙련된 기술자는 상기 식물에서 발현 가능한 유전자를 구하기 위해 필요한 분자 생물학적 방법 및 그 식물의 게놈내로 상기 유전자를 삽입하는데 필요한 방법들을 알고 있다.
곤충은 스스로 그의 생활환 동안 특정 단계에서 발육을 조절하는 기작의 주요 구성요소가 되는 egt 유전자를 발현할 것 같다. 따라서, 곤충의 egt 유전자는 새로운 곤충 조절 계획에 있어 적당한 목표일 수 있다. 본 발명의 명세서는 상기 계획을 고안하기 위한 방법들을 제공한다.
본 발명의 부가적인 실시형태에 있어서, EGT 효소와 결합하지만 이 효소로부터 분리되고 방출될 수 없는 엑디스테로이드 유사체를 고안할 수 있다. 그러한 자살기질(suicide substrates)은 EGT 효소의 작용을 억제하거나 차단시키기 위해 경쟁적으로 결합할 것이고 결과적으로 곤충의 발육을 저해할 것이다. 택일적으로, 재조합 유기체를 본원의 기술을 이용하여 유전공학 처리할 수 있고 공지된 바와 같이 곤충 egt 유전자의 발현은 예를들어, 비전사 RNA(antisense RNA)의 생성을 통해 방지된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 곤충 조절제는 조성물이거나 해충에 역영향을 미치는 조성물의 활성성분이다. 곤충의 먹이 섭취는 곤충 조절제에 반응하여 감소하며 정상적인 곤충 탈피는 혼란을 일으켜 결국 곤충은 죽게 된다. 본 발명의 곤충 조절제는 엑디스테로이드 변이 효소를 암호하는 유전자를 불활성화시키기 위해 유전자 공학에 의해 생산한 곤충 바이러스 또는 곤충의 발육에 악영향을 미치는 단백질을 암호하는 이형의 유전자를 발현시키기 위해 더 유전자 공학에 의해 생산한 곤충 바이러스이거나 탈피에 악영향을 미치는 단백질을 암호하는 이형의 유전자를 발현시키기 위해 유전자공학에 의해 생산한 식물, 곤충 병원체 또는 비식물 병원성 박테리아일 수 있다.
해충 조절을 위한 식물 적용용으로 적합한 살충제 조성물은 농업용으로 적합한 담체 및 곤충 조절제를 포함한다. 본 발명의 살충제 조성물의 적용은 감수성 해충의 먹이 섭취를 감소시키고 살충함으로써 해충으로부터 식물을 보호할 수 있다.
본 분야의 숙련자는 특정 해충의 조절에 적합한 곤충 조절제(예를들어, 곤충 바이러스)를 선택하는 방법을 알고 있다.
곤충 조절제의 섭취, 흡입 또는 직접 접촉과 같은 종래의 방법으로 본 발명의 곤충 조절제에 해충을 노출시킬 수 있다는 사실을 본 분야 기술자는 이해할 것이다.
또한 곤충 조절제로서 고안한 것은 곤충의 발육에 악영향을 미치는 최소한 하나의 단백질을 발현하도록 유전자 변이시킨 식물 및 곤충 병원성 미생물이다. 그러한 단백질의 예로는 전흉선자극호르몬, 부화 호르몬, 유충 호르몬 에스테라제 및 엑디손 글루코실 전이효소가 포함되지만 여기에 한정되는 것은 아니다.
또한 박테리아 바이러스류, 균류 및 다른 곤충류를 포함하는 곤충 기생체를 egt를 발현하도록 유전자 변이시킬 수 있다. 그러한 곤충 기생체가 적합한 곤충에 기생하면 변이되지 않는 기생체와 관련하여 보통 나타나는 증상 이외에 정상 발육에 있어서의 혼란을 야기시키는 결과를 초래한다. 감염된 곤충들의 발육에 있어서의 혼란은 곤충 질병 상태를 악화시킨다. 해충의 감염으로 인해 먹이 섭취는 감소하고 죽음은 앞당겨질 것이다.
본원에서 기술한, 곤충의 발육에 악영향을 미치는 EGT 단백질을 암호하는 DNA 서열은 유기체에 적합한 프로모터의 일정 조절하에서 발현되며, 곤충 조절제를 생성하도록 유기체를 유전자 변이시키는데 사용할 수 있다. 유전자 변이를 위한 표적 유기체는 곤충 기생체류, 식물류 및 비식물병원성 식물 - 군체형성 박테리아를 포함한다.
egt 유전자, 유전자 산물, 이 유전자 산물에 대해 유도된 항체들, 및 이러한 것들과 관련된 또는 이러한 것들로부터 파생된 다른 모든 EGT 반응물들은 모두 본 발명의 범위에 포함된다. EGT 단백질은 실질적으로 본 발명에 따른 검정법 및 공지된 기술들을 이용하여 정제할 수 있다.
유전자 공학에 의해 생산된 본 발명의 바쿨로바이러스의 일차 용도는 식물의 해충을 생물학적으로 조절함에 있어서 효과적으로 식물에 적용되는 농약 성분으로서 사용하는 것이다. 곤충 조절을 위한 상기 농업용으로 적합한 조성물을 제조함에 있어 다양한 변화가 공지되어 있다.
식물 보호를 위한 살충제로서 유효한 농업 조성물을 제조하기 위해 곤충 조절제를 농축시킬 필요가 있는데 이러한 곤충 조절제의 농도는 사용한 유기체의 돌연변이체의 유형 및 조성물의 제제형에 따라 달라진다. 조성물내 곤충 조절제의 살충 유효농도는 실험을 통해 쉽게 결정할 수 있음을 숙련된 기술자는 알고 있다. 예를들어 바이러스 살충 유효농도는 실시예 6내지 11에 기재한 기술을 다양하게 응용함으로써 쉽게 결정할 수 있다.
농업 조성물은 농업용 및 현지에 살포하기에 적당해야 한다. 일반적으로 조성물 성분은 폐색 바이러스의 원상태에 해를 미치지 않고 식물에 비독성이어야 한다. 관엽식물에 적용할 경우 잎을 상해시키지 말아야 한다. 농업용 조성물은 적당한 고체형 담체 또는 더욱 바람직하게는 액체형 담체 이외에 점착제 및 접착제, 유화제 및 습윤제를 포함할 수 있으나 곤충의 먹이 섭취를 중단시키거나 어떠한 바이러스의 기능을 중단시키는 성분들은 포함할 수 없다. 또한 UV 불활성화로부터 곤충 조절제를 보호하는 성분을 첨가하는 것이 바람직 할 수 있다. 또한 해충 조절을 위한 농업 조성물은 곤충의 먹이섭취를 자극시키는 약제를 포함할 수 있다.
생물학적 곤충 조절제의 적용방법 및 농업적 적용방법을 기술한 평론지를 이용할 수 있다. 예를들어, Couch 및 Ignoffo의 (1981) Microbial control of Pests and Plant Disease 1970-1980, Burges (ed.), chapter 34, PP. 621-634 ; Corke 및 Rishbeth 의 동일문헌, chapter 39, PP. 717-732 ; Brockwell의 (1980) Methods for Evaluating Nitrogen Fixation, Bergersen (ed.), PP. 417-488 ; Burton 의 (1982) Biological Nitrogen Fixation Technology for Tropical Agriculture, Graham 및 Harris (eds.) PP. 105-114 ; 및 Roughley의 (1982) 동일문헌, PP. 115-127 ; The Biology of Baculoviruses, Vol.II, 상기문헌을 참조하시오.
본 발명은 다음의 실시예로 설명되되, 이는 어떤 식으로든 본 발명의 분명한 한계라고 해석될 수는 없다. 본 기술 분야의 숙련자들은 본 발명의 의도 및 / 또는 첨부한 특허청구의 범위를 벗어나지 않고서, 본 명세서와 동등하거나 다양한 다른 실시형태 및 변경이 가능함을 알 것이다.
[실시예 1]
AcMNPV 게놈상의 egt 유전자의 위치는 제1도에 도시되어 있다. AcMNPV 게놈의 지도위에 지도 단위의 규모가 나타나 있다. 이 유전자 및 측면 부위의 누클레오티드 서열을 결정하고 유전자의 후속적인 조작을 가능하도록 하기 위해 우선 이 부위를 포함하는 몇몇의 DNA 단편들을 플라스미드 백터내로 클로닝시킬 필요가 있다[표준 클로닝 방법에 관한 T.Maniatis 등의 (1982) Molecular cloning : a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY 참조]. 패널 A는 제한 엔도누클레아제 FcoRI 과 HindIII으로 절단한 후의 AcMNPV게놈의 선형지도를 나타낸다.
패널 B는 egt 유전자의 위치를 나타내는 7.6 내지 11.1 지도 단위 (mu)의 게놈을 확대시킨 것이다. 사용한 본래의 AcMNPV 균주는 미국 농무성에서 수득한 wt AcMNPV로부터 유도된 단일 플라크 분리물인 L1 균주 [Lee 및 Miller의 (1978) J. virol. 27 : 754 참조]인데, 본질적으로는 ATCC 제 VR-1344호의 E2 균주와 동일하다. 클로닝시킨 DNA 단편들 및 결과적으로 생성된 플라스미드들의 명칭이 제1도의 패널 C에 나타나 있다. 7.6mu의 PstI 부위로부터 11.1mu 의 BamHI 부위까지 연장되어 있는 단편 1을 ATCC 제 37254호의 플라스미드 벡터 pUC19내로 클로닝시킨다 ; 단편 2와 3 {각각 Pstl(7.6mu) 내지 EcoRI (8.65mu) 및 EcoRI (8.65mu) 내지 sall(10.5mu)}은 둘 다 벡터 블루스크립트 M13+ 및 블루스크립트 M13-에 클로닝시킨다.[미국 캘리포니아 샌디에고에 소재하는 스트라타진(Stratagene)에서 통상적으로 이용 가능함]. 단편 {4BstEII (8.35mu) 내지 BstEII (8.7mu)}는 블루스크립트 M13+에 클로닝시킨다.
BCPsE 및 BCES 플라스미드의 수많은 서브클론들이 생성된다. [Henikoff의 (1984) Gene 28 : 351 참조]. 이 서브클론들은 점차적으로 바이러스 삽입물의 보다 많은 삭제물을 갖는데 50 염기쌍 이하에서 전체 바이러스 단편까지의 범위를 갖는 차등적인 바이러스 DNA의 양을 가지게 된다. 그런다음 이들 많은 서브클론들 및 플라스미드 BCB를 서열결정하여 [Sanger 등의 (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463 참조] 전체 egt 유전자를 양방향으로 서열결정한다. 그 결과 수득한 누클레오티드 서열을 Pustell 및 Kefatos의 (1984) Nucl. Acids Res. 12 : 643 - 655 및 Devereaux 등의 (1984) Nucl. Acids Res. 12 : 387 - 396 문헌의 프로그램을 이용하여, 단백질을 암호할 수 있는 오픈 리딩 프레임의 존재를 컴퓨터로 분석한다. 이 분석은 egt 유전자가 506개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호한다는 사실을 나타낸다. egt 유전자의 누클레오티드 서열 및 egt 유전자의 예상 아미노산 서열은 표1에 나타나 있다.
[실시예 2]
기능적 egt 유전자를 발현할 수 없는 재조합 바이러스를 구성하기 위해 실시예 1에 기술한 플라스미드 클론들을 더 조작할 필요가 있다. 플라스미드 pUCBCPsB를 제한 엔도누클레아제 EcoRI 및 Xbal으로 절단하고 [egt 유전자내의 부위들을 나타낸 제3도 참조] 작은 단편을 제거한다. EcoRI 및 AhaIII으로 절단하여 pSKS104 [Casdaban 등의 (1983) Methods in Enzymology 100 : 293 - 303 참조] 로부터 잘라낸 E. coli lacZ 유전자를 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 Xbal 부위 사이에 삽입한다. 그 결과 생성된 플라스미드를 pEGTZ라 명명한다. 이 플라스미드내에 삽입시킨 lacZ 유전자는 선행 egt 암호화 서열과 함께 골격을 이룬다. 택일적으로, 플라스미드 pEGTDEL은 EcoRI 및 Xbal부위를 (두 부위를 블런트 말단으로 만든 후) 그들 사이에 아무런 서열도 삽입시키지 않고 서로 간단히 결합시켜 구성한다.
모든 바이러스들은 본래 AcMNPV L-1으로부터 유도하고 [Lee 및 Miller의 (1978) 상기문헌 참조] 플라크-정제하여 이미 기술한 방법들 [Lee 및 Miller(1978) ; Miller 등의 (1986) Genetic Engineering, Principles and Methods Vol.8 (eds. J. Setlow 및 A. Hollaender), Plenum Press, N.Y., PP 277-298, (1986) 참조]을 이용하여 ATCC 제 CRL 1711호의 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) IPLB-SF-21 세포주(SF 세포들) [Vaughn 등의 (1977) In Vitro 13 : 213-217 및 미국 캘리포니아 샌디에고에 소재하는 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 통상적으로 이용가능함] 내에서 증식시킨다.
그런다음 플라스미드 pEGTZ를 Miller 등의 (1986) 상기문헌에 기술된 바와 같이 wt AcMNPV DNA와 함께 SF 세포들 내로 공동형질감염시킨다. 이 과정은 바이러스 DNA와 플라스미드 DNA의 서열들 사이에서 상동 재조합(homologous recombination)이 일어날 수 있게하여 그 결과 바이러스의 egt 유전자를 플라스미드로부터의 egt - lacZ 융합 유전자로 치환하게 한다. 잔존하는 egt 암호화서열이 lacZ서열과 함께 골격을 이루기 때문에 그러한 재조합 바이러스는 β-갈락토시다제에 결합한 egt의 처음 84개의 아미노산을 포함하는 융합 단백질을 생성할 것이다. vEGTZ라 명명한 재조합 바이러스는 β-갈락토시다제의 발현이 5-브로모-4-크로로-3-인도릴-β-D-갈락토피라노시드(X-gal)와 같은 색소생성 지시약의 존재하에서 청색 바이러스 플라크를 나타내므로 확인할 수 있다. vEGTZ의 egt 유전자는 제3도, 패널 B에 도시되어 있다.
제조합 바이러스 vEGTDEL은 플라스미드 pEGTDEL와 바이러스 vEGTZ로부터 DNA를 SF 세포내로 공동형질감염시킴으로써 수득한다. 상동 재조합으로 인해 vEGTZ내의 egt-lacZ융합 유전자가 pEGTDEL로부터의 삭제 egt 유전자로 치환되는 결과가 초래한다. 재조합 바이러스 vEGTDEL은 X-gal의 존재하에서 청색 플라크를 형성하지 못함으로써 확인된다. vEGTDEL의 egt 유전자의 구조는 제3도, 패널 C에 나타나 있다.
[실시예 3]
egt 유전자 산물은 wt AcMNPV(EGT를 생성함)에 의해 합성되는 단백질과 vEGTZ 또는 vEGTDEL(EGT를 생성할 수 없음)에 의해 생성되는 단백질을 비교함으로써 확인된다. SF 세포를 O'Reilly 및 Miller의 (1990) J. Virol. 64 : 1321-1328 문헌에 기술된 바와 같이 감염 다중도(Multiplicity of Infection ; MOI) 20에서 wt AcMNPV로 감염시키거나 아니면 vEGTZ로 감염시킨다. 또한 감염시키지 않은 세포도 분석한다. 감염 6시간 후에 세포를 방사능 표지한 [ S] - 메티오닌의 존재하에서 1시간 동안 배양하면 이 기간 동안에 방사능 표지한 모든 단백질들이 생성된다. 그리고 나서 세포를 용균시켜 상기 단백질들을 SDS - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS - PAGE)에 의해 분리한다. [Laemmli 등의 (1970) Nature 227 : 680 - 685 참조]. 또한 세포로부터 분비되는 모든 단백질을 수확하고 분석한다. SDS - Page를 실시한 후, 방사능 표지 단백질을 오토레디오그래피로 검출한다. 60KDa의 단백질은 vEGTZ로 감염시킨 세포들이나 감염시키지 않은 세포들로부터가 아니라 wt AcMNPV로 감염시킨 세포들로부터 분비된다. 이 60KDa의 단백질은 wt AcMNPV로 감염된 세포들의 용균액에서는 검출할 수 없는데, 이는 그것이 wt AcMNPV로 감염된 세포들의 용균액에서는 검출할 수 없는데, 이는 그것이 wt AcMNPV 세포로부터 분비된다는 것을 나타낸다. 이 데이터는 egt 유전자 산물이 60KDa의 분비 단백질이며 누클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 잘 일치하는 성질을 가짐을 증명한다.
[실시예 4]
wt AcMNPV 또는 vEGTZ로 감염시킨 SF 세포들을 비교함으로써 EGT 단백질을 효소 활성도를 확인한다. wt AcMNPV 또는 vEGTZ로 감염시킨 SF 세포들에 관하여는 실시예 3에 기술되어 있다. 감염 후 12시간이 되면 세포와 세포외 배지를 모으고 개별적으로 실험한다. 감염시키지 않은 세포들도 병행하여 실험한다. 세포 용균액이나 세포외 배지를 O'Reilly 및 Miller 의 (1989) Science 245 : 1110 - 1112 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 1mM UDP - 글루코스 및 0.25 μ Ci[ H] 엑디손의 존재하에서 배양한다. 세포 용균액이나 배지에서의 엑디스테로이드 UDP - 글루코실 전이효소 활성도는 엑디손 - 글루코스 결합체를 형성하기 위해 UDP - 글루코스로부터 글루코스를 엑디손으로 전이시키는 것을 촉매할 것이다. 엑디손과 엑디손 - 글루코스 결합체를 실리카겔 얇은막 크로마토그래피로 서로 분리하고 [Bansal 및 Gessner의 (1988) Anal. BioChem. 109 : 321 참조] 오토레디오그래피로 가시화시킨다. 엑디손 - 글루코스 결합체(G)는 wt AcMNPV로 감염된 세포 용균액이나 세포외 배지를 검정할 때에만 형성된다. 감염되지 않았거나 vEGTZ로 감염된 세포 용균액 또는 배지를 사용할 때에는 결합체가 관찰되지 않는데 이것은 그 활성도가 egt의 발현에 달려있음을 의미한다. 그 활성도의 대부분은 세포외 배지에 위치해 있는데, 실시예 3에 기술된 데이터와 일치한다. 글루코스가 엑디손에 결합되어 있다는 증거는, UDP - 글루코스를 방사능 표지한 UDP - [U - C] 글루코스로 치환시키는 것을 제외하고는 상기한 바와 같은 wt AcMNPV로 감염된 세포 용균액을 검정함으로써 얻어진다. 반응은, 비방사능 표지한 UDP - 글루코스 또는 방사능 표지한 UDP - [U - C] 글루코스를 가지고, 양 반응 모두 [ H] 엑디손의 존재하에서 실행하였으며, 결합체를 섬광 계수함으로써 엑디손으로부터의 H와 글루코스로부터의 C 둘 다가 검출될 수 있었다. 이 데이터는 egt 유전자 산물이 UDP - 글루코스에서 엑디손으로 글루코스를 전이시키는 촉매 역할을 하는 UDP - 글루코실 전이효소라는 사실을 증명해 준다.
그런 다음 EGT의 기질 특이성을 더욱 철저히 연구하기 위한 실험을 한다. 이 실험에서는 상당한 egt 활성도를 함유하는 wt AcMNPV로 감염된 세포로 부터의 세포외 배지의 존재하에 다양한 기질(1mM)을 배양한다. 관찰된 모든 결합이 EGT 때문임을 확실히 하기 위한 대조로서, 각 기질 역시 EGT를 생성할 수 없는 감염시키지 않은 세포 및 vEGTZ로 감염시킨 세포들로부터의 배지와 함께 배양한다. 0.05μCi의 UDP - [U - C] 글루코스를 각 반응에 가한다. EGT에 대한 기질로서의 기능을 하는 모든 화합물은 글루코스와 결합될 것이다 ; 이들은 글루코스가 방사능으로 표지되었기 때문에 검출가능하다.
하나의 부가 대조는 굴루쿠론산이 이와 같은 반응에 의해 전이되지 않는다는 것을 증명하기 위해 UDP - [U - C] wt AcMNPV로 감염된 세포로부터의 배지를 수반한 개별 반응 세트에 글루쿠론산을 가한 것이다. 그 결과 수득한 데이터는 표3에 나타나 있다. 확인된 기질은 엑디손, 20 - 히드록시엑디손 및 마키스테론 A 뿐인데 이들 모두 엑디스테로이드이다. 모조물(mock)이나 vEGTZ로 감염된 세포들로부터의 배지를 사용한 경우 결합(conjugation)은 관찰되지 않았는데 이것은 관찰된 활성도가 egt의 발현 때문이란 사실을 확실히 해준다. UDP - [U - C] 글루쿠론산을 사용할 때 결합이 관찰되지 않는다는 것은 EGT가 글루쿠론산을 전이시키지 않는다는 것을 입증하는 것이다.
[실시예 5]
다른 바쿨로바이러스 또한 AcMNPV egt 유전자에 대해 실질적인 상동성을 가지는 유전자를 포함한다는 것을 입증하기 위하여, OpMNPV의 DNA를 분리하고 제한 엔도누클레아제인 EcoRI, BamHI 및 HINDIII로 각각 절단한다. 이 효소는 바이러스 DNA를 몇몇의 다른 크기의 단편으로 절단하는데 OpMNPV 게놈내의 그들의 위치는 이미 공지되어 있다 [Leisy 등의 (1984) J. Virol. 52 : 699 참조]
Maniatis 등의 (1982) 상기문헌에 기술된 바와 같이 서던 혼성화를 실시한다. AcMNPV egt 유전자의 내부 단편을 제한 효소 EcoRI 및 Xbal 으로 절단하여 플라스미드 BCES로부터 잘라낸다(제1도 참조). 이 단편을 p로 방사능 표지하고 OpMNPV 게놈내의 모든 관련 서열을 확인하기 위한 프로브로 사용한다. 본 기술분야에 공지된 바와 같이, 적당한 조건하에서 DNA 단편은 그와 유사하거나 동일한 서열을 갖는 다른 DNA 단편에 결합될 것이다. 그러므로 AcMNPV egt 프로브는 관련 DNA 서열을 함유하는 나일론 막위의 모든 OpMNPV DNA 단편에 결합해야 한다. 결합한 프로브의 위치는 그 막을 X-ray 필름에 노출시킴으로써 가시화될 수 있다. 우선 egt 프로브를 낮은 엄격한(stringency) 조건 (1M 염화나트륨, 9.3M 시트론산 나트륨, 5% 덱스트란 설페이트, 5x 덴하르트 용액, 및 0.25% SDS, 37℃)하에서 나일론 막과 혼성화시킨다. 이것은 프로브를 비교적 간접적으로 관련 서열에 혼성화하도록 한다. 혼성화의 엄격성은 특이적으로 혼성화하는 밴드들이 관찰될 때까지 혼성화의 온도를 상승시키거나 혼성화 용액에 포름 아미드를 가함으로써 증가량을 증가시킨다. 제4도를 위한 혼성화 조건은 1M 염화나트륨, 0.3M시트론산 나트륨, 5% 덱스트란 설페이트, 5x 덴하르트 용액 및 0.25% SDS, 68℃, 15시간이다. 그런 다음 막을 68℃에서 0.3M 염화나트륨, 0.1M 시트르산 나트륨, 0.1% SDS로 15분간 각각 2회 세척한다. OpMNPV DNA 의 특정 단편들, 즉 EcoRI 단편 B, BamHI 단편 A 및 HindIII 단편 N 및 S에 결합한 AcMNPV egt 프로브는 제4도에 나타나 있다. OpMNPV egt 유전자가 AcMNPV유전자와 유사한 게놈상의 상대적 위치에 존재한다는 사실은 주목할 만하다(제5도). 이와 유사한 프로토콜을 다른 곤충 병원체내의 egt 상동 유전자를 확인하는데 적용할 수 있다. 고수준의 분산 서열(dvergent sequence)이 실시예 4에 기술한 측정법을 이용하여 EGT 활성도를 확인하기 위해 필요할 것이란 사실은 이미 공지되어 있다. 게놈의 분자 유전학적 분석은 본 기술분야에 공지되어 있는 방법론학을 이용하여 EGT 효소를 암호하는 유전자를 분리하기 위해서 필요하다.
택일적으로, 실시예 4에 기술한 엑디스테로이드 UDP - 글루코실 전이효소 활성도를 위한 특정 분석법을 이용하여 다른 유기체 내에서도 EGT 유전자를 발견할 수 있다. 이 분석법은 통상의 생화학적 기술에 의한 정제과정 중에 효소를 확인하기 위해 사용한다. 정제한 후 EGT 단백질의 부분 아미노산 서열을 결정한다. 올리고누클레오티드 프로부 생성에 사용하는 다음 게놈상의 EGT 유전자의 위치를 확인하는데 이 자료를 이용한다.
[실시예 6]
엑디스테로이드의 혈임파 적정농도는 유충 - 유충 및 유충 - 번데기 - 탈피를 조절하기 위해 순환 방식으로 변화가 생기고, 글루코스 결합이 엑디스테로이드를 불활성화할 것으로 예상되기 때문에 [Warren 등의 (1986) J. Liq. Chromatogr. 9 : 1759 ; Thompson 등의 (1987) Arch. Insect Biochem. Physiol. 4 : 1 ; Thompson 등의 (1988) Arch. Insect Biochem. Physiol. 7 : 157 참조] AcMNPV 감염중에 egt 발현은 그 감염된 곤충의 정상적인 발육과정을 혼란시킬 것임을 짐작할 수 있다. 그러한 혼란을 입증하기 위해 새로 탈피한 제4충기의 에스. 프루기페르다(S. frugiperda) 유충에 wt AcMNPV 또는 vEGTZ을 주입하여 감염시키고 그들의 발육에 있어 모든 혼란상태를 매일 측정한다. 유충군에 음성 대조로서 조직 배양액을 주입한다. 이 실험 결과는 아래의 표4에 나타나 있다. 조직 배양액(모조물로 감염시킨 것)을 주입한 모든 유충은 예상한 바와 같이 제5충기로 탈피한다. wt 바이러스로 감염시킨 16마리의 유충들 중에서 한 마리 만이 변화가 생긴다. 반대로, 돌연변이 vEGTZ로 감염시킨 모든 유충은 제4충기에서 제5충기로 탈피한다. 그러므로 wt AcMNPV에 의한 egt 발현이 분명하고 명확하게 숙주 탈피를 억제한다. 두 감염군의 유충은 곧 바이러스 감염으로 죽게 되는데 이것은 egt의 붕괴가 vEGTZ에 의해 곤충 숙주가 죽게 되는 것을 방지하지 않는다는 것을 나타낸다.
제4충기의 에스. 프루기페르다 유충에 1 × 10 pfu의 wt AcMNPV 또는 vEGTZ 5μl를 주입한다. 모조물로 감염시킬 유충에는 5μl 조직 배양액을 주입한다. 각 군은 28℃에서 14:10 시간의 명:암 주기에서 인공식이로 유지시킨 16마리의 유충으로 구성되어 있다. [R. L. Burton의 (1969) ARS publication. PP. 33 - 134 참조]. 매일 유충의 탈피상태를 측정하고, 7일째에 사망률을 기록한다.
제5충기 초기에 주입한 유충에서 이와 유사한 결과를 얻을 수 있다. 새로 탈피한 제5충기의 유충을 사용하여 실험한 결과 wt 바이러스로 감염된 유충은 번데기를 형성하려는 기미가 전혀 보이지 않는 반면에 vEGTZ로 감염된 대부분의 유충은 급박한 유충 - 번데기 탈피의 특징인 몇몇 행동상의 변화 (먹이섭취의 중단, 방황, 및 방적)를 보인다. 그러나 양 바이러스로 감염된 유충은 모두 번데기가 되기 전에 죽는다. 이 데이터는 AcMNPV 감염으로 유충의 탈피 또는 번데기 형성이 방지된다는 것을 나타낸다. 또한 이 데이터는 곤충의 발육에 있어서 이러한 혼란이 egt의 발현 때문임을 나타낸다.
[실시예 7]
야생형(wt) AcMNPV 및 vEGTZ의 생체내 생물검정은, egt 유전자의 발현이 감염된 유충의 먹이섭취 기간을 연장시키고 egt의 혼란이 살충제로서 바이러스의 특징을 증진시킨다는 사실을 나타낸다. 이 연구에서 에스, 프루기페르다 유충을 제4충기 초기에 wt AcMNPV 또는 vEGTZ중 어느 하나로 감염시킨다. 비교용으로 대조 유충에 바이러스를 함유하지 않는 조직 배양액을 주입한다. 유충의 체중 증가량, 탈피 또는 번데기 형성 상태, 및 사망률을 매일 조사한다. 사망률(%)과 함께 다른 유충군의 매일 평균 체중 증가량은 제6도 및 7도에 각각 나타나 있다. 대조 유충의 경우 처음 2일 동안은 성장이 억제되는 것으로 나타난다. 두 번째 2일 동안은 대조 유충 모두 제5충기로 탈피한다. 그런다음 그것들은 번데기 형성의 준비기간 동안에 먹이섭취를 중단하기 전 2일 동안 더 극적으로 성장한다. wt AcMNPV로 감염된 유충 16마리 중 1마리만이 탈피하고, 나머지 유충들은 감염 후 3일 동안 계속적인 성장을 한다. 이 단계에서 유충들은 아프기 시작하나 5일이 될 때가지 죽는 유충은 없다. wt ACMNPV로 감염된 유충은 6일재에 모두 죽는다. 반대로 vEGTZ로 감염된 유충은 모두 제4충기에서 제5충기로 탈피하고 이 기간 동안 그들은 먹이 섭취를 중단한다. 이것은 1일에서 2일가지 성장하지 않음을 설명해 주는 것이다. 탈피 후 그것들은 먹이를 섭취하지만 3일째에 병의 기미를 보이기 시작한다. 감염후 4일째에 죽기 시작하여 5일째에 모두 죽는다. 기능적 egt 유전자가 결여된 AcMNPV 유도체로 감염된 유충은 먹이섭취가 줄어들고 야생형 AcMNPV로 감염된 유충보다 감염 후 훨씬 더 빨리 죽는다.
이 현상은 제5충기의 유충을 감염시켜보면 더 분명히 관찰된다.(제8도 및 9도) 예상한 바와 같이, 대조 유충은 그들이 번데기 형성을 위한 준비 기간 동안에 먹이 섭취를 중단하기 전 2일 동안 상당히 성장한다. 이 먹이섭취의 중단은 극적인 체중 손실을 수반한다. wt AcMNPV로 감염된 유충은 그러한 먹이섭취 중단의 기미를 보이지 않고, 그것들은 계속 먹이를 섭취하고 병이 나기전 2일동안 체중도 계속 증가한다. 감염후 7일까지 사망률은 완료되지 않는다.
요약하면, vEGTZ로 감염된 유충은 대조 유충의 경우와 같이 감염후 처음 2일동안만 먹이를 섭취한다. 이 기간 후 그것들이 번데기를 형성하기 위해 준비할 때 극적인 체중 손실이 생긴다. 그러나 이 유충의 어느것도 번데기를 형성하진 못하고, 그것들은 3일째에 병의 기미를 보이고 감염후 6일재에 모두 죽는다. 다시 말해서, vEGTZ 감염은 먹이섭취의 감소 및 조기 사망을 초래한다.
[실시예 8]
새로 부화한 제1충기의 에스. 프루기페르다 유충에 대해 vEGTZ 및 wt AcMNPV 감염의 효과를 비교한다. 신생 에스. 프루기페르다에 vEGTZ 또는 wt AcMNPV 다면성 세포봉입체(PIBs)를 다양한 농도로 함유하는 식이를 공급하고 사망률을 매일 측정한다. 두 개의 개별 투여량에 대해 수득한 결과가 제10도 및 11도에 나타나 있다. 두 투여량에 있어서, wEGTZ로 감염된 유충은 wt 바이러스로 감염된 유충보다 실질적으로 더 빨리 상당히 높은 사망률을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 일반적으로, 재조합 바이러스로 감염된 유충은 wt 바이러스로 감염된 유충보다 더 빠른 3일 내지 4일 사이에 죽는다. 이 결과는, 불확실성화된 egt 유전자를 포함하는 바쿨로바이러스가 본래의 egt 유전자를 갖는 wt 바쿨로바이러스보다 더 양호한 생물학적 살충제로서의 기능을 한다는 점을 지지해 준다.
[실시예 9]
전흉선 자극 호르몬(PTTH)을 발현하는 재조합 바이러스를 구성하기 위해 PTTH 유전자를 트랜스플레이스먼트 플라스미드인 pEVmodXIV (본 발명의 참고문헌으로 인용한 1989년 5어　 17일자 미국 특허 출원 제 07/353,847호에 기술되어 있음) 내로 클로닝 시킨다.
AcMNPV 폴리헤드린 유전자의 상류 및 하류 서열을 포함하는 이 플라스미드는 발현가능한 PTTH 유전자가 Egt 바이러스내로 상동 재조합 되도록 매개한다. 다중 클로닝 부위는 LSXIV - 변이 폴리헤드린 프로모터로부터 하류에 있는 보통의 폴리헤드린 번역 개시 부위에 위치시킨다. [Rankin 등의 Gene, 70 : 39 (1988) 참조]. 봄빅스 모리 (Bombyx mori) PTTH 유전자는 제한 효소 HindIII 으로 절단하여 플라스미드 pBc22K - C19 [Kawakami 등의, Science, 3347 : 1333(1990) 참조]로부터 잘라낸다. HindIII 부착말단을 T4 DNA 폴리머라제로 채우고 플라스미드를 FcoRI으로 절단한다. pEVmodXIV를 Kpnl으로 절단하고, Kpnl 돌출말단을 T4 DNA 폴리머라제로 제거한 다음 FcoRI으로 절단한다. PTTH 유전자를 함유하는 그 단편을 이들 부위를 경유하여 트랜스플레이스먼트 플라스미드 내로 클로닝 시킨다. 그 결과 생성된 플라스미드 pEVPTTH내에서 PTTH 유전자는 LSXIV - 변이 폴리헤드린 프로모터로부터의 하류에 근접하여 위치한다.
SF 세포내로 vEGTDEL 또는 wt AcMNPV DNA와 함께 pEVPTTH를 공동형질감염시킴으로써 PTTH를 발현하는 재조합 바이러스를 수득한다. 바이러스 DNA내의 측면 폴리헤드린 서열과 pEVPTTH내의 PTTH 유전자 측면 폴리헤드린 서열 사이의 조합 결과 폴리헤드린 유전자는 PTTH로 치환된다. 재조합 결과 생성된 바이러스는 그들의 폐색 - 음성 표현형 (occlusion - negative phenotype)으로 확인한다. [Miller 등의 Genetic Engineering, Principles and Methods, Vol. 8, J. Setlow 및 A. Hollaender, eds., Plenum Press N.Y., 1986, pp277 - 298 참조]. 각각의 재조합 바이러스를 vEGT PTTH 및 vWTPTTH로 명명한다.
유충 호르몬 에스테라제를 발현하는 재조합 바이러스를 생성하는 방법도 이와 유사하다. 첫째, 헬리오티스 바이래슨스 (Heliothis Virescens) 유충 호르몬 에스테라제 유전자 [Hanzlik 등의 (1989) J. Biol. Chem. 264 : 12419 참조]를 FcoRI 및 Kpnl 으로 절단하여 플라스미드 pJHE16B [Hammock 등의 (1990) Nature 344 : 458 참조]로부터 잘라낸다. 또한 트랜스플레이스먼트 플라스미드 pEVmodXIV를 FcoRI 및 Kpnl으로 절단하고, 유충 호르몬 에스테라제 유전자를 포함하는 단편을 이들 부위 사이에 삽입한다. 그 결과 pEVJHE는 유충 호르몬 에스테라제 유전자 측면의 폴리헤드린 유전자 서열을 포함한다. vEGTZ 또는 wt AcMNPV DNA와 함께 pEVJHE를 공동형질감염시키고 폐색 - 음성 플라크 (occlusion - negative plaques)를 선별하여 각각 재조합 바이러스 vEGTJHE 및 vWTJHE를 수득한다.
부화호르몬을 발현하는 재조합 바이러스를 구성하기 위해, 만듀카 섹스타(Manduca sexta) 부화 호르몬 유전자를 EcoRI 및 Hpal으로 절단하여 플라스미드 pF5 - 3 [horodyski 등의 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 8123 참조]으로부터 잘라낸다. pEVmodXIV를 Kpnl으로 절단하여 Kpnl 돌출 말단을 T4 DNA 폴리머라제로 제거한 후 EcoRI으로 절단한다. 트랜스플레이스먼트 플라스미드내로 그 부화 호르몬 유전자를 함유하는 단편을 삽입하여 재조합 pEVEH를 제조하되, 그 재조합 pEVEH 내의 부화 호르몬 유전자를 LSXIV - 변이 폴리헤드린 프로모터의 하류에 위치시킨다. vEGTZ 또는 vDA26Z DNA와 함께 이 플라스미드를 공동형질감염시키면 각각의 재조합 바이러스 VEGTEG 및 vDA26ZEH를 분리해 낼 수 있다. vDA26Z는 DA26 유전자 [O'Reilly 등의 J. Gen Virol, 발행중임]에 삽입된 E. coli lacZ 유전자를 가지는 재조합 바이러스이다. DA26 유전자의 기능은 공지되어 있지 않고, vDA26Z는 탈피에 관해서는 표현상 야생형이다.
lacZ 유전자의 존재로 인해 vDA26Z 유도체는 X - gal의 존재하에서 청색 플라크를 생성한다.
[실시예 10]
이 재조합 바이러스의 생체 내 효과를 평가하기 위해 에스, 프루기페르다 유충에 2×10 pfu의 vEGTDEL, VEGT PTTH, vWTPTTH을 주입하거나, 제3충기 후기 또는 제4충기 초기에 vEGT PTTH 및 vEGT JHE(각각 1×10 pfu)를 함께 주입한다. 매일 측정한 사망률은 표 5에 나타나 있다. 모든 EGT 바이러스의 경우 감염된 곤충은 제4충기 과정을 거치고 3일째에 급박한 탈피를 나타내는 헤드 캡슐 편차(head capsule slippage)를 보인다. vEGT PTTH 단독으로 또는 vEGT PTTH 와 vEGT JHE를 함께 감염시킨 후의 PTTH 발현은 감염된 곤충을 급속히 병에 걸리게하여 4일 째에는 현저한 사망률이 관찰된다. 대조적으로, vEGTDEL로 감염된 곤충은 5일까지 고려할 만한 사망률을 보이지 않는다. 예상한 바와 같이 vWTPTTH로 감염된 곤충은 제5충기로 탈피할 기미를 전혀 보이지 않는다. 헤드 캣슐 편차는 관찰되지 않고 곤충은 6일까지 고려할 만한 사망률을 보이지 않는다. 따라서 EGT의 부재하에서 PTTH의 발현은 vEGTDEL과 비교해 볼 때 감염 후의 사망시간을 하루 앞당긴다. 이 데이터는 곤충의 탈피에 악영향을 미치는 유전자를 발현시킴으로써 바쿨로바이러스의 살충특성을 개선시켰음을 증명하고, 상기 계획이 유효하도록 egt가 분명히 불활성화되었음을 보여준다.
[실시예 11]
곤충 발육에 악영향을 미치는 이형 단백질을 발현하는 폐색 - 양성 바이러스 (occlusion - positive virus)를 다음 계획에 따라 생성할 수 있다. 첫째, β-갈락토시다제를 발현하는 EGT 폐색-음성바이러스를 다음과 같이 구성한다. β-갈락토시다제를 암호하는 E.coli lacZ 유전자를 1989년 5월 17일자 미국 특허 출원제 07/353,847호에 기술된 트랜스플레이스먼트 벡터 pSynVI 내로 클로닝시킨다. pSynVI 는 합성 변이 폴리헤드린 프로모터의 하류에 근접하게 위치한 다중클로닝 부위를 수반한, AcMNPV 폴리헤드린 유전자로부터의 상류 서열과 하류 서열을 포함한다. 플라스미드 pSKS105 [Casadaban 등의 (1983) 상기문헌 참조]를 Pstl으로 절단하여 lacZ 유전자를 잘라낸다. Pstl 돌출 말단을 멍 빈 누클레아제(mung bean nuclease)로 제거하고, 그 플라스미드를 SstII로 절단한다. pSynVI 을 EcoRV 및 SstII로 절단하고 lacZ 유전자를 이들부위내로 클로닝시킨다. 그 결과 생성된 플라스미드를 pSynVI gal이라 명명하는데, 그것은 합성 변이 폴리헤드린 프로모터의 하류에 근접하게 위치한 lacZ 유전자를 포함한다. pSynVI gal을 vEGTDEL DNA와 함께 SF 세포내로 공동형질감염시키고, β-갈락토시다제를 발현하는 폐색 - 음성 플라크를 분리함으로써 바이러스 vEGT SynVI gal을 생성한다.
PTTH를 발현하는 폐색 - 양성 재조합 바이러스를 구성하기 위해 PTTH유전자를 트랜스플레이스먼트 벡터 pSpXIVVI+X3내로 클로닝시킨다.
pSpXIVVI+X3을 구성하기 위해, 우선 중간 플라스미드 pSpXIVVI+을 구성한다. 1989년 5월 16일자 ATCC 제 40607호의 pSpLSXIVVI+CAT [1989년 5월 17일자 미국 특허 출원 제 07/353,847호에 기술되어 있음]를 BgIII로 절단하고 그 말단을 DNA폴리머라제로 채운다. 플라스미드 pSynVI+wtp [1989년 5월 17일자 미국 특허 출원 제 07/353,847호에 기술되어 있음]를 EcoRV 및 Sacl으로 절단하고 작은 EcoRV - Sacl 단편을 정제한다. 두 플라스미드의 상기 단편을 결합시키고 pSpXIVVI+를 분리해 낸다. pSpXIVVI+ 플라스미드는 BgIII 부위에서 Sacl 부위까지의 다중클로닝 부위를 제외하고는 pSPLSXIVVI+CAT과 동일하며 pSynVI+wtp과 동일하다. 다중클로닝 부위 #3 [1989년 5월 17일자 미국 특허 출원 제 07/353,847호 참조]을 구성하기 위해 pSpXIVVI+ 의 EcoRI - Sacl 부위 사이에 폴리링커를 삽입한다. 융합된 BgIII 부위에서 Sacl 부위까지 pSpXIVVI+X3내의 다중클로닝 부위의 서열은 다음과 같다. :
이 플라스미드는 야생형 폴리헤드린 프로모터 조절하의 본래 폴리헤드린 유전자를 포함한다. 합성 변이 폴리헤드린 프로모터를 폴리 헤드린 유전자의 상류에 위치시키되 포리헤드린 유전자의 역방향으로 위치시킨다. 다중 클로닝 부위는 합성 변이 폴리헤드린 프로모터의 조절하에서 발현될 유전자의 삽입이 가능하도록 위치시킨다. 플라스미드 pBc22K - C19 [Kawakami 등의 (1990) 상기문헌 참조]를 HindIII로 절단하여 PTTH 유전자를 잘라낸다. HindIII 돌출 말단을 T4DNA 폴리머라제로 채우고 그 플라스미드를 EcoRI으로 절단한다. pSpXIVVI+X3을 EcoRI 및 Smal으로 절단하고 PTTH 유전자를 이들 부위내로 클로닝시켜 플라스미드 pSpPTTH를 형성한다. 이 플라스미드에서 PTTH 유전자는 야생형 폴리헤드린 프로모터 및 암호화 서열에 근접해 있되 이와 역방향으로 위치한, 합성 변이 폴리헤드린 프로모터의 하류에 위치한다. PTTH와 폴리헤드린 유전자 둘 다 AcMNPV내의 폴리헤드린 유전자 상류 및 하류 서열의 측면에 위치한다.
pSpPTTH를 vEGT-SynVI-gal DNA와 함께 SF 세포내로 공동형질감염 시킨다. 바이러스 DNA 내의 폴리헤드린 상류 및 하류 서열들과 그들의 측면에 위치한 pSpP-TTH내의 PTTH 및 폴리헤드린 유전자들 간의 재조합 결과 vEGT-SynVI-gal 의 lacZ 유전자는 pSpPTTH로부터의 PTTH 및 폴리헤드린 유전자로 대체된다. 재조합 바이러스 vEGT-SpPTTH는 폐색 - 양성, β-갈락토시다제 - 음성 표현형으로 확인한다.
유충 호르몬 에스테라제를 발현하는 폐색 - 양성 바이러스를 구성하기 위해, 플라스미드 pJHE16B [Hammock 등의 (1990) 상기문헌 참조]를 Kpnl으로 절단하여 유충 호르몬 에스테라제 유전자를 잘라내고 T4 DNA폴리머라제로 그 돌출 말단을 제거하고 EcoRI으로 절단한다. 유충 호르몬 에스테라제 유전자를, EcoRI 및 Smal으로 절단한 플라스미드 pSpXIVVI+X3내로 클로닝시킨다. 그 결과 생성된 플라스미드 pSpJHE를 재조합 바이러스 vEGT-SpJHE를 생성하기 위해 vEGT-SynVI-gal DNA와 함께 공동형질감염시킨다. 이 폐색 - 양성 바이러스는 합성 변이 폴리헤드린 프로모터의 조절하에서 유충 호르몬 에스테라제를 발현한다.
이와 유사하게, 플라스미드 pF5-3 [horodyski 등의 (1990) 상기문헌 참조]을 EcoRI 및 Hpal 으로 절단하여 부화 호르몬 유전자를 잘라 내고 EcoRI 및 Smal으로 절단한 pSpXIVVI+X3내로 클로닝시킨다. 그 결과 생성된 플라스미드 pSpEH를 재조합 바이러스 vEGT-SpEH를생성하기 위해 vEGT-SynVI-gal DNA와 함께 공동형질감염시킨다.
탈피에 악영향을 미치는 단백질 (곤충 펩티드 호르몬 또는 곤충 호르몬을 불활성시키는 효소)을 발현하도록 더 유전자 변이시킨 폐색 - 양성, EGT-바이러스는 단지 egt유전자를 불활성화시키기 위해서 유전자 변형시킨 바쿨로바이러스 또는 wt 바쿨로바이러스 보다 먹이 섭취가 감소하고 감염된 유충을 더 빨리 죽게 할 것이다.
실시예 11의 곤충 조절제는 폐색되었으므로 이 바이러스들을 감염 농작물에 적용할 수 있는, 살충제로서 유효하고 농업용으로 용인가능한 조성물내에 삽입할 수 있다. 상기 폐색 바이러스 입자가 섭취됨으로써 들판에 이들 바이러스가 증식되어 곤충 조절제를 분산시키는 결과를 초래한다. 감염은 곤충의 죽음을 야기하므로 해충으로부터 농작물을 보호할 수가 있다.
상기 내용은 본 발명의 바람직한 특정 실시형태에서만 관련된 것으로 첨부한 특허청구의 범위에서와 같은 본 발명의 의도 및 범위 내에서의 많은 수정 또는 변형이 가능하다.

Claims (39)

  1. 엑디스테로이드 DUP - 글루코실 전이효소를 암호하는 자연발생적인 유전자를 불활성화시킨 곤충 기생체를 포함함을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자가 egt 유전자임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제.
  3. 제1항에 있어서,상기 곤충 기생체가 곤충 바이러스임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제
  4. 제3항에 있어서, 상기 곤충 바이러스가 바쿨로바이러스임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 바쿨로바이러스가 핵 다면성바이러스증 바이러스임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵 다면성바이러스증 바이러스는 오토그라파 캘리포르니카 (Autographa californica) 핵 다면성바이러스증 바이러스 및 오르기아 슈도츄가타 (Orgyia pseudotsugata) 핵 다면성바이러스증 바이러스로 구성된 군에서 선택한 것임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제.
  7. 제6항에 있어서, 불활성화시킨, 엑디스테로이드 UDP - 글루코실 전이효소를 암호하는 유전자를 포함하는 상기 곤충 바이러스는 vEGTZ 및 vEGTDEL 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제.
  8. 제3항에 있어서, 상기 곤충 바이러스로 감염되는 곤충 세포들 내에서 발현가능하고 탈피에 악영향을 미치는 단백질을 암호하는 적어도 하나의 이형 유전자를 삽입함으로써 곤충 바이러스를 더 변이시킴을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 이형 유전자는 전흉선자극 호르몬, 부화 호르몬 및 유충 호르몬 에스테라제로 구성된 단백질을 암호하는 유전자군 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 이형 유전자가 전흉선자극 호르몬을 암호하는 유전자임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 유전자를 삽입함으로써 더 변이시킨 곤충 바이러스가 vEGT-SpPTTH 임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제.
  12. 제9항에 있어서, 상기 이형 유전자가 부화 호르몬을 암호하는 유전자임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 유전자를 삽입함으로써 더 변이시킨 곤충 바이러스가 vEGT-SpEH임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제
  14. 제9항에 있어서, 상기 이형 유전자가 유충 호르몬 에스테라제를 암호하는 유전자임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제.
  15. 제14항에 있어서, 상기 유전자를 삽입함으로써 더 변이시킨 곤충 바이러스가 vEGTSpJHE임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제
  16. 유기체내의 엑디스테로이드 UDP - 글루코실 전이효소를 암호하는 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함하되, 상기 유전자가 상기 유기체 게놈의 본래 부분임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제의 제조방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 유기체가 곤충 바이러스임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 곤충 바이러스가 바쿨로바이러스임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제의 제조방법
  19. 제26항에 있어서, 상기 바쿨로바이러스가 핵 다면성바이러스증 바이러스임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제의 제조방법.
  20. 제16항에 있어서, 엑디스테로이드 UDP - 글루코실 전이효소를 암호하는 유전자를 불활성화시킨, 삭제된 오토그라파 캘리포르니카 (Autographa californica) 핵 다면성바이러스증 바이러스 유도체를 곤충 세포 내에서 연속 계대배양한 후에 분리함을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제의 제조방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 핵 다면성 바이러스증 바이러스는 오토그라파 캘리포르니카 (Autographa californica) 핵 다면성바이러스증 바이러스 및 오르기아 슈도츄가타 (Orgyia pseudotsugata) 핵 다면성바이러스증 바이러스로 구성된 군에서 선택한 것임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 핵 다면성 바이러스증 바이러스는 vEGTZ 및 vEGTDEL 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제의 제조방법.
  23. 제16항에 있어서, 곤충 세포 내에서 발현 가능하고 탈피에 악영향을 미치는 단백질을 암호하는 이형 유전자를 삽입함으로써 상기 유기체를 변이시키는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제의 제조방법.
  24. 제23항에 있어서, 탈피에 악영향을 미치는 단백질을 암호하는 상기 제2유전자는 전흉선자극 호르몬, 부화 호르몬 및 유충 호르몬 에스테라제를 암호하는 유전자로 구성된 군에서 선택한 것임을 특징으로 하는 개량된 생물학적 곤충 조절제의 제조방법.
  25. 불활성화시킨, 엑디스테로이드 UDP - 글루코실 전이효소를 암호하는 유전자를 포함하는 곤충 조절제에 곤충을 노출시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 곤충 조절방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 곤충 조절제가 곤충 바이러스임을 특징으로 하는 곤충 조절방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 곤충 바이러스가 바쿨로바이러스임을 특징으로 하는 곤충 조절방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 바쿨로바이러스는 오토그라파 캘리포르니카 (Autographa californica) 핵 다면성바이러스증 바이러스 및 오르기아 슈도츄가타 (Orgyia pseudotsugata) 핵 다면성바이러스증 바이러스로 구성된 군에서 선택한 것임을 특징으로 하는 곤충 조절방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 바이러스로 감염되는 곤충 세포내에서 발현가능하고 탈피에 악영향을 미치는 단백질을 암호하는 이형 유전자를 삽입함으로써 상기 유전자를 불활성화시킴을 특징으로 하는 곤충 조절방법.
  30. 제29항에 있어서, 탈피에 악영향을 미치는 단백질을 암호하는 상기 제2유전자는 상기 바이러스로 감염되는 곤충 세포내에서 발현가능한, 전흉선자극호르몬, 부화 호르몬 및 유충 호르몬 에스테라제를 암호하는 유전자로 구성된 군에서 선택한 것임을 특징으로 하는 곤충 조절방법.
  31. 엑디스테로이드 UDP - 글루코실 전이효소를 암호하는 자연 발생적인 유전자를 불활성화시키기 위해 변이시킨 곤충 조절제 및 농업용으로 적합한 담체를 포함함을 특징으로 하는 살충 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 탈피에 악영향을 미치는 단백질을 암호하는 이형 유전자를 발현시키기 위해 더 변이시킨 곤충 조절제를 포함함을 특징으로 하는 살충제 조성물.
  33. 제31항 또는 32항에 있어서, 상기 곤충 조절제가 곤충 바이러스임을 특징으로 하는 살충제 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 곤충 바이러스가 바쿨로바이러스임을 특징으로 하는 살충제 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 바쿨로바이러스가 핵 다면성바이러스증 바이러스임을 특징으로 하는 살충제 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 핵 다면성바이러스증 바이러스는 오토그라파 캘리포르니카 (Autographa californica) 및 오르기아 슈도츄가타 (Orgyia pseudotsugata)로 구성된 군에서 선택한 것임을 특징으로 하는 살충제 조성물.
  37. 제17항의 개량된 생물학적 곤충 조절제의 제조방법을 이용하여 제조함을 특징으로 하는 곤충 바이러스.
  38. a) 제한 엔도누클레아제 EcoRI 및 Xbal 으로 pUCBCPsB를 절단하여 그 결과 생성된 큰 단편을 정제하고 ; b) 제한 엔도누클레아제 EcoRI 및 Ahalll으로 pSKS104로부터 lacZ 유전자를 잘라내고 ; c) pEGTZ를 형성하기 위해 T4 DNA 폴리머라제로 Xbal 블런트 말단을 만든 후 상기 lacZ 유전자를 상기 pUCBCPsB 의 큰 EcoRI - Xbal 단편과 결합시키고 ; d) SF 세포내로 pEGTZ 및 AcMNPV를 공동형질감염시키고 ; e) β-갈락토시다제가 발현됨으로써 바이러스 재조합체를 확인하고 ; f) 상기 재조합 바이러스, vEGTZ를 정제하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 vEGTZ의 제조방법.
  39. a) 제한 엔도누클레아제 EcoRI 및 Xbal 으로 pUCBCPsB를 절단하여 그 결과 생성된 큰 단편을 정제하고 ; b) (a) 단계의 상기 큰 DNA 단편의 양쪽을 블런트 말단으로 만들고 ; c) (b) 단계의 상기 큰 DNA 단편을 결합시키고 ; d) 상동 재조합이 가능하도록 SF 세포내로 pEGTDEL 및 vEGTZ를 공동형질감염시키고 ; e) β-갈락토시다제가 발현되지 않음으로써 재조합 vEGTDEL을 확인하고 ; f) 상기 재조합 vEGTDEL을 정제하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 vEGTDEL의 제조방법.
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