JPH06506594A - 新規なエントモボックスウイルス発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３０、昆虫細胞と鴫乳類細胞からなる群から選ばれる、特許請求の範囲第２９項 に記載の細胞。 ３１、選ばれた異種遺伝子配列に任意付加的に連結されることもあり得るエント モポックスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子ポリヌクレオチド配列、その対立 遺伝子変異型、またはその断片を含めてなる組替えウィルスで感染させた細胞。 ３２、昆虫細胞と鴫乳類細胞からなる群から選ばれる、特許請求の範囲第３１項 に記載の細胞。 ３３、選ばれたポリペプチドをコードした異種遺伝子配列に機能できるように連 結されたエントモポックスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子ポリヌクレオチド 配列、その対立遺伝子変異型、またはその断片を含めてなる組替えウィルスで感 染させた選ばれた宿主細胞を培養し、上記のポリペプチドを培養基培地から回収 することを含めてなる、上記の選ばれたポリペプチドの製法。 ３４、選ばれたポリペプチドをコードした異種遺伝子配列に機能できるように連 結されたエントモポックスウィルスのスフエロイジン遺伝子ポリヌクレオチド配 列、その対立遺伝子変異型、またはその断片を含めてなる紹替えウィルスで感染 させた選ばれた宿主細胞を培養し、上記のポリペプチドを培養基培地から回収す ることを含めてなる、上記の選ばれたポリペプチドの製法。 ３５、エントモポックスウィルスのスフエロイジンをコードしたポリヌクレオチ ド配列へ挿入された選ばれた異種遺伝子配列を含むポリヌクレオチド分子で、組 替え宿主細胞を形貢転損することを含み、スフェロイジンタンパク質の発現によ って通常形成される閉鎖体の非存在が異種遺伝子の組込みを示す、異種遺伝子挿 入用の組替え宿主細胞をスクリーニングする方法。 ３６、エントモボックスのチミジンキナーゼをコードしたポリ又クレオチド配列 へ挿入された選ばれた異種遺伝子配列を含むポリヌクレオチド分子で、ＭＩＦえ 宿主細胞を感染させることを含み、不活性チミジンキナーゼ配列の組込みによっ て形成されるチミジンキナーゼＩＩＩ能の存在が異種遺伝子の挿入を示す、異種 遺伝子挿入用の組替え宿主細胞をスクリーニングする方法。 明細書 〔発明の名称〕 新規なエントモポックスウィルス発現系〔発明の分野〕 本発明は一般的には遺伝子組替えでつくられるタンパク質に関し、特定的には新 規な組替え型エントモポックスウィルス蛋白質１．蛋白質調節配列および形質転 換宿主中で異種遺伝子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎｅ　：外来遺伝子又 は非相同遺伝子）を発現する上でのそれらの使用に間する。 〔発明の背景〕 ポックスウィルスは分類学的には、例えばオルトポックスウィルス・ワクチニア （０ｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ　ｖａｃｃｉｎｉａ）のように、を推動物宿主に 感染するコルドボックスウイリナエ（ＣｈｏｒｄｏｐｏｘｖＩｒｉｎａｅ）科や 、エントモボックスウイリナエ（Ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ）科に分類 される。Ｚントモボックスウイリナ工科のメンバーについては、個々のメンバー の昆虫宿主範囲以外にほとんど知られていない。 エントモポックスウィルス（ＥＰＶ）の一つの種はアムサクタ・モオレイ（＾■ ５ａｃｔａ　ｇ＋ｏｏｒｅｉ）エントモポ・ンクスウイルス（Ａ−ＥＰＶ）であ り、これは赤毛虫（ｒｅｄ　ｈａｉｒｙ　ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）のアムサク タ拳モオレイ（Ａｓ５ａｃｔａ　ｗｏｏｒｅｉ）の幼虫から初めて分離された［ ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）およびグラナトス（Ｇｒａｎａｄｏｓ）、、　１ｎ ｖｅｒｔｅｂｒ、　Ｐａｔｈｏｆ、、　＋２１１４１−１４３頁（１９６８年） ］、　ＡｍＥＰｖはＥＰｖノＢ属の基準種でＳす、培養された昆虫細胞中でＩＩ 製する３種の既知ＥＰＶ類の−っであるｃアール・アール・グラナトス（Ｒ，Ｒ ，Ｇｒａｎａｄｏｓ）ら、「エスチグメネ・アクレア（Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ　ａ ｃｒｅａ）からの血球細胞系統におけるアムサクタ・モオレイ・エントモポック スウィルスおよびオートグラファ拳カリフォルニカく＾ｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核ポリへドロシスウィルスの［１、「医学、生物学、農 学への篇を椎組織培養の応用Ｊ所収、イー・カースタック（Ｅ、にｕｒｓｔａｋ ）およびケイ・マラモロ・ンシ：Ｌ　（Ｋ、　Ｍａｒａｍｏｒｏｓｃｈ）（ＩＩ 　）、アカデミツクブレス社、ニューヨーク、３７９−３８９頁（１９７６年） ；ティー−ツクハラ（Ｔ、　Ｈｕｋｕｈａｒａ）ら、　、　１ｎｖｅｒｔｅｂｒ 、　Ｐａｔ肚ム、　５６Ｍ！１１２２２−２３２頁（１９９０年）；およびティ ー・サトウ（Ｔ、５ａｔｏ）、「ハマキガ（Ｔｏｒｔｉｃｉｄｓ）（鱗翅目）新 生幼虫からの８細胞系統の確立、および昆虫ウィルスへの感受性を含めた幾つか の特徴」、「無を椎繍胞系の応用１ジエイ・ミツハシ（編）、第■巻、＋８７− １９８頁、ＣＲＣプレスインコーポレイテッド、フロリダ州ポカレイトン（１９ ８９年）］。 Ａ■ＥＰＶｕ毘虫細胞培養基中で複製できる数少ない昆虫ポックスウィルスの一 つである。ＡｍＥＰＶはを推動物系では＊ａ’ｔｃ’きなイ、　ＡｍＥＰＶ（０ ２本鎖ＤＮＡゲノムハ約２２５　ｋｂで、＾÷Ｔが異常に多い（１８，５％Ｇ＋ Ｃ）　［ダブリュー・エッチ・アール・ラングリッジ（Ｗ、Ｈ，Ｒ，Ｌａｎｇｒ ｉｄｇｅ）ら、　Ｖｉｒｏｌ。 １１　７６ｍ！　６１６−６２０頁（１９７７年）］、最近、ＡｍＥＰＶ（Ｄ一 連の制限地図が発表された［アール・エル・ホール（Ｒ，Ｌ、　Ｈａｌｌ）ら、 Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、、１１０巻？？−９０頁（１９９０年）］、ワクシニア とのＤＮＡの相同性は検出されなかった［ダブリュー・エッチ・ラングリッジ１ ．１ｎｖｅｒｔｅｂｒ、　Ｐａｔｈｏｌ、４２貴？？−８２頁（１９８３年）： ダブリニー・エッチ・ラングリッジ、　Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ、　Ｐａｔｈｏ ｌ、４３１　：　４１−４６頁（１９８４年）］。 Ａ■ＥＰＶのウィルス複製サイクルは、感染後期に閉鎖ウィルスが出現する以外 は、他のポックスウィルスのそれと似ている。　ＡｍＥＰＶの場合、細胞が感染 されると、閉鎖ウィルスと細胞外ウィルスの両方の粒子が発生する。感染中に環 境からヴイリオンを保護する責任を果たす成熟した閉鎖体粒子は、主に単一タン パク質のスフエロイジンからなる結晶マトリックス内に埋め込まれたウィルスか らなっている。スフエロイジンはＡｍＥＰＶの主要な構造タンパク質で、分子量 ＋１０ｋＤａで、高率の荷電された及び硫黄含有アミノ酸からなる、と報告され た［ラングリ・フジおよびロバーツ、Ｊ、　１ｎｖｅｒｔｅｂｒ、　Ｐａｔｈｏ ｌ、　３９１！３４６−３５３頁（１９８２年）］、真核宿主／ベクター系での ウィルスとウィルスタンパク質の利用は、相当な研究と推測の対象となっている 。多くの既存のウィルスベクター系は、それらの有用性を消してしまうような相 当な欠点と限界をもフていた０例えば、幾つかの真核ウィルスベクター類は、鴫 乳類系で腫瘍原性または発癌原性であり、生ずる遺伝子生成物と偶発的な感染に 間違する重大な健康・安全性問題の潜在的可能性をつくりだすものであった。更 に、幾つかの真核宿主／ウィルスベクター系で、遺伝子生成物自体が抗ウィルス 活性を示し、それによりてそのタンパク質の収量を低下させた。 単純なウィルスの場合、単純なウィルスへパッケージできる外来のＤＮＡの量は 制限される。この制限は、使用遺伝子が真核生物のものの時には、特に急を要す る問題となる。真核遺伝子は通常、介在配列を含有するから、単純なウィルスへ 適合させるには大きすぎる。更に、これらは多くの制限位置をもっているので、 外来のＤＮＡを複雑なウィルスの特定位置に挿入するのがよけい困難である。 ワクシニアウィルスは、真核性クローニングおよび発現ベクターとして最近開発 された［エム・マゲット（Ｍ。 Ｍａｃｋｅｔｔ）ら、ＤＮＡクローニング、第■巻、ディー・エム・グミーヴｙ 　−（Ｄ、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ）扁、１９１−２１２頁、オックスフォード、Ｉ ＲＬブレス社（１９８５年）；ディー・バニカリ（Ｄ、Ｐａｎ１ｃａｌｉ）ら、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾　８８５３６４−５３６８頁（ １９８２年）］、多くのウィルス抗原は、ワクシニアウィルスベクターを使用し て発現された［イー・パオレッティ（Ｅ、　Ｐａｏｌｅｔｔｉ）ら、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳ＾８１巻＋９３−１９７頁（１９８４ 年）；エイ・ビッチーネ（＾、　Ｐｉｃｃｉｎｅ）ら、Ｌバ１状■５巻２４Ｂ− ２５２頁（１９８６年）］、これに含まれるものとして、特にＨＢｓ＾ｇ、狂犬 病Ｇタンパク質、およびヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のｇｐ１２０／ｇｌ） ４１がある。 ハマキガ（ｓｐｒｕｃｅ　ｂｕｄｗｏｒｍ）ＥＰＶからの調節配列は、以前ワク シニアと一緒に使用されたことがある［エル・ユアン（Ｌ、Ｖｕｅｎ）ら、しＬ １ユｕＵ上１４２７−４３３頁（１９９０年）］。 そのほか、ワクシニアウィルスでの研究は、ポックスウィルスがワクチンベクタ ーとして幾つかの有利な特徴をもつことを立証した。これらは、細胞媒介性免疫 と体液性免疫の両方を刺激するポックスウィルス基盤のワクチンの能力、ワクチ ンを大量生産するコストの低いことと冷蔵しない凍結乾燥ワクチンの安定性、非 無菌条件下に投与しやすいこと、および少なくとも２５．０００塩基対の外来Ｄ ＮＡを感染性線替え型に挿入して、一つの組替え型からの多くの抗原を同時発現 する能力を含んでいる。 なおも多くのウィルス組成物の必要や、選ばれた宿主細胞中で異種遺伝子を発現 させたり、これらに間違する他の研究および生産手法を実施したりする上での使 用法について、この技術で必要性がある。 〔発明の要旨〕 一つの面として本発明は、本来結びついていた他のウィルス配列から自由になっ たエントモポックスウィルスのポリヌクレオチド配列を提供している。この配列 は、エントモポックスウィルスのスフエロイジン遺伝子および／またはその調節 配列、その対立遺伝子変異型、類似体または断片をコードした配列を含めてなる 。特定的な態様において、スフエロイジンＤＮＡ配列はアムサクタ・モオレイ・ エントモポックスウィルスから単離され、図２　［ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、Ｉコに 例示されている。 本発明のもう一つの面は、エントモポックスウィルス・スフエロイジン・プロモ ーターまたはその対立遺伝子変異型、類似体または断片をコードしたポリヌクレ オチド配列である。スフエロイジン・プロモーター配列は、その配列即ち断片を 、選ばれた宿主細胞中で機能するように結合させた異種遺伝子の発現を導く能力 を特徴としている。 もう一つの面として、本発明は組替えポリヌクレオチド配列を提供しており、こ れは異種遺伝子をコードした第二のポリヌクレオチド配列に結合されたエントモ ボツクスウイルス・スフエロイジンタンパク質および／またはその調節配列、対 立遺伝子変異型、類似体またはその断片をコードした配列を含めてなる。このポ リヌクレオチド配列の一つの態様は、選ばれた宿主細胞中で異種遺伝子の発現を 導くために、異種遺伝子に機能するようζこ結合されたスフエロイジン・プロモ ーター配列を提供している。もう一つの態様は、融合タンパク質の発現を可能と するような形で異種遺伝子に結合されたスフエロイジンタンパク質をコードした 配列を提供している。更ζこもう一つの態様は、異種遺伝子がスフエロイジン配 列によって両末端でフランキングされるように、スフエロイジン遺伝子内の部位 に挿入された異種遺伝子を提供している。 なおも一つの面として、本発明は自然状態で結びついていた他のウィルス配列を 含まないエントモポックスウィルスのポリヌクレオチド配列を提供しており、こ れはエントモポックスウィルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子をコードした 配列および／またはその調節配列、配列の対立遺伝子変異型、類似体、または断 片を含めてなる。 特定の態様では、この配列はアムサクタ・モオレイ（Ａｓｓａｃｔａ　ｗｏｏｒ ｅｉ）に由来しており、図３　［ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、８］に例示されている。 なおも別の面で、この配列はエントモポックスウィルスのｔｋプロモーター、そ の対立遺伝子変異型または断片をコードしている。　ｔｋプロモーター配列は、 配列または断片を選ばれた宿主細胞中で機能するように結合させた異種遺伝子の 発現を導く能力を特徴としている。 本発明の更に一つの面は、異種遺伝子に結合されたエントモポックスウィルスｔ ｋ遺伝子および／またはその調節配列、その対立遺伝子変異型または断片をコー ドした上記の組替えポリヌクレオチド配列を提供している。このポリヌクレオチ ド配列の一つの態様は、選ばれた宿主細胞中で異種遺伝子の発現を導くために、 異種遺伝子に操作自在に結合されたｔｋプロモーター配列を提供している。もう 一つの面は、融合タンパク質の発現を可能とする形で異種遺伝子に結合された、 ｔｋタンパク質をコードした配列を提供している。なおも一つの態様は、異種遺 伝子がｔｋ配列によって両末端でフランキングされるようにｔｋ遺遺伝円内部位 に挿入された異種遺伝子を提供している。 本発明のもう一つの面は、任意付加的に異種タンパク質またはペプチドに融合さ れることもあり得る、エントモボツクスウイルスのスフエロイジン拳ポリヌクレ オチド、その断片、またはその類似体である。また、任意付加的に異種タンパク 質またはペプチドに融合されることもあり得る、エントモポックスウィルスのｔ ｋポリペプチド、その断片、またはその類似体も提供されている。 本発明のなおも別の面は、一つ以上の上記のポリヌクレオチド配列を含めてなる ｗＡｖえポリヌクレオチド分子によって提供される。この分子は、発現ベクター またはシャトルベクターでありうる。また、この分子はスフエロイジンまたはｔ ｋポリヌクレオチド配列に寄与したエントモポックスウィルス以外のウィルス、 例えばワクシニアウィルスに由来するウィルス配列も含有できる。 別の面で、本発明は上記のポリヌクレオチド配列を含めてなる絹瞥λウィルスを 提供している。また、一つ以上の上記の絹替えウィルスに感染した宿主細胞も提 供されている。 本発明はまた、上記の組替えウィルスで感染させた選ばれた宿主細胞を培養し、 培養基培地からポリペプチドを回収することを含めてなる、選ばれたポリペプチ ドの製法を提供している。 最後の面として、本発明は異種遺伝子の挿入用の組替え宿主細胞を選定する方法 を提供しており、この方法は、異種遺伝子が各末端でエントモポックスウィルス のスフェロイジンまたはｔｋポリヌクレオチド配列によってフランキングされる ように、不完全なスフエロイジンまたはｔｋポリヌクレオチド配列に結合される かまたはその中に挿入されコード化配列を中断している、選ばれた異種遺伝子配 列を含むポリヌクレオチド分子を含有する組替えウィルスで、細胞を感染させる ことからなる。スフエロイジン含冑細胞中でスフエロイジンタンパク質の発現に よって形成される閉鎖体が存在しないことは、異種遺伝子の組込みを示している 。その代わりに、チミジンキナーゼ機能、すなわち不活性チミジンキナーゼ配列 の絹込みによって形成されるメトトレキセートまたはメトトレキセートのヌクレ オチド類似体の不在は、異種遺伝子の挿入を示している。 本発明のその他の面および利点は、本発明の態様の以下の詳細な説明において、 更に記述される。 〔図面の簡単な説明〕 図１はＡｍＥＰＶの制限断片を例示し、Ｈｉｎｄｍ−Ｇ断片中の位置ｓ２９のす ぐ右にスフエロイジン遺伝子を示すＡｍＥＰＶの物理的地図である。 図２は、アムサクタ・モオレイ・エントモポックスウィルスのスフェロイジン遺 伝子の＾ｍＥＰＶＤ　Ｎ　Ａ配列とフランキング配列［ＳＥＱ　１０　ＮＯ＋１ １、スフエロイジンタンパク質の推定アミノ酸配列［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：６］ および五つの追加オーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を提示している。 １！１３は、アムサクタ・モオレイ・エントモポックスウィルスのチミジンキナ ーゼ（ｔｋ）遺伝子のＤＮＡ配列とフランキング配列［ＳＥＱ　Ｉ［１ＮＯ：８ ］　、ｔ　ｋタンパク質の推定アミノ酸配列［ＳＥｏ　１０　ＮＯ＋１１１　、 および二つの追加ＯＲＦを提示している。 図４は、ＲＭ５８　［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１２］　、ＲＭ８２［ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：＋３１、ＲＭ８３　［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１４］、ＲＭ９２　［ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：１５］　、ＲＭ１１８［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１６］　、Ｒ旧 ６５　［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１７］　、ＲＭＯ３［５ＥＱＩＤ　ＮＯ：＋８１ 　、ＲＭＯ４［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：＋９１　、およびＲＭ１２９　ＣＳＥＱ　 １０　ＮＯ：２０］と命名される合成オリゴヌクレオチド類のヌクレオチド配列 を提示している。 図５は、物理的地図上のスフエロイジンＯＲＦの方向を説明し、相同性を示す＾ 蒙ＥＰＶ断片の略図である。 〔発明の詳細な説明〕 本発明は、本来結びついていた他のウィルス配列との関連から解放された、新規 なエントモポックスウィルス（ＥＰＶ）ポリヌクレオチド配列を提供している。 配列を含有する組替えポリヌクレオチドベクター、配列を含有する覇替えウィル ス、および朝替えウィルスで感染させた宿主細胞も、ここに記述されている。こ れらの組成物は本発明の方法において、異種遺伝子の発現と昆虫および鴫乳類宿 主ａｉｒａ中における選ばれたタンパク賀の生産に有用である。 本発明の新規なポリヌクレオチド配列は、遺伝子の発現用の調節信号を提供する 配列を含めて、ＥＰＶスフエロイジン遺伝子および／またはそのフランキング配 列をコードしている０本発明はまた、ＥＰＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子お よび／またはそのフランキング配列をコードした新規なポリヌクレオチド配列を 提供している０本発明のポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列であ りうる。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列である 。 本発明によって特定的に明らかにされているのは、アムサクタ◆モオレイーエン トモボ・ンクスウイルス（Ａ　ｍ　Ｅ　ＰＶ）から得られるスフエロイジンおよ びｔｋポリヌクレオチド配列である。これは、本発明の方法および組成物の実施 に現在好ましい種であるが、本明纏書に記述された手法を利用して、他の入手可 能なエントモポックスウィルス種から当業者は実質的に相同の配列を得ることが できる。 フランキングおよび調節配列を含めたＪｖＥＰＶスフエロイジンＤＮＡ配列は、 ヌクレオチド番１〜６７６８　［ＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎｏ：１］にわたるものとして 図２に報告されている。この配列内で、スフェロイジン遺伝子コーディング配列 はヌクレオチド＄３０８０〜＄６０９１　［ＳＥＱ　Ｉｌｌ　ＮＯ：２１］に及 んでいる。 プロモーター配列を含有していそうな断片は、ヌクレオチド嘗２７８１−　＄３ １９９　［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２２コに及んでいる。この配列のその他の領域 も、スフエロイジンと関連する他の構造遺伝子や調節遺伝子用の！！像上のコー ディング領域として確認されている。これらの興味のある他の断片は、次の配列 を含んでいる。　Ｇ２ＲＯＲＦ　［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３］をコードしたヌク レオチド１１１４７２〜１１２＋５１　Ｃ３ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３］　；ηＲ ＯＲＦ　［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：５］をコードしたヌクレオチド＃２５０２〜雲 ２９８７　［ＳＥＱ　１０１１０：２４］；および図２で左から右に転写される 以下の配列：すなわち、ＧＩＬ　ＯＲＦ　［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２］をコード したヌクレオチド＃６５〜＃目５９　［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ二２５コ　；Ｇ３Ｌ 　０ＩＩＦ　［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４］をコードしたヌクレオチド１２２３９ 〜＃２４７５Ｃ５ＥＱ　１０　ＮＯ：２６］；およびＧ６Ｌ　ＯＲＦ［ＳＥＱ　 ｌ［）　ＮＯニア］をコードしたヌクレオチド＃６７７〜＄６７６８　［５ＥＱ 　Ｉｎ　ＮＯ：２７］、これらのＯＲＦは図２で確認されている。 スフエロイジン遺伝子のすぐ上流にあるＡｗ＋ＥＰＶ　ＯＲＦ　Ｇ４Ｒ［５Ｅ（ ｌ　ＩＤ　ＮＯ：５］は、カブリポックスウィルス）１Ｍ３０ＲＦに有意の相同 性をもっている。　８Ｍ３０ＲＦの相同体は、ワクシニアウィルス中で、牛痘つ ィルスＡＴＩ遺伝子の末端切除されたもの（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｖｅｒｓｉｏ ｎ）のすぐ上流に見出される。従って、この領域のミクロ環境は２ウイルスで似 ている。ほかの二つのＯＲＦは、ワクシニアウィルスの対応部分に関係している 。これらのＯＲＦは、＾璽εＰＶ　ＧＩＬ　ＯＲＦ［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２］ に間係するワクシニアウィルスＨｉｎｄｌＩ［−１断片の１７０ＲＦ　（＋７） 　［ジエイ・エフ・シー・シュミット（Ｊ、Ｆ、Ｃ，Ｓｃｈｍｉｔｔ）ら、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、８２巻１８８９−１９９７頁（１９８８年）］と、Ａ＠ＥＰＶ　Ｇ ６Ｌ　ＯＲＦ　［ＳＥＱ　１０　ＮＯニア］に関係するＨｉｒｄ■−０断片のＮ ＴＰａｓｅ　ｌ　（ＮＰＨｌ）　ＯＲＦ　Ｃニス・ニス中ブロイルス（５，５− Ｅｌｒｏｙｌｅｓ）ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１巻＋７３８−１７４２頁（１ ９８７年）　；およびジエイ拳エフ番ロドリゲス（Ｊ、Ｆ、　Ｒｏｄｒｉｇｕｅ ｚ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３巻９５６６−９ ５７０頁（１９８８年）】を包含している。ワクシニアウィルスのＯＲＦと比較 したＡｍＥＰＶ　ＯＲＦのゲノミック位置は、背椎動物のポックスウィルスの全 部でないにしても多くではよりマクロな規模で中心に位置し共直線性である本貢 的な「コア遺伝子」の配置が、昆虫ウィルス中ではまったく違うことを示唆して いる。 後に述べる実施例で詳細に記述されるように、ＡｍＥＰＶのスフエロイジン遺伝 子は、タンパク質の直接的なミクロ配列決定を通して確認され、その結果はオリ ゴヌクレオチド・プローブの設計に使用された。スフエロイジン遺伝子の転写は シクロヘキシミドによりて抑制され、これが後朋遺伝子であることを示唆してい る。この推定と一致して、スフエロイジン転写物がＴＡＡＴＧモチーフ内で開始 されたこと（１！１２、ヌクレオチド＄３０７７〜３０８２を参＠）、および５ ′ポリ（Ａ）配列があったことが観察されており、これらはいずれも後期転写物 の特徴である。 フランキングおよび調節配列を含めたＡｍＥＰＶの　ｔｋ　ＤＮＡ配列は図３で 、スパンニングヌクレオチドＨ〜１５１１［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８］として報 告されている。この配列内で、ｔｋ遺伝子コード化配列はヌクレオチド書２３４ 〜７８２［５ＥＱ１０　ＮＯ：２９］　（図３では右から左へ転写される）の範 囲に及んでいる。もう一つの興味ある断片は、その配列またはその断片のヌクレ オチド雲７８３〜１ｊ８５１　［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２９］を包含している。 プロモーター領域を含有していそうな断片ハ、ヌクＩ、　、ｔ’　チ）’　＄７ ５０〜８９０　［ＳＥｏ　１０　ＮＯ：３０］の範囲にある。この配列のその他 の領域は、ｔｋと関連する他の構造遺伝子やｒ１４１Ｆ５遺伝子の想像上のコー ディング領域としても確認されている。これらの興味ある他の断片は、以下の配 列（図３で左から右へ転写される）、すなわちＯＲＦ　ＱＩ［ＳＥＱ　１０　Ｎ Ｏ：ｌＯ］をコートしたヌクレオチド１１１８〜２１８　Ｃ３ＥＱＩＤ　）１０ ：３１１；およびＯＲＦ　Ｃ３［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：ＩＯ３をコードンたヌク レオチド＄８５２〜＋５１１　［ＳＥｏ　１０　ＮＯ＋３２１を包含する。 ＡｍＥＰＶ　ｔ　ｋ遺伝子の位置は、Ａｇ＋ＥＰＶゲノム（図１）（７）物理的 地図の左端近くのＥｃｏＲｌ−Ｑ断片中に描かれる［アール・エル・ホール（Ｒ ，Ｌ、　Ｈａｌｌ）ら、Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、　１１０巻７７−９０頁（１ ９９０年）も参照、ＩＩ照により本明細書に取り入れられている］、Ａ■ＥＰＶ ゲノム内ての遺伝子の方法のため、遺伝子の転写は末端方向へ起こりそうである 。哺乳類系を含めた他の系に同様なｔｋ遺伝子またはその変異型が存在すると思 われる。下の実施例に詳細に説明されるように、ＡｍＥＰＶのｔｋ遺伝子はタン パク質の直接的なミクロ配列決定を通して確認され、その結果はオリゴヌクレオ チドプローブの設計に使用された。 本発明との関連で使用される用語「ポリヌクレオチド配列」は、コーディング配 列をフランキングする調節配列を伴ったＥＰＶスフエロイジンまたはｔｋ遺伝子 の全体を包含しつる０例示されているＡＪＥＰＶ配列もこの用語によって包含さ れる。また、フランキング調節配列を伴ったコーディング配列の断片も、この定 義に包含される。 この定義はまた、調節配列のみ、例えばプロモーター配列、転写位置、終結配列 、およびその他のｙ４！ｌｌ配列をも包含している。 本発明の配列は、枠内で異種遺伝子配列に結合されたスフエロイジンまたはｔｋ 遺伝子の全部または一部を包含し得る。そのほか、本発明のポリヌクレオチド配 列は、ＥＰＶ配列が異種遺伝子配列をフランキングするように、外来または異種 遺伝子配列を挿入させたスフエロイジンないしｔｋ遺伝子配列を包含しうる。 本発明のポリヌクレオチド配列は、厳密な条件下に図２と３の配列とハイブリッ ドを形成できる配列をも包含する。これらの配列は図のものと同じ生物学的活性 や調節活性を保持している。また、厳密でない条件下に図２と３の配列とハイブ リッド形成できる配列もこの定義の範囲内に入るが、但し図２と３の配列のそれ ぞれ生物学的または調節的特性が保持されることが条件である。ハイブリッド形 成の厳密・非厳密条件の例は、慣用のものである［例えば、サムプルツク（Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング実験マニュアルＪ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コ ールドスプリングハーバ−研突所、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク （１９８９年　）　コ。 同様に、本発明のポリヌクレオチド配列は、スフエロイジンまたはｔ、　ｋタン パク質配列をコードしたＤＮＡ配列、または図２と３に例示された他のＯＲＦま たは調節配列をコードしたＤＮＡ配列、の対立遺伝子変異型（アミノ酸の変化を 生しるまたは生じないＥＰＶ種の集団中で天然の塩基変化）も包含している。同 様に、本発明のスフエロイジンまたはｔｋタンパク質をコードしているが、コー トされる所望のポリヌクレオチド配列の生物学的性状または有用性を強化するた めの点突然変異または誘発性縫飾によって起こる遺伝暗号の縮重やＤＮＡ配列の 変異のためにコドン配列が異なっているようなりＮＡ配列も、本発明に包含され る。 図２または３の配列データ、ならびにスフエロイジンまたはチミジンキナーゼの 指定された特性を利用して、これらのポリペプチド類をコードしたその他のＤＮ Ａ配列を得ることは、当業者の技術の範囲内にある０例えば、正しいアミノ酸を 保持しながら個々のヌクレオチドを代えるか、または酵素活性を失わずにアミノ 酸を修鋒するようにヌクレオチドを代えることによって、構造遺伝子を操作でき る。ヌクレオチド類は、試験官内突然変異誘発やプライマー修復を含めた既知手 法によって置換、挿入、または欠失できる。 生物学的活性を保持しながら、構造遺伝子の３′末端および／または５′末端で 、これを部分切断できる。ポリペプチド配列の一部を異種コーディング配列に連 結して、融合ペプチドをつくるのも望ましい。 本発明のポリヌクレオチド配列は、この技術で標準となフている化学的および遺 伝子工学的手法、またはそれらの鞘合せによフて、合成的に調製するか、または ウィルスＲＮＡまたは入手可能なｃＤＮ＾含有プラスミド類から導くことができ る。 本明細書で記述されているＡ■ＥＰＶタンパク質、スフエロイジン、チミジンキ ナーゼ、およびそれらの各々の調節配列は、自然的な対立遺伝子や種の変異のた めに、図２と３の配列とは配列の異なるポリヌクレオチド配列によってコードで きる。このため、用語「スフエロイジン」またはｒｔｋＪポリペプチドは、天然 の配列と種々の類似体類、例えば同じ生物学的活性を保持し、図２または３に対 して好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、および最も好ましく は９５％の相同性を保持した成熟スフエロイジンまたはｔｋポリペプチドおよび 突然変異体または修飾されたポリペプチド類または断片を含めて、処理ないし部 分切断された配列または断片の任意のものを指す。 本発明のもう一つの面は、ＥＰＶスフェロイジンおよびｔｋポリヌクレオチド配 列によってコードされたタンパク質を提供することである。二つのＥＰＶタンパ ク質の想像上のアミノ酸配列、ならびに図２と３で確認されるこれらの配列のＯ ＲＦによってコードされる追加の想像上のタンパク質、　ＥＰＶスフェロイジン は、バクロウィルスのポリヘトリンタンパク質を含めた既に報告されているタン パク質への有意のアミノ酸相同性をもっていない、スフエロイジンとｔｋの両方 とも、非本質的タンパク質であり、このことから外因性ＤＮＡの挿入位置として これらが望ましいものとなっている。 Ａ■ＥＰＶのｔｋアミノ酸配列を他のｔｋ遺伝子と比較すると、ＡｓＥＰＶのｔ ｋ遺伝子はを推動物ポックスウィルスのｔｋ遺伝子のどれとも高い関連性がない （４３，４−４５，７％）ことが示される。を推動物ｔｋタンパク質とＡｓＥＰ Ｖとの関連性はもっと低いが（３９，３−４１，０％）、アフリカ豚熱（Ａｆｒ ｉｃａｎ　５ｗ１ｎｅ　Ｆｅｖｅｒ、　ＡＳＦ）は試験されたｔｋタンパク質中 て最低の相同性（３１，４％）を示した。ＡＳＦはポックスウィルスに多くの類 似性をもち、ＡＳＦとＡｗＥＰＶの両方ともを推動物宿主に感染するが、ｔｋ遺 伝子は漸を椎宿主から派生する共通性および／または共通起源の兆候をほとんど 示さない。 スフエロイジンおよびチミジンキナーゼポリペプチド配列は、図２と３で確認さ れる、本明細書で確認される単離された天然のスフェロイジンまたはｔｋアミノ 酸配列、またはＡ−εＰｖポリペプチド類の生物学的機能または調節機能を保持 しているような、意図的に修飾された配列を包含している。従って、これらのポ リペプチド類の生物学的活性がこのような修飾にも関わらず丸ごと、または部分 的に保持されることを条件として、本発明は、本明細書で明らかにされたすべて のアミノ酸配列、ならびにスフエロイジンまたはｔｋの生物活性を保持している その類似体類の使用を包含している。典型的には、このような類似体は！、２． ３または４個のコドンの変化によって異なっている。同様に、他のスフエロイジ ンまたはｔｋのＯＲＦによってコードされるタンパク質または機能は、わずかな アミノ酸の修飾を含有するが、それらの調節機能や他の生物機能を保持している ような配列を包含しうる。 このような修飾の例は、エントモポックスウィルスのスフエロイジンまたはチミ ジンキナーゼの天然のアミノ酸配列からのわずかなアミノ酸の変化、特に同類ア ミノ酸置換を伴ったポリペプチド類を包含する。同類置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔ ｉｖｅ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）とは、側鎖に間係するアミノ酸のファミリー 内で起こる置換のことである。遺伝的にコードされたアミノ１Ｉｌｌ類は、一般 に次の４フアミリーに分類される。（１）酸性＝アスパラギン酸塩、グルタミン 酸塩；（２）塩基性＝リジン、アルｇニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニ ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニ ン、トリプトファン；および（４）無荷電の極性＝グリシン、アスパラギン、グ ルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン、フェニルアラニン、トリ プトファン、およびチロシンは合同で芳香族アミノ酸類に分類されることもある ０例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸塩とグルタミ ン酸塩、スレオニンとセリンとの孤立置換（ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｒｅｐｌａｃｅ ｍｅｎｔ）、またはあるアミノ酸と構造的に間違するアミノ酸との同様な同類置 換が、特に置換がポリペプチド類の活性部位のアミノ酸に間係していない場合は 、生物活性に対して大きな影響をもたないと予想するのが妥当している。 本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸類の重合体を指 し、生成物の特定の長さのものをさしてはいない、このため、ペプチド類、オリ ゴペプチド類およびタンパク質はポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。この 用語は、ポリペプチドの発現後の修飾物、例えばグリコジル化、アセチル化、ホ スホリル化等を指すものでなく、排除してもいない。この定義に含まれるものは 、例えばアミノ酸の一つ以上の類似体く例えば非天然アミノ酸等を含む）を含有 するポリペプチド類、置換結合ならびにこの技術で知られたその他の修飾を伴っ た天然および非天然のポリペプチド類等である。 本発明のタンパク質またはポリペプチド類は、慣用手段によって宿主細胞中に表 現され、細胞または培地から精製できる［サムプルツクら、「分子クローニング 実験マニュアル」、第２版、コールドスプリングハーバ−研究所、コールドスプ リングハーバ−、ニューヨーク（１９８９年）］。 本発明はまた、選ばれた宿主細胞中で異種遺伝子の発現を可能とするような、新 規なウィルス組替えポリヌクレオチド分子またはベクターに間する０本発明のこ のようなポリヌクレオチドベクターは、スフエロイジンまたはｔｋ遺伝子の全部 又は一部をコードしたポリヌクレオチド配列、選ばれたポックスウィルスからの ＲＮＡポリメラーゼ、および所望の異種遺伝子をコードしたポリヌクレオチド配 列を含めてなる。好ましくは、配列はＥＭＶスフエロイジンまたはｔｋ遺伝子の 調節領域を包含し、最も好ましくはプロモーター領域を包含する。更に、ポリメ ラーゼの給源はＥＭＶに限定されず、むしろ任意のポックスウィルスＲＮＡポリ メラーゼを利用できる。 従フて、ウィルスベクターは、を椎または無を椎の別のポックスウィルスによっ て寄与された他のウィルス要素を含有できるが、唯〜のＥＰＶ配列はＥＰＶスフ ェロイジンまたはｔｋ遺伝子配列、またはその断片の存在によって提供される。 多くの慣用的な発現ウィルスベクターおよび発現系が、この技術で知られている 。特に望ましいベクター系はを椎または無を推動物のポックスウィルスの　゛ベ クター類である。エントモポックスウィルスのスフェロイジンおよびｔｋ遺伝子 の調節配列は、これらの系の性能を強化するためにポックスウィルスＲＮＡポリ メラーゼを含有する他のウィルスベクター系で、例えばワクシニアベクター類で 使用できる０発現系全般を構築する方法、および発現ベクターと形質転換された 宿主細胞を含めたその構成分は、この技術の範囲内にある。一般的には、前掲サ ムプルツクらなどの標準テキストに記述された方法を参照のこと、従って本発明 は、本発明のポリヌクレオチド配列を挿入するための任意特定のウィルス発現系 またはベクターに限定されないが、但しベクターまたは系はポックスウィルスＲ ＮＡポリメラーゼを含有することを条件としている。 本発明のベクター類は、ヘルパー独立ベクター系を提供している。すなわち、要 素、例えばＲＮＡポリメラーゼをベクターに対し寄与している、ポックスウィル ス中の機能的スフエロイジンまたはｔｋ遺伝子の存在または非存在は、生ずる組 替えウィルスベクターの有用性に影響しない、スフェロイジンとｔｋの両方が必 須遺伝子でないから、本発明のウィルスベクターは任意の他のウィルスタンパク 質の存在を要しない、ヘルパー依存系においては、他のウィルス蛋白質は選ばれ た宿主細胞を共同感染するために、追加ウィルスの寄与によりもたらされる。 ウィルスベクターによって感染されたときに異種遺伝子の発現を可能とする選択 宿主細胞には、昆虫および哺乳類細胞が包含される。特定的には、ウィルスベク ターがエントモボックスウイリナ工科の任意の成員（例えば任意の種のＥＰＶ） へ挿入される本発明のＥＰＶスフエロイジンまたはｔｋ遺伝子配列を含めてなる 場合に、宿主細胞は通常、ＥＶＰで感染させた昆虫細胞に限定される。ウィルス ベクターがワクシニアや豚痘のような背椎動物ポックスウィルスへ挿入された本 発明のＥＰＶスフエロイジンまたはｔｋ遺伝子配列を含めてなる場合は、宿主細 胞は通常、野性型を推動物ポックスウィルスによって感染させた鴫乳類種の中か ら選定できる。最も望ましくは、このような哺乳類細胞はヒト細胞、げつし類細 胞および霊長ａ細胞を包含し、すべて当業者に知られ、人手できる。 従って、本発明の一つの面によれば、本発明のベクター類はＥＰＶスフエロイジ ンのポリヌクレオチド配列の断片、特に遺伝子の自然的高水準の発現を担当して いるプロモーター配列と補助的調節配列を利用できる。スフエロイジン配列が図 ２の配列［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１内に、より特定的には、ヌクレオチド＄２ ７８１〜３１９９　［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２２１の領域に見出されるのが望ま しい、この領域内のより小さな断片も、有用な調節配列を提供できる。所望のス フェロイジンプロモーター配列は、を椎または無を椎宿主細胞中で機能しうるウ ィルス発現ベクター中で、選ばれた異種遺伝子と機能し得る関係にこの配列を置 くことにより、多量の所望タンパク質をつくるために利用できる。 本明細書で使用される用語の「機能し得る関係」は、調節配列が適当な宿主細胞 中で複製とタンパク質発現の指令ができるような、調節配列と選ばれたタンパク 質遺伝子との閏の関係を定義するものである。当業者は慣用技術を用いて、この ような配列を機能し得る間係にすることができる。 ベクター中のスフエロイジンボリヌクレオチド配列が、異種遺伝子と関係づけら れた、または結合されたスフエロイジンコーディング配列の全部または一部を含 有する場合は、宿主細胞中で発現される生ずるタンパク質は、スフエロイジンタ ンパク質の全部または一部と異種タンパク質からなる融合タンパク質てありうる 。ベクター中のスフエロイジンボリヌクレオチド配列が、スフエロイジンタンパ ク賀またはペプチド断片の発現にと）で十分なコーディング配列を含有しない場 合は、異種タンパク質のみがつくられる。 同様な方法で、ｔｋのプロモーターおよび調節配列（図３　、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：８）は、選ばれた既知発現系において、異種タンパク質または融合タンパク 質の発現を行なわせるための発現ベクターの構築に使用できる。これらのｔｋｒ Ａ！！ｆｆ配列は、図３の配列［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８］　カラ、特にヌクレ オチド＃７５０〜８９０間の断片［５ＥＱ　ＩＤ　）１０：３０］中で得られる のが望ましい、この領域内のより小さな断片も、有用な調節配列を様供できる。 本発明のＥＰＶスフエロイジンまたはｔｋプロモーター配列を使用することの一 つの利点は、これらの調節配列がを椎ポックスウィルス（例えばワクシニア）− 鴫乳類細胞発現ヘクター系において機能し得るという点である。 例えば、強いスフエロイジンプロモーターを、相同組替えによってワクシニアウ ィルス系に絹込むことができる。 バクロウィルスポリヘトリン遺伝子用のプロモーターと異なり＋　ＥＰＶスフエ ロイジン遺伝子用のプロモーターは、ワクシニアや豚痘ウィルス発現系に直接利 用できる。 本発明に従フてベクターを構築するには、スフエロイジンまたはｔｋポリヌクレ オチド配列を単離し、選ばれたエントモポックスウィルス、例えばＡ＊ＥＰＶか ら精製し、適当な制限エンドヌクレアーゼ酵素で消化させると、スフェロイジン またはｔｋ遺伝子の全部または一部を含めてなる断片がつくられる。その代わり に、このような断片を化学的に合成できる。 またその代わりに、所望のＡｍＥＰＶ配列はプラスミドｐＲＨ５１２、ｐＭＥＧ ｔｋ弓またはｐＲＨ７を含有する細菌培養基から得られる。プラスミドｐＲＨ５ １２の構築は、下の実施例に記述されている。このプラスミドは、慣用のベクタ ーｐＵｃ９のＢａ５ａｌ　１部位へ挿入された４、５１　ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ断片 の＾−ＥＰＶＤＮＡ配列を含有している。プラスミドｐＲＨ７は、実施例１のと おりに得られるＡｗＥＰＶゲノムＤＮＡをＢｓｐ１２８６１で消化させ、生ずる 断片をＨａｅ　Ｕて消化させることにより構築された。　Ａ＠ＥＰＶＤ　Ｎ　Ａ を平滑末端化するのに７４ＤＮＡポリメラーゼが使用され、スフエロイジン遺伝 子を含有する断片は５ｅａｌで消化させたｐＵｃ９断片の大断片に連結される。 この断片は、Ｉ！１２の１１２２７４−６１８２　［ＳＥＱ　ｌ［Ｉ　ＮＯ：３ ３］のＲ囲のヌクレオチド配列内に含まれた、スフエロイジンのオーブンリーデ ィングフレームの全体と幾分のフランキング配列を含有している。ｔｋ遺伝子の 調節配列ならびに構造遺伝子を含めてなるブラスミＦ　ｐＭＥｃ、ｔｋ−１の構 築は、下の実施例８に記述されている。これは、Ａ■ＥＰＶのＥｃｏＲｉＱ断片 を慣用のベクターｐＵｃ＋８に挿入することによって構築された。 プラスミドｐＲＨ５１２、ｐＭＥＧ　ｔｋ−１、およびｐＲＨ７を含有する細菌 培養基は、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビル、バークローン・ドライブ １２３０＋のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され た。 寄託培養基は以下のとおりである。 培養基　呼出番号　寄託日 大腸菌ＳＵＲε菌株　ＡＴＣＣ６Ｂ５３２　９１年２月２６日（ス）ラタシ”− ン）　ｐＭＥＧ−ｔｋｌ大騙菌５ＵＲＥ菌株　ＡＴＣＣ６Ｂ５３３　９１年２月 ２６日（ストラタジーシ）　ｐＲＨ５＋２ 大ｉｉ　＠　５ＵＲＥｉｉ株　ＡＴＣＣ（ストラタノー−ｙ）　ｐＲＨ７ ブラスミト頚は標準手順を用いて、例えば透明溶菌・密度勾配平衡手順などを用 いて、寄託された細菌培養基から得ることができる。 これらのＡＴＣＣ寄託物は、３７　ＣＦＲｌ、＋４及び３５　ＵＳＣＩ２２の下 で特許庁長官により権原ありと認められた者は、本特許出願の係属中に、ｔｆ！ 養基を人手できることが保証されるという条件により寄託された。また、本出願 又はその子孫の対応特許出馴が提出されている国々の外国特許法で要求されるな らば、寄託物は人手できる。しかし、寄託物が人手できるからといって、行政行 為によって付与された特許権を損わしめて本発明を実施する権利を構成するもの ではないことを理解すべきである。 更に、本培養基寄託物は、ブタペストｅ生物寄託条約の規定に従って保存され、 一般の人々に入手可能とされる。すなわち、寄託物の試料提供に対する最も最近 の請求後少なくとも５年閘、かつとんな場合も、寄託門口から少なくとも３０年 間か、又は培養基を開示して発行される特許の権利行使可能な期間中、これらの 寄託物は、生育可能で汚染されていない状態に保つために必要なあらゆる配慮を もって保存される。要求を受けた受託施設が、寄託物の状態のために試料を供給 できない場合には、寄託者は寄託物を補充する＃ｌ務を認めるものである。本培 養基寄託物の一般への入手可能性に間するすべての制限は、これらを開示した特 許の付与に際して永久に取り除氷発明のベクター類の構築を記述する上で、本明 細書で言及された分子生物学手順は、標準的な良く知られた手順である。プラス ミドベクター類のｖ４Ｉ！と宿主生物の形質転換や感染に使用される種々の方法 は、この技術で周知である。これらの手順は、例えば上に引用されたサムプルツ クらに、すべて記述されている。従フて、微生物細胞からＤＮＡを抽出し、制限 防禦の消化を行ない、ＤＮＡ断片を電気泳動にかけ、プラスミドのテーリングと アニーリングを行ない、ＤＮＡを挿入し、連結させ、細胞を形質転換させ、プラ スミドＤＮＡを調製し、タンパク質を電気泳動にかけ、ＤＮＡの配列を決定する のは、遺伝子工学の当業者の技術の範囲内にある。 ＾−ＥＰＶゲノムは、スフェロイジンまたはｔｋプロモーター配列の制御下に選 ばれた遺伝子を位置特異的な形で効果的に導入するための、既知の独特の制限部 位をもフていないから、このような制限部位を選ばれたＥＰＶポリヌクレオチド 配列中の所望の部位に導入しなければならない０例えば、スフェロイジン遺伝子 の開始から下流のヌクレオチド１１３１７２に位置する独特のＢｓｔＢ１部位は 、クローニング用に使用可能な挿入配列を遺伝子工学処理するのに最も近い部位 である。従って、スフェロイジン遺伝子の間ＩＩｊＭｅｔに近い制限位置を、わ ざわざ挿入しなけれ制限部位の挿入法は当業者に知られており、中間シャトルベ クターを使用することを含み、例えば適当なりローニング・ビヒクルの部位にＥ ＰＶ配列をクローニングすることによる。スフエロイジンまたはｔｋ遺伝子とフ ランキングウィルスＤＮＡとが機能的に結送まれることを条件として、任意適当 なりローニングビヒクルを使用できることは、当業者に理解されよう。 スフエロイジンシャトルヘクターは、スフエロイジン構造遺伝子の要素、スフエ ロイジンプロモーターに隣接した、かつその制御下にあるウィルスゲノムへ、選 ばれた異種遺伝子が適切に挿入できるように、遺伝子内に位置するか導入される かするクローニング部位、およびスフエロイジンー外来遺伝子フランキング配列 を別の発現ベクターへ挿入しやすくするために、スフエロイジン遺転子のいずれ かの側に結合されるフランキングウィルスＤＮＡを包含するように構築できる。 フランキングウィルスＤＮＡの存在は、野性型エントモポックスウィルスとの組 替えをも容易にし、選択遺伝子のｍａウィルスゲノムへの移動を可能にする。 ｌ欠に、シャトルヘクターは、スフエロイジンまたはｔｋ合成をコートした配列 の幾分か、または全部を各々の転写開始位置の近くで削除することにより、選択 遺伝子の挿入のために修飾できる。スフエロイジン中のこのような部位の例は、 ヌクレオチド薯３０７７と３０８０てあり、ｔｋではヌクレオチド参８０９を包 含している。スフエロイジンまたはＬｋココ−ィング配列を削除するために慣用 手順を利用できる。 制限部位の代わり、または追加として、種々の合成または天然オリゴヌクレオチ ドリンカー配列を削除位置に挿入できる。ポリヌクレオチドリンカー配列は天然 または合成オリゴヌクレオチドであって、削除位置に挿入でき、この位置でのＤ ＮＡセグメントのカップリングを可能としている。一つのこのようなリンカ−配 列は、二つの結合された配列の閏、例えばプロモーター配列と完工１しようとす る遺伝子の間、に適当なスペースを提供できる。その代わりに、このリンカ−配 列は、所望により、慣用の化学的または酵素的方法によって選択的に切断ないし 消化できるようなポリペプチドをコートできる。例えば、選択された切断部位は 、エンテロキナーゼ、Ｘａ因子、トリプシン、コレゲナーゼおよびトロンビンの ようなタンパク分解酵素による切断用の部位を含めた酵素的切断部位でありうる 。その代わりに、リンカ−中の切断部位は選ばれた化学薬品、例えばシアノゲン ブロマイドやヒドロキシルアミンへ暴露すると切断できるような部位でもありう る。切断位置は、本発明の配列に有用なリンカ−中に挿入されるならば、本発明 を制限するものではない、この技術で知られた多くの任意所望の切断部位が、こ の目的に使用できる。もう一つの代替えとして、リンカ−配列は一つないし一連 の制限部位をコードしうる。 この開示の恩恵を受ける当業者には、適当な制限部位をもつリンカ−配列が、ス フエロイジン構造配列の全部ないし一部の代わりに挿入される必要のないこと、 および選ばれたポリペプチドをコードした配列とスフェロイジン構造配列の両方 が発現されるように、エントモポックスウィルスゲノム中の位置にリンカ−を挿 入できることが認められよう。例えば、選ばれたポリペプチドをコードした配列 を、ｔｋｋ造配列の全部ないし一部の代わりに、かつｔｋプロモーターの転写制 御下に、ｔｋｋ伝子に挿入できる。 慣用の制限部位をＥＰＶ　ＤＮＡへ導入するため、ならびにＥＰＶ　ＤＮＡの特 定ＩＮ域を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法も使用できる 。これらの手法は当業者に周知である０例えば、ｒ　ＰＣＲプロトコル：方法と 応用への指釧」　［エム・エイ・イエス（Ｍ、Ａ、　１ｎｎｉｓ）、ディー・エ ッチ・ゲルファント’　（Ｄ、Ｈ，Ｇｅ１ｆａｎｄ）、ジェイ・ジェイ・スニン スキー（，１−，１，５ｎｉｎｓｋｙ）およびティー・ジェイ・ホワイト（Ｔ、 Ｊ、　Ｗｈｉｔｅ）、（１９９０年）〕を参照。 これらの手法を用いて、選ばれた遺伝子やその一部を總込むための種々の代わり の修飾シャトルベクター類が、本発明に適切に利用できる。 従って、本発明の一つの態様として、上記のポリヌクしオチト配列は、迩ばれた ′ｉ４種遺伝子を選ばれたウィルスに伝達するだめのシャトルベクターとして使 用できる。 このｏ擾ては、ＥＭＶスフエロイジン遺伝子又はＥＭνｔｋ遺伝子、またはその 断片をコードしたポリヌクレオチド配列は、異種遺伝子に結合される。ポリヌク レオチド配列は更に、選ばれたウィルスへの容易な伝達を可能とするために、ス フエロイジンー異種遺伝子またはｔｋ−異種遺伝子のいずれかの側にフランキン グ領域を含有する。 生ずるこの構造体はカセットと呼ばれる。このようなフランキング領域はＥＰＶ から誘導されるか、またはその代わりに、標的ウィルスに相補的でありうる０例 えば、選ばれた異種遺伝子をワクシニアウィルスに挿入してｍｙえウィルスをつ くりたい場合に、標的のワクシニアウィルスに相補的なフランキング領域が利用 される。同様に、選ばれたＥＰＶｔ１節配列と異種遺伝子がＥＰＶ遺伝子自体の 配列によってフランキングされるように、異種遺伝子をＥＰＶスフェロイジンま たはｔｋ遺遺伝円内挿入する場合は、相同配列をもった野性型ＥＰＶをフランキ ング配列に伝達するために、このカセットを使用できる。 本発明のｔｋまたはスフエロイジン配列への外来遺伝子の挿入や連結、またはス フエロイジンやｔｋｋ伝子に異質のフランキング配列の連結は、上記のように達 成できる。本発明のベクター類は、外来遺伝子のｃＤＮ＾のクローンを使用でき る。なぜなら、おそらく感染が全く細胞質位置である結果として、ポックスウィ ルス遺伝子がイントロンを含有しないためである。 標準的なりローニング手法に従って、ａｊｌｌｌＩえ型のシャトルベクターをつ くる為に、任意の選ばれた遺伝子を利用可能な制限部位でベクターに挿入できる 。所望タンパク質の高い発現を得るために、事実上任意の興味ある遺伝子を、本 明細書に記載のベクター類に挿入できる０次に、スフエロイジンプロモーター配 列から下流で３′方向に位置する一つ以上の切断またはクローニング部位をもっ た好ましいスフェロイジンまたはｔｋシャトルベクターをつくるように、断片中 の制限部位を除去できる。このように、本発明は異種遺伝子の選択に限定されな い。 その代わりに、本発明のベクターは、タンパク賀の自然な処理を中断させるため の、ＥＭＶスフェロイジンまたはｔｋタンパク質をコードした配列の全部または 一部へ挿入された異種遺伝子を含めてなるものでもよい、しかし、野性型スフエ ロイジンまたはｔｋ遺伝子を含有する別のウィルスにベクターを伝達する時は、 挿入された異種遺伝子の発現が得られる。このため、エントモポックスウィルス のスフエロイジン遺伝子（図２、ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：１）および／またはｔｋ 遺伝子（図３、ＳＥＱ　１０　ＮＯ：８）は、上記の発現系の任意のものにおい て、外来のまたは異種ＤＮＡの挿入用の位置として使用できる。こうして構築さ れるシャトルベクターは、選ばれた発現系へうまく組込まれた異種遺伝子の存在 を確認するための研究および生産技術のマーカーとして有用である。 ｔｋ遺伝子は選ばれた異種遺伝子の挿入用に特に望ましい部位である。スフエロ イジンと異なり、ｔｋは感染の初朋に、より少ない量でつくられる。そのほか、 多くのポックスウィルスが、容易なｗｉ替えを提供するＥＰＶ　ｔｋに対して十 分に相同であるｔｋ遺伝子をもっている。 例丈ば、哺乳ｇ細胞用のワクシニアウィルス発現系において、ワクソニアｔｋ遺 伝子は共通の挿入部位である。 従って、この遺伝子の使用は、直接にベクター系の閏の選ばれた遺伝子をシャト ルするための、シャトルベクターの構築に特に望ましいものである。より特定的 には、外来遺伝子はヌクレオチ）”１１４６０と＄１５６０　（図３を１１照） の間のＥＰＶｔｋ遺伝子配列へ挿入されるのが望ましい。 外来遺伝子を含有するカセットの野性型ポックスウィルスへの挿入は、相同的組 替えによって達成できる。興味ある遺伝子を本発明のウィルス類へ挿入するため に用いられる相同的組替え手法は、当業者に周知である。シャトルベクターは、 野性型ウィルスと一緒に宿主細胞へ共同感染させた時に、相同的組替えによって 、選ばれた遺伝子を含有するカセットをウィルスに伝達し、それによって１ＩＩ ｖえウィルスベクターをつくりだす。 選ばれた遺伝子の発現は、適当な成長培地中で、感受性のある宿主昆虫細胞を本 発明の朝替えウィルスベクターで感染させることによって達成される。　ＥＰＶ 発現ベクターは、感染性ウィルス粒子の複製と集合により、昆虫細胞や昆虫中で 増殖する。これらの感染性ベクター類は、適当な昆虫細胞中で選ばれた遺伝子を つくるのに使用でき、こうして感染細胞中の選ばれたＤＮＡ配列の効率的な発現 が容易になる。上記と同じ方法によってＥＰＶスフェロイジン遺伝子（またはｔ ｋ遺伝子）−異種遺伝子断片をを推動物ポックスウィルスに挿入する場合は、絹 替えウィルスは哺乳類細胞を感染させて、哺乳類細胞中に異種タンパク質をつく るのに使用できる。 例えば、ワクシニアウィルス系のｔｋ部位に挿入された遺伝子は、本発明のエン トモポックスウィルスベクターのｔｋ位置に直接伝達でき、またその逆も可能で ある。 このシャトリングは、例えば相同的組替えを用いて達成できる。同様に、ウィル スベクター中のスフエロイジン遺伝子またはｔｋ遺伝子への選ばれた遺伝子の挿 入によって、遺伝子は相同のそれぞれスフエロイジンまたはｔｋ配列をもつ他の ウィルスへシャトルできる。 以下の説明は、異種遺伝子としてヒトβ−インターフェロン（ＩＦＮ−β）の合 成をコードした遺伝子を使用しての、本発明の例示的なベクターを示す、　ＩＦ Ｎ−β遺伝子を含有するＤＮＡ断片は、制限酵素で慣用的に５ｌｌｉ１され、消 化又は末端平滑化されて、ＡｍＥＰＶスフエロイジン遺伝子中の転子な部位にク ローン化され、この中に制限部位が上記の方法によって遺伝子工学的に入れられ た。 ＩＦＮ−β遺伝子の挿入は、上記のようにスフエロイジン遺伝子の一部のみが削 除される場合は、融合ポリペプチド生成物を生産できるような、ハイブリッドま たは融合スフエロイジンーＩＦＮ−β遺伝子をつくる。スフエロイジン構造配列 の全体を削除する場合は、インターフェロンのみが生産される。更に、ハイブリ ッド遺伝子はスフエロイジンプロモーター、ＩＦＮ−βタンパク質をコードした 配列、およびスフエロイジンタンパク質のポリペプチド配列の一部をコードした 配列を含むものでありうるが、但しこのようなコーディング配列全部が利用され る特定シャトルベクターから削除されるわけではない。 生ずるシャトルベクターは、ＩＦＮ−β遺伝子にカップリングされた＾−ＥＰＶ のスフエロイジン遺伝子配列を含有する０次に、組替えシャトルベクターのハイ ブリッドスフェロイジン−ＩＦＮ−β遺伝子は、好ましいエントモポックスウィ ルス＾−ＥＰＶのような適当なエントモポックスウィルスのゲノムに伝達されて 、宿主昆虫細胞中でβ−インターフェロンをコードした遺伝子を発現できる朝替 え型のウィルス発現ベクターを生ずる。野性型ウィルスへのハイブリッド遺伝子 の伝達は、当業者に周知の方法によって達成される０例えば、適当な昆虫細胞を 野性型エントモポックスウィルスで感染させることができる０次に、これらの感 染細胞は本発明のシャトルベクターでトランスフェクトされる。これらの手順は 、例えばｒＤＮＡクローニング：実際的な方法」第■巻［ディー・エム・グロー バー（Ｄ、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ）編、第７章、１９８５年］に記述されている。 当業者は本発明に従って使用される適当な昆虫細胞を選択できる０例として、ヒ トリガ幼虫（ｓａｌｔ■ａｒｓｈ　ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）と培養されたマイ マイガ（ｇｙｐｓｙ　＠。 ｔｈ）細胞を使用できる。 トランスフェクション後のＡ■ＥＰＶＤ　Ｎ　Ａの複製中に、ハイブリッド遺伝 子は絹替えシャトルベクターと＾■ＥＰＶＤＮＡとの間での相同的組替えによっ て、野性型＾■ＥＰＶに伝達される。従って、ＩＦＮ−β遺伝子を発現できる野 性型、非線替え型ＥＰＶおよび絽替え型ＥＰＶを含めてなる混合物がつくられる 。 トランスフェクションがハイブリッド遺伝子のＥＰＶゲツムへの転移に好ましい 方法であるが、ＥＰＶゲノムへの遺伝子の挿入を行なうために、他の手順も適切 に利用できること、およびハイブリット遺伝子配列と他の株の対応する配列との 間にａｌｌＩＩＩえが起こるほどに十分な相同がある限り、絹替えをシャトルベ クターと他のＥＰＶ株（または他のポックスウィルス）との閏て絹替えが達成で きることは、当業者に理解されよう。 Ｉ欠に、ＡｗＥＰＶゲノムへ組込まれたハイブリッドスフェロイジン〜ＩＦＮ− β遺伝子を含めてなる好ましい組替え型Ａ厘εＰν発現ヘクターは、非線替え型 と絹替え型のエントモポックスウィルスの混合物から選択できる。好ましいが唯 一でない選択方法は、ウィルス閉鎖体（ｖｉｒａｌ　ｏｃｃｌｕｓｉｏｎｓ）を 生しないウィルスで感染させた宿主昆虫細胞によってｔａされるプラークをスク リーニングするものである。、！ｌ択がこの方法で行なわれるのは、異種遺伝子 によって中断されたスフエロイジンまたはｔｋタンパク質ココ−ディング配列含 有する組替え型ＥＰνウイルスが、スフェロイジン遺伝子の挿入失活のためウィ ルス閉鎖体の生産に欠陥があるためである。 また、選択手順は、色遍択を容易にするために、β−ガラクトソダーゼ遺伝子の 使用を伴い得る。この手順は、大ｉｉ′ｇｉβ−ガラクトンダーゼ遺伝子のシャ トルへフタ−への絹込みを伴い、当業者に周知である。この手法は、なおもスフ エロイジン遺伝子が発現されるように外来ＤＮＡをｔｋβ遺伝子挿入する場合に は、特に１ｒｉｉがある。 本発明に従フて、代わりの選定手順も利用できることは、当業者に理解されよう 。 従７て、次に組替え＾謬ＥＰＶベクターが適切な位置に選ばれた遺伝子の挿入体 をもっていることを確認するために、朝替えウィルスからのＤＮＡを精製し、適 当な制限酵嚢またはＰＣＲ手法で分析する。 本発明によって提供されるベクター類および方法は、既知ベクター類およびベク ター系に対する幾つかの利点を特徴としている。従って、本発明のこのようなＥ ＰＶウィルスベクター類は哺乳類で発癌性でも腫瘍発生性でもない。また、アム サクタ・モオレイ・エントモポックスウィルス（ＡＪＥＰＶ）遺伝子の発現を支 配する調節信号は、ワクシニアウィルスのそれと類似している。従って、強く発 現されるスフエロイジン遺伝子やチミジンキナーゼ遺伝子を発現カセットとして 、昆虫細胞中だけでなく、ワクシニアウィルスと豚痘ウィルスのようなを椎ポッ クスウィルス用に伝達することは可能である。 ワクシニアウィルス、ヘルペスおよびバクロウィルスのベクター系での報告デー タは、ベクターの生存可能性を混乱させずに３０　ｋｂまて伝達できることを示 唆しており、これらの報告データに基づいて、ウィルス中にパッケージできる外 因性ＤＮＡ量に対する通常の制限は、本発明の新規なＥＰＶベクター類と方法を 使用する時には、ぶつからないものと予想される。 もう一つの利点は、本発明の新規なベクター類にとって、外来タンパク質の転写 と翻訳が全面的に細胞質性という点である。もう一つの利点は、ＥＰＶスフェロ イジン調節配列の発現力にある。これは、本発明のベクター中で異種遺伝子と機 能できる関係で居る時に、選ばれた宿主細胞中で高水準の異種タンパク質の発現 をもたらすものである。 本発明のＥＰＶベクター類と、上記のように、昆虫または哺乳類細胞中で選ばれ た異種タンパク質を発現するためにこれらを使用する方法は、昆虫細胞中での複 製の利点を特徴としている。すなわち、哺乳類ウィルスの使用を回避し、それに よって哺乳類ウィルスによる生成物の汚染の可能性を低下させている。本発明の 発現系は、ヘルパーから独立したウィルス発現ベクター系でもある。 これらの二つの特性は既知のバクロウィルス発現系によって共有されている。し かし、表１に示すように、本発明のベクター類を使用するＥＰシ発現ベクター系 （ＥＥＶＳ）は、バクロウィルス発現系（ＢＥＶＳ）に比べて、趨つかの重要な 区別する特徴をもっている。 」」 ＥＥＶとＢＥＶＳト（７）差 ＥＥＶ　ＢＥＶＳ 複製部位　細胞質　核 つィルス科　ボックスウイリ　バクロウイリダエ　ダニ 外来遺伝子の　スフェロイジン　ポリヘトリン挿入部位　＆チミジンキナ　＆　 Ｉ）１０−ゼ（ｔｋ） を推動物と昆虫　あり　哺乳類対応なし系との閏のシャ　（オルトボックス　バ クロウィルストルの可能性　ウィルス）（レボリ　はｔｋβ遺伝子含ポックスウ ィルス）有することは知 （スイボ・ンクスウ　られていない。 イルス）（アビボッ　ポリヘトリンは クスウイルス）　哺乳類系で見ら れない。 本発明は、異種遺伝子の挿入のための組替え宿主細胞のスクリーニング方法を提 供している。これは、本発明の朝替えウィルスポリヌクレオチド分子を使用して 提供される。 ウィルス分子は、全部未満のエントモポックスウィルスのスフェロイジンタンパ ク質をコードしたポリヌクレオチド配列に結合された、選ばれた異種遺伝子配列 を含有している。異種遺伝子は完全なコーディング配列の非存在下にスフエロイ ジンまたはｔｋｌ１ｍ配列に結合されるか、またはスフエロイジンまたはｔｋ遺 伝子コーデイング配列に挿入されて、コーディング配列を混乱させる。 組替え型ベクターで感染させたＩＩ胞は、未融合タンパク質またはスフエロイジ ン配列の一部との融合タンパク質としての異種タンパク質の発現に適した条件下 に培養される。ＮＩ傷のスフエロイジンタンパク質の発現によフて通常形成され る閉鎖体が存在しないことは、異種遺伝子の組込みを示している。 ウィルスベクターが同様に、不完全又は中断されたεＰＶｔｋコーディング配列 を含有した場合は、不活性チミジンキナーゼ配列の組込みによって生ずるチミジ ンキナーゼ機能（例えばメトトレキセートまたはその類似体への耐性）が存在し ないことは、異種遺伝子の挿入を示している。 その代わりに、親ウィルスがそのｔｋまたはスフエａイジン遺伝子の一部を削除 され、次いで外来遺伝子に融合される無傷のｔｋまたはスフエロイジンを含有す るウィルスベクターと混合される場合は、組替え物はそれぞれメトトレキセート 耐性を発現するか、または閉鎖体を生じ、こうして活性ｔｋまたはスフエロイジ ン遺伝子と外来遺伝子の絹込みを示す。 上記の選定手順は、組替え型のエントモポックスウィルス発現ベクターの選定に 効率的で好都合な手段を提供している。 本発明のもう一つの態様は、昆虫防除のために本発明の新規なＥＰＶ発現系を使 用するものである。害虫の防除は、上記のように本発明のベクター類と方法を使 用して達成される０例えば、選ばれた昆虫毒素をコードした遺伝子が、スフェロ イジンまたはｔｋｌ１節配列の制御下に、ウィルス発現ベクターに挿入されるか 、または相同フランキング領域をもった選ばれたウィルスへの組替えを目的とし た２１１の遺伝子の一方の内部に挿入される。 昆虫毒素をコードした遺伝子は、当業者に周知である。 バチルス・チューリンゲンシス（Ｂ、ｔ、）から単離された例示的な毒素遺伝子 が、本発明に従って利用できる。Ｂ。 ｔ、遺伝子は、例えば米国特許第４，７７５，１３１号と第４，８６５，９８１ 号に記述されている。その他の既知の毒素も、本方法に使用できる。 生ずる毒素遺伝子含有のＥＰＶベクターは、標的の害虫やその環境に施用される 。有利には、ウィルスベクターは標的害虫に感染させると、多量の毒素がつくら れ、こうして害虫防除をもたらす、毒素を発現させるのにエントモポックスウィ ルスのスフエロイジン遺伝子の調節配列を使用すると、特に多量の毒素タンパク 質を生産できる。 その代わりに、スフエロイジン遺伝子を無傷のままにしておき、毒素遺伝子をｔ ｋ遺伝子のような異なるエントモポックスウィルス遺伝子に挿入できる。この構 造体では、毒素はこの系によって生産され、次にスフエロイジン天然ウィルス生 産によって効率的に被覆ないしカプセル化される。この系は、標的害虫への利用 性を持続させる環境中で有利に存続する毒素を生産する。 ここに記載の新規なエントモポックスウィルス発現ベクターとそれらの使用法の ほか、本発明は、哺乳類ポックスウィルス属を通じて機能出来る、新規なキメラ ワクシニアおよび膠層ワクチンおよび発現系を構築するための、エントモポック スウィルスからの新規な調節要素の使用に間する０本発明のポリヌクレオチド配 列は、ワクチン類の有効性を強化するためにウィルスワクチン類、例えば既知の ワクシニアウィルスワクチンと共に使用できる。このようなワクチンは、哺乳類 の狂犬病その池の感染性病気の抑制に使用されることが記載されている。 特定的には、哺乳類宿主で選ばれたタンパク質を生体内発現するのに使用される 既知ウィルスベクター類へ、ＥＰ■スフェロイジンプロモーター配列を導入する ことは、ウィルスワクチン中のタンパク質の発現を高める強力なスフエロイジン プロモーターを可能とすることが期待される０本発明のこの面は、バクロウィル ス発現系（ＢＥＶＳ）を含めた他の発現系に対する相当な改善を提供している。 以下の実施例は、本発明を実施するための最善の態様を含めた組成物および手順 を例示している。これらの実施例は限定的に考えられてはならない、他に注意が なければ、百分率はすべて重量、および溶媒混合物割合はすべて容量による０本 明細書に開示された制限酵素は、ベテスダ研究所（メリーランド州ゲイサーズバ ーグ）またはニューイングランド・バイオラブ（マサチューセッツ州ビバリー） から購入できる。１１素は、供給者から提供された指示に従って使用される。Ｄ ＮＡポリメラーゼのフレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼは、ニューイングランド・バイオラブとプロメガから得られた。 実施例Ｉ　Ａｇ＋ＥＰＶＤ　Ｎ　Ａの調製＾■ＥＰＶの複製はすでに記述されて いる［アール・エッチ・グツドウィン（Ｒ，Ｈ，Ｇｏｏｄｗｉｎ）ら、Ｊ、１ｎ ｖｅｒｔｅｂｒ、　Ｐａｔｈａｔ、　５６巻＋９０−２０５頁（１９９０年）］ 、マイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉ＠ｄｉｓｐａｒ）　ＩＩ胞系統ＩＰｔ、８−Ｌ Ｄ−６５２［米国ＪＩ務省、農業研究サービス、昆虫病理研究所、メリーランド 州ベルツビル］は、ｌＯ％牛脂児血清、ペニシリン１００単位、および−１当た りストレプトマイシン１００μｇを補充したＥＸ−ＣＥＬＬ　４００　［ＪＲＨ バイオサイエンス、カンザス州しネクサ］中で、２６−２８℃に保持された。他 の昆虫細胞系統は当業者に周知であり、本発明に従って使用できる。 細胞培養向けのＡ■ＥＰＶ接種物は、−７０℃に保存された触ＥＰＶ感染し凍結 乾燥したエスチグメネ・アクレア（Ｅ、　ａｃｒｅａ）幼虫からのものである［ アール・エッチ・ホールら、Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、　１１０巻？？−９０頁 （１９９０年）】、幼虫を粉砕し、メラニン化防止のためにシスティンＭＣＩ　 （０，００３ｇ＞を加えておいた、ＥＸ−ＣＥＬＬ　４０　（ペニシリンとスト レプトマイシンを有しているが、牛胎児血清を含まないもの）５■１中で柔らか にした。粉砕物を２００ｘｇで５分間ペレット化し、上１み液を孔径０．４５１ のフィルターに通した。 マイマイガ細胞は、集密的細胞単層形成前（ｐｒｅｃｏｎｆｌｕｅｎｔ　５ｏｎ ｏｌａｙｅｒ）の細胞に接種物（細胞当たり約０．１〜ＩＰ川を添加することに より、ＡｌＥＰＶで感染させ、第１日のあいだ皿を時々かきまぜた。感染後５− ６日に感染細胞を取り入れた。 ＾−ＥＰＶＤ　Ｎ　Ａは、２方法の一つによって感染細胞からｐｉａｓされた。 第一の方法は、アガロースプラグ内に埋め込まれた感染細胞の現場消化を行なう もので、このあと放出された細胞およびウィルスＤＮＡはパルスフィールド電気 泳動によって分離された［バイオラド社、ＣＨＥＦ−１＋−ＯＲシステムコ、　 ＩＰＬ８−ＣＤ−６５２１１胞を第一継代細胞培養の＾ｍＥＰＶで感染させた。 感染後６日に２００ｘｇで５分間の遠心分離によって感染細胞を取り入れ、すす ぎ、変更されたバンク燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。これはＬ当たり １５８のブドウ糖を含有したが、Ｃａ”やＭ　ｇ　２°を含有しなかった。 アガロースプラグへ感染細胞を埋め込むために、１％ジープラークＧＴＧアガロ ース（変更ハングＰＢＳ中で＊ａされ、３７℃で平衡化したもの）を感染細胞と ｌ：ｌで混合すると、０．５％アガロース中の一１当たり５ＸＩＯ’個の細胞を 生ずる。ＤＮＡを放出させるための消化は、−１中１％サル：２　シル／　０． ５Ｍ　ＥＯＴＡ／プロテイナーゼＫ１ｍｇ中、５０’Ｃテ２日閏、挿入物を穏や かに振とうすることによって行なわれた［シーーｘル・スミス（Ｃ，Ｌ、　Ｓｓ ＋１ｔｈ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｇ＋ｏ１．　１５１巻４６１−４８９ 頁（１９８７年）］、ＤＮＡ分離用のＣＨＥＦ−ＩＩ−ＤＲバーｙｙｌ−ターは １８０Ｖ、パルス比ｌ、パルス時間初期５０秒、最終９０秒、および４℃２０− ２５時閏の操作時間であった０分離用ゲルは０．５Ｘ　ＴＢＥＩＩ衝液［前掲サ ムプルツクら］中の１％５ｅａＫｅ■ＧＴＧアガロースであった。ウィルスＤＮ Ａバンドはエチジウムブロマイド染色によって視覚化され、電気溶離された［ダ ブりニー・ビー・アリントン（Ｗ、Ｂ、ＡｌｌｉｎＡｌｌｌｎら、Ａｎａｌ、Ｂ ｉｏｃｈｅｖ、８５巻１８８−１９６頁（１９７８年）］００回されたＤＮＡは 、エタノール沈殿後プラスミドクローニングに使用された。 ウィルスＤＮＡ！１ｕｌｌの第二の方法は、感染細胞培養基上澄み液中に見出さ れる細胞外ウィルスを使用した。１０日日閏細胞培養基からの上澄み液は、２０ ０ｘｇで５分間の遠心分離によって透明化された。ウィルスは、＋２．ＯＯＯｘ ｇでの遠心分離によって、上澄み液から回収された。ウィルスペレットをＩｘＴ ε（６ｍｌ）に再懸濁した＊　ＤＮａｓｅ　ｌとＲＮａｓｅＡ（それぞれ１０お よび２０ｔＩｇ＃ｌ最終濃度）を加え、混合物を３７℃で３０分培養した。混合 物を５０℃に１５分加熱した。 次に、ＳＯ５とプロテイナーゼＫ（それぞれ１％と２００ｕｇ／＋ｗ１）を加え た。サンプルを５０℃に一夜培養し、緩衝液で飽和したフェノールで３回、およ び５ＥＶＡＧ　［前掲サムプルツクら］で１回抽出した。ＤＮＡをエタノール沈 殿させ、Ｉｘ　ＴＥ（ｐＨ８）に再懸濁した一 通常のウィルス定量の為には、適当なウィルス希釈液（未補充ＥＸ−ＣＥＬＬ　 ４（１０中テｒＲ１１＞１ｍｌヲ、６０　ａｍ培養血中の集密的細胞単層形成前 の細胞に、２６−２８℃で５時間の吸着期間にわたり、間欠的にかきまぜながら 添加した。ウィルス接種物を除去し、２ｘ　ＥＸ−ＣＥＬＬ　４００でＩＩ！ｕ ３７℃で平衡化した５−１の０．７５％５ｅａＰＩａｑｕｅアガロース［ＦＭＣ バイオプロダクツ、メイン州ロックランド］オーバレイを単層に添加した。２６ ℃で５８閏の培Ｉ後、立体ＩＩＩ微鏡検鏡検査ラークを視覚化した。 いずれかの方法で調製されたＤＮＡを、次に種々の制限エンドヌクレアーゼ酵素 、例えばＲａｍ　Ｈｌ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｍ、Ｐ　ｓ　ｔ、　ｌおよびＸｈ ｏｌで切断すると、図１の物理的＃！！図に示す種々の断片が生じた。以下、各 制限断片について述べる場合は、酵素と相当する文字で、例えばＢａｓ　Ｈｌ− ＾からＲａｍ　Ｈｌ−Ｅ、　ＥｃｏＲｌ−ＡからＥｃｏＲｌ−５のように表わす 。 実施例２　スフェロイジン遺伝子の単離スフェロイジン遺伝子の場所を限定する 為に、感染毛虫からの閉鎖体（ＯＢ）の精！！製剤を溶解化し、４％アクリルア ミドスタッキングゲルと７．５％分離用ゲルとで、ドデシル硫酸ナトリウム・ポ リアクリルアミドゲル電気線ｆｉ　＜５０５−ＰＡＧＥ）にかけた［ジエイ・ケ イ・ラエムリ（」。 に、Ｌａｅｗｗｌｉ）、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）２２７巻６８０−６８５頁（ １９７０年）］、タンパク質ミクロシークエンシング用のスフェロイジンのｇ４ 製に使用されるアクリルアミドをＡＧ５０１Ｘ８樹Ｎ［バイオラド社、カリフォ ルニア州すッチモノド］て脱イオン化した。ゲルを４℃で一夜重合化した。サン プル調製には、１２５　ｗＭ）リス−ＨＣｌ　（ρ）ｌ　６．８）、４％５０５ 　（讐／ｖ）、１０％β−メルカプトエタノール（Ｖ／Ｖ）および２０％グリセ ロール（ｖ／ｖ）からなる２Ｘ　Ｌａｅｍｉ＋Ｉｉサンプル緩衝液を使用した。 ＯＢ懸ｌＩ液サンプルを２ｘラエムリサンプル緩衝液でｌ：ｌ希釈し、５分間沸 騰させた。　ＯＢタンパク貢＊ａ物の幾つかのレーンを電気泳動で分離した。ス フェロイジンタンパク質（１１３にＤａ）は、ＩＩＩ！　０８の優勢的なタンパ ク質であった。　５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル内のスフエロイジンを、過ヨ ウ素酸−シッフ染色［アール・エム・ザカリアス（Ｒ，Ｍ、Ｚａｃｈａｒｉｕｓ ）ら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｗ、　３０巻＋４９−１５２頁（１９６９年）コ によってグルコシル化について試験した。 電気泳動分離法に続いて、未染色ゲル中の幾つかのレーンを、ｌＯ−一モルホリ ンブロパンスルホン酸くｐＨ６，０）と２０％メタノールからなる緩衝液中で、 ９０Ｖのバイオラド製トランスプロット装置で２時間、イモビロンボリビニリデ ンジフロライド（ＰＶＤＦ）膜へ移した。スフエロイジンをクーマシー青色染色 によってＰＶＤＦ膜上で視覚化した。 スフエロイジンを含有するＰＶＤＦ膜の領域を膜から切除し、アプライド・バイ オシステムズ社の気相配列決定装置で直接的タンパク賀ミクａシークエンシング を行なった。無傷のタンパク質のミクロシーフェンシングは、恐らくタンパク質 のＮ末端が封鎖されているために不成功であフた。 ＰＶＤＦ膜から溶離されたスフェロイジンサンプルに対し臭化シアン切断を行な うと、配列決定用の内部ペプチド断片が生じた。１５．９．８．および６．２　 ｋＤａの主要ペプチド類がつくられた。 実施例３　配列決定、ハイブリッド形成りＮＡ配列決定はスヘテ、［ａ−”Ｓ］ ｄＡＴＰとシー’ｙｚ＋−ゼ〔ＵＳバイオケミカル社、オハイオ州クリーブラン ド〕でのジデオキシチェインターミネータ−法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　 ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）　［エフ・サンガー（Ｆ、　Ｓａｎｇ ｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４巻５４６３ −５４６７頁（１９７７年）コによって行なった。シークエナーゼによる標準的 な配列決定反応は、供給者のＵＳバイオケミカル社の指示によりて実施された。 信頼性のあるアミノ酸配列は、実施例３に記述されたとおりにつくられる９、８ 、および６．２　ｋＤａポリペプチド類から得られた。８および９　ｋＤａのポ リペプチド類は重複する部分的ＣＮＢｒ切断生成物を表わしており、これらは− 緒に、次のような最も長い連続したアミノ酸配列を生じた。　Ｎｅｔ−Ａｌａ− （ＡｓｎまたはＡｒｇ）−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｃ！ｌ Ｉ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−（ＡｓｎまたはＡｒｇ）−（？）−Ｔｙｒ−Ｖａｌ　−（ Ａｓｎ？）−ｌ　Ｉｅ−Ｇｌｕ−１１ｅ−＾５ｎ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ｖａｌ−（ ？）−（Ｇｌｕ？）［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３４］　、６゜２　ｋＤａの断片か ら得られたアミノ酸配列は、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｔｈ　ｒ−Ｓｅ　ｒ−５ ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇ　１ｕ−Ｖａ　ｌ　−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−Ｖ ａ　Ｉ　−（Ｔｈｒまたは１ｌｅ）−Ｓｅｒ−（Ａｓｎ？）［ＳＥＱ　１０　Ｎ Ｏ＋３５］を生じた。１５ｋＤａの断片の部分的な配列も得られたａ　（Ａｓｎ ？）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−（Ｐｈｅ？）（Ａｓｎ？）−Ｖａｌ−Ｐｈｅ　 Ｃ３ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６］　、上の配列での疑問符は未決定または未確認ア ミノ酸類を示す、すべての配列は究極的にスフェロイジン遺転子配列内に置かれ た。 実施例４　プラスミドｐＲＨ５１２ Ｂ３１１［ＡｍＥＰＶＤ　Ｎ　Ａライブラリーは、メーカーの指示に従って、ア ノミック４厘ＥＰＶＤ　Ｎ　ＡをＢｇｌ■で消化させて調製された。プラスミド ｐＵｃ９　［ＧＩＢＣＯ社、ベテスダ研究所］を８３℃旧で消化させ、ホスファ ターゼ処理した。ゲノミックｅｇ＋ｎで切断したＡａ＊ＥＰＶを、ｐＵｃ９のＢ ａｇ　８１部位にショットガン法でクローン化した。大腸菌５ＩＪＲＥ　［スト ラタジーン社、カリフォルニア州うホラ］は、種々の組替え用プラスミドを含有 するショットガン連結反応についてメーカーから提供された指示に従い、バイオ ラド製遺伝子パルサー装置での電気穿孔法（エレクトロポレーション）によって 形質転換された。プラスミド類のミニ製剤は、慣用のアルカリ溶菌手順［前掲サ ムプルツクら］にょって行なった。これらのプラスミド類は、挿入体を放出させ 、ゲル上で走らせるために、ＥｃｏＲＩ−５ａｌｌで切断された。 生ずるプラスミドＤＮＡをナイロン膜に対してサザンブロツティング処理すると 、幾つかのクローンを生じた。 ゲノミックＤＮＡの制限酵素消化から生ずる断片のうちに、４．４８ｇ１　ＩＩ 断片とＥｃｏＲＩ−Ｄ断片があった。上でつくられる中から望ましいクローンを つきとめるために、６゜２　ｋＤａ　ＣＮＢｒ断片に由来する配列を使用して、 クローン内のスフェロイジン遺伝子をつきとめるためのハイブリッド形成プロー ブとして使う縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチドを設計した。　 ＲＭ５８と呼ばれるこのプローブのヌクレオチド配列［ＳＥＱ　１０　ＮＯ＋１ ２１は、ＧＡ５ＧＴ７ＧＡ６ＣＣ７ＧＡ５Ｔ＾６ＧＴてあり、ここで５はＡまた はＧを表わし、６はＣまたはＴを、７は＾、Ｇ、　Ｃ１または丁を表わす、プロ ーブのペプチド配列は、Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｖ ａｔ　ＣＳＥＱ　Ｉ（ＩＮＯ：３７］であった・ ＤＮＡプローブの放射性標識は、無作為オリゴヌクレオチド延長法［エイ・ビー ・フエインバーグ（Ａ、Ｐ、　Ｆｅｉｎｂｅｒｇ）ら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、１３２巻６−１３　（１９８３年）］によって［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで、 または［γ−３２ＰＩＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ［前掲サムプルツ クらコで行なわれた。 これらの同じ手順は、下記の他のすべてのオリゴヌクレオチドプローブについて も使用された０両タイプのプローブは、セファデックスＧ〜５０のスパンカラム 内の通過によって精製された。 サザントランスファーは、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ　［アマ−ジャム］によって行なわ れた。移されたＤＮＡはＵｖ交差架偶によ７て膜に固定された。サザンハイブリ ッド形成は、上記の制限断片を包含する移されたＤＮＡで、また上記のように８ ａ園Ｈ１消化されたプラスミドρυＣ９ヘクローン化されたＡｍＥＰＶＤ　Ｎ　 ＡのＢｇｌ　ＩＩライブラリーで行なわれた。オリゴヌクレオチドプローブとの ハイブリッド形成は、３７℃または４５℃で、ＢＬＯＴＴＯ［前掲サムプルツク ら］で行なわれ、続いて０．３Ｍ　ＮａＣｌ−０，０６Ｍ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ８ ）−２ｍＭ　ＥＤＴＡで室温で５分閏２回の洗浄を行なった。 ＲＭ５８ブｏ−７［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１２］　ハＡｍＥＰＶＤ　Ｎ　Ａ（７ ）４．４　ｋｂＢｇｌＩＩ断片とＥｃｏＲＩ−Ｄ断片とハイブリッド形成したＥ ｒＭｌを参照］、ショットガンクローニングでつくられたプラスミド、すなわち 組替えｐＲＨ５１２（スフエロイジン遺伝子の５′末端の約１．５　ｋｂを含有 するρυＣ９のＢａｍ　８１部位へ挿入されたＢｇｌＩＩ　４．５６　ｋｂ断片 ）も、ＲＭ５８オリゴヌクレオチド［ＳＥＱ　１０　ＮＯ＋１２］とのこのハイ ブリッド形成によって確認された。 ４．５　ｋｂのｐＲＨ５１２Ｂｇｌ　ＩＩ挿入体を単離し、上記のように放射性 標識をつけ、次のように種々のＡｍＥＰＶゲノム消化物に戻しハイブリッド形成 を行なった。ＤＮＡ−ＤＮＡのハイブリッド形成は、６５℃でＢＬＯＴＴＯ［前 掲サムプルツクら］と行ない、続いて室温で５分閏、０．３Ｍ　ＮａＣ１−０， ０６ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）−２璽Ｍ　ＥＤＴＡでの２回の洗浄、６５℃で０．４ ％ＳＯＳを添加して各１５分間２回の洗浄、および室温で０．３Ｍ　ＮａＣ１− ０，０６Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）４園門εＤＴＡでの２回の洗浄を行なった。 ハイブリッド形成はＡｍＥＰＶＤ　Ｎ　ＡのＢａｇ＋　Ｈｌ−Ａ、　ＥｃｏＲｌ −Ｄ。 Ｈｉｎｄｍ−Ｇと−」、Ｐｓｔｌ−Ａ、およびＸｈｏｌ−８断片に見られた。 これらのハイブリット形成の結果は、ｐＲＨ５１２中の４．５１　ｋｂ断片がゲ ノミックＤＮＡの８ｇＩｎ消化によってつくられる４、４　ｋｂ断片と実質的に 同一であることを示した。 次に、ｐＲＨ５１２の４．５１　ｋｂのＢｇｌ■挿入物は、二つの手順で配列決 定された。一つは、２本鎖プラスミド配列決定法［エム”　７Ｎ　ットリ（Ｍ、 　Ｈａｔｔ、ｏｒｉ）ら、Ａａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ＊、　１５２ｍ！　２３２− ２３８頁（１９８６年）であって、「ミニブレツブ」［前掲サムプルツクら］　 ＤＮＡおよび各配列決定反応につきｌ　ｐｓｏｌの万能、逆方向または特別設計 のオリゴヌクレオチドブライマーによって行なわれる。この方法によってプラス ミドρＲＨ５＋２の配列を決定するために、重ね合わせ（ｎｅｓｔｅｄ）エキソ ヌクレアーゼ■欠失［ニス・ヘニコフ（Ｓ、　Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ）、Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　Ｅｎｚｙｓｏｌ、　１５５巻＋５６−１６５頁（１９８７年）〕を使用し た。欠失は万能プライマー末端から行なわれた。これらの欠失を行なうには、Ｄ ＮＡをｔｏＲＩで切断し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片を用いて、 α−チオホスフェ−）　ｄＮＴＰ　［ニス争ディー・ブットネー（Ｓ、Ｄ、　Ｐ ｕｔｎｅｙ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。 ＵＳＡ　７８巻７３５０−７３５４頁（１９８１年）］を充填し、Ｓｍａ　Ｉで 切断し、エキソヌクレアーゼ■て処理した。サンプルを（資）秒毎に除去し、再 連結させ、電気穿孔法（エレクトロポレーション）によって大ＩＩ　Ｍ　５ＵＲ Ｅ細胞の形質転換に使用した。シーフェンシング反応は万能プライマーで実施さ れた。 その配列と相補的なプライマーを調製し、ＲＭ５８結合部位（塩基３９８３〜４ ００２）を通して戻し配列に使用すると、生ずる配列は、翻訳されると、６．２ 　ｋＤａ　ＣＮＢｒポリペプチド断片をミクロシーフェンシングから生ずるアミ ノ酸配列を生じた。 第二の配列決定法は、次のように１本鎖配列決定を可能とするために、旧３ファ ージ中へ標準および万能および逆ＭＩ３プライマーとＭ１２ショットガン配列決 定との組合せを用いて実施された。プラスミドｐＲＨ５１２を音波処理すると無 作為断片を生じ、バクテリオファージＴ４０）ｉ＾ポリメラーゼで修復し、これ らの断片をＳｅａ　Ｉで切断した１３ｓ＋ｐ１９［ＧＩＢｃＯ］へショットガン クローン化した。ショットガン１本鎖配列決定用の適当なりローンを確認するた めに、ｐＲＨ５１２中に発見された４、５　ｋｂ挿入物から調製された放射性標 識つきプローブでプラーク採取物（ｌｉｆｔｓ）をスクリーニングした［例えば 前掲サムプルツクらを参［］、　ｐＲＨ５１２のＢｇｌＩＩ挿入物の配列決定は 、これをヌクレオチド魯０〜４５０５として単離し、こうして配列５′と３′を スフエロイジン遺伝子に延長した（図２）。 実Ｉｉ！！例５　追加ＡｍＥＰＶ配列の獲得Ｏｒａ　Ｔ　ＡｍＥＰＶ　Ｄ　Ｎ　 Ａラオプラリーは、ゲノミックＤＮＡをＤｒａ　Ｉて消化させてｒＩ４Ｉ！され た。これらのＤｒａｇ断片をＳｅａ　Ｉ消化、ホスファターゼ処理、ヘクターＭ Ｉ３ｍｐ１９ヘショットガンクローン化した。旧３ウィルスとＤＮＡの製剤は、 標準手順によって調製された［前掲ジェイ・サムプルツクらコ。連結と熱シヨツ ク形質転換手順を慣用的に行なうと［前掲サムプルツクら］、細菌菌株の大腸！ １１１７４８１［テネシー大学］または５ＵＲＥ菌株へ形質転換されたンヨット ガンクローン化された断片を生した。 ゲノミックＡｍＥＰＶ　ＤＮＡ（４００ｎｇ）を鋳型とした標準的なＰＣＲ［前 掲イニス（Ｉｎ口ｉｓ）ら］を用いて、０ｒａｌで切断した＾＠ＥＰ〜′断片の １３ンヨソトガンライブラリーのニトロセルロースフィルターレプリカ（プラー ク採取物）［ミクロン・セバレーンヨン社］からの５８６　ｂｐ　Ｄｒａｌクロ ーンを確認するためのプローブを調製した。これは、スフェロイジン遺伝子の中 央の配列未決定領域にわたるクローンを！離するために行なった。この反応に使 用される標準的すＰｒＲフラー１’　マーｉ、ｔＲＭ９２［ｓＥｏ　１０　ＮＯ ：１５］　（ＧＣＣＴＧＧＴＴＧＧＧＴＡＡｒＡＣＣＴＣ＞とＲＭＩＩ８　Ｅ　 ＳＥＱ　１１）１：１６］　（ＣＴＧＣＴＡＧＡＴＴＡＴ（：ＴＡＣＴＣＣＧ） であった。この配列決定は、塩基９３１に単一）ｆｉｎｄ■部位があること、お よびスフェロイジンオーブンリーディングフレーム（０ＲＦ）の２′末端が切断 されていることく図２）を明らかにした。 逆ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の手法［エム・エイ・イニスら、ｒ　ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏＭ方法と応用の指針」アカデミツクブレス社、カリフォルニア州 すンディエゴ（１９９０年）をＣ１ａ　Ｉて消化させたＡｍＥＰＶ　ＤＮＡ断片 と共に使用すると、この断片は円形に連結されて、フランキング配列を含有する クローンの確認用、または隣接クローン閏の介在配列の非存存在を検証するため のプローブが作られる。逆ＰＣＲに使用されるプライマーはＲＭ８２とＲＭ８３ であり、これらはｐＲＨ５１２配列から取られた。ＩＩＭ８２配列［５ＥＱＩＤ ＮＯ：１３］はＴＴＴＣＡＡＡＴＴＡＡＣＴＧＧＣＡＡＣＣであり、ＲＭ８３の それ［ＳＥＱ　ＩＤ　１１０：１４コはＧＧＧＡＴＧＧ＾ＴＴＴＴＡＧＡＴＴＧ ＣＧであった。 ３４サイクルに対する特定的なＰＣＢ反応条件は、次のとおりてあった。変性に ９４℃で３０秒、アニーリングに３７℃で３０秒、および延長に７２℃で１．５ 分、最後に、サンプルを７２℃で８．５分培養して、延長を終了させた。各プラ イマーの濃度は１μ門であった。 生ずる２、２　ｋｂの逆ＰＣＲ生成物をＣ１ａ　Ｉて消化させ、１．７ｋｂの断 片をゲル精製した。　１．７　ｋｂのＰＣＲ断片はＲＭ８３をプライマーとして 配列決定された。追加のＰＣＲプライマーは、新配列が確認されるにつれて、こ れに対してつくられた。配列決定法は各プライマーにつき５ｐ■０１のシークエ ナーゼと、１０〜５０　ｎＨの鋳型を使用した。配列決定の前に、ＰＣＲ生成物 をクロロホルムで抽出し、セブアクリルＳ−４００のスパンカラム［前掲サムプ ルツクらコ上で精製した。ＤＮＡ配列を集め、整合させ、共通配列をっく７た［ アール・スターデン（Ｒ，５ｔａｄｅｎ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ 、　１０＠４７Ｈ−４７５１頁（１９８２年）］００両ストランとも完全に配列 決定された。　ＰＣＲ生成物の配列は、慣用の配列によって立証された。 １．７　ｋｂのＰＣＲ断片の関連するＣ１ａ　１部位は３４８５と６１６５にあ る。この断片に放射性ａｍをつけ、８８１１１断片ライブラリーからの追加のク ローン、すなわちｐＲＨ８２７（３０７ｂｐ）、　ｐＲ）１８５　（１，８８ｋ ｂ）およびｐＲＨ８７（１，８８ｋｂ）をつきとめるプローブとして使用した。 プラスミドｐＲＨ８５とｐＲＨ８７は、ｐＲＨ５＋２について記述されたものと 同し重ね合わせた（ｎｅｓｔｅｄ）エキソヌクレアーゼ■欠失および配列決定手 順を使用して配列決定された。特別設計のプライマーによる逆ＰＣＲ生成物の配 列決定は、プラスミドｐＲＨ８５とｐＲＨ８７が反対方向で回し１．８８　ｋｂ のＢｇｌ　ＩＩ　ＤＮＡ挿入物を表わしていることを確認したが、ｐＲＨ８２７ とｐＲＨ８５との間で欠けているｓｏ　ｂｐをも明らかにした。この８０ｂｐＤ ＮＡ断片はＤｒａ夏断片中で、Ｍ１３へクローン化された塩基４５４３〜５１２ ８′ｂ）らの延長として確認された。 物理的地図上のスフエロイジンＯＲＦの方向づけを図１に示す。１．７　ｋｂの 逆ＰＣＲ断片が、ＡｍＥＰν）ｌｉｎｄｍ−Ｇ断片に対してのみハイブリッドを 形成することに注目すると興味ふがい。８および９　ｋＤａの重複するＣｎＢｒ で発生させたポリペプチド類に由来するアミノ酸配列は、ヌクレオチド位［１４ ８８３〜４９５７　［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３８］から見つかる。　６．２　ｋ ｎａのポリペプチドに由来する配列は、ヌクレオチＦ　３９６２〜４０１２　［ ＳＥＱ　Ｉ［１ＮＯ：３９コから見つかり、また１５　ｋＤａポリペプチドに由 来する配列は、ヌクレオチド４６２８〜４６５１［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４０］ から見つかる。従って、タンパク質のミクロシーフェンシングから得られるすべ ての配列は、究極的にはスフエロイジンＯＲＦ内にあることがわかった。 実施例６　スフエロイジン遺伝子の転写スフェロイジン遺伝子の転写開始部位を 決定した。予想された開始メチオニンの６５　ｂｐ上下流始まるスフェロイジン 遺伝子配列に相補的なプライマーをつくり、一連のプライマー延長に使用した。 Ａ、ＲＮＡ調製と１ライマ一延長反応 集密に至らない（５ｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）細胞の１５０　ｍｍ＋皿６枚を用 言した。培養基培地を吸引し、ウィルス接種物２霞１を各回に添加した。ウィル ス濃度は細胞当たり約０．１１ＰＦＬＩであった６３時時間吸着朋間中に、皿を 時折かきまぜた。この１間の終りに、細胞を変更ＰＢＳ　（５ｍｌ）ですすいだ 、培地を取り替え、感染細胞を２７℃で７２時間培養した。感染細胞からの全Ｒ ＮＡをグアニジニウムチオシアン酸−塩化セシウム手順［ジェイ・エム・チャー ギン（，１，Ｍ、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８巻 ５２９４−５２９９頁（１９７９年）コによって単離した。 プライマー延長反応はプライマーＲＭＩ６５［５Ｅ（１１０ＮＯ：１７］すなわ ちＴＡＡＡＴＧモチーフ中に見られる開始メチオニンコドンの１００および６５ 　ｂｐ上下流それぞれ開始し終結する３５塩基のオリゴヌクレオチド（ＧＴＴＣ ＧＡＡＡＣＡＡＧＴＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣ）て実施さ れた。プライマーをＣｒ−３２Ｐ］＾ＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ で末端標識をっけ、「スパンカラム」　［前掲サムプルツクら］上で精製した。 アニーリングには、４０μｇの全感染細胞ＲＮＡと、１０’　ｃｐ−の放射性標 識つきプライマーをエタノールで共同沈殿させた。ペレットをハイブリット形成 緩衝液［８０％ホルムアミド、４０ｇＭピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタ ンスルホン酸（ｐＨ６，４）　、　４００ｍＭ　ＮλＣ１，１蒙Ｍ　ＥＤＴＡ　 （ｐＨ８゜０）１２５μｍ中に再！濁し、７２℃で１５分閉度性させ、３０℃で １８時間培養した。 プライマー延長には、ＲＮＡ−ブライマーハイブリッドをエタノール洗穀させ、 再懸濁し、５回の各反応に使用した。各反応物は、全感染細胞ＲＮＡ（８ａｇ） 、５０１ｉ’ＩＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，３）　、５０　ｇＭ　ｋｃｌ、１ ０８Ｍジチオスレイトール、１０−Ｍ　ＭｇＣｌ□、鳥骨髄芽球症つィルス逆転 写酵嚢（ライフサイエンス）４υ、ＲＮａｓｉｎ　（プロメガ）８Ｕ、０゜２５ −一各デオキシヌクレオシド三燐酸（ｄＮＴＰ）　、および適当なジデオキシヌ クレオシト三燐ｆｉｔ！　（ｄｄＮＴＰ）を含有したが、但し対照反応の場合は 、ｄｄＮＴＰを含有しなかった。　ｄＮＴＰＩｄｄＮＴＰ比はＣ，Ｔ、Ａ、およ びＧ反応について、それぞれ４：ｌ、５：１．５：１、および２：ｌてあった。 反応を４２℃て３０分１丁なった。 チェイス緩衝液（５ｇＭ　ｄＮＴＰ混合物４μｍと２０−Ｕ／μｍ逆転写酵素１ μｌ）　１μｍを各反応混合物に加え、次にこれを４２℃で更に３０分培養した 。反応生成物をシークエンシンが明らかになった。また、スフェロイジンＯＲＦ の９２ｂｐ５°内に既知のを椎ポックスウィルス調節配列の存在が検出された。 　３１ｉのＴＴＴＴ　ＴＮＴ初期遺伝子終結信号と、恐らくはスフエロイジン遺 伝子の転写と翻訳を開始するのに使用される後期転写ｒＷ４始信号を表わしてい るＴＡＡＡＴＧが含まれている。幾つかの隣接翻訳終結コドンも、スフェロイジ ンＯＲＦの上ｔｊＥ９２ｂｐ内に存在する。 スフェロイジン遺伝子から上流の配列の分析は、追加の４個ノ有力すＯＲＦ、ス ナワチ上記（１）　ＧＩＬ　［ＳＥＱ　１０１１０：２５］、Ｇ２Ｒ［ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：２３］　、　Ｇ３Ｌ　［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６］お上びηＲ［ ＳＥｏ　１０　ＮＯ：２４］を明うカニした。これら（Ｄ　ＯＲＦ＋７）想像上 のアミノ酸配列は図２に報告されている［それぞれＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２．　 ３．　４および５］　、ＯＲＦ　Ｇ２Ｒ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３］またはＧ ３Ｌ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６］によってコードされた小さな有力ポリベブチ ト類については、有意の相同性は見られなかった。しかしノ、ＯＲＦ　ＧＩＬ　 ［ＳＥｏ　１０　ＮＯ：２５］は、未知の機能のワクシニアウィルスのＨｔｎｄ ｍ−ｌ断片内に見られるＯＲＦ　１７との相当程度の相同性を示した。　ＯＲＦ 　Ｇ４Ｒ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４］はカブリポックスウィルスのＯＲＦ　８ Ｍ３との相同性を示した。ワクシニアウィルスでは、ＯＲＦ　ＨＭ３相同体は不 完全ＡＴＩ遺伝子の部位の非常に近くに見出された。 スフェロイジン遺伝子の右にある部分的なＧ６Ｌ［ＳＥＱ　ＩＤＮ０：２７］は 、ワクシニアウィルスＮＴＰａｓｅ　ｌとの良好な相同性を示した。部分的なＧ ６Ｌ　ＯＲＦ　［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７コと、別の昆虫ポックスウィルスの ＣｂＥＰＶのＮＰＨ１［ユアン・エル（Ｙｕｅｎ、Ｌ、、）ら、Ｖｉｒｏｌ、１ ８２巻４０３−４０６頁（１９９１年〉］との閏で、ずっと良好な相同性（１６ ２アミノ酸で７８，４％の同一性）が見られた。 実施例８　ｔｋ遺伝子を含有するｌ＋ＥＰＶ　ＥｃｏＲｌ−Ｑ断片の単離と配列 決定 実施例１のゲノミックＡ■ＥＰＶのＥｃｏＲｉＱ断片の配列決定は、スフエロイ ジンについて上述された手法を用いて実施された。配列決定は、二つの完全なＯ ＲＦと一つの部分的なＯＲＦを含有する＋５１１　ｂｐを示した。　ＯＲＦ　Ｑ ｌ　［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２８］のＤＮＡ配列の分析は、確認用の縮重オリゴ ヌクレオチド（ＲＭＯ３ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ＩＢおよびＲＭＯ４ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：Ｉ９）がハイブリッドを形成しうる部位を示している。幾つかのポック スウィルスとを推動物のｔｋ遺伝子の異なるが強く侃存された領域に基づいて［ シー・アブトン（Ｃ，Ｕｐｔｏｎ）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６０巻９２０−９２７ 頁　（１９８６年）；ディー・ビー・ボイル（Ｄ、Ｂ、　Ｂｏｙｌｅ）ら、Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ　１５６巻３５５−３６５頁（１９８７年）］、二つのオリゴヌク レオチドＲＭＯ３とＲＭ　０４は上に引用された方法ｔこよってＴｌ４Ｉ！され た。　ＲＭＯ３は８２位置のアスパラギン酸から８７位置のフェニルアラニンま でのワクシニアＬｋタンパク質中のアミノ酸残基に対応している、３２＠の縮重 オリゴヌクレオチド［ＳＥｏ　１０　ＮＯ：ｌ８１Ｇ＾（ＴｌＣ）ＧＡ（Ｇ／Ａ ）ＧＧ（Ｇ／Ａ）ＣＧ（Ｇ／Ａ）ＣＡ（Ｇ／Ａ）　ＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＴＴである。 　ＲＭＯ４［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：Ｉ９］はワクシニアで１１位置のグリシンか ら１６位置のグリシンまでの領域に対応している、３２倍の縮重をもった（ＧＧ ！ＩＣＣＣＡＴＧＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＴＣＮＧＧである。これらのプローブは、Ｒ８ ５Ｂプローブについて上に記述されたように、放射性標識を付された。 ＡｍＥＰＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子は、ＥｃｏＲＩで消化させたＥＰＶ 　ＤＮＡのサザンプロットに対し、縮重オリゴヌクレオチドプローブＲＭＯ３お よび１１ＭＯ４でのハイブリッド形成によって確認された。関心のあるＥｃｏＲ Ｉバント（Ｅｃ。 Ｒ１−Ｑ）を単離し、精製し、ＥｃｏＲｌで予め消化させ牛腸アルカリホスファ ターゼ処理したｐＵｃＩ８ベクター（ギブコ）へ連結させた０組替え型クローン は挿入物の大きさによ７て、また放射性標識つきオリゴヌクレオチドプローブへ のハイブリット形成によって確認された。 一つのこのようなりローンはρＭＥＧｔｋ−１と呼ばれた。ｐｕＣ１８ヘクター 配列に対して両方向のＥｃｏＲｌ−Ｑ断片を含有するｇ替え型クローンを、配列 決定に使用した。配列の重ね合わせ（ｎｅｓｔｅｄ）欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ）は、ｐＲＨ５１２について述へたように、上に引用されたヘニコフ法によフて 行なわれた。これらのクローンは全体のＥｃｏＲｌ−Ｑ断片の配列決定に使用さ れた。 続いて、これらのオリゴヌクレオチド類と別のＲＭ＋２９（これは０ＲＦＱＩｂ ）ら調製される非縮重オリゴヌクレオチドＧＧＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＴ ＴＴＣ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０］である）が、ＯＲＦ　Ｑｌ　［ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：２８コに示されたように、それらの位置決定を確認するためのシーフ ェンシングプライマーとして使用された。ＯＲＦ　Ｑｌは潜在的に１８２アミノ 酸（２＋、２ｋＤａ）　［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌＯ］のタンパク質をコードし ている。 ＯＲＦ　Ｑ３は潜在的に、少なくとも６８アミノ酸のポリペプチドをコートして いるが、不完全てあり、ＯＲＦ　Ｑｌとは反対方向ニ転写すレル。０ＩＩＩＦ　 Ｑｌ　［ＳＥＱ　ｌ［ｌ　ＮＯ：３１］は潜在的に、６６アミノ＃　（７，７５ ｋＤａ）　［ＳＥＱ　１０　ＮＯ：９コの小ペプチドをコートしている。 ＥｃｏＲｉＱ断片をなおも分析すると、他の趨っかの点が明らかになる。第一に 、ＡＣＴ含有量が非常に高い（８０％）。 ＯＲＦ　Ｑｌの場合、翻訳開始コドンの上流の１００ヌクレオチドは、９０％が ＡＣＴである。幾つかの有力なポックスウィルス転写信号が、ＯＲＦ　Ｑｌと０ ２の間に見られた。　ＯＲＦ　Ｑｌの出発コドンのすぐ先の５個の塩基はＴＡＡ ＡＴＧであって、これは共通の後門ポックスウィルスプロモーターを含めてなる 。潜在的なポックスウィルス切貼転写終結信号配列（ＴＴＴＴＴＡＴ）は、Ｑｌ の翻訳停止コドンから２　ｎｔ過ぎた位置にある。 ＥｃｏＲｌ−Ｑ断片のＯＲＦ　Ｑｌによってコードされたｔｋの推定アミノ酸配 列は、ポックスウィルスの豚痘［ダブリュー・エム・シュニッツライン（讐、Ｍ 、　５ｃｈｎｉｔｚｌｅｉｎ）ら、ｖｌｒｏｌ、　１８１巻７２７−７３２頁（ ＋９９１頁）；ジェイ・エイ・フエラー（Ｊ、Ａ、Ｆｅ１ｌｅｒ）ら、Ｖｉｒｏ ｌ、１８３巻５７８−５８５頁（１９９１年）］；鶏痘［前掲ボイルら；エム・ エム参ビンズ（ＭｏＭ−ＢｉｎｎＳ）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６９巻＋２７５−１ ２８３頁　（１９８８年）コ　：ワクシニア［ジェイφビー・ウェア（Ｊ、Ｐ、 　Ｗｅｉｒ）ら、ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。 ４６巻５３０−５３７頁（１９８３年）：ディー・イー・フラビー（Ｄ。 Ｅ、Ｈｒｕｂｙ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１１０ ４３４１１−３４１５頁（＋９８３頁）］；天然痘と猿痘ジエイ・ジェイ・エス ボジト　（Ｊ−Ｊ、Ｅｓｐｏｓｉｔｏ）ら、Ｖｉｒｏｌ、１３５巻５６１−５６ ７頁（１９８４年）］；カブリポックスウィルス［ピー・ディー・ガーション（ Ｐ、Ｄ、　Ｇｅｒｓｈｏｎ）ら、Ｊ、Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　７０１５２５− ５３３頁（＋９８９頁）コ　；ショーブ繊！ｔ　ＩＩウィルス［前掲アブトンら ］　；ヒト纏胞子ミシン・キナーゼ［エッチ・ディー・プラットシ：ｉ　−（Ｈ ，Ｄ、　Ｂｒａｄｓｈａｗ）ら、Ｍｏ１．　ＣｅＩＩ　８ｉｏ１．４巻２３＋６ −２３２０頁（１９１３４年）；イーψフレミントン（Ｅ、Ｆｌｅｍｉｎｇｔ、 ｏｎ）ら、Ｇｅｎｅ　５；）巻２６７−２７７頁　（１９８７年）］　；マウス ｔｋ［ピー・エフ・リン（Ｐ、Ｆ、　Ｌｉｎ）ら、Ｍｏｌ。 Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、５嘗３１４９−３１５６頁　（１９８５頁）］；　ニワト リ　ｔｋ［ティー・ジエイ・りｔ　−（Ｔ、Ｊ、にｗｏｈ）ら、Ｎｕｃｌ、　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２巻２９５９−３９７１頁　（１９８４年）コ　；　ＡＳ Ｆ　（アール・ブラスコ（Ｒ，Ｂｌａｓｃｏ）ら、Ｖｉｒｏｌ、１７８巻３０１ −３０４頁（１９９０年）：エイ・エム・マーチン・ヘルナンデス（Ａ、Ｍ、　 Ｍａｒｔｉｎ　Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ）ら、ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６５巻１０４６−１ ０５２頁　（１９９１年）コのｔｋ遺伝子に比肩しうる。 実１ｉＩ！例９　ワクシニアウィルスにおけるＡｍＥＰＶ　ｔ　ｋ遺伝子の発現 ＡｍＥＰＶｔｋ遺伝子は、次のようにワクシニアウィルス株ｔｋ突然変異種へ遺 伝子をクローン化することによって、ＩＩｌ能的に試験された。 上記のＡｍＥＰＶのＥｃｏＲｉＱ断片は、アルカリ溶菌法によって細菌細胞から 単離されたシャトルプラスミドｐＨＧＮ３．１［ディー・ディー・ブルーム（Ｄ 、Ｄ、　Ｂｌｏｏｍ）ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。 ６５巻＋５３０−１５４２頁（１９９１年）］中へ、両方向で挿入された。この ＥｃｏＲｉＱ断片はＡｍＥＰＶのｔｋオープンリーディングフレーム（読取り枠 ）　（ＯＲＦ）を含んでいる。クローニングは慣用的に実施された。生ずるプラ スミドはｐＨＧＮ３゜１／ＥｃｏＲ１−Ｑと命名された。 プラスミドは下に特定的に記述されるように、リボフェクチン［ギブコ〕により 、ワクシニアウィルスで感染させた哺乳類ＩＩ胞に導入された。細胞はラットｔ ｋ、ヒ）　＋４３ｔ　ｋ、またはＣＶ−ＩＡＩ胞系統であり、これにワクシニア ウィルスＶＳＣ８を増殖させた。これらの細胞は、アール塩を加えたイーグルの 最少必須ｔｇ地［マスング（Ｍａｓｓｕｎｇ）ら、Ｖｉｒｏｌ、　１８０巻３４ ７−３５４頁（１９９１年）、参照により本明細書に取り入れたコ中で保持され た。 ＶＳＣ８ワクシニアｎ［パーナート・モス博士］は、ウィルスｔｋ遺伝子へ挿入 されたワクシニアｐＨプロモーター　（Ｐｌ、−Ｌａｃ　Ｚカセット）に駆動さ れたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有している。　ＶＳｅ２はβ−ガラクトシ ダーゼの挿入のために不活性ｔｋ遺伝子を含有しているが、ワクシニアウィルス の部分は残っている。このように、ｖｓｃａはｔｋ−であり、Ｘ−Ｇａ１　（５ −ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシト）で染色 すると、青色のプラーク（β−ガラクトシダーゼ陽性）を形成しよう。 細胞を８０％の密集度まで生育させた（６０ｍｍの回当たり４　ｘ　１０６個） 　−ｄＨ２０（５０μＩ）中のｉｏμｇプラスミドＤＮＡ　（ｐＨＧＮ３．１／ ＡｍＥＰＶ　ＥｃｏＲｌ−Ｑ）に、リボフェクチン液（ｄ８２０（５０ｇ　ｌ） 中リボフェクチン２０μｇ）を添加し、室温で１５分培養した。２時間のウィル ス吸着（感染多重度２）後、血清を含んていないＯｐｔｉＭＥＭで単層を３回洗 った。 次に、血清を含まないＯｐｔｉＭＥＭ　（３ｍｌ）を各６０　ｍ−皿に加えた。 穏やかにかきまわしながら、リボフエクチン／ＤＮＡ混合物を徐々に滴加し、３ ７℃でさらに＋２−１８時間培養した０次に、牛胎児血清を加え（最終ｌＯ％） 、４８時間の後感染時に感染細胞を取り入れた。 ワクシニアのへマグルチニン（用遺転子へ挿入されたＥｃｏＲｌ−Ｑ断片を含有 する組替え型ウィルスは、上記の手順によって放射性標識を付けたＡｍＥＰＶ　 ＥｃｏＲＩＱ断片を、感染単層からのウィルスプラークのニトロセルロース「採 取物（ｌｉｆｔｓ）Ｊのレプリカとハイブリッド形成させることによフて確認さ れた。有力な組替え体はレプリカフィルターから単離され、試験前に数回プラー ク精製されＡｍＥＰＶのｔｋは、ワクシニアのｔｋとのある程度の相同性を示シ ティる。　ＡｍＥＰＶｔ　ｋ　ｉｌ伝転子挿入が、ＶＳｅ２に残っている残留物 ｔｋ配列内よりも、ワクシニアのＨ＾遺伝転子であることを確認するために、種 々のウィルスのＨｉｎｄｍ消化物との一連のサザンハイブリッド形成によって、 組替え型を調べた。野性型ウィルスからのＤＮＡをワクシニアウィルスｔｋプロ ーブとハイブリッド形成させるとき、ハイブリッド形成はＡｍＥＰＶの〜５　ｋ ｂのＨｉｎｄｍ−Ｊ内に排他的に観察された。 ワクシニアｔｋプローブを使用して、ＶＳｅ２またはいずれかのＡ■ＥＰＶｔｋ 含有組替え型含有へる時は、放射性標識つきの基賀の存在下にポリメラーゼと一 致した〜８　ｋｂ断片とのハイブリッド形成が代わりに生じた。延長は、Ｐｓｔ ｌ−Ｆ断片の末端で終了しよう。 次に、放射性標識つき生成物をＡｓＥＰＶＤ　Ｎ　ＡのＥｃｏＲ１消化物とハイ ブリッド形成させた。遺伝子の方向が、ｔｋのＯＲＦがゲノム末端に向かって読 取るようになっている場合は、ＥｃｏＲｌ　−Ｅ断片とのハイブリッド形成が期 待される。一方、遺伝子がゲノム中心に向かって読取られる場合は、ＥｃｏＲｌ 　−１断片とのハイプリ・ンド形成が期待される。 結果は、ＥｃｏＲ１４断片とばかりでなく　、　ＥｃｏＲＩ−＾断片とのハイブ リッド形成を示している。これらの結果は、ｔｋ遺伝子の方向がゲノム左端に向 かう読取りになっていることを意味している。ランオフ延長生成物とＥｃｏＲＩ Ａ断片とのハイブリッド形成も、ポックスウィルスに共通な逆方向末端反復の存 在と一致しており、同一配列がなｏＲＩ−ＡとＥｃｏＲｌ−εの両断片に存在し ている。 実験室での＾―ＥＰＶに最適の生育温度は２８℃であるが、を椎ポックスウィル スのそれは３７℃である０本明細書に記述されたように、全ｔｋ遺伝子を含有す るＡｗＥＰＶＤ　ＮＡ断片をワクシニアウィルスのｔｋ株へクローン化する時は 、鞘替え型ウィルスはメトトレキセート（シグマ）の存在下に３７℃で生育可能 であり、これはｔｋ÷表現型を示す。本実施例は、エントモポックスウィルスｔ ｋ遺伝子が哺乳類発現系に噸調に転移できること、およびＡｍＥＰＶｔｋが相当 な温度範囲にわたって機能的に活性であることを例証している。 本明細書に記述された実施例およびｍ擺が、例示的な目的のものにすぎないこと を理解すべきである。これに照して、本明細書によって種々の変更が当業者に示 唆されよう０本発明は絹替え型ポリヌクレオチド配列、プラスミド、ベクター、 および形質転換宿主を包含し、ＤＮＡ配列への些細な修飾がなされたとしても、 上記の同等な構造体に特徴的な発現特徴が保持されている点て、これらの構造体 は本明細書に特定的に例示されたものと同等である０例えば、所望の水準の発現 を達成するために、構造遺伝子の上流にあるスフエロイジン遺伝子の非コーディ ング領域の断片を用いることは、当業者の技術の範囲内にある０本系統に特徴的 な所望の水準の発現が保持される限り、ｖ４！１１配列のこのような断片は、本 発明の範囲内に入る。更に、ヌクレオチド配列への些細な変更は、これらの配列 の開示された機能に影響を与えずになされつる。このような変更も、本発明のｔ ｉｌｌ内にあり、本出願の精神と範囲内に、および添付の特許請求の範囲に含ま れるへきものである。 配列表 （＋）一般的情報 （１）出願人：フロリダ大学 （目）発明の名称ご新規なエントモポックスウィルス発現系 （ｉｉｉ）配列数：４０ （１ｖ）連絡先 （＾）宛先：デビット・アール・サリヮンチック（Ｂ）　街ｖｓ：　２４２１　 Ｎ、Ｗ、　４１ス）　’Ｊ−ト、Ａ−１号＜Ｃ＞　市：ゲインズビル （Ｄ）　州：フロツグ （Ｅ）　国：合衆国 （Ｆ）　郵便番号：　３２６０６ （ｖ）コンピューター読取り形式 （Ａ）　媒体タイプ：フロッピーディスク（８）　コニ、ｔ　ヒユーター：　Ｉ ＢＭ　ＰＣ互換型（Ｃ）ＯＳ二ＰＣ−００５／ＭＳ−ＤＯ５（Ｄ）　ソフトウェ ア：　Ｐａｔｅｎｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　Ｈ，０゜Ｖｅｒ、＄１．２５ （ｖｉ）現在の出願データ （Ａ）　出願番号： （Ｂ）　出願日： （Ｃ）　分類： （νｉｉ）先行出願データ （Ａ）　出願番号：　ＩＪＳ　０７／６５７．５８４：　ＬＩＳ　０７／（Ｂ） 　出願日：　１９９＋年２月１９日；　１９９２年１月３０日（ｖｉｉｉ）弁理 士／代理人情報 （Ａ）　名前：サリワンチック、デビット・Ｒ（８）登録番号：　３１．７９４ （Ｃ）　参＠／ドケット番号：　ｔＪＦ１５１５−１１４．Ｃ２（１ｘ）通信情 報 （Ａ）　電話：　（９０４）　３７５−８１００（Ｂ）　ＦＡＸ：　（９０４） 　３７２−５８００（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：ｌに関する情報（ｉ）配列特 性 （＾）長さ：　６７６８塩基対 （ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ν１）元の給源 （＾）生物：アムサクタ・モオしイ・エントモボ（Ｂ）　位置：相補（６５，， １４５９）（１ｘ）特徴 （Ａ）　名前／キー：　ＣＤＳ （８）位置：　１４７４．．２１５＋ （ｉｘ）特徴 （＾）名前／キー：ＣＤ５ （Ｂ）　位置：相補（２２３９，，２４７５）（ｉｘ）特徴 （＾）名前／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）　位置：　２５０２．．２９８７（１ｘ）特徴 （＾）名前／キー：ＣＤ５ （Ｂ）　位置：　３０８０．．６０９１（＾）名前／キー：ＣＤ５ （Ｂ）　位置：相補（６２７７、，６７６８）（ｘｌ）配列の記述：　ＳＥＱ　 １０　ＮＯ：ｌ：入ＧＡＴＣＴＧＡＴＧ　ｆｆｌ＋：’ｒＡＴＡＴ入τ　ＡＧＴ ＾ＣＡＪＩＡＴＴ　ＴＧＴ＾丁ＧＡＴ？Ａ　ＡτＴＧＡ丁ＡτＴ丁　τλ入入■ 酷■`　６０ 八ＴＡＡＣＡＴＡＣＡ　ＣＡτ入Ａ入ＡＴＴＡ　ＡＴＡＣＣＡＧＡＴＴ　ＣＴＧ ＧＣＡＴＴＴｌ　τ入ＡＡＴＴτＴ丁Ａ　ＴＴ’ｒＧＧ入Ａ`ＴＣ１４４０ 人Ａ？Ａτλ　入ＡＴ　ＡＣＡ　入Ａ１”　ＣＣＡ　Ｔ’ｒ丁　ＴＴＡ　丁子Ａ 　丁子丁　ＡＣＡ　入Ａτ　ＡＣＡ　丁Ｃ丁　（ＹＡ　ＣＣ`　１８７８ ）ｖｎ　Ｉｌａ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｍｎ　Ｐｒｏ　Ｐｈ＠　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　 Ｐｈａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　＾１ｍＣ入Ａ　入ＡＴ　＾ ＧＴ　ＣＡＴ　ＧＴｋ　丁？Ａ　ＧｋＴ　ＡＴＡ　Ｇ＋ｒＪＬ　ＴＣＡ　ＣＡＴ 　ＡＴＡ　Ｇｋｈ　ＴＴｒ　ＡＴＣＡＡ`　１９７４ ｃｌｎ　Ａｓｎ　Ｓ＠ｔ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｚｌｓ　Ｖａｌ　 ５＠ｒ　Ｈｉｍ　ＩＩｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　ＨａセＬｙｓＧＴＧ　ＡＧＡ　ＴＴ Ａ　ＡＴＡ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　？ＡＴ　ＡＡＣＴＣＴ　ＡＴＡ　ＡＴＡ　ＴＣＡ 　ＴＴＴ　ＴＴＡ　ＡＡＴ　ＡＴＣ２P１８ Ｖａｌ　ＡＪ″ｇ　Ｌｅｕ　Ｈ＋ｅ　Ａｍｐ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ＾ａｎ　Ｂａｒ　 Ｘｉ＠工ｉ＠Ｓａｒ　Ｐｈａ　Ｌ・ｕ　Ａｓｎ　ｒｌｓ丁入ＸｅＡＴＡＴＴＴ　 ＴＴＴＡＴＴ入入八Ａ　ＴＧへＡＴ入ＡＡＡτ　＾丁ＡＴ＾ＴτＧττ　＾Ｔ丁 ＧτＣ八へ丁Ａｆｆ丁τ＾τＡ丁ＣO　２２２８ π１ＡＣＡＧτＣ買Ａπ■ππ＝Ｇσ買ＴＡ茜τＡＴ紡τＴ？ＴＡＣ＝Ｃ黒ＣＧ ｆｆＴＡτ　２２８８八ａｎＴｈｅＣｙ＊ｉ’ｈｓにｌｕ＾ｒｇＶａｌＶａＬ＾ ＊ｐＭｅｔＶａＬＶａｌＰｒｏＬ＊ｕτｙｒａｓｐコＯ３５４０ 人ＡＴ　ＯＴＡ　ＴＣＪ＊　ＣＡＴ　ｋｋＴ　ＧＡｃ　ＧＴＡ　ｊｌＪＬＡ　Ｔ ｋＴ　ＡＡＡ　Ｔ’ＴＡ　Ｇｃｒ　ＡＡＴ　ｆｆτ　ｋＧＡ@ＣＴＣ３４５１ Ａ＊ｎ　Ｖａｎ　５ｇ５ｒ　ＢＬｍ　Ａｇｏ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｅ　Ｔｙｒ 　Ｌｙｓ　Ｌａｕ＾ｌａ　Ａｓｎ　Ｐｈｍ　ｋｇ　Ｌｍｕｌｉｏ　１１５　１２ ０ 八Ｃｒ　ＣＴ’ｒ　ＡＡＴ　ＧＧｋ　ＡＡＡ　（ＪＴ　ＴＴＡ　ＡＡＡ　ｉＡ　 ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＴＣＯＡＴ　ｅＡＡ　ＣＣＧ　ＣＴＡ　R４９９ Ｔｈｒ　ｋｕ＾ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｍ　ＢＬｍ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｌｓｕ　Ｌｙ ｓ　ＧＬｕ　ＸＬｍ　ｋｍｐ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　ＬｓｕＴＴＴ　ＡＴＴ　ＴｋＴ 　ＴＴＴ　ＧＴＣＧｋＴ　ＧＡＴ　ＴＴＱ　ＧＣＡ　ｋＡＴ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　 ＴＴＡ　ＡＴＴ　ＡＣＴ　ＡＡＧ　R５４７ Ｐｈ・　工１＠　Ｔｙｒ　Ｐｈ＠　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｍｐ　Ｌｍｕ　ＧＬｙ　 Ａｍｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｅｌ−丁ｈｒ　Ｌｙｓ１４５　１ｓｏ　ｘｓ ｓ ＣＪＡ　入ＡＴ　ＡＴＴ　ＣＡＡ　ｋｋＴ　ＡＡＴ　ｋＡＴ　ＴＴＡ　ＣＡＡ　 Ｇ？’Ｔ　Ｍｅ　ＡＡＡ　ＯＡＴ　ＣＣＡ　ＴＣＡ　ｆｆ？@３５９５ ＧＬｕ　Ａｍｎ　ＩＬｅ　ｃｌｎ　Ａｇｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｓｕ　Ｇｉｎ　 ＶａＬ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ＭＰ　入１ａ　Ｓａｒ　Ｐｈ＠１６Ｇ　１６５　１７ ０ Ａｆｆ　ＡＣＴ　ＡＴＡ　ＴＴＴ　ＣＣＡ　ＣＡＡ　？へτ　ａＣａ　丁ＡＨＡ 丁子　丁Ｇτ　ττＡＧＯτ　八Ｇ＾　ＡＡＡＧτ＾　３６Sコ ニ１・　Ｔｈｒ　ＩＬａ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　丁ｙｒ　 ｔｉ＠　Ｃｙｓ　Ｌｓｕ　Ｇｌｙ　入ｒｇ　Ｌｙｓ　ＶａＬ丁＾丁　ＴＴＡ　Ａ ＡＴ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＧＴｋ　ＡＣＴ　Ａ ＣＡ　ＧＡＴＧＣＡ　ＡＣＴ　ＡＡＴ　R６９１ τｙｒ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　ＬＹ＠　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｈｓ　Ａｍｐ　 Ｖａｌ　Ｔｈｒ　丁ｈｒ　Ａｓｐ　Ａ１１　丁ｈｒ　Ａｍｎ１９Ｑ　１９５　２ ００ ＾Ｔ丁　ＡＣＴ　ＴＴＡ　ＧＡＴ　’！？Ｔ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＣＴＴ 　ＡＡＴ　ＡＴｅ　ＧＣＡ　ＧＴｋ　ＴＣＡ　ｉＴＣＣＴＴ@コツ３９ 工ｌｅ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　ｐｒｎ　Ａ１１ｎ　Ｌｙｇ　５＠ｒ　Ｖａｌ 　ｋｅｎ　ｚｌｌｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓａｔ　Ｐｈａ　Ｌ高■ ＧＡＴ　ＡＴＡ　ＴＡＴ　丁＾ＣＧＡＡ　ＣＴＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　入ＡＴ　Ｇ ＡＡ　ＣＡＡ　入＾＾　ＣＡＴ　？’？Ａ　？丁ＡＡＡＡ　R）８フ Ａｓｐ　Ｘ１ａ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃ１ｕ　Ｖａｌ　Ａｍｎ　ＡｇｎＡｓｎ　Ｇ Ｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｅ　Ａｓｐ　Ｌｓｕ　Ｌａｕ　ＬｙｓＯＡＴ　ＴＴＡ　ＣＴ Ｔ　ＡＡＯＡＣ；Ａ　ＴＡＣＧＧＴ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＣＡＡ　ＧＴＣＴＡＴ　 ＡＡＣＧＣＡ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　３８R５ ＾＠ｐ　Ｌａｕ　Ｌｓｕ　Ｌｙｅ　入ｒｇ　Ｔｙｒ　ＧＬｙ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　 ｃＬｕ　ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａ−ｎ　ＡＬａ　Ａｍｐ　τｈ【ＣＣ＾　丁τＡ　Ａ Ｔ′ｒ　ＴＡＴ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＣＴＡ　ＡＧＴ　ＡｒＴ　ＡＪＬＡ 　ＡＡＴ　τ＾ＴＧ＾ＴＡＣ丁　ＣＳａ@コ８Ｂ３ Ｇｌｙ　Ｌａｕ　工Ｌ＠　Ｔｙｒ　入１ａ　Ｌｙｓ　Ａｇｎ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　 工Ｌｍ　Ｌｙｓ　Ａ１０　でｙｒ　Ａｓｐ　’！’ｂｒ　Ｖ≠k ＾ＧＴ　ＡＧＡ　ＣＭ　ＧＡＣＣＴｒ　）ｉＡＴ　ＡＡＣＡＴＯＴＣＡ　ＴＣＴ 　ｉＡ　ＴＴＡ　ＧＧＡ　ＡＴＡ　ＡＡＣＡ？Ａ　４フ４７Ｓｓｒ　ｋｒｑ　Ｇ ｌｎ　Ａｍｐ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｍａｔ　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　Ｘｉｓ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｙ　ＡＬａ　Ａｓｎ　１１日ｃｃ丁　ｕＴ　ＴＣＣＣＴＡ　ＡＡＴ　 ＡＴＴ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＴＴＧ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＴＣＧ　ＧＴＡ　ＡＣＡ　 ＣＣＴ　ＣＡＣ４７X５ ｃｒｙＡｓｎｓｓｒＶａｌ＾ａｎＺｌ＊５ｓｒＳａｙ：Ｌ＠ｕＰｒｏ（ｌｙ？ｒ ｐＶａ１丁ｈｒＰｒｏＨ１ｓＧｋＡ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　Ａ費ｃ′ｒＡ　ＡＧＡ　 ＴＣＴ　ＧＧＴ　？’Ｇ？　ＧＣＴ　ＡＯＡ　ＧＴＴ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　Ｔ’ｌ ’Ｔ　ＴfＴ　４Ｂ４３ ＧＬｕ　ＡＬａ　Ｌｙｅ　ＸＬｍ　Ｌｓｕ　Ａｒｇ　５ｓｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　 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Ｓ＠ｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｓ　１１ｓ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　ＨＬｍ　＄＠ｒ　１１＊　 Ｇｌｕ　ｔｈｅ　Ｌｅｕ＾ａｎ　ＣＹ＃　（ｌｕ　ｇ＠ｔＣｙｓ＾５ｎＸｉｓ＾ ａｎＡｓｐＴｙｒＡｓｎＰｈ＠！ｌ＠＾ＩｎＡｊｎＬａｕＶａｌＡｓｎＬ＠ｕＬ ｙｅｕｓ　１２０　１２５ ＬＦＬａｕＸｉｓＩｌ＠Ｓ＠ｇＬｙ−ＡｇｎＬｙｓＰｈｓＧｌｙＡｍｎＰｈｅ入 ａｎＡｓｎＶａｎＰｈ＊Ｐｒｏ　）Ｌｍ　Ｓａｔ　ＸＬ＠Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌａ ｕ　Ｍｒｔ　Ｍ七Ｇｌｕ　Ｓ・ｒ　ＨＬｍ　Ｇｉｎ　ＨＬｍ　Ｌｙｓ　ＡｓｐＱ ｒ　Ｌｙｓ　Ｐｈ＠Ｚｌ＊　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　ＨＬｍ　Ａｓｎ　Ｌａｕ 　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　ｕｐ　Ｘｉｓ　５ｅｔ１６５　１フ０　１フ５ Ｐｈ＠　Ａｇｎ　Ｖａｌ　ＬｙＩＩ　Ｌｙｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　ＨＬｍ 　Ｌｅｕ　Ｉｌｓ　Ｌｙｅ　Ｐｈ＠　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｓ＠■ ！１・Ｔｈｒ　）Ｉｔｓ　Ｌ＠ｕ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｑｒ　Ｇｉｎ　５ｓｒτｙ ｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ＾ａｎτｙｒ　Ａｇｎ　ＴｙｒＬ＠ｕ　Ｌｙｓ　ｋｍｎ　Ｌ ＠ｕ　ｓａｒ　Ａｇｎ工１−工ｉｓ　Ｏｌｕ　Ｔｙｒ　ＧＬｕ　Ｐｈａ（２）　 ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１２に間する情報（Ａ）　長さ：２０塩基対 （Ｂ）　タイプ：核酸 （Ｃ）　鎖：１本鎖 （０）トポロジー二未知 （目）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｉ）配列の記述：　ＳＥＱ　１０ 　ＮＯ＋１２：ＧＡＲＧＴＮＧＡＹＣＣＮＧＡＲＴＡＹＧＴ（２）　ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　１１０：１３に間する情報（ｉ）配列特性 （Ａ）　長さ：２０塩基対 （Ｃ）　鎖冒本鎖 （Ｄ）トポロジー二未知 （１１）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（Ｘｌ）配列の記述：　ＳＥＱ　１ ０　ＮＯ：Ｉ３：（ｉ）配列特性 ＜Ｃ＞　鎖：１本鎖 （１１）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ５ に間する情報（１）配列特性 （Ａ）　長さ：２０塩基対 （Ｂ）　タイプ：核酸 ＜Ｃ＞　鎖冒本鎖 （０）トポロジー二未知 （１１）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｌ）配列の記述：　ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：Ｉ５：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ６に関する情報（１）配列特 性 （Ａ）　長さ：２０塩基対 （Ｃ）　鎖：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （１１）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミツク）（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１９ に間する情報（１）配列特性 （Ａ）　長ざ：！７塩基対 （Ｂ）　タイプ：核酸 （Ｃ）　鎖：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ＩＩ）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｌ）配列の記述：　ＳＥＱ　１ ０　ＮＯ：Ｉ９＋ＧＧＮＣＣＣＡＴＧＴ　ＴＹＴＣＮＧＧ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：２０に間する情報（１）配列特性 （Ａ）　長さ：２０塩基対 （Ｂ）　タイプ：核酸 ＜Ｃ＞　鎖：１本鎖 （Ｄ）トポロジー二未知 （１１）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｌ）配列の記述：　ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：２０：ＧＧＴＧＣＡＡＡＴ　ＣＴＧＡＴＡＴＴＴＣ（Ｂ）　タイプ： 核酸 （Ｃ）　鎖：２本鎖 ＡτＧ入Ｇτ＾ＡＣＧ　τ＾ＣＣＴＴ’ＴＡＧＣ八＾ＣＣＡＡＡＡＣＡ　ＡＴ入 ｘｃ入入入ＡＴ　τ＾ＴＣ八ＡＡへＣＧ　入Ａ＾ＡτＡτＧ`Ａ　６０ ｋＡｃＧＰＡＧｃｋＧ　ＴＡＴＧＣＧＡＡＴＡ　ＴｅＣＴＣＧＡＴＡＴ　０ＴＣ ＡＴＡＴＴＡ？　ＴＣＧＣｋｋＧｋＧＣＴＡＴＴＡＡＡＧ丁`　１９２０ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２に間する情報（１）配列特性 （＾）長さ：４１９塩基対 （Ｂ）　タイプ：核酸 （Ｃ）　鎮：２本鎖 （Ｏ）トポロジー：未知 （１１）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミツク）（ｘｌ）配列の記述：　ＳＥＱ　１ ０　ＮＯ：２２：ＴＣｋｋＣＴｋｋＴｋ　ｋＴｋｋＴＡＴＡＴ？　ＴＴＡＴＧＣ ＾ＧＴＴ　ＴＣＡＡＣｒＴττＧ　ＧｋＴＴｆＴτＡＡＧ　τｋｃｋＧλＡＡf Ｔ　６０ ＴＡＡＡＧＡ丁τ丁ＡＴ丁丁ＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＡＣｒτＧＴＴＴＣＧ ｋｈＣｔｉ〒ＧＴ＾ＱＴ＾ＧｈＴＡＴＧＧＴＡＯＴＴ４１９（２）　ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：２３に間する情報（１）配列特性 （＾）長さ二６７８塩基対 （Ｂ）　タイプ：核酸 ＜Ｃ＞　鎖＝２零鎖 （０）トボコジー：未知 （１１）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（χ１）配列の記述：　ＳＥＱ　１ ０　ＮＯ：２３：ＴＴＴＣＴＣＡτ＾Ａ　ＡＴＣＣＡＴ入Ａ　６フ８（２）　Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４に間する情報（Ｂ）　タイプ：核酸 （ｘｌ）配列の記述：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４：（２）　ＳＥＱ　１０　Ｎ Ｏ：２５ニ間する情報（ｉ）配列特性 （Ａ）　長さ：　１３９５塩基対 （Ｂ）　タイプ：核酸 （Ｃ）ｍｌ：２本鎖 （０）トポロジー二未知 （ＩＩ）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｌ）配列の記述：　ＳＥＱ　１ 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（１１）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミツク）（Ｘｌ）配列の記述：　ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：３３：ＡＧＣＡＧＴＡＴＡＣＧｋｋｋｋＴｋＡｃＡ　ＡＡＣＴＡＡＡ ＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴ　ＡＧ＾ＧｋＡ）＊ＴｋＴ　ＴτＧＡＴＴＧ？Ａ` 　３３００ τＣＣ’ｒ＾Ａτ入Ａτ　＾ＡＴＡＡＴＧ＾ＡＴ　ＴＡＡＴＡＴＣＣＡＩ）　入 丁ＡＴＧＧＡＴＡＴ　ＡＯＡＡＴＡＡ？ＧＧ　ＡＴ’ｌ’Ｔ`ＣＡＴＡＡ　コ３ ６０ Ｇ？ｃＡＴＡＡ　３９０７ （２）　ＳＥｏ　１０　Ｎｆ）＋３４に関する情報（１）配列特性 （Ａ）　長さ＝２５アミノ酸 （Ｂ）　タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （目）分子タイプ：蛋白質 （ｉｘ）特徴 （＾）名前／キー：領域 はＡｒｇの何れかであり得る」 （１ｘ）特徴 （Ａ）　名前／キー：領域 はＡｒｇの何れかであり得る」 （ｘｉ）配列の記述：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３４：Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｘａａ　 Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＭｅｔ　Ｘａａ　Ｘ ａａ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ　Ａｓｎ　ｌｌｅ　Ｇｌｕ　ｌｌｅ　Ａｓｎ（２）　ＳＥ Ｑ　ＩＤ　１１０：３５に関する情報（１）配列特性 （Ａ）　長さ：１７アミノ酸 （Ｂ）　タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トボロジー：不明 （１１）分子タイプ：ペプチド （ＩＸ）特徴 （Ａ）　名前ｌキー：領域 （Ｂ）　位置：１５ （０）　池の情報：／注＝「このアミノ酸はＴｒｅ又はｌｌｅの何れかであり得 る」 （ｘｌ）配列の記述：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３５：Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　ｌｌｅ　 Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ａｓｐ＋　５　１０ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６に関する情報（１）配列特性 （Ａ）　長さ：８アミノ酸 （Ｂ）　タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トボロジー：不明 （１１）分子タイプ：蛋白質 （ｘｉ）配列の記述：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：３７に間する情報（ｉ）配列特性 （Ａ）　長さニアアミノ酸 （Ｂ）　タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （１１）分子タイプ：ペブチト （×Ｉ）配列の記述：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３７：（２）　ＳＥＱ　１０　Ｎ Ｏ：３Ｂに関する情報（１）配列特性 （Ａ）　長さ；６６塩基対 （Ｂ）　タイプ：核酸 （Ｃ）　鎖：２本鎖 （Ｄ）トボロジー：不明 （１１）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミツク）（×１）配列の記述：　ＳＥＱ　１ ０１１０：３８：＾ＴＧＧＣＴＡＧＡＧ　ＡＴＣＴＣＧＴＡＡＧ　ＴＴＴＡＣＴ ＡＴＴＴ＾ＴＧＴＧＴＡＡＣＴ　ＡＴＧＴＴＡＡＴＡＴ　ＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣ ６０ＧＡＡＧＣＡ　６６ （２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３９に関する情報（１）配列特性 （＾）長さ：５１塩基対 （Ｂ）　タイプ：核酸 （Ｃ）＠：２本鎖 （Ｄ）トボロジー：不明 （１１）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（×１）配列の記述：　ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：３９：ＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡ　ＣＡＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＡＡＧＴＡ ＧＡＣＣＣＣＧＡＧＴＡＴＧ　ＴＡＡＣＴＡＧＴＡＡ　Ｔ　５１（２）　ＳＥＱ 　１０　ＮＯ：４０に間する情報（ｉ）配列特性 （Ａ）　長さ：２４塩基対 （Ｂ）　タイプ：核酸 ＜Ｃ＞　鎖：２本鎖 （０）トボロジー：不明 （ｉ　ｉ）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｉ）配列の記述：　ＳＥＱ　 １０　ＮＯ：４０：ＡＡＴＡＡＴＡＧＡＴ　ＴＴＡＡＴＡＡＴＧＴ　ＡＴＴＴ　 ２４図２ 図　２（続き） ＡＡＴ　ＣＡＡ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＡＴＡ　ＡＴＣＡＴＡ　ＡＴＣＴＧＴ　ＡＴ Ｔ　ＡＡＴ　（Ｊτ　ＡＣＴ　ＴＡＡ　ＴＯＧ　ＡＴＡ　τ`’ｌ’　８７４ Ｔ１ｍ　Ｌａｕ　ＨＬｍ　Ｐｈａ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　 Ａｓｎ　ＨＬｍ　Ｈａｔ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ@ＩＬ＊ ＡＣＡ　ＡＴ？’　ＡＴＡ　ＴＡＴ　ＡＴＣＴＣＣＣＧＡ　ＡＣＴ　Ｔｋｋ　Ｃ ＣＡ　ＴＧＴ　ＡＧＡ　ｆｆｌ’　ＡＴＣ八↑へＴ’！”Ｔ@でＣτ　９２５ Ｃｙ自Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｉｌ−Ａｓｐ　ＧＬｙ　Ｓｉｒ　Ｓｓｒ　Ｌａｕτｒｐ 　Ｔｈｘ　Ｓａｔ　Ｌｙｅ　ＡＱ　ＨＬｍ　Ｌｙｓ＾ｒｇ２７０　２７５　２８ ０　２Ｅ１５ ＧＧｋ　ＴＭ　ＴＴＣＴＣＡ　ｆｆＴ　ＴＡＧ　ＡＭ　ＡＧＡ　ＣＴＴ　ＴＣＴ 　ＣｋＴ　Ａ’！’Ａ　ＴＡＣＴＡＡ　ＴＧＧ　ＡＡＴ　ＧbＣ１０）８ Ｓ＠ｒ　Ｌｓｕ　ＧＬｕ　８＠ｒ　Ｌｙｓ　Ｌ＠ｕ　Ｐｈａ　Ｓｉｒ　ＬＹ＊　 ｘｒｇ　ＭセＴｙｒ　ＶａＬ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　ＨＬｍ　Ｇkｙ コ２５　３３０　３３５ ｆｆｌ’τＡＴＡ　ＡＴＴ　ＡＴＴ　ＡＧＡ　ＴＧＴ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＡＣＴ 　ＡＴＴ　ｈＡＴ　ＡＴＴ　ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＴＴ’Ｔ　Ａ窒メ@ＴＴＧ　１１ ２９ Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｙｌｌ　Ｌｙｓ　Ｓｉｒ　Ｔｈｅ　工１ｍ　Ｐｈａ　ｒｈｔ 　入−ｎ　工Ｌｍ　Ａｇｏ　Ｘｉｓ　Ｍｎ　ＬＹＩＩ　ＡＳo　Ｇｉｎ コ４０　３４５　３５０ τ入＾　ＡＴＡ　ｆｆＴ　ＴＴＴ　丁入τ　ＡＧＴ　ＣＣＡ　入ＡＡ　ＴＡＧ　 入ＡＡ　八人ＡＴ〒Ｔ’ｌ’Ｃ！　７７丁　八人Ｔ　ＡＴＴs　ＡＴＴ　１１８ ０ Ｌ＊ｕ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　工１ｍ　Ｔｈｒτｒｐ　Ｐｈ＠Ｌａｕ　Ｐｈ ・Ｐｈａ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　Ｌｙ■Ｉｉｓ　Ａｍｎ　Ａｓｎ３５５　’　３６０ 　３６５　３フロ 丁丁ＣＡＡＡ　ＡＴＴ　八人τ　ＡＴＴ　入Ｔ？　ＡＡＴ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　Ｔ ＧＱ　ＡＴＣＴＡＡ　入ＡＣＴＡＡ　ＴＴＣ＾↑丁　ＡＴＡ@１２コＩ ＧＬｕ　Ｐｈａ　Ａｍｎ　工Ｌ＠　Ａｓｎ　Ａｇｎ　工Ｌ＠　）Ｈｌｓ　Ａ＋ｗ ｎ　Ｐｒｏ　入ｓｐ　Ｌａｕ　ＶａＩ　Ｌａｕ　ＧＬｕ　Ａ唐氏@Ｔｙｔ τ入＾　丁ＡＴＴ↑ＣＣＡＡ　ＧＴＡ　ＴＴＴ　？＾τ　ＡＧＧ　ＴＡＴ　八人 Ａ　ＴＣＴ　ＴＡ（：　’ｆ’Ｔ〒ＡＣＣＴＣＴ　ＴＧ丁？sＣ１２Ｂ２ Ｌ＠ｕ　工Ｌｍ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　ｆＬａ　Ｐｒｏ　工Ｌｍ　 Ｐｈｅ　Ｔｈｅ　Ｖａｎ　Ｌｙｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ@Ｇｌｕ コ９０　３９５　４００　４０５ ＡＴＣへ丁Ｃ入ＴＣＡＴＣＴＡＴ　ＡＴＴ　Ｔ’ＴＣＴＡＡ　ＴＡＴ　ＡＧＣＴ ＡＴ　ＡＭ　ＴＧＣＡＴＴ　ＡＣＴ　ＡＴＴ　ＡＴＡ　１３R３ ＾ｓｐ　八−ｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　工Ｌｍ　Ｌｙｅ　ＧＬｕ　Ｌ＠ｕ　ＨＬｍ　 ＡＬａ　工１ｅ　Ａｍｎ　ＡＬａ　ｋｅｎ　Ｔｈｅ　Ａｍｎ@τｙｒ ＴＴ’Ｔ　八人Ｔ　ＡＣＧ　ＡＴＴ　ＴＡＴ　ＡＭ　ＡＴＡ　ＴＡＣＣＡＴ　Ａ ＴＴ　ＡτＣＴ入ＴＴＴ丁　ＡＣＴ　ＡＡＡ　八人Ａ　ＴＡ`　１３８４ Ｌｙｓ　工Ｌ＠　Ｐ：ｏ　Ａｇｎ　工Ｌｍ　Ｐｈａ　τｙ！＋　Ｖａｎ　Ｈａヒ 　Ａ＃ＩＩ　ＡＩＩＰ　工ｉｓ　Ｌｙｓ　Ｂａｒ　Ｐｈａ　oｈａ　Ｌ自ｕ ｃＡ？　ＡＧＡ　（：ＡＴ　ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＡＣＣＡＧＡ　ＴＴＣＴ ＧＯＣＡＴ　ＡＴＴ　ＴＡＡ　ＡＴＴ　’！？↑　ＡＴＴ　sＧＧ　工４３５ Ｈ−仁　Ｓｉｒ：　Ｍ仁　Ｐｈａ　ｋｍｎ　Ｚｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｇｌｕ　 Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｅ　入ｓｎ@Ｐｒ。 １！Ｉ　２（続き） 図　２（続き） ？？’ＣＴＴＣＡＧＴ　ＡＴＴ　ＴＭ　ＡＴＴ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＡＴＡ　ＴＣ ＣＡＡＧ　Ａｆｆ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　ＡＴＴ　ＴＯＡ　ＴＧ`　２４６９ Ｇ↓ｕ　ｃｌｕ　Ｔｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈ＠Ｔｙｒ　Ｇ Ｌｙ　ＬｅｕＭｎ　Ａｉｎ　Ｌｙｅ　Ｌｙｅ　Ｓｅｘ　５ｔ≠■ フ５０　７５５　７６０　７６５ Ａｆｆｌ　？＋ｒＣＡＡＣＡＪｔＴ　ＡＧＡ　ＴＴ’ｌ’　ＴＮＴ　ＡＴＡ　’ ｌ’ＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＡＴＣＡＡＴ　ＡＣＴ　ＣＴＡ@ＣＭ　Ａ’ｆｆ　 ２５７３ ！Ｉｍ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ａａｎ　Ａｒｇ　Ｐｈ＠Ｔｙｒ工１ｍ　Ｔｙｒ　Ｌｙ ｓ　Ａｒｇ　Ｍａｔ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　ＶａＩＧｌｎ　ｌ１■ ＧＯＴ　ＴｃＡ　＾Ｃで　ＡＡＴ　入ＡＴ　入＾τ　＾ＴＡＴ’？？Ａｌａ　ｊ ａｗ、５，３．。１．。３．。ｘｘ。Ｐｈａ　ＴＡＴ　ＧＣ：ｋ　ＧＴＴ　ＴＣ Ｊ　ＡＣＴ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＴＴＡ　QＢ２８ ８６ｏａ６５　ｒｙｒ　Ａｌａ　Ｉ／ａｌ　Ｓａｔ　ＴｈｒＰｈ＠Ｇｌｙ　Ｐｈ ａ　Ｌ＊ｕ８７０　、．５ ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＡＣＣＡＡＡ　ＡＣＡ　ＡＴＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＴＴＡ　Ｔ ＣＡ　ＭＴ　ＣＧＡ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＡＴＡ　入`Ｇ　３１４５ Ｌａｕ　Ａｌａτｈｒ　Ｌｙｅ　Ｔｈｅ工１ｅ　Ａｒｇ　Ｌｙ嘗−５ａｔ　Ａｓ ｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　ＺＬａ　ＬＹ口図　２（続き） ＧＴ”ｒ　ＣＣＡ　Ｔ’ＴＡ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　ＧＴＧ　ＴＧＴ　ＡＡＴ　ＧＡ Ａ　ＡＣＴ　ＴＣＴ　ＧにＧＴ　ＧＴ”ｌ’　ＡＣＴ　ｆｆAｌ　ＧＡＡ　ＴＣ Ａ　コ２４７ ＶａＬ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　ＶａＬ　Ｃｙｓ　Ａｇｎ　ＧＬｕ　 Ｔｈｒ　５ｓｉｒ　ＧＬｙ　ＶａＬ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　ＧＬ普@５ｔａｒ： ＴにＧＴ　Ａ（Ｊ　ＣＣＡ　ＡＡＴ　ＡＴＡ　ＣＡＡ　ＧＴｋ　ＡＴＴ　ＧＡＡ 　丁τＡ　ＧＡｃ　ＡＡＴ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　ＧＴＴ　ＡＧ`　ＡＴＣコ２９８ Ｃｙｓ　Ｓ＠ｌ？　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　工１ａ　Ｇｌｕ　ｖａＬ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ 　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　ＨＬｍ　Ｖａｌ　人ｒX　工１・ ９８Ｓ　９り０　９９５　１０００ 人ＡＡ　ＧＴ’Ｔ　ＣＡＣＧＧＣＧＡＴ　ＡＣＡ　ＴＴＡ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　Ａ ＴＧ　ＴＧＴ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　Ｔ’ＴＡ　７２０　ＴＴＣbＣＧ　ココ４９ ＬＹ＠　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　ＧＬｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　ＧＬｕ　 Ｍａｔ　ＣＹ＠　Ｐｈ＠ＧＬｕ　Ｌａｕ　Ｌｓｕ　Ｐｈｓ　oｒ。 工ｏｏｓ　１ｏｔａ　１ｏｘｓ ＴＧＴ　ＡＡＴ　Ｃ’ｌ’Ａ　ＡＡＣＧＡＡ　Ｇ（：ＣＣＡＡ　ＣＴＡ　ＴＧＧ 　入ＡＡ　ＴＡＴ　ＣＴＡ　ＡＧＴ　ＣＧＡ　ＴＴＡ　ＴＴb（：ＴＡ　コ４０ ０ Ｃｙｓ　Ａｓｎ　ＶａＬ　入−ｎ　ＧＬｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　ＶａＬ　Ｔｒｐ　 ＬＹＩＩ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　５ｅｒ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｌａ普@Ｌａｕ １０２０　１０２５　！０３０　１０３５ＯＡＴ　ＡＡＴ　ＣＴＡ　ＴＣＡ　Ｃ ＡＴ　ＡＡＴ　ＧＡＣＧＴＡ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＡＡＡ　ｆｆＡ　ＧＣＴ　ＡＡ Ｔ　ｆｆｌ　ＡＧＡ　bＴＯ！４５１ Ａｓｐ　入−ｎ　Ｖａｌ　５ａｒ　Ｈｌｓ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　ＶＪＬＩ　Ｌｙｅ 　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｓｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｈａ　入ｘ早@Ｚ、＊ｕ 工０４０　１０４５　ユ０５０ ＡＣ？　Ｃ’ｌｌ”！’　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＡＭ　ＣＡＴ　Ｔ’？Ａ　ＡＡＡ　 Ｔ’ＴＡ　ＡＡＡ　Ｇ＾ＡＡτｃａｂτ　ＣＡＡ　ＣＣＯＣsＡ　ＡＴＴ　コ５ ０２ τｈｒ　Ｌ＠ｕ　Ａｓｎ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｓ　Ｌ壷ｕ　 Ｌｙｓ　ＧＬｕ　工１・　Ａｍｐ　ｃａｎ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ@Ｐｈａ 工０５５　ユｏｓｏ　１０６５ Ａ？’で　ＴＡＴ　Ｔ′ＴＴ　ＧＴＣＣＡＴ　ＧＡＴ　ＴＴＧ　ＧＧＡ　ＡＡＴ 　丁ＡＴ　ＧＧＡ　ｆｆＡ　ＡＴＴ　ＡＣＴ　ＡＡＣＧＡＡ@ＡＡＴ　３５５３ Ｘ１＊　Ｔｙｒ　Ｐｈａ　ＶａＬ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　ＧＬｙ　入ａｎ　 Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　エ１ｍ　Ｔｈｒ　ＬＹ＊　ＧＬｕ@八１ｎ ＡＴ？　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＴＴＡ　ＣＡＡ　ＣＴＴ　八人ＣＡ ＡＡ　ＧＡＴ　ＧＣＡ　ＴＣＡ　ＴＴＴ　Ａｆｆ　ＡＣＴ　■sＡ　３６０４ 工Ｌｅ　Ｇｉｎ　Ａｍｎ　ｋｍｎ　Ｍｎ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　ＶａＬ　Ａｍｎ　Ｌ ｙｓ　Ｍｐ　ＡＬａ　Ｈｅｒ　Ｐｈ−エエａ　Ｔｈｔ：　！kｍ １０９０　、１０９５　１１００ ｆｆｌ　ＣＣＡ　ＣＡＡ　２人７　ＧＣＧ　ＴＡ’！’　ＡＴＴ　ＴＣＴ　ＴＴ Ａ　ＧＧＴ　ＡＨＡ　ＡＡＡ　ＧＴＡ　ＴｋＴ　ＴＴＡ　Ａ`Ｔ　ＧＡＡ　３６ ５５ Ｐｈ＊　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　ＡＬａτｙｒ：ｕ＠　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　ＧＬ ７　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ＶＪＩＬ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ＾−ｎ　Ｃkｕ １１０５　１１１０　１ｌｌｓ　１１２０人ＡＡ　ＧＴｋ　ＡＣＴ　ｆｆＴ　Ｇ ＡＴ　ＧＴｋ　ＡｅＴ　ＡＣＡ　ＣＡＴ　ＣＣＡ　ＡＣＴ　ＭＴ　ＡＴＴ　ＡＣ Ｔ　ＴＴＡ　ＧＡＴＴ■s　３］ｏ６ ＬＹＩＩ　ＶａＬ　Ｔｈｅ　ＰＭ　入ｓｐ　ＶａＬ　Ｔｈｅ　Ｔｈｅ　＾１ｐ＾ １龜　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｚ工・　Ｔｈｅ　Ｌａｕ　Ａａｐ　oｈ＊ １１２５１１コ０１１３５ ＡＡＴ　ＭＡ　ＴＣＴ　ＧＴｒ　ＡＡＴ　ＡＴ（：　ＧＣＡ　ＧＴＡ　ＴＣＡ　 ’ｍｃ　ｃτＴＧ＾τ　ＡＴＡ　ＴＡＴ　〒へ〇〇入ＡＧ丁s　３７５） Ｍｎ　Ｌｙｓ　５＊ｒ　Ｖａｌ　人１ｎ　工１＠　ＡＩＪＬ　ＶＪＩＬ　５＠ｒ 　Ｐｈ・　Ｌａｕ　Ａｓｐ　工ｉｓ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌ普@Ｖａｎ ＋１ｕＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＣＡＡ　（：ＡＡ　ＡＡＡ　ＧｋＴ　ＴＴＡ　ＴＴ Ａ　八人Ａ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＡＧＡ　丁`ＣＧＧＴ　３１１ ０１１ Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｍｎ　ＧＬｕ　Ｇｉｎ　ＫＩＹ＠Ａｇｐ　Ｌｍｕ　Ｌａｕ　 Ｌｙｅ　Ａｍｐ　Ｌ仙し＊ｕ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　Ｔ）ｒｒ　fｌｙ １１５５　工１６０　１１６５　１エフ。 ＧＡＡ　ＴＴＴ　Ｇｋｋ　ＧＴＣＴＡＴ　ＡＡＣＧＣＡ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＧＧ Ａ　ＴＴＡ　ＡＴＴ　ＴＡＴ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＣsＡ　３Ｂ５９ Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａａｎ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｅ　 Ｇｌｙ　Ｌｓｕ　工１＠　Ｔｙｒ　＾１１１　Ｌ）ｎ　Ａｓ氏@Ｌ＊ｕ λＧＴ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＧＴＣＡＴＴ　Ｃ ＡＡ　ＧＴＡ　ＧＡＡ　ＡＧＧ　’！”！’Ｇ　ＣＣＡ　Ｇfｆｆ　ＡＡで　３ ９１０ Ｓｅｔ　Ｚｌｅ　ＬＹ＠　ｋＩＩｎ　Ｔｙｔ　ＡＪＩＰ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ工Ｌｍ 　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　ＧＬｕ　ｋｘｇ　Ｌｓｕ　Ｐｒｏ　Ｖａ戟@Ａｓｎ 図　２（続き） 図　２く続き） 図　２（続き） 図　２（続き） 図３ 丁入Ａ　ＡＴＴ　ｆｆｌ　ＴＡＡ　ＣＡＴ　τ丁ＴＡＴＴ　ＡＴＴ　ＡＴＴ　Ｔ ＣＡ　でＡＡ　ＴＴＣＴＴＴ　ＡＴＴ　τＡＡＴτＣＧＴで@１０４ Ｌ＊ｕ　Ａｓｎ　ＬＹＩ　Ｌａｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｅ　Ａｓｎ　Ｍｎ　Ａｓｎ　５ ＊ｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　`ｓｎ 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アメリカ合衆国　６５２０３　ミズリー州　コロンビア　アルハンブラ　２１１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．天然では一緒に存在する他のウイルスヌクレオチド配列との関連から離れた エントモボックスウイルスのスフェロイジン遺伝子ポリヌクレオチド配列。 ２．一つ以上のスフェロイジン遺伝子コーディング配列、スフェロイジン遺伝子 調節配列、スフェロイジン遺伝子プロモーター配列、対立遺伝子変異型またはそ れらの断片からなる群から選ばれる特許請求の範囲第１項に記載の配列。 ３．上記のポリヌクレオチド配列がＤＮＡ配列である、特許請求の範囲第１項に 記載の配列。 ４．上記の配列がアムカスタ・モオレイ・エントモポックスウイルスに由来する 、特許請求の範囲第１項に記載の配列。 ５．図２のヌクレオチド＄１〜＄６７６８の範囲の配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ 、図２のヌクレオチド＄３０８０〜＄６０９１の範囲の配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：２１、それらの対立遺伝子変異型、類似体または断片からなる群から選ばれる 、特許請求の範囲第４項に記載の配列。 ６．選ばれた宿主細胞中で上記の配列または断片が機能できるように連結されて いる異種遺伝子の発現を指令する能力を有することを特徴とする、特許請求の範 囲第２項に記載の配列。 ７．エントモボックスウイルスのスフェロイジン遺伝子ポリヌクレオチド配列、 その対立遺伝子変異型または断片を含めてなる第一のポリヌクレオチド配列と、 これに関連づけられた、異種遺伝子をコードした第二のポリヌクレオチド配列と を含めてなる、ポリヌクレオチド配列。 ８．天然では一緒に存在する他のウイルスヌクレオチド配列との関連から離れた エントモボックスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子ポリヌクレオチド配列。 ９．一つ以上のチミジンキナーゼ遺伝子コーディング配列、チミジンキナーゼ遺 伝子調節配列、チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター配列、それらの対立遺伝子 変異型またはそれらの断片からなる群から選ばれる特許請求の範囲第１項に記載 の配列。 １０．上記のポリヌクレオチド配列がＤＮＡ配列である、特許請求の範囲第８項 に記載の配列。 １１．上記の配列がアムカスタ・モオレイ・エントモボックスウイルスに由来す る、特許請求の範囲第８項に記載の配列。 １２．図３のヌクレオチド＄１〜＄１５１１の範囲の配列ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：８ 、図３のヌクレオチド＄２３４〜＄７８２の範囲の配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ ８、図３のヌクレオチド＄７８３〜＄８５１の範囲のＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９ 、それらの対立遺伝子変異型、類似体または断片からなる群から選ばれる、特許 請求の範囲第１１項に記載の配列。 １３．選ばれた宿主細胞中で上記の配列または断片が機能できるように連結され ている異種遺伝子の発現を指令する能力を有することを特徴とする、特許請求の 範囲第９項に記載の配列。 １４．エントモボックスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子ポリヌクレオチド配 列、その対立遺伝子変異型または断片を含めてなる第一のポリヌクレオチド配列 と、これに関連づけられた、異積遺伝子をコードした第二のポリヌクレオチド配 列とを含めてなる、ポリヌクレオチド配列。 １５．エントモボックスウイルスのスフェロイジンポリペプチド、その断片また はその類似体。 １６．異種タンパク質またはペプチドに融合された、特許請求の範囲第１５項に 記載のポリペプチド。 １７．エントモボックスウイルスのチミジンキナーゼポリペプチド、その断片、 またはその類似体。 １８．異種タンパク質またはペプチドに融合された、特許請求の範囲第１７項に 記載のポリペプチド。 １９．エントモポックスウイルスのスフェロイジンプロモーター配列、その対立 遺伝子変異型またはその断片をコードしたポリヌクレオチド配列を含めてなる組 替えポリヌクレオチド分子であって、上記のプロモーター配列が選ばれた異種遺 伝子配列に機能できるように連結され、上記のプロモーター配列が選ばれた宿主 細胞またはウイルス中での複製と発現を指令することができる組替えポリヌクレ オチド分子。 ２０．エントモボックスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター配列、その対 立遺伝子変異型またはその断片をコードしたポリヌクレオチド配列を含めてなる 組替えポリヌクレオチド分子であって、上記のプロモーター配列が選ばれた異種 遺伝子配列に機能できるように連結され、上記のプロモーター配列が選ばれた宿 主細胞またはウイルスの複製と発現を指令することができる組替えポリヌクレオ チド分子。 ２１．選ばれた異種遺伝子配列をコードしたポリヌクレオチド配列に枠内で連結 された、エントモボックスウイルスのスフェロイジン遺伝子、その対立遺伝子変 異型、またはその断片をコードしたポリヌクレオチド配列を含めてなる組替え分 子。 ２２．選ばれた異種遺伝子配列をコードしたポリヌクレオチド配列に枠内で連結 された、エントモボックスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子、その対立遺伝子 変異型、またはその断片をコードしたポリヌクレオチド配列を含めてなる組替え 分子。 ２３．選ばれた異種遺伝子配列を挿入させたエントモボックスウイルスのスフェ ロイジン遺伝子ポリヌクレオチド配列、その対立遺伝子変異型、またはその断片 を含めてなる組替え分子。 ２４．選ばれた異種遺伝子配列を挿入させたエントモボックスウイルスのチミジ ンキナーゼ遺伝子ポリヌクレオチド配列、その対立遺伝子変異型、またはその断 片を含めてなる組替えの分子。 ２５．選ばれた異種遺伝子配列に任意付加的に連結されることもあり得るエント モボックスウイルスのスフェロイジン遺伝子ポリヌクレオチド配列、その対立遺 伝子変異型、またはその断片を含めてなるポリヌクレオチド配列を含めてなる組 替えウイルス。 ２６．脊椎動物ボックスウイルス、オルトボックスウイルス、スイボックスウイ ルス、ワクシニアウイルスおよびエントモボックスウイルスからなる群から選ば れるボックスウイルスである、特許請求の範囲第２５項に記載のウイルス。 ２７．選ばれた異種遺伝子配列に任意付加的に連結されることもあり得るエント モボックスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子ポリヌクレオチド配列、その対立 遺伝子変異型、またはその断片を含めてなるポリヌクレオチド配列を含めてなる 組替えウイルス。 ２８．脊椎動物ボックスウイルス、オルトボックスウイルス、スイボックスウイ ルス、ワクシニアウイルスおよびエントモボックスウイルスからなる群から選ば れるポックスウイルスである、特許請求の範囲第２７項に記載のウイルス。 ２９．選ばれた異種遺伝子配列に任意付加的に連結されることもあり得るエント モボックスウイルスのスフェロイジン遺伝子ポリヌクレオチド配列、その対立遺 伝子変異型、またはその断片を含めてなる組替えウイルスで感染させた細胞。 ３０．昆虫細胞と哺乳類細胞からなる群から選ばれる、特許請求の範囲第２９項 に記載の細胞。 ３１．選ばれた異種遺伝子配列に任意付加的に連結されることもあり得るエント モボックスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子ポリヌクレオチド配列、その対立 遺伝子変異型、またはその断片を含めてなる組替えウイルスで感染させた細胞。 ３２．昆虫細胞と哺乳類細胞からなる群から選ばれる、特許請求の範囲第３１項 に記載の細胞。 ３３．選ばれたポリペプチドをコードした異種遺伝子配列に機能できるように連 結されたエントモボックスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子ポリヌクレオチド 配列、その対立遺伝子変異型、またはその断片を含めてなる組替えウイルスで感 染させた選ばれた宿主細胞を培養し、上記のポリペプチドを培養基培地から回収 することを含めてなる、上記の選ばれたポリペプチドの製法。 ３４．選ばれたポリペプチドをコードした異種遺伝子配列に機能できるように連 結されたエントモボックスウイルスのスフェロイジン遺伝子ポリヌクレオチド配 列、その対立遺伝子変異型、またはその断片を含めてなる組替えウイルスで感染 させた選ばれた宿主細胞を培養し、上記のポリペプチドを培養基培地から回収す ることを含めてなる、上記の選ばれたポリペプチドの製法。 ３５．エントモボックスウイルスのスフェロイジンをコードしたポリヌクレオチ ド配列へ挿入された選ばれた異種遺伝子配列を含むポリヌクレオチド分子で、組 替え宿主細胞を形質転換することを含み、スフェロイジンタンパク質の発現によ って通常形成される閉鎖体の非存在が異種遺伝子の組込みを示す、異種遺伝子挿 入用の組替え宿主細胞をスクリーニングする方法。 ３８．エントモボックスのチミジンキナーゼをコードしたポリヌクレオチド配列 へ挿入された選ばれた異種遺伝子配列を含むポリヌクレオチド分子で、組替え宿 主細胞を感染させることを含み、不活性チミジンキナーゼ配列の組込みによって 形成されるチミジンキナーゼ機能の存在が異種遺伝子の挿入を示す、異種遺伝子 挿入用の組替え宿主細胞をスクリーニングする方法。