FI104263B - Baculoviruksen sisältävä hyönteistorjunta-aine, menetelmät sen tuottamiseksi ja yhdistelmä-DNA-molekyyli - Google Patents

Baculoviruksen sisältävä hyönteistorjunta-aine, menetelmät sen tuottamiseksi ja yhdistelmä-DNA-molekyyli Download PDF

Info

Publication number
FI104263B
FI104263B FI910968A FI910968A FI104263B FI 104263 B FI104263 B FI 104263B FI 910968 A FI910968 A FI 910968A FI 910968 A FI910968 A FI 910968A FI 104263 B FI104263 B FI 104263B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gene
hormone
baculovirus
udp
egt
Prior art date
Application number
FI910968A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI910968A0 (fi
FI104263B1 (fi
Inventor
Lois K Miller
David R O'reilly
Original Assignee
Univ Georgia Res Found
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Georgia Res Found filed Critical Univ Georgia Res Found
Publication of FI910968A0 publication Critical patent/FI910968A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI104263B1 publication Critical patent/FI104263B1/fi
Publication of FI104263B publication Critical patent/FI104263B/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

104263
Baculoviruksen sisältävä hyönteistorjunta-aine, menetelmät sen tuottamiseksi ja yhdistelmä-DNA-molekyyli - Insektregleringsmedel innefattande ett baculovi-rus, forfaranden för framställning av detsamma och rekombinant-DNA-molekyl 5 Tämä keksintö tehtiin National Institutes of Healthin rahoittamana (apuraha n:o Al-23719) ja Yhdysvaltain maatalousministeriön Hatch Act-rahoituksella (apuraha n:o GE 000918).
Tämä keksintö koskee menetelmiä ja koostumuksia tuhohyönteisten biologisen torjunnan parantamiseksi. Erityisesti tämä keksintö koskee baculoviruksen erään gee-10 nin ja tämän geenin tuottaman proteiinin käyttöä ja käsittelyä. Tämä geenituote valvoo tehokkaasti hyönteisten kasvua ja kehitystä. Tämä keksintö koskee myös perinnöllisesti muutettuja baculoviruksia ja muita hyönteistorjunta-aineita, jotka vaikuttavat haitallisesti tuhohyönteisiin.
Mielenkiinto tuhohyönteisten biologiseen torjuntaan on noussut tavanomaisten ke-15 miallisten hyönteistorjunta-aineiden haittojen tuloksena. Kemialliset hyönteistoijun-ta-aineet vaikuttavat yleensä sekä hyödyllisiin että haitallisiin lajeihin. Tuhohyönteisillä on taipumus hankkia vastustuskyky tällaisille kemikaaleille siten, että voi nopeasti kehittyä uusia tuhohyönteispopulaatioita, jotka ovat vastustuskykyisiä näille hyönteistorjunta-aineille. Lisäksi kemialliset jätteet asettavat ympäristövaaroja ja 20 mahdollisia terveysongelmia. Biologinen toijunta tarjoaa tuholaistorjuntaan vaihto-ehtoisia keinoja, jotka voivat vähentää riippuvuutta kemiallisista hyönteistorjunta- • · . aineista.
• · · • · · • · * '·' * Biologista torjuntaa varten olevat päästrategiat sisältävät hyönteisille tauteja aiheut- ·...· tavien luonnollisesti esiintyvien eliöiden hyväksikäytön (entomopatogeenit) ja sel- 25 laisten lajikkeiden kehittämisen, jotka ovat vastustuskykyisempiä tuhohyönteisille. :T: Menetelmät sisältävät sellaisten hyönteisgeenien tai geenituotteiden identifioinnin ja luonnehtimisen, jotka saattavat toimia sopivina kohteina hyönteistorjunta-aineille, aikaisemmin käyttämättömien mikro-organismien identifioinnin ja hyväksikäytön (mukaan lukien luonnollisesti esiintyvien tautia aiheuttamattomien mikro-organis- • t 30 mien muuttamisen hyönteisille tautia aiheuttaviksi), tällä hetkellä käytettyjen ento- mopatogeenien muuttamisen ja jalostuksen, ja geeniteknologian avulla muutettujen :sellaisten lajikkeiden kehittämisen, joilla on suurempi vastustuskyky tuhohyönteisil-le.
• · 2 104263
Virukset, jotka aiheuttavat luonnollisia eläinkulkutauteja hyönteispopulaatioissa, ovat niiden entomopatogeenien joukossa, joita on kehitetty biologisiksi pestisideiksi. Baculovirukset ovat suuri virusryhmä, jotka tartuttavat vain niveljalkaisia (Miller, L.K. (1981) teoksessa Genetic Engineering in the Plant Sciences, N. Panopoulous, 5 (ed.), Praeger Pubi., New York, s. 203-224; Carstens, (1980) Trends in Biochemical
Science 52:107-110; Harrap ja Payne (1979) teoksessa Advances in Virus Research, Voi. 25, Lawfer et ai. (eds.), Academic Press, New York, s. 273-355). Monet baculovirukset tartuttavat hyönteisiä, jotka ovat taloudellisesti tärkeiden maatalous- ja metsäsatojen tuholaisia. Tällaiset baculovirukset ovat mahdollisesti arvokkaita bio-10 logisina torjunta-aineina. Yhdysvaltain Environmental Protection Agency on rekisteröinyt neljä erilaista baculovirusta käytettäväksi hyönteismyrkkyinä. Eräs baculo-virusten etu biologisena pestisidinä on niiden isäntäspesifisyys. Baculovirukset eivät ainoastaan ryhmänä tartuta vain niveljalkaisia, vaan myös yksittäiset baculovirus-kannatkin yleensä infektoivat vain yhtä tai muutamaa hyönteislajia. Täten ne eivät 15 aseta vaaraa ihmiselle tai ympäristölle, ja niitä voidaan käyttää ilman, että haitallisesti vaikutettaisiin hyödyllisiin hyönteislajeihin.
Baculovirusalaryhmiin kuuluvat nukleaariset polyhedroosivirukset (NPV), granu-loosivirukset (GV) ja okluusittomat baculovirukset. Baculovirusten okluusiomuo-doissa viruspartikkelit (vaipalliset nukleokapsidit) ovat kiteisen proteiinikuoren si-20 säliä. Tämä rakenne, johon viitataan inkluusio- tai okluusiokappaleella, on muoto, jota löydetään eliöiden ulkopuolelta luonnossa ja joka on vastuussa infektion levittämisestä eliöiden välillä. NPV:n tunnusomainen piirre on se, että yhden okluusio-
I
•\v kappaleen sisällä on useita viruspartikkeleita. NPV-okluusiokappaleet ovat suhteel- lisen suuria (5 mikrometriin asti). GV-virusten okluusiokappaleet ovat pienempiä ja 25 ne sisältävät kukin yhden viruspartikkelin. Molempien muotojen okluusiokappalei- :***: den kiteinen proteiinikuori koostuu pääasiallisesti yhdestä 25 000 - 33 000 daltonin • · · polypeptidistä, joka tunnetaan polyhedriininä tai granuliinina. Okluusittoman ala-ryhmän baculovirukset eivät tuota polyhedriini- tai granuliiniproteiinia, eivätkä ne • · · muodosta okluusiokappaleita.
• · · · 30 Luonnossa infektio alkaa, kun hyönteinen nauttii ravintoa, joka on saastunut bacu- :T: loviruspartikkeleilla, jotka ovat tyypillisesti okluusiokappaleiden muodossa. Okluu- , siokappaleet hajoavat hyönteisen keskisuolen aikalisissä olosuhteissa vapauttaen < 4 ... yksittäiset viruspartikkelit, jotka sitten tunkeutuvat suolta reunustaviin epiteeliso- •; · luihin. Baculovirus vaeltaa isäntäsolussa tumaan, jossa replikaatio tapahtuu. Aluksi 35 tuotetaan tiettyjä virukselle erityisiä proteiineja infektoidussa solussa niin kutsuttu-·:··: jen "varhaisten geenien" transkription ja translaation avulla. Muiden toimintojen 3 104263 ohella näitä proteiineja tarvitaan mahdollistamaan viruksen DNA:n kahdentuminen, mikä alkaa 4-6 tuntia sen jälkeen, kun virus on saapunut soluun. Laaja viruksen DNA:n kahdentuminen jatkuu kunnes infektion alkamisesta on kulunut noin 12 tuntia (12 pi). Noin 8-10 tuntia infektion alkamisen jälkeen (8-10 pi) infektoitunut solu 5 tuottaa suuria määriä "viruksen myöhäisiä geenituotteita". Näihin kuuluvat nukleo-kapsidin aineosat, jotka ympäröivät viruksen DNA:n jälkeläisviruspartikkeleiden muodostuksen aikana. Jälkeläisviruspartikkeleiden tuotanto alkaa noin 12 tuntia infektion alkamisen jälkeen (12 pi). Aluksi jälkeläisvirukset vaeltavat solukalvolle, jossa ne silmikoituessaan saavat vaipan solun pinnalta. Sitten tämä okluusiton virus 10 voi infektoida muita soluja hyönteisessä. Polyhedriinin synteesi alkaa 12-18 tuntia infektion jälkeen ja kasvaa erittäin suuriin mittoihin 24 tuntia infektion jälkeen (24 pi). Silloin silmikoituneiden viruspartikkeleiden määrä vähenee, ja jälkeläisvirukset ovat okluusiokappaleiden sisällä. Okluusiokappaleiden valmistus jatkuu kunnes solu kuolee tai hajoaa. Eräät baculovirukset infektoivat käytännöllisesti katsoen kaikki 15 isäntähyönteisen kudokset siten, että infektiotapahtumasarjan lopuksi koko hyönteinen on tuhottu ja se vapauttaa erittäin suuren määrän okluusiokappaleita, jotka voivat sitten levittää infektion muihin hyönteisiin. (Katsausartikkeli teoksessa The Biology of Baculoviruses, voi. I ja Π, Granados ja Federici (eds.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1986.) 20 Yksi merkittävä haitta baculovirusten käyttämisessä pestisideinä on pitkä aika viruksen nauttimisen ja hyönteisen kuoleman välillä. Tänä aikana tuhohyönteiset jatkavat satojen käyttämistä ravinnoksi ja tuhoamista. Koska viljelijä ei todennäköisesti ::: käytä pestisidejä ennen kuin vahinko on ilmeinen, on ratkaisevaa, että ravinnoksi- : käyttöaika rajoitetaan mahdollisimman lyhyeksi.
• · · • · ♦ 25 Tarvitaan biologinen pestisidi, joka vähentää hyönteisen ravinnon käyttöä ennen • · ***** kuolemaa. Biologista pestisidiä pidetään parempana, koska se aiheuttaa vähemmän ***** · * * ympäristövaaraa kuin kemiallinen pestisidi. Hyönteisen nopeampi kuolema on myös • » · v : toivottavaa. Hyönteisen kehitystä ja sen liittymistä eri eliöihin valvovaa proteiinia (proteiineja) koodaavan geenin (geenien) hyväksikäyttö sallii tuhohyönteisten pa- :T: 30 rannetun biologisen torjunnan.
♦ · · Tässä keksinnössä tunnistetaan baculoviruksen geeni ja sen geenituote, joka vaikut-taa hyönteisten kasvuun, kehitykseen tai käyttäytymiseen. Tämä keksintö antaa käyttöön sekä menetelmiä tämän geenin ja geenituotteen käyttöä varten että menetelmiä tämän geenin tai sen geenituotteen toiminnan lopettamiseksi hyönteistor-35 juntastrategioissa. Suositussa suoritusmuodossa egt-geeni koodaa AcMNPV:n 4 104263 ecdysteroidi-UDP-glykosyylitransferaasia (EGT). Baculoviniksen egt-geenin ilmeneminen aiheuttaa EGT:n tuotantoa, mikä tekee hyönteisen nahanvaihtohormonit tehottomiksi, täten estäen hyönteistoukkaa vaihtamasta nahkaansa tai koteloitumasta. Baculoviniksen egt-geenin toiminnan lopettaminen sallii infektoidun toukan na-5 hanvaihdon ja koteloitumisen jatkumisen.
Tämä keksintö käsittää suuren määrän eri hyönteistorjunta-aineita, jotka käyttävät hyväkseen egt-geenejä ja niiden geenituotteita. Tämän keksinnön hyönteistorjunta-aineet joko aiheuttavat EGT-proteiinin epäasianmukaisen synteesin tai estävät EGT-proteiinin normaalin toiminnan tai ilmenemisen tuhohyönteisessä siten, että tuho-10 hyönteisen normaali kehitys saatetaan sekaisin.
egt-geenin sisältävä baculovirus on tuhohyönteiselle spesifinen virus, jonka egt-geeni on tehty tehottomaksi, mikä siten sallii viruksella infektoidun hyönteisisännän jatkuvan kehityksen. Hyönteisisännän kehitys aiheuttaa käyttäytymismuutoksia kuten ravinnon käytön vähentymistä ja, kun infektoidaan viruspestisidillä, hyönteis-15 isännän kasvu vähenee ja se kuolee nopeammin. Tämä keksintö sisältää myös menetelmän parannetun viruspestisidin tuottamiseksi. Lisäksi tämä keksintö sisältää tuhohyönteisten torjuntamenetelmän, joka käsittää tuhohyönteisen asettamisen alttiiksi parannetulle viruspestisidille.
Tämän keksinnön tutkimat perinnöllisesti muunnetut virukset ovat tehokkaampia 20 pestisidejä kuin alalla aikaisemmin tunnetut virukset. Baculovirukset, kuten Auto-grapha califomica nukleaarinen polyhedroisivirus (AcMNPV) ja Orgyia pseudot-’ *;' sugata nukleaarinen polyhedroosivirus (OpMNPV), ilmentävät luonnostaan egt-gee- ' > · ·' niä, jonka ilmeneminen pidentää ajanjaksoa, jonka infektoitu toukka käyttää syömi- : seen ennen kuin se kuolee virusinfektioon. Tämä keksintö sisältää egt-geenin tehot- • · · :...: 25 tomaksi tekemisen baculoviruksien genomissa. egt-geeni voidaan tehdä tehottomaksi ·:·**: korvaamalla se tai liittämällä siihen toinen geeni kuten β-galaktosidaasia koodaava merkkigeeni, joka ei ole viruksen geeni. On selvää, että voidaan käyttää mitä tahansa DNA-jaksoa egt-geenin katkaisemiseen kunhan se vain lopettaa egt.tä koodaavan jakson ilmenemisen. Vaihtoehtoisesti kaikki tai osa egt-geenistä voidaan poistaa ,’v 30 genomista deletoimalla sopiva kappale koodaavaa DNA:ta tai voidaan muuttaa tai poistaa genomin säätelyosa, joka valvoo egt-geenin ilmenemistä, egt-geenin inakti-voivia deleetioita sisältäviä baculoviruksia voidaan myös tuottaa kasvattamalla vi-:...: ruksia useita kertoja hyönteissoluviljelmissä. Tulokseksi syntyneillä viruksilla on se etu, että niillä ei ole vierasta DNA:ta ja ne poikkeavat villikannan viruksista vain 35 siten, että niiltä puuttuu toiminnallinen egt-geeni. Tällaiset muutetut baculovirukset • · 5 104263 toimivat paremmin tuholaistorjunta-aineina kuin ne virukset, joita käytetään tällä hetkellä. Säätelylaitosten (esim. Yhdysvaltain EPA:n) pitäisi myös hyväksyä nämä yksinkertaiset häviämämutantit geeniteknologian avulla muutetuiksi pestisideiksi, koska niillä ei ole heterologista DNA:ta. Toimivaa egt-geeniä ilmentämättömät 5 baculovirukset voidaan muuttaa liittämällä muita geenejä kuin egt-geenejä, jotka estävät hyönteisen kehityksen, täten parantaen tällaisten virusten tehokkuutta hyön-teistorjunta-aineina.
Tämä keksintö sisältää myös menetelmän tuhohyönteisten toijumiseksi infektoimalla hyönteistoukat mutanttiviruksella, jolta puuttuu ehjä egt-geeni, tai mutanttiviruk-10 sella, joka ei pysty ilmentämään toimivaa EGT-tuotetta. Mutanttiviruksella infektoidut toukat yrittävät vaihtaa nahkansa ja koteloitua, siis syövät lyhyemmän aikaa kuin toukat, jotka on infektoitu villikannan tai muilla alalla aikaisemmin tunnetuilla viruksilla. Mutanttiviruksella infektoidut hyönteistoukat myös kuolevat nopeammin kuin villikannan tai muilla alalla aikaisemmin tunnetuilla viruksilla infektoidut tou-15 kat.
Tämän keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön yhdistelmävirus, joka on tehokkaampi pestisidi kuin villikanta tai alalla aikaisemmin tunnetut virukset. Tätä keksintöä valaisee esimerkki yhdistelmä-AcMNPV:stä, jota nimitetään vEGTZ:ksi ja jonka egt-geenistä on osa deletoitu ja korvattu bakteerin IacZ-geenillä, joka koodaa β-galakto-20 sidaasia. Mikä tahansa DNA-jakso, joka tekee egt-geenin tehottomaksi, voidaan korvata, kuten alan ammattilaiset ymmärtävät. Tätä keksintöä valaistaan lisäksi esi-merkillä yhdistelmäbaculoviruksesta, jota nimitetään vEGTDEL:ksi ja jonka egt- . . ·. geenistä on osa deletoitu. Toinen suoritusmuoto on baculoviruspestisidi, jonka egt- • · · geeni on poistettu. Mukaan luetaan myös baculovirukset, joissa luonnollisesti esiin- 25 tyvä mutaatio, mukaan lukien häviämä, on johtanut egt-geenin toiminnan lopettami- ***\ seen.
• «
Keksinnön mukaisesti on aikaansaatu hyönteistorjunta-aine, jolle on tunnusomaista, että se sisältää baculoviruksen, jossa ecdysteroidi-UDP-glukosyylitransferaasient-. ·: ·. syymiä koodaava luonnollisesti esiintyvä geeni on tehty tehottomaksi.
• · · ‘ 30 Keksinnön muut tunnusmerkit ilmenevät oheisista patenttivaatimuksista.
... Niinpä tämän keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön egt-geeni ja sen geenituote, jot- « « • ; ’ ka ovat hyödyllisiä tuhohyönteisten torjunnassa. Keksinnön rajoissa ovat myös olen- j' naisesti puhdistetut ecdysteroidi-UDP-glykosyylitransferaasi ja sille erityinen vasta- •: · · · aine. egt-geenit voidaan tunnistaa jaksohomologian avulla taulukossa 1 olevalle egt- 6 104263 geenin nukleotidijaksolle tai määrittämällä EGT-entsyymin aktiivisuus ja sen jälkeen tutkimalla DNA. Tässä määritetään egt-geeniksi mikä tahansa DNA-jakso, joka koodaa ecdysteroidi-UDP-glykosyylitransferaasia. Egt-proteiini voidaan puhdistaa käyttämällä alalla tunnettuja tekniikkoja ja esimerkissä 4 selitettyä koemenetelmää.
5 Olennaisesti puhdas ^-proteiinivalmiste sisältää ainakin noin 70 % (w/w) ecdyste-roidi-UDP-glykosyylitransferaasia. Yhdistelmä-egt-proteiini on tehty missä tahansa eliössä, joka on muu kuin eliö, jossa kyseessä olevaa proteiinia koodaava geeni luonnollisesti esiintyy. Yhdistelmäproteiinia ilmennetään perinnöllisen muuttelun tai yhdistelmä-DNA-teknologian seurauksena.
10 Tämän keksinnön toinen tarkoitus on antaa käyttöön geeniteknologian avulla muutettu virus, joka on tehokas pestisidi ja joka on myös ympäristön kannalta hyväksyttävä.
Tämän keksinnön tarkoitus on vielä antaa käyttöön yhdistelmäpestisidi, jolta puuttuu toimiva egt-geeni ja joka ilmentää toista geeniä, joka häiritsee hyönteisen kehi-15 tystä ja joka ei luonnostaan kuulu tähän eliöön. Tämä toinen geeni koodaa gee-nituotetta, joka vaikuttaa nahan luomiseen. Tällainen geenituote voi olla hyön-teishormoni, joka vaikuttaa hyönteisen kehitykseen, tai entsyymi, joka tekee nahan luomista säätelevän hormonin tehottomaksi. Erityisiin esimerkkeihin kuuluvat proto-rasikotrooppinen hormoni, eklosion-hormoni ja nuoruushormoniesteraasi. Kun näitä 20 proteiineja koodaavia geenejä on määrä sisällyttää hyönteisvirukseen tuottamaan hyönteistoijunta-aine, tämä virus ei saa sisältää egt-geeniä tai viruksen egt-geeni . \ ·. täytyy tehdä tehottomaksi.
• I
:. i.' Tämän keksinnön tarkoitus on vielä antaa käyttöön perinnöllisesti muutettu baculo- • * · : virus, jossa egt-geeni ei luonnostaan ilmene, käytettäväksi hyönteistoijunta-aineena, • · · 25 joka ilmentää perinnöllisesti liitettyä egt-geeniä. Tällaiset perinnöllisesti muutetut *:··: EGT:tä ilmentävät baculovirukset vaikuttavat haitallisesti tuhohyönteisiin, mikä ai- ·* ·*: heuttaa vähemmän tuhoa kasveille.
Tämän keksinnön tarkoitus on lisäksi antaa käyttöön insektisidisiä koostumuksia, • · « ’·* * jotka sopivat maatalouden sovellutuksiin. Tällaiset koostumukset sisältävät maata- 30 louden kannalta sopivan kuljettaja-aineen, kuten alalla ymmärretään, ja baculoviruk-• | sen, jota on perinnöllisesti muutettu siten, että kyseessä olevan viruksen egt on tehty ,, · . tehottomaksi. Tällaista Egt'-baculovirusta voidaan edelleen perinnöllisesti muuttaa '·] ilmentämään heterologista geeniä, joka koodaa hyönteishormonia, joka vaikuttaa < · · '· nahan luomiseen, tai entsyymiä, joka tekee nahan luomiseen vaikuttavan hyönteis- "·35 hormonin tehottomaksi. Heterologisiin geeneihin, joiden geenituotteet vaikuttavat 7 104263 nahan luomiseen, kuuluvat protorasikotrooppinen hormoni, eklosion-hormoni ja nuoruushormoniesteraasi, mutta heterologiset geenit eivät rajoitu pelkästään näihin. Perinnöllisesti muutettuja baculoviruksia sisältävät insektisidiset koostumukset formuloidaan mieluummin ruiskutuskäyttöä varten.
5 Mikä tahansa edellä erikseen mainittu insektisidinen koostumus voi lisäksi sisältää aineksia, jotka piristävät hyönteisen ravinnon käyttöä. Tuhohyönteiset voivat nauttia tämän keksinnön insektisidisiä koostumuksia kasveille sivelyn jälkeen, ja ne tuhohyönteiset, jotka ovat alttiita insektisidisessä koostumuksessa olevalle hyönteistor-junta-aineelle, syövät vähemmän ja kuolevat.
10 Tämän keksinnön toinen tarkoitus on antaa käyttöön muunnettu biologinen pestisidi, joka estää egt-geenin ilmenemistä tai sen geenituotteen toimintaa.
Kuvio 1 on AcMNPV-genomin kaaviokuva, joka osoittaa egt-geenin sijainnin. AcMNPV-genomi esitetään karttayksiköissä ja EcoRI-ja Hindlll-restriktiokarttoina.
Kuvio 2 on kaavamainen yhteenveto egt-geenin sekvensointi- ja jakson analysointi-15 tuloksista. A-osa kuvaa alueen restriktioendonukleaasikarttaa. B-osassa esitetään jakson avoimien lukuraamien tietokoneavusteisen analyysin tulokset. Pystysuorat viivat osoittavat lopetuskoodikolmikkoja. Jokaisen DNA-juosteen (1, 2, 3, Γ, 2', 3') jakso "transloidaan" kaikissa kolmessa mahdollisessa lukuraamissa. Avoin lukuraami (2), joka vastaa egt:tä, on merkitty EGT:ksi.
. ·. . 20 Kuvio 3 on kaaviokuva AcMNPVin (A) ja vEGTZ- (B) ja vEGTDEL- (C) yhdistel- « · * *!. mäviruksien egt-geenialueiden rakenteista. Viivoitettu alue esittää IacZ-geeniä.
* « * I I ( ··· : Kuvio 4 on kaaviokuva agaroosigeelielektroforeesista ja Southern blot -analyysistä
OpMNPV-baculoviruksen egt-geenin identifioimiseksi.
• « ... Kuvio 5 on OpMNPV-genomin kaavamainen restriktiokartta.
• · · 25 Kuvio 6 on kaaviokuva infektoimattomien kontrollitoukkien tai 4. asteen toukkavai-:T: heessa villikannan AcMNPV:llä tai vEGTZ:11a infektoitujen toukkien painon lisäyk- sestä.
Kuvio 7 on kaaviokuva toukkien kuolleisuudesta sen jälkeen, kun ne on infektoitu 4.
: ’" * asteen toukkavaiheessa villikannan AcMNPVillä tai vEGTZ:lla.
• # « 30 Kuvio 8 on kaaviokuva painon lisäyksestä sen jälkeen, kun toukat on infektoitu 5. ':": asteen toukkavaiheessa villikannan AcMNPVillä tai vEGTZ:11a.
3 104263
Kuvio 9 on kaaviokuva toukkien kuolleisuudesta sen jälkeen, kun ne on infektoitu 5. asteen toukkavaiheessa villikannan AcMNPVillä tai vEGTZilla.
Kuvio 10 on kaaviokuva toukkien kuolleisuudesta sen jälkeen, kun ne on infektoitu ensimmäisen asteen toukkavaiheessa villikannan AcMNPVillä tai vEGTZ:lla kon-5 sentraation ollessa 4,8 x 106 polyhedraalisia inkluusiokappaleita (PIB)/ml.
Kuvio 11 on kaaviokuva toukkien kuolleisuudesta sen jälkeen, kun ne on infektoitu ensimmäisen asteen toukkavaiheessa villikannan AcMNPVillä tai vEGTZilla kon-sentraation ollessa 2,4 x 106 PIB/ml.
Perhoset käyvät läpi hyvin kuvatun Saijan tapahtumia kehityksensä aikana munasta 10 aikuiseksi hyönteiseksi (ks. yksityiskohtaisemmat katsausartikkelit julkaisuista Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology, vol. 7 ja 8, Kerkut ja Gilbert (eds.), Pergamon Press, Oxford, 1984). Munasta kuoriutumisen jälkeen hyönteistoukka astuu vaiheeseen, jolloin se syö paljon ja jona aikana se vaihtaa nahkansa useita kertoja, mikä sallii jatkuvan koon kasvun. Peräkkäisten na-15 hän vaihtojen välisiä vaiheita kutsutaan eri asteisiksi toukkavaiheiksi. Toukan kasvuvaiheen lopussa toukka koteloituu ja lopulta syntyy aikuiseksi hyönteiseksi. Nahan vaihtamis- ja koteloitumistapahtumia (yhteisnimitys nahan luominen) säätelevät useiden eri hormoniryhmien yhteistoiminnat. Alkusysäys on protorasikotrooppisen hormonin (PTTH) vapautuminen tietyistä aivosoluista. Tämä herättää prothoracic-20 rauhaset tuottamaan ja erittämään ecdysteroideja, joihin usein viitataan hyönteisen , , nahanluomishormoneilla. Nuoruushormonin läsnäollessa seuraa toukan nahan luo- ' minen, kun taas nuoruushormonin puuttuessa toukat koteloituvat. Eklosion-hormoni '. on myös tärkeä ohjatessaan nahan luomiseen liittyviä useita käyttäytymismuutoksia.
• · · • « · .···. AcMNPV-baculovirus, jota käytetään paljon mallijärjestelmänä baculovirustutki- 25 muksessa, häiritsee edellä selitettyä hyönteisen kehitystapahtumaa aikaisemmin aa-vistamattomalla tavalla. AcMNPVillä infektoidut hyönteistoukat eivät enää pysty • « · * vaihtamaan nahkaansa tai koteloitumaan, koska AcMNPV ohjaa entsyymin synteesiä, joka tunnetaan ecdysteroidi-UDP-glykosyylitransferaasina (EGT), joka erityi- • · · ’ sesti tekee hyönteisen ecdysteroidit tehottomiksi.
30 Tämän keksinnön keksijät tunnistivat EGTitä koodaavan geenin; se ulottuu 8,4 , , karttayksiköstä 9,6 karttayksikköön AcMNPV-genomissa (kuviot 1 ja 2). Kuten on ' ;· esitetty kuviossa 1C, egt-geenin sisältävät DNA-kappaleet on kloonattu pUC19-,
Bluescript M13+- ja Bluescript M131-plasmideihin. Kuvio 2 esittää genomin egt-·:·· alueen restriktiokartan ja egt-alueen avoimien lukuraamien tietokoneavusteisen » 104263 analyysin. Vain lukuraami 2 sisältää suhteellisen pitkän avoimen lukuraamin, joka on tunnistettu egt-geenin koodausalueeksi. Taulukossa 1 esitetään egt-geenin nuk-leotidijakso ja siitä päätelty 506 aminohapon aminohappojakso. egt:n koodausjakso ulottuu noin 149-nukleotidista noin 1670-nukleotidiin.
5 Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa AcMNPV-baculoviruksen egt-geeni tehdään tehottomaksi korvaamalla osa egt-geenistä bakteerin β-galaktosidaasia koo-daavalla jaksolla. Tätä yhdistelmäbaculovirusta nimitetään vEGTZ:ksi. Toisessa suositussa suoritusmuodossa osa AcMNPV:n egt-geenistä deletoidaan ilman korvaamista, kuten on esitetty kuviossa 3. Villikannan AcMNPV-ja vEGTZ-infektion 10 aikana syntetisoitujen proteiinien vertailu paljasti, että EGT-proteiini on 60 kDa proteiini, jota eritetään infektoiduista soluista. Vaihtoehtoinen mekanismi hyönteis-viruksen egt-geenin toiminnan lopettamiseksi on nahan luomiseen vaikuttavaa hyönteishormonia koodaavan geenin liittäminen tai nahan luomiseen vaikuttavan hyönteishormonin tehottomaksi tekevää entsyymiä koodaavan geenin liittäminen. 15 Tätä geeniä täytyy kyseessä olevalla viruksella infektoitujen solujen pystyä ilmentämään.
Genbank database -tutkimus paljasti 21-22 % aminohappojaksohomologian egt:n ja nisäkkäiden useiden UDP-glukuronosyylitransferaasien välillä. Homologiaa löydettiin myös kasvin UDP-glukosyylitransferaasille. egt-aminohappojakson tarkistus 20 näistä tiettyjen entsyymien aminohappojaksojen kanssa osoitetaan taulukossa 2.
• « « 4 « • · · • · · • · · • · · • · • · «·· • ♦ «»· • · · • « · ··· • · ♦ • · Φ 1 ( 4 · · 10 104263
Taulukko 1
AcMNPV eat:n nukleotidijakso ja siitä päätelty aminohappojakso
1 GTCGACGCGC TTCTGCGTAT AATTGCACAC TAACATGTTG CCCTTTGAAC
51 TTGACCTCGA TTGTGTTAAT TTTTGGCTAT AAAAAGGTCA CCCTTTAAAA
101 TTTGTTACAT AATCAAATTA CCAGTACAGT TATTCGGTTT GAAGCAAAAT
egt: M
151 GACTATTCTC TGCTGGCTTG CACTGCTGTC TACGCTTACT GCTGTAAATG
TIL CWLA LLS TLT A V N A
201 CGGCCAATAT ATTGGCCGTG TTTCCTACGC CAGCTTACAG CCACCATATA
ANI LAV FPTP AYS H H I
251 GTGTACAAAG TGTATATTGA AGCCCTTGCC GAAAAATGTC ACAACGTTAC V Y K V YIE ALA E K C H N V T
301 GGTCGTCAAG CCCAAACTGT TTGCGTATTC AACTAAAACT TATTGCGGTA VVK PKLF AYS TKT YCGN
351 ATATCACGGA AATTAATGCC GACATGTCTG TTGAGCAATA CAAAAAACTA ITE INA D M S V EQY KKL
401 GTGGCGAATT CGGCAATGTT TAGAAAGCGC GGAGTGGTGT CCGATACAGA VANS A M F RKR GVVS DTD
451 CACGGTAACC GCCGCTAACT ACCTAGGCTT GATTGAAATG TTCAAAGACC TVT AANY LGL IEM FKDQ
501 AGTTTGACAA TATCAACGTG CGCAATCTCA TTGCCAACAA CCAGACGTTT :V: F D N INV RNLI ANN QTF
1 f.;V 551 GATTTAGTCG TCGTGGAAGC GTTTGCCGAT TATGCGTTGG TGTTTGGTCA
[··.·. D L V V V E A F A D YALV F G H
1·* *
S 601 CTTGTACGAT CCGGCGCCCG TAATTCAAAT CGCGCCTGGC TACGGTTTGG
Γ**. LYD PAPV I Q I A P G YGLA
fr··*· • · ·
i*:\ 651 CGGAAAACTT TGACACGGTC GGCGCCGTGG CGCGGCACCC CGTCCACCAT
[·’* ENFDTVGAVARHPVHH
L. 701 CCTAACATTT GGCGCAGCAA TTTCGACGAC ACGGAGGCAA ACGTGATGAC
: P NIW R S N FDD TEAN V M T
• · · • «
·’ ' 751 GGAAATGCGT TTGTATAAAG AATTTAAAAT TTTGGCCAAC ATGTCCAACG
E M R LYKE F K I LAN M S N A
« <
!*’: 801 CGTTGCTCAA ACAACAGTTT GGACCCAACA CACCGACAAT TGAAAAACTA
LLKQQFGPNTPTIEKL
« · ·
851 CGCAACAAGG TGCAATTGCT TTTGCTAAAC CTGCATCCCA TATTTGACAA *: * ·: R N K V QLL LLN LHPI F D N
! 11 104263
Taulukko 1 (ja,tkuu)
| 901 CAACCGACCC GTGCCGCCCA GCGTGCAGTA TCTTGGCGGA GGAATCCATC
NRP VPPS VQY LGG G I H L
951 TTGTAAAGAG CGCGCCGTTG ACCAAATTAA GTCCGGTCAT CAACGCGCAA VKS APL TKLS PVI N A Q
1001 ATGAACAAGT CAAAAAGCGG AACGATTTAC GTAAGTTTTG GGTCGAGCAT M H K S K S G T I Y V S F G SSI
1051 TGACACCAAA TCGTTTGCAA ACGAGTTTCT TTACATGTTA ATCAATACGT DTK SPAN EFL YML I N T F
1101 TCAAAACGTT GGATAATTAC ACCATATTAT GGAAAATTGA CGACGAAGTA KTL DHY T I L W KID DEV
1151 GTAAAAAACA TAACGTTGCC CGCCAACGTA ATCACGCAAA ATTGGTTTAA V K H I TLP A N V ITQN W F N
1201 TCAACGCGCC GTGCTGCGTC ATAAAAAAAT GGCGGCGTTT ATTACGCAAG QRA VLRH K K M λ A F ITQG
1251 GCGGACTACA ATCGAGCGAC GAGGCCTTGG AAGCCGGGAT ACCCATGGTG G L Q S S D SALE A G I PMV
1 1301 TGTCTGCCCA TGATGGGCGA CCAGTTTTAC CATGCGCACA AATTACAGCA
\ CLPMKGD QFY H A H K LQQ
1351 ACTCGGCGTA GCCCGCGCCT TGGACACTGT TACCGTTTCC AGCGATCAAC L G V ARAL DTV TVS SDQL
1401' TACTAGTGGC GATAAACGAC GTGTTGTTTA ACGCGCCTAC CTACAAAAAA L V A INDVLFH APT YKK
; 1451 CACATGGCCG agttatatgc gctcatcaat catgataaag gaacgtttcc
V * ! H H A E LYA LIN H D K A TFP
• · ·
·...·* 1501 GCCTCTAGAT AAAGCCATCA AATTCACAGA ACGCGTAATT CGATATAGAC
·:··· PLD K A I K F T E R V I RYRH
• · ·
·*.·*· i 1551 ATGACATCAG TCGTCAATTG TATTCATTAA AAACAACAGC TGCCAATGTA
| DISRQLYSLKTTAANV
1601 ccgtattcaa attactacat gtataaatct gtgttttcta ttgtaatgaa
PYSN YYH YKS VFSI VMN
» » · • « « 1651 TCACTTAACA CACTTTTAAT TACGTCAATA AATGTTATTC ACCATTATTT H L T H F *
1 1 i I
I 1701 ACCTGGTTTT TTTGAGAGGG GCTTTGTGCG ACTGCGCACT TCCAGCCTTT 1751 ATAAACGCTC ACCAACCAAA GCAGGTCATT ATTGTGCCAG GACGTTCAAA
12 104263
Taulukko 2
EGT MTILCWLALLS-----TLTAVNAANILAVFPTPAYSHHIWKVYIEALAEKCHNVTV
HUMUDPGAT Msm____ALL.......fss.s. gkvL-V. PT-. fSH.m.. K. . ld.L.qr.HeVTV
MUSUDPGAT M......ALL.......f.sVk.gkvL-V.P.-. fSH.m. .Ki. ld.L.qr.HeVTV
RATUDPGAT M......ALf.......f. s.h.gkvL-V. P.fSH.m. .Ki . ld.L.qr.HeVTV
;
EGT VKP-KLFAYSTKTYCGNITEI -NADMSVE-----QYKKLVANSAMFRKRGWSDTDT
HUMUDPGAT l.S... isf. .ns......Ev... .lt.....-.. .KqLV...A-...kd......s MUSUDPGAT lrP.. .y... .K.. .G.. .E.. .t.vS.d.......K.v.. .t.----Rd.......
RATUDPGAT 1KP...F· · ..K...d««.El«st·iS.d...«..«2C.L.. *t·*· ·.Rd.......
EGT VTAANYLGLIEMFKDQF- DNINVRNLIANNQ—TFDLVWEAFADYALVFGHLYDPA
| HUMUDPGAT ....____f.dilr____D.vs.kkla.k.Q.. .FDvVl.dAl. .fg.llaeL.. .p ! MUSUDPGAT 1.......f.d.F.....D.vs.keLmtk.Q.. .FDvll.dpiA. .g.liaeL.q.p RATUDPGAT i.......f... y.....D.vs.kqLmtk.Q.. .FDvl. .dplA. .g.liaeL.h.p
! EGT PVI~QIAFGYGLAENFDTVGAVAR-HPVHHPNIW-RSNFDDTEANVMTEMRLYKEF
HUMUDPGAT .V.. .rfsFGYai. .h.g.l.. .p... PV. .sei. .q. .F.e.. .Hai-.v-LY.EF
MUSUDPGAT .1.. .rfsPGY.i. .s.g.....p.. .PV. .s.l. .q. .F.e.. .Nmi-.M-LY.dF
RATUDPGAT .1____fsPG..L. .sig.....p.. .PV. .s.l. .k. .F.D.. .Nmi-.M-LY.dF
EGT —KIL-ANMSNALLKQQFGPNTPTIEKLRHKVQLLLLNLHPIFDNNRPVPPSVQYLG
HUMUDPGAT . .qlf. .k. .d.f. .e.lG. .T-Tl.....K.di.Li.....Fq. .hPl.PnVefv- MUSUDPGAT . .qmf. .k. .dsf. .e.lG. .T-Tl.....q.em.Li. .n. .le. .hP. .PnVdYv- RATUDPGAT ____L. .k..dtf ..e.lG..T-Tvd...sKVei.Li.....1...hP..PnVdYi-
EGT GGIHLVKSAPLTKLSPVINAQMNKSKSGTIYVSFGSSIDTKSFANEFLYMLINTFKT
HUMUDPGAT GG1H.. .a.PL.K... .f-.Q.s. .ng. .vf-SlGS.*tf-*.-n.seE.. .vi.sal.. MUSUDPGAT GG1H.. .a.PL.K....f-.Q.s.. .g..vf-SlGS.v-.-n.teE... .i. .ai.. RATUDPGAT GG1H.. .a.PL.K... .f-.Q.s.. .g. .vf-SlGS.v-.-n.teE... .L. .ai.. ZMAYUDPGT 285 qp. .G. .YVSFGT. .. .rp.. .El.. .L.ds...
• «
EGT LDNYTILWKIDDEWKNITLPANVITQNWFNQRAVLRHKKMAAFITQGGLQSSDEAL
HUMUDPGAT i.-. .vLWrfDgn____l.L.t.l—.kWi.Q. .1L.H.K. .AFIThGG.ng.. .Ai MUSUDPGAT i.-. .vLHKfDg.....1.. .t.V—.kWi.Q. .IL.H.K. .AFhThGG.ng. .EAi RATUDPGAT i.-..vLWKfDg.....1.. .t.V—.kWi.Q. .1L.H.K. .AFvThGG.ng. .EAi
. ·: ZMAYUDPGT L......W.l... .1.. .a. .g. .1.. .W. .Q.AVLRH. .vgAFvThaG. .S. .EgL
EGT EAGIPMVCLPMMGDQFYHAHKLQQLGVARALDTVTVSSDQLLVAINDVLFNAPTYKK
; HUMUDPGAT .p.IPMV.vPl.aDQ. .n.. .mk. .G.A.sLD. .TnSS.dLL.Alk.Vi-N.P.YK. MUSUDPGAT . .GIPMi. iPl.GeQ. .n.. .m.. .G.A.ALn. .TmS. .dvL.AleeVi-. .P.YKK RATUDPGAT . .GIPMi. iPl.GDQ. .n.. .m.. .G.A.sLn. .TmS. .dfL.AleeVi-d.P.YKK ZMAYUDPGT .sGvPM.C.P. .GDQ. .nAr.v.hvG.G.Afe.-amtS. .v. .AveelL......rr • ·
:·: EGT HMAELYALINHDKATFPPLDKAIKFTERVIRYRHDISRQLYSLKTTAANVPYSNYYM
HUMUDPGAT n...L-s.IhHDqp-..PLDrA-.F....v-.RH..akhL...---A.dl.---.f.
MUSUDPGAT n.. .L-s.IhHDqp-. .PLDrA-.F----v-.RH. .akhL.pL---g.Nl.---.f.
RATUDPGAT nv.. L-s. IhHDqp-.. PLDrA-. F____I-.RH. .akhL.pL---g.NlP---.Y.
ZMAYUDPGT . .AEL.ALv.e. .g......K.frF.E.V.R.
0 « · · · · EGT YKSVFSIVMHHLTHF* HUMUDPGAT Y.S-l.v____La.............-................* MUSUDPGAT Y.S-l.vi. . . Ls...........................'· · . * | RATUDPGAT Y . S-l. v i . . . LT . F............................* ! ,3 104263
Taulukko 2 valaisee egt-aminohappojakson tarkistusta muiden lajien UDP-glukuro-nosyylitransferaasien ja UDP-glukosyylitransferaasin valinnan kanssa. Egt:n ennustettua aminohappojaksoa verrataan ihmisen (HUMUDPGAT) (Jackson et ai. (1987) Biochem. J. 242:581; hiiren (MUSUDPGAT) (Kimura ja Owens (1987) Eur. J.
5 Biochem. 168:515; ja rotan (RATUDPGAT) (MacKenzie (1987) J. Biol. Chem. 262:97441: UDP-glukuronosyylitransferaaseihin ja maissin UDP-glukosyylitransfe-raasiin (ZMAYUDPGT) (Ralston et ai. (1988) Genetics U9:185) käyttämällä FASTP-algoritmia (Lipman ja Pearson (1985) Science 227:1435), kuten International Biotechnologies Inc. pani täytäntöön. Isot khjaimet osoittavat aminohappojak-10 soja, jotka ovat tarkalleen samat; pienaakkoset osoittavat korvautumisia, joita esiintyy usein toisilleen sukua olevilla proteiineilla, (Dayhoff, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, vol. 5, täydennysosa 3, Silver Spring, MD); täplät kuvaavat korvautumisia, joita esiintyy harvoin; yhdysviivat osoittavat aukkoja jaksossa; ja poisjääntimerkki osoittaa jakson kohdan, 15 josta aminohappo on deletoitu. Nuolien välissä olevat aminohapot deletoidaan egt-geenistä vEGTZ:ssa ja vEGTDEL:ssä. AcMNPV-geenin homologia tunnetuille UDP-glukoosille ja UDP-glukuronosyylitransferaaseille tukee tämän AcMNPV-jakson tunnistamista egt:n koodausjaksoksi.
Nisäkkäissä UDP-glukuronosyylitransferaasit katalysoivat glukuronihapon siirtoa 20 suurelle määrälle sekä ulkosyntyisiä että sisäsyntyisiä lipofiilisiä substraatteja (katsausartikkeli teoksessa Glucuronidation of Drugs and Other Compounds, Dutton (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1986). Tämä konjugaatioreaktio on tärkeä tiettyjen lääkkeiden ja syöpää aiheuttavien aineiden myrkyttömäksi ja vaarattomaksi tekemisessä. Lisäksi eri sisäsyntyisten yhdisteiden, kuten bilirubiinin ja steroidi- ...: 25 hormonien, normaali aineenvaihdunta ja hävittäminen etenee glukuronihapon kanssa ·;·4 konjugoitumisen kautta. Saatavilla oleva todiste hyönteisjärjestelmistä osoittaa, että • · * tämän tyyppiset sokerikonjugaatioreaktiot liittyvät pikemmin sokerin kuin glukuronihapon siirtoon (Smithin katsausartikkeli (1977) teoksessa Drug Metabolism - • · ·’ * From Microbe to Man, Parke ja Smith (eds.), Taylor and Francis Ltd., Lontoo, s.
: 30 219-232). Kuten nisäkkäissä, suuri määrä eri ulkosyntyisiä ja sisäsyntyisiä yhdistei- ♦ .
: · · · tä ovat konjugaation kohteena hyönteisissä.
• · ·
Keksijät ovat osoittaneet, että AcMNPV:n EGT-proteiini on UDP-glukosyylitrans- ;:· feraasi, joka erityisesti konjugoi glukoosin ecdysteroidin kanssa, kuten ecdysonin, : · ·: 20-hydroksiecdysonin ja A-makisteronin kanssa (katso taulukko 3). Infektoimatto- 35 mien solujen tai vEGTZ:lla infektoitujen solujen sekä lysaatit että solun ulkopuoliset elatusaineet eivät muuta ecdysonia. Suurin osa AcMNPV:llä infektoitujen solujen ecdysteroidiglukosyylitransferaasiaktiivisuudesta eritetään solun ulkopuoliseen 14 104263 elatusaineeseen; AcMNPViliä infektoitujen solujen lysaateissa havaitaan vain suhteellisen pieni aktiivisuustaso.
Käyttämällä DNA-koettimena AcMNPV:n egt-geeniä on tunnistettu egt-geeni toisessa baculoviruksessa, Orgyia pseudotsugata nukleaarisessa polyhedroosivirukses-5 sa (OpMNPV), kuten esitetään kuviossa 4. Alan ammattilaiset tunnistavat tämän ilmoittamisen hyötynä, että minkä tahansa baculoviruksen, hyönteisviruksen tai hyönteisen egt-geeni voidaan paikallistaa, kuvata ja eristää samalla tavalla kuin tässä on näytetty esimerkkiä. Niitä egt-geenejä, joilla on ainakin 70 % nukleotidijaksohomo-logia taulukossa 1 olevalle jaksolle, pidetään taulukossa 1 olevaa jaksoa vastaavana, 10 ja näin annetaan käyttöön ne homologiset geenit, jotka koodaavat entsyymiä, joka on ecdysteroidi-UDP-glukosyylitransferaasi.
egt-geeniä toiminnallisesti vastaavia ovat ne, jotka myös katalysoivat ecdysteroidien toiminnan lopettamista, kuten ecdysonin, siirtämällä UDP-glukoosin sokeriosan ecdysteroidille (ecdysteroideille). Nämä egtin toiminnalliset vastikkeet voidaan 15 tunnistaa käyttämällä tässä selitettyjä koemenetelmiä.
Paikallistaessaan, tunnistaessaan ja eristäessään egt-geeniä taitava ammattilainen voi tehdä tämän geenin toimimattomaksi käyttämällä tämän ilmoituksen opetuksia ja alalla tunnettuja tekniikkoja tuottaakseen tehokkaamman hyönteistorjunta-aineen.
Vertaamalla vEGTZin ominaisuuksia villikannan (wt) AcMNPVin ominaisuuksiin, 20 tämän keksinnön keksijät ovat osoittaneet, että egtin ilmeneminen estää hyönteistä : ·. vaihtamasta kuortaan ja koteloitumasta. Villikannan AcMNP Viliä infektoidut hyön teiset eivät vaihda nahkaansa eivätkä koteloidu, mutta vEGTZilla infektoidut hyön- * ’’: teiset luovat nahkansa ja yrittävät koteloitua (katso taulukko 4 esimerkissä II).
• · « · · .; : Estämällä nahan vaihtamisen ja koteloitumisen villikannan AcMNPV-infektio voi 25 itse asiassa pidentää toukan syömiseen käyttämää aikaa. Viidennen asteen toukka- : vaiheen (viimeinen toukkavaihe) alussa villikannan viruksella infektoidut toukat jat- kavat syömistä kunnes kuolevat 5 tai 6 päivää infektion jälkeen. Kuitenkin infektoi- . mattomat toukat lopettavat syömisen 2-3 päivää viidennen asteen toukkavaiheeseen «· · siirtymisen jälkeen valmistautuakseen koteloitumista varten (katso kuvio 8). Saman-30 laisia vaikutuksia havaitaan, kun tutkitaan aikaisempien toukkavaiheiden toukkia. • Infektoimattomat toukat lopettavat syömisen noin 24 tunniksi nahan luomisen aika na, kun taas villikannan AcMNPVillä infektoidut toukat eivät vaihda nahkaansa eivätkä siis lopeta syömistä (katso kuvio 6).
15 104263
Yhdistelmäbaculovirukset, joilta puuttuu toimiva egt-geeni, eivät pidennä toukan syömiseen käyttämää aikaa. Täten vEGTZ:lla aikaisessa viidennen asteen toukka-vaiheessa infektoidut toukat lopettavat syömisen kaksi päivää infektion jälkeen valmistautuakseen koteloitumista varten (katso kuvio 8). Kuitenkaan ne eivät kote-5 loidu, vaan sen sijaan kuolevat virusinfektioon jopa nopeammin kuin villikannan viruksella infektoidut toukat, kuten esitetään kuviossa 9. Samoin vEGTZ:lla aikaisessa neljännen asteen toukkavaiheessa infektoidut toukat lopettavat syömisen kaksi päivää infektion jälkeen vaihtaakseen nahkansa, ja sitten ne kuolevat nopeammin kuin villikannalla infektoidut toukat (katso kuviot 6 ja 7). Nopeampi tappaminen baculo-10 viruksen avulla, jolta puuttuu toimiva egt-geeni. on dramaattisimmillaan nähtävissä, kun juuri munasta kuoriutuneet ensimmäisen asteen toukkavaiheessa olevat toukat infektoidaan villikannan AcMNPVrllä ja vEGTZrlla, kuten esitetään kuvioissa 10 ja 11. VEGTZ.lla infektoidut toukat kuolevat virusinfektioon 3-4 päivää nopeammin kuin villikannan AcMNPV:llä infektoidut toukat. Siksi yhdistelmäbaculovirukset, 15 joilta puuttuu toimiva egt-geeni, ovat huomattavasti tehokkaampia hyönteistoqunta-aineina kuin villikannan baculovirukset. Alan ammattilaisille on selvää tämän tiedon perusteella, että egt-geeni voidaan tehdä toimimattomaksi missä tahansa baculovi-ruksessa tai hyönteisessä millä tahansa alalla tunnetuilla keinoilla.
Edellä ja seuraavissa esimerkeissä selitetyt vaikutukset ovat dramaattisempia pellol-20 la. VEGTZ:lla infektoiduilla toukilla on vaikeuksia nahan vaihtamisessa, ja ne luo-vat nahkansa onnistuneesti vain huolellisesti valvotuissa laboratorio-olosuhteissa.
:*: Kun lämpötilaa ja valaistusta ei valvota tarkasti, monet hyönteiset epäonnistuvat ΜΙ’: hän luomisen loppuun saattamisessa. Nämä hyönteiset eivät aloita uudestaan syö mistä ja kuolevat pian sen jälkeen.
' ’ 25 Vaikka aikaa, jolloin jälkeläisvirukset voivat lisääntyä baculoviruksilla, joilta puut- .: : tuu toimiva egt-geeni. infektoiduissa toukissa, on jonkin verran lyhennetty ja infek- toitu hyönteinen osoittaa vähentynyttä kasvua, jälkeläisviruksia tuotetaan runsaasti. T: Toukasta saatu virusmäärä myöhäisen asteen toukkavaiheen toukkien vEGTZ- : infektion jälkeen on noin puolet virusmäärästä, joka saadaan villikannan viruksella.
* . 30 Tämä on riittävä sallimaan viruksen siirron pellolla ja viruspartikkeleiden suurien määrien kustannuksien kannalta tehokkaan tuotannon.
• · • · * Tämän keksinnön toisessa suoritusmuodossa hyönteisvirus, jolta puuttuu toimiva ‘”. egt-geeni. muutetaan geeniteknologian avulla siten, että sen tehokkuus biologisena valvontavaikuttimena edelleen lisääntyy. Hyönteisvirus muutetaan liittämällä toinen 35 geeni, jonka tuote vaikuttaa hyönteisen kehitykseen.
,6 104263 PTTH:ta (peptidihormoni) koodaava geeni voidaan liittää viruksen genomiin, josta on deletoitu egt-geeni, ja PTTH:ta voidaan ilmentää tasoilla, jotka ovat riittävän korkeita vaikuttamaan nahan luomiseen. Tällaisella viruksella infektoidut toukat kokevat kehityksen hormonaalisen toijunnan laajan hajoamisen. Nämä hyönteiset tule-5 vat nopeasti sairaiksi, mikä johtaa vaarantavaan kasvuun ja kehitykseen, vähentyneeseen ruokailuun ja aikaisempaan kuolemaan.
Eklosion-hormoni on myös pieni peptidihormoni, jonka geeni voidaan liittää viruksen genomiin, jolla ei ole toimivaa egt-geeniä, käyttämällä alalla tunnettuja tekniikoita. Koska eklosion-hormoni ohjaa monia nahan luomiseen liittyviä käyttäy-10 tymismuutoksia, Egt-viruksella infektoidut virukset, jotka tuottavat riittävän suuria määriä tätä hormonia, osoittavat käyttäytymis- ja/tai kehityspoikkeavuuksia, kuten vähentynyttä ruokailua.
Nuoruushormonitiittereiden tärkein säätelijä hyönteisessä on nuoruushormonieste-raasientsyymi, joka tekee nuoruushormonin toimimattomaksi. Yhdistelmävirus, jolta 15 puuttuu toimiva egt-geeni ja joka ilmentää riittäviä määriä nuoruushormoniesteraa-sia, voi vaikuttaa haitallisesti hyönteisen käyttäytymiseen ja/tai kehitykseen.
On tärkeää huomata, että vaikka kaikki edellä mainitut geenit voitaisiin lisätä villi-kannan viruksen genomiin, niiden ei odotettaisi merkittävästi vaikuttavan hyönteisen käyttäytymiseen villikannan viruksessa, koska villikannan viruksen ilmentämä egt-20 geeni tekee ecdysteroidi-nahanluomishormonit tehottomiksi ja nahan luominen este- 5.* tään, huolimatta muiden hormonien tuotannosta. Täten onnistuneet strategiat, jotka .: : sisältävät hyönteisen nahan luomista häiritsemään suunniteltujen viruksien kehittä- misen, riippuvat egt-geenin tehottomaksi tekemisestä etukäteen, kuten on selitetty :": tässä keksinnössä.
25 egt-geenin tuotteen on osoitettu häiritsevän hyönteisen kehitystä tehoavalla ja erityisellä tavalla. Ecdysteroideilla on ratkaiseva rooli pohjimmiltaan kaikkien hyön-•' * teislajien kehityksessä (katsausartikkeli teoksessa Comprehensive Insect Physiology :.: : Biochemistry and Pharmacology, Kerkut ja Gilbert (eds.), Pergamon Press, Oxford, 1984). Täten egt:llä itsellään on huomattavat mahdollisuudet käytettäväksi laaja-. · · *. 30 pohjaisissa hyönteistoijuntastrategioissa.
·:· On todennäköistä, että hyönteiset itse ilmentävät egt-geeniä tietyissä vaiheissa nii- •: · < · den elämänkierron aikana ja että tämä muodostaa tärkeän osatekijän kehitystä sääte levistä mekanismeista. Täten on mahdollista, että hyönteisen egt-geeni saattaisi olla sopiva kohde uusille hyönteistorjuntastrategioille. Tämä keksintö antaa käyttöön 35 keinot tällaisten strategioiden suunnitteluun.
17 104263
Voidaan suunnitella tämän keksinnön lisäsuoritusmuoto, ecdysteroidianalogit, jotka sitoutuvat EGT-entsyymiin, mutta joita ei voi pilkkoa ja vapauttaa entsyymistä. Tällaiset "itsemurhasubstraatit" sitoutuvat kilpailukykyisesti EGT-entsyymiin ja estävät EGT-entsyymin toimintaa, siis häiritsevät hyönteisen kehitystä. Vaihtoehtoi-5 sesti yhdistelmäeliöt voidaan muuttaa geeniteknologian avulla käyttämällä tässä annettuja opetuksia ja, kuten alalla ymmärretään, siten, että hyönteisen egt-geenin ilmeneminen estetään tuottamalla esimerkiksi vastamerkitys-RNA:ta.
Kuten tässä on käytetty, hyönteistorjunta-aine on koostumus tai koostumuksen toimiva ainesosa, jolla on haitallinen vaikutus tuhohyönteisiin. Reaktiona hyönteistor-10 junta-aineelle hyönteiset syövät vähemmän, normaali hyönteisen nahan luominen saatetaan sekaisin ja seuraa hyönteisen kuolema. Tämän keksinnön hyönteistorjunta-aine on baculovirus, joka on geeniteknologian avulla muutettu tekemään ecdys-teroidi-UDP-glukosyylitransferaasientsyymiä koodaava geeni tehottomaksi, tai baculovirus, jota on edelleen geeniteknologian avulla muutettu ilmentämään hyön-15 teisen kehitykseen vaikuttavaa proteiinia koodaavaa geeniä.
Kasveihin sovellettavat tuhohyönteisiä torjuvat hyönteismyrkkykoostumukset käsittävät maatalouden kannalta sopivan välittäjäaineen ja hyönteistoijunta-aineen. Tämän keksinnön hyönteismyrkkykoostumuksen sovellutus voi suojata kasveja tuhohyönteisiltä vähentämällä hyönteisten ruokailua ja tappamalla alttiit hyönteiset.
• · 20 Alan ammattilainen tietää, miten valitaan hyönteistoijunta-aine, joka on sopiva tie- .:.' tyn tuhohyönteisen torjuntaan.
• · · • · • · ···. Alan ammattilaisille on selvää, että tuhohyönteiset voidaan asettaa alttiiksi tämän : keksinnön hyönteistoijunta-aineelle tavanomaisten menetelmien avulla, joihin kuu- « · .;t luvat hyönteistoijunta-aineen nauttiminen, sisäänhengitys tai suora kosketus.
1 * 25 egt-geeni, geenituote ja sen vasta-aineet, ja kaikki muut reagenssit, jotka on saatu . : edellä olevasta tai liittyvät siihen, ovat kaikki tämän keksinnön rajoissa. EGT-pro- :T: teiini voidaan puhdistaa suurin piirtein käyttämällä tässä selitettyä koetta ja alalla ' . tunnettuja tekniikkoja.
• · '..,: Tämän keksinnön perinnöllisesti muutettujen baculovirusten tärkein käyttö on maa- 30 talouden koostumusten aineosina levitettäväksi kasveille vaikuttamaan kasvien tuhohyönteisten biologiseen torjuntaan. Alalla tunnetaan monia muunnoksia torjuntaan olevien tällaisten maatalouden kannalta sopivien koostumuksien valmistamiseksi.
18 104263
Hyönteistoqunta-aineen konsentraatio, jota tarvitaan tuottamaan hyönteismyrkkynä tehokkaita maatalouden koostumuksia kasvien suojelua varten, riippuu eliötyypistä ja käytetystä mutaatiosta ja koostumuksen formuloinnista. Hyönteistoijunta-aineen hyönteistoijunnallisesti tehokas konsentraatio koostumuksessa voidaan helposti 5 määrittää kokeellisesti, kuten alan ammattilainen ymmärtää. Esimerkiksi viruksen hyönteistoijunnallisesti tehokas konsentraatio voidaan helposti määrittää käyttämällä minkä tahansa esimerkeissä VI-XI selitettyjen tekniikoiden muunnelmia.
Maatalouden koostumusten täytyy olla sopivia maatalouden käyttöön ja hajaantumiseen pelloilla. Yleensä koostumuksen aineosat eivät saa olla myrkyllisiä kasveille 10 eivätkä vahingollisia okluusioviruksen eheydelle. Lehvistösovellutukset eivät saa turmella tai vahingoittaa kasvin lehtiä. Sopivien kiinteiden tai mieluummin nestemäisten välittäjäaineiden lisäksi maatalouden koostumukset voivat sisältää liimautuvia ja tarttuvia vaikuttimia, emulgoivia ja kastelevia vaikuttimia, mutta ei mitään aineosia, jotka estävät hyönteistä syömästä tai viruksen toimintoja. Saattaa olla 15 myös toivottavaa lisätä aineosia, jotka suojelevat hyönteistorjunta-ainetta UViita, joka tekee aineen tehottomaksi. Tuhohyönteisen toijuntaan olevat maatalouden koostumukset voivat myös sisältää aineita, jotka herättävät hyönteisen ruokahalua.
On saatavilla katsausartikkeleja, jotka selittävät biologisten hyönteistoijunta-ainei-den ja maatalouden sovellutusmenetelmiä. Katso esimerkiksi Couch ja Ignoffo y; 20 (1981) teoksessa Microbial Control of Pests and Plant Disease 1970-1980, Burges (ed.), kappale 34, s. 621-634; Corke ja Rishbeth, ibid, kappale 39, s. 717-732; · ’·, Brockwell (1980) teoksessa Methods for Evaluating Nitrogen Fixation, Bergersen :.. (ed.) s. 417-488; Burton (1982) teoksessa Biological Nitrogen Fixation Technology . for Tropical Agriculture, Graham ja Harris (eds.) s. 105-114; ja Roughley (1982) ] ’ 25 ibid, s. 115-127; The Biology of Baculoviruses, voi. Π, supra.
Tätä keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä, joita ei pidä tulkita millään taval-. la tätä keksintöä rajoittaviksi. On selvää, että saatetaan turvautua muihin eri suori- , · : . tusmuotoihin, muunnoksiin ja niiden vastikkeisiin, jotka tulevat alan ammattilaisten
« I
mieleen, kun he lukevat tätä selitystä, ilman että poiketaan tämän keksinnön henges-’ * 30 tä ja/tai liitettyjen patenttivaatimusten rajoista.
Esimerkki I
egt-geenin paikka AcMNPV-genomissa valaistaan kuviossa 1. Karttayksikkömitta-kaava esitetään AcMNPV-genomin kartan yläpuolella. Tämän geenin ja sitä reunustavien alueiden nukleotidijakson määrittämiseksi, ja sen jälkeisen geenin käsittelyn 35 sallimiseksi, on ensin välttämätöntä kloonata useita tämän alueen sisältäviä DNA- 19 104263 kappaleita plasmidivektoreihin (katso vakiokloonausmenetelmät teoksesta T. Ma-niatis et ai. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). A-osa esittää kartan suorasta AcMNPV-genomista sen jälkeen, kun se on pilkottu EcoRI- ja Hindlll-restriktioendonukleaa-5 seilla. B-ösa on genomin suurennus 7,6:sta ll,l:een karttayksikköön esittäen egt-geenin paikan. Käytetty alkuperäinen AcMNPV-kanta on Ll-kanta (Lee ja Miller (1978) J. Virol. 27:754). Kloonatut DNA-kappaleet ja tulokseksi saatujen plasmi-dien nimet esitetään kuviossa 1C. Kappale 1, joka ulottuu Pstl-paikasta 7,6:sta BamHI-paikkaan 11,1 reen karttayksikköön, kloonataan pUC19-plasmidivektoriin; 10 kappaleet 2 ja 3 (PstLstä (7,6 karttayksikköä) EcoRI:een (8,65 karttayksikköä) ja EcoRI:stä (8,65 karttayksikköä) SalLeen (10,5 karttayksikköä), vastaavasti) kloonataan molemmat Bluescript M13+-ja Bluescript M13'-vektoreihin (Stratagene, San Diego, Kalifornia). Kappale 5 (BstEUsta (8,35 karttayksikköä) BstEII:een (8,7 karttayksikköä) kloonataan Bluescript M13+:aan.
15 Sitten kehitetään suuri määrä BCPsE- ja BCES-plasmidien klooneja (Henikoff (1984) Gene 28:351). Näissä klooneissa on liitetyn viruksen kasvavassa määrin suurempia häviämiä siten, että ne sisältävät eri määriä virus-DNA:ta, alle 50 emäspa-rista kokonaiseen viruskappaleeseen. Sitten monet näistä klooneista ja BCB-plasmi-di sekvensoidaan (Sanger et ai. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463) siten, 20 että koko egt-geeni on sekvensoitu molempiin suuntiin. Sitten saadut nukleotidijak-sot analysoidaan tietokoneella käyttämällä Pustellin ja Kefatosin ohjelmia (1984) Nucl. Acids Res. 12:643-655 ja Devereauxin ym. ohjelmia (1984) Nucl. Acids Res.
: 12:387-396, jotta saataisiin selville avoimet lukuraamit, jotka voivat koodata prote- ·*·. iineja. Tämä analyysi osoittaa, että egt-geeni koodaa 506 aminohapon proteiinia.
. ' 25 egt-geenin nukleotidijakso ja siitä ennustetun egt-geenituotteen aminohappojakso « · esitetään taulukossa 1.
I · * «
Esimerkki Π !.. 4 Jotta rakennettaisiin yhdistelmäviruksia, jotka eivät pysty ilmentämään toimivaa egt- *. geeniä, tarvitaan lisäkäsittely esimerkissä 1 selitetyille plasmidiklooneille. Plasmidi 30 pUCBCPsB pilkotaan EcoRI- ja Xbal-restriktioendonukleaaseilla (katso kuviosta 3 paikat egt-geenissä) ja pieni kappale heitetään pois. Sitten Escherichia colin lacZ-geeni, joka on irrotettu pSKS104:stä (Casadaban et ai. (1983) Methods Enzymol.
’ * * ‘. 100:293-303) EcoRLllä ja AhalLlla, liitetään EcoRI- ja Xbal-kohtien väliin sen jäl keen, kun Xbal-päät on täytetty käyttämällä T4:n DNA-polymeraasia. Tulokseksi 35 saatua plasmidia nimitetään pEGTZrksi. Tässä plasmidissa liitetty IacZ-geeni on samassa lukuraamissa edeltävien egt-koodausiaksoien kanssa. Vaihtoehtoisesti 20 104263 pEGTDEL-plasmidi rakennetaan yksinkertaisesti liittämällä EcoRI- ja Xbal-kohdat yhteen (sen jälkeen, kun molemmat kohdat on tehty tylppäpäisiksi) ilman, että liitetään yhtään jaksoa niiden väliin.
Kaikki virukset on saatu alun perin AcMNPV L-l:stä (Lee ja Miller (1978) supra), 5 ja ne on puhdistettu plakeissa ja kasvatettu Spodontera frugioerda IPLB-SF-21 -solulinjassa (SF-solut) (Vaughn et ai. (1977) In Vitro 13:213-217) käyttämällä aikaisemmin selitettyjä menetelmiä (Lee ja Miller (1978); Miller et ai. (1986) Genetic Engineering, Principles and Methods, voi. 8 (eds. J. Setlow ja A. Hollaender) Plenum Press, N.Y., pp. 277-298, 1986).
10 Sitten pEGTZ-plasmidi yhteistransfektoidaan villikannan AcMNPV-DNA:n kanssa SF-soluihin, kuten Miller ym. ovat selittäneet (1986) supra. Tämä menetelmä sallii homologisen rekombinaation tapahtua virusjaksojen ja plasmidi-DNA:iden välillä, mikä johtaa viruksen egt-geenin korvautumiseen plasmidin egt-lacZ-geenifuusiolla. Koska jäljelle jäävä egt-koodausiakso on samassa lukuraamissa IacZ-jaksojen kans-15 sa, tällainen yhdistelmävirus tuottaa fuusioproteiinia, joka sisältää 84 ensimmäistä egt:n aminohappoa liittyneenä β-galaktosidaasiin. Yhdistelmävirus, jota nimitetään vEGTZ:ksi, voidaan tunnistaa, koska β-galaktosidaasin ilmeneminen synnyttää sinisiä virusplakkeja, kun läsnä on väriä synnyttävää indikaattoria, kuten 5-bromo-4-kloro-3-indolyyli^-D-galaktopyranosidia (X-gal). Diagrammi vEGTZin egt-geenis-. ·. 20 tä esitetään kuviossa 3B.
'·' Yhdistelmävirus vEGTDEL saadaan transfektoimalla pEGTDEL-plasmidi yhdessä : : vEGTZ-viruksen DNA:n kanssa SF-soluihin. Homologinen rekombinaatio johtaa vEGTZ.ssa egt-lacZ-geenifuusion korvautumiseen pEGTDELm deletoidulla egt-geenillä. Yhdistelmävirus vEGTDEL tunnistetaan siitä, että se ei pysty muodosta-’: *: 25 maan sinisiä plakkeja X-gal:n läsnä ollessa. vEGTDEL:n egt-geenin rakenne esite tään kuviossa 3C.
Esimerkki III
< < · •
Egt-geenin tuote tunnistetaan vertaamalla villikannan AcMNPV:n (joka tekee EGT:tä) syntetisoimia proteiineja vEGTZin tai vEGTDEL:n (jotka eivät pysty te-30 kemään EGT:tä) tuottamiin proteiineihin. SF-solut infektoidaan joko villikannan AcMNPV:llä tai vEGTZ:lla infektion moninaisuuden (MOI) ollessa 20, kuten on ·:··: selitetty O’Reillyn ja Millerin artikkelissa (1990) J. Virol. 64:1321-1328. Infektoi- mattomat solut analysoidaan myös. 6 tuntia infektion jälkeen soluja inkuboidaan radioaktiivisesti leimatun (35S)-metioniinin läsnäollessa 1 tunti, jotta kaikki tänä ai-35 kana tehdyt proteiinit leimautuisivat radioaktiivisiksi. Sitten solut hajotetaan ja pro- 2l 104263 teiinit erotetaan SDS-polyakryyliamidigeelielektroföreesin (SDS-PAGE) avulla (Laemmli et ai. (1970) Nature 227:680-685). Myös mitkä tahansa solujen erittämät proteiinit kerätään ja analysoidaan. SDS-PAGE:n jälkeen radioaktiivisesti leimatut proteiinit saadaan selville autoradiografian avulla. Villikannan AcMNPV :llä in-5 fektoidut solut erittävät 60 kDa proteiinia, mutta vEGTZ:lla infektoidut solut tai in-fektoimattomat solut eivät eritä. Tätä 60 kDa proteiinia ei tavata villikannan AcMNPVrllä infektoitujen solujen lysaateista, mikä osoittaa, että sitä eritetään solusta. Nämä tiedot osoittavat, että egt-geenin tuote on 60 kDa erittyvä proteiini, jonka ominaisuudet sopivat yhteen nukleotidi-ja aminohappojakson tietoihin.
10 Esimerkki IV
EGT-proteiinin entsymaattinen aktiivisuus tunnistetaan vertaamalla SF-soluja, jotka on infektoitu villikannan AcMNPV:llä tai vEGTZilla. Villikannan AcMNPVillä tai vEGTZrlla infektoidut SF-solut selitetään esimerkissä ΠΙ. Kaksitoista tuntia infektion jälkeen (pi) solut ja solun ulkopuolinen elatusaine kerätään ja käsitellään erik-15 seen. Infektoimattomat solut käsitellään samalla tavalla. Solulysaatteja tai solun ulkopuolisia elatusaineita inkuboidaan 1 mM UDP-glukoosin ja 0,25 pCi (3H)ecdyso-nin läsnä ollessa, kuten on selitetty O'Reillyn ja Millerin artikkelissa (1989) Science 245:1110-1112. Ecdysteroidi-UDP-glukosyylitransferaasiaktiivisuus solulysaateissa tai elatusaineissa katalysoi glukoosin siirtoa UDP-glukoosilta ecdysonille, jolloin y. 20 muodostuu ecdysoniglukoosikonjugaatti. Ecdysoni ja ecdysoniglukoosikonjugaatti erotetaan toisistaan silikageeliohutkerroskromatografian avulla (Bansal ja Gessner « t (1988) Anal. Biochem. 109:321) ja tehdään näkyväksi autoradiografian avulla. Ecdysoniglukoosikonjugaatteja (G) muodostetaan vain, kun villikannan «
AcMNPV :llä infektoidulle lysaatille tai solun ulkopuoliselle elatusaineelle suorite-‘ * 25 taan analyysi. Konjugaatteja ei havaita, kun käytetään infektoimattomia tai
III
. · : vEGTZ:lla infektoituja solulysaatteja tai elatusaineita, mikä osoittaa, että aktiviteetti johtuu egt:n ilmenemisestä. Suurin osa aktiviteetista on solun ulkopuolisessa ela-: tusaineessa, mikä täsmää esimerkissä ΙΠ käsiteltyjen tietojen kanssa. Todiste siitä, !*: että glukoosi on konjugoitunut ecdysoniin, saadaan analysoimalla villikannalla in- ’30 fektoidut lysaatit kuten edellä on selitetty paitsi, että UDP-glukoosi korvataan radio-' aktiivisesti leimatulla UDP-(U-wC)glukoosilla. Reaktiot, jotka on suoritettu leimaa- mattomalla UDP-glukoosilla tai leimatulla UDP-(U-14C)glukoosilla (3H)ecdysonin ;: · ollessa mukana molemmissa reaktioissa, ja konjugaatin analyysi nestetuikelaskimel- • * · la osoittavat, että sekä 3H-ecdysonista että 14C-glukoosista voidaan havaita. Nämä 35 tiedot todistavat, että egt-geenin tuote on UDP-glukosyylitransferaasi, joka katalysoi glukoosin siirron UDP-glukoosilta ecdysonille.
22 104263
Sitten suoritetaan kokeita, joilla tutkitaan tarkemmin EGT.n substraattispesifisyyttä. Näissä kokeissa inkuboidaan eri substraatteja (1 mM) merkittävää egt-aktiivisuutta sisältävien villikannan AcMNPV:llä infektoitujen solujen ulkopuolisen elatusaineen kanssa. Jokaista substraattia inkuboidaan myös infektoimattomien ja vEGTZ:lla in-5 fektoitujen solujen, jotka eivät pysty tuottamaan EGT:tä, elatusaineiden kanssa, jotta saataisiin kontrollit, joilla varmistetaan, että mitkä tahansa havaitut konjugaatit johtuvat EGTistä. Jokaiseen reaktioon lisätään 0,05 pCi UDP-(U-14C)-glukoosia. Mitkä tahansa yhdisteet, jotka toimivat EGT:n substraatteina, konjugoidaan glukoosin kanssa; ne voidaan havaita, koska glukoosi on leimattu radioaktiiviseksi.
10 Taulukko 3 EGT :n substraattispesifisyys
Substraatti Jäljitelty Villi kanta (pmol glukoosia siirretty) (pmol glukoosia siirretty) p-aminobentsoehappo bilirubiini kloramfenikoli dietyylistilbestroli ecdysoni - 155,7 β-estradioli 20-hydroksiecdysoni — 87,8 Y: hydroksikvinoliini ‘.i. makisteroniA - 89,6 (-) mentoli · metyyliumbelliferoli a-naptoli p-nitrofenoli fenoliftaleiini ' ‘ testosteroni a-tetraloli • Y: Substraatteja inkuboidaan sopivasti infektoiduista soluista saadun elatusaineen ja ' . 0,05 pCi UDP-(U-14C)-glukoosin läsnä ollessa. Siirretyn glukoosin määrät lasketaan 15 sen jälkeen, kun kromatografialevyjen sopivat alueet on analysoitu nestetuikelas-kimella.
Yksi lisäkontrolli on UDP-(U-14C)-glukuronihapon lisääminen erillisten reaktioiden sarjaan villikannalla infektoitujen solujen elatusaineen kanssa, jotta osoitetaan, että glukuronihappoa ei siirretä tässä reaktiossa. Saadut tiedot esitetään taulukossa 3. 20 Ainoat tunnistetut substraatit ovat ecdysoni, 20-hydroksiecdysoni ja makisteroni A, 23 104263 jotka kaikki ovat ecdysteroideja. Konjugaatiota ei havaita käyttämällä elatusainetta jäljitelmistä tai vEGTZ:lla infektoiduista soluista, mikä varmistaa sen, että havaittu aktiviteetti johtuu egtin ilmenemisestä. Konjugaatiota ei havaita, kun käytetään UDP-(U-l4C)-glukuronihappoa, mikä osoittaa, ettei EGT siirrä glukuronihappoa.
5 Esimerkki V
Jotta osoitetaan, että muut baculovirukset sisältävät myös geenejä, joilla on oleellinen homologia AcMNPVin egt-geenille, OpMNPVin DNA eristetään ja pilkotaan erikseen EcoRI-, BamHI- ja Hindlll-resiriktioendonukleaaseilla. Nämä entsyymit pilkkovat viruksen DNA:n useisiin eri kokoisiin kappaleisiin, joiden sijainti 10 OpMNPV:n genomissa tunnetaan jo (Leisy et ai. (1984) J. Virol. 52:699). Southem-hybridisaatiot suoritetaan, kuten T. Maniatis ym. ovat selittäneet (1982) supra. Kappale AcMNPVin egt-geenin sisältä irrotetaan BCES-plasmidista EcoRI- ja Xbal-entsyymeillä (katso kuvio 1). Tämä kappale leimataan radioaktiiviseksi P:llä ja sitä käytetään koettimena tunnistettaessa mitä tahansa lähisukuisia jaksoja OpMNPVin 15 genomissa. Sopivissa olosuhteissa, kuten alalla ymmärretään, DNA-kappale sitoutuu toiseen DNA-kappaleeseen, jolla on samanlainen tai identtinen jakso. Täten AcMNPVin egt-koettimen pitäisi sitoutua nailonfiltterillä mihin tahansa OpMNPVin DNA-kappaleisiin, joilla on lähisukuisia DNA-jaksoja. Sitoutuneen koettimen sijainti voidaan tehdä näkyväksi valottamalla röntgenfilmiä filtterillä.
·.·. 20 Ensin egt-koetin hybridisoidaan nailonfiltterille helpoissa olosuhteissa (IM nat- riumkloridia, 0,3 M natriumsitraattia, 5 % dekstraanisulfaattia, 5 x Denhardtin « · iliuosta ja 0,25 % SDS 37°C:ssa). Tämä sallii koettimen hybridisoitua jaksoihin, jot-ka ovat suhteellisen kaukaista sukua koettimelle. Sitten hybridisaatio-olosuhteita ···* muutetaan ankarammiksi lisäyksittäin nostamalla hybridisaation lämpötilaa tai li- M · f
25 säämällä formamidia hybridisaatioliuokseen, kunnes havaitaan spesifisiä hybridi-.: : saatiojuovia. Hybridisaatio-olosuhteet kuviossa 4 ovat 1 M natriumkloridi, 0,3 M
natriumsitraatti, 5 % dekstraanisulfaatti, 5 x Denhardtin liuos ja 0,25 % SDS T: 68 °:ssa 15 tuntia. Sitten filtteri pestään kahdesti 15 min 0,3 M natriumkloridissa, 0,1 M natriumsitraatissa, 0,1 % SDSissä 68 °C:ssa. Kuvio 4 esittää, että AcMNPVin ‘ <. 30 egt-koetin sitoutuu ΟρΜΝΡVin DNAin erityisiin kappaleisiin, nimittäin EcoRI-kap- paleeseen B, BamHI-kappaleeseen Aja Hindlll-kappaleisiin N ja S. Huomaa, että OpMNPVin egt-geeni sijaitsee suhteessa samassa paikassa genomissa kuin ;: · AcMNPVin geeni (kuvio 5). Samoja menetelmiä voidaan soveltaa egtille homologis- ·:··· ten geenien tunnistamisessa muilla entomopatogeeneilla. On selvää, että erittäin 35 poikkeavia jaksoja tutkittaessa on välttämätöntä varmistaa EGT-aktiivisuus käyttämällä esimerkissä IV selitettyä koemenetelmää. Sitten tarvitaan genomin molekyyli- 24 104263 geneettinen analyysi, jotta EGT-entsyymiä koodaava geeni voidaan eristää käyttämällä alalla tunnettuja menetelmiä.
Vaihtoehtoisesti EGT-geeni voidaan myös löytää muista eliöistä käyttämällä esimerkissä IV selitettyä erityiskoetta ecdysteroidi-UDP-glukosyylitransferaasiaktiivi-5 suuden havaitsemiseksi. Tätä koetta käytetään entsyymin tunnistamisessa puhdistamisen aikana tavanomaisten biokemiallisten tekniikoiden avulla. Kun se on puhdistettu, määritetään osa EGT-proteiinin aminohappojaksosta. Tätä tietoa käytetään oligonukleotidikoettimen kehittämisessä, jota sitten käytetään egt-geenin paikallistamisessa genomiin.
10 Esimerkki VI
Ecdysteroidien hemolymfaattiset tiitterit vaihtelevat jaksollisesti säädellen sekä toukka-toukka- että toukka-kotelonahanvaihtoja ja koska glukoosikonjugaation epäillään tekevän ecdysteroidit tehottomiksi (Warren et ai. (1986) J. Liq. Chroma-togr. 9:1759; Thompson et ai. (1987) Arch. Insect Biochem. Physiol. 4:1; Thomp-15 son et al. (1988) Arch. Insect Biochem. Physiol. 7:157), on todennäköistä, että egt:n ilmeneminen AcMNPV-infektion aikana katkaisee infektoidun hyönteisen normaalin kehitystapahtumasarjan. Tällaisen hajaannuksen osoittamiseksi juuri nahkansa luoneet neljännen asteen toukkavaiheen S. frugiperda -toukat infektoidaan ruiskuttamalla niihin villikannan AcMNPV.tä tai vEGTZ.aa ja niitä tarkkaillaan päivittäin 20 kehityshäiriöiden havaitsemiseksi. Yhteen toukkalaumaan ruiskutetaan kudosvilje-.:.: lynestettä, jolloin saadaan negatiivinen kontrolli. Tämän kokeen tulokset esitetään I I 1 .: : seuraavassa taulukossa 4. Kaikki kudosviljelynesteellä ruiskutetut toukat (valeinfek- ' toidut) luovat nahkansa ja siirtyvät viidennen asteen toukkavaiheeseen, kuten on : : oletettua. Vain yksi villikannan viruksella infektoiduista kuudestatoista toukasta te- 25 kee tämän siirtymävaiheen. Päinvastoin kaikki mutantti-vEGTZdla infektoidut toukat käyvät läpi neljännen ja viidennen asteen toukkavaiheen välisen nahan luonnin.
, ·. Täten AcMNPV:n ilmentämä egt selvästi ja spesifisesti estää isännän nahan luomi- · !.. ^ sen. Molemmat infektoidut toukkaryhmät kuolevat myöhemmin virusinfektioon, mi kä osoittaa, että egt:n hajoaminen ei estä vEGTZ:aa tappamasta sen hyönteisisäntää.
• · · » · • ♦ •««
Taulukko 4 25 104263
Nahan luomisen estäminen AcMNPV-infektion avulla.
Virus Nahan luominen Kuolleisuus
Jäljitetty 16 O
Villi kanta 1 16 vEGTZ 16 16
Neljännen asteen toukkavaiheen S. frugjperda -toukat ruiskutetaan 1 x 105 pfu villi-5 kannan AcMNPV:llä tai vEGTZrlla 5 plrssa. Valeinfektoidut toukat ruiskutetaan 5 μΐ kudosviljelynestettä. Jokainen lauma sisältää 16 toukkaa, joita pidetään yllä keinotekoisella ruokavaliolla (R. L. Burton (1969) ARS-julkaisu, pp. 33-134), 28 °C:ssa 14 tuntia valossa ja 10 tuntia pimeässä. Toukkien nahan luomista tarkkaillaan päivittäin, ja kuolleisuus kirjataan 7 päivänä.
10 Samanlaisia tuloksia saadaan, kun toukat ruiskutetaan varhaisessa viidennen asteen toukkavaiheessa. Kun käytetään juuri nahkansa luoneita viidennen asteen toukka- vaiheen toukkia, villikannalla infektoiduissa toukissa ei havaita mitään merkkejä koteloitumisesta, kun taas suurin osa vEGTZ:lla infektoiduista toukista osoittaa useita käyttäytymismuutoksia (syömisen lopettaminen, kuljeskelu ja pyöriminen), v> 15 mikä on lähestyvän toukka-kotelo-nahanluomisen tunnusomainen piirre. Kuitenkin « « 1 ! kaikki viruksella infektoidut toukat kuolivat ennen koteloitumista. Nämä tiedot • · osoittavat, että AcMNPV-infektio estää hyönteistä luomasta nahkaansa ja koteloi- « « * tumasta. Lisäksi nämä tiedot osoittavat, että hyönteisten kehityksen katkaiseminen ..." johtuu egtrn ilmenemisestä.
Ml· « ·
20 Esimerkki VII
• ·
Villikannan (wt) AcMNPVrn ja vEGTZ:n in vivo -biokokeet paljastavat, että egt- v : geenin ilmeneminen pidentää aikaa, jonka infektoidut toukat käyttävät syömiseen ja • « · :: tämä egt.n hajottaminen parantaa viruksen tunnusomaisia piirteitä pestisidinä. Näis- . sä tutkimuksissa S, frugjperda -toukat ruiskutetaan joko villikannan AcMNPV:llä tai 25 vEGTZrlla varhaisessa neljännen asteen toukkavaiheessa. Vertailun vuoksi kont-rollitoukat ruiskutetaan kudosviljelyelatusaineella, joka ei sisällä virusta. Toukkien « ,.’,Γ painon nousu, merkit nahan luomisesta tai koteloitumisesta ja kuolleisuus tarkas- • ‘ ‘: tetaan päivittäin. Eri toukkaiyhmien keskimääräiset päivittäiset painon nousut sekä kuolleisuusprosentti esitetään graafisesti kuvioissa 6 ja 7 vastaavasti. Kontrollitou-30 kat kasvavat kohtalaisesti kahden ensimmäisen päivän ajan. Toisen päivän aikana ne kaikki luovat nahkansa ja siirtyvät 5. asteen toukkavaiheeseen. Sitten ne kasvavat 26 104263 dramaattisesti vielä kaksi päivää ennen kuin ne lopettavat syömisen valmistautuakseen koteloitumista varten. Vain 1 villikannan AcMNPV:llä infektoiduista 16 toukasta luo nahkansa, ja sen sijaan toukat kasvavat jatkuvasti kolmen päivän ajan infektion jälkeen. Tässä vaiheessa ne alkavat tulla sairaiksi, mutta toukat kuolevat 5 vasta 5. päivänä. Kaikki villikannan AcMNPV:llä infektoidut toukat ovat kuolleet 6. päivänä. Päinvastoin kaikki vEGTZilla infektoidut toukat käyvät läpi neljännen ja viidennen asteen toukkavaiheen välisen nahan luomisen ja tänä aikana ne lopettavat syömisen. Tämä selittää kasvun puuttumisen päivien 1 ja 2 välillä. Nahan luomisen jälkeen ne alkavat uudestaan syödä, mutta osoittavat merkkejä sairaudesta 3. päi-10 vään mennessä. Ne alkavat kuolla 4 päivää infektion jälkeen ja kaikki ovat kuolleet 5. päivään mennessä. AcMNPV-johdannaisella, jolta puuttuu toimiva egt, infektoidut toukat syövät vähemmän ja kuolevat nopeammin infektion jälkeen kuin toukat, jotka on infektoitu villikannan AcMNPViliä.
Nämä ilmiöt havaitaan vielä selvemmin, kun 5. asteen toukkavaiheen toukat infek-15 toidaan (kuviot 8 ja 9). Kuten on oletettua, kontrollitoukat kasvavat huomattavasti kahden päivän ajan ennen kuin ne lopettavat syömisen valmistautuakseen koteloitumista varten. Tätä syömisen lopettamista seuraa dramaattinen painon menetys. Villikannan AcMNP Viliä infektoidut toukat eivät osoita mitään merkkejä tällaisesta syömisen lopettamisesta; ne jatkavat syömistä ja niiden paino nousee vielä kaksi 20 päivää ennen kuin ne tulevat sairaiksi. Kuolleisuus on täydellinen vasta seitsemän ' päivää infektion jälkeen.
• ·
Yhteenvetona voidaan nähdä, että vEGTZilla infektoidut toukat, kuten kontrollit, ·*/ syövät vain kahden ensimmäisen päivän aikana infektion jälkeen. Tämän vaiheen ·..* jälkeen niiden paino putoaa dramaattisesti, kun ne valmistautuvat koteloitumista : ‘ ‘: 25 varten. Kuitenkaan yksikään näistä toukista ei koteloidu; ne osoittavat sairastumisen I i · • · merkkejä kolmanteen päivään mennessä ja kaikki ovat kuolleet kuusi päivää in fektion jälkeen.
Esimerkki VIII
I f · I Λ «
Verrataan vEGTZ- ja villikannan AcMNPV-infektion vaikutuksia juuri kuoriutu-30 neisiin ensimmäisen asteen toukkavaiheen S. frufiiperda -toukkiin. S. frugiperda e -jälkeläiselle syötetään ruokaa, joka sisältää vEGTZin tai villikannan AcMNPVin r polyhedristen inkluusiokappaleiden (PIBit) eri konsentraatioita, ja kuolleisuutta e tarkkaillaan päivittäin. Tulokset, jotka saatiin käyttämällä kahta eri annosta, esitetään kuvioissa 10 ja 11. Voidaan nähdä, että molemmilla annoksilla huomattava 35 määrä vEGTZilla infektoituja toukkia kuolee oleellisesti nopeammin kuin villikan- 27 104263 nan viruksella infektoituja toukkia. Yleensä yhdistelmäviruksella infektoidut toukat kuolevat kolmesta neljään päivää aikaisemmin kuin villikannalla infektoidut toukat. Tämä tulos antaa lisätukea sille, että tehottomaksi tehtyjä egt-geenejä sisältävät baculovirukset toimivat paremmin biologisina pestisideinä kuin villikannan baculo-5 virukset, joilla on ehjät egt-geenit.
Esimerkki IX
Jotta rakennettaisiin yhdistelmäviruksia, jotka ilmentävät protorasikotrooppista hormonia (PTTH), kloonataan PTTH:n geeni pEVmodXIV-siirtosijoitusplasmidiin, joka on selitetty US-patenttihakemussarjassa n:o 07/353,847, joka on jätetty 17. 10 toukokuuta 1989 ja joka sisällytetään tähän liitteenä. Tämä plasmidi sisältää jaksoja 5'- ja 3'-suuntaan AcMNPV:n polyhedriinigeenistä, joka välittää PTTH:n ilmentyvän geenin homologisen rekombinaation Egf-virukseen. Monikloonauspaikka sijaitsee tavallisessa paikassa polyhedriinin translaation aloituskohdassa, 3'-suuntaan LSXIV-muutetusta polyhedriinin promoottorista (Rankin et ai., Gene, 70:39 15 (1988)). Bombvx morin PTTH:n geeni irrotetaan pBc22k-C19-plasmidista (Kawakami et ai., Science, 247:1333, (1990)) pilkkomalla Hindlll-restriktioentsvv-millä. Kohesiiviset Hindlll-päät täytetään T4:n DNA-polymeraasilla, ja sitten plasmidi pilkotaan EcoRLllä. Kpnl:llä pilkotaan pEVmodXTV, jolloin syntyy yksijuos-teinen pää, joka täytetään kaksijuosteisiksi T4:n DNA-polymeraasilla, ja sitten 20 plasmidi pilkotaan EcoRIrllä. PTTH:n geenin sisältävä kappale kloonataan siirtosi-joitusplasmidin näihin kohtiin. Tulokseksi saadaan plasmidi, pEVPTTH, jossa : PTTH.n geeni sijaitsee välittömästi 3'-suuntaan LSXIV-muutetusta polyhedriinipro- moottorista.
• · · *···* PTTH:ta ilmentäviä yhdistelmäviruksia saadaan transfektoimalla pEVPTTH SF- * * 25 soluihin yhdessä vEGTDEL:n tai villikannan AcMNPV:n DNA:n kanssa. Rekombi- • · · : naatio viruksen DNA:ssa olevien polyhedriinijaksoja reunustavien alueiden ja pEVPTTH:ssa olevien PTTH:n geeniä reunustavien alueiden välillä johtaa poly-:T: hedriinigeenin korvautumiseen PTTH:lla. Virukset, joissa tämä rekombinaatio on tapahtunut, tunnistetaan niiden okluusio-negatiivisen ilmiasun avulla (Miller et ai., ' . 30 teoksessa Genetic Engineering, Principles and Methods, voi. 8, J. Setlow ja A. Hol- !..* laender, eds., Plenum Press N.Y., 1986, s. 277-298). Vastaavia yhdistelmäviruksia * ·; · * nimitetään vEGT'pTTH:ksi ja vWTPTTH:ksi.
# · · ” "; Menetelmä yhdistelmävirusten tuottamiseksi, jotka ilmentävät nuoruushormonieste- raasia, on samanlainen. Ensin Heliothis virescensin nuoruushormoniesteraasigeeni 35 (Hanzlik et ai. (1989) J. Biol. Chem. 264:12419) irrotetaan pJHE16B-plasmidista 28 104263 (Hammock et ai. (1990) Nature 344:458) pilkkomalla EcoRIillä ja Kpnl.llä· Plas-midivektori pEVmodXIV pilkotaan myös EcoRIillä ja Kpnl:llä ja nuoruushormoni-esteraasi-geenin sisältävä kappale liitetään näiden kohtien väliin. Täten pEVJHE sisältää nuoruushormoniesteraasigeeniä reunustavia polyhedriinigeenijaksoja. Yhdis-5 telmävirukset vEGTJHE ja vWTJHE saadaan transfektoimalla pEVJHE yhdessä vEGTZin tai villikannan AcMNPVin DNA:n kanssa vastaavasti, ja seulomalla ok-luusio-negatiiviset plakit.
Jotta rakennettaisiin eklosion-hormonia ilmentäviä yhdistelmäviruksia, Manduca sextan eklosion -hormonigeeni irrotetaan pF5-3-plasmidista (Horodyski et ai. (1989) 10 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:8123) pilkkomalla EcoRIillä ja Hpalillä. Kpnl:llä pilkotaan pEVmodXIV, jolloin syntyy yksijuosteinen pää, joka poistetaan T4:n DNA-polymeraasilla, ja sitten pilkotaan EcoRIillä. Kun eklosion-hormonigeenin sisältävä kappale liitetään plasmidivektoriin, saadaan yhdistelmä-pEVEH, jossa eklo-sion-hormonigeeni sijaitsee 3'-suuntaan LSXTV-muutetusta polyhedriinipromootto-15 rista. Kun tämä plasmidi transfektoidaan yhdessä vEGTZin tai vDA26Z:n DNAin kanssa, voidaan eristää vEGTeH- ja vDA26ZEH-yhdistelmävirukset vastaavasti. VDA26Z on yhdistelmävirus, jossa E. colin IacZ-geeni on liitetty DA26-geeniin (O'Reilly et ai., J. Gen. Virol., painossa). DA26-geenin toimintaa ei tunneta, ja vDA26Z on ilmiasultaan nahan luomisen suhteen villityyppinen. Koska vDA26Z-20 johdannaisilla on IacZ-geeni, ne synnyttävät sinisiä plakkeja, kun läsnä on X-gal:a.
Esimerkki X
« · « !!! Jotta arvioitaisiin näiden yhdistelmävirusten in vivo -vaikutukset, ruiskutettiin S.
frugiperda -toukat 2 x 105 pfu vEGTDELiä, vEGT'PTTHita, vWTPTTHita, tai sekä *···[ vEGTPTTHilla että vEGTJHEillä (jokaista 1 x 105 pfu) myöhäisessä 3. asteen * * 25 toukkavaiheessa tai varhaisessa 4. asteen toukkavaiheessa. Päivittäinen kuolleisuus- • · · v : prosentti esitetään taulukossa 5. Kun käytetään mitä tahansa EGT -virusta, infektoi dut hyönteiset jatkavat 4. asteen toukkavaiheen läpi ja osoittavat pääkotelon liuku-:T: mistä, mikä osoittaa lähestyvää nahan luontia 3. päivään mennessä. Kun infektoi- daan pelkästään vEGTPTTHilla tai vEGTPTTHilla yhdessä vEGT JHE.n kanssa, ‘ . 30 PTTHin ilmeneminen aiheuttaa infektoitujen hyönteisten nopean sairastumisen, ja ].. havaitaan merkittävää kuolleisuutta 4. päivään mennessä. Päinvastoin vEGTDELillä ‘ ' infektoiduista hyönteisistä huomattava määrä kuolee vasta 5. päivänä. Kuten on ole- tettua, vWTPTTHilla infektoidut hyönteiset eivät koskaan osoita merkkejä nahan •: · · * luomisesta, kun niiden pitäisi siirtyä 5. asteen toukkavaiheeseen. Ei havaita pääkote- 35 lon liukumista ja hyönteisistä kuolee huomattava määrä vasta 6. päivänä. Täten PTTHin ilmeneminen EGTin puuttuessa jouduttaa kuolinhetkeä, joka seuraa infek- 29 104263 tiota 1. päivänä, verrattuna vEGTDEL:iin. Nämä tiedot osoittavat baculovirusten pestisidiominaisuuksien parantumista, kun ne ilmentävät hyönteisen nahan luontiin vaikuttavia geenejä, ja tiedot osoittavat, että egt täytyy tehdä tehottomaksi, jotta tällaiset strategiat olisivat tehokkaita.
5 Taulukko S
Kuolleisuus-% Päivä
Virus 3. 4. 5. 6. 7. 8.
vEGTDEL 4,5 4,5 68,2 90,9 90,9 95,5 vWTPTTH 0 0 13,0 39,1 78,3 95,7 vEGT-PTTH 4,2 62,5 87,5 100,0
vEGT-PTTH
ja 8,7 60,9 91,3 95,7 100,0
vEGT-JHE
Esimerkki XI
Okluusio-positiivisten virusten, jotka ilmentävät hyönteisen kehitykseen vaikuttavia 10 heterologisia proteiineja, kehittäminen voidaan suorittaa seuraavan kaavan mukaan.
Ensin β-galaktosidaasia ilmentävä okluusio-negatiivinen EGT-virus rakennetaan :Y: seuraavasti, β-galaktosidaasientsyymiä koodaava E. colin IacZ-geeni kloonataan ; pSynVI-vektoriin, joka on selitetty US-patenttihakemussaijassa n:o 07/353 847, jo- • · · ka on jätetty 17. toukokuuta 1989. pSynVI' sisältää jaksoja 5'- ja 3-suuntaan .’··. 15 AcMNPV:n polyhedriinigeenistä ja näissä jaksoissa on monikloonauspaikka, joka • · sijaitsee välittömästi 3'-suuntaan synteettisestä, muutetusta polyhedriinipromootto- • · rista. IacZ-geeni irrotetaan pSKS105-plasmidista (Casadaban et ai. (1983) supra) *·* ’ pilkkomalla Pstlillä. Yksijuosteinen Pstl-pää poistetaan mungpavun nukleaasilla, ja plasmidi pilkotaan SstII:lla. pSynVI- pilkotaan EcoRVillä ja Sstllilla ja IacZ-geeni v * 20 kloonataan näihin kohtiin. Tulokseksi saadaan plasmidi, jota nimitetään pSynVI- • · · v : gal:ksi, ja se sisältää IacZ-geenin välittömästi 3'-suuntaan synteettisestä, muutetusta polyhedriinipromoottorista. pSynVI-gal transfektoidaan SF-soluihin yhdessä .···. vEGTDEL:n DNA:n kanssa, ja eristetään β-galaktosidaasia ilmentävät okluusio- • negatiiviset plakit, jolloin saadaan vEGT-SynVI-gal-virus.
25 Jotta rakennettaisiin PTTH:ta ilmentävä okluusio-positiivinen yhdistelmävirus, PTTH-geeni kloonataan pSpXTWI+X3-vektoriin.
30 104263
Jotta rakennettaisiin pSpXIWI+X3, ensin rakennetaan pSpXTVVT-välivaiheplas-midi. pSpLSXIWI+CAT (selitetty Yhdysvaltain patenttihakemussaijassa n: o 07/353 847, joka on jätetty 17. toukokuuta 1989) pilkotaan BglUilla ja päät täytetään DNA-polymeraasilla. Plasmidi pSynVI+wtp (selitetty Yhdysvaltain patenttiha-5 kemussarjassa n:o 07/353 847, joka on jätetty 17. toukokuuta 1989) pilkotaan EcoRV:llä ja Saclillä ja pieni EcoRV-SacI-kappale puhdistetaan. Kahden plasmidin kappaleet liitetään yhteen ja valikoidaan pSpXIWI+. Plasmidi pSpXIVVH- on sama kuin pSPLSXIWI+CAT paitsi että monikloonauspaikka Bglll-kohdasta Sacl-kohtaan on sama kuin pSynVI+wtp:n monikloonauspaikka. Jotta rakennettaisiin 10 monikloonauspaikka #3 (selitetty Yhdysvaltain patenttihakemussaijassa n: o 07/353 847, joka on jätetty 17. toukokuuta 1989) liitetään polylinkkeri pSpXI-WI+:n EcoRI-SacI-kohtien väliin. Monikloonauspaikan jakso pSPXIWI+X3:ssa fuusioidusta Bglll-paikasta Sacl-paikkaan on:
AGATCATC GAATTCTCGAG CTGCAGATCT GTCGACCCGGG AATAAA 15 GAGCTC
EcoRV/Bgl EcoRI-XhoI Pstl-Bgll Sall-Smal poly A
Sacl Tämä plasmidi sisältää ehjän polyhedriinigeenin villikannan polyhedriinipromoot-torin valvonnan alaisuudessa. Synteettinen, muutettu polyhedriinipromoottori sijait-20 see 5'-suuntaan polyhedriinigeenistä ja sen suunta on vastakkainen polyhedriinigee-nille. Monikloonauspaikka sijoitetaan siten, että se sallii geenien liittämisen, joita on . . määrä ilmentää synteettisen, muutetun polyhedriinipromoottorin valvonnan alai- suudessa. PTTH-geeni irrotetaan pBc22k-C19-plasmidista (Kawakami et ai. (1990) supra) pilkkomalla HindllLlla. Yksijuosteinen Hindlll-pää täytetään T4:n DNA-1 25 polymeraasilla ja plasmidi pilkotaan EcoRI.llä. pSpXIWI+X3 pilkotaan EcoRI:llä ·...· ja SmaT.llä ja PTTH-geeni kloonataan näihin kohtiin, jolloin saadaan pSpPTTH- plasmidi. Tässä plasmidissa PTTH-geeni on 3'-suuntaan synteettisestä, muutetusta polyhedriinipromoottorista, joka sijaitsee villikannan polyhedriinipromoottorin ja koodausjaksojen vieressä, joiden suunta on vastakkainen synteettiselle, muutetulle 30 polyhedriinipromoottorille. Sekä PTTH-että polyhedriinigeenejä reunustavat jaksot, . jotka ovat 5'- ja 3'-suuntaan polyhedriinigeenistä AcMNPVissä.
• ·:··: pSpPTTH transfektoidaan SF-soluihin yhdessä vEGT-SynVI-gal-DNA:n kanssa.
Rekombinaatio viruksen DNA:ssa olevien 5'- ja 3'-polyhedriinijaksojen ja pSpPTTH:ssa olevien PTTH- ja polyhedriinigeenejä reimustavien jaksojen välillä • · € 35 johtaa vEGT-SynVI-gal:n IacZ-geenin korvautumiseen pSpPTTH:n PTTH- ja poly- hedriinigeeneillä. Yhdistelmävirus vEGT-SpPTTH tunnistetaan okluusio-positiivi-sen, β-galaktosidaasi-negatiivisen ilmiasun perusteella.
31 104263
Jotta rakennettaisiin nuoruushormoniesteraasia ilmentävä okluusio-positiivinen virus, nuoruushormoniesteraasigeeni irrotetaan pJHE16B-plasmidista (Hammock et ai. (1990) supra) pilkkomalla KpnLllä, yksijuosteinen pää poistetaan T4:n DNA-polymeraasin avulla, ja pilkotaan EcoRI:llä. Sitten nuoruushormoniesteraasi-geeni 5 kloonataan pSpXIWI+X3-plasmidiin, joka on pilkottu EcoRLllä ja SmaLllä. Tulokseksi saadaan plasmidi pSpJHE, joka transfektoidaan yhdessä vEGT-SynVI-gal-DNA:n kanssa, jolloin syntyy vEGT-SpJHE-yhdistelmävirus. Tämä okluusio-positiivinen virus ilmentää nuoruushormoniesteraasia synteettisen, muutetun polyhedrii-nipromoottorin valvonnan alaisuudessa.
10 Samoin eklosionhormonigeeni irrotetaan pF5-3-plasmidista (Horodyski et ai. (1990) supra) pilkkomalla EcoRIllä ja Hpal:llä ia kloonataan pSpXIWI+X3:een, joka on pilkottu EcoRTllä ja SmaLllä. Tulokseksi saadaan plasmidi pSpEH, joka transfektoidaan yhdessä vEGT*SynVTgal-DNA:n kanssa, jolloin syntyy vEGTSpEH-yhdis-telmävirus.
15 Okluusio-positiiviset EGT-virukset, joita on lisäksi perinnöllisesti muunnettu ilmentämään nahan luomiseen vaikuttavaa proteiinia (hyönteisen peptidihormonia tai hyönteisen hormoneja tehottomaksi tekevää entsyymiä), vähentävät hyönteistoukkien ruokailua ja aiheuttavat infektoitujen hyönteistoukkien nopeamman kuoleman kuin villikannan baculovirukset tai baculovirukset, joita on perinnöllisesti muun-20 nettu tekemään tehottomaksi vain egt-geeni.
* 1 Koska esimerkin XI hyönteistorjuntavaikuttimet ovat kuoren sisällä, nämä virukset voidaan sisällyttää hyönteismyrkkynä tehokkaisiin, maatalouden kannalta sopiviin *;',' koostumuksiin, joita voidaan käyttää infektoituihin satolajikkeisiin. Näiden kuoren *···| sisään suljettujen viruspartikkeleiden nauttiminen johtaa näiden virusten lisääntymi- 25 seen pellolla ja hyönteistoquntavaikuttimen leviämiseen. Infektio aiheuttaa hyöntei- » · · : sen kuoleman ja siten suojelee satolajikkeita tuhohyönteisiltä.
On selvää, että edellä mainittu koskee vain tämän keksinnön suosittuja erityissuori- • · · tusmuotoja ja että siihen voidaan tehdä lukuisia muunnelmia tai muutoksia poikkea-\ matta keksinnön hengestä ja rajoista, kuten ilmaistaan liitteenä olevissa patentti- *:**: 30 vaatimuksissa.
« ·

Claims (36)

104263
1. Insektregleringsmedel, kännetecknat av att det innefattar ett baculovirus, väri en naturligt forekommande gen kodande ecdysteroid-UDP-glykosyltransferas är inaktiverat.
1. Hyönteistoijunta-aine, tunnettu siitä, että se sisältää baculoviruksen, jossa ecdysteroidi-UDP-glukosyylitransferaasientsyymiä koodaava luonnollisesti esiintyvä geeni on tehty tehottomaksi.
2. Insektregleringsmedel enligt patentkrav 1, kännetecknat av att nämnda gen är :':': en egt-gen. « « 4 « *···* 20 3. Insektregleringsmedel enligt patentkrav 1, kännetecknat av att nämnda bacu- ’** ' lovirus utgöres av ett nukleärt polyhedrosvirus. ««* • · · • · ·
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hyönteistorjunta-aine, tunnettu siitä, että mainittu geeni on egt-geeni.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hyönteistorjunta-aine, tunnettu siitä, että mainittu baculovirus on nukleaarinen polyhedroosivirus.
4. Insektregleringsmedel enligt patentkrav 3, kännetecknat av att nämnda nukleära polyhedrosvirus utväljes ur gruppen bestaende av Autographa califomica • · · nucleärt polyhedrosvirus och Orgyia pseudotsugata nukleärt polyhedrosvirus. • · ·
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen hyönteistorjunta-aine, tunnettu siitä, että 10 mainittu nukleaarinen polyhedroosivirus valitaan ryhmästä, joka koostuu Auto- grapha califomica nukleaarisesta polyhedroosiviruksesta ja Orgyia pseudotsugata nukleaarisesta polyhedroosiviruksesta.
5. Insektregleringsmedel enligt patentkrav 4, kännetecknat av att nämnda bacu lovirus innefattande en inaktiverad gen kodande ecdysteroid-UDP-glukosyltransferas utgöres av vEGTZ eller vEGTDEL (exempel II pä sida 20).
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen hyönteistoijunta-aine, tunnettu siitä, että mainittu baculovirus, joka sisältää ecdysteroidi-UDP-glukosyylitransferaasia koo- 15 daavan tehottomaksi tehdyn geenin, on vEGTZ tai vEGTDEL (esimerkki II sivulla 20).
6. Insektregleringsmedel enligt patentkrav 1, kännetecknat av att baculoviruset har modifierats ytterligare genom inlägg av ätminstone en heterolog gen, väri 104263 nämnda heterologa gen(er) kan uttryckas i insektceller infekterade med nämnda virus och väri nämnda gen(er) kodar ett protein som päverkar ecdysis.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hyönteistorjunta-aine, tunnettu siitä, että baculovirusta on edelleen muutettu liittämällä ainakin yksi heterologinen geeni, jota :Y: (joita) voidaan ilmentää mainitulla viruksella infektoiduissa hyönteissoluissa, ja : 20 jolloin mainittu geeni (geenit) koodaa (koodaavat) nahan luomiseen vaikuttavaa «· · proteiinia. ··· *···* 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen hyönteistorjunta-aine, tunnettu siitä, että mainittu heterologinen geeni valitaan geeneistä, jotka koodaavat proteiineja, jotka • · · : koostuvat protorasikotrooppisesta hormonista, eklosion-hormonista ja nuoruushor- 25 moniesteraasista. • · · • · · • · · I.. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen hyönteistoijunta-aine, tunnettu siitä, että \ * mainittu heterologinen geeni on protorasikotrooppinen hormoni. I I « 4 < ,···, 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen hyönteistorjunta-aine, tunnettu siitä, että se on vEGT'SpPTTH (esimerkki XI sivulla 30). • · · i · i • · · · :Υ; 30 10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen hyönteistorjunta-aine, tunnettu siitä, että • · mainittu heterologinen geeni on eklosion-hormoni. 104263 Λ Λ
7. Insektregleringsmedel enligt patentkrav 6, kännetecknat av att heterologa gen utväljes bland gener kodande proteiner bestäende av protoracikotropt hormon, eklo- 5 sionshormon och juvenilt hormonesteras.
8. Insektregleringsmedel enligt patentkrav 7, kännetecknat av att nämnda heterologa gen utgöres av protoracikotropt hormon.
9. Insektregleringsmedel enligt patentkrav 8, kännetecknat av att det utgöres av vEGTSpPTTH (exempel XI pä sidan 30).
10. Insektregleringsmedel enligt patentkrav 7, kännetecknat av att nämnda hetero loga gen utgöres av eklosionshormon.
11. Insektregleringsmedel enligt patentkrav 10, kännetecknat av att det utgöres av vEGT SpEH (exempel XI pä sidan 31).
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen hyönteistorjunta-aine, tunnettu siitä, että se on vEGTSpEH (esimerkki XI sivulla 31).
12. Insektregleringsmedel enligt patentkrav 7, kännetecknat av att nämnda hetero-15 loga gen utgöres av juvenilt hormonesteras.
12. Patenttivaatimuksen 7 mukainen hyönteistoijunta-aine, tunnettu siitä, että mainittu heterologinen geeni on nuoruushormoniesteraasi.
13. Insektregleringsmedel enligt patentkrav 12, kännetecknat av att det utgöres av vEGT SpJHE (exempel XI pä sidan 31). • · t I t
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen hyönteistoijunta-aine, tunnettu siitä, että se on vEGTSpJHE (esimerkki XI sivulla 31).
14. Förfarande för framställning av ett forbättrat insektregleringsmedel, känne- • · · ‘ · · ‘ tecknat av att det innefattar stegen: € · · • · « j·**; 20 (a) isolering av en gen som kodar ett protein som päverkar ecdysis; och ·»» • · ·· « [ ‘ (b) inforande av nämnda gen i ett baculovirus som ej uttrycker nämnda gen naturligt v : och som ej uttrycker ecdysteroid-UDP-glukosyltranferas.
14. Menetelmä parannetun hyönteistorjunta-aineen tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet: (a) nahan luomiseen vaikuttavaa proteiinia koodaavan geenin eristäminen; ja 10 (b) mainitun geenin liittäminen baculovirukseen, joka ei luonnostaan ilmennä mai nittua geeniä ja joka ei ilmennä ecdysteroidi-UDP-glukosyylitranferaasia.
15. Förfarande enligt patentkrav 14, kännetecknat av att nämnda gen kodar ett protein som utväljes ur gruppen av proteiner som päverkar ecdysis bestäende av 25 protoracikotropt hormon, eklosionshormon och juvenilt hormonesteras.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu geeni koodaa proteiinia, joka valitaan nahan luomiseen vaikuttavien proteiinien ryhmästä, joka koostuu protorasikotrooppisesta hormonista, eklosion-hormonista ja 15 nuoruushormoniesteraasista.
16. Förfarande enligt patentkrav 14, kännetecknat av att nämnda baculovirus ut- , ·, göres av ett nukleärt polyhedrosvirus.
16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu baculovirus on nukleaarinen polyhedroosivirus. • · a • t : 17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu nu- . ·: ·. kleaarinen polyhedroosivirus valitaan nukleaaristen polyhedroosivirusten ryhmästä, .···. 20 joka koostuu Autographa califomica nukleaarisesta polyhedroosiviruksesta ja Or^ gyia pseudotsugata nukleaarisesta polyhedroosiviruksesta. • » « · · : 18. Menetelmä parannetun hyönteistoijunta-aineen tuottamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä sisältää vaiheen, jossa ecdysteroidi-UDP-glukosyylitransferaasient-syymiä koodaava geeni tehdään tehottomaksi baculoviruksessa, jonka genomin 25 luonnollinen osa mainittu geeni on. :V: 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu : ' : baculovirus on nukleaarinen polyhedroosivirus. : 20. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Autographa . · · califomica nukleaarinen polyhedroosivirusjohdannainen, jossa oleva häviämä tekee 30 tehottomaksi ecdysteroidi-UDP-glukosyylitransferaasia koodavan geenin, eristetään sen jälkeen, kun mainittua virusta on kasvatettu useita kertoja hyönteissoluissa. M 104263
17. Förfarande enligt patentkrav 16, kännetecknat av att nämnda nukleära polyhedrosvirus utväljes ur gruppen av nukleära polyhedrosvirus bestäende av Auto- 104263 grapha califomica nukleärt polyhedrosvims och Premia pseudotsugata nukleärt po-lyhedrosvinis.
18. Förfarande för framställning av ett förbättrat insektregleringsmedel, känne-tecknat av att det innefattar steget av inaktivering av en gen som kodar ett ecdyste- 5 roid-UDP-glukosyltransferasenzym i ett baculovirus, vilken gen utgör en naturlig del av genomet hos nämnda baculovirus.
19. Förfarande enligt patentkrav 18, kännetecknat av att nämnda baculovirus ut-göres av ett nukleärt polyhedrosvims.
20. Förfarande enligt patentkrav 18, kännetecknat av att ett Autographa califomi-10 ca nukleärt polyhedrosvims med en utradering som inaktiverar genen som kodar ecdysteroid-UDP-glukosyltransferas isoleras efter seriepassage av nämnda virus i insektceller.
21. Förfarande enligt patentkrav 19, kännetecknat av att nämnda nukleära polyhedrosvims utväljes ur gruppen bestäende av Autographa califomica nucleärt poly- 15 hedrosvims och Orgyia pseudotsugata nukleärt polyhedrosvims.
21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu nukleaarinen polyhedroosivirus valitaan ryhmästä, joka koostuu Autographa cali-fomica nukleaarisesta polyhedroosiviruksesta ja Oravia pseudotsugata nukleaarises-ta polyhedroosiviruksesta.
22. Förfarande enligt patentkrav 21, kännetecknat av att nämnda nukleära polyhedrosvims utgöres av vEGTZ eller vEGTDEL (exempel II pä sidan 20).
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu nu kleaarinen polyhedroosivirus on vEGTZ tai vEGTDEL (esimerkki II sivulla 20).
23. Förfarande enligt patentkrav 18, kännetecknat av att det ytterligare innefattar • * · ' steget innefattande genetisk förändring av nämnda baculovirus genom inlägg av en 20 heterolog gen som kan uttryckas i en insektcell och vilken gen kodar ett protein som ’;',' paverkar ecdy sis. • « • · • · · ·;··: 24. Förfarande enligt patentkrav 23, kännetecknat av att nämnda andra gen utväl- :*]*: jes ur gruppen bestäende av gener som kodar protoracikotropt hormon, eklosion- hormon och juvenilt hormonesteras. • · « : 25 25. Förfarande för insektreglering, kännetecknat av att det innefattar steget av ex- • · · v : ponering av insekten för ett baculovims innehällande en gen kodande ett ecdys- ....: teroid-UDP-glukosyltransferasenzym, vilken gen har inaktiverats.
23. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää vaiheen, jossa perinnöllisesti muutetaan mainittua baculovirusta liittämällä heterologinen geeni, jota hyönteissolu pystyy ilmentämään ja joka koodaa nahan 10 luomiseen vaikuttavaa proteiinia.
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu toinen geeni valitaan ryhmästä, joka koostuu protorasikotrooppista hormonia, eklosion-hormonia ja nuoruushormoniesteraasia koodaavista geeneistä.
25. Menetelmä hyönteistorjuntaa varten, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheen, 15 jossa hyönteinen asetetaan alttiiksi baculovirukselle, joka sisältää ecdysteroidi- UDP-glukosyylitransferaasientsyymiä koodaavan geenin, joka on tehty tehottomaksi.
26. Förfarande enligt patentkrav 25, kännetecknat av att nämnda baculovims utväljes ur gruppen bestäende av Autographa califomica nucleärt polyhedrosvims och 30 Orgyia pseudotsugata nukleärt polyhedrosvims. 104263
26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu :V: baculovirus valitaan ryhmästä, joka koostuu Autographa califomica nukleaarisesta : :': 20 polyhedroosiviruksesta ja Orgyia pseudotsugata nukleaarisesta polyhedroosiviruk- •«· sesta. • · · *···* 27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu geeni on tehty tehottomaksi liittämällä heterologinen geeni, jota mainitulla viruksel- • · · v : la infektoitunut hyönteissolu pystyy ilmentämään ja joka koodaa nahan luomiseen 25 vaikuttavaa proteiinia. • · · • · · • · ·
27. Förfarande enligt patentkrav 26, kännetecknat av att nämnda gen har inaktive-rats genom inlägg av en heterolog gen som kan uttryckas i en insektcell infekterad med nämnda virus, vilken heterologa gen kodar ett protein som päverkar ecdysis.
28. Förfarande enligt patentkrav 27, kannetecknat av att nämnda andra gen utväl-5 jes ur gruppen bestäende av gener kodande protoracikotropt hormon, eklosion- hormon och juvenilt hormonesteras, vilka gener kan uttryckas i insektceller infekte-rade med nämnda virus.
28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu toi- • · · ’ \ * nen geeni valitaan ryhmästä, joka koostuu protorasikotrooppista hormonia, eklosion- * t ” hormonia ja nuoruushormoniesteraasia koodaavista geeneistä, joita mainitulla viruk- : * ‘ ‘: sella infektoidut hyönteissolut pystyvät ilmentämään.
29. Insekticid komposition, kännetecknad av att den innefattar en agrikulturellt lämplig bärare och ett baculovirus som har modifierats genetiskt sä att en naturligt 10 uppträdande gen som kodar ecdysteroid-UDP-glukosyltransferas är inaktiverad.
29. Hyönteismyrkkykoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää maatalouden kan- ‘: naita sopivan välittäjäaineen ja baculoviruksen, jota on perinnöllisesti muutettu si ten, että ecdysteroidi-UDP-glukosyylitransferaasia koodaava luonnollisesti esiintyvä geeni on tehty tehottomaksi. 104263
30. Insekticid komposition enligt patentkrav 29, kännetecknad av att den innefattar ett baculovirus som ytterligare har modifierats genetiskt sä att den uttrycker en heterolog gen som kodar ett protein som päverkar ecdysis.
30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen hyönteismyrkkykoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää baculoviruksen, jota on edelleen perinnöllisesti muutettu siten, että se ilmentää heterologista geeniä, joka koodaa nahan luomiseen vaikuttavaa proteiinia.
31. Insekticid komposition enligt patentkrav 29, kännetecknad av att nämnda 15 baculovirus utgöres av ett nukleärt polyhedrosvirus.
31. Patenttivaatimuksen 29 mukainen hyönteismyrkkykoostumus, tunnettu siitä, 5 että mainittu baculovirus on nukleaarinen polyhedroosivirus.
32. Insekticid komposition enligt patentkrav 31, kännetecknad av att nämnda nukleära polyhedrosvirus utväljes ur gruppen bestäende av Autogranha califor-nicasta och Orgyia pseudotsugata. • · III 4 » * .·, 33. Rekombinant-DNA-molekyl, kännetecknad av att den innefattar en nukleotid- • I I 20 sekvens för en gen som kodar ecdysteroid-UDP-glukosyltransferas, varvid nämnda nukleotidsekvens utgöres av sekvensen i tabell 1, frän cirka nukleotid 149 tili cirka • *···] nukleotid 1670, eller en funktionell ekvivalent sekvens därav uppvisande ätminstone * * cirka 70 % nukleotidsekvenshomologi med nämnda sekvens. • · • · ·
32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen hyönteismyrkkykoostumus, tunnettu siitä, että mainittu nukleaarinen polyhedroosivirus valitaan ryhmästä, joka koostuu Auto-grapha califomicasta ia Oravia pseudotsugatasta.
33. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää ecdysteroidi-UDP-10 glukosyylitransferaasia koodaavan geenin nukleotidijakson, jolloin mainittu nukleo- tidijakso on taulukon 1 jakso noin nukleotidista 149 noin nukleotidiin 1670 tai sen toiminnallinen ekvivalenttijakso, jolla on ainakin noin 70 % nukleotidijaksohomo-logia mainitun jakson kanssa.
34. Förfarande för framställning av vEGTZ, kännetecknat av att det innefattar 25 stegen: • · · • · · v : a) uppslutning av pUCBCPsB med restriktionsendonukleasen EcoRI och Xbal och ...·'· rening av erhället stort fragment; b) utsnittande av IacZ-genen ur pSKS104 med restriktionsendonukleasen EcoRI och Ahain: (I .· t « 104263 c) ligering av näihnda lacZ-een med nämnda Stora EcoRI-Xbal-fragment frän pUCBCPsB efter det att Xbal-änden gjorts trubbig med T4-DNA-polymeras under bildning av pEGTZ; d) samtransfektion av pEGTZ och AcMNPV i SF-celler; 5 e) identifiering av virala rekombinanter genom β-galaktosidasexpression; och f) rening av nämnda rekombinantvirus, vEGTZ.
34. Menetelmä vEGTZ:n valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet: 15 a) pUCBCPsB:n pilkkominen EcoRl- ja Xbal-restriktioendonukleaaseilla ja tulokseksi syntyneen suuren fragmentin puhdistaminen; b) IacZ-geenin irrottaminen pSKS104:stä EcoRl- ja Ahalll-restriktioendonukleaa-seilla; t I « • · c) mainitun IacZ-geenin ja mainitun pUCBCPsB:n suuren EcoRI-Xbal-fragmentin • I · v : 20 liittäminen yhteen sen jälkeen, kun Xbal-pää on tehty tylpäksi T4:n DNA-polyme- raasilla, jotta muodostettaisiin pEGTZ; • · d) pEGTZ.n ja AcMNPV:n transfektoiminen yhdessä SF-soluihin; • · · e) yhdistelmävirusten tunnistaminen β-galaktosidaasin ilmenemisen avulla; ja • · · • · · • · # λ. f) mainitun yhdistelmäviruksen, vEGTZ:n, puhdistaminen. • · *
35. Förfarande for framställning av vEGTDEL, kännetecknat av att det innefattar stegen: a) uppslutning av pUCBCPsB med restriktionsendonukleasen EcoRI och Xbal och 10 rening av ett erhället stort fragment; b) överföring av bägge ändar till trubbiga ändar hos nämnda stora DNA-fragment frän steg (a); c) ligering av nämnda stora DNA-fragment fran steg (b); d) samtransfektion av pEGTDEL och vEGTZ i SF-celler för att homolog rekombi-15 nation skall tillatas; e) identifiering av rekombinant vEGTDEL pä grund av dess oförmaga att uttrycka « I « ’ ! ( β-galaktosidas; och t ( * i I III v ' f) rening av nämnda rekombinanta vEGTDEL. « I I « * • ·
35. Menetelmä vEGTDELin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää vai heet: a) pUCBCPsB:n pilkkominen EcoRl- ja Xbal-restriktioendonukleaaseilla ja tulokseksi syntyneen suuren fragmentin puhdistaminen; 36 104263 b) vaiheen (a) mainitun suuren DNA-fragmentin molempien päiden tekeminen tylpiksi; c) vaiheen (b) mainitun suuren DNA-fragmentin liittäminen; d) pEGTDEL:n ja vEGTZ:n transfektoiminen yhdessä SF-soluihin, jotta sallittaisiin 5 homologinen rekombinaatio; e) yhdistelmä-vEGTDEL tunnistetaan siten, ettei se pysty ilmentämään β-galakto-sidaasia; ja f) mainitun yhdistelmä-vEGTDEL:n puhdistaminen.
36. Olennaisesti puhdas ecdysteroidi-UDP-glukosyylitransferaasi, tunnettu siitä, 10 että sillä on taulukon 1 aminohappojakso tai aminohappojakso, jolla on ainakin 70 % homologia taulukon 1 aminohappojakson kanssa ja jolla on mainittuun ecdys-teroidi-UDP-glykosyylitransferaasiin nähden ekvivalenttinen entsymaattinen aktiivisuus.
36. Väsentligen rent ecdysteroid-UDP-glukosyltransferas, kännetecknat av att det • · ... 20 uppvisar en aminosyrasekvens enligt tabell 1 eller en aminosyrasekvens med ätmins- tone 70 % homologi med aminosyrasekvensen enligt tabell 1 och uppvisande enzy-matisk aktivitet ekvivalent med nämnda ecdysteroid-UDP-glykosyltransferas. • · · « · · • · · • · · • · · , l
FI910968A 1989-06-29 1991-02-27 Baculoviruksen sisältävä hyönteistorjunta-aine, menetelmät sen tuottamiseksi ja yhdistelmä-DNA-molekyyli FI104263B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37395289 1989-06-29
US07/373,952 US5180581A (en) 1989-06-29 1989-06-29 Biological insect control agents and methods of use
US9003758 1990-06-29
PCT/US1990/003758 WO1991000014A1 (en) 1989-06-29 1990-06-29 Improved biological insect control agents and methods of use

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI910968A0 FI910968A0 (fi) 1991-02-27
FI104263B1 FI104263B1 (fi) 1999-12-15
FI104263B true FI104263B (fi) 1999-12-15

Family

ID=23474601

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI910968A FI104263B (fi) 1989-06-29 1991-02-27 Baculoviruksen sisältävä hyönteistorjunta-aine, menetelmät sen tuottamiseksi ja yhdistelmä-DNA-molekyyli

Country Status (26)

Country Link
US (2) US5180581A (fi)
EP (1) EP0432256B1 (fi)
JP (1) JP2968997B2 (fi)
KR (1) KR0165121B1 (fi)
AR (1) AR243604A1 (fi)
AU (1) AU627910B2 (fi)
BR (1) BR9006835A (fi)
CA (1) CA2033169C (fi)
DD (1) DD296311A5 (fi)
DE (1) DE69007952T2 (fi)
DK (1) DK35191D0 (fi)
EG (1) EG20419A (fi)
ES (1) ES2063370T3 (fi)
FI (1) FI104263B (fi)
GE (1) GEP19991540B (fi)
HU (1) HU217846B (fi)
IE (1) IE62564B1 (fi)
IL (1) IL94820A (fi)
LT (1) LT3807B (fi)
LV (1) LV10996B (fi)
NO (1) NO308691B1 (fi)
NZ (1) NZ234115A (fi)
PT (1) PT94557B (fi)
RU (1) RU2099420C1 (fi)
WO (1) WO1991000014A1 (fi)
ZA (1) ZA905123B (fi)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5674485A (en) * 1988-11-01 1997-10-07 The Regents Of The University Of California Insect diagnostic and control compositions with truncated JHE
US5643776A (en) * 1988-11-01 1997-07-01 The Regents Of The University Of California Insect diagnostic and control compositions
US6689356B1 (en) 1988-12-19 2004-02-10 The Regents Of The Unviersity Of California Recombinant baculoviruses producing insect toxins
GB9106185D0 (en) * 1991-03-22 1991-05-08 Wellcome Found Biological control agents
JPH10507065A (ja) 1994-07-05 1998-07-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 遺伝子工学作出生物殺虫剤による昆虫の制御方法
PL184944B1 (pl) * 1994-07-27 2003-01-31 American Cyanamid Co Kompozycja owadobójcza do zwalczania owadów z rzędu Lepidoptera
US6156309A (en) * 1994-07-27 2000-12-05 University Of Georgia Research Foundation Insecticidal compositions and methods
US5662897A (en) * 1994-07-27 1997-09-02 U. Of Ga Research Foundation Insect viruses, sequences, insecticidal compositions and methods of use
US5639454A (en) * 1995-04-06 1997-06-17 Board Of Trustees Operating Michigan State University Recombinant baculovirus with broad host range
US5756340A (en) * 1995-05-08 1998-05-26 The Regents Of The University Of California Insect control with multiple toxins
US5716831A (en) * 1995-05-24 1998-02-10 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method and test kit for detecting insecticide resistance
US5925346A (en) * 1995-06-01 1999-07-20 Queen's University At Kingston Antisense strategy for the production of species specific viral insecticides
US5753249A (en) 1995-12-08 1998-05-19 Mycogen Corporation Materials and methods for pest control
US6596271B2 (en) 1996-07-12 2003-07-22 The Regents Of The University Of California Insect control method with genetically engineered biopesticides
US5882913A (en) * 1997-08-07 1999-03-16 The United States Of American As Represented By The Secretary Of Agriculture Strain of gypsy moth virus with enhanced polyhedra and budded virus production
US5853982A (en) * 1997-10-03 1998-12-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of isolating strains of the Lymantria dispar nuclear polyhedrosis virus
AUPP135698A0 (en) 1998-01-15 1998-02-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Insectical modalities
US6200561B1 (en) 1998-12-11 2001-03-13 BILIMORIA SHäN L. Use of viral proteins for controlling the cotton boll weevil and other insect pests
BR0212523A2 (pt) 2001-08-14 2014-04-15 Sentigen Corp Ácido nucléico, polipeptídeo purificado e seus usos
PE20090959A1 (es) * 2007-08-07 2009-07-20 Educational Foundation Jichi Med Univ Vector de transferencia, baculovirus recombinante y composiciones que lo comprenden
JP2010273676A (ja) * 2009-04-28 2010-12-09 Univ Of Tokyo 転移基で修飾された基質の製造方法
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US9737592B1 (en) 2014-02-14 2017-08-22 David Gordon Bermudes Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1441094A (en) * 1972-11-08 1976-06-30 Shell Int Research Cell culture
JPH0615447B2 (ja) * 1985-12-02 1994-03-02 進 前田 ウイルスを利用した殺虫剤及びその調製法
CA1336120C (en) * 1988-04-06 1995-06-27 Robert R. Granados Baculovirus proteins and viral pesticides containing same
GB0115243D0 (en) 2001-06-21 2001-08-15 Kvaerner Process Tech Ltd Method

Also Published As

Publication number Publication date
CA2033169A1 (en) 1990-12-30
BR9006835A (pt) 1991-08-06
LTIP1581A (en) 1995-06-26
EP0432256A1 (en) 1991-06-19
NO910796L (no) 1991-02-27
IL94820A0 (en) 1991-04-15
EP0432256B1 (en) 1994-04-06
US5352451A (en) 1994-10-04
LV10996B (en) 1996-10-20
KR920700545A (ko) 1992-08-10
AR243604A1 (es) 1993-08-31
IE62564B1 (en) 1995-02-08
PT94557A (pt) 1991-02-08
PT94557B (pt) 1997-02-28
NZ234115A (en) 1991-09-25
HU217846B (hu) 2000-04-28
ES2063370T3 (es) 1995-01-01
FI910968A0 (fi) 1991-02-27
EG20419A (en) 1999-04-29
NO308691B1 (no) 2000-10-16
CA2033169C (en) 1999-11-23
DE69007952D1 (de) 1994-05-11
FI104263B1 (fi) 1999-12-15
HU905629D0 (en) 1991-10-28
AU627910B2 (en) 1992-09-03
DK35191A (da) 1991-02-28
JP2968997B2 (ja) 1999-11-02
JPH04500611A (ja) 1992-02-06
DK35191D0 (da) 1991-02-28
RU2099420C1 (ru) 1997-12-20
LT3807B (en) 1996-03-25
IL94820A (en) 1997-04-15
HUT58475A (en) 1992-03-30
IE902391L (en) 1990-12-29
WO1991000014A1 (en) 1991-01-10
LV10996A (lv) 1996-02-20
KR0165121B1 (ko) 1999-01-15
AU5958890A (en) 1991-01-17
IE902391A1 (en) 1991-06-19
DE69007952T2 (de) 1994-10-13
DD296311A5 (de) 1991-11-28
NO910796D0 (no) 1991-02-27
GEP19991540B (en) 1999-03-05
ZA905123B (en) 1991-05-29
US5180581A (en) 1993-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI104263B (fi) Baculoviruksen sisältävä hyönteistorjunta-aine, menetelmät sen tuottamiseksi ja yhdistelmä-DNA-molekyyli
KR100226241B1 (ko) 곤충-특이 마비성 신경독 유전자를 포함하는 재조합 dna 분자 및 그 신경독의 제조방법
AU692290B2 (en) Insect viruses, sequences, insecticidal compositions and methods of use
CA2331853A1 (en) Recombinant baculovirus-based insecticides
AU743526B2 (en) Transgenic virus
US6156309A (en) Insecticidal compositions and methods
JPH10503650A (ja) 強化された昆虫防除のための遺伝子的に修飾された昆虫ウイルス類と化学的および生物学的殺虫剤類の混合物
SK282444B6 (sk) Hmyzí vírus so zníženou schopnosťou šíriť sa v životnom prostredí z hostiteľa na hostiteľa a spôsob jeho výroby
AU720082B2 (en) Heterologous signal sequences for secretion of insect controlling toxins
MXPA00010981A (es) Insecticidas con base en basculovirus recombinantes
MXPA98000646A (en) Transgen virus