JPH08508170A

JPH08508170A - 軟体動物毒素を含む生物学的制御剤

Info

Publication number: JPH08508170A
Application number: JP6521800A
Authority: JP
Inventors: ウィンダス，ジョン・デイヴィッド; サナー，マリー−マーセ; アーレイ，ファーガス・ジェラルド・ポール; ゲスト，フィリッパ・ジェーン
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1993-03-26
Filing date: 1994-03-25
Publication date: 1996-09-03
Also published as: DE69407771T2; ES2111919T3; GB9406032D0; AU684762B2; EP0690920A1; ATE161889T1; GB9306295D0; GB2276622A; BR9406500A; DE69407771D1; WO1994023047A1; AU6432694A; CN1123560A; GR3026151T3; EP0690920B1; DK0690920T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、適当な宿主生物、例えば、バキュロウイルスのゲノム中に組込まれた場合に昆虫に対して毒性のペプチドタンパク質を発現することができる、該タンパク質が、軟体動物、例えば、イモガイ属種に由来するペプチド毒素と同一であるかまたは構造的および機能的に似ている新規の合成ＤＮＡを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】軟体動物毒素を含む生物学的制御剤本発明は、農業の昆虫等病害虫に対して毒性であるタンパク質をコードしているＤＮＡ配列および前記ペプチドの少なくとも一つの発現のためのプロモーターの制御下の異種遺伝子を含むゲノムを有する生物学的制御剤に関する。特に、本発明は、生物学的制御剤、更に詳しくは、昆虫に対して毒性であるペプチドまたは小タンパク質（以下、「タンパク質」と称する）を発現することができる異種遺伝子を含み、該タンパク質が軟体動物由来のタンパク質であるかまたは機能的にそれと均等である生物学的制御剤に関する。生物学的制御剤という用語によって、昆虫と共存させた場合に昆虫に感染し、その正常な生化学的過程を妨げ、最終的に昆虫を死滅させることができる任意のウイルス、原核生物または真核生物を意味する。本発明の範囲内の適当な生物学的制御剤としては、昆虫の細菌、ウイルスおよび真菌病原体に基づくものがある。細菌病原体としては、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、例えば、Ｂ．サリンジエンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．セレウス（ｃｅｒｅｕｓ）等がある。適当な昆虫ウイルス病原体としては、バキュロウイルスおよび昆虫ポックスウイルス、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）およびアムサクタ・モーライ（Ａｍｓａｃｔａｍｏｏｒｅｉ）等がある。昆虫の真菌病原体としては、例えば、ハクキョウサン病菌属（Ｂｅａｕｖａｒｉａ）種、例えば、Ｂ．バシアナ（ｂａｓｓｉａｎａ）がある。ウイルス、特に、異種遺伝子の発現が極めて有効なプロモーター制御下にあるものが特に好ましい。オートグラファ・カリフォルニカなどのバキュロウイルスの場合、プロモーターはポリヘドリン遺伝子のためのものである。アムサクタ・モーライなどの昆虫ポックスウイルスの場合、プロモーターはスフェロイジン遺伝子（ｓｐｈｅｒｏｉｄｉｎｇｅｎｅ）のためのものである。或いは、生物学的制御剤は、昆虫に対して毒性であるタンパク質であって、軟体類由来のタンパク質であるかまたは機能的にそれと均等である該タンパク質を発現することができる遺伝子を組み込むようにゲノムが変更されている遺伝的に修飾された植物内部寄生植物でありうる。このような内部寄生植物を植物と共存させた場合、そのタンパク質は植物中の内部寄生植物によって発現され、そしてその植物を食べるまたはその中に住む昆虫に対して毒性作用を及ぼすことができる。更に別の変形において、生物学的制御剤は、植物自体、特に、昆虫に対して毒性であるタンパク質であって、軟体動物に由来するタンパク質であるかまたは機能的にそれと均等である該タンパク質を発現することができる遺伝子の組み込みによって植物ゲノムが変更されている食品または繊維製品用に栽培された耕作植物でありうる。近年、海生腹足類動物（ｍａｒｉｎｅｇａｓｔｒｏｐｏｄｓ、別名“ＣｏｎｅＳｎａｉｌｓ”）のイモガイ属（Ｃｏｎｕｓ）のメンバー（「イモガイ」）の毒素は、極めて多様な範囲の生物学的作用を有する新規の低分子量神経活性ペプチドの豊富な源として認識されている（オリベラ（Ｏｌｉｖｅｒａ）ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９２５７〜２６３、オリベラ（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６２２０６７〜２２０７０）。この属のメンバーは、極めて特殊な且つしばしば極めて選択的なペプチド毒素を少数の基本形またはフレームワーク、すなわち、ＣＣ．．．Ｃ．．．Ｃ、Ｃ．．．Ｃ．．．ＣＣ．．．Ｃ．．．Ｃ、ＣＣ．．．Ｃ．．．Ｃ．．．ＣＣ（但し、Ｃはシステイン残基を表わし且つ「．．．」は３〜１０アミノ酸長さのアミノ酸の短い部分を示す）から発生させることによって脊椎動物（魚）および無脊椎動物（軟体動物、蠕虫類および甲殻類）両方の餌食を捕るのに明らかに適応されている（オリベラら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９２５７〜２６３）。種々の系列のコノトキシン（例えば、α−コノトキシン、μ−コノトキシンおよびω−コノトキシン）は、それらが含むシステイン残基のパターンによって主として区別され、それによって認識されることができる。α−コノトキシンで代表されるこれらの系列のいくつかは極めて類似の構造を有し、いずれもニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗作用によって作用すると考えられる。１−コノトキシンによって代表される他のものは構造がかなり異なり、実際、類似性追求によって、特徴的なω −コノトキシン型システインモチーフの存在およびしばしば「ベンドプロモーティング（ｂｅｎｄｐｒｏｍｏｔｉｎｇ）」アミノ酸（グリシンおよびプロリン）の配置に基づいてはるかに大きい系列のペプチドと構造的に関係していると認識されている。この更に大きい系列に含まれるのは、「キングコング（ＫｉｎｇＫｏｎｇ）」系列のコノトキシン（ヒリアード（Ｈｉｌｌｙａｒｄ）ら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８３５８〜３６１、ウッドワード（Ｗｏｏｄｗａｒｄ）ら（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９１０１５〜１０２０）；クモ毒素、例えば、μ−アガトキシン類（μ−ａｇａｔｏｘｉｎｓ）；サソリ毒素、例えば、クルタトキシン（Ｃｕｒｔａｔｏｘｉｎ）２およびブサス・ペプ（ＢｕｔｈｕｓＰｅｐ）２；抗微生物性タンパク質、例えば、ミラビリス・ヤラパ（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓｊａｌａｐａ）の種子由来のＭｊ−ＡＭＰ１（カミュー（Ｃａｍｍｕｅ）ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７２２２８〜２２３３）；並びにバキュロウイルスＡｃＭＮＰＶによってコードされた未知の機能を有するペプチド（ＣＴＬ）（エルドリッジ（Ｅｌｄｒｉｄｇｅ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）６５６３〜６５７１）までのような種である。この関係を下記の配列表並びに表１および２に示す。（「--」は、隣接するアミノ酸残基間の直接結合を示す） ω−コノトキシン自体は電圧ゲートＣａ²⁺チャンネルによって作用すると考えられるが、更に遠縁の系列メンバーの作用機序はしばしば異なるかまたは現在のところ知られていない。表１おび表２に示されたように、ω−コノトキシン関連ペプチドが全て同様の標的を有する場合、それらペプチドのこの大きい系列のメンバーのアミノ酸配列の相違は全く驚くべきことであると考えられる。これらの生物学的活性の相違はむしろ、基本的なω−コノトキシン分子フレームワークが、有効な小タンパク質／ペプチドリガンドを構築するための特に変化しやすい根拠であることを示すものとして受けとられるかもしれない。ω−コノトキシン系列の若干の更に遠縁のメンバーの活性および由来（クモおよびサソリ毒）が与えられた場合、いくつかのものが殺虫活性を示すことがあることは驚くべきことではない。しかしながら、演繹的に、それらが生息する海洋環境が与えられた場合、昆虫活性コノトキシンがイモガイにとって特に好都合であると考える理由はほとんどない。したがって、全く意外なことに、コノトキシンが昆虫活性または昆虫選択的神経ペプチドを与えることがあるかどうかに関する問題は、未解決で且つなお大部分は未着手の問題を残している。したがって、例えば、本発明者が承知している唯一の報告において、「キングコング」毒素（ＴｘＩＡと称する）を含むコヌス・テクスティル・ネオバリクス（Ｃｏｎｕｓｔｅｘｔｉｌｅｎｅｏｖａｒｉｃｕｓ）の毒から単離された近縁毒素群は、クロバエ（サルコファガ・ファルクラタ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａｆａｌｃｕｌａｔａ））幼虫における注入実験によって殺虫活性が評価された（ファインジルバー（Ｆａｉｎｚｉｌｂｅｒ）ら（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２５８９〜５９５）。活性は検出されなかったが、軟体動物に対する強力な作用は、はるかに低い投与量で明らかであった。ファインジルバーらの報告にもかかわらず、本発明者は、後にＫＫ−０［配列番号１６］（ウッドワードら（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９１０１５〜１０２０）と称する軟体動物および甲殻類活性「キングコング」コノトキシン（ヒリアードら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）並びに１９８８年１０月２４〜２８日の毒素動物に関するジャク・モノ会議（ｔｈｅＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓＪａｃｑｕｅｓＭｏｎｏｄｏｎＴｏｘｉｎｅｓＡｎｉｍａｌｓ）（オソア、フランス）において報告された二つの関連ペプチドＫＫ−１［配列番号１７］およびＫＫ−２［配列番号１８］が昆虫系において何等かの活性を有したかどうかを確証するための研究を開始した。以下の実施例１に詳述されるように、ＫＫ−０、ＫＫ−１およびＫＫ−２の報告された配列に対応する合成ペプチド（図７を参照されたい）を製造し、そして成体のペリプラナタ・アメリカーナ（Ｐｅｒｉｐｌａｎａｔａａｍｅｒｉｃａｎａ）（目：ディクティオプテラ（Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ））並びに幼生のヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）およびトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）（目：鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ））の検体中に注入することによって評価した。標品ＫＫ−０およびＫＫ−１は両方とも、被験種それぞれにおいて明確な殺虫活性および／または麻痺誘発活性を示した。ＴｘＩＡ（ＫＫ−０と均等）がサルコファガ・ファルクラタ（目：ディプテラ（Ｄｉｐｔｅｒａ）幼虫に効果なく注入されたファインジルバーらの結果に照らして、本発明者は、観察した殺虫作用がＫＫ−０および／またはＫＫ−１の固有の性質であったかどうかはなお幾分疑わしいと考えた。合成ペプチド標品は十分に精製されたが、それらの高システイン含量、結果として凝集する性質および間違って折りたたまれた構造を形成するありそうな性質のために、それらの化学合成には若干の問題があった。したがって、本発明者が観察した殺虫活性は、用いられた合成法の結果であったかもしれない。本発明者は、したがって、コヌス・テクスティル由来のタンパク質ＫＫ−０およびＫＫ−１の前駆物質をコードしている遺伝子をバキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）発現系において発現させることによってそれらの殺虫性および可能性の研究を広げてきた。ここで、本発明者は、ＫＫ−０前駆物質をコードしている遺伝子が、バキュロウイルスが感受性昆虫宿主を無力にするのに必要な時間をかなり短縮することができるという知見を最初に報告する。バキュロウイルスの作用速度のこの改良は、独特の麻痺経過に続く致死に始まり、そして同様の発育段階においてＫＫ−０組換えウイルスを与えられた感受性鱗翅類幼虫（susceptible le pidpteran larvae）の大きさを、野生型幼虫を与えられた対照幼虫と比較してかなり減少させる。これらの作用は、適当なウイルス製剤を噴霧された宿主植物を感受性幼虫が食べることによって感染した場合に明らかな作物保護効果をもたらす。この作物保護効果は、実証されるように、同様の投与量の野生型ウイルスによって達成されうるよりも優れている。バキュロウイルスの性質のこのような改良は、「キングコング」（ＫＫ−０）コノトキシン、すなわち、おそらく合成中の分泌経路に入り、しかも少なくともコヌス・テクスティル中で成熟ＫＫ−０を生産するように引続き操作されるプロトキシンとして最初に製造されうる７８アミノ酸タンパク質の推定上の天然前駆物質を順にコードすると考えられるｍＲＮＡ分子をコードするように設計された合成遺伝子［配列番号１］を用いて得られた（ウッドワードら（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９１０１５〜１０２０）。この研究に本発明者が用いた合成遺伝子は、コヌス・テクスティルＫＫ−０遺伝子の天然ヌクレオチド配列を考慮することなく設計された。遺伝子はむしろ、天然ＫＫ−０前駆物質をコードするが、おそらくは昆虫細胞系において効率よく発現されるし、操作するのに好都合でもあることを確実にするように設計された（実施例２の詳細を参照されたい）。したがって、本発明者はコヌス・テクスティルからの天然ＫＫ−０遺伝子またはｃＤＮＡを用いなかったが、しかしながら、このような配列、またはＫＫ−０前駆物質をコードすることができる別の合成遺伝子がバキュロウイルス宿主の作用速度を増加させるのに等しく有効ではないと考える理由はない。本発明者が実際に用いた合成遺伝子（ｓＫＫ−０）は、天然ＫＫ−０ｍＲＡＮのコーディング配列と７７％のヌクレオチド配列しか一致していない。ｓＫＫ−０遺伝子を発現するオートグラファ・カリフォルニカ多重包膜核多面体ウイルス（Autographa californica Multiply Enveloped Nuclear Polyhedros is Virus）（ＡｃＭＮＰＶ）に基づく組換えバキュロウイルスの性質についての本発明者の研究の表面的に意外な態様は、該ウイルスの性質が、遺伝子を発現させるのに用いられるプロモーターに極めて依存性であるという知見であった。ｓＫＫ−０遺伝子が、強力で極めて遅いｐ１０プロモーターから転写されるような位置にあるポリヘドリンプラス（吸蔵）ウイルスは、生物学的活性の増加を示さない。対照的に、ポリヘドリンプラス（ポリヘドリン⁺またはｐｏｌ＋）および、別の極めて遅いポリヘドリンプロモーターがｓＫＫ−０発現を駆動するポリヘドリンマイナス（ポリヘドリン^-またはｐｏｌ−／非吸蔵）ウイルスは両方とも、作用速度を明確に改良する。文献先例は、ｐ１０（スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５２８５〜８８、マックチェン（ＭｃＣｕｔｃｈｅｎ）ら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９８４８〜８５２）かまたはポリヘドリンプロモーター（トマルスキ（Ｔｏｍａｌｓｋｉ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５２８２〜８５および（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０５４５〜５４９）が、殺虫性遺伝子産物に対して適当な発現レベルを与えることができると予想されたことを示唆した。更に、最近公開された特許出願は、実質的な証拠を全く与えていないが、これらのプロモーターが、「寄生性ハチ、ブラコン・ヘベター由来殺虫性毒素（ＩｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌＴｏｘｉｎｓｆｒｏｍｔｈｅＰａｒａｓｉｔｉｃＷａｓｐＢｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒ）」（ＷＯ９３／１８１４５）かまたは「プレクトリューリス・トリスティス由来殺虫性毒素（ＩｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌＴｏｘｉｎｓｆｒｏｍＰｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓｔｒｉｓｔｉｓ）」（ＥＰ０５５６１６０Ａ２）を発現する場合に殺虫活性を増加させることができると推定されると考えられる。本発明者は、ｓＫＫ− ０遺伝子が組換えＡｃＭＮＰＶにおいてｐ１０プロモーターから発現された場合に殺虫作用引き起こさない理由を承知していないが、最も考えられる説明としては、ハイブリッドであるポリヘドリン／ｓＫＫ−０およびｐ１０／ｓＫＫ−０ｍＲＮＡに対する特異な安定作用であるかもしれない。ＫＫ−０をコードしているが異なるヌクレオチド配列を有する別の遺伝子によって同様の作用が見られるかまたは見られないかを結論付ける根拠は存在しない。同様に、このような作用がＫＫ−０遺伝子系に独特であると考える演繹的理由は存在しない。本発明者は、プロモーター／毒素遺伝子組合わせがウイルス効力の向上に希望を与えることに関して、バキュロウイルス技術が断定できる段階に達していないと結論している。ＫＫ−０の前駆物質をコードしている遺伝子を発現する能力をバキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に与えることによってそれらの作用速度を増加させることに本発明者が成功したのとは対照的に、今のところ本発明者は、ＫＫ−１前駆物質を発現するように設計されたウイルスについて同様の改良を見ていない（実施例１４を参照されたい）。更に、この結果は、ＫＫ−１の化学的に合成された試料の注入によって得られた励みになる結果と、ＫＫ−０およびＫＫ−１の前駆物質部分をコードしている推定上のシグナル配列の配列決定（ウッドワードら）が、前にｓＫＫ−０遺伝子と一緒にうまく用いられたように、ＫＫ−１前駆物質のこの部分をコードする同様の遺伝子配列を本発明者が正確に用いることを可能にしたという事実との両方を幾分意外にも与えると考えられる。ｓＫＫ−０発現を駆動するポリヘドリンおよびｐ１０プロモーターの異なる能力を用いる実験に基づいて、本発明者は、ｓＫＫ−１遺伝子を用いる研究が信頼しうる発現を達成する可能性を最大限に利用するようにポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−０発現構築物を組み立てることを更に選択した。適当な遺伝子構築物が与えられたとしても、ＫＫ−１が組換え体バキュロウイルス殺虫剤の効力を増大させることができると決定的に結論を下すには不十分なｓＫＫ−１で着手した研究を考慮するとはいえ、それにもかかわらず、本発明者は、何等かのコノトキシンまたはコノトキシン関連ペプチドをコードしている遺伝子がバキュロウイルス活性を増大させる能力を有するとは考えられないということを、得られた結果が強調していると考える。このような結論は、ＡｃＭＮＰＶによって発現された天然「コノトキシン様」ペプチドをコードするが、遺伝子切除実験（エルドリッジら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）６５６３〜６５７１）によって確証されうるかぎりでは生物学的作用がないと考えられるＣｔｌ（コノトキシン様）遺伝子を用いる実験と一致する。表１および表２で示されたように、ＣＴＬおよびＫＫ−１は両方とも明らかにω−コノトキシン系列のメンバーであるが、明らかに両方ともＫＫ−０（＜４０％）または系列の任意の他のメンバーとの絶対的一致水準は低いにすぎない。実際に、種子由来の抗微生物性タンパク質Ｍｊ−ＡＭＰ１は系列の他のメンバーと均等の類似性を有する。したがって、この研究は、コノトキシンおよびコノトキシン様ペプチドをコードしている遺伝子が、バキュロウイルス活性を増大させることができる種を探求するのに潜在的に有益な分野であることを教示しているが、そのように分類されたどの遺伝子も有効であることが明らかであるということを示しているものと解することはできない。ＫＫ−０が害虫を無力にするように働く作用の態様を考える場合、それが昆虫および軟体動物両方の均等の標的タンパク質を認識している可能性を考える必要がある。しかしながら、軟体動物と甲殻類と昆虫との間の進化論的相違を考えると、昆虫におけるＫＫ−０標的の構造がコヌス・テクスティルの天然海産餌食において見出されるのと正確に一致したならば極めて驚くべきことであろう。したがって、ＫＫ−０が昆虫標的のための完全なリガンドであるように生成されているとは考えられない。したがって、ＫＫ−０タンパク質は、軟体動物または甲殻類標的に対立するものとしてそれが昆虫標的タンパク質の特異性を一層大きくさせることができることによって殺虫剤として更に強化されうる可能性が強い。このような展開は、当業者が熟知している種々のタンパク質工学技術アプローチによって達成されうる。潜在的に、最も強力なこの種の方法は、近年開発されてきているペプチドライブラリー法の一つであることは明らかであると考えられる。このようなアプローチは、最大６個までのアミノ酸を無作為抽出し、同時に、生成されたペプチド集団（最大６．４ｘ１０⁷までの変異型）から高特異性変異型を選択するための比較的簡単な方法を示している。６個のアミノ酸は２７分の６すなわち２２％のＫＫ−０ペプチドを含むと考えられる。したがって、本発明者はＫＫ−０と最大１００−２２＝７８％の相同性であるタンパク質をコードしている遺伝子が、増強された、昆虫または鱗翅類にも選択的なＫＫ−０変異型を探求するのに常識的でも実用的でもある範囲であると断言する。したがって、このような範囲は本発明の範囲内に包含されると考えられる。本発明は、したがって、第一の態様において、感受性害虫に対して適当に投与された場合に殺虫作用を与えるためのコヌス・テクスティルＫＫ−０およびＫＫ −１タンパク質の合成製剤の使用を提供する。第二の態様において、本発明は、感受性昆虫宿主に対して親の野生型バキュロウイルス宿主に対するよりも早い時期に無力化作用を与えることによって組換えバキュロウイルスの作用速度を増加させるための、コヌス・テクスティルＫＫ− ０コノトキシンの前駆物質をコードする天然、合成または半合成遺伝子の使用を提供する。バキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカ多重包膜核多面体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）、または適当な遺伝子工学または操作技術が利用可能である若しくは開発される、そして必要ならば発現のためにＫＫ−０遺伝子が入れられる前後関係を最大限利用するような範囲が存在する任意の他のウイルス種であってよい。もう一つの態様において、本発明は、コヌス・テクスティルＫＫ−０コノトキシンの前駆物質をコードしている天然、合成または半合成遺伝子の発現を駆動するための、ｐ１０プロモーターよりもむしろバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの使用を提供する。更にもう一つの態様において、本発明は、種々の周知の技術によって構築されうる、しかも高性能プロモーター（ＡｃＭＮＰＶｐ１０プロモーター以外のＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターを含む）から発現された場合に組換えバキュロウイルスの作用速度を明確に増加させるＫＫ−０コノトキシン前駆物質をコードする合成遺伝子の設計を提供する。したがって、本発明は、図１で示された配列を有するタンパク質を発現することができる遺伝子をコードしている合成ＤＮＡまたはその機能性均等物若しくは遺伝コードの同義性によって許容されるその変異型を提供する。更に、本発明は、図１および図２に示された配列を有する合成ＤＮＡまたはその機能性均等物若しくは遺伝コードの同義性によって許容されるその変異型を提供する。もう一つの態様において、本発明は、本明細書中前記の昆虫集団を制御する方法であって、毒素が、昆虫に対して毒性作用する請求項１若しくは請求項２に記載のＤＮＡ配列によって発現されたペプチドまたはそのフラグメント若しくは変異型である上記方法を提供する。更に、本発明は、組換え生物学的制御剤が、ＡｃＭＮＰＶ、任意の他のバキュロウイルス、昆虫ポックスウイルス、任意の他の昆虫病原ウイルス、ボーベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａｂａｓｓｉａｎａ）、メタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）、任意の他の適当な昆虫病原真菌かまたは任意の適当な植物宿主を基剤としていようといまいと、その制御剤の効力を増加させるコノトキシン遺伝子を用いる最適手段を確実にするための発現単位構造／機能（プロモーター／ＫＫ−０コノトキシン遺伝子組合わせ）の半経験的（ｓｅｍｉ−ｅｍｐｉｒｉｃａｌ）スクリーニングの使用を提供する。特に、本発明は、殺虫性生物学的制御剤の有効性を増加させるための、コヌス・テクスティルＫＫ−０のそれと７７％より大の類似性を有するタンパク質若しくはペプチド、または該タンパク質若しくはペプチドの前駆物質をコードしている任意の遺伝子の使用を提供する。このような遺伝子は、制限されないが、イモガイ、クモ、サソリおよび種子を含む任意の適当な天然源から選択することができるしまたは任意の適当なタンパク質工学技術によって生じることができる。本発明は、更に、成長植物などの場所にいる昆虫集団を、これらの昆虫に対して毒性のペプチドを該昆虫または該昆虫の場所に対して投与することによって制御する方法であって、該ペプチドが、イモガイ属、例えば、コヌス・テクスティルなどの軟体動物に由来するＫＫ−０またはＫＫ−１ペプチドと機能的に均等であり且つそれとの相同性が７７％より大である上記方法を提供する。更にもう一つの態様において、本発明は、図１に示された配列を有するタンパク質を発現することができる遺伝子をコードしているＤＮＡ配列またはその機能性均等物若しくは遺伝コードの同義性によって許容されるその変異型を包含する、或いは図１または図２で示された配列を有するＤＮＡまたはその機能性均等物若しくは遺伝コードの同義性によって許容されるその変異型を包含する伝達ベクターを提供する。プラスミド、例えば、バキュロウイルスゲノムの修飾に関連して用いるのに適当なプラスミド中の好ましい伝達ベクターはｐＶＬ１３９２として知られるものなどである。他のプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＡｃＵＷ２１として知られるものがある。図１および図２のＤＮＡ配列を包含するｐＶＬ１３９２に基づくプラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中に導入し、そして１９９３年３月１２日にナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ）、アバディーン、英国に受託番号ＮＣＩＭＢ４０５４０として寄託した。本発明の種々の態様を以下の実施例によって例証する。実施例１「キングコング」（ＫＫ−０）、ＫＫ−１およびＫＫ−２ペプチドの合成製剤の生物学的評価ＫＫ−０、ＫＫ−１およびＫＫ−２ペプチドの合成製剤の生物学的活性の予備的評価を、ゴキブリ成虫（ペリプラネタ・アメリカーナ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａａｍｅｒｉｃａｎａ）：ブラッティデエ（Ｂｌａｔｔｉｄａｅ）：ディクティオプテラ）および第５令タバコバドウォーム（ｔｏｂａｃｃｏｂｕｄｗｏｒｍ）幼虫（ヘリオシス・ビレセンス：ヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）：鱗翅目）を用いる一連の注入実験において行なった。該タンパク質は、蒸留水および一般的に注入用に用いられる標準的な水性緩衝液中に不溶性であることが判明した。ＫＫ−０およびＫＫ−１を０．１Ｍ重炭酸アンモニウム中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁させた。静かに１時間撹拌後、懸濁液を０．２μｍフィルターによって濾過した。目視評価は、ＫＫ−０製品の約５０％が可溶化されたがＫＫ−１製品はほとんど溶解しなかったことを示した。このことは、種々のタンパク質を正確に定量し且つ直接的に投与率を比較することを難しくした。しかしながら、与えられる最大用量を推定することは可能であった。ＫＫ−２は極めて疎水性であり、粗製品１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯ中に溶解させた。タバコバドウォーム幼虫（ＴＢＷ）に、１５ｍｍ３３ゲージ針を備えた１０μ １ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）シリンジを用いて注射した。平均体重約３００ｍｇの第５令初期幼虫に、それぞれの処置について１〜４μｌを注射した。典型的に、それぞれの処置について少なくとも５重反復試験で行なった。雄ゴキブリ成虫に、１５ｍｍ２７ゲージ針を備えた５０μｌハミルトンシリンジを用いて注射した。各被験動物に、１〜１０μｌ用量の試験溶液を与え、平均体重は約８４０ｍｇであった。対照昆虫には等容量の適当な溶媒を注射した。注射後、餌が供給されている容器中において処置済み昆虫を制御条件下（２５ ℃、６５％ＲＨ）で最大７２時間まで飼育した。観察を定期的に行なって、何等かの異常症状をチェックした。タバコバドウォームＨ．ビレセンス幼虫へのＫＫ−０およびＫＫ−１両方の注射は、独特の「締まりのない麻痺状態」を引き起こした（表ＩＩＩ）。典型的に、症状はほぼ注射直後に観察され、幼虫は「麻酔」されたように見えた。影響があった幼虫は、立っていることおよび／または協調された足並みをとることができなかった。更に、それらは、仰向けに置かれた場合に起き上がることができなかったし、刺激（木製カクテルスティックで軽くつつくこと）に対しても口器および尾脚の限られた微かな動きしかできなかった。「麻酔状態」のピークにおいて、影響があった幼虫は締まりがなく柔軟であった。これらの作用は比較的短期間であったが、しかしながら、通常、注射後５〜１０分間までに完全に回復した。全ての幼虫が処置後２４時間（２４ＨＡＴ）で活動し且つ正常になった。高用量の注射は、症状の苛酷さおよび期間の両方を増加させた。症状はＫＫ−０によって更に顕著であるように見えた。ＫＫ−２タンパク質をＨ．ビレセンス幼虫にタンパク質約１０μｇ／匹（すなわち、タンパク質３３μｇ／ｍｇ（幼虫））の最大用量に等しい１回量で注射後に異常な作用は見られなかった。ゴキブリ３種類のタンパク質はいずれも、ゴキブリにおいて独特の且つ衰弱作用を生じた（表ＩＶ）。それぞれの場合において、作用の苛酷さは、注射されたタンパク質懸濁液の量に伴って増加した。ゴキブリへのＫＫ−０タンパク質懸濁液の注射は、最初に激しい震えを引き起こした後、協調の損失、麻痺およびノックダウンを引き起こした。作用は最初に後脚で観察されたが、すぐに中脚に、そして最後に前脚に広がって昆虫を虚脱状態にさせた。他の症状としては背部湾曲化があった。影響があった昆虫は回復することができなかったし、２２ＨＡＴまでに死滅した。ＫＫ−１タンパク質を注射された昆虫は同様の症状を示したが、その作用はタンパク質懸濁液１μｌの最低用量で僅かに苛酷さが少ないように思われた。異常な作用は、ＫＫ−２タンパク質２μｌおよび５μｌを注射された昆虫においても簡単に観察された。症状としては、背部の湾曲化、羽を下げることおよび協調運動の損失が挙げられ、注射して数分以内に引き起こされた。作用は一時的であるように見え、影響があった昆虫は、注射後２０分までに完全に回復したように見えた。しかしながら、これらの処置における被験動物はいずれも７２ＨＡＴで死滅した。最低量（１μｌ容量）で処置された昆虫では異常な症状が記録されず、全ての昆虫が７２ＨＡＴで活動し且つ正常であった。これらの観察は引続きの実験で確証され、そしてコノトキシンタンパク質がゴキブリおよびＴＢＷ幼虫に対して殺虫活性を有することを実証した。実施例２合成キングコング（ｓＫＫ−０）コノトキシン遺伝子設計天然ＫＫ−０遺伝子のコドン使用が昆虫細胞における発現に特に有利であると考える演繹的理由はなかったので、本発明者は、新規の合成（ｓＫＫ−０）遺伝子を設計することを決めた。これは、ＴＲＡＮＳＬ、ＲＥＳＴＲＩおよびＭＵＴＳＩＴＥのようなＰＣジーン（ＰＣＧｅｎｅ）^TM（インテリジェネテクス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、７００イースト・カミーノレアール、マウンテン・ビュー、カルフォルニア）プログラムの助けによって着手された。ｓＫＫ−０遺伝子の特徴は下記であった。・ウッドワードらによるｃＤＮＡクロ−ニング実験（（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９１０１５〜１０２０）によって記載されたＫＫ−０ペプチドのアミノ酸配列［配列番号２］を正確にコードした。・ＫＫ−０プロペプチドをコードするのに用いられたコドンは、それらが好ましいかまたは少なくとも昆虫（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））および酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））でしばしば見出されるので、発現実験を後者の生物で行なうことができるかもしれないと考えられたことから選択された（アシュバーナー（Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ）ら（１９８４）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ４２９５〜３１２；イケムラ（Ｉｋｅｍｕｒａ）（１９８５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２１３〜３４；シャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１４５１２５〜５１４３）。・翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の直前のヌクレオチド配列は、コザク（Ｋｏｚａｋ）（（コザク（１９８１）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ９５２３３〜５２５２；コザク（１９８４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２８５７〜８７３；コザク（１９８６）Ｃｅｌｌ４４２８３〜２９２；コザク（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６９４７〜９５０）によって定義された動物ｍＲＮＡの好ましい配列とぴったり対合する。・コヌク・テクスティルによってＫＫ−０プロペプチドをコードするのに用いられたコドンは全く無視された。（結果として、ｓＫＫ−０および天然ＫＫ− ０遺伝子の全体としての相同性は７７．２％にすぎない）。・隣接する制限酵素認識部位（上流のＢｇｌＩＩおよび下流のＸｍａＩＩＩおよびＢａｍＨＩ）を設計中に組み入れて、最初に選択されたバキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９２（インビトロジェン・コーポレーション（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、３９８５ソレント・バリー・ブルバール、サン・ディエゴ、カリフォルニア）中への直接クローニングを促進した。これらの酵素によるクローニングは、このトランスファーベクターによって運ばれるＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターから直接的に遺伝子を転写する可能性をもたらすと予想された（図４を参照されたい）。・いくつか追加の独特のヘキサヌクレオチド認識配列部位を、ｓＫＫ−０配列中の遺伝子中の位置ではあるが、コードされたアミノ酸配列に影響を及ぼさない位置に組み入れた。これらの部位を包含して、組換え体の特性決定および可能な引続きの遺伝子操作を容易にした（実施例１４を参照されたい）。組み込まれた部位が特に好ましくないコドンの包含を引き起こすことはなかった。得られたｓＫＫ−０配列［配列番号１］を、ＫＫ−０プロペプチドのコーディング配列を強調している図１および制限酵素認識部位の位置を強調している図２に示す。実施例３ｓＫＫ−０遺伝子の合成ｓＫＫ−０遺伝子の組み立てに選択された計画は、図１および図２に示されたＤＮＡフラグメントをコードしている重複相補オリゴヌクレオチドの合成に続いて、ＤＮＡポリメラーゼに媒介された一本鎖部分の完成および豊富な量の完成した遺伝子フラグメント（図３を参照されたい）を生じさせるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を必要とした。例えば、完成したｓＫＫ−０ＤＮＡフラグメントを一緒にコードしている４種類のオリゴヌクレオチド（ＣｏｎｏＡ、ＣｏｎｏＢ、ＣｏｎｏＣ、ＣｏｎｏＤ）［配列番号３、４、５、６］を、標準法によってアプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０ＢＤＮＡ合成機で合成した。ＣｏｎｏＡおよびＣｏｎｏＤの５′３０および２８ヌクレオチドと同一の２種類の追加の更に短いオリゴヌクレオチドＣｏｎｏＰＣＲ１およびＣｏｎｏＰＣＲ２［配列番号７、８］を更に合成してＰＣＲプライマーとして用いた。それぞれのオリゴヌクレオチドを５５℃で約８時間のインキュベーションによって脱保護した後、真空下で乾燥させた。次に、それらをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）２００μｌ中に溶解させ、ＵＶ分光学（約２０μｇ／ｍｌに等しい１ＯＤ₂₆₀単位／ｍｌ）によって濃度を測定し、そしてＴＥで希釈して約１０μＭ原液とした。これらを使用するまで−２０℃で貯蔵した。次に、ｓＫＫ−０合成反応は、（１）１０μＭのＣｏｎｏＡおよびＣｏｎｏＢそれぞれ５μｌを、滅菌５００ μｌポリプロピレン製コニカルミクロ遠心管中において５μｌの１０ｍＭｄＧＴＰ、１０ｍＭｄＡＴＰ、１０ｍＭｄＣＴＰ、１０ｍＭＴＴＰおよび５μ ｌの５００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（８．５）、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１％ゼラチンと一緒に混合し、水を加えて４９μｌにし、そしてＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ／ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）１μｌ（５単位）を加えた後、軽パラフィン油（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を２滴上に置いた。次に、試験管に蓋をし、それをテクンＰＨＣ−１プログラマブル・ドリブロック（ＴｅｃｈｎｅＰＨＣ−１ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＤｒｉ−Ｂｌｏｃｋ）^R中に入れ、そして以下の温度サイクル１．１′ ＠９４℃ １′ ＠５５℃ ４′ ＠７３℃ を５回施した後、７′＠７３℃の最後のインキュベーション時間を施した。（２）１０μＭのＣｏｎｏＣおよびＣｏｎｏＤそれぞれ５μｌを混合し且つ前記（１）の場合と全く同様に処理した。（３）反応（１）生成物０．５μｌをとり、反応（２）生成物０．５μｌと混合し、そして反応（１）生成物５μｌを反応（２）生成物と混合した。次に、それぞれの混合物に対して、１０μｌの１０μＭＣｏｎｏＰＣＲ１；１０μｌの１０μＭＣｏｎｏＰＣＲ２；１０μｌの５００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（８．５）、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１％ゼラチン；１０μｌの１０ｍＭｄＧＴＰ、１０ｍＭｄＡＴＰ、１０ｍＭｄＣＴＰ、１０ｍＭＴＴＰを加え、次に水を加えて９９μｌにした後、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー・シータス）１μｌ（５単位）を加え、そして最後に軽パラフィン油２滴を上に置いた。平行して、ＰＣＲプライマー、反応１または反応２生成物を欠いた対照反応を用意した。次に、反応に、テクン・プログラマブル・ドリブロック^R中において以下の温度サイクル１．１′ ＠９４℃ １′ ＠６８℃ ４′ ＠７３℃ を２５回施した後、７′＠７３℃の最後のインキュベーション時間を施した。次に、反応３生成物の１０μｌアリコートについての分析用アガロースゲル電気泳動は、必要なＤＮＡフラグメントおよびオリゴヌクレオチド全部を含んだこれらの反応においてのみ約２７０ｂｐフラグメントが生成されたことを確証した。次に、各ＤＮＡフラグメントの残りを等量の水飽和フェノール（２回）でフェノール抽出し、続いて等量の水飽和ｎ−ブタノール（２回）で抽出した後、エタノール沈殿によって回収した。実施例４ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０組換え体トランスファーベクターの組立て回収後、上記ＰＣＲ生成物それぞれに、製造業者推奨規格にしたがってＢｇｌＩＩＩおよびＥｃｌＸＩ（ＸｍａＩＩＩのアイソシゾマー）制限酵素による消化を施した。平行して、商業的に入手可能なバキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）トランスファーベクター（インビトロジェン）であるｐＶＬ１３９２の５μｇアリコートを同様に処理した。次に、制限消化物を、臭化エチジウム０．５μｇ／ｍｌ含有分離用０．８％アガロース／トリス酢酸電気泳動ゲルに流した。ＰＣＲ生成物および直鎖状ベクターＤＮＡフラグメントをＵＶ照射下においてゲルから切り取った。次に、それらを、シリコーン処理されたグラスウールを介する遠心分離およびエタノール沈殿によって回収した。次に、単離されたインサートおよびベクターＤＮＡフラグメントのアリコートを適当な緩衝液条件（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．（１９８９）「分子クローニング。実験室マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ））においてＴ４リガーゼと一緒に混合した。次に、連結反応混合物を用いて標準法（サムブルックら、同書）によってコンピテントＤＨ５α細胞を形質転換した。アンピシリン１０μｇ／ｍｌ含有Ｌ寒天平板上で一晩中増殖させることによって子孫形質転換細胞を選択した。次に、形質転換細胞を、ｓＫＫ−０遺伝子に対して相補的な配列の存在について、標準法によるハイボンド（ＨｙＢｏｎｄ）−Ｎ（アマーシャム・インターナショナル（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））フィルターでのコロニーハイブリッド形成によってスクリーニングした。用いられたハイブリッド形成プローブは、ｇ³²Ｐ−ＡＴＰ（アマーシャム・インターナショナル）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ノーサンブリア・バイオロジカルズ・リミテッド（ＮｏｒｔｈｕｍｂｒｉａＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓＬｔｄ．））を用いる処理によって５′リン酸化されたオリゴヌクレオチドＣｏｎｏＢであった。プラスミドＤＮＡを６種類の強くハイブリッド形成したコロニーから製造した。これらのＤＮＡの制限分析は、３種類がほぼｓＫＫ−０に予想された寸法および特徴を有するインサートを含むｐＶＬ１３９２誘導体であったことを示唆した。次に、選択されたｐＶＬ１３９２組換え体（＃２．２、＃５．２および＃６．１）に存在するインサートの配列を、シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）^TM （ＵＳＢ、クリーヴランド、オハイオ）キットと、ＢｇｌＩＩおよびＸｍａＩＩＩ認識部位に隣接するｐＶＬ１３９２の部分に対してハイブリッド形成するように且つこれらの部位の間に導入された何等かのインサートの配列決定を可能にするように設計された２種類の合成オリゴヌクレオチドプライマー（ｐＶＬ１３９２ＦＯＲおよびｐＶＬ１３９２ＲＥＶ）［配列番号１３、１４］とを用いてチェックした（図４を参照されたい）。３種類の組換え体の内の一つ（＃２．２）におけるインサート［配列番号１５］の配列は、予想された方法でクローン化されたｓＫＫ−０について予想されたものと正確に対合した（図５を参照されたい）。他のプラスミドは、僅かな配列変化（突然変異）を伴うインサートを含んでいた。ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの転写制御下の遺伝子ｓＫＫ−０を含むトランスファーベクターｐＶＬ１３９２の誘導体である組換え体＃２．２は、したがって、引続きの実験全てに対して選択された。組換え体プラスミドｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２．２を有する大腸菌ＤＨ５α培養物は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア、アバディーン、英国に受託番号ＮＣＩＭＢ４０５４０として寄託されている。実施例５ｓＫＫ−０を有する組換え体（ポリヘドリンマイナス）ＡｃＭＮＰＶの生成例えば、キング（Ｋｉｎｇ）およびパシー（Ｐｏｓｓｅ）（１９９２）「バキュロウイルス発現システム。実験室手引き（ＴｈｅＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＧｕｉｄe ）」（チャプマン・アンド・ホール（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ））に記載のような標準的なバキュロウイルス技術を用いて、ポリヘドリンプロモーターの転写制御下のｓＫＫ−０を有するが、機能性ポリヘドリン遺伝子を欠いている組換え体ＡｃＭＮＰＶウイルスを、約２００ｎｇのＳａｕｌ（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、マンハイム）で直鎖状にされたＡｃＭＮＰＶ．ｌａｃＺ（パシーおよびハワード（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１５１０２３３〜１０２４８）および１μｇのｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２．２ＤＮＡを用いるＳｆ２１細胞の同時トランスフェクションによって生成した。最初に、組換え体ウイルスの選択は、Ｓｆ２１細胞単層培養において生じたプラーク中において組換え体ｌａｃＺ−ウイルスがＸ−ｇａｌ（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／ＢＲＬ、グランド・アイランド、ニューヨーク）を代謝できないことに基づいた。ｌａｃＺ−ウイルスなどの６種類（「ＣＯＮＯ−Ａ」、「ＣＯＮＯ−Ｂ」、「ＣＯＮＯ−Ｃ」、「ＣＯＮＯ−Ｄ」、「ＣＯＮＯ−Ｄ」および「ＣＯＮＯ−Ｅ」）を採取し且つＳｆ２１細胞上で再度平板培養して、それらを均一になるまで精製し且つそれらがβガラクトシダーゼを合成できないことを確証した。次に、それぞれ精製されたウイルスの小規模（約４ｍｌ）培養を、２５ｃｍ²組織培養フラスコ（ビビー（Ｂｉｂｂｙ）、ストーン（Ｓｔｏｎｅ）、スタッフス（Ｓｔａｆｆｓ））中のＴＣ１００／７．５％ウシ胎児血清培地（両方ともギブコ／ＢＲＬ製）４ｍｌ中に１．５ｘ１０⁶個のＳｆ２１細胞を播種し、２８℃で一晩中インキュベーションし、単一の精製プラークを採取することによって回収されたウイルスの５０％を加え、そして２８℃で更に６日間インキュベーションを続けることによって調製した。次に、これらのウイルス原液それぞれのアリコートをバイオアッセイ用とした（実施例６を参照されたい）。同様のアリコートを用いて、物理的分析のためのウイルスＤＮＡの小試料を調製した（キングおよびパシー（１９９２）同書）。予期されるｓＫＫ−０／ＡｃＭＮＰＶ組換え体を用いて行なわれる診断用物理的分析は下記であった。（ａ）ｓＫＫ−０および平行してβガラクトシダーゼ遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲ実験。（ｂ）ＣｌａＩおよびＢｇｌＩＩで処理され、１％アガロースゲル上の電気泳動によって分別され、ハイボンド−Ｎフィルターに移され、そして単離されたランダムプライムドα³²Ｐ−ｄＣＴＰ標識ｓＫＫ−０プローブとハイブリッド形成されたウイルスＤＮＡについてのサザンブロット分析。これらの実験は、ウイルス「ＣＯＮＯ−Ｃ」が予想された物理的特徴を全て有するｓＫＫ−０遺伝子を含み且つβガラクトシダーゼ遺伝子を欠いていたことを確証した。他の予期される組換え体ウイルスはｓＫＫ−０遺伝子を欠いていた。実施例６予期されるＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０組換え体ウイルスのバイオアッセイ推定上のＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ウイルスの生物学的活性を、後期ヘリオシス・ビレセンス幼虫を用いる一連の注入実験において評価した。精製された非吸蔵ウイルスのアリコートを第４令または第５令Ｈ．ビレセンス幼虫に、１５ｍｍ３３ゲージ針を備えた１０μｌハミルトンシリンジを用いて注射した。典型的に、１μｌ容量の標準的な量のウイルス懸濁液による処置について少なくとも５匹の幼虫に注射した。対照昆虫には均等な量のＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｌａｃＺウイルス、ＡｃＭＮＰＶ野生型または滅菌水を注射した。注射後、幼虫を人工試料で別々に維持し、その後２４時間間隔で更に７日間調べた。それぞれの評価に際し、生きている幼虫および死んだ幼虫の数を記録した。生き残った幼虫の何等かの異常症状および／または行動反応を調べた。最初に、実施例５に記載のように生成された６種類の推定上のＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０クローンを検査した。ＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯ−Ｃの１種類のみが何等かの異常な作用を示した。生物学的知見は、ＣＯＮＯ−Ｃウイルスのみが、予想された物理的特徴全部を有するｓＫＫ−０遺伝子を有していたことを示した実施例５に記載された物理的分析を確証した。更に、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯ−Ｃの生物学的性質を特徴化する注入検定を、滴定されたウイルス原液を用いて行なった。第４令初期Ｈ．ビレセンス幼虫に対するＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯ−ＣおよびＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｌａｃＺウイルスの生物学的効力を比較するデータを表Ｖに示す。処置後７２時間（７２ＨＡＴ）で、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯ−Ｃによって処置された幼虫の４／１１が完全にかまたは部分的に締まりのない麻痺状態を示した。「締まりのない麻痺状態」として分類された幼虫は瀕死状態、すなわち、立っている、起き上がるまたは歩くことができなかったし且つ刺激に反応して口器および尾脚の極めて微かな動きしかできなかった。「部分的に麻酔状態」の幼虫は、体の中央部および後部の局部的麻痺を示したが、頭部および口器を含む前部は刺激に対して正常に反応することができた。これらの幼虫は、仰向けに置かれた場合に起き上がることができなかったししかも限られた動きしかできなかったが、動作は鈍く且つほとんど調製されていなかった。９６ＨＡＴにおいて、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯＣウイルスによって処置された幼虫は全て、死滅するかまたは異常な症状を示した。対照的に、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｌａｃＺ対照ウイルスを注射された幼虫は全て、９６ＨＡＴにおいて生きていて且つ普通に行動していて、これらの幼虫の１／１０は１２０ＨＡＴで死滅し、６／１０の幼虫は１４４ＨＡＴで死滅した。ｌａｃＺ遺伝子を有するＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２誘導体の殺生速度は野生型ウイルスよりも遅い。典型的に、野生型ＡｃＭＮＰＶは、１２０ＨＡＴ以上でかなりの致死率を引き起こし始める。したがって、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯＣ構築物は、ＡｃＭＮＰＶ野生型よりもＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｌａｃＺ対照ウイルスよりも速い作用速度およびそれゆえの高い殺虫効果を有すると結論することができる。実施例７ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０組換え体トランスファーベクターの組立て経口的に感染することがあり、それゆえ用量反応作用についておよび作物保護効果の評価について実際的評価が可能であると考えられるポリヘドリン⁺（吸蔵）組換え体ＡｃＭＮＰＶ／ｓＫＫ−０誘導体を製造する目的で、本発明者は、最初にｐＡｃＵＷ２１トランスファーベクター（ＡＭＳバイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＵＫ）Ｌｔｄ．）を用いることを選択した。このトランスファーベクターは、強力な後期ｐ１０プロモーターの制御下の昆虫選択性毒素遺伝子の発現のために促進された生物学的作用を与えることができる組換え体ウイルスを製造するのに従来うまく用いられたトランスファーベクターｐＡｃＵＷ２ｂの簡単な誘導体（パシー（Ｐｏｓｓｅｅ）Ｒ．Ｄ．、個人通信）である（スチュワートら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５２８５〜８８；マックチェンら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９８４８〜８５２）。ｐＡｃＵＷ２１中に導入するための適当なｓＫＫ−０インサートを放出させるために、ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２．２プラスミドＤＮＡの２０μｇアリコートに、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素による消化を施した。平行して、ｐＡｃＵＷ２１トランスファーベクターＤＮＡの１０ｐｇアリコートを同様に処理した。次に、制限消化物を、臭化エチジウム０．５μｇ／ｍｌ含有分離用１％アガロース／トリス酢酸電気泳動ゲルに流した。放出されたｓＫＫ−０インサート（約２８２塩基対）および直鎖状ベクターＤＮＡをＵＶ照射下においてゲルから切り取った。次に、それらを、シリコーン処理されたグラスウールを介する遠心分離およびエタノール沈殿によって回収した。次に、単離されたｓＫＫ−０インサートおよびｐＡｃＵＷ２１ベクターＤＮＡフラグメントのアリコートを適当な緩衝液条件（サムブルックら（１９８９）「分子クローニング。実験室マニュアル」（コールド・スプリング・ハーバー・プレス）中）においてＴ４リガーゼと一緒に混合した。次に、連結反応混合物を用いて標準法（サムブルックら、同書）によってコンピテントＤＨ５α細胞を形質転換した。アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有Ｌ寒天平板上で一晩中増殖させることによって子孫形質転換細胞を選択した。プラスミドＤＮＡを６種類の推定上の組換え体コロニーから製造した。これらのＤＮＡの制限分析は、６種類前部がｓＫＫ−０に予想された寸法および特徴を有するインサートを含むｐＡｃＵＷ２１誘導体であったことを示唆した。次に、上記６種類の組換え体の内の二つ（＃Ａ１および＃Ａ２）に存在するインサートの配列を、シークエナーゼ^TM（ＵＳＢ、クリーヴランド、オハイオ）キットと、ｓＫＫ−０インサートに対してハイブリッド形成するように設計された２種類の合成オリゴヌクレオチドプライマーとを用いてチェックした。両方のクローンのインサートの配列は、目的の方法でクローン化されたｓＫＫ−０について予想されたものと正確に対合した。したがって、ＡｃＭＮＰＶｐ１０プロモーターの転写制御下の遺伝子ｓＫＫ −０を含むトランスファーベクターｐＡｃＵＷ２１の誘導体である組換え体＃Ａ１は、引続きの実験用に選択された。この組換え体トランスファーベクターもまた、天然ポリヘドリンプロモーターの制御下のそのままのＡｃＭＮＰＶポリヘドリン遺伝子を有する。実施例８ｐ１０プロモーター／ｓＫＫ−０遺伝子発現単位を有する組換え体（ポリヘドリンプラス）ＡｃＭＮＰＶの生成標準的なバキュロウイルス技術（キングおよびパシー（１９９２）「バキュロウイルス発現システム。実験室手引き」（チャプマン・アンド・ホール））を用いて、ｐ１０プロモーターの転写制御下のｓＫＫ−０遺伝子を有するポリヘドリン⁺（吸蔵）ＡｃＭＮＰＶ誘導体を生成した。これは、２００ｎｇのＳａｕｌ（ベーリンガー、マンハイム）で直鎖状にされたＡｃＭＮＰＶ．ｌａｃＺ（パシーおよびハワード（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１５１０２３３〜１０２４８）および１μｇのｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０組換え体＃Ａ１ＤＮＡを用いるＳｆ２１細胞の同時トランスフェクションによって達成された。次に、候補組換え体ＡｃＭＮＰＶ／ｓＫＫ−０ウイルスを、Ｓｆ２１細胞単層上のプラーク精製（キングおよびパシー（１９９２）同書）により、ウイルスがＸ−ｇａｌ（ギブコ／ＢＲＬ、グランド・アイランド、ニューヨーク）を代謝できないことおよび顕微鏡で判定されるポリヘドラ（ウイルス吸蔵体）を生産する能力をスクリーニングして選択した。このような６種類のｌａｃＺ−ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃１、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃２、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃３、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃４、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃５およびＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃６）を採取した。次に、第二プラーク検定を上記６種類のクローンについてＳｆ２１細胞単層上で行なってそれらが均一になるまで精製し、そしてそれらがβガラクトシダーゼを合成できないことおよびポリヘドラを生産するそれらの能力を確証した。次に、精製されたウイルスそれぞれの小規模培養を実施例５に記載のように調製した。次に、これらのウイルス原液それぞれのアリコートをバイオアッセイ用にした（実施例９を参照されたい）。同様のアリコートを用いて、物理的分析のためのウイルスＤＮＡの小試料を調製した。サザンブロット分析を、予期されるＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ− ０ウイルスＤＮＡについて行なった。これらのＤＮＡは、（ａ）ＨｉｎｄＩＩＩ並びに（ｂ）ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで処理され、１％アガロースゲル上の電気泳動によって分別され、ハイボンド−Ｎフィルターに移され、そして単離されたランダムプライムドα³²Ｐ−ｄＣＴＰ標識ｓＫＫ−０プローブとハイブリッド形成した。これらの実験は、ウイルスＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃１、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃４およびＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃５がそれそれ、予想された物理的特徴を全て有するｓＫＫ−０遺伝子を含み、βガラクトシダーゼ遺伝子を欠き、そしてポリヘドリン⁺ウイルス粒子を生産したことを確証した。ウイルスＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃１は引続きの全ての実験用に選択された。実施例９予期されるＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０組換え体ウイルスのバイオアッセイ推定上のＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０ウイルスの生物学的性質を、ヘリオシス・ビレセンスに対する一連の注入および経口投与実験において評価した。精製された非吸蔵ウイルス原液を用いる注入検定を、実施例６に概説した方法を用いて行なった。精製ポリヘドラを用いる経口投与試験は、ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ）およびウッド（Ｗｏｏｄ）（（１９８１）Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ．Ｐａｔｈｏｌ．３７，５４）によって開発された所化したばかりの幼虫のための小滴給養法（ｄｒｏｐｌｅｔｆｅｅｄｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）の変法を用いて行なわれた。実施例８に記載のように生成された６種類の推定上のＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０ウイルスについての予備的注入実験は、３種類のクローン（ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃１、＃４および＃５）のみがｓＫＫ−０遺伝子を有していたことを示した。これらのウイルスで処理された幼虫のいくつかは、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯＣウイルスで処理された昆虫において観察されたのと最初は類似しているように見られた異常な症状を示した。しかしながら、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＣＵＷ２１／ｓＫＫ− ０＃１についての引続きの実験は、これらの「異常な」作用が、概して、十分に定義されなかったし且つ特に衰弱させることはなかったということおよびＡｃＭＮＰＶ／ｐＣＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃１は作用速度または殺虫作用に関して野生型ＡｃＭＮＰＶにまさる顕著な利点を示さなかったということを確証した。ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃１および野生型ＡｃＭＮＰＶの生物学的効力を比較する経口投与実験は、これらの知見を確証した。実施例１０組換え体ＡｃＭＮＰＶの生成のためのＡｃＵＷ１−ＰＨＤＮＡの製造ｓＫＫ−０遺伝子がｐ１０プロモーターから発現されたポリヘドリンプラスＡｃＭＮＰＶ誘導体（実施例７、８および９）と比較して、ｓＫＫ−０遺伝子がポリヘドリンプロモーターから発現されるポリヘドリンマイナスＡｃＭＮＰＶ誘導体（実施例４、５および６）の異なる性質を考慮して、本発明者は、ｓＫＫ−０遺伝子がポリヘドリンプロモーターから発現されたポリヘドリンプラス誘導体を構築して、改良された殺虫性効力がポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−０発現単位によっては達成されうるがｐ１０プロモーター／ｓＫＫ−０発現単位によっては達成されないかどうかを確証することに決めた。ポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−０発現単位の受容体として選択されたウイルスは、ＡｃＵＷ１−ＰＨであった（ウェイアー（Ｗｅｙｅｒ）ら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１１５２５〜１５３４および図６を参照されたい）。このウイルスは、ｐ１０プロモーター／ポリヘドリン遺伝子発現単位を野生型ＡｃＭＮＰＶ中のｐ１０遺伝子によって占有された遺伝子座に有し且つ通常はポリヘドリン遺伝子によって占有された場所にポリヘドリンプロモーター／ｌａｃＺ指示遺伝子発現単位を有する。したがって、それは、ＡｃＭＮＰＶ吸蔵体を有する細胞を含み且つＸ−Ｇａｌ指示薬（ギブコ／ＢＲＬ）グランド・アイランド、ニューヨーク）の存在下で青色に染色されるプラークをＳｆ２１細胞単層上に形成する。したがって、ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２．２組換え体トランファーベクターのポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−０発現単位によるポリヘドリンプロモーター／ｌａｃＺ発現単位の置換は、ポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−０遺伝子発現単位を有するポリヘドリンプラスＡｃＭＮＰＶ誘導体を製造する好都合な手段であると期待された。未知のタイターを有するＡｃＵＷ１−ＰＨ原液は、Ｒ．Ｄ．パシー博士（ＮＥＲＣインスティトゥート・オブ・ヴァイロロジー・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），マンスフィールド・ロード、オックスフォード）によって快く提供された。次に、このウイルスの小規模増幅培養を、２５ｃｍ²組織培養フラスコ（ビビー、ストーン、スタッフス）中のＴＣ１００／１０％ウシ胎児血清培地（両方ともギブコ／ＢＲＬ製）４ｍｌ中に１．５ｘ１０⁶個のＳｆ２１細胞を３ロット播種し、２８℃で一晩中インキュベーションした後、原液ウイルスの１／１０希釈アリコート５０μ ｌ、５μｌおよび５μｌを一つ一つのフラスコに加え、そして２８℃で更に６日間インキュベーションを続けることによって調製した。これらの小規模増幅を、標準的なプラーク検定技術（キングおよびパシー（１９９２）「バキュロウイルス発現システム。実験室手引き」（チャプマン・アンド・ホール））を用いて滴定した。得られたプラークは全て封入体を含み且つＸ−Ｇａｌの存在下で青色に染色された。最初の投入量５０μｌの培養から生成されたウイルス原液のタイターは２．３ｘ１０⁷ｐｆｕ／ｍｌであり、それを用いてＡｃＵＷ１−ＰＨの更に大きい２００ｍｌスピナー貯蔵培養物を製造し、それからウイルス原液を精製した後、ウイルスＤＮＡを標準法（キングおよびパシー（１９９２）同書並びにパシーおよびハワード（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１５１０２３３〜１０２４８）によって製造した。次に、直鎖状ＡｃＵＷ１−ＰＨ原液を、製造業者推奨規格にしたがってＳａｕｌ（ベーリンガー・マンハイム）を用いてウイルスＤＮＡ３μｇを消化することによって製造したが、この酵素はＡｃＭＮＰＶ．ｌａｃＺの場合と同様にβガラクトシダーゼ遺伝子内部のみを開裂するので、これは組換え体ＡｃＭＮＰＶ子孫の生産および検出を容易にする方法であると期待された（キングおよびパシー（１９９２）同書）。実施例１１ポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−０遺伝子発現単位を有する組換え体（ポリヘドリンプラス）ＡｃＭＮＰＶの生成次に、標準的なバキュロウイルス技術（キングおよびパシー（１９９２）同書）を用いて、活性ポリヘドリン遺伝子と一緒にポリヘドリンプロモーターの転写制御下のｓＫＫ−０を有する組換え体ＡｃＭＮＰＶウイルスを、ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２．２からのポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−０発現モジュールのための受容体としてＳａｕｌで直鎖状にされたＡｃＵＷ１−ＰＨウイルスＤＮＡを用いることによって生成した。これは、実施例１０に記載のように製造された２００ｎｇのＳａｕｌで直鎖状にされたＡｃＵＷ１−ＰＨＤＮＡと、１μｇのｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２．２ＤＮＡとを用いるＳｆ２１細胞の同時トランスフェクションによって達成された。ウイルスがＳｆ２１細胞単層培養を生成する場合、プラーク検定技術を用いて、Ｘ−ｇａｌ（ギブコ／ＢＲＬ、グランド・アイランド、ニューヨーク）を代謝する能力を欠くが、封入体（ポリヘドラ）を生産する能力を維持したウイルスについて最初にスクリーニングすることによって組換え体ウイルスを選択した。このような６種類のｌａｃＺ− ウイルス（ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ＫＫＯ＃１、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ＫＫＯ＃２、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ＫＫＯ＃３、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ＫＫＯ＃４、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ＫＫＯ＃５およびＡｃＵＷ１−ＰＨ／ＫＫＯ＃６）を採取した。次に、第二プラーク検定を上記６種類のクローンそれぞれについてＳｆ２１上で行なってそれらが均一になるまで精製し、そしてそれらがβガラクトシダーゼを合成できないことおよびポリヘドラを生産するそれらの能力を確証した。精製されたウイルスそれぞれの小規模培養を実施例５に概説された方法によって調製した。次に、これらのウイルス原液それぞれのアリコートをバイオアッセイ用にした（実施例１２を参照されたい）。平行して、小規模ウイルス原液のアリコートを用いて、物理的分析のためのウイルスＤＮＡの小試料を調製した。サザンブロット分析を、予期されるＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ウイルスＤＮＡについて行なった。これらのＤＮＡをＢｇｌＩＩおよびＢｓｃＩ（ＣｌａＩのアイソシゾマー）で処理し、１．４％アガロースゲル上の電気泳動によって分別し、ハイボンド−Ｎフィルターに移し、そして単離されたランダムプライムドα³²Ｐ−ｄＣＴＰ標識ｓＫＫ−０プローブとハイブリッド形成させた。これらの実験は、ウイルスＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃２、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃４、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃５およびＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃６がそれぞれ、予想された物理的特徴を全て有するｓＫＫ−０遺伝子を含み、βガラクトシダーゼ遺伝子を欠き、そしてポリヘドリン⁺ウイルス粒子を生産したことを確証した。ウイルスＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃２を引続きの実験用に選択した。実施例１２予期されるＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０組換え体ウイルスのバイオアッセイ推定上のＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０組換え体ウイルスの生物学的効力を、ヘリオシス・ビレセンス幼虫に対する一連の注入および経口投与実験において評価した。精製された非吸蔵ウイルス原液を用いる注入検定を、実施例６に記載した方法を用いて行なった。精製ポリヘドラを用いる経口投与実験は、実施例９に記載の小滴給養検定の変法を用いて行なわれた。実施例１１に記載のように生成された６種類の推定上のＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ウイルスの生物学的活性を比較する予備的注入実験は、ウイルスＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃２、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ− ０＃４、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃５およびＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃６のみが、野生型ウイルスと比較して高い殺菌作用を有するかもしれないことを示した。ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２を、スケールアップおよび更に特性決定するのに選択した。注入検定データは、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２ウイルスで処理された幼虫が７２ＨＡＴから以後、異常な症状を示したことを示した（表ＶＩ）。９６ＨＡＴまでに大部分の幼虫が死滅し、生き残ったものだけが麻痺状態にあった。全ての幼虫が１４４ＨＡＴまでに死滅した。対照的に、野生型ＡｃＭＮＰＶで処理された幼虫においては、５０％の幼虫が死滅した１２０ＨＡＴまでに異常作用は見られず；野生型ＡｃＭＮＰＶについては１４４ＨＡＴで１００％致死率を記録した。精製されたポリヘドラを用いてＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ− ０および野生型ＡｃＭＮＰＶの生物学的効力を比較するために一連の経口投与実験を行なった。いずれの場合にも、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ −０＃２は野生型よりも有意に速い殺生速度およびそれゆえの改良された殺虫作用を有することが分かった。ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ウイルスで処理された幼虫は、７２ＨＡＴから以後、麻痺症状を示し且つ死滅し始めた（表ＶＩＩ）。用量応答データのプロビット分析は、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２の殺生速度が７２および９６ＨＡＴにおいて野生型ＡｃＭＮＰＶのそれよりも有意に速かったが、１２０ＨＡＴまでには野生型ウイルスが追いついたことを確証した。実施例１３ＫＫ−１コノトキシンをコードしている合成遺伝子の構築およびクローニングウッドワードら（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９１０１５〜１０２０によって報告されたように、イモガイのコヌス・テクスティルは、「キングコング」毒素系列に属すると示され且つ実施例１に記載の一連の低分子量神経活性ペプチドを生産し、ＫＫ−０およびＫＫ−１両方の化学的に合成された製剤は害虫種の一団への注入に対して有意の作用を示した。実施例２、３、４、５、６、１０、１１および１２に記載された実験から得られた、合成ＫＫ−０遺伝子を発現する能力を有するＡｃＭＮＰＶ誘導体が実質的に改良された殺虫活性を有する更に別の根拠が与えられると、本発明者は、更に、組換え体ＡｃＭＮＰＶウイルスの性質に影響を及ぼすＫＫ−１の能力を研究した。ＫＫ−１毒素ｍＲＮＡの配列は、ウッドワードら（同書）によって、コヌス・テクスティル毒腺調製試料についてのｃＤＮＡクローニングおよび特性決定実験の結果としてのＫＫ−０ｍＲＮＡの配列と一緒に記載された。これらの実験は、成熟ＫＫ−０および予想の成熟ＫＫ−１が約２６％の同一性しかないが（表２を参照されたい）、それらは、実質的に更に高い水準の相同性を有し且つ明らかにタンパク質系列のメンバーである可能なプレプロトキシンから処理されることを示した。具体的に、ＫＫ−１ｍＲＮＡは、成熟毒素に対応するＣ末端部分において２６％しかない水準と比較して、Ｎ末端の５１アミノ酸をコードしている部分のＫＫ−０（７８アミノ酸）と高水準の配列相同性（８８〜９２％）を有する７７アミノ酸のプロペプチドをコードする。仮定のシグナル配列部分（ハイジュン（Ｈｅｉｊｎｅ）（１９８６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１４４６８３〜４６９０による１〜（約）２２残基）中のアミノ酸同一性は１００％である。合成ＫＫ−１遺伝子（ｓＫＫ−１）遺伝子の設計計画において、プレプロＫＫ −０およびプレプロＫＫ−１の仮定のシグナル配列の絶対的同一性が与えられるならば、本発明者はＫＫ−１のプロトキシン部分をコードしている合成ＤＮＡフラグメントを構築することだけ選択する。更に詳しくは、本発明者は、このような遺伝子操作目的のために元のｓＫＫ− ０遺伝子中に組み入れられたＰｓｔＩおよびＸｍａＩＩＩ制限部位に隣接されたこの部分をコードしているＤＮＡフラグメントを設計した（図２を参照されたい）。これらの特徴は、既存のＫＫ−０構築物の同一で且つ明らかに有効なシグナル配列コーディング部分を利用することによって本発明者が組み立てに必要とした新規の合成ＫＫ− １（ｓＫＫ−１）遺伝子の最小量までの減少を可能にするように設計された。ｓＫＫ−１遺伝子フラグメント用に開発された基本的な設計を図８に概説する。このＤＮＡフラグメントの設計の追加の特徴としては、下記が挙げられる。＊ワダ（Ｗａｄａ）ら（１９９２）（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２０補遺２１１１〜２１１８）によって公開されたデータに基づく昆虫優先／好適コドン使用の選択。＊フラグメントの一次クローニング、特性決定および引続きの操作を容易にするための追加のフランキングＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限部位の包含。図９において、本発明者は、新規の合成ｓＫＫ−１フラグメントの配列［配列番号２３］と、プロＫＫ−０［配列番号２５］の対応する配列と比較して主要な読み取り枠（プロＫＫ−１）［配列番号２４］によってコードされたアミノ酸とを一緒に示す。前記で論及され且つ図８に示された新規のｓＫＫ−１プロトキシン遺伝子を組み立てるために、本発明者は、ｓＫＫ−０遺伝子を構築するのに前にうまく用いられた方法を応用することを選択する。例えば、図１０に示されたように、相補的ＤＮＡ鎖をコードし且つ２１ｂｐのオーバーラップを有するｓＫＫ−１の完成した１９６ｎｔを互いに包含する２種類の合成オリゴヌクレオチド、ＳＹＮＫＫ１Ａ（１１１マー）［配列番号２６］およびＳＹＮＫＫ１Ｂ（１０６マー）［配列番号２７］を合成した。更に、ＳＹＮＫＫ１ＡおよびＳＹＮＫＫ１Ｂのアニーリング後の完成したｓＫＫ−１フラグメントの増幅を可能にするようにＰＣＲプライマーとして作用することができるし且つＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる修復をフィルインすると考えられる２種類の追加のオリゴヌクレオチド（ＫＫ１ＰＣＲ１およびＫＫ１ＰＣＲ２）［配列番号２８、２９］を製造した。実施例３に記載のこれらのオリゴヌクレオチドの合成、脱保護などの後、それらを、ｓＫＫ−０遺伝子フラグメントについて前に記載されたのと同様の方法で用いた。しかしながら、ｓＫＫ−１フラグメントは（４種類よりもむしろ）２種類の重複オリゴヌクレオチドだけから組み立てられていたので、この場合、１種類だけの「５回路ＰＣＲ修復」反応を行なった後、その修復反応生成物０．５μ ｌまたは５μｌの接種材料を用いる２５回路増幅段階へと進行した。前記のようにｓＫＫ−０遺伝子を用いるこれらの反応および適当な制御は期待通り正確に進行した。必要なオリゴヌクレオチドが全て含まれた場合、実質的な量（数μｇ）の新規の約２００ｂｐＤＮＡフラグメントが生成された。個々のオリゴヌクレオチドの脱落はこのフラグメントを生成させなかった。新規のｓＫＫ−１ＤＮＡフラグメントをクローン化することを試みる前に、標準法によるフェノール抽出およびエタノール沈殿によってそれを処理した（サムブルックら（１９８９）「分子クローニング。実験室マニュアル」（コールド・スプリング・ハーバー・プレス）中）。このように製造されたｓＫＫ−１遺伝子フラグメントは、天然ＫＫ−１遺伝子のシグナルペプチド以外の成熟および仮定のプロ配列をコードするだけであるべきである。その構造を実証し且つ更に働く材料を得るために、最初にそれをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化した（図８および１１を参照されたい）。次に、それを、ｓＫＫ−１フラグメントを調節するおよび操作するのに特に好都合にさせる別のポリリンカー配列［配列番号３０］を有するｐＵＣ１９の簡単な誘導体であるｐＭＭＳＩＢのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位にそれをクローン化した（図１２を参照されたい）。この連結反応生成物をコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換し、そして１２種類の推定上の組換え体を更に分析するために採取した。上記クローンを、インサートを放出させるクローニング酵素を用いる制限酵素分析によって分析した。次に、明確で正確な寸法のインサートを含む６種類のクローンを、本質的には実施例４に記載のように、このｐＵＣ１９誘導体のポリリンカー部分に隣接した部分を認識するいわゆる普遍的および逆Ｍ１３配列決定用プライマーを用いる配列分析用に選択した。６種類の組換え体の内の一つ（ｐＭＭＳ／ＫＫ−１＃３．２）は、期待される方法でクローン化されたｓＫＫ−１に予想されるものに正確に対合したインサートを有した。このクローンを、以下のようにｓＫＫ−０のプロペプチドコーディング配列に対する融合による完成ｓＫＫ−１遺伝子の最終的な組立てに用いた。クローンｐＭＭＳ／ＫＫ−１＃３．２のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを単離し、そして製造業者推奨規格にしたがってＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２．２ベクター中にサブクローン化して（図１３を参照されたい）、ｐＶＬ１３９２トランスファーベクター中において完成プレプロＫＫ−１−次転写物をコードしている、すなわち、ｓＫＫ−０のシグナル配列並びにｓＫＫ−１のプロおよび成熟配列を含んでいる遺伝子フラグメントを提供した。次に、連結反応生成物をコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換し、そして１２種類の推定上の組換え体を更に分析するために採取した。上記クローンを、ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０クローンを切断するのみでｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−１組換え体を切断すべきでないクローニング酵素およびＥｃｏＲＩを用いる制限酵素開裂によって分析した。この分析に基づいて、配列分析用に２種類のクローンを選択した。これらの組換え体の内の一つ（ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−１＃１）は期待された配列を有しており、組換え体ＡｃＭＮＰＶ組立て用に選択された。実施例１４ポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−１遺伝子発現単位を有する組換え体（ポリヘドリンマイナス）ＡｃＭＮＰＶの生成ここで用いた方法は、実施例４に記載されたのと同様であった。したがって、実施例４に記載の方法を用いて、６種類の推定上のＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−１（単離物１〜６）組換え体ウイルスを製造した。次に、物理的分析を行なって、ウイルスがそのままのｓＫＫ−１遺伝子を有していたことを確証した。前記のように、生物学的検定は全６種類のウイルスについて行なった。結果は下記であった。６種類の可能なｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−１の内の３種類（１、５および６）の単離物は、完成したｓＫＫ−１遺伝子を有していた。これらのウイルスは、Ｈ．ビレセンス幼虫に注入された場合に殺虫活性の増加を全く示さなかった。配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：ゼネカ・リミテッド（ＺＥＮＥＣＡＬＩＭＩＴＥＤ）（ｉｉ）発明の名称：生物学的制御剤（ｉｉｉ）配列の数：３７（ｉｖ）宛先：（Ａ）住所：ＩＣＩグループ・パテンツ・サービシズ・デパートメント（ＩＣＩＧＲＯＵＰＰＡＴＥＮＴＳＳＥＲＶＩＣＥＳＤＥＰＡＲＴＭＥＮＴ）（Ｂ）地区：私書箱６、シャイア・パーク、ベッサマー・ロード（ＳＨＩＲＥＰＡＲＫ，ＢＥＳＳＡＭＥＲＲＯＡＤ）（Ｃ）市名：ウェルウィン・ガーデン・シティー（Ｄ）州名：ハートフォードシャー（Ｅ）国名：英国（Ｆ）郵便番号：ＡＬ７１ＨＤ（ｖ）コンピューター読取り形式：（Ａ）中型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース（ＰａｔｅｎｔＩｎＲｅｌｅａｓｅ）＃１．０、バージョン＃１．２５（ｖｉ）現行出願資料：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）先行出願資料：（Ａ）出願番号：ＧＢ９３０６２９５．８（Ｂ）出願日：１９９３年３月２２日（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報：（Ａ）氏名：ビショップ，ニゲル，ディー（ＢＩＳＨＯＰ，ＮＩＧＥＬＤ）（Ｂ）登録番号：ＧＥＮＡＵＴＨＮ３１４３４（Ｃ）照会／事件整理番号：ＰＰＤ３７４９１（ｉｘ）通信情報：（Ａ）電話：（＋４４）０７０７３２３４００（Ｂ）ファクシミリ：（＋４４）０７０７３３７４５４（Ｃ）テレックス：９４０２８５００ＩＣＩＣＧ（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２６９塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｉｖ）アンチセンス：なし（ｘｉ）配列記載：配列番号：１：（２）配列番号：２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：７８アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：２：（２）配列番号：３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：８４塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｉｖ）アンチセンス：なし（ｘｉ）配列記載：配列番号：３：（２）配列番号：４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：８９塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｉｖ）アンチセンス：なし（ｘｉ）配列記載：配列番号：４：（２）配列番号：５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：８９塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｉｖ）アンチセンス：なし（ｘｉ）配列記載：配列番号：５：（２）配列番号：６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：７３塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：６：（２）配列番号：７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：７：（２）配列番号：８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２６塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：８：（２）配列番号：９の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４５塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：９：（２）配列番号：１０の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４５塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：１０：（２）配列番号：１１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１９塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：１１：（２）配列番号：１２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４９塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：１２：（２）配列番号：１３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１５塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：１３：（２）配列番号：１４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１５塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：１４：（２）配列番号：１５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２８２塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：１５：（２）配列番号：１６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：７８アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：１６：（２）配列番号：１７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：７７アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：１７：（２）配列番号：１８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：７７アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：１８：（２）配列番号：１９の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２７アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：１９：（２）配列番号：２０の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２６アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：２０：（２）配列番号：２１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２６アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：２１：（２）配列番号：２２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２５アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：２２：（２）配列番号：２３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１９６塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：２３：（２）配列番号：２４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５６アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：２４：（２）配列番号：２５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５７アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：２５：（２）配列番号：２６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１１１塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：２６：（２）配列番号：２７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１０６塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：２７：（２）配列番号：２８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２７塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：２８：（２）配列番号：２９の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２６塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：２９：（２）配列番号：３０の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４５塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列番号：３０：（２）配列番号：３１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２７アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：３１：（２）配列番号：３２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２５アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：３２：（２）配列番号：３３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３８アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：３３：（２）配列番号：３４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３８アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：３４：（２）配列番号：３５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２８アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：３５：（２）配列番号：３６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３０アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：３６：（２）配列番号：３７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３７アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列記載：配列番号：３７：

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年３月８日【補正内容】原請求の範囲を以下の新請求の範囲に全文差し替える請求の範囲１．タンパク質を発現することができる遺伝子をコードし且つ配列番号１で示される配列を有する合成ＤＮＡ。２．タンパク質を発現することができ且つ配列番号１で示される配列との相同性が７７％より大である請求項１に記載の合成ＤＮＡ。３．一定の場所の昆虫集団を制御する方法であって、昆虫に対して毒性のタンパク質を該昆虫または該場所に対して投与することを含み、該タンパク質は、昆虫において毒性作用を有する軟体動物に由来するタンパク質またはそのフラグメント若しくは変異体であるかまたはそれと機能的に均等である上記方法。４．軟体動物がイモガイ属（Ｃｏｎｕｓ）のイモガイ種である請求項３に記載の方法。５．毒素が、配列番号１で示されるＤＮＡ配列から発現されたタンパク質、またはその機能的均等物若しくは遺伝子コードの同義性によって許容されるその変異型である請求項３または４に記載の方法。６．ＤＮＡ配列が配列番号１で示されるＤＮＡ配列に対して７５％より大である相同性を有する請求項５に記載の方法。７．毒素が、昆虫において毒性作用を有する配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、或いはその機能的均等物またはそのフラグメント若しくは変異型である請求項３または４に記載の方法。８．ウイルス、原核性または真核性宿主生物を含む生物学的制御剤であって、該生物のゲノムが、昆虫に対して毒性であるタンパク質を発現することができる、軟体動物に由来するＤＮＡ配列または均等な作用を有する合成ＤＮＡ配列の組込みによって修飾されている上記生物学的制御剤。９．軟体動物がイモガイ属の種である請求項８に記載の生物学的制御剤。１０．毒素が、配列番号１で示されるＤＮＡ配列から発現されたタンパク質、またはその機能的均等物若しくは遺伝子コードの同義性によって許容されるその変異型である請求項８または９に記載の生物学的制御剤。１１．ＤＮＡ配列が配列番号１で示されるＤＮＡ配列に対して７５％より大である相同性を有する請求項１０に記載の生物学的制御剤。１２．毒素が、昆虫において毒性作用を有する配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、或いはその機能的均等物またはそのフラグメント若しくは変異型である請求項８または９に記載の生物学的制御剤。１３．宿主生物がバキュロウイルスまたは昆虫ポックスウイルスである請求項８〜１２のいずれか１項に記載の生物学的制御剤。１４．宿主生物がバキュロウイルスであり且つタンパク質の発現がポリヘドリンプロモーターの制御下にある請求項１３に記載の生物学的制御剤。１５．宿主生物がバキュロウイルスであり且つタンパク質の発現がｐ１０プロモーターの制御下にある請求項１３に記載の生物学的制御剤。１６．宿主生物が昆虫ポックスウイルスであり且つタンパク質の発現がスフェロイジンプロモーターの制御下にある請求項１３に記載の生物学的制御剤。１７．宿主生物が、昆虫に感染しているまたは昆虫と共生的関係にある細菌または真菌生物である請求項８〜１２のいずれか１項に記載の生物学的制御剤。１８．宿主生物が、バチルス・サリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）である請求項１７に記載の生物学的制御剤。１９．宿主生物が、ボーバリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖａｒｉａｂａｓｓｉａｎａ）である請求項１７に記載の生物学的制御剤。２０．宿主生物が植物内部寄生性植物である請求項８〜１２のいずれか１項に記載の生物学的制御剤。２１．タンパク質を請求項８〜２０のいずれか１項に記載の生物学的制御剤の形で前記場所に対して投与する請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。２２．生物学的制御剤が植物内部寄生性植物であり且つ前記場所が植物または植物の種子である請求項２１に記載の方法。２３．植物であって、そのゲノムが、昆虫に対して毒性でありしかも昆虫によって加えられた損害に対して該植物の感受性を少なくするタンパク質を発現することができる、軟体動物に由来するＤＮＡ配列または均等な作用を有する合成ＤＮＡ配列の組込みによって修飾されている上記植物。２４．伝達ベクターであって、昆虫において毒性作用を有する、配列番号２で示されるタンパク質を発現することができる遺伝子をコードしている合成ＤＮＡ、またはその機能的均等物、またはそのフラグメント、またはは変異型を含む上記伝達ベクター。２５．タンパク質を、配列番号１で示される配列を有するＤＮＡ配列、またはその機能的均等物、または遺伝子コードの同義性によって許容されるその変異型から発現させる請求項２４に記載の伝達ベクター。２６．ＤＮＡ配列が配列番号１で示されるＤＮＡ配列に対して７５％より大である相同性を有する請求項２５に記載の伝達ベクター。２７．プラスミドである請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の伝達ベクター。２８．プラスミドがｐＶＬ１３９２またはｐＡｃＵＷ２１である請求項２７に記載の伝達ベクター。２９．請求項２７または２８に記載のプラスミドベクターを含む細菌宿主生物。３０．宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であり且つプラスミドがＰＶＬ１３９２である請求項２９に記載のプラスミドベクターを含む細菌宿主生物。３１．ＪＨＣＣ８００２（ＮＣＩＭＢ４０５４０）の特性を有する請求項２９に記載のプラスミドベクターを含む細菌宿主生物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ０１Ｎ 63/00 8931−4ＢＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アーレイ，ファーガス・ジェラルド・ポールイギリス国サウサンプトンエスオー２１アールエス，ハイフィールド，グロスヴナー・ガーデンズ７ (72)発明者ゲスト，フィリッパ・ジェーンイギリス国バークシャーアールジー12 ７ディーエイチ，ブラックネル，クロウソーン・ロード，スプリングヒル・コート６

Claims

【特許請求の範囲】１．図１に示された配列を有するタンパク質を発現することができる遺伝子をコードしている合成ＤＮＡ、またはその機能性均等物若しくはその遺伝子コードの同義性によって許容されるその変異型。２．図１および図２に示された配列を有する合成ＤＮＡ、またはその機能性均等物若しくはこの遺伝子コードの同義性によって許容されるその変異型。３．図１に示された配列との相同性が７５％より大であるタンパク質を発現することができる請求項１に記載の合成ＤＮＡ。４．一定の場所の昆虫集団を制御する方法であって、昆虫に対して毒性のペプチドタンパク質を該昆虫または場所に対して投与することを含み、該タンパク質は、昆虫において毒性作用を有する軟体動物に由来するペプチドタンパク質またはそのフラグメント若しくは変異体であるかまたはそれと機能的に均等であり且つそれとの相同性が７５％より大である上記方法。５．軟体動物がイモガイ属（Ｃｏｎｕｓ）のイモガイ種である請求項４に記載の方法。６．毒素が、昆虫において毒性作用を有する請求項１または請求項２に記載のＤＮＡ配列によって発現されるペプチドタンパク質、またはそのフラグメント若しくは変異体である請求項４に記載の方法。７．ウイルス、原核性または真核性宿主生物を含む生物学的制御剤であって、該生物のゲノムが、軟体動物に由来するＤＮＡ配列、または均等な作用を有する合成ＤＮＡ配列の組込みによって修飾されており、且つ昆虫に対して毒性であるペプチドタンパク質を発現することができる上記生物学的制御剤。８．軟体動物がイモガイ属の種である請求項７に記載の生物学的制御剤。９．宿主生物がバキュロウイルスまたは昆虫ポックスウイルスである請求項７に記載の生物学的制御剤。１０．宿主生物がバキュロウイルスであり且つペプチドタンパク質の発現がポリヘドリンプロモーターの制御下にある請求項９に記載の生物学的制御剤。１１．宿主生物がバキュロウイルスであり且つペプチドタンパク質の発現がｐ１０プロモーターの制御下である請求項９に記載の生物学的制御剤。１２．宿主生物が昆虫ポックスウイルスであり且つペプチドタンパク質の発現がスフェロイジンプロモーターの制御下にある請求項９に記載の生物学的制御剤。１３．宿主生物が、昆虫に感染しているまたは昆虫と共生的関係にある細菌または真菌生物である請求項７に記載の生物学的制御剤。１４．宿主生物が、バチルス・サリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）である請求項１３に記載の生物学的制御剤。１５．宿主生物が、ボーバリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖａｒｉａｂａｓｓｉａｎａ）である請求項１３に記載の生物学的制御剤。１６．宿主生物が植物内部寄生性植物である請求項１３に記載の生物学的制御剤。１７．ペプチドタンパク質を請求項７に記載の生物学的制御剤の形で前記場所に対して投与する請求項４に記載の方法。１８．生物学的制御剤が植物内部寄生性植物であり且つ前記場所が植物または植物の種子である請求項１７に記載の方法。１９．植物であって、そのゲノムが、昆虫に対して毒性であり、しかも昆虫によって加えられた損害に対して該植物の感受性を少なくするペプチドタンパク質を発現することができる、軟体動物に由来するＤＮＡ配列または均等な作用を有する合成ＤＮＡ配列の組込みによって修飾されている上記植物。２０．請求項１に記載のＤＮＡ配列を含む伝達ベクター。２１．プラスミドである請求項２０に記載の伝達ベクター。２２．プラスミドがｐＶＬ１３９２またはｐＡｃＵＷ２１である請求項２１に記載の伝達ベクター。２３．バキュロウイルスを含み、そのゲノムが請求項１に記載の配列の組込みによって修飾されている請求項７に記載の生物学的制御剤。２４．請求項２１に記載のプラスミドベクターを含む細菌宿主生物。２５．宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であり且つプラスミドがＰＶＬ１３９２である請求項２４に記載のプラスミドベクターを含む細菌宿主生物。２６．ＪＨＣＣ８００２（ＮＣＩＭＢ４０５４０）の特性を有する請求項２４に記載のプラスミドベクターを含む細菌宿主生物。