JPH02502873A - ヘリオティス発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 へりオティス発現系 １、−序一 本発明はへりオティス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）ポリヘトリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒ ｉｎ）プロモーターによって制御される異種遺伝子の発現を指令し得るベクター ／宿主細胞系に関する０本発明の系を使用して、興味のある異種遺伝子を非融合 ペプチド若しくは蛋白質、融合蛋白質または組換え閉塞体（ｏｃｃｕｌｓｉｏｎ 　ｂｏｄｙ）として発現させることができる。異種遺伝子産生物を含有する組換 え閉塞体はワクチンまたは殺虫剤製剤として特に有用でバクロウィルスは昆虫お よび成る種の甲殻類動物に対して病原性である一群のウィルスである。これらウ ィルス粒子はリポ蛋白質膜で取り囲まれた桿状ヌクレオカプシドを含有する。形 態学的に異なる２つの形態のバクロウィルス、即ち非閉塞ウィルスおよび閉塞ウ ィルスは感染細胞によって産生される。非閉塞ウィルスは感染後初期に合成され る；ヌクレオカプシドが核内に集まりプラズマ膜を通した出芽によってエンベロ ープを獲得して細胞外ウィルスになる。閉塞バクロウィルスでは、ウィルス粒子 は、多角体（ｐｏｌ　１ｈｅｄｒａｎ）または閉塞体と呼ばれる大きな蛋白質、 内の核（ｎｕｃｌｅｕｓ）の中に取り込まれる。 バクロウィルスはバクロウィルス科およびバクロウィルス属のメンバーである。 この属は３つの亜群（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）のウィルス、即ち核多角体ウィルス（ ＮＰＶ）、顆粒症ウィルスおよび非閉塞ウィルスからなっている。 ＮＰＶは、形状が多面体から立方体で直径が１〜１５μ鋼である閉塞体を有して いる。リボ蛋白質膜はエンベロープ当たり１個のヌクレオカプシド（ＳＮＰＶ） かまたは多数（３９個まで）のヌクレオカプシド（ＭＮＰＶ）かのどちらかを含 有している。　　１００個までのウィルス粒子が１個の閉塞体内に取り込まれる ことができる（Ｖｌａｋ、Ｊ、Ｍ、おＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐｐ、 ４８９−５４２）　ｅ　この群のウィルスの例には主立上ｌ立１ｘ−左ユヱヱ亜 三左（ｂ豆肛鉦厘ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　　ＮＰＶ　（ＡｃＮＰＶ）、へ’　 オー　　ス（’　　（Ｈｅｌｉ−ｏｔｈｉｓ　　ｉ？１ｌＮＰＶ　（ＨｚＮＰＶ ）および、ｆ７？Ｘ−１−ユ（Ｂ９！！ｊｕＸｓｏｒｔ）　ＮＰＶ　（ＢｍＮＰ Ｖ）がある、全ライスゲノムのＤＮＡ配列の比較によってＨｚＳＮＰＶとＡｃＭ ＮＰＶとの間には２％以下の相同性が明らかにされている　が、一方種々のＭＮ ＰＶ間の比較では更に大きな相同性が示されている（Ｓｇｓｉｔｈ、　Ｇ、Ｅ、 およびＳｕｍｓｅｒｓ＋　Ｍ、Ｄ、＋１９８２ｔＶｉｒｏｌ、　１２３：３９３ −４０６）　、　ＨｚＳＮＰνは殺虫剤として使用するために現在米国で製造さ れ商品名エルカ−（Ｅｌｃａｒ、商標）で販売されている。 顆粒症ウィルスは大きさが０．１〜１μ讃の円形乃至楕円形の閉塞体を有してい る。閉塞体は各々１つの膜で覆われた１個のヌクレオカプシドを含有している（ Ｖｌａｋ、Ｊ、Ｍ、およびＧ、Ｆ、Ｒｏｈｒｍａｎｎ＋上記）。 バクロウィルスは、６０〜ｌｌ０ＸＩＯ’ダルトンの範囲にある二本鎖の環状Ｄ ＮＡ分子を含んでいる。バクロウィルス科のプロトタイプはＡｃＮＰＶであり、 これは約８２〜８８Ｘ１０’ダルトンのゲノムを有している（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｌ 、に、。 １９８Ｌ　Ａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉ ｎｅｅｒｉｎｇ　１ｎＩｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ、Ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅ ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｒａｅ ｇｅｒ　Ｐ’ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋ｐｐ、２０３−２２４） 。 ＡｃＮＰＶは感染昆虫細胞の核内で複製する。ウィルスの２つの形態、即ち閉塞 および非閉塞ウィルス粒子は野生型ＡｃＮＰＶ感染の結果として作製される。 ウィルスのライフサイクルにおける閉塞体の明らかな役割は、ウィルスを不活性 化環境ファクターから保護することによって宿主昆虫の外部で安定に保つことで ある。経口摂取された閉塞体は牛腸のアルカリ性環境で溶解して、ウィルス粒子 を放出し、感染がもう１巡行われる。閉塞体は主としてポリヘトリンとして知ら れている約２９，０００ダルトンの分子量の１個のポリペプチドからなっている （Ｖｌａｋ、Ｊ、Ｍ、およびＲｏｈｒｓ＋ａｎｎ、　Ｇ。 Ｆ、、上＠　；　Ｍｉｌｌｅｒ、Ｌ、に、、韮）　、この蛋白質はウィルス粒子 の周囲に不完全結晶格子を形成し、そしてマルチマー（ｏ＋ｕｌｔｉｍｅｒ）と して存在する。ポリヘトリンはウィルス複製の後、ウィルス怒染中に非常に多量 に産生される。遺伝子増幅の証明は全（ない（Ｔｊｉａ、　Ｓ、Ｔ。 等、　１９７９．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　９９：３９９−４０９）が、ポリへドリ ンプロモーターは非常に効率的なプロモーターである可能性がある。 仝ユ土元土ム亙ヱ５ＮＰＶのプラーク精製分離株は特徴が決定されており、そし て１つのこのような分離株がクローン化されている（Ｃｏｒｓａｒｏ、Ｂ、Ｇ、 およびＦｒａｓｅｒ。 Ｍ、Ｊ、＋　１９８５＋　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　１ｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ 　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ。 ＸＶＩＩＩ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、　Ａｕｇｕｓｔ　４−８＋１９８ ５＋　０ｎｔａｒｉｏ＋Ｃａｎａｄａ、Ａｂｓｔｒａｃｔ　７５）＊２．２．困 ユニ」五ｌ 閉塞体（ＯＢ）は、ウィルス粒子の囲わりに不完全結晶。 格子を形成する約３０キロダルトンのポリへドリンボリペプチドのマルチマーと して存在する（Ｔｉｎｓｌｅｙ、Ｔ、Ｗ。 およびＨａｒｒａｐ、に、Ａ、＋１９７８＋　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｖ ｉｒｏｌｏｇｙ。 Ｖｏｌ、１２＋　Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ、　Ｈ，およびＲ，Ｗａｇｎ ｅｒ（ｉｌ）。 Ｐ１ｅｎｕ＋ｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋｓＰｐ−１−１０１）　、　 ＯＢのアルカリ溶解後、１１８〜１３Ｓの沈陣係数を有するポリヘトリン粒子（ ２００〜３７４キロダルトン）が単離される（Ｂｅｒｇｏｌｄ、Ｇ。 ■、およびＳｃｈｒａｍｍ、　Ｇ、＋１９４２．　Ｂｉｏｌ、Ｚｅｎｔｒａｌｂ ｌａｔｔ、６２：１２２；　Ｂｅｒｇｏｌｄ、Ｇ、Ｈ，，１９４Ｂ、　Ｚｅｉｔ ｓｃｈｒ、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ、　３ｂ：３３８；Ｈａｒｒａｐ、に、Ａ、 、１９７２＋　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５０：１２４　　；　Ｅｐｐｓｔｅｉｍ。 Ｄ、Ａ、およｉ　Ｔｈｏｍａ、Ｊ、Ａ、＋１９７７、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　 １６７：３２Ｉ　；Ｒｏｈｒ＠ａｎｎ、Ｇ、Ｆ、＋１９７７、　Ｂｔｏｃｈｅ＋ ｓ、　１６：１６３１）　＊　Ｘ線回折研究によって、ポリヘトリンは本体主体 の立方格子状で結晶化していることが決定されている（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ＋Ａ、 ＋１９７４、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏ、１１ニア）　ｅポリ、ヘト リン結晶の電子顕微鏡分析によって、サブユニットの配列が６稜の結節ユニット と一致していることが示唆されている（Ｈａｒｒａｐ、　Ｋ、Ａ、＋１９７２． 　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５０：１２４）。ジメチルスベリミデートを用いたポリヘ トリンの架橋分析によって１２量体構造が示される。それ故、結節ユニットの各 校は２つのサブユニットから構成されている（Ｓｃｈａｒｎ−ｈｏｒｓｔ、Ｄ、 Ｗ、およびＷｅａｖｅｒ、Ｒ，Ｆ、＋１９８０．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１０２　： に形成されることを示唆している。このことは不完全結晶格子が個々のモノマー の非共有結合性の、イオン性分子間会合によって維持されていることを示してい る。ジスルフィド結合形成はマルチマー形態の４次構造にも影響を与えることが ある。 バクロウィルス閉塞体蛋白質はＮＰＶではポリヘトリンと、そしてＧＶではグラ ヌリンと称されてきた。しかしながら、最近の研究によって、ポリヘトリンおよ びグラヌリンは全て関連蛋白質の１つの群に属していることが示されている（Ｒ ｏｈｒ＋ｎａｎｎ、Ｇ、Ｆ、等、　１９８１．　Ｊ、Ｍｏｌ。 Ｅｖｏｌ、１７：３２９；　Ｓｏ＋ｉｔｈ、　Ｇ、Ｅ、およびＳｕｍａ＋ｅｒｓ ＋Ｍ、Ｄ、＋１９８１＋Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　３９：１２５）。トリプシン消化ペ プチド分析によってＭＮＰＶ、　５ＮＰＶおよびＧＶから得られたポリヘトリン が多くの共通の断片を有していることが示されている（ＳｕａｏｎｅｒｓＪ、Ｄ 、およびＳｍ１ｔｈ、Ｇ、Ｅ、＋１９７５．Ｉｎｔｅｒ−ｖｉｒｏ−１ｏｇｙ　 ６：１６８−１８０；Ｍａｒｕｎｉａｋ、Ｊ、Ｅ、およびＳＩＪｌｌ１ｍｅｒｓ ＋Ｍ−Ｄ−＋１９７８、　Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ、Ｐａｔｈｏｌ、３２：１９ ６）。このような配列の類似性は種々のＮＰＶおよびＧＶから得られたポリヘト リンのＮ−末端アミノ酸配列中に見ることができる（Ｖｌａｋ。 Ｊ、Ｍ、およびＲｏｈｒｍａｎｎ、Ｇ、Ｆ、＋１９８５＋Ｔｈｅ　Ｎａｔｕｒｅ 　ｏｆ　Ｐｏ１ｙ−ｈｅｄｒｉｎ、Ｉｎ　Ｖｉｒａｌ　Ｉｎ５ｅｃｔｉｃｉｄｅ ｓ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ。 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋ｐｐ、４８９−５４２）。成るポリヘトリンは 他のポリヘトリンよりグラヌリンに一層密接に関連していることが見い出されて いる（Ｒｏｈｒｍａｎｎ、Ｇ、Ｆ、等、上記）、かくして、以下では、ポリヘト リンという用語は関連蛋白質の全てのグループを指すものとして使用する。 ６個の鱗翅類ＮＰＶポリヘトリン（Ｖｌａｋ、Ｊ、Ｍ、およびＲｏｈｒｍａｎｎ 、Ｃ，Ｆ、＋上記、　ｐｐ、５０６−５０８）のアミノ酸配列の比較によって、 ８０〜９０％のアミノ酸がこれらの蛋白質内に保持されていることが明らかにさ れている。配列保持に基づいて区別し得る数個の領域がある。例えば、アミノ酸 １５〜１６および５８〜８６が高度に保持されている。 アミノ酸３８〜５５間の領域は親水性であって非常に可変性である。その他の可 変性部位にはＮ−末端領域、アミノ酸１２０〜１２７．１４５〜１４８．１６５ ．１９５および２１６がある（Ｖｌａｋ、Ｊ、Ｍ、およびＲｏｈｒｍａｎｎ＋　 Ｇ、Ｆ４）ｅ２．３．　　　　えＤＮＡ′お　びバ　ロ　イルス蛋白質を産生ず る組換えＤＮＡ技術の使用は分子クローニングおよび所望の蛋白質をコードして いる遺伝情報の適当なベクターでの発現に係わっている。バクロウィルスは組換 え体ＤＮＡベクター系として有用である。 何故なら、これらは二本鎖ＤＮＡ複製ユニットであり、大量の外来ＤＮＡ　（２ ０メガダルトンまたはそれ以上）を挿入することができ、そしてこの外来ＤＮＡ は非必須機能を有する遺伝子をコントロールして細胞培養液中で増殖させる少な くとも１つの強いプロモーター（ポリヘトリン）をもたらし、このプロモーター を外来ＤＮＡによる置換または挿入に利用できるからである（Ｍｉｌｌｅｒ。 Ｌ、）［、＋１９８１＋Ａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔｉ ｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｉｎ　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ、　Ｉｎ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃ　Ｅｎｇ３ｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅＰｌａｔ　５ｃｉｅｎｃｅｓ ＋Ｐｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、２０３− ２２４；Ｖｌａｋ、Ｊ、Ｍ、およびＲｏｈｒｍａｎｎ＋　Ｇ、　Ｆ、　＋　１９ ８５＋　ＴｈｅＮａｔｕｒｅｏｆ　Ｐｏ１ｙｈｅｄｒｉｎ、　Ｉｎ　Ｖｉｒａｌ 　Ｉｎ５ｅｃｔｉｃｉｄｅｓ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏ−ｇｉｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏ ｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ、４８９−５４２）、バクロウィルス 系を使用する組換え蛋白質の産生方法は記載されている（Ｐｅｎｎｏｃｋ等、１ ９８４Ｊｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　４　：　３９９：Ｓａ＋ｉｔｈ等、１９ ８３．Ｊ、Ｖｏｒｏｌ、　４６：、５８４）、バクロウィルスベクターが構築さ れるとウィルスゲノムに挿入されている外来ＤＮ’Ａが発現する。適当な宿主に 導入することによって、外来蛋白質が産生される。 組換えバクロウィルス内での外来ＤＮＡの発現には、蛋白質をコードする配列が プロモーターのコントロール下にあるように、外来蛋白質をコードするＤＮＡ配 列にバクロウィルス配列を連結する必要がある。挿入ベクターとも呼ばれるプラ スミドベクターはキメラ遺伝子をＡｃＮＰＶに挿入するように構築されてきた。 このような挿入ベクターの１例は、（ａ）転写開始部位を有するＡｃＮＰＶプロ モーター、（ロ）転写開始部位の下流に位置する数個の特をの制限エンドヌクレ アーゼ認識部位、これは外来ＤＮＡ断片を挿入するために使用することができる 、（Ｃ）　ＡｃＮＰＶ　ＤＮＡ配列（例えばポリヘトリン遺伝子）、これはプロ モーターおよびクローニング部位の側面に位置しそしてウィルスゲノムの相同の 非必須領域へのキメラ遺伝子の挿入を指令する、そして（ロ）大腸菌（Ｅ、ｃｏ ｌｉ）での複製および選択用の細菌起源の複製および抗生物質耐性のマーカー、 から構築されている。 このようなベクターの例はミャモト（Ｍｉｙａｍｏｔｏ）等によって記載されて いる（１９８５．Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　５：２８６０）。 組換えバクロウィルスは、バクロウィルスＤＮＡと共に外来遺伝子含有組換え体 細菌プラスミドを用いて細胞のコトランスフェクションによって作製されている 。 外来遺伝子は感染細胞内での相同組換えによってウィルスゲノムの非必須ポリヘ トリン遺伝子に挿入されるかまたはこれを置換する。得られた組換え体プラーク を視覚的にスクリーニングして機能性ポリヘトリン遺伝子の欠失から生じる閉塞 体の欠落を確認できる。感染細胞はまた、免疫学的技術、ＤＮＡプラークハイブ リダイゼーションまたは後で単離した組換えウィルスに対する遺伝子選択を使用 してスクリーニングすることができる。これらのバクロウィルスの組換え体はそ の必須の機能および感染力を保持している。 外来遺伝子発現は酵素的または免疫学的アッセイ（例えば、免疫沈降法、ラジオ 免疫分析またはイムノプロット法）によって検出することができる。高い発現レ ベルは強いプロモーターを使用することによってかまたは唯一つの遺伝子の多数 のコピーをクローニングすることによって得ることができる。 幾つかの外来蛋白質がオウトグラファ系で成功裡に発現されている。ヒトインタ ーロイキン２（Ｓ−ｉｔｈ等。 １９８５、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：８ ４０４−８４０８）、ヒトｃ−ｍｙｃ（Ｍｉｙａｍｏｔｏ等、　１９８５．　Ｍ ｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、５：２８６０−２８６５）、細菌性ベーターガラク トシダーゼ（Ｐｅｎｎｏｃｋ等。 １９８４、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　４：３９９−４０６）　、インフ ルエンザウィルス血球凝集素（Ｋｕｒｏｄａ等、　１９８６．　ＥＭＢＯ５：１ ３５９−１３６５）およびヒトベーターインターフェロン（Ｓ＊ｉ　ｔｂ等。 １９８３、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　３：２１５６−２１６５）は全て 、組換えＡｃＮＰＶ発現ベクター中のポリへドリンプロモーターのコントロール 下昆虫細胞で発現した。ヒトアルファーインターフェロンはＢ＋ＰＮＶのポリへ ドリンプロモーターに連結することによってカイコ中で発現した（Ｍａｅｄａ等 、　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　３１５：５９２−５９４）　 、スミス（Ｓ＋＋＋１ｔｈ）およびサマーズ（Ｓｕｎ＋ｍｅｒｓ）　（ヨーロッ パ特許出願公開第０１２７８３９号、１９８４年１２月１２日）は組換えバクロ ウィルス発現ベクターの作製方法を提案し、そしてポリへドリンプロモーターの コントロール下でヒトベーターインターフェロンおよびヒトインターロイキン２ を発現させるために組換えＡｃＮＰＶベクターの使用を報多数の方法がウィルス 感染の予防および治療用に現在使用されている。これらの方法には、活性の免疫 応答を引き出すワクチン、化学療法剤での治療およびインターフェロン治療があ る。 ワクチンを製造する伝統的な方法には不活性化または弱毒化したウィルスの使用 がある。ウィルスの不活性化によってウィルスは生物学的作用としては無害とな るが、その免疫原性は破壊されない、これらの「死滅」ウィルス粒子を宿主に注 入すると、将来の生きたウィルスによる感染を中和化し得る免疫応答が誘導され る。しかしながら、死滅ワクチンを使用する（不活性化したウィルスを使用する ）際の主な懸念は全てのウィルス粒子を不活性化し得ないことである。この不活 性化が達成されるときであっても、死滅ウィルスは宿主中で増殖しないので、得 られた免疫はしばしば持続が短かくそして通常追加免疫化する必要がある。最後 に、不活性化過程はウィルス蛋白質を変化させて免疫原としての効果をより弱（ することがある。 病原性減弱（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）とは疾病をひき起こす能力を本質的に喪 失したウィルス株の産生をいう。これを達成する１つの方法はウィルスを通常で ない生育条件および／または頻繁な細胞継代培養に付すことである０次いで、毒 性を喪失しているが依然として免疫応答を誘導し得るウィルスの突然変異株を選 択する０弱毒化ウィルスは、宿主内で実際に複製すると、一般に良好な免疫原を もたらしそして長期に持続する免疫性を誘発する。しかしながら、生ワクチンを 使用すると幾つかの問題に直面する。最もやっかいな問題は病原性減弱が不十分 なことである。 上記方法に代わる方法はサブユニットワクチンを使用することである。これは関 連のある免疫学的材料を含有する蛋白質だけによる免疫化に係わるものである。 多くの外被で覆われたウィルスでは、ウィルス的にコードされた糖蛋白質が中和 抗体を誘発し得るエピトープを含有している。これらにはラクロッセ（Ｌａ　Ｃ ｒｏｓｓｅ）ウィルス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｓｅａｒａｎｏ、Ｆ＋、　５ｈｏｐ ｅ＋Ｒ０Ｅ−＋Ｃａ１ｉｓｈｅｒ＋Ｃ，Ｅ、およびＮａｔｈａｎｓｏｎ、Ｎ、１ ９８２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１２０：４２）、新生児期子ウシ下痢ウィルス（Ｍ ａｔｓｕｎｏ、Ｓ。およびＩｎｏｕｙｅ＋Ｓ、、１９８３．Ｉｎｆｅｅｔｉｏｎ 　ａｎｄ　Ｉｍ＋＋＋ｕｎｉｔｙ　３９：１５５）、ＶＥＲ（シｅｎｅ−ｚｅｕ ｌａｎ　Ｅｑｕｉｎｅ　Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）ウィルス（＋’ ｌａｔｈｅｗｓ。 Ｊ、）！、およびＲｏｅｈｒｉｇ、　Ｊ、Ｔ、＋１９８２＋Ｊ。Ｔ＋ｗ＋、　１ ２９　：　２７６３）、プンタトロ　（Ｐｕｎｔａ　Ｔｏｒｏ）　　ウィルス（ Ｄａｌｒｙｍ−ｐｉｅ、Ｊ、Ｍ、。 Ｐｅｔｅｒｓ＋Ｃ，Ｊ、、Ｓｏ＋ｉｔｈ、Ｊ、Ｆ、およびＧｅｎｔｒｙ、　、Ｍ 、に、　、　１９８］、、　ＩｎＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｅｇａｔｉ ｖｅ　５ｔｒａｎｄ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　Ｄ、Ｈル。 Ｂ１５ｈｏｐおよびＲ，Ｗ、Ｃｏ＋ｎｐａｒ＋ｓ＋　ＩＬ　ｐ、１６７、Ｅ１ｓ ｅｖｉｅｒ＋ＮｅｗＹｏｒｋ）、マウス白血病ウィルス（Ｓｔｅｅｖｅｓ、Ｒ， Ａ、、５ｔｒａｎｄ。 列、およびＡｕｇｕｓｔ、Ｊ、Ｔ、、１９７４ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　１４：１８７ ）およびマウス乳癌ウィルス（Ｍａｓｓｅｙ、Ｒｊ、およびＳｅｈｏｃｈｅｔｍ ａｎｔＧ、、１９８１．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１１５：２０）の糖蛋白質が含まれ る。サブユニットワクチンの１つの利点は、関係のないウィルス材料が除外され ることである。 ワクチンはしばしば種々の助剤（アジュバント）と共に投与される。アジュバン トは免疫原を単独で投与した場合より少ない投与量でより少ない量の抗原を使用 して、より一層持続性でより高いレベルの免疫性の獲得を助けるものである。ア ジュバントの作用機構は複雑であり、完全には理解されていない。しかしながら 、アジュバントは細網内皮系の食面作用および他の活性の刺激並びに抗原の遅延 性放出および分解に係わっている可能性がある。アジュバントの例には、フロイ ンドアジュバント（完全または不完全）、アジュバント６５（ピーナツ油、マン ニドモノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含有する）、プルロ ニックポリオールＬ−１２１、アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）　　および水酸 化アルミニウム、りん酸アルミニウムまたは明ばんのような鉱物ゲルがある。フ ロインドアジュバントは代謝できない鉱物油を含有しており且つ発癌性の可能性 があるため、これはヒト用のワクチン製剤にはもはや使用されていない。 ２．５．　　　　横坑および　　感仇　　クチン寄生虫症または細菌症の予防用 ワクチンの開発は多（の研究努力の中心である。ワクチンは現在ジフテリア、百 日咳および破傷風で利用できる（Ｗａｒｒｅｎ、に、Ｓ、＋１９８５、Ｉｎ　Ｖ ａｃｃｉｎｅｓ　８５．Ｌｅｒｎｅｒ、Ｒ，Ａ、、Ｒ，Ｍ、Ｃｈａｎｏｃｋおよ ザ（Ｈｅａ＋ｏ吐旦閃ｔｎｆｌｕｅｎｚａｅ）菌の多糖体莢膜からなるワクチン が母集団のうちのある一層においては疾病予防の効果がないにもかかわらず最近 認可された（Ｇｒａｎｏｆｆ。 Ｄ、Ｍ、およびＭｕｎｓｏｎ、Ｒ，Ｓ、Ｊｒ、、１９８６．Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｄｉｓ、１５３：４４８−４６１）　、マラリアのような多くの原虫類感染また は住血吸虫症および回虫症のような螺虫感染のいずれに対してもワクチンは現在 存在しない。大腸菌毒素、コレラ菌毒素、ゴノコッカルピリおよびマラリア菌表 面抗原のエピトープに対して向けられた抗血清の予防効果（Ｖａｃｃｉｎｅｓ　 ８５＋１９８５＋Ｌｅｒｎｅｒ＋Ｒ，Ａ、Ｊ、Ｍ、ＣｈａｎｏｃｋおよびＦ、Ｂ ｒｏｗｎ　（ｍ）＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　　；　Ｍｏｄｅｒｎ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ 　Ｖａｃｃｉｎｅｓ＋　１９８ＣＣｈａｎｏｃｋ、Ｒ，Ｍ、およびＲ，Ａ、Ｌｅ ｒｎｅｒ（Ｗ）＋　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ）＋＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）は多くの系で現在研究中である。 ３、木　　　０」Ｌ貫 本発明はヘリオティスポリへドリンプロモーターのコントロール下で外来遺伝子 の発現を指令し得る組換えベクター／宿主系に関する０本発明の宿主系には培養 細胞、幼虫または微生物が含まれるが、これらに限定されない０本発明はヘリオ ティスポリへドリンプロモーターのコントロール下で関心のある異種遺伝子を非 融合ペプチド若しくは蛋白質、融合蛋白質または組換え閉塞体として発現させ、 その際組換え閉塞体はその表面または内部に異種遺伝子産生物を有する。異種遺 伝子産生物が病原性微生物のエピトープからなる場合、本発明の組換え蛋白質ま たは閉塞体はワクチン製剤で特に有用である。本発明のもう１つの実施Ｂ様では 、外来配列は殺虫活性を有する分子をコードすることができる。本発明のベクタ ー／宿主系はへりオティスプロモーターのコントロール下で発現される外来ペプ チドまたは蛋白質の産生用の発現系として使用することができるや本発明の組換 え蛋白質または抗原決定基からなる、上記蛋白質の断片もまた免疫分析での用途 を有する。 ３．１６足−一一且 次の用語および略号は下記の意味を有する。 Ａｃ＝オウトグーフ　左ユＩＪルニカ Ｈｚ＝ニュエ立１２−１１ ＥＣＶ　＝細胞外ウィルス ｐｏＪｙＨ＝ポリヘトリン アイソザイム： ＥＳＴ−エステラーゼ ＦＵＭ　＝フマル酸水添加酵素 ＬＤＨ＝乳酸脱水素酵素 ＭＤＩ’ｌ　＝リンゴ酸脱水素酵素 緩衝液： ＴＥ−１０ｍＭ　　）リス−塩酸、１　ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，６７ＢＥ ＝８１．２ａ＋Ｍ　　）リス、２０＋ｅＭホウ酸１．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、、ｐＨ ８Ｊ ＴＣ−９，７＋ｏＭ　　トリス、２．１３ｍＭクエン酸、ｐＨ７，１ＯＢ＝閉塞 体、バクロウィルス粒子を閉塞している不完全結晶蛋白質マトリックス、この不 完全結晶蛋白質マトリックスは、多面状、立方状または球状形態の屈折性物体を 形成する。 用語ＯＢは以下では可溶性ポリヘトリンの再結晶化によってインビトロで形成さ れた格子を指すようにも使用する。 ＮＰＶ　＝核ポリへドロシスウィルス、バクロウイルドは共有のエンベロープに よって１個（ＳＮＰＶ）または多数（ＭＮＰＶ）のリボプロティン膜で被覆され ている。１００個までのこれら粒子パッケージは、形態が多面状から立方状で直 径が１〜１５μｍの閉塞体に取り込まれている。 ＧＶ＝顆粒症ウィルス、バクロウィルス属の亜群であって、その際個々に外被で 覆われている１個のヌクレオカプシドは形態が球状から楕円状で大きさが０．１ 〜１μｍの閉塞体によって取り込まれている。 Ｎ０ＢＶ　＝非閉塞バクロウィルス ＭＣ５＝多重クローニング部位。一連の特有の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位 を有するＤＮＡ５ｆｆ域。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル゛アミドゲル電気泳 動。 カセットトランスファーベクターー ヘリオティスポリへドリンプロモーターと該ポリへドリンプロモーターのコント ロール下で異種遺伝子配列を挿入し得る制限酵素認識部位とからなるトランスフ ァーベクター、その際ヘリオティスポリへドリンプロモーターおよび制限部位の 側面に親ベクター配列に相同の配列が位置（ｆｌａｎｋ）　シている。異種遺伝 子配列はカセットトランスファーベクターに挿入され、次いで該ベクターはイン ビｔで親ベクター・との相同組換えを経由して組換え発現ベクターを構築するた めに使用することができる。 トランスファーベクター＝ トランスファーベクターはヘリオティスポリへドリンブロモーターと８亥ポリへ ドリンフ゛ロモーターのコントロール下で位置させた異種遺伝子配列とからなっ ており、その際ポリへドリンプロモーターと異種遺伝子配列の側面に親ベクター 配列に相同である配列が位置（ｆｌａｎｋ）　している、異種遺伝子配列を含む トランスファーベクターはインビボで親ベクターとの相同組換えを経由して組換 え体発現ベクターを構築するために使用することができる。 カセット発現ベクター＝ ヘリオティスボリへドリンプロモーターおよび該ポリへドリンプロモーターのコ ントロール下で異種遺伝子が適当な宿主中で発現されるように該遺伝子配列を挿 入することができる制限酵素認識部位からなる発現ベクター。 発現ベクター＝ ヘリオティスポリへドリンプロモーターと該ポリへドリンプロモーターのコント ロール下で異種遺伝子が適当な宿主中で発現できるように位置させた異種遺伝子 配列とからなる発現ベクター。 ４．２」Ｌ立］Ｌ皿 第１図、二ュ主主土ス亙ヱのポリヘトリン遺伝子のヌクレオチド配列、このヌク レオチド配列はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等のジデオキシチェインターミネータ −法を使用して決定された（１９７’Ｌ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｉ　、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ　、　Ｕ、　Ｓ。 Ａ、７４：５４６３）、推定アミノ酸配列はヌクレオチド配列の下に示す。 第１図囚、ヘリオティスポリヘドリン遺伝子の制限地図、制限エンドヌクレアー ゼＢｉｎｄ［［、Ｎｒｕ　Ｉ　、　１ｉｎｅ■およびＡｃｃ　Ｉでのヘリオティ スボリヘドリン遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ消化地図を示す、この地図は第 １図に示されるヌクレオチド配列から誘導された。 括弧内の数字は第１図のヌクレオチドの番号を表す。 第１図■、ヘリオティスボリヘドリン遺伝子のヌクレオチド配列決定法、ヘリオ ティスポリヘドリン遺伝子の配列を決定するジデオキシチェインターミネータ− 法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、等＋　１９７’Ｌ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。 ７４：５４６３−５４６７）で使用される配列決定計画を表す、矢印は各断片で の配列決定方向を示す０次の略号を本図では使用する：　Ｘｈｏ（珈１）、　５ ａｌ（Ｓａｌ　Ｉ）、　Ｒ１（ＥｃｏＲＩ）。 ８３（Ｈｉｎｄｎ［）、　ＨＩＩ　（ＨｉｎｄＩ）およびＮｒ（Ｎｒｕ　Ｉ　） 。 第２図、オ＋１−り醪と２１−カルフルニカＭＮＰＶ　（Ａｃ）、仝ニオｌコノ 。藍ヱＳＮＰν（Ｈｚ）およびボンビイクス至見ＮＰＶ　（Ｂｍ）のポリヘトリ ン遺伝子のアミノ酸配列の相同性、　Ａｃのポリヘトリン遺伝子のＤＮＡおよび 推定アミノ酸配列を示す（Ｈｏｏｆｔｖａｎ　Ｉｄｄｅｋｉｎｇｅ、Ｂ、Ｊ、Ｌ 、等、　１９８３゜Ｖｉ？ｏｌｏｇｙ　１３１：５６１）　、　Ａｃポリヘトリ ンの推定アミノ酸配列とＢｍ（Ｋｏｚｌｏｖ、Ｅ、Ａ、、等、１９８１．Ｂｉｉ ｏｒｇ、Ｋｈｉｓ　７：１００Ｂ）およびＨｚ　（上述の第１図参照）のそれと の差異を示す。 アミノ酸が１つの配列に存在しそしてもう１つの配列に存在しない場合、存在し ないアミノ酸は次の記号：一−−−−−で示す。 第３図、　ＨｚおよびＡｃポリヘトリンの疎水性プロフィール、ホップ（Ｈｏｐ ｐ）およびウッズ（Ｗｏｏｄｓ）が測定した各アミノ酸残基の疎水性（１９８Ｌ 　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８：３８２４）をポリヘトリン遺伝子のアミノ酸残基数に対し てプロットした。アミノ末端およびアミノ酸残基３５〜５０はヘリオティスボリ ヘドリン分子の親水性領域として同定した。 第４図、ポリへドリンボリリンカー配列０合成ポリリンカー遺伝子配列およびそ れでコードされるアミノ酸を示す、この遺伝子断片は２オ’７）グ」Ｌ２１−　 左ユヱオルニカポリヘドリン遺伝子をコードし、アミノ末端からアミノ酸５８に 相当する坦νＨＩまで続いている。制限エンドヌクレアーゼ切断部位はＤＮＡ配 列の下に示す。 Ｐｖｕ　Ｉ　ｒ　Ｓｃａ　Ｉ　＋　Ｂｃｌ　！およびＸｂａ　Ｉ部位はそれぞれ アミノ酸９．１９．２７および４６に相当する。 第５図囚、カセットベクターｐＨＥ２．６の構造の図示的描写であり、カセット ベクターｐ）ＩＥ２．６はポリヘトリン遺伝子内に外来遺伝子を挿入しそしてイ ンビボの組換えによってＨｚウィルスを作製するために使用できる。 これらのＨｚ組換え体は、適当な宿主系に置くとき、ポリへドリンプロモーター のコントロール下で外来遺伝子を発現する０図中では次の略号を使用する＝　ｐ ｏｌｙＨ（ヘリオティスポリヘドリン遺伝子配列）　、　Ｒ１（ＥｃｏＲＩ）　 。 ５ｓｔ（Ｓｓｔ　Ｉ）＋　Ｓ＋ｍａ（Ｓｍａ　ＩＬ　Ｂ＋＋（Ｂａｇ旧）、　Ｘ ｂ（ＸｂａＩ）。 ５ａｌ（Ｓａｌ　ｌ）、　Ｐｓｔ（ＰｓｔＩ）、　Ｒ３（）ｌＬｎｄｌ［ｒ）、 　Ｎｒ（ＮｒｕＩ）およびＸｈｏ（糎Ｉ）。 第５図■０機能性の大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子を含有するトランス ファーベクターｐＨＥ２．６１ａｃの構造の図示的描写である。ｐＨＥ２．６１ ａｃは且旦±での組換えによって組換えへリオティスウィルスを作製するために 使用することができ、これらウィルスはヘリオティスポリへドリンプロモーター のコントロール下でベーターガラクトシダーゼ遺伝子を発現する。この図では次 の略号を使用する：Ｘｂａ（Ｘｂａ　ＩＬ　Ｂａｇ（ＢａｍＨＩ）、　Ｋｐｎ（ 七１１）、　Ｓ＋ａａ（ＳｍａＩ）、　Ｏｌｉｇｏ（オリゴヌクレオチド）およ びＭＣ５（多重クローニング部位）、。 第５図０．ヘリオティスポリヘドリン遺伝子のアミノ末端をコードする領域に欠 失があるトランスファーベクターの構造の図示的描写である。これらのトランス ファーベクターはポリヘトリン遺伝子内に外来遺伝子を挿入しそして４ｙ　　ｈ ±での組換えによって）Ｉｚウィルスを作製するために使用することができる。 この図では次の略号を使用する；ｘｂａ（珈Ｉ）、　ｂａｏ＋（ＢａｍＩＩＩ） 。 ｋｐｎ（ＫＬＬ！　）、　ｓｅａ（Ｓｍａ　Ｉ　）、　５ｐｈ（シ１１　）、　 ｂｇｌ（ｈ注１　）。 およびｐｓｔ（力１１）。 第６図、　ＨｚＳＮＰＶエルカ−分離株およびプラーク精製株の制限エンドヌク レアーゼ分析、ウィルスＤＮＡはシラ糖勾配で精製した閉塞ウィルス粒子から精 製し、ＨｉｎｄＩＩ［で切断し、そして下記で記載するように０．７５％アガロ ースゲルで分画した。野生型エルカ−分離株（−゛）とプラーク精製株（１〜２ ５）間には明らかに多くの差異があった０本発明者は分析用の標準としてＨｚＳ −１５を選択し、切断パターンに関して他の全ての株の特Ｃ、３，８３ｋｂ　Ｈ ｉｎｄｌＩ［−におよび２．７６ｋｂ　ＨｉｎｄＩ［−Ｌ断片を欠いていた。大 部分の株は更に、ＨｚＳ−１５のＨｉｎｄＩ［［−Ｃ＋におよびＬ断片とハイブ リッドを形成した１０．２４．６．６および３．２６ｋｂのＨｉｎｄＩＩ［断片 も有していた。 第７図。エルカ−分離株とＨｚＳ−１５株の遺伝子型の比較。野生型エルカ−分 離株（−゛）とプラーク精製ＨｚＳ−１５株は酵素ＢａｍＨＩ＋　ＥｃｏＲＩ、 　ＥｅｏＲＶ、　Ｈｉｎｄｌｌｌ、　七１１．　ＰｓｔＩおよび５ｓｔＩで切断 し、そして０．７５％アガロースゲルで分画した。坦υＩ１．　、ＬＬＩＬＩお よびＰｓｔＩの断片パターンは同一である一方、シ遼ＲＩ、　Ｅ（但ＲＶ、形ｎ ｄＩ［［及び影」■のそれは異なる。 第８図、　ＨｚＳＮＰＶウィルスゲノムの物理的地図。線状ゲノム地図は、ゲノ ム制限酵素切断用のプローブとしてクローン化したＢａｍＨＩ、　ＨｉｎｄＩ［ ＩおよびＰｓｔｌ断片を使用して、プラーク精製株ＨｚＳ−１５のハイブリダイ ゼーション分析によって作製した０本発明者の地図はクネル（Ｋｎｅｌｌ）およ びサマーズの以前の地図（１９８４，Ｊ、Ｇｅｎ。 Ｖｉｒｏｌ、６５：４４５−４５０）から、特にＨｉｎｄ　ｍ−ＢおよびＪ並び にシ馴旧−Ｇ、１．Ｊおよびに断片の配置において、逸脱している。 第８図（Ａ）、　ＨｚＳＮＰνゲノムの４つの可変性領域の分析。 ＨｚＳＮＰＶプラーク精製株中の精製人中可変性ＳｉＭはクローン化したＨｚＳ −１５断片を用いたハイブリタ槍ゼーション分析によって決定した。領域■、■ および■はウィルス分離株の各々においてわずかな変化であフた。　）ｌｚｓ− ２３の遺伝子型は領域■のＲｉｎｄ　ｍ−Ｆに未決定起源の小さな挿入を有して いた。領域Ｉが変化したプラーク精製遺伝子型の大部分はＨｉｎｄ　ｍ−Ｈで小 さな挿入または欠失を有していたが、１つの遺伝子型（ＨｚＳ株１および２で示 されている）では断片の大きさはさほど変化していなかった。　ＨｚＳ−２１は 、領域■および■での変化に加えてＨｉｎｄ　ｍ−Ｄに小さな挿入があった。 第９図、ＨｚＳＮＰＶエルカ−分離株およびプラーク精製株の閉塞ウィルス粒子 の構造蛋白質、勾配法で精製したウィルス粒子は１０　Ｘ　ｌ０ＣＩ＋の１２％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で３０ミリアンペアで４．５時間電気泳動した 。 主要な野生型蛋白質の位置および大きさは左側に表示し、一方ブラーク精製株の 幾つかで見い出された特有の蛋白質は右側に表示する。 第１０図、　ＩＰＬＢ−Ｈｚ１０７５から誘導し、クローン化して単離した細胞 株の細胞増殖曲線０組織培養フラスコの３つの特定の領域（２５ｄｌ）は総８日 間で４８時間の間隔で計数した。グラフ上の点は計数した３つの領域の平均を示 し、誤差線は１つの標準偏差を示す、各グラフの左隅低部の文字は特定の細胞株 （ｃｅｌｌ　５ｔｒａｉｎ）の名称に対応する。 第１１図、　ＩＰＬＢ−）ＩＺ１０７５から誘導した全ての細胞株とアイソザイ ムＦＵＭ、ＬＤＨおよびＢＳＴを有するへりオティスゼア幼虫との間のアイソザ イムバンドパターンの比較、細胞および幼虫抽出物はＴＢＥがまたはＴＣ５衝液 がのいずれか中の５％ポリアクリルアミドゲル（９５％のアクリルアミド、５％ ビス−アクリルアミド）で電気泳動し、そして適当な酵素に関して染色した。　 　ＦＵＭおよびＬＤ）ｌ　ノ染色ニに、　−）　で、細胞株が親ＩＰＬＢ−Ｈ２ １０７５（Ｗ”）細胞株から誘導されたものでありそして、これらが最終的にへ りオティスゼア幼虫から誘導されることが確認される。　　ＢＳ？ゲルでの差異 によって、全ての株は必ずしも同一でないことが示唆される。アイソザイムの染 色方法は以下に記載する。　Ａ）　ＦＵＭ＝フマル酸水添加酵素、Ｂ）　ＬＤＨ ＝乳酸脱水素酵素、Ｃ）　ＥＳＴ　＝エステラーゼ。 第１２図。数種の昆虫細胞系（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）についてのアイソザイムバ ンドパターンの比較、記載したように調製した細胞系はＴＣ緩衝液中５％のポリ アクリルアミドゲル（９５％のアクリルアミド、５％のビス−アクリルアミド） テ電気泳動した。　　ＬＤＨはＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５を他の全ての細胞系から 区別するが、ＡＴＣ−１０とＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５はＲｆ値が僅か０．０３Ｌ か異なっていない、　　ＭＤＨはＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５をＡＴＣ−１０から、 またＬＤＨで染色したとき一緒に移動するＢＴＩ−ＥＡＡをもＩＰＬＢ−ＳＦ− ２１ＡＥから明らかに区別する。染色方法は以下に記載する。 第１３図、カセットベクターｐＡＶ１．５の構造の図示的描写である。このベク ターはオウトグラファポリヘドリン配列内に外来遺伝子を挿入するために使用で き、そしてこの配列はインビボでの組換えによってオウトグラファウイルスゲノ ムに対して形質転換することができる。　ｐＡν１．５はまた図１６で示される ヘリオティスボリヘドリン遺伝子の挿入のようなその後の遺伝子操作用に使用す ることができる。この図では次の略号を使用する：ＲＩ（ＥｃｏＲＩ）、　５ｓ ｔ（ＳｓｔＩ）、　Ｂａｎ（Ｂａｎ旧）、　Ｋｐｎ（七＋ｎｌ）。 ５ａｌ（ＳａｌＩ）、　ＲＶ（ＥｃｏＲＶ）、　Ｐｓｔ（Ｐｓｔｌ）、　Ｈ３（ Ｈｉｎｄｎ［）およびＸｈｏ　（還遼Ｉ）。 第１４図、カセットベクターｐＡＶＨｐ６の構造の図示的描写である。このベク ターはへリオティスおよび／またはオウトグラファボリヘドリン遺伝子内に外来 遺伝子を挿入するために使用でき、そしてこのような外来遺伝子をインビボでの 組換えによってオウトグラファウイルス内に形質転換するために使用することが できる。 この図で次の略号を使用する：　５ｓｔ（ＳｓｔＩ）、Ｂａ間（ル狸旧）。 ＲＩ（ＥｃｏＲＩ）；　　Ｋｐｎ（ｊ迫Ｉ）、　５ａｌ（ＳａｌＩ）、　ＲＶ（ ＥｃｏＲＶ）、　Ｐｓｔ（ＰｓｔＩ）、　１３（ＨｉｎｄＩ［［）およびＸｈｏ 　（珈工）。 第１５図、オウトグラファポリヘドリン遺伝子内に特定のル徂■部位で挿入した インフルエンザ血球凝集素のアミノ酸９８〜１０６をコードする外来ＤＮＡ配列 を含有するトランスファーベクターの構造の図示的描写である。 第１６図、β−ガラクトシダーゼを発現する組換えへリオティスウイルスで感染 させた２４ウエルのプレートの細胞から得た細胞蛋白質の７．５％ポリアクリル アミドゲルのウェスターンプロット法による顕微鏡写真。 、レーン１にはＨｚＳ１５Ｂｇａｌ−Ｄ４（ウェル１の細胞から得た）で感染さ せた１、　６　ＸＩＯ’個の細胞の溶解物を置いた。 レーン２にはＨｚＳ１５Ｂｇａｌ−Ｄ４（ウェル２の細胞から得た）で感染させ た３、２Ｘ１０’個の細胞を置いた。レーンＭ（対照マーカー）にはバイオ−ラ ッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社のβ−ガラクトシダーゼ（分子量１１０．０００）１ ０μｇを入れた。 第１７図、β−ガラクトシダーゼを発現する組換えへリオティスウイルスで感染 させた、２４ウエルのプレートの細胞から得た細胞蛋白質の９％ポリアクリルア ミドゲルのウェスターンプロット法による顕微鏡写真。 レーンＣにはＨｚＳ１５Ｂｇａｌ−Ｄ４（ウェル５の細胞から得た）で感染させ た０、５Ｘ１０’個の細胞の溶解物を置き、そしてレーンＭ（対照マーカー）に はバイオ−ラッド社のβ−ガラクトシダーゼ（分子量１１０．０００）１０μｇ を置いた。 第１８図０組換えへリオティスウイルスＨｚＳ１５Ｂｇａｌ−Ｄ３で感染させた Ｈ、ゼア新生幼虫（総重量１〜３■）から得た蛋白質をクーマシーブルーで染色 した９％ポリアクリルアミドゲル、レーンＬ１には感染させた新生幼虫からの抽 出物６．２μｇを置いた。抽出物は蛋白質１■当たり５１８．４単位のβ−ガラ クトシダーゼ活性を有していた。レーンＬ２には別の感染させた新生幼虫からの 抽出物６．０μｇを置いた。抽出物は蛋白質１■当たり５４０．０単位のβ−ガ ラクトシダーゼ活性を有していた。レーンＭ（対照マーカー）にはバイオ−ラッ ド社のβ−ガラクトシダーゼ（分子量１１０，０００）１０μｇを入れた。レー ンして（唯一）見えるバンドは組換え体β−ガラクトシダーゼ蛋白質が予期され る場所に移動しているものである。 第１９図、岨換え体へリオティスウイルスＨｚＳ１５Ｂｇａｌ−Ｄ３で感染させ たＨ、ゼア新生幼虫（総重量２■）から得た蛋白質の９％ポリアクリルアミドゲ ルのウェスターンプロット法による顕微鏡写真、レーンＬには感染新生幼虫から 得た抽出物５．４μｇを置き、これは蛋白質１■当たり１５６３．８単位のβ− ガラクトシダーゼ活性を有していた。レーンＭ（対照マーカー）にはバイオ−ラ ッド社のβ−ガラクトシダーゼ（分子量１１０，０００）１０μｇを入れた。マ ーカーと幼虫抽出物蛋白質との相対的染色に基づいて、本発明者は、組換えβ− ガラクトシダーゼ蛋白質が幼虫の湿潤重量の０．１％より多く構築されていたと 結論することができる。 ５、　　　Ｈの量　なＬ 本発明は、異なる宿主系でヘリオティスボリへドリンプロモーターによってコン トロールされる異種遺伝子の発現を指令し得る組換えベクター／宿主系に関する ものであり、上記宿主には培養細胞、幼虫または微生物が含まれるがこれらに限 定されるものではない。 本発明の系を使用して、遺伝子産生物が非融合ペプチド若しくは蛋白質、融合蛋 白質としてまたは、閉塞体の表面若しくは内部に異種遺伝子産生物を有する結晶 化ポリヘトリン融合蛋白質からなる組換え閉塞体として発現されるように異種遺 伝子を操作することができる。発現産生物は多（の用途を有し、そして本発明は ワクチン製剤の製造に特に有利である。 考察を明瞭にするために、以下の節では次の内容の項目について本発明の発現ベ クター／宿主系を記載する：（ａ）遺伝子産生物が非融合ペプチド若しくは蛋白 質、融合蛋白質または組換え閉塞体として発現されるように異種遺伝子をヘリオ ティスボリへドリンプロモーターのコントロール下に置くためのヘリオティスポ リヘドリン遺伝子の操作；イ）へりオティスウイルス発現ベクターおよびこれを 作製するために使用することができるへりオティス親ウィルス；（Ｃ）組換えへ りオティスウイルスの構築、組換えへリオティスウイルスの増殖および／または 異種遺伝子産生物の発現に使用できるへりオティス細胞系（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ ）　；並びに（ｄ）組換えへリオティスウイルスの増殖および／または異種遺伝 子　。 産生物の大量生産に使用できるへりオティス幼虫。 非ヘリオティス昆虫宿主および細菌のような微生物中ヘリオティスポリへドリン プロモーターのコントロール下で異種遺伝子の発現をもたらす他の系もまた記載 する。 異種遺伝子産生物の単離法および精製法は、本発明による種々のワクチン製剤で 記載したとおりである。 ５．１．　　々の゛　−せるたへニュユオーイスポｌヘト１ン゛　−およびブロ モ−叉二夏操崖 へりオティスゼアポリヘドリン遺伝子のＤＮＡ配列はサンガーのジデオキシ法（ １９７７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、ＬＩ。 Ｓ、Ａ、　７４：５４６３）を使用で決定し、第１図に示す、第１図は更に、推 定アミノ酸配列も示している。本発明によれば、異種遺伝子をヘリオティスボリ へドリンプロモーターのコントロール下に置くためには多くのｉ作が可能である 。ポリヘトリン遺伝子を操作する方法に依って、異なる種類の遺伝子産生物が発 現される。このような操作には次のものがあるが、これらに限定されない： （ａ）　　ヘリオティスボリヘドリン遺伝子配列の全てまたは実質的に全ては関 心のある異種遺伝子で置換することができ、その結果異種遺伝子はポリへドリン プロモーターのコントロール下に置かれる。異種遺伝子産生物は、本発明の上記 組換えへりオティスウイルス／宿主系によって高レベルで発現される。 （ハ）ヘリオティスポリヘドリン遺伝子配列部分は関心のある異種遺伝子の全部 分または成る部分で置換することができる。異種遺伝子が、翻訳停止シグナルを コードする配列によって中断されていないポリヘトリン遺伝子と同一の翻訳読み 取りフレーム内にある場合には、融合蛋白質は本発明の組換え体へリオティスウ イルス／宿主系によって発現される。この目的のために使用できる好都合の制限 部位には第１図に示されるようなＨｉｎｄｌ［ＩおよびＮｒｕＩであるがこれら に限定されるものではない。 （Ｃ）　　結晶化に必要ではないポリヘトリン蛋白を領域をコードするポリヘト リン遺伝子配列の特定の部分が、関心のある異種遺伝子の全部分または成る部分 で全部または部分的に置換されるようにヘリオティスボリヘドリン遺伝子を巧み に処理することができる。結晶化に必須でない領域は、他のポリヘトリン配列と 比較したとき可変である。挿入された異種配列が、翻訳停止シグナルをコードす る配列によって中断されていないポリヘトリン遺伝子と同一の翻訳読み取りフレ ーム内にある場合には、ｍｖｓｘ　ｃ本明細書では組換えＯＢと称する）玉ｌＬ ■Ｕ成↓ＪＬ６融合タンパク質を発現する。これらポリヘトリン融合タンパク質 によって形成される組換えＯＢは、、ＯＢ結晶の表面または内部に異種遺伝子産 生物が存在するＯＢ結晶からなっている。それ故、組換えポリヘトリン結晶を産 生ずることによって、実質的に純粋な形態で、その成分である異種遺伝子産生物 の挙離を容易にする。 組換えＯＢはワクチンの製造に特に有用であると思われる。本発明のこの特徴の 好ましい実施態様では、異種配列は、ポリヘトリン蛋白質の多分表面領域であろ うと思われる親水性領域をコードするポリヘトリン遺伝子の部分に挿入されるか または置換することができる。これらの表面領域の構造は、ワクチン組成物で使 用すべき異種蛋白質が免疫原性を与えるキャリア分子に通常カップリングしなけ ればならないハブテン（即ち、抗原ではあるが免疫原ではない）であるときに特 に有益であると思われる。本発明の発現ベクター／宿主系を使用して表面に異種 ハブテンを有する組換えＯＢを産生させると分子が免疫原性となりそして化学的 カップリング反応が省略されよう、ポリヘトリン蛋白質の疎水性領域をコードす るポリヘトリン遺伝子配列は、ワクチン製剤に有用な組換えＯＢが産生されるよ うに、異種配列中に挿入されるかまたは異種配列で置換される。 １尺で更に詳細に説明するように、組換えＯＢは、溶解し再結晶化することがで きるので、（ａ）外被で覆われた組換えへリオテイスウイルス粒子を溶解した組 換えＯＢから取り出し、次いでｉｏＢは組換えへりオテイスウイルスのない状態 で再結晶化することができ、および／またはい）各々が異なる異種蛋白質を有す る組換えＯＢの混合物は溶解可能であり且つ再結晶化可能である。 得られたＯＢは各異種蛋白質を有してセリ、多価ワクチンとして特に有用であろ う。 本発明のこの実施態様に従って異種遺伝子配列で置換することのできる表面領域 をコードすると思われるポリヘトリン遺伝子配列部分を同定するために、本発明 者は、へりオテイスボリへドリンアミノ酸配列の疎水性領域および親水性領域並 びに該疎水性および親水性領域をコードする遺伝子配列の対応する領域を同定し た（第３図および第１図参照）、アミノ酸配列の親水性領域は結晶の外部領域に あると思われ、更には結晶解析によってポリへドリンモノマーの外部領域にある と思われるので、このような領域は、それらが宿主の免疫系に外来エピトープを 容易にもたらすと思われるから、ワクチン製剤に組換えＯＢを使用する本発明の 実施態様で特に有用であろう、親水性領域をコードするポリヘトリン遺伝子の部 分は、挿入された外来エピトープが容易に免疫原性になるので、本発明の特別の 実施Ｂ様の異種遺伝子配列の挿入または該配列での置換のための主要な候補であ る。か（して、親水性であり且つ非常に変動可能なポリヘトリン蛋白質領域をコ ードするヘリオティスボリヘドリン遺伝子配列の部分は異種遺伝子配列によって 置換される良好な候補であり、その結果、得られる融合ポリヘトリン蛍白質は結 晶化しそして免疫原性外来エピトープを有する組換えＯＢを形成する。 ポリヘトリン蛋白質の疎水性領域をコードするポリヘトリン遺伝子の配列も異種 遺伝子配列中に挿入するかまたは該配列で置換することができ、そしてワクチン 製剤で有用な組換えＯＢを提供する。特別の実施態様では、両性ペプチド（即ち 、疎水性の一面と親水性の一面を有するペプチド）をコードする遺伝子配列（以 下の５．４．１．節参照）は、ポリヘトリン蛋白質の疎水性部分をコードするポ リヘトリン遺伝子領域に挿入することができる。 本発明の特別な実施態様では、本発明者はアミノ末端（概ねアミノ酸１から４ま で）およびアミノ酸残基番号３８〜５０（第３図参照）を、恐らく蛋白質の表面 上にありそしてそれ故ＯＢの表面にあると思われるポリヘトリン蛋白質の親水性 領域として同定した。異種遺伝子配列は、異種遺伝子がヌクレオチド残基番号１ から１２および／または１４２から１８０の全てかまたは部分を中断するかまた は置換するかのどちらかをするようにポリヘトリン遺伝子配列中に挿入すること ができ、そしてこの配列はアミノ酸配列のこれら領域をコードする（第１図参照 ）、これら残基番号は鳳凰でありそしてこれら領域内または近接して生起する任 意の１つまたは複数の制限部位は、異種遺伝子配列を挿入するためにポリヘトリ ン遺伝子配列を特異的に開裂させるように使用することができることに注意すべ きである。有用と思われる幾つかの制限部位には第１図に示される制限部位があ るがこれらに限定されるものではない、特有の制限部位を使用することが好まし く、その結果適当な部位が存在しない場合には、例えばインビボでの変異誘発に よって新しい部位が得られる（Ｈｕｔ−ｃｈｉｎｓｏｎ。 Ｃ０等、１９７８．Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ＋、　　２５３：６５５１）。 ５．２．へ奮オーイス　イルス　　ベ　　−少なくとも２つのタイプの組換え発 現ベクターが本発明に係わっている。１つの実施態様は、ポリヘトリンプロモー ターのコントロール下にある異種遺伝子配列または遺伝子断片を含有している組 換えへりオティスウイルスからなる。ポリヘトリン遺伝子配列内の異種遺伝子の 位置に依って、異種遺伝子産生物は非融合ペプチド若しくは蛋白質、融合蛋白質 または組換え閉塞体のいずれかとして発現される。 別の実施Ｂ様は、ポリヘトリン遺伝子配列内部に１つのクローニング／制限部位 または多数のクローニング／制限部位を含有する組換えへりオティスウィルスか らなっている；以後、この組換え体ベクターはへりオテイス「カセット−発現（ ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）　Ｊウィルスと称する。クローニン グ部位は、関心のある任意の異種遺伝子またはその断片がポリへドリンプロモー ターのコントロール下のポリヘトリン遺伝子配列内に挿入できるようにポリヘト リン遺伝子内部に位置している。ポリヘトリン遺伝子内のクローニング部位の正 確な位置に依存して、遺伝子産生物は非融合ペプチド若しくは蛋白質、融合蛋白 質または組換え閉塞体として発現される。 組換えへリオティスウイルスのどのタイプも、本発明に従って使用される宿主系 に関して特に有利な特性を有する親へりオティスウイルスから構築することがで きる０例えば、宿主系で高い感染力および高いウィルス力価を示すへりオティス ウイルスが好ましい、へりオティス幼虫宿主系を使用するときには、メラニン黒 化を引き起こさないヘリオティスウイルスが好ましい、これらの特徴の各々は以 下で更に詳細に考察する。 ５．２．１．　　　えへ１オー　ス　イルスの上記したようなポリへドリンプロ モーターのコントロール下で異種遺伝子またはその１部分を含有する組換えへリ オティスウィルスを構築するために、異種遺伝子の関係のある配列をポリヘトリ ン遺伝子配列内の適当な位置に挿入することができる。同様に、１つまたは複数 のクローニング部位を含有する組換えへりオティスウィルスを構築するために、 ポリヘトリン遺伝子配列内および／またはへりオティスゲノムそれ自体に特有で あるかまたは稀な１つまたはそれ以上の制限部位をコードするオリゴヌクレオチ ド配列をポリヘトリン遺伝子配列内の適当な位置に挿入することができる（以後 、このオリゴヌクレオチドリンカーをポリリンカー（ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ）と 称する）、異種配列かまたはポリリンカーかのいずれかを含有する組換えへリオ ティスウイルスは、インビトロまたはインビボのどちらかでＤＮＡの組換えを提 供する任意の技術を使用して親へりオティスウイルスから構築することができる ０例えば、本発明の組換えへりオティスウィルスを構築する１つの実施Ｂ様では 、インビボの組換えがポリヘトリン遺伝子内の特定の部位に異種遺伝子配列およ び／またはポリリンカーを挿入するために使用できる。この目的のために、ポリ ヘトリン遺伝子配列内に挿入されそしてへりオティス配列の側面に位置する異種 遺伝子を含有するトランスファーベクターを構築することができる（例えば、第 ５囲い参照）、親へリオティスウイルスＤＮＡとトランスファーベクターＤＮＡ とは感染しやすい細胞内にコトランスフェクションすることができ、そしてその 際インビボの組換えによって本発明の組換えへリオティスウイルスの作製が行な われる。或いは、ポリヘトリン遺伝子配列内に挿入されそしてへりオテシス配列 の側面に位置するポリリンカー配列からなるカセットトランスファーベクターを 構築することができる　（例えば、第５囲い参照）。このカセットトランスファ ーベクターを用いて感染しやすい細胞内に精製ウィルスＤＮＡをトランスフェク ションすると、インビボ組換えによってヘリオティスカセットー発現ウィルスが 作製される０次いで、ウィルスＤＮＡは且旦上二組換えの目的のために単離する ことができ、その際異種遺伝子配列による、カセット−発現ウィルスゲノム内Ｄ ＮＡへの挿入または置換がウィルスゲノム内のポリリンカー配列によって促進さ れる。或いは、−イー７ｅ上旦組換えはへリオティスウイルスＤＮＡを単離する ことによって達成することができ、次いで、このＤＮＡはポリヘトリン遺伝子配 列内の適当な位置に特異的な制限酵素で開裂される０次いで、異種遺伝子または ポリリンカーは該開裂部位でポリヘトリン遺伝子内に連結される。 ５．１．で説明したように、異種遺伝子配列および／またはポリリンカーの挿入 部位に依って種々の遺伝子産生物が発現される。しかしながら、特有の制限部位 が所望の位置に存在しない場合、存在する制限部位を変えることができる。存在 する部位を特有の制限部位に変えるために、適当な制限酵素で開裂し、（必要な 場合には）修飾して平滑末端を作り、そして特有の制限部位をコードする適当な オリゴヌクレオチドの存在下で連結することができる。更に、ポリヘトリンまた は異種遺伝子配列は、新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成させるかまたは 以前から存在している制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊するためにインビトロ またはインビボで変異させて不Ｚに上且での連結法を促進させることができる。 インビトロでの部位指令変異誘発（Ｈｕｔｃｔ＋１ｎｓｏｎ＋Ｃ，等、　１９７ Ｂ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、　２５３：　６５５１）、タブ（ＴＡＢ、商 標）リンカ−（ファルマシア社）の使用等を含むがこれらに限定されない任意の 当該技術分野で既知の技術を使用できる。ポリヘトリン遺伝子配列の部分はまた 、異種配列によって中断されるよりもむしろＷ−こともできる、１つまたは複数 の適当な制限酵素によるポリヘトリン配列の開裂後、開裂末端はポリヘトリン配 列部分を取り出すために、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、エキソヌクレアーゼ■、 ラムダエキソヌクレアーゼ、ヤエナリ（ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼまた はＴ４　ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性のような、はんの２．３ 例だけを挙げたが、有名なヌクレアーゼを使用して“分解する（ｃｈｅｗｅｄ　 ｂａｃｋ）”ことができる、或いは、これらの部位によって特定される断片を取 り出すために２つまたはそれ以上の制限酵素による開裂を達成することができる 。これに続（平滑末端への変換（必要な場合）および異種遺伝子配列またはポリ リンカーの存在下での連結によって、ポリヘトリン遺伝子の適当な領域の消失お よび異種遺伝子またはポリリンカーによる上記領域の置換が生じる。 遺伝子融合体を構築する特別の方策は、置換されるかまたは挿入される特定のポ リヘトリン配列並びに挿入される異種遺伝子によって決まる。以下の考察は、土 Ｚ竺土三組換えの目的のためにポリヘトリン遺伝子の制限部位の操作が達成され るほんの１つの方策に関するものであり、そして単に説明のためだけに意図する ものである。他の多くの組換えの方策は本発明の範囲内である。 本発明の１つの特別の実施態様では、ポリヘトリン遺伝子内の特別な制限部位に 外来ＤＮＡを挿入するために１つの方策を使用することができ、その際この部位 は特有の制限部位であることができ、またはそうでなくても良い、この実施態様 では、組換えベクターのポリヘトリン遺伝子の一本鎖ＤＮＡは■淀屋−制限部位 で部位−特異的な開裂を生じさ″せるために操作される。（この方策を使用する １つの例としては上皿の１０．１．４’１１）。 ポリヘトリン遺伝子から得た一本鎖ＤＮＡを単離する。 この単離は二本鎖形態の熱変性のような多くの標準的技術、次いで分画または好 ましくは、ゲノム内に挿入されたポリヘトリンＤＮＡを有するバクテリオファー ジ誘導体（ｌ！、旧３ファージ、ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ））のような ベクターの一本鎖ＤＮＡ０単離によって達成される。　ＤＮＡ内の特別な制限部 位での特異的開裂は、制限消化をする前に、相補的合成オリゴヌクレオチド（オ リゴ−１）を−末鎖ＤＮＡにアニーリングすることによって達成される。このア ニーリングは制限エンドヌクレアーゼによる認識および開裂に必須の二本鎖領域 を創り出す、開裂後に、−末鎖の線状のＤＮＡは既知の技術（例えば熱変性法お よびカラムクロマトグラフィー）で単離することができる。外来エピトープをコ ードする配列を有するオリゴヌクレオチドも合成することができる（以後、オリ ゴ２と称する）０次いで、オリゴ２に相補的であるもう１つのオリゴヌクレオチ ドを合成することができ（以後、オリゴ３と称する）、これは更に、ポリヘトリ ンＤＮＡの一本鎖末端に相補的であるオリゴ２を超えて伸びている５′および３ ′末端を有している０次に、オリゴ２とオリゴ３は一緒にアニーリングし、次い でこの二本鎖を一末鎖ポリヘドリンＤＮＡに連結することができる。太遅且のよ うな適当なベクター宿主の形質転換によって、ポリヘトリン遺伝子内の特定の制 限部位に挿入された外来ペプチドをコードするＤＮＡを有する組換え体トランス ファーベクターが作製される。 ポリヘトリン遺伝子内のヌクレオチド配列の置換は、上に５．ｉ−で記載したよ うに本発明に従って組換え閉塞体を産生ずるのに特に有用であろう。 ５．２．２．　　へＩオー　スウイルス任意のへリオティスウイルスが、本発明 の組換えへりオティスウイルスを構築する親として使用できる。 好ましい実施態様では、同種遺伝子型ををするプラーク精製分離株を親へりオテ イスウイルスとして使用すべきである。更に、本発明に従って使用される発現ベ クター／宿主系の特別の宿主で使用するときには、所望の品質を有する株を選択 すべきである。 幼虫宿主系でＨｚＳＮＰＶを取り扱うときには、メラニン黒化を起こさないウィ ルスが好ましい。血リンパ含有ウィルス粒子かまたは閉塞体かのいずれかのメラ ニン黒化を避けるために注意深く感染の時期を決めることが有利である。メラニ ン黒化は昆虫のクチクラに入っている色素であるメラニンの産生からなりそして チロシンの酸化によって誘導されるインドール環状化合物の重合に関係があると 思われる、ウィルス感染に対する正常な応答である（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈ 、Ｖ、Ｂ、、１９７４．ｉｎ　ＴｈｅＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｉｎ５ｅｃ ｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、　ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、 ｐ、６１０）、メラニン黒化過程に係わりのあるチロシナーゼは昆虫の血リンパ 中に豊富にあるので、利用可能な蛋白質とかなり非特異的に反応することができ る。それ故、本発明の組換えウィルスを有する昆虫内のチロシナーゼ活性は異種 蛋白質を非特異的に代謝することができ、異種産生物の収量および純度を損いそ して減少させる。閉塞体のメラニン黒化はその後のウィルス粒子蛋白質および核 酸の化学的変化を生じさせる。メラニン黒化はまた、接種後の培養細胞の毒とな るだけでなく、採集した血リンパ中のウィルスの感染性細胞外力価もひどく減少 させる。その故、メラニン黒化しないかまたは徐々にメラニン黒化する宿主株が これらの問題を回避するには好ましい。 ＨｚＳＮＰＶの８種の地理的分離株の制限切断パターンは、各々が僅かに異なる 優勢な遺伝子型を有するウィルスの別個の集団であることを示唆しているが、ど のパターンも総合的に特有のウィルス種は示していない（ＧｅｔｔｉｇおよびＭ ｃＣａｒｔｈｙ、１９８２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１１７：２４５−２５２）。 試験した８つの地理的分離株の内７つは５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）で類似の主要な閉塞ウィルス構造蛋白質プロフィールを 有している（ＭｏｎｒｏｅおよびＭｃＣａｒｔｈｙ、１９８４．　Ｊ、Ｉｎｖｅ ｒｔ、Ｐａｔｈ、　４３：３２−４０）、　８つのへりオティス５ＮＰＶ分離株 は遺伝子学的にそして生化学的に類領しているとはいえ、７つの分離株はＨ，ゼ ア幼虫に対する毒性にかなりの差異を示している（ＧｅｔｔｉｎｇおよびＭｃＣ ａｒｔｈｙ、１９８２．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１１７：２４５−２５２）。 それ故、本発明者はＨｚＳＮＰＶのエルカ−分離株から得たプラーク精製株（元 々は叶、Ｊ、Ｊ、ＨａＩＩＩｍにより単離された、［１，Ｓ、Ｄ、Ａ、、Ｔｒｉ ｆｔｏｎ、ＧＡ、）を更に分析した０本発明者はウィルスゲノムの制限酵素切断 、閉塞ウィルス構造蛋白質の５ＯＳ−ＰＡＧＥプロフィールおよびプラーク精製 株間の幼虫病理学的差異を比較して、エルカ−分離株の遺伝子型異種性および表 現型異種性の特徴を決定した。 エルカ−分離株から得た２０株を精製し分析した後、本発明者は優勢な遺伝子型 は１つもないことを見い出した。各人は１つまたはそれ以上の制限酵素を使用し て区別することができ、そしてどの株も野生型分離株のモル制限パターンと同一 ではなかった。１個の優勢遺伝子型も同定し得なかったことは、このウィルスが 高度に可変性であることを示していた。 本発明者は、Ｈｉｎｄｌ［Ｉ制限パターン（第８図、第８囲い）に基づいてプラ ーク精製人中の４つの可変性領域を同定した。これらの領域の内３つ（■、■お よび■）での変化はプラーク精製株間ではわずかである。・ＨｚＳ−２３株の領 域■のＨｉｎｄ　Ｉ［ｒ−Ｆでの小さな挿入は唯一の例外である。領域Ｉでの変 化は更に重要であることがあり、この領域で改変された遺伝子型の中には明らか に４つの小さな欠失および１つの挿入がある。領域Ｉの全ての欠失はシ１旧−Ｈ 断片に位置している。領域１−ＩＶの外部に更に変化を有する唯一つの株はＨｉ ｎｄ　ｍ−Ｄに挿入を有するＨｚＳ−２１である。 メラニン黒化はＨｚＳＮＰＶの生化学を研究するときに常に問題であるので、幼 虫宿主系で使用するためには、本明細書に記載したメラニン黒化しない株が好ま しい。 特に、下記の株５．７．８．９．１５．２１．２２．２４および２５（７節、特 に第■表参照）は榎１星メラニン黒化を生じさせる。好ましい実施態様では、　 ＰＣ’ｆｔメラニン黒化を生じさせる）ｌｚｓ−１５株を、幼虫宿主系で使用す る組換えへリオティスウイルス発現ベクターを構築する親株として使用すべきで ある。 Ｈ２Ｓ−１５株の遺伝子型（第７図、第８図および第８囚参照）は３つの可変性 領域（■、■および■）で野生型集団の遺伝子型と相異している。これら遺伝子 型間の相異は酵素ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶＳＨｉｎｄｌｎおよび影匹ｌでの切断 で明白である（第７図）、野生型の集団に対するＨｚＳ−１５の相異は、全体的 なゲノムの大きさまたは組織よりむしろ幾つかの制限部位の相対的位置における 変化によって生じる。 ＨｚＳＮＰＶ集団の遺伝子型における可変性領域はエルカ−株に限られるもので はない、　　ＨｚＳＮＰＶの地理的変化に関して発表された分析を再検査するこ とによって、これら可変性領域が他のへりオティス種の５ＮＰＶに存在すること が明らかになっている（Ｇｅｔｔｉｇ、Ｒ，Ｇ、およびＭｃＣａｒｔｈｙ、　Ｗ 、Ｊ、、１９８２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１１７：２４５−２５２）　、更に、本 発明者のプラーク精製分離株間に保存されている多くのＨｉｎｄＩ［［断片はま た以前に分析された地理的変種間にも保存されている。このことは特にＨｉｎｄ Ｉ［［断片Ａ。 Ｂ、Ｄ、Ｄ’、ＭおよびＮで当てはまり、それらの全ては８つの地理的変種の内 ７種に見られそして本発明者の２０のプラーク精製分離株の内の１３で見られる 。へりオティス種の５ＮＰＶ中に見られた可変性の高いこと（Ｇｅｔｔｉｇおよ びＭｅＣａｒｔｈｙ、１９８２．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１１７　：　２４５−２ ５２）が種々の地理的条件下でウィルス集団に利点を与えるか否かは未だ決定さ れないでいる。 ＨｚＳ−１５の制限酵素地図（第８図）は以前に発表されたクネルおよびサマー ズの地図（１９８４，Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６５：４４５−４５０）とは実 質的に異なっている。例えば、以前の地図ではシ１旧断片におよびＩがＨｉｎｄ 　ｍ断片Ｂ内に位置していた０本発明者のハイブリッド形成分析ではこれらのＢ ａｍＨＩ断片はＨｉｎｄｌｌ［−Ｃ内に位置していた。更に、ＰｓｔＩ断片りお よびＥはＨｉｎｄ　ｍ−ＢおよびＪとハイブリッドを形成するが、以前の地図で はこれらの断片は別々である０本発明者の地図はクローン化したＨｚＳ−１５断 片のゲノム切断物によるハイブリダイゼーション結果および種々のプラーク精製 株間のハイブリッド形成分析に基づいて構成されている。以前の地図での誤りは 、ハイブリダイゼーション形成分析において恐らく偽陽性をもたらすウィルス集 団の異種性の高さに起因すると考えることができよう。 ＨｚＳ４５プラーク精製株での研究によって、本発明者は全体のゲノムの大きさ が僅かに異なっているとの推定を得た。クローン化した個々の断片の二重切断お よび分析に基づくゲノムの大きさに関する本発明者の推定は以前に報告された（ ＫｎｅｌｌおよびＳｕｍｍｅｒｓ＋　１９８４＋上記）１１９ｋｂよりもむしろ 約１３７ｋｂである。しかしながら、これらの価はさほど異なっておらず、多分 ＤＮＡ断片の大きさの推定で予想される変動を反映したものであろう。 プラーク精製株間の可変性は遺伝子型に限定されず、ウィルス粒子の構造蛋白質 にも反映される（第９図参照）０本発明者は閉塞ウィルス蛋白質の内の幾つかが 株間で相異していることを観察した。事実、ＨｚＳＮＰＶの幾つかの異なる地理 的分離株間に以前に観察された相異（ＭｏｎｒｏｅおよびＭｃＣａｒｔｈｙ＋１ ９８４．Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈ、４３：３２−４０）より、１つのエルカ −分離株の株間での相異の方が多かった。 メラニン黒化の度合の相違の正確な理由は、個々の株の細胞溶解能力または成る 組織への向性における比活性に関係があると思われる。細胞溶解が幼虫のメラニ ン黒化応答における差異の原因であるとの証明はメラニン黒化しない株、ＨｚＳ −１５で感染させた幼虫での凍結−融解実験から得られる。メラニン黒化してい ないＲｚＳ−１５感染幼虫は数回の凍結／融解サイクルの後にメラニンが黒化す るであろう、予備の細胞培養データもこの仮説を支持しているが、細胞溶解が主 要ファクターであることを確認するためには更に研究する必要が本発明の組換え へリオティスウイルスの選択は、ポリヘトリン構造遺伝子が組換えウィルスを構 築した結果どのように変わったかによって、多ぐの方法で達成することができる ０例えば、以下に示す組換え体は、閉塞体産生不能性（ＯＢ−）に基づいて同定 し、選択することができよう： （萄　ポリヘトリン遺伝子配列がもはや正しい翻訳読み取りフレーム内にない（ 即ち、相外である）ように、または該配列が翻訳停止シグナルによって中断され るように、異種遺伝子配列またはポリリンカーがポリヘトリン遺伝子配列を中断 している組換え体構築物はポリヘトリン蛋白質を発現せず、それ故閉塞体を形成 しないであろう。 （ロ）各々が、翻訳停止シグナルで中断されていない同一の翻訳読み取りフレー ム内にあるように異種遺伝子配列がポリヘトリン配列を中断している組換え構築 物は融合蛋白質として異種遺伝子産生物を発現するように指令するであろう、し かしながら、該異種遺伝子が、ポリヘトリン遺伝子産生物の結晶化に必須である ポリヘトリン遺伝子配列の領域内に位置している場合、閉塞体は全く形成されな いであろう。 組換えへリオティスウイルスがＯＢ−である場合、組換えウィルスに閉塞体形成 能を取り戻しまたは回復させることが望ましいと思われる。このことは、閉塞体 が感染の水平伝達に利点を与える幼虫宿主系で組換えウィルスが使用されるべき である場合、特に有用であろう。閉塞体形成能を回復するために、別の非必須領 域がポリヘトリン構造遺伝子およびそのプロモーターによって置換されるように 組換えウィルスを更に修飾することができる。このような非必須領域にはｐｌＯ 遺伝子（Ｓａ＋ｉ　ｔｈ等、１９８３．Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　４５：２１５−２２ ５）およびＦＰ遺伝子座（Ｆｒａｓｅｒ等、　１９８５．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 　１４５：３５６−３６１　；Ｆｒａｓｅｒ等、１９８３．Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　 ４７：２８７−３００）があるが、これらに限定されない、このような置換は、 前に説明したようにインビボまたはインビトロでの組換えによって実行できるで あろう、インビボ組換えは、ポリヘトリン構造遺伝子およびプロモーター並びに 側面に位置するへりオティスウイルスＤＮＡ配列を有するトランスファーベクタ ーを使用して達成することができる。　ＯＢ−組換えヘリオティスウイルスと共 にトランスファーベクターを感染性細胞にコトランスフェクションすると、王ヱ 堕での組換えによって、組換えウィルスのポリヘトリン発現能の回復をもたらし 、そして閉塞体を産生ずる。或いは、制限酵素はポリヘトリン遺伝子およびそ（ ７）７”ロモーターを組換えヘリオティスウイルスゲノムの非必須領域に挿入す るために使用できよう、これらの実施態様では、回復した組換え体はＯＢ−の背 景に対して閉塞体陽性（ＯＢ”）として同定することができる。 組換え閉塞体を産生ずるヘリオティスウィルスの同定に関しては多数の試みが可 能である：（ａ）　　前に説明したように、これらの組換えウィルスは、結晶化 に必須でないポリヘトリン遺伝子配列領域を、異種遺伝子配列が翻訳停止シグナ ルで中断されないように異種遺伝子配列で置換するかまたは中断することによっ て、インビボまたはインビトロでの組換えにより構築することができる。これら の組換え体の遺伝子産生物は組換え閉塞体として発現されるので、ＯＢ″背景に 対してＯＢ”ウィルスプラークを選択するためには、ＯＢ−親へリオティスウイ ルス株を使用することが好ましいと思われる。ＯＢ”ウィルスはＯＢ″ウィルス よりも一層屈折性のプラークを形成するので、ＯＢを発生するウィルスはＯＢを 産生じ得ない多数の親ウィルス中のプラークアッセイで検出することができる。 ℃）クローニング／発現組換えウィルスは結晶化に必須でないポリヘトリン遺伝 子配列領域を１つまたはそれ以上の特有の制限／クローニング部位をコードする ポリリンカーで置換または中断することによって、インビボまたはインビトロ組 換えにより構築することができる。得られた組換えへりオティスウイルスは、任 意の異種遺伝子を適当な制限酵素を使用して挿入することができる「カセット」 に類似している。 この実施態様では、中断されたポリヘトリン配列がもはや正しい翻訳読み取りフ レーム内にはないようにポリリンカー配列をポリヘトリン遺伝子内に挿入するこ とが有利であり、この場合にはクローニング部位を有する組換えへリオティスウ イルスはＯＢ−であろう。 その後異種遺伝子を結晶化に必須でないポリヘトリン遺伝子配列領域内に位置し ているクローニング部位に連結し、その結果再配列が翻訳停止シグナルで中断さ れていない正しい翻訳読み取りフレーム内にあって、組換え閉塞体を結晶化し形 成する融合蛋白質の産生を指令する構造が生じるであろう。組換え閉塞体を産生 ずるウィルスはＯＢ″背景に対しＯＢ“プラークとして選択することができる。 組換え閉塞体を産生ずる組換えウィルスを選択する際に、なされるであろう対照 選択実験は、野生型子孫の中でＯＢを製造し得ない組換え体を検出するために野 生型ウィルスＤＮＡ（ＯＢ”）でコトランスフェクションすることである。この タイプのコトランスフェクションで生成した組換え体の同定および性質検討は陰 性の結果の実施態様の実施には不適当であるのかに関して価値ある情報を提供す る。 づいて選択することもできる０例えば、外来抗原決定基の発現を検出するために エリザ法（ｅｎｚｙｇｅ−１ｉｎｋｅｄｉ−ｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓ ａｙ）（ＥＬＩＳＡ）を使用することができる。 酵素をコードする異種遺伝子が導入されている場合、酵素活性に基づいて選択す ることができる。外来ペプチドの化学的反応性に基づく染色技術を使用すること ができる。当該技術分野で知られている多くの他の技術は、発現される外来配列 に従って使用することができ、そしてこれらは本発明の範囲内にある。 組換えウィルスを選択しようと試みる場合、この選択がＯＢ−背景に対してであ ろうとＯＢ”背景に対してであろうと、この選択を助けて他のマーカーを使用す ることが可能である０例えば、選択可能なマーカーをコードする別の遺伝子をポ リヘトリン遺伝子領域に挿入することもできる。ウィルスゲノムに伝達される前 に、この選択可能なマーカーは相対的に明確なりＮＡ断片として存在することが できるかまたは組換えポリヘトリン遺伝子を有するトランスファーベクターの隣 接ＤＮＡ配列に含有されていてもよい。この選択可能なマーカーは、インビボで の組換えが生起するバクロウィルスに対して組換えポリヘトリン遺伝子を用いて コトランスフェクシジンすべきである８次に、選択可能なマーカーをも発現する 組換え体を選択することができる。 当該技術分野で既知のクローン化した多くの遺伝子を選択可能なマーカーとして 使用することができ、これにはベーターガラクトシダーゼのような酵素をコード する遺伝子があるがこれに限定されず、そしてこれは選択するための標準的方法 を有する。 選択用のもう１つの方法は、ポリヘトリン遺伝子に挿入された異種ＤＮＡ配列の 存在をスクリーニングすることである。これは、複製プラークとの核酸ハイプリ ダイゼーシジン形成法（Ｂｅｎｔｏｎ＋Ｗ、Ｄ、およびＤａｖｉｓ、Ｒ。 Ｗ、、１９７７、５ｃｉｅｎｃｅ　１９６：１８０）およびその変法のような当 該技術分野で既知の技術によって達成することができる。 選択用に使用することができる、当該技術分野で既知のもう１つの技術は、マー カー遺伝子の不活性化または置換によるマーカー遺伝子活性の喪失である。この 実施態様では、組換えポリヘトリンを取りまいている配列と相同な配列が側面に 位置している選択マーカーを有する親バクロウィルスを構築することができる。 例えば、ポリへドリンプロモーターの下流にベーターガラクトシダーゼ遺伝子を 有する親バクロウィルスを構築することができる０組換えポリヘトリン遺伝子と 構築された親株との間のインビボ組換えによって、ベーターガラクトシダーゼ遺 伝子を取りまいている、親の側面配列との相同性によって組換えポリヘトリン遺 伝子の挿入が生じる。組換えポリヘトリン遺伝子の挿入およびベーターガラクト シダーゼ遺伝子の不活性化または置換が生じる組換えは、既知の方法（Ｍｅｓｓ ｉｎｇ、Ｊ。 等＋　１９７７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７４： ３６４２）によるベーターガラクトシダーゼ活性の欠如によって選択することが できる。 上記した組換えへリオティスウイルスは、へりオティスウイルスを増殖し得る細 胞系および幼虫を含むがこれらに限定されない多数の宿主系中で異種遺伝子産生 物の発現を指令するために使用することができる。 本発明のこの実施態様に従って使用することができる幾つかの有用な細胞系およ び幼虫系は以下の節で記載する。 ５．３．１．へ１オー　ス　　、 大部分の５ＮＰＶのインビトロ増殖の達成は困難である。 最初にグツドウィン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）によってコツトンボオルワーム（ｃｏｔ ｔｏｎ　ｂｏｌ１ｗｏｒｓ＋）　、即ち２Ｊ」２ヒ仁入　亙ヱの幼虫卵巣および 脂肪体から確立されたＩＰＬＢ−ｆ（Ｚ１０７５細胞系（Ｇｏｏｄｗｉｎ、Ｒ， Ｈ，等＋　１９８２．１ｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１１．Ｄｅｖ。 Ｂｉｏ、１８：８４３−８５０）はＨｚＳＮＰＶの増殖を支持することができる 。しかしながら、１００％の感染をこの系で定型的に達成することは困難である ことが多数の報文で示されている（Ｇｒａｎａｄｏｓ、Ｒ，Ｒ，等＋１９８Ｌ　 Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６：７１−７９；　Ｙａｏ＋ａｄａ、に、等、 １９８２．Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈ、３９：１８５−１９１）。 核内ＯＢの存在で測定するとき５０から７０％の感染しか得られないのがより一 般的であり、それ故、ＨｚＳＮＰＶ複製方法の分析に対するこの系の有用性は非 常に限られている。インビトロでのＨｚＳＮＰＶの生産性を高めるための努力に おいて、幾人かの研究者がへりオティスゼアから新規細胞系を確立した（Ｇｏｏ ｄｗｉｎ等、上記；　ＦＩｃｌｎｔｏｓｈ＋Ａ、Ｈ，等、　１９８５．　Ｉｎｔ ｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　２３：１５０−１５６）　、マンキントッシｓ　（Ｍｃ ｌｎｔｏｓｈ）およびイグノッホ（Ｉｇｎｏｆｆｏ）（１９８１，Ｊ、Ｉｎｖｅ ｒｔ、Ｐａｔｈｏｌ、３７：２５Ｂ−２６４）　　は”＝’＋−，＜ｘ亙ヱまた はニュ左主土ス　ビレジーンズ（ｖｉｒｔｅｃｅｎｓ）に由来する細胞系でＯＢ の製造に関してＨｚＨＰＶの複製を証明した。 Ｈｚ１０７５細胞系の定型的な継代培養（Ｇｏｏｄｗｉｎ等、　１９８２゜Ｉｎ 　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１１．Ｄｅｖ、Ｂｉｏ、１８：８４３−８５０）中に、本発 明者は類似の形態を有する細胞のクローン性生育をしばしば観察した。この細胞 系は異種混交性であり、そして本発明者はこの集団の細胞の全てが多分ＨｚＳＮ ＰＶで同じ様には感染しやすくないとの可能性を考慮した０本発明者は、サブク ローンの単離および特徴決定によって、Ｈｚ　Ｓ　Ｎ　Ｐ、Ｖに感染しやすく且 つ感染でより多くの閉塞体を産生ずる細胞系が提供される可能性があると推論し た。 本明細書の実施例の特別な実施態様で、本発明者は本発明の実施に使用できるＩ ＰＬＢ−Ｈ２１０７５昆虫細胞系由来のクローン細胞株（ｃｅｌｌ　５ｔｒａｉ ｎ）の単離および特徴決定を記載する。これらの株は、ＨｚＳＮＰＶで感染され ると異なる増殖特性、形態およびウィルス産生性を示した。これらは本願明細書 で特定する０本発明者はまた、細胞株の特徴を求めそしてそれらが全てへりオテ ィスゼアに由来することを証明するためにアイソザイムマーカーも使用した。 ＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５細胞系は異種細胞の集団からなっており、この異種混合 性はＨｚＳＮＰＶを接種しても１００％の感染が得られない原因の１部であるよ うに思われる。個々の細胞株のクローニングによって感染に対し更に均質な応答 を得るために、本発明者はＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５から得た１２０株をクローン 化し、そして特徴を決定した。 クローン化した細胞系は全て、本発明者の培養条件下でＨｚＳＮＰＶ分離株Ｈｚ Ｓ−１５で接種してもどれもが１００％の感染が可能でなかった点で親細胞系と 類似していた。 各細胞株は増殖キネティクス（第１０図１皿）、主要細胞形態およびウィルス複 製能（以下の第１表参照）に僅かな相違を示した。 主要細胞形態は大部分の細胞系で異なっていたが、２つの株だけ（ＵＮＤ−Ｂお よびＵＮＤ−Ｇ）はかなり同質の細胞形態を示した。他の株は、それらがクロー ン性集団に起源していたにも関わらず幾つかの異なる形態からなっていた。細胞 株は全て、親細胞系と同様に線維芽細胞であった（Ｇｏｏｄｗｉｎ、Ｒ，Ｈ，等 、１９８２．Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１８：８４３−８５０）。 細胞株の集団倍加時間は３７．３３から６５．４８時間の間で広範に変動し、親 細胞系はほぼ最大（６３，１５時間）の倍加時間であった。親細胞系の定型的継 代培養では類似の増殖キネティクスを有する細胞を選択しないように思われる。 多分、混合細胞集団は何らかの方法で、恐らくはより早い増殖株の増殖を抑制す ることによって、個々の細胞株の増殖を規制している。 感染した細胞およびＯＢかまたはＥＣＶ産生かのいずれかの割合にも広範な変動 性があった。感染培養物中でのＯＢ産生を推定するために本発明者が測定した幾 つかのパラメータは感染細胞の割合または相対的細胞増殖率のいずれとも関連づ けることができなかった。感染培養物由来のＥＣＶ比濃度はいかなる他の測定し たパラメーターとも無関係であった。 クローン化した細胞株の内の２つ、即ちＵＮＤ−ＨおよびＵＮＤ−には親細胞系 のＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５よりＯＢ産生の幾つかの個々のパラメータが統計的に 高い価であった０株ＵＮＤ−Ｈは怒染細胞当たりのＯＢ産生が一層多かったが、 ＵＮＤ−には培養物当たりのＯＢ産生が一層多かった。これらの観察は上ユユプ 土之ヱ三ｌ（と江崩且旦ｎ皿）細胞株ＴＮ−３６８に関するより早期の研究（Ｆ ａｕｌｋｎｅｒ、　ｐ、等。 １９７６、ｉｒｉ　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｉｏｌｏｇｙ、ａｎｄ 　Ａｇｒｉｅｕｌｕｒｅ、Ｋｕｒｓｔａｋ、Ｅ＋およびＭａｒａｍｏｒｏｓｃｈ 、に、＆Ｌ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅ１ｎ　Ｙｏｒｋ。 ｐｐ、３４７−３６０；Ｖｏｌｋｍａｎ、　Ｌ、Ｅ、およびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｍ 、Ｄ、＋１９７６＋ｉｎ　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔ 、ｕｒｅ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｉｏｌｏｇｙ 、ａｎｄ　Ａｇｒｉｃｕｉｔｕｒｅ、Ｋｕｒｓｔａｋ、Ｅ。およびＭａｒａｍｏ ｒｏｓｃｈ＋に、＋　曙、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　 ｐｐ。 ２８９−２９６）と対照的である。　ＴＮ−，３６８のクローン化した細胞株は 細胞倍加時間（Ｆａｕｌｋｎｅｒ＋Ｐ、等、　１９７６、上記）およびオヱしＬ グラニ乙乙　−丸旦ｌΔ」しとた囲ＰＶ　（ＡｃＭＮＰＶ）プラーク生成能（Ｖ ｏｌｋ＋ｐａｎ、Ｌ、Ｅ、およびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｍ、Ｄ、＋１９７６９．！、 りに関して親細胞系と識別可能であったが、ＴＮ−３６８クロ一ン化細胞株のい ずれもクローン化していない親細胞系より良好にはＡｃｌ’１ＮＰＶを複製しな かった。 培養物当たりの全体的平均ＯＢ数の値は２づの独立変数、即ち細胞当たりＯＢお よび感染細胞のパーセントに基づいての推定を示す。本発明者は培養物当たりの 平均ＯＢ数がＯＢ産生性の良好な表示であると考える０例えば、ＵＮＤ−に株は 細胞当たりのＯＢおよび感染細胞のパーセントは共にＨ２１７０５とさほど異な っていなかったが、培養物当たりの平均ＯＢはかなり異なっていた。このことは Ｈｚ１０７５細胞系と比較したＵＮＤ−に産生性の別個の観察と良好に相関して いる。 全ての細胞株がＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５細胞系に由来するとの！認はアイソザイ ム染色プロフィールの比較によった（第１１図参照）０本発明者はまた幾つかの 無を椎動物細胞系のアイソザイムプロフィールも比較しく第１２図参照）、そし てこれら全てを酵素？１Ｄ）ＩおよびＬＤ）ｌを相前後して使用して明白に分離 できることを見い出した。 このことは、多数の酵素および２つの異なるゲル系を使用してもＩＰＬＢ−５Ｆ ２１ＡＥとＩＰＬＢ−Ｈｚ１０７５を分離できなかったとのより早期の報文（Ｂ ｒｏｗｎ、Ｓ、Ｅ、およびＫｎｕｄｓｏｎ。 Ｄ、Ｌ、＋　１９８（Ｌ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１６：８２９−８３２：　Ｔａｂ ａｃｈｎｉｋ、Ｗ、Ｊ。 およびＫｎｕｄｓｏｎ、Ｄ、Ｌ、、１９８０．　工ｎｖｉｔｒｏ１６：３８９− ３９２）と対照的である。 好ましい実施態様では、ＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５ＵＮＤ、に細胞系は、迅速且つ 高い力価でヘリオティスウィルスを増殖する能力のため、そしてそれ故そのプラ ークによって同定が可能になるので、本発明の発現ベクター／宿主系で使用する ことができる。 もう１つの好ましい実施態様では、本発明に従って宿主として使用される任意の ＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５細胞系の増殖培地は、感染力を約１００％に改善するた めに１％のウシ血清アルブミンおよび２　ｇ　／　１２のＬ−グルタミンを含有 すべきである０本発明の発現／宿主系で宿主として培養細胞を使用するとき、該 細胞培養物をＯＢでよりはむしろＥＣＶで感染させることが好ましい、感染性細 胞培養上清液は液体アガロースを最終濃度が０．１％になるように加えて安定化 することができる。或いは、スミスおよびサマーズが記載した技術（１９７８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８４：３９０−４０２）のような既知の方法および本願明細書 の以下の７．１．４．節に記載する変法に従ってウィルス粒子をＯＢから単離す ることができる。 ５．３．２．弛−Ω−組−聡一及 本発明の組換えバクロウィルスがへりオティスプロモーターのコントロール下で 増殖し、異種遺伝子を発現することができる任意の細胞系を使用することができ る０例えば、このような細胞系には次のものがあるがそれらに限定されるもので はない：上述の５．３．１．節に記載したへりオティスゼア細胞培養；スポドブ テラフルギベルダ（鉢堕匹旦、工二臼−１ｔ」：１Ｌ８．ｉ」１ｊＬエコｉａ） 　ＩＰＬＢ−ＳＦ２１八Ｅ細胞：エスチグメネ　アクレア（ハあｌ咀匣匹匹紅Ｂ ＴＩ−ＥＡＡ細胞；上ユニ１上乞ヱ三土ＴＮ−３６８細胞；上ユユエ止之ヱ三土 ＢＴＩ−ＴＮ４Ｂｉ、　ＢＴＩ−ＴＮ５Ｆ２．　ＢＴＴ−ＴＮ５Ｆ２ＰおよびＢ ＴＩ−ＴＮ５Ｆ２Ａ細胞（Ｇｒａｎａｄｏｓ、Ｒ，Ｒ，等、　１９８６゜Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ　１５２　：　４７２−４７６）　；ヱｌ」運トｉ　ブラ」Ｃし毛（ Ｍａｍｅｓｔｒａ　　ｂｒａｓｓｉｃａｅ）　Ｍｂ０５０３およびＭｂ１２０３ 細胞（Ｍｉｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒ、　Ｈ，Ｇ、等、　１９７６、　Ｚ、Ａｎｇｅ ｗ、　Ｅｎ　ｔｏｍｏｌ　、　８２（３）　：３０６−３２３）　；ニュ土土土 久亙ヱＢＣＩＲＬ−Ｈｚ−ＡＭ　１．２または３細胞（ＭｃＩｎｔｏｓｈ、Ａ、 ）１．およびＩｇｎｏｆｆｏ、　Ｃ，Ｍ、、１９８１゜Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａ ｔｈｏｌ、　３７：　２５８−２６４）：ニュし九立、Ｌ衣　ｅｌｙジーンズＢ ＣＩＲＬ−ＨＶ−ＡＭＩ細胞（同上）；並びにそれらの誘導細胞系。 インビトロのバクロウィルス複製の有益な考察に関してはフォルクマン、エル・ イー（Ｖｏｌｋｎ＋ａｎ、Ｌ、Ｅ、）およびクヌッドソン、ディ・エル（Ｋｎｕ ｄｓｏｎ＋Ｄ、Ｌ、）＋　１９８６年、「バクロウィルスのインビトロ複製」、 ザ・バイオロジー・オブ・バクロウィルスズ（Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆＢ ａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）、　　Ｉ巻、バイオロジカル・プロパティーズ・ア ンド・モレキュラー・バイオロジー（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｐｅｒｔｉｅ ｓ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、　　グラナトス。 アール・アール（Ｇｒａｎａｄｏｓ、　Ｒ，１，）およびビー・エイ・フェデリ シ（Ｂ、Ａ、Ｆｅｄｅｒｉｃｉ）ｉ、　　ＣＲＣプレス（Ｐｒｅｓｓ）　＊フロ リダ州、を参照、これは本願明細書に引用する。 ５．３．３．　　のバクロウィルスでの本発明のもう１つの実施態様では、へり オテイスプロモーターのコントロール下で発現した異種遺伝子は任意のバクロウ ィルスゲノム（これにはＮＰＶおよび顆粒症ウィルス（ＧＶ）が含まれるがこれ らに限定されない）内に含有されていることができる。　ＧＶのポリヘトリン（ グラヌリン）およびＮＰＶのポリヘトリンが１群の関連蛋白質を形成することが 研究によって示されている（Ｒｏｈｒａ＋ａｎｎ、Ｇ、Ｆ、等、１９８１．Ｊ、 Ｍｏ１．　　Ｅｖｏｌ、　　１７：３２９；Ｓｍ１ｔｈ。 Ｇ、　Ｅ、およびＳｕ＋ｌｌ＋ｌ１ｅｒｓ、　Ｍ、Ｄ、、１９８１．　Ｊ、Ｖｉ ｒｏｌ、　３９：１２５）。 それ故、異種遺伝子およびへりオティスプロモーターは、多分ウィルスの本質的 な機能に悪影響を与えることなり、（上述の５．２．１．に記載したような）組 換えＤＮＡ技術で顆粒症ウィルスまたは他のＮＰＶ中に巧みに操作することがで きる。本発明に従って使用することができるＮＰＶには次のものがあるが、それ らに限定されない；　ＡｃＭＮＰＶ、　ＨｚＳＮＰν、−”５ｌｆ−ａ入　？Ｌ 、５ジーンズＮＰＶ、　Ｓ、ユ上ｉ丈久（１ｉｔｔＯｒａ１ｉＳ）ＮＰＶ、立ユ １土之ヱ土立（ｈ山凪犯ｎ匹）ＭＮＰＶ　、九とユヱメロネ５ＮＰＶ、オリシア 　シュードチュガタ（ｏＬＵＬｉＡ　　匹匹並−７５ＮＰＶおよびＭＮＰＶ、　 、ｔ　”；　７］ロＢＬｋ元り久Ｎ、文土主土ユＬ二（Ｓｅｒｔｉｆｅｒ）　５ ＮＰＶＳＴ、パルドサ（胆り並ｕ）　５ＮＰＶ、　　”：２”７”）Ｌ’ｔＴ　 　土工ＭＮＰＶ並びに：ＬＭ　−７”　−−７）Ｌｔ−Ｖ＜）ｂ　”　ＭＮＰＶ 　（Ｖｌａｋ、Ｊ、ｌ’！、およびＲｏｈｒｍａｎｎ、　ｃ、Ｆ、＋上記）。本 発明に従ッテ使用することができるＧｖには次のものがあるがそれらに限定され ない：Ｐ、７’立之左工ＧＶＳ孟λ±久人主ヱー久上ＺＣＶ　。 上皿ヱ王ヱ　イン　−ブンクー−（Ｐｌｏｄｉａ江旦■匹−ｃｔｅｌｌａ）　Ｇ Ｖ、　Ｔ、＝ｘ　ＧＶ　、ユｉＡ上ム±主ヨニ史土よ一且針ＣＶおよびユユス上 ム不立ヱｌヱ王立±ＧＶ　（Ｖｌａｋ。 Ｊ、Ｍ、およびＲｏｈｒ＋＋＋ａｎｎ、Ｇ、Ｆ、、上記；　Ｔｗｅｅｔｅｎ、に 、Ａ、等。 １９８１、塩！廊山江」叩工４５：３７９−４０８）。 好ましい実施態様では、同種遺伝子型を有するプラーク精製単離体を親バクロウ ィルスとして使用すべきである。更に、組換えバクロウィルスは、本発明に従っ て使用される宿主系に関して特に有利な特性、例えば高感染力、高力価および緩 慢なメラニン黒化を有する親ウィルスから構築することができる。 適当なカセットベクター、トランスファーベクターおよび／またはカセット発現 ベクターは所望の組換えを容易にするために構築することができる。他のバクロ ウイルスにおけるへりオティスプロモーターのコントロール下での異種遺伝子の 発現によって、使用した特別の宿主でのウィルス感染および増殖の最大効率を達 成するためにそのベクター株の操作が考慮される。 例えば、’　ＡｃＮＰＶはＨｚＮＰＶよりも一層効率的にスポドプテラフルギペ ダル細胞を感染させる。それ故ヘリオティスボリへドリンプロモーターおよび異 種遺伝子はＳ、ヱ五玉ユｌ土細胞で得られる発現値を高めるためにＡｃＮＰＶ中 で発現させることができる。 ５．３．４肋−１ｌＬ−主 本発明の組換えポリヘトリン遺伝子を発現するバクロウィルスは種々の宿主昆虫 幼虫の感染によって増殖しおよび／または大量生産することができる。実験室的 幼虫集団を使用するバクロウィルスの増殖および分離は以前に記載した（例えば 、Ｗｏｏｄ、Ｂ、Ａ、等、　１９８１゜Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ、　Ｐａｔｈｏ ｌ、　３８　：　２３６−２４１　：　Ｉｇｎｏｆｆｏ、Ｃ，Ｍ。 およびＧａｒｃｉａ＋Ｃ，＋１９７９．　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｅｎｔｏｍｏｌ　 ８　：　１１０２−１１０４）　、組換えポリヘトリン遺伝子を発現するウィル スの増殖および作製に使用することができる幼虫宿主には工皿第１表に示したよ うな種があるが、これらに限定されるものではない。 第１表 本発明の組換えポリヘトリン遺伝子を発現するウィルスの増殖および作製に使用 できる昆虫の幼虫種ｚ’二仁−ｘ：）、、＋ヱ（Ｂｏｄｄｉｅ）上１ニブ土之ヱ 三土（Ｈｕｂｅｒ） ユニ久上左不立グコ」仁元五ノ。 ブ］し４土１−イン　−プンクーー 特別の実施態様では、Ｌ、ヨエまたはＧ、　／三冬旦幼虫　は組換えＡｃＭＮＰ Ｖ、％Ｇ、　Ｌユ主立ＭＮＰＶまたはＴ−、土土？ＩＮＰνの増殖および作製に 使用できるが、）１．−ｔヱは組換えＨｚＳＮＰＶの増殖を持続させるために使 用することができる。 幼虫の繁殖および維持を持続させる任意の飼育条件および飼料組成物を使用する ことができるｅＴ、−’−４またはＨ，−ｔヱ幼虫の繁殖を維持するために使用 できる飼料混合物の１つの例は下記の９．１．で記載する。 Ｈ，−ｔヱ、Ｔ、＝＜またはＧ、メロネラに使用できる飼育条件の例は下記の９ ．２．１．．９．２．２．および９．３．で記載する。幼虫は共食いである（■ え星ニュ主孟王λ亙ヱ）可能性があり、それ故それらは一緒には飼育できない。 それ故、僅か１または２匹の昆虫が各成長容器に分配されるように幼虫を分離す ることが好ましいと思われる。 必要ではないが、微生物のいない環境下で幼虫培養物を維持することが好ましい 、このように維持した培養物は、ヒトに対して毒性またはアレルギー性である物 質をもたらし得る可能性のある外来性微生物は存在しないと思われる。 本発明の更に好ましい実施態様では、昆虫幼虫は外来性および内在性微生物を共 に有さないで培養することができる。鱗翅類（例えば、ユ史を主土久　亙ヱ、上 ユニ１土之ヱ　土工等）は内在性共生微生物を含んでいないので、これらは内在 性および外来性微生物の不存在下で維持することができる。かくして、ヒトに病 原性の微生物による汚染の危険を除去できる。これらの微生物のない条件を達成 しそして維持する際には昆虫卵を殺菌することができる（別久産、過酢酸処理に よって、下記の９．３．１Ｍ）　、昆虫飼料混合物は、■■放射線を使用して、 殺菌することができる。 更に、上記の５．２．２．節で考察したように、ウィルスのメラニン非沈着株は 、感染幼虫から得た異種蛋白質の収量および純度を最適にするために使用するの に好ましい。 本発明の特徴の他の実施態様では、本発明の組換えバクロウィルスを増殖させる ために巨大幼虫を作製して使用することができる。°幼若ホルモン（Ｊ）Ｉ−） エステラーゼの選択的阻害によって、Ｊ）Ｉ力価の維持および巨大幼虫の作製を もたらすことが示されている（Ｓｐａｒｋｓ＋Ｔ。 Ｃ６等、１９８３．　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３：５２９：　Ｈａｍ ｍｏｃｋ、Ｂ、Ｄ。 およびＲｏｅ、　Ｒ，Ｍ、、１９８５．　ｌ’１ｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　 ＩＩＩＢ：４８７）。 本発明の異種蛋白質の大量生産において、このような幼虫を使用すると収量を非 常に増加させることができる。 ５．３．５．　　０　　　での 本発明の組換えポリヘトリン遺伝子は、ワクチンウィルス、アデノウィルス、レ トロウィルス等のような他のウィルス、酵母および細菌を含むがこれらに限定さ れない微生物に係わるベクター／宿主系でも発現することができる。適当なカセ ットベクター、トランスファーベクターおよび／またはカセット発現ベクターは 適当な組換えを促進するために使用することができる６例えば、細菌プラスミド カセットベクターはヘリオテイスプロモーターおよびポリリンカー領域を含むよ うに構築することができ、これはポリリンカー中の制限部位への異種遺伝子の挿 入および適当な細菌株の形質転換によって、ヘリオティスプロモーターのコント ロール下で異種遺伝子の発現を提供する。 １つの実施態様として、細菌細胞内での組換えポリヘトリン遺伝子の発現は多数 の魅力的な利点を有している。遺伝子融合体をバクロウィルスに転移させ、そし て得られた組換えウィルスを同定し特徴を決定する必要がなくなるであろう。更 に、昆虫細胞を培養するのに比べて細菌細胞を大量に増殖する方が安価で且つ容 易である。当該技術分野で知られている多くの種々の細菌株およびプラスミドタ イプは、宿主がベクターの組換えポリヘトリン遺伝子の適当な発現を可能にする 限り、本発明の実施態様で使用できる。 細菌発現系での生産は上記５．２．１．節で記載したのと同一タイプの遺伝子操 作を使用することによって達成することができる。１つの例として、組換えＯＢ 影形成望ましい特別の実施態様では、遺伝子コードの縮合を利用して、新規で且 つ特有の制限部位を有し、しかも野生型ポリヘトリン遺伝子と同一のアミノ酸を 未だにコードしているポリヘトリン遺伝子セグメントを合成することができる。 かくして、「ポリへドリンボリリンカー」配列が創生され、これは親ポリヘトリ ン遺伝子の残部に連結でき、そして特をの制限部位に外来エピトープをコードす る配列を挿入するために使用することができる。このような遺伝子構築によって 、ポリヘトリン遺伝子に多数の変化をもたらすように処理し易（なる可能性が提 供される。更に、遺伝子構築は大腸菌発現ベクターへの挿入に適する、近傍に位 置する制限部位で設計することができる。このような構築は大腸菌での使用に限 定されない、これはまたバクロウィルスまたは他の系での使用の際に巧みに処理 することができる。このようなオウトグラファポリヘドリンボリリンカーの１例 は第４図で示す。第４図はオウトグラファカリフォルニカのポリヘトリン蛋白質 のアミノ酸５８　（Ｂａｎ＋旧部位での）に対するアミノ末端をコードする遺伝 子セグメントを示し、このセグメントはまたアミノ酸９．１９．２７および４６ に相当する位置にそれぞれ新しいＰＶｕＩ、　５ｃａｌ＋　Ｂｃｌ　ＩおよびＸ ｂａ　Ｉ部位も有している。　ＡｃＭＮＰＶポリヘトリン遺伝子の３′末端を有 する２キロ塩基対のＢａｍＨＩ断片の連結によって完全な遺伝子が再構築される 。特有の制限部位は、新しい抗原決定基をコードする合成オリゴヌクレオチドを 有する遺伝子の５′断面での小さな領域の置換を促進することができる０本発明 に使用するヘリオティスボリへドリンボリリンカーは類似の方法で構築すること ができる。 合成遺伝子の５′にじかに接する特有のＥｃｏＲ１部位は大腸菌発現ベクターの ＥｃｏＲＩ部位への融合遺伝子のクローニング化を可能にする。例えば、使用可 能なベクターは大腸菌発現ベクターＰＫ２２３−３　　（ファルマシア社）であ る、このプラスミドはｔａｃプロモーター（ｄｅ　Ｂｏ６ｒ。 Ｈ，Ａ、等、　１９８３＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ 、　７８：２１）および特有のクローニング部位の上流にシャイン−ダルガノ配 列を含有している。更に、クローニング部位の下流に強いリポソーム末端配列が ある。かくして、ＰＫ２２３−３プラスミド構造によってそのクローニング部位 に挿入された遺伝子の効果的に規制された発現が可能にされるものと思われる。 適当なりローニング部位および発現シグナルを有する多数の他のプラスミドタイ プも使用することができる。 閉塞体を形成し得る組換え融合ポリヘトリン蛋白質が産生される本発明の特別の 実施態様では、適当なベクター／宿主系での構築および発現によって、このよう な系で発現される組換えポリヘトリンが結晶化するか否かが決定されよう。蛋白 質がインビボで結晶化しない場合、溶解したポリヘトリン蓋白質はインビトロで 精製しそして結晶化できる（Ｓｈｉ−ｇｅｉａｔｓｕ、　Ｈ，および５ｕｚｕｋ ｉ、Ｓ、、１９７１．　Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈｏｌ、　１７：３７５−３ ８２）、かくして、組換えポリヘトリン遺伝子の発現によって、新しいエピトー プを露出しているポリヘトリン結晶を発生させることができる。１例として、第 ４図のポリリンカー配列を使用しそしてＸｂａ　Ｉ部位とＢａｍ旧部位かまたは Ｂｃｌ　１部位かのどちらかとの間でセグメントを置換することによって、アミ ノ酸３７〜４９間の推定上の修飾可能領域での新しい決定基の挿入が可能になる 。 抽１部位は蛋白質のアミノ末端に決定基を加えるために使用することができる。 へりオティスポリへドリン遺伝子は、結晶化して閉塞体を形成し得る本発明によ る組換えポリヘトリン蛋白質の細菌内での発現をもたらすために、類似の態様で 操作することができる。 上述の考察は組換えポリヘトリンのクローニングおよび発現に使用し得る操作お よび構築のタイプの例としてのみ意図したものである。他のベクター、宿主およ び合成遺伝子配列は本発明の組換えポリヘトリンを発現させるために類似のＪ３ 様で操作することができる。 ５．４．！ＪＵ　　−の　　− へりオティスプロモーターのコントロール下で発現した異種遺伝子産生物の単離 は、蛋白質の精製用に当該技術分野で知られている任意の技術、即ちクロマトグ ラフィー（例えば、高圧液体クロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマ トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイジングカラムクロマト グラフィー）、遠心分離、分画溶解度、等電点電気泳動および２次元ゲル電気泳 動を含むがこれらに限定されない技術によって可能である。 ５−４−１−　ｊｌｊｊｔ人 分泌される非融合異種蛋白質は標準的技術によって細胞培養培地から単離するこ とができる。この異種蛋白質が内在性またはプラズマ膜関連である場合には、宿 主細胞は、当該技術分野で知られている種々の技術、即ち界面活性剤溶解、ダウ ンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモシネ−ジョン、音波処理、浸透圧ショック、フレンチ プレスの使用等を含むがこれらに限定されない種々の技術によって破壊すること ができ、その後所望の破砕細胞フラクションを単離することができる（標準的技 術、例えばＦｅｌｄｍａｎ等、１９８３．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４５　：　７ ８２−７９１の遠心分離によって）、異種蛋白質に対するモノクローナル抗体が 利用できる場合には、イムノアフィニティクロマトグラフィーが有効な精製手段 として使用できる（Ｇｏｄｉｎｇ＋Ｊ、Ｗ、、１９８３＋Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ 　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ　　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、 ６　章＋　　　”Ａｆｆｉｎｉｎｙ　　Ｃｈｒｏｓａ−ｔｏｇｒａｐｈｙＵｓｉ ｎｇ　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　”、　　Ａｃａｄ ｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、＋Ｌｏｎｄｏｎ、　ｐｐ、１８Ｂ−２０７）。 ５．４．２．　　鳳金ｌｎｉ主主史 融合蛋白質である本発明の組換えポリヘトリンは上記で考察した任意の技術によ って精製することができる。しかし乍ら、個々の分子に依って、融合産生物は溶 解度の変化または細胞局在化のような特有の特性に従って異なる精製方法を必要 とすることがある０例えば、へりオティスプロモーターのコントロール化での組 換え融合ポリヘトリンの細菌中の発現によって組換え蛋白質を含有する細胞質閉 塞体を形成させることができる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｄ、Ｃ，等、１９８２， ５ｃｉｅｎｃｅ　２１５：６８７）。 このような８体からの蛋白質の回収は当該技術分野で知られている方法によって 達成することができる（Ｂｕｉｌｄｅｒ等、米国特許第４，５１１，５０２号； 　０１ｓｏｎ等、米国特許第４．５１１．５０３号；　Ｊｏｎｅｓ等、米国特許 第４，５１２．９２２号；　０１ｓｏｎ等、米国特許第４，５１８．５２６号； 　Ｂｕｉｌｄｅｒ等、米国特許第４，６２０．９４８号）、細菌内で過剰に産出 された組換え蛋白質はまた、驚く程該蛋白質を安定化して精製を促進する集合体 を形成することもできる（Ｃｈｅｎｇ＋ｙ、　−ｓ、　、等、　１９８１．　Ｇ ｅｎｅ　１４：１２１−１３０）、更に、組換え蛋白質を過剰に産出する細菌は 通常の細菌密度に比べて密度が上昇することに基づいて分離することができる（ Ｃｈｅｎｇ、米国特許第４，４８０．０３８号）。特定の実施態様においては、 組換えポリヘトリン蛋白質を認識するモノクローナル抗体（ポリヘトリンかまた は異種エピトープかのどちらかに向けられた）を有効な精製手段としてイムノア フィニティークロマトグラフィーで使用することができる（Ｇｏｄｉｎｇ、　Ｊ 、Ｗ、＋１９８３．　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｊｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒ１ｎｃ ｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　６章どＡｆｆｉｎｉｔｙＣｈｒｏｍ ａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ″、Ａｃａ−ｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ＋　　Ｉｎｃ、、Ｌｏｎｄｏｎ＋ｐｐ 、１８８−２０７）ｅ５．４．３．　　皿Ｊしく澗ＪＬ生 ＯＢは公知技術によって多数の宿主細胞から精製することができる（例えば、下 記７．１．４．節およびＴｗｅｅｔｅｎ。 Ｋ、Ａ、等、１９８１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　４５　：　３７９ −４０８参照）。 これら技術は本発明による組換えＯＢを精製するために使用することができる。 宿主細胞には、バクロウィルスが増殖してＯＢを産生じ得る細胞系および幼虫が あるが、これらに限定されない。例えば、このような細胞系にはｘ−Ｈ）’７” 　−−ｔ７ｂ＋−＜７ｕ　’ＩＰＬＢ−ＳＦ−２１ＡＥ細胞、へりオティスゼア ＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５細胞、孟不テスエイジ二至工（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐ ｔｉ）　ＡＣＴ−１０細胞、エスチグメネアクレアＢＴＩ−ＥＡＡ細胞、上１ユ ニ止之ヱ三王ＴＮ−３６８細胞およびそれらの誘導細胞系が含まれるが、これら に限定されない０組織培養細胞の感染は当該技術分野で知られている標準的な方 法によって達成することができる（Ｓ＋＋＋ｉｔｈ、　Ｇ、および５ｕｌｌｌｌ ｌｅｒＳ＋Ｍ−＋　１９７！Ｌ　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　３０＝８２８）、特別の実 施態様では、ス±上１元ｉ　フルギペ旦細胞はオゴし上ｊ二Ｌ２１−　及ユ」ラ ッｈ五立ＭＮＰＶを用いて１〜２　ｐｆｕ／細胞で感染させることができる。次 いで、ポリヘトリン蛋白質は当該技術分野で既知の技術によってＯＢから精製す ることができる０例えば、ポリヘトリン蛋白質は、０．ＩＭ　ＮａｚＣＯｓ（ｐ Ｈ１１）、０．１７Ｍ　ＮａＣＬ。 １ｍＭ　ＥＤＴＡ中で精製閉塞体をインキュベートしそして溶解した蛋白質をＳ 讐５０．１０一ター中４℃で３０分間２４．０００ｒｐ−で回転させてウィルス 粒子および不溶物を除去することによって精製することができる。可溶化したポ リヘトリンは一２０″Ｃで貯蔵でき（Ｈｕａｎｇ、　Ｙ、Ｓ、等、　１９８５゜ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１４３：３８０）　、そして調製品の均質性は、数ある方法 の中で、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定することができる 。 補足方法または代替方法として、組換えポリヘトリン蛋白質に向けられたモノク ローナル抗体をポリヘトリン蛋白質精製の有効な手段として使用することができ る０例えば、単離した組換えＯＢ調製品は可溶化し、組換え尿すヘドリン蛋白質 をイムノアフィニティクロマトグラフィーによって精製しくＧｏｄｉｎｇ＋　Ｊ 、Ｗ、＋１９８３＋上記）、次いで再結晶して組換えＯＢの精製調製品を形成さ せることができる。この方法には、結晶溶解に必要な苛酷な条件の後でさえ依然 として抗体に結合し得る抗原が必要である。 ５．５　　　　　　り　　チ　　ン ５．５．１．組換えポリヘトリン遺伝子によって発現される外来エピトープの免 疫能力の証明 本発明による組換えポリヘトリン遺伝子によって発現される病原性微生物のエピ トープの免疫能力の証明はワクチン製剤化前に必要な段階である。外来エピトー プの免疫能力は組換えポリヘトリン遺伝子産生物で免疫化した後で試験動物の免 疫応答をモニターして測定することができる。 閉塞体を形成しない非融合異種蛋白質および組換えポリヘトリンは当該技術分野 で知られている標準的技術によって精製することができ（上述の５．４．、５． ４．１゜および５．４．２．＝１９＝Ｗ）　、そして適当なアジュバントと共に 製剤化して免疫応答を高めることができる。適当なアジュバントには、鉱物ゲル 、例えば水酸化アルミニウム、リゾレシチンのような界面活性剤、プルロニック ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン並びにＢＣＧ（ｂａ ｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウムバル バム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＰａｒｖｕｍ）のような有用なヒトアジ ュバントがあるが、これらに限定されるものではない。 免疫化目的用の組換え閉塞体は昆虫若しくは昆虫細胞培養物からの精製によって （±ｉ里下記？、１．４．節およびＴｗｅｅｔｅｎ、に、Ａ、等、　１９８１． 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　、Ｒｅｖ、４５：３７９−４０８の方法によって）また はインビトロでのポリヘトリンの再結晶（Ｓｈｉｇｅｏ＋ａｔｓｕ、　Ｈ，およ び５ｕｚｕｋｉ、Ｓ、、１９７１＋　Ｊ。 Ｉｎｖｅｒｔ、　Ｐａｔｈｏｌ、　１？　＝　３７５−３８２）によって得るこ とができる。 試験動物には、マウス、ウサギ、チンパンンジーおよび最終的にはヒト対象が含 まれるが、これらに限定されるものではない、免疫源の導入方法には経口、皮肉 、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内または他の標準的な免疫化経路がある 。試験対象の免疫応答は少なくとも次の３つの方法によって分析することができ る：（ａ）所望のエピトープを含存する既知標準の病原性分子若しくはその断片 または単離した天然生起病原性微生物に対する得られた免疫血清の反応性、これ は公知の技術、孤工猛エリザ法（ｅｎｚｙｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏ− ｓｏｒｂａｎｔ　ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）　、イムノプロット法、ラジオイ ムノ沈降法等によってアッセイされる、（ロ）免疫血清が病原体の感染力をイン ビトロで中和する能力および（Ｃ）免疫化した動物における感染防御および／ま たは感病原性減弱。 ５．５．２．　　クチン＋１　　の　　えポ１ヘトリン這猛王主生上 病原性微生物に特異的な免疫応答を誘導し得る該微生物の任意の蛋白質エピトー プはワクチン製剤で使用し得る可能性がある。本発明で規定するように、免疫強 化状態で外来エピトープを発現する組換えポリヘトリン遺伝子産生物の生成の証 明がワクチンとして製剤化する前に必要である。 ワクチン製剤にとって有用性のある抗原は種々の評価規準、例えば病原体の感染 力の中和と抗原の関係（Ｎｏｒｒｂｙ＋Ｅ、１９８５＋Ｓｕａ１ｍａｒｙ＋　Ｉ ｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　８５＋　Ｌｅｒｎｅｒ＋Ｒ，Ａ、、　Ｒ，Ｍ、　Ｃｈａ ｎｏｃｋおよびＦ、Ｂｒｏｗｎ（績）、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　ｐｐ、３８８−３８９）、タ イプまたはグループ特異性、患者の抗血清による認識および／または抗原に対し て発生した抗血清の防御効果の証明、によって同定することができる。更に、コ ードされる抗原のエピトープは好ましくは、先々の抗原変動度が少ないかまたは 全くないことを示すべきである。 組換えポリヘトリン遺伝子によって発現されるべきエピトープをコードする遺伝 子配列は、微生物のゲノムＤＮＡからの精製を含むがこれに限定されない当該技 術分野で公知の技術、微生物のＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、組換えＤＮＡ技術ま たは化学的合成によって得ることができる。 組換えポリヘトリン遺伝子産生物はウィルス性、寄生虫性および細菌性起源の疾 病および疾患用のワクチンでの使用可能性を有している。多くのウィルス−特異 性抗原は既知であり、そして本発明のワクチン製剤に導入することができる。例 えば、使用することができエピトープをコードするような抗原および／またはそ の部分には次のものが含まれるがこれらに限定されない：インフルエンザＡ型血 球凝集素：肝炎Ａ型つィルスｖｐ１：肝炎Ｂ型表面、コア若しくはｅ抗原；レト ロウィルスの糖蛋白質若しくはキャブジッド蛋白質；ボリオウイルスキャブッシ ド蛋白質ＶＰｉ；狂犬病ウィルス糖蛋白質；ロ蹄疫つィルスＶＰＩ；単純ヘルペ スウィルス糖蛋白質Ｄ；エプスタイン−バーウィルス１Ｍ蛋白質；偽狂犬病ウィ ルス糖蛋白質；水庖性ロ内炎ウィルス糖蛋白質等。特別の実施態様では、本発明 の組換えポリヘトリン遺伝子産生物はエイズ（ＡＩＤＳ）ウィル７、　（ＨＴＬ ＶＩＩＩ／ＬＡＶ／ＨＩＶ）　ｔｉ蛋白質および／　マタハ−ｔ−＋　７’ジツ ド蛋白質のエピトープからなることができる。このような実施態様は、Ｔリンパ 球細胞の融合および死亡の誘導のような、活性のエイズウィルス糖蛋白質の存在 によって生じる有害な影響の付随的誘導を伴わないで、エイズに対するワクチン を接種する際に特に有用であると思われる。 最近の研究によって、本発明に従ってワクチンに処方できる細菌または寄生虫の 多くの可能性のある抗原が同定された；例えば、エピトープをコードするような 抗原またはその断片（これは本発明に従ってワクチンに処方することができる） にはマラリア抗原（Ｍｉｌｌｅｒ。 Ｌ、Ｈ，＋１９８５．Ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　８５．Ｌｅｒｎｅｒ、Ｒ，Ａ、 、Ｒ，Ｍ、ＣｈａｎｏｃｋおよびＦ、Ｂｒｏｗｎ（瘍）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、１−５）、コレラ毒素、ジフテリア毒素および淋菌抗 原が含まれるがこれらに限定されない。更に特別の例として、上首尾にクローン 化されそして組換えポリヘトリン遺伝子産生物ワクチン製剤で使用することがで きる微生物遺伝子には大腸菌の腸毒素遺伝子、主五五主立　　ベルツシス（Ｂｏ ｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の毒素およびフィラメント状血球凝集 素遺伝子並びにマラリア寄生虫１孟λ−ｔ−茗ｉ　Ａ　　フ　ルシパーム（Ｐ１ ａｓｎ＋ｏ−ｄｉｕｍ　ｆａｌｃｔｐａｒｕｍ）のスポロゾイト周囲（ＣＳ）抗 原（Ｎｏｒｒｂｙ。 Ｅ、＋１９８５．ｌｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　８５＋上記、ｐｐ、３Ｂ？−３９４ ；　Ｄａｍｅ。 Ｊ、Ｂ、等、１９８５．Ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　８５＋上Ｎ、　ｐｐ−７−１ １）が含まれるがこれらに限定されるものではない。 ヘリオティスポリへドリンプロモーターのコントロール下で発現される異種蛋白 質はサブユニットワクチン製剤の免疫源として使用することができ、その際該製 剤は複数の微生物に対して活性であると思われる。 組換えポリヘトリン遺伝子産生物は、異種蛋白質を発現する任意のベクター／宿 主系からワクチン製剤を作る目的で精製することができる。このような系には前 に記載したウィルス感染培養細胞またはインビボ宿主、細菌形質転換体、酵母形 質転換体等の内の任意のものが含まれる（上記５，３．および５．４４＝Ｂ？？ ）　、精製した蛋白質は適当な濃度に調整し、適当なワクチンアジュバントと共 に処方し、そして使用のために包装すべきである。適当なアジュバントには次の ものがあるが、これらに限定されるものではない：鉱物ゲル、例えば水酸化アル ミニウム；リゾレシチン、プルロニックポリオールのような界面活性剤；ポリア ニオン；ペブチド：オイルエマルジッン：並びにＢＣＧ　（ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃ ａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウムパルバムのような潜 在的に有用なヒトアジュバント、この免疫原はまたリポソームに導入することも でき、またワクチン製剤で使用される多糖類および／または他のポリマーに抱合 させることもできる。 組換えポリヘトリン遺伝子産生物がハブテン、即ち同系の抗体と選択的に反応す ることができる点で抗原性であるが免疫応答を引き出し得ない点で免疫原性では ない分子、である場合には、このハブテンはキャリアまたは免疫原性分子と共有 結合させることができる：例えば、蛋白質血清アルブミンのような大きな蛋白質 は結合したハブテンに免疫原性を与える。ハブテン−キャリアはワクチンとして 使用するために処方することができる。 上記したワクチン製剤の投与には多くの方法が使用できる；これらの方法には、 経口、皮肉、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下および鼻腔内経路があるが、これら に限定されるものではない。 病原性微生物のエピトープを発現する組換えＯＢはワクチン製剤に特に有用であ る。好ましい実施態様では、外来エピトープは結晶表面に露出している。閉塞体 の結晶格子は主としてポリヘトリン分子からなっているので、この分子内の外来 エピトープは０８表面上で何倍も現われる０組換えＯＢは、たとえ外来エピトー プが結晶表面に現われていなくて内部にあるとしても、ワクチン製剤で使用でき る。何故なら、結晶特性（±左置インビボでの解離）の変化によって、宿主の免 疫系にエピトープを提供したら、蛋白質（外来エピトープからなる）を結晶から 徐々に放出させることができるからである。更に、閉塞体は大量で産出され、構 造が安定でありそして精製が容易である。それらは既知のヒト病原体を産生じな い昆虫細胞培養物中で発生可能である。特別の実施態様では、ワクチン用の組換 えＯＢは細菌の存在しない環境下で成長させた感染昆虫幼虫から得ることができ る。 ワクチン製剤で使用される異種ペプチドまたは蛋白質が、通常は免疫原性をもた らすキャリア分子に結合していなければならないハブテン（皿上抗原性であるが 免疫原性ではない）であるとき、組換えＯＢの使用は特に有利であると思われる ０本発明の発現ベクター／宿主系を使用して表面上に異種ハブテンを有する組換 えＯＢを製造するとその分子は免疫原性にされそしてカップリング反応は除去さ れるであろう。更に、組換えＯＢは、（ａ）夾雑するウィルス粒子および炭水化 物を除去し；そして／または（ロ）各々が異なる異種蛋白質を有している組換え ＯＢの混合物を溶解させ再結晶させ得るように、解離させそして再結晶させるこ とができる（例えばＳｈｉｇｅｍａｔｓｕ、　Ｈｏおよび５ｕｚｕｋｉ　、　Ｓ 、　＋　１９７Ｌ　Ｊ、　ＩｎｖｅｒｔＰａｔｈｏｌ、１７：３７５の方法によ って）、得られたＯＢは各異種蛋白質を有しており、複数の微生物に活性なワク チンとして特に有用であろう。 本発明のこの特徴のもう１つの特別な実施態様では、組換えＯＢ上または内で発 現される外来ペプチドまたは蛋白質は両性、即ち１面に親水性を有し１面に疎水 性を有する両性であることができる。このような外来ぺブチドはＴ細胞介在免疫 の導入に特に有用であろう。 両性エピトープは、その疎水面と存在する細胞膜またＩａとの相互作用および親 水面とＴ細胞レセプターとの相互作用をもたらすことによってＴ細胞刺激を誘発 すると思われる（Ａｌｉｅｎ、Ｐ、Ｍ、等＋１９８４．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａ ｃａｄ。 Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１：　２４８９；　Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、　Ｊ、　 Ａ、等、　１９８５゜ｉｎ　Ｉｍａ＋ｕｎｅ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　 Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｎｔｆｇｅｎｓ、Ｌａｖｅｒ＋Ｗ　、Ｇ、およびＧ＋Ｍ、Ａ ｉｒ＋［＋　Ｃｕｒｒｅｎｔ　ＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＭｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ。 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、１５６−１６０）　、特別な実施態様では、両性の アルファーヘワックス状構造をコードする異種配列は、可変性で且つアルファー ヘワックス領域（疎水性であっても良い）をコードするポリヘトリン遺伝子の部 分に挿入するかまたは該部分を置換することができ、その結果組換え蛋白質が産 生され、この蛋白質は内部のＯＢと両性エピトープの両者をそれらの構造的無傷 状態のまま保持できる。可変性で且つアルファーフリックス領域をコードするポ リヘトリン遺伝子配列の１例はヘリオティスポリヘドリン蛋白質のアミノ酸３７ 〜４９をコードするものである。 ５、５．３．　　　　えボ１ヘト１ンで　　　して土工抗生夏淡旦 本発明の組換えポリヘトリン遺伝子産生物で免疫化することによって病原性微生 物に対して生じた抗体はまた、診断免疫分析、受動的免疫療法および抗イデイオ タイプ抗体の発生において用いられる可能性がある。 発生した抗体は当該技術分野で知られている標準的技術（Ｕ、イムノアフィニテ ィクロマトグラフィー、遠心分離、沈降法等）によって単離し、ヒトまたは動物 の組織、血液、血清等内の医学的または獣医学的に重要なウィルス、細菌または 寄生虫の存在を検出するために診断免疫分析で使用することができる。この抗体 はまた、治療および／または疾病の進行をモニターするために使用することもで きる。当該技術分野で知られている任意の免疫分析系をこの目的で使用すること ができ、これらにはラジオ免疫分析、ＥＬＩＳＡ（エリザ法）、「サンドイッチ 」免疫分析、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集アッセイ、補体結 合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、螢光免疫分析、プロティンＡア ッセイおよび免疫電気泳動アッセイのような、２．３を除いて有名な技術を使用 する競合的および非競合的アッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。 本発明のワクチン製剤はまた、受動的免疫療法に使用する抗体を産生させるため に使用することもでき、その際宿主の短期間防御は、病原性微生物に対して予め 形成された抗体を投与することによって達成される。 受動的免疫化は、例えば病院および他のへルスケア施設で病原性微生物にさらさ れている、免疫化されていない個人の迅速な予防用の緊急手段として使用するこ とができよう、ヒト免疫グロブリンは、異種免疫グロブリンがその外来免疫原成 分に対して免疫応答を誘導するのでニヒトで使用するのに好ましい。 本発明のワクチン製剤で発生した抗体はまた抗イデイオタイプ抗体の産生にも使 用できる。次いで、この次使用することができる（Ｊｅｒｎｅ、　Ｎ、に、＋　 １９７４＋　Ａｎｔｉ。 Ｉｅ＋ｍｕｎｏ１．（Ｐａｒｉｓ）　１２５ｃ：３７３；　Ｊｅｒｎｅ、　Ｎ、 に、等、　１９８２゜ＥＭＢＯ１：２３４）。 ５．６．土生望五段忠剋 バクロウィルスは多数の農業害虫の主要な病原体である（Ｖｌａｋ、　Ｊ、Ｍ、 およびＲｏｈｒ＋ｇａｎｎ、　ｃ、Ｆ、ｌ上記）、多くの地域でのコーンイア− ワーム（ｃｏｒｎ　ｅａｒｗｏｒｍ）へりオティスゼアは日常的にスィートコー ンの穂を９０〜１００％損傷させる　（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、　Ｅｎｃｙｃ ｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏ１ｏｇｙ＋１９８１．第 ３版、１３巻＋Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　ｐｐ 、４１５）　、　ＨｚＳＮＰＶはウィルス性殺虫剤として認可されており、コツ トンボオルワームおよびコーンイア−ワーム用の病原体として使用される。 閉塞体（ＯＢ）は生物から野生生物へのウィルス伝達に寄与する感染性粒子であ る０本発明の特別の実施態様では、組換え閉塞体の産生が外来遺伝子の同時発現 による感染の全般的伝達を提供する。酵素活性、毒性ペプチドまたは殺虫活性を 有する任意の分子を導入するためポリヘトリン蛋白質を操作すると、宿主農業害 虫に対するＯＢの致死率を増加させることができる。それ故、本発明の組換えＯ Ｂは生物学的殺虫剤として価値ある適用を有している。 本発明のこの特徴による特別な実施態様では、組換えヘリオティスポリヘドリン 蛋白質は、殺虫活性を有する外来ペプチドからなる組換え閉塞体を形成すること ができる。別の実施態様では、外来殺虫配列をヘリオティスポリヘドリン遺伝子 に導入することによって最初は閉塞体形成が破壊されるが、閉塞体形成能はもう １つの欠陥のないポリヘトリン遺伝子をウィルスゲノムの非必須領域に挿入する ことによって回復することができる。かくして、閉塞体を形成する二己シ（孟コ ーλ　亙ヱＮＰＶは、結晶多角体の部分を形成しまたは形成しない組換えポリヘ トリン分子内に外来殺虫配列を発現することができる。 本発明のこの実施Ｂ様に従ってポリヘトリン遺伝子内に組換えることのできる遺 伝子にはウィルス自体の生育力または感染力を損うことな（バクロウィルスの所 望の殺虫活性を効果的に高める分子をコードする任意の遺伝子がある。このよう な分子には酵素、酵素阻害剤、昆虫ホルモン拮抗剤、神経毒、代謝阻害剤、昆虫 の化学誘引剤、他の昆虫病原体の内毒素等をコードする分子があるが、これらに 限定されるものではない。 例えば、バクロウィルスに感染しやすい節足動物に特有の生理学的過程および／ または発育学的過程を障害する分子を組換えポリヘトリン内で発現させることが できる。このような分子にはホルモン拮抗剤のような昆虫成長調節剤（貫左星ネ オテニン（ｎｅｏｔｅｎｉｎ）拮抗剤）、およびキチン合成阻害剤が含まれるが これらに限定されない、毒性であるかまたは有害な行動修正（例えば食欲または 交尾行動の喪失）を誘導する神経ペプチドをポリヘトリン遺伝子内にコードする ことができる。 化学誘引剤として作用する性フェロモンは昆虫集団全体へのバクロウィルス感染 拡散を増大させるために使用することができる。　ＯＢに導入されたキチナーゼ はウィルスの感染力を増加させることができる。バチルスサリンギエンシス（Ｂ ａｃｉｉｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）内毒素のような他の昆虫病原体 の内毒素は病原性を高めるために発現させることができる。殺虫分子の組換え形 態が感染昆虫の生理学的環境内で機能的に活性であるとの前提で、本発明の多く の特別の実施態様が可能である。 ペプチドを生物学的に活性の形態に変える代謝機構が宿主昆虫内の感染部位で利 用でき且つ機能的であるとの前提で、組換えポリヘトリン遺伝子が殺虫分子の代 謝前駆体をコードすることもできる。 組換えバクロウィルスによる致死率をアッセイするためには任意の標準的方法を 使用することができる。 このような方法にはＯＢ活性をバイオアッセイする食餌−表面技術と容器（Ｉｇ ｎｏｆｆｏ、　Ｃ，Ｍ、、１９６６＋　Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ。 Ｐａｔｈｏｌ、８：　５３１−５３６；Ｉｇｎｏｆｆｏ、Ｃ，Ｍ、およびＢｏｅ ｎｉｎｇ＋０．Ｐ、＋１９７０、　Ｊ、　Ｅｃｏｎ、　Ｅｎｔｏｍｏｌ、　６３ ：　１６９６−１６９７）が含まれるがこれに限定されない。 ５．７．光」Ｌご−と！ユニ 本発明の組換えポリヘトリン遺伝子を発現するベクター／宿主系は一般に１個ま たは複数の外来ペプチド産生用の発現ベクター系として使用することができる。 本発明のこの実施態様では、ヘリオティスポリへドリンプロモーターのコントロ ール下で外来ペプチドを発現する組換えベクターは所望量の異種ペプチドを得る ために適当な宿主細胞内で増殖させる。この目的のために、外来ペプチドは、蛋 白質を精製する当該技術分野で既知の標準的技術によって宿主細胞または継代細 胞フラクシヨン、細胞培養培地、閉塞ウィルス粒子、単離閉塞体、感染幼虫等か ら精製することができ、上記標準的技術にはクロマトグラフィー（例えばイオン 交換、アフィニティおよびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、 分画溶解度、等電点電気泳動および分離用電気泳動が含まれるが、これらに限定 されるものではない、（上記５．５、参照、）特別の実施Ｂ様では、組換えポリ ヘトリン遺伝子の結晶蛋白質としての発現（即ち、組換えＯＢが形成可能である ）は実質的に純粋な形での異種蛋白質の単離を大いに容易ならしめることができ る。 ５．８．逸−疫一分一近 １つまたは複数の外来エピトープを発現する、本発明の組換えポリヘトリン遺伝 子産生物またはその断片は、該エピトープに対する抗体検出用の免疫分析で抗原 として使用することができる。異種蛋白質またはその断片はまた、競合的アッセ イによって上記エピトープまたは関連エピトープを検出するためにも使用するこ とができる０組換えポリヘトリン産生物または該産生物によって発現される１つ または複数の外来エピトープは、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（エリザ法 ）、「サンドイッチ」免疫分析、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散分析、 凝集分析、補体結合分析、イムノラジオメトリックアッセイ、螢光免疫分析、プ ロティンＡ免疫分析および免疫電気泳動分析のような、２゜３を除いて有名な技 術を使用する競合的および非競合的アッセイ系が含まれるが、これらに限定され ない当該技術分野で既知の免疫分析系で使用することができる。 ６、　　　　：Ｈ２え　　　　　るため　　゛　−１へ１オーイスポ１へ゛１ン ゛　−に るために　　　れるトーンスフ　−ベ 、久ｌ：ゴロ１策 以下の節は、ヘリオティスボリヘドリン遺伝子の配列およびポリヘトリン遺伝子 配列内に外来遺伝子を有するへりオティスゼアウイルス組換えの産生を可能にす るプラスミドトランスファーベクターの１つのファミリーの構築を記載する。 ６．１　　材−料一之一友一汰 ６．１．１．星ｌヱヱ旦ヱ久 プラスミドＤＮＡは生産者〔ベセスダリサーチラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄ ａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはプロメガバイオチク 社（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ））が指定する条件下において、制限酵素Ｈ ｉｎｄＩ［［、Ｅ（遼ＲＩ、Ｐｓｔｉ、担＋ａＩ。 影徂Ｈ１，シα■、珈Ｉ、シＩＩ　＋すａＬ形ｎｃＬ影１１あるいは拘副Ｉによ って切断した。切断されたＤＮＡは、９０１ＩＩＭトリスー硼酸塩、　　９０ｍ Ｍ硼酸、　　２　ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）、　０．１μｇ／ｒｒｄｌ 臭化エチジウムを含む０．７％−１，２％アガロース・ゲルあるいは８％アクリ ルアミド・ゲル中で細分化した。ＤＮＡバンドを紫外線トランスイルミネーター によって視覚化し写真撮影を行った。制限地図を作成するために単一および複数 切断分析法を用いた。 ６．１．２．サザン・プロ・−ング ゲルは３０分間変性溶液（０，５Ｍ水酸化ナトリウム、１．５片塩化ナトリウム ）中に浸漬した。ゲルはさらにｐ）１８．０の１．０Ｍ）リスー塩酸バッファー および１．５月塩化ナトリウムに浸漬して中性にした。ＤＮＡは、サザン（Ｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　９８：５０３−５１７）の変法に従ってニトロセルロース に移した。ＤＮＡは、１．０Ｍ酢酸アンモニウムを用いてプロットされた。フィ ルターは２時間真空中で加熱し、プレハイブリダイゼーシゴン溶液（ｐＨ６，８ の０．１２Ｍ　リン酸ナトリウム、　　２ＸＳＳＣ，５０％ホルムアミド、　１ ０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１％サルコシル、　　３　ＸＤｅｎｈａｒｄｔｓ）中に３ 時間以上浸漬した。フィルターは蒸留水で洗浄し、変性標識放射性プローブを加 えた新鮮なプレハイブリダイゼーション溶液中にて、３７°Ｃにおいて一晩イン キユベートした。フィルターは０．２ＸＳＳＣですすぎ、Ｄｅｎｈａｒｄｔｓを 含まないプレハイブリダイゼーション溶液中で１時間洗浄した。すすぎと洗浄は ４回繰り返した。フィルターは乾燥させ、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−Ｏｍａｔ　ＡＲ５フ ィルムを用いてオートラジオグラフィーを行った。 ＳＳＣ＝１５０ｓＭ１５０量リウム、　５ｎ＋Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７，０ Ｄｅｎｂａｒｄｔ溶液＝０．０２χフイコール、　０．０２χポリビニルピロリ ドン、　０．０２χＢＳＡ ６．１．３．助護【」【歿夾定 ＤＮＡ塩基配列は、へりオティスヘドリン遺伝子のＭ１３サブクローンを用いて サンガーのジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ＋Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、＋および Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ、Ｒ，＋１９７７＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｌｌ、Ｓ、Ａ、７４　：　５４６３−５４６７　　；　Ｍｅ ｓｓｉｎｇ、Ｊ、、Ｃｒｅａ＋Ｒ０，およびＳｅｅｂｕｒｇ、Ｐ、Ｈ，＋１９８ １．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　９　：３０９−３２１）　北よって決定 した。ｈ１３感染菌の上清を２回２０分間５０００ｒｐ１１＋において遠心分離 を行って、菌や菌の破砕片を取り除いた。ファージは１７５量の２０％ＰＥＧ６ ｍＭ塩化ナトリウム、　０．２＋Ｍ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、ウィルスを１ ７５量の２０％ＰＥＧ６０００と２．５ａ＋Ｍ塩化ナトリウムを加えて再沈澱さ せた。ペレットから可能な限り液体を取り除くように注意した。ペレットは６． ６．．２中に再懸濁させ、ＤＮＡを０．１Ｍ）リスｐＨ８，０で飽和させたフェ ノールで抽出した。　ＤＮＡは、フェノール：クロロフォルム（１；　１）で、 さらにクロロフォルムで、最後にエーテルで再抽出を繰り返した。　ＤＮＡはエ タノールで２回沈澱させ、１回すすいだ。 −重鎖ＤＮＡの鋳型は、５μ２の一本鎖ＤＮＡ鋳型、２μ！のブライマー、２μ ｌのＨＢバッファー（７０ｍＭ　　トリスｐＨ７，５，７０ｍＭ塩化マグネシウ ム、　５００ｍＭ塩化ナトリウム）を含む１０μ！反応液中で塩基配列ブライマ ー（ベセスダリサーチラボラトリーズまたはファルマシア社）とアニールさせた ０反応液は５分間９５°Ｃに熱し、４５分間室温にで放冷した。アニーリングの 後、２μｌのアルファー３２Ｐ−ｄＡＴＰ、　１μ！の２５ＭＭ　ｄＡＴＰおよ び２ＵｎｉｔｓのＤＮＡポリメラーゼ大断片（ベセスダリサーチラボラトリーズ またはファルマシアまたはプロメガバイオチク社）を加えた。ジデオキシ・ヌク レオチドの存在下でのベライマーの伸長は、シイデオキシ・ヌクレオチド（ｄｄ ）およびデオキシ・ヌクレオチドの適当な混合液を含む試験管に、３μ！のアニ ール混合液を加えることにより開始させた。Ａ反応＝１μ！の０．５ｍＭ　ｄｄ ＡＴＰ、　　１　ｐ　ｊ２の１２５ＭＭ　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ 　。 Ｃ反応：１μ！の０．６２５ｍＭ　ｄｄＧＴＰ、　　１μｌの８ＭＭ　ｄＧＴＰ 、　１７０μｉのｄｃＴＰおよびｄＴＴＰ　、　Ｃ反応：１μ２の０．５０回Ｍ 　ｄｄＣＴＰ、　１　ｕ　ｌの８　ｕＦＩ　ｄＣＴＰ、　１７０　、Ｃ／Ｍのｄ ＧＴＰおよびｄＴＴＰ、　Ｔ反応＝１μ！の０．８４ｍＭ　ｄｄＴＴＰ。 １μｌの８μ−ｄＴＴＰ、　１７０μＮのｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、反応液は４ ５°Ｃにて１５分間インキュベートした。１μ！の０、５ａ＋Ｍ　ｄＡＴＰ、　 ０．５ａ＋Ｍ　ｄＧＴＰ、　０．５ｏ＋Ｍ　ｄＣＴＰおよび０．５ｎ＋ＭｄＴＴ Ｐを加え、反応液を更に１５分間インキ亙ベートした。 反応は、１２μ１０９５％ホルムアルデヒドおよび１０ｍＭのＥＤＴＡ　ｐＨ８ ，０を加えることにより停止させた。試料は９５°Ｃまで熱し、８Ｍの尿素、９ ０ｍＭのトリスｐ）！　８．３．９０ｍＭはう酸および２ｍＭＥＤＴＡを含む変 性アクリルアミド・ゲルにロードした。ゲルは固定乾燥させ、オートラジオグラ フにかけた。 ６．２．へ１オーイスゼアウイルスのボ１ヘト１ン゛　−の西　　と　　　１′ へりオティスゼアウイルスのＤＮＡはへりオティスゼアウィルス感染幼虫から分 離したウィルスより得た。 ウィルスＨｉｎｄｌＩ［およびＸｈｏ　Ｉ断片はそれぞれｐＵｃ１２のＨｉｎｄ Ｉ［［と５ａｌＩ部位にクローン化した。２つのプラスミドは以下のように特徴 づけられる。３．１ｋｂ　ＨｉｎｄＩ［Ｉウィルス断片を含むｐＨＨ５ｐ、およ び６．５ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉウィルス断片を含むｐＨＸ１２゜両方のプラスミドは 緩和条件下において、オウトグラファポリヘドリン遺伝子部分をコードしたＤＮ Ａ断片に交差交配的に挿入した。 ｐＨＨ５とｐＨＸ１２の制限地図によると、挿入されたｐＨＨ５はｐＨＸ１２の 中に含まれていた。プローブとしてオウトグラファボリヘドリン遺伝子を用いた 。ｐＨ）１５のサザン・プロットは、１．７ｋｂ　Ｎｒｕ　Ｉ断片がオウトグラ ファポリヘドリン遺伝子に交差交配していることを示した。 ｐＨＨ５のＨｉｎｃ　ＩＩおよびＨｉｎｄ　ｍ　／　Ｓａｔ　ｌの断片と、ｐＨ Ｘ１２のＨｉｎｄ　ｍ　／　Ｅ、ｃｏＲＩ断片はＭ１３＋ｐ１８　（Ｙａｎ　１ ｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ＋　Ｃ，ｈ等。 １９８５、銃匣３３：１０３−１１９）の中にサブクローンされていた。ｐＨＥ ２．６　（上皿６．３．２　ｔ、＝記載）　ノＥｃｏＲＩ／Ｎｒｕ　Ｉ断片およ び転移ベクトル１　（工ｆｆ１６．３．４．に記載）のＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌ ｌｌ断片もサブクローンされていた０選択したサブクローンのＤＮＡ配列は（Ｓ ａｎｇｅｒ、　Ｆ、＋等＋１９７７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、７４：５４６３−５４６７）によって決定した。 用いた配列決定法は第１図■に示した。ヘリオティスンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ■、　Ｎｒｕ　Ｉ　、旦ｎｃｌＩおよび結上Ｉの制限酵素地図はヌクレオチド配 列から誘導され、それは第１図囚に示した。分解断片とその大きさは第■表に示 した。 第■表 ヘリオティスボリヘドリン遺伝子のＨｉｎｄ　ＩＩＩ　／　Ｎｒｕ　１／シｎｃ ｌＩ／脇Ｉ制限酵素分解断片！５′末端から３′末端の切断リスト の　　　　　　　　□　　、　　　　　　　亡１＋２ ２　　　　２５０　　　　　　　＋３　　　　＋２５２３　　　　　９　　　　 　　＋２５３　　　　＋２６１４　　　　　１４　　　　　　＋２６２　　　　 ＋２７５５　　　　　１２　　　　　　＋２７６　　　　＋２８７１示した断片 は、第１図に示したヘリオティスボリヘドリン遺伝子が影１ｄｌＩ［、勤Ｉ１１ 影ｎｃＩＩ、批工Ｉによって切断された後のＤＮＡ塩基配列から想定されるもの である。 ネ塩基決定領域にはなかったもの。 ヘリオティスポリヘドリン遺伝子のコード塩基配列を同定するために、サブクロ ーンのＤＮＡ塩基配列とオウトグラファポリヘドリン遺伝子のＤＮＡ塩基配列を 比較した。第１図に示した部位のＤＮＡ塩基配列は、７５３ヌクレオチドの開放 読み取りフレームであることを示していた。開放読み取りフレームの７番目のコ ドンはメチオニンをコードしている。それに続いてろオウトグラファボリヘドリ ン塩基配列とアミノ酸配列が８４％相同な２４４個のアミノ酸をコードする配列 がつながっている。この塩基配列はオウトグラファ遺伝子の対応する位置に見出 されるＴＡＡコドンで終了している。我々はこの開放読み取りフレームにおいて 最初に現われるメチオニンをオウトグラファポリヘドリン遺伝子の開始コドンと 定義した。 オウトグラファ（ＭＮＰＶ）とへリオティス（ＳＮＰＶ）ポリヘトリンのアミノ 酸配列が相同性が最大になるように配置するならば、２つの蛋白質は配列相同性 が８４％になる。これはへりオティスＨｅ１ｉｏｔｈｉｓ（ＳＮＰＶ）とボンビ イスフモリ（ＭＮＰＶ）蛋白質（第２図）の７７％の配列相同性に匹敵する。オ ウトグラファとボンビイスフ蛋白質の間にも８４％の配列相同性がみられる。へ りオティス配列のアミノ酸残基５−７のｔｙｒ−ｓｅｒ−ｔｙｒ配列が２つの蛋 白質の相同性の始まりを示すのであれば、オウトグラフ７やボンビイスフ蛋白質 に比べてヘリオティス配列はアミノ末端に一つの余分なアミノ酸残基の挿入を有 する。へりオティスの配列の２２６と２２７２７番目置の間にアミノ酸の欠失が ありかつオウトグラファとへリオティス蛋白質の間には、３６個のアミノ酸の置 換がある。 へりオティスとボンビイスフの配列は相違が大きく、７７％の配列相同性を有し ている。５２個のアミノ酸の置換に加えて、ヘリオティス配列には２個のアミノ 酸の挿入と２個のアミノ酸の欠失が見られる。興味深いことに、この２つの配列 間の４つの挿入と欠失について、そのうち１つの挿入と欠失がへりオティスとオ ウトグラファの比較において見出され、他方の１つの挿入と欠失がオウトグラフ ァとボンビイスフ比較において見出される。このことは、オウトグラファとへリ オティス間あるいはオウトグラファとボンビイスフ間の進化上の距離がほぼ等し く、へりオティスとポンビイスフはより進化上の距離が離れていることを示唆し ている。 同様な結論は、３つの種のポリヘトリン蛋白質の全般的な配列相同性の比較によ っても得ることができる。 配列の相違の程度と、そのウィルスが５ＮＰＶかＭＮＰＶのいずれであるかとい うことの間に関係があるとは思われない、オウトグラファ（ＭＮＰＶ）とへりオ ティス（ＳＮＰＶ）間あるいはボンビイスフ（ＭＮＰＶ）間の配列の相違の程度 が類似している。 親水性のパターンはオウトグラファとへりオティス蛋白質は非常に類似している （第３図）。興味深いことに、最も高い親水性を示すポリヘトリン蛋白質の領域 は最も配列の相違の大きい領域である。その３８番目から５０番目のアミノ酸に おけるオウトグラファとへりオティスのポリヘトリン間の配列相同性は５４％に 過ぎない。この領域において、オウトグラファとボンビイスフの配列はわずか３ １％の配列相同性を有し、一方へりオティスとボンビイスフの配列は同領域にお いて３９％相同である。これらの数値は、全蛋白質のおよそ８０％の配列相同性 に匹敵する。恐ら（これらの親水性領域は、他のウィルスや細胞構成要素との種 特異的相互作用に関与する部位として規定される。この領域から作成される小ペ プチドは、恐らく別のバクロウィルスから区別できるようなモノクローナル抗体 を産生ずるために用いられることができる。 ６．３．　　−ンスフ　−ベタ　−の ｐＨＥ２．６と命名したトランスファーベクターを構築するためにプラスミドｐ ＨＨ５，ｐＨＸ１２を用いた。このトランスファーベクターは、外来遺伝子を含 む組換え七ウィルスがインビボ組換えによって産生されるようにするためにポリ ヘトリン遺伝子配列の中へ外来遺伝子を挿入することができる。 このトランスファーベクターの構築は、第５図囚で概説するが、以下に続く記述 を簡略化するために咳図に言及する。 ６．３．１．　　ブースミド）ｌＨ５およびＨＸ１２ｐＨＨ５とｐＨＸ１２の調 製は上の６．２．に記載した。　ｐ）ＩＨ５プラスミドは、ｐＵｃ１２　（第５ 囲い）のＨｉｎｄＩＩ［部位の中の七ウィルスＤＮＡ（第１図に示したポリヘト リン遺伝子配列のヌクレオチド残基番号２５３から開始する）の３．１ｋｂＨｉ ｎｄ　ｍ断片を含んでいる。　ｐＨＨ５のＨｉｎｄＩ［Ｉ　Ｈｚ　ＤＮＡ挿入は 、カルボキシル末端をコードする領域を含むポリヘトリン遺伝子のおよそ３分の ２をコードしている（即ち、アミノ末端をコードする領域を含むポリヘトリンを コードする配列の約３分の１を欠いている）、ポリヘトリン遺伝子配列は、ｐＵ ｃ１２親プラスミドのポリリンカー複鎖がポリヘトリン遺伝子配列の上流または ５′末端に位置するように向いている（第５囲い）。 ｐＨＸ１２プラスミドの珈Ｉ　　Ｈｚ　ＤＮＡ挿入は、ｐＵｃ１２の５ａｌＩ部 位に挿入された全ポリヘトリン遺伝子配列を含んでいる。ｐＨＸ１２中のＨｚポ リヘトリン遺伝子配列は、ｐ）ＩＩ（５中に含まれるＨｚポリへドリンコード配 列に比較して、ｐＵｃ１２ポリリンカーに対し逆方向に向いている。 すなわち、ｐＵｃ１２ポリリンカーのＥｃｏＲＩ部位はｐ）ＩＸ１２においてポ リヘトリン遺伝子配列の３′末端に位置している（第５囲い）。 ６．３．２．　　−ンスフ　−ベタ　−のｐＨＨ５中のポリヘトリン遺伝子の再 構築のために、Ｈｚポリヘトリン遺伝子配列のアミノコーディング末端の一部を 含むｐｉ（Ｘ１２制限断片を用いた。それはアミノコーディング末端において複 合クローニング部位（ＭＣＳ）によって中断されたポリヘトリン遺伝子配列を含 むトランスファーベクターが産生されるようにするためである。 ｐＨＸ１２プラスミドはＥｃｏＲＩおよびＮｒｕ　Ｉで切断し、プロモーターや ヘリオティスボリヘドリン遺伝子のアミノ末端部分を含むおよそ１１２５ｂｐ　 ＥｃｏＲＩ−Ｎｒｕ　Ｉ断片を分離した。この１１２５ｂｐ断片は、ｐＨＨ５中 （７）ｐＵｃ１２ポリリンカーのＥｃｏＲＩおよびＳｍａ　Ｉ部位にクローン化 した。 次にこのクローンのポリリンカーのＢａ＋ｏ旧からＰｓｔｌまでの配列を様々な 制限酵素認識部位（複合クローニング部位、　ＭＣ５）を含む合成オリゴヌクレ オチドと置換した。オリゴヌクレオチドのクローニング接合部位の配列はＤＮＡ 塩基配列分析によって確認した。 得られたプラスミド（ｐＨＥ２．６と命名）は、プロモーター配列を含むポリヘ トリン５′末端隣接領域、ｈｅｓ、３′ポリへドリンコード配列、３′末端隣接 領域、およびｐＵｃ１２配列を含む、外来遺伝子配列はポリリンカーに挿入する ことができ、得られたプラスミドベクターはへりオティスゼアウイルスに感染し た宿主細胞をトランスフェクトするために用いることができる。外来遺伝子を含 む組換えＨｚウィルスが形成され、ポリへドリンプロモーターを用いてその形質 発現を指令する。 ６．３．３．ベー　−ガラクトシダーゼーンス　　−ベタ　− ｐ）ｌＥ２．６１ａｃと名づけたトランスファーベクターは、ヘリオティスボリ ヘドリン配列（第５図ｅ）と隣接したＭＣ５Ｏ中に挿入された大腸菌のベーター ガラクトシダーゼ（Ｂ−ｇａｌ）を含むように構築された。大腸菌のＢ−ｇａｌ 遺伝子を含むプラスミドｐＭｃ１８７１　（ファルマシア社）の３ｋｂ断片は、 ゲルで精製した後に、Ｂａｍ旧で開裂させることにより分離した。プラスミドｐ ＨＥ２．６は、シｄ■で開裂し、バクテリアアルカリフォスファターゼ処理し、 Ｂ−ｇａｌ遺伝子をｐＨＥ２．６のＨ■部位に挿入するためにｐＭｃ１８７１由 来断片と連結（Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ）させた、得られたプラスミドは、 ポリへドリンプロモーターとコード配列に対して両方向（５′末端から３′末端 、３′末端から５′末端の両方）のＢ、−ｇ　ａ　１遺伝子を含む。 大腸菌のＤＨＩ株は得られたプラスミドによって形質転換させ、形質転換体の同 定は、そのプラスミドＤＮＡの制限切断のＤＮＡ断片サイズ決定法によっ確認し た。大腸菌のＤＨＳ　ａｌｐｈａ株（ベセスダリサーチラボラトリーズ）もＢ− ｇａｌ遺伝子を含むプラスミドで形質転換させ、得られた形質転換体は、メシン グ（Ｍｅｓｓｒｎｇ）ら（１９７７゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４　：　３６４２−３６４６）の「ブルー・ホワイト」スクリ ーニング法によって試験した。 簡単に述べると、形質転換されたバクテリア細胞はブレーティングを行う前に発 色基質ｒＸ−ｇａｌ　（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガ ラクトピラノシド」と混合した。青色のバクテリア・コロニーは、機能的なβ− ｇａｌが発現しているプラスミドを含むバクテリアから生ずる。そのようなプラ スミドは、ｒＸ−ｇａｌ　Ｊを加水分解し結果として青色の５−ブロモー４−ク ロロインジゴの生成をつかさどる酵素をコードするベーターガラクトシダーゼ遺 伝子を含む０機能的なり−ｇａｌ活性がが発現しないプラスミドを有するバクテ リアは、発色基質を加水分解できないので白色のコロニーを生成する。 適切な方向に向いたＢ−ｇａｌを含むプラスミドはベーターガラクトシダーゼ活 性を示す青色のコロニーを生成する。このプラスミドはｐＨ８２，６１ａｃと命 名した。 ｐＨＥ２．６１ａｃは、ポリへドリンプロモーターに対して適した方向（すなわ ち、同じ５′末端から３′末端）に向いたＢ−ｇａｌ遺伝子を含むことを適当な 制限切断法によって決定した。親プラスミドｐＨＥ２．６や誤った方向に向いた Ｂ−ｇａｌ遺伝子を含む形質転換体は白色のコロニーしか生成しない。この結果 は、大腸菌中でプロモーター活性を有する配列からのＢ−ｇａｌ融合遺伝子の低 レベル発現があることを示唆した。ポリへドリンプロモ−ター配列は交雑種プロ モーター活性を規定する二次構造の役割を担っているかもしれないので、このプ ロモーター活性はポリへドリンプロモーターに由来するのかもしれない、観察さ れたＢ−ｇａｌの発現は、Ｂ−ｇａｌ配列が適切な読み取りフレームにあること 、および融合蛋白質は酵素的に活性を有することを示している。 プラスミドｐＨＥ　２．６１ａｃは、ベーターガクラトシダーゼ遺伝子フュージ ョンをヘリオティスウィルスにトランスファーさせるために、へりオティスウイ ルスと一緒に細胞へのコトランスフエクシッンに用いられてきた。青色プラーク の形成は、本発明によって外来遺伝子大腸菌ベーターガラクトシダーゼの発現を 示している。　ＨｚＮＰＶ発現系におけるベーターガラクトシダーゼの発現と、 ベーターガラクトシダーゼを発現する組換えへリオティスウイルスの性質検討は 、上記１１に記載した。ベーターガラクトシダーゼを発現するへりオティスウイ ルスはまた、プラスミドｐＨＥ２．６のようなトランスファーベクターと親つィ ルス感染細胞のトランスフェクションを介して、ポリヘトリン遺伝子の挿入や削 除にかかわる遺伝子操作のための親ウィルスとしても用いられる。青色プラーク の背景の中に白色プラークを検出する事によって、所望の組換えウィルスの選択 は非常に容易になるであろう。 一方、別の遺伝子が適当な読み取りフレームの中のＢ−ｇａｌ遺伝子の下流で、 トランスファーベクターｐＨＥ２．６１ａｃの中に挿入されるかもしれない、「 青色」形質転換体を選択することにより、第二の異種遺伝子を含むバクテリア・ コロニーを分離することも可能である。このトランスファーベクターは、さらに 感染細胞中へのトランスフェクションにより、そして青色プラークの選択によっ て、ヘリオティスウイルスへのトランスファーのために用いることができる。特 別の実施態様においては、第二の遺伝子はオウトグラファボリヘドリンプロモー ターを含むことができる。Ｓａｌｌ−Ｂａｍ旧断片は、オウトグラファポリヘド リン遺伝子のプロモーターと５′末端を含むｐＥｃｏＲＩ−Ｉから分離すること ができる。この断片は、ＤＮＡ末端修飾法（上記５．２゜１、に記載）によって ｐＨＥ２．６１ａｃＯ中のＢ−ｇａｌの下流、ＭＣ５のＰｓｔＩ部位に挿入する ことができる。得られたプラスミドは、ヘリオティスポリへドリンプロモーター と５′末端コ一ド配列、Ｂ−ｇａｌ　、オウトグラファポリヘドリンプロモータ ーと５′末端コ一ド配列、および３′末端ヘリオテイスボリへドリンコード配列 を含む、外来遺伝子は、ポリへドリンプロモーターのひとつのコントロール下に おいて、挿入および発現される可能性を有する。該プラスミドはインビボ組換え によってヘリオティスウイルス中に挿入するためのトランスファーベクターとし て使用可能である。 ６．３．４．へ！オーイスポＩヘト１ンアミノ　を配泗りｎλ１戊 ヘリオティストランスファーベクターにおいてポリヘトリン遺伝子のアミノ末端 内に欠失を形成ために本発明者が用いた方法は第５図０に示した。 プラスミドｐＨＥ２．６は見通Ｒ１とＰｓｔＩによって切断された。ヘリオティ スポリヘドリン遺伝子を含む１．１ｋｂ　Ｅｃ夕ＲＩ−カｉｔＩ断片を作成し、 それは肘３＋５ｐ１８にサブクローンされた。得られた旧３誘導体の二本鎖複製 体は、Ｘｂａ　Ｉと批１１によって切断された。この制限酵素はＭＣ３を切断し 、Ｘｂａ　Ｉ開裂部位で５′末端が突出した一本鎖と、七１１開裂部位で３′末 端が突出した一本鎖を生成する。得られたＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡの一方をＸｂ ａ　Ｉ開裂末端から開始して３′末端から５′末端方向に様々な長さに切断する エンドヌクレアーゼＩＩＩ（ｅｘｏｌＩ［）で処理した。３′末端突出部を持つ 、ＬＬＬＩ開裂末端は、ｅｘｏ　ｍ切断に対し抵抗性（耐性）を有する。さらに ＤＮＡをヤエナリヌクレアーゼで切断した。この酵素は一本６３Ｋ　Ｄ　Ｎ　Ａ を切断し、ｅｘｏ　ｍ切断後残された一本鎖ＤＮＡを取り除いて平滑末端を生成 する。平滑末端はＤＮＡリガーゼによって連結され、ヘリオティスポリヘドリン 遺伝子のＮ末端部分にさまざまな長さの欠失を含むトランスファーベクターが得 られる。こうして得られたトランスファーベクターはヘリオティスポリへドリン プロモーター、様々な長さの５′末端ポリヘトリン領域、短縮されたＭＣ５、お よび３′末端ポリヘトリン配列を含む。 これまでに、３種類のＮ末端に欠失を持つトランスファーベクターが得られてい る。トランスファーベクター１は、七１１部位を通って第１図のヌクレオチド番 号６３に及ぶ２８２個の塩基対欠失を有する。トランスファーベクター２は１． ＫＬＬＩ部位を通って第１図のヌクレオチド番号７１に及ぶ２７４個の塩基対欠 失を有する。 トランスファーベクター３は開始メチオニン・コドンにわたる欠失を有し、ヘリ オティスポリへドリンプロモーターのコントロール下で非融合異種蛋白質の生成 のために供される。トランスファーベクター３は、七１１部位を通って第１図の ヌクレオチド番号−３６に及ぶ欠失を有する。欠失領域に挿入することができ、 さらに非融合異種蛋白質のアミノ末端部をコードする開始メチオニン・コドンを 含むような様々な遺伝子配列を発現させることによって、開始メチオニン・コド ンは、生成する異種蛋白質のアミノ末端部の操作を可能にする。 ７、　　　　：へ１オーイスノ　　　二にお番るへ１オーイスウイルスの１ ウィルスＤＮＡの制限酵素による切断パターン、構造蛋白質の特徴および幼虫メ ラニン黒化反応に基づいて、プラーク精製された２０種類のＨｚＳＮＰＶ株の性 質検討を行なった、２０株は各々、独自の遺伝子型を有する。株間のゲノムが異 なっているところは、）ｌｚｓＮＰＶゲノムの４つの領域に限られている。封入 されたウィルスの蛋白質の特徴の差異は、野生型分離株と比較して個々の株で顕 著だった０株は、相対毒性と幼虫の死亡時の黒化の程度の差異に基づいて３群に 分類した。病理学的差異と、遺伝子型あるいは構造蛋白の特異的変化の間には何 等相関は認められなかった０弱い黒化を示したＨｚＳ−１５株の遺伝子型は広範 囲にその遺伝子型の特徴を記載した。　ＨｚＳ−１５株と、プラークが精製され た全ての株についてその物理的地図を作成した。 ７．１　　材二江」Ｌ」二広 ７．１．１．　ＨｚＳＮＰＶのインビトロ感染５日後で黒化を起こしていないＨ ，ゼアの５齢幼虫から感染血リンパを得た。血リンパは前足を摘んで、５　ＸＩ Ｏ”　Ｈの１−システィン−塩酸ＨＣＩ　と５　Ｘｌ０３Ｍのジチオスレイトー ルを含む５−のＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｈｘｎｋ＋Ｗ、　Ｆ、および５ｔｒａｕｓｓ ＋Ｅ、＋１９７６＋　Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈ、２７　：４９−５５）に１ ０匹の血リンパを採取した。希釈した血リンパは濾過滅菌し、ＴＮ？Ｉ−ＦＨ培 地に適用したＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５細胞（Ｇｏｏｄｗｉｎ、　Ｒ，Ｈ，＋等、 　１９８２．　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　１８　：　８４３−８５０）に対し接種原と して用いた。培養細胞の接種は、５ｄの濾過接種原を、組織培養フラスコ（２５ ｃｉ）の中の２４時間令の単層になった１、ＯＸ　１０’個のＩＰＬＢ−Ｈ２１ ０７５細胞に加えることにより行った。２９°Ｃで１時間培養した後、接種原を 除き、その単層を新鮮な培養液で１回洗った。５ＩＩ１１のＴＮ？１−ＦＢ培養 液を加え、培地を２９°Ｃでインキュベートし、２４時間間隔で閉塞体の有無を 観察した。 ７．１．２．　Ｈ２ＳＮＰｖ′−のブー二Ｌ１製前述したように、幼虫から分離 したＨｚＳＮＰＶに感染させた細胞培養液の上滑についてプラーク・アッセイを 行った（Ｆｒａｓｅｒ＋１９８２．Ｊ、Ｔｉｓ、Ｃｕ１ｔ、１１ｅｔｈ、　７　 ：　４３−４７）。 ２４個の野生型プラーク　（肝タイプ）を抽出し、２４個のウェルを持つプレー トの各々のウェル１個に入ったｌＸ１０５の細胞に対する接種原として用いた。 これらの単回プラーク精製によって得た分離株は再アフセイし、２回目のアッセ イで得られた個々のプラークは最初に２４ウエルプレート培養で増殖させてから 、ＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５細胞の２５ｃ＋ｉフラスコ培地にて増殖させた。 ？、１．３．　）１．ゼアの　−とウィルスのＨ，ゼア幼虫はブチインゲンマメ と寒天培地で２９℃、相対湿度７５％、１２時間明期の条件下で保存した。 それぞれの株は、各プラーク精製系統の二次細胞培養を行ったものから分離され た閉塞体を体長から２インチの仝」」Ｌ九工ノ、亙ヱ幼虫（３−４齢）に直接経 口的に接種することによって増殖させた。幼虫を採集するまで４−７日間の感染 進行期を設けた。各人に感染させた幼虫は、採集時に黒化の有無によって分け、 分析まで一２０°Ｃで凍結保存した。 ？、１．４．　　実　）゛のウィルスｌ　の＼−感染閉塞体（ＯＢｓ）は、０． １％ＳＤＳを含むＴＥバッファー（１０＋ｏＭ　）リス−塩酸、　　１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ　ｐＨ７，６）でホモゲネートは２層のチーズクロスで濾過し、１５分間 １．８００×ｇで遠心分離した。上滑を捨て、ＯＢペレットを２０ｄのＴＥバッ ファーで再懸濁して２回洗浄し、１，８００Ｘｇで遠心分離した。洗浄したＯＢ ｓは最終容積１０威のＴＥバッファーで再懸濁した。 ウィルス粒子は、洗浄部分精製したＯＢからスミスとサマーズの方法（１９７８ ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　８４　　：３９０−４０２）を少し変更した方法で分離し た。５ｄの溶解バッファー（０，３カ炭酸ナトリウム、　０．０３？Ｉ　ＥＤＴ Ａ、　０．５１Ｍ塩化ナトリウム、　ｐｎ　１０．９）を１０−の洗浄したＯＢ ｓ　（およそ１５ｍｇ／ｍ）に加え、ＯＢｓは室温で１０分間インキュベートし て溶解した。混合液は２０−６０％（ｈ／ｗ）シー！ｔＭ濃度勾配ＴＥバッファ ー溶液にいれ、４℃、６０分間７．５００　Ｘ　ｇで遠心分離した。１本の目に 見えるウィルス粒子バンドを採集し、等量の丁Ｅバッファーで希釈し、ウィルス 粒子は３０分間５，５００Ｘｇで遠心分離してペレットにした。ウィルス粒子の ペレットは蒸留水で再懸濁し、分析まで一２０℃で保存した。 ７．１．５．バΔ」＝乙ム土ゴ」ＬｌｈＥた近表面処理バイオアフセイ　（Ｉｇ ｎｏｆｆｏ、　Ｃ，Ｍ、、１９６６＋　Ｊ−Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈ、　８　： 　５３１−５３６）を選択したウィルス株と野生型エルカ−分離株に実施した。 各ＯＢ希釈液の一定量（１００μハを、１オンス・プラスティックカップ（Ｆａ ｂｒｉ４ａｌ　Ｃｏｒｐ、、Ｋａｌａｍａｚｏｏ＋ＭＩ）で固めた寒天培地の上 に均一に広げた。各カップの総処理表面積は、６７９ｍｍ”で、ＯＢ希釈液はＩ 　Ｘ　１０’　ＯＢ／　ｍｌ！　（１４７３０Ｂ／　＋ａｍ”）から１×１０％ Ｑ１３／ｄ　（１４，７３０Ｂ／ｍｗ＋２）まで’Ａ　１ｏ、ｇの増加率で増加 した。総計３０匹の新生幼虫（２４時間齢、カップ当り１匹）に各希釈液を接種 し、毎日生死を監視した。各バイオアッセイのＬＴｓｏ値の９５％信転限界はＳ ＡＳプロビット（Ｆｉｎｎｅｙ、　Ｄ、Ｊ、＋１９７１＋　Ｐｒｏｂｉｔ　Ａｎ ａｌｙｓｉｓ、　Ｃａａ＋ｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌ ｏｔ＋ｄｏｎ、ｔｌ、に、）分析によって算出した。 ７．１．６．ウィルス腫土Ｊとｔ塁 濃度勾配法によって精製されたウィルス粒子は、６５°Ｃにおいて３時間、０． １％　塩化カリウム、０．１％ＳＤＳおよび０．１■／−プロテアーゼＫ（シグ マ）を含むＴＥバッファーでインキュベートした。フェノールで２回、クロロフ ォルム：イソアミルアルコール（２４：　１）で２回抽出後、ＤＮＡを１７１０ 倍量の２Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量の９５％エタノールを加えて沈澱させた。沈 澱したＤＮＡは１５分間　１．８００Ｘｇで遠心分離してペレットにし、３０分 間６５°Ｃの滅菌蒸留水中で再懸濁し、分析まで４°Ｃで保存した。 ７．１．７．−」辷折 ウィルスＤＮＡは、提供者の特定する条件下で制限酵素Ｂａｍ旧、　ＥｃｏＲＩ 、　ＥｃｏＲＶ、　ＨｉｎｄｌＩｌ、　Ｋ３ｚ　Ｉ　、　Ｐｓｔ　Ｉ、およびＳ ｓｔ　Ｉ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）によって切断した。制限酵素断片は、０．２５μｇ／ｄの臭化エチディウムを 含むトリス酢酸バッファー（０，０４Ｍ　）リス酢酸、　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ 、　ｐＨ８，０）に入れたアガロース・ゲルを用いて電気泳動法によって分離し た。ゲルは１７時間７０ボルトで電気泳動させ、ＤＮＡ断片はＵＶ　（３０６ｎ ｍ）によって検出した。ゲルはＫｏｄａｋ臀ｒａｔｔｅｎ　２３Ａフイルターと Ｐｏ１ａｒｏｉｄ　ｔｙｐｅ　５５ポジネガフイルムを用いて写真撮影した。 ？、１．８．５ＤＳ−ボラアク１ルアミド・　゛小骨０゛昏閉塞体からアルカリ 処理によって放出されたウィルス粒子の構造蛋白は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ ）（１９７０，Ｎａｔｕｒｅ２２７　：　６８０）の方法に従って不連続ポリア クリルアミド・スラブ・ゲルを用いた電気泳動によって比較した。 ウィルス粒子蛋白は、１■蛋白／Ｉｄの濃度で３分間変性バッフｙ　　（６２， ２Ｑｌｌ’ｌ　）リス塩酸、２０χＳＤＳ、　２０％グリセロール、２．５％　 ジチオスレイトール、　ｐＨ６，８）中で沸騰させることによって可溶化した。 電気泳動は、１２％分離ゲル（長さ１０　Ｃ１１、幅１２Ｃ１，厚さ１．５　ｃ ｍ）中で４．５時間、３０ミリアンペアの条件で実施した。ゲルは、標準プロト コール（Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｍ、Ｄ、ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、Ｇ、Ｅ、、１９７８゜ νｉｒｏｌｏｇ３’　８４：３９０−４０２　；　Ｍｏｎｒｏｅ＋　Ｊ、Ｅ、ａ ｎｄ　月ｃｃａｒｔｈｙ。 Ｈ，Ｊ、　、　１９８４．　Ｊ、　Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈ、４３　：　３２− ４０）に従って０．１２５％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した 。 ウィルスＤＮＡは、スミスとサマーズ（１９８０，Ａｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０９　：　１２３−１２９）の方法に従ってナイロン・メ ンブレン（Ｍｉｃｒｏ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｉｎｃ、）に２方向にトランス ファーした。全体として１０ＭｇのＨｚＳ−１５ウイルスＤＮＡがＢａｍ旧、　 Ｈｉｎｄ　Ｉ［、あるいはＰｓｔｌによって切断され、上述の予備アガロース・ ゲルの０．７５％において電気泳動により分離された。ゲルは上述したニトロセ ルロース（Ｓ＋ａｉｔｈ、　Ｇ、Ｅ、およびＳｕｍ＋＋＋ｅｒｓＪ、Ｄ、１９８ ０．　Ａｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、　１０９　：　１２３−１２９）のナイロンメンブレンにト ランスファーするように調製し、１．５から３時間プロットした。メンブレンは トランスファー後０．ｌＸ５ＣＣ（ＳＣＣ”　１５０＋＋＋Ｍ塩化ナトリウム、 　　１５＋Ｍクエン酸ナトリウム：ｐＨ７，５）中ですすぎ、１時間乾燥させ、 ８０°Ｃにおいて真空中で１時間加熱した。加熱だメンブレンは分析しで室温で 保存した。ストリップをこれらのハイブリダイゼーション用ゲル・プロットから 切り出し、個々のプローブとした。 ハイブリダイゼーション分析のためのＤＮＡプローブは、ｐＵｃ　ｓプラスミド ・ベクター（Ｖｉｅｒｉａ、　Ｊ、およびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、、　Ｇｅｎｅ　 １９：２５９−２８６）の中にクローン化されたＨｚＳ−１５ゲノムのシ狸ｔｌ Ｉ、石、ｄＩＩ［、およびシ」■断片から調製した。クローン化された断片は光 活性ビオチン（ＰＡＢ　；　Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 　Ｉｎｃ、、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）で標識した。１ミリグラムのプラスミ ドＤＮＡ（１■／ｄ）を等量のＰＡＢ（１■／ｍｆｆ１）と混合し、水浴中で１ ０分間サンランプ（２７６ワツト、　Ｇｅｒ＋ｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｃ ｏ、、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＲ）を照射した。その量を希釈バッファー（ １０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，９）、　０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）で１００μ２ に調整し、結合していないＰＡＢをＧ−５０セフアデツクス・カラムを用いて５ 分間２２５　Ｘ　ｇで遠心分離した。標識プローブは使用まで一２０°Ｃで保存 した。 ナイロンメンブレンに結合した制限酵素によって切断されたＤＮＡ断片は、ハイ ブリダイゼーション・バッフｙ　−（５ＸＤｅｎｈａｒｄｔｓ、　０．ＩＸＰＢ Ｓ、　５ＸＳＣＣ，０，１５■／−子牛胸腺ＤＮＡおよび４５％ホルムアミド） 中で８時間、４５°Ｃでブレスハイブリダイスした。熱変性したビオチン標識Ｄ ＮＡプローブをハイブリダイゼーション・バッファーに１１００ｎ／ｊｄ２の濃 度で加え、時々攪拌しなから１２から２４時間、４５°Ｃでハイブリダイズした 。 相同な領域は、供給者（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。 Ｉｎｃ、）によって提供された検出システムを多少変更したものを用いて同定し た。ハイブリダイズしたメンブレンは、室温で３分間、２ＸＳＳＣと０．１％Ｓ ＤＳ、および０．２ＸＳＣＣと０．１％ＳＤＳで２回ずつ洗浄し、さらに０．１ ５ＸＳＣＣと０．１％ＳＤＳで１５分間４５°Ｃで洗浄した。メンブレンは２Ｘ ＳＳＣで軽くすすぎ、３０分間１％ゼラチンを含むバッファーＡ（バッファーＡ ＝ＬＭ塩化ナトリウム、０．１Ｍ　　トリス塩酸（ｐ）ｌ　７．５）、　２＋Ｍ 塩化マグネシウム、　０．０５％Ｔｒｆｔｏｎ　Ｘ−１００）に浸した。全体と して、５から１０Ｍｇのストレプトアビジン結合アルカリフォスファターゼ（Ｓ ＡＰ）を、１％ゼラチンを含む新鮮なバッファーＡに加え、メンブレンをさらに １時間室温にて浸漬した。次に、メンブレンをバッファーＡで３回、バッファー Ｃ（０，１Ｍ塩化ナトリウム、　０．１ｍＭ　　トリス塩酸（ｐＨ９，５）、　 　１０＋ａＭ塩化マグネシウム）で１回洗浄した。バッファーＣに１．６■／− の濃度のニトロブルーテトラゾリウム（シグマケミカル社＋Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ＋ 　ＭＯ）と５−プロモー４−クロロ−３−インドリルリン酸（シグマ）を加える と、ハイブリダイズしたビオチン標識バンドは発色する。メンブレンを脱イオン 水ですすぎ、空気乾燥させて反応を停止させた。 ７．２．　　Ｈｚ玉揖１９」Ｌ敗 ７．２．１．不ヱ旦工三１１ζＡｉ二え権盟ＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５昆虫細胞系 は、８％の新生子牛血清を加えたＴＮＦＩ−ＦＢ培地で良好に生育する。細胞は Ｈ２ＳＮＰＶに感染しやすいが、感染率はこの条件下では１００％では高力価で 、５０〜７０％の細胞が感染するのが最もよく観察される。最高感染率は、ウィ ルス接種の少なくとも本発明者は、生育培地に１％のウシ血清アルブミン（ＢＳ Ａ）と２ｇ／！のし一グルタミンを加えることによって感染率がほぼ１００％に 改善されることを見出している。 プラークは、以前に記述した方法（Ｆｒａｓｅｒ、　１９８２．Ｊ。 Ｔｉｓ、Ｃｕ１ｔ、Ｍｅｔｈ、　７　：　４３−４６；　Ｆｒａｓｅｒおよびｌ ’１ｃｃａｒｙｈｙ＋１９８４、　Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈ、　４３　　： ４２７−４２９）によって細胞の単層に生成した０本研究ではＦＰ（ｆｅｗ　ｐ ｏｌｙｈｅｄｒａ）様プラークは観察されなかった０分離抽出した全てのプラー クは野生型形態を示し、感染細胞当たり多くの閉塞体を生成した。 プラーク精製株は、Ｈ，−ｔヱの３−４齢幼虫中で増殖させた。幼虫的増殖は、 ウィルスを高速に増殖させ、インビトロ通過突然変株体を選択する可能性を減少 させる上で必要である。 突然変異株の選択は、インビトロでのバクテリア・ウィルス増殖の間にたやす（ 生ずる現象である（Ｐｏｔｔｅｒ。 Ｋ、Ｎ、　、等、１９７６、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　１８　：　１０４０−１０５０ 　；　１ｉｎｋ、および５ｔｒａｕｓｓ、１９７６、　Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａ ｔｈ、２７　：　４９−５５　；Ｆｒａｓｅｒおよび１ｉｎｋ、１９８２．　Ｖ ｉｒｏｌｏｇｙ　１１７　：　３６６−３７８　；　ＦｒａｓｅｒおよびＭａＣ ａｒｔｈｙ、１９８４．　Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈ、　４３：４２７−４２ ９）が、短いインビボでのＨｚＳＮＰＶ増殖の期間においては観察されない（Ｍ ｃＩｎｔｏｓｂ＋Ａ、Ｈ，ａｎｄ　Ｉｇｎｏｆｆｏ、Ｃ，Ｍ、、１９８６＋Ｉｎ ｔｅｒｖｉｒｏ１．２５　：　１７２−１７６）。 ウィルスを幼虫内で増殖させるために、接種は、１−当たり１×１０１′個のＯ Ｂを含む懸濁液の一滴を直接各幼虫の頭部にかけることによって行った。幼虫由 来のＯＢは次の、各人と野生型分離株の相対毒性や病原性の程度を把握するため の接種に用いた。 これらのインビボ増殖を通じて、我々は、野生型分離株の病状に比較していくつ かのプラーク精製株の著しい病状の違いに注目した。プラーク精製株の多くは黒 化を速く引き起こし、幼虫の死亡時にクチクラを不安定にしたが、これはＨｚＳ ＮＰνの感染後通常見出される病状である。これに対しいくつかの株では、通常 観察される速い黒化とクチクラの剥げ落ちを起こすことなく死亡させたのである 。 プラーク精製ウィルス株は、感染した３齢幼虫に黒化を誘発する相対的な能力に 基づいて、３つのグループに分類することができた。 第■表 里　銹　　　に　づ　ＨｚＳＮＰＶエルカ−の　−里銖 速い黒化と死亡　　　−十、１．２．４．１１．１２．１３．１４．１７．１８ ．２０．２３ 遅い速黒化と死亡　　５．７．８．９．２１．２２．２４．２５黒化を示さず＋ １１５ 畠−「黒化を示さず」は、幼虫の死後９日以内に黒化野生型ウィルス分離株（− 十）と数種のプラーク精製株（１，２，４，１１，１２，１３，１４，１７，１ ８，２０，２３）は、接種後４日から５日以内に幼虫を死亡させた。死亡幼虫は １から３時間で速く黒化し、全身が黒褐色に変化し、クチクラは容易に剥げ落ち た。 数種の他の株（５，７，８，９，１５，２１，２２，２４，２５）に感染した幼 虫も、接種後４−５日で感染組織から多量の閉塞体が出現し、明らかに完全に感 染した。 しかし幼虫は死亡したり、速く黒化されるようなことはなかった。接種４−５日 後、幼虫は柔らか（なり、体躯の後ろ３分の２が動けなくなった。しかし、死亡 （すなわち、針で刺しても反応を示さなくなる）に至り黒化を示すまでには、さ らに数日、いくつかのケース（例えば）ｌｚｓ−１５）では数週間を要した。 Ｈ２Ｓ−１５株は、他の遅く黒化を引き起こす株と同様な病状を示した。しかし 、ＨｚＳ−１５株は、この株を接種されたほとんどの幼虫が接種後７日以上経過 するまで黒化を起こさず、多くは完全に黒化するまでに数週間を要したという点 で著しく異なっていた。さらにＨｚＳ−１５は毒性が高かった。 我々は、プラーク精製株間のこれらの明らかな病状の差異を把握するために、表 面処理バイオアッセイ法を用いて全ての系統の接種法を標準化した。１００１！ のＩ　ＸＩＯ’　ＯＢ／ｍ（１４７３０Ｂ／ｍｍ”）希釈液で表面処理された寒 天培地（Ｉｇｎｏｆｆｏ＋Ｃ，Ｍ、＋１９６３＋Ａｎｎ、Ｅｎｔｏａ＋、Ａｓ５ ｏｃ。 Ａｍ、　５６　：　１７８−１８２）の入った各１０プラスチツク・カップ（１ オンス）に、２匹の新生Ｈ，ゼア幼虫（２４時間齢）を入れた。幼虫は、毎日そ の死亡の有無（針で刺した時の反応の有無）と黒化の有無（色と、刺激によるク チクラの剥げ落ちで判定）を調べた。この用量では、感染幼虫は全て４日以内に 死亡した。 以前の観察（第■表）を観察しながら、規定期間内における幼虫の黒化の相対百 分率に基づいて、ウィルス系統を３グループに分類した（表■）。 第■表 ｊＬｊ！ｌ　　　　１２　　　　　７８　　　　１７　　　　５　　　−ＬｉＬ ”　　１４　　９４　　６　　−　−弧−温　　２１　　　　６９　　　１２　 　　１３　　　６ＩＪ、’　　　２４　　　　　０　　　　７　　　２７　　６ ７黒化を示さずＣ１０５１１１１７３ １１３日以内に９０％以上が死亡し、少なくとも７５％の幼虫が死後１日以内に 黒化した。 ゝ幼虫の３０％以上が死後９日以内に黒化した。 Ｃ幼虫の３０％以下が死後９日目において黒化した。 速く黒化を起こす株に感染した少なくとも７５％の幼虫が、死後２４時間以内に 完全に黒化した。遅く黒化を起こす株は、幼虫の死後９日以内に３０％以上の黒 化を引き起こした。またもＨｚＳ−１５は、幼虫の死後９日目において３０％以 下の黒化しか示さなかった点において特徴的であった。 各人の５段階のＯＢ希釈液からＬＴ、。値を算出して、表■のデータから各グル ープの代表の数種の株の用量反応効果を検討した（第Ｖ表）。 第Ｖ表 したＨｚＳＮＰＶ　　のＬＴｏ　′ 光重　のＯＢｍｌ＋！ ウィルス　　４．７３　７３．６６　１４７．３　７３６．６　１４７３．２Ｈ ｚＳＮＰＶＷ＋　　　３．９６”　　　４．３７’　　　４．１６”　　　４． ２０”　　４．４４’ＨｚＳ−１４６，６４’　　　６．４８ｈ６．６８ｃ５． ９４’　　４．２８’ＨｚＳ−１５５，８０ｂ６．３５１　５．６４’　　　４ ．１９”　　３．５６畠ＨｚＳ−１８５，３８’　　　６．１４’　　　５．５ １’　　　４．４５”　　４．４４”・ゝ＄同じ上付文字の添付された数値は９ ％信頼限界において有意差はない。 い（つかのプラーク精製株の間に、重複しない９５％信頼限界において有意な差 が認められた。野生型ＥｌｃａｒＴＭ分離株は、試験した最高濃度を除く全ての 濃度において最も病原性が高かった（第Ｖ表）。ＨｚＳ−１４は、試験した全て の濃度において最も病原性の低い株であった。一般にいずれの株共、濃度が減少 するとＬＴＳ。値は上昇した。注目すべきことに、野生型分離株はこれと異なっ て、０８４度が減少してもＬＴ、。値は有意な上昇を示さなかった。 ７．２．３．　　　　　０ウイルスＤＮＡ　　　パ　−乙２０種全てのウィルス 株のゲノムをＢａｍＨｌ、　　ＥｃｏＲＩ。 ＨｉｎｄｍおよびＰｓｔＩで切断した後比較した。それぞれのウィルス株は、結 合制限切断パターンに基づいて互いに識別することができた。とくに優勢な遺伝 子型は認められなかった。例えばＨｉｎｄＩ［Ｉの切断断片では、同一の断片パ ターンを持つ株は５つしかなかった（第６図）、この５つの株は、ＢａｍＨＩや 力」１による切断断片に基づいて互いに識別することができた。いくつかの制限 酵素でウィルス・ゲノムを比較すると、ＨｚＳＮＰＶゲノムには変動領域が限ら れた数しか存在しないことが分かった。 ＨｚＳ−１５株は、黒化期間が著しく長く、ウィルス粒子構造蛋白が複雑に封入 されている点で独特なので選抜した。我々はさらにいくつかの酵素を用いて、こ の株と野生型分離株とを比較した（第７図）。野生型ウィルスとＨｚＳ−１５株 は、制限酵素影馴旧、拘通ＩおよヒＰｓｔＩに対して同様な制限パターンを示し たが、酵素Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　＋ＥｃｏＲＶ、　Ｈｉｎｄ　ｍおよび５ｓｔＩに よる切断パターンに関しては明らかに異なっていた（第７図）。いくつがの酵素 によるＨｚＳ−１５の制限断片の大きさは、サザンの方法（１９７９，Ａｎａｌ 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１００　：　３１９−３２３）を用いて推定した（第■表） 。 （本頁以下余白） 第■表 Ｂ　　２９．５９１０．２８　１２．７７　１４．０１　３３．６２２５．４２ 　２３．４７Ｃ１４，５４９，２１１０，９４１３，２０３３，６２２３，６３ １４，５４Ｄ　　１３．８７　８．３１　９．２４　１２．４７　１１．３９２ ０．０？　　８．１５Ｅ　　１２．８９　６．５３　８．５０　１０．５５　６ ．１５　１１．４９　７．９１Ｆ　　７，９１　６．３８　８．０７　１０．５ ５　３．４６　９．８８　６．４５Ｇ　　４．０２　６．１１　８．０７　９． ９７　０．５６　４．３１　６．１５Ｂ　　３．９０　６．０５　７．４１　９ ．５８　　　　　　５．１２Ｉ　　１．８７　５．９２　７．４１　７．８０　 　　　　　４．７５Ｊ　　１．８３　５．９２　６．４３　７．５６　　　　　 　４．３３Ｋ　　１．２７　５．８０　５．５８　３．８３　　　　　　４．０ ２Ｌ　　　　４．８１　３．７１　２．７６　　　　　　３．９０Ｍ　　　　４ ．５９　３．２３　２．５８　　　　　　３．４６Ｎ　　　　４．４６　２．９ １　１．４７　　　　　　３．０８０　　　４．４６　２．８８　　　　　　　 　１．８７Ｐ　　　　３．３４　２．７３　　　　　　　　１．８３Ｑ　　　　 ３．１？　　２．５６　　　　　　　　０．２７Ｒ３，０９１，６７０，５６ Ｓ　　　　２．９５　１．５８ Ｔ　　　　２．６５　１．５８ Ｕ　　　　１．７２　１．４３ ν　　　０．９８　０．９６ 縁　　　０．７６　０．８９ Ｘ　　　　Ｏ，４７０，６５ ＡＡ　　　　　　０．２８ 計１２５．１４１２１．３５１２６．４２１２７．１４１２２．４２１２４．７ ２１２６．９３ＨｚＳ−１５と野生型分離株は同様なりａｍ旧制限パターンを示 したので、我々はクネルとサマーズ（１９８４，Ｊ、Ｇｅｎ。 Ｖｉｒｏｌ、６５　：　４４５−４５０）の制限酵素地図を参考にしてマツピン グ分析を始めた。しかしながら、本発明者の、プローブとしてクローン化したシ 徂旧、　ＨｉｎｄＩ［Ｉ、　Ｐｓｔｌ断片を用いた独立ハイブリダイゼーション 分析は、基礎ＨｚＳＮＰＶ地図の再解釈を要した。ＨｚＳ−１５とＨｚＳＮＰＶ の修正地図は第８図に示した。 他のプラーク精製分離株のハイブリダイゼーション分析によってＨｉｎｄ　ｍ切 断片の中に４カ所の変異領域が同定された（第８図囚）、その、領域■、■およ び■は、各ウィルス分離株の保存的変化を含んでいた。ＨｚＳ−２３遺伝子型は 、領域■のＨｉｎｄＩＩＩ　Ｆバンドの中に、由来が未確認の小さな挿入部分を 含んでいた。他の株は全て、これらの領域に何らの欠失も挿入も示さなかった。 領域Ｉの変化はより重大であった。領域Ｉに変化を持つプラーク精製株のゲノム は、１つの株だけは断片の大きさに有意な変化を認めなかったが、その多くは小 さな欠失あるいは挿入を示した。ＨｚＳ−２１だけが領域Ｉから■以外の場所に 変化部を持っていたのでＨｉｎｄｌ［［−りの中の挿入部分によって独自にＨｚ Ｓ−２１を識別することができた。 ７．２．４．　　　イルレス１　　告　　の幼児の病状の多様性によって、同様 な病状を示すウィルス株間の構造蛋白の類似性の研究が促進された。 ウィルス粒子は、アルカリ処理によって幼虫由来の閉塞体から遊離させ、ショ糖 の不連続直線濃度勾配溶液によって精製した。野生型分離株の封入されたウィル ス構造蛋白を電気泳動にかけ、クーマシープルーＲ−２５０の染色を施すと、１ ３本の主なポリへブチドのバンドが現われた。これらの蛋白の大きさは、１７． ８から６２．９キロダルトンの幅があった（第９図）。このポリペプチドの内５ ツ（ＶＰ　３２．１．　ＶＰ　３７．２．　ＶＰ　４１．１．　ＶＰ４９．２お よびＶＰ　６２．９）は全てのプラーク精製株の封入されたウィルス蛋白に見出 された。残りの８本の野生型ポリペプチドは、プラーク精製株の中にあったり、 なかったり様々であった。 各プラーク精製株の主なポリペプチドは、総数は最少は１３から最多は１９まで 、大きさは１７．８から８４．１キロダルトンまでの幅があった。　ＶＰ　４６ ゜６は全てのプラーク精製株の蛋白の中からは容易に見出されたが、野生型分離 株では明瞭ではなかった。他の通常は見出せないポリペプチドとしては、唯−Ｈ ｚＳ−２１だけに見出されたＶＰ　６２．０．１８から２５の株だけに見出され た２１．１から２５．７キロダルトンの数種の蛋白があった。 ＨｚＳ−１５株は、ＶＰ　３３．８とＶＰ　６６．１を除くほとんどの野生型ポ リペプチドを有し、また、他の数種の株の個々に見出されるポリペプチドの多く を有していた。ｖＰ５１．０や、ＶＰ　６９．０より上の３本のバンド等の数種 の蛋白質バンドは、明らかにＨｚＳ−１５に独自なものであった。 封入されたウィルス粒子構造蛋白の有無や、感染幼虫の黒化の程度の差異の間に は、いずれも明確な相関関係は見出されなかった。 ８．１差舅ユ公ユｊ−イス　　ニシスームにい゛れた　　二　゛ 総計２４のクローン化されたへりオティスゼア由来の細胞系統（Ｈ２１０７５／ ＵＮＤ−ＡからＸ）は、初めに、確立されたへりオティスゼア由来細胞系ＩＰＬ Ｂ−）ＩＺ１０７５希釈ブレーティングによって分離された。細胞質に液胞を大 量に持っている分離細胞系の多くは二次培養の間に結局死滅した。生き残ったク ローン細胞株は、主な形態、細胞分裂時間、ＨｚＳＮＰＶの複製を支持する比活 性の点で異なっていた。クローン細胞系の由来は、酵素ＦＵＭ。 ＬＤ）ＩおよびＭＤＨ染色を用いて、親のＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５とＨ，ゼア幼 虫のアイソザイムの特徴とを比較することによって確認した０本発明者の研究室 で維持している一種の双翅類と数種の双翅類の細胞系も、ＬＤＨとＭＤＨの染色 を用いて識別するたとができた。 ８．１．材」計上」Ｌ悲 ８．１．１．　　　　　の　ローニングＩＰＬＢ−Ｈｚ１０７５細胞系を、いく つかの継代を経て、ＴＮＭ−ＦＨ培地で馴化・増殖させた。細胞株のクローニン グは、細胞を１００μ！あたり平均１細胞の濃度に希釈し、９６のウェルのある 培養平板の各ウェルごとに１００μ２を筒布して行った。１２時間後にウェルを 検査し、１ウエルにつき細胞１個のみを含むものに印をつけた。細胞クローンの 生育培地は、濾過滅菌し、馴化したＴＮＭ−ＦＨ培地と、新しいＴＮＭ−ＦＨ培 地培地の等景況合物（５０％馴化培地）からなる。馴化培地は２４時間を経てＩ ＰＬＢ−Ｈｚ１０７５細胞の活発に生育する培養物から得られ、細胞のキャリオ ーバーをなくすために濾過滅菌した。細胞株は５日毎に５０％馴化培地を補充し て、９６ウエルつきの平板上に保存したが、過密になると２４ウエルつきの平板 に植えかえなくてはならかった。 この細胞株をＨｚ１０７５／ＵＮＤ−Ａ−Ｘと命名した。当初、全部で２４株を 分離したが、増幅や植えつぎの過程で多（が最終的に死滅した。残存したものの うち１株は、わずかな部分的な性質検討を行なった後、雑菌混入により失われた 。 ８．１．２．組ｊＬ１１」Ｌ里 個々の組織培養フラスコ（２５ｃｉｆｉ）中のＴＮＭ−ＦＨ培地３−に、各人の 細胞ｌＸｌ０’個を接種した。各細胞は付着するままにしておき、２４時間の対 数増殖期をに至り初発細胞数を計測した。初発計測後８日目まで、４８時間ごと にフラスコ上の３つの決められた領域を計測した。細胞の凝塊化は大抵の細胞株 の場合問題ではなく、若し生じた場合には、いくつかの平面を特定して計測車ヱ 匹ス皇ユ 各細胞株の相対的生産性は、ＨｚＳＮＰＶ（ＨｚＳ−１５）のプラーク精製分離 株を接種することにより評価した。各細胞株の３回重複培養を、９６ウエルつき 団塊平板のウェル１個あたり４．２５　Ｘ　１０’の濃度で接種した。この培養 物は２４時間の付着期間をおいてから、接種培地（ＩＭ。 ＩＭ＝１χ牛血清アルブミン、１４ＩＩ＋Ｍ新調製Ｌ−グルタミン、１０χ牛脂 児血清を添加したＴＮＭ−ＦＨ培地）に５０プラ一ク形成単位（ＰＦＵ）　／細 胞を接種した。ウィルスは２９℃で１時間吸収され、培地をＩＭと交換した。細 胞は７日間観察し、培地と細胞を、夫々ＥＣＶとＯＢＳの定量のために回収した 。 細胞とＯＢｓは、１５．０００Ｘ　ｇ　、　２時間の遠心分離でベレットにした 。　ＥＣＶ含有の上滑液の力価は、５０％組織組織感染投与（ｔｃｘｎｓｏ）法 （山田他、１９８２．Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ。 Ｐａｔｈ、３９　：１８５−１９１）で測定した。各ウェルより採取した細胞培 養上清液から、１０倍の連続希釈液を作った。 各希釈液の２０μ２を１Ｍ中で１８０ｕｆのＨ２１０７５／ＵＮＤ−に細胞懸濁 液（ｉあたり２．５Ｘ１０’細胞）と混合し、接種した細胞混合物の１０μ！を タカサキ（Ｔａｒａｓａｋｉ）マイクロタイター平板（Ｌｕｘ”）の１０個のウ ェルのそれぞれに等分に分配した。ウェルは感染後７臼目に、細胞核中のＯＢｓ の存在を記録し、各サンプルのＴＣＩＤＳ。価を、リドおよびミュンシュ（Ｒｅ ｅｄ　ａｎｄ　Ｍｅｕｎｃｈ）　（１９３８，Ａｍｅｒ。 Ｊ、Ｈｙｇ、２７　：　４９３−４９７）に従って算出した。 各細胞株の０ＢｓＯ比生産性を、いくつかの方法で測定した。ウェルごとの感染 細胞を、感染性の上滑液を除いた後に２００μ！のＴＮＭ−Ｆ）ｌ培地に再懸濁 した。ウェルごとの感染細胞に対する未感染細胞の割合（核中のＯＢｓの存在に 暴く）は、２回測定した血球計数器の計測値を平均して求めた。くりかえしのウ ェルごとの割合を集めし、株ごとの全体の平均ベーセントを得た。 １細胞あたりのＯＢｓの平均値を測定するために、ウェルごとのくりかえしの数 値から得られる１５個の感染細胞の平均ＯＢ数を使って、各人あたりで計算した 。各細胞株が産生ずるＯＢｓの総数は、まず各ウェルのくりかえしによる感染細 胞の平均数を、細胞あたりのＯＢｓの平均数に乗する０次に各人あたり３回のく りかえしの値の平均を求めるという計算から概算した。 ８．１．４．３　　　＼　　のアイソザイム単層の細胞（２５Ｃ１１りを集めて 、１８００Ｘ　ｇ　、　１０分間でペレット状にした。培地を傾斜し、細胞を溶 解バッファーに再懸濁した（溶解バッファー＝０．０１５２Ｍ　）リス。 ０．０４６Ｍクエン酸、１０％シェークロース、１％トリトンＸ−１００，０， ０２０ＩＭブロモフェノール・ブルー）。細胞を、て破壊し、細胞溶解物は１５ ．．０ＯＯＸ　ｇ　、　　３分間の遠心分離により清澄化した。清澄な上滑液は 、−７０°Ｃで長期間保存しても酵素活性は殆んど変化しなかった。 アイソザイムの検出は、清澄化した細胞溶解物の５％ポリアクリルアミドゲル電 気泳動により、酵素エステラーゼ（ＥＳＴ）およびフマル酸デヒドラターゼ（Ｆ ＵＭ）の場合にはＴＢＥバッファー（８１，２ｍＭ　　５リス、　２０ａ＋Ｍ硼 酸。 １．５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，９）を、また酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ ＬＤＨ）　　とマルテートデヒドロゲナーゼＣＭＤＨ）の場合は２ＸＴＣバツフ ｙ　　（１９，４ｍＭ　　トリス、　　４．２５ｎＭクエン酸、　ｐＨ７，１） を用いて行った。ＴＢＥバッファーまたはＴＣバッファーのどちらかを、垂直平 板ゲル（２０Ｘ２０ｃｍ）に３５０ボルトで２時間流し、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ ）とホプキンソン（Ｈｏｐｋｉｎｓｏｎ）の方法（１９７７、ｉｎ　Ｈａｎｄｂ ｏｏｋ　ｏｆＥｎｚｙｍｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａ ｎ　Ｇｅｒｍ−ｔｅｉｃｓ、　ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ ｇ　ＣＯ，、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、　Ｐ、２９７）に従って各酵素用の染色を行 なった。 ８．２．　１上Ｊ坏８１【検討 ８．２．１．　］］Ｌｆｉ−五一 旦初に、Ｈｚ１０７５／ＵＮＤ−Ａ−Ｘと名づけた細胞株２４個を、９６ウエル つき平板中で限界希釈接種法により分離した。 細胞株の多くは、大量の液胞をもつ細胞から成っていた、このように液胞化の甚 だしい株の大部分は最終的に死滅し、全部で１３株が残ったが、そのうちの１は 最終的に雑菌が混入し消失した。 生き残った１２株は繊維芽細胞的な性質を有し、特徴的な細胞の形態に基づいて 区別できた。全体の形態の特徴は、主として２個以上の伸展を有する楕円形（Ｏ ＮＤ−Ｂ、　Ｃ，Ｆ、　Ｂ、　Ｍ、　０．　Ｒ，Ｕ）が、あるいはいくつがの原 形質伸展をもつ不規則な形のもの（ＵＮＤ−Ｇ、　Ｈ，Ｌ、　Ｋ。 ■）であった、　　（ＵＮＤ−Ｈ細胞の集団は、大部分がこの両形態の細胞から 成っていることに注意、）たとえ単一の細胞から生じた場合でも、どの細胞株も 混合形態を示した。ＵＮＤ−Ｂ株は、楕円形の細胞が優勢で、最も一様な形態を 有していた。　ＵＮＤ−Ｇ株は、著しい原形質の液胞化によって特徴づけられた 。 ８．２．２．■ｊＬ１１」１腺 生存した１２株と、親細胞系統ＩＰＬＢ−）ＩＺ１０７５の細胞倍加時間は、２ ５ｃｉｉ組織培養フラスコ中で、各細胞の単層の決められた３区画を、４８時間 ごとに全部で８日間計測することより決定した。２個の例外を除く全細胞株が、 ９６時間までに定常増殖期に達した。　ＵＮＤ−Ｃ株は１４４時間で定常増殖期 に入ったが、ＵＮＤ−Ｘは二相性増殖曲線を示した。すなわち、９６から１４４ 時間までの見掛けの第一次定常期と、１４４と１９６時間の間の第二次増殖期で ある（第１０図）。集団倍加時間を各人ごとに計算したが（第７表）、３７．３ ３時間と６５．４８時間の範囲にあった。大多数の細胞株の倍加時間は、４５と ６０時間の間にあった。 （本頁以下余白） 第４表 Ｂ　　５０．９　１３．５８”’　　　１８．１”’　　２６．４”’　　３． ２６”’Ｃ４８，３０１６，０９’′”’　　２３．２ｂ・’　　３１．８”　 　　２．１０”＝’Ｆ　　５９．１９　１５．７８’−”’　　１９．４ｂ−ｃ ２６．２”’　　４．７２”’Ｇ　　５２．１６　１２．２４’　　　３１．２ １　１８．９”°ゝ”−’　１．２６”′”）１　３７．３３　３０．８８”　 　　　６．２ｃ４．３’　　　０．２２ｂＩ　　＞５０ｃ１１．９３’　　　　 ３．６ｃ６．３’　　　０．４８ｂＫ　　４６．６５’２６．６０”−’　　　 ５４．９’　　　２５．２”°＆ｎｅ　　Ｑ、１６ゝＬ　　６５．４８　２３． ２７ｂ−’・’　　１６．５’゛Ｃ２０，６”′’°’−’　０．４１ｂ？ｌ　 ’　３９．０２ ０　６４．５７　１７．１６ｃ′’′”′’　　１４．３”’　　２３．９”” ’　　４．５９”＝’Ｒ４１，０８２１，７９’−ｅ−’　　３０．５’　　　 ３３．９’　　　４．４９”−”Ｕ　　５１．９４　２０．４９ｂ′’−’＝” 　　１３．２”ｃ１２．８ｂ′Ｃ′’　　５．５４’゛ｂＶ　　５９．８２　１ １５１’−’−’−’　　１３．７ｂ′ｃ１Ｂ、５’＝’−’−’　５．５４” ＝”１０７５６３．１５　２３．９９”ｅ３０．５’　　　１９．２’・’−Ｃ −’　６．６７””１各細胞株の倍加時間は、Ｆｉｇ、１０の細胞増殖曲線を用 いて算出ｊ７た。 ゝ有意差の判定には、Ｄｕｎｃａｎのｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｒａｎｇｅ　ａｎａｌ ｙｓｉｓを用いた。 おなし上付き文字のついた細胞株は有意細胞がない。 ０これは倍加時間の推定値である。実際の計算はなされていない。 １データの収集前に細胞系に消失した。 ８．２．３．　ＨｚＳＮＰＶに・　る　　　のウイノし浬Ｌｉ１ＨｚＳＮＰＶの ＨｚＳ−１５プラ一ク精製分離株に対する各細胞株の相対生産性は、感染細胞の 割合、細胞あたりのＯＢｓの平均数、遊離された総感染性ＥＣＶ　、並びに感染 ７日後までの培養あたりの総ＯＢｓを概算して調べた（第４表）。ダンカン（Ｄ ｕｎｃａｎ）のマルチプルラング分析を用いて培養あたりのＯＢｓと細胞あたり のＯＢｓの統計解析を行うと、存意グループは、それぞれ３グループと６グルー プであった。細胞あたりのＯＢｓの全平均計測値は、３０．８８（ＵＮＤ−Ｈ） から１１．９３　（ＵＮＤ−Ｆ）の範囲であり、培養あたりのＯＢｓの全平均計 測値は、５４．９　Ｘ　１０’　（ＵＮＤ−Ｋ）から３．６　ＸＩＯ’（ＵＮＤ −ｉ）の範囲にあった。培養あたりの感染細胞の百分率をＤＭＲ解析すると、平 均値は３３．９％（ＵＮＤ−Ｒ）から４．３％（ＵＮＤ−Ｈ）の範囲で、４つの グループが統計的有意差をもつことが分かった。　ＥＣＶ生産性のデータは２つ の有意差のある群に分かれ、その範囲は−あたり５．４　ＸＩＯ’（Ｈｚ１０７ ５）から１．６　Ｘｌ０５（ＵＮＤ−Ｋ）ｒｃｒｎｓ。であった。 クローン化した細胞株のウィルス生産性を評価するのに用いたどのパラメーター の間にも明白な相関はなかった。集団倍加時間もこれらの生産性概算とは無関係 であった０例えば、［ＩＮＤ−ＣとｔｌＮＤ−には類似した集団倍加時間（４８ ，３対４６．６５時間）を有していたが、この両株は細胞あたりのＯＢｓ　（１ ６，０９対２６．０）と培養あたりのＯＢｓ　（２３，２Ｘ　１０’対５４．９ 　Ｘ　１０’）が有意に異っていた。 しかなからし、培養あたりの感染細胞の割合と、産生されたＥＣＶのレベルでは 統計的に類似していた（第■表）、他方、長い集団倍加時間（６５，４８時間） のｔｌＮＤ−Ｌ株と、はるかに短い倍加時間（４１，８時間）のＵＮＤ−Ｒ株は テストした生産性パラメーターのいずれでも有意差はなかった。　ＵＮＤ−Ｌ株 と親細胞系Ｈ２１０７５は同様な集団倍加時間（６５，４８時間対６３．１５時 間）を有し、ＥＣＶの生産だけが有意であった。 ８．２．４．　　　　　と　　二　のアイソザイムクローン化された細胞株の起 源を確認するために、アイソザイムであるフマル酸水添加酵素（ＦＵ？’ｌ）　 、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）　、エステラーゼ（ＥＳＴ）　（第１１図）および リンゴ酸脱水素酵素（ＮＤＨ，図には示していない）の染色パターンを、ＩＰＬ Ｂ−Ｈ２１０７５親細胞系および、起源の宿主であるＨ、ゼア由来の幼虫の組織 の両者と比較した。 全くのクローン化された細胞株のＦＵＭ、　ＬＤＨ，？ｌＤＨのパターンは、Ｈ ，ゼアの幼虫組織および親Ｉ　ＰＬＢ−Ｈ２１０７５細胞系のそれと同一であっ た。 エステラーゼ染色で得られたパターンは特に複雑であった。クローン化された株 のパターンは全て、幼虫ならびに親細胞系のパターンと類似していたが、クロー ン化細胞株間の個々の相違は明白であった。このことは、これら細胞株のクロー ン的性質を更に裏付けたことになる。 ＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５細胞系を、本発明者の研究室に保存されている他の鱗翅 類ならびに双翅類の細胞系と比較した。細胞ホモゲネートを作り、前述のように 電気泳動にかけ、ＬＤ）ＩとＭＤＨのいずれかに対して染色した（第１２図）細 胞系ごとのアイソザイム・バンドのＲｆ値は、ＴＰＬＢ−Ｈ２１０７５のバンド を対照として（Ｒｆ　＝　１．０）計算し、第４表に示しである。 （本頁以下余白） 第４表 一炭１！λＮ５旦Ｊ匂シーのしＤＨとＭＤＨに・　るＲｆ育に　　　　　ＬＤＨ ｂＭＤＨ”　　となるＡＣＴ−１０１−０３１０，０ニーデス　ニジブチＢＴＩ −ＥＡＡ　　　　　　　　　Ｏ，７７４，０エスチグメネ　アクレアＩＰＬＢ− Ｈ２１０７５１，００１，０ヘリオテベス　ゼアＩＰＬＢ−ＳＦ−２１ＡＥ　　 　　Ｏ，７７１，０スボドブラス　フルギベルダＴＮ−３６８０，５８１，９） ルコブルシア　ニイａ　細胞抽出物をＴＣバッファー中で、５％ポリアクリルア ミドゲル（９５％アクリルアミド、５％ビス−アクリルアミド）で電気泳動し、 ＬＤＨまたは？１Ｄ）ｌに対して染色した。Ｒｆ４ｆＬはＩＰＬＢ−Ｈｚ１０７ ５酵素の移動と比較して算出した。 ｂ　乳酸脱水素酵素 ０　リンゴ酸脱水素酵素 ＭＤＨに対して得られたパターンによれば、ＩＰＬＢ−）ＩＺ１０７５細胞系は 、鱗翅類細胞系の１種（ＩＰＬＢ−ＳＦ２１ＡＥ）を除く全て、並びにニーデス ニジブチに由来する双翅類の細胞系（１種）のものと異っていた。スボドブラフ ルギペルダのＩＰＬＢ−ＳＦ２１ＡＥ細胞系は、Ｍ（ＩＨに対する染色ではＩＰ ＬＢ−１（Ｚ１０７５と区別できなかったが、ＬＤＨに対する染色では区別でき た。 ９、：へ１オーイス　　二にお番る 立虹Ｌ」引１ 以下の小節では、本発明に従って作成した組換えウィルスの大量培養のために、 へりオテイスゼアの幼虫を育てる方法を記述する。上記６に記載したように、Ｈ ｚＳＮＰＶの非メラニン黒化株が、本発明の幼虫発現系として利用するのに望ま しい。 ９．１．　　　　−　’の札割 この手順は、トリク・フルシアとへりオテイスゼア用の飼料調製法を示す。エス チグメネ　アクレア用の飼料では、ビタミン混合物が２倍量必要である。 （本頁以下余白） 処　　法 ｇｇ ９０、ｄ水中のピント豆　　　　　　　１８９寒　天（シグマ”）　　　　　　 　　　　２５　　　１２．５ビタミン飼料強化混合物（ＩＣＮ）　　　３．３　 　１．６６カゼイン（シグマ’Ｉ　　　　　　　　　４２　　　２１シユークロ ース　（ＩＣＮ）　　　　　　　４２　　　２１小麦胚芽（ＮｒＣ）　　　　　 　　　　　３６　　　１８Ｗｅｓｓｏｎの温湿合物（ＩＣＮ）　　　　　　１２ 　　　６Ａｌｆａｃ、ｅｌ　（非栄養素の大袋）６３９５％エタノール１８Ｈ１ 中の メチル・パラベン　　　　　１．６６　　０．８３ソルビン酸（シグマ’）　　 　　　　　　　１．６６　　０．８３アスコルビン酸（シグマ’）　　　　　　 ５　　　２．５ストレプトマイシン硫酸塩（シグマ）　０．１６　　０．０８飼 料は次のようにして調製する： ■、調製を始める前に、メチル・パラベンを水にとかす。 ■、水１００−を沸騰させる０強く攪拌しつつ、寒天をゆ１くりと加える。２． 速攪拌は、寒天が固まるのを防ぐために必要である。寒天が固まった場合には、 スパテラでこわさなくてはならない。 ■、該混合物を、ビーカーの壁に小泡が現れるまで再加熱する。 ■、プレンダーにより、溶けた寒天とピント豆を混合する。 ■、高速で、１．５分間混合する。 ■、残りの原料を加え、高速で更に１．５分間混合する。 ■、出来上った培地を、適当な容器に分注する。室温で放冷する（１５−３０分 ）。 ■、培地を密封できる容器に入れ、使用時まで冷蔵庫中で貯蔵する。 ９．２．見」Ｌ夏」Ｌ且 上記のように調製した飼料を、各幼虫が少なくとも約１０ｄは摂取できるよう分 注する。 ９．２．１．　Ｔ、ニイ　たはＨ，ゼ　の−７、＝土またはＨ，ゼアの飼育条件 は、２８−３０″Ｃ１相対湿度６５−７０％、光同期１２時間（各２４時間）で ある、蝙化時には、踊を１立方フイートの大きさの輸送用かごに、１かごあたり ４０ケずつ入れる。蛾の成虫が出て来たら、以下の混合物を摂食させる：シュー クロース２５０ｇ、はちみつ２５ｄ、アスコルビン酸５ｇ、メチル・パラベン（ 添加する前に、始めに９５％エタノール５Ｉｄに溶かす）５ｇ５これに蒸留水５ ００ｄ！を加える（各成分は中程度の加熱により溶解させる）。蛾の成虫のため の餌混合物は、１５戚容の円錐形遠心管に入れて蓋をつけ、その蓋から２インチ の長さの歯科用糸ようじの芯が伸びているようにしであるので、成虫はその芯を つついて餌をとることが出来る。輸送用かどの壁は、滅菌した祇タオルを添付し であるので、蛾の成虫はその上に卵をうみつける。卵のついた紙タオルを、無菌 的取扱いでかごから外し、クリスパー（ｃｒｉｓｐｅｒ）と名づけだプラスチッ ク・ボックスに移す。そのボックスには、いくらかの寒天をベースにした餌混合 物が入れである。クリスパー中で卵から幼虫が卿る。幼虫は積極的屈光性である から、クリスパーの餌混合物が置いである端に光を照らすと、幼虫は餌混合物の 方へ移動し、それを摂食する。幼虫に餌混合物を与えると、幼虫の収率が向上す る。というのは、幼虫は共食いの性質があり、こうしないと他の幼虫や畔化して いない卵を食べてしまうからである。共食い性のため、幼虫は郷化したあと一日 以内に隔離する。この隔離０．２５％クロロックス（Ｃ１ｏｒｏｘ、商標）で滅 菌し、２℃蒸留した水ですすいだ画家用の筆をに用いて手で行う。この筆を使っ て、幼虫をさっと持ち上げ、各幼虫を１つのカップに１ケだけ入れるようにする 。幼虫はカップ中で蝋化まで成長させ、その時点で蛸を輸送用かごに入れる。 ｈ三イは肛叉ヱはどの共食い性はないので、わずかに違ったやり方を選択的に用 いる。Ｔ、ニイの卵が祇タオルの上に付いたら、１クオートのカップ（Ｊ、　Ｃ ｕｐ。 Ｄａｒｔ　Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ　Ｃ０ｒｌ）−＋ＭａＣＯｎ＋　Ｍｉｃｈｉｇａ ｎ、カタログＮａ８５Ｊ２０）の中に凝固した液体寒天ベースの餌混合物２Ｏ− ３０ｄを入れておき、その蓋の上に１インチ四方に切ったその紙タオルを置く。 その紙の上に、カップを逆さまにして載せる。幼虫が樽化して、餌の表面の方へ 移動したら、紙を底部より除去し、カップを正常の位置に戻す。幼むう蛸化まで カップ中で成長させ、その時点で蛸を輸送用かごに入れる。 ９．２．２．Ｇ、メロネー１ｑＪＬ！ Ｌノ」Ｌ主ニーの飼育法は、９．２．１．節のＴ、ニイ又はＬ蓋ヱのための最適 法（上記）中に述べたものと同様なプロトコールで行うが、次の点が異っている ：Ｌ人三主上の成長には光同期は不要である。温度は２５から３０°Ｃの範囲が 良好である。相対湿度は、通常の室の条件が適当である。 Ｌノ二札旦う−の幼虫の餌の組成は、２００ｄはちみつ、１００　ｄグリセリン 、ガーバー（Ｇｅｒｂｅｒ＋商標）社の混合シリアル１箱の混合物である。この 餌混合物を１クオートの蓋付広口ガラス瓶に入れるが、そのジャーの頂部には、 ワイヤー編みのスクリーンを付し、その中にＬノ二礼三ｊ−の卯を置く、幼虫が 痺ったら、その幼虫が面を作るまで必要に応じて餌混合物を更に追加する。 虹左主豆主の幼虫は、ｎ−ｔヱの幼虫はど共食い性はないので、幼虫を隔離する 必要はない、幼虫が最後の土鈴段階にあって、画形成を開始する時に、ジャーか ら手で（手袋着用）とり出し、クリスパー中に一緒に入れる。昆虫は蛸化し、成 虫がクリスパー中に現れる。 蛾の成虫は給餌なしで、クリスパーの割れ目や裂は目に卵をうみつける。こうし て、卵は蓋と箱の境い目にうみつけられるので、蓋をとると卵は蓋についてくる 。 次いで、卵をかみそりの刃で剥ぎ落とし、餌混合物の入った蓋付広口ガラスびん に入れる。 ９．３．無」Ｌ」Ｌ止 我々は、完全に無菌である昆虫群体の設立に従事している。滅菌過程で卵を殺す ことなく、Ｈ，ゼアとＬ三土の卵を滅菌することが可能となっている。卵を紙タ オル上に置き、過酢酸に３０分間さらす０次いで卵を滅菌環境（アイソレーター ）中に置き、アイソレーター中にある間、滅菌水ですすぎ洗浄する。こうして滅 菌された卵は、無菌の幼虫を生ずる。 １０、ニオ　トグーフ　シ　トルベタ　−のへ丁オーイスポ１へ′ｔン゛　−と ブロモ二り二 ＡｃＮＰＶというポリヘトリン遺伝子をもつプラスミドｐＥｃｏＲＩ−１（Ｖｌ ａｋ、　Ｊ、Ｍ、、等、１９８１．Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４０　：　７６２−７７１ ；Ｒｏｈｅｌ、　Ｄ、Ｚ、等、１９８３．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１２４　：　３５ ７−３６５：Ｓ＋ｗｉｔｈ。 Ｇ、Ｅ、、等、　１９８２．　Ｊ、ν１ｒｏ１．４４　：　１９９−２０８）を 、ヘリオティスボリヘドリン遺伝子とプロモーターをもつオウトグラファのシャ トルベクター構築のための出発物質として用いたく第１３．１４図）　、　２ｋ ｂ（７）ＸｈｏｌからＢａａ）ＩＩまでの断片を単離し、Ｍ１３ｍｐ１９のＳａ ｔ　ＩおよびＢａｍ）ＩＩ部位にサブクローン化し、クローン＋ｎｐ１９ｐＥｃ ｏＩＸＢを作成した。 プロモーター領域のＥｃｏＲＶ部位から転写開始部位に亘り、更に影１旧、シ徂 ＲＩ、５ａｌＩおよび七通Ｉ制限酵素認識部位を含む複合クローニング部位（Ｍ ＣＳ）に到るオートグラファボリヘドリン配列に従って１本のＤＮＡ断片を合成 した。オリゴヌクレオチドの合成には、アプライドバイオシステムモデル３８０ Ａ　ＤＮＡシンセサイザー（自動ホスホラミトン化学）を用いた０合成した断片 は、ｍｐ１９ｐＥのＥｃｏＲＶと上述１部位の間でクローン化し、Ｊ）１９Ａ１ ｄクローンを得た。 ｍｐ１９Ａ１ｄのＨ３ｎｄ　ｍから石Ｉまでの断片を分離した。 （Ｘｈｏ　１部位はクローニング中に失われて、ｍｐ１９の５ａｌＩ部位となっ たので、ｍｐ１９ＭｃｓのＩｉｎｄＩ［は近傍の部位として好都合である）。ｐ ＥｃｏＲＩ−１の拘徂ＩからもＢａｍＨＩまでの断片も分離した。これら２つの 断片をｐＵｃ１２のＭＣ３の）ＩｉｎｄＩ［［と５ｓｔｌ部位にクローン化した （第１３図）。 連結反応には、合成したオリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＴＣＡＧＣＴ−３’） を含むが、それは下に示す推定の反応機構に基づき、ｐＥｃｏＲＩ−ＩのＢａｍ 旧末端をｐＵｃ１２の５ｓｔＩ末端に連結させ、ＢａｍＨＩ部位を除去するため である。 −−−Ｇ　　　　　　＋　５’−ＧＡＴＣＡＧＣＴ−３’＋　　　　　Ｃ−−− −−−−−−ＣＣＴＡＧ−５’　　　　ｏｌｉｇｏ　　　　　３−ｔｃｇａｇ− −−−−−ＢａｍＨＩ　ｅｎｄ　　　　　　　　　　　　５ｓｔｌ　　ｅｎｄ− −−−ＧＧＡＴＣＡＧＣＴｃ−−−−−−−−−ＣＣＴＡＧｔＣｇａｇ−−−＝ 得られたクローン、ｐＡＶ１．５は、ポリヘトリン遺伝子のＸｈｏ　Ｉ部位５′ から転写開始部位（１つのＭＣ５）に亘るオウトグラファ配列、およびポリヘト リン遺伝子のカルボキシルコーディング末端における脂１１部位から、その遺伝 子のＢａｍＨＩ部位３′に亘るオートグラファ配列を含んでいた。Ｘｈｏ　Ｉと ＢａｍＨＩ部位は消失した。 プラスミドｐＡＶ１．５とプラスミドｐ）ＩＸ１２を、第１４図に示す構築のた めの親プラスミドとして用いた。ｐＡＶｌ、５（７）　２　ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ− ＥｃｏＲＩ断片（オウトグラファ多角体プロモーターを含む）と、ｐＡＶｌ、５ の４．２ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片（ｐＵｃ１２配列を含む）を分離 した。ｐＨＸ１２の２．２ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ　Ｉ断片（ヘリオティスボリ へドリンプロモーターおよびコーディング配列を含む）を分離し、Ｐｓｔ　Ｉ　 −ＥｃｏＲｌおよびＳａｌ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ　　ｐＡＶ　１．５由来の断片と 連結した。得られたプラスミド、ｐＡＶ）Ｉｐ　６と命名、は、ヘリオティスボ リへドリンプロモーターおよびコーディング配列をもっており、オウトグラファ ボリヘドリンプロモーターを有するオウトグラファボリへドヘリオティスポリヘ ドリン遺伝子をインビボの組換えにより、ＡｃＮＰＶ中に転写し、その結果、本 発明に準拠した発現システムを有する組換えウィルスを得るのに使うことが出来 る。　　ｐＡＶ）Ｉｐ　６は、２ケのポリへドリンプロモーターをもつ組排えＡ ｃＮＰＶを作成するのにも使用できる。こうして、同じウィルスの内部に２つの 異った異種遺伝子を発現する能力が得られる。更に、このような組換えウィルス 中に外部遺伝子が挿入され、オートグラファのプロモーターに制御されて発現す る場合には、親ヘリオティスボリへドリンプロモーターおよび遺伝子は、確実に 閉塞体形成を保持しつづけることが出来ると思われる。 １０、Ｌ　ｆＪ二蒲トＪｙ”　　−Ｋ　　−に≦＞、＋ｂｚ７ｆ・ヘマグルチニ ンの　、’　　　　コ−）ｊるオウト−Ｚｊ１１二二区ユニ」に＜ＬＬニーオウ トグラフアコ−ディング配列の一部にあるインフルエンザ・ヘマグルチニンエピ トープをコードする配列をもつオうトグラファ・シャトルベクターを構築するた めに用いられる補筆を第１５図に図解する。 第１５図には、インフルエンザ・ヘマグルチニンのアミノａ９８−１０６を、オ ウトグラフ７ポリヘドリン遺伝子のアミノ末端コード配列にクローン化する方策 が示しである。この方策は、ポリヘトリン蛋白質の第２のアミノ酸をコードする 配列の中で、インフルエンザの配列を゛Ｍ１３由来のｍｐ１９ＥｃｏＩＸＢ　（ 上記第１０で既述）に含まれるオウトグラフプポリヘドリン配列の中に挿入しよ うとするときに使うことが出来る。アミノ酸２のコドン中でｊｊｐｑｌｌ開裂部 位を含んでいる領域と相同の、オリゴヌクレオチド（Ｒｏｌ−１と命名）を合成 できる（アプライド　バイオシステムズ　モデル３８０Ａ）、　Ｒｏｌ−１をア ニーリングして、ｍｐ１９ＥｃｏｌＸＢの一本鎖ＤＮＡとし、次にこれをＨ５２ ４ｍで切断する。オリゴヌクレオチドのアニーリングにより、制限エンドヌクレ アーゼ開裂のために必要な２本領域が出来る。ｍｎ由来の末端を有する直鎖状１ 本鎖ＤＮＡは、熱変性とゲル精製により分離される。インフルエンザ・ヘマグル チニンのアミノ酸９８−１０６に相当するオリゴヌクレオチド（Ｒｏｌ−２と命 名）を合成する０次にＲｏｌ−２は、Ｒｏｌ−２に相補的な第３の合成オリゴヌ クレオチド（Ｒｏｌ−３）にアニーリングされる。更に）ｉｏｌ−３は、Ｒｏｌ −２の向うに伸びている５′および３′末端を有しているが、これは分離された 一本鎖のファージＤＮＡの塩１１Ｉ由来の末端に相補的である。このようにして 、アニーリングされたＲｏｔ−２／Ｒｏｌ−３ＤＮＡは、分離された一本鎖ファ ージＤＮＡと連結され、円状のＤＮＡ分子が形成される。 細菌の細胞を、上記の連結した複合体で形質転換した後、希望する形質転換細胞 を、ベントン（Ｂｅｎ　ｔｏｎ）およびデービス（Ｄａｖｉｓ）の方法（１９７ ７，５ｃｉｅｎｃｅ　１９６：１８０−１８２）により、放射性同位元素標識し たＲｏｌ−３に対するハイブリダイゼーションで選択することができる。更にＲ ｏｌ−３は２つの制限部位、Ｍｌｕ　Ｉとル１１をコードしているが、この２つ は親のｍｐ１９ＥｃｏｌＸＢ　ＤＮＡ中には見出されていない、そこで、選択さ れた形質転換細胞の同一性は、形質転換細胞群から分離されたファージＤＮＡ中 にＭｌｕ！およびＭｓｆ　１制限部位の存在によづて確認される。 変法としては、アミノ酸５８をコードしている配列中のＢａｍＨｉ部位として、 ＋ａｐ１９ＥｃｏｉＸＢ中に含まれているポリヘトリン配列を切るために、上記 と同様の方策を用いることもできる。 １１、実Ｊｕｌ：ΣＬオーイスゼアク　　　ライ」ぞに主炭五ぶ」■Ｌ釘り二り 旦り」］９５：臼以免曵ここでは、ＨｚＳＮＰＶに基づく発現系を用いて、−’ ４土±土ｘ−Ｗヱ（Ｂｏｄｄｉｅ）中の異種蛋白質の産生について記述する。プ ラスミドｐ）ｌＥ２．６１ａｃを、大腸菌のＬａｃＺ遺伝子を、ＨｚＳＮＰＶの 多角体遺伝子の５′配列に融合することにより構築された（上記６．３．３．− ＩＪ＝Ｍ）。、±２づニ弘組換えにより、このプラスミドを、幼虫と培養細胞中 でβ−ガラクトシダーゼを産生ずる組換えＨｚＳＮＰＶの作製に用いた。β−ガ ラクトシダーゼの発現には、一時的な調節が見られた。培養細胞と幼虫中のβ− ガラクトシダーゼのレベルは、培養中ですくなくとも２００μｇ／１０’細胞で あり、幼虫の全湿重量の０．１％よりも大きかった。 １１．１．材」生」と坊二汰 １１．１．１．旦皿立光重四ス ＨｚＳＮＰＶエルカ−株のプラーク精製クローンであるＨｚＳ−１５を、親ウィ ルスとして用いた。ユニ土主土久亙ヱＩＰＬＢ−Ｈ２１０７５のクローン系統（ Ｇｏｏｄｗｉｎ、　Ｒ，Ｈ，１９７５゜Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１１：３６９−３７ ８）であるＩＰＬＢ−）ＩＺ１０’７５　ｔｌＮＤ−にの単層培養を、１０ｇ／ ｆのＢＳＡ（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ。 ！１１ｉｎｏｉｓ）、　２　ｇ　／　１２のＬ−グルタミンおよび１０％牛脂児 ［血清コ丁）ＪＭ−ＰＨ−１０（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、Ｎｅ ｗ　Ｗｏｒｋ）を添加した丁ＮＭ−ＦＨ培地（ｌｉｎｋ、　Ｗ、Ｆ、、１９７０ ．Ｎａｔｕｒｅ　２２：４６６−４６７）中で、２８℃で生育させた。ウィルス ・ストックのは、０．１の感染多重度で単層の細胞を感染させ、１０日後に培養 培地を回収し、０．４５μ園フイルターで培地を濾過し、０．１％アガロースと 共に４°Ｃで貯蔵するという方法り作成した。ストックは、プラーク・アッセイ 法に依り力価を検定した。　（Ｆｒａｓｅｒ、？１．Ｊ、＋１９８２＋Ｊ−Ｔｉ ｓ、Ｃｕ１ｔ、Ｍｅｔｈ　７　：４３−４６）。 １１．１．２．　ａ　　−スミ゛の　開祖換えプラスミドをＭａｒｉｉａｔｉｓ 等の方法を用いて作製した（１９８２１Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｏｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、制限酵素はプロメガ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏ ｎｓｉｎ）から購入した。バクテリアアルカリフォスファターゼとＴ４　ＤＮＡ 　リガーゼはＢＲＬ　（Ｇａ　ｉ　−ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ＋　Ｍａｒｙｌａｎｄ ）より入手した。オリゴヌクレオチドは、アプライド　バイオシステム　モデル ３８０ＡＤＮＡシンセサイザー（ＣＡ）を用いて合成した。 １．５Ｘ１０’個の細胞Ｃ５，５５ｇ／１．　ＢＳＡと２０％牛脂児血清ＴＮ？ １−Ｆ）！−２０を添加したＴＮ？１−ＦＨ培地中で２継代生長せしめたもの） を６０閣ブレー中で一晩付着させ、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびパンデルニ ブ（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）の塩化エルシウム沈澱方法（１９７３，Ｖｆｒｏｌ ｏｇｙ　５２　：　４５６−４６０）を用いてトランスフェクトした。インビボ 組換えによる組換えウィルス作製のためのコトランスフェクシジン実験で、８ｎ ｇのウィルスＤＮＡと１０μｇのプラスミドＤＮＡを用いた。沈澱物を加えた培 地は１６時間後に３ｄのＴＮ？Ｉ−ＰＨ−２０培地と交換した。細胞は７日間、 回復させた。 トランスフェクトした細胞から得た１００μｌの上清を含むＴＮＭ−ＰＨ−１０ 培地３Ｉｄと共に、６０■プレート中の新鮮な単層を２８°Ｃ１１８時間培養し た。　　ＴＮＭ−ＰＨ−１０培地中で、細胞を０．４％ジ−プラーク（Ｓｅａｐ ｌａｑｕｅ）アガロース（Ｆ？ｌＣバイオプロダクツ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、？１ ａｉｎｅ）の３−で表面をおおった。７日後、叢生した細胞のプラークを調べた 。　　（Ｆｒａｓｅｒ＋　Ｍ、Ｊ、＋１９８２．Ｊ、Ｔｉｓ、Ｃｕ１ｔ、Ｍｅｔ ｈ、　７　：　４３−４６）、β−ガラクトシダーゼを発現している組換えウィ ルスを選択するために、５−プロモー４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガ ラクトピノラシド（Ｘ−ｇａｌ）のジメチル・ホルムアミド溶液（２０■／ｄ） を１プレートあたり６μｌずつアガロースの被覆物の上に添加した。 １１．１．４．　　　　゛ウィルスの　制と青色のプラークをディスポーザブル のピペットチップでプレートから取出し、ＩＩ！１１の完全培地中に置いた。 アガロースからウィルスを分離するために、チューブを短時間攪拌し、その１０ ０μ２を用いて新鮮な単層を、アガローズの被覆物の代りに６０ｍプレート上に 接種した０組換えウィルスはこの方法で３回乃至は一連の平板培養を連続して２ 回行って、全てが閉塞体陰性である青色プラークを与えるまでプラーク精製を行 った。 ウィルスのストックは、プラークを採取し、２４のウェルをもつ平板中のＴＮＭ −ＦＨ−１０培地に、１ウエルあたり５Ｘ１０’個の細胞を接種したものに対し て、１ウエルに１個のプラーク全体を入れて作った。２週間後、ウェルの上滑を 、１．５　ＸＩＯ’個の細胞を接種した６０ｍｏ＋平板に添加した。１０日後、 ６０ＩＩＩＩＩｌ平板からとった上滑を０．４５μ−のフィルターで濾過し、こ れで７２５フラスコ中の細胞を感染させた。さらに１０日後、このＴ２５フラス コの上滑を濾過し、別の７７５フラスコに感染させた。 １０日経過後、↑７５フラスコから上清を取出し、濾過した。Ｔ７５°フラスコ の濾過した上滑２ｍを使って、Ｔ１５０フラスコを感染させ、更に１０日後、こ のＴ１５０フラスコの上清を取出し、濾過し、０．１アガロースで安定化し、１ ウエルあたりｌＸｌ０’個の細胞を接種した。６個のウェルに、１０３．１０’ 、　１０’、　１０’倍に希釈したものの各１μ２を接種した。各希釈ごとにく りかえしをとったので、希釈されたものを接種されたウェルは、全部で１２個と なった。７日後に、２０■／ｄのＸ−ｇａｌ溶液を１μｌずつ各ウェルに添加し た。更に１０日間、毎日、プレートを検査してウェル中の青色の展開状況を見た 。 希釈各組の青色ウェルの数を数え、最確数表から推定力価を算出した。 １１．１．５．感汎した玄　　１゛ウイルスＤＮＡの感染した幼虫５０１ｄを、 ０．１％ジチオスレイトール入り水冷ＴＥバッファーパンファー（１０ＩＩＩＭ トリス、１ａ＋ＭＥＤＴＡ、　ｐｉ　７．５）１００　ｄに入れて、乳鉢と乳棒 で磨砕した。 ホモゲネートを、数層のチーズクロスで濾過した。次にホモゲネートを、１０． ０ＯＯＸ　ｇ　、　２０分間遠心分離し、ベレットを水冷ＴＥバッファー３０ｄ に再懸濁した。多角体は、ＴＥババッァー中で、４０−６３％御／−の連続ショ 糖勾配置５Ｉ！Ｉｌニ５−を重層し、５Ｗ３０　ｏ−ターで、１００，０ＯＯＸ ｇ、３０分間スピンして、２回分画した。各スピンの後、多角体のバンドをプラ スチック製転移ピペット（Ｆｉｓｈｅｒ）で取出し、蒸留、脱イオン水で２０ｍ １に希釈し、１０．０００ｘ　ｇ　、　３０分間スピンしてベレット状とした。 多角体をＴＥバッファー２０ｄに再懸濁し、その多角体懸濁液を室温で、アルカ リパンファー（０，１Ｍ炭酸ナトリウム、　０．１７Ｍ、塩化ナトリウム、ｐ） Ｉ　１０．８）で１：４に希釈し、ウィルスを遊離した。５分後、５Ｉｄのウィ ルスをＴＥババッァー中で、２５から５３％−への連続シヨ糖勾装置５Ｉｄニ重 層し、５Ｗ３Ｑｏ−ターフ、１００．０ＯＯｘ　ｇ　、　３０分間スピンした。 転移ピペットでウィルス分画を取出し、ウィルスを蒸留、脱イオン水で２０戚に 希釈し、５Ｗ３Ｑｏ−ターｒ、１００，０ＯＯＸ　ｇ　、　３０分間スピンしテ ヘレットとした。各ウイルスベレットを、０．１５？ｌ　ＫＣＩを含むＴＥバッ ファーバッファー１１ｄに再懸濁し、このウィルス懸濁液を６５°Ｃで１５分間 培養した。ウィルスを溶解するために、ウィルス３Ｉｄに１５０μ！の２０％サ ルコシルおよび１５０μ１０２０■／Ｉ！！ｉ、ブロティナーゼに溶液を加え、 ４２℃、２時間培養した。次に３．３ｇの塩化カルシウムおよび０．２５ｄの１ ０■／ｄエチジウム・プロミドのストック液を加え、ゆっくり攪拌し、５Ｗ５０ ．　１０−ターで、４０．ＯＯＯｒｐｍ、　２４時間スピンした。プラスチック 製転移ピペットで上層と下層を取り出し、エチジウム・プロミドが全て除去され るまで塩化ナトリウム飽和イソプロパツールで抽出し、０．１ｘＳｓＣＪｆ中で 一夜透析した。ＤＮＡは４°Ｃにで保存した。 １１．１．６．構法した　　　）ＤＮへのゝ−感感染後１ロ 除去した。全ＤＮＡは感染した細胞に４月グアニジニウム溶液（４Ｍグアニジニ ウム・イソチオシアネート。 ０、５％サルコシル、　５＋ｎＭ酢酸ナトリウムおよび０．１ＭＢ？１ＤＨ）の ３−を加え、同容積のフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール（２ ５　：　２４　：　１）で３回抽出し、エタノールで２回沈澱させることにより 分離した。適当な酵素で限定分解を行い、０．７％アガロースゲル６０−で電気 泳動を行った後、ＤＮＡを毛細管運動によりナイロンメンブレンへ移した（１’ １ａｎｉａｔｉｓ　等，１９８２。 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ，Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｒ＋ｇＨａｒｂｏｒ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。ハイブリダ イゼーションは５０％ホルムアミドを用いて行った。 １１、１．７．邦ｌ「υ乳ｉ上１ガークトシ゛ーゼ＼２４個のウェルつき平板２ 枚にＴＮＭ−ＰＨ−１０培地を入れて、ウェルあたり５Ｘ１０’個の細胞を接種 した。細胞は一夜付着するままにさせた．１６個のウェルをＨｚＳ１５Ｂｇａｌ −Ｃ３又はＨｚＳ−１５で感染させ、あるいは未感染のままにしたが、その方法 は、培地をＴＮＭ−ＰＨ４Ｍあたり３Ｘ　ｌｏ’ｐｆｕ　（プラーク形成単位） のウィルス・ストック（Ｌ５　Ｉｄで置きかえることに依った。この時点をｔｏ とした。感染後１８時間目に、接種体を取出し、０．５ｄのＴＮＭ−ＦＨ−１０ 培地を加えた。感染後２４時間口に、細胞の上の培地を１０％牛脂児血清を含み 、ＢＳＡを含んでいないＴＮＭ−ＦＨ培地ととりかえた。感染後４０時間口に培 地をＧｒａｃｅの培地ととりかえた。各接種体あたり、細胞のウェル２個を、約 １２時間間隔で採取した。細胞と上滑を、ｌｄのピペットを用いて、ウェルから 取り出した。 細胞は、５ｏｒｖａ１１２Ｂ遠沈器で、３０００ｒｐｍ、　１０分間スピンして ベレットにした。上清を他の滅菌したチューブに移し、両チューブを液体窒素浴 で急速凍結し、分析時まで一７０℃で貯蔵した。β−ガラクトシダーゼ活性は、 ファルマシアの方法に手を加えて分析した（１９８６．　　β−ガラクトシダー ゼ分析法：原核細胞と真核細胞の抽出物の調製と分析条件、Ａｎａｌｅｃｔｓ＋ Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ、Ｖｏｌ、１４：２，４−５）、細胞のベレットは、ＦＴ バッファー２５μ２を加えて再懸濁した。細胞を、１．５　ｄチューブ中で、１ ０％ＮＰ−４０１０ｕ　ｌおよびクロロホルム２μ！を加えて溶解した。細胞を ５秒間、はげしく攪拌した。抽出液と２バツフアーの同量を混合し、全体で２０ ０μ２とした０次に、４０μｌの０ＮＰＧ反応バッファーを加えて、チューブを ３０″Ｃで培養し、かすかな黄色が現れたら、炭酸ナトリウム１００μ２を加え て反応を停止した。４２０ｎｍ（Ａａ□。）の吸光度を測定した。β−、ガラク トシダーゼ（β＝ｇａｌ）の活性は、次のようにして計算した。 β−ｇａｌユニット／滅＝　（Ａ、、、１０．００４５）／（反応時間（分）× 抽出液のｄ）ｅ 蛋白質の濃度は、ブラットフォード（Ｂｒａｃｌｆｏｒｄ）の方法を基礎にし７ たバイオラッドラボラドす・−ス゛（Ｒｉｃｂｔ＋ｏｎｄ。 ＣＡ）の分析法を用いて測定した。更に、９％ポリアクリルアミドゲルによる分 離のために、一定量をサンプルバッファーと共に３分間煮沸し、つづいてクーマ シー・ブルーとウェスタン法で染色した。この煮沸したサンプルは、必要時まで 一２０°Ｃで貯蔵した。　Ｃａｐｐｅｌからのウサギ抗β−ガラクトシダーゼ抗 体を、ウェスタン法に用いた。アルカリフォスファクーゼに抱１合したマウス抗 ウサギＩｇＧを、第２の抗体として使った。 １１．１．８゜幼皇Ω三叉上Ｌ−Ｌ九乞１乞久二だ二立捉幼虫をイグノッホのピ ント豆寒天べ・−ス飼料（１９６３゜Ａｎｎ、Ｅｎｔ、Ｓｏｃ、Ａｍ、　５６　 ：　１７Ｂ−１８２）を用いて、カップ中で飼育した。幼虫は、生まれたての時 （第−令）もしくは１から２インチの大きさになったとき（第３〜第４令）に、 直接に口から感染細胞を接種して感染させた。 コントロールには蒸留水を与えた。大きめの感染した幼虫を１個ずつ、１０％Ｎ Ｐ−４０を５０μｌとクロロホルム２０μｌを含むＦＴバッファー４５０μ！中 で粉砕した。ホモゲネートをマイクロ遠沈器で１０分間スピンした。幼虫抽出液 は、上述の細胞抽出液と同様に分析した。新生幼虫は、ＦＴババッｙ　　４５μ ｊｉ、１０％ＮＰ−４０＋　　５　ｕ　’　＋クロロホルム２μ！を用いて粉砕 した。 １１．２．　　亘−一一一果 １１．２．１．　ＨｘＳ１５Ｂ　ａｌ−Ｄ３のプラスミドｐＨＥ２．６１ａｃは 、上記６．３，３．に述べたと同様な方法で構築した。トランスフェクションは 、上記１１．１．３．で述べたと同様に行った。トランスフェクションの上清か ら１０６細胞あたり平均５７６ｐｆｕが出来たが、そのうち５％はＸ−ｇａｌの 存在で青変するプラークであった。青色プラークの１つ、ＨｚＳ−１５Ｂｇａｌ −Ｄは３回の精製によりプラーク純化されたものであった。３回目で出来た青色 プラーク、ＨｚＳ１５Ｂｇａｌ−Ｄ３は、今後の研究のためウィルス・ストック を作るのに使用された。 採取し、１ＩＪ１の培地に再懸濁したプラークから、平均４９ｐｆｕ／ｌｌ１１ がえられた。　ＨｚＳ１５Ｂｇａｌ−Ｄ３の最終ストックの力価は、９６個ウェ ルつき力価平板上で細胞の希釈分析を行うと、５　Ｘ１０’ｐｆｕ／ｄであった 。 １１．２．２．　−ガラクトシダーゼ　　　　る　　えイルスの　　　−・ ＨｚＳ１５Ｂｇａｌ−Ｄ３で感染した細胞のβ−ガラクトシダーゼ産生を時系列 分析したところ、β−ガラクトシダーゼは一時的に制御を受けていることがわか った。第■表には、ＨｚＳ１５Ｂｇａｌ−Ｄ３に感染した細胞から作った細胞ベ レット中のβ−ガラクトシダーゼ活性（Ｕｎｉｔｓ／ｇ）の発現を、ＨｚＳ−１ ５に感染した細胞並びに未感染細胞と比較して示しである。 （本頁以下余白） 第■表 １７．５　　　４．４　　３．２　４．０３．８　　９．５　０．０ ２４．０　　　１．３　　０．４　０．４０．４　　１．１　０．６ ４０．５　　　０．２　　２．７　１．７２．９　　１．１　１．７ ４８．０　　　０．０　　０．０　０．００．０　　０．０　２０．０ ６５．５　　　７３．７　　３．４　３．４９７．９　　１．５　１３．４ ２７．７ ２９．２ ７２．０　　１８７．１　　２，９　１３．７３９．３　　１２．４　１４．５ １１８．２ ２３．９ ８８．５　　３６６．９　　７．８　６．９２１４．６　　２．９　１９．１ ９７．０　　２７６．０　　４．４　１７．４５１０．１　　８．０　　・１． ３ 本細胞ペレットのタンパク質質レベルの定ｔがら。 １１．２．３．　　　　えウィルスに座汎した　　　の　−ガラクトシダーゼの 第１６図に示すのは、低感染多重度でウィルスＨｚＳ１５Ｂｇａｌ−Ｄ４に感染 し、１４日後に回収した２４−ウェルの平板の細胞からとった細胞蛋白質を、７ ．５％ポリアクリルアミドゲルにかけたウェスタン法である０組換えβ−ガラク トシダーゼの蛋白質は、マーカー（野生型）のβ−ガラクトシダーゼよりも緩慢 に移動しているが、それは、組換え体は、β−ガラクトシダーゼに融合した分子 量約１０．０００ダルトンの多角体をもつ融合蛋白質だからである。ウェスタン 法によるコントロールのβ−ガラクトシダーゼ・蛋白質（レーンＭ、β−ガラク トシダーゼ１０μｇを重層）と、感染した細胞蛋白質（レーン１：ウェル１から １．６　ＸＩＯ’の溶解した細胞を重層：レーン２：ウェル２から３．２Ｘ１０ ’の溶解した細胞を重層）の相対染色に基づいて、ゲルに重層された感染細胞の 溶解物中には、少なくとも１μｇの組換え蛋白質が存在する、乃至はｌＸｌ０’ 個の細胞中に約１００μｇが存在すると結論することができる。 第１７図に示すのは、低感染多重度でウィルスＨｚＳ１５Ｂｇａｌ−Ｄ４に感染 し、１４日後に回収した２４−ウェル平板の第５ウエル中の細胞からとった細胞 蛋白質を９％ポリアクリルアミドゲルにかけたもののウェスタン法である０組み かえβ−ガラクトシダーゼの蛋白質は、マーカーのβ−ガラクトシダーゼよりも 緩慢に移動しているが、それは、組換えはβ−ガラクトシダーゼに融合した分子 量約１０，０００ダルトンの多角体をもつ融合蛋白質であるからである。ウェス タン法によるコントロールのβ−ガラクトシダーゼ・蛋白質（レーンＭ：β−ガ ラクトシダーゼ１０μ！重層）と、感染した細胞蛋白質（レーンＣ：　０．５　 ＸＩＯ’溶解細溶解細胞重相対染色に基づいて、ゲルに重層された感染細胞の溶 解物中には、少なくとも１μｇの組換え蛋白質が存在する、乃至は、ｌＸｌ０’ 個の細胞中に約２００μｇが存在すること結論することが出来る。 １１．２．４．　　　　えウィルスに構法したＨ、ゼアの　−ガラクトシダーゼ の 第１８図に、ＨｚＳ１５Ｂｇａｌ−Ｄ３に感染した、生まれたてのＨ，ゼア幼虫 （全重量１〜３■）からとった蛋白質のクーマシー・ブルー染色９％ポリアクリ ルアミドゲルを示す、目に見えるバンドは、組換え蛋白質が存在すると期待され る位置に移動したものだけである。感染した新生幼虫のβ−ガラクトシダーゼ活 性の単位は、レーンＬ１では、５１８．４Ｕｎｉ　ｔｓ　／　ｍｇ蛋白質、レー ンＬ２では、５４０．０Ｕｎｉｔｓ／■蛍白質という測定結果であった。 第１９図には、ＨｚＳ１５Ｂｇａｌ−Ｄ３　（レーンＬ）に感染した新生幼虫（ 全重量２■）からとった蛋白質のウェスタン法による９％ポリアクリルアミドゲ ルを示す。感染した新生幼虫のβ−ガラクトシダーゼ活性の単位は、１５６３． ８　Ｕｎｉｔｓ／■蛋白質であった。クマシー染色の幼虫蛋白質にみられた主要 蒼白質のバンドは、抗β−ガラクトシダーゼ抗体処理により視覚化したウェスタ ン法（第１９図）のバンドと一緒に移動している。この結果は、組換えβ−ガラ クトシダーゼの蛋白質が、感染した幼虫の乾燥重量の重要な部分を占めているこ とを示唆している。幼虫抽出液の約２０％をポリアクリルアミドゲルに重層した 。β−ガラクトシダーゼのマーカーと、幼虫抽出蛋白質の相対染色に基づき、幼 虫の湿重量の０．１％以上が、組換えβ−ガラクトシダーゼ・蛋白質であると結 論することが出来る。第Ｘ表には、ＨｚＳ−１５に感染した幼虫の、多角体収量 の概算（全湿重量の１．８％）を示す。 第Ｘ表 叩０Ｔ）Ｉ）Ｓ　ＺＡＥ玄の 幼　虫　　粗多角体　　　　部分的に 湿重量　　　重量　　％１　精製された　　％１（ｍ　　　　　（ｍ）　　　　 　　　遵バムと一一一１　　．２９９　　　．０６１　　２０　　　８．８　　 　２．９２　　．３２９　　　．０５２　　１６　　　８．０　　　２．４３　 　．１６４　　　．１０４　　６３　　　３．７　　　２．３４　　．４１２　 　　．０６０　　１５　　　３．７　　　０．９５　　．４４０　　　．０４１ 　　　９　　　２．２　　　０．５６　　．４６９　　　．１０８　　２３　　 　７．１　　　１．５１．８ 本蛋白質定量のため可溶化 １多角体により表される幼虫重量のパーセント。 表に示すプラスミドをもつ、下記の大腸菌株を、農業研究センター−コレクショ ン（ＮＲＲＬ）　（Ｐｅｏｒｉａ、　ＩＬ・、）に寄託し、下記のような受託番 号が割りあてられている。 Ｌ９旦抹　　プラスミド　　　７？九入象−に１２　（ＤＨ５）　　　　　ｐＨ χ１２　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ４８１７２Ｘｉ２（Ｄ）１５）　　　　　ｐＨＨ ５ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１７３Ｍ１２（ＤＨ５）　　　　　ｐＨＥ２．６　　　　 ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１７４に１２（ＤＨ５）　　　　　ｐＨＥ２．６１ａｃ　　 　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１７５に１２（Ｄ）１５）　　　　　ｐＡＶ）ｌｐ６　　 　　ＮＲＲＬ　Ｂ４８１７６下記のへりオティスゼア細胞系と、へりオテイスゼ アＮＰＶ分離株を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃ　Ｋｖｉ ｌｌｅ、ＭＤ）に寄託し、表のような受託番号が割りあてられている。 アクセス・階 へリオティス細胞系　　　・　　　ＡＴＣＣＣＲＬ　９２８１１ＰＬＢ−Ｈ２１ ０７５／ＵＮＤ ヘリオティ、；ｕｐｖ分離株　：　　　　ＡＴＣＣＶＲ２１５６ｚＳ−１５ 本発明は、寄託した微生物と細胞系範囲に限られるものではない、というのは、 寄託した具体物は、本発明の単なる一面を示すことのみを意図したものであり、 機能的に同等であるならば、いかなる微生物でもウィルスでも、本発明の範囲に 入るからである。実際、技術的に優れた人々にとっては、これまでに述べたこと や添付の図面から、本文の内容に加えて、この発明を様々に修正し得ることが明 らかになるであろう。そのような修正は、添付した請求の範囲に含まれるものと 解釈する。 更に了解を得たいのは、ヌクレオチドに関して用いた塩基対の大きさは、全て概 略のものであって記述の目的に使ったものであり、ＤＮＡ配列を模式的に表わし ている図面は、必らずしも一定のスケールで書かれてはいないということである 。 第１図 ｔｈｒ　ａｒｇ　ｐｈｅ　ｗｅｔ　ｇｌｕ　ａｓｐ　ｓｅｒ　ｐｈｅ　ｐｒｏ　 Ｌｉｅ　ｖａｌ　ａｓｎ　ａｓｐ　ｇｌｒ＋　ｇｌｕ　１１■@ｔａｃｔ　ａｓ ｐ　ｖａｌ　ｐｈｅ ＡＣＴ　　ＣＧＴ　　ｎＣＡＴＣ（：ＡＡ　　ＣＡＣＡＣＴ　　ｍ　　ＣＣＣＡ Ｔｒ　　ＣＴＡ　　ＡＡＣＣＡＣＣＡＡ　　ＧＡＡ　　ＡＴ秩@　ＡＴＣＣＡＣ ＧＴＣｍ １ｅｕ　ｓｅｒ　ｖａｌ　ａａｎ　ｗｅｔ　ａｒｇ　ｐｒｏ　ｔｈｒ　ｌｙｇ　 ｐｒｏ　ａａｎ　ａｒｌ（ｅｙｓ　ｔｙｒ　ａｒｇ　ｐｈｅ@ｌｅｕ　ａｌａ　 Ｂｌｎ　ｈａｓ ＣＴＣＴＣ’ｒ　　ＣＴｒ　　ＡＡＴ　　ＡＴＣ；　　ＣＧＡ　　ＣＣＡ　　Ａ ＣＣＡＡＡ　　ＣＣＧ　　ＡＡＣＣＣ７τ（ｉＴ　　ＴＡＣbＣＡ　　”ｒ’ｒ ＣＴｒＡ　　ＧＣＣ，ＣＡＡ　　ＣＡＣａｌａ　ｌｅｕ　ａｌａ　Ｃｙｓ　ａｓ ｐ　ｐｒｏ　ａｓｐ　ｔｙｒ　Ｌｉｅ　ｐｒｏ　ｈｌｓ　ｇｌｕ　ｖａｌ　Ｌｉ ｅ　ａｒｇ　ｌｌｅ@ｖ＋ｉＬ　ｇｌｕ　ｐｒ口ａｔｒ ＧＣＴ　　ＣＴＧ　　ＣＣＴ　Ｔ（Ｔ　０１丁　ＣＣＣＧＡＣＴＡＴ　　ＡＴｒ 　　ＣＣＴ　ＣＡＣＧＡＡ　ＣＴＣＡＴＴ　ＣＣＴ　ＡＴｒ@ＣＴＡ　　ＣＡＡ 　　ＣＣＴ　ＴＣＣ ｔｙｒｖ＊Ｌｇユｙｓｅｒａｓｈａｓｎｇｌｕ七ｙｒｅｒｇＬｉｅａｅｒｌｅｕ ａｉｍｌｙｓＡｙｓｔｙｒｇａｙｇｌｙａｙｓｐｒ。 ＴＡＴ　ＩＩＴＡ　ＧＣＣＡ（Ｔ　　ＡＡＣＡＡＣＧＡＧ　ＴＡＣＡＧＡ　　Ａ Ｔｒ　　ＡＧＴ　ＴＴＡ　ＧＣＣＡＡＡ　　ＡＡＡ　丁＾ＣbＣＣＧＯＴ　ＴＣ ＣＣＣＣ ｖａｌ　ｒｎｅｔ　　ａａｎ　　ｌｅｕ　　ｈｌｓ　　ａｌａ　　ｇｌｕ　　ｔ ｙｒ　　ｔｈｒ　　ａａｎ　　ｓｙ　　ｐｈｅ　　ｇｌｕ　@ａｓｐ　　ｐｈｅ 　　Ｌｉｅ　　ｔｈｒ　　ａｓｎ　　ｖａＬ　　ＬｉｅｃＴ丁　ＡＴＧ　　ＡＡ ττＴＣ；　　ＣＡＣｃｃＴＧＡＡ　　ＴＡＣＡＣＴ　　ＡＡＴ　ＴＣＣｍ　　 ＧＡＡ　ＧＡ丁　Ｔｒ：　　ＡＴＴ@Ａｃｅ　　ＡＡＣＣ，τＡＡＴｒ ｔｒｐ　ｇｌｕ　ａｓｎ　ｓＪｎ　ｔｙｒ　Ａｙｓ　ｐｒｏ　Ｌｉｅ　ｖ！Ｉｌ 　ｔｙｒ　ｖａｌ　畦ｙ　ｕｈｒ　ａｓｐ　ａｔｒ　ｌＩＬ普@ｇＬｕ　ｇｌｕ 　ｇＬｕ　ｇｌｕ 丁ＧＧ　ＧＡＧ　　ＡＡＣｎＣＴＡＣＡＡＡ　　ＣＣＡ　　ＡＴｒ　（ｉＴｒ　 　ＴＡＣＧｉＴＡ　　ＧＣＣＡＣＴ　にＡＴ　ＴＣＴ　ＣＣbＧＡＡ　　ＧＡＡ 　　ＧＡＧ　　ＣＡＡＬＬ＠　ｌ＠ｕ　　ｌｅｕ　　ｇｌｕ　　’ｖａＬ　　ａ ｅｒ　　ｌｅｕ　　Ｌｉｅ　　ｐｈｅ　　ｌｙａ　　Ｌｉｔ　　ｌｙｓ　　ｇＬ ｕ@　ｐｈｅ　　ａｌａ　　ｐｒｏ　　ｅｌｍ　　ｐｒｏ　　ｌｅｕ　　ｔｙｒ ＡＴＡ　　ＣＴＣＣＴｋ　ＧＡＧ　　ＣＴｒ　ＴＣＴ　ＴｒＣｉ　　ＡＴＡ　　 ｍ　　ＡＡに　　ＡＴＣＡＡＡ　にＡＡ　ｍ　ＧＣＡ　　ＣbＴ　ＣＣＣ；　　 ＣＣＣＣＴＡ　　ＴＡＣ第１図（Ａ） 第１図ＣＢ） 第２図 疎水性 第４図 第５図ＬＡ）（２） 第５図（Ａ）　（１）がら ＢａｍＨ１／Ｐｓｌｌ 第５図（Ｂ） 合成オリゴヌクレオチド（ＭＣ３） 第５図（Ｃ） Ｃｘｏ　ｍで消化−二重鎖ＤＮＡ３’→５′を消化連結、形質転換 第６図 Ｈｉｎｄｍ　　　　　　Ｈｉｎｄｍ Ｗ’１２４５７　Ｂ　１１１２１３１４１５２１２２２４　　１７２０２３２５ 第７図 ＢｏｍＨＩＥｃｏＲＩ　ＥｃｏＲＶＨｉｎｄｍ　Ｋｐｎｒ　Ｐｓｆｌ　５ｓｆＬ ＊”　１５　’４１”１５　＊’１５　＊’″１５　Ｗ”１５　Ｗ”１５　Ｗ” １５第８図（Ａ） 単離体　　領＠夏　　　　　領域ＩＩ　　　　　領域■　　　　　領域■第９図 ＨｚＳＮＰＶの構造タンパク質 ＊”　　２　４　５　７　９　　／２　１３　１５特表平：２−５０２８７３（ ４Ｂ） 第１１図 ＦｕＭ　　　　　　　　　　　　　　　ＬＤＨ第１２図（Ａ） 第１２図（Ｂ） 第１３図 ↓ ｔり　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　×第１６ 図 Ｈ，ゼア組換え体（細胞培養物）によるベータ・ガラクトシダーゼの発現 第１７図 Ｈ，ゼア組換え体＜ｔａ胞培養物）によるベータ・ガラクトシダーゼの発現 Ｃ 第１８図 ガラクトシダーゼの発現（クーマシー染色）ＬＩＬＺ　　　　　　　Ｍ η 第１９図 Ｍ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．そのゲノムがヘリオデイスポリヘドリンプロモーターおよびヌクレオチド配 列を含む組換えウイルスであって、該ヌクレオチド配列は異種ペプチドまたは蛋 白質が上記組換えウイルスで感染した宿主内で発現されるように、上記ヘリオデ イスポリヘドリンプロモーターのコントロール下で発現される上記異種ペプチド または蛋白質をコードしている、組換えウイルス。 ２．バクロウイルスを含む請求の範囲第１項に記載の組換えウイルス。 ３．顆粒症ウイルスを含む請求の範囲第２項に記載の組換えウイルス。 ４．核ポリヘドロシスウイルスを含む請求の範囲第２項に記載の組換えウイルス 。 ５．ヘリオテイスゼア核ポリヘドロシスウイルスを含む請求の範囲第４項に記載 の組換えウイルス。 ６．上記ヘリオテイスゼア核ポリヘドロシスウイルスがＡＴＣＣに寄託されそし て受託番号ＶＲ２１５６が付されたＨｚＳ−１５ウイルス株からなる請求の範囲 第５項に記載の組換え体ウイルス。 ７．上記宿主が感染昆虫からなる請求の範囲第５項に記載の組換えウイルス。 ８．上記宿主がヘリオデイス細胞系からなる請求の範囲第５項に記載の組換えウ イルス。 ９．上記ヘリオデイス細胞系がヘリオテイスゼア細胞系１ＰＬＢ−ＨＺ１０７５ からなる請求の範囲第８項に記載の組換えウイルス。 １０．上記ヘリオデイス細胞系がＡＴＣＣに寄託されそして受託番号ＣＲＬ９２ ８１がれされたヘリオテイスゼア細胞株ＩＰＬＢ−ＨＺ１０７５／ＵＮＤ−Ｋか らなる請求の範囲第８項に記載の組換えウイルス。 １１．オウトグラファカリフォルニカ核ポリヘドロシスウイルスを含む請求の範 囲第４項に記載の組換えウイルス。 １２．上記宿主が感染昆虫からなる請求の範囲第１１項に記載の組換えウイルス 。 １３．上記宿主が細胞株からなる請求の範囲第１１項に記載の組換えウイルス。 １４．上記異種ペプチドまたは蛋白質が非融合ペプチドまたは蛋白質からなる請 求の範囲第１項に記載の組換えウイルス。 １５．上記異種ペプチドまたは蛋白質が融合蛋白質からなる請求の範囲第１項に 記載の組換えウイルス。 １６．上記外来ペプチドまたは蛋白質が組換え閉塞体からなる請求の範囲第１５ 項に記載の組換えウイルス。 １７．上記外来ペプチドまたは蛋白質が病原性微生物のエピトープからなる請求 の範囲第１，４，５、１１，１４，１５または１６項に記載の組換えウイルス。 １８．上記病原性微生物がウイルスからなる請求の範囲第１７項に記載の組換え ウイルス。 １９．上記ウイルスが肝炎Ａウイルスからなる請求の範囲第１８項に記載の組換 えウイルス。 ２０．上記エピトープがインフルエンザ血球凝集素のアミノ酸９８〜１０６から なる請求の範囲第１８項に記載の組換えウイルス。 ２１．上記宿主が感染昆虫からなる請求の範囲第１項に記載の組換えウイルス。 ２２．上記宿主が細胞系からなる請求の範囲第１項に記載の組換えウイルス。 ２３．上記外来ペプチドまたは蛋白質が太腸菌ベーターガラクトシダーゼからな る請求の範囲第１または５項に記載の組換えウイルス。 ２４．上記外来ペプチドまたは蛋白質が殺虫活性を有している請求の範囲第１項 に記載の組換えウイルス。 ２５．ヘリオデイスポリヘドリンプロモーターおよびヌクレオチド配列を含む組 換え発現ベクターであって、該ヌクレオチド配列は、異種ペプチドまたは蛋白質 が上記組換え発現ベクターを含有する適当な宿主内で産生されるように、上記ヘ リオデイスポリヘドリンプロモーターのコントロール下で上記異種ペプチドまた は蛋白質をコードしている、組換え発現ベクター。 ２６．上記宿主が細菌からなる請求の範囲第２５項に記載の組換え発現ベクター 。 ２７．更にプラスミドを含む請求の範囲第２６項に記載の組換え発現ベクター。 ２８．更にバクテリオファージを含む請求の範囲第２６項に記載の組換え発現ベ クター。 ２９．ヘリオデイスポリヘドリンプロモーターと該ポリヘドリンプロモーターの コントロール下で異質遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、組換えに よって異種ヌクレオチド配列の親ベクターへの挿入を可能にするトランスファー ベクターであって、該ポリヘドリンプロモーターおよびヌクレオチド配列の側面 に親ベクター配列と相同性の配列が位置している、トランスファーベクター。 ３０．プラスミドを含む請求の範囲第２９項に記載のトランスファーベクター。 ３１．上記親ベクターがバクロウイルスからなる請求の範囲第２９項に記載のト ランスファーベクター。 ３２．上記親ベクターが顆粒症ウイルスからなる請求の範囲第３１項に記載のト ランスファーベクター。 ３３．上記親ベクターが核ポリヘドリロシスウイルスからなる請求の範囲第３１ 項に記載のトランスファーベクター。 ３４．上記核ポリヘドロシスウイルスがヘリオテイスゼアの核ポリヘドロシスウ イルスからなる請求の範囲第３３項に記載のトランスファーベクター。 ３５．プラスミドを含む請求の範囲第３４項に記載のトランスファーベクター。 ３６．ＮＲＲＬに寄託され受託番号Ｂ−１８１７５が付されたプラスミドｐＨＥ ２．６１ａｃからなる請求の範囲第３５項に記載のトランスファーベクター。 ３７．上記核ポリヘドロシスウイルスがオートグラフユカリフォルニカ核ポリヘ ドロシスウイルスからなる請求の範囲第３３項に記載のトランスファーベクター 。 ３８．プラスミドを含む請求の範囲第３７項に記載のトランスファーベクター。 ３９．上記異種遺伝子配列がインフルエンザ血球凝集素のアミノ酸９８〜１０６ をコードする請求の範囲第３８項に記載のトランスファーベクター。 ４０．上記異質遺伝子配列が病原性微生物のエピトープをコードする請求の範囲 第２９項に記載のトランスファーベクター。 ４１．ヘリオデイスポリヘドリシプロモーターと制限部位をコードするヌクレオ チド配列とを含み、請求の範囲第２９項に記載のトランスファーベクターを構築 するために異種遺伝子配列を挿入することができるカセットトランスファーベク ターであって、該プロモーターおよび制限部位の側面には、上記異種遺伝子配列 がポリヘドリンプロモーターのコントロール下で上記制限部位に挿入され得るよ うに、親ベクター配列と相同性の配列が位置している、カセットトランスファベ クター。 ４２．更にプラスミドを含む請求の範囲第４１項に記載のカセットトランスファ ーベクター。 ４３．上記親ベクターがバクロウイルスからなる請求の範囲第４１項に記載のカ セットトランスファーベクター。 ４４．上記発現ベクターが顆粒症ウイルスからなる請求の範囲第４３項に記載の カセットトランスファーペクター。 ４５．上記親ベクターが核ポリヘドロシスウイルスからなる請求の範囲第４３項 に記載のカセットトランスファーベクター。 ４６．上記核ポリヘドロシスウイルスがヘリオデイスゼア核ポリヘドロシスウイ ルスからなる請求の範囲第４５項に記載のカセットトランスファーベクター。 ４７．更にプラスミドを含む請求の範囲第４６項に記載のカセットトランスファ ーベクター。 ４８．ＮＲＲＬに寄託され受託番号Ｂ−１８１７４が付されたプラスミドｐＨＥ ２．６からなる請求の範囲第４７項に記載のカセットトランスファーベクター。 ４９．上記核ポリヘドロシスウイルスがオウトグラフユカリフォルニカ核ポリヘ ドロシスウイルスからなる請求の範囲第４５項に記載のカセットトランスファー ベクター。 ５０．更にプラスミドを含む請求の範囲第４９項に記載のカセットトランスファ ーベクター。 ５１．ＮＲＲＬに寄託され受託番号Ｂ−１８１７６が付されたプラスミドｐＡＶ Ｈｐ６からなる請求の範囲第５０項に記載のカセットトランスファーベクター。 ５２．ヘリオデイスポリヘドリンプロモーターおよびヌクレオチド配列を含み、 請求の範囲第２５項に記載の発現ベクターを構築するために異種遺伝子配列を挿 入することができるカセットー発現ベクターであって、該ヌクレオチド配列は上 記ポリヘドリンプロモーターのコントロール下で異種遺伝子配列が制限部位に挿 入されるように該制限部位をコードしている、カセット発現ベクター。 ５３．更にカセットー発現ウイルスからなる請求の範囲第５２項に記載のカセッ トー発現ベクター。 ５４．上記ウイルスがバクロウイルスからなる請求の範囲第５３項に記載のカセ ットー発現ベクター。 ５５．上記バクロウイルスがヘリオデイスウイルスからなる請求の範囲第５４項 に記載のカセットー発現ベクター。 ５６．上記バクロウイルスがオウトグラファウイルスからなる請求の範囲第５４ 項に記載のカセットー発現ベクター。