ES2217339T3 - Enzimas insecticidas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de control de un organismo nocivo que no forma parte de la clase de los mamíferos, elegido entre los insectos, los nematodos y los ácaros, y que consume tejidos vegetales, que comprende la administración al vegetal o al suelo que lo rodea, o el aporte sobre o en el tejido del vegetal, de una enzima que cataliza una reducción del grupo 3-ceto de 3-deshidroecdisona o de 3-deshidro-20-deshidroecdisona en un grupo 3a-hidroxi.
Description
Enzimas insecticidas.
Los insectos cuestan a los granjeros miles de
millones de dólares anualmente, en pérdidas en los cultivos y en
gastos para mantener estos parásitos bajo control. Las pérdidas
causadas por los insectos parásitos en los sectores de la producción
agrícola comprenden una reducción del rendimiento del cultivo, una
menor calidad del cultivo y mayores costes de recogida.
Los pesticidas químicos han proporcionado un
procedimiento eficaz de control de los parásitos; sin embargo, la
opinión publica se interesa por la cantidad de residuos químicos
que se encuentra en la comida, el agua subterránea y el
medioambiente. Por esta razón, hay cada vez más interés por los
pesticidas químicos sintéticos, y por consiguiente, por sus
potenciales consecuencias tóxicas sobre el medioambiente. Los
pesticidas químicos sintéticos pueden envenenar el suelo y las
capas acuíferas, contaminar las aguas superficiales como
consecuencia del riego, y destruir formas de vida contra las que no
se apunta. Los agentes químicos sintéticos de control tienen la
desventaja adicional de presentar peligros para la seguridad
pública cuando se aplican en zonas en las que los animales
domésticos, los animales de la granja o los niños pueden entrar en
contacto con éstos. También pueden presentar peligros para la salud
del personal que los aplica, en particular si no se siguen las
técnicas apropiadas de aplicación. Las agencias de regulación por
el mundo restringen y/o prohíben el uso de numerosos pesticidas y,
en particular, de los pesticidas químicos sintéticos orgánicos,
que persisten en el medioambiente y entran en la cadena
alimentaria. Ejemplos de pesticidas químicos sintéticos ampliamente
utilizados comprenden organoclorados, por ejemplo el DDT, el mirex
la kepona, el lindano, la aldrina, el clordano, el aldicarbo y la
dieldrina; organofosfatos, por ejemplo el clorpirifos, el
paratión, el malatión y el diazinón, y carbamatos. Nuevas y severas
restricciones acerca del uso de los pesticidas y la eliminación de
ciertos pesticidas eficaces del mercado pueden limitar las
opciones económicas y eficaces de control de los parásitos costosos
de eliminar.
A causa de los problemas asociados a la
utilización de pesticidas químicos sintéticos orgánicos, existe una
clara necesidad de limitar el uso de estos agentes, y una necesidad
de identificar agentes alternativos de control. La sustitución de
los pesticidas químicos sintéticos, o la combinación de estos
agentes con pesticidas biológicos, puede reducir la proporción de
los productos químicos tóxicos en el medioambiente. Un agente
pesticida biológico que goza de una creciente popularidad, es el
microbio de los suelos Bacillus thuringiensis (B.t.).
Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva,
esporulante, caracterizada por inclusiones cristalinas, proteicas
parasporales. Estas inclusiones aparecen frecuentemente al
microscopio, como cristales de formas distintivas. Las proteínas
pueden ser muy tóxicas para los parásitos, y específicas en lo que
respecta a su actividad tóxica. Se han aislado y sequenciado
ciertos genes de toxina de B.t, y se han producido y
aprobado productos de B.t. basados en el ADN recombinado
para un uso. Además mediante el uso de técnicas de ingeniería
genética, se están desarrollando nuevos estudios de administración
de estas endotoxinas de B.t. en los entornos agrícolas,
incluido el uso de plantas genéticamente tratadas con genes de
endotoxina para la resistencia a los parásitos, y el uso de células
microbianas intactas estabilizadas como vehículos de administración
de endotoxina de B.t.. Hasta estos últimos diez años, el
uso comercial de pesticidas de B.t. se ha limitado en gran
medida a una estrecha gama de lepidópteros parásitos (orugas). Sin
embargo, estos últimos años, unos investigadores han descubierto
pesticidas de B.t. con especificidades para una gama más
amplia de parásitos.
Desgraciadamente, ciertos insectos son
refractarios a los efectos del B.t. y/o los insectos pueden
desarrollar una resistencia al B.t.. Los primeros comprenden
insectos tales como el picudo del algodonero y del noctuido ypsilon,
así como los insectos adultos de la mayoría de las especies que no
han demostrado hasta la fecha ninguna sensibilidad significativa
aparente a las \delta-endotoxinas de B.t.
En lo que respecta a estas últimas, las estrategias de gestión de
las resistencias en la tecnología de las plantas transgénicas a
B.t. se alcanza una posición importante. Sin embargo, sigue
habiendo una gran necesidad de identificación de nuevos
procedimientos de control de los insectos, que son eficaces, y
también seguros para un uso en el medio ambiente.
Un posible enfoque del control de los insectos
implica la ruptura de las funciones metabólicas vitales del
insecto. Los compuestos esteroides desempeñan una función
importante en el crecimiento y el desarrollo de los insectos. Los
insectos son incapaces de formar la estructura cíclica de
ciclopentaperhidrofenanterno de los esteroides. Por esto, son
dependientes de fuentes de esteroides alimentarios colesterol y/o
\beta-sitosterol) para la posterior elaboración
de los esteroides del desarrollo, incluida la ecdisona y la
20-hidroxiecdisona. La ecdisona y la
20-hidroxiecdisona son hormonas pivote en la
metamorfosis de los insectos. La ecdisona oxidasa interviene en la
oxidación de la ecdisona y de la 20-hidroxiecdisona
en la 3-deshidroecdisona y en la
3-deshidro-20-hidroxiecdisona,
respectivamente, además de H_{2}O_{2}. Los insectos parecen ser
únicos en lo que respecta a esta reacción de oxidación. Los
productos de reacción tienen una actividad marginal de muda, y
ninguna otra actividad hormonal conocida, de este modo se supone que
la ecdisona oxidasa participa en las vías de inactivación del
catabolismo de los esteroides. La ecdisona oxidasa se localiza en
el cuerpo graso y el citosol del intestino de los insectos. Unos
estudios han demostrado que la ecdisona y la
20-hidroxiecdisona administradas de manera exógena
pueden tener un profundo efecto sobre el desarrollo del insecto,
pudiendo incluso ocasionar la muerte (Tananka, 1993).
El gen que codifica la colesterol oxidasa se ha
clonado en plantas (Purcell, 1994; Corbin, 1994). Sin embargo, los
mamíferos son dependientes del colesterol como precursor de la
elaboración de las hormonas esteroideas (corticosterona, hormonas
sexuales, etc.). Dicha presentación de una enzima activa en las
plantas puede plantear cuestiones de seguridad a causa de la
potencial interferencia con la elaboración de los esteroides de
mamífero.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de control de los parásitos que no forman parte de la
clase de los mamíferos. Según la invención, un procedimiento de
control de un organismo nocivo que no forma parte de la clase de los
mamíferos, elegido entre los insectos, los nematodos y los ácaros,
y que consume tejidos vegetales, comprende la administración al
vegetal o al suelo que lo rodea, o el aporte sobre o en el tejido
del vegetal, de una enzima que cataliza una reducción del grupo
3-ceto de la 3-deshidroecdisona o
de la -deshidro-20-hidroxiecdisona
en un grupo 3\alpha-hidroxi.
El procedimiento de la invención es
particularmente ventajoso puesto que la vía que se perturba no
existe en los mamíferos y, por consiguiente, los materiales y los
procedimientos de la invención son muy selectivos y no se le conoce
que plantee ningún riesgo de seguridad para el hombre.
En una realización preferida de la invención, el
procedimiento comprende además la administración a dicho organismo
nocivo, de una -endotoxina de Bacillus thuringiensis. La
administración puede ser la de un huésped transformado para
expresar la \delta-endotoxinas de Bacillus
thuringiensis y dicha enzima.
El huésped puede ser por ejemplo, una planta
sobre la cual el parásito se va a alimentar. En una variante, el
huésped puede ser un microorganismo como un hongo o una bacteria,
que se puede aplicar entonces en el lugar en el que el parásito
deber ser controlado. Los microbios transformados pueden estar
vivos, y elegidos de manera que colonicen las zonas en las que los
parásitos deben ser controlados. Igualmente, el microbio puede
haber sido matado después de la producción de la proteína, en cuyo
caso el microbio se utiliza simplemente para administrar el
compuesto pesticida.
El uso de un pesticida con base proteica como la
ecdisona oxidasa, cuyo modo de acción y cuya composición molecular
son distintos de los del B.t., proporciona una excelente
alternativa al B.t. en los esquemas de gestión de las
resistencias.
Además de la ecdisona oxidasa, también se puede
utiliza la enzima 3-oxoecdisteroide
3\beta-reductasa como agente de control, sola o
expresada con la ecdisona oxidasa. Esta enzima proporciona también
un control selectivo de los parásitos sin afectar ninguna vía
biológica conocida de los mamíferos. La
3-oxoecdisteroide
3\beta-reductasa cataliza la reducción del grupo
3-ceto de la 3-deshidroecdisona o de
la
3-deshidro-20-hidroxiecdisona
en un grupo 3\alpha-hidroxilo. Estos productos de
reducción están desprovistos de actividad, y la reacción es
irreversible.
La invención es particularmente ventajosa para el
control de los parásitos que son refractarios los efectos de
Bacillus thuringiensis (B.t.) y/o a lo parásitos que
desarrollan una resistencia al B.t. El uso de un pesticida
con base proteica como la ecdisona oxidasa, cuyo modo de acción y
la estructura molecular son distintos de los del B.t.,
proporciona una excelente alternativa al B.t. en los esquemas
de gestión de las resistencias.
Tal como se utiliza en la presente memoria
descriptiva, la expresión "control de los parásitos" significa
la reducción del número de parásitos que pueden provocar daños.
Esta reducción se puede hacer mediante la mortalidad, el retraso del
desarrollo (ralentización) o una eficacia reproductora reducida. La
referencia a los "parásitos" indica los parásitos que no
forman parte de la clase de los mamíferos, y comprende por ejemplo
los insectos, los nematodos y los ácaros. Los insectos
comprenderán, por ejemplo, todos los tipos de insectos chupadores y
picadores, por ejemplo, los dípteros, los coleópteros y los
lepidópteros. Los compuestos de ecdisteroide son bien conocidos en
la técnica, como lo son los precursores y los derivados de estos
compuestos. Véase por ejemplo, Gilbert y Goodman, 1981.
Los compuestos útiles, según la invención, para
controlar los parásitos, se pueden purificar a partir de fuentes
naturales. Una vez purificados, los compuestos se pueden formular y
aplicar directamente sobre los parásitos, o aplicarse de tal
manera que los parásitos entren en contacto con los compuestos. De
este modo, los compuestos se pueden aplicar de manera general,
sobre superficies, como las superficies de los vegetales o el suelo
que los rodea, ahí donde se deben controlar los parásitos. En una
variante, los compuestos se pueden formular como cebo para ser
ingeridos por los parásitos. Estas composiciones formuladas se
pueden preparar y aplicar fácilmente por el experto en la técnica
con conocimientos de la presente descripción.
La administración de los compuestos de control de
los parásitos de la invención también puede realizarse
transformando un huésped apropiado con una construcción genética que
induce al huésped recombinado a producir el compuesto pesticida.
La identificación, la producción y el uso de tales construcciones
genéticas también se pueden realizar por el experto en la técnica
con conocimientos de la presente descripción. Por ejemplo, para una
proteína aislada aquí descrita, la secuenciación parcial de los
aminoácidos se puede utilizar para el desarrollo de sondas de
oligonucleótido. Se puede construir u obtener un banco de ADNc. Las
sondas se pueden utilizar entonces para identificar el gen deseado
en el banco de ADNc. Después de la secuenciación, el p gen se puede
reconstruir para un uso en una expresión en los vegetales, bajo el
control de un promotor apropiado.
Los genes interesantes se pueden insertar en un
casete de un vector de transformación, que se utiliza para
transformar un huésped apropiado. En una realización, el huésped
puede ser un microorganismo que coloniza los vegetales que, cuando
se aplica sobre las plantas o su entorno, expresa los genes que
producen el compuesto de control, como la ecdisona oxidasa, para
así provocar el control de los parásitos. En una variante, los
genes que funcionan en las plantas, y que codifican los compuestos
en cuestión, se pueden insertar en casetes de vector de
transformación que pueden incorporarse en el genoma de la planta,
que se protege ella misma del ataque del parásito expresando el gen
y produciendo el compuesto de control de los parásitos. Además, la
planta también se puede transformar para coexpresar genes de
B.t, que expresan proteínas para el control de los
parásitos.
De este modo, un aspecto de la presente
invención consiste en un procedimiento de producción de plantas
genéticamente transformadas, que expresan una cantidad eficaz de un
compuesto de control de los parásitos como la ecdisona oxidasa. El
procedimiento puede comprender las etapas que consisten en:
- (a)
- insertar en el genoma de una célula vegetal, una molécula de ADN recombinado que comprende:
- (i)
- un promotor que funciona en las células vegetales, para inducir la producción de una secuencia de ARN;
- (ii)
- una secuencia codificante de estructura, que codifica la ecdisona oxidasa, y
- (iii)
- una región 3' no traducida, que funciona en dichas células vegetales para inducir la adición de nucleótidos poliadenilato en el extremo 3' de la secuencia de ARN,
- donde el promotor es heterólogo respecto de la secuencia codificante de estructura, y donde el promotor está unido de manera funcional a la secuencia codificante de estructura, que está a su vez unida de manera funcional a la región no traducida;
- (b)
- obtener células vegetales transformadas, y
- (c)
- regenerar, a partir de las células vegetales transformadas, de plantas genéticamente transformadas que expresan una cantidad eficaz como pesticida, el compuesto de control del parásito.
Un cierto número de promotores, que están activos
en las células vegetales, se han descrito en la literatura. Dichos
promotores se pueden obtener a partir de plantas o de virus de
plantas y comprenden, pero no se limitan a, los promotores de la
nopalina sintetasa (NOS) y de la octopina sintetasa (OCS) (que son
llevados por plásmidos que inducen tumores de Agrobacterium
tumefaciens), los promotores 19S y 35S del virus del mosaico de
la coliflor (CaMV), el promotor inducible por la luz para la
pequeña subunidad de la ribulosa 1,5-bisfosfato
carboxilasa (ssRUBISCO, un polipéptido vegetal muy abundante) y el
promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (FMV). Todos
estos promotores se han utilizado para crear diferentes tipos de
construcciones de ADN, que se han expresado en las plantas.
Además, los materiales y procedimientos para
introducir genes en las plantas para conferir a estas plantas la
capacidad de producir las proteínas pesticidas, se conocen bien en
la técnica. En una realización preferida, los genes se modifican
para facilitar la estabilidad óptima y la expresión en el huésped
vegetal elegido. A este respecto, la patente de los Estados Unidos
Nº 5 380 831 se refiere específicamente a la optimización de genes
de B.t. para la expresión en las plantas.
En una realización de la invención, un gen que
codifica un compuesto de control de los parásitos se puede
transformar en un huésped apropiado. Los genes útiles según la
invención comprenden no sólo las secuencias de longitud completa,
sino también los fragmentos de esta secuencia, las variantes y los
mutantes, que codifican compuestos pesticidas. Tal como se utiliza
en la presente memoria descriptiva, los términos "variantes" o
"variaciones" de los genes se refieren a las secuencias de
nucleótidos que codifican las mismas proteínas o que codifican
proteínas equivalentes. Tal como se utiliza en la presente memoria
descriptiva, la expresión "proteínas equivalentes" se refiere a
compuestos que tienen la misma actividad biológica o una actividad
esencialmente idéntica respecto de los parásitos dianas, respecto
de los compuestos que se describen específicamente.
Es evidente para el experto en la técnica, que
los genes que codifican los compuestos útiles según la invención se
pueden obtener por diversos medios. Estos genes, o partes o
variantes de éstos, se pueden construir de manera sintética, por
ejemplo utilizando un sintetizador de genes. Las variaciones de los
genes se pueden construir fácilmente mediante técnicas estándar
para realizar mutaciones puntuales. Igualmente, se pueden preparar
fragmentos de estos genes utilizando las exonucleasas o
endonucleasas comerciales, o por mutagénesis dirigida, según los
procesos estándar. Por ejemplo, se pueden utilizar enzimas como
Ba131 para cortar sistemáticamente el nucleótido desde los extremos
de estos genes. Los genes que codifican fragmentos activos también
se pueden obtener utilizando una serie de enzimas de restricción.
Las proteasas se pueden utilizar para obtener directamente los
fragmentos activos de estos compuestos. Los genes que codifican
estos compuestos equivalentes se pueden sacar de bancos de ADN
utilizando las descripciones dadas en la presente memoria
descriptiva.
Existe un cierto número de procedimientos para
obtener los compuestos útiles según la presente invención. Por
ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos de las enzimas descritas en
la presente memoria descriptiva para identificar y aislar otras
enzimas. Estos anticuerpos e pueden entonces utilizar para
identificar específicamente enzimas equivalentes con la actividad
característica por inmunoprecipitación inmunodosificación
enzimática (ELISA) o transferencia de Western. Los anticuerpos de
las enzimas descritas en la presente memoria descriptiva, o de las
enzimas equivalentes, o de los fragmentos de estas enzimas, se
pueden preparar fácilmente utilizando los procesos estándar de la
técnica. Entonces se pueden obtener los genes que codifican estas
enzimas.
Los fragmentos y equivalentes que conservan la
actividad enzimática de las enzimas ilustradas entran en el marco
de la invención. Igualmente a causa de la redundancia del código
genético, una serie de diferentes secuencias de ADN puede codificar
estas enzimas. Forma parte de la pericia de una persona preparada,
el crear estas secuencias alternativas de ADN, que codifican las
mismas, o esencialmente las mismas, enzimas. Las secuencias de ADN
variantes entran en el marco de la invención. Tal como se utiliza
en la presente memoria descriptiva, la referencia a una secuencia
"esencialmente la misma" indica secuencias que tienen
sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos,
que no afectan materialmente a la actividad enzimática.
Los genes útiles según la invención se pueden
introducir en una gran variedad de huéspedes microbianos o
vegetales. La expresión del gen da como resultado, directa o
indirectamente, la producción del compuesto de control de los
parásitos. Con los huéspedes microbianos apropiados por ejemplo
Pseudomonas, los microbios se pueden aplicar en el biotopo
de los parásitos, donde van a proliferar y ser ingeridos por el
parásito, lo que da como resultado el control del parásito. En una
variante, el microbio que presenta el gen deseado se puede tratar
en condiciones que prolongan la actividad del compuesto activo y
que estabilizan la célula. La célula tratada, que conserva la
actividad pesticida, se puede aplicar entonces en el entorno del
parásito diana. Cuando el gen se introduce por medio de un vector
apropiado en un huésped microbiano, y que dicho huésped se aplica
al medioambiente en estado vivo, es ventajoso utilizar ciertos
huéspedes microbianos. Por ejemplo, se pueden elegir los
microorganismos huéspedes conocidos por ocupar el hábitat del
parásito. Los microorganismos huéspedes también pueden vivir de
manera simbiótica con una especie específica de los parásitos.
Estos microorganismos se eligen de manera a poder entrar en
competición en el medioambiente particular con los microorganismos
de tipo salvaje, lo que conduce al mantenimiento estable y a la
expresión del gen que expresa el compuesto deseado y de manera
deseable, a una protección mejorada del pesticida de la degradación
y de la inactivación por el medioambiente.
Una gran variedad de vías están disponibles para
introducir el gen interesante en un microorganismo huésped en
condiciones que permiten el mantenimiento estable y la expresión del
gen. Estos procedimientos son bien conocidos por el experto en la
materia.
Como se ha indicado anteriormente, las células
recombinadas que expresan un compuesto pesticida se pueden tratar
para prolongar la actividad pesticida y estabilizar la célula por
formación de una microcápsula celular. La microcápsula pesticida que
se forma, comprende el compuesto activo en una estructura celular,
que se ha estabilizado y que va a proteger el compuesto cuando la
microcápsula se aplica al entorno del parásito diana. Las células
huéspedes apropiadas pueden comprender procariotas o eucariotas,
limitándose normalmente a las células que no producen sustancia
tóxica para los organismos superiores, como los mamíferos. La
célula usualmente va a estar intacta, y estar sensiblemente bajo una
forma proliferativa, en vez de estar bajo una forma de espora,
aunque se pueden utilizar esporas en ciertos casos. Se describen
procedimientos de tratamiento de las células microbianas en las
patentes de los Estados Unidos Nº 4 695 455 y 4 695 462.
El huésped celular que contiene el gen
interesante puede cultivarse en cualquier medio nutritivo
apropiado, donde la construcción de ADN proporciona una ventaja
selectiva, proporcionando un medio selectivo de manera que todas o
sensiblemente todas las células conserven el gen. Estas células
pueden entonces ser recogidas según las vías clásicas. Los
microbios recuperados se pueden formular en un polvo mojable, un
concentrado líquido, gránulos u otras formulaciones por adición de
tensioactivos, dispersantes, soportes inertes y otros componentes
para facilitar la manipulación y la aplicación sobre parásitos
dianas particulares. Estas formulaciones y procedimientos de
aplicación son bien conocidos en la técnica.
Unos gránulos de cebo formulados que contienen un
atractivo y el compuesto y el compuesto de control de los parásitos
o microbios recombinados que comprenden los genes que codifican
el compuesto, se pueden aplicar al medioambiente del parásito. El
cebo se puede aplicar sin límite ya que los compuestos de control no
afectan a las vías biológicas conocidas de los animales o de los
seres humanos. El producto también se puede formular como un espay
o un polvo. Un huésped recombinado que expresa el gen del compuesto
de control también se puede incorporar a un cebo o una fuente
alimentaria para el parásito.
Como se apreciará por parte del experto en la
técnica, la concentración pesticida va a variar en gran medida en
función de la naturaleza de la formulación particular, en
particular si se trata de un concentrado o si se utiliza
directamente. El pesticida estará presente en al menos un 1% en
peso y puede estarlo en un 100% en peso. Las formulaciones secas
tendrán aproximadamente entre el 1% y el 95% en peso del
pesticida, mientras que las formulaciones líquidas serán en general,
de aproximadamente entre el 1% y el 60% en peso de las materias
sólidas. Las formulaciones que contienen células tendrán en
general, entre aproximadamente 10^{2} y aproximadamente 10^{4}
células/mg. Estas formulaciones se administrarán aproximadamente
entre 50 mg (líquido o seco) a 1 kg o más por hectárea.
Las formulaciones se pueden aplicar en el
medioambiente del parásito, por ejemplo sobre las hojas de las
plantas.
Los siguientes ejemplos ilustran características
relativas a la invención. Estos ejemplos no serán considerados como
limitativos. Todos los porcentajes son en peso y todas las
proporciones de mezcla de solvente son en volumen, salvo que se
indique lo contrario.
Se pueden cultivar larvas de Manduca sexta
(gusano del Cuerno) de los dos sexos a temperatura ambiente
(20-25ºC) y humedad relativa
(50-60%) sobre comida artificial. Una o dos semanas
después de la ecdisis en el quinto nivel, las larvas se congelan en
hielo y se disecan. Salvo que se indique lo contrario, todos los
siguientes procedimientos se realizan a 4ºC. Se recoge el hilo de
30-50 larvas, se coloca en tres volúmenes de
tampón de homogeneización (Tris-Hcl 50 mM, pH 7,0,
Na_{2}-ácido etilenodiaminotetracético
(Na_{2}-EDTA) 1mM, leupeptina 10 \muM y
ditiotreitol (DTT) 0,1 mM) y se homogeneiza mediante un
homogeneizador Teflón-vidrio de
Potter-Elvejum. El homogeneizado se puede
centrifugar (10 k X g X 30 minutos) y se puede separar el residuo.
El sobrenadante se puede someter a sonicación durante 20 segundos a
80% (Branson Sonifier 450, CT) y el material sobrenadante se puede
centrifugar (105 k X g X 90 minutos). El residuo microsómico se
puede separar, el sobrenadante se conserva y el volumen se
registra.
Se añade sulfato de amonio saturado gota a gota
al sobrenadante con agitación. Se recoge el material precipitando
entre el 35% y el 60% de sulfato de amonio saturado, por
centrifugación (10 k X g X 30 minutos). El residuo resultante se
vuelve a suspender en un tampón que contiene fosfato de sodio 10
mM, pH 7,0, Na_{2}-EDTA 1 mM, DDT 0,1 mM,
leupeptina 10 \muM y glicerol al 20% (tampón de equilibrado) y se
registra el volumen.
El material resuspendido se puede aplicar sobre
una columna (1 \times 15 cm que contiene
DEAE-Sefarosa (Sigman Chem. Co., St Louis, Mo), y
se recoge n fracciones de 1,0 ml. Se pasan sobre la columna dos
volúmenes de columna suplementarios de equilibrado. Se aplica sobre
la columna un gradiente lineal de NaCl (0-0,3 M,
\Sigma ml) en el tampón de equilibrado. Se controlan las
fracciones para la absorbencia a 280 nm y las fracciones de pico se
analizan por SDS PAGE y dosificación enzimática. Las fracciones
enriquecidas con actividad ecdisona oxidasa y con proteína se unen
y se dializan respecto del tampón de equilibrado.
El material dializado se aplica sobre una columna
(1 x 15 cm) que contiene CM-Sefarosa (Sigma Chem.
Co, St Louis, MO), previamente equilibrada con el tampón de
equilibrado y se recogen fracciones de 1,0 ml. Se pasan dos
volúmenes de columna suplementarios de equilibrados sobre la
columna. Se aplica sobre la columna un gradiente lineal de NaCl
((0-0,3 M, Ó ml) en el tampón de equilibrado. Se
pueden controlar de nuevo las fracciones por su absorbencia a 280
nm y las fracciones de pico se analizan por SDS PAGE y dosificación
enzimática. Las fracciones enriquecidas con actividad ecdisona
oxidasa y con proteína se unen y se dializan respecto del tampón de
equilibrado.
Las concentraciones proteicas se pueden
determinar según el procedimiento de Bensadoun y Weinstein
(Bensadoun et col, 1976) utilizando serumalbumina bovina
como estándar proteico. La electroforesis sobre gel de
poliacrilamida se realiza en presencia de dodecilsulfato de sodio
(SDS PAGE) esencialmente como se ha descrito (Laemmlli, 1979).
Una mezcla de reacción típica contiene entre 0,05
y 2 mg de la enzima y del tampón fosfato de potasio 50 mM, pH 7,0
en un volumen final de 1,0 ml. Después de una preincubación de 3
minutos a 30ºC, la reacción se inicia por adición de
\alpha-[23,24-^{3}H(N)]-ecdisona
o de
[24,24,26,27-^{3}H(N)]-ponasterona
A 10-50 \muM (Dupont NEN®, Boston, MA). Las
incubaciones se llevan a cabo durante 5-60 minutos a
30ºC con agitación a 60 oscilaciones por minuto en un baño de agua
girorrotativo modelo 976 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ). La
reacción se detiene por extracción de la ecdisona o de la
ponasterona A y de sus respectivos metabolitos en 9,0 ml de
cloroformo. Después de la centrifugación a 2.500 X g X 5 minutos,
se elimina la fase acuosa por aspiración y se seca una fracción
alícuota de fase orgánica que contiene la ecdisona y sus
metabolitos bajo una corriente de nitrógeno. Se vuelve a disolver el
residuo en 25 \mul de acetato de etilo y se aplica sobre una hoja
de gel de sílice IB2-F (J.T. Baker, Phillipsburg,
NJ). Las hojas de capa fina se pueden desarrollar por cromatografía
secuencial con cloroformo: etanol (9:1) y acetato de
etilo:ciclohexano (1:1). El sustrato promotor y sus metabolitos se
pueden visualizar por autorradiografía y las zonas del gel de sílice
que contienen los compuestos interesantes se eliminan y cuantifican
mediante un analizador por centelleo líquido (Packard Instruments
Co., Laguna Hills, Ca). La identificación de la
3-deshidroecdisona y de la
3-deshidro-20-hidroxiecdisona
se realiza por comparación directa de la movilidad relativa con las
de 3-deshidroecdiesteroides auténticos.
Se recogen larvas recién nacidas de la polilla de
la col (Plutella xylostella) después de su eclosión y se
mantienen en ayuna durante 18 horas. Se colocan unas gotas de una
solución de agua que contienen un colorante y la ecdisona oxidasa
purificada (0-0,1 mg/ml) en una zona sobre una caja
de Petri. Las larvas se colocan en el disco y pueden acceder a la
solución. Después de aproximadamente 30 minutos, se examinan las
larvas de manera microscópica para la presencia de colorante en el
hilo, y estas larvas se colocan sobre una comida artificial, en la
que la ecdisona oxidasa se incorpora (0-0,1 mg/ml).
Cada día después de la ingestión de la comida por las polillas, se
cuentan las larvas para la detención del crecimiento. Tres a cinco
días después de la infestación inicial, se pesan las larvas y se
las compara con el grupo testigo.
Un aspecto de la invención es la transformación
de plantas con genes que codifican una proteína que perturba el
metabolismo del ecdisteroide en los parásitos que ingieren partes
de la planta. Las plantas transformadas son resistentes al ataque de
los parásitos.
Un gen que codifica la proteína de control de los
parásitos se puede insertar en las células vegetales mediante una
serie de técnicas, que son bien conocidas en la especialidad. Estas
técnicas comprenden la transformación con un ADN T, mediante
Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes
como agente de transformación, la fusión, la microinyección, el
bombardeo de partículas (biolística), la inserción de ADN asistida
por un agente químico (PEG) o la electroporación así como otros
posibles procedimientos. Si se utilizan Agrobacteria para
la transformación, el ADN a insertar se debe clonar en plásmidos
especiales, a saber en un vector intermedio o en un vector binario.
Los vectores intermedios se pueden integrar en el plásmido Ti o Ri
por recombinación homóloga a causa de las secuencias que son
homólogas a las secuencias en el ADN T. El plásmido Ti o Ri
comprende también la región vir necesaria para la transferencia del
ADN T. Los vectores intermedios no se pueden replicar a si mismos
en Agrobacteria. El vector intermedio se transfiere
Agrobacterium tumefaciens mediante un plásmido helper
(conjugación). Los vectores binarios se pueden replicar a sí mismos
en E. Coli y en Agrobacteria. Comprenden un gen de
marcador de selección y un atador atador multisitio, que están
enmarcados por las regiones límites derecha e izquierda del ADN T.
Se pueden transformar directamente en Agrobacteria
(Holsters et coll., 1978). La Agrobacterium utilizado
como célula huésped debe comprender un plásmido que lleva una
región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del
ADN T en la célula vegetal.
La utilización del ADN T para la transformación
de las células vegetales se ha estudiado de manera importante y se
ha descrito suficientemente en el documento EP 120 516; Hoekema
(1985) en el Binary Plant Vector system, Offsetdrukkertij Kanters
B.V., Albasserdam, capítulo 5; Fraley et col., Crit. Rev.
Plant. Sci. 4:1-46, y An et col., (1985)
EMBO J. 4:277-287.
Una vez que el ADN insertado se ha integrado en
el genoma, es relativamente estable y en general no se sale de
éste. Contiene normalmente un marcador de selección, que confiere a
las células vegetales transformadas, la resistencia a un biocida o
a un antibiótico, como la kanamicina, el G418, la bleomicina, la
hidromicina o el cloranfenicol, entre otros. El marcador utilizado
individualmente puede permitir de este modo la selección de las
células transformadas respecto de las células que no contienen el
ADN insertado.
La bacteria así transformada se utiliza para la
transformación en las células vegetales. Se cultivan ventajosamente
explantes vegetales con Agrobacterium tumefaciens o
Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la
célula vegetal. Toda la planta se puede regenerar a partir del
material vegetal infectado (por ejemplo, un trozo de hoja, un
segmento de tallo, la raíz, pero también protoplastos, células de
callo o células cultivadas en suspensión) en un medio apropiado, que
puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las
plantas así obtenidas se pueden testar entonces para la presencia
del ADN insertado. No se ha tenido en cuenta ninguna exigencia
especial sobre los plásmidos en el caso de la microinyección y de
la electroporación. Es posible utilizar plásmidos ordinarios, como
por ejemplo derivados pUC.
Las células transformadas crecen en las plantas
de manera usual. Pueden formar células germinales y transmitir los
caracteres transformados a las plantas hijas. Tales plantas se
cultivan de la manera normal, y se cruzan con plantas que tienen los
mismos factores hereditarios transformados, u otros factores
hereditarios. La progenitura resultante presenta las propiedades
fenotípicas correspondientes.
Se ha de entender que los ejemplos y las
realizaciones descritos en la presente memoria descriptiva lo son
únicamente a título ilustrativo, y que se le aparecerán diferentes
modificaciones o cambios al experto en la técnica, y deben
considerarse como integrantes de marco de las reivindicaciones
anexas.
Patente U.S. Nº 4 695 455
Patente U.S. Nº 4 695 462
Patente U.S. Nº 5 380 831
EP 120 516
An et col. (1985) EMBO
J. 4:277-287)
Bensadoun A., D. Weinstein
(1976) Anal. Biochem. /0:241-250.
Carnin D.R. et col. (1994)
"Cloning of Insectidal Cholesterol Oxidase Gene and Its Expresion
in Bacteria and in Plant Protoplasts". Appl. Environn.
Microbiol. 60:4239-4244.
Fraley et col., Crit. Rev. Plant
Sci. 4:1-16
Gilbert y Goodamn (1981)
capítulo 5: Chemistry, "Metabolism and Transport of Hormones
Controlling Insect Metamorphosis" (subcapítulo: "Molting
Hormone") en Metamorphosis: A problem in Developmental Biology,
Gilbert L.I y E. Frieden, editores, Plenum Press, NY,
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Holsters et col; (1978)
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Hoekema (1985) en: The binary Plant
Vector system, Offsertdrukkerij Kanters B.V., Albasserdam,
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the diet Affect Laval Development in the Silkworm Bombix mori,
Differencially" J. Insect. Pathol.
39:805-809.
Claims (4)
1. Procedimiento de control de un organismo
nocivo que no forma parte de la clase de los mamíferos, elegido
entre los insectos, los nematodos y los ácaros, y que consume
tejidos vegetales, que comprende la administración al vegetal o al
suelo que lo rodea, o el aporte sobre o en el tejido del vegetal,
de una enzima que cataliza una reducción del grupo
3-ceto de 3-deshidroecdisona o de
3-deshidro-20-deshidroecdisona
en un grupo 3\alpha-hidroxi.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además la administración a dicho organismo nocivo de una
\delta-endotoxina de Bacillus
thuringiensis.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, que
comprende la administración de un huésped transformado para
expresar la \delta-endotoxina de Bacillus
thuringiensis y dicha enzima.
4. Composición para el control de un organismo
nocivo que no forma parte de la clase de los mamíferos, que
comprende una enzima tal como la definida en la reivindicación 1, y
una \delta-endotoxina de Bacillus
thuringiensis.
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