NO308691B1 - Insektbekjempelsesmiddel, anvendelse derav og insekticid blanding inneholdende nevnte middel, samt hovedsakelig ren ekdysteroid-UDP-glukosyltransferase og rekombinant DNA-molekyl som omfatter et gen som koder for transferasen - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse ble gjort med midler fra National Institutes of Health (bevilgning nr. AI-23719) og USA's regjering ved landbruksdepartementet ved "Hatch Act" bevilgning nr. GE 000918.

Den foreliggende oppfinnelse angår insektbekjempelsesmiddel og blandinger for forbedret biologisk bekjempelse av skadeinsekter. Mer spesielt angår den foreliggende oppfinnelse anvendelse og manipulasjon av et baculovirus-gen og dets genprodukt som er effektivt ved bekjempelse av veksten og utviklingen av insekter. Den foreliggende oppfinnelse angår også genetisk modifiserte baculovirus og andre insektbekjempelsesmidler som er skadelige for infiserte skadeinsekter.

Interessen for biologisk bekjempelse av skadeinsekter har oppstått som et resultat av ulemper ved vanlige kjemiske pesticider. Kjemiske pesticider påvirker vanligvis nyttige såvel som ikke nyttige arter. Skadeinsekter har tendens til å utvikle resistens overfor slike kjemikalier, slik at nye skade-insektpopulasjoner som er resistente overfor disse pesticider, hurtig kan utvikles. Videre utgjør kjemiske rester miljømessige farer og mulige helse-problemer. Biologisk bekjempelse gir en alternativ form for skadeinsektbekjempelse som kan redusere avhengighet av kjemiske pesticider.

De primære strategier for biologisk bekjempelse innbefatter utnyttelse av naturlig forekommende organismer som er patogene overfor insekter (entomopatogener), og utvikling av nyttevekster som er mer motstandsdyktige overfor skadeinsekter. Fremgangsmåter innbefatter identifikasjon og karakterisering av insektgener eller -genprodukter som kan tjene som egnede mål for insektbekjempelsesmidler, identifikasjon og utforsking av tidligere ubrukte mikroorganismer (innbefattende modifikasjon av naturlig forekommende ikke-patogene mikroorganismer for å gjøre dem patogene overfor insekter), modifikasjon og raffinering av entomopatogener som anvendes for tiden, og utvikling av nyttevekster som er frembrakt ved gensløyd og som viser større motstandsdyktighet overfor skadeinsekter.

Virus som kan forårsake naturlige epizootiske sykdommer hos insektpopulasjoner, er blant de entomopatogener som er blitt utviklet som biologiske pesticider. Baculovirus er en stor gruppe virus som bare infiserer artropoder (L.K. Miller (1981) i Genetic Engineering in the Plant Sciences,

N. Panopoulous (red.), Praeger Publ., New York, s. 203-224; Carstens (1980), Trends in Biochemical Science 52:107-110; Harrap og Payne (1979) i Advances in Virus Research, vol. 25, Lawfer et al. (red.), Academic Press, New York, s. 273-355). Mange baculovirus infiserer insekter som er skadedyr for kommersielt viktige landbruks- og skogbruksnyttevekster. Slike baculovirus er potensielt verdifulle som biologiske bekjempelsesmidler. Fire forskjellige baculovirus er blitt registrert for anvendelse som insekticider av U.S. Environmental Protection Agency. Blant fordelene med baculovirus som biologiske pesticider er deres vertsspesifisitet. Ikke bare infiserer baculovirus som gruppe bare artropoder, men individuelle baculovirus-stammer infiserer vanligvis bare én eller noen få insektarter. De innebærer således ingen risiko for mennesker eller miljøet og kan anvendes uten ugunstig påvirkning på gagnlige insektarter.

Baculovirus-undergrupper innbefatter nukleær-polyhedrosevirus (NPV), granulosevirus (GV) og ikke-okkluderte baculovirus. I de okkluderte former av baculovirus er virionene (innkapslede nukleokapsider) innleiret i en krystallinsk proteinmatriks. Denne struktur, omtalt som et inklusjons- eller okklusjonslegeme, er i den form som finnes utenfor organismen i naturen, og er ansvarlig for spredning av infeksjonen mellom organismer. Det karakteristiske trekk hos NPV-virus er at mange virioner er innleiret i hvert okklusjonslegeme. NPV-okklusjonslegemene er forholdsvis store (opp til 5 mikrometer). Okklusjonslegemer av GV-virusene er mindre og inneholder et enkelt virion hver. Den krystallinske proteinmatriks i okklusjonslegemene i begge former består hovedsakelig av et enkelt polypeptid på 25 000 - 33 000 dalton som er kjent som polyhedrin eller granulin. Baculovirus i den ikke-okkluderte undergruppe produserer ikke et polyhedrin- eller granulinprotein og danner ikke okklusjonslegemer.

I naturen startes en infeksjon når et insekt inntar mat som er forurenset med baculoviruspartikler, typisk i form av okklusjonslegemer. Okklusjonslegemene spaltes under de alkaliske betingelser i insekt-mellomtarmen og frigir individuelle viruspartikler som så trenger inn i epitelceller som dekker tarmen innvendig. Inne i en vertscelle vandrer baculoviruset til kjernen, hvor replikasjon finner sted. I begynnelsen dannes visse spesifikke virusproteiner i den infiserte celle via transkripsjon og translasjon av såkalte "tidlige gener". Blant andre funksjoner fordres det at disse proteiner gjør mulig replikasjon av virus-DNA, som begynner 4-6 timer etter at viruset kommer inn i cellen. Utstrakt virus-DNA-replikasjon foregår opp til 12 timer etter infiseringen (pi).

Fra ca. 8 til 10 timer pi danner den infiserte celle store mengder av "sene virusgenprodukter". Disse innbefatter komponenter i nukleokapsidet som omgir virus-DNA under dannelsen av avkom av viruspartikler. Dannelsen av virusavkom-partiklene begynner rundt 12 timer pi. I begynnelsen vandrer virus-avkom til cellemembranen hvor de får en kapsel idet de knoppskytes ut fra cellens overflate. Dette ikke-okkluderte virus kan så infisere andre celler i insektet. Polyhedrinsyntese begynner fra 12 til 18 timer etter infisering og øker til meget høye nivåer 24 timer pi. På dette tidspunkt er det en minskning i antallet knoppskutte viruspartikler, og virus-avkom innleires så i okklusjonslegemer. Okklusjonslegeme-dannelse fortsetter inntil cellen dør eller lyseres. Noen baculovirus infiserer faktisk hvert vev i vertsinsektet slik at ved slutten

av infiseringsprosessen er hele insektet omgjort til væske og frigjør meget store antall okklusjonslegemer som så kan spre infeksjonen til andre insekter.

(Omtalt i The Biology of Baculoviruses, vol. I og II, Granados og Federici (red.), CFC Press, Boca Raton, Florida, 1986).

Én betydelig ulempe ved anvendelse av baculovirus som pesticider, er tidslengden mellom virusinntak og insektdød. I løpet av dette tidsrom fortsetter skadeinsektet å spise og ødelegge nyttevekstene. På grunn av at en dyrker sannsynligvis ikke vil påføre pesticidet før etter at et skadedyr-angrep er synlig, er det avgjørende at spisetiden minimaliseres.

Det som trenges, er et biologisk pesticid som reduserer insektets fødeinntak før det dør. Et biologisk pesticid er foretrukket fordi det gir mindre miljømessig fare enn et kjemisk pesticid. Hurtigere insektdød er også

ønskelig. Utnyttelsen av et gen (gener) som koder for et protein (proteiner) som bekjemper insektets utvikling og dets innlemming i forskjellige organismer, vil gjøre mulig forbedret biologisk bekjempelse av skadeinsekter.

Ved den foreliggende oppfinnelse identifiseres et baculovirus-gen og

dets genprodukt som påvirker insektets vekst, utvikling eller oppførsel. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelse av dette gen og genprodukt såvel som inaktivering av dette gen eller dets genprodukt ved

insektbekjempelsesstrategier. Ved en foretrukket utførelsesform koder egt-genet for ekdysteroid-UDP-glukosyltransferase (EGT) fra AcMNPV. Ekspresjon av baculovirus-egt-genet bevirker dannelse av EGT, som inaktiverer insekt-hamskiftehormoner og således forhindrer at insektlarvene skifter ham eller forpuppes. Inaktivering av baculovirus-egt-genet gjør mulig at hamskifte og forpupping av den infiserte larve kan foregå.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter et vidt område av insektbekjempelsesmidler som utnytter egt-gener og deres genprodukter. Insektbekjempelsesmiddelet ifølge oppfinnelsen, kjennetegnes ved at det omfatter en baculovirus hvor et naturlifg forkommende gen som koder for et ekdysteroid UDP-glukosyl-transferase enzym er inaktivert, og eventuelt at baculoviruset er blitt ytterligere modifisert ved innsetting av minst ett heterologt gen, hvor det (de) heterologe gen(er) kan uttrykkes i insektceller infisert med viruset, og hvor genet (genene) koder for et protein som påvirker ekdysen.

Insektbekjempelsesmidlene ifølge den foreliggende oppfinnelse bevirker enten uhensiktsmessig syntese av EGT-proteinet eller forhindrer normal funksjon eller ekspresjon av EGT-proteinet i skadeinsektet slik at normal utvikling av skadeinsektet avbrytes.

Organismen som inneholder egt-genet, er fortrinnsvis et virus som er spesifikt for skadeinsektet og hvor egt-genet i viruset er blitt inaktivert, hvorved den fortsatte utvikling av insektverten infisert med viruset blir mulig. Utvikling av insektverten bevirker forandringer i oppførselen såsom redusert fødeinntak, og ved infeksjon med virus-pesticidet er det redusert vekst og hurtigere død.

De genetisk forandrede virus som er påtenkt ved den foreliggende oppfinnelse, er mer effektive pesticider enn virus ifølge teknikkens stand. Baculovirus, såsom Autographa californica nukleær-polyhedrosevirus (AcMNPV) og Orgyia pseudotsugata nukleær-polyhedrosevirus (OpMNPV) uttrykker naturligvis et egt-gen hvis ekspresjon forlenger det tidsrom en infisert larve tilbringer med spising før den bukker under for virusinfeksjonen. Den foreliggende oppfinnelse innbefatter inaktivering av egt-genet i genomet hos virus såsom, men ikke begrenset til, baculovirus. egt-genet kan inaktiveres ved at det på dets sted innføres, eller ved at det i dette innføres, et annet gen såsom ikke-virus-markørgenet for B-galaktosidase. Det må være klart at hvilken som helst DNA-sekvens kan anvendes til avbrytelse av egt-genet så lenge det avbryter ekspresjon av den egt-kodende sekvens. Alternativt kan hele, eller en del av, egt-genet fjernes fra genomet ved delesjon av et passende DNA-kodingssegment, eller den regulerende del av genomet som kontrollerer egt-genekspresjon, kan forandres eller fjernes. Baculovirus med delesjoner som inaktiverer egt-genet, kan også dannes ved serievirus-overføring i insektcellekultur. De resulterende deleterte virus har den fordel at de ikke inneholder noe fremmed DNA og er forskjellige fra villtype-virus bare på den måte at de mangler et funksjonelt egt-gen. Slike modifiserte baculovirus fungerer bedre som skadeinsekt-bekjempelsesmidler enn de virus som for tiden anvendes. Som enkle delesjonsmutanter skulle de også være akseptable for regulerende organer (f.eks. US EPA) som pesticider dannet ved gensløyd, fordi de ikke inneholder heterolog DNA. Baculovirus som ikke uttrykker et funksjonelt egt-gen, kan modifiseres ved innføring av andre gener enn egt som innvirker på insektutviklingen, og således forbedre effektiviteten av slike virus som insektbekjempelsesmidler.

Det beskrives også en fremgangsmåte for bekjempelse av skadeinsekter ved infisering av insektlarver med et mutant-virus som mangler et intakt egt-gen eller som ikke kan uttrykke et funksjonelt EGT-produkt. Larvene som er infisert med mutant-viruset, prøver å skifte ham og forpuppes og spiser følgelig i kortere tidsrom enn larver infisert med villtype-virus eller andre virus ifølge teknikkens stand. Insektlarvene infisert med mutantviruset dør også hurtigere enn villtypevirusinfiserte larver eller larver infisert med andre virus ifølge teknikkens stand.

Det er et formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et rekombinant virus som er et mer effektivt pesticid enn villtype-virus eller virus ifølge teknikkens stand. Den foreliggende oppfinnelse er eksemplifisert ved det rekombinante AcMNPV betegnet vEGTZ, hvor en del av egt-genet er blitt deletert og erstattet av lacZ, et bakteriegen som koder for G-galaktosidase. Hvilken som helst DNA-sekvens som inaktiverer egt-genet, kan erstattes, hvilket vil forstås av fagfolk på området. Den foreliggende oppfinnelse er ytterligere eksemplifisert ved det rekombinante baculovirus betegnet vEGTDEL, hvor en del av egt-genet er blitt deletert. En annen utførelsesform er et baculovirus-pesticid hvor egt-genet er blitt fjernet. Også innbefattet er baculovirus hvor en naturlig forekommende mutasjon, innbefattende en delesjonen, har resultert i inaktivering av egt-genet.

Det er følgelig et formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et egt-gen og dets genprodukt som er egnet til bekjempelse av skadeinsekter. Innenfor oppfinnelsens ramme er også hovedsakelig renset ekdysteroid-UDP-glukosyltransferase og antistoff som er spesifikt for denne, egt-gener kan identifiseres ved sekvenshomologi med nukleotidsekvensen av et egt-gen i Tabell 1 eller etter bestemmelse av EGT-enzymaktiviteten og etterfølgende DNA-analyse. Hvilken som helst DNA-sekvens som koder for en ekdysteroid-UDP-glukosyltransferase, er et egt-gen som definert i det foreliggende. Et egt-protein kan renses under anvendelse av teknikker som er kjent på området og analysefremgangsmåten beskrevet i Eksempel 4. Et hovedsakelig rent egt-proteinpreparat er et preparat som omfatter minst ca. 70 vekt% ekdysteroid-UDP-glukosyltransferase. Et rekombinant egt-protein er et protein som er blitt dannet i hvilken som helst annen organisme enn den hvor genet som koder for proteinet, naturlig forekommer. Det rekombinante protein uttrykkes som et resultat av genteknikk eller rekombinant DNA-teknologi.

Det er et annet formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et virus dannet ved gensteknikk, som er et effektivt pesticid og som også er miljømessig akseptabelt.

Det er enda et annet formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et rekombinant pesticid som mangler et funksjonelt egt-gen og uttrykker et andre gen som innvirker på insektutviklingen, hvor det annet gen ikke finnes naturlig i organismen. Dette annet gen er et gen som koder for et genprodukt som påvirker ekdyse. Et slikt genprodukt kan være et insekthormon som påvirker insektutviklingen, eller et enzym som inaktiverer et insekthormon som regulerer ekdyse. Spesifikke eksempler innbefatter prothorakikotropt hormon, eklosjonshormon og juvenil hormonesterase. Når gener som koder for disse proteiner, skal innlemmes i et insektvirus for dannelse av et insektbekjempelsesmiddel, må dette virus være ett som ikke inneholder et egt-gen eller ett hvor et egt-gen er blitt inaktivert.

Det er enda et annet formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en genetisk modifisert organisme for anvendelse som et insektbekjempelsesmiddel som uttrykker et genetisk innført egt-gen, hvor intet egt-gen naturlig var uttrykt. Slike genetisk modifiserte organismer som uttrykker EGT, vil skade skadeinsekter, hvilket resulterer i mindre ødeleggelse av planter.

Det er et ytterligere formål med denne oppfinnelse å tilveiebringe insekticide blandinger egnet for landbruksanvendelse. Slike blandinger omfatter en landbruksmessig egnet bærer man har erfaring med på området, og et insektvirus, såsom et baculovirus, som er blitt genetisk modifisert slik at et egt hos dette virus er inaktivert. Et slikt Egt-baculovirus kan ytterligere modifiseres genetisk for ekspresjon av et heterologt gen som koder for et insekthormon som påvirker ekdysen, eller et enzym som inaktiverer et insekthormon som påvirker ekdysen. Heterologe gener hvis genprodukter påvirker ekdysen, innbefatter, men er ikke begrenset til, prothorakikotropt hormon, eklosjonshormon og juvenil hormonesterase. Fortrinnsvis utformes insekticide blandinger omfattende genetisk modifiserte baculovirus for sprøytepåføring.

Som insecticide blandinger er også påtenkt slike som omfatter en landbruksmessig egnet bærer og genetisk modifisert insektparasitt. En insektparasitt er en organisme som lever eller replikeres i nær forbindelse med en insektlarve, og har skadelig virkning på denne larve. En insektparasitt kan være en bakterie, en sopp, en virus eller et annet insekt. En slik genetisk modifisert insektparasitt omfattende et egt-gen vil forbedres som insektbekjempelsesmiddel ved inaktivering av dette egt-gen.

Hver av de ovenfor angitte insekticid-blandinger kan videre omfatte bestanddeler for stimulering av insektspising. Insekticidblandingene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan inntas av skadeinsekter etter plante-påføring, og de skadeinsekter som er utsatt for insektbekjempelsesmidlet i insecticidblandingen, vil vise redusert fødeinntak og vil dø.

Det er et annet formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et modifisert biologisk pesticid som inhiberer ekspresjonen av egt-gen eller funksjonen av dets genprodukt.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er en skjematisk fremstilling av AcMNPV-genomet som viser beliggenheten av egt-genet. AcMNPV-genomet er presentert i kart-enheter og som EcoRI- og Hindlll-restriksjonskart. Fig. 2 er en skjematisk oppsummering av resultatene fra sekvens-bestemmelse av egt-genet og analysering av sekvensen. Felt A viser et restriksjonsendonuklease-kart over området. Resultatene av den datamaskin-assisterte analyse av sekvensen for åpne leserammer vist på Felt B. De vertikale linjer viser stoppkodoner. Sekvensen translateres i alle de tre potensielle åpne leserammer for hver DNA-kjede (1, 2, 3, 1', 2', 3'). Den åpne leseramme (2) som svarer til egt, er merket EGT. Fig. 3 er en skjematisk fremstilling av strukturene av egt-genområdene hos AcMNPV (A) og de rekombinante virus vEGTZ (B) og vEGTDEL (C). Det skraverte felt representerer lacZ-genet. Fig. 4 er en skjematisk fremstilling av agarosegelelektroforese og "Southern blot"- analyse for identifikasjon av et egt-gen i baculovirus OpMNPV.

Fig. 5 er et skjematisk restriksjonskart over OpMNPV-genomet.

Fig. 6 er et diagram over vektøkning hos ikke-infiserte kontrollarver eller etter infisering av larver på fjerde stadium med wt-(villtype-)AcMNPV eller vEGTZ. Fig. 7 er et diagram over larve-dødelighet etter infisering av larver på fjerde stadium med wt-AcMNPV eller vEGTZ. Fig. 8 er et diagram over vektøkningen etter infisering av larver på femte

stadium med wt-AcMNPV eller vEGTZ.

Fig. 9 er et diagram over larve-dødelighet etter infisering av larver på

femte stadium med wt-AcMNPV eller vEGTZ.

Fig. 10 er et diagram over larve-dødelighet etter infisering av larver på første stadium med wt-AcMNPV eller vEGTZ med en konsentrasjon på 4,8 x 10<6>polyhedriske inklusjonslegemer (PIB)/ml. Fig. 11 er et diagram over larve-dødelighet etter infisering av larver på første stadium med wt-AcMNPV eller vEGTZ med en konsentrasjon på 2,4 x 106 PIB/ml.

Detaljert beskrivelse av de beskrevne utførelsesformer

Sommerfuglinsekter gjennomgår en godtkarakterisertsekvens av fenomener under utvikling fra egg til fullt utviklet insekt (se Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology, vol. 7 og 8, Kerkut og Gilbert (red.), Pergamon Press, Oxford, 1984, for detaljerte beskrivelser). Etter utklekking kommer insektlarven inn i en periode med meget stort fødeinntak, og i løpet av dette tidsrom vil den skifte ham flere ganger for at stadig vekst skal kunne finne sted. Trinn mellom etter hverandre følgende hamskiftinger er kjent som stadier. Ved slutten av larvevekst-tidsrommet forpuppes larven og kommer til slutt ut som fullt utviklet insekt. Hamskifte- og forpuppingsprosessene (samlet betegnet ekdyse) reguleres ved de felles virkninger av flere forskjellige hormongrupper. Initial-stimulusen frigjøres av prothorakikotropt hormon (PTTH) av visse hjerneceller. Dette stimulerer pro-torakskjertlene til å danne og utsondre ekdyseteroider, ofte omtalt som insekt-hamskiftehormoner. I nærvær av juvenilt hormon vil et larve-hamskifte oppstå, mens larven i fravær av juvenilt hormon vil forpuppes. Eklosjonshormon er også viktig ved formidling av flere oppførselsforandringer forbundet med ekdyse.

Baculovirus AcMNPV, som anvendes som modellsystem for mye baculovirus-forskning, innvirker på insektutviklingsprosessen omtalt ovenfor på tidligere uant måte. Insektlarver infisert med AcMNPV er ikke lenger i stand til å skifte ham eller forpuppes, fordi AcMNPV styrer syntesen av et enzym kjent som ekdysteroid-UDP-glukosyltransferase (EGT), som spesifikt inaktiverer insekt-ekdysteroidene.

Genet som koder for EGT, ble identifisert av oppfinnerne; det strekker seg fra 8,4 til 9,6 kart-enheter på AcMNPV-genomet (Fig. 1 og 2). Som vist på Felt C på Fig. 1, er virus-DNA-fragmenter som omfatter egt-genet, blitt klonet i plasmidene pUC19, Bluescript M13+ og Bluescript M13-. Fig. 2 viser restriksjonskartet for egt-området i genomet og den datamaskin-assisterte åpne leseramme-analyse av egt-området. Bare leseramme 2 inneholder en forholdsvis lang åpen leseramme, som er blitt identifisert som kodingsområdet for egt-genet. Nukleotidsekvensen i egt-genet og den utledede aminosyresekvens på 506 aminosyrer er vist i Tabell 1. Kodingssekvensen i egt strekker seg fra ca. nukleotid 149 til ca. nukleotid 1670.

Ved en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse inaktiveres egt-genet i baculovirus AcMNPV ved at en del av egt-genet erstattes med en bakteriell sekvens som koder for B-galaktosidase. Dette rekombinante baculovirus betegnes vEGTZ. Ved en andre foretrukket utførelsesform utelukkes en del av egt-genet i AcMNPV uten erstatning, som vist på Fig. 3. En sammenlikning av proteinene syntetisert under wt-AcMNPV- og vEGTZ-infisering viste at EGT-proteinet er et protein på 60 kDa som utsondres fra infiserte celler. En alternativ mekanisme for inaktiveringen av insektvirus-egt-genet er innføring av et gen som koder for et insekthormon som påvirker ekdysen eller et enzym som inaktiverer et insekthormon som påvirker ekdysen, hvilket gen kan eksprimeres i en insektcelle infisert med dette insektvirus.

En undersøkelse av Genbank-databasen viste 21-22% aminosyresekvens-homologi mellom egt og flere pattedyrs-UDP-glukuronosyltransferaser. Homologi ble også funnet med en plante-UDP-glukosyl-transferase. Oppstilling av egt-aminosyresekvensen på linje med amino-syresekvensene hos noen av disse enzymer er vist i Tabell 2.

Tabell 2 illustrerer egt-aminosyresekvensen oppstilt på linje med et utvalg av UDP-glukuronosyltransferaser og en UDP-glukosyltransferasefra andre arter. Den forutsette egt-aminosyresekvens er sammenliknet med human (HUMUDPGAT) (Jackson et al. (1987) Biochem. J. 242:581; mus (MUSUDPGAT) (Kimura og Owens (1987) Eur. J. Biochem. 168:515; og rotte (RATUDPGAT) (MacKenzie (1987) J. Biol. Chem. 262: 9744); UDP-glukuronosyltransferaser og mais-UDP-glukosyltransferase (ZMAYUDPGT)

(Ralston et al. (1988) Genetics 119:185), under anvendelse av FASTP-algoritmen (Lipman og Pearson (1985) Science 227:1435), som utført av International Biotechnologies Inc. Bokstaver i øvre rekke angir nøyaktige motstykker; bokstaver i nedre rekke angir substitusjoner som ofte opptrer blant beslektede proteiner (Dayhoff, 1978) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Vol. 5, Supplement 3, Silver Spring, MD); prikker representerer substitusjoner som ikke opptrer ofte; bindestreker angir gap i en sekvens; og et innskuddstegn viser hvor en aminosyre er blitt utelukket fra sekvensen. Aminosyrene mellom pilene er utelukket fra egt-genet i vEGTZ og vEGTDEL. Homologien mellom AcMNPV-genet og kjente UDP-glukose- og UDP-glukuronosyltransferaser understøtter identifikasjonen av denne AcMNPV-sekvens som egt-kodingssekvensen.

Hos pattedyr katalyserer UDP-glukuronosyltransferasene overføringen av glukuronsyre til mange forskjellige både eksogene og endogene lipofile substrater (omtalt i Glucuronidation of Drugs and Other Compounds, Dutton (red.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1986). Denne konjugeringsreaksjon er viktig ved detoksifisering og sikker eliminering av visse legemidler og karsinogener. Dessuten foregår den normale metabolisme og bortskaffelse av forskjellige endogene forbindelser såsom bilirubin og steroidhormoner via konjugering med glukuronsyre. Tilgjengelig bevismateriale når det gjelder insektsystemer viser at sukkerkonjugeringsreaksjoner av denne type innbefatter glukose- i stedet for glukuronsyreoverføring (omtalt i Smith (1977) i Drug Metabolism - From Microbe to Man, Parke og Smith (red.), Taylor og Francis Ltd., London, s. 219-232). Som hos pattedyr, er mange forskjellige eksogene og endogene forbindelser underkastet konjugering i insekter.

Oppfinnerne har vist at AcMNPV-EGT-proteinet er en UDP-glukosyl-transferase med spesifikt konjugerer glukose med ekdysteroider såsom ekdyson, 20-hydroksyekdyson og makisteron A (se Tabell 3). Verken lysater eller ekstracellulært medium for ikke-infiserte celler eller VEGTZ-infiserte celler modifiserer ekdyson. Mesteparten av ekdysteroidglukosyltransferase-aktiviteten eksprimert av AcMNPV-infiserte celler utsondres i det ekstracellulære medium; bare et forholdsvis lavt aktivitetsnivå observeres i AcMNPV-infiserte cellelysater.

Under anvendelse av AcMNPV-egt-genet som probe er et egt-gen blitt identifisert i et annet baculovirus, Orgyia pseudotsugata nukleærpolyhedrosevirus (OpMNPV), som vist på Fig. 4. Det vil være klart for fagfolk på området med støtte i denne beskrivelse at egt-genet i hvilket som helst baculovirus, insektvirus eller insekt kan lokaliseres, karakteriseres og isoleres på liknende måte som eksemplifisert i det foreliggende, egt-gener med minst 70% nukleotidsekvens-homologi med sekvensen i Tabell 1 anses for å være ekvivalente med sekvensen i Tabell 1, under forutsetning av at disse homologe gener koder for et enzym som er en ekdysteroid-UDP-glukosyl-transferase.

Funksjonelle ekvivalenter til egt-genet er slike som også katalyserer inaktiveringen av ekdysteroider såsom ekdyson ved overføring av en glukose-del fra UDP-glukose til ekdysteroidet (ekdysteroidene). Disse funksjonelle ekvivalenter av egt kan identifiseres under anvendelse av analysemetodene beskrevet i det foreliggende.

Med lokaliseringen, identifiseringen og isoleringen av et egt-gen kan en fagmann på området inaktivere dette gen under anvendelse av læren ifølge den foreliggende beskrivelse og teknikker som er kjent på området under fremstilling av et mer effektivt insektbekjempelsesmiddel.

Ved sammenlikning av egenskapene hos vEGTZ med egenskapene hos villtype (wt)-AcMNPV har oppfinnerne vist at egt-ekspresjon hindrer insektet fra å skifte ham eller forpuppes. Insekter infisert med wt-AcMNPV skifter ikke ham eller forpuppes, men insekter infisert med vEGTZ skifter ham og forsøker å forpuppes (se Tabell 4 i Eksempel II).

Ved inhibering av hamskifting og forpupping kan wt-AcMNPV-infisering faktisk forlenge den tid larvene spiser. Larver infisert i begynnelsen av femte stadium (det siste larvestadium) med wt-virus fortsetter å spise inntil de dør, 5 eller 6 dager etter infisering. Imidlertid stanser ikke-infiserte larver med å spise 2-3 dager etter at de er kommet inn i det femte stadium ved forberedelse til forpupping (se Fig. 8). Liknende effekter observeres når larver på tidligere stadier undersøkes. Ikke-infiserte larver slutter å spise i ca. 24 timer under hamskiftingen, mens larver infisert med wt-AcMNPV ikke skifter ham og følgelig ikke stopper med å spise (se Fig. 6).

Rekombinante baculovirus som mangler et funksjonelt egt-gen, forlenger ikke spisetiden for larvene. Således opphører larver infisert med vEGTZ tidlig på femte stadium med å spise to dager etter infisering ved forberedelse til forpupping (se Fig. 8). Imidlertid forpuppes de ikke og bukker i stedet under for virusinfeksjonen enda hurtigere enn larver infisert med wt-virus, som vist på Fig. 9. Likeledes stopper larver infisert med vEGTZ tidlig på fjerde stadium med å spise to dager etter infisering ved hamskifte, og dør så hurtigere enn wt-infiserte larver (se Fig. 6 og 7). Den hurtigere avliving ved et baculovirus som mangler et funksjonelt egt-gen, sees mest dramatisk når nylig utklekkede larver på første stadium infiseres med wt-AcMNPV og med vEGTZ som vist på Fig. 10 og 11. Larver infisert med vEGTZ bukker under for virusinfeksjonen 3-4 dager før larver infisert med wt-AcMNPV. Derfor er rekombinante baculovirus som mangler et funksjonelt egt-gen, betydelig mer effektive som insektbekjempelsesmidler enn villtype-baculovirus. Det vil være klart for fagfolk på området, med støtte i denne beskrivelse, at egt-genet kan gjøres ikke-funksjonelt i hvilket som helst baculovirus eller insektvirus på hvilken som helst måte kjent på området.

Effektene som er beskrevet ovenfor og i de etterfølgende eksempler, vil være mer dramatiske på feltet. vEGTZ-infiserte larver viser vanskelighet med å skifte ham, og de gjør dette med hell bare under omhyggelig regulerte laboratoriebetingelser. Når temperatur og lys ikke reguleres strengt, fullfører mange insekter ikke hamskiftingen. Disse insekter tar ikke opp igjen spisingen og dør kort tid etter.

Skjønt den tidslengde ved hvilken virusavkom kan akkumuleres i larver infisert med baculovirus som mangler et funksjonelt egt-gen, er noe avkortet og det infiserte insekt viser redusert vekst, er det en vesentlig dannelse av virus-avkom. Den oppnådde virusmengde pr. larve etter vEGTZ-infisering av larver i sene stadier er omtrent halvparten av den som fås med wt-virus. Dette er tilstrekkelig til at overføring av viruset kan skje på feltet og til at man får kostnadseffektiv dannelse av store mengder viruspartikler.

Ved en annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse modifiseres et insektvirus som mangler et funksjonelt egt-gen, ved gen-sløydteknikker slik at dets effektivitet som biologisk bekjempelsesmiddel ytterligere forøkes ved innlemming av et andre gen hvis produkt påvirker insektutviklingen.

Genet som koder for PTTH (et peptidhormon), kan innføres i virusgenomet med egt-genet utelukket, og PTTH kan uttrykkes ved nivåer som er tilstrekkelig høye til at det påvirker ekdysen. Insektlarver infisert med et slikt virus får meget stor grad av avbryting av den hormonelle regulering av utviklingen. Disse insekter blir hurtig syke, hvilket resulterer i alvorlig kompromittert vekst og utvikling, redusert fødeinntak og tidligere død.

Eklosjonshormon er også et lite peptidhormon hvis gen kan innføres i virusgenomet med et ikke-funksjonelt egt-gen under anvendelse av teknikker kjent på området. Fordi eklosjonshormon styrer mange oppførsels-forandringer forbundet med ekdyse, vil insekter infisert med et Egt-virus som produserer tilstrekkelig høye nivåer av dette hormon, vise unormaliteter når det gjelder oppførsel og/eller utvikling, såsom redusert fødeinntak.

En hoved regulator når det gjelder juvenilt hormon-titre i insektet er enzymet juvenil hormon-esterase, som inaktiverer juvenilt hormon. Et rekombinant virus som mangler et funksjonelt egt-gen og uttrykker tilstrekkelig høye nivåer av juvenil hormon-esterase, kan skade insektenes oppførsel og/eller utvikling.

Det er viktig å bemerke at skjønt alle de ovennevnte gener kan adderes til villtypevirus-genom, ville det ikke ventes at de i noen betydelig grad påvirker insektenes oppførsel når det gjelder villtype-virus, fordi ekspresjon av egt-genet ved villtype-virus inaktiverer ekdysteroid-hamskiftehormonene og ekdysen forhindres, uten hensyn til dannelse av andre hormoner. Således avhenger vellykkede strategier som innbefatter dannelse av virus utformet til å innvirke på insekt-ekdysen, av tidligere inaktivering av egt-genet, som beskrevet ved denne oppfinnelse.

Det vil være klart for fagfolk på området at mutant-organismer som mangler et intakt egt-gen eller som ikke kan uttrykker et funksjonelt egt- produkt, og slike som er ytterligere genetisk modifiserte for å uttrykke et annet hormon-modifiserende enzym eller et peptidhormon, er innbefattet som insektbekjempelsesmidler ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Det er blitt vist at egt-genproduktet innvirker på insektutviklingen på en kraftig og spesifikk måte. Ekdysterioder spiller en avgjørende rolle ved utviklingen av hovedsakelig alle insektarter (omtalt i Comprehensive Insect Physiology Biochemistry and Pharmacology, Kerkut og Gilbert (red.), Pergamon Press, Oxford, 1984). Således har egt i seg selv et betydelig potensial for anvendelse ved bred-baserte insektbekjempelsesstrategier. Ved for eksempel en fjerde foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse kan nyttevekstarter dannes ved gensløyd for grunnleggende fremstilling av EGT-proteinet ved hvilken som helst teknikk kjent på området. Insekter som spiser slike nyttevekster, vil ikke kunne fullføre utviklingen til fullt utviklede voksne insekter, hvorved det tilveiebringes effektiv langvarig nyttevekstbeskyttelse. Likeledes kan bakterier som normalt er tilstede i eller på planten eller insektet, fremstilles ved gensløyd ved teknikker kjent på området for dannelse av EGT-enzymet. Slike bakterier vil likeledes fungere som effektive biologiske bekjempelsesmidler.

Likeledes kan ikke-fytopatogene, plante-koloniserende bakterier modifiseres genetisk for ekspresjon av EGT-genet. Planter som koloniseres av slike genetisk modifiserte bakterier, vil bli beskyttet mot skadeinsekter som er ømfindtlige overfor påvirkningen av det (de) uttrykke protein(er). Ikke-fytopatogene, plantekoloniserende bakterier er for eksempel beskrevet i US-patent 4 798 723, og genetiske modifikasjoner av visse plantekoloniserende bakterier er beskrevet i US-patent 4 771 131 og EPO-publikasjon nr. 0185005. Andre plantekoloniserende bakterier er kjent på området. Hvilken som helst måte som er kjent på området, kan anvendes for innføring av uttrykkbare gener såsom slike som er oppregnet ovenfor, for dannelse av insektbekjempelsesmidler.

Et påvirkelig insekts inntak av slikt genetisk modifisert plantemateriale eller av plantemateriale kolonisert av slike genetisk modifiserte plante-koloniserende bakterier vil resultere i avbrytelse av normal utvikling hos dette insekt. Det er kjent på området at visse insekter, f.eks. bladlus, har spesielt gjennomtrengelig tarmvev. En fagmann på området forstår de molekylære biologiske trinn som er nødvendige for konstruering av et slikt plante-uttrykkbart gen og de trinn som er nødvendige for innlemming av et slikt gen i plantens genom.

Det er sannsynlig at insekter selv uttrykker et egt-gen på spesifikke trinn

i sin livssyklus og at dette utgjør en viktig komponent i mekanismene som regulerer utviklingen. Det er således mulig at et insekt-egt-gen kan være et egnet mål for nye insektbekjempelsesstrategier. Beskrivelsen av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer midler for utforming av slike strategier.

En ytterligere utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, ekdysteroid-analoger som bindes til EGT-enzymet, men som ikke kan spaltes og frigjøres fra enzymet, kan utformes. Slike "selvmordssubstrater" vil bindes konkurrerende til, og inhibere eller blokkere, virkningen av EGT-enzymet, og følgelig innvirke på insektutviklingen. Alternativt kan rekombinante organismer fremstilles ved gensløyd under anvendelse av lærdommer tilveie-brakt i det foreliggende og som man har kjennskap til på området, slik at ekspresjon av insekt-egt-genet hindres for eksempel ved dannelsen av antisense-RNA.

Som anvendt i det foreliggende, er et insektbekjempelsesmiddel en blanding, eller den aktive bestanddel i en blanding, som har skadelig virkning på skadeinsekter. Insekters fødeinntak reduseres som svar på insektbekjempelsesmidlet, normal insekt-ekdyse avbrytes og resultatet er at insektet dør. Et insektbekjempelsesmiddel ifølge denne oppfinnelse kan være et insektvirus dannet ved gensløyd for inaktivering av et gen som koder for et ekdysteroid-modifiserende enzym eller ett som ytterligere bearbeides ved gensløyd for å uttrykke et heterologt gen som koder for et protein som påvirker insektutviklingen, eller det kan være en plante, en insektparasitt eller en ikke-fytopatogen bakterie, som alle kan være blitt dannet ved gensløyd for ekspresjon av et heterologt gen som koder for et protein som påvirker ekdysen.

Insekticide blandinger egnet for påføring på planter for bekjempelse av skadeinsekter omfatter en landbruksmessig egnet bærer og et insektbekjempelsesmiddel. Påføring av en insekticid blanding ifølge denne oppfinnelse kan beskytte planter mot skadeinsekter ved å redusere det de spiser og ta livet av ømfintlige insekter.

En fagmann på området vet hvordan han skal velge et insektbekjempelsesmiddel, f.eks. et insektvirus, som er egnet for bekjempelse av et spesielt skadeinsekt.

Det vil være klart for fagfolk på området at skadeinsektene kan utsettes for insektbekjempelsesmidlet ifølge den foreliggende oppfinnelse ved vanlige metoder innbefattende inntak, inhalering eller direkte kontakt med insektbekjempelsesmidlet.

Også påtenkt som insektbekjempelsesmidler er planter og entomo-patogene mikroorganismer som er blitt genetisk forandret for ekspresjon av minst ett protein som påvirker insektutviklingen. Eksempler på et slikt protein innbefatter, men er ikke begrenset til, prothorakikotropt hormon, eklosjonshormon, juvenilt hormon-esterase og ekdipon-glukosyltransferase.

Insektparasitter, innbefattende bakterievirus, sopp og andre insekter, kan også modifiseres genetisk for ekspresjon av egt. Parasittisme av passende insekter ved slike insektparasitter vil resultere i avbrytelse av normal utvikling i tillegg til symptomologi normalt forbundet med den ikke-modifiserte parasitt. Avbrytelsen av utviklingen av infiserte insekter forverrer sykdomstilstanden hos insektet. Fødeinntak hos, og infisering av, skadeinsektet vil redusere fødeinntaket og fremskynde døden.

DNA-sekvenser som koder for et EGT-protein som påvirker insekt-utvikling beskrevet i det foreliggende, uttrykt under regulerende kontroll av en aktivator som er passende for organismen, kan anvendes for genetisk modifisering av en organisme til dannelse av et insektbekjempelsesmiddel. Mål-organismer for genetisk modifisering innbefatter insektparasitter, planter og ikke-fytopatogene plante-koloniserende bakterier.

En hovedanvendelse av de genteknologisk fremstilte baculovirus ifølge den foreliggende oppfinnelse vil være som komponenter i landbruks-blandinger for påføring på planter for bevirkning av biologisk regulering av skadeinsekter på planter. Mange variasjoner ved fremstillingen av slike landbruksmessig egnede blandinger for insektbekjempelse er kjent på området.

Konsentrasjonen av insektbekjempelsesmidlet som vil bli fordret for fremstilling av insekticid effektive landbruks-blandinger for plantebeskyttelse vil avhenge av typen organisme og mutasjon som anvendes og utformningen av blandingen. Den insekticid effektive konsentrasjon av insektbekjempelsesmidlet i blandingen kan lett bestemmes eksperimentelt, som det vil forstås av en fagmann på området. For eksempel kan den insekticid effektive konsentrasjon av et virus lett bestemmes under anvendelse av variasjoner av teknikker beskrevet i hvilket som helst av Eksemplene VI - XI.

Landbruksblandinger må være egnet for landbruksanvendelse og utbredelse på feltet. Generelt må komponenter i blandingen være ikke-fytotoksiske og ikke skadelige for det okkluderte virus' integritet. Bladpåføringer må ikke ødelegge eller skade plantebladene. I tillegg til hensiktsmessige faste, eller mer foretrukket, væskeformige bærere, kan landbruksblandinger innbefatte klebe- og heftemidler, emulgerings- og fuktemidler, men ikke komponenter som hindrer fødeinntaket hos insektene eller eventuelle virusfunksjoner. Det kan også være ønskelig å tilsette komponenter som beskytter insektbekjempelsesmidlet mot UV-inaktivering. Landbruksblandinger for skadeinsektbekjempelse kan også innbefatte midler som stimulerer inntaket hos insekter.

Oversiktsartikler som beskriver påføringsmetoder for biologiske insektbekjempelsesmidler og landbruksanvendelse, er tilgjengelige. Se for eksempel Couch og Ignoffo (1981) i Microbial Control of Pests and Plant Disease 1970-1980, Burges (red.), kapitel 34, s. 621-634; Corke og Rishbeth, som ovenfor, kapitel 39, s. 717-732; Brockwell (1980) i Methods for Evaluating Nitrogen Fixation, Bergersen (red.) s. 417-488; Burton (1982) i Biological Nitrogen Fixation Technology for Tropical Agriculture, Graham og Harris (red.) s. 105-114, og Roughley (1982), som ovenfor, s. 115-127; The Biology of Baculoviruses, vol. II, som ovenfor.

Denne oppfinnelse er illustrert ved følgende eksempler. Det må være klart at man kan ta i bruk forskjellige andre utførelsesformer, modifikasjoner og ekvivalenter av disse som, etter at man har lest den foreliggende beskrivelse, kan melde seg for fagfolk på området uten at man avviker fra den foreliggende oppfinnelses prinsipp og/eller rammen for de tilknyttede krav.

Eksempel I

Posisjonen for egt-genet på AcMNPV-genomet er illustrert på Fig. 1. En skala i kart-enheter er vist ovenfor kartet over AcMNPV-genomet. For bestemmelse av nukleotidsekvensen hos dette gen og flankerende områder, og for å gjøre mulig etterfølgende manipulasjon av genet, er det først nødvendig å klone flere DNA-fragmenter som omfatter dette område, i plasmid-vektorer (se T. Maniatis et al. (1982) i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, når det gjelder standard-kloningsfremgangsmåter). Felt A viser et linært kart over AcMNPV-genomet etter spalting med restriksjonsendonukleasene EcoRI og Hindlll. Felt B er en forstørrelse av genomet fra 7,6 til 11,1 kart-enheter som viser egt-genets beliggenhet. Den opprinnelige AcMNPV-stamme anvendt er L1 -stammen (Lee og Miller (1978) J. Virol. 27:754). De klonede DNA-fragmenter og navnene på de resulterende plasmider er vist på Fig. 1, Felt C. Fragment 1, som strekker seg fra Pstl-setet ved 7,6 mp til et BamHI-sete ved 11,1 mp, er klonet i plasmidvektor pUC19; fragmenter 2 og 3 (henholdsvis fra Pstl (7,6 mp) til EcoRI (8,65 mp) og fra EcoRI (8,65 mp) til Sali (10,5 mp)) er begge klonet i vektorene Bluescript M13+ og Bluescript M13- (Stratagene, San Diego, California). Fragment 5 (BstEII (8,35 mp) til BstEII (8,7 mp)) er klonet i Bluescript M13+.

Et stort antall subkloner av BCPsE- og BCES-plasmider dannes så

(Henikoff (1984) Gene 28:351). Disse subkloner har progressivt større utelukkelser av virus-innskuddet slik at de inneholder varierende mengder virus-DNA i området fra under 50 basepar til hele virus-fragmentet. Mange av disse subkloner og plasmidet BCB blir så sekvensbestemt (Sanger et al.

(1977) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463) slik at hele egt-genet sekvensbestemmes i begge retninger. De oppnådde nukleotidsekvenser analyseres så med datamaskin med hensyn til tilstedeværelse av åpne leserammer som kan kode for proteiner under anvendelse av programmer ifølge Pustell og Kefatos (1984) Nucl. Acids Res. 12:643-655 og Devereaux et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:387-396. Denne analyse viser at egt-genet koder for et protein med 506 aminosyrer. Nukleotidsekvensen i egt-genet og den forutsette aminosyresekvens i egt-genproduktet er vist i Tabell 1.

Eksempel II

For konstruksjon av rekombinante virus som ikke kan uttrykke et funksjonelt egt-gen, fordres ytterligere manipulering av plasmidklonene beskrevet i Eksempel I. Plasmidet pUCBCPsB spaltes med restriksjonsendonukleasene EcoRI og Xbal (se Fig. 3 når det gjelder seter i egt-genet), og det lille fragment kastes. Escherichia coli-lacZ-genet, fjernet fra pSKS104 (Casadaban et al. (1983) Methods Enzymol. 100:293-303) med EcoRI og Ahalll, innføres så mellom EcoRI- og Xbal-setene etter at de Xbal-fremspringende ender er utfylt under anvendelse av T4-DNA-polymerase. Det resulterende plasmid betegnes pEGTZ. I dette plasmid er det innførte lacZ-gen i ramme med de forutgående egt-kodende sekvenser. Alternativt konstrueres plasmidet pEGTDEL ved at EcoRI- og Xbal-setene ganske enkelt ligeres sammen (etter at begge seter er blitt stumpendet) uten at det innføres noen sekvenser mellom dem.

Alle virus stammer opprinnelig fra AcMNPV L-1 (Lee og Miller (1978) som ovenfor) og er plakk-renset og formert i Spodoptera frugiperda IPLB-SF-21-cellelinjen (SF-celler) (Vaughn et al. (1977) In Vitro 13:213-217) under anvendelse av metoder beskrevet tidligere (Lee og Miller (1978); Miller et al.

(1986) Genetic Engineering, Principles and Methods, Vol. 8 (red. J. Setlow og A. Hollaender), Plenum Press, N.Y., s. 277-298,1986).

Plasmidet pEGTZ kotransfekteres så med wt-AcMNPV-DNA i SF-celler som beskrevet i Miller et al. (1986), som ovenfor. Denne fremgangsmåte gir mulighet for at homolog rekombinasjon kan finne sted mellom sekvenser i virus- og plasmid-DNA-molekylene, hvilket resulterer i erstatning av virus-egt-genet med egt-lacZ-genfusjonen fra plasmidet. På grunn av at den gjenværende egt-kodende sekvens er i ramme med lacZ-sekvensene, vil et slikt rekombinant virus danne et fusjonsprotein som omfatter de første 84 aminosyrer i egt bundet til B-galaktosidase. Det rekombinante virus, betegnet vEGTZ, kan identifiseres fordi S-galaktosidase-ekspresjon gir opphav til blå virus-plakk i nærvær av en kromogen indikator såsom 5-brom-4-klor-3-indolyl-B-D-galaktopyranosid (X-gal). Et diagram over egt-genet i vEGTZ er vist på

Fig. 3, Felt B.

Rekombinant virus vEGTDEL fås ved kotransfektering av plasmidet pEGTDEL og DNA fra viruset vEGTZ i SF-celler. Homolog rekombinering resulterer i erstatning av egt-lacZ-fusjonsgenet i vEGTZ med det utelukkede egt-gen fra pEGTDEL. Det rekombinante virus vEGTDEL identifiseres ved at det ikke kan danne blå plakk i nærvær av X-gal. Strukturen av egt-genet i vEGTDEL er vist på Fig. 3, Felt C.

Eksempel III

Produktet av egt-genet identifiseres ved sammenlikning av proteiner syntetisert ved wt-AcMNPV (som gir EGT) med slike som er dannet ved vEGTZ eller vEGTDEL (som ikke kan gi EGT). SF-celler infiseres enten med wt-AcMNPV eller med vEGTZ ved en infeksjons-multiplisitet (MOI) på 20 som beskrevet i 0'Reilly og Miller (1990) J. Virol. 64:1321-1328. Ikke-infiserte celler analyseres også. Etter 6 timers infisering inkuberes cellene i nærvær av det radioaktivt merkede [<35>S]-metionin i 1 time for radiaktiv merking av alle proteiner dannet i dette tidsrom. Cellene lyseres så og proteinene separeres ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) (Laemmli et al. (1970) Nature 227:680-685). Alle proteiner som utsondres fra cellene, blir også høstet og analysert. Etter SDS-PAGE påvises de radiomerkede proteiner ved autoradiografi. Et protein på 60 kDa utsondres fra wt-AcMNPV-infiserte celler, men ikke fra vEGTZ-infiserte celler eller ikke-infiserte celler. Dette protein på 60 kDa kan ikke påvises i lysater av wt-AcMNPV-infiserte celler, hvilket viser at det utsondres fra cellen. Disse data viser at produktet av egt-genet er et utsondret protein på 60 kDa, med egenskaper i god overensstemmelse med nukleotid- og aminosyresekvens-dataene.

Eksempel IV

EGT-proteinets enzymatiske aktivitet identifiseres ved sammenlikning av SF-celler som er infisert med wt-AcMNPV eller vEGTZ. SF-celler infisert med wt-AcMNPV eller vEGTZ er beskrevet i Eksempel III. Tolv timer pi oppsamles cellene og det ekstracellulære medium og bearbeides atskilt. Ikke-infiserte celler behandles parallelt. Cellelysater eller ekstracellulære medier inkuberes i nærvær av 1 mM UDP-glukose og 0,25 pCi [<3>H]-ekdyson som beskrevet i 0'Reilly og Miller (1989) Science 245:1110-1112. Ekdysteroid-UDP-glukosyltransferaseaktivitet i celle-lysatene eller -mediene vil katalysere overføringen av glukose fra UDP-glukosen til ekdyson under dannelse av et ekdyson-glukose-konjugat. Ekdyson og ekdyson-glykose-konjugatet atskilles fra hverandre ved silikagel-tynnsjiktkromatografi (Bansal og Gessner (1988) Anal. Biochem. 109:321) og visualiseres ved autoradiografi. Ekdyson-glukose-konjugater (G) dannes bare når wt-AcMNPV-infisert cellelysat eller ekstracellulært medium analyseres. Ingen konjugater observeres når ikke-infiserte eller vEGTZ-infiserte cellelysater eller medier anvendes, hvilket viser at aktiviteten skyldes egt-ekspresjon. Mesteparten av aktiviteten finnes i det ekstracellulære medium, i overensstemmelse med dataene omtalt i Eksempel III. Bevis på at glukose er konjugert med ekdyson, fås ved analysering av wt-infiserte lysater som beskrevet ovenfor, bortsett fra at UDP-glukosen erstattes med den radiomerkede UDP-[U-<14>C]glukose. Omsettinger utført med umerket UDP-glukose eller merket UDP-[U-<14>C]glukose, med [<3>H]-ekdyson tilstede ved begge omsettinger, og scintillasjonstelling av konjugatet viser at både<3>H fra ekdysonet og<14>C fra glukosen kan påvises. Disse data beviser at egt-genproduktet er en UDP-glukosyltransferase som katalyserer overføringen av glukose fra UDP-glukose til ekdyson.

Det utføres deretter forsøk for mer grundig undersøkelse av EGTs substratspesifisitet. I disse forsøk inkuberes forskjellige substrater (1 mM) i nærvær av ekstracellulært medium fra wt-AcMNPV-infiserte celler som inneholder betydelig egt-aktivitet. Som kontroller for å sikre at eventuell observert konjugering skyldes EGT, inkuberes hvert substrat også med media fra ikke-infiserte og vEGTZ-infiserte celler, som ikke kan danne EGT. 0,05 pCi UDP-[U-<14>C]-glukose tilsettes ved hver reaksjon. Alle forbindelser som fungerer som substrater for EGT, vil konjugeres med glukose; de kan påvises fordi glukosen er radioaktivt merket.

Substratene inkuberes i nærvær av medium som stammer fra passende infiserte celler og 0,05 pCi UDP-[U-<14>C]glukose. Mengder overført glukose beregnes etter scintillasjonstelling av de passende områder på kromatografiplatene.

Én ytterligere kontroll er tilsetting av UDP-[U-<14>C]glukuronsyre til et atskilt sett av reaksjoner med medium fra wt-infiserte celler for å vise at

glukuronsyre ikke overføres ved denne reaksjon. De oppnådde data er vist i Tabell 3. De eneste identifiserte substrater er ekdyson, 20-hydroksyekdyson og makisteron A, som alle er ekdysteroider. Ingen konjugering observeres ved anvendelse av medium fra blindprøve- eller vEGTZ-infiserte celler, hvilket bekrefter at den observerte aktivitet skyldes ekspresjonen av egt. Ingen konjugering observeres når UDP-[U-<14>C]-glukuronsyre anvendes, hvilket viser at EGT ikke overfører glukuronsyre.

Eksempel V

For å vise at andre baculovirus også inneholder gener med vesentlig homologi med AcMNPV-egt-genet, isoleres DNA fra OpMNPV og nedbrytes separat med restriksjonsendonukleasene EcoRI, BamHI og Hindlll. Disse enzymer spalter virus-DNA i flere fragmenter med forskjellige størrelser hvis posisjon i OpMNPV-genomet allerede er kjent (Leisy et al. (1984) J. Virol. 52:699). "Southem"-hybridiseringer utføres som beskrevet i T. Maniatis et al.

(1982), som ovenfor. Et indre fragment av AcMNPV-egt-genet fjernes fra plasmidet BCES med enzymene EcoRI og Xbal (se Fig. 1). Dette fragment merkes radioaktivt med<32>P og anvendes som probe for identifisering av eventuelle beslektede sekvenser i OpMNPV-genomet. Under hensiktsmessige betingelser vil et DNA-fragment, slik som man kjenner til på området, bindes til et annet DNA-fragment som inneholder sekvenser som likner eller er identiske med dette. Således bør AcMNPV-egt-proben bindes til eventuelle OpMNPV-DNA-fragmenter på nylonmembranen som inneholder beslektede DNA-sekvenser. Den bundne probes posisjon kan visualiseres, ved at membranen utsettes for røntgenfilm, egt-proben hybridiseres først med nylonmembranen under lite strenge betingelser (1 M natriumklorid, 0,3 M natriumcitrat, 5% dekstransulfat, 5 x Denhardts oppløsning og 0,25% SDS ved 37°C). Dette gir mulighet for proben til hybridisering til forholdsvis fjernt beslektede sekvenser. Strengheten ved hybridiseringsbetingelsene økes så trinnvis ved at hybridiseringstemperaturen økes eller ved at det tilsettes formamid til hybridiseringsoppløsningen, inntil spesifikt hybridiserende bånd observeres. Hybridiseringsbetingelsene for Fig. 4 er 1 M natriumklorid, 0,3 M natriumcitrat, 5% dekstransulfat, 5x Denhardts oppløsning og 0,25% SDS ved 68°C, i 15 timer. Membranen blir så vasket to ganger, 15 minutter hver gang i

0,3 M natriumklorid, 0,1 M natriumcitrat og 0,1% SDS ved 68°C. Fig. 4 viser at AcMNPV-egt-proben bindes til spesifikke fragmenter av OpMNPV-DNA, nemlig EcoRI-f rag ment B, BamHI-fragment A og Hindlll-fragmentene N og S. Bemerk at OpMNPV-egt-genet er i samme relative posisjon i genomet som AcMNPV-genet (Fig. 5). Liknende protokoller kan anvendes for identifisering av egt-homologe gener i andre entomopatogener. Det er klart at når det gjelder innbyrdes høyst forskjellige sekvenser, vil det være nødvendig å bekrefte EGT-aktiviteten under anvendelse av analysemetoden beskrevet i Eksempel IV. Deretter vil det fordres en molekylær genetisk analyse av genomet for isolering av genet som koder for EGT-enzymet under anvendelse av metodologi kjent på området.

Alternativt kan EGT-genet også finnes i andre organismer under anvendelse av den spesifikke analyse for ekdysteroid-UDP-glukosyltransfer-aseaktivitet beskrevet i Eksempel IV. Denne analyse anvendes for identifisering av enzymet under rensingen ved vanlige biokjemiske teknikker. Når det er renset, bestemmes en partial-aminosyresekvens i EGT-proteinet. Denne informasjon anvendes til dannelse av en oligonukleotid-probe, som så anvendes til lokalisasjon av EGT-genet i genomet.

Eksempel VI

Hemolymfetitere for ekdysteroider svinger på en syklisk måte for regulering av både larve-larve- og larve-puppe-hamskifte, og siden man har mistanke om at glukosekonjugering inaktiverer ekdysteroider (Warren et al.

(1986) J. Liq. Chromatogr. 9:1759; Thompson et al. (1987) Arch. Insect Biochem. Physiol. 4:1; Thompson et al. (1988) Arch. Insect Biochem. Physiol. 7:157), er det sannsynlig at egt-ekspresjon under AcMNPV-infeksjon avbryter den normale utviklingsprosess for det infiserte insekt. For å vise en slik avbrytelse, infiseres nylig ekdyserte S. frugiperda-larver i fjerde stadium ved injeksjon med wt-AcMNPV eller vEGTZ og kontrolleres daglig med hensyn til eventuelle forstyrrelser i sin utvikling. Én gruppe larver injiseres med vevskulturfluid som negativ kontroll. Resultatene av dette forsøk er vist i Tabell 4 nedenfor. Alle larver injisert med vevskulturfluid (blindprøver) skifter til femte stadium som ventet. Bare én av 16 larver infisert med wt-virus gjennomgår denne overgang. I motsetning til dette, gjennomgår alle larver infisert med det mutante vEGTZ et hamskifte mellom fjerde og femte stadium. Således inhiberer egt-ekspresjon ved wt-AcMNPV verts-hamskifte tydelig og spesifikt. Begge de infiserte larvegrupper bukker deretter under for virus-infeksjon, hvilket viser at avbrytelse av egt ikke hindrer vEGTZ fra å drepe sin insektvert.

Fjerde stadium S. frugiperda-larver injiseres med 1 x 10<5>pfu wt-AcMNPV eller vEGTZ i 5 pl. Larver tilsatt blindprøve injiseres med 5 pl vevskulturfluid. Hver gruppe innbefatter 16 larver som holdes på kunstig diett (R.L. Burton (1969) ARS publikasjon, s. 33-134) ved 28°C med en 14:10 timers lys:mørke-syklus. Larvene kontrolleres daglig med hensyn til ekdyse, og dødeligheten noteres på dag 7.

Liknende resultater oppnås når det gjelder larver injisert tidlig i femte stadium. Under anvendelse av nylig ekdyserte larver i femte stadium, viser ingen wt-infiserte larver noen tegn til forpupping, mens mesteparten av vEGTZ-infiserte larver viser flere modifikasjoner når det gjelder oppførsel (opphør av fødeinntak, omflakking og rotasjon) som er karakteristiske for et forestående larve-puppe-hamskifte. Imidlertid døde alle virusinfiserte larver før forpupping. Disse data viser at AcMNPV-infisering hindrer insektlarvene fra å skifte ham eller forpuppes. Videre viser dataene at denne avbrytelse av insektets utvikling skyldes ekspresjonen av egt.

Eksempel VII

In wVo-bioanalyser av villtype- (wt-)AcMNPV og vEGTZ viser at egt-genekspresjon forlenger den tid de infiserte larver bruker på å spise, og at avbrytelse av egt forbedrer karakteregenskapene hos viruset som pesticid. Ved disse undersøkelser injiseres S. frugiperda-larver enten med wt-AcMNPV eller vEGTZ tidlig på 4. stadium. For sammenlikning injiseres kontroll-larver med vevskulturmedium som ikke inneholder noe virus. Larvene undersøkes daglig med hensyn til vektøkning, tegn til hamskifting eller forpupping og dødelighet. De gjennomsnittlige daglige vektøkninger for de forskjellige larvegrupper, sammen med prosentvis dødelighet, er inntegnet på henholdsvis Fig. 6 og 7. Kontroll-larver viser moderat vekst i de første to dager. I løpet av den annen dag skifter de alle til 5. stadium. Deretter vokser de dramatisk i to dager til før de stopper fødeinntaket ved forberedelse til forpupping. Bare 1 av 16 wt-AcMNPV-infiserte larver skifter ham, og i stedet viser larvene kontinuerlig vekst i 3 dager etter infisering. På dette stadium begynner de å bli syke, men ingen larver dør før dag 5. Alle wt-AcMNPV-infiserte larver er døde på dag 6. I motsetning til dette gjennomgår alle vEGTZ-infiserte larver et skifte fra 4. til 5. stadium, og i løpet av dette tidsrom slutter alle å spise. Dette forklarer fraværet av vekst fra dag 1 til dag 2. Etter hamskifte gjenopptar de fødeinntaket, men begynner å vise tegn til sykdom på dag 3. De begynner å dø 4 dager etter infisering, og alle er døde på dag 5. Larver infisert med et AcMNPV-derivat som mangler et funksjonelt egt, viser redusert fødeinntak og dør hurtigere etter infiseringen enn de som er infisert med villtype-AcMNPV.

Disse fenomener observeres enda tydeligere etter infisering av 5.-stadium-larver (Fig. 8 og 9). Som ventet, viser kontroll-larver betydelig vekst i to dager før de stopper å spise ved forberedelse for forpupping. Dette opphør av fødeinntak følges av et dramatisk vekttap. Wt-AcMNPV-larver viser ingen tegn til slikt opphør av fødeinntak; de fortsetter å spise og øker i vekt i to dager til før de begynner å bli syke. Dødeligheten er ikke fullstendig før syv dager etter infisering.

Oppsummert vil det kunne sees at vEGTZ-infiserte larver, likesom kontrollene, bare spiser i de første to dager etter infisering. Etter dette tidspunkt er det et dramatisk vekttap idet de forbereder forpupping. Imidlertid forpuppes ingen av disse larver; de viser tegn til sykdom på dag tre og er alle døde seks dager etter infisering. Igjen gir vEGTZ-infisering redusert fødeinntak og tidligere død.

Eksempel VIII

Virkningene av vEGTZ- og wt-AcMNPV-infisering av nylig utklekkede S. frugiperda-larver i første stadium sammenliknes. Nyfødte S. frugiperda gis en diett som inneholder forskjellige konsentrasjoner av vEGTZ- eller wt-AcMNPV-polyhedriske inklusjonslegemer (PIB) og kontrolleres daglig med hensyn til dødelighet. De oppnådde resultater for to atskilte doser er vist på Fig. 10 og 11. De vil kunne sees ved begge doser at vEGTZ-infiserte larver viser betydelig dødelighet vesentlig før larver infisert med wt-virus. Vanligvis avlives larver infisert med det rekombinante virus mellom tre og fire dager tidligere enn wt-infiserte larver. Dette resultat understøtter ytterligere at baculovirus som omfatter inaktiverte egt-gener, fungerer bedre som biologiske pesticider enn wt-baculovirus med intakte egt-gener.

Eksempel IX

For konstruksjon av rekombinante virus som uttrykker prothorakikotropt hormon (PTTH), klones PTTH-genet i transplacementplasmidet pEVmodXIV, hvilket plasmid er beskrevet i US-patentsøknad 07/353 847, inngitt 17. mai 1989, som er medtatt i det foreliggende som referanse. Dette plasmid innbefatter sekvenser oppstrøms og nedstrøms for AcMNPV-polyhedrin-genet, som formidler homolog rekombinering av det eksprimerbare PTTH-gen i Egt-viruset. Et multippel-kloningssete finnes på det vanlige sete for polyhedrin-translasjonsinitiering, nedstrøms for den LSXIV-modifiserte polyhedrinpromotor (Rankin et al., Gene, 70:39 (1988)). Bombyx mori PTTH-genet fjernes fra plasmidet pBc22k-C19 (Kawakami et al., Science, 247:1333,

(1990)) ved nedbryting med restriksjonsenzymet Hindlll. De kohesive Hindlll-ender utfylles med T4-DNA-polymerase, og plasmidet spaltes så med EcoRI. pEVmodXIV spaltes med Kpnl, den fremspringende Kpnl-ende fjernes med T4-DNA-polymerase, og plasmidet spaltes så med EcoRI. Fragmentet som inneholder PTTH-genet, klones i transplacement-plasmidet via disse seter. I det resulterende plasmid, pEVPTTH, befinner PTTH-genet seg like nedstrøms for den LSXIV-modifiserte polyhedrin-promotor.

Rekombinante virus som uttrykker PTTH, fås ved kotransfektering av pEVPTTH i SF-celler med vEGTDEL- eller wt-AcMNPV-DNA. Rekombinasjon mellom de flankerende polyhedrin-sekvenser i virus-DNA og de som flankerer PTTH-genet i pEVPTTH, resulterer i erstatning av polyhedrin-genet med PTTH. Virus hvor dette rekombinasjons-fenomen har funnet sted, identifiseres ved sin okklusjons-negative fenotype (Miller et al. i Genetic Engineering, Principles and Methods, vol. 8, J. Setlow og A. Hollaender, red., Plenum Press N.Y., 1986, s. 277-298). De respektive rekombinante virus er betegnet vEGT-PTTH og vWTPTTH.

Fremgangsmåtene for dannelse av rekombinante virus som uttrykker juvenilt hormon-esterase, er like. Først fjernes Heliothis virescens juvenilt hormon-esterasegenet (Hanzlik et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:12419) fra plasmidet pJHE16B (Hammock et al. (1990) Nature 344:458) ved nedbryting med EcoRI og Kpnl. Transplacement-plasmidet pEVmodXIV spaltes også med EcoRI og Kpnl, og fragmentet som inneholder juvenilt hormon-esterasegenet, innføres mellom disse seter. pEVJHE innbefatter således polyhedrin-gensekvenser som flankerer juvenilt hormon-esterase-genet. De rekombinante virus vEGT-JHE og vWTJHE fås ved kotransfektering av pEVJHE med henholdsvis vEGTZ- eller wt-AcMNPV-DNA, og undersøkelse med hensyn til okklusjonsnegative plakk.

For konstruering av rekombinante virus som eksprimerer eklosjons-hormon, fjernes Manduca sexta-eklosjonshormon-genet fra plasmidet pF5-3 (Horodyski et al. (1989) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86:8123) ved nedbryting med EcoRI og Hpal. pEVmodXIV spaltes med Kpnl, og den fremspringende Kpnl-ende fjernes med T4-DNA-polymerase og spaltes så med EcoRI. Innføring av det eklosjonshormon-gen-holdige fragment i transplacement-plasmidet gir det rekombinante pEVEH, hvor eklosjons-hormon-genet befinner seg nedstrøms for den LSXIV-modifiserte polyhedrin-promotor. Kotransfeksjon av dette plasmid med vEGTZ- eller vDA2 6Z-DNA gjør mulig isolering av henholdsvis de rekombinante virus vEGT-EH og vDA2 6ZEH. vDA2 6Z er et rekombinant virus med E. coli-lacZ-genet innført i DA2 6-genet (0'Reilly et al., J. Gen. Virol., under trykking). DA2 6-genets funksjon er ikke kjent, og vDA2 6Z er fenotypisk villtype med hensyn til ekdysen. På grunn av tilstedeværelsen av lacZ-genet, gir vDA2 6Z-derivater opphav til blå plakk i nærvær av X-gal.

Eksempel X

For vurdering av in wVo-effektene av disse rekombinante virus, injiseres S. frugiperda-larver med 2 x 10<5>pfu vEGTDEL, vEGTT-TTH, vWTPTTH, eller både vEGfPTTH og vEGT"JHE (1 x 10<5>pfu hver) sent i 3. stadium eller tidlig i 4. stadium. Den daglige prosentvise dødelighet er vist i Tabell 5. Når det gjelder alle EGT~-virus, går de infiserte insekter gjennom 4. stadium og kaster hodekapselen, hvilket viser et forestående hamskifte, på dag 3. Etter infisering med vEGfPTTH alene eller ved infisering med vEGT"PTTH og vEGTJHE sammen, bevirker ekspresjon av PTTH at de infiserte insekter hurtig blir syke, og betydelig dødelighet observeres på dag 4. I motsetning til dette, viser insekter infisert med vEGTDEL ikke noen betydelig dødelighet før dag 5. Som ventet, viser insekter infisert med vWTPTTH aldri tegn til skifting til 5. stadium. Ingen hodekapselkasting observeres, og insektet viser ikke betydelig dødelighet før dag 6. Ekspresjon av PTTH i fravær av EGT frem-skynder således tiden for død etter infisering etter 1 dag sammenliknet med vEGTDEL. Disse data viser forbedringen av de pesticide egenskaper hos baculovirs ved ekspresjon av gener som påvirker insektekdysen, og viser at egt må inaktiveres for at slike strategier skal være effektive.

Eksempel XI

Dannelse av okklusjonspositive virus som eksprimerer heterologe proteiner som påvirker insektutviklingen, kan utføres etterfølgende skjema. Først konstrueres et okklusjonsnegativt EGT~virus som eksprimerer B-galaktosidase, som følger. E. coli lacZ-genet, som koder for enzymet B-galaktosidase, klones i transplacementvektoren pSynVI- beskrevet i US-patentsøknad 07/353 847, inngitt 17. mai 1989. pSynVI- innbefatter sekvenser oppstrøms og nedstrøms for AcMNPV-polyhedringenet, med et multippel-kloningssete anbrakt like nedstrøms for en syntetisk modifiserte polyhedrin-promotor. lacZ-genet fjernes fra plasmidet pSKS105 (Casadaban et al. (1983) som ovenfor) ved spalting med Pstl. Den fremspringende Pstl-ende fjernes med mungbønne-nuklease, og plasmidet spaltes med Sstll. pSynVI "spaltes med EcoRV og Sstll og lacZ"genet klones i disse seter. Det resulterende plasmid betegnes pSynVfgal og inneholder lacZ-genet like nedstrøms for den syntetiske modifiserte polyhedrin-promotor. pSynVfgal kotransfekteres i SF-celler med vEGTDEL-DNA, og okklusjonsnegative plakk som eksprimerer fi-galaktosidase, isoleres, hvilket gir viruset vEGT~SynVI gal.

For konstruksjon av et okklusjonspositivt rekombinant virus som uttrykker PTTH, klones PTTH-genet i transplacementvektoren pSpXIWI+X3.

For konstruksjon av pSpXIWI+X3 konstrueres først et mellomplasmid pSpXIWK pSpLSXIWI+CAT (beskrevet i US-patentsøknad 07/353 847, inngitt 17. mai 1989) kuttes med Bg1 II og endene fylles ut med DNA-polymerase. Plasmid pSynVI+wtp (beskrevet i US-patentsøknad 07/353 847, inngitt 17. mai 1989) kuttes med EcoRV og Sacl, og det lille EcoRV-Sacl-fragment renses. Fragmentene fra de to plasmider ligeres, og pSpXIWI+ utvelges. pSpXIWI+-plasmidet er det samme som pSPLSXIWI+CAT, bortsett fra at multikloningssetet fra Bg1 ll-setet til Sacl-setet er det samme som for pSynVI+wtp. For konstruksjon av multippel-kloningssete nr. 3 (beskrevet i US-patentsøknad 07/353 847, inngitt 17. mai 1989), innføres en polykopling mellom EcoRI-Sacl-setene i pSpXIWI+. Sekvensen for multikloningssetet i pSPXIWI+X3 fra det koplede Bg1ll-sete til Sacl-setet er:

Dette plasmid innbefatter et intakt polyhedringen under regulering av en villtype-polyhedrinpromotor. En syntetisk modifisert polyhedrinpromotor befinner seg oppstrøms for, og i orientering overfor polyhedringenet. Et multippel-kloningssete er anbrakt for å gjøre mulig innsetting av gener som skal eksprimeres under regulering av den syntetiske modifiserte polyhedrin-promotor. PTTH-genet fjernes fra plasmidet pBc22k-C19 (Kawakami et al.

(1990) som ovenfor) ved nedbryting med Hindlll. Den fremspringende Hindlll-ende utfylles med T4-DNA-polymerasen, og plasmidet spaltes med EcoRI. pSpXIWI<+>X3 spaltes med EcoRI og Smal, og PTTH-genet klones i disse seter, hvilket gir plasmidet pSpPTTH. I dette plasmid er PTTH-genet nedstrøms for den syntetiske modifiserte polyhedrinpromotor, som befinner seg i nabostilling til, og i motsatt orientering i forhold til, villtype-polyhedrin-promotoren og -kodingssekvenser. Både PTTH- og polyhedringenene er flankert av sekvenser oppstrøms og nedstrøms for polyhedringenet i AcMNPV. pSpPTTH kotransfekteres i SF-celler med vEGT~SynVfgal-DNA. Rekombinasjon mellom polyhedrin-oppstrøms- og nedstrøms-sekvensene i virus-DNA og de som flankerer PTTH- og polyhedringenene i pSpPTTH, resulterer i erstatning av lacZ-genet i vEGT~SynVfgal med PTTH- og polyhedringenene fra pSpPTTH. Det rekombinante virus vEGT SpPTTH er identifisert ved en okklusjonspositiv, B-galaktosidase-negativ fenotype.

For konstruksjon av et okklusjonspositivt virus som eksprimerer juvenilt hormon-esterase, fjernes juvenilt hormon-esterasegenet fra plasmidet pJHE16B (Hammock et al. (1990) som ovenfor) ved nedbryting med Kpnl, fjerning av den fremspringende ende med T4-DNA-polymerase og nedbryting med EcoRI. Juvenilt hormon-esterasegenet klones så i plasmidet pSpXIWI<+>X3, som er blitt spaltet med EcoRI og Smal. Det resulterende plasmid, pSpJHE, kotransfekteres med vEGT~SynVfgal-DNA under dannelse av det rekombinante virus vEGT~SpJHE. Dette okklusjonspositive virus eksprimerer juvenilt hormon-esterase under regulering av den syntetiske modifiserte polyhedrinpromotor.

Likeledes fjernes eklosjonshormongenet fra plasmidet pF5-3 (Horodyski et al. (1990) som ovenfor) ved nedbryting med EcoRI og Hpal, og klones i pSpXIWI<+>X3 som er blitt spaltet med EcoRI og Smal. Det resulterende plasmid, pSpEH, kotransfekteres med vEGT~SynVI"gal-DNA under dannelse av det rekombinante virus vEGT~SpEH.

De okklusjonspositive EGT~-virus som modifiseres ytterligere genetisk for ekspresjon av et protein som påvirker ekdysen (et insektpeptidhormon eller et enzym som inaktiverer insekthormoner) vil redusere fødeinntaket og forårsake hurtigere død av infiserte insektlarver enn wt-baculovirus eller baculovirus som er genetisk forandret bare for inaktivering av egt-genet.

På grunn av at insektbekjempelsesmidlene ifølge Eksempel XI er okkluderte, kan disse virus innarbeides i insekticid effektive, landbruksmessig akseptable blandinger som kan påføres på infiserte nyttevekster. Inntak av slike okkluderte viruspartikler resulterer i formering av disse virus på feltet, og spredning av insektbekjempelsesmiddel. Infisering vil forårsake insektdød og følgelig beskyttelse av nyttevekstene mot skadeinsekter.

Det må være klart at det ovenstående bare angår foretruné spesifikke utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse og at tallrike modifikasjoner eller forandringer kan gjøres i denne uten at man avviker fra oppfinnelsens prinsipp og ramme som fremsatt i de tilknyttede krav.

Claims (13)

1. Insektbekjempelsesmiddel,karakterisert vedat det omfatter en baculovirus hvor et naturlig forekommende gen som koder for et ekdysteroid UDP-glukosyl-transferase enzym er inaktivert, og eventuelt at baculoviruset er blitt ytterligere modifisert ved innsetting av minst ett heterologt gen, hvor det (de) heterologe gen(er) kan uttrykkes i insektceller infisert med viruset, og hvor genet (genene) koder for et protein som påvirker ekdysen.

2. Insektbekjempelsesmiddel ifølge krav 1, karakterisert vedat baculoviruset er et nukleær-polyhedrosevirus.

3. Insektbekjempelsesmiddel ifølge krav 2, karakterisert vedat nukleærpolyhedroseviruset er valgt fra gruppen som består av Autographa californica nukleærpolyhedrosevirus og Orgyia pseudotsugata nukleær-polyhedrosevirus.

4. Insektbekjempelsesmiddel ifølge krav 3, karakterisert vedat polyhedrosisviruset er Autographa californica nukleærpolyhedrosisvirus omfattende et inaktivert gen som koder for ekdysteroid-UDP-glukosyltransferase og er ett av vEGTZ og vEGTDEL.

5. Insektbekjempelsesmiddel ifølge krav 4, karakterisert vedat det heterologe gen er valgt fra gruppen av gener som koder for proteiner bestående av prothorakikotropt hormon, eklosjonshormon- og juvenil hormon- esterase.

6. Insektbekjempelsesmiddel ifølge krav 5, karakterisert vedat det er valgt fra gruppen bestående av vEGT-SpPTTH, vEGT-SpEH eller vEGT-SpJHE.

7. Anvendelse av et insektbekjempelsesmiddel ifølge kravene 1-6,karakterisert vedat den omfatter det trinn at insektet utsettes for et insektbekjempelsesmiddel, hvilket insektbekjempelsesmiddel er blitt dannet ved gensløyd for ekspresjon av et gen som koder for et ekdysteroid-modifiserende enzym, hvor enzymet skader insektet.

8. Anvendelse av et insektbekjempelsesmiddel ifølge kravene 1-6,karakterisert vedat insektene utsettes for et insektbekjempelsesmiddel ifølge krav 1-6.

9. Anvendelse av et insektbekjempelsesmiddel ifølge kravene 1-6,karakterisert vedat det omfatter det trinn at insektet utsettes for et insektbekjempelsesmiddel inneholdende et gen som koder for et ekdysteroid-modifiserende enzym, hvor genet er blitt inaktivert ved innføring av et heterologt gen som kan uttrykkes i en insektcelle infisert med viruset, hvilket heterologe gen koder for et protein som påvirker ekdysen.

10. Anvendelse ifølge krav 9, karakterisert vedat det annet gen er valgt fra gruppen som består at gener som koder for prothorakikotropt hormon, eklosjonshormon- og juvenilhormon-esterase, hvilke gener kan eksprimeres i insektceller infiserte med viruset.

11. Insekticid blanding,karakterisert vedat den omfatter et insektbekjempelsesmiddel ifølge krav 1-6, og en landbruksmessig egnet bærer, idet insektbekjempelsesmidlet er blitt genetisk modifisert for inaktivering av et naturlig fore-kommende gen som koder for ekdysteroid-UDP-glukosyltransferase.

12. Rekombinant DNA-molekyl,karakterisert vedat det omfatter en nukleotidsekvens av et gen som koder for ekdysteroid-UDP-glukosyltransferase hvor sekvensen er sekvensen ifølge Tabell 1, fra ca. nukleotid 149 til ca. nukleotid 1670, eller en funksjonell ekvivalent til denne.

13. Hovedsakelig ren ekdysteroid-UDP-glukosyltransferase,karakterisert vedat den har en aminosyresekvens ifølge Tabell 1, eller en aminosyresekvens som har den biologiske aktivitet til nevnte ekdysteroid-UDP-glukosyltransferase.