DD296311A5

DD296311A5 - Mittel zur biologischen insektenkontrolle und verfahren zu deren anwendung

Info

Publication number: DD296311A5
Application number: DD90342364A
Authority: DD
Inventors: Lois K Miller; David R O'reilly
Original assignee: ��@��@��@��@��k��K@��@��@��@��@�k��
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 1991-11-28
Also published as: GEP19991540B; FI104263B1; IL94820A0; NZ234115A; AU627910B2; EP0432256A1; DE69007952D1; NO308691B1; CA2033169C; JPH04500611A; KR0165121B1; LV10996B; LTIP1581A; DE69007952T2; ES2063370T3; NO910796D0; PT94557B; PT94557A; LT3807B; FI104263B

Abstract

Beschrieben werden Mittel zur Insektenkontrolle, die Protein-codierende Gene enthalten, welche das Wachstum, die Entwicklung oder das Verhalten von Insekten beeinflussen. Das Gen ist entweder aktiviert, um die Insektenhaeutung und -verpuppung zu verhindern, oder es ist inaktiviert, um das Nahrungsaufnahmeverhalten zu verringern, das Wachstum zu behindern und einen frueheren Tod des Insektenwirts herbeizufuehren. Ein solches Mittel zur Insektenkontrolle wird beispielhaft durch ein Baculovirus erlaeutert, indem das fuer Ecdysteroid-Glucosyltransferase codierende Gen inaktiviert worden ist. Zusaetzlich koennen solche Baculoviren weiter veraendert werden, um ein Protein zu exprimieren, das die Haeutung beeinfluszt. Verfahren zur Herstellung des Mittels zur Insektenkontrolle und Verfahren zur Kontrolle von Insekten, wobei sie dem Mittel zur Insektenkontrolle ausgesetzt werden, sind ebenfalls eingeschlossen.{Insektenkontrolle; Insektenentwicklung; Baculovirus; Polyhedrosisvirus; Schaedlingsbekaempfung; DNA-Rekombination; EGT-Protein; egt-Gen; prothoracothropes Hormon; Haeutungshormon; Juvenilhormon-Esterase}

Description

Verpackungskörpern freigesetzt werden, die die Infektion dann auf andere Insekten ausbreiten können. (Übersichtsartikel in Biology of Baculoviruses, Vol. I und II, [1986] Granados und Federici, Herausgeber, CRC Press, Boca Raton, Florida).

Ein bedeutender Nachteil in der Verwendung von Baculoviren als Pestiziden ist die Zeitdauer zwischen der Virusaufnahme und dem Tod des Insekts. Während dieser Zeit fährt der Schädling fort. Getreide durch seine Nahrungsaufnahme zu zerstören. Da ein Getreidebauer das Pestizid nicht anwenden wird, bis der Befall erkennbar ist, ist es entscheidend, daß die Zeit der Nahrungsaufnahme auf ein Minimum begrenzt wird.

Was benötigt wird, ist ein biologisches Pestizid, das die Nahrungsaufnahme durch die Insekten vor ihrem Tod verringert. Ein biologisches Pestizid wird bevorzugt, da es eine geringere Gefährdung der Umwelt schafft als ein chemisches Pestizid. Ein schnellerer Tod der Insekten ist jedenfalls wünschenswert. Die Benutzung eines Gens (von Genen), das (die) für ein Protein (Proteine) codiert (codieren), das (die) die Entwicklung von Insekten und ihre Einschleusung in verschiedene Lebewesen kontrolliert (kontrollieren), wird eine verbesserte biologische Schädlingsbekämpfung erlauben.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur verbesserten biologischen Schädlingsbekämpfung bereit. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung und Handhabung eines Baculovirusgenes und seines Genproduktes, das Auswirkungen in der Kontrolle des Wachstums und der Entwicklung von Insekten hat. Die Erfindung stellt ferner genetisch veränderte Baculoviren und andere Mittel zur Insektenkontrolle bereit, die infizierte Schädlinge negativ beeinflussen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, Mittel bereitzustellen, die ein genetisch manipuliertes Genom aufweisen und somit zur Insektenkontrolle geeignet sind.

Ferner besteht die Aufgabe der Erfindung darin, insektizide Zusammensetzungen bereitzustellen, die die erfindungsgemäßen Mittel enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Insektenkontrolle, bei dem folgende Schritte durchgeführt werden:

(a) Isolierung eines Gens, das ein die Häutung beeinflussendes Protein codiert; und

(b) Einfügen des Gens in einen dieses Gen nicht natürlicherweise exprimierenden Organismus.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Protein eine Ecdysteroid UDP-Glucosyl-Transferase (EGT), ein prothoracotrophes Hormon, ein Häutungshormon (eclosion hormone) oder eine Juvenilhormon-Esterase ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Organismus ein Insektenvirus ist, das das egt-Gen nicht exprimiert.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Gen aus einem Baculovirus stammt.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Baculovirus ein nucleares Polyhedrosisvirus ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das nucleare Polyhedrosisvirus ein Autographs californica nucleares Polyhedrosisvirus oder ein Orgyia pseudotsugata nucleares Polyhedrosisvirus ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Organismus ein insektenparasitäres, nicht phytopathogenes, Pflanzen-besiedelndes Bakterium, ein entomopathogenes Bakterium, ein entomopathogener Pilz oder eine enthomopathogene Pflanze ist.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Insektenkontrolle, bei dem ein natürlicherweise im Genom eines Organismus vorkommendes Gen inaktiviert wird, das ein ein Ecdysteroid-veränderndes Enzym codiert.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Gen die EGT codiert.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Organismus ein Insektenvirus ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Insektenvirus ein Baculovirus ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das nucleare Polyhedrosisvirus ein Autographa californica nucleares Polyhedrosisvirus oder ein Orgyia pseudotsugata nucleares Polyhedrosisvirus ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß ein Autographa californica nucleares Polyhedrosisvirus-Abkömmling mit einer Deletion, die das egt-Gen inaktiviert, nach einer Reihe von Passagen des Virus in infizierten Zellen isoliert wird.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das nucleare Polyhedrosisvirus entweder vEGTZ oder vEGTDEL ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das nucleare Polyhedrosisvirus vEGTZ wie folgt hergestellt wird:

(a) pUCBCPsB wird mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und Xbal gespalten und das dadurch entstehende große Fragment gereinigt;

(b) das lacZ-Gen wird mit den Restriktionsendonucleasen EcoRi und Ahalll aus pSKS104 herausgeschnitten;

(c) das lacZ-Gen wird mit dem großen EcoRI-Xba-l-Fragment von pUCBCPsB ligiert, nachdem das Xbal-Ende mit T4 DNA-Polymerase in ein glattes Ende überführt worden ist, um pEGTZzu bilden;

(d) pEGTZ und AcMNPV werden in SF-Zellen cotransfiziert;

(e) virale Rekombinanten werden durch ß-Galactosidase-Expression identifiziert; und

(f) das rekombinante Virus vEGTZ gereinigt.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das nucleare Polyhedrosisvirus vEGTDEL wie folgt hergestellt wird:

(a) pUCBCPsB wird mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und Xbal verdaut und das dadurch entstehende große Fragment gereinigt;

(b) beide Enden des großen DNA-Fragments aus Schritt (a) werden in glatte Enden überführt;

(c) das große DNA-Fragment aus Schritt (b) wird ligiert;

(d) pEGTDEL und vEGTZ werden in SF-Zellen contransfiziert, um eine homologe Rekombination zu ermöglichen;

(e) rekombinantes vEGTDEL wird durch die nicht vorhandene Fähigkeit zur Expression von ß-Galactosidase identifiziert; und

(f) rekombinantes vEGTDEL wird gereinigt.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Organismus ferner durch Einfügen eines heterologen, in Insektenzellen exprimierbaren Gens genetisch verändert wird, wobei das Gen ein die Häutung beeinflussendes Protein codiert.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das eingefügte Gen ein prothoracotropes Hormon, ein Häutungshormon oder eine Juvenilhormon-Esterase codiert.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Verfahren zur Herstellung einer Insektiziden Zusammensetzung, bei dem ein nach den vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenes Mittel zur Insektenkontrolle mit einem landwirtschaftlich geeigneten Träger vermischt wird.

Nachstehend werden Beispiele für besondere Ausführungsformen des erfindungsgemäß hergestellten Mittels angegeben:

Mittel zur Insektenkontrolle, beinhaltend einen Insektenparasiten, in dem ein natürlich vorkommendes, für ein Ecdysteroideveränderndes Enzym-codierendes Gen inaktiviert ist;

Mittel zur Insektenkontrolle, wobei das Gen ein egt-Gen ist;

Mittel zur Insektenkontrolle, wobei der Organismus ein Insektenvirus ist;

Mittel zur Insektenkontrolle, wobei das Insektenvirus ein Baculovirus ist;

Mittel zur Insektenkontrolle, wobei das Baculovirus ein nucleares Polyhedrosisvirus ist; Mittel zur Insektenkontrolle, wobei das nucleare Polyhedrosisvirus ein Autographa californica nucleares Polyhedrosisvirus oder ein Orgyia pseudotsugata nucleares Polyhedrosisvirus ist;

Mittel zur Insektenkontrolle, wobei das ein inaktiviertes, Ecdysteroid UDP-Glucosyl-Transferase-codierendes Gen enthaltende Insektenvirus entweder vEGTZ oder vEGTDEL ist;

Mittel zur Insektenkontrolle, wobei das Insektenvirus ferner durch das Einfügen von mindestens einem heterologen Gen, wobei das (die) heterologe(n) Gen(e) in mit dem Virus infizierten Insektenzellen exprimierbar sind und wobei das (die) Gen(e) für ein die Häutung beeinflussendes Protein codiert (codieren), verändert worden ist;

Mittel zur Insektenkontrolle, wobei das heterologe Gen ein prothoracotropes Hormon, ein Häutungshormon oder eine Juvenilhormon-Esterase codiert;

Mittel zur Insektenkontrolle, das vEGT~SpPTTH ist;

Mittel zur Insektenkontrolle, das vEGT~SpEH ist;

Mittel zur Insektenkontrolle, das vEGT~SpJHE ist.

Erfindungsgemäß wird auch ein rekombinantes DNA-Molekül bereitgestellt, das eine Nucleotidsequenz eines für Ecdysteroid UDP-Glucosyl-Transferase-codierenden Gens beinhaltet. Erfindungsgemäß wird ferner ein rekombinantes DNA-Molekül bereitgestellt, wobei die EGT-Sequenz die Sequenz aus Tabelle I von etwa Nucleotid 149 bis etwa Nucleotid 1670 oder ein funktionsfähiges Äquivalent davon ist.

Erfindungsgemäß werden ferner die nach den erläuterten Verfahren erhältlichen Insektenviren bereitgestellt.

Dabei ist das Insektenvirus vEGTZ wie folgt erhältlich:

a) pUCBCPsB wird mit den Restriktionsendonucleasen EcoRi und Xbal verdaut und das dadurch entstehende große Fragment wird gereinigt;

b) das lacZ-Gen wird mit den Restriktionsendonulceasen EcoRi und Ahalll aus pSKS104 herausgeschnitten;

c) das lacZ-Gen wird mit dem großen EcoRI-Xbal-Fragment von pUCBCPsB ligiert, nachdem dasXbal-Ende mit T4 DNA-Polymerase in ein glattes Ende überführt worden ist, um pEGTZ zu bilden;

d) pEGTZ und AcMNPV in SF-Zellen werden cotransfiziert;

e) virale Rekombinanten werden durch ß-Galactosidase-Expression identifiziert; und

f) das rekombinante Virus vEGTZ wird gereinigt.

Ferner ist das rekombinante Virus vEGTDEL wie folgt erhältlich:

a) pUCBCPsB wird mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und Xbal verdaut und das dadurch entstehende große Fragment gereinigt;

b) beide Enden des großen DNA-Fragments aus Schritt (a) werden in glatte Enden überführt;

c) das große DNA-Fragment aus Schritt (b) wird ligiert;

d) pEGTDEL und vEGTZ werden in SF-Zellen cotransfiziert, um homologe Rekombination zu ermöglichen;

e) rekombinantes vEGTDEK wird durch die nicht vorhandene Fähigkeit zur Expression von ß-Galactosidase identifiziert; und

f) rekombinanter vEGTDEL wird gereinigt.

Erfindungsgemäß wird ferner rekombinante Ecdysteroid UDP-Glucosyl-Transferase bereitgestellt, die die Aminosäuresequenz aus Tabelle I beinhaltet, oder eine Ecdysteroid UDP-Glucosyl-Transferase, die dann eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 70%iger Homologie hat. Vorzugsweise ist diese im wesentlichen rein.

Diese erfindungsgemäßen Transferasen gestatten die Herstellung entsprechender monoclonaler oder polyclonaler Antikörper, die spezifisch für die Ecdysteroid UDP-Glucosyl-Transferase sind.

In der vorliegenden Erfindung werden ein Baculovirusgen und sein Genprodukt, welches das Wachstum, die Entwicklung oder das Verhalten von Insekten beeinflußt, identifiziert. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verwendung dieses Genes und des Genproduktes, sowie Verfahren zur Inaktivierung dieses Genes oder seines Genproduktes in Strategien zur Insektenkontrolle zur Verfügung. In einer bevorzugten Ausführungsform codiert das egt-Gen Ecdysteroid UDP-Glucosyl-Transferase (EGT) von AcMNPV. Die Expression des egt-Gens von Baculoviren bewirkt die Herstellung von EGT, das die Häutungshormone der Insekten inaktiviert und so die Insektenlarven an der Häutung und Verpuppung hindert. Die Inantivierung des Baculovirus egt-Gens erlaubt den Vorgang der Häutung und Verpuppung der infizierten Larven.

Die vorliegende Erfindung umfaßt einen breiten Bereich von Mitteln zur Insektenkontrolle unter Verwendung von egt-Genen und ihren Genprodukten. Die Mittel zur Insektenkontrolle der vorliegenden Erfindung bewirken entweder die ungeeignete Herstellung des EGT Proteins oder behindern die normale Fuktion der Expression des EGT-Proteins in den Schädlingen, so daß die normale Entwicklung der Schädlinge unterbrochen wird.

Vorzugsweise ist der das egt-Gen enthaltende Organismus ein für den Schädling spezifischer Virus, wobei das egt-Gen des Virus inaktiviert worden ist, wodurch die fortlaufende Entwicklung des mit dem Virus infizierten Insektenwirtes möglich wird. Die Entwicklung des Insektenwirtes verursacht Änderungen im Verhalten, wie z. B. verringerte Nahrungsaufnahme und, wenn mit dem viralen Pestizid infiziert/gibt es ein verringertes Wachstum und einen schnelleren Tod. Die vorliegende Erfindung beinhaltet ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung des verbesserten viralen Pestizide. Zusätzlich beinhaltet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle von Schädlingen, wobei der Schädling dem verbesserten viralen Pestizid ausgesetzt wird. Die genetisch veränderten Viren der vorliegenden Erfindung sind wirksamere Pestizide als im Stand der Technik bekannte Viren. Baculoviren, wie z.B. Autographa californica nuclearer Polyhedrosisvirus (AcMNPV) und Orgyia pseudotsugata nuclearer Polyhedrosisvirus (OpMNPV) exprimieren natürlicherweise ein egt-Gen, dessen Expression die Zeitspanne verlängert, die eine infizierte Larve mit der Futteraufnahme verbringt, bevor sie der viralen Infektion erliegt. Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Inaktivierung des egt-Gens im Genom von Viren, wie z. B., aber nicht beschränkt auf, Baculoviren. Das egt-Gen kann durch Einsetzen an seine Stelle oder Einfügen eines anderen Gens, wie z. B. des nichtviralen Markergens für ß-Galactosidase in das Gen inaktiviert werden. Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß jede DNA-Sequenz zur Zerstörung des egt-Gens verwendet werden kann, solange sie die Expression der für egt codierenden Sequenz zerstört. Als Alternative dazu kann das gesamte egt-Gen oder ein Teil davon aus dem Genom entfernt werden, indem ein geeignetes, codierendes DNA-Segment deletiert wird, oder der regulatorische Teil des Genoms, der die egt-Genexpression kontrolliert, geändert oder entfernt wird. Baculoviren mit Deletionen, die das egt-Gen inaktivieren, können auch durch Reihen von Viruspassagen in Insektenzellkulturen hergestellt werden. Die daraus entstehenden Viren mit den Deletionen haben den Vorteil, daß sie keine fremde DNA beinhalten und sich vom Wildtyp-Virus nur dadurch unterscheiden, daß ihnen ein funktionsfähiges egt-Gen fehlt. Solche veränderten Baculoviren funktionieren als Schädlingsbekämpfungsmittel besser als die gegenwärtig verwendeten Viren. Als einfache Deletionsmutanten sollten sie auch regulatorischen Mittein, (z. B. US. EPA) als genetisch konstruierte Pestizide zugänglich sein, da sie keine heterologe DNA enthalten. Baculoviren, die kein funktionelles egt-Gen exprimieren, können durch Einfügen anderer Gene als das egt-Gen verändert werden, die die Insektenentwicklung beeinträchtigen und so die Wirksamkeit solcher Viren als Mittel zur Insektenkontrolle verbessern.

Die vorliegende Erfindung beinhaltet ebenfalls ein Verfahren zur Kontrolle von Schädlingen, wobei Insektenlarven mit einem mutierten Virus, dem ein unversehrtes egt-Gen fehlt, oder der unfähig ist, ein funktionelles EGT Produkt zu exprimieren, infiziert werden. Die mit dem mutierten Virus infizierten Larven versuchen sich zu häuten und zu verpuppen und nehmen dafür für eine kürzere Zeitspanne Nahrung zu sich, als Larven, die mit dem Wildtyp-Virus oder anderen Viren aus dem Stand der Technik infiziert sind. Die mit dem mutierten Virus infizierten Insektenlarven sterben auch früher als Wildtyp-Larven oder infizierten Larven von anderen Viren aus dem Stand der Technik.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines rekombinanten Virus, der ein wirksameres Pestizid als Wildtyp-Viren oder Viren aus dem Stand der Technik ist. Ein Beispiel für die vorliegende Erfindung ist der rekombinante, mit vEGTZ bezeichnete AcMNPV, in dem ein Teil des egt-Gens deletiert und durch lacZ, ein bakterielles, für ß-Galactosidase codierendes Gen, ersetzt worden ist. Jede DNA-Sequenz, die das egt-Gen inaktiviert, kann eingesetzt werden, wie dem Durchschnittsfachmann bekannt ist. Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch den rekombinanten Baculovirus mit der Bezeichnung vEGTDEL, in dem ein Teil des egt-Gens deletiert worden ist, bespielhaft dargestellt. Eine weitere Ausführungsform ist ein Baculovirus-Pestizid, in dem das egt-Gen entfernt worden ist. Ebenfalls eingeschlossen sind Baculoviren, in denen eine natürlicherweise vorkommende Mutation, eine Deletion einschließend, zur Inaktivierung des egt-Gens geführt hat. Dementsprechend ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines egt-Gens und seines Genproduktes, die in der Schädlingsbekämpfung nützlich sind. Ebenfalls im Bereich der Erfindung sind wesentlich gereinigte Ecdysteroid UDP-Glucosyl-Transferase und dafür spezifische Antikörper. egt-Gene können durch Sequenzhomologie mit der Nucleotidsequenz eines egt-Gens in Tabelle I oder nach Bestimmung der EGT-Enzymaktivität und nachfolgender DNA-Analyse identifiziert werden. Jede für eine Ecdysteroid UDP-Glucosyl-Transferase codierende DNA-Sequenz ist nach dieser Definition ein egt-Gen. Ein egt-Protein kann durch Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind und das in Beispiel 4 beschriebene Untersuchungsverfahren gereinigt werden. Eine im wesentlichen reine egt-Proteinpräparation ist eine, die mindestens etwa 70 Gew.-% Ecdysteroid UDP-Glucosyl-Transferase enthält. Ein rekombinantes EGT-Protein ist ein solches, das von einem anderen Organismus hergestellt wird, als dem, in dem das für das Protein codierende Gen natürlicherweise vorkommt. Das rekombinante Protein wird als Folge genetischer Konstruktionen oder rekombinanter DNA-Technologie exprimiert. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines genetisch konstruierten Virus, der ein wirksames Pestizid und gleichfalls unweitverträglich ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines rekombinanten Pestizide, dem ein funktionelles egt-Gen fehlt und das ein zweites, die Insektenentwicklung beeinträchtigendes Gen exprimiert, wobei das zweite Gen nicht natürlicherweise in dem Organismus vorkommt. Dieses zweite Gen ist eins, welches für ein die Häutung beeinflussendes

Genprodukt codiert. Ein solches Genprodukt kann ein Insektenhormon sein, welche die Insektenentwicklung beeinflußt oder ein Enzym, das ein die Häutung regulierendes Insektenhormon inaktiviert. Typische Beispiele beinhalten das prothoracotrope Hormon, das prothoracotrope Hormon, das Häutungshormon und die Juvenilhormon-Esterase. Wenn für diese Proteine codierende Gene in ein Insektenvirus eingefügt werden, um ein Mittel zur Insektenkontrolle herzustellen, muß der Virus ein solcher sein, der kein egt-Gen enthält oder in dem ein egt-Gen inaktiviert worden ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines genetisch veränderten Organismus zur Verwendung als Mittel zur Insektenkontrolle, der ein genetisch eingefügtes egt-Gen exprimiert, wo natürlicherweise kein egt-Gen exprimiert wurde. Solche genetisch veränderten, EGT exprimierenden Lebewesen werden Schädlinge nachteilig beeinflussen, was einen verringerten Schaden für die Pflanzen bewirkt.

Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist die Bereitstellung insektizider Zusammensetzungen, die für die landwirtschaftliche Anwendung geeignet sind. Solche Zusammensetzungen beinhalten einen landwirtschaftlich geeigneten, dem Fachmann bekannten Träger und ein Insektenvirus, wie z.B. Baculovirus, das genetisch verändert worden ist, so daß ein egt-Gen dieses Virus inaktiviert worden ist. Ein solches Egt-Baculovirus kann genetisch weiter verändert werden, um ein heterologes Gen, das für ein die Häutung beeinflussendes Insektenhormon oder ein Enzym, das ein die Häutung beeinflussendes Insektenhormon inaktiviert, codiert, zu exprimieren. Heterologe Gene, deren Genprodukte die Häutung beeinflussen, beinhalten, aber sind nicht beschränkt auf prothoracotropes Hormon, Häutungshormon und Juvenilhormon-Esterase. Vorzugsweise sind insektizide Zusammensetzungen, die genetisch veränderte Baculoviren beinhalten, für die Anwendung in Sprayform ausgerichtet. Ebenfalls als insektizide Zusammensetzungen werden solche betrachtet, die einen landwirtschaftlich geeigneten Träger und genetisch veränderte Insektenparasiten beinhalten. Ein Insektenparasit ist ein Organismus, der in einer engen Verbindung mit einer Insektenlarve lebt oder sich repliziert und nachteilige Auswirkungen auf diese Larve hat. Ein Insektenparasit kann ein Bakterium, ein Pilz, ein Virus oder ein anderes Insekt sein. Ein solcher genetisch veränderter Insektenparasit, der ein egt-Gen beinhaltet, wird als Mittel zur Insektenkontrolle durch die Inaktivierung dieses egt-Gens verbessert.

Jede der oben erwähnten Insektiziden Zusammensetzungen kann weitere Bestandteile beinhalten, um die Nahrungsaufnahme der Insekten zu stimulieren. Zusammensetzungen der Insektizide der vorliegenden Erfindung können von den Insekten nach Anwendung bei den Pflanzen aufgenommen werden, und diejenigen Schädlinge, die für das Mittel zur Insektenkontrolle in der Insektiziden Zusammensetzung anfällig sind, werden verringerte Nahrungsaufnahme zeigen und sterben. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines veränderten biologischen Pestizids, das die Expression des egt-Gens oder die Funktion seines Genproduktes behindert.

Kurze Beschreibung der Figuren:

Die Figuren zeigen

Fig. 1: Schematische Darstellung des AcMNPV-Genoms mit dem egt-Genlocus. Das AcMNPV-Genom ist in

Genkarteneinheiten und als EcoRi- und Hindlll-Restriktionskarte dargestellt. Fig. 2: Schematische Zusammenfassung der Ergebnisse aus der Sequenzierung des egt-Gens und der Sequenzanalyse.

Abschnitt A zeigt eine Restriktionsendonucleasenkarte des Bereichs. Die Ergebnisse einer mit Hilfe eines Computers durchgeführten Analyse der Sequenz auf offene Leseraster ist in Bereich B dargestellt. Die vertikalen Striche bezeichnen Stopcodons. Die Sequenz ist in allen drei möglichen offenen Leserastern für jeden DNA-Strang (1,2,3,1', 2', 3')

„translatiert". Der egt entsprechende offene Leseraster (2) ist mit EGT bezeichnet. Fig. 3: Schematische Darstellung der Strukturen der egt-Regionen von AcMNPV (A) und der rekombinanten Viren vEGTZ (B)

und vEGTDEL (C). Der gestrichelte Bereich stellt das lacZ-Gen dar

Fig.4: Schematische Darstellung der Agarosegel-Elektrophorese und Sothern Blot-Analysezur Identifizierung eines egt-Gens im Baculovirus OpMNPV.

Fig. 5: Schematische Restriktionskarte des OpMNPV-Genoms

Fig. 6: Kurven der Gewichtszunahme in nichtinfizierten Kontroll-Larven oder nach Infektion der Larven im 4. Larvenstadium mit wt AcMNPV oder vEGTZ.

Fig. 7: Kurve der Larvensterblichkeit nach Infektion der Larven im 4. Larvenstadium mit wt AcMNPV oder vEGTZ. Fig. 8: Kurve der Gewichtszunahme nach Infektion der Larven im 5. Larvenstadium mit wt AcMNPV oder vEGTZ. Fig. 9: Kurve der Larvensterblichkeit nach Infektion der Larven im 5. Larvenstadium mit wt AcMNPV oder vEGTZ. Fig. 10: Kurve der Larvensterblichkeit nach Infektion der Larven im 1. Larvenstadium mit wt AcMNPV oder vEGTZ in einer

Konzentration von 4,8 χ 10⁶polyhedraler Einschlußkörper (PIB)/ml

Fig. 11: Kurve der Larvensterblichkeit nach Infektion der Larven im 1. Larvenstadium mit wt AcMNPV oder vEGTZ in einer Konzentration von 2,4 χ 10⁶PIB/ml.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Zur Ordnung der Lepidoptera gehörende Insekten durchlaufen eine gut charakterisierte Schrittfolge während der Entwicklung vom Ei zum erwachsenen Insekt (siehe Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology, Bd.7 und 8, Kerkut und Gilbert, Herausgeber, Pergamon Press, Oxford, 1984 wegen genauer Übersichtsartikel). Nachdem Schlüpfen tritt die Insektenlarve in einen Zeitraum ausgiebiger Nahrungsaufnahme ein, während dem sie mehrmals schlüpft, um ein fortdauerndes Wachstum zu gewährleisten. Die Stadien zwischen aufeinanderfolgenden Häutungen werden als Larvenstadien bezeichnet. Am Ende der Zeitspanne des larvalen Wachstums verpuppt sich die Larve und kommt schließlich als erwachsenes Insekt zum Vorschein. Die Vorgänge der Häutung und Verpuppung (zusammenfasend mit Ecydsis bezeichnet) werden durch die gemeinsame Wirkung von mehreren, verschiedenen Hormongruppen reguliert. Der anfängliche Reiz ist das Freisetzen des prothoracotropen Hormons (PTTH) durch bestimmte Gehirnzellen. Dies stimuliert die Prothoraxdrüsen, Ecydsteroide, die oft als Insektenhäutungshormone bezeichnet werden, herzustellen und auszuschütten. In Anwesenheit des Juvenilhormons wird eine Larvenhäutung folgen, während sich die Larve in der Abwesenheit des Juvenilhormons verpuppen wird. Das Häutungshormon ist ebenfalls wichtig in der Auslösung verschiedener, mit der Ecdysis verbundener Verhaltensänderungen.

Das für einen großen Bereich der Baculovirus-Forschung als Modellsystem verwendete Baculovirus-AcMNPV beeinflußt den oben erläuterten Vorgang der Insektenentwicklung in einer vorher nicht vermuteten Art und Weise. Mit AcMNPV infizierte Insektenlarven sind nicht langer in der Lage, sich zu häuten oder zu verpuppen, da AcM NPV die Herstellung eines als Ecdysteroid UDP-Glucosyl-Transferase (EGT) bekannten Enzyms lenkt, das spezifisch die Ecdysteroide der Insekten inaktiviert. Das fü r EGT codierende Gen wurde von den hier genannten Erfindern identifiziert; es erstreckt sich über die Genkarteneinheiten 8,4 bis 9,6 des AcMNPV-Genoms (Figuren 1 und 2). Wie im Abschnitt C von Fig. 1 dargestellt, sind virale DNA-Fragmente, die das egt-Gen beinhalten, in die Plasmide pUC19, Bluescript M13+ und Bluescript M13— cloniert worden. Fig.2 zeigt die Restriktionskarte des egt-Bereichs des Genoms und die mit Hilfe des Computers erstellte offene Leserasteranalyse des egt-Bereichs. Nur der Leseraster 2 enthält einen ziemlich langen offenen Leseraster, der als der für das egt-Gen codierende Bereich identifiziert worden ist. Die Nucleotidsequenz des egt-Gens und die abgeleitete Aminosäuresequenz von 506 Aminosäuren sind in Tabelle I dargestellt. Die codierende Sequenz von egt erstreckt sich von etwa Nucleotid 149 bis etwa Nucleotid1670.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das egt-Gen des Baculovirus-AcMNPV durch Ersetzen eines Teils des egt-Gens durch eine bakterielle Sequenz, die für ß-Galactosidase codiert, inaktiviert. Dieser rekombinante Baculovirus wird mit vEGTZ bezeichnet. In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wird, wie in Fig. 3 dargestellt, ein Teil des egt-Gens von AcMNPV ohne Ersatz deletiert. Ein Vergleich der während der wt AcMNPV- und vEGTZ-lnfektionen hergestellten Proteine hat offenbart, daß das EGT-Protein ein 60 KDa-Protein ist, das von den infizierten Zellen sekretiert wird. Ein anderer Mechanismus zur Inaktivierung des egt-Gens von Insektenviren ist das Einfügen eines Gens, das für ein die Ecdysis beeinflussendes Insektenhormon oder ein Enzym, das ein die Ecdysis beeinflussendes Insektenhormon inaktiviert, codiert, wobei dieses Gen in einer Insektenzelle, die mit dem Insektenvirus infiziert ist, exprimiert werden kann. Ein Suchprogramm in der Genbank-Datenbank offenbarte eine 21-bis 22%ige Aminosäuresequenzhomologie zwischen egt und verschiedenen Säuger-UDP-Glucuronosyl-Transferasen. Eine Homologie wurde ebenfalls zu einer Pflanzen-UDP-Glucosyl-Transferase gefunden. Das Ausrichten der egt-Aminosäuresequenz auf die Aminosäuresequenzen verschiedener dieser Enzyme ist in Tabelle Il dargestellt.

Tabelle I

Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von AcMNPV egt

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Jl ^AAAAGCTCACCCTTTAAAATTTGTTACATAATCAAATTACCAGTACACTTATTCaQTTTÖAAaCAAAATCACTATTCTC

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Tabelle II

Vergleich der Proteinsequenz von EGT mit denen verschiedener anderer Steroid-verändernder Enzyme

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Tabelle Il zeigt die Ausrichtung deregt-Aminosäuresequenzauf eine Auswahl von UDP-Glucuronosyl-Transferasen und eine UDP-Glucosyl-Transferase aus anderen Arten. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von egt wird mit menschlichen (HUMUDPGAT) (Jackson et al., Biochem.J.242 [1987], 581); Maus-(MUSUDPGAT) (Kimura und Owens, Eur.J.Biochem. [1987], 168,515); und Ratten-(RATUDPGAT) (MacKenzie, J. Biol.Chem.262 [1987], 9744), UDP-Glucuronosyl-Transferasen und Mais-UDP-Glucosyl-Transferase (ZMAYUDPGAT) (Ralston et al. Genetics 119 [1988], 185) unter Verwendung des FASTP-Algorithmus (Lipman und Pearson, Science 227 [1985], 1435), wie von der International Biotechnologies Inc. durchgeführt, verglichen. Großbuchstaben bezeichnen genaue Gegenstücke; kleine Buchstaben bezeichnen Austausche, die zwischen verwandten Proteinen häufig vorkommen (Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Vol. 5, Supplement 3 [1978], Silver Spring, MD); Punkte stellen Austausche dar, die selten vorkommen, Bindestriche bezeichnen Lücken in der Sequenz und ein Einschaltungszeichen zeigt an, wo eine Aminosäure aus der Sequenz deletiert worden ist. Die Aminosäuren zwischen den Pfeilen sind aus dem egt-Gen in vEGTZ und vEGTDEL deletiert worden. Die Homologie des AcMNPV-Gens zu bekannten UDP-Glucose- und UDP-Glucuronosyl-Transferasen bekräftigt die Identifikation dieser AcMNPV-Sequenz als die egt codierende Sequenz.

In Säugern katalysieren die UDP-Glucuronosyl-Transferasen das Übertragen von Glucuronsäure auf eine große Vielfalt von sowohl exogenen als auch endogenen lipophilen Substraten (Übersichtsartikel in Glucuronidation of Drugs and Other Compounds, Dutton, Herausgeber, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1986). Diese Verbindungsreaktion ist wichtig für die Entgiftung und sichere Beseitigung verschiedener Medikamente und Karzinogene. Zusätzlich vollziehen sich der normale Metabolismus und die Beseitigung verschiedener endogener Wirkstoffe, wie z. B. Bilirubin und Steroidhormonen über die Verbindung mit Glucuronsäure. Verfügbare Beweise aus Insektensystemen deuten an, daß Zuckerverbindungsreaktionen dieses Typs eher eine Glucose- als eine Glucuronsäure-Übertragung beinhalten (Übersichtsartikel in Smith in Drug Metabolism -From Microbe to Man, Parke and Smith, Herausgeber, Taylor and Francis Ltd., London, [1977], Seiten 219-232). Wiebeiden Säugern wird eine große Vielfalt von exogenen und endogenen Verbindungen in Insekten verbunden. Die Erfinder haben gezeigt, daß das AcMNPV-EGT-Protein eine UPD-Glucosyl-Transferase ist, die spezifisch Glucose mit Ecdysteroiden, wie z. B. Ecdyson, 20-Hydroxyecdyson und Makisteron A (siehe Tabelle III) verbindet. Weder verändern Lysate noch extrazelluläres Medium nichtinfizierter Zellen, noch vEGTZ-infizierte Zellen Ecdyson. Der größte Teil der von mit AcMNPV infizierten Zellen exprimierten Ecdysteroidglucosyl-Transferase-Aktivität wird in das extrazelluläre Medium ausgeschleust; lediglich eine ziemlich kleine Aktivitätsebene wird in AcMNPV-infizierten Zellysaten beobachtet.

Unter Verwendung des AcMNPV-egt-Gens als Sonde ist in einem anderen Baculovirus, Orgyia pseudotsugata nuklearer Polyhedrosisvirus (OpMNPV) ein egt-Gen identifiziert worden, wie in Fig. 4 gezeigt. Es wird vom Durchschnittsfachmann anerkannt werden, daß mit dem Nutzen aus dieser Offenbarung, das egt-Gen von jedem Baculovirus, Insektenvirus oder Insekt in einer ähnlichen Art und Weise, wie hier beispielhaft dargestellt, ausfindig gemacht, charakterisiert und isoliert werden kann. egt-Gene mit einer mindestens 70%igen Nucleotidsequenz-Homologie zur Sequenz in Tabelle I werden als zur Sequenz in Tabelle I gleichwertig betrachtet, vorausgesetzt, daß diese homologen Gene für ein Enzym codieren, das eine Ecdysteroid-UDP-Glucosyl-Transferase ist.

Funktionelle Gegenstücke zum egt-Gen sind solche, die durch Übertragung eines Glucosebestandteils von UDP-Glucose auf das Ecdysteroid (die Ecdysteroide) die Inaktivierung von Ecdysteroiden, wie z. B. Ecdyson katalylsieren. Diese funktioneilen Gegenstücke von egt können unter Verwendung der hier beschriebenen Untersuchungsverfahren identifiziert werden. Mit dem Ausfindigmachen, der Identifizierung und Isolierung eines egt-Gens kann der Durchschnittsfachmann unter Verwendung der Lehren der vorliegenden Offenbarung und im Stand der Technik bekannter Techniken das Gen inaktivieren, um ein wirksameres Mittel zur Insektenkontrolle herzustellen.

Durch Vergleich der Eigenschaften von vEGTZ mit den Eigenschaften des Wildtyps (wt) AcMNPV ist erfindungsgemäß gezeigt worden, daß egt-Expression die Insekten an der Häutung und Verpuppung hindert. Mit wt AcMNPV infizierte Insekten häuten und verpuppen sich nicht, mit vEGTZ infizierte Insekten häuten sich jedoch und versuchen sich zu verpuppen (sieheTabelle IV in Beispiel 2).

Durch die Hemmung von Häutung und Verpuppung kann die Infektion mit wt AcMNPV die Zeit der Nahrungsaufnahme von Larven tatsächlich verlängern. Larven, die zu Beginn des 5. Larvenstadiums (des letzten Larvenstadiums) mit wt-Virus infiziert worden sind, fahren mit der Nahrungsaufnahme bis zum Tod 5 oder 6 Tage nach der Infektion fort. Nichtinfizierte Larven hören jedoch mit der Nahrungsaufnahme 2 bis 3 Tage, nachdem sie in das 5. Larvenstadium eingetreten sind und sich auf die Verpuppung vorbereiten (siehe Fig. 8) auf. Ähnliche Auswirkungen werden beobachtet, wenn Larven früherer Larvenstadien begutachtet werden. Nichtinfizierte Larven hören während der Häutung etwa 24 Stunden mit der Nahrungsaufnahme auf, während mit wt AcMNPV infizierte Larven sich nicht häuten und folgerichtig nicht mit der Nahrungsaufnahme aufhören (siehe Fig. 6).

Rekombinante Baculoviren, denen das funktionsfähige egt-Gen fehlt, verlängern die Zeit der Nahrungsaufnahme durch die Larven nicht. Somit hören mit vEGTZ im frühen fünften Larvenstadium infizierte Larven 2 Tage nach der Infektion bei der Vorbereitung auf die Verpuppung mit der Nahrungsaufnahme auf (siehe Fig. 8). Sie verpuppen sich jedoch nicht, sondern sterben sogar schneller an der Virusinfektion als Larven, die mit dem wt-Virus infiziert sind, wie in Fig. 9 gezeigt. Ähnlich hören mit vEGTZ früh im vierten Larvenstadium infizierte Larven mit der Nahrungsaufnahme 2 Tage nach der Infektion auf, um sich zu häuten und sterben dann schneller als mit wt infizierte Larven (siehe Figuren 6 und 7). Das schnellere Abtöten durch ein Baculovirus, dem ein funktionsfähiges egt-Gen fehlt, ist besonders dramatisch sichtbar, wenn frisch geschlüpfte Larven des ersten Larvenstadiums mitwt AcMNPV und mit vEGTZ, wie in den Figuren 10 und 11 gezeigt, infiziert werden. MitvEGTZ infizierte Larven sterben an der viralen Infektion 3 bis 4 Tage früher als mit wt AcMNPV infizierte Larven. Daher sind rekombinante Baculoviren, denen ein funktionelles egt-Gen fehlt, wesentlich wirksamer als Wildtyp-Baculoviren als Mittel zur Insektenkontrolle. Es ist für den Durchschnittsfachmann augenscheinlich, daß mit dem Nutzen aus dieser Offenbarung das egt-Gen in jedem Baculovirus oder Insektenvirus durch irgendwelche, im Stand der Technik bekannte Mittel, funktionsunfähig gemacht werden können.

Die oben und in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Auswirkungen werden auf dem Felde dramatischer sein. Mit vEGTZ infizierte Larven zeigen Schwierigkeiten beim Häuten und haben darin unter sorgfältig kontrollierten Laborbedingungen Erfolg. Wenn Temperatur und Licht nicht streng kontrolliert werden, können viele Insekten die Häutung nicht vollenden. Diese Insekten fangen nicht wieder mit der Nahrungsaufnahme an und sterben kurz danach.

Obwohl die Zeitspanne, in der sich Virusnachkommen in mit Baculoviren, denen ein funktionsfähiges egt-Gen fehlt, ansammeln können, ein wenig verkürzt ist und das infizierte Insekt verringertes Wachstum zeigt, gibt es eine beträchtliche Herstellung von Virusnachkommen. Die Menge an pro Larve erhaltenem Virus nach Infektion der Larve des späten Larvenstadiums mit vEGTZ ist etwa halb so groß wie die mit wt-Virus erhaltene. Dies ist ausreichend, um die Übertragung des Virus im Feld und eine kostenwirksame Herstellung von großen Mengen an Viruspartikeln zu gestatten.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Insektenvirus, dem ein funktionsfähiges egt-Gen fehlt, durch Genmanipulations-Techniken so verändert, daß seine Wirksamkeit als Mittel zur biologischen Kontrolle durch den Einbau eines zweiten Gens, dessen Produkt die Insektenentwicklung beeinflußt, weiter erhöht wird.

Das für PTTH (ein Peptidhormon) codierende Gen kann in ein Virusgenom, in dem das egt-Gen deletiert ist, eingefügt werden und PTTH kann auf Ebenen exprimiert werden, die ausreichen, um die Ecdysis zu beeinflussen. Mit einem solchen Virus infizierte Insektenlarven erfahren ein äußerstes Auseinanderbrechen der hormonalen Entwicklungskontrolle. Diese Insekten werden schnell krank, was zu ernsthaft gefährdetem Wuchs und gefährdeter Entwicklung, verringerter Nahrungsaufnahme und früherem Tod führt.

Das Häutungshormon ist ebenfalls ein kleines Peptidhormon, dessen Gen unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren in das virale Genom mit einem nichtfunktionsfähigen egt-Gen eingefügt werden kann. Da das Häutungshormon viele mit der Ecdysis verbundene Verhaltensänderungen steuert, werden mit einem egt~-Virus, der genügend hohe Mengen dieses Hormons herstellt, infizierte Insekten Abweichungen vom normalen Verhalten und/oder von der normalen Entwicklung, wie z. B. verringerte Nahrungsaufnahme, zeigen.

Ein Hauptregler für den Juvenilhormontiter im Insekt ist das Enzym Juvenilhormon-Esterase, das Juvenilhormon inaktiviert. Ein rekombinantes Virus, dem ein funktionsfähiges egt-Gen fehlt, und das genügend hohe Mengen von Juvenilhormon-Esterase exprimiert, kann das Verhalten und/oder die Entwicklung von Insekten nachteilig beeinflussen.

Es ist wichtig zu beachten, daß, während all die obigen Gene in das Wildtypvirus-Genom eingefügt werden können, nicht erwartet werden kann, daß sie im Wildtyp-Virus das Insektenverhalten in bedeutendem Ausmaß beeinflussen, da die Expression des egt-Gens durch den Wildtyp-Virus die ecdysteroiden Häutungshormone inaktivieren und Ecdysis unabhängig von der Herstellung anderer Hormone verhindert wird. Somit hängen erfolgreiche Strategien, welche die Erzeugung von Viren beinhalten, die ausgerichtet sind, die Insektenecdysis zu behindern von der vorherigen Inaktivierung des egt-Gens ab, wie erfindungsgemäß beschrieben.

Für den Durchschnittsfachmann ist es selbstverständlich, daß mutierte Organismen, denen ein unversehrtes egt-Gen fehlt oder die nicht in der Lage sind, ein funktionsfähiges egt-Genprodukt zu exprimieren, und die weiterhin genetisch verändert sind, so daß sie ein weiteres Hormon veränderndes Enzym oder ein Peptidhormon exprimieren als Mittel zur Insektenkontrolle der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind.

Für das egt-Genprodukt ist gezeigt worden, daß es die Insektenentwicklung auf eine nachdrückliche und spezifische Art und Weise beeinträchtigt. Ecdysteroide spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung von im wesentlichen allen Insektenarten (Übersichtsartikel in Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology, Kerkut und Gilber, Herausgeber, Pergamon Press, Oxford, 1984). Somit bestehen für egt selbst beträchtliche Möglichkeiten zur Verwendung in breit angelegten Strategien zur Insektenkontrolle. In der vierten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beispielsweise können Getreidearten genetisch durch irgendein im Stand der Technik bekanntes Verfahren verändert werden, um das EGT-Protein konstitutiv herzustellen. Insekten, die Nahrung von solchen Getreiden zu sich nehmen, werden nicht in der Lage sein, sich vollständig zu erwachsenen Insekten zu entwickeln und dadurch für einen wirksamen Langzeitschutz des Getreides zu sorgen. Auf ähnliche Weise können normalerweise in oder auf der Pflanze oder dem Insekt anwesende Bakterien durch zum Stand der Technik gehörende Verfahren genetisch verändert werden, um das Enzym EGT herzustellen. Solche Bakterien werden gleichfalls als wirksame Mittel zur biologischen Kontrolle funktionieren.

Auf ähnliche Weise können nichtphytopathogene, Pflanzen besiedelnde Bakterien genetisch verändert werden, um das egt-Gen zu exprimieren. Pflanzen, die von solchen genetisch veränderten Bakterien besiedelt sind, werden vor Insekten, die für die Wirkung des exprimierten Proteins (der exprimierten Proteine) anfällig sind, geschützt. Nichtphytopathogene, Pflanzen besiedelnde Bakterien sind z.B. in der US-PS4,798,723 beschrieben und genetische Veränderungen bei bestimmten Pflanzen besiedelnden Bakterien sind in der US-PS Nr.4,771,131 und in der EP-A0185005 beschrieben. Andere Pflanzen besiedelnde Bakterien sind im Stand der Technik bekannt. Alle im Stand der Technik bekannten Mittel können verwendet werden, um exprimierbare Gene, wie z.B. die oben aufgeführten einzuführen, um Mittel zur Insektenkontrolle herzustellen. Aufnahme solchen genetisch veränderten Pflanzenmaterials oder Pflanzenmaterials, das von solchen genetisch veränderten, Pflanzen besiedelnden Bakterien besiedelt ist, durch ein anfälliges Insekt wird zu einem Auseinanderbrechen der normalen Entwicklung in diesem Insekt führen. Im Stand der Technik ist bekannt, daß bestimmte Insekten, z.B. Blattläuse ein besonders durchlässiges Darmgewebe besitzen. Der Durchschnittsfachmann kennt die zur Konstruktion eines solchen, in Pflanzen exprimierbaren Genes und die zum Einbau eines solchen Genes in das Pflanzengenom notwendigen molekularbiologischen Verfahrensschritte.

Es ist wahrscheinlich, daß Insekten während bestimmter Stadien ihres Lebenszyklus ein egt-Gen selbst exprimieren und daß dies einen wichtigen Bestandteil der die Entwicklung regulierenden Mechanismus darstellt. Es ist somit möglich, daß ein Insekten-egt-Gen ein geeignetes Ziel für neue Strategien zur Insektenkontrolle sein kann. Die Offenbarung der vorliegenden Erfindung stellt die Mittel für das Entwerfen solcher Strategien zur Verfügung.

Eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, daß Ecdysteroidanaloge, die an das EGT-Enzym binden, aber nicht gespalten und vom Enzym freigesetzt werden können, entworfen werden können. Solche „Selbstmordsubstrate" werden konkurrierend an das EGT-Enzym binden und seine Tätigkeit beeinträchtigen oder verhindern und folgerichtig die Insektenentwicklung beeinträchtigen. Andererseits können rekombinante Lebewesen genetisch konstruiert werden, wobei die hier zur Verfügung gestellten Lehren und solche des Standes der Technik verwendet werden, so daß z. B. die Expression des Insekten-egt-Gens durch die Herstellung von „antisense" RNA verhindert wird.

Wie hier verwendet, ist ein Mittel zur Insektenkontrolle eine Zusammensetzung oder der wirksame Bestandteil einer Zusammensetzung, die eine nachteilige Auswirkung auf Schädlinge hat. Die Nahrungsaufnahme durch die Insekten ist als Antwort auf das Mittel zur Insektenkontrolle verringert, die normale Insektenecdysis ist auseinandergerissen, und es folgt der Tod des Insekts. Ein Mittel zur erfindungsgemäßen Insektenkontrolle kann ein Insektenvirus sein, das genetisch verändert wurde, um

ein für ein ein Ecdysteroid veränderndes Enzym codierendes Gen zu inaktivieren oder eins, das weiter verändert ist, um ein heterologes, für ein die Insektenentwicklung beeinflussendes Protein codierendes Gen zu exprimieren, oder es kann eine Pflanze, ein Insektenparasit oder ein nichtphytopathogenes Bakterium sein, wobei jeder Organismus genetisch verändert worden ist, um ein heterologes Gen zu exprimieren, das für ein die Ecdysis beeinflussendes Protein codiert.

Zur Anwendung bei Pflanzen zur Schädlingsbekämpfung geeignete insektizide Zusammensetzungen beinhalten einen für die Landwirtschaft geeigneten Träger und ein Mittel zur Insektenkontrolle. Die Anwendung einer Insektiziden Zusammensetzung dieser Erfindung kann Pflanzen durch verminderte Nahrungsaufnahme von und Abtöten von empfänglichen Insekten vor Schädlingen schützen.

Der Durchschnittsfachmann weiß, wie er ein Mittel zur Insektenkontrolle auswählt, z. B. einen Insektenvirus, der zur Kontrolle eines besonderen Schädlings geeignet ist.

Es ist für den Durchschnittsfachmann selbstverständlich, daß die Schädlinge dem Mittel zur Insektenkontrolle der vorliegenden Erfindung in üblicherweise, einschließlich Nahrungsaufnahme, Einatmen oder direkten Kontakt mit dem Mittel zur Insektenkontrolle ausgesetzt werden können.

Ebenfalls als Mittel zur Insektenkontrolle betrachtet werden Pflanzen und entomopathogene Mikroorganismen, die genetisch verändert worden sind, um mindestens ein Protein, das die Insektenentwicklung beeinflußt, zu exprimieren. Beispiele für solche Proteine beinhalten, aber sind nicht beschränkt auf, prothoracotropes Hormon, Häutungshormon, Juvenilhormon-Esterase und Ecdiponglucosyl-Transferase.

Insektenparasiten, Bakterienviren, Pilze und andere Insekten eingeschlossen, können ebenfalls genetisch verändert werden, um egt zu exprimieren. Schmarotzertum bei geeigneten Insekten durch solche Insektenparasiten wird im Auseinanderreißen der normalen Entwicklung zusätzlich zur Symptomatik, die normalerweise mit dem nichtveränderten Parasiten verbunden ist, führen. Das Auseinanderbrechen der Entwicklung in infizierten Insekten verschlimmert das Krankheitsstadium der Insekten. Die Nahrungsaufnahme durch den und die Infektion des Schädlings wird die Nahrungsaufnahme verringern und den Tod beschleunigen.

Hier offenbarte, für ein EGT-Protein, das die Insektenentwicklung beeinflußt, codierende DNA-Sequenzen, die unter der regulatorischen Kontrolle eines für den Organismus geeigneten Promotors exprimiert werden, können zur genetischen Veränderung eines Lebewesens zur Herstellung eines Mittels zur Insektenkontrolle verwendet werden. Zielorganismen für eine genetische Veränderung beinhalten Insektenparasiten, Pflanzen und nichtphytopathogene Pflanzen besiedelnde Bakterien.

Das egt-Gen, das Genprodukt, gegen das letztere gerichtete Antikörper und alle anderen, vom obigen abgeleiteten oder damit verbundenen Reagenzien fallen alle unter den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. Das EGT-Protein kann unter Verwendung der hierin beschriebenen Untersuchung und von im Stand der Technik bekannten Verfahren wesentlich gereinigt werden.

Eine der grundlegenden Anwendungen der genetisch veränderten Baculoviren der vorliegenden Erfindung wird die als Bestandteile von landwirtschaftlichen Zusammensetzungen zur Anwendung bei Pflanzen sein, um die biologische Kontrolle von Pflanzenschädlingen zu bewirken. Viele verschiedene Möglichkeiten zur Herstellung solcher landwirtschaftlich geeigneter Zusammensetzung zur Insektenkontrolle sind im Stand der Technik bekannt.

Die Konzentration des Mittels zur Insektenkontrolle, das erforderlich sein wird, um als Insektizide wirksame Zusammensetzungen für den Pflanzenschutz herzustellen, werden von der Art des Organismus, der verwendeten Mutation und der Formulierung der Zusammensetzung abhängen. Die als Insektizid wirksame Konzentration des Mittels zur Insektenkontrolle innerhalb der Zusammensetzung kann leicht im Versuch bestimmt werden und ist für den Durchschnittsfachmann leicht nachvollziehbar. Die als Insektizid wirksame Konzentration eines Virus kann z. B. leicht bestimmt werden, indem Abwandlungen von den in den Beispielen 6 bis 11 beschriebenen Techniken verwendet werden.

Landwirtschaftliche Zusammensetzungen müssen zur landwirtschaftlichen Verwendung und zum Ausstreuen auf Feldern geeignet sein. In der Regel müssen Bestandteile der Zusammensetzung nichtphytotoxisch sein und dürfen der Unversehrtheit des verpackten Virus keinen Schaden zufügen. Anwendungen bei Blättern dürfen die Pflanzenblätter nicht zerstören oder verletzen. Zusätzlich zu geeigneten festen oder, besonders bevorzugt, flüssigen Trägern, können landwirtschaftliche Zusammensetzungen Klebe- oder Haftmittel, emulgierende oder benetzende Mittel, jedoch keine Bestandteile, die die Nahrungsaufnahme der Insekten oder irgendwelche viralen Funktionen behindern, einschließen. Es kann ebenfalls wünschenswert sein, Bestandteile zuzugeben, die das Mittel zur Insektenkontrolle vor UV-Inaktivierung schützen.

Landwirtschaftliche Zusammensetzungen zur Schädlingsbekämpfung können auch Mittel einschließen, die die Nahrungsaufnahme der Insekten anregen.

Übersichtsartikel, die Verfahren zur Anwendung von biologischen Schädlingsbekämpfungsmitteln und die landwirtschaftliche Anwendung beschreiben, sind verfügbar. Siehe z.B. Couch und Ingnoffo (1981) in Microbial Control of Pests and Plant Disease 1970-1980,Burges, Herausgeber, Kapitel 34,Seiten 621-634; Corke und Rishbeth,a.a.O., Kapitel 39,Seiten 717-732; Brockwell

(1980) in Methods for Evaluating Nitrogen Fixation, Bergersen, Herausgeber, Seiten 417-488; Burton (1982) in Biological Nitrogen Fixation Technology for Tropical Agriculture, Graham und Harris, Herausgeber, Seiten 105-114; und Roughley (1982), a.a. O., Seiten 115—127; The Biology of Baculoviruses, Vol. II, a. a.O.

Diese Erfindung wird durch die folgenden, nicht als Einschränkung auszulegenden Beispiele erläutert. Es wird vorausgesetzt,

daß es Anwendungen für verschiedene andere Ausführungsformen, Veränderungen und Äquivalente hierfür geben kann, die sich, nach dem Durchlesen der hier gegebenen Beschreibung, dem Durchschnittsfachmann anbieten, ohne daß dabei vom Geist der vorliegenden Erfindung und/oder vom Schutzbereich der beigefügten Ansprüche abgewichen wird.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Die Lage des egt-Gens auf dem AcMNPV-Genom ist in Fig. 1 dargestellt. Eine Einteilung in Genkarteneinheiten ist oberhalb der Karte des AcMNPV-Genoms gegeben. Um die Nucleotidsequenz dieses Gens und der flankierenden Bereiche zu bestimmen und um die nachfolgenden Manipulationen des Gens zu ermöglichen, ist es zunächst notwendig, mehrere, diesen Bereich enthaltende DNA-Fragmente in Plasmidvektoren zu clonieren (siehe T. Maniatis et al. in Molecular Cloning: a Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY [1982] bezüglich Standardclonierungsverfahren). Abschnitt A zeigt eine lineare Genkarte des AcMNPV-Genoms nach Spaltung mit den Restriktionsendonucleasen EcoR I und Hind III. Abschnitt B ist eine Vergrößerung des Genoms von 7,6 bis 11,1 Genkarteneinheiten, die den Ort des egt-Gens zeigt. Der ursprünglich verwendete AcMNPV-Stamm ist der L1-Stamm (Lee und Miller, J.Virol.27 [1978], 764). Dieclonierten DNA-Fragmente und die Namen der sich daraus ergebenden Plasmide sind in Fig. 1, Abschnitt C, dargestellt. Fragment 1, das sich von der Pst I-Stelle bei 7,6 Genkarteneinheiten bis zu einer BamH I-Stelle bei 11,1 Genkarteneinheiten erstreckt, ist in den Plasmidvektor pUC 19 cloniert; die Fragmente 2 und 3 (von der Pst I-Stelle (7,6 Genkarteneinheiten) zur EcoR I-Stelle (8,65 Genkarteneinheiten) und von der EcoR I-Stelle (8,65 Genkarteneinheiten) zur SaI I-Stelle (10,5 Genkarteneinheiten) sind in die Vektoren Bluescript M13+ bzw. Bluescript M 13- (Stratagene, San Diego, California) cloniert. Fragment 5 (BstEII-Stelle [8,35 Genkarteneinheiten] bis BstEII-Stelle [8,7 Genkarteneinheiten]) ist in Bluescript M13+ cloniert.

Eine große Anzahl von Subclonen der Plasmide BCPsE und BCES wird dann hergestellt (Henikoff, Gene 28 [1984], 351). Diese Subclone haben zunehmend größere Deletionen der viralen Einfügung, so daß sie verschiedene Mengen viraler DNA, im Bereich von weniger als 50 Basenpaaren bis zum gesamten viralen Fragment enthalten. Viele dieser Subclone und das Plasmid BCB werden dann sequenziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 [1977], 5463), so daß das gesamte egt-Gen in beiden Richtungen sequenziert ist. Die erhaltenen Nucleotidsequenzen werden unter Verwendung der Programme von Pustell und Kefatos, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 643-655 und Devereaux et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 387-396 mittels Computers auf die Anwesenheit von offenen Leserastern, die für Proteine codieren können, untersucht. Diese Untersuchung weist darauf hin, daß das egt-Gen für ein Protein von 506 Aminosäuren codiert. Die Nucleotidsequenz des egt-Gens und die abgeleitete Aminosäuresequenz des egt-Genproduktes sind in Tabelle I dargestellt.

Beispiel 2

Um rekombinante Viren zu konstruieren, die nicht in der Lage sind, ein funktionsfähiges egt-Gen zu exprimieren, sind weitere Manipulationen der in Beispiel 1 beschriebenen Plasmidclone erforderlich. Das Plasmid pUCBCPsB wird mit den Restriktionsendonucleasen EcoR I und Xbal (siehe Fig.3für die Restriktionsschnittstellen innerhalb des egt-Gens) gespalten und das kleine Fragment wird verworfen. Das Escherichia coli lacZ-Gen, mit EcoR I und Aha III aus pSKS104 (Casadaban et al., Methods Enzymol.100 [1983], 293-303) herausgeschnitten, wird zwischen die EcoRI und Xbal-Restriktionsschnittstellen eingefügt, nachdem die Xbal überhängenden Enden unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase aufgefüllt worden sind. Das sich ergebende Plasmid wird mit pEGTZ bezeichnet. In diesem Plasmid befindet sich das eingefügte lacZ-Gen im Leseraster mit den vorausgehenden für egt codierenden Sequenzen. Auf der anderen Seite wird das Plasmid pEGTDEL konstruiert, indem einfach die EcoR I und Xbal-Restriktionsschnittstellen ligiert werden (nachdem beide Restriktionsschnittstellen mit glatten Enden versehen worden sind), ohne daß irgendwelche Sequenzen zwischen ihnen eingefügt wurden.

Alle Viren stammen ursprünglich von AcMNPV L-1 (Lee und Miller [1978], a.a.O.), sind plaque-gereinigt und in derSpodoptera frugiperda-Zellinie IPLB-SF-21 (SF-Zellen) (Vaughn et al., In Vitro 13 [1974], 213-217) unter Verwendung von früher beschriebenen Verfahren (Lee und Miller [1978]; Miller et al., Genetic Engineering, Principles and Methods, Vol.8, Herausgeber J. Setlow und A. Hollaender, Plenum Press, N. Y., Seiten 277-298,1986), vermehrt worden.

Das Plasmid pEGTZ wird dann mitwt AcMNPVDNA, wie von Miller et al. (1986), a.a.O. beschrieben in SF-Zellen cotransfiziert. Dieses Verfahren ermöglicht, daß homologe Rekombination zwischen den viralen und Plasmid-DNA-Sequenzen stattfinden kann, was zum Ersatz des viralen egt-Gens durch das egt-lacZ-Fusionsgen des Plasmids führt. Da die verbleibenden für egt codierenden Sequenzen im selben Leseraster wie die lacZ-Sequenzen sind, werden solche rekombinanten Viren ein Fusionsprotein herstellen, wobei die ersten 84 Aminosäuren von EGT mit ß-Galactosidase verbunden sind. Der mit vEGTZ bezeichnete rekombinante Virus kann identifiziert werden, da ß-Galactosidase-Expression in Gegenwart eines chromogenen Indikators, wie z. B. ö-Brom^-chlor-S-indolyl-ß-D-galactopyranosid (X-gal) zu blauen viralen Plaques führt. Eine graphische Darstellung des egt-Gens von vEGTZistin Fig. 3, Abschnitt B, gegeben.

Der rekombinante Virus vEGTDEL wird durch Cotransfektiondes Plasmids pEGTDELund DNA aus dem Virus vEGTZin SF-Zellen erhalten. Homologe Rekombination hat den Ersatz des egt-lacZ-Fusionsgens in vEGTZ mit dem deletierten egt-Gen aus pEGTDEL zur Folge. Der rekombinante Virus vEGTDEL wird durch sein Versagen, in Gegenwart von X-gal blaue Plaques zu bilden, identifiziert. Die Struktur des egt-Gens von vEGTDEL ist in Fig.3, Abschnitt C, dargestellt.

Beispiel 3

DasProdukt des egt-Gens wird durch den Vergleich der von wt AcMNPV (das EGT herstellt) hergestellten Proteine mit dem von vEGTZ oder vEGTDEL (die EGT nicht herstellen können) hergestellten identifiziert. SF-Zellen werden entweder mit wt AcMNPV oder mit vEGTZ bei einer Infektionsmultiplizät (MOD von 20, wie in O'Reilly und Miller, J. Virol. 64 [1990], 1321-1328 beschrieben, infiziert. Nicht infizierte Zellen werden ebenfalls untersucht. 6 Stunden nach der Infektion werden die Zellen in Gegenwart von radioaktiv markiertem ³⁶S-Methionin 1 Stunde inkubiert, um alle während dieser Zeitspanne hergestellten Proteine radioaktivzu markieren. Die Zellen werden dann lysiert und die Proteine durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) (Laemmli et al., Nature 227 [1970], 680-685) getrennt. Jegliche von den Zellen sezernierten Proteine werden ebenfalls geerntet und untersucht. Nach SDS-PAGE werden die radioaktiv markierten Proteine durch Autoradiographie nachgewiesen. Ein 60-KDa-Protein wird von wt AcMNPV infizierten Zellen, jedoch nicht von veGTZ infizierten Zellen oder nicht infizierten Zellen sezerniert. Dieses 60-KDa-Protein kann nicht in Lysaten von wt AcMNPV infizierten Zellen nachgewiesen werden, was zeigt, daß es von den Zellen sezerniert wird. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Produkt des egt-Gens ein sezerniertes 60-KDa-Protein ist, also Eigenschaften besitzt, die sich in guter Übereinstimmung mit den Daten der Nucleotid- und Aminosäuresequenz befinden.

Beispiel 4

Die enzymatische Aktivität des EGT-Proteins wird durch Vergleich von wt AcMNPV infizierten SF-Zellen mit vEGTZ infizierten SF-Zellen identifiziert. Mitwt AcMNPV oder vEGTZ infizierte SF-Zellen sind in Beispiel 3 beschrieben. 12 Stunden pi werden die Zellen und extrazellulären Medien gesammelt und getrennt weiter behandelt. Nicht infizierte Zellen werden parallel dazu behandelt. Zellysate oder extrazelluläre Medien werden in Gegenwart von 1 mM UDP-Glucose und 0,25 pCi-³H-Ecdyson, wie in O-Reilly und Miller, Science 245 (1989), 1110-1112 beschrieben, inkubiert. Ecdysteroid UDP-Glucosyl-Transferase-Aktivität in

den Zellysaten oder Medien wird die Übertragung von Glucose von der UDP-Glucosezu Ecdyson zur Bildung einer Ecdyson-Glucose-Verbindung katalysieren. Ecdyson und die Ecdyson-Glucose-Verbindung werden durch Silikagel-Dünnschichtchromatographie(Bansal und Gessner, Anal. Biochem. 109 [1988], 321 (voneinander getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Ecdyson-Glucose-Verbindungen (G) werden nur gebildet, wenn wt AcMNPV infizierte Zellysate oder extrazelluläres Medium untersucht werden. Man sieht keine Verbindungen, wenn nicht infizierte oder mit vEGTZ infizierte Zellysate oder Medien verwendet werden, was zeigt, daß die Aktivität auf egt-Expression zurückzuführen ist. Der größte Anteil der Aktivität befindet sich im extrazellulären Medium, in Übereinstimmung mit den in Beispiel 3 erörterten Ergebnissen. Der Beweis, daß Glucose mit Ecdyson verbunden sind, wird dadurch erhalten, daß wt infizierte Lysate wie oben beschrieben, untersucht werden, mit der Ausnahme, daß die UDP-Glucose durch die radioaktiv markierte UDP-[U-¹⁴C]-Glucose ersetzt wird. Reaktionen, die mit nicht markierter UDP-Glucose oder markierter UDP-[U-¹⁴C]-Glucose durchgeführt werden, wobei ³H-Ecdyson in beiden Reaktionen anwesend ist und Scintillationszählung der Verbindung zeigen, daß sowohl ³H aus dem Ecdyson und ¹⁴C aus der Glucose nachgewiesen werden können. Diese Ergebnisse beweisen, daß das egt-Genprodukt eine UDP-Glucosyl-Transferase ist, die die Übertragung von Glucose von UDP-Glucose auf Ecdyson katalysiert. Anschließend werden Untersuchungen durchgeführt, um dieSubstratspezifität von EGT gründlicher zu untersuchen. In diesen Untersuchungen werden verschiedene Substrate (1 mM) in Gegenwart von extrazellulärem Medium von wt AcMNPV infizierten Zellen, die eine bedeutsame EGT-Aktivität beinhalten, inkubiert. Als Kontrollen zur Sicherstellung, daß jegliche beobachtete Verbindung auf egt zurückgeht, wird jedes Substrat ebenfalls mit Medien von nichtinfizierten und vEGTZ-infizierten Zellen, die EGT nicht herstellen können, inkubiert. 0,05 μΟί UDP-[U-¹⁴C]-Glucose werden zu jeder Reaktion gegeben. Jegliche Bestandteile, die Substrate für EGT sind, werden mit Glucose verbunden werden; sie können nachgewiesen werden, da Glucose radioaktiv markiert ist.

Tabelle III

Substratspezif ität von EGT

Scheininfektion Wildtyp

(pMol Glucose (pMol Glucose

Substrat übertragen) übertragen)

p-Aminobenzoesäure - -

Bilirubin - -

Chloramphenicol - -

Diethylstilbestrol - -

Ecdyson — 155,7

ß-Estradiol -

20-Hydroxyecdyson - 87,8

Hydroxychinolin - -

MakisteronA - 89,6

(-) Menthol - -

Methylumbelliferol - -

a-Naphthol - -

p-Nitrophenol — —

Phenolphthalein - -

Testosteron - -

a-Tetralol - -

Die Substrate werden in Gegenwart von Medium, das aus in geeigneter Weise infizierten Zellen und 0,05μ0ϊ UDP-[U-¹⁴C]-Glucose stammt, inkubiert. Die Mengen an übertragener Glucose werden nach Scintillationszählung der geeigneten Bereiche der Chromatographieplatten berechnet.

Eine weitere Kontrolle ist die Zugabe von UDP-[U-¹⁴C]-Glucuronsäure zu einem getrennten Satz von Reaktionen mit Medium von wt-infizierten Zellen, um zu zeigen, daß Glucuronsäure durch diese Reaktion nicht übertragen wird. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt. Die einzigen identifizierten Substrate sind Ecdyson, 20-Hydroxyecdyson und Makisteron A, die alle Ecdysteroide sind. Keine Verbindung wird beobachtet, wenn Medium von Schein- oder vEGTZ infizierten Zellen verwendet wird, was bestätigt, daß die beobachtete Aktivität auf die Expression von egt zurückzuführen ist. Keine Verbindung wird beobachtet, wenn UDP-[U-¹⁴C]-Glucuronsäure verwendet wird, was zeigt, daß EGT keine Glucuronsäure überträgt.

Beispiel 5

Um zu zeigen, daß andere Baculoviren ebenfalls Gene mit einer wesentlichen Homologie zum AcMNPV-egt-Gen enthalten, wird die DNA von OpMNPV isoliert und getrennt mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI, BamH I und Hind III gespalten. Diese Enzyme spalten die virale DNA in mehrere Fragmente verschiedener Größen, deren Lage im OpMNPV-Genom schon bekannt sind (Leisyetal., J.Virol.52 [1984], 699). Southern-Hybridisierungen werden, wie in T.Maniatis et al. (1982) a.a.O. beschrieben, durchgeführt. Ein inneres Fragment des AcMNPV-egt-Gens wird mit den Enzymen EcoR I und Xba I (siehe Fig. 1) aus dem Plasmid BCES herausgeschnitten. Dieses Fragment wird radioaktiv mit ³²P markiert und als Sonde verwendet, um verwandte Sequenzen im OpMNPV-Genom zu identifizieren. Unter geeigneten, zum Stand der Technik gehörenden Bedingungen, wird ein DNA-Fragment an ein anderes DNA-Fragment binden, das ähnliche oder identische Sequenzen enthält. Somit sollte die AcMNPV egt-Sonde an jegliche OpMNPV-DNA-Fragmente auf der Nylon-Membran binden, die verwandte DNA-Sequenzen enthalten. Die Lage der gebundenen Sonde kann dadurch sichtbar gemacht werden, daß die Membran einem Röntgenfilm ausgesetzt wird. Die egt-Sonde wird zunächst mit der Nylon-Membran unter Bedingungen niedriger Stringenz (1M Natriumchlorid, 0,3M Natriumeitrat, 5% Dextransulfat, 5x Denhardt's-Lösung und 0,25% SDS bei 37⁰C) hybridisiert. Dies ermöglicht der Sonde, an ziemlich weit entfernt verwandte Sequenzen zu hybridisieren. Die Stringenz der Hybridisierung wird dann zunehmend erhöht.

indem die Hybridisierungstemperatur erhöht wird oder durch Zugabe von Formamid zur Hybridisierungslösung, bis spezifisch hybridisierende Banden beobachtet werden. Die Hybridisierungsbedingungen für Fig.4 sind 1 M Natriumchlorid, 0,3M Natriumeitrat, 5% Dextransulfat, 5x Denhardt's-Lösung und 0,25% SDS bei 68°C für 15 Stunden. Die Membran wird dann zweimal 15 Stunden jeweils in 0,3M Natriumchlorid, 0,1 M Natriumeitrat, 0,1 % SDS bei 68⁰C gewaschen. Fig.4 zeigt, daß die AcMNPV-egt-Sonde an spezifische Fragmente der OpMNPV-DNA, nämlich EcoR I-Fragment B, BamH I-Fragment A und Hind III-Fragmente N und S bindet. Zu beachten ist, daß das OpMNPV-egt-Gen sich in derselben relativen Lage im Genom befindet wie das AcMNPV-Gen (Fig.5). Ähnliche Protokolle können zur Identifizierung von egt-homologen Genen in anderen Entomopathogenen angewendet werden. Es wird vorausgesetzt, daß es für stark verschiedene Sequenzen notwendig sein wird, EGT-Aktivität unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Untersuchungsverfahren zu bestätigen. Anschließend wird eine molekulargenetische Analyse des Genoms erforderlich sein, um das für das EGT-Enzym codierende Gen unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren zu isolieren.

Andererseits kann das egt-Gen in anderen Lebewesen auch gefunden werden, indem die in Beispiel 4 beschriebene spezifische Untersuchung für EcdysteroidUDP-Glucosyl-Transferaseaktivität verwendet wird. Diese Untersuchung wird verwendet, um das Enzym während der Reinigung durch in üblicher Weise angewendete biochemische Techniken zu identifizieren. Einmal gereinigt, wird ein Teil der Aminosäuresequenz des EGT-Proteins bestimmt. Diese Information wird verwendet, um eine Oligonucleotidsonde zu erzeugen, die dann verwendet wird, um das egt-Gen im Genom ausfindig zu machen.

Beispiel 6

Hämolymphe Titer von Ecdysteroiden schwanken in einer cyclischen Art und Weise, um sowohl Larven-Larven- als auch Larven-Puppen-Häutungen zu steuern, und da vermutet wird, daß die Verbindung mit Glucose Ecdysteroide inaktiviert (Warren et al., J.Liq.Chromatogr.9[1986], 1759; Thompson et al.. Arch. Insect Biochem.Physiol.4 [1987], 1; Thompson et al., Arch. Insect Biochem.Physiol.7[1988], 157), ist es wahrscheinlich, daß egt-Expression während AcMNPV-lnfektion den normalen Entwickiungsfortgang des infizierten Insekts auseinanderreißt. Um ein solches Auseinanderreißen zu zeigen, werden frisch gehäutete S.frugiperda-Larven des vierten Larvenstadiums durch Injektion von wt AcMNPV oder vEGTZ infiziert und täglich auf Störungen in ihrer Entwicklung überwacht. Eine Gruppe Larven wird mit Gewebekulturflüssigkeit als negative Kontrolle injiziert. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind unten in Tabelle IV dargestellt. Alle mit Gewebekulturflüssigkeit injizierten Larven (scheininfiziert) häuten sich, wie erwartet, im fünften Larvenstadium. Nur eine von 16mitwt-Virus infizierten Larven vollzieht diesen Übergang. Im Gegensatz dazu vollziehen alle mit dem mutierten vEGTZ infizierten Larven die Häutung vom vierten zum fünften Larvenstadium. Somit behindert egt-Expression durch wt AcMNPV eindeutig und spezifisch die Häutung des Wirts. Beide Gruppen infizierter Larven sterben nachfolgend an der viralen Infektion, was zeigt, daß die Zerstörung des egt-Gens vEGTZ nicht daran hindert, seinen Insektenwirt zu töten.

Tabelle IV

Behinderung der Häutung durch AcMNPV-lnfektion

Virus Häutung Sterblichkeit

Scheininfektion 16 0

Wildtyp 1 16

vEGTZ 16 16

S.frugiperda-Larven des vierten Larvenstadiums werden mit 1X 10⁵pfu wt AcMNPV oder vEGTZ in 5 μΙ injiziert. Scheininfizierte Larven werden mit 5μΙ Gewebekulturflüssigkeit injiziert. Jede Gruppe beinhaltet 16 Larven, die bei 28⁰C mit einem 14:10 Stunden Hell-Dunkel-Zyklus auf künstlicher Diät gehalten werden (R. L. Burton [1969] ARS-Veröffentlichung, Seiten 33 bis 134). Larven werden täglich auf Häutung überwacht und die Sterblichkeit wird am Tag 7 aufgezeichnet. Unterschiedliche Ergebnisse erhält man, wenn Larven im frühen fünften Larvenstadium injiziert werden. Wenn frisch geschlüpfte Larven des fünften Larvenstadiums verwendet werden, zeigen keine wt-infizierten Larven irgendwelche Zeichen von Verpuppung, während hingegen die Mehrzahl dervEGTZ-infizierten Larven mehrere, eine bevorstehende Larven-Puppen-Häutung kennzeichnende Verhaltensänderungen (Einstellen der Nahrungsaufnahme, Herumwandern und Spinnen) zeigen. Alle virusinfizierten Larven starben jedoch vor der Verpuppung. Diese Ergebnisse zeigen, daß Infektionen mit AcMNPV die Insektenlarve^daran hindern, sich zu häuten oder zu verpuppen. Ferner zeigen die Ergebnisse, daß diese Unterbrechung der Entwicklung des Insekts auf die Expression von egt zurückzuführen ist.

Beispiel 7

Biologische Untersuchungen in vivo von Wildtyp (wt) AcMNPV und vEGTZ offenbaren, daß egt-Gen-Expression die Zeitspanne, die die infizierte Larve mit der Nahrungsaufnahme verbringt, verlängert und daß Zerstörung von egt die Eigenschaften des Virus als Pestizid verbessert. In diesen Untersuchungen werden S.frugiperda-Larven früh im vierten Larvenstadium entweder mit wt AcMNPV oder vEGTZ injiziert. Zum Vergleich werden Kontrollarven mit Gewebekulturmedium, das kein Virus enthält, injiziert. Die Larven werden täglich auf Gewichtszunahme, Anzeichen für Häutung oder Verpuppung und Sterblichkeit untersucht. Die durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahmen der verschiedenen Larvengruppen sind zusammen mit der prozentualen Sterblichkeit in den Figuren 6 bzw. 7 aufgetragen. Kontroll-Larven zeigen während der ersten beiden Tage gemäßigtes Wachstum. Während des zweiten Tages häuten sie sich alle zum fünften Larvenstadium. Dann wachsen sie dramatisch fürzwei weitere Tage, bevor sie mit der Nahrungsaufnahme in Vorbereitung auf die Verpuppung aufhören. Lediglich eine von 16wt AcMNPV-infizierten Larven häutet sich und statt dessen zeigen die Larven für drei auf die Infektion folgende Tage fortgesetztes Wachstum. In diesem Stadium beginnen sie, krank zu werden, keine Larve stirbt jedoch vor Tag 5. Alle wt-AcMNPV-infizierten Larven sind am Tag 6 tot. Im Gegensatz dazu durchlaufen alle vEGTZ-infizierten eine Häutung vom vierten zum fünften Larvenstadium und hören während dieser Zeitspanne mit der Nahrungsaufnahme auf. Dies ist für das Fehlen des Wachstums von Tag 1 bis Tag 2 verantwortlich. Nach der Häutung setzen sie die Nahrungsaufnahme fort, beginnen jedoch am Tag 3, Anzeichen von Krankheit zu zeigen. Am Tag 4 nach der Infektion beginnen sie zu sterben und alle sind am Tag 5 tot. Mit einem

AcMNPV-Abkömmling, dem ein funktionsfähiges egt fehlt, infizierte Larven zeigen eine verringerte Nahrungsaufnahme und sterben nach der Infektion schneller als jene mit Wildtyp AcMNPV infizierten.

Diese Erscheinungen beobachtet man sogar noch deutlicher nach Infektion von Larven des fünften Larvenstadiums (Figuren und 9). Wie erwartet, zeigen Kontrollarven zwei Tage lang beträchtliches Wachstum, bevor sie mit der Nahrungsaufnahme in Vorbereitung auf die Verpuppung aufhören. Dieses Einstellen bei der Nahrungsaufnahme ist von einem dramatischen Gewichtsverlust begleitet. Mit wt AcMNPV infizierte Larven zeigen keine Anzeichen eines solchen Einsteilens der Nahrungsaufnahme; sie fahren fort, Nahrung aufzunehmen und nehmen zwei weitere Tage an Gewicht zu, bevor sie anfangen, krank zu werden. Die Sterblichkeit ist bis sieben Tage nach der Infektion nicht vollständig.

Es ist zusammenfassend ersichtlich, daß mit vEGTZ infizierte Larven, ebenso wie die Kontrollen lediglich in den ersten beiden Tagen nach der Infektion Nahrung zu sich nehmen. Nach diesem Punkt gibt es einen dramatischen Gewichtsverlust, da sie sich auf die Verpuppung vorbereiten. Keine dieser Larven verpuppt sich jedoch; sie zeigen am dritten Tag Anzeichen von Krankheit und sind alle sechs Tage nach der Infektion tot. Wie gehabt, bringt Infektion mit vEGTZ verminderte Nahrungsaufnahme und einen früheren Tod mit sich.

Beispiel δ

Die Auswirkungen von Infektionen mit vEGTZ und wt AcMNPV auf frisch geschlüpfte S.frugiperda-Larven des ersten Larvenstadiums werden verglichen. Neu geborene S.frugiperda werden mit einer Nahrung gefüttert, die verschiedene Konzentrationen von vEGTZ oder wt AcMNPV polyhedralen Einschlußkörpern (PIBs) enthält und täglich auf Sterblichkeit hin überwacht. Die für zwei verschiedene Dosen erhaltenen Ergebnisse sind in den Figuren 10 und 11 dargestellt. Es ist ersichtlich, daß mit vEGTZ infizierte Larven bei beiden Dosen wesentlich früher eine beträchtliche Sterblichkeit zeigen als mit dem wt-Virus infizierte Larven. In der Regel werden mit dem rekombinanten Virus infizierte Larven drei bis vier Tage früher als mit Wildtyp infizierte Larven getötet. Dieses Ergebnis sorgt für einen weiteren Beweis dafür, daß inaktivierte egt-Gene enthaltende Baculoviren besser als biologische Pestizide arbeiten als wt- Baculoviren mit unversehrten egt-Genen.

Beispiel 9

Um rekombinante Viren, die das prothoracotrope Hormon (PTTH) exprimieren zu konstruieren, wird das PTTH-Gen in das „transplacement" Plasmid pEVmcdXIVcloniert; dieses Plasmid ist in der US-PatentanmeldungO7/353,847, eingereicht am 17. Mai 1989, die hier als Referenz eingebaut ist, beschrieben. Dieses Plasmid enthält Sequenzen, die sich stromaufwärts und stromabwärts vom AcMNPV-Polyhedringen befinden und die homologe Rekombination des exprimierbaren PTTH-Gens in dem EGT~-Virus bewirkt. Eine Vielfach-Clonierungsstelle ist in die normale Translations-Initiationsstelle, unterhalb des LSXIV-veränderten Polyhedrinpromotors gelegt (Rankin et al., Gene, 70 [1988], 39). Das Bombyx mori PTTH-Gen wird aus dem Plasmid pBc22k-C19(Kawakamietal., Science 247 [1990] 1333) durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym Hind III ausgeschnitten. Die Hindill überhängenden Enden werden mit T4 DNA-Polymerase aufgefüllt und das Plasmid wird dann mit EcoRI gespalten. pEVmodXIV wird mit Kpn I gespalten, das Kpn I überhängende Ende wird mit T4 DNA-Polymerase entfernt und das Plasmid anschließend mit EcoR I gespalten. Das das PTTH-Gen enthaltende Fragment wird über diese Restriktionsschnittstellen in das „transplacemenf'-Plasmid cloniert. Im daraus entstehenden Plasmid, pEVPTTH befindet sich das PTTH-Gen unmittelbar stromabwärts von dem LSXIV-veränderten Polyhedrin-Promotor.

Rekombinante, PTTH exprimierende Viren werden durch Cotranfektion von pEVPTTH mit vEGTDEL oder wt AcMNPV DNA in SF-Zellen erhalten. Die Rekombination zwischen den flankierenden Polyhedrinsequenzen in der viralen DNA und denen das PTTH-Gen in pEVPTTH flankierenden führt zu einem Ersatz des Polyhedringens durch PTTH-Viren, bei denen dieser Rekombinationsvorgang stattgefunden hat, werden durch ihren verpackungsnegativen Phänotyp identifiziert (Miller et al., in Genetic Engineering, Principles and Methods, Vol. 8, J.Setlowund A.Hollaender, Herausgeber, Plenum Press, New York, 1986, Seiten 277-298). Die jeweiligen rekombinanten Viren werden mit vEGT"PTTH und vWTPTTH bezeichnet. Das Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Viren, die Juvenilhormon-Eesterase exprimieren, ist ähnlich. Zunächst wird das Heliothis virescens- Gen für Juvenilhormon-Esterase (Hanzlik et al., J. Biol. Chem. 264 [1989], 12419) durch Verdau mit EcoR I und Kpn I aus dem Plasmid pJHE16B (Hammock et al.. Nature 344 [1990], 458) ausgeschnitten. Das „transplacemenf'-Plasmid pEVmodXIV wird ebenfalls mit EcoR I und Kpn I gespalten und das das Gen für Juvenilhormon-Esterase enthaltende Fragment wird zwischen diesen Restriktionsschnittstellen eingefügt. pEVJHE beinhaltet somit Polyhedringensequenzen, die das Gen für Juvenilhormon-Esterase flankieren. Die rekombinanten Viren vEGT"JHE und vWTJHe werden durch Cotransfektion von pEVJHE mit vEGTZ bzw. wt AcMNPV DNA und Absuchen nach Verpackungs-negativen Plaques erhalten.

Um rekombinante Viren, die Häutungshormon exprimieren, zu konstruieren, wird das Manduca secta-Häutungshormon-Gen durch Verdau mit EcoRI und Hpal aus dem Plasmid pF5-3 (Horodyski et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 86 [1989], 8123) ausgeschnitten. pEVmodXIV wird mit Kpn I gespalten, das Kpn I überhängende Ende mit T4 DNA-Polymerase entfernt und anschließend mit EcoRI gespalten. Das Einfügen des das Häutungshormongen enthaltenden Fragmentes in das „transplacemenf'-Plasmid ergibt das rekombinante Plasmid pEVEH, in dem das Eclosionshormongen in einer Lage stromabwärts vom LSXIV-veränderten Polyhedrinpromotor gebracht worden ist. Cotransfektion dieses Plasmides mit vEGTZ oder VDA26Z DNA erlaubt die Isolierung der rekombinanten Viren vEGT~EH bzw. vDA26ZEH. vDA26Z ist ein rekombinantes Virus, in dem das E.coli lacZ-Gen in das DA26-Gen eingefügt ist (O'Reilly et al., J.Gen.Virol., im Druck). Die Funktion des DA26-Gens ist nicht bekannt und vDA26Z ist im Hinblick auf die Häutung phänotypisch Wildtyp. Wegen der Anwesenheit des lacZ-Gens führen vDA26Z-Abkömmlinge in Gegenwart von X-gal zur Ausbildung von blauen Plaques.

Beispiel 10

Um die In-vivo-Einflüsse dieser rekombinanten Viren zu beurteilen, werden im späten dritten Larvenstadium oder im frühen vierten Larvenstadium befindliche S.frugiperda-Larven mit 2x 10⁵pfu vEGTDEL, vEGT"PTTH, vWTPTTH oder sowohl vEGT"PTTH als auch vEGTJHE (jeweils 1 x 10⁵pfu) injiziert. Die tägliche, prozentuale Sterblichkeit ist in Tabelle V dargestellt. Für alle EGT~-Viren gilt, daß die infizierten Insekten das vierte Larvenstadium durchlaufen und Schlüpfen der Kopfkapsel zeigen, was auf ein am Tag drei unmittelbar bevorstehendes Häuten hindeutet. Nach Infektion mit nur vEGT"PTTH oder nach Infektion mit sowohl vEGT~PTTH als auch vEGT~JHE bewirkt die Expression von PTTH, daß die infizierten Insekten schnell krank werden; eine

bedeutsame Sterblichkeit wird am Tag 4 beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigen mit vEGTDEL infizierte Insekten keine wesentliche Sterblichkeit bis zum Tag 5. Wie erwartet, zeigen mit vWTPTTH infizierte Insekten niemals Zeichen von Häutung bis in das fünfte Larvenstadium hinein. Kein Schlüpfen der Kopfkapsel wird beobachtet, und die Insekten zeigen keine wesentliche Sterblichkeit bis zu Tag 6. Die Expression von PTTH in Abwesenheit von EGT legt somit die Zeit des auf die Infektion folgenden Todes im Vergleich zu vEGTDEL um einen Tag nach vorn. Diese Ergebnisse zeigen die Verbesserung der pestiziden Eigenschaften von Baculoviren durch Expression von Genen, die die Insektenhäutung beeinflussen und zeigen, daß egt inaktiviert werden muß, damit solche Strategien wirksam sind.

Tabelle V	Tag 3	Tag 4	Tag 5	Tag 6	Tag 7	Tag 8
% Sterblichkeit	4,5	4,5	68,2	90,9	90,9	95,5
Virus	0	0	13,0	39,1	78,3	95,7
vEGTDEL	4,2	62,5	87,5	100,0
vWTPTTH
vEGT-PTTH	8,7	60,9	91,3	95,7	100,0
vEGT"PTTH
und
vEGT'JHE

Beispiel 11

Die Erzeugung von verpackungspositiven Viren, die heterologe, die Insektenentwicklung beeinflussende Proteine exprimieren, kann durch die folgende Vorgehensweise erreicht werden. Zunächst wird in zwei Schritten ein EGT~-verpackungsnegativer, ß-Galactosidase exprimierender Virus wie folgt konstruiert. Das für das Enzym ß-Galactosidase codierende E. colilacZ-Gen wird in den „transplacemenf-VektorpSynVr, der in der US-Patentanmeldung 07/353847, eingereicht am 17. Mai 1989 beschrieben ist, cloniert. pSynVP enthält Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts vom AcMNPV Polyhedringen, wobei eine Vielfachclonierungsstelle unmittelbar stromabwärts von einem synthetischen, veränderten Polyhedrinpromotor befindlich ist. Das lacZ-Gen wird durch Spaltung mitPstl aus dem Plasmid pSKS105(Casadabanetal. [1983], a.a.O.) ausgeschnitten. Das überhängende Pst I-Ende wird mit Mungobohnen-Nuclease entfernt, und das Plasmid wird mit Sst Il gespalten. pSynVr wird mit EcoRV und Sstll gespalten und das lacZ-Gen in diese Restriktionsschnittstellen cloniert. Das daraus entstehende Plasmid wird pSyn vr gal genannt und enthält das lacZ-Gen unmittelbar stromabwärts von dem synthetischen, veränderten Polyhedrinpromotor. pSyn Vl" gal wird mit vEGTDEL DNA in SF-Zellen cotransfiziert und verpackungsnegative Plaques, die ß-Galactosidase exprimieren, werden isoliert und ergeben das Virus vEGT~SyaVI~ gal.

Um einen verpackungspositiven rekombinanten Virus, der PTTH exprimiert, zu konstruieren, wird das PTTH-Gen in den „transplacemenf'-Vektor pSpXIVVI+X3 cloniert.

Für die Konstruktion von pSpXIVVI+X3 wird zunächst das Zwischenplasmid pSpXIWI+ konstruiert. pSpLSXIVVI+CAT (beschrieben in der US-Patentanmeldung 07/353847 eingereicht am 17. Mai 1989) wird mit BgIII gespalten und die Enden mit DNA-Polymerase aufgefüllt. Das Plasmid pSynVI+wtp (beschrieben in der US-Patentanmeldung 07/353847, eingereicht am 17. Mai 1989) wird mit EcoR V und Sacl gespalten und das kleine EcoR V-Sacl-Fragment wird gereinigt. Die Fragmente der beiden Plasmide werden ligiert und pSpXIWI+ wird ausgewählt. Das Plasmid pSpXIVVI+ ist das gleiche wie pSPLSXIVVI+CAT, mit der Ausnahme, daß die Vielfachclonierungsstelle von der BgI II- bis zur Sacl-Restriktionsschnittstelle die gleiche wie die von pSyn Vl+wtp ist. Um die Vielfach-Clonierungsstelle Nr.3 (beschrieben in der US-Patentanmeldung 07/353847 eingereicht am 17. Mai 1989) zu konstruieren, wird ein Polylinker zwischen die EcoRI-Sacl-Restriktionsschnittstelle von pSpXIWI+ eingefügt. Die Sequenz der Vielfach-Clonierungsstelle in pSPXIVVI+X3von der zusammengesetzten Bglll-Restriktionsschnittstellezur Sacl-Restriktionsschnittstelle ist:

AGATCATC GAATTCTCGAG CTGCAGATCT GTCGACCCGGG AATAAA GAGCTC EcoRV/Bgl EcoRI-Xhol Pstl-Bgll Sall-Smal polyA Sacl

Dieses Plasmid beinhaltet ein unversehrtes Polyhedringen unter der Kontrolle eines Wildtyp-Polyhedrin-Promotors. Ein synthetischer, veränderter Polyhedrin-Promotor befindet sich stromaufwärts vom und in umgekehrter Orientierung zum Polyhedringen. Eine Vielfach-Clonierungsstelle ist so gesetzt, daß sie erlaubt, Gene so einzufügen, daß sie unter der Kontrolle des snythetischen, modifizierten Polyhedrin-Promotors exprimiert werden. Das PTTH-Gen wird durch Verdau mit Hindlll aus dem Plasmid pBc22k-C19 (Kawakami et al. [1990], a.a.O.) ausgeschnitten. Das Hindlll überhängende Ende wird mit T4-DNA-Polymerase aufgefüllt und das Plasmid mit EcoRI gespalten. pSpXIWI + X3 wird mit EcoRI und Smal gespalten und das PTTH-Gen in diese Restriktionsschnittstellen cloniert, was das Plasmid pSpPTTH ergibt. In diesem Plasmid befindet sich das PTTH-Gen stromabwärts von dem synthetischen, veränderten Polyhedrin-Promotor, der sich angrenzend an den und in der entgegengesetzten Orientierung zu Wildtyp Polyhedrin-Promotor und den codierenden Sequenzen befindet. Sowohl das PTTH-als auch das Polyhedringen werden von Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts vom Polyhedringen in AcMNPV flankiert.

pSpPTTHwird mit vEGT~Syn VI~gal-DNA in SF-Zellen cotransfiziert. Rekombination zwischen den stromaufwärts und stromabwärts von Polyhedrin befindlichen Sequenzen in der viralen DNA und denen das PTTH- und das Polyhedringen in pSpPTTH flankierenden hat den Ersatz des lacZ-Gens von vEGT~SynVrgal durch die PTTH- und Polyhedringene von pSpPTTH zur Folge. Das rekombinante Virus vEGT~SpPTTH wird als verpackungspositiver, ß-Galactosidase-negativer Phänotyp identifiziert.

Um ein verpackungspositives, Juvenilhormon-Esterase exprimierendes Virus zu konstruieren, wird das Juvenilhormon-Esterasegen durch Verdau mit Kpn I aus dem Plasmid pJHE 16B (Hammock et al. [1990], a. a. O.), Entfernung der überhängenden Enden mit T4 DNA-Polymerase und Verdau mit EcoR I ausgeschnitten. Das Juvenilhormon-Esterasegen wird dann in das mit

EcoR I und Sma I gespaltene Plasmid pSpXIVVI+X3 cloniert. Das sich ergebene Plasmid, pSpJHE wird mit vEGTTSyn VPgal DNA cotransfiziert, um das rekombinante Virus vEGT~SpJHE zu erzeugen. Dieses verpackungspositive Virus exprimiert Juvenilhormon-Esterase unter der Kontrolle des synthetischen, veränderten Polyhedrinpromotors.

Gleichermaßen wird das Häutungshormongen durch Verdau mit EcoR I und Hpa I aus dem Plasmid pF5-3 (Horodyski et al. [1990], a.a. O.) herausgeschnitten und in mit EcoRI und Sma I gespaltenes pSpXIVVI+X3 cloniert. Das sich daraus ergebende Plasmid, pSpEH wird mit vEGT~SynVI~gal DNA cotransfiziert, um das rekombinante Virus vEGT'SpEH zu erzeugen.

Die verpackungspositiven EGT~-Viren, die weiter genetisch verändert werden, um ein die Häutung beeinflussendes Protein zu exprimieren (ein Insektenpeptidhormon oder ein Enzym, das Insektenhormone inaktiviert), werden die Nahrungsaufnahme verringern und einen schnelleren Tod der infizierten Insektenlarven als wt-Baculoviren oder genetisch nur so veränderte Baculoviren, daß das egt-Gen inaktiviert ist, bewirken.

Da die Mittel zur Insektenkontrolle im Beispiel 11 verpackt sind, können diese Viren in als Insektizide wirksame, landwirtschaftlich annehmbare Zusammensetzungen eingebaut werden, die auf infiziertes Getreide angewendet werden können. Aufnahme solcher verpackter Viruspartikel durch die Nahrung hat die Verbreitung solcher Viren auf dem Feld und die Ausbreitung des Mittels zur Insektenkontrolle zur Folge. Die Infektion wird den Tod der Insekten bewirken und damit den Schutz des Getreides vor Schädlingen.

Aus dem Vorstehenden ergibt sich, daß das Vorangehende sich nur auf bevorzugte, bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bezieht und daß viele Abwandlungen und Veränderungen hierin gemacht werden können, ohne daß vom Geist- und Geltungsbereich der Erfindung, wie in den beigefügten Patentansprüchen dargestellt, abgewichen wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Insektenkontrolle, bei dem folgende Schritte durchgeführt werden:

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein eine Ecdysteroid UDP-Glucosyl-Transferase (EGT), ein prothoracotropes Hormon, ein Häutungshormon oder eine Juvenilhormon-Esterase ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Insektenparasit ein Insektenvirus ist, das das egt-Gen nicht exprimiert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Gen aus einem Baculovirus stammt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Baculovirus ein nucleares Polyhedrosisvirus ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das nucleare Polyhedrosisvirus ein Autographa californica nucleares Polyhedrosisvirus oder ein Orgyia pseudotsugata nucleares Polyhedrosisvirus ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Organismus ein insektenparasitäres, nicht phytopathogenes, Pflanzen-besiedelndes Bakterium, ein entomopathogenes Bakterium, ein entomopathogener Pilz oder eine enthomopathogene Pflanze ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Insektenkontrolle, bei dem ein natürlicherweise im Genom eines Organismus vorkommendes Gen inaktiviert wird, das ein ein Ecdysteroidveränderndes Enzym codiert.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Gen die EGT codiert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Organismus ein Insektenvirus ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Insektenvirus ein Baculovirus ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Baculovirus ein nucleares Polyhedrosisvirus ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das nucleare Polyhedrosisvirus ein Autographa californica nucleares Polyhedrosisvirus oder eine Orgyia pseudotsugata nucleares Polyhedrosisvirus ist.

14. Verfahren nach Anspruch 8, wobei ein Autographa californica nucleares Polyhedrosisvirus-Abkömmling mit einer Deletion, die das egt-Gen inaktiviert, nach einer Reihe von Passagen des Virus in infizierten Zellen isoliert wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das nucleare Polyhedrosisvirus entweder vEGTZ oder vEGTDEList.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das nucleare Polyhedrosisvirus vEGTZ wie folgt hergestellt wird:

(c) das lacZ-Gen wird mit dem großen EcoRI-Xbal-Fragment von pUCBCPsB ligiert, nachdem das Xbal-Ende mitT4DNA-Polymerase in ein glattes Ende überführt worden ist, um pEGTZzu bilden;

(d) pEGTZ und AcMNPV werden in SF-Zellen cotransfiziert;

(e) virale Rekombinanten werden durch j3-Galactosidase-Expression identifiziert; und

(f) das rekombinante Virus vEGTZ wird gereinigt.

17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei dasnucleare Polyhedrosisvirus vEGTDEL wiefolgt hergestellt wird:

(c) das große DNA-Fragment aus Schritt (b) wird ligiert;

(d) pEGTDEL und vEGTZ werden in SF-Zellen cotransfiziert, um eine homologe Rekombination zu ermöglichen;

(e) rekombinanter vEGTDEL wird durch die nicht vorhandene Fähigkeit zur Expression von ß-Galactosidase identifiziert; und

(f) rekombinanter vEGTDEL wird gereinigt.

18. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Organismus ferner durch Einfügen eines heterologen, in Insektenzellen exprimierbaren Gens genetisch verändert wird, wobei das Gen ein die Häutung beeinflussendes Protein codiert.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das eingefügte Gen ein prothoracotropes Hormon, ein Häutungshormon oder eine Juvenilhormon-Esterase codiert.

20. Verfahren zur Herstellung einer Insektiziden Zusammensetzung, bei dem ein Mittel zur Insektenkontrolle nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 19 hergestellt wird und sodann mit einem landwirtschaftlich geeigneten Träger vermischt wird.

Hierzu 8 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Anwendung der Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Herstellung von Mitteln und Zusammensetzungen zur biologischen Insektenkontrolle.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Das Interesse an der biologischen Schädlingsbekämpfung ist als Ergebnis der Nachteile herkömmlicher chemischer Pestizide erwachsen. Chemische Pestizide beeinflussen in der Regel nützliche wie auch nicht nützliche Arten. Schädlinge neigen dazu, gegenüber solchen Chemikalien resistent zu werden, so daß sie schnell neue Schädlingspopulationen entwickeln können, die gegenüber diesen Pestiziden resistent sind. Des weiteren werfen chemische Überreste die Fragen nach Gefahren für die Umwelt und möglichen Bedenken für die Gesundheit auf. Die biologische Kontrolle bietet ein anderes Mittel zur Schädlingsbekämpfung, das die Abhängigkeit von chemischen Pestiziden verringern kann.

Die wichtigsten Strategien zur biologischen Kontrolle beinhalten die Entfaltung von in der Natur vorkommenden Lebewesen, die pathogen für Insekten sind (Entomopathogene) und die Entwicklung von Getreiden, die gegen Schädlinge resistenter sind. Ansätze beinhalten die Identifizierung und Charakterisierung von Insektengenen oder Genprodukten, die als geeignete Ziele für Insektenkontrollmittel dienen könnten, die Identifizierung und Ausnutzung bisher nicht benutzter Mikroorganismen (darin eingeschlossen ist die Veränderung von natürlich vorkommenden, nicht-pathogenen Mikroorganismen, um sie für Insekten pathogen werden zu lassen), die Veränderung und Veredelung von gegenwärtig verwendeten Entomopathogenen und die Entwicklung von genetisch konstruierten Getreiden, die eine größere Resistenz gegenüber Schädlingen zeigen. Viren, die natürliche seuchenartige Krankheiten innerhalb von Insektenpopulationen verursachen, gehören zu den Entomopathogenen, die als biologische Pestizide entwickelt worden sind. Baculoviren sind eine große Gruppe von Viren, die nur Arthropoden infizieren (Miller, L. K. [1981] in Genetic Engineering in the Plant Sciences, N. Panopoulous, Herausgeber, Praeger Publ., New York, Seiten 203-224; Carstens, Trends in Biochemical Science 52 [1980], 107-110; Harrap and Payne in Advances in Virus Research, 25 [1979], Lawfer et al., Herausgeber, Academic Press, New York, Seiten 273-355). Viele Baculoviren infizieren Insekten, die Schädlinge gewerblich wichtiger landwirtschaftlicher und waldwirtschaftlicher Getreide sind. Solche Baculoviren sind möglicherweise wertvoll als biologische Kontrollmittel. Vier verschiedene Baculoviren sind von der U.S. Environmental Protection Agency zur Verwendung als Insektizide eingetragen worden. Einer der Vorteile der Baculoviren als biologische Pestizide ist ihre Wirtsspezifität. Es ist nicht nur so, daß Baculoviren als eine Gruppe lediglich Arthropoden infizieren, sondern einzelne Baculovirenstämme infizieren in der Regel auch nur eine oder wenige Insektenart(en). Somit werfen sie keine Gefahr für den Menschen oder die Umgebung auf und können verwendet werden, ohne nützliche Isektenarten nachteilig zu beeinflussen. Baculoviren-Untergruppen beinhalten nucleare Polyhedrosisviren („nuclear polyhedrosis virus", NPV), Granuloseviren (GV) und nicht-verpackte Baculoviren. In der verpackten Form („occluded form") der Baculoviren sind die Virione (Nucleocapside mit Mantel) in eine kristalline Proteinmatrix eingebettet. Diese als Einschluß-oder Verpackungskörper bezeichnete Struktur ist die in der Natur gefundene, außerhalb von Lebewesen vorkommende Form, die für die Ausbreitung der Infektion zwischen den Lebewesen verantwortlich ist. Die charakteristische Eigenschaft der NPV-Viren ist, daß viele Virione in jeden Verpackungskörper eingebettet sind. Die NPV-Verpackungskörper sind ziemlich groß (bis zu 5 μηη). Verpackungskörper der GV-Viren sind kleiner und enthalten jeweils ein einzelnes Virion. Die kristalline Proteinmatrix der Verpackungskörper beider Formen ist hauptsächlich aus einem einzigen 25000 bis 33000 Dalton Polypeptid aufgebaut, das als Polyhedrin oder Granulin bekannt ist. Baculoviren der nicht-verpackten Untergruppe stellen kein Polyhedrin- oder Granulinprotein her und bilden keine Verpackungskörper. In der Natur beginnt die Infektion damit, daß ein Insekt Nahrung aufnimmt, die mit Baculovirenpartikeln verunreinigt ist, typischerweise in der Form von Verpackungskörpern. Die Verpackungskörper lösen sich unter den alkalischen Bedingungen des Insektenmitteldarmes auf und setzen einzelne Viruspartikel frei, die in an den Darm angrenzende Epithelzellen eindringen. Innerhalb der Wirtszelle wandert das Baculovirus zum Nucleus, wo sich die Replikation abspielt. Anfänglich werden bestimmte, spezifische virale Proteine innerhalb der infizierten Zelle über die Transkription und Translation sogenannter „frühen Gene" hergestellt. Neben anderen Funktionen sind diese Proteine für die Replikation derviralen DNA erforderlich, die 4 bis 6 Stunden, nachdem das Virus in die Zelle eingedrungen ist, beginnt. Ausgiebige virale DNA-Replikation findet bis etwa 12 Stunden nach der Infektion (Post-Infektion, pi) statt. Etwa 8 bis 10 Stunden pi stellt die infizierte Zelle große Mengen der „späten viralen Genprodukte" her. Diese beinhalten Bestandteile des Nucleocapsids, die die virale DNA während der Bildung der Viruspartikel-Nachkommen umgeben. Herstellung der Viruspartikel-Nachkommen beginnt etwa 12 Stunden pi. Anfänglich wandern Virus-Nachkommen zur Zellmembran, wo sie eine Hülle bekommen, sowie sie von der Oberfläche der Zelle aus ausknospen. Dieses nicht verpackte Virus kann dann andere Zellen innerhalb des Insektes infizieren. Die Polyhedrinsynthese beginnt 12 bis 18 Stunden nach der Infektion und steigt 24 Stunden pi auf sehr hohe Werte an. Zu dieser Zeit gibt es einen Abfall in der Zahl der Viruspartikelknospen, und die Virusnachkommen werden dann in Verpackungskörper eingebettet. Die Verpackungskörperbildung setzt sich fort, bis die Zelle stirbt oder lysiert. Einige Baculoviren infizieren praktisch jedes Gewebe im Wirtsinsekt, so daß das gesamte Insekt am Ende des Infektionsprozesses verflüssigt ist, wodurch äußerst große Mengen an